06_chap3_mise_au_point_technique

CHAPITRE III : MISE AU POINT DES TECHNIQUES D’ETUDES
I. CARACTERISATION DU SYSTEME D'AEROBIOCONTAMINATION
A. PARAMETRES PHYSIQUES
1. TAILLE DES BIOAEROSOLS
2. STABILITE DE LA PRODUCTION DE L'AEROSOL
3. EFFET DE LA VITESSE D’AIR DE SOUFFLAGE
4. CONTAMINATION DES SURFACES
B. PARAMETRES BIOLOGIQUES
1. EFFET DE L’AGE DE LA CULTURE SUR LA DISPERSION
2. IMPACT DE L’AEROSOLISATION SUR LA GERMINATION
3. EFFET DE L’ETAT D’HYDRATATION DE LA CULTURE
II. SUIVI DE LA CROISSANCE FONGIQUE
A. DETERMINATION DE LA CROISSANCE EN MILIEU AQUEUX
B. ESTIMATION DU TEMPS D’ADAPTATION DES MOISISSURES AUX SUBSTRATS
C. MESURE DE LA BIOMASSE AU SEIN DES MATERIAUX : DOSAGE DE
L’ERGOSTEROL
1. MISE AU POINT ET VALIDATION DE LA TECHNIQUE ANALYTIQUE
2. MISE AU POINT DE L'ETAPE D'EXTRACTION
3. QUANTITE D'ERGOSTEROL PAR SPORE
D. MESURE DU PH DES PRODUITS DE CONSTRUCTION
- 67 - 67 - 67 - 69 - 70 - 71 - 72 - 72 - 73 - 74 - 75 - 75 - 76 - 77 - 77 - 78 - 80 - 80 -
TABLE DES ILLUSTRATIONS
CHAPITRE III
FIGURES
Figure 1 : Profil granulométrique de l’aérosol d’Aspergillus niger et photographie de ses conidies impactées sur
gélose (microscope optique x400) .................................................................................................- 67 Figure 2 : Photographie d'une spore d'Aspergillus niger (MEB)...........................................................................- 68 Figure 3 : Photographie d'une zone d'impaction réalisée sur lame graissée sans (A) et avec (B) le système de
désagrégation d'amas .....................................................................................................................- 68 Figure 4 : Concentration conidienne d'Aspergillus niger obtenue lors d'une génération continue d'aérosol pour un
débit d'air de soufflage de 2,9 l/min...............................................................................................- 69 Figure 5 : Dispersion des spores d’Aspergillus niger, Penicillium brevicompactum et Cladosporium
sphaerospermum selon la vitesse d’air de soufflage (n = 7)..........................................................- 70 Figure 6 : Concentration de spores d'Aspergillus niger impactées sur lame graissée en fonction de la concentration
particulaire aérosolisée ..................................................................................................................- 71 Figure 7 : Décroissance conidienne d'Aspergillus niger........................................................................................- 72 Figure 8 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’âge de la culture (débit d'air de soufflage=
2,9 l/min) .......................................................................................................................................- 73 Figure 9 : Photographie d’une zone d’impaction 15 heures après la collecte de conidies d’Aspergillus niger sur
lame gélosée. Observation au microscope à fond clair (X1000) ...................................................- 74 Figure 10 : Proportion de spores capables de germer selon l'âge de la culture fongique.......................................- 74 Figure 11 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’état d’hydratation de la culture (débit de
soufflage=2,9 l/min) ......................................................................................................................- 75 Figure 12 : Photographies de cultures d’Aspergillus niger réalisées en suspension liquide..................................- 76 Figure 13 : Photographies de spores d'Aspergillus niger en phase de germination réalisée au microscope optique
(x1000) et au microscope électronique à balayage (x10000) (spores impactées sur gélose) .........- 76 Figure 14 : Corrélation entre l’aire des pics et la concentration d’ergostérol (n=3) ..............................................- 77 Figure 15 : Influence de la température (de 4 à 53 °C) sur le dosage de l’ergostérol............................................- 78 Figure 16 : Effet du temps d’ultrasonication sur l’extraction de l’ergostérol à partir de spores d’Aspergillus niger ...79 Figure 17 : Effet de la concentration de matériau sur la mesure du pH.................................................................- 81 Figure 18 : Influence du broyage et du temps de contact sur la mesure du pH .....................................................- 82 -
