Claudio D. Borsarelli Andrés H. Thomas

Transcription

Coordinadores:
Claudio D. Borsarelli
Andrés H. Thomas
Cronograma
Sesión I Moderador: Claudio Borsarelli
09:00-09:45
09:45-10:15
10:15-10:45
Francisco Velázquez-Escobar Análisis de la estructura del cromóforo del fitocromo en el
estado Pfr
TU Berlin
Cecilia Challier
UNRC
Interacción de HSA con antidiabéticos y su influencia sobre
la degradación fotoinducida de la proteína
Descanso-café
Sesión II Moderador: Claudio Borsarelli
10:45-11:15
M. Laura Dántola
INIFTA-UNLP
11:15-11:45
Gastón Paris
Instituto Leloir
11:45-12:15
Virginia Albarracin
PROIMI-UNT
12:15-14:15
Alteraciones estructurales y funcionales de Tirosinasa
fotoinducidas por pterina
Análisis estructural del fotorreceptor LOVHK de Brucella:
Implicancias en el mecanismo de activación.
Sistemas fotoinducidos de reparación de adn en bacterias
extremófilas de lagunas de altura Puno-Andinas
Almuerzo
Sesión III Moderador: Andrés H. Thomas
14:15-15:00
Diana Kirilovsky
CEA, Saclay
15:00-15:30
F. Eduardo Morán Vieyra
CITSE-UNSE
15:30-16:00
Soledad Celej
CIQUIBIC-UNC
16:00-16:30
Photoprotection by thermal dissipation of excess absorbed
energy: The Orange Carotenoid Protein (OCP) and the
Fluorescence Recovery Protein (FRP)
Effect of dye self-aggregation on the photosensitizing
properties of rose bengal associated with bovine serum
albumin
Lightening the architecture of -synuclein amyloid
oligomers
Descanso-café
Sesión IV Moderador: Andrés H. Thomas
Interacción de Complejos de Cr(III) con proteínas de
transporte.
16:30-17:00
Pablo Facundo García
UNC
17:00-17:30
Lorena Valle
CITSE-UNSE
Modulation of photophysical properties of FAD by
modications of the C-terminus of a ferrodoxin/flavodoxin
reductase
17:30-18:00
Julio Caramelo
IIBBA-UBA
Sensores fluorescentes para medir hacinamiento molecular
en sistemas biológicos
Análisis de la estructura del cromóforo del fitocromo en el estado Pfr
Francisco Velázquez-Escobar1, Maria Andrea Mroginski1 y Peter Hildebrandt 1
1
Institut f. Chemie, Technische Universität Berlin, Alemania
El fitocromo es una proteína fotoreceptora presente en plantas, en bacteria y en hongos. En función del tipo
de luz detectada, el fitocromo puede desencadenar distintas reacciones como la floración y germinación en
plantas o la fototaxia y pigmentación en bacteria. El cromóforo del fitocromo en una molécula Bilin
consistente en una cadena abierta de cuatro anillo pirroles que esta unida covalentemente a la proteína. La
absorción de luz roja ( R) o roja lejana (FR: “far red”) induce un cambio conformacional del cromóforo que
desencadena cambios estructurales mayores de la proteína responsable de su actividad biológica.
En las bacterias se han descubierto dos tipos de fitocromos, los “bathy”-fitocromos y los fitocromos
canónicos. Mientras el fitocromo canónico es termodinámicamente estable en el estado Pr caracterizado por
una fotocromicidad roja, el “bathy”-fitocromo es estable en el estado Pfr con una fotocromicidad roja lejana.
(1) La diferencia en las propiedades termodinámicas de estas dos formas del fitocromo bacterial es la razón
principal por la que las estructuras cristalinas hasta ahora disponibles del fitochromo han sido resueltas
solamente para el estado Pr de fitocromos bacteriales canónicos y para el estado Pfr de los “bathy”fitocromos. (2,3)
El objetivo principal de este trabajo es el de investigar a nivel molecular y atómico el origen de la diferencia
de las propiedades termodinámicas entre “bathy”-fitocromos y fitocromos canónicos, con el fin de mejorar
nuestro entendimiento sobre la manera en que la naturaleza emplea luz roja o luz roja lejana para
desencadenar procesos fisiológicos. Para ello, hemos combinado métodos experimentales como la
espectroscopia infrarroja (IR) y Raman resonante (RR) con los correspondientes cálculos teóricos utilizando
métodos híbridos de mecánica molecular / mecánica cuántica (QM/MM). (4)
Algunos resultados relevantes de este estudio son:
a) el cromóforo biliverdina en el “bathy”-fitocromo de Pseudomonas aeruginosa (PaBphP) exhibe una
estructura con la configuración ZZEssa, en acuerdo con el análisis cristalográfico, y esta unido
covalentemente a la proteína a través del grupo vinil exocíclico del anillo A.
