SA255_33-38 - Spectra Analyse

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Mélanie LAGARRIGUE1, Anne BOSSÉE1, Arlette BÉGOS1, Anne VARENNE2, Nathalie DELAUNAY2,
Pierre GAREIL2,*, Bruno BELLIER1
Le couplage EC/SM
pour la détection et l’identification
de produits de dégradation
d’agents de guerre chimique
RÉSUMÉ
Couplage
age
La menace de l’utilisation d’armes chimiques par des organisations terroristes motive le développement
de techniques analytiques permettant la détection et l’identification d’agents de guerre chimique et de
leurs produits de dégradation dans diverses matrices. L’électrophorèse capillaire (EC) est une technique
intrinsèquement adaptée à la séparation de composés chargés ou très polaires tels que les produits
de dégradation d’agents de guerre chimique organophosphorés (acides alkylphosphoniques et alkyl
alkylphosphoniques) qui peuvent être difficilement séparables en chromatographie en phase liquide à
polarité de phases inversée en raison de leur élution très rapide. L’électrophorèse capillaire offre de plus
une grande efficacité de séparation et une très faible consommation d’échantillon (quelques nanolitres
injectés) et de solvant. Le couplage de l’électrophorèse capillaire à la spectrométrie de masse (EC/SM)
permet de bénéficier d’une puissante capacité d’identification des composés. Cet article présente le
couplage EC/SM pour la détection et son intérêt potentiel pour l’identification de produits de dégradation
d’agents de guerre chimique dans des matrices environnementales.
MOTS-CLÉS
Electrophorèse capillaire, couplage électrophorèse capillaire/spectrométrie de masse, acides
phosphoniques, préconcentration, matrices environnementales
CE/MS for the detection and identification of chemical warfare agent
degradation products
SUMMARY
The threat of the use of chemical weapons for terrorist purposes promotes the development of analytical
techniques for the detection and identification of chemical warfare agents and their degradation products.
Capillary electrophoresis is intrinsically adapted to the separation of charged or very polar compounds such as
organophosphorous degradation products (alkylphosphonic and alkyl alkylphosphonic acids) which are generally
rapidly eluted and consequently hardly separated by reversed phase liquid chromatography. Moreover, capillary
electrophoresis provides high separation efficiency and very low consumption of sample (in the nanoliter range)
and solvent. The hyphenation of capillary electrophoresis with mass spectrometry thus displays high identification
capabilities. This article presents the interest of CE/MS for the detection and identification of chemical warfare
agent degradation products in environmental matrices.
KEYWORDS
Capillary electrophoresis, capillary electrophoresis/mass spectrometry coupling, phosphonic acids, preconcentration,
environmental matrices
1
Département Analyse Chimique – Centre d’Etudes du Bouchet – 5, rue Lavoisier – BP 3 – 91710 Vert-le-Petit
* Pour correspondance
2
Laboratoire Electrochimie et Chimie Analytique (UMR 7575 CNRS-ENSCP-Université Paris 6) – Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Paris – 11, rue Pierre et Marie
Curie – 75231 Paris cedex 05 – Tél. : 01 55 42 63 71 – Fax : 01 44 27 67 50 – E-Mail : [email protected]
SPECTRA ANALYSE n° 255 • Avril - Mai 2007
33
TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
I - Introduction
Si l’Homme a fait l’usage de substances toxiques
à des fins belliqueuses depuis l’Antiquité, le terme
moderne d’«arme chimique» n’a réellement pris
tout son sens que depuis la Première Guerre Mondiale, un conflit qui fut marqué par l’utilisation
massive de gaz de combat (gaz moutarde, chlore,
phosgène etc.) des deux côtés du front (1). De nouveaux agents de guerre chimique (neurotoxiques
organophosphorés) furent développés pendant
l’Entre-deux-guerres et la Seconde Guerre Mondiale (tabun, sarin, soman) puis pendant la Guerre
Froide (VX et R-VX) mais ne furent pas utilisés.
Toutefois, des armes chimiques furent probablement employées durant le conflit Egypte-Yemen
(1963-1967) et firent l’objet d’une utilisation avérée et à grande échelle durant la guerre Iran-Irak
(1983-1988). L’usage d’armes chimiques s’est ensuite étendu à des actes terroristes notamment
ceux commis par des membres de la secte Aum au
Japon, durant les années 1994-1995, à Matsumoto
puis dans le métro de Tokyo au moyen du sarin
(2).
