Etude des métabolites secondaires de deux scrophulariacées du
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Etude des métabolites secondaires de deux scrophulariacées du
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE EL HADJ LAKHDAR-BATNA FACULTE DES SCIENCES – DEPARTEMENT DE CHIMIE THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES Spécialité CHIMIE Présentée par Melle Souad ARRIF Thème Etude des métabolites secondaires de deux scrophulariacées du genre Verbascum: V. ballii et V. dentifolium. JURY Yassine BOUZAHER Professeur Université de Batna Président Mohammed BENKHALED Professeur Université de Batna Rapporteur Fadila BENAYACHE Professeur Université de Constantine Examinatrice Belkacem LEGSEIR Professeur Université de Annaba Examinateur Kaddour LAAMARA Professeur Université d’Oum El Bouaghi Examinateur Abdelhamid BENKOUIDER Maître de Conférences Université de Batna Examinateur 2008/2009 ABREVIATIONS UTILISEES Ac acétate AcOEt acétate d’éthyle Api apinose Bz benzyl CC chromatographie sur colonne CCM chromatographie sur couche mince CDCl3 chloroforme deutéré CD3OD méthanol deutéré CHCl3 chloroforme Cinn cinnamoyle CLHP chromatographie liquide haute performance COSY correlated spectroscopy 1D monodimensionnel 2D bidimensionnel d doublet dd doublet de doublet DEPT distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO diméthylsulfoxyde EP Ether de pétrole ESI electro spray ionisation Fuc fucose g gramme Glc glucose Gal galactose t triplet s singulet sl singulet large m multiplet MeOH méthanol RMN 1H résonance magnétique nucléaire du proton RMN 13C résonance magnétique nucléaire du carbone HMBC heteronuclear multiple bonding connectivity HSQC heteronuclear single quantum connectivity 2 H2O eau IR infra-rouge J constante de couplage m/z masse/charge électrique Me méthyle mg milligramme MHz megahertz ml millilitre MS/MS mass spectroscopy / mass spectroscopy nd non déterminé nm nanomètre NOESY nuclear overhauser effect spectroscopy Ph phényle ppm partie par million Qui quinovose Rf Rapport frontal Rha rhamnose RP-18 reversed phase silica with C-18 functional groups SM spectrométrie de masse TMS tétraméthylsilane UV ultra-violet Xyl xylose λ longueur d’onde δ déplacement chimique exprimé en ppm 3 REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier très sincèrement mon directeur de thèse Monsieur le Professeur Mohammed Benkhaled pour m’avoir accueilli, il y a maintenant un certain nombre d’années, au sein de son laboratoire. Merci de m’avoir fait confiance et encouragé tout au long de ces années. Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Monsieur le professeur Yassine Bouzaher (Université de Batna) d’avoir aimablement accepté de présider le jury de cette thèse. Je remercie vivement Madame le Professeur Fadila Benayache (Université de Constantine), Monsieur le professeur Belkacem Legseir (Université de Annaba), Monsieur le professeur Kaddour Laamara (Université d’Oum El Bouaghi) et Monsieur Abdelhamid Benkouider, Maître de Conférences (Université de Batna) d’avoir bien voulu juger ce travail. Je remercie le Professeur Catherine Lavaud, Professeur de l’UFR de pharmacie de l’université de Reims Champagne-Ardenne, pour la réalisation des spectres de RMN. Mes remerciements vont également à Monsieur Christophe Long du Centre de Recherche sur les Substances Naturelles UMS CNRS-Pierre Fabre 2597Toulouse pour la réalisation des spectres de masse. Mes remerciements vont également à mes collègues de labo, merci à vous tous. 4 Je tiens particulièrement à exprimer toute ma gratitude à ma famille dont le soutien a été essentiel tout au long de mes études, et tout particulièrement au cours de ce travail. Baba, je suis fière d’avoir eu un père tel que toi à mes côtés tout au long de ces années. Tu m’as appris beaucoup de choses, et je te suis très reconnaissante pour la patience et le courage dont tu as fait preuve à mon égard… Un énorme merci à Ma mère, qui m’a soutenue, rassurée et qui a su prendre sur elle dans les moments difficiles. Merci pour tout ce que tu m’as apportée… Merci aussi à mes frères, Abdelkader et Kheireddine, pour l’amour qu’ils me portent et à qui je souhaite plein de bonnes choses… Un grand merci aussi à ma sœur Samira. Tu as toujours cru en moi, alors juste merci pour ta tendresse qui m’accompagne chaque jour. Pensée particulière à ceux qui ne peuvent être là physiquement mais qui sont présents dans mon coeur. Un merci tout particulier à mes amies : Amel, Habiba, Fouzia et Ahlem Je terminerai en remerciant tous ceux que je n’ai pas cités mais qui sont présents. Merci à tous et à toutes. 5 TABLE DE MATIERES INTRODUCTION……………………………………………………………………………….1 1ère PARTIE : Synthèse bibliographique…………………………………………………………5 CHAPITRE I : Présentation du genre Verbascum……………………………………………….6 I.1. Caractéristiques botaniques………………………………………………..7 I.2. Usage traditionnel………………………………………………………….8 I.3. Activités biologiques reconnues…………………………………………...9 I.4. Etudes phytochimiques antérieures………………………………………12 I.4.1. Iridoïdes…………………………………………………………..13 I.4.2. Saponosides………………………………………………………16 I.4.3. Autres composés…………………………………………………20 CHAPITRE II : Etude des iridoïdes……………………………………………………………24 II.1. Définition des iridoïdes…………………………………………………..25 II.2. Classification des iridoïdes……………………………………………….26 II.2.1. Les iridoïdes glycosilés…………………………………………..28 II.2.2. Les iridoïdes simples (non glycosilés)……………………………29 II.2.3. Les séco-iridoïdes………………………………………………...30 II.2.4. Les bis-iridoïdes………………………………………………….31 II.3. Propriétés biologiques des iridoïdes……………………………………..31 II.4. Biosynthèse des iridoїdes………………………………………………..33 CHAPITRE III : Etude des saponosides……………………………………………………….39 III.1. Définition des saponosides……………………………………………….40 III.2. Classification des saponosides…………………………………………...40 III.2.1. Les saponosides stéroïdiques……………………………………..40 III.2.2. Les saponosides triterpéniques…………………………………...43 III.3. Propriétés biologiques des saponosides………………………………...47 III.4. Biosynthèse des saponosides…………………………………………...50 2ème PARTIE : Travail personnel……………………………………………………………….53 CHAPITRE IV : Investigation chimique de Verbascum ballii…………………………………54 IV.1. Aspect botanique et lieux d’existence……………………………………55 IV.2. Travaux antérieurs sur Verbascum ballii…………………………………56 6 IV.3. Résultats et discussions…………………………………………………..56 IV.3.1. Extraction……………………………………………………………56 IV.3.2. Séparation et purification……………………………………………56 IV.3.3. Détermination de structures…………………………………………58 Composé A…………………………………………………………...58 Composé B……………………………………………………………63 Composé C……………………………………………………………71 Composé D…………………………………………………………...75 Composé E……………………………………………………………79 Composé F……………………………………………………………85 Composé G…………………………………………………………...96 Composé H………………………………………………………….102 CHAPITRE V : Investigation chimique de Verbascum dentifolium………………………….109 V.1. Aspect botanique et lieux d’existence………………………………...110 V.2. Travaux antérieurs sur Verbascum dentifolium………………………111 V.3. Résultats et discussions……………………………………………….111 V.3.1. Extraction………………………………………………………..111 V.3.2. Séparation et purification………………………………………..112 V.3.3. Détermination de structures……………………………………..112 Composé I…………………………………………………………...112 Composé J…………………………………………………………...112 Composé K………………………………………………………….119 Composé L…………………………………………………………..123 Composé M………………………………………………………….126 Composé N………………………………………………………….129 CONCLUSION………………………………………………………………………………..137 CHAPITRE VI : Partie expérimentale………………………………………………………...143 VI.1. Matériel et méthodes………………………………………………...144 VI.1.1. Matériel végétal et extraction…………………………………...144 VI.1.2. Techniques analytiques de séparation…………………………..144 VI.1.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)………………144 VI.1.3. Techniques préparatives de séparation …………………………145 VI.1.3.1. Chromatographie sur colonne ouverte (CC)………………..145 7 VI.1.3.2. Chromatographie sur couche épaisse (CCE)……………….145 VI.1.4. Méthodes physicochimiques…………………………………….146 VI.1.4.1. Spectrométrie UV………………………………………….146 VI.1.4.2. Spectrométrie IR…………………………………………...146 VI.1.4.3. Spectrométrie de masse……………………………………146 VI.1.4.4. Spectrométrie de RMN…………………………………….146 VI.1.4.5. Pouvoir rotatoire…………………………………………...147 VI.1.5. Méthodes chimiques……………………………………………147 VI.1.5.1. Hydrolyse acide de saponoside (composé F)……………...147 VI.2. Contrôle chromatographique des extraits…………………………147 VI.2.1. Extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii……...147 VI.2.2. Extrait acétate d’éthyle de V. dentifolium……………………147 VI.3. Séparation et purification…………………………………………148 VI.3.1. Extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii………148 VI.3.1.1. Séparation et purification de l’extrait méthanolique des parties aériennes de V .ballii……………………………148 VI.3.1.2. Composés isolés de l’espèce V. ballii…………………...149 VI.3.2. Extrait acétate d’éthyle des racines de V. dentifolium………...152 VI.3.2.1. Séparation et purification de l’extrait acétate d’éthyle des racines de V. dentifolium………………………………...152 VI.3.2.2. Composés isolés de l’espèce V. dentifolium……………...153 BIBLIOGRAPHIE ……………………………………………………………………………155 8 INTRODUCTION 9 L’histoire nous rapporte qu’au fil des âges, l’homme n’a cessé de chercher de subvenir à ses besoins en puisant dans la nature qui lui procure aliments, abris, vêtements, outils de défense et lui assure ses besoins médicaux qu’il découvre en général dans l’utilisation de plusieurs plantes qui s’avèrent très bénéfiques pour sa santé, guérissant ses maladies bénignes telles que le rhume, la toux et la diarrhée, ou plus sérieuses comme la tuberculose, la malaria et autres maladies plus graves. Aujourd’hui et malgré les progrès réalisés en médecine, plusieurs populations ont recours aux plantes pour se soigner, soit par inaccessibilité aux médicaments prescrits par la médecine moderne, soit parce que ces plantes ont donné des résultats thérapeutiques très encourageants et à moindres effets secondaires remarqués lors de leur utilisation, soit parce qu’elles sont moins agressives et moins nocives pour l’organisme. L’industrie pharmaceutique exploite les plantes pour extraire leurs principes actifs. A titre d’exemple, on peut citer la quinine (dérivé du genre Cinchona) employée contre la malaria, la digitoxine (du genre Digitalis) utilisée contre les maladies cardiovasculaires, l’éphédrine (du genre Ephedra) que l’on retrouve dans de nombreuses prescriptions contre les rhumes, ou encore le taxol (du genre Taxus) pour son action anticancéreuse mondialement reconnue. L’investigation des plantes représente actuellement un potentiel inestimable pour la découverte de nouvelles substances. Le présent travail, rentrant dans le cadre du programme de recherche du laboratoire destiné à la valorisation de la flore locale, s’inscrit donc dans cette logique qui consiste en la découverte de nouveaux composés ou principes actifs à débouchés thérapeutiques. Pour cela, deux plantes de la famille Scrophulariaceae [1] , en l’occurrence Verbascum ballii (Batt.) M. Qaiser et Verbascum dentifolium Del., m’ont été confiées en vue d’une investigation chimique. La sélection de ces deux espèces s’est basée essentiellement sur la grande utilisation en médecine traditionnelle des plantes Scrophulariaceae en général. Pour preuve, le nom de la famille et du genre Scrophularia est lié à l’usage que l’on fait de l’espèce Scrophularia vernalis [2] communément appelée scrophulaire jaune, pour guérir la scrofule, cette maladie qui constitue un ensemble de manifestations par lesquelles se révèle une infection tuberculaire chez les enfants sujets aux diathèses essudatives de la peau et des muqueuses, et qui souffrent également d’inflammations des premières voies respiratoires, de végétations adénoïdes et d’enflement des glandes du cou, des aisselles et de l’aisne. On ne connaît pas d’usage en médecine traditionnelle 10 à l’espèce V. ballii, probablement en raison de sa rareté. L’espèce V. dentifolium est utilisée pour le traitement des conjonctivites, de la vue brouillée et de la cataracte. Les diverses investigations phytochimiques menées sur cette famille et plus particulièrement sur le genre Verbascum auquel appartiennent ces deux espèces, ont montré une richesse remarquable en métabolites secondaires d’un grand intérêt biologique. En effet et comme il sera rapporté ultérieurement, les études chimiques réalisées sur le genre ont mis en évidence la présence de saponosides, iridoïdes, alcaloïdes, phenyl éthanoïdes glycosilés, lignanes glycosilés, stérones, flavones et flavonolignanes. La recherche bibliographique exhaustive effectuée sur les deux espèces V. ballii et V. dentifolium et qui a donné une motivation supplémentaire pour la concrétisation de ce travail, a montré qu’elles n’ont fait l’objet d’aucune étude phytochimique. Notre travail sera présenté comme suit : 1ère PARTIE : Synthèse bibliographique CHAPITRE I : Présentation du genre Verbascum Caractéristiques botaniques Usage traditionnel Activités biologiques reconnues Etudes phytochimiques antérieures CHAPITRE II : Etude des iridoïdes Définition des iridoïdes Classification des iridoïdes Propriétés biologiques des iridoïdes Biosynthèse des iridoїdes CHAPITRE III : Etude des saponosides Définition des saponosides Classification des saponosides Propriétés biologiques des saponosides Biosynthèse des saponosides 2ème PARTIE : Travail personnel CHAPITRE IV : Investigation chimique de Verbascum ballii 11 Aspect botanique et lieux d’existence Travaux antérieurs sur Verbascum ballii Résultats et discussion Extraction Séparation et purification Détermination de structures CHAPITRE V : Investigation chimique de Verbascum dentifolium Aspect botanique et lieux d’existence Travaux antérieurs sur Verbascum dentifolium Résultats et discussion Extraction Séparation et purification Détermination de structures CONCLUSION CHAPITRE VI : Partie expérimentale BIBLIOGRAPHIE 12 1 ERE PARTIE SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 13 CHAPITRE I PRESENTATION DU GENRE VERBASCUM (SCROPHULARIACEAE) 14 I.1. Caractéristiques botaniques Les plantes Scrophulariaceae sont généralement à fleurs irrégulières, à corolle de cinq pétales répartis en deux lèvres. Etamine postérieure fréquemment avortée et remplacée par une écaille, parfois deux étamines seulement. Elles sont réparties en deux types, celles à corolle tubuleuse et celles à corolle évasée. C’est à ce dernier type qu’appartient le genre Verbascum [2]. Tableau I.1: Classification systématique Super-embranchement Spermatophyta Embranchement Angiospermae Classe Eudicotyledonae Sous-classe Asteridae Ordre Lamiales Famille Scrophulariaceae Tribu Verbasceae Genre Verbascum Les plantes de ce genre sont reconnaissables à leurs fleurs jaunes et aux dimensions de leur tige florale qui peut atteindre, voire même dépasser le mètre. Quelques unes ont des feuilles très velues, d’autres presque glabres ou velues seulement sur la page inférieure. Elles affectionnent toutes les terrains chauds, secs et bien exposés au soleil [1]. On les retrouve parfois même parmi les décombres. Elles fleurissent généralement à partir de juin. Ces plantes dicotylédones pour la plupart bisannuelles et par ailleurs facilement hybridables [1] , sont communément appelées molènes. Sous le nom de molène , on regroupe différentes espèces et en particulier la molène thapsus appelée bouillon blanc ou fleur de grand chandelier (Verbascum thapsus) et la molène faux phlomis (Verbascum phlomoides). Les principales espèces du genre Verbascum sont regroupées dans le tableau ci-dessous. 