Détection des rotavirus dans les effluents de station - envlit

Détection des rotavirus dans les effluents de station
d'épuration par immuno-capture
Pierre Le Cann 1, Fabienne Loisy 1, Jean Cohen 2, Monique Pommepuy 3, Françoise Le Guyader 1
1
3
Laboratoire de Microbiologie, Ifremer, Nantes ([email protected]), Brest
Laboratoire de Virologie - Immunologie moléculaire, INRA, 78350 Jouy-en-Josas 2
Résultats
Introduction
1
La détection des virus entériques humains dans les échantillons de l'environnement est actuellement basée
sur la PCR. Cependant, la mise en oeuvre de cette technique est rendue difficile par la présence d'inhibiteurs
de la polymérase. Leur élimination nécessite des étapes de purification situées en amont de l'extraction des
acides nucléiques comme ci-après ou en aval (voir Loisy, A33). L'immuno-capture consiste à capter la
capside virale, ici le rotavirus, sur un support solide à l'aide d'un anticorps spécifique (anti-protéine de capside
VP6). Les inhibiteurs sont éliminés par lavage du support puis le génome viral est extrait et amplifié par RTPCR.
Matériel et
Ac anti-IgG ou anti-Fc
Méthodes
Bille de sépharose
ou bille magnétique
Ac anti-Rotavirus
Fixation de l'anticorps anti-Rotavirus
20 µg Ac/mg billes, 1 mg billes
3
4
MW
T-
Figure 1 : Détection des rotavirus (104
virus/ml : 1ml) sur billes de sépharose.
1: billes de sépharose recouvertes
avec l’anti-VP6, 2 : même chose avec
échantillon dilué au 1/10, 3 : billes de
sépharose non recouvertes avec l’antiVP6, 4 : pas de billes de sépharose,
MW: marqueur de poids moléculaire,
T- : témoin de RT-PCR.
1062 pb
Les rotavirus se fixent non seulement sur les billes recouvertes d’anticorps anti-rotavirus (lignes 1 et 2) mais
également sur les billes qui en sont dépourvues (ligne 3), et sur les tubes collecteurs (ligne 4). Différentes
solutions de lavage ont été testées , mais il n ’a pas été possible d’éliminer ces réactivités non spécifiques.
Cette technique a été rapidement abandonnée au profit des immuno-sticks en raison notamment de la difficulté
pour laver les billes de sépharose.
1- L'immuno-capture anti-rotavirus comporte plusieurs étapes. La première consiste à fixer des anticorps antirotavirus sur un support solide. Les anticorps choisis sont les monoclonaux anti-VP6 dirigés contre une protéine
externe de la capside du rotavirus. Différents supports ont été testés :
* la protéine A sépharose (Pharmacia) constituée de billes de sépharose recouvertes de protéine A qui
fixe les fragments Fc des anticorps,
* les immuno-sticks Nunc) petits supports plastiques traités "maxisorb" pour adsorber de façon
importante les protéines,
* les billes magnétiques (Dynal) recouvertes d'anticorps de mouton anti-IgG de souris.
2- La deuxième étape consiste à immerger le support dans la suspension supposée contenir les rotavirus, en
l'occurrence des échantillons de station d'épuration. Différents volumes ont été traités : 1 ml, et 5 ml.
3- L'ARN viral est ensuite directement extrait à partir des particules virales fixées sur leur support en utilisant un kit
d'extraction des ARN viraux (High pure Viral RNA kit, Boehringer).
4- Enfin, l'ARN viral est amplifié par RT-PCR en utilisant les amorces Beg 9 et End9 (Gouvéa) situées sur le gène 9
codant pour la protéine VP7 ou Con1 et Con2 situées sur le gène 4 et codant pour la protéine VP4 (Gentsch). Les
produits amplifiés sont révélés en gel de polyacrylamide.
Le protocole général est représenté sur le schéma suivant.
Ac anti-Rotavirus
2
1
2
4
5 MW 6
1062 pb
7
8
9
Figure 2 : Détection des rotavirus sur
immuno-sticks. 1 : eau ne contenant
pas de rotavirus, 2 : immuno-stick non
recouvert d’anticorps anti-VP6, 3 :
témoin négatif de RT-PCR, 4 : eau brute
de station d’épuration, 5 : eau épurée de
station d’épuration, MW: marqueur de
poids moléculaire, 6 : immuno-stick
recouvert d’anti-rotavirus, 7 et 8 même
chose avec échantillons dilués au 1/10
et 1/100, 9 : témoin négatif de RT-PCR.