Après de difficiles négociations, la Convention
d’Interdiction des Armes Chimiques (CIAC),
signée en 1993 à Paris, est entrée en vigueur en
1997. Ce traité international prohibe l’utilisation, le
développement, la production et le stockage d’armes chimiques et impose la destruction des stocks
existants. L’Organisation pour l’Interdiction des
Armes Chimiques (OIAC) (3) est chargée de contrôler le respect de la convention en procédant notamment à l’inspection de sites suspects. Les prélèvements réalisés sur ces sites peuvent être analysés
sur place ou envoyés à des laboratoires désignés.
Bien que de nos jours l’utilisation d’armes chimiques lors de conflits soit peu probable, il existe une
réelle menace concernant leur utilisation à des fins
terroristes. Il est donc indispensable de disposer
de techniques analytiques performantes permettant de détecter et identifier les agents de guerre
chimique et leurs produits de dégradation.
II - Les techniques d’analyse des
agents neurotoxiques et de leurs
produits de dégradation (4)
Figure 1
Voie de dégradation
des agents de
guerre chimique
neurotoxiques de
types G et V.
34
Les neurotoxiques organophosphorés sont les plus
toxiques des agents de guerre chimique répertoriés. Leur stabilité dans l’environnement est relativement limitée. En effet, ces agents s’hydrolysent au
cours du temps (figure 1) pour donner d’abord les
acides alkyl alkylphosphoniques spécifiques de
SPECTRA ANALYSE n° 255 • Avril - Mai 2007
l’agent initial puis les acides alkylphosphoniques
non spécifiques.
1. Chromatographie en phase gazeuse et
couplage chromatographie en phase gazeuse
/ spectrométrie de masse
La chromatographie en phase gazeuse (CG) est la
technique la plus couramment employée pour la
séparation d’agents neurotoxiques qui constituent
des composés volatils et thermiquement stables
(5). Cette technique, qui procure une grande
efficacité de séparation, peut être couplée avec
différentes techniques de détection telles que la
photométrie de flamme, l’ionisation de flamme,
l’émission atomique ou la spectrométrie de masse
(SM). Cette dernière est particulièrement intéressante pour l’identification des composés. Des
sources d’ionisation par impact électronique (IE)
ou par ionisation chimique (IC) sont classiquement utilisées et fournissent des informations très
complémentaires. En effet, l’IE génère de nombreux ions fragments permettant d’identifier un
composé à partir d’une bibliothèque de spectres
existants tandis que l’IC préserve l’ion pseudomoléculaire conduisant à la masse moléculaire du
composé. Cependant, la CG présente quelques
inconvénients tels que la dérivation chimique
nécessaire pour l’analyse des produits de dégradation en raison de leur faible volatilité ou l’échange
de solvant requis pour l’analyse d’échantillons
aqueux.
2. Couplage chromatographie en phase
liquide et spectrométrie de masse
La chromatographie en phase liquide (CL) à polarité de phases inversée est souvent utilisée pour un
criblage rapide des produits de dégradation en milieu aqueux (6) car elle ne nécessite pas de dérivation chimique ni d’échange de solvant. La plupart
des agents de guerre chimique et leurs produits
de dégradation étant dépourvue de groupement
chromophore, la détection par spectrométrie de
masse est souvent employée.
3. Electrophorèse capillaire et couplage
électrophorèse capillaire / spectrométrie de
masse
L’électrophorèse capillaire (EC) est moins couramment employée mais présente des propriétés intéressantes, en particulier pour l’analyse de composés chargés ou très polaires qui sont généralement
très rapidement élués en CL et donc difficilement
séparables. Cette technique permet par ailleurs de
bénéficier de principes de séparation très complémentaires à ceux de la chromatographie, d’une
grande efficacité de séparation et d’une très faible
consommation d’échantillon (quelques nanolitres
injectés) et de solvant. L’analyse de produits de dé-
Technologie appliquée
Le couplage EC/SM pour la détection et l’identification
de produits de dégradation d’agents de guerre chimique
gradation d’agents de guerre chimique par électrophorèse capillaire implique en général une détection UV indirecte (7). Cependant, la sensibilité est
alors limitée par le faible trajet optique parcouru
et la faible quantité d’échantillon injectée. La détection par fluorescence induite par laser est très
sensible mais nécessite la dérivation des composés pour leur adjoindre un fluorophore adéquat.
Le couplage de l’électrophorèse capillaire avec la
spectrométrie de masse (8) connaît un développement important depuis une dizaine d’années dans
des domaines d’application très variés car il permet de bénéficier à la fois de la sensibilité et de
la puissance d’identification de la spectrométrie de
masse. Cependant, le couplage EC/SM a été peu
utilisé pour l’analyse de produits de dégradation
d’agents de guerre chimique (9, 10) L’objectif de
ce travail est de développer et optimiser des méthodes utilisant le couplage EC/SM pour la détection et l’identification de produits de dégradation
d’agents neurotoxiques dans diverses matrices.