15 Tableau I.2: Principales espèces du genre Verbascum Nom latin Nom vernaculaire Verbascum alpinum Molène des Alpes Verbascum blattaria Herbe aux mites ou Molène blattaire Verbascum boerhavii Molène de mai Verbascum chaixii Molène de Chaix Verbascum chaixii austriacum Molène d’Autriche Verbascum Molène Faux-Bouillon-blanc ou Molène densiflorum (Verbascum thapsiforme) à fleurs denses Verbascum lychnitis Molène lychnite Verbascum nigrum Molène noire Verbascum phlomoides Molène faux phlomis Verbascum phoeniceum Molène de Phénicie Verbascum pulverulentum Molène pulvérulente Verbascum sinuatum Molène à feuilles sinuées Verbascum thapsus Molène thapsus, Bouillon-blanc Verbascum thapsus crassifolium Molène à feuilles épaisses Verbascum virgatum Molène effilée ou Molène fausse blattaire I.2. Usage traditionnel Les espèces appartenant au genre Verbascum sont très utilisées en phytothérapie. Ainsi les molènes de type bouillon blanc, à l’instar de Verbascum thapsus et Verbascum blattaria [1] , reconnaissables à leurs feuilles très velues, blanchâtres ou grisâtres, sont connues depuis très longtemps pour leurs effets bénéfiques sur le système respiratoire. Les fleurs, préparées en infusion avec de l’eau ou du lait, sont préconisées pour combattre les diverses formes de toux, les bronchites et les extinctions de voix. On les emploie aussi pour calmer l’irritation des muqueuses et favoriser l’expectoration et la fluidification du catarrhe [1] . L’infusion est préalablement filtrée afin d’éliminer les poils. A cet effet, la récolte se fait de la fin du printemps jusqu’à la fin de l’été. Les fleurs sont séchées à l’ombre et conservées en bocaux bien fermés à l’abri de l’humidité et de la poussière [1]. 16 Les fleurs de Verbascum sinuatum L. [3] , plante bisannuelle tomenteuse, sont utilisées contre les maladies oculaires. La fleur cueillie le matin avant le lever du soleil ou le soir quand elle est épanouie, est triturée à travers une gaze propre. Le jus est mis à décanter pendant 3 jours et le surnageant est employé en instillation dans les yeux. Verbascum nigrum [4] ou molène noire constitue un remède doté d’une action prononcée sur l’oreille, sur les voies respiratoires et la vessie en calmant les irritations bronchiques et urinaires ainsi que la toux. Il est également indiqué dans les catarrhes et les rhumes. Les fleurs, feuilles et racines de Verbascum phlomoides [5] , plante robuste à tige raide pouvant atteindre 2 mètres, à grandes feuilles ovales crénelées, font l’objet d’une utilisation thérapeutique. En effet, le mucilage de la plante lui procure des qualités émollientes, adoucissantes, favorables aux irritations respiratoires. Les phytothérapeutes contemporains recommandent parfois le thé chaud à base de la plante en question pour l’asthme et les toux. I.3. Activités biologiques reconnues La plante Verbascum thapsus, soumise à des études biologiques [6], a montré des activités antibactérienne, antitumorale et inhibitrice de la germination des graines. Les tests ont porté sur les extraits alcoolique et aqueux, ainsi que les saponines isolées. Ces dernières ont présenté une activité antibactérienne sur 6 types de bactéries à gram positif et négatif. Une toxicité, même à faible concentration, a été également mise en évidence alors que les extraits n’étaient toxiques qu’à concentration élevée. Pour les extraits aqueux, il a été établi qu’une décoction est plus toxique qu’une infusion, du fait qu’elle peut contenir plus de principes toxiques. Par ailleurs, tous les extraits ont montré des activités antitumorale et inhibitrice de la germination. L’extrait méthanolique des feuilles [7] s’est révélé actif sur les virus herpès de type 1. Les feuilles, racines et fleurs de Verbascum sinuatum [8] présentent des activités antiseptique, antispasmodique, analgésique, antileischmanique et anticancéreuse. Les activités antibactérienne et allopathique de l’extrait méthanolique de la plante ont été mises en évidence par Senatore et collaborateurs [8]. En effet, cette étude a montré que cet extrait possède un effet sur 13 bactéries utilisées. Les bactéries à gram positif se révélant plus sensibles. Un fractionnement bioguidé suivi d’une purification au moyen de diverses méthodes chromatographiques dont la CLHP, ont permis d’identifier 5 principes actifs ayant pour noms : verbascoside 1, sinuatol 2, aucubine 3, luteoline 7-O-β-D-glucoside 4 et ajugol 5. A l’exception du composé 4, tous les autres composés ont présenté une activité antibactérienne. La plus grande activité a été montrée par le verbascoside 1. 17 OH OR H HO O OH HO O HO O OH OH O O OH O H OGlc HOH2C O OH 2 R=Rha 1 3 OH GlcO O HO H OH O HO OH R=H H CH3 OGlc O 4 Dans la médecine traditionnelle turque 5 [9] , l’infusion des fleurs de Verbascum lasianthum est utilisée contre les poussées hémorroïdaires. Afin d’établir une assise scientifique à cette pratique, l’investigation des activités anti-inflammatoire et antinociceptive a été mise en oeuvre. L’extrait aqueux de la plante a montré un faible effet par apport à l’extrait méthanolique. Les essais réalisés sur les 8 produits purs isolés de la plante en question ont montré que l’aucubine 3 et un autre saponoside triterpénique nommé ilwensisaponin A 6, possèdent des activités antiinflammatoire et antinociceptive importantes, et cela sans induire aucune toxicité ou causer des problèmes gastriques [9]. 18 O HO H3C OH O O O H3C HO CH2OH O O HO OH OH O HO HO O HO HO O OH 6 L’extrait méthanolique de Verbascum georgicum [10] a subi une investigation biologique en vue de mettre en évidence d’éventuelles propriétés antimicrobiennes. Les tests ont concerné pas moins de 143 microorganismes. Les résultats ont révélé que l’extrait a un effet inhibiteur sur 10 espèces différentes de bactéries. Il ne montre aucune activité antifongique. Une autre étude, réalisée cette fois par Barbour et collaborateurs [11] , a également montré que les extraits méthanolique et aqueux des fleurs de Verbascum leptostychum possèdent une activité antimicrobienne. Ces résultats complètent, voire confirment, les conclusions établies précédemment et qui indiquent que les plantes du genre Verbascum contiennent des substances aux propriétés antimicrobiennes [12,13]. L’extrait méthanolique des parties aériennes de Verbascum wiedemannianum [14] , a montré une activité antioxydante. La toute première étude biologique ayant concerné l’espèce Verbascum virgatum [15] , a révélé que l’extrait méthanolique des parties aériennes inhibe la germination des graines. Un fractionnement bioguidé a permis d’isoler quatre iridoïdes. Il s’agit de: 6-O-α-L-(2"-O-trans-pcoumaroyl)-rhamnopyranosyl-catalpol 7, 6-O-α-L-(3"-O-trans-p-coumaroyl)-rhamnopyranosyl catalpol 8, ajugol 5 et aucubine 3. Mis à part l’ajugol 5, les trois autres iridoïdes ont montré cette activité. 19 OR1 R2O HO H3C O O H O O H HO OGlc R1 R2 O H 7 HO O 8 H HO I.4. Etudes phytochimiques antérieures Il est connu que les plantes possèdent des métabolites dits « secondaires » par opposition aux métabolites primaires constitués de protéines, glucides et lipides. Ces composés, ceux du métabolisme secondaire, diffèrent en fonction des espèces. Bien que leurs rôles soient encore mal connus, il est cependant clair qu’ils interviennent dans les relations qu’entretient la plante avec les organismes vivants qui l’entourent. Ils sont probablement des éléments essentiels de la coévolution des plantes avec les organismes vivants. Ces différentes relations ont donné lieu à une extrême diversification des composés secondaires. A ce sujet, les espèces du genre Verbascum ont été largement étudiées. Il ressort de ces études que les principaux métabolites secondaires du genre sont constitués de saponosides et d’iridoïdes. Les pages qui suivent tracent un aperçu non exhaustif, pour ne pas tomber dans le fastidieux, des différents composés rencontrés dans le genre Verbascum. 20 I.4.1. Iridoїdes : Les iridoïdes, composés largement répandus dans la nature, sont présents particulièrement au sein de nombreuses plantes médicinales. Leur importance biologique a été largement démontrée. En effet, ils possèdent des propriétés jugées, à juste titre d’ailleurs, fort intéressantes. Ils ont également une importance chimio-taxonomique et biogénétique certaine, du fait qu’ils constituent des intermédiaires importants dans la biosynthèse de nombreux alcaloïdes. Leur ubiquité fait qu'ils sont utilisés comme marqueurs chimio-taxonomiques. Bianco, dans sa recherche systématique des iridoїdes des plantes Scrophulariaceae, a isolé [16,17] à partir de l’extrait éthanolique des parties aériennes de Verbascum sinuatum , outre l’harpagide 9 et l’aucubine 3, deux autres dérivés de l’aucubine 10 et 11. HO RO OH H O O HO MeH OGlc HOH2C 9 H OGlc R= Xyl 10 R= Xyl(3→1)Gal 11 L’aucubine 3 a été également isolée de l’espèce Verbascum georgicum [18] , en plus d’un dérivé du catalpol 12 nommé verbascoside A 13. HO H MeO OH HO O HOH2C O O H O Me O OGlc O H O HOH2C 12 O H OGlc 13 Un autre dérivé de l’aucubine a été isolé des fleurs de Verbascum phlomoides [19]. Il s’agit du phlomoidoside 14. 21 O HO O O O HO H OH O H HOH2C OGlc 14 Des parties aériennes de Verbascum salviifolium [20] , cinq dérivés de l’aucubine et du catalpol (15-19) ont été isolés. GlcO O HOH2C OR H O H O HO HO O H OH OGlc O HOH2C 15 H R= H 16 R= trans-p- coumaroyl 17 OR1 R 2O HO Me OGlc O O H O HOH2C O H OGlc R1 R2 18 H H 19 trans-p-méthoxycinnamoyl COCH3 22 Des iridoїdes glycosilés ont été également isolés des fleurs de Verbascum lasiantum [21] . Il s’agit de : aucubine 3, catalpol 12, ajugol 5, sinuatol 2 et deux dérivés de l’aucubine 20 et 21. OH HO RO Me O O H O HOH2C H OGlc R= trans-p-hydroxycinnamoyl 20 R= trans-p-méthoxycinnamoyl 21 Dans une première étude réalisée sur l’espèce Verbascum pterocalycinum [22] , Tatli a pu caractériser deux iridoides glycosilés, ajugol 5 et picroside 22, ainsi qu’un monoterpène glycosilé : 1-(β-D-glucopyranosyl)-8-hydroxy-3,7-dimethyl-oct-2(E) ,6(E)-diénoate 23. HO H O O OH O O OH HO OH O O HO O O H HOH2C O OH OH OH OH 22 23 A noter que les iridoïdes caractérisés dans ce genre se présentent majoritairement sous forme glycosilée et acylée notamment par l’acide cinnamique et ses dérivés. 23 I.4.2. Saponosides Les saponosides constituent un vaste groupe d’hétérosides très fréquents chez les végétaux. Ils se caractérisent par des effets tensioactifs, leur conférant la propriété de former des solutions moussantes lorsqu’ils sont dissous dans l’eau. Trois études phytochimiques réalisées par Seifert et collaborateurs [23-25] , portant sur les parties aériennes de Verbascum songaricum, ont abouti à l’isolement de six saponosides à squelette oléanane, nommés songarosaponines : A 24, B 25, C 26, D 27, E 28 et F 29. CH2OH HOH2C O HO Me HO O OH Me O H O O O H CH2OH CH2OH O OH OH OH O HO HO OH 24 OH H HOH2C O HO Me HO O O OH Me H O O O OH O HO HO OH 25 24 H CH2OH CH2OH O OH OH CH2OH O H HOH2C HO HO O OH HOH2C O HO OH Me O H O O O H CH2OH OH O HO CH2OH OH O OH 26 O H HOH2C HO HO O OH HOH2C O HO OH Me O OH H O O O OH O HO H CH2OH CH2OH O OH OH 27 CH2OH HOH2C HO HO O OH HOH2C O HO O OH Me H O O O H CH2OH OH O HO R=H 28 R = OH 29 25 CH2OH OH O OH R Une étude, effectuée sur l’espèce Verbascum nigrum [26] , a permis l’identification de deux saponosides 30 et 31. Leurs structures ont été déterminées par les méthodes chimiques et spectroscopiques d’analyse. MeO CH2OH HOH2C O HO Me HO OH Me O H O O O CH2OH CH2OH O OH OH OH O O HO HO OH 30 O HOH2C O HO Me HO O OH Me H O O O OH O O HO HO OH CH2OH CH2OH O OH OH 31 Miyase [27] , dans la recherche systématique des saponosides du genre Verbascum, a étudié les espèces V. sinaiticum, V. thapsiforme, V. fruticulosum et V. roripifolium. Ces investigations ont abouti à l’isolement de 18 saponosides dont 7 se sont avérés originaux. Ils sont désormais connus sous l’appellation de mulleinsaponines I 32, II 33, III 34, IV 35, V 36, VI 37 et VII 38. 26 R1 O OH Me R2 H O O R 4O CH2OH OR 3 R1 R2 R3 R4 32 H H H Glc 33 H H H Rha(1→4)Glc 34 H OH H Rha(1→4)Glc 35 OH OH Glc Rha(1→4)Glc 36 OAc OH Glc Rha(1→4)Glc 37 H OAc Glc Rha(1→4)Glc 38 H OGlc Glc Rha(1→4)Glc Il apparaît ainsi que les saponines triterpéniques à squelette oléanane sont majoritairement présentes au sein du genre Verbascum. Les deux premiers saponosides de type ursane 39 et 40 identifiés dans le genre en question et connus respectivement sous les noms de rosamutine et niga-ichigoside F1, ont été isolés de Verbascum wiedemannianum [28]. HO O HO H HO O H HO R H R = CH3 39 R = CH2OH 40 27 CH2OH OH O OH I.4.3. Autres composés Diverses autres classes de composés ont été identifiées dans le genre. Nous n’allons citer que ceux des espèces les plus connues (Tableau 1.2). Tableau I.3: Quelques métabolites secondaires isolés des plantes du genre Verbascum Type de composé Molécules Plante NH HN H R1 V. pseudonobile N NH R2 [29-31] O O R1= H, R2= H Verbacine 41 R1= OCH3, R2= OCH3 Alcaloïdes N H Verbasitrine 42 N V. phoeniceum [32] CO NH N O O Verballoscenine 43 ORha Phényléthanoїdes glycosilés HO HO O OH O O C O RhaO OH OH V. lasiantum [33] Poliumoside 28 44 OH O HO OH O OCH2 RO O O O O OH HO H3C HO OR O HO OH V. spinosum [34] OH R= H Angoroside A 45 R= CH3 Angoroside C 46 OH Phényléthanoїdes glycosilés CH2OR OO ORha HO OH O HO V. thapsus [35] OH O R= Xyl Arénarioside 47 R= Api Forsythoside B 48 OGlc OH Lignanes glycosilés R V. thapsus [35] O OMe HO OMe R= H Dehydrodiconuferyl glucoside E 49 R= OCH3 Dehydrodiconuferyl glucoside G 50 Stérones O H 24α-éthyl-5α-cholestan-3-one 51 29 H O H 24ζ-éthyl-5α-cholestan-22-en-3-one 52 V. thapsus [36] Stérones O H 24ζ-éthyl-5α-cholestan-7-en-3-one 53 O H 24α-éthyl-5α-cholestan-Δ7,22-dien-3-one 54 COOH V. thapsus [36] Acides sesquiterpéniques HO 3α-hydroxy-drimmanyl-8-méthanoate 55 OH HO O OR V. sinaiticum [37] Flavones OH R= H R= CH3 O Lutéoline 56 Chrysoeriol 57 30 V. sinaiticum [37] R OH O Flavonolignanes HO O OH O CH2OH O R= H R= OCH3 Sinaiticum 58 Hydnocarpin 59 La recherche bibliographique réalisée montre bien la grande diversité du métabolisme secondaire au niveau de ce genre. Il est important de souligner que les iridoïdes du type catalpol, aucubine et harpagide s’y trouvent majoritairement dans le genre. Les saponosides ont été également mis en évidence et sont principalement représentés par des saponosides à squelette oléanane. 31 CHAPITRE II ETUDE DES IRIDOIDES 32 II.1. Définition des iridoïdes Les iridoïdes sont des monoterpènes caractérisés par un squelette cyclopenta [C] pyranique à jonction cis, partiellement hydrogéné. Ils ont une fonction énol-éther très caractéristique qui s’ouvre facilement s’il n’y a pas de sucre lié. L’iridodial 60 en est un exemple [38]. 11 6 4 5 3 7 8 9 1 O 10 Les iridoïdes doivent leur nom à un genre de fourmis, Iridomirmex, d’où furent isolés les premiers représentants du groupe dont l’iridodial 60 et l’iridomyrmécine 61 [38]. H H O O O O H H 60 61 Ce sont des monoterpènes d’origine presque exclusivement végétale. Leur intérêt vient surtout du fait que ce sont des intermédiaires clefs pour la biosynthèse de produits naturels extrêmement importants. Ainsi le plus connu d’entre eux, la loganine 62 et son dérivé la sécologanine 63, sont les précurseurs de plusieurs composés [39] . Parmi ceux-ci, on cite l’akuammicine 64, l’ajmalicine 65, la tabersonine 66 et la catharanthine 67. 