151 25-34 propr antibact HE anis no

25
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2012, 151(1-4), 25-34
COMPOSITION CHIMIQUE ET ACTIVITÉ
ANTIBACTÉRIENNE DE L’HUILE
ESSENTIELLE DE FRUITS D’ANIS VERT
MAROCAIN (*)
Yasmine GHOUATI ( 1 ) , Touriya BELAICHE ( 2 ) ,
Mohammed OUHSSINE ( 3 ) , Ali AMECHROUQ ( 4 ) ,
Abdessalem TAHIRI ( 5 ) , Said CHAKIR ( 1 )
L’hydrodistillation des fruits de Pimpinella anisum récoltés à
Agouray au Maroc fournit 3,55 % d’huile essentielle. Par
couplage chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de
masse, onze composés ont été identifiés, représentant 90,92 % de
l’huile essentielle totale. L’(E)-anéthole (81,19) et le
γ-himachalène (6,22 %) constituent les composés majoritaires.
L’activité antibactérienne a été testée sur quatre souches
bactériennes : Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia
coli et Salmonella typhi avec des concentrations minimales
inhibitrices variant de 0,98 à 1,97 mg/ml.
(*)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Manuscrit reçu le 10 mai 2012.
Faculté des Sciences de Meknès, Département de Biologie, BP 11021, Zitoune,
50000 Meknès, Maroc. [email protected], [email protected]
École Nationale d’Agriculture, Unité de Technologie Alimentaire et de Biochimie,
BP S/40, 50000 Meknès, Maroc. [email protected]
Faculté des Sciences de Kénitra, Laboratoire de Biotechnologie, Environnement et
Qualité, Université Ibn Tofaïl, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected]
Laboratoire de Chimie Moléculaire et Substances Naturelles, Université Moulay
Ismail, Faculté des Sciences BP 11021 Zitoune, 50000 Meknès, Maroc.
[email protected]
École Nationale d’Agriculture de Meknès, Département de Protection des Plantes et
de
l’Environnement,
BP
S/40,
50000
Meknès,
Maroc.
[email protected]
26
INTRODUCTION
L’anis vert est une plante aromatique herbacée annuelle cultivée dont
on utilise le fruit velu, de 3 à 5 mm de long qui se présente sous forme de
diakènes gris brun à stries claires d’odeur anisée [3].
Le fruit est utilisé aussi bien comme condiment alimentaire, que
comme remède en médecine traditionnelle. Il possède des propriétés
antispasmodique, digestive, carminative, antiseptique… et entre dans la
composition de produits cosmétiques et d’hygiène [3,5,27].
L’huile essentielle renferme l’(E)-anéthole comme principal
constituant (Tableau I).
Tableau I :
Pourcentages des principaux constituants de quelques huiles essentielles
des fruits de Pimpinella anisum.
[1]
Origine
estragole
p-anisaldéhyde
(Z)-anéthole
(E)-anéthole
Turquie
0,00-2,67
0,00-0,17
80,36-94,03
α-chamigrène
α-longipinène
eugénol
ß-caryophyllène
coumarine
himachalène
(E)pseudoisoeugényl
2-méthylbutyrate
aromadendrène
quercétol
p-anisylacétone
pics identifiés
[2]
90,0
1,1
[12]
[17]
[16]
1,02
2,4
Europe
0,5-2,3
0,0-5,4
85,0
2,2
93,9
76,993,7
[25]
(Kovats sur
DB-5)
2,0
0,4
0,2
94,2
1195
1252
1269
1283
1,4
0,7
1351
1356
1428
1439
1447
1765
7,22
0,8
1,1
≤22
0,9
11
22
10
0,4-8,2
0,4-6,4
7
L’Anis vert est traditionnellement cultivé par les agriculteurs de la
région d’Agouray (Maroc).
Le présent travail a pour objectif de valoriser les fruits de Pimpinella
anisum du Maroc afin d’inciter les agriculteurs de la région à domestiquer
cette espèce. Nous avons commencé par une caractérisation chimique suivie
27
d’une étude de l’effet antibactérien de l’huile essentielle extraite des fruits.
Ce dernier test a été accompli sur quatre souches pathogènes.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
Monsieur Taoufiq Boukhari, propriétaire de Société « Agriculteur
Plantes Médicinales et Aromatiques » à Agouraï, El Hajeb, à une vingtaine
de kilomètres au sud de Meknès, dans la région de Meknès-Tafilalet au nord
du Maroc, a mis à notre disposition les échantillons d’Anis vert, Pimpinella
anisum L. La récolte des parties aériennes été effectuée manuellement à
maturité des diakènes à la mi-juin 2010. Après séchage à l’ombre, les
semences ont été séparées à l’aide d’une moissonneuse batteuse. Les fruits
sont versés dans des sacs en raphia de 70 kg.
