Stage - DLST

STAGE D’EXCELLENCE
Caractérisation de la
protéine Alix
Equipe 2 – Neurodégénérescence et plasticité
Kacher Radhia
Stage du 01/06/12 au 31/07/12
Maitre de stage : Petiot Anne
Directeur : Sadoul Rémy
Table des matières
Introduction .............................................................................................................................. 2
Matériels et Méthodes .............................................................................................................. 5
Cellules ................................................................................................................................... 5
Transfections........................................................................................................................... 5
Traitements ............................................................................................................................. 5
Western Blot ........................................................................................................................... 6
Immunofluorescence............................................................................................................... 7
Résultats .................................................................................................................................... 8
Effet de la suppression d’Alix sur l’expression des protéines chez les MEF ......................... 8
Effets d’un stress induit au réticulum sur la mort cellulaire ................................................... 8
Effet de l’expression de mutants d’Alix sur la structure du RE/golgi .................................. 10
Effet de l’expression des mutants d’Alix sur la distribution de la protéine ALG-2 ............. 12
Effets d’un stress induit au réticulum sur l’expression d’Alix et de ses partenaires ............ 12
Conclusion/Discussion ............................................................................................................ 14
Remerciements ....................................................................................................................... 16
Bibliographie........................................................................................................................... 16
1
Introduction
Alix (ALG-2 interacting protein X) est une protéine adaptatrice qui a initialement été
identifiée comme étant un partenaire de la protéine ALG-2 (apoptosis linked gene 2, figure 1)
qui est impliqué dans la mort cellulaire calcium dépendante. Alix est une protéine cytosolique
de 869 acides aminés qui se lie à ALG-2 dans son domaine PRD riche en tyrosine (figure 3).
Depuis sa découverte en 1999 Alix a été décrite comme ayant de nombreux partenaire : elle
joue un rôle dans le contrôle de la voie endocytaire (complexes ESCRT…), ainsi que dans la
voie de la mort cellulaire programmée.
La mort cellulaire programmée dont nous allons parler est l’apoptose. C’est une mort
cellulaire physiologique intervenant suite à la réception de signaux externes (activation des
récepteurs de mort) ou internes à la cellule (élévation du calcium intracellulaire). Cette mort
cellulaire n’induit pas d’inflammations car il y a condensation des membranes et du noyau,
puis fragmentation de la cellule en corps apoptotiques qui seront phagocytés. Un excès de
mort cellulaire est associé à de nombreuses pathologies (notamment des maladies
neurodégénératives), alors qu’une inhibition de ce processus est caractéristique de cancers.
Figure 1: Alg-2 (Apoptosis linked Gene 2)
ALG-2 est une protéine de 22 kDa appartenant à une famille de protéines PEF (Penta-EFhand)
possédant toutes 5 motifs « EF-hand » (EF1-EF5). Ces protéines changent de conformation en
présence de calcium et acquièrent la capacité à interagir avec d’autres protéines dont elles régulent la
fonction. ALG-2 lie le calcium au niveau de ses domaines EF1, EF3 et EF5. L’interaction d’ALG-2
avec Alix est strictement dépendante du calcium et de l’intégrité des domaines EF1 et EF3 d’ALG-2.
Les données obtenues au sein du laboratoire montrent que la protéine Alix est impliquée dans
la mort neuronale, cette protéine interviendrait dans l'activation des caspases par des
récepteurs de mort endocytés (comme le TNFR1). Il a aussi été montré qu'il y a une
augmentation de la protéine Alix dans les zones hippocampiques au cours de la
dégénérescence induite par le kainate chez le rat. De plus, la surexpression d'Alix dans les
2
CGN (neurones granulaire de cervelet) est suffisante pour induire une mort caspase
dépendante. )
L’équipe a récemment observé, sur des cellules MEF (mouse embryonic fibroblast) issu de
souris KO Alix, une déformation du réticulum endoplasmique (RE) (figure 2), on peut donc
se demander s’il existe un lien entre cette déformation et l’inactivation de la protéine Alix. De
plus, sachant qu’Alix est impliqué dans la mort cellulaire, et qu’un stress au réticulum peut
aboutir à l’apoptose, nous nous sommes demandé si ce lien potentiel pouvait être la mort
cellulaire induite par un stress au réticulum.