33 N CO2Me N H 64 N CO2Me CO2Me H HO H O Me HOC O N H MeO2C 65 O H OGlc H OGlc 62 63 N CO2Me N H 66 N CO2Me N H 67 Schéma II.1 : Biosynthése de quelques alcaloïdes à partir d’iridoїdes II.2. Classification des iridoïdes Les structures des iridoїdes sont extrêmement variées et cela pour plusieurs raisons : Le méthyle porté par le carbone C-8 présente plusieurs degrés d’oxydation : hydroxyméthyle (6-O-coumaroylscandoside 68) [40], époxyde (valtrate 69) [41]. Il est rarement absent. 34 HO OAc COOCH3 CH CH COO O O HO O O O 8 8 H OGlc O O 68 69 Le carbone C-11 peut être inclus dans un groupe carbométhoxyle (loganine 62), carboxylique [42] (acide incarvillique 70) ou hydroxyméthyle (l’aglycone de la suspensolide A 71) même un aldéhyde (scyphiphine A1 72) [44] ou un méthyle (lamiol 73) [45] 11 11 COOH CH2OH AcO O H O HO OH O AcO O 70 71 11 11 H CHO HO OH O HO H CH3 O HO H OH 72 OGlc 73 35 , voire . Dans un certain nombre de cas, ce carbone est absent (globularisicine 74) [46]. H [43] HO H O O H O OGlc O 74 Il peut aussi y avoir une insaturation en 7 (6'-O-sinapoylgeniposide 75) [47], laquelle est une source d’oxydation (globularisicine 74) [46] et d’hydratation (lamiol 73). On notera la possible oxydation du carbone C-6 (globularisicine 74) ainsi que l’éventualité d’une insaturation en 6 (gardénoside 76) [48]. CO2CH3 H CO2CH3 7 O O HO HO O H OGlc OH O O HO O H3CO HO OH HO OCH3 75 76 Ces variations structurales ont permis de classer les iridoïdes en quatre classes : II.2.1. Les iridoïdes glycosilés Les sucres sont portés par les carbones C-1 (gardénoside 76), C-6 (scrospioside B 77) [49] et C-11 (suspensolide A 78) [43] de la génine. 36 O H3C HO O CH2OGlc O O AcO O OAc O HO O HO OGlc O AcO O 77 78 La partie osidique peut être un sucre simple (suspensolide A 78) ou un oligosaccharide (paedéroside 79) [50] . Ces structures, en raison du nombre de fonctions hydroxyles, peuvent également être acylées, engendrant une grande variété de structures. COOH OH O O HO BzO O OH HO HO O O OH 79 II.2.2. Les iridoïdes simples (non glycosilés) Les iridoïdes non hétérosidiques peuvent également être alcaloïdiques (indicaine 80) [51] ou polycycliques (dunnisinine 81) [52]. CHO H N CO2CH3 O HO 80 H O 81 37 II.2.3. Les séco-iridoïdes Les séco-iridoïdes dérivent des iridoïdes par ouverture du cycle cyclopentanique. L’appellation séco-iridoïde regroupe un vaste ensemble de molécules divisées en trois classes, selon la nature de leur génine : - Celles ayant un vinyle en C-9 (sécoxyloganine 82) [53] . La polyfonctionnalisation permet des lactonisations (sweroside 83) [53]. - Celles ayant un groupe éthylidène (oléoside 84) [54] ou hydroxyéthylidène en C-9 (10-OH- oléoside 85) [54]. - Celles qui sont amidifiées par une amine aromatique (fontaphilline 86) [54]. O CO2H CO2CH3 O H O H O H OGlc 82 OGlc 83 CO2H CO2H CO2H CO2H O O HO OGlc OGlc 84 85 O HO O CO2CH3 N 86 38 II.2.4. Les bisiridoïdes Ce sont des molécules issues de la condensation de deux iridoïdes. Des représentants de cette [53] classe ont été rencontrés lors de l’étude des espèces Lonicera (centauroside 87) . Des bisiridoïdes différents sont également présents chez les Oléacées (picconioside I 88) [54]. CHO CO2CH3 H3CO2C HC CO2CH3 C CO2 O O OGlc O OGlc O OGlc OGlc 87 88 Il est à rappeler que le genre Verbascum est en général riche en iridoїdes glycosilés susceptibles d’être acylés. II.3. Propriétés biologiques des iridoïdes Les iridoïdes, composés largement répandus dans la nature, sont principalement connus pour être des principes actifs de plantes jouissant d’un usage non négligeable en phytothérapie. On citera pour cela la valériane et l’harpagophyton utilisés pour traiter les désordres digestifs, la fièvre et soulager les douleurs des parturientes [55] . Ils présentent un large éventail d'activités biologiques du fait de leurs particularités structurales. Ils possèdent des propriétés antimicrobiennes (cantleyoside 89) [56] (scandoside [58] méthyle ester 91) antinociceptives (catalposide 93) [60] , antitumorales (oleuropeine 90) , antiinflammatoires [47] , antioxydantes (scrovcalentinoside , anti allergiques (kutkoside 94) [61] 92) O CO2 OHC O O CO2CH3 HO O OH O OGlc OGlc OGlc 89 90 39 , , immunostimulantes (loganine 62) [62]…etc. CO2CH3 [59] HO H OAc CO2CH3 AcO O H3C O O H HO O O OGlc O O HO H3CO OGlc 91 92 HO O O H O O O O O H O OGlc HO OH OGlc H3CO HO 93 94 L’harpagoside 95 et procumboside 96 sont reconnus comme les principes actifs de la griffe du diable (racines de l’harpagophyton), habituellement utilisée pour soulager les pertes d’appétit et la dyspepsie. Ces iridoїdes possèdent également des effets cardiaques et stimulent la sécrétion d’acide gastrique [63]. HO HO OH O OH O O O O CH3 H3C 95 H OGlc 96 Les iridoïdes ne sont pas connus comme des substances antiradiclaires. Les propriétés antioxydantes constatées chez certains iridoїdes sont le fait d’une acylation par un acide-phénol (cas de l’oleuropioside 97) [64] et/ou la conséquence d’une action indirecte, c'est-à-dire de l’induction d’une enzyme antioxydante telle que la glutathion-S-transférase, par la géniposide [65] ou l’hème oxygénase-1 par le catalposide [66]. 40 HO O HO O H CO2H O OGlc 97 Les iridoïdes de la gentiane, de la centaurée et du ményanthe stimulent les sécrétions gastriques, d’où cette sensation de faim pouvant être à l’origine d’un effet antiasthénique, voire d’une prise de poids [67]. Ancolio et coll. [68] se sont particulièrement intéressés à l’identification des principes actifs de plantes utilisées en médecine traditionnelle africaine et reconnues comme antimalariques. Ces travaux qui ont concerné quatre plantes, ont révélé que les extraits actifs sont riches en iridoїdes. A partir de l’extrait de Pycnanthus angolensis, il a été isolé l'aspéruloside 98 qui s’est avéré actif sur deux souches de Plasmodium falciparum [68]. O O H O H AcOCH2C OGlc 98 II.4. Biosynthèse des iridoїdes Les iridoїdes, monoterpènes en C10, dérivent du pyrophosphate de géranyl. Nombreuses expériences [41,69] basées sur le marquage isotopique, ont montré que le 8-hydroxygéraniol préalablement oxydé en dialdéhyde, subit une cyclisation conduisant à l’iridodial ou le 8-épiiridodial. La glucosylation puis l’oxydation de l’iridodial, donnent le loganoside, précurseur immédiat de la plupart des iridoïdes. Le même processus [41,69] s’appliquant au 8-épi-iridodial, conduit via le 8-épi-loganoside, aussi bien à l’antirrhinoside qu’à l’aucuboside ou au 41 gardénoside. Il s’avère que c’est au niveau du loganoside, que s’opère l’ouverture du cycle (Schéma II.2), aboutissant aux séco-iridoïdes. Cette ouverture conduit au sécologanoside, précurseur de tous les séco-iridoïdes et de beaucoup d’alcaloïdes, particulièrement les alcaloïdes indoliques [70]. O O dialdehyde H H O O O O H H 8- épi- iridodial iridodial COOH COOH HO O H OH O O OGlc OGlc O O HO antirrhinoside aucuboside OGlc HO H gardénoside H HO CO2CH3 O H OGlc loganoside O H CO2CH3 O H OGlc sécologanoside Schéma II.2 : Biosynthèse des iridoїdes Le mécanisme proposé pour la conversion de la loganine en sécologanine est basé sur la formation d’un radical en C-10, suivie d’une rupture de la liaison C7-C8. Le radical en C-7 résultant est transformé en aldéhyde par hydroxylation. Parllèlement à ce mécanisme radicalaire, il y’a lieu de signaler que le départ du radical hydrogène et d’un électron conduit à la formation 42 d’un carbocation. La rupture de la liaison C7-C8 se ferait dans ce cas précis, selon un mécanisme ionique [39]. H CO2CH3 HO O H OH H [EnzFeO]V H loganine CO2CH3 H CO2CH3 H HO O O O . H OH + H OH [EnzFeOH]IV H CO2CH3 H H OHC O O H OH . [EnzFeOH]IV sécologanine H O H OH CO2CH3 HO HO CO2CH3 O H OH Schéma II.3 : Conversion de la loganine en sécologanine Une expérience de marquage isotopique réalisée sur l’espèce Scrophularia umbrosa permis de reproduire une voie biosynthétique des iridoïdes, illustrée par le schéma II.4. 43 [69] ,a O O O O O O O O OGlc OGlc OGlc O O O 8-epi-iridodial 8-epi-iridotrial boschnaloside HO OH O O HO OGlc OH harpagide COOH COOH HO O O O HO OGlc acide épidéoxyloganique HO OGlc O OGlc HO OGlc aucubine Schéma II.4 : Biosynthèse des iridoïdes à partir du 8-épi-iridodial L’utilisation des 8-épi-iridodial (Schéma II.4), 8-épi-iridotrial et le boschnaloside marqués au deutérium, donne à la fois l’harpagide et l’aucubine. Damtoft précurseur [71-72] pour a rapporté que l’acide épidéoxyloganique (Schéma II.4) est aussi un quelques iridoïdes dont l’antirrhinoside dans l’Antinium majus (Scrophulariaceae) et l’aucubine dans Plantago major (Plantaginaceae) et Scrophularia racemosa (Scrophulariceae). Ceci montre indirectement que le 8-épi-iridodial est un intermédiaire biosynthétique. Ces résultats montrent que deux voies biosynthétiques sont possibles. L’une renferme l’iridodial comme précurseur essentiel, et l’autre le 8-épi-iridodial comme intermédiaire clé. L’incohérence apparente de cette approche biosynthétique liée à la présence d’iridoïdes possédant des doubles liaisons en C7-C8, C8-C9 et C8-C10, a été expliquée [71] comme le fruit de l’effet phytotoxique du précurseur sur la plante, ou encore du fait que le même iridoïde peut être biosynthétisé par différents processus de cyclisation dans différentes espèces de plantes. 44 Le problème est de savoir si la cyclisation a lieu avant ou après l’oxydation du groupement méthyle d’une part, et si qui de l’iridodial ou l’iridotrial est le premier intermédiaire cyclisé d’autre part. Le cation iridodial 99 [69] semble être le premier intermédiaire cyclisé, et les oxydations des groupements méthyles en C4 et C8 prennent probablement place après la formation du cycle pyranne. Tous les iridoïdes connus semblent dériver de ce cation [69] qui peut être stabilisé, par l’emprunt d’un proton d’un atome de carbone adjacent (C7, C9 ou C10) ou par l’addition d’un hydrure. H H 7 9 + 8 H 10 O O 99 La réaction de cyclisation formant le cycle pyranne de l’iridoïde [69] peut provenir de l’un des deux chemins suivants (Schéma II.5) : Chemin 1 : perte d’un proton du carbone C4 conduisant à la formation d’une double liaison en C3-C4. Par conséquent, l’atome 3-O carbonyle va être lié à C1. Chemin 2 : attaque d’un hydrure sur C1 entraînant une attaque de l’atome 1-O-carbonyle sur le C3, aboutissant à la lactone. H O 4 3 3 O 1 O 1 H- O Chemin 1 Chemin 2 Schéma II.5 : Cyclisation des iridoïdes Certains iridoїdes perdent le groupement méthyle en C-10 par hydroxylation puis décarboxylation. Des études récentes ont permis d’établir la voie biosynthétique de ces structures [73] , illustrée par le schéma ci-dessous (Schéma II.6). 45 H H CO2H H H OGlc OGlc CO2H H H HO OGlc H HO O O O O 10 H H HO OGlc O H HO iridodial glucoside acide déoxyloganique HO HO OH O HO H H H H O O H OGlc stibericoside O H OGlc O H OGlc O H OGlc 6 - déoxyretzioside unédoside Schéma II.6 : Déméthylation des iridoїdes 46 HO HO2C O H OGlc OGlc CHAPITRE III ETUDE DES SAPONOSIDES 47 III.1. Définition des saponosides Les saponines sont des substances hétérosidiques. Elles ont des propriétés moussantes et constituent ainsi de très bons émulsifiants. Leur propriété physique principale est de réduire fortement la tension superficielle de l'eau. Elles doivent leur nom au fait qu’elles produisent de la mousse quand on les plonge dans l’eau [39] . Ces hétérosides sont utilisés dans les extincteurs à mousse et pour la fabrication de préparations tensioactives. Ce sont des produits du métabolisme secondaire des plantes. Du point de vue chimique, elles se caractérisent par un radical glucidique (glucose, galactose…), lié à un radical aglycone. La partie glucidique est le plus souvent inactive, tout en exerçant un effet favorable sur la solubilité du glucoside et son absorption, voire son transport vers tel ou tel organe. L'effet thérapeutique est déterminé par la seconde partie. La partie sucre et l'aglycone sont normalement liées par une fonction éther ou ester. III.2. Classification des saponosides Selon la nature de leurs génines, on distingue deux groupes de saponosides, stéroïdiques et triterpéniques [41]. Lorsque la génine est substituée par une seule chaîne osidique, les saponosides sont dits monodesmosidiques et lorsque la génine est substituée par deux chaînes osidiques, on parle de saponosides bidesmosidiques [41] . Les différents hydroxyles de ces molécules, que ce soit au niveau de la génine ou de la partie osidique, peuvent aussi être estérifiés par des acides organiques [41]. III.2.1. Les saponosides stéroïdiques La structure chimique des génines stéroïdiques est similaire à celle de nombreuses hormones humaines, et de nombreuses plantes qui en contiennent ont un effet sur l’activité hormonale. L’igname sauvage (Dioscorea villosa) contient des saponines stéroïdiques à partir desquelles, on synthétisa la pilule contraceptive [74]. Les saponosides stéroïdiques sont présents chez les dioscoraeae (Dioscoreae) et les dicotylédones (Fabaceae, Ranunculaceae). Ils possèdent un squelette à 27 atomes de carbone. Deux principaux types existent [41]: - Hexacyclique : spirostane 100. - Pentacyclique : furostane 101. 48 26 O 20 18 12 19 1 2 A 3 4 9 10 5 17 11 13 CH 8 BH 7 E D 22 23 OH 27 26 F 24 O OH O H 1 16 H 15 H H H 6 H 100 101 Pour les saponosides à squelette furostane 101, le C-26 est toujours glycosilé dans la plante fraîche. Son hydrolyse conduit spontanément au dérivé spirostanique [41]. La configuration du carbone C-25 peut varier, donnant ainsi deux séries [41], celle des néosapogénines 102 et celle des isosapogénines 103. H 25 O O O H H H 25 O H H H H H H 102 103 La double liaison en 5(6) peut être conservée (diosgénine 104) ou réduite. La fusion des cycles A et B peut être cis (smilagénine 105, sarasapogénine 106) ou trans (tigogénine 107) [41]. H H O O O O HO H HO 104 105 49 H O O H O HO O HO H H 106 107 Les génines stéroïdiques possèdent généralement un hydroxyle en position 3. D’autres hydroxyles peuvent être présents sur ce squelette, en positions 11 (pentandroside C 108) (éléphanoside F 109) [76] , 15 (5α-Spirostan-3β,12β,15α-triol 110) [77] [75] , 12 et 17 ((25S)-5β-spirostane- 3b,17α-diol 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→4)]-β-D glucopyranoside 111) [78]…etc. HO HO 11 OH H H O H O OH O HO HO O OH OH O HO 108 OH 12 OH OH OH HO HO O O O OH HO HO O OH O O OH 109 50 H GlcO OH O O OH O H H HO 15 H OH H 110 O H HO 17 O OH O HO HO O O HO OH O H O HO HO O OH 111 III.2.2. Les saponosides triterpéniques Les saponosides triterpéniques, composants majoritaires des plantes Scrophulariaceae en général et le genre Verbascum en particulier qui font l’objet de notre attention, sont présents chez les dicotylédones (Saponaire, Marronnier d’inde, Luzerne, Ginseng,…). Leurs génines à 30 atomes de carbone sont, soit tétracycliques à squelettes dammarane 112, cucurbitane 113 et lanostane 114, soit pentacylcliques à squelettes oléanane 115, ursane 116, lupane 117, friedelane 118 et hopane 119 [79]. 