b) la similitud de los espectros RR de PaBphP y del “bathy”-fitochromo de Agrobacterium tumefacians
(Agp2) indica que la estructura del cromóforo y de la proteína que lo rodea son semejantes en ambos
fitocromos.
c) la comparación de los espectros IR y RR de “bathy”-fitocromos y varios fitocromos canónicos revela
que en el estado Pfr la estructura del cromóforo en “bathy”-fitocromos es homogénea mientras que en
los fitocromos canónicos el cromóforo exhibe por los menos dos confórmeros.
d) se presume que la causa de la disparidad estructural, termodinámica y, quizás también, funcional entre
“bathy”-fitocromos y fitocromos canónicos resida en la interacción entre la biliverdina y el Asp194, a
través de puentes de hidrogeno.
Referencias
1- Rockwell, N.C., Lagarias,J.C. , Chemphyschem 11, 1172, 2010
2- Essen, L.O.,Hughes,J., Mailliet,J., Proc.Nat. Aca. Sci.U.S.A., 105, 14709, 2008
3- Yang,X.J., Kuk,J., Moffat,K. Proc.Nat. Aca. Sci.U.S.A., 105, 14715, 2008
4- Salewski,J. et al, J. Biol. Chem, 2013, in press
II GRAFOB, Córdoba, Argentina
1
Interacción de HSA con antidiabéticos y su influencia sobre la degradación
fotoinducida de la proteína
C.Challiera; C. Boetschb, P. Beassonnib; N.A.Garcíaa; S.Criadoa ; M. A.Biasuttia
a Departamento de Química, Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC)
b Departamento de Biología Molecular, Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC)
En las últimas décadas ha crecido notablemente el interés por estudios de procesos oxidativos que involucran
tanto a macromoléculas de importancia biológica como a fármacos consumidos por el hombre. De hecho,
recientes investigaciones1 han vinculado a enfermedades como diabetes miellitus, arterosclerosis e
hipertensión a escenarios de estrés oxidativo en los que podrían tener lugar dichos procesos.
Teniendo en cuenta que en la sangre el transporte de diversos compuestos y fármacos se realiza a través de la
albúmina de suero humano (HSA), se considera de relevancia investigar la susceptibilidad a la degradación de
dicha proteína unida al antidiabético Gliclazida (Gli), en condiciones de estrés oxidativo.
Con el objetivo de caracterizar el sistema, se estudió la unión o binding de Gli a HSA. Los resultados,
obtenidos mediante quenching de fluorescencia excitando en la región de absorción del aminoácido Trp,
indican que Gli se une a HSA en dos sitios, con constantes de binding del orden de 104 para ambos. A su vez,
estos resultados experimentales fueron confirmados por estudios de acoplamiento molecular (docking), los
que permiten identificar el o los sitios donde un ligando (el antidiabético en nuestro caso) se une en la proteína
y qué orientación asume en el sitio de unión.
Finalmente, se estudió la fotooxidación de HSA mediada por oxígeno singlete (O 2(1Δg)), en ausencia y en
presencia de Gli. Los resultados indican que HSA es menos reactiva que Gli frente a O2(1Δg), mientras que el
sistema HSA-Gli resulta más reactivo que cada una de las especies, individualmente. La interpretación más
directa es la simple contribución aditiva a la desactivación de la especie oxidante, mientras que una segunda
interpretación incluiría cambios conformacionales en HSA-Gli que favorezcan la accesibilidad de O2(1Δg) a
los restos fotooxidables del sistema.
Referencias
1 Vijayaling S., Parthiban A, Shanmugasundaram K.R., Mohan V. (1996) Diabet Med. 13, 715.
2 Kojda G., Harrison D. (1992)Cardiovasc Res 43, 562. (c) Orie N. N, Zidek W, Tepel M. (1999) Am. J. Hypertens 12,
1169.