En effet, lorsque des protéines de conformations anormales s’accumulent dans le RE, cela
peut conduire à une réponse cellulaire définie comme le stress du Réticulum Endoplasmique.
Les cellules eucaryotes soumises à ce stress développent la réponse aux protéines mal repliées
ou réponse UTR (« unfolded protein response ») qui possède deux composantes. La première
consiste à activer la transcription de gènes impliqués dans le repliement des protéines et dans
l’activation du trafic intracellulaire au sein de la voie sécrétrice et à dégrader les protéines mal
repliées. La seconde est une répression rapide et intense de la synthèse protéique qui limite
l’afflux de nouvelles protéines dans le RE et évite ainsi la surcharge de cet organite. Lorsque
ces 2 composantes ne peuvent remédier à une situation de stress trop intense ou de trop
longue durée, la réponse UPR aboutit à l’apoptose.
Figure 2 : Le réticulum endoplasmique est dilaté dans les MEF KO Alix
Observation en microscopie électronique du réticulum endoplasmique de MEF wild type (WT) et KO
Alix. Grossissement : x30000.
Afin d’observer s’il y a ou non des modifications lorsqu’on perturbe l’expression d’Alix, nous
avons travaillé sur deux mutants d'Alix : Alix CT et Alix ΔPGY (figure 3). Alix CT
correspond au mutant dépourvu de la moitié N-terminale de la protéine Alix. Il a été montré
3
que ce mutant protège de la mort induite par une privation en facteur trophique chez les
neurones granulaires du cervelet, il induirait aussi une protection contre la mort induite par le
TNFR1 chez les cellules Hela, enfin il bloquerait la mort cellulaire programmée au cours de
l'embryogénèse du poulet. Quant à Alix ΔPGY, c'est le mutant de la protéine Alix privé de
son site d'interaction avec ALG-2. De même, ce mutant apporterait une protection de la mort
induite par le TNFR1 chez les cellules Hela, et bloquerait la mort cellulaire programmée au
cours de l’embryogenèse du poulet.
Figure 3 : Alix et ses mutants
But du stage : déterminer le lien potentiel entre Alix, le réticulum endoplasmique (RE), et par
extension l'appareil de golgi, et la mort cellulaire liée à un stress au réticulum.
4
Matériel et méthodes
Cellules
Les cellules HeLa sont des cellules cancéreuses humaine (isolées à partir d'un tissu cancéreux
de l'utérus), conservées à 37°C à 5% de CO2 et 20% d’O2, en milieu DMEM (Dulbecco's
modified Eagles's Medium) supplémenté par 10% de SVF (sérum de veau fœtal) et 2% de Lglutamine. Ce sont des cellules adhérentes, cultivées pendant 20 passages dans des boites de
100 mm et ensemencées au 1/8e (125 000 cellules pour la maintenance), pour des plaques 6
puits de 35 mm elles sont ensemencées au 1/16e (20 000 cellules) avec lamelles.
Les MEF (mouse embryonic fibroblast) sont des cellules embryonnaires fibroblastiques de
souris (prélevées sur embryons au stade E11). Le laboratoire dispose de 2 types de MEF : les
MEF Alix +/+ (souris wild type) et les MEF Alix -/- (souris KO Alix). Elles sont conservées à
37°C à 5% de CO2 et 3% d’O2, en milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagles's Medium)
supplémenté par 10% de SVF et 2% de L-glutamine. Ce sont des cellules adhérentes,
cultivées pendant une quinzaine de passages, avec un repiquage 2 fois par semaine ou
400 000 cellules sont utilisées pour ensemencer une boite de 100mm.
Transfections
Les transfection sont été réalisée sur des populations de cellules à environ 60% de confluence.
Les cellules ont été transfectées avec le JetPei (Polyplus). Pour transfecter un puits de 35mm
on ajoute à 200µL de NaCl (150mM), 1µg d’ADN et 6µL de JetPei. Après 20min
d’interaction à température ambiante, ce mélange est ajouté dans le milieu de culture des
cellules. Les cellules sont utilisées après 24h de transfection.
Constructions utilisées : PCI flag Alix ΔPGY, PCI flag Alix CT (Hit2), GFP (témoin de
transfection), PCI flag Alix (Hit 13).
