Prédisposition Génétique aux maladies infectieuses chez l

EVIDENCE POUR LE ROLE DE FACTEURS GENETIQUES
OBSERVATIONS EPIDEMIOLOGIQUES
Prédisposition Génétique
aux maladies infectieuses chez l’homme;
L’exemple des infections mycobactériennes
Grande variabilit é individuelle de réponse à un agent infectieux
Concentration familiale (rôle des facteurs environnementaux)
Ressemblance ethnique
Etudes de jumeaux (MZ vs. DZ)
MODELES EXPERIMENTAUX
Contrôle infection, facteurs de milieu
Utilisation souris congéniques, recombinantes, KO
Un gène (chromosome 1) contrôle la résistance naturelle à l’infection par
Leishmania donovani, Mycobacterium lepraemurium...
→ Nramp1 (Natural resistance associated macrophage protein)
METHODES DE RECHERCHE CHEZ L’HOMME
Facteurs microbiens
(virulence…)
→ GENETIQUE MENDELIENNE
MALADIE
- Atteint/non atteint
- Formes sévères
- Age de survenue
INFECTION
- Sero+/Sero- Niveaux infection
AGENT
INFECTIEUX
REPONSE IMMUNITAIRE
- Anticorps/Cytokines…
- Réponses cellulaires…
Facteurs
d’exposition
Facteurs de risque
environnementaux
MARQUEURS GENETIQUES
5’
→ GENETIQUE EPIDEMIOLOGIQUE
• Phénotypes communs (tuberculose pulmonaire, lèpre…)
- sur de grands échantillons (populations/familles)
- combinant: . information épidémiologique (facteurs environnementaux)
. information génétique (liens familiaux, marqueurs)
Facteurs de l’hôte
(gènes, âge…)
R156H
(467G>A)
• Phénotypes rares et sévères (infection mycobactérienne disséminée)
- sur de petits échantillons (patients/familles)
- pour identifier les mutations causales
MENDELIAN AND COMPLEX INHERITANCE
HYPOTHESIS- DRIVEN APPROACH
3’
ANIMAL MODELS
(forward/reverse genetics..)
-111A>T
387G>C
+21C>A
684C>T
(CA)n
Marqueurs microsatellites
- répétitions de bases (di, tri, tetranucleotides...) → très polymorphiques (5-15 allèles)
- le plus souvent extrag éniques (rôle inconnu)
- plusieurs milliers décrits sur l'ensemble du génome
→ analyse de liaison génétique (linkage)
Polymorphismes mononucléotidiques: SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
- peu polymorphique (2 allèles)
- extrag éniques ou intrag éniques (rôle neutre ou fonctionnel)
- probablement plusieurs millions.
→ analyse d'association (SNP intrag éniques)
HUMAN DATA
(in vitro, medical …)
GENOME -WIDE APPROACH
LINKAGE STUDY DIFFERENTIAL EXPRESSION
(model-based, model-free)
(microarrays…)
CANDIDATE
GENES
MUTATION
DETECTION
‘RARE’
VARIANTS
‘COMMON’
POLYMORPHISMS
ASSOCIATION STUDIES
- Population-based (Case/controls)
- Family-based (TDT)
FUNCTIONAL STUDIES
- Analysis of cellular phenotypes
- Studies of wild-type and mutant RNA and/or protein
- Molecular complementation in vitro and/or in vivo
1
PREDISPOSITION MENDELIENNE
AUX INFECTIONS MYCOBACTERIENNES
• Infections disséminées par des mycobactéries environnementales ou BCG
Mycobacteria
IL12
p35 IL12Rβ 1
p40 IL12Rβ 2
• Pas de déficit immunitaire connu
IFNγR 1
• Rares (10-5 – 10-6 ) mais caractère familial fréquent (consanguinité )
STAT1
IFNγ
IFNγR 2
1
γR
IFN
2
γR
IFN
• Cinq gènes identifiés jusqu’à présent (immunité IL12 – IFNγ)
Macrophage/Dendritic cell
• Forte corrrélation entre la sévérité des manifestations cliniques et la sévérité
du déficit génétique
T Lymphocyte/ NK Cell
Infectious diseases in IL-12Rβ1 deficiency
among 29 probands and 12 affected siblings
1.0
Infection free
Déficits en
IFNγR1
Hérédité
Expression en surface
Fixation de l’IFN γ
Défaut de signalisation
AD
+++
+
AR
+
+/-
AR
+
-
AR
-
tot (n=34)
bcg (n=18)
0.8
sal (n=21)
em (n=8)
0.6
Non MSMD (n=7):
-asymptomatic (n=5)
-tuberculosis (n=2)
0.4
0.2
0.0
Partiel Partiel Complet Complet
0
2
4
6
8
10
12
14
16
years
ANALYSE DE LIAISON GENETIQUE: PRINCIPES
MENDELIAN AND COMPLEX INHERITANCE
HYPOTHESIS- DRIVEN APPROACH
ANIMAL MODELS
(forward/reverse genetics..)