2
Alteraciones estructurales y funcionales de Tirosinasa fotoinducidas por pterina
Beatriz N. Zurbano,1 Aldana D. Gojanovich,2 Andrés H. Thomas,1 M. Laura Dántola1
1
INIFTA, Dep. de Química, Fac. de Ciencias Exactas, UNLP, CCT La Plata-CONICET. La Plata, Argentina. E-mail:
[email protected]
2
IIB-INTECH (Chascomús), UNSM, CONICE,. Chascomús, Argentina.
La radiación UV, es la porción más energética del espectro solar que alcanza la superficie terrestre.
Este tipo de radiación es capaz de modificar la estructura química de ciertas macromoléculas (proteínas, ácido
desoxirribonucleico (ADN)), generando alteraciones que pueden conducir a la muerte celular.
Las pterinas, son una familia de compuestos orgánicos heterocíclicos ampliamente distribuidos en la
naturaleza que participan en diversas reacciones metabólicas. Se ha demostrado que estas moléculas pueden
actuar como fotosensibilizadores, es decir, absorber radiación y producir cambios químicos en un segundo
compuesto que actúa como sustrato. Actualmente, se sabe que las pterinas son capaces de oxidar ADN [1,2] y
nucleótidos [3,4] mediante procesos fotosensibilizados, sin embargo, se desconoce su acción sobre proteínas.
El vitiligo es una patología cutánea que cursa con déficit de la pigmentación a causa de la inactivación
de enzimas de la biosíntesis de melanina (melanogénesis). Se ha demostrado, que en la piel de estos pacientes
existe acumulación de derivados pterínicos junto a altos niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2).[5] La
tirosinasa es una cuproglicoproteína que cataliza las dos primeras etapas de la melanogénesis en la piel del ser
humano. A pesar de que se reconoce que las pterinas podrían estar involucradas en la fisiopatología del
vitiligo, no existen estudios sobre la capacidad de estas moléculas para inactivar enzimas de la melanogénesis.
En este contexto, el objetivo de este trabajo es estudiar la capacidad de Pterina (Ptr) para inactivar
fotoquímicamente a la tirosinasa, como así también evaluar el daño estructural que sufre la proteína en este
proceso. Para esto, soluciones acuosas conteniendo la enzima y Ptr fueron expuestas a radiación UV-A (exc =
350nm) durante distintos períodos de tiempo (pH = 6,5, 25 ºC). Una vez terminada la irradiación, se realiza el
ensayo de medida de la actividad enzimática ((pH = 6,5, 37 ºC), el cual consiste en monitorear el aumento de
la absorbancia a 475 nm, correspondiente a la formación de L-Dopacroma, en función del tiempo de reacción.
[6]
Por otra parte, para evaluar el daño a nivel estructural, las soluciones irradiadas son analizadas por
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y espectroscopía de
fluorescencia.
Los resultados obtenidos indican que la Ptr es capaz de fotoinactivar a la tirosinasa, sugiriendo que la
reacción se inicia con una transferencia de electrones de la enzima al estado excitado triplete del
fotosensibilizador, generando el radical catión de la enzima y el radical anión del fotosensibilizador. El radical
catión de la enzima puede sufrir procesos de oxidación que conducen a la inactivación irreversible de la
enzima. Mientras que el radical anión del fotosensibilizador puede reducir al oxígeno disuelto (O2) para
generar el radical anión superóxido.7 Por otra parte, el análisis por SDS-PAGE de las soluciones irradiadas
muestra que la enzima sufre una ruptura irreversible generando productos de menor peso molecular. Respecto
al estudio del daño que sufre la tirosinasa a nivel de su estructura primaria, se observó que de los aminoácidos
que le confieren fluorescencia a las proteínas, en este caso, el triptófano es el aminoácido que sufre alteración
en el proceso fotosensibilizado.
Referencias
1
Ito K. y Kawanishi S. Biochem., 36, 1774 (1997)
Lorente, C.; Thomas, A. H.; Villata, L. S.; Hozbor, D.; Lagares, A.; Capparelli, A. L. Pteridines, 11, 100 (2000)
3
Petroselli, G.; Erra-Balsells, R.; Cabrerizo, F. M.; Lorente, C.; Capparelli, A. L.; Braun, A. M.; Oliveros, E.; Thomas, A. H. Org. Biomol. Chem., 5,
2792 (2007)
4
Petroselli, G.; Dántola, M. L.; Cabrerizo, F. M.; Capparelli, A. L.; Lorente, C.; Oliveros, E.; Thomas A. H. J. Am. Chem. Soc., 130, 3001 (2008)
5
Schallreuter K. U., Wood J. M., Pittelkow M. R., Gutlich M., Lemke K. R., Rodl W., Swanson N. N., Hitzemann K., Ziegler I. Science, 263, 1444
(1994)
6
Pomerantz, S. H.; Li, J. P. C. Method Enzimol., 17, 620 (1970)
7
Dantola M. L.; Gojanovich A. D., Thomas A. H., Biochem. Biophys. Res. Commun, 424, 568 (2012)
2
3
Análisis estructural del fotorreceptor LOVHK de Brucella: Implicancias en el
mecanismo de activación.