Traitements : induction d’un stress au réticulum endoplasmique
Les cellules Hela ont été traitées avec les produits suivants : BFA (Brefeldine A) à 5µg/mL,
tunicamycine à 10µg/mL, thapsigargine à 1mM. Ces traitements ont été réalisés pour
différents temps, de 1h à 24h.
5
Western Blot
Lyse des cellules : Les cellules sont lavées avec du PBS (phosphate buffer saline), puis lysées
dans du RIPA (Radio-Immune-Precipitation-buffer salineAssay : 150 mMNaCl, 1% NO 40,
0.5% SDS, 50mM tris pH8) avec un inhibiteur de protéases (complete EDTA-free). Après
10min à 4°C, les cellules sont récupérées et centrifugées 20min à 13200rpm. Après
centrifugation, le surnageant est utilisé pour un dosage protéique.
Dosage des protéines : La méthode BCAssay (BCA) est utilisée pour doser la quantité de
protéines présente dans le lysat cellulaire. On dilue 5μL d’échantillon dans 95μL d’eau, puis
on ajoute 100μL de réactif BCA. Les échantillons sont mis à 37°C pendant 30 min. Puis, les
mesures spectrophotométriques sont faites à λmax = 562nm avec le lecteur de plaque
Pherastar FS. La gamme étalon est réalisée à partir d’une solution de BSA à 0,5mg/mL.
Préparation des échantillons : Une fois la quantité de protéine connue, le lysat est repris dans
du tampon de charge Leammli 5x (125mM tris HCl ph 6.8, 2% SDS p/v, 10% glycérol v/v,
0.2 mg/ml bleu de bromophénol, 2.5% β-mercaptoéthanol v/v), chauffé 5min à 90°C, puis
déposé sur un gel SDS PAGE.
SDS PAGE et western blot : 20µg de chaque échantillon est déposé sur un gel d’acrylamide
(10% ou 12% selon le poids moléculaire de la protéine d’intérêt). La migration se fait dans un
tampon de migration (running buffer :TrisHCl 3g/L, Glycine 14.4g/L, SDS 1g/L) à 90V
pendant 30min puis à 120V pendant 1h. Les protéines sont ensuite transférées sur une
membrane de nitrocellulose en transfert semi-sec à 20V pendant 1h30, dans un tampon de
transfert (TrisHCl 3g/L, Glycine 14.4g/L, SDS 0.4g/L, 10% Isopropanol). Une fois le transfert
terminé, la membrane est saturée dans une solution de TBS 0.1% tween 5% lait pendant
30min. La membrane est ensuite incubée avec un anticorps primaire (dilué dans la solution
TBS 0.1% tween 5% lait) pendant 16h à 4°C, puis 3 lavages de 10min au TBS 0.1% tween
sont réalisés, suivit d’une incubation d’une heure avec un anticorps secondaire couplé à la
HRP dilué au 1/20000e dans le TBS 0.1% tween (anticorps secondaire anti-rabbit pour les
anticorps primaires polyclonaux, et anti-mouse pour les anticorps primaires monoclonaux). La
membrane est ensuite lavée 3 fois pendant 10min avec du TBS 0.1% tween. Enfin, la
membrane est révélée avec une solution composée de Tris 100 mM ph 8.5, 0.5% v/v luminol,
0.22% v/v acide coomaric, 0.03% v/v H2O2, puis exposée sur un hyperfilm ECL.
6
Anticorps primaires utilisés en western blot : Actine monoclonal (1/10000e), Flag monoclonal
(1/1000e), Alix polyclonal (1/3000e), ALG-2 polyclonal (1/1000e), GM130 monoclonal
(1/1000e), PDI monoclonal (1/1000e).
Immunofluorescence
Fixation des cellules : Les cellules cultivées sur lamelles sont lavées 3 fois au PBS 1X, puis
fixées avec du PFA 4% (paraformaldéhyde) pendant 20 minutes à température ambiante. Les
lamelles sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS 1X.
Perméabilisation des membranes : Les cellules sont perméabilisées avec du TBS 1X 0.02%
saponine (TBS.S) 3% GPI (goat pre-immun serum, qui permet de saturer les sites non
spécifiques) pendant 30min.