HUMAN DATA
(in vitro, medical …)
GENOME -WIDE APPROACH
LINKAGE STUDY DIFFERENTIAL EXPRESSION
(model-based, model-free)
(microarrays…)
Tester si des apparentés avec une ressemblance phénotypique (ex. malades) partagent
plus d’allèles hérités d’un ancêtre commun qu’attendu du fait de leur lien de parenté
Une approche classique: méthode des paires de germains (sib-pairs)
AB
CANDIDATE
GENES
CD
Basée sur les allèles parentaux partagés
identiques par descendance (IBD)
MUTATION
DETECTION
‘RARE’
VARIANTS
‘COMMON’
POLYMORPHISMS
ASSOCIATION STUDIES
- Population-based (Case/controls)
- Family-based (TDT)
FUNCTIONAL STUDIES
- Analysis of cellular phenotypes
- Studies of wild-type and mutant RNA and/or protein
- Molecular complementation in vitro and/or in vivo
AC
IBD=2
AC
AD
IBD=1
BC
IBD=0
Distribution attendue pour une paire de germains
IBD = 2 : 0.25
IBD = 1 : 0.5
IBD = 0 : 0.25
Phénotype clinique: méthode des paires de germains malades
→ Recueil d’un échantillon de paires de germains malades avec leurs valeurs IBD
→ Liaison quand excès d ’allèles IBD partag és par des germains malades
2
ETUDES D’ASSOCIATION : PROTOCOLES
ETUDES D’ASSOCIATION : INTERPRETATION
Essentiellement dans une stratégie de gènes candidats
ex: étude de polymorphismes mononucléotidiques → SNP avec 2 allèles : A, G
Interprétation d’une association positive entre une maladie et un allèle A:
- A est l’allèle délétèr e D (variant fonctionnel) impliqué dans la maladie
Etudes en populations:
→ Etudes cas/témoins comparant la distribution de A entre malades et témoins.
G/A
Etudes en familles:
Evite les problèmes liés au choix des témoins ou à des stratifications de population
D/d
-Déséquilibre de liaison (LD) entre A et D
. Liaison étroite entre le locus marqueur et le locus maladie (dans le même gène)
. ET A est préférentiellement associé à D [freq(A -D) > freq(A)xfreq(D) ]
Exemple: Test de Déséquilibre de Transmission (Spielman et al, Am J Hum Genet, 1993)
AG
GG
AG
AG
GG
Si A est le variant fonctionnel D ou
est en déséquilibre de liaison avec D,
il aura été transmis de parents AG à leurs
enfants malades avec une probabilité ≠ 0.5
GG
pas de LD
LD complet (fA>f D)
LD complet (fA=f D)
A-D
A-d
G-D
fA x fD (0.005)
fA x fd (0.095)
fG x fD (0.045
fD (0.05)
fA-f D (0.05)
0
fA=fD
0
0
G-d
fG x fd (0.855)
fG (0.9)
fG=fd
ex. fA=0.1, fD = 0.05
ETUDES D’ASSOCIATION : INTERPRETATION
TUBERCULOSE
Number of family trios
Marker allele frequency = 0.1
→ Puissance très dépendante:
- importance du déséquilibre
- fréquences de A et D
100000
10000
0.5 LDmax
0.75 LDmax
1000
100
0.0
LDmax
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Functional allele frequency
- Stratification de populations (mélange de populations avec ≠ fréquences alléliques et
≠ fréquences de maladie) → Intérêt des études basées sur des familles
- Problème tests multiples
GENETIQUE ET TUBERCULOSE
Pays avec une incidence > 0.001 en 1999
• 8 millions nouveaux cas et 1.9 millions décès par an
• ~ 90% des sujets infectés ne développent pas la maladie
TUBERCULOSIS AND IL12RB1
Il existe des cas de tuberculose mendélienne
- 3 cas avec défaut complet de IL12RB1
- 1 cas avec défaut partiel de IFNGR1
Family-based association study in Morocco:
→ 101 families including 157 offspring >15 years old with PTB (culture +)
Un seul criblage complet publié (Tuberculose pulmonaire):
85 paires provenant de Gambie, 88 d’Afrique du Sud (Bellamy et al, PNAS, 2000)
→ Deux régions avec suggestion de liaison (p ~ 10-3 ) : 15q and Xq
Strategy:
- Sequencing of promoter , exons and flanking intron regions in 40 patients
→Search for null mutations and common polymorphisms >5%
Approches gène candidat:
- HLA
- IL12RB1
- NRAMP1
- autres ….