21 21 25 19 18 17 30 19 29 28 112 20 17 1 1 29 25 18 20 30 28 113 51 21 30 25 18 29 20 19 19 17 20 12 1 1 30 18 13 11 25 26 14 3 28 4 8 15 27 7 5 28 16 2 29 22 17 9 10 21 6 24 23 114 115 30 30 29 25 25 26 28 1 26 27 24 23 23 116 117 30 29 22 25 27 25 30 26 1 28 29 27 28 1 28 1 27 24 20 29 24 26 23 24 23 118 119 Ces saponosides ont également un hydroxyle en position 3, généralement en position β. Ce dernier est le plus souvent substitué par une chaîne osidique. Les positions 23, 24, 28, 29 et 30 52 sont souvent fonctionnalisées sous forme hydroxyle, aldéhyde ou acide carboxylique (acanjaposide A 120, acanjaposide B 121 et nipponoside E 122) [80]. COOR COOR HO HO COOH CHO 23 23 120 121 COOR HO CH2OH 23 122 R= -β-D-Glc-(6→1)-β-D-Glc-(4→1)-α-L-Rha De nombreux carbones peuvent être hydroxylés en: C-1, C-2 (gamboukokoensein A 123) [81] , C-6 (gamboukokoenside A 124) C-22 (aesculioside Ib 126) [83] [81] , C-7 (khekadaengoside F 125) [82] , C-15, C-16, C-21 et . HO OH HO 2 COOH CH2OH HO 1 6 HO HO AraO2C CH2OH 123 OH 124 53 HO H O H GlcO OH H O OH 7 OH O 125 OH 21 H 22 15 O OH OH CH2OH 28 OH H COOH O O O 16 OH H CH2OH HO OH OH HO O O OH OH OH 126 Les saponosides bidesmosidiques possèdent généralement leur seconde chaîne osidique sur l’acide carboxylique en C-28 (salsoloside C 127) [84]. H HO CO2H HO O 28 O O OH O O OH HO OH OH 127 54 Il est désormais établi que la RMN multiimpulsionnelle, par la diversité des techniques qu’elle utilise, constitue un outil efficace et approprié pour élucider la structure de composés aussi complexes que les saponines. La RMN a ainsi supplanté, compte tenu de sa fiabilité et sa grande performance, l’autre voie de détermination de structure basée sur les méthodes dégradatives (hydrolyse, perméthylation, …) qui exige de quantités importantes de produit pur. III.3. Propriétés biologiques des saponosides Les saponines ont une propriété caractéristique : celle d'hémolyser les globules rouges [85] , c'est-à-dire de libérer leur hémoglobine, expliquant l'effet toxique de certaines d'entre elles, qui les rend inconsommables. Elles sont capables d’agir sur la perméabilité des membranes cellulaires. Elles provoquent une hémolyse par action sur le cholestérol des membranes cellulaires qui éclatent. Le pouvoir hémolytique dépend de la nature de la génine et du nombre des unités osidiques [86] . La comparaison des activités des saponosides monodesmosides et bidesmosides a prouvé que les premiers cités sont généralement plus hémolytiques [86]. Les saponosides ont été largement étudiés et cela durant des années. Ils présentent des activités biologiques plus ou moins marquées, en tant qu’antiviraux (torvoside H 128) antifongiques (phytolaccoside B 129) [88] 130) [89] , antiprolifératifs (astersedifolioside A 131) [90] ou anti-HIV [91]. CO2CH3 OGlc HO O CO2H HO H XylO O CH2OH 3 Qui , , antimicrobiens (1α,3,β-Hydroxyimberbic acid-23-α- [L-3,4-diacetyl-rhamnopyranosyl]-29-O-α-rhamnopyranoside O [87] Rha 128 129 55 CO2Rha O OH H OH OH O HO HO HO CH2O O HO O H3 C HO CH3 OAc O O OH O O O H3C HO HO O HO OH OH OH OAc 130 131 D’autres activités ont été également mises en évidence. Ainsi les saponosides triterpéniques à structures très complexes [92] (julibroside J29 132, julibroside J30 133 et julibroside J31 134), isolés des écorces de Albizia julibrissin [92] , sont considérés comme des métabolites secondaires de très grande importance dans la mesure où ils sont utilisés comme agents anti-tumoraux [92]. O O O OH R2 O OH Me HO OH O HO O O OH O O O OH OH OH O R1 OH OH O O O Me HO OH OH OH OH OO OH OH O OH HO O OH OH OH R1 R2 132 NHAc Me 133 NHAc H 134 OGlc Me 56 Certains saponosides à squelette cycloartane comme oleifolioside A 135, oleifolioside B 136, cyclocanthoside E 137 et astragaloside II 138 [93] , isolés tous de l’espèce Astragalus oleifolius, possèdent une activité contre la leishmaniose. OH OH OH O HO HO O OR2 OR1 R1 R2 135 α-arabinose β-xylose 136 α-arabinose β-glucose 137 H β-glucose O OH OH O HO HO O OH O OAc O HO OH OH 138 De nombreuses plantes utilisées en médecine traditionnelle, se sont révélées riches en saponosides. Certaines d’entre elles sont encore utilisées en dermocosmétique. Un extrait d’hydrocotyle (Centella asiatica) par exemple, est aujourd’hui commercialisé sous le nom de Madécassol® pour les propriétés cicatrisantes des saponosides qu’il renferme; le Marron d’inde est utilisé pour ses propriétés veinotoniques sous le nom de veinotonyl® ; L’aescine est commercialisée sous les noms commerciaux de Reparil® ou Escinogel® pour ses propriétés antiinflammatoires, anti-oedémateuses et veinotoniques. Les ruscoganines du Petit Houx (Proctolog®) sont utilisées comme anti-hémorroïdaires. 57 III.4. Biosynthèse des saponosides Il apparaît qu’un nombre important de plantes synthétisent les saponines triterpéniques, comme une partie de leur programme normal de croissance et de développement ou comme réponse aux attaques pathogènes et au stress [94]. Il semble établi que génine et partie osidique sont synthétisées séparément puis combinées entre elles. Cette combinaison, ayant lieu à un stade très précoce, se fait parfois en utilisant une liaison osidique déjà éxistante par le jeu de transférase. Le plus souvent, celle-ci se fait par l’emploi de NADP-Sucres [95] . Nous nous intéresserons dans ce qui suit à la biogénèse des triterpènes cycliques. Tous les terpènes et les stéroїdes sont constitués par l’assemblage d’un nombre variable d’unités isopréniques. Le géranyl pyrophosphate GPP, précurseur de monoterpènes, est formé par addition d’une molécule d’IPP (isopentyle de pyrophosphate) sur une molécule de DMAPP (diméthylallyle de pyrophosphate) selon une condensation tête à queue. CH2OPP CH2 + PPO CH2OPP IPP DMAPP GPP Schéma III.1 : Formation du géranyl pyrophosphate Une addition similaire d’IPP conduit au farnésyl de pyrophosphate (FPP), précurseur des sesquiterpènes (Schéma III.2). OPP CH2 CH2OPP CH2OPP FPP Schéma III.2 : Formation du farnésyl pyrophosphate 58 Deux molécules de FPP vont former le squalène. Cette duplication nécessite l’intervention d’enzymes spécifiques (Schéma III.3). NADPH + O P P P PO Schéma III.3 : Formation du squalène Le squalène est ensuite oxydé par le squalène oxydase donnant ainsi l’époxy-2,3-squalène (Schéma III.4). Squalène oxydase (epoxydation) O époxy 2,3 squalène Squalène Schéma III.4 : Oxydation du squalène Le cycle époxy s’ouvre par addition d’un proton, l’oxygène restant fixé sur le carbone C-3 où il constitue le groupe hydroxyle caractéristique de tous les stérols [96]. Cette ouverture initie la cyclisation. La cyclisation enzymatique de l’époxy-2,3-squalène peut se faire selon des conformations « chaise-bateau-chaise », pour donner le cation protosteryl, lui même converti ensuite en cycloarténol ou lanostérol. Ces cyclisations sont catalysées [94] respectivement par les 2,3- oxydosqualène cyclase (OSCs), cyclosynthase (CS) et lanostérolsynthase (LS). La cyclisation de triterpènes peut se faire également selon des conformations « chaisechaise- chaise », pour donner le cation dammarenyl tétracyclique. Ce dernier peut subir ultérieurement des réarrangements conduisant à la formation de triterpénoїdes pentacycliques [94,39] . Toutes ces transformations sont illustrées par le schéma III.5. 59 chaise chaise chaise chaise bateau chaise OSCs O H H Epoxy 2,3 squalène H H H HO Cation protostéryl HO Cation dammarényl LS CS HO HO Cation baccharényl HO Cycloarténol Lanostérol HO Cation lupényl Lus H H H HO HO HO amyrine AS H BAS Cation oléanyl Lupéol H HO B amyrine Schéma III.5 : Cyclisation de l’époxy-2,3-squalène La biosynthèse de saponines à partir de produits issus de la cyclisation de 2,3oxydosqualène, implique une série de modifications qui peuvent être des oxydations, des substitutions ou des additions de sucres sur la génine par différentes enzymes. On citera pour l’exemple, les glycosyltransférases indispensables lors de l’addition des monosaccharides aux sapogénines [94,97]. 60 2 EME PARTIE TRAVAIL PERSONNEL 61 CHAPITRE IV INVESTIGATION CHIMIQUE DE VERBASCUM BALLII 62 IV.1. Aspect botanique et lieux d’existence Verbascum ballii (Batt.) M. Qaiser [98] se rencontre particulièrement dans la région pré- saharienne, allant de la région d’El-Kantara-Biskra et s’étendant jusqu’au M’Zab [2,99] . Cette plante initialement décrite sous l’appellation Celsia ballii Batt. et Trab.[100], a été ensuite renommée Verbascum ballii (Batt.) Hub.-Mor. [101] pour être finalement combinée et adoptée sous le nom Verbascum ballii (Batt.) M. Qaiser [98]. C’est une plante bisannuelle, fleurissant du mois d’avril au mois de mai. Ses feuilles présentent une pubérulence cendrée en dessus, et des stigmates largement capités. Elle présente également une capsule ovoïde sub-globuleuse, dépassant le calice et terminée par un rostre court et assez grêle. Celle-ci est portée par une tige grêle, rameuse à pubérulence cendrée et formée de poils courts, réfléchis, très denses et non glanduleux. Ses feuilles inférieures sont pétiolées et pennées [99]. On ne connaît pas d’usage en médecine traditionnelle à Verbascum ballii. La population locale reconnaît cependant une certaine toxicité attribuée, à juste titre d’ailleurs, à une présence accrue de saponosides [102]. Verbascum ballii (Scrophulariaceae) 63 IV.2. Travaux antérieurs sur Verbascum ballii L’espèce ballii, à notre connaissance et en vertu de la recherche documentaire exhaustive réalisée, n’a fait l’objet d’aucune étude chimique ou biologique. Ce manque d’engouement quant à l’investigation de cette plante, tant du point de vue chimique que biologique, ne signifie nullement que cette dernière offre peu d’intérêt dans ce domaine. De notre point de vue, ceci semble plutôt lié à la rareté de la plante [2] et son existence dans des zones peu fréquentées. Devant ce constat, il nous a paru motivant d’apporter notre contribution à l’étude chimique de cette plante, sachant que le genre Verbascum renferme des substances chimiques d’un grand intérêt, à l’instar des iridoїdes et saponosides connus comme les constituants majoritaires du genre et de la famille Scrophulariaceae. IV.3. Résultats et discussions IV.3.1. Extraction L’espèce V. ballii a été collectée dans son habitat naturel dans la région de Biskra au mois de mai 2000. L’identification botanique a été réalisée par le Professeur Bachir OUDJEHIH, du département d’Agronomie de l’Université de Batna. Le matériel végétal séché et broyé est extrait sous agitation à température ambiante, successivement par le cyclohexane, le chloroforme et le méthanol. Le schéma IV.1 illustre le protocole d’extraction de la plante en question. Notre étude a concerné l’extrait méthanolique, riche en saponosides et iridoїdes. Il est à noter qu’une étude chimique antérieure effectuée au laboratoire sur l’extrait chloroformique [103], a permis d’isoler 2 iridoїdes glycosilés acylés à noyau catalpol et un saponoside d’une grande complexité structurale, notamment dans sa partie osidique. IV.3.2. Séparation et purification Le fractionnement de 10 grammes de l’extrait méthanolique, a été effectué sur une colonne de polyamide. L’élution est réalisée par un gradient eau/méthanol (100/0, 80/20, 50/50, 20/80, 0/100). Des fractions de 50 millilitres ont été collectées à chaque fois pour être par la suite regroupées en 5 lots. Le fractionnement du lot 2 par chromatographie sur colonne de gel de silice, en utilisant comme éluant CHCl3/MeOH/H2O, a permis d’obtenir 5 sous lots. Le sous lot 1 est de nouveau 64 mis à chromatographier sur une colonne de gel de silice, permettant ainsi d’obtenir le composé A à l’état pur. L’analyse chromatographique sur silice RP-18 du sous lot 3 (du lot 2) montre la présence de deux produits. Une chromatographie préparative sur silice RP-18 suivie de deux purifications séparées sur colonne de Sephadex LH-20 dans le méthanol, a permis d’isoler les deux composés B et C à l’état pur. Une chromatographie préparative effectuée sur le lot 3, puis une filtration sur colonne de Sephadex LH-20 en présence de méthanol, a abouti à l’isolement du composé D à l’état pur. Le lot 4 soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant comme éluant CHCl3/MeOH/H2O à différents gradients, a permis d’isoler le produit E. Le lot 5, montrant en CCM un mélange complexe de composés, est soumis lui aussi à une chromatographie sur une colonne de gel de silice normale. L’élution est réalisée au moyen d’un mélange CHCl3/MeOH/H2O à différents gradients. 10 sous lots ont été obtenus. Le sous lot 10 qui en est issu, est soumis à une chromatographie préparative RP-18. Une filtration sur colonne de Sephadex LH-20 dans le méthanol, a permis d’obtenir les trois composés F, G et H. Parties aériennes de Verbascum ballii 700 g Extrait cyclohexanique 6g Evaporation Macération dans le cyclohexane (4 х 4 L) Pendant 48 h Filtration Marcs Extrait chloroformique 14 g Evaporation Macération dans le chloroforme (2 x7 L) Pendant 48 h Filtration Marcs Evaporation Extrait méthanolique 100 g Macération dans le méthanol (2 х 7 L) Pendant 48 h Filtration Marcs jetés Schéma IV.1 : Schéma de l’extraction 65 IV.3.3. Détermination de structures Composé A HO H 4 6 3 5 9 7 8 OH 1 H O 5' 1' O OH O HO OH HO Les spectres de masse ESI, enregistrés en modes positif (Figure IV.1) et négatif (Figure IV.2), présentent respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 371 [M+Na]+ et 383 [M+Cl]-, soit une masse moléculaire égale à 348 et correspondant à une formule brute en C15H24O9. Figure IV.1: Spectre de masse ESI (mode positif) du composé A Figure IV.2: Spectre de masse ESI (mode négatif) du composé A Le spectre RMN 1 H (Figure IV.3) de ce composé, enregistré dans un mélange CDCl3/CD3OD, montre d’emblée les signaux caractéristiques d’un iridoїde. En effet, on observe : 66 Un signal sous forme de doublet de doublet à 6,13 ppm (J= 6,2 ; 2 Hz) caractéristique du proton oléfinique H-3. Un signal sous forme de doublet de doublet à 4,8 ppm (J= 6,2 ; 2,7 Hz) caractéristique du proton oléfinique H-4. Un signal sous forme de doublet à 5,43 ppm (J= 2 Hz) caractéristique du proton H-1. Un signal sous forme de doublet de doublet à 2,58 ppm (J= 9,3 ; 2 Hz) caractéristique du proton H-9. Un doublet à 4,63 ppm (J= 7,9 Hz) caractéristique du proton anomère H-1' du sucre, en l’occurrence le glucose. Figure IV.3: Spectre RMN 1H du composé A En plus de ces signaux, le spectre RMN 1H (Figure IV.3) montre un singulet résonant à 1,31 ppm et s’intégrant pour trois protons attestant de la présence d’un groupement méthyle. L’expérience de corrélation homonucléaire ou COSY H-H (Figure IV.4) montre des corrélations entre : Les deux protons oléfiniques H-3 et H-4. Le protons oléfiniques H-4 et un proton résonant à 2,75 ppm ne pouvant être que le proton H-5 qui corrèle également avec le proton H-9, préalablement repéré à 2,58 ppm en RMN 1H. Le proton H-5 et un autre proton résonant à 3,94 ppm attribué au proton H-6. Ce dernier corrèle avec deux autres protons fortement couplés au regard de la grande tache de corrélation 67 qu’ils présentent, attribués logiquement aux protons géminés H-7. Le déplacement chimique du proton H-6 (3,94 ppm) indique une oxydation du carbone qui le porte. HO H H 4 6 3 5 9 7 H OH H 1 O OGlc Figure IV.4: Spectre COSY H-H (partie génine) du composé A Cette expérience permet également de relier tous les protons d’un hexose, à travers leurs taches de corrélation (Figure IV.5). On observe clairement les couplages entre : Le proton anomère H-1' et le proton H-2' résonant à 3,22 ppm (dd, J= 7,9; 9,2 Hz). Le proton H-2' et le proton H-3' résonant sous forme de triplet à 3,4 ppm (J= 9,2 Hz). Le proton H-3' et le proton H-4' résonant à 3,31 ppm. Le proton H-4' et un proton résonant à 3,32 ppm sous forme de multiplet correspondant au proton H-5'. Ce dernier couple avec deux autres protons résonant à 3,68 et 3,87 ppm, correspondant respectivement aux protons H-6'a et H-6'b. 68 Cette expérience a permis de relier sept protons correspondants aux protons d’un hexose. Les grandes valeurs de constantes de couplages, indiquent que ces protons sont axiaux. Il s’agit donc d’un D-glucose de configuration β au regard de la constante de couplage J1’-2’= 7,9 Hz. Figure IV.5: Spectre COSY H-H (partie osidique) du composé A L’expérience de corrélation hétéronucléaire longue distance ou HMBC permet d’observer les couplages entre : Le proton H-1 et les carbones C-5, C-1' et C-3. Le couplage de ce proton avec le carbone anomère C-1' du glucose confirme que ce dernier est positionné en C-1. Les trois protons méthyliques singulets repérés en RMN 1H et les carbones C-7 et C-9, ainsi qu’un carbone quaternaire résonant à 79,4 ppm ne pouvant être que le carbone C-8. 