Gastón Paris, Jimena Rinaldi, Sebastián Klinke, Mariana Gallo, Daniel Cícero, Fernando A.
Goldbaum.
Fundación Instituto Leloir-IIBBA CONICET. Buenos Aires. Argentina
La brucelosis es causada por bacterias del género Brucella. Dicha enfermedad se encuentra
ampliamente distribuida por todo el mundo y afecta a una gran variedad de mamíferos. En los
humanos produce una enfermedad debilitante caracterizada por ciclos repetidos de fiebre, mientras
que en los animales produce abortos e infertilidad. En los genomas de Brucella se encuentra
codificada un proteína con dominio LOV asociado a un dominio histidina quinasa (HK) que es
relevante en la infectividad de la bacteria. Los dominios LOV tienen un plegamiento muy
conservado con una hoja beta de cinco hebras y cuatro alfa hélices y unen FMN como cofactor. Al
estimular la flavina con luz azul forma un enlace covalente entre el C4a del cofactor y un residuo de
cisteína conservado en todos los dominios LOV. El fotociclo se completa cuando el enlace covalente
se rompe en la oscuridad de manera espontánea. La formación de este enlace inicia una serie de
cambios conformacionales, aún no caracterizados para ninguna proteína del tipo histidina quinasa,
que finalizan en la activación de la autofosforilación del dominio HK. El análisis estructural del
dominio LOV mediante cristalografía de rayos y RMN complementada con estudios biofísicos indica
que la hoja beta y una hélice presente en el C-terminal del dominio están involucrados en la
transmisión de la señal hacia otros dominios. Por otro lado, la estructura de rayos X del dominio HK
sugiere que este dominio sufre grandes cambios conformacionales que involucran a las hélices Nterminales del dominio HK. Estamos desarrollando experimentos que permitan confirmar el rol de
las hélices en el mecanismo de activación. En trabajos previos se ha sugerido que los dominios
histidina quinasa son activados mediante la rotación de estas alfa hélices. Utilizando las estructuras
obtenidas por nosotros junto con los datos estructurales de otras histidinas quinasas aportados por
otros grupos de investigación construimos un modelo tridimensional de la LOVHK. El análisis de
este modelo se encuentra en desarrollo y nos permitirá elaborar hipótesis sobre los posibles
mecanismos de activación que serán probados mediante estudios estructurales y mutagenésis sitio
dirigida.
4
Sistemas fotoinducidos de reparación de adn en bacterias extremófilas de lagunas
de altura puno-andinas
Virginia H. Albarracin
Laboratorio De InvestigacionesMicrobiológicas De Lagunas Andinas (LIMLA), PROIMI-CCTTUCUMAN CONICET.
De una colección de 500 microorganismos extremófilos aislados de las Lagunas de Altura Puno Andinas
(LAPAs) se obtuvieron los genomas de tres cepas modelo: Acinetobacter sp. Ver3, Exiguobacterium sp. S17 y
Nesterenkonia sp. Act20 consideradas politextremófilas, ya que resisten múltiples factores extremos
(Albarracin et al., 2012; Belfiore et al, 2013; Farias et al., 2013). El minado de los mismos reveló la existencia
de varios genes codificantes de fotorreceptores en entornos genómicos diferentes a cepas del mismo género
que no viven en condiciones extremas, indicando que los mismos pueden tener un papel fundamental en la
respuesta adaptativa en su ambiente de origen, intensamente irradiado por luz, incluso en el rango del UV-B.
Se puso especial atención en los fotorreceptores pertenecientes a la familia de las fotoliasas-criptocromos (PLCry). En Ver3, Act20 y S17 se encontraron secuencias codificantes para fotoliasas CPD-Clase I y para la
nueva clase de criptocromos llamadas Cry-Pro. Los Cry-DASH fueron encontrados sólo en Exiguobacterium.
