LA CONSTITUTION DES PROTÉINES ET LEUR DOSAGE

LA CONSTITUTION DES PROTÉINES ET LEUR DOSAGE
I. INFLUENCE DE LA CHALEUR ET DE
L’ACIDITÉ SUR LES PROTÉINES
Fiche technique 1
Ajoutez, dans un tube à essai, 1cm d’acide
chlorhydrique (HCl) sur 1cm de sérume albumine et
placez le mélange 1 heure au bain à sec à 100 °C.
La comparaison des résultats des réactions du
biuret et xanthoprotéique sur de l’eau albumineuse et
sur le mélange permet de tirer des conclusions sur la
structure des protéines ainsi que sur l'influence de
l'acidité et de la chaleur.
II. DOSAGE DES PROTÉINES
Le dosage des protéines est
réalisé par la méthode de Gornall qui est
une application analytique de la réaction
du biuret.
Le principe est de réaliser une courbeétalon au spectrophotomètre avec des
concentrations connues de protéines,
puis d'interpoler sur cette courbe les
valeurs spectophotométriques des
échantillons afin de trouver leur
concentration en protéine.
Le spectrophotomètre est une méthode
analytique quantitative qui consiste à
mesurer l'absorption des rayons
lumineux par une substance chimique
donnée en solution. Plus cette espèce est
concentrée plus elle absorbe la lumière
et moins la lumière transmise est
intense. On parle d'absorbance.
Réaction du biuret
Dans un tube à essai, on ajoute à la substance à analyser (1ml
suffit) de la soude (NaOH) puis du sulfate de cuivre (CuSO4).
Si on obtient une coloration violette, alors on a la présence de
liaisons peptidiques.
Réaction xanthoprotéique
On ajoute à la substance à analyser de l’acide nitrique (HNO3) puis
on fait bouillir (chauffage). Si on obtient une coloration jaune qui
passe à l’orange après refroidissement et ajout d’ammoniaque
(NH4OH), alors on a mis en évidence la présence de certains acides
aminés.
Fiche technique 2
dosage des protéines de Gornall
- Casser l'œuf, séparer le blanc du jaune, recueillir le blanc et le jaune.
- Faire une dilution au 1/50 dans de l'eau physiologique (NaCl 9‰)
- Bien mélanger.
- Préparer 8 tubes selon les indication du tableau suivant :
Tubes n°
0
1
2
3
4
5
E1 E2
Solution diluée de blanc d'œuf en ml
1
Solution diluée de jaune d'œuf en ml
1
Solution de sérum-albumine à 5g/l (ml)
0
0,2 0,4 0,6 0,8
1
Eau physiologique (ml)
1
0,8 0,6 0,4 0,2
0
0
0
Réactif de Gornall (ml)
3
3
3
3
3
3
3
3
Protéines en mg par tube
0
1
2
3
4
5
x
x
Absorbance mesurée à 340nm
0
-Bien mélanger les tubes.
- Transférer le contenu des tubes dans des cuves à spectrophotomètre.
- Lire l'absorbance à 340nm (le proche ultraviolet) pour chacun des tubes en
utilisant le tube 0 pour faire le 0.
On tentera de doser les protéines du
blanc d'œuf et celles du jaune.
La courbe étalon est réalisée avec de la
sérum-albumine (à 5g/l) qui est plus soluble que l'ovalbumine de
l'œuf.
Le schéma ci-contre présente le principe de fonctionnement du
spectrophotomètre.
activités
capacités
barème
Réaliser techniquement
2
Représenter graphiquement
4
Mettre des données en relation
4
Réaliser techniquement
4
Représenter graphiquement
Raisonner
6
ère
1 partie
1° Réalisez le mélange d'albumine et d'HCl chauffé. Puis effectuez les tests
caractéristiques (fiche technique 1) sur le mélange et sur l'eau albumineuse.
2° Schématisez l'expérience ainsi que les résultats obtenus.
3° Interprétez les résultats en tenant compte des données fournies dans la fiche technique.
ème
2 partie
4° Réalisez les 8 tubes (fiche technique 2). Reproduisez le tableau de la fiche 2 et
complétez-le avec les valeurs de l'absorbance.
5° Tracez le graphe de l'absorbance en fonction de la concentration en protéines à partir
des valeurs des tubes-étalons, Interpoler sur le graphe les valeurs de l'absorbance pour
avoir les valeurs x. Calculer la concentration en protéines dans le blanc d'œuf (en g/100
ml) sans oublier qu'il a été dilué 50 fois.