TABLEAUX
Tableau I : Moyenne géométrique du diamètre aérodynamique et écart type géométrique des spores fongiques
aérosolisées....................................................................................................................................- 69 Tableau II : Statistique descriptive (unités arbitraires) ..........................................................................................- 78 Tableau III : Efficacité de la procédure d'extraction de l'ergostérol ......................................................................- 80 Tableau IV: Evaluation de la quantité d’ergostérol par conidie d’Aspergillus niger.............................................- 80 Tableau V : Données statistiques relatives aux essais réalisés pour évaluer la répétabilité de la mesure du pH...- 82 -
- 66 -
CHAPITRE III
MISE AU POINT DES TECHNIQUES D’ETUDES
Nos travaux de recherche nécessitent la mise au point d'outils, tant pour simuler
la contamination des surfaces par un aérosol fongique, que pour évaluer la croissance de
ces microorganismes sur les supports ou encore caractériser les propriétés des produits
de construction contaminés. Dans ce chapitre, nous étudions les caractéristiques du
bioaérosol produit et en particulier, l'influence des paramètres physiques et biologiques
du système. Nous présentons également les différentes techniques d'évaluation du
développement fongique ainsi que le protocole mis au point pour déterminer le pH des
produits de construction.
I. CARACTERISATION DU SYSTEME D'AEROBIOCONTAMINATION
A. PARAMETRES PHYSIQUES
1. Taille des bioaérosols
Dans la mesure où le comportement des particules aéroportées dépend de leur
taille, il nous faut connaître les dimensions de l'aérosol produit. Une culture pure (7
Concentration particulaire (conidies/cm3)
jours) d’Aspergillus niger est utilisée pour cette expérimentation.
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
.5
.7
1
2
3
5
7
10
20
Diamètre aérodynamique
Figure 1 : Profil granulométrique de l’aérosol d’Aspergillus niger et photographie de ses
conidies impactées sur gélose (microscope optique x400)
- 67 -
La distribution granulométrique du bioaérosol est évaluée à l’aide d'un compteur
aérodynamique (APS) (Figure 1). Nous constatons que la taille des particules
biologiques se situe entre 3 et 5 µm avec un diamètre aérodynamique moyen égal à 3,4
±0,2 µm. Nous avons complété ces mesures par une observation au microscope
électronique à balayage qui permet d’apprécier le diamètre réel de ces bioaérosols. Cette
taille est d'environ 5 µm si on estime la forme échinulée spécifique de cette moisissure
(Figure 2).
Figure 2 : Photographie d'une spore d'Aspergillus niger (MEB)
Lors des premiers essais, nous avions constaté la production d'amas ou de
chaînes de spores, désagrégés par la mise en place, en sortie du générateur, d'un
réducteur de section de 0,4 mm de diamètre (Figure 3).
A
A
B
Figure 3 : Photographie d'une zone d'impaction réalisée sur lame graissée sans (A) et avec (B) le
système de désagrégation d'amas
Nous effectuons les mêmes essais avec des cultures pures de Cladosporium
sphaerospermum et de Penicillium brevicompactum (Tableau I).
- 68 -
Espèces fongiques
dae (µm)
σg
Aspergillus niger
3,2-3,6
1,35
Cladosporium sphaerospermum
2,4-2,8
1,30
Penicillium brevicompactum
2,3-2,7
1,25
Tableau I : Moyenne géométrique du diamètre aérodynamique et écart type géométrique des
spores fongiques aérosolisées
La distribution de l'aérosol est proche de la mono dispersion pour les trois souches
(valeur des σg légèrement supérieure à 1,2). Par ailleurs, nous constatons que, ni la durée
d'incubation, de 5 à 28 jours, ni le degré d'humidité dans le montage, de 26 à 85 %
(27°C), n'affecte la taille du bioaérosol produit.
