Doctorat AgroParisTech T H È S E L`Institut des Sciences et

N° : 2016 AGPT XXXX
Doctorat AgroParisTech
THÈSE
pour obtenir le grade de docteur délivré par
L’Institut des Sciences et Industries
du Vivant et de l’Environnement
(AgroParisTech)
Spécialité : Sciences du vivant
présentée et soutenue publiquement par
Vincent MAUFFRÉ
le 10 octobre 2016
Identification de marqueurs précoces de la gestation dans
les cellules immunitaires circulantes chez les ruminants
Directeur de thèse : Bénédicte GRIMARD
Coencadrement de la thèse : Fabienne CONSTANT
Jury
M. Patrice HUMBLOT, Professeur, Swedish University of Agricultural Sciences, Suède
M. Gilles FOUCRAS, Professeur, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, France
M. Jean-François BECKERS, Professeur, Faculté de Médecine Vétérinaire de Liège, Belgique
Mme Sandrine FRÉRET, Ingénieur de recherche, Institut National de Recherches Agronomiques, France
Mme Bénédicte GRIMARD, Professeur, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, France
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
ENVA, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, UMR 1198 Biologie du Développement et de la Reproduction,
Université Paris Est, F-94704 Maisons-Alfort, France
INRA, UMR 1198 Biologie du Développement et Reproduction, Paris Saclay, F-78352 Jouy-en-Josas, France
Abstract
Title : Identification of early pregancy markers in immune circulating cells in ruminants.
Keywords : ruminants ; pregnancy ; immunity ; biomarkers ; implantation ; diagnosis
Abstract : In cattle farming, reproductive performance is closely linked to farm profitability.
The early identification of non-pregnant females, using pregnancy diagnosis tests, would allow
rapid re-insemination of the animals, thus shortening the interbreeding interval. Ideally,
pregnancy detection would be performed prior to the return to oestrous, namely at the time of
implantation, which is not possible using current state-of-the-art pregnancy diagnosis
techniques. At this early stage of pregnancy, the conceptus produces a ruminant-specific
antiluteolytic signal, the interferon tau, which is responsible for the maternal pregnancy
recognition. This interferon is critical in the communication between conceptus and maternal
organism. The expression of numerous genes has been reported to be regulated by the
interferons, in the endometrium and in blood leucocytes of ruminants, at the time of
implantation.
Recent technical advances for functional analysis of the genome have provided new
opportunities for the use of these biological markers in pregnancy diagnosis. The main purpose
of this work was to identify non-invasive, reliable and early pregnancy diagnostic markers in
immune circulating cells, along with the characterisation of the local and systemic responses
of the maternal organism to pregnancy.
In order to identify new candidate genes, we performed a transcriptome analysis of
pregnant and non-pregnant peripheral blood mononuclear cells, which we combined to a
transcriptome analysis of the caroncular endometrium and the lymph nodes that specifically
drain the uterus. For practical and cost-effectiveness reasons, these samples were collected
in sheep. Based on the results of the transcriptome analysis, we selected, among the
differentially expressed genes (DEG), a set of candidate genes in order to develop an early
pregnancy diagnosis test initially in ewes and in cows in a second step. Expression of these
genes was assessed using real time qPCR. Based on the expression levels of these candidate
genes, pregnancy diagnosis tests were performed on different sets of animals: an experimental
set of ewes, an experimental set of cows and finally, on a set of ewes from commercial herds.
Five candidate genes were identified and evaluated: CXCL10, STAT1, MX1, MX2 and ISG15.
Diagnosis tests displayed reliable results in the experimental sets of animals but failed to
discriminate pregnancy in the set of farm animals. In this group, we observed high variations
in interferon stimulated genes (ISG) expression levels highlighting the low specificity of ISG
based pregnancy diagnosis tests performed in farm on heterogeneous batch of animals.
To understand this lack of specificity, a simultaneous transcriptome analysis of blood
leucocytes, lymph nodes and caroncular endometrium revealed respectively 118, 17 and 2823
DEG. Very few DEG were noticed in the lymph nodes. But if 78% of the DEG in blood
leucocytes were found in the endometrium as well, only 3% of the DEG in the endometrium
were shared with blood cells. Data mining analysis of the lists of DEG showed a strong
pregnancy associated response in both blood leucocytes and the endometrium, an interferon
response type, related to the implication of the interferon tau. However, this transcriptomic
signature, identified in both biological tissues, is not pregnancy specific as it is frequently
associated with pathogen agents.