- Genotyping of common polymorphisms in the whole sample
→ Test for association with PTB
3
TUBERCULOSIS AND IL12RB1
R156H
Q214R
(467G>A) (641A>G)
I
5’
II
III
IV
V
VI
IL12RB1
M365T G378R
(1094T>C) (1132G>C )
VII VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV XV
XVI XVII
Association with two promoter polymorphisms in strong LD
-especially in the families of Arabic origin (p<0.004 for -2C>T)
3’
- frequency of the T allele ~ 0.10
- Odds ratio for CT or TT vs. CC = 3.80[1.62-10.19]
-111A>T -2C>T
387G>C
+21C>A
684C>T
+46T>C
+24C>T
+47G>T +34C>T
- T is an uncommon allele at position –2 (consensus site)
→ Functional studies
Lèpre - Epidémiologie
ETUDES DE LIAISON : TUBERCULOSE - NRAMP1
NRAMP1: Homologue humain du gène murin Nramp1
Etude par analyse modèle-dépendante (lod -score classique) d’une grande famille
d’amérindiens Canadiens (67 membres, 24 TB) après une épidémie:
→ Liaison significative (p ~ 10-5 ) avec la région NRAMP1 (Greenwood et al. AmJ Hum Genet, 2000) :
- allèle dominant (0.05) prédisposant à la tuberculose avec un risque relatif de 10
- pénétrance dépend de l’âge, exposition,vaccination
- pas de d émonstration du rôle direct de NRAMP1
~ 700,000 nouveaux cas par an
LEPRE
Très grande variabilité de réponse à l’infection par M. leprae
Lèpre - Epidémiologie
10
0
1984
1988
1992
1996
2000
Incidence = pré
prévalence
Transmission ?
1995
2000
Ne
pa
l
Mo
zam
biq
ue
20
60
50
40
30
20
10
0
Ma
da
ga
sc
ar
Prevalence
Incidence
Br
az
il
My
an
ma
r
cases per 100,000
50
40
30
Incidence 6 pays endé
endémiques
Ind
ia
ceses per 10,000
Incidence et pré
prévalence en Inde
Clinical threshold
Nouvelles approches
n écessaires
D’après Gentilini et Duflo
Duflo,, Médecine Tropicale, Flammarion Médecine -Sciences
4
Criblage du génome - Echantillon
MENDELIAN AND COMPLEX INHERITANCE
HYPOTHESIS- DRIVEN APPROACH
GENOME -WIDE APPROACH
HUMAN DATA
(in vitro, medical …)
ANIMAL MODELS
(forward/reverse genetics..)