2. Stabilité de la production de l'aérosol
L'une des volontés concernant le système d'aérobiocontamination était de pouvoir
contaminer de manière reproductible et contrôlable plusieurs échantillons. Nous avons
donc estimé la stabilité de l’aérosol produit sur une durée de 15 minutes. Une souche
d’Aspergillus niger cultivée pendant 7 jours en ambiance humide est soumise à un flux
d’air sec stérile pendant 15 minutes. La cinétique de dispersion est présentée dans la
Figure 4.
spores/cm
3
10
1
0,1
0,01
0,001
0
5
10
Temps en min
15
Figure 4 : Concentration conidienne d'Aspergillus niger obtenue lors
d'une génération continue d'aérosol pour un débit d'air de soufflage de 2,9 l/min
- 69 -
Nous constatons que la concentration de l’aérosol produit se stabilise après 3 minutes à
une valeur moyenne de 2 ± 0,3 conidies/cm3 et qu’elle reste stable durant les 12 minutes
suivantes.
3. Effet de la vitesse d’air de soufflage
Pour nous permettre d’évaluer l’influence de la vitesse de soufflage sur la libération
des spores, nous utilisons trois espèces fongiques : Aspergillus niger, Penicillium
brevicompactum et Cladosporium sphaerospermum. Des cultures sèches âgées de 7
jours et incubées dans les mêmes conditions sont dispersées successivement à l’aide de
différents débits d’air de soufflage : 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4, et 5 l/min (de 4,1 à 41,5 m/s en
sortie de buse). La dispersion des spores selon la vitesse d'air est représentée sur la
Figure 5.
Aspergillus niger
10000
Penicillium brevicompactum
1000
Cladosporium sphaerospermum
Spores/cm 3
100
10
1
0,1
0,01
0
10
20
30
40
50
Vitesse d'air de soufflage (m/s)
Figure 5 : Dispersion des spores d’Aspergillus niger, Penicillium brevicompactum et
Cladosporium sphaerospermum selon la vitesse d’air de soufflage (n = 7).
Comme attendu, la concentration de spores aéroportées augmente avec la vitesse de l’air
de soufflage. La dispersion observée dépend également de la souche fongique
considérée, la culture d’Aspergillus niger nécessitant une vitesse d’air moindre par
rapport à Cladosporium sphaerospermum ou Penicillium brevicompactum. En effet,
pour aérosoliser une concentration de 1 spore/cm3, la vitesse de soufflage nécessaire est
égale à 4; 17 et 21 m/s pour, respectivement, Aspergillus niger, Cladosporium
sphaerospermum et Penicillium brevicompactum. Dans un environnement intérieur, à
niveau de contamination équivalent (hors sources extérieures), nous pouvons supposer,
- 70 -
que des prélèvements atmosphériques révèleront une concentration plus importante en
Aspergillus qu'en Penicillium ou Cladosporium. Aussi, pour caractériser au mieux la
contamination d'un local, les techniques de prélèvement d'air devraient s'accompagner
d'un examen des surfaces contaminées avec identification des espèces présentes.
4. Contamination des surfaces
Nous réalisons cette contamination à l'aide d'un impacteur placé à la base de la
chambre d'homogénéisation. Nous avons modifié les caractéristiques de ce collecteur de
manière à pouvoir contaminer simultanément 5 échantillons. La dispersion entre les
zones d’impaction d’un même échantillon a été évaluée par observation microscopique
du support contaminé. Le dénombrement des spores est réalisé, à l’aide d’un système
d’analyse d’images, sur 10 zones choisies aléatoirement sur la surface. La dispersion
observée entre les spots est d'environ 15%.
De manière à contrôler l’aérobiocontamination des surfaces, nous relions également la
concentration du bioaérosol produit avec le degré de contamination des surfaces. Nous
employons comme surface de référence une lame de verre graissée. Ce support permet
de limiter les phénomènes de rebond et de bioadhésion spécifique. Nos résultats sont
présentés Figure 6. Dans l’intervalle de concentration testé, on note une relation linéaire
Concentration de spores sur la surface
4
2
(10 part/mm )
entre les mesures aériennes et surfaciques (r² égale 0,97).