Comme précédemment les rotavirus se fixent de façon non spécifique sur les immuno-sticks (ligne 2). Il faut
noter qu’il a été possible de détecter des rotavirus non seulement dans les eaux artificiellement contaminées
avec 104 virus/ml (lignes 6 à 8) mais également dans les eaux brutes de station d’épuration (ligne 4) montrant
l’efficacité de la technique. Cependant, le système composé d’une tige à ailettes solidaire du bouchon du tube
NUNC ne permet de traiter que des volumes inférieurs ou égal à 1 ml. Et la concentration des virus à partir de
volumes plus importants par ultracentrifugation puis reprise des culots dans 1 ml avant immuno-capture s’est
révélée moins sensible que la détection directe sur 1 ml.
1
Immuno-stick
30 mn à température ambiante
sous agitation
3
2
3
MW
T+
Figure 3 : Détection des rotavirus sur
billes magnétiques dans des
échantillons d’eaux épurées de station
d’épuration. 1, 2, 3 : stations d’épuration
1 2 et 3 ; MW : marqueur de poids
moléculaire, T+ : témoin positif de RTPCR.
1062 pb
4 lavages en tampon PBS BSA 0.1 %
Rotavirus
Rotavirus
Immuno-capture du Rotavirus
sur le support
Les billes magnétiques Dynal ont été utilisées suivant les recommandations du fabricant avec
quelques modifications pour détecter les rotavirus dans les eaux de station d’épuration trouvés
positifs par détection directe en RT-PCR. L’expérience a été réalisée sur 1 ml d’échantillon. Tous les
échantillons positifs en RT-PCR directe sont positifs en immuno-capture sur billes magnétiques.
1
2
3
4 lavages en tampon PBS BSA 0.1 %
Extraction des ARN viraux
(Kit Boehringer)
RT-PCR
Discussion
211 pb
4
MW T+
Figure 4 : Comparaison entre la
détection directe des rotavirus par RTPCR et par immuno-RT-PCR sur billes
magnétiques dans des échantillons
d’eaux de station d’épuration. 1 et 3 :
eaux brutes, 2 et 4 : eaux épurées, 1 et 2
: détection directe par RT-PCR, 3 et 4 :
détection par immuno-RT-PCR sur
billes magnétiques, MW : marqueur de
poids moléculaire, T+ : témoin positif de
RT-PCR.
La détection des rotavirus sur billes magnétiques (lignes 3 et 4) a été comparée à la technique utilisée en
routine dans le laboratoire pour rechercher les rotavirus dans les eaux de station d’épuration (lignes 1 et 2).
Cette méthode est basée sur l’ultracentrifugation de 5 ml d ’échantillon, l’extraction des ARN totaux à l’aide
du kit "high pure viral RNA kit" de Boehringer suivi de la RT-PCR. L’intensité du signal est plus importante
dans les échantillons traités par immuno-capture. Pour vérifier que cette différence de signal était réellement
due à une différence de sensibilité et non pas à un artefact de PCR, les échantillons ont été dilués avant RTPCR. Une différence d’un logarithme a été observée dans les eaux épurées.
Les différents essais ont permis de sélectionner la technique d’immuno-capture sur billes magnétiques car elle est simple, rapide et présente des réactions non spécifiques moins importantes. Il faut cependant noter
qu’il n’a pas été possible de les éliminer complètement. L’autre avantage de cette technique est la possibilité de traiter des volumes plus importants. La détection de rotavirus a pu être réalisée sur un volume de 5 ml
d ’eau de station brute ou épurée. Des résultats préliminaires montrent que l'on peut augmenter ce volume à 50 ml. Il est donc possible d'adapter la technique d'immuno-capture pour détecter les rotavirus dans
l'environnement et cette technique semble efficace pour se débarrasser des inhibiteurs de la RT-PCR. De plus, elle permet de mettre en évidence des particules virales et non pas seulement leur génome comme la RTPCR seule. Même si l’infectiosité des particules ne peut être préjugée, la notion d’intégrité structurale apporte des éléments sur le risque sanitaire.
Des expériences complémentaires sont nécessaires pour améliorer la spécificité de la réaction et le volume d’échantillon traité.
Gentsch, J. R., R. I. Glass, P. Woods, V. Gouvea, M. Gorziglia, J. Flores, B. K. Das, and M. K. Bhan. 1992. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 30: 1365-73.
Gouvea, V., R. I. Glass, P. Woods, K. Taniguchi, H. F. Clark, B. Forrester, and Z. Y. Fang. 1990. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J Clin Microbiol.
28:276-82.
Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer - Direction de l'Environnement et de l'Aménagement Littoral
Département Microbiologie et Phycotoxines, BP 21105, 44311 Nantes Cedex 3, France