Marquage : Les cellules sont ensuite incubées 1h à température ambiante dans 50µL d’une
solution d’anticorps primaire dilué dans le TBS.S 3% GPI. Les lamelles sont ensuite lavées 3
fois avec la solution de TBS.S 3% GPI, puis incubées 1h à température ambiante dans 50µL
d’anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (anticorps dilué au 1/1000e dans la solution
de TBS.S 3% GPI). On ajoute à cette solution d’anticorps un colorant fluorescent du noyau, le
Hoechst dilué au 1/100e. Après lavage au TBS.S 3% GPI, les lamelles sont montées dans 5μL
de mowiol. Les lames sont ensuite conservées à 4°C, avant d’être analysé au microscope.
Anticorps utilisés en immunofluorescence : Flag monoclonal ou polyclonal (1/500e), Alix
polyclonal (1/200e), ALG-2 polyclonal (1/100e), GM130 monoclonal (1/250e), PDI
monoclonal (1/100e).
7
Résultats
Effet de la suppression de la protéine Alix sur l’expression protéique dans les cellules
MEF
Nous avons réalisé une série de western blot afin de caractériser l’expression de différentes
protéines d’intérêts dans les cellules MEF -/- (provenant de souris KO Alix) et MEF +/+ (wild
type).
Ainsi nous avons vérifié l’expression en western blot des protéines : Alix, ALG-2 (partenaire
d’Alix), GM130 (Golgi Matrix Protein 130 : marqueur de l’appareil de Golgi), PDI (Protein
disulfide isomerase : marqueur du réticulum endoplasmique). L’actine est ici utilisée comme
témoin de charge.
Figure 4 : Etude comparative de l’expression protéique entre les MEF +/+ et les MEF -/-
L’anticorps anti-Alix a permis de vérifier que les MEF -/- n’expriment pas cette protéine.
Les résultats obtenus montrent que l’expression de GM130 et ALG-2 ne semblent pas modifié
par l’extinction de la protéine Alix.
L’anticorps anti-PDI n’a pas donné de résultats exploitables pour cette expérience.
Effets d’un stress induit au réticulum sur la mort cellulaire
Nous avons traité des cellules MEF +/+ et MEF -/- afin d’observer si les MEF -/- sont plus
sensible à la mort cellulaire induite par un stress au réticulum que les MEF +/+. Les
traitements ont été réalisés sur différents temps.
8
Pour cela, nous avons utilisé différentes drogues connues pour induire un stress au réticulum :
-
La Tunicamycine est un antibiotique qui inhibe l'enzyme GPT (glucose-NAcetylPhosphotransferase), empêchant ainsi la N-glycosylation. Les protéines ne
peuvent alors plus sortir du réticulum (n’étant pas correctement repliées) et vont
s'accumuler, provoquant un stress au réticulum et l’arrêt du cycle cellulaire en phase
G1.
-
La Thapsigargine est un inhibiteur non compétitif de la classe d'enzymes SERCA
(sarco-endoplasmic réticulum Ca2+ATPase). Elle inhibe les protéines membranaires
qui pompent le calcium à l’intérieur du réticulum endoplasmique, ce qui augmente la
concentration cytosolique en calcium et appauvri les stocks.
-
La BFA (brefeldin A) est un antibiotique produit par des organismes fongiques. Elle
inhibe de façon réversible le transport antérograde des protéines (du réticulum
endoplasmique vers l'appareil de Golgi) et induit le transport rétrograde des protéines
(de l'appareil de Golgi vers le réticulum endoplasmique). Cela conduit à
l'accumulation des protéines dans le réticulum ainsi que l’effondrement de l'appareil
de Golgi. Une exposition prolongée à la BFA peut alors inhiber la sécrétion de
protéines et finalement conduire à l'apoptose.
Afin d’établir le pourcentage de mort cellulaire pour chaque échantillons, nous avons compté
le nombre de noyau apoptotique par rapport au nombre de noyau total en microscopie à
fluorescence (figure 5).
Figure 5 : Détermination du pourcentage de mort cellulaire
Nous avons utilisé un marqueur du noyau, le Hoechst pour compter le pourcentage de mort en
microscopie à fluorescence. Les noyaux apoptotiques apparaissent beaucoup plus condensés et ont un
marquage plus intense que les noyaux des cellules vivantes. Les données des pourcentages ne figures
pas ici.