3
[conidies/mm2]prélevées =[1,9. [conidies/cm3]aérosolisées + 0,14].104
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Concentration de spores aéroportées (part/cm3)
Figure 6 : Concentration de spores d'Aspergillus niger impactées sur lame graissée en fonction
de la concentration particulaire aérosolisée
Selon le degré d’aérobiocontamination des surfaces désiré, nous utilisons deux
procédures : la génération continue ou interrompue.
- 71 -
Nous l’avons vu (Figure 4), la technique de génération en continu permet d’atteindre une
concentration stable d’aérosol sur une période de 12 minutes. Toutefois, la concentration
élevée obtenue en permanence ne convient pas pour l’ensemble de nos expérimentations
et l’utilisation d’une dilution importante ou d’un temps de collecte réduit, de manière à
la limiter, augmentent considérablement l’incertitude. La deuxième procédure adoptée
utilise la décroissance de la concentration particulaire au cours du temps. Après avoir
atteint une concentration comprise entre 10 et 15 part/cm3, la génération est stoppée et
remplacée par un air filtré de débit identique. Sur la Figure 7 est représentée la cinétique
de décroissance moyenne utilisée. Le calcul de l’intégrale de cette décroissance
exponentielle permet d’atteindre simplement et précisément le niveau de contamination
souhaité.
Figure 7 : Décroissance conidienne d'Aspergillus niger
Cette procédure permet ainsi de réaliser une large gamme de concentrations selon le
moment auquel nous procédons au prélèvement et sa durée. Par exemple, une impaction
de 1 minute réalisée entre 400 et 460 secondes permet de collecter en moyenne 76
particules biologiques.
B. PARAMETRES BIOLOGIQUES
1. Effet de l’âge de la culture sur la dispersion
Nous évaluons l’impact de la durée d’incubation des moisissures sur leur propension
à être aérosolisées, en utilisant une même culture hydratée d'Aspergillus niger après 5, 7,
14, 21 et 28 jours d’incubation. La concentration du bioaérosol produit est mesurée pour
- 72 -
chaque essai. Nous représentons dans la Figure 8 les différents profils de dispersion
obtenus.
Entre 5 et 15 minutes de génération, deux niveaux de concentration sont ainsi mis en
évidence : la concentration moyenne de l’aérosol produit à partir des cultures âgées (14,
21 et 28 jours) est 10 fois plus importante que pour les cultures jeunes (5 et 7 jours). Les
structures mycéliennes âgées seraient plus aisément dispersées. Cette différence est
probablement liée à la dégénérescence des structures fongiques au cours du temps,
phénomène vraisemblablement rencontré dans les environnements intérieurs sur les
surfaces contaminées.
Figure 8 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’âge de la culture (débit
d'air de soufflage= 2,9 l/min)
2. Impact de l’aérosolisation sur la germination
Outre la concentration produite, nous étudions l'effet de la durée d'incubation sur la
capacité des spores aérosolisées à se développer. Ainsi, nous contaminons des lames de
verre gélosées avec la même culture d'Aspergillus niger après 7; 14; 21 et 28 jours
d'incubation (Figure 9 et Figure 10).
- 73 -
Mycélium en
croissance
Conidies en phase de
germination
Conidie inactive
Figure 9 : Photographie d’une zone d’impaction 15 heures après la collecte de conidies
d’Aspergillus niger sur lame gélosée. Observation au microscope à fond clair (X1000)
100
Conidies germant (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
7 jours
14 jours
21 jours
28 jours
Age de la culture
Figure 10 : Proportion de spores capables de germer selon l'âge de la culture fongique
Une baisse de la capacité à se développer pour les cultures les plus âgées est clairement
mise en évidence (Figure 10) : après 7 jours d'incubation, la biomasse active est proche
de 85% et n’est plus que de 60% après 28 jours. De manière à standardiser et optimiser
la procédure d’aérobiocontamination, nous utiliserons une culture âgée de 7 jours.
Au vu de nos résultats, on peut supposer que la proportion de spores aérosolisées
susceptibles de croître est probablement sur estimée dans les études utilisant la culture
comme technique de dénombrement (Verhoeff et al, 1992; Madelin, 1995).