Trois kilogrammes de fruits provenant de trois sacs pris au hasard, à
raison d’un kilogramme par sac prélevé à la main au milieu du sac ont été
ramenés au laboratoire fin septembre 2010 pour analyse. Les tiges, feuilles,
fleurs, fruits non murs, graines étrangères, etc. ont été éliminés et les fruits
ont été stockés dans des bocaux en verre opaque à température ambiante, à
l’abri de la lumière et de l’humidité. Le pourcentage de diakènes est de
92 %.
Extraction de l’huile essentielle
L’extraction de l’huile essentielle a été effectuée par
hydrodistillation dans un appareil de type Clevenger. La distillation de
100 g de fruits dans deux litres d’eau a eu lieu trois heures à partir de
l’ébullition. Le rendement en huile essentielle est rapporté à 100 g de
matière sèche. Ce dernier a été estimé sur trois fois 10 g de fruits entiers
séchés à l’étuve à 105°C jusqu’à poids constant. L’huile essentielle obtenue
est séchée au sulfate de sodium anhydre puis stockée à 4°C à l’obscurité
dans des flacons en verre opaque de 25 ml.
Analyse chromatographique
L’identification des constituants a été réalisée par CPG/SM :
chromatographe à phase gazeuse Trace GC ULTRA couplé à un
spectromètre de masse Polaris Q MS à trappe ionique ; solvant : n-hexane ;
28
colonne VB-5 (méthylpolysiloxane à 5 % phényl), 30 m x 0,25 mm x
0,25 µm ; volume d’injection 1 µl ; température d’injection 220°C ;
température de détection pour la CPG 40°C ; température d’interface
300°C ; mode d’injection split ; gaz vecteur hélium à 1,4 ml/min ;
programme de température 40°C 2 min, 40 à 180°C à 4°C/min, 180 à 300°C
à 20°C/min, 300°C 2 min ; température de la source d’ionisation : 200°C ;
ionisation 70 eV ; base de données utilisée : NIST MS Search.
Activité antibactérienne
Quatre souches bactériennes ont été choisies pour leurs fréquences
élevées à contaminer les denrées alimentaires et pour leur pathogénicité. Il
s’agit de deux bactéries à Gram+, Bacillus cereus et Staphylococcus aureus
et deux bactéries à Gram-, Escherichia coli et Salmonella typhi. Ces souches
bactériennes proviennent de la collection du Laboratoire de l’Unité de
Technologie Alimentaire et de Biochimie de l’École Nationale
d’Agriculture de Meknès. Elles ont été entretenues par repiquage sur gélose
cœur cervelle toutes les 24 h, avec une incubation à l’étuve à 37°C.
La méthode décrite par Remmal et al. [21], qui permet d’obtenir une
émulsion de l’huile essentielle dans le milieu de culture, a été retenue. Étant
non miscible à l’eau et donc aux milieux de culture, l’huile essentielle a été
émulsionnée par une solution d’agar à 0,2 % afin de favoriser le contact
germe / composé.
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de l’huile
essentielle ont été déterminées selon la méthode décrite par Remmal et al.
[21] et Satrani et al. [22].
Des dilutions ont été préparées au 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/200,
1/300 et 1/500 dans la solution d’agar. Dans des tubes à essais contenant
chacun 13,5 ml de milieu gélosé TSA (Tryptic Soja Agar), stérilisés à
l’autoclave 20 min à 121°C et refroidis à 45°C, ont été ajoutés 1,5 ml de
chacune des dilutions de façon à obtenir les concentrations finales de 1/100
à 1/5000 (v/v). Les tubes ont été ensuite agités au vortex avant d’être versés
dans des boites de Petri de 90 mm de diamètre en verre. Des témoins, ne
contenant que le milieu de culture additionné de la solution d’agar à 0,2 %
seule ont été préparés. L’ensemencement a été fait par stries à l’aide d’une
anse de platine calibrée afin de prélever le même volume d’inoculum. Ce
dernier se présente sous forme de bouillon de culture de 24 h à 37°C.
Chaque essai a été répété trois fois et trois boites ont été utilisées pour
chaque dilution.
29
RÉSULTATS
Optimisation du rendement en huile essentielle
Le rendement dépend du traitement appliqué aux fruits. Il est de
3,00 % pour les fruits, 3,10 après concassage au mortier et 3,55 après
broyage au moulin électrique.
Composition chimique
L’(E)-anéthole est le composé dominant (Tableau II) avec 81,19 %.
Le sesquiterpène γ-himachalène vient en deuxième position (6,22). Il est
suivi du (Z)-anéthole (0,59 %) et de l’estragole (0,46), isomères du (E)anéthole. Viennent ensuite des sesquiterpènes (α-chamigrène, αlongipinène, aromadendrène) et du quercétol (0,09 %). Les composés
identifiés représentent 90,92 % de l’essence totale.
Tableau II :
Principaux constituants de l’huile essentielle des semences de
Pimpinella anisum d’Agouray (Maroc) cités selon leur ordre d’élution.
