Activité antivirale des protéines de lactosérum estérifiées.

Activité antivirale des protéines de
lactosérum estérifiées.
Jean-Marc Chobert et Thomas Haertlé
INRA BIA-FIPL, Nantes, France
ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
Le lait
Protéines
de vache
Lait écrémé
pH=4,6
centrifugation
Caséines
Lactosérum
caséine αs1
caséine β
caséine κ
caséine αs2
β-lactoglobuline
α-lactalbumine
…
ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
9 La β-lactoglobuline, protéine
majeure du lactosérum, est une
protéine globulaire, résistante à la
protéolyse par la pepsine
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ENVIRONNEMENT
Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline
Masse du monomère : 18,4 kDa, 8 feuillets, β tonneau, 1 hélice α, 5 cystéines – 2
ponts SS, fixation de molécules hydrophobes, dimérique au pH du lait (6,8)
ALIMENTATION
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ENVIRONNEMENT
9 Dans leurs structures
primaires, les protéines du lait
renferment de nombreux
peptides actifs, libérés par
protéolyse
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Quelques exemples de peptides bio-actifs issus des protéines
laitières.
Peptides
Protéines de départ
Type de bio-activité
Casomorphines
caséines α et β
Agoniste opioïde
α-lactorphine
α-lactalbumine
Agoniste opioïde
β-lactorphine
β-lactoglobuline
Agoniste opioïde
Lactoferroxines
Lactoferrine
Antagoniste opioïde
Casoxines
caséine κ
Antagoniste opioïde
Casokinines
caséines αs1 et β
Anti-hypertension
Casoplatelines
caséine κ
Anti-hypertension
Caséinomacropeptide
caséine κ
Anti-thrombique
Immunopeptides
caséines α et β
Immunostimulant
Lactoferricine
Lactoferrine
Transport de minéraux
Phosphopeptides
caséines α et β
Transport de minéraux
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ENVIRONNEMENT
9 Trouver des moyens de
rendre la BLG hydrolysable par
la pepsine afin de produire des
peptides présentant une
activité biologique
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ENVIRONNEMENT
Réaction d’estérification
R-COOH + EtOH / MetOH
RCOOEt/Met
HCl
9Protéines amphiphiles
9Protéines « basifiées »
9Interactions avec des charges négatives
9Interactions avec des acides nucléiques
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De simples modifications des protéines laitières α-lactalbumine
et/ou β-lactoglobuline génèrent à peu de frais des protéines
chargées positivement.
Rouge - Charges négatives
Bleu - Charges positives
+ CH3OH
ou CH3CH20H
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ENVIRONNEMENT
Isoélectrofocalisation
1
2
3
4
5
6
7
3.50
3.75
4.55
5.20
5.85
6.55
6.85
7.35
8.15
8.45
8.65
9.30
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AGRICULTURE
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8
Hydrolyse
pepsique de la
BLG en milieu
hydroéthanolique
„ 0%
† 20%
¡ 25%
‘ 30%
S 35%
U 40%
ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
Diversified and amplified peptide libraries produced by
combination of chemical modifications and proteolysis.
"Procédé d'obtention de populations peptidiques nouvelles. Produits obtenus." Jean-Marc Chobert, Loïc
Briand et Thomas Haertlé, French Patent N° 93 15764. P.C.T.World extension N° 94 01500.
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ENVIRONNEMENT
ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
Influence de la
concentration en
100% Met-BLG
(1: 180 µM; 2:
240 µM)
dans le milieu
d’incubation sur
son activité
antivirale envers
le phage bIL67
(105 pfu/mL), par
rapport à un
contrôle réalisé
en absence de
protéine (C).
1
2
C
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ENVIRONNEMENT
(B): activité antivirale de
100% Met-BLG contre le
virus Coxsackie B6 après
incubation à 37°C en
présence de 5% CO2
pendant 24 h („: 1.0 MOI),
48 h (z: 0.1 MOI; T: 1.0
MOI), et 72 h (S: 0.01
MOI).
Figure 1
A
100
Poliovirus
A
Antiviral activity (%)
80
60
40
20
68% Met-ALA
100% Met-BLG
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
-1
Concentration of esterified whey proteins (µg mL )
100
B
Coxsackie virus
80
Antiviral activity (%)
(A): activité antivirale de
68% Met-ALA (z) et de
100% Met-BLG („) contre
le poliovirus type 1 (1.0
MOI) inoculé dans des
cellules Vero, après 48 h
d’incubation à 37°C.
60
40
0.1 MOI, 2 days
0.01 MOI, 3 days
1.0 MOI, 1 day
1.0 MOI, 2 days
20
0
0
20
40
60
80
-1
Concentration of 100% Met-BLG (µg mL )
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ENVIRONNEMENT
100
100% Met-BLG and its peptic peptides
80
A
60
60
40
40
20
20
0
0
80
80
B
60
60
40
40
20
20
0
0
0
25
50
75
100
125
Protein concentration (µg/ml)
C
Cytotoxicity (%)
Antiviral activity (%)
80
Antiviral activity (%)
Activité antivirale de
60% Met-ALA (A) et
après son hydrolyse
pepsique de 10 h (B),
100% Met-BLG (C) et
après son hydrolyse
pepsique de 10 h (D)
contre HSV-1 [(z)
100% CPE, (V) 50%
CPE] inoculé dans des
cellules Vero, après 72
h d’incubation à 37°C.