Nesterenkonia sp. Act20, presentó un tipo adicional de fotoliasas con homología a las CPD-Clase III.
Posteriormente, se trabajó más específicamente con la fotoliasa (Ver3Phr) de Acinetobacter sp. Ver3, puesto
que esta cepa demostró un alta resistencia a UV asociada a una eficiente capacidad de fotorreparación
(Albarracín et al., 2012). De acuerdo a estudios filogenéticos, de comparación de secuencia con la fotoliasa
CPD-Clase I de Escherichia coli (EcPhr) y de modelado por homología estructural, confirmamos que Ver3Phr
correspondería a una PL CPD-Clase I. El gen correspondiente fue clonado y sobreexpresado, tras lo cual se
realizaron estudios funcionales del mismo para caracterizar el fotorreceptor tanto por métodos
espectroscópicos (absorbancia, fluorescencia) como analíticos (HPLC). La capacidad de fotorreparación de la
fotoliasa recombinante fue confirmada in vivo por experimentos de complementación cuando el gen
codificante de Ver3Phr fue clonado en vectores pQE60 e incorporado por transformación a una cepa E. coli
(KY1225) con mutaciones deletéreas para los genes RecA y EcPhr, y por lo tanto deficiente en
fotorreparación del daño a ADN y en reparación de daño en la oscuridad. Los transformantes que llevaban el
pQE60-Ver3Phr o los controles sin plásmido fueron irradiados con UV-B. Ambos tipos de celulas se
inocularon en placas inmediatamente después del tratamiento no presentando supervivientes luego de 24 h de
incubación en la oscuridad. Sin embargo, si las células irradiadas se fotorreparaban durante 120 minutos antes
de la incubación, las células transformadas alcanzaban casi los mismos números de UFC que las células no
tratadas con UV (ca. un orden de magnitud menos) mientras quelas células no-transformadas no lograron
recuperarse. Estos resultados indican que la proteína codificada por el gen phr de Acinetobactersp. Ver3
efectivamente presenta actividad de fotorreactivación, pero a diferencia de su homólogo EcPhr (la fotoliasa de
E. coli), su contribución a la reparación en la oscuridad es nula.
Los resultados expuestos indican que los extremófilos de las LAPAs son fuentes importantes de moléculas
noveles de importancia biotecnológica que, por otro lado, podrían convertirse en moléculas modelos
(“extremoenzimas”) para estudiar y entender determinados mecanismos fotoinducidos en proteínas
fotorreceptoras.
1. Albarracín, V.H., Pathak, G., Douki, T., Cadet, J., Borsarelli, C., Gärtner, W., Farias, M.E. (2012). ExtremophilicAcinetobacter strains from HighAltitude Lakes in Argentinean Puna: Remarkable UV-B Resistance and Efficient DNA Damage Repair. Origin of Life and Evolution of Biospheres.42:
201-221.
2. Belfiore, C., Ordoñez, O., Farías, M.E. (2013). Proteomic Approach of Adaptive Response to Arsenic Stress in Exiguobacterium sp. S17. An
Extremophile Strain Isolate from High Altitude Andean Lake Stromatolite. Extremophiles 1-11.
3. Farias, M.E., Rascovan, N., Toneatti, D.M., Albarracín, V.H., Flores, M.R., Poiré, D., Collavino, M., Aguilar, M., Vazquez, M., Polerecky, L.
(2013). The discovery of stromatolites developing in a high-altitude volcanic lake Socompa, Argentinean Andes.PLoS ONE 8(1): e53497.
doi:10.1371/journal.pone.0053497.
5
Photoprotection by thermal dissipation of excess absorbed energy: The
Orange Carotenoid Protein (OCP) and the Fluorescence Recovery Protein (FRP)
Adjele Wilsona,b, Marcus Sutterc, Ryan Leverenzd, Michal Gwizdalaa,b, Dennis Jalleta,b, Adrien
Thurottea,b, Rocio Lopez Iguala,b, Cheryl Kerfeldc,d,e and Diana Kirilovskya,b
a
Commissariat à l’Energie Atomique (CEA), Institut de Biologie et Technologies de Saclay (iBiTecS), bCentre National de la Recherche Scientifique, UMR 8221 (CNRS), 91191 Gif sur Yvette,
France, cUnited States Department of Energy - Joint Genome Institute, Walnut Creek CA 94598,
d
Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA 94720, USA
and eBerkeley Synthetic Biology Institute, Berkeley, CA 94720, USA.