9
Figure 6 : Cellules MEF +/+ et MEF -/- traitées par les différentes drogues
Observation au microscope à fluorescence des cellules traitées marquées par le Hoechst, pour un
même temps de traitements (8h).
Suite aux différents traitements, on observe la présence de quelques noyaux apoptotiques dans
les différents échantillons, il semble donc qu’il y ait mort cellulaire suite aux traitements.
Cependant, il n’y a pas de différences significatives entre le nombre de noyaux apoptotiques
chez cellules MEF -/- par rapport au MEF +/+. Il n’y a donc, d’après la figure 6, pas plus de
mort cellulaire chez les cellules MEF -/-.
Effet de l’expression de mutants d’Alix sur la structure du RE/golgi
D’après des observations faites récemment au laboratoire, il apparait que les cellules MEF
KO Alix présentent une perturbation du RE. Nous nous sommes donc intéressés à l’effet de
l’expression des mutants Alix sur le réticulum endoplasmique et l’appareil de golgi, à travers
l’étude en microscopie à fluorescence de deux protéines: PDI (marqueur du RE) et GM130
(marqueur du golgi) ; dans des cellules transfectées avec différents mutants de la protéine
Alix.
10
Figure 7 : Effets des différents mutants d’Alix sur l’expression de PDI et GM130
Les cellules Hela ont été transfectées par les plasmides PCI flag Alix ΔPGY
ou PCI flag Alix CT (Hit2) pendant 24h à 37°C. Nous avons réalisé un comarquage sur les cellulestransfectés de façon à observer à la fois la proteine
Alix transfectée (anticorps anti-flag rouge) et la protéine d’intérêt (vert : PDI
ou GM130) pour chaque condition. Les images ont été prises sur un
microscope à fluorescence inversé.
Les cellules transfectées Alix CT donne un marquage ponctiforme du cytoplasme, alors que
pour les cellules transfectées Alix ΔPGY le marquage est cytosolique.
11
Les résultats présentés dans la figure 7 ne montrent pas de différences de distribution pour les
différents marqueurs lorsque les cellules sont transfectées ou non, il ne semble pas exister de
perturbation du réticulum endoplasmique et du golgi lorsque les cellules sont transfectées
avec les mutants Alix ΔPGY ou Alix CT.
Effet de l’expression des mutants d’Alix sur la distribution de la protéine ALG-2
Nous nous sommes également intéressé à l’effet de l’expression des deux mutants d’Alix
(Alix CT et Alix ΔPGY) sur la distribution de la protéine ALG-2, connu pour être un des
partenaires d’Alix et pour être localisé au niveau de RE.
Figure 8 : Effets des différents mutants d’Alix sur la proteine ALG-2
Les cellules Hela ont été transfectées par les plasmides PCI flag Alix ΔPGY ou
PCI flag Alix CT (Hit2) pendant 24h à 37°C. Nous avons ensuite réalisé un comarquage sur les cellules transfectés de façon à observer la transfection
(anticorps anti-flag rouge) et la distribution d’ALG2 (vert) pour chaque
condition. Les images ont été prises sur un microscope à fluorescence inversé.
Le marquage apparait plus diffus pour les cellules transfectées Alix CT, alors qu’il ne semble
pas y avoir de différence significatives lorsqu’on transfecte les cellules avec Alix ΔPGY. La
distribution de la protéine ALG-2 semble donc perturbée en présence de la mutation Alix CT.
Effets d’un stress induit au réticulum sur l’expression d’Alix et de ses partenaires
Nous avons tenté de voir si l’induction d’un stress au réticulum était associée à une
modification de l’expression de la protéine Alix et/ou de son partenaire ALG-2 dans les
cellules Hela.
12
Pour cela, nous avons utilisé les différentes drogues présentées précédemment pour induire un
stress au réticulum : BFA, tunicamycine, thapsigargine.
Figure 9 : Effet des différents traitements sur l’expression d’Alix et ALG-2
Les cellules Hela ont été traitées pendant 24h pour chaque condition.
D’après cette expérience, il ne semble pas exister de différence dans l’expression d’Alix ou
d’ALG-2, lorsque les cellules Hela sont traitées avec la BFA, la tunicamycine ou la
thapsigargine, par rapport aux cellules non traitées (le témoin de charge étant homogène le
western blot est exploitable).