(„): cytotoxicité
D
Cytotoxicity (%)
60% Met-ALA and its peptic peptides
0
25
50
75
100
Protein concentration (µg/ml)
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ENVIRONNEMENT
125
Inhibition de la réplication de différents virus
9Bactériophage M13. Spécifique d’E. coli. Comparaison
avec les effets des histones et du lysozyme
9Bactériophages de lactocoques. Comparaison avec les effets
des histones, du lysozyme et des polylysines
9Virus Herpes simplex de type 1
9Poliovirus (enterovirus)
9Cytomégalovirus
9Comparaison avec acyclovir et L-polylysines (5-14 kDa)
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AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT
M. Sitohy ; S. Billaudel ; T. Haertlé ; J.-M. Chobert. Antiviral activity of esterified α-lactalbumin and β-lactoglobulin against herpes simplex virus type 1. Comparison with
the effect of acyclovir and L-polylysines. J. Agric. Food Chem. 2007, 55 (24) DOI: 10.1021/jf0724421 .
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; M. Nowoczin ; B. Besse ; S. Billaudel ; T. Haertlé. The effect of bovine whey proteins on the ability of poliovirus and
Coxsackie virus to infect Vero cells cultures. Int. Dairy J. (accepté).
J.M. Chobert; M. Sitohy; S. Billaudel; M. Dalgalarrondo; T. Haertlé. Anti-cytomegaloviral activity of esterified milk proteins and L-polylysines. J. Mol. Microbiol.
Biotechnol. 2007, 13, 255-258.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; U. Karwowska ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Inhibition of bacteriophage M13 replication with esterified milk proteins. J. Agric. Food
Chem. 2006, 54, 3800-3806.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Esterified whey proteins can protect Lactococcus lactis against bacteriophage infection. Comparison with the effect of native basic
proteins, and L-polylysines. J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 3727-3734.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.-C. Gaudin ; T. Renac ; T. Haertlé. When positively charged milk proteins can bind to DNA. J. Food Biochem., 2002, 26, 511-532.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Schmidt ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Interactions between esterified whey proteins (α-lactalbumin and ß-lactoglobulin) and DNA
studied by differential spectroscopy. J. Prot. Chem., 2001, 20, 633-640.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.C. Gaudin ; T. Haertlé. Esterified milk proteins inhibit DNA replication. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 29, 259-266.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of the formation of complexes between DNA and esterified dairy proteins. Int. Dairy J., 2001, 11, 873-883.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Susceptibility to trypsinolysis of esterified milk proteins. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 28, 263-271.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; T. Haertlé. Factors influencing pepsinolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- ester derivatives of ß-lactoglobulin. J. Food
Biochem., 2001, 25, 181-198.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Improvement of solubility and of emulsifying properties of milk proteins at acid pHs by esterification. Nahrung-Food, 2001, 45, 8793.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Peptic hydrolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- esters of ß-casein and α-lactalbumin. Milchwissenschaft, 2001, 56, 303-307.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Simplified short-time method for the esterification of milk proteins. Milchwissenschaft, 2001, 56, 127-131.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of factors influencing protein esterification using ß-lactoglobulin as a model. J. Food Biochem., 2000, 24, 381-398.
J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Composition pour l’inactivation de particules virales, et applications d’une telle composition. Demande de Brevet Français déposée le 5 Juin
2003, sous le n° 03/06786. Demande Internationale PCT déposée le 7 juin 2004.
J.-M. Chobert ; L. Briand ; T. Haertlé. Procédé d'obtention de produits peptidiques et produits obtenus. Demande de Brevet Français déposée le 23 Décembre 1993, n°
93/15764, délivrée le 8 Mars 1996, n° 2 714.390. Demande Internationale PCT déposée le 20 Décembre 1994, n° 94/01500, délivrée le 27 janvier 1999.
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Conclusions
De simples modifications des protéines lactosériques
peuvent conduire, à faible coût, à la production de
librairies amplifiées et diversifiées de peptides
amphiphiles.
Ces protéines peuvent servir
neutralisation virale (virucides).
comme
agents
de
Certaines formes de bêta-lactoglobulines modifiées sont
actives contre HSV, Polio, hCMV, bactériophages, etc
« Inactivation of viral particles. » Jean-Marc Chobert and Thomas Haertlé. French
Patent N° FR-03 06786, world extension applied for.
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Collaborations
Mahmoud Sitohy
Zagazig University, Faculty of Agriculture, Biochemistry
Department, Zagazig, Egypt
Urszula Karwowska, Anna Gozdzicka-Jozefiak
A.Mickiewicz University, Zaklad Wirusologii Molekularnej,
Poznan, Poland
Sylviane Billaudel
Université de Nantes, UFR des Sciences Pharmaceutiques,
Bactériologie-Virologie, Nantes, France
Christophe Chevalier et Bernard Delmas INRA, VIM, Équipe Virus Influenza
Jouy-en-Josas, France
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Soutiens obtenus
Partenariat Hubert Curien ‘Imhotep’ FranceÉgypte « Propriétés antivirales et
hypoallergéniques des protéines laitières
modifiées »
Département CEPIA
Région Pays de la Loire; valorisation.
« Développement d’une famille de protéines
et peptides antiviraux »
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