3. Effet de l’état d’hydratation de la culture
Pour évaluer l’influence de l’état d’hydratation des cultures sur la libération des spores,
nous utilisons deux cultures d’Aspergillus niger de 7 jours, l’une étant maintenue
- 74 -
pendant 24 heures à proximité d’un gel de silice (assèchement de la culture), l’autre
bénéficiant d’une ambiance saturée en eau. Nos résultats sont présentés Figure 11.
Des concentrations moyennes de 2 et 450 spores/cm3 sont mesurées respectivement pour
les cultures humide et sèche. L’état d’hydratation de la culture aurait un effet sur la
libération des spores. L’eau est nécessaire à la croissance des moisissures et la
déshydratation semble favoriser leur libération. Dans les environnements intérieurs, ce
phénomène favoriserait la prolifération et la dissémination des spores vers des substrats
riches en eau plus propices à leur croissance. Nous choisissons de standardiser notre
technique de production de l'aérosol en séchant les cultures fongiques pendant les 24
heures précédant l'aérosolisation.
Figure 11 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’état d’hydratation de
la culture (débit de soufflage=2,9 l/min)
II. SUIVI DE LA CROISSANCE FONGIQUE
Comme nous l’avions évoqué dans la synthèse bibliographique, le développement
fongique est le fruit de différentes étapes spécifiques : la germination, la croissance des
hyphes, et enfin la sporulation. Pour appréhender le comportement des moisissures sur
les matériaux, nous avons été amenée à mettre en œuvre et valider différents protocoles
d’évaluation : de l’observation macroscopique qualitative à l’approche moléculaire.
A. DETERMINATION DE LA CROISSANCE EN MILIEU AQUEUX
La première approche consiste à évaluer qualitativement l'effet des nutriments (rapport
carbone sur azote) et du pH sur le développement fongique. Pour ce faire, une même
quantité de spores d'Aspergillus niger est ajoutée à un volume constant de solution
- 75 -
nutritive et la croissance est évaluée macroscopiquement après une semaine
d’incubation.
0
1
2
Figure 12 : Photographies de cultures d’Aspergillus niger réalisées en suspension liquide
Les résultats de croissance observés (Figure 12), nous permettent d’ordonner le
développement selon 3 catégories : pas de croissance (0); colonisation visible (1) et
développement important (2). Cette première méthode de tests rapides pourra être
employée pour orienter le choix des variables (nutriments et pH).
B. ESTIMATION DU TEMPS D’ADAPTATION DES MOISISSURES AUX SUBSTRATS
Une fois en contact avec un matériau (propice à son développement), la spore va utiliser
plus ou moins rapidement les nutriments constitutifs de ce substrat. Elle devra ainsi
s’adapter à ce nouvel environnement. Le temps spécifique nécessaire à cette
accoutumance correspond à l’étape de germination. Nous avons assimilé cette durée au
moment où le premier hyphe émerge de la cellule (Figure 13).
Conidies en cours
de germination
Figure 13 : Photographies de spores d'Aspergillus niger en phase de germination réalisée au
microscope optique (x1000) et au microscope électronique à balayage (x10000) (spores
impactées sur gélose)
- 76 -
Cette période d’adaptation est comprise entre 8 et 59 heures pour respectivement le
substrat le plus favorable (milieu de culture) et le milieu le plus défavorable (support
basique ayant un rapport carbone sur azote faible) au développement du
microorganisme. Nous constatons que, malgré des conditions de culture bien maîtrisées,
la germination des spores est asynchrone, phénomène déjà constaté par Bosch en 1995.
Des observations microscopiques horaires permettent de déterminer que le laps de temps
nécessaire à la germination de toutes les spores capables de se développer est de 4
heures.
C. MESURE
DE
LA
BIOMASSE
AU
SEIN
DES
MATERIAUX
:
DOSAGE
DE
L’ERGOSTEROL
1. Mise au point et validation de la technique analytique
Nous réalisons une gamme étalon de solutions d'ergostérol de concentrations croissantes
comprises entre 0 et 10 mg/l. La relation entre l’aire des pics et la concentration en
ergostérol injectée est représentée sur la Figure 14.