III - Intérêt du couplage EC/SM pour
la détection et l’identification de
produits de dégradation d’agents
neurotoxiques
Conditions opératoires de l’électrophorèse capillaire
nature
silice vierge
longueur
85 cm
capillaire
diamètre interne
50 μm
mode d’injection
par pression (hydrodynamique)
injection classique (sans
50 mbars pendant 10 s
préconcentration)
injection
injection réalisée lors des expériences de
50 mbars pendant 130 s
préconcentration
séparation
électrolyte
tension
température
HCOONH4 15 mM ajusté à pH 8,8
+20 kV
22°C
Conditions opératoires du spectromètre de masse
paramètres
de source
paramètres
de nébulisation
liquide
additionnel
tension au capillaire d’introduction
tension en sortie du capillaire de
transfert
tension à l’écrémeur 1
tension à l’écrémeur 2
gamme de masse analytique
pression du gaz nébulisant (N2)
température du gaz séchant(N2)
débit du gaz séchant
composition
débit (délivré par un pousse-seringue)
+3,5 kV
-60 V
-20 V
-10 V
m/z 50-500 Th
7 psi
200°C
5 L.min-1
MeOH/H2O/NH4OH
(75:25:2, v/v/v)
4 μL.min-1
1. Problématique du couplage EC/SM
Tableau I
3D
Un système d’électrophorèse capillaire (HP CE,
Agilent Technologies) couplé à un spectromètre de masse (Esquire3000TM, Bruker Daltonics)
équipé d’une source d’électronébulisation (ESI) et
d’un piège ionique (ITMS) a été utilisé lors de cette
Figure 2
Schéma représentant une interface EC/SM coaxiale à liquide
additionnel (1 psi = 6894,76 Pa)
étude. Le couplage entre ces deux appareils est assuré par une interface coaxiale à liquide additionnel représentée en Figure 2. Le débit de l’électrophorèse capillaire étant trop faible (de l’ordre de la
centaine de nL.min-1) pour permettre la formation
d’un nébulisat stable, il est nécessaire d’introduire
un liquide additionnel de débit plus adapté
(3-6 μL.min-1). Les conditions opératoires de l’électrophorèse capillaire et du spectromètre de masse
sont répertoriées dans le Tableau I.
Plusieurs paramètres interviennent dans l’élaboration d’une méthode d’analyse par EC/SM. L’optimisation des conditions de détection des composés (mode d’ionisation, paramètres de nébulisation
et de piégeage des ions) peut être réalisée en introduction directe. La séparation par électrophorèse
capillaire est déterminée par la composition de
l’électrolyte de séparation. Dans le cas d’un couplage avec la spectrométrie de masse, le choix des
électrolytes est cependant limité aux espèces volatiles (formiate, acétate,…). Le pH de l’électrolyte
détermine la vitesse de l’écoulement électroosmotique et le degré d’ionisation des composés qui
affectent la durée de l’analyse et la sélectivité de
la séparation. L’électrolyte peut aussi être préparé
dans un milieu hydro-organique afin d’améliorer la
sélectivité. La force ionique de l’électrolyte influe
également beaucoup sur la vitesse de l’écoulement
électroosmotique et sur l’intensité du signal. Différents traitements chimiques du capillaire peuvent être réalisés pour permettre, par exemple, la
Conditions
opératoires pour
l’électrophorèse
capillaire et la
spectrométrie de
masse
SPECTRA ANALYSE n° 255 • Avril - Mai 2007
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
acides alkyl alkylphosphoniques
acides alkylphosphoniques
Composé (M)
EEPA
MPrPA
PrMPA
MEPA
EMPA
IPA
PrPA
EPA
PhPA
MPA
R1
C2H5
(CH3)(CH2)2
CH3
C2H5
CH3
(CH3)2CH
(CH3)(CH2)2
C2H5
C6H5
CH3
R2
C2H5
CH3
(CH3)(CH2)2
CH3
C2H5
H
H
H
H
H
Mw
(g.mol-1)
138
138
138
124
124
124
124
110
158
96
Ordre de migration
(cf. figure 3)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
[M-H](m/z)
137
137
137
123
123
123
123
109
157
95
Ion fragment
majoritaire (m/z)
109
105
95
91
95
79
79
79
79
79
Tableau II
Structures, masses
molaires et rapports
m/z des ions pseudomoléculaires et
des ions fragments
majoritaires
correspondant
aux acides alkyl
alkylphosphoniques
et
alkylphosphoniques
étudiés. E : éthyl, M :
méthyl, Pr : propyl, I :
isopropyl, Ph : phényl
suppression (greffage au polyacrylamide, au polyvinylalcool, aux alkylcelluloses etc.) ou l’inversion
du flux électroosmotique (greffage au bromure
d’hexadiméthrine). Enfin, le débit et la nature du
liquide additionnel peuvent également influencer
fortement l’intensité du signal. Le liquide additionnel est souvent constitué d’un mélange d’eau et de
solvant organique. Selon le mode d’ionisation utilisé, un acide ou une base volatile peut être ajouté
au liquide additionnel pour améliorer la protonation (mode d’ionisation positif ) ou la déprotonation (mode d’ionisation négatif ) des composés.