Finally, this work has enabled to highlight the slight correlation between the local
(endometrium) and the peripheral (blood leucocytes) response during early pregnancy. But
this work has also pointed out that the transcriptomic signature related to pregnancy, an
interferon response type, is not pregnancy-specific. This lack of specificity is due to the
unreliability of ISG based pregnancy diagnosis tests. Further investigations are needed to
identify alternative pregnancy markers, independent of the interferon tau.
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Titre : Identification de marqueurs précoces de la gestation dans les cellules circulantes chez
les ruminants.
Mots clés : ruminants ; gestation ; immunité ; biomarqueurs ; implantation ; diagnostic.
Résumé : En élevage bovin, la détection précoce des femelles non gravides grâce au
diagnostic de gestation permet une réinsémination rapide des animaux. Idéalement, ce
diagnostic devrait être réalisé avant la fin du cycle sexuel, pendant la période périimplantatoire, ce qui n’est pas possible actuellement. Pendant cette étape de la gestation
précoce, le conceptus produit un facteur de reconnaissance maternelle de la gestation,
l’interféron tau (IFNt), qui occupe un rôle important dans le dialogue entre le conceptus et
l’organisme maternel. Plusieurs études ont montré que l’expression de gènes régulés par
l’IFNt était augmentée dans l’endomètre et dans les leucocytes sanguins des ruminants,
pendant la période péri-implantatoire.
Les récentes avancées technologiques permettant l’analyse fonctionnelle du génome
ont ouvert de nouvelles perspectives pour l’utilisation de ces marqueurs biologiques à des fins
diagnostiques. L'objectif de ce travail a donc été l'identification de marqueurs diagnostiques
fiables et précoces de la gestation, dans les cellules immunitaires circulantes des ruminants,
ainsi que la caractérisation de la réponse locale (endomètre) et systémique (leucocytes
sanguins) de l'organisme maternel à la gestation.
Pour identifier de nouveaux candidats, nous avons réalisé un transcriptome des
leucocytes d’animaux gravides et non gravides, que nous avons combiné à une analyse
transcriptomique de l’endomètre caronculaire et des nœuds lymphatiques drainant
spécifiquement l'utérus. Pour des raisons pratiques, ces prélèvements ont été réalisés chez
l’ovin. A partir de ces résultats, nous avons sélectionné, parmi les gènes différentiellement
exprimés (DEG), des candidats pour mettre au point un test de diagnostic précoce de gestation
chez la brebis dans un premier temps, puis chez la vache dans un second temps. L’expression
de ces gènes a été évaluée par RT-qPCR et des tests de diagnostic de gestation basés sur
les niveaux d‘expression de ces gènes ont été conduits sur 2 lots expérimentaux de brebis et
de vaches puis, sur un lot de brebis provenant d’élevages commerciaux. Cinq candidats ont
été identifiés et évalués : CXCL10, STAT1, MX1, MX2, ISG15. Les tests, performants dans
les lots expérimentaux, n’ont pas permis de discriminer efficacement la gestation dans le lot
d’animaux d’élevage commerciaux. Chez ces animaux, une grande variabilité de l’expression
des gènes candidats a été observée et suggère un défaut de spécificité de ces gènes dans le
cadre du diagnostic de gestation en élevage.
Pour comprendre ce défaut de spécificité, une analyse conjointe des transcriptomes des
leucocytes sanguins, des nœuds lymphatiques et de l’endomètre caronculaire a montré un
différentiel d’expression pour respectivement 118, 17 et 2823 gènes dans les 3 tissus explorés.
Peu de DEG ont été trouvés dans les nœuds lymphatiques. Mais, si 78 % des DEG dans les
leucocytes sanguins l’étaient aussi dans l’endomètre, les DEG communs à l’endomètre et aux
leucocytes ne représentent que 3 % des DEG de l’endomètre. Les analyses de data mining
ont mis en évidence dans les leucocytes et dans l’endomètre une réponse forte associée à la
gestation, une réponse de type interféron liée à l’IFNt. Cependant, cette signature
transcriptomique commune aux deux tissus n’est pas spécifique de la gestation et peut être
associée à la présence d’agents infectieux.
Ce travail a ainsi permis de mettre en évidence une certaine concordance entre la
réaction locale et la réponse périphérique de l’organisme maternel à la gestation. Mais il a
également montré que la signature transcriptomique de type interféron observée n’est pas
spécifique de la gestation. Ce défaut de spécificité est à l’origine du manque de fiabilité du test
de diagnostic de gestation basés sur les niveaux d’expression des gènes régulés par
l’interféron que nous avons tenté de mettre au point. D’autres études sont nécessaires pour
identifier des marqueurs alternatifs de la gestation, indépendants de l’IFNt.