25
Aire des pics
(Unités arbitraires)
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
Concentration d'ergostérol (mg/l)
Figure 14 : Corrélation entre l’aire des pics et la concentration d’ergostérol (n=3)
La relation entre ces deux paramètres est linéaire :
[Aire] = 23382[Ergostérol ] + 485
avec un coefficient de corrélation r² de 0,99.
La dispersion de la mesure est calculée à partir de 31 manipulations réalisées de façon
identique. La concentration de la solution étalon d'ergostérol utilisée est égale à 6 mg/l
(Tableau II).
- 77 -
Moyenne
144265,5
Ecart-type
1108,5
Minimum
141236
Maximum
146662
Nombre d'échantillons
31
Tableau II : Statistique descriptive (unités arbitraires)
Il est admis qu’une méthode est répétable lorsque le rapport de l’écart type à la moyenne
est faible. Le coefficient de variation calculé, inférieur à 1 %, apparaît satisfaisant.
Par ailleurs, en utilisant des solutions d'ergostérol de concentration décroissante à partir
de 1 mg/l, nous pouvons évaluer la limite de quantification. Elle est égale à 40 ± 5 ng/l
(n=35, coefficient de variation de 13%).
2. Mise au point de l'étape d'extraction
L'extraction de la molécule d'ergostérol des parois cellulaires fongiques implique de
soumettre l'éprouvette à doser à une phase de sonication en présence de méthanol, durant
laquelle la température du bain peut atteindre 53°C.
a) Effet de la température
Des filtres, sur lesquels 2 µg d’ergostérol commercial sont déposés, sont conservés
pendant 45 minutes à différentes températures comprises entre 4 et 53°C. Les quantités
d’ergostérol dosées pour chaque filtre sont reportées sur la Figure 15.
Figure 15 : Influence de la température (de 4 à 53 °C) sur le dosage de l’ergostérol
- 78 -
Les valeurs obtenues varient de 1,8 à 2,05 µg. La quantité d'ergostérol dosée est quasi
identique à celle initialement déposée sur chaque filtre : la température, entre 4 et
53 °C, n'a donc pas d'effet sur le dosage de la molécule.
b) Effet du temps de sonication
Plusieurs filtres sont contaminés simultanément avec une quantité identique de spores
d'Aspergillus niger. Ces supports sont ensuite immergés dans du méthanol et soumis à
l'ultrasonication pendant une durée variant de 0 à 75 minutes. Les quantités d'ergostérol
dosées sont reportées dans la Figure 16.
Nous constatons que l’étape de trempage dans le méthanol est déterminante. Elle permet
d’extraire, à elle seule, 60% de l’ergostérol accessible par cette technique. L’effet du
temps de sonication diffère très peu entre 15 et 75 minutes. Pour la suite de nos
expériences, nous choisissons une durée de sonication égale à 45 minutes.
Figure 16 : Effet du temps d’ultrasonication sur l’extraction de l’ergostérol à partir de spores
d’Aspergillus niger
c) Rendement de la technique
Plusieurs filtres, préalablement conditionnés en nutriments et en pH, sont simultanément
contaminés via un aérosol d’Aspergillus niger. Les éprouvettes sont mises à incuber
dans une enceinte d'humidité relative proche de 100%, à 25°C, dans l’obscurité. Une fois
la sporulation observée, les filtres sont traités simultanément. Chaque filtre subit 3 cycles
extraction - dosage. Les concentrations d'ergostérol obtenues après chaque cycle sont
reportées dans le Tableau III.
- 79 -
Concentration d’ergostérol
(µg/ filtre)
Filtre 1
1ère
extraction
2,285
2ème
extraction
0,463
3ème
extraction
0,093
4ème
extraction
0
Filtre 2
2,609
0,520
0,17
0
Filtre 3
2,122
0,391
0,096
0
Tableau III : Efficacité de la procédure d'extraction de l'ergostérol
Nos résultats montrent que 3 sonications sont nécessaires pour doser la quasi totalité de
l’ergostérol accessible. Toutefois, la première extraction permet déjà de récupérer de 79
à 81% de l’ergostérol total dosé. Nous avons donc choisi de procéder à une seule
extraction lors du traitement des prochains échantillons.