2. Couplage électrophorèse capillaire /
spectrométrie de masse en tandem
pour l’identification d’acides alkyl
alkylphosphoniques isomères
L’étude d’un mélange de 10 acides alkylphosphoniques et alkyl alkylphosphoniques isomères à
50 μg.mL-1 chacun dans l’eau pure nous a permis
d’évaluer la capacité de séparation et d’identification du couplage EC/SM/SM (voir tableau II et
figure 3). L’électrolyte de séparation est constitué
de formiate d’ammonium 15 mM ajusté à pH 8,8
par une solution d’hydroxyde d’ammonium. Les
analytes étant détectés en mode d’ionisation négatif, 1% de solution d’hydroxyde d’ammonium
à 30% est ajouté au liquide additionnel constitué
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SPECTRA ANALYSE n° 255 • Avril - Mai 2007
d’un mélange MeOH/H2O 3:1 (v/v) pour favoriser
la déprotonation des composés.
On peut constater sur l’électrophorégramme obtenu (voir figure 3a) une séparation efficace des
acides isopropylphosphonique (IPA) et propylphosphonique isomères (PrPA) (identifiés 6 et 7
sur la figure 3) en raison de leurs constantes d’acidité légèrement différentes (pKa1(IPA)=8,44 et
pKa1(PrPA)=8,18). Ce résultat présente un intérêt
certain car la séparation de ces deux composés en
CL est impossible sur des phases apolaires classiques de type silice greffée, et nécessite l’utilisation
de colonnes particulières constituées de carbone
graphite poreux (11). En revanche, les constantes
d’acidité très proches des différents acides alkyl
alkylphosphoniques isomères ne permettent pas
d’obtenir leur séparation. Toutefois, l’identification sans ambiguïté de chacun de ces composés
a pu être réalisée grâce à des expériences de EC/
SM/SM au cours desquelles le module d’acquisition alterne l’enregistrement de spectres SM et de
spectres SM/SM grâce à l’application d’une amplitude d’excitation déterminée par l’opérateur et
permettant la fragmentation des espèces présentes
dans le piège ionique. Les spectres SM/SM correspondant aux acides alkyl alkylphosphoniques
(figure 3b) montrent en effet la présence d’ions
fragments spécifiques à chaque isomère. Toutefois, les spectres SM/SM obtenus à partir de la
fragmentation des acides alkylphosphoniques
Technologie appliquée
Le couplage EC/SM pour la détection et l’identification
de produits de dégradation d’agents de guerre chimique
Figure 3
a)
Electrophérogramme
EC-SM d’un mélange
d’acides alkyl- et alkyl
alkylphosphoniques
à 50 μg.mL-1 dans
l’eau pure. Capillaire
en silice vierge,
85 cm x
50 μm d.i.. Electrolyte
de séparation :
HCOONH4 15 mM
ajusté à pH 8,8
par l’hydroxyde
d’ammonium.
Tension appliquée :
+20 kV. Détection
par spectrométrie de
masse. Spectres SMSM correspondants
b) aux acides alkyl
alkylphosphoniques
et c) aux acides
alkylphosphoniques.
(figure 3c) montrent la formation d’un ion fragment commun (m/z 79).
L’ensemble de ces résultats illustre la complémentarité de l’EC et de la SM pour l’identification des
composés isomères. En effet, d’une part, la mise
en œuvre du couplage EC/SM/SM résout le problème de co-migration des acides alkyl alkylphosphoniques et, d’autre part, la séparation par électrophorèse capillaire permet d’identifier des acides
alkylphosphoniques qui présentent les mêmes
ions fragments et ne peuvent pas, dès lors, être
différenciés par la SM/SM.