69 Figure IV.6: Spectre HMBC du composé A Cette analyse spectrale a permis d’attribuer tous les protons et les carbones constituant cette molécule. Leurs déplacements chimiques ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire ([α]D= 169, C=0,3 g/100ml, MeOH) sont identiques à ceux d’un iridoïde déjà isolé des plantes du genre Verbascum [104] et très présent au sein de la famille Scrophulariaceae en génénal, à savoir l’ajugol aux propriétés antibactériennes [105]. HO H 4 6 3 5 9 7 8 10 OH 1 H O O 1' OH O HO OH HO Ajugol Les attributions de tous les signaux des protons et carbones sont présentées dans le tableau (IV.1). 70 Tableau IV.1: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé A N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH2) δc ( ppm) δH ( ppm) J (Hz) 93,2 140,0 105,0 40,7 76,9 49,9 2,0 2,0, 6,2 2,7, 6,2 8 (C) 9 (CH) 10 (CH3) 79,4 51,3 24,6 5,43 d 6,13 dd 4,8 dd 2,75 m 3,.94 m 1,77 dd 2,0 dd 2,58 dd 1,31 s (3H) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) 98,6 73,8 77,0 70,7 77,2 62,6 3,1, 13,6 5,0, 13,6 9,3, 2 4,63 d 3,22 dd 3,4 t 3,31 t 3,32 m 3,68 dd 3,87 dd 7,9 7,9, 9,2 9,2 9,0 5,2, 11,9 1,4, 11,9 Composé B 1''' O OCOCH3 O H3COCO H3C O 1" 5" O H 4 6 7 O 5 9 8 HO H 10 3 1 O 5' 1' O OH O OH HO OH Le spectre de masse ESI enregistré en modes négatif (Figure IV.7) et positif (Figure IV.8), montre respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 721 [M-H]- et 745 [M+Na]+, soit une masse moléculaire égale à 722 correspondant à une formule brute en C34H22O17. 71 Figure IV. 7: Spectre de masse ESI (mode négatif) du composé B Figure IV.8: Spectre de masse ESI (mode positif) du composé B Le spectre UV (Figure IV.9) du composé B, montre des bandes d’absorption maximale à 203, 216 et 278 nm caractéristiques d’un système éther-énol d’un iridoïde et d’un chromophore cinnamoyle. Figure IV.9: Spectre UV du composé B 72 L’observation du spectre RMN 1H (Figure IV.10) du composé B permet de confirmer sa nature iridoїdique, par la présence de certains signaux caractéristiques cités précédemment. En effet, on observe les signaux des deux protons oléfiniques H-3 et H-4 résonant respectivement à 6,41 ppm (dd, J= 1,6; 6 Hz) et 5,1 ppm (dd, J= 5,1; 6 Hz), deux signaux à 2,5 et 2,61 ppm présentant une parenté évidente avec ceux des protons H-5 et H-9 du composé A. Les signaux à 4,8 ppm (d, J= 7,9 Hz) et 5,11 ppm (d, J= 9,6 Hz) sont attribués respectivement aux protons H-1' et H-1. Figure IV. 10: Spectre RMN 1H du composé B Partant de cette première identification, les autres protons et carbones sont progressivement identifiés par expériences bidimensionnelles COSY H-H, HSQC et HMBC. Le spectre COSY H-H (Figure IV.11) met clairement en évidence les corrélations attendues entre les protons H3H4, H4-H5 et H5-H9. En plus de ces corrélations, le proton H-5 corrèle avec un proton résonant à 4,08 ppm sous forme de doublet de doublet (H-6, J= 0,7 ; 8,3 Hz) lui même corrélant avec un proton à 3,69 ppm attribué au proton H-7. La présence d’un seul proton H-7 indique que le composé B n’est pas à noyau ajugol. Le proton H-6 montre, dans l’expérience HSQC, un couplage direct avec son carbone à 83,3 ppm. Le déblindage de ce dernier (+ 6,4 ppm) par 73 rapport au même carbone (76,9 ppm) dans le composé précédent, montre la substitution de l’hydroxyle porté par le carbone C-6. Figure IV. 11: Spectre COSY H-H (partie génine) du composé B Dans la carte HMBC, le proton H-9 corrèle avec les carbones C-1 (93,7 ppm), C-5 (35,7 ppm), C-7 (57,9 ppm), identifiés par HSQC, et un carbone quaternaire résonant à 65,1 ppm correspondant sans nul doute au carbone C-8. Ce dernier corrèle avec les deux protons H-10, formant un système AB et résonant à 4,17 ppm (d, J= 13 Hz) et 3,84 ppm (d, J= 13 Hz) correspondant à un alcool primaire. O H 6 7 10 3 5 O 9 8 HO 4 H 1 O OGlc A partir du proton anomère H-1', l’expérience COSY H-H permet d’identifier un glucose de configuration β substituant la génine en C-1 comme le montre l’expérience HMBC. Les valeurs des déplacements chimiques des protons et carbones correspondent à celles des protons et carbones d’un iridoïde très présent au sein des plantes du même genre : le catalpol. 74 HO H O HO O H OGlc Catalpol Il apparaît ainsi que le catalpol constitue ce qu’on pourrait appeler la partie aglycone du composé B. En effet, outre les signaux ayant permis de caractériser la génine, le spectre RMN 1H (Figure IV.12) laisse observer : Deux signaux résonant à 7,43 et 7,16 ppm et s’intégrant pour cinq protons caractéristiques de protons aromatiques. Deux signaux résonant chacun sous forme de doublet (J= 16 Hz) à 7,67 et 6,45 ppm de deux protons oléfiniques (H-β et H-α), à géométrie trans au vu de la valeur de la constante de couplage. Figure IV. 12: Spectre RMN 1H (étalé) du composé B La présence de cinq protons aromatiques et deux protons oléfiniques déblindés en position trans, nous permet de suggérer la présence d’un groupement trans-cinnamoyle. O O Groupement trans-cinnamoyle Le spectre RMN 1H montre également deux signaux singulets d’intégration 3H chacun à 2,06 et 2,18 ppm, suggérant la présence de deux groupements acétate. De même que l’observation d’un signal doublet à 1,25 ppm d’intégration 3H correspondant à un groupement méthyle (H-6''), nous autorise à envisager la présence d’un sucre très présent et substituant généralement la génine en C-6, à savoir le rhamnose. 75 A partir de ces protons, l’expérience COSY H-H (Figure IV.13) permet de relier tous les autres protons faisant partie d’un même système de spin. En effet, elle met en évidence les couplages entre : Les protons H-6" cités et le proton H-5" résonant à 4,05 ppm, lui même corrélant avec un proton résonant sous forme de triplet à 5,17 ppm (J = 9,8 Hz) correspondant au proton H-4". Le proton H-4" et un proton résonant sous forme de doublet de doublet à 5,4 ppm (J = 9,9; 3,4 Hz) correspondant au proton H-3". Le proton H-3" et un proton résonant sous forme de doublet de doublet à 5,38 ppm (J= 3,4; 1,7 Hz) attribué au proton H-2". La petite valeur de la constante de couplage J2"-3"= 3,4 Hz indique que le proton H-2" est en position équatoriale. Le proton H-2" et le proton H-1" (5,1 ppm) correspondant au proton anomère. Ces corrélations permettent ainsi d’identifier un déoxyhexose. Il s’agit d’un rhamnose de configuration α. Configuration déduite de la constante de couplage J1''-2''= 1,7 Hz. Le déblindage des protons H-2", H-3" et H-4" indiquent des substitutions à ces niveaux par les trois groupements acyles préalablement identifiés, à savoir les deux groupements acétate et le groupement trans-cinnamoyle et dont il faut déterminer précisément leurs positions ou points de branchement. Figure IV. 13: Spectre COSY H-H (rhamnose) du composé B 76 Les positions des trois groupements acyles sur le rhamnose sont mises en évidence par l’expérience HMBC (Figure IV.14). Elle montre les corrélations entre : Les protons H-2" (5,38 ppm) et H-4" (5,17 ppm) du rhamnose et les carbonyles des groupements acétate résonant respectivement à 170,2 et 170,4 ppm. Ces derniers ont été identifiés par leurs corrélations en HMBC avec les protons méthyliques constituant ces deux groupements. Le proton H-3" (5,4 ppm) et le troisième carbonyle résonant à 165,8 ppm attribué à celui du groupement trans-cinnamoyle. Cette attribution est confirmée par le spectre HMBC qui montre des corrélations en 3J et 3J entre ce carbonyle et les protons oléfiniques H-α et H-β. Figure IV.14: Spectre HMBC du composé B Toutes ces données spectrales ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire ([α]D= - 27°, C= 0,21 g/100ml, MeOH) permettent d’établir sans ambiguïté la structure du composé B. Cette structure s’est avérée identique à celle du scrospioside A, isolé pour la première fois par Zhang [104] à partir des racines de Scrophularia spicata. Ce composé a été isolé une deuxième fois par Calis [105] de Scrophularia ilwensis sous le nom de scropolioside D et par Pachaly [106] de Scrophularia korainensis sous le nom de scropheanoside III. Il apparaît ainsi que ce composé a été isolé pour la première fois dans le genre Verbascum. 77 1''' O OCOCH3 O H3COCO H3C O 1" O H 4 6 O 7 5 9 8 HO H 10 3 1 O O OH 1' O OH HO OH 6-O-[(2",4"-di-O-acetyl-3"-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol Le tableau IV.2 reproduit tous les déplacements chimiques des protons et carbones du composé B. Tableau IV.2: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé B N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle 1"' (C) 2"', 6"' (CH) 3"', 5"' (CH) 4"' (CH) α (CH) β (CH) CO Acétates CH3 CH3 CO CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 93,7 141,1 101,7 35,7 83,3 57,9 65,1 41,8 60,0 5,11 d 6,41 dd 5,1 dd 2,5 m 4,08 dd 3,69 sl 2,61 dd 4,17 d ( H-10a ) 3,84 d ( H-10b ) 9,6 1,6-6 5,1-6 98,2 73,3 76,2 70,3 77,1 61,5 4,8 d 3,29 t 3,43 t 3,28 t 3,33 m 3,49 dd ( H-6a ) 3,65 dd ( H-6b ) 96,2 69,9 69,3 70,8 66,6 16,4 5,1 d 5,38 dd 5,4 dd 5,17 t 4,05 m 1,25 d 134,0 128,0 128,6 130,4 116,4 146,0 165,8 7,61 m 7,43 m 7,43 m 6,45 d 7,67 d 19,4 19,5 170,4 170,2 2,18 s 2,06 s - 78 0,7-8,3 7,6-9,6 13 13 7,9 9 9 8,7 2-12 6,7-12 1,7 1,7-3,4 3,4-9,9 9,8 6,2 16 16 Composé C 1''' O 1'''' O OCOCH3 O O H3C O 1" 5" O H 6 7 O 9 8 HO 10 4 3 5 1 H O O 1' HO 5' OH O OH HO Le spectre de masse enregistré en modes positif (Figure IV.15) et négatif (Figure IV.16), présente respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 833 [M+Na]+ et 845 [M+Cl]-, correspondant à une structure en C41H46O17, soit une masse moléculaire égale à 810. Figure IV. 15: Spectre de masse ESI (mode positif) du composé C Figure IV. 16: Spectre de masse ESI (mode négatif) du composé C Le spectre RMN 1H (Figure IV. 17) du composé C présente de fortes similitudes avec celui du composé B précédent. La différence notable consiste en la disparition d’un méthyle d’un groupement acétate et l’apparition des signaux suivants : 79 Deux signaux d’intégration 1H résonant chacun sous forme de doublet à 7,73 et 6,54 ppm, dénotant de la présence de deux protons oléfiniques (H-β' et H-α'), à géométrie trans au regard de la constante de couplage égale à 16 Hz. Deux signaux à 7,58 et 7,39 ppm d’intégration 5H, caractéristiques de protons aromatiques. L’ensemble de ces signaux autorise à suggérer la présence d’un deuxième groupement trans-cinnamoyle, remplaçant un groupement acétate par analogie au composé B. Figure IV. 17: Spectre RMN 1H du composé C L’expérience COSY H-H permet de retrouver toutes les corrélations ayant permis de caractériser le rhamnopyranose et la génine. Les positions des deux groupements cinnamoyles et du groupement acétate sont élucidées sans ambiguïté au moyen du spectre HMBC (Figure IV. 18). En effet, ce dernier met clairement en évidence les corrélations pertinentes entre : Le proton H-2" du rhamnose et le carbonyle du groupement acétate résonant à 170,2 ppm, identifié sur la base de sa corrélation HMBC avec les protons méthyliques (2,2 ppm) constituant ce groupement. Ceci montre que l’acétate est branché en position C-2" du rhamnose. Le proton H-4" du rhamnose et le carbonyle du groupement trans-cinnamoyle résonant à 166,2 ppm, confirmant la substitution du rhamnose en 4" par un groupement trans-cinnamoyle. 80 Le proton H-3" du rhamnose et le carbonyle du second groupement trans-cinnamoyle résonant à 165,8 ppm, montrant que le second groupement cinnamoyle est branché en C-3" du rhamnose. Figure IV. 18: Spectre HMBC du composé C Toutes ces données spectrales ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire ([α]D= - 14°, C= 0,21, MeOH), ont permis de proposer sans ambiguïté, la structure suivante pour le composé C : 1''' O 1'''' O O O H 3C OCOCH3 O 1" 5" O H 6 7 3 O 9 8 HO 4 5 10 1 H O O 1' HO 5' OH O OH HO 6-O-[(2"-O-acetyl-3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 81 Cet iridoïde connu sous le nom de Scropolioside B, a été isolé antérieurement des feuilles de différentes espèces du genre Scrophularia : Scrophularia scopollii scorodonia [108] , des feuilles de Gmelina arborea [109] [107] , Scrophularia et récemment de Scrophularia deserti [110] . Il apparaît, à notre connaissance, que ce composé est cité pour la première fois dans le genre Verbascum. Les déplacements chimiques des protons et carbones constituant cette molécule, assignés conjointement par expériences COSY H-H, HMBC et HSQC, sont présentés dans le tableau IV.3. Tableau IV.3: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé C N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle I 1''' 2''',6''' 3''',5''' 4''' α β CO Cinnamoyle II 1'''' 2'''',6'''' 3'''',5'''' 4'''' α' β' CO' Acétate CH3 CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 93,7 141,0 101,7 35,7 83,5 58,0 65,1 41,8 59,9 5,13 d 6,44 dd 5,15 dd 2,55 m 4,12 dd 3,72 sl 9,5 1,6-6 5,1-6 0,7-8,1 2,63 dd 4,20 d (H-10a) 3,85 d (H-10b) 7,7-9,5 13,1 13,1 98,2 73,4 76,2 70,6 77,2 61,5 4,81 d 3,30 t 3,43 t 3,27 t 3,60 m 3,65 dd ( H-6a ) 3,95 dd ( H-6b ) 7,8 8,9 9,0 9,5 96,3 70,3 70,0 70,9 66,8 16,3 5,14 d 5,42 dd 5,52 dd 5,32 t 4,17 m 1,28 d 134,0 127,9 128,5 130,3 116,4 146,0 165,8 7,55 m 7,39 m 7,39 m 6,43 d 7,63 d 16 16 134,0 128,0 128,5 130,3 116,1 146,2 166,2 7,58 m 7,39 m 7,39 m 6,54 d 7,73 d 16 16 19,3 170,2 2,2 s - 82 6,7-11,9 1,9-11,9 1,8 1,7-3,4 3,4-10,1 9,9 6,2 Composé D 1''' O 1'''' O OH O O H3C O 1" 5" O H 4 6 7 3 O 5 9 8 HO 10 1 H O O 5' 1' OH O HO OH HO Le composé D présente une formule moléculaire en C39H44O16. Formule déterminée grâce aux spectres de masse ESI, enregistrés en modes positif (Figure IV.19) et négatif (Figure IV.20), qui présentent respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z= 791 [M+Na]+, 807 [M+K]+ et 803 [M+Cl]-, correspondant à une masse moléculaire égale à 768. Figure IV. 19: Spectre de masse (mode positif) du composé D Figure IV. 20: Spectre de masse (mode négatif) du composé D Le spectre RMN 1H (Figure IV. 21), enregistré dans un mélange CDCl3/CD3OD, est très voisin de celui du composé C. Il permet de reconnaître entre autres : Les protons H-5, H-9, H-7, H-3 et le proton anomère H-1' du glucose résonant respectivement à 2,49; 2,59; 3,62; 6,32 et 4,76 ppm, indiquant la présence du noyau catalpol. Les protons méthyliques H-6" du rhamnose résonant à 1,25 ppm. Les deux systèmes AX résonant à 6,4 et 7,64 ppm (JAX= 16 Hz), 6,35 et 7,63 (JAX= 16 Hz) attestant de la présence de deux groupements cinnamoyles. 