3. Quantité d'ergostérol par spore
Nous avons préparé une suspension de spores d’Aspergillus niger de concentration
connue et ensemencé un filtre avec un volume connu de cette solution puis réalisé
l’ensemble du protocole de dosage. Les résultats obtenus sont présentés dans le
Tableau IV.
Nombre de conidies
Quantité d’ergostérol par
conidie (pg)
3,450.106
0,04
3,800.106
0,042
6,275.106
0,034
10,375.106
0,036
Tableau IV: Evaluation de la quantité d’ergostérol par conidie d’Aspergillus niger
La quantité d’ergostérol contenue dans une spore d’Aspergillus est de 0,038 pg (σ =
0,004 pg), Ce résultat est conforme aux résultats de la littérature. En effet, Miller en
1997 trouve, avec le même champignon, une valeur de 1,71 ± 20 pg d'ergostérol par
conidie.
D. MESURE DU PH DES PRODUITS DE CONSTRUCTION
Les méthodes préconisées par les différentes normes relatives à la mesure du pH de
l'extrait aqueux de divers produits (NF EN ISO 1264, 1997; NF EN ISO 4045, 1998; NF
EN 1245, 1999…) ont pour inconvénient d'être spécifiques aux matériaux considérés.
- 80 -
Toutefois trois étapes sont récurrentes : mise en solution du produit, broyage de la
matière et mesure du pH après un temps de contact défini. Nous avons optimisé le
protocole en l'appliquant à différents produits.
L'influence de la concentration de matière sur la mesure du pH est étudiée sur des
échantillons de dalle de plafond acoustique. Nos résultats sont reportés sur la Figure 17.
8
7
pH
6
5
4
3
2
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
Concentration en matériau (g/l)
Figure 17 : Effet de la concentration de matériau sur la mesure du pH
Nous constatons que le pH augmente avec la quantité de matériau broyé. Toutefois à
partir d'une concentration en matériau égale à 7 g/l, le pH est quasiment constant.
Compte tenu du faible niveau de désagrégation de certains produits, nous choisissons,
par commodité, de travailler avec une concentration massique de 10 g/l.
Nous évaluons également les effets du broyage et du temps de contact sur la mesure du
pH. Cette dernière est réalisée dans deux solutions de dalle de plafond acoustique à la
concentration massique prédéfinie. Dans un cas la matière est broyée pendant 30
secondes. Le pH des deux solutions, avec et sans broyage, est mesuré après 1; 3; 10; 20;
30; 60 et 120 minutes. Une mesure de contrôle est réalisée après 24 heures de contact
(Figure 18). Les deux milieux sont soumis à une agitation permanente durant toute
l'expérimentation.
- 81 -
6,6
6,4
Sans broyage
Avec broyage
6,2
pH
6,0
5,8
5,6
5,4
5,2
0
50
100 1200
120
Temps de contact (min)
1400
Figure 18 : Influence du broyage et du temps de contact sur la mesure du pH
La mesure réalisée après 2 heures de contact révèle une différence de l'ordre de 1 unité
pH en faveur de la solution dont le matériau a été broyé. Cet écart est probablement dû
au fait que le broyage a libéré les composants acido-basiques du matériau.
Nous constatons qu’entre 2 et 24 heures de contact, le pH n’évolue quasiment pas, que le
matériau soit broyé ou non, aussi avons-nous finalement retenu un temps de contact de 2
heures avec des matériaux préalablement broyés pour l’ensemble des essais.
Nous évaluons la répétabilité de notre méthode à partir de 15 essais réalisés de façon
identique sur une plaque de plâtre. Les données statistiques relatives à nos essais sont
reportées dans le Tableau V.
Moyenne
7,3
Écart-type
0,0655
Minimum
7,2
Maximum
7,4
Coefficient de variation (%)
0,9
n
15
Tableau V : Données statistiques relatives aux essais réalisés pour évaluer la répétabilité de la
mesure du pH
Compte tenu de la valeur du coefficient de variation, proche de 1 %, notre méthode peut
donc bien être considérée comme répétable.
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Nous éprouvons notre technique en l’appliquant à un matériau test conditionné avec une
solution nutritive tamponnée (cf. Chapitre II). Le pH mesuré correspond effectivement à
celui attendu, à savoir le pH du tampon.
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