Cette méthode a ensuite pu être utilisée avec succès pour la détection et l’identification des analytes
en EC/SM et EC/SM/SM dans des extraits de sol
dopés à 5 μg.mL-1 avec les 10 composés présentés
dans le Tableau II (13).
3. Amélioration de la sensibilité
En EC/SM, la sensibilité est souvent inférieure à
celle obtenue en CL/SM en raison du très faible
volume d’échantillon injecté. Dans notre cas, la
sensibilité de la détection par spectrométrie de
masse est de plus limitée pour les analytes de faibles rapports m/z, en particulier pour les acides
éthylphosphonique (composé 8) et méthylphosphonique (composé 10) en raison de leur efficacité d’ionisation relativement faible (12, 13). De
nombreuses techniques de préconcentration électrophorétique existent pour augmenter la quantité ou directement le volume d’échantillon injecté
classiquement limité à 1% du volume du capillaire
(14). Parmi ces techniques, la préconcentration de
Figure 4
Schéma illustrant
le principe de
préconcentration
de l’échantillon par
amplification de
champ où les cercles
rouges représentent
les analytes, Kj et Ej
la conductivité et le
champ électrique de
la zone j, vij la vitesse
de migration d’un
analyte i dans la
zone j.
l’échantillon par amplification de champ (FASS)
peut être facilement appliquée dans le cas de matrices faiblement conductrices puisqu’elle nécessite
simplement l’utilisation d’un électrolyte de séparation de conductivité plus élevée, d’un facteur 10
environ, que celle de l’échantillon. Le champ électrique régnant dans la zone électrolyte fortement
conductrice est ainsi beaucoup plus faible que
celui régnant dans la zone échantillon faiblement
conductrice. Les analytes, accélérés dans la zone
échantillon, sont alors fortement ralentis lorsqu’ils
pénètrent dans la zone échantillon provoquant
ainsi le rassemblement des analytes dans une zone
étroite et concentrée (figure 4). Cette technique de
préconcentration a permis d’augmenter la sensibilité d’un facteur 10 dans des matrices environnementales faiblement conductrices telles que l’eau
potable ou l’eau de rivière. Ainsi, des limites de déSPECTRA ANALYSE n° 255 • Avril - Mai 2007
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
tection compatibles avec les exigences de l’OIAC
(inférieures à 1 ppm) ont pu être atteintes.
Dans le cas de matrices fortement conductrices
telles que des extraits de sol ou des échantillons
biologiques (urine, sérum, plasma,…) la préconcentration des analytes par isotachophorèse peut
être réalisée (15). Le principe de cette technique
repose sur l’utilisation d’un ion meneur et d’un ion
terminal de mobilité électrophorétique respectivement supérieure et inférieure à celle des composés à concentrer. Les composés dont les mobilités
électrophorétiques ne sont pas comprises entre
celles des ions meneur et terminal ne sont pas
préconcentrés ce qui peut être très intéressant s’il
s’agit de composés matriciels. L’isotachophorèse
est assez délicate à mettre en œuvre en raison des
nombreux paramètres à optimiser (longueur des
zones injectées, concentration des ions meneur
et terminal, pH,…) mais procure souvent des facteurs de préconcentration élevés. Cette technique
est actuellement en cours d’optimisation pour la
préconcentration dans des matrices fortement
conductrices (extraits de sol et urine) et donne des
résultats prometteurs.
IV - Conclusion
Cette étude illustre la grande complémentarité
de l’électrophorèse capillaire et de la spectrométrie de masse pour l’identification de produits de
dégradation d’agents de guerre chimique. La réalisation d’expériences EC/SM/SM s’est révélée particulièrement intéressante pour la différenciation
d’acides alkyl alkylphosphoniques isomères non
séparés par électrophorèse capillaire. La sensibilité
limitée par le faible volume d’échantillon injecté en
électrophorèse capillaire de zone a pu être améliorée d’un facteur 10 dans des matrices environnementales faiblement conductrices (eau potable et
eau de rivière) en utilisant une méthode de préconcentration électrophorétique en ligne simple
à mettre en œuvre et se déroulant de manière simultanée à la séparation. L’amélioration de la sensibilité dans des matrices fortement conductrices
telles que des extraits de sol ou des échantillons
biologiques (urine) est actuellement développée
en réalisant une préconcentration des composés
par isotachophorèse. Le couplage EC/SM apparaît
donc constituer une technique prometteuse pour
la détection et l’identification de produits de dégradation d’agents de guerre chimique fournissant
des informations très complémentaires à celles obtenues par CL/SM grâce aux principes de séparations caractéristiques de l’électrophorèse.
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