83 La seule différence réside en la disparition du groupement acétate. Figure IV. 21: Spectre RMN 1H du composé D L’analyse COSY H-H permet de retrouver toutes les corrélations permettant d’identifier le catalpol et surtout le rhamnopyranose (Figure IV.22) du fait qu’il est porteur des groupements acyles. Figure IV. 22: Spectre COSY H-H du composé D (rhamnopyranose) 84 Le blindage du proton H-2" (4,17 ppm) comparativement au déplacement chimique (5,42 ppm) du même proton enregistré pour le composé C, illustre bien la présence d’un hydroxyle libre en C-2" du rhamnose. Le déblindage des protons H-3" (5,37 ppm) et H-4" (5,35 ppm) confirment les acylations à ces deux niveaux par les deux groupements cinnamoyles. L’attribution complète des signaux observés en RMN 13 C J-modulé (Figure IV. 23) confirmant la structure proposée, est établie conjointement par les expériences de corrélation hétéronucléaire HSQC et HMBC. Figure IV. 23 : Spectre RMN 13C du composé D Le pouvoir rotatoire ([α]D= - 58°, C= 0,2, MeOH) ainsi que les déplacements chimiques des protons et carbones du composé D (Tableau IV.4) sont identiques à ceux d’un iridoïde isolé de l’espèce Veronicastrum virginicum [111] appartenant à la famille Scrophulariaceae. Il s’agit du : 6-O-[(3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol. 85 1''' O 1'''' O OH O O H3C O 1" 5" O H 6 7 3 O 5 9 8 HO 4 10 1 H O O 1' HO 5' OH O OH HO 6-O-[(3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol Tableau IV.4: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé D N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle I 1"' (C) 2"', 6"' (CH) 3"', 5"' (CH) 4"' (CH) α (CH) β (CH) CO Cinnamoyle II 1"'' (C) 2"'', 6"'' (CH) 3"'', 5"'' (CH) 4"'' (CH) α' (CH) β' (CH) CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 94,5 141,3 102,7 36,0 82,8 58,3 65,5 42,3 60,8 4,91 d 6,32 dd 5,07 dd 2,49 m 3,98 nd 3,62 sl 2,59 dd 3,89 d 3,97 d 9,6 1,6-5,9 4,5-5,9 98,9 73,3 76,3 70,0 76,9 61,6 4,76 d 3,27 t 3,43 t 3,38 t 3,29 m 3,84 dd 3,69 dd 7,9 8,2 9,1 9,1 99,0 69,2 72,0 71,5 67,2 17,5 5,01 d 4,17 dd 5,37 dd 5,35 t 3,98 m 1,25 d 134,3 129,0 128,4 130,8 117,3 146,3 166,7 7,45 m 7,31 m 7,34 m 6,4 d 7,64 d - 134,15 128,9 128,3 130,7 117,1 146,2 166,6 7,45 m 7,31 m 7,34 m 6,35 d 7,63 d - 86 7,7-9,6 13,2 13,2 2,1-12,1 5,1-12,1 1,5 2,6 ;1,8 2,6 ;10,2 10,2 6,0 16 16 16 16 Composé E 1"' HO O HO O HO H3C O 1" 5" O 4 6 7 5 O 9 8 HO 3 10 1 O O 5' 1' OH O HO OH HO Le spectre de masse ESI, obtenu en mode négatif (Figure IV.24), présente un pic pseudo moléculaire à m/z = 653 [M-H]-, soit une masse moléculaire égale à 654 correspondant à une formule brute en C30H38O16. Figure IV. 24 : Spectre de masse (mode négatif) du composé E Le spectre RMN 1H (Figure IV. 25) de ce composé, enregistré dans un mélange CDCl3/MeOD, est très voisin de celui du composé D. On reconnaît aisément : 87 Les protons H-5, H-9, H-7, H-3, H-4 et le proton anomère H-1' du glucose résonant respectivement à 2,47, 2,56, 3,62, 6,35, 4,75 et 5,5 ppm, indiquant ainsi la présence du noyau catalpol. Les protons méthyliques H-6" (d, J = 6,2 Hz) à 1,3 ppm, suggérant la présence du rhamnose. Figure IV. 25 : Spectre RMN 1H du composé E L’observation sur le spectre étalé (Figure IV.26) d’un système AX à 6,38 et 7,68 ppm (J= 15,9 Hz), de quatre signaux doublets de protons aromatiques à 6,75 (J= 8,7 Hz, 1H), 6,81 (J= 8,6 Hz, 1H), 7,46 (J = 8,6 Hz, 1H) et 7,65 ppm (J= 8,7 Hz, 1H), confirmée par analyse COSY H-H (Figure IV. 27 ) ainsi que la valeur de 161,2 ppm observée sur le spectre RMN 13 C, laisse suggérer cette fois la présence d’un groupement trans-p-coumaroyle. Il est par ailleurs le seul groupement acylant. HO O O Trans-p-coumaroyle 88 Figure IV. 26 : Spectre RMN 1H (étalé) du composé E Figure IV. 27 : Spectre COSY H-H étalé du composé E 89 Ces protons aromatiques montrent en HMBC (Figure IV. 28) des couplages avec deux carbones quaternaires résonant à 127,6 et 161,2 ppm attribués respectivement aux deux carbones C-1"' et C-4"'. Le déblindage de ce dernier confirme la substitution à ce niveau par un groupement hydroxyle et par conséquent, la présence du groupement trans-p-coumaroyle. Figure IV. 28 : Spectre HMBC étalé du composé E Le problème maintenant est de déterminer la position de ce groupement sur le rhamnose. A cet effet et initialement, l’expérience COSY H-H (Figure IV. 29) constitue un outil de choix dans la mesure où l’identification des protons du rhamnose renseigne sur le point de branchement du groupement en question. 90 Figure IV. 29 : Spectre COSY H-H (Rhamnose) du composé E Le déplacement chimique du proton H-2" (dd, J = 1,4 ; 3,5 Hz) de l’ordre de 5,15 ppm indique que le groupement trans-p-coumaroyle est porté par le carbone C-2" du rhamnose. Ceci est confirmé par l’expérience HMBC qui montre clairement un couplage en 3JC-H entre H-2" et le carbone du carbonyle (168,6 ppm). Les analyses HMBC et HSQC ont permis de caractériser sans ambiguїté tous les carbones constituant (Tableau IV.5) le composé E. Il a été identifié au saccatoside, iridoїde isolé pour la première fois de l’espèce Verbascum saccatum [112]. 91 HO O HO O HO H3C O 1" O H 6 7 3 O 1 8 HO 4 10 H O 1' O OH O HO OH HO 6-O-[(2"-p-coumaroyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol Tableau IV.5: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé E N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle 1"' (C) 2"' (CH) 3"' (CH) 4"' 5"' (CH) 6"' (CH) α (CH) β (CH) CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 95,1 142,2 103,3 37,1 84,2 59,4 66,4 43,2 61,4 5,01 d 6,35 dd 5,5 dd 2,47 m 4,2 d 3,62 s 2,56 dd 3,8 d 4,13 d 9,5 1,4-6,1 4,2-6,1 99,6 74,0 77,5 71,6 78,4 62,8 4,75 d 3,27 dd 3,39 t 3,25 t 3,35 m 3,61 dd 3,91 dd 7,2 7,2-9,2 9,2 9,2 97,6 74,7 70,4 74,1 70,2 18,0 5,3 d 5,15 dd 3,93 dd 3,48 t 3,73 m 1,3 d 127,6 133,7 116,8 161,2 115,8 131,1 114,8 145,8 168,6 7,65 d 6,75 d 6,81 d 7,46 d 6,38 d 7,68 d 92 8,0 7,5-9,5 13,1 13,1 6,4-11,8 8,2-11,8 1,4 1,4-3,5 3,5-9,6 9,5 6,2 8,7 8,7 8,6 8,6 15,9 15,9 Composé F O Fuc Glc HO H 3C OH O O CH2OH O O HO H 3C HO O O Rha OH OH O HO HO HO O OH OH Glc' Les spectres de masse ESI, enregistrés en modes positif (Figure IV.30) et négatif (Figure IV.31), présentent respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 1095 [M+Na]+ et 1071 [M-H]-, soit une masse moléculaire égale à 1072, correspondant à une formule brute en C54H88O21. Figure IV. 30 : Spectre de masse (mode positif) du composé F Figure IV. 31 : Spectre de masse (mode négatif) du composé F 93 L’observation du spectre RMN 1H (Figure IV. 32) de ce composé, enregistré dans un mélange CDCl3/CD3OD, renseigne d’emblée sur la nature glycosidique prononcée du composé. En effet, on observe : Plusieurs signaux entre 3 et 4 ppm caractéristiques de protons osidiques. Leur forte densité suggère à priori l’existence de plus de deux sucres, comparativement aux composés décrits antérieurement. Deux signaux résonant chacun sous forme de doublet à 4,48 (d, J= 7,8 Hz, 1H) et 4,6 ppm (d, J= 7,7 Hz, 1H) caractéristiques de protons anomères de sucres. Figure IV. 32 : Spectre RMN 1H du composé F L’observation également de six signaux singulets à champ fort entre 0,7 et 1 ppm, s’intégrant pour trois protons chacun correspondant à des groupements méthyles ainsi que de deux signaux de protons oléfiniques à 5,35 (dd, J= 2,8 ; 10,4 Hz) et 5,93 ppm (d, J= 10,4 Hz), indique qu’on est en présence d’une saponine triterpénique à squelette oléanane insaturé en 1112 : squelette Δ-11 oléanène. Le spectre RMN 13 C (Figure IV. 33) en apporte la confirmation à travers les six signaux méthyliques résonant dans la région allant de 11,3 à 32,9 ppm, les deux signaux de C-H éthyléniques à 129,9 et 132,7 ppm, ainsi que les quatre signaux C-H vers 100 ppm de carbones anomères de sucres. L’expérience HSQC J-modulé permet d’identifier les protons de ces derniers à 4,48, 4,6, 4,83 et 4,85 ppm. Il est à signaler que les signaux de ces deux 94 derniers n’ont pas été détectés sur le spectre RMN 1H car enveloppés par le signal des protons de l’eau. Ce premier constat permet de déduire que le composé F est constitué d’une génine triterpénique à squelette oléanène substituée par quatre unités osidiques. L’analyse par chromatographie sur couche mince de ce composé, montre une tache de couleur bleue après vaporisation par la vanilline sulfurique, caractéristique de saponosides à génine triterpénique [41]. Figure IV. 33 : Spectre RMN 1 3C du composé F La présence de seulement six méthyles implique évidemment l’oxydation de deux des huit méthyles constituant le squelette oléanane, vraisemblablement en positions C-23 et C-28. L’absence de signaux au delà de 140 ppm sur le spectre RMN 13C (Figure IV. 33), indique que ces deux carbones sont inclus dans des groupements hydroxyméthyles. Ceci est confirmé en RMN 1H par la présence de deux systèmes AB, l′un résonant à 3,28 et 3,76 ppm (J= 10,7 Hz), l′autre à 3,24 et 3,72 ppm (J= 6,6 Hz). Le spectre RMN 13 C permet d’identifier également une grande caractéristique de ce squelette, à savoir le carbone C-3 oxygéné à 83,8 ppm. Le déblindage de +10 ppm vers les champs faibles de ce signal, comparé à celui du même carbone porteur d’un OH libre (70 ppm) [113] , traduit bien des substitutions à ce niveau par des unités osidiques. 95 30 19 12 11 1 2 25 10 21 18 17 22 8 16 15 28 OH 27 4 24 20 14 9 3 HO 13 26 29 5 23 7 6 OH Squelette oléanène L’avènement de nouvelles techniques de RMN multiimpulsionnelle, a rendu très aisée l’identification du triterpène et cela par l’attribution totale de ses carbones sans éprouver le besoin de recourir aux données de la littérature comme il était d’usage auparavant. Ainsi l’expérience HMBC (Figure IV.34) permet d’attribuer une bonne partie des carbones de la génine par observation de leurs couplages en 2J et 3J avec les protons des méthyles angulaires, car corrélant au maximum avec quatre carbones constituant le socle de la base carbonée qui les porte. Ainsi le méthyle-24 est le seul à corréler avec le carbone C-3 connu (83,8 ppm). Ce méthyle résonant à 0,73 ppm couple également avec le carbone quaternaire C-4 (42,9 ppm), le carbone secondaire C-23 (63,2 ppm) et le carbone C-5 (46,7 ppm) qui corrèle aussi avec les protons méthyliques en 25. Ceux-ci couplent avec les carbones C-1 (47,8 ppm), C-10 (35,6 ppm) et C-9 (53,1 ppm). Le proton de ce dernier résonant à 1,94 ppm, identifié par expérience HSQC, montre sur la carte HMBC un fort couplage en 2J avec le carbone éthylénique résonant à 129,9 ppm attribué au carbone C-11, confirmant ainsi la localisation de la double liaison en C11-C12. Le méthyle-26 couple avec le carbone C-9 déjà identifié, le carbone C-7 (30,6 ppm) et les carbones C-8 (43,6 ppm) et C-14 (41,3 ppm), eux même couplant avec les protons méthyliques en 27. Ces derniers corrèlent également avec un carbone quaternaire résonant à 85,5 ppm (C-13). Son déplacement chimique indique qu’il est oxydé. Les protons des méthyles géminaux 29 et 30 résonant à 0,90 et 0,98 ppm, donnent des couplages avec les carbones C-20 (31,2 ppm), C-21 (34,4 ppm) et C-19 (36,8 ppm). La caractérisation de ce dernier est faite sur la base de son couplage avec le proton H-18 résonant à 1,64 ppm sous forme de multiplet. Les autres carbones de la génine sont identifiés par l’analyse combinée des deux expériences COSY H-H et HSQC. Cette dernière permet d’identifier directement les carbones méthyliques par l’observation des couplages avec leurs protons respectifs. Le proton H-5 (1,16 ppm) déterminé par HSQC, montre sur la carte HMBC sept taches de corrélation : six issues de 96 couplages avec les carbones C-24, C-25, C-23, C-10, C-4 et C-3, la dernière du fait d’un couplage avec un carbone résonant à 16,8 ppm, attribué au carbone C-6. De la même manière, le carbone C-16 a été identifié par HSQC du fait d’un couplage direct avec les protons H-16, eux même caractérisés par expérience COSY H-H en raison de la corrélation qu’ils présentent avec les protons H-15. Le carbone C-22 est identifié par HSQC à partir des protons H-22 déterminés par COSY H-H d’après les corrélations qu’ils présentent avec les protons H-21 identifiés par HSQC. Figure IV. 34 : Spectre HMBC mettant en évidence les corrélations des méthyles angulaires 97 L’expérience HMBC montre les corrélations du carbone C-16 déjà identifié avec deux protons résonant à 3,24 ppm (d, J= 6,6 Hz) et 3,72 ppm (d, J= 6,6 Hz) attribués aux protons H-28, eux même corrélant avec un carbone quaternaire résonant à 41,3 ppm attribué au carbone C-17. Le proton H-28a résonant à 3,24 ppm, montre également des taches de corrélations avec un carbone secondaire résonant à 30,4 ppm attribué au carbone C-22. Le proton H-28b résonant à 3,72 ppm, montre aussi deux corrélations avec les carbones C-13 et C-18 déjà identifiés. H 28 O 18 22 17 13 H 16 12 15 Cette analyse complète a permis d’identifier sans ambiguïté la génine : 13β, 28époxyoléan-11-en-23-ol. Elle s’est avérée identique à la 16-déhydroxysaikogénine G [113] isolée la première fois de Bupleurum falcatum (Apiaceae). 