In most cyanobacteria a photoprotective mechanism decreasing the excess energy arriving at
the photosystems is induced by the absorbance of strong blue-green light by the photoactive Orange
Carotenoid Protein, the OCP. Strong light induces structural changes in the carotenoid and the
protein; this converts the orange inactive dark form, OCPo, into a red, active form, OCPr. This active
red form binds to the core of phycobilisomes (PBs) and induces an increase of thermal dissipation of
the absorbed energy. The site of primary quenching is an APC660 trimer (emitting at 660 nm). None
of the PBs terminal emitters (ApcD, ApcF and ApcE, emitting at 680 nm) is absolutely required for
fluorescence and energy quenching. The OCP consists of an all -helical N-terminal domain and an
/ C-terminal domain joined by a linker. The R155-E244 salt bridge between the N- and C-terminal
domains stabilizes the dark inactive OCPo and avoids the binding of the inactive OCP to PBs. In
OCPr, breakage of the salt bridge with concomitant domain motion exposes the surface of the Nterminal domain containing Arg 155 and increases its exposure. Arg155 is directly involved in the
binding of OCPr to the PBs and its positive charge is essential for this binding. The isolated Nterminal domain (without the C-terminal domain) is able to bind to PBs and to quench their
fluorescence. While the binding of the Synechocystis OCP to Synechocystis PBs is very strong and is
efficient in fluorescence quenching, the binding to PBs from other strains it is non-existent or very
weak indicating a high specificity of binding. In contrast, Arthrospira OCP is less specific and
allowed to demonstrate that the conformation of the PBs plays also an important role in OCP
binding.
The Fluorescence Recovery Protein is the switch-off of the photoprotective mechanism and
mutants lacking this protein are unable to regain full capacity of antenna after high light illumination.
The FRP interacts with OCPr and accelerates its reconversion to the OCPo. In addition, FRP
facilitates the detachment of OCP from the PBs and accelerates the recovery process. The threedimensional structure of this protein, which in its active form is a dime,r has been just resolved and it
will be presented in the meeting. In addition, it was identified a patch of highly conserved amino
acids and demonstrated that they are essential for FRP activity. Finally, the interaction of FRP with
the C-terminal domain of the OCP was demonstrated.
6
Efecto de la auto-agregación molecular en las propiedades espectroscópicas y
fotosensibilizadoras de Rosa de Bengala asociada a albúmina de suero bovino.
M. Beatriz Espeche Turbay, Valentina Rey, Natalia M. Argañaraz, F. Eduardo Morán Vieyra,
y Claudio D. Borsarelli.
El efecto de la auto-agregación del colorante Rosa de Bengala en albúmina de suero bovino (BSA)
sobre sus propiedades espectroscópicas y de fotosensibilización fue estudiado en un rango de
relación de concentraciones 0 < [BSA]/[RB] < 10 mediante espectroscopia de absorción y emisión
tanto de régimen estacionario como dinámico.
Los resultados muestran que existen dos regímenes de organización supramolecular que gobiernan
las propiedades del colorante. A relaciones [BSA]/[RB] < 0.1 se produce una asociación múltiple de
colorante por molécula de proteína, n = [RB]bound/[BSA]total  5, que genera la formación de
agregados de colorante cuantificado por los cambios espectrales de la banda visible de RB. Estos
agregados de RB intra-proteicos favorecen la desactivación no radiativa de los estados excitados del
colorante, reduciendo notoriamente su capacidad de fotosensibilización.
Sin embargo, el aumento relativo de la concentración de BSA induce la formación de aductos
colorante-proteína con n = [RB]bound/[BSA]total  1. En este régimen, el colorante recupera hasta un
25% de su capacidad de generación de oxígeno singulete del observado en solución buffer, a pesar
que el rendimiento cuántico de generación de tripletes es similar. Esta diferencia de rendimientos
resulta en la oxidación de BSA, visualizada en los cambios espectroscópicos de la proteína. Los
estudios dinámicos, demuestran que en este régimen de agregación hay al menos dos poblaciones de
estados excitados, siendo uno de ellos más sensible a desactivación por oxígeno molecular.
Los resultados se analizan tanto en función del grado de auto-asociación de RB intra-proteico y su
impacto sobre los mecanismos tipo I y II de fotosensibilización del colorante. Se concluye que los
aductos RB-BSA con n  1 pueden ser utilizados en medios biológicos como potenciales
fotosensibilizadores supramoleculares.