13
Conclusion/Discussion
L'équipe neurodégénérescence et plasticité s’intéresse depuis plusieurs années à la protéine
Alix et a montré que cette protéine était impliquée dans la mort neuronale. Depuis peu, le
laboratoire a à sa disposition des souris KO Alix, dont le phénotype est en cours d’analyse.
Une observation par microscopie électronique des cellules MEF KO Alix a révélé que la
morphologie du réticulum endoplasmique de ces cellules étaient perturbée (en comparaison
avec des MEF +/+).
Le but de mon stage, a été de déterminer le lien potentiel entre Alix, le réticulum
endoplasmique (et par extension l'appareil de golgi) et la mort cellulaire liée à un stress au
réticulum.
A travers l'étude des MEF, nous avons cherché à observer s’il existe modification de
l’expression d’ALG-2, ainsi que de l’appareil de Golgi et du réticulum, lorsque la protéine
Alix n’est pas fonctionnelle. Les résultats obtenus par western blot n’ont pas montrés de
différences significatives dans l'expression de la protéine GM130 (marqueur de l'appareil de
golgi) entre les MEF +/+ et les MEF -/-, de même pour ALG-2. Pour ces cellules, nous avons
également utilisé un anticorps anti-PDI, mais cet anticorps n'a pas donné de résultats que ce
soit pour les MEF +/+ ou pour les -/-, il serait donc intéressant de trouver un autre marqueur
du réticulum pour réaliser un western blot. D’après cette expérience il ne semble pas exister
de modification dans l’expression d’ALG-2 ou dans l’expression des compartiments étudiés.
Nous avons ensuite induit un stress au réticulum sur ces cellules MEF à l’aide de différentes
drogues. Nous n’avons pas obtenu de résultats montrant une mortalité plus élevées pour les
MEF -/- par rapport au MEF +/+. Pour valider cette observation il serait, dans un premier
temps nécessaire de vérifier qu’il y a bien eu induction d’un stress sur les cellules traitées.
Pour cela, on peut, par exemple, réaliser un western blot avec un anticorps anti-CHOP
(protéine dont l’expression augmente lors d’un stress). Dans un deuxième temps on peut se
poser la question du type de mort cellulaire induite suite au stress provoqué dans nos
expériences. En effet, l’observation des noyaux permet de mettre en évidence les cellules
mortes suivant une voie caspase dépendante (apoptose), or ce n’est pas le seul type de mort
cellulaire existant (nécrose). Il serait donc intéressant de quantifier la mort cellulaire totale, à
l’aide par exemple d’un test toxi-like. De plus, on peut remarquer que, malgré la présence de
quelques noyaux apoptotique, la mortalité est très peu élevée. Hors, des expériences utilisant
14
les mêmes drogues ont été réalisées sur des cellules Hela pour lesquelles on observe une
mortalité beaucoup plus importante, on peut donc aussi penser que les drogues utilisées ne
donnent pas une mortalité suffisante pour réaliser une observation pertinente sur les cellules
MEF.
En ce qui concerne les expériences faites sur les cellules Hela, il a été montré que les mutants
d’Alix protègent de la mort induite par le TNFR-1, nous avons donc essayé de savoir si cet
effet protecteur peu provenir du réticulum. Les expériences de transfection des cellules Hela
par les mutants d’Alix (Alix CT et Alix ΔPGY) n’ont pas montré de différence significative
dans l’expression de PDI ou GM130, et donc potentiellement pas de perturbation majeur de
ces compartiments.
Ensuite, nous avons étudié l'effet de ces mutants sur l'expression d’ALG-2 dans les cellules
Hela. On a pu observer qu'une transfection par le plasmide Alix CT entraîne un changement
dans la distribution de ALG-2 (il serait plus diffus chez les cellules transfectées). Mais les
autres résultats ne semblent pas indiqués de différence pour la transfection par le plasmide
Alix ΔPGY. L'expression du mutant Alix CT semble donc perturber la distribution de ALG-2,
de plus il a été montré que le mutant Alix CT protègerait d’avantage les cellules de la mort
cellulaire qu’Alix ΔPGY, cette modification de la distribution de ALG-2 pourrait alors avoir
un lien avec cette protection plus importante apportée par le mutant Alix CT.