30 20 21 28 19 25 11 12 O 18 26 13 1 2 14 9 10 3 4 7 HO 22 H 17 16 8 5 29 15 27 6 24 CH2OH 23 13β,28-époxyoléan-11-èn-23-ol (16-déhydroxysaikogénine G) Elle montre aussi que les 4 unités osidiques substituent le carbone C-3 et qu’il faut maintenant identifier leur nature ainsi que les points de branchement entre eux ou les liaisons intrasucres. C’est justement ce dernier point qui constitue la grande complexité de l’élucidation structurale des saponines, conjuguant méthodes dégradative et spectroscopique. La méthode dégradative consistant en une hydrolyse acide du composé a permis d’identifier le glucose, le fucose et le rhamnose, et cela par comparaison avec des échantillons authentiques. Reste maintenant à en apporter la confirmation, à déterminer la séquence des unités osidiques ainsi que leurs points de branchement, au moyen de la RMN bidimensionnelle et notamment l’expérience COSY H-H. La méthodologie d’identification des sucres reposant sur cette dernière ayant été largement détaillée auparavant (cas des iridoїdes), l’analyse qui va suivre 98 et bien que rigoureuse, sera présentée avec moins de détails afin d’éviter ainsi les répétitions ennuyeuses. A partir du proton anomère résonant à 4,48 ppm, l’expérience COSY H-H (Figure IV. 35) permet de mettre en évidence la présence d’un déoxyhexose. En effet, on repère les corrélations entre les protons H-1 et H-2, H-2 et H-3, H-3 et H-4, H-4 et H-5, et enfin H-5 et 3 protons H-6 d’un groupement méthyle résonant sous forme de doublet (J= 6,4 Hz) à 1,28 ppm. La petite taille des taches de corrélation entre les protons H-3 (3,76 ppm) et H-4 (3,88 ppm), H-4 et H-5 (3,66 ppm) traduisant de faibles constantes de couplage, indique d’emblée que le proton H-4 est en position équatoriale. Ce sucre est un fucose de configuration β déduite de la valeur de la constante de couplage J1-2= 7,9 Hz. A partir du second proton anomère résonant à 4,6 ppm, on relie sept protons correspondant à un hexose (Figure IV. 35). Les grandes taches de corrélation traduisant de grandes valeurs de constantes de couplage montrent que tous ces protons sont axiaux. On identifie ainsi un glucose de configuration β comme l’indique la valeur de la constante de couplage J1-2= 7,7 Hz. Figure IV. 35 : Spectre COSY H-H du fucose et du premier glucose 99 Le troisième sucre dont le proton anomère (masqué par le pic de l’eau) résonne à 4,83 ppm, identifié sur la base d’un couplage HSQC avec son carbone à 102 ppm, présente en COSY H-H des corrélations similaires à celles observées pour le sucre décrit précédemment. Il s’agit également d’un β-glucose. Le quatrième sucre est identifié à partir du proton anomère le plus déblindé (également masqué par le pic de l’eau) et identifié en HSQC par la corrélation qu’il présente avec le carbone qui le porte (101,4 ppm). Le spectre COSY H-H permet d’identifier un rhamnopyranose de configuration α. Configuration déduite de la petite tache de corrélation entre les protons H-1 et H-2 de ce dernier. Il est clair que cette identification n’est pas du tout une chose aisée en raison, comme il a été énoncé précédemment, de la forte concentration des protons osidiques dans une zone restreinte allant de 3 à 4 ppm. Il fallait donc s’assurer des corrélations des protons établies par expérience COSY H-H. A cet effet, une expérience TOCSY qui permet de mettre en évidence les corrélations entre un proton et les autres protons d’une même unité osidique a été exploitée. Cette technique de choix permet de repérer tous les couplages entre protons dans un même système de spin, et cela à partir d’un proton ′′espion′′ qui est le plus souvent l’anomère d’un sucre ou comme dans ce cas précis le groupement méthyle d’un déoxyhexose. Le spectre TOCSY (Figures IV. 36 et IV.37) confirme parfaitement l’identification établie par COSY H-H. Figure IV. 36 : Spectre TOCSY de la partie osidique (à partir des protons anomères) du composé F 100 Figure IV. 37 : Spectre TOCSY de la partie osidique (à partir des protons méthyliques) du composé F L’expérience HSQC a permis de déterminer sans ambiguïté les déplacements chimiques de tous les carbones osidiques. Le déblindage des carbones Glc-4 (78,1 ppm), Fuc-2 (74,9 ppm) et Fuc-3 (84,5 ppm) laisse suggérer évidemment des substitutions à ces niveaux par des sucres. L’identification des 4 unités osidiques ayant été établie, il faut maintenant déterminer leur agencement ou plus exactement leur séquence ainsi que leurs points de branchement. L’expérience HBMC et à un degré moindre la spectrométrie de masse sont les techniques appropriées. Le spectre HMBC (Figure IV. 38) permet d’établir la séquence des sucres ainsi que les points de branchement et cela par l’observation des couplages suivants entre : 101 Le proton anomère du fucose et le carbone C-3 (83,8 ppm) de la génine. Le proton anomère du glucose et le carbone C-2 (74,9 ppm) du fucose. Le proton anomère du second glucose et le carbone C-3 (84,5 ppm) du fucose. Le proton anomère du rhamnose et le carbone C-4 (78,1 ppm) de ce dernier glucose. Figure IV. 38 : Spectre HMBC mettant en évidence l’enchaînement des sucres Le spectre MS/MS (Figure IV.39) du pic pseudo moléculaire, enregistré en mode négatif, qui montre des fragments à m/z = 909 [M-H-162]- correspondant à la perte d’un hexose (le glucose), m/z = 763 [M-H-162-146]- correspondant à la perte d’un déoxyhexose (le rhamnose) et m/z = 601 [M-H-162-146-162]- correspondant à la perte d’un autre hexose (le second glucose), confirme la séquence proposée. 102 -162 601 Fuc Glc HO H3 C OH 2 O OH HO OH O O HO HO -146 HO O OH OH Rha O O O H3 C HO 3 O 4 763 -162 Glc' 909 Figure IV. 39 : Spectre de MS/MS (mode négatif) du composé F Cette analyse spectrale permet d’assigner la structure suivante pour le composé F : 12 Fuc Glc Rha H3C H3C HO O O O HO O 3 3 O O 2 CH2OH 23 OH OH O HO HO HO 28 HO OH 4 O 11 O OH OH Glc' 3-O-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyranosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}-13β,28-epoxyolean-11- en-23-ol Cette saponine s’est avérée identique à la verbascosaponine isolée de Verbascum phlomoides [119] [117] et Verbascum nigrum [118] , ilwensisaponine A isolée de Scrophularia ilwensis et mimengoside A isolée de Buddleja officinalis [120] . Ces plantes appartiennent toutes à la famille Scrophulariaceae. Cette molécule a montré des activités anti-inflammatoire et antinociceptive importantes [9]. 103 La mesure du pouvoir rotatoire dans le méthanol donne la valeur [α]D= + 28,8 ° (C= 0,32). Valeur qui concorde avec celle de la littérature (+ 32°, C= 0,87, MeOH) [120]. Tableau IV.6 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé F N° 1 (CH2) δc (ppm) 37,8 2 (CH2) 24,9 3 (CH) 4 (C) 5 (CH) 6 (CH2) 7 (CH2) 8 (C) 9 (CH) 10 (C) 11 (CH) 12 (CH) 13 (C) 14 (C) 15 (CH2) 83,8 42,9 46,7 16,8 30,6 43,6 53,1 35,6 129,9 132,8 85,5 41,3 24,9 16 (CH2) 25,2 17 (C) 18 (CH) 19 (CH2) 41,3 51,0 36,8 20 (C) 21 (CH2) 31,2 34,4 22(CH2) 23(CH2) 30,4 63,2 24(CH3) 25 (CH3) 26(CH3) 27 (CH3) 28(CH2) 11,2 17,7 18,8 18,9 76,5 29(CH3) 30(CH3) 32,9 22,8 δH (ppm) 0,96 m 1,85 m 1,80 m 1,98 m 3,64 dd 1,16 nd 1,5 m 1,23 m 1,94 sl 5,35 dd 5,93 d 1,03 m 1,8 m 1,13 m 2,08 m 1,64 m 1,29 m 1,78 m 1,23 m 1,40 m 1,48 m 3,28 d 3,76 d 0,73 s 0,95 s 1,08 s 0,99 s 3,24 d 3,72 d 0,98 s 0,90 s J (Hz) N° δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 102,0 74,4 76,7 70,8 76,7 62,1 4,83 d 3,16 dd 3,36 t 3,15 t 3,29 m 3,57 m 3,83 dd 7,7 7,7-9,3 9,3 9,3 Glucose' 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 3; 12 Glucose 2,8-10,4 10,4 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 103,7 73,8 75,3 78,1 75,1 60,2 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 10,7 10,7 7,7 7,7-9 9 9 2,4-12,2 103,1 74,9 84,5 71,1 69,9 15,7 4,48 d 3,91 dd 3,76 dd 3,88 m 3,66 m 1,28 d 101,4 70,9 70,7 72,2 69,3 16,6 4,85 s 3,87 sl 3,66 nd 3,44 t 3,95 m 1,3 d 7,8 7,8-8 4,3-8 6,4 Rhamnose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 6,6 6,6 Fuc CH2OH Glc HO H3C OH O O O O CH2OH O O HO H3C HO 4,6 d 3,39 dd 3,44 t 3,58 t 3,37 m 3,69 m 3,8 dd Fucose Composé G Rha 2,2-12,2 OH OH O HO HO HO O OH OH Glc' 104 9,5 6,5 Comme pour le produit F décrit précédemment, le composé G donne une tache bleue après révélation par la vanilline sulfurique et possède la même masse moléculaire, au vu des spectres de masse ESI qui montrent les mêmes pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 1095 [M+Na]+ (Figure IV.40) et 1107 [M+Cl]- (Figure IV.41). Il est à signaler que ce composé est visible en UV (254 nm), contrairement au produit F. Figure IV. 40 : Spectre de masse (mode positif) du composé G Figure IV. 41 : Spectre de masse (mode négatif) du composé G Le spectre UV (Figure IV.42) montre des bandes d’absorption à 243, 251 et 260 nm, caractéristiques de deux doubles liaisons conjuguées [120]. Figure IV. 42: Spectre UV du composé G 105 Le spectre RMN 13 C J-modulé (Figure IV. 43) est très voisin de celui du composé F. En effet, on reconnaît pratiquement tous les signaux de la génine et des 4 unités osidiques. La seule différence notable se situe au niveau de la génine et cela par l’apparition de deux signaux supplémentaires de deux carbones éthyléniques quaternaires à 136,6 et 134,6 ppm au détriment de carbone primaire et d’un carbone quaternaire oxygéné, prédisant ainsi de la présence cette fois d'une génine de type oléan-11,13(18) diène-3β,23α,28-triol [119]. 12 11 13 18 28 OH 3 HO 23 OH Squelette oléan-11,13(18) diène-3β,23α,28 triol Figure IV. 43: Spectre RMN 13C du composé G 106 Le spectre RMN 1H (Figure IV. 44) montre les signaux correspondant aux quatre protons anomères résonant à 3,78, 4,46, 4,39 et 4,82 ppm, les six groupements méthyliques résonant à champ fort entre 0,65 et 0,92 ppm, les signaux des deux protons éthyléniques résonant à 5,2 (H-12, d, J= 11,5 Hz) et 6,4 ppm (H-11, dd, J= 2,5 ; 11,5 Hz). On identifie aussi les deux systèmes AB dont l’un résonne à 3,34 et 3,59 ppm, l'autre à 3,24 et 3,63 ppm, correspondant aux deux alcools primaires en C-23 et C-28. Le déblindage du proton H-11 sortant à 5,35 ppm dans le cas du composé F, explique bien la présence des deux doubles liaisons conjuguées. Figure IV. 44 : Spectre RMN 1H du composé G L'attribution des déplacements chimiques des carbones (tableau IV.7) constituant la génine, a été établie conjointement par expériences COSY H-H, HSQC et HMBC. 107 Figure IV. 45: Spectre HMBC (étalé) du composé G Bien que cette analyse donne à priori pour le composé G, une structure similaire à celle du produit F, avec comme seule différence la présence d’une double liaison en 13-18, il est impératif d’identifier les unités osidiques et d’assigner les liaisons intrasucres. Le spectre COSY H-H, partant des signaux des quatre protons anomères, permet d’identifier deux β-glucopyranoses, un β-fucopyranose et un α-rhamnopyranose. Les attributions des carbones osidiques (Tableau IV.7) ont été assignées par expérience HSQC. Les points de branchements des sucres sont déterminés par expérience HMBC. Cette dernière montre des corrélations entre : Le proton anomère du fucose résonant à 4,39 ppm et le carbone C-3 (85,9 ppm) de la génine. Le proton anomère du premier glucose résonant à 4,46 ppm et le carbone en 3 du fucose. Le proton anomère du second glucose résonant à 3,78 ppm et le carbone en 2 du fucose. Le proton anomère du rhamnose résonant à 4,82 ppm et le carbone en 4 du premier glucose. Il se confirme ainsi que le composé en question possède la même structure et le même enchaînement osidique que le composé F. Les données spectrales établies et ayant permis de proposer la structure ci-dessous pour le composé G ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire (([α]D= + 26°, C= 0,3, MeOH), se sont 108 avérées similaires à celles décrites pour la songarosaponine A [23] isolée antérieurement de Verbascum songaricum et l’ilwensisaponine B [119] isolée de Scrophularia ilwensis. Fuc CH2OH Glc HO H3 C OH Rha O CH2OH O O OH HO H3 C HO O O OH O O HO HO HO O OH OH Glc' 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyrnosyl(1→2)]-β-d-fucopyranosyl}-olean-11-13(18)-diène23α,28diol Tableau IV.7: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé G N° 1 (CH2) δc (ppm) 37,9 2 (CH2) 3 (CH) 4 (C) 5 (CH) 6 (CH2) 7 (CH2) 8 (C) 9 (CH) 10 (C) 11 (CH) 12 (CH) 13 (C) 14 (C) 15 (CH2) 29,1 85,9 42,3 48,2 18,2 39,8 40,3 54,4 36,4 125,5 126,2 136,6 43,0 32,1 16 (CH2) 25,1 17 (C) 18 (C) 19 (CH2) 39,7 134,6 38,3 20 (C) 21 (CH2) 33,0 35,0 22 (CH2) 23 (CH2) 32,1 63,6 24 (CH3) 25 (CH3) 26 (CH3) 27 (CH3) 28(CH2) 11,7 18,6 116,6 20,5 66,0 29 (CH3) 30(CH3) 32,4 24,4 δH (ppm) 0,95 m 1,84 m 1,77 m 3,56 dd 1,05 nd 1,33 m 1,2 m 1,9 sl 6,4 dd 5,52 d 1,29 m 1,73 m 1,74 m 1,91 m 1,59 d 2,63 d 1,13 m 1,40 m 1,13 m 3,34 d 3,59 d 0,72 s 0,88 s 0,65 s 0,92 s 3,24 d 3,63 d 0,88 s 0,74 s J (Hz) N° δc (ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 102,2 74,4 77,0 70,9 76,6 62,0 3,78 d 3,09 dd 3,28 3,23 3,21 m 3,55 dd 3,74 dd 7,9 7,9; 9,7 103,8 73,7 75,4 78,9 75,3 60,6 4,46 d 3,36 dd 3,42 3,50 t 3,28 m 3,60 dd 3,69 dd 102,7 75,1 85,4 71,0 70,1 16,4 4,39 d 3,81 dd 3,67 dd 3,81 d 3,55 m 1,23 d 101,9 71,1 70,2 72,5 69,7 17,3 4,82 sl 3,77 3,59 dd 3,37 t 3,82 m 1,25 d Glucose' 4,7;11,2 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 2,5-11,5 11,5 2,3;12,3 4,4;12,3 Glucose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 14,2 14,2 7,7 7,7; 8,6 9,4 2,2 ;12,2 2,4; 12,4 Fucose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 10,7 10,7 7,8 7,8; 9,8 9,8; 3,5 3,2 6,2 Rhamnose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 6,6 6,6 109 3,2; 10 10 6,2 Ce composé se présenterait comme un artéfact issu de la transformation du composé F sous influence acide, lors des opérations d’extraction et de séparation chromatographique. Le schéma ci-dessous reproduit le mécanisme probable de cette transformation. Ce raisonnement est conforté par le fait que le composé G, de polarité quasi-identique que celle du composé F (CCM en phase normale), n’a pas été détecté dans l’extrait chloroformique. H H O O H+ OH O O O CH2OH CH2OH CH2OH - H+ OH O CH2OH Figure IV.46: Mécanisme de la transformation de F en G Composé H: H3CO Fuc CH2OH Glc HO H3C OH Rha O O CH2OH O O HO H3C HO O O OH OH O HO HO HO O OH OH Glc' Le composé H possède des données physicochimiques et spectrales très proches de celles des deux composés F et G. La couleur bleue, obtenue après révélation par la vanilline sulfurique, plaide également pour une saponine à génine triterpénique. Le spectre de masse (ESI) enregistré en mode négatif (Figure IV.47) montre un pic d’ion pseudo-moléculaire à m/z= 1103 [M-H]-, soit une masse moléculaire M= 1104, correspondant à une formule brute en C55H92O22. 110 Figure IV. 47: Spectre de masse (mode négatif) du composé H Le spectre RMN 13 C (J modulé) (Figure IV.48) du composé H permet de reconnaître la plupart des attributions des carbones du composé G. Cependant, l’observation d’un signal à 53,8 ppm d’un carbone de groupement méthoxyle et la présence de deux carbones éthyléniques au lieu des quatre observés pour notre produit de référence, l’un tertiaire à 121 ppm et l’autre quaternaire à 149,5 ppm, nous orientent cette fois vers une génine triterpénique à squelette oléan12-ène, porteuse d’un groupement OCH3. Figure IV. 48: Spectre RMN 13C du composé H La présence d’un tel squelette est confirmée par RMN 1H (Figure IV.49) qui montre un signal d’un proton éthylénique à 5,28 ppm (d, J= 3,3 Hz). La présence d’un groupement OCH3 à 3,2 ppm substituant probablement la génine en 11, au regard de la multiplicité du signal du proton oléfinique, se trouve également confirmée. 111 Figure IV. 49: Spectre RMN 1H du composé H L’analyse COSY H-H (Figure IV.50) montre bien une corrélation entre le proton éthylénique H-12 (d, J= 3,3 Hz) et le proton vicinal H-11 (dd, J= 3,3 ; 10 Hz) résonant à 3,83 ppm, valeur qui laisse logiquement déduire que le groupement OCH3 est fixé à ce niveau. Le couplage HMBC entre le carbone C-11 (76,4 ppm), identifié par expérience HSQC, et les protons du groupement méthoxyle, confirme bien cette hypothèse. Il incombera après d’assigner la stéréochimie à ce niveau. Figure IV.50 : Spectre COSY H-H étalé du composé H 112 Il apparaît clairement que le groupement méthoxyle est en position α, au vu de la valeur de la constante de couplage JH-11/H-9 égale à 10 Hz. Le couplage NOESY qu’il présente avec le Me27 confirme cette configuration (Figure IV.51), prévisible du fait d’un fort encombrement β occasionné par les méthyles angulaires. H H 11 18 MeO Me O 5 Me 17 Me 8 27 H 24 20 Me HOH2C Me Me HOH2C 23 Figure IV. 51: Spectre NOESY (étalé) du composé H Toutes ces données permettent d’identifier cette génine à la saikosaponine-b4 représentée ci-dessous. 113 [119] , 12 H3CO 11 13 CH2OH 3 27 HO CH2OH Saikosaponine-b4 L’analyse conjuguée des spectres COSY H-H, HMBC, HSQC et NOESY ont permis de déterminer sans ambiguïté la nature des 4 unités osidiques ainsi que leurs points de branchement. Ces derniers qui se sont avérés similaires à ceux établis pour les composés F et G décrits précédemment. Cette molécule, se différenciant finalement et uniquement par la structure de la génine, se révèle en tout point identique à la mimengoside B. Elle est également identifiée sous le nom de ilwensisaponin C, isolée de Scrophularia ilwensis C. Koch [119], Buddleja officinalis Maxim. [120], Buddleja madagascariensis Lamk. [12] et de Verbascum nigrum L. [26]. H3CO Fuc CH2OH Glc HO H3C OH Rha O O CH2OH O O HO H3C HO O O OH OH O HO HO HO O OH OH Glc' 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyrnosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}- 11α-methoxyoléan-12-ène-23,28diol Le tableau suivant reproduit les déplacements chimiques de tous les carbones et protons de la molécule. 