7
Lightening the architecture of -synuclein amyloid oligomers
M. Soledad Celej.
Dto. de Química Biológica-CIQUIBIC(CONICET), Facultad de Ciencias Químicas., Universidad
Nacional de Córdoba; email: [email protected]
Parkinson’s disease is an age-related movement disorder characterized by the presence in the
mid-brain of fibrillar amyloid deposits of the 140-aa protein -synuclein (AS). Like in other
neurodegenerative diseases, prefibrillar amyloid oligomers are considered to be the most toxic
species underlying neurodegeneration. It has been recognized that AS oligomers contain -sheet
structural elements differing from the canonical cross -sheet conformation of amyloid fibrils1.
However, a more detailed structural characterization of such species remains elusive.
We used FTIR spectroscopy, a technique especially sensitive to -sheet structure, to get a
deeper insight into the -sheet organization of AS oligomers. Spectral analysis revealed that AS
oligomers adopt an antiparallel -sheet structure, as opposed to the parallel arrangement present in
fibrils2.
Compared to the monomer, the N-terminus and the hydrophobic region of the protein to at
least position 90 are more solvent protected in the oligomeric form3, and therefore, they are likely
involved in early -sheet interactions. Currently, we are employing engineered single-cysteine AS
variants specifically labeled with solvatochromic dyes (pyrene-maleimide or acrylodan) in order to
define the regions involved in cooperatively folded structures. We also take advantage of the ability
of pyrene to form excimers depending on the distance between two fluorophores to identify
intermolecular contacts. According to GdmCl denaturation profiles, positions 9 and 18 are shielded
from the solvent but they would not be entailed in structured regions. Positions 27 and 90 are also
protected from the solvent and have similar denaturation curves. Position 76 shows the most
distinctive unfolding transition and an excimer band suggesting that this region is involved in early
-sheet interactions. As expected, the C-terminus is solvent-exposed and unstructured.
We expect to obtain a detailed residue-specific picture of the supramolecular arrangement of
AS oligomers which may contribute to the understanding of both amyloid aggregation mechanism
and oligomer-induced toxicity.
References
1
2
3
Kim, HY et al., J Am Chem Soc (2009) 131, 17482.
Celej, MS et al., Biochem J (2012) 443, 719.
van Rooijen, BD et al., J Mol Biol (2009) 394, 826.
Acknowledgements
Dr. Bertoncini and Dr. Jovin for proving us the several Cys-AS variants. SECyT-UNC, FONCyT,
CONICET and ISN-CAEN for financial support.
8
Interacción de complejos de Cromo(III) con proteínas de transporte.
Lic. Pablo Facundo Garcia
Las proteínas de transporte son aquellas encargadas de llevar diferentes sustancias a través del
organismo a donde sean requeridas. Así es como la célula recibe el oxígeno necesario para respirar, recibe
algunos nutrientes, y elimina toda aquella sustancia que pueda generar daño al organismo. En este sentido,
podemos encontrar proteínas que transportan de manera específica un determinado sustrato, o proteínas
que pueden transportar diferentes sustancias de manera más inespecífica. En los últimos años se han
encontrado numerosos trabajos donde se estudia la asociación de drogas terapéuticas a diversas proteínas
de transporte, como por ejemplo, Albúminas séricas, Transferrinas, Lipoproteínas, etc.
Ahora bien, en el marco de las nuevas terapias contra el cáncer, ¿Qué utilidad puede tener estudiar como
potenciales drogas se asocian a proteínas de transporte? Se conoce que el metabolismo de una célula
tumoral es sumamente diferente al de una célula normal, y que tienen una capacidad de proliferación mucho
mayor. Esta capacidad de proliferar exacerbadamente tiene que estar acompañada por un consumo mayor
de nutrientes, y es ahi donde las proteínas de transporte juegan un rol crítico. Se conoce, por ejemplo, que
muchas líneas celulares cancerosas tienen sobre-expresado el receptor de membrana de la proteína que se
encarga de transportar el hierro: Transferrina. Por esto esta proteína podría servir como un carrier de drogas
al interior celular de células cancerosas.
En este sentido nuestro trabajo consiste en estudiar los parámetros de asociación y termodinámicos,
aminoácidos involucrados y estudios conformacionales de diversas proteínas de transporte cuando un
complejo metálico, en particular complejos de Cromo(III), se encuentra interaccionando. Estudios previos
nos muestran que estos complejos de Cr(III) pueden ser utilizados como posibles fotosensibilizadores para
su uso en Terapia Fotodinámica.