86 familles multiplex
LINKAGE STUDY DIFFERENTIAL EXPRESSION
(model-based, model-free)
(microarrays…)
CANDIDATE
GENES
# enfants
atteints
2
3
4
5
# familles
63
15
6
2
MUTATION
DETECTION
‘RARE’
VARIANTS
‘COMMON’
POLYMORPHISMS
Type de l èpre
ASSOCIATION STUDIES
- Population-based (Case/controls)
- Family-based (TDT)
PB
MB
FUNCTIONAL STUDIES
- Analysis of cellular phenotypes
- Studies of wild-type and mutant RNA and/or protein
- Molecular complementation in vitro and/or in vivo
Criblage du génome - Design
Criblage du génome – Fine mapping
• Carte primaire:
• 89 microsatellites supplé
supplémentaires dans les 8 régions
– 388 microsatellites (CHLC screening set)
– Distance interinter-marqueurs ~ 10 cM
• Information content > 0.95
• Méthode MLB:
Modèle
Modè
le--ind
indéépendante
Orientéée fratrie
Orient
Distribution asymptotique valide
Statistique de test = lod score
8 regions pp -value < 0.01 (lod
(lod score > 1.18)
Genome--scan - fine mapping 6q25
Genome
LD mapping - Echantillon
197 familles simplex
5
Type de l èpre
4
3
PB
MB
2
LD mapping
1
3 cM
D6S1599
D6S955
D6S305
x
D6S1590
x
D6S503
D6S1027
x
D6S1277
D6S1273
xx
D6S1550
x
D6S253
x
D6S415
x x x
D6S1579 D6S1614
x
D6S1035
x
D6S476
D6S2420
D6S2436
0
GATA184A08
D6S1654
Lod Score
–
–
–
–
64 SNPs informatifs
(≥ 1 / g ène connu
connu))
5
⇑ densité
densit é
snps
LD MAP
Bloc B
PARK2 intron 1
PACRG intron 1
PARK2 exon 1 PACRG exon 1
p < 0.05
not significant
Bloc B
Analyse
multivariée
SNP1
SNP2
Snp 1
Snp 2
C
C
PARK2 intron 1
C
T
T
T
C
T
C
T
OR*
CI 95%
P- value
1.00
-
-
3.23
[1.34 - 7.82]
0.009
5.28
[2.06 - 13.55]
0.0005
T
T
PACRG intron 1
PARK2 exon 1 PACRG exon 1
T
C
C
T
T
T
T
C
* Estimé par régression logistique conditionnelle
6
Etude de réplication au Brésil
Marker
587 cas – 388 contrôles
Même distribution ethnique
Type de lè
l èpre
PB
MB
13 SNPs significatifs
Vietnam
Brazil
Risk allele
p-value
Risk allele
rs2803104
A
0.011
-
p-value
ns
10Kb_5_2
T
0.013
T
0.008
e01(-697)
G
0.013
G
0.0002
SNP 1
T
0.0006
T
0.0006
e01(-3024)
C
0.029
-
ns
e01(-3800)
G
0.001
G
0.003
28Kb_2_1
T
0.017
-
ns
28Kb_4_1
A
0.002
A
0.0009
rs1514343
T
0.03
T
0.023
rs1333955
C
0.0007
C
0.016
SNP 2
C
0.004
C
0.0002
40Kb_F60
A
0.034
A
0.015
40Kb_F706
G
0.017
-
ns
Analyse
Multivariée
0.0000005
PARK2 - Ubiquitin Protein E3 Ligase
PARK2 / PACRG
PARK2
PACRG
1.4 Mb - 12 exons - 465 AA
0.5 Mb – 6 exons – 257 AA
Shared regulatory region
Ubiquitin Protein E3 Ligase
(Synphilin 1 / Pael
Pael--R / α -synuclein
synuclein//
CyclinE ..)
Linked to ubiquitin
ubiquitin-proteasome sytem
Juvenile Parkinson AR
?
Giasson and Lee, Neuron, 2001
Conclusion Lè
Lè pre
• 1er clonage positionnel dans une maladie infectieuse commune
Prédisposition génétique aux mycobactéries → un spectre continu?
1) Mutations rares à pénétrance quasi complète
- bases moléculaires établis
- corrélation génotype/phénotype
• Nouveau pathway
pathway:: ubiquitination
ubiquitination/d
/déégradation proté
protéique
• Lien maladies infectieuses – maladies neurod
neurodéégén ératives ?
→ Etudes fonctionnelles
2) Polymorphismes fréquents avec effets modérés (RR ~2-4):
- validation du rôle causal difficile
- effet important au niveau de la population
3) Situation intermédiaire: effet gène majeur (RR ~10):
- dans des populations particulières (isolée, sans long passé d’exposition…)
- pour des phénotypes spécifiques (formes sévères…)
→ Rôle d’un même gène dans les différentes situations?
→ Importance d’une recherche combinant les différentes approches
7
Génétique Humaine des Maladies Infectieuses, INSERM U550, Paris, France
Alexandre Alcaïs
Stéphanie Dupuis
Claire Fieschi
Emmanuelle Jouanguy
Capucine Picard
Natascha Remus
Laurent Abel
Jean -Laurent Casanova
Laboratoire d ’Immunologie, Hôpital Militaire de Rabat, Maroc
Jamila El Baghdadi
Abdellah Benslimane
Marcelo Mira
McGill University, Montreal, Canada
Tom Hudson
Erwin Schurr
Hospital of Dermato
Dermato--Veneorology
Veneorology,, Ho Chi Minh City, Vietnam
Nguyen Thuc
Minh Phuong
Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz
Fiocruz,, Rio de Janeiro, Brazil
Milton Moraes
8