Enfin, nous avons induit un stress au réticulum sur les cellules Hela afin d’observer s’il existe
une perturbation dans l’expression de la protéine Alix et de son partenaire ALG-2. Les
résultats de la figure 9 semblent indiquer qu’il n’y a pas de modification dans l’expression
d’Alix ou d’ALG-2 lorsque les cellules sont traitées avec les différentes drogues. On peut
faire ici les mêmes observations que pour les MEF traitées avec ces drogues, c’est à dire
vérifier qu’il y a bien eu induction d’un stress sur les cellules traitées, en réalisant un western
blot avec un anticorps anti-CHOP. Cependant, d’autres expériences ont montré des résultats
différents, comme dans la figure 10 où on observe une différence
dans l’expression d’Alix (mais pas au niveau d’ALG-2) lorsque
les cellules sont traitées avec de la BFA ou de la thapsigargine.
Nous pouvons donc, dans l’état actuel des choses, difficilement
conclure sur cette expérience.
Figure 10 : Effet des différents traitements sur l’expression d’Alix
et ALG-2
Les cellules Hela ont été traitées pendant 24h pour chaque condition.
15
Remerciement
Je tiens tout d'abord à remercier Anne Petiot qui m'a encadrée pendant ces deux mois de
stage, et grâce à qui j'ai beaucoup appris tant au niveau de la pratique en biologie qu’au
niveau du raisonnement scientifique. Je remercie également Rémy Sadoul pour m'avoir
accueilli dans son équipe. Merci également à toute l'équipe pour la l’ambiance de travail
agréable. Enfin, je remercie l'UJF pour m'avoir donné l'opportunité de réaliser un stage à
travers le dispositif d’excellence.
Bibliographie
Nobuhiro Nakamura, Catherine Rabouille, Rose Watson, Tommy Nilsson, Norman Hui, Paul
Slusarewicz, Thomas E. Kreis and Graham Warren, Characterization of a cis-Gol Matrix Protein
GM130 (1995).The Journal of Cell Biology, Volume 131
Marc Missotten, Anthony Nichols, Klaus Rieger, Rémy Sadoul, (1999). Alix, a novel mouse
protein undergoing calcium-dependent interaction with the apoptosis-linked-gene 2 (ALG-2) protein.
Cell Death and Differentiation 6, 124 – 129
Trioulier Y, Torch S, Blot B, Cristina N, Chatellard-Causse C, Verna J M and Sadoul R (2004).
Alix, a protein regulating endosomal trafficking, is involved in neuronal death. J Biol Chem 279,
2046-52.
Hemming F. J., Fraboulet S., Blot B. and Sadoul R. (2004). Early increase of apoptosis-linked
gene-2 interacting protein X in areas of kainate-induced neurodegeneration. Neuroscience 123, 88795.
Malhul-Mellier AL, Hemming FJ, Blot B, Fraboulet S, Sadoul R, (2006). Alix, making a link
between apoptosis-linked gene-2, the endosomal sorting complexes required for transport, and
neuronal death in vivo. J Neurosci. 2006 26 : 542-9
Greg Odorizzi, (2006). The multiple personalities of Alix. Journal of Cell Science 119, 3025-3032
Malhul-Mellier A, Strappazzon F, Petiot A, Chatellard-Causse C, Torch S, Blot B, Freeman K,
Kuhn L, Garin J, Verna JM, Fraboulet S, Sadoul R, (2008). Alix and ALG-2 are involved in tumor
necrosis factor receptor 1-induced cell death. JBiol Chem. Dec 12;283(50):34954-65
Malhul-Mellier A, Strappazzon F, Chatellard-Causse C, Blot B, Béal D, Torch S, Hemming F,
Petiot A, Verna JM, Fraboulet S, Sadoul R, (2009). Alix and ALG-2 make a link between
endosomes and neuronal death. Biochem Soc Trans. 2009 :200-3
Breckenridge DG, Stojanovic M, Marcellus RC, Shore GC. (2003) Caspase cleavage product of
BAP31 induces mitochondrial fission through endoplasmic reticulum calcium signals, enhancing
cytochrome c release to the cytosol. J Cell Biol. 2003 Mar 31;160(7):1115-27.
16