9
Impact on the photophysical properties of cofactor FAD by C-terminus domain
mutation in Rhodobacter capsulatus ferredoxin/flavodoxin NADP reductase
Lorena Valle,1 Faustino E. Morán Vieyra,1 Inés Abatedaga,1 Ana Bortolotti,2 Néstor Cortez,2
Claudio D. Borsarelli,1
1
Centro de Investigaciones y Transferencia de Santiago del Estero (CITSE-CONICET), UNSE, RN
9, Km 1125, Villa El Zanjón, CP4206 Santiago del Estero.
2
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, Universidad Nacional de Rosario y
CONICET, Suipacha 531, S2002L RK Rosario, Argentina
The photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus contains a single (flavodoxin)-NADP(H)
oxidoreductase (RcFPR) that catalyzes the electron transfer from NADP(H) to the flavodoxin nifF for
nitrogenase reduction. Plastidic class of reductases presents a C-terminal Tyr residue involved in catalytic
mechanism and stabilizing the RE face of the isoalloxazine ring of FAD. Differently, bacterial class FPRs
carry a Phe or Ala instead terminal Tyr, and a C-terminal extension  = -FVGEGI, which also participates in
NADP(H) binding and hydride transfer mechanism.1 A site-directed mutagenesis approach on RcFPR was
performed, producing three different mutants: A266Y, A266 and A266Y, where  represents mutants
without the terminal peptide FVGEGI.
In this work, the photophysical properties of FAD in the above mutant series were analyzed by steadystate and time-resolved UV-Vis absorption and emission spectroscopies, and the role of both Ala-Tyr and –
FVGEGI modifications are discussed. Although catalytic activity is present in all cases, in aerated solutions of
A266 a 10-fold higher fluorescence quantum yield was observed as compared with FAD in buffer, but with a
similar quantum yield of excited triplet state (T  0.35). This is totally contrary to the wild type protein,
which almost does not fluoresce and not show excited triplet state of FAD. However, for the mutant A266,
the formation of singlet molecular oxygen was not detected. These results indicate how delicate is the tuning
of photophysical properties of flavin cofactors in the protein cavity.
Acknowledgements: We thanks to FONCyT (PICT2012-2666, PICT2010-2356), CONICET (PIP-0374/12),
and UNSE (CICyT A23/162) for financial support.
Referencias
1 Bortolotti A., Pérez-Dorado I., Goñi G., Medina M., Hermoso J. A., Carrillo N., Cortés N. Biochim. Biophys. Acta,
1794, 199, 2009.
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Desarrollo de una sonda fluorescente para medir hacinamiento molecular in vivo
María Soledad Labanda, Paula Monserrat Couto, Carlos Labriola, Rodrigo Corti Bielsa y Julio
J. Caramelo
Fundación Instituto Leloir, Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBACONICET) y Departamento de Química Biológica, FCEN-UBA. Av. Patricias Argentinas 435, Buenos
Aires, Argentina. C1405BWE.
El interior de la células es una matriz rica en donde la concentración de macromoléculas puede llegar hasta el 30
% p/v. El hacinamiento molecular ("crowding") puede afectar profundamente diversos aspectos biofísicos de la
fisiología celular. Por ejemplo, el hacinamiento puede alterar las constantes de unión aparente entre
macromoléculas en cerca de dos órdenes de magnitud. Si bien se reconoce la importancia de este fenómeno, aún
no se dispone de herramientas que permitan medir los niveles de hacinamiento de entornos celulares en forma
directa. Recientemente desarrollamos una proteína cuyas propiedades de emisión son influenciadas por los
niveles de hacinamiento. Esta proteína está compuesta por dos proteínas fluorescentes, YFP y CFP, separadas
por un espaciador nativamente desplegado. La eficiencia de FRET de esta construcción mostró un marcado
incremento cuando se lo incubó con agentes que aumentan el grado de hacinamiento del medio, tales como PEG
y Ficoll. El rango en donde esta sonda mostró una mayor sensibilidad está cerca de los niveles de hacinamiento
estimados para los medios intracelulares. La posibilidad de modular el rango de respuesta de la sonda y de poder
dirigirla al destino celular de interés permitirá estudiar el efecto del hacinamiento en diversos fenómenos
fisiológicos.
Este trabajo ha sido financiado por la ANPCyP y la UBA.
[email protected]
11

Claudio D. Borsarelli Andrés H. Thomas

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