Temps de
rétention
19,33
19,44
20,75
25,85
26,75
27,45
29,09
39,07
Pourcentage
0,46
0,59
81,19
0,48
6,22
0,36
0,07
0,09
Composé
Formule
m/z
estragole
(Z)-anéthole
(E)-anéthole
α-chamigrène
γ-himachalène
α-longipinène
aromadendrène
quercétol
C10H12O
C10H12O
C10H12O
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C18H16O7
148,22
148,22
148,22
204,35
204,35
204,35
204,35
344,31
Activité antibactérienne
L’huile essentielle des fruits de Pimpinella anisum est
antibactérienne à 1/1000 sauf pour Salmonella typhi (1/500) (Tableau III).
La concentration minimale inhibitrice est de 0,988 mg/ml sauf pour
Salmonella typhi (1,98).
30
Tableau III :
Volumes inhibiteurs et concentrations minimales inhibitrices de l’huile
essentielle d’Anis vert d’Aguray (Maroc) pour quatre souches
bactériennes.
Concentration
(volume /volume)
(mg/ml)*
Bacillus cereus
Staphylococcus
aureus
Escherichia coli
Salmonella typhi
1/100
1/250
1/500
1/1000
1/2000
1/3000
1/5000
Témoin
9,89
-
3,95
-
1,98
-
0,99
-
0,49
+
+
0,33
+
+
0,20
+
+
0
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- : inhibition, + : croissance
* : concentration calculée en fonction de la moyenne de la densité de 0,98 g/ml
DISCUSSION ET CONCLUSION
Le rendement moyen en huile essentielle de l’Anis vert étudié est de
3,55 %. Le broyage des semences au moulin électrique a permis
d’augmenter le rendement de 0,55 %.
Les chémotypes de Pimpinella anisum sont définis par rapport au
pourcentage d’(E)-anéthole. En général, il varie de 75 à 95 % [3,7,27,etc.].
L’Anis vert analysé (81,19 %) rentre dans cette marge. Les variations
qualitatives et quantitatives de composition chimique peuvent être dues à
des facteurs génétiques mais aussi écologiques, environnementaux, ou aux
conditions de culture, à la date de récolte [15,18,etc.].
L’huile essentielle d’Anis vert montre in vitro une activité
antibactérienne contre Bacillus cereus, Staphyloccocus aureus et
Escherichia coli (0,98 mg/ml) et dans une moindre mesure contre
Salmonella typhi (1,97 mg/ml). Singh et al. [24] ont observé une activité
antibactérienne sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli et quatre autres
bactéries.
Ces bactéries pathogènes contaminent les denrées alimentaires.
L’homme est la plupart du temps responsable de la contamination avant, au
cours et après la transformation des aliments [9,20].
L’anéthole et probablement ses isomères sont responsables de
l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle d’Anis vert [11,19,26].
Muthanna [14] a démontré l’activité antimicrobienne de l’(E)-anéthole isolé
31
des fruits de Pimpinella anisum. Mohammed [13] a observé une activité de
l’anéthole des fruits d’Anis vert sur Staphylococcus aureus, Bacillus aureus
et Escherichia coli. Shan et al. [23] ont aussi montré que les fruits d’Illicium
verum, qui sont riches en (E)-anéthole, ont une action antibactérienne contre
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Escherichia coli.
Les autres constituants pourraient agir en synergie. L’activité
antibactérienne résulterait de l’implication positive de tous les constituants
de l’huile essentielle [4,10].
L’huile essentielle d’Anis vert, employée comme arôme naturel,
pourrait aussi servir d'agent de conservation alimentaire. Comme un grand
nombre d’huiles essentielles, elle est approuvée comme additif alimentaire
et appartient aux GRAS ou composés généralement reconnus comme sains
[Generally Recognized As Safe]. Combinée avec d’autres procédés de
conservation, que ce soit des produits chimiques synthétiques ou des
traitements physiques [10], elle pourrait contribuer à augmenter la durée de
vie des aliments. Elle génèrerait moins d’effets secondaires que les produits
synthétiques [6], sans risquer d’altérer la qualité organoleptique des aliments
à faible dose et sans nécessiter d’autorisation d’emploi. Elle va conférer une
propriété neutraceutique au produit alimentaire [8].
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ABSTRACT
Chemical composition and antibacterial activity of essential oil of
Pimpinella anisum fruits
The hydrodistillation of Pimpinella anisum fruits harvested in
Agouray, Morocco, supplied 3.55% essential oil. By GLC/MS coupling,
eleven compounds were identified, representing 90.92% of the total
essential oil. (E)-anethole (81.19) and γ-himachalene (6.22%) constituted
the major compounds.
The antibacterial activity was tested on four bacterial strains:
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli and Salmonella
typhi and presented an inhibitive minimal concentration varying from 0.98
to 1.97 mg/ml.
Key-words: antibacterial activity, essential oil, Pimpinella anisum, yield.
__________