114 Tableau IV.8: Déplacements chimiques des protons et carbones du composé H N° 1 (CH2) δc (ppm) 39,4 2 (CH2) 25,4 3 (CH) 4 (C) 5 (CH) 6 (CH2) 7 (CH2) 8 (C) 9 (CH) 10 (C) 11 (CH) 12 (CH) 13 (C) 14 (C) 15 (CH2) 86,2 43,0 48,5 18,2 32,9 41,9 51,7 36,9 76,4 121,7 149,5 43,3 25,7 16 (CH2) 21,8 17 (C) 18 (CH) 19 (CH2) 37,9 42,3 46,4 20 (C) 21 (CH2) 29,8 34,2 22 (CH2) 31,1 23 (CH2) 66,6 24 (CH3) 25 (CH3) 26 (CH3) 27 (CH3) 28 (CH2) 12,1 18,1 16,4 25,2 69,2 29 (CH3) 30 (CH3) OMe 33,2 23,6 53,8 δH (ppm) 1,16 m 1,87 m 1,74 m 1,88 m 3,55 m 1,03 nd 1,76 m 1,6 m 1,7 d 3,83 dd 5,28 d 0,96 m 1,61 m 1,64 m 1,78 m 1,98 dd 1,08 m 1,69 m 1,16 m 1,3 m 1,37 m 1,48 m 3,28 d 3,65 d 0,75 s 1,04 s 0,93 s 1,16 s 3,1 d 3,46 d 0,85 s 0,85 s 3,2 s J (Hz) N° δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 102,2 74,3 76,9 70,1 76,6 61,9 4,46 d 3,12 dd 3,31 m 3,27 m 3,25 m 3,59 dd 3,78 dd 7,7 7,7-9,8 103,8 73,7 75,3 78,8 75,2 60,6 4,78 d 3,39 dd 3,46 t 3,53 t 3,31 m 3,64 dd 3,72 dd 102,6 75,4 85,4 71,0 70,1 17,4 4,38 d 3,84 dd 3,71 dd 3,83 m 3,57 m 1,28 d 101,9 71,2 70,9 72,5 69,7 17,5 4,82 sl 3,80 m 3,62 m 3,41 t 3,85 m 1,28 d Glucose' 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 2,2-12,4 4,5-12,4 8,8 Glucose 3,3; 10 3,3 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH2) 4;13 3-11,5 3,4-11,5 Fucose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 10,7 10,7 7,9 7,9-8,6 8,6 9,2 7,8 7,8-8,6 3-8,6 6,5 Rhamnose 1 (CH) 2 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH3) 6,6 6,6 10 6,5 Ce composé pourrait être aussi un artéfact issu de la transformation du composé F et cela durant les opérations de séparation. Cette hypothèse se trouve confortée par Ding et coll. [120] qui ont montré que le composé F traité par l’acide p-toluène sulfonique dans le méthanol [120] , conduit au composé H. La réaction inverse a été observée lors du chauffage à 37°C dans l’acétate d’éthyle tampon (pH = 4) et cela durant un jour (Figure IV.52). 115 O Glc H3C HO HO O OH OH O (pH 4) 37°C, 24 h O HO HO O H3C HO HO O O O CH2OH O O HO OH OH O OH OH HO H3C OH Rha CH2OH O O HO p-TsOH MeOH O O Rha CH2OH Glc HO H3C OH H3CO Fuc Fuc O HO HO O OH OH Glc' Glc' Figure IV.52: Transformation entre composés F et G Le mécanisme suggéré pour cette réaction consisterait en une protonation du groupement époxyde provoquant ainsi son ouverture et entraînant par voie de conséquence, la formation d’un carbocation. Ce dernier subit finalement une addition nucléophile stéréosélective du méthanol (Figure IV.53). H O O H HO + O O O CH2OH CH2OH CH2OH MeOH Me_OH H MeO - H+ Me O OH O O O CH2OH OH OH CH2OH CH2OH Figure IV.53: Mécanisme proposé pour la transformation de F en H Conclusion L’étude chimique de l’extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii, nous a permis d’isoler huit produits naturels dont trois saponines triterpéniques et cinq iridoïdes glycosilés. La grande teneur en saponosides expliquerait la toxicité de la plante, comme pour les autres plantes du genre. 116 CHAPITRE V INVESTIGATION CHIMIQUE DE VERBASCUM DENTIFOLIUM 117 V.1. Aspect botanique et lieux d’existence L’espèce Verbascum dentifolium Del., appelée aussi Verbascum granatense Boiss.[99], est une plante bisannuelle rencontrée dans le sud Algérien et plus particulièrement dans les montagnes [99]. Les hauteurs des Aurès constituent un relief propice. La plante est recouverte entièrement par un tomentum dense, étoilé, grisâtre et persistant à tige rameuse à partir de son milieu. Ses feuilles basilaires sont grandes, longuement pétiolées et entièrement ou grossièrement sublobées, à lobes triangulaires. Ses bractées cordées-triangulaires sont ordinairement plus larges que longues [99] . Le connectif des deux étamines antérieures est densément recouvert sur la face supérieure de pailles à peine claviformes. Les filets sont densément villeux à papilles violet pale ou jaunâtre. La capsule est deux fois plus longue que le calice. Ce dernier est à divisions ovales-lancéolées. Les pédicelles fructifères sont un peu épaissis [99]. Verbascum dentifolium (Scrophulariaceae) Au Maroc, cette plante est appelée vernaculairement « Muslih al-andar », c'est-à-dire le correcteur de la vision, en rapport à l’usage qu’on en fait localement des racines pour traiter les conjonctivites, la vue brouillée et la cataracte [102] . Les racines brûlées, pilées et mélangées au « khol » sont appliquées sur les cils. Il arrive aussi d’incorporer à ce mélange du sucre candi 118 carbonisé, du cuivre brûlé et des noyaux d’olives pulvérisés [102]. La population montagnarde des Aurès quant à elle, lui attribue des pouvoirs toxiques, voire hallucinogènes. V.2. Travaux antérieurs sur Verbascum dentifolium La recherche bibliographique exhaustive réalisée sur l’espèce dentifolium a montré qu’elle n’a fait l’objet d’aucune investigation d’ordre chimique ou biologique. V.3. Résultats et discussions V.3.1. Extraction La plante a été récoltée en juin 2005, sur son lieu de prédilection, au pied des monts Aurès et identifiée par le Professeur Bachir OUDJEHIH, du département d’Agronomie de l’Université de Batna. Le matériel est mis à sécher à l’ombre, à l’abri de la chaleur et de l’humidité. Les racines pulvérisées sont extraites successivement par trois solvants différents : hexane, acétate d’éthyle et méthanol. Les extraits finaux sont obtenus après évaporation à sec du solvant. Tout le protocole d’extraction est illustré par le schéma ci-dessous. Il est à rappeler qu’une analyse CCM préalable a montré que les racines et les parties aériennes présentent une constitution chimique similaire. Racines de Verbascum dentifolium 420 g Extrait hexanique 3.5 g Evaporation Macération dans l’hexane (4 х 5 L) Filtration Marcs Extrait acétate d’éthyle 14 g Evaporation Macération dans l’acétate d’éthyle (3 х 5 L) Filtration Marcs Evaporation Macération dans le méthanol (2 х 5 L) Filtration Extrait méthanolique 70 g Marcs jetés SCHEMA DE L’EXTRACTION 119 V.3.2. Séparation et purification Le fractionnement de 12 grammes d’extrait acétate d’éthyle est effectué sur une colonne de gel de silice en phase et pression normales avec un gradient éther de pétrole-acétate d’éthyle et acétate d’éthyle-méthanol. 362 fractions de 50 ml sont recueillies et regroupées en 11 lots sur la base d’une analyse par CCM. Le lot 9 est chromatographié sur une colonne de gel de silice. L’élution mise en oeuvre au moyen d’un mélange CHCl3/MeOH/H2O (90/10/1, 80/20/2), a permis de recueillir deux sous lots. Une filtration sur une colonne de Sephadex LH-20 dans le méthanol, a permis d’obtenir à partir du premier, le composé M à l’état pur et du deuxième, un mélange inséparable de deux isomères géométriques I et J. Toutes les tentatives de séparation, y compris l’usage de la chromatographie CLHP, se sont avérées infructueuses. Le lot 10 montrant en CCM et après révélation à la vanilline sulfurique une tache marron invisible en UV, est soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice normale. L’élution a été réalisée respectivement par le chloroforme, chloroforme/méthanol/eau (90/10/1, 80/20/2). Le rassemblement des fractions présentant des similitudes, a donné 5 sous lots. L’analyse chromatographique sur silice RP-18 du sous lot 3 montre la présence de deux taches bien distinctes. Une chromatographie préparative de silice RP-18 menée au moyen d’un mélange MeOH/H2O (40/60), a permis d’isoler les deux composés K et L à l’état pur. Le lot 8 est également soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice. L’élution effectuée avec un mélange CHCl3/MeOH/H2O (90/10/1, 80/20/2), a permis d’obtenir le composé N à l’état pur. V.3.3. Détermination de structures Composés I et J 1"' O 1"' OCH3 H3COCO O H3COCO O HO H3C O HO H3C 1" 5" O H O 7 8 HO 10 1" O 3 5 9 1 H O 5" 4 6 H 4 6 7 O 5' 1' O OCH3 O 5 9 8 OH O HO OH HO O 10 H 3 1 O 1' O 5' O OH HO OH OH 120 OH Le spectre de masse ESI, enregistré en mode positif, montre un pic d’ion pseudomoléculaire à m/z 733 [M+Na]+, soit une masse moléculaire M= 710 correspondant à une formule brute en C33H42O17. Figure V. 1: Spectre de masse (mode positif) des deux composés I et J Le spectre RMN 1H (Figure V. 2) montre toutes les caractéristiques d’un iridoïde à noyau catalpol. On reconnaît facilement les protons H-5 (δ 2,45, m), H-9 (δ 3,9, m), H-1 (δ 4,87, d, J= 9,7 Hz), H-3 (δ 6,27, dd, J= 1,8; 6,2 Hz), H-4 (δ 5,04, dd, J= 4,4 ; 6,2 Hz). Leur intégration 2H, la présence de deux signaux de protons anomères H-1' (δ 4,74, d, J= 7,9 Hz) de glucose constituant le noyau catalpol et l’analyse du spectre de masse qui montre un seul pic d’ion pseudo-moléculaire, laissent envisager la présence de deux iridoїdes isomères. En outre, l’observation (Figure V.3) de signaux de deux protons anomères (δ 4,95, d, J= 1,4 Hz et δ 4,91, d, J= 1,4 Hz) de déoxyhexose et de deux groupements acétate à 1,98 et 2,01 ppm permet d’envisager légitimement l’hypothèse d’un mélange de deux rhamnopyranosyl catalpol isomères. Figure V. 2: Spectre RMN 1H des deux composés I et J 121 Figure V. 3: Spectre RMN 1H (étalé) des deux composés I et J L’observation, toujours au niveau du spectre proton, de quatre signaux doublets de protons aromatiques d’intégration 2H chacun (δ 6,88 et 7,84, J= 8,7 Hz) et (δ 6,84 et 7,86, J= 8,8 Hz), de deux protons de double liaison trans à 6,33 (H-α, d, J= 15,9 Hz) et 7,63 ppm (H-β, d, J= 15,9 Hz), ainsi que de deux protons de double liaison cis à 5,84 (H-α', d, J= 12,8 Hz) et 6,89 ppm (Hβ', d, J= 12,9 Hz) laisse suggérer la présence de deux groupements cinnamoyles para-substitués, l’un de configuration trans et l’autre de configuration cis. Le spectre RMN 13 C qui révèle un total dédoublement des signaux, montre que les carbones C-4 des deux groupements cinnamoyles résonant à 161,8 et 160,7 ppm et identifiés sur la base de leurs corrélations HMBC avec les protons aromatiques, se trouvent déplacés de presque 30 ppm par rapport au même carbone C-4 (130,4 ppm) non substitué du composé B (scropolioside D) décrit précédemment. Leurs couplages HMBC avec les protons de deux groupements méthoxyles résonant à 2,83 et 2,94 ppm permettent d’identifier deux groupements p-méthoxy-cinnamoyles. MeO CH CH CO p-méthoxy-cinnamoyle L’expérience COSY H-H (Figure V.4) permet de retrouver toutes les corrélations identifiant le noyau catalpol. 122 Figure V. 4: Spectre COSY (noyau catalpol) des deux composés I et J Elle permet d’identifier, partant des deux protons anomères résonant à 4,91 et 4,95 ppm (Figure V.5), deux rhamnopyranoses de configuration α. Figure V. 5: Spectre COSY H-H (rhamnopyranoses) des deux composés I et J 123 Les déplacements vers les champs faibles des protons H-2 (5,35 et 5,29 ppm) et H-3 (5,14 et 5,13 ppm) traduisent des substitutions à ces niveaux par les groupements p-méthoxycinnamoyles et acétates préalablement identifiés. Ceci est confirmé par expérience de corrélation C-H longue distance (Figure V.6) qui montre les corrélations en 3JC-H entre : Le proton H-2 du premier rhamnose et le carbonyle du groupement p-méthoxy-transcinnamoyle résonant à 166,7 ppm. Le proton H-3 du premier rhamnose et le carbonyle du premier groupement acétate résonant à 171,3 ppm. Le proton H-2 du second rhamnose et le carbonyle du groupement p- méthoxy- cis-cinnamoyle résonant à 165,5 ppm. Le proton H-3 du second rhamnose et le carbonyle du second groupement acétate résonant à 171,4 ppm. L’expérience HMBC confirme bien qu’on est en présence de deux rhamnopyranosylcatalpol acylés isomères. La différence se situe uniquement au niveau de la géométrie de la double liaison des deux groupements p-méthoxy-cinnamoyle. Figure V. 6: Spectre HMBC (étalé) des deux composés I et J Toutes ces données, en plus des données HSQC, permettent d’identifier sans ambiguïté les deux composés I et J comme étant : 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-trans-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-Lrhamnopyranosyl]-catalpol (composé I) et 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-cis-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-αL-rhamnopyranosyl]-catalpol (composé J). Ceci est en parfait accord avec la formule brute proposée pour ces deux composés. 124 1"' O OCH3 H3COCO O HO H3C O 1" O 4 6 5 7 9 8 HO 3 O 10 O 1 OH 1' O O OH HO OH 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-trans-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]catalpol 1"' O H3COCO HO H 3C OCH3 O O 1" O H 4 6 3 7 O 1 8 HO 10 H O O OH 1' O OH HO OH 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-cis-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]catalpol Si le composé I s’est avéré en tout point identique au pulverulentoside I isolé antérieurement de Verbascum pulverulentum [122] fois. 125 , Le composé J est décrit ici pour la première Tableau V.1 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé I N° δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) 94,5 141,1 102,5 35,9 82,9 58,3 65,3 42,2 60,8 4,87 d 6,27 dd 5,04 dd 2,45 m 3,9 dd 3,57 sl 2,55 m 3,84 d 3,92 d 9,7 1,8; 6,2 4,4; 6,2 Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) 98,9 73,3 76,2 70,1 76,8 61,5 4,74 d 3,26 dd 3,41 t 3,27 t 3,4 m 3,68 dd 3,8 dd 7,9 7,9;9,1 9,1 9,1 96,6 69,9 71,9 70,5 69,2 17,5 4,95 d 5,35 dd 5,14 dd 3,6 t 3,81 m 1,33 d 126,9 130,1 114,5 161,8 114,4 132,5 166,7 55,5 7,48 d (2H) 6,88 d (2H) 6,33 d 7,63 d 2,94 s (3H) 2,01 s (3H) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle 1"' (C) 2"', 6"' (CH) 3"', 5"' (CH) 4"' (CH) α (CH) β (CH) CO OMe Acétate CH3 CO 20,9 171,3 126 0,8; 8,3 12,0 12,0 2; 12,2 5,1; 12,2 1,4 1,4; 3,4 3,4, 9,0 9,0 6,23 8,7 8,7 15,9 15,9 Tableau V.2 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé J N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) Rhamnose 1" (CH) 2" (CH) 3" (CH) 4" (CH) 5" (CH) 6" (CH3) Cinnamoyle 1"' (C) 2"', 6"' (CH) 3"', 5"' (CH) 4"' (CH) α (CH) β (CH) CO OMe Acétate CH3 CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 94,5 141,1 102,5 35,9 82,9 58,3 65,3 42,2 60,8 4,87 d 6,27 dd 5,04 dd 2,45 m 3,9 dd 3,57 sl 2,55 m 3,84 d 3,92 d 9,7 1,8; 6,2 4,4; 6,2 98,9 73,3 76,2 70,1 76,8 61,5 4,74 d 3,26 dd 3,41 t 3,27 t 3,4 m 3,68 dd 3,8 dd 7,9 7,9;9,1 9,1 9,1 96,6 69,9 71,8 70,4 69,2 17,4 4,91 d 5,29 dd 5,13 dd 3,49 t 3,76 m 1,28 d 127,2 146,0 113,6 160,7 115,9 145,3 165,5 55,4 7,68 d (2H) 6,84 d (2H) 5,84 d 6,89 d 2,83 s (3H) 1,98 s (3H) 20,8 171,4 Composé K HO H 4 6 3 5 9 7 8 HOH2C 1 H O 10 O 5' 1' OH O HO OH HO 127 0,8; 8,3 12,0 12,0 2; 12,2 5,1; 12,2 1,4 1,4; 3,4 3,4; 9,7 9,7 6,2 8,8 8,8 12,9 12,9 Le spectre de masse enregistré en mode positif (Figure V.7) montre un pic d’ion pseudomoléculaire à m/z = 369 [M+Na]+, soit une masse moléculaire M= 346 correspondant à une formule brute en C15H22O9. Figure V. 7: Spectre de masse (mode positif) du composé K Le spectre RMN 1H (Figure V.8) montre des signaux caractéristiques du noyau catalpol (H-3 à 6,43 ppm, H-4 à 5,12 ppm, H-9 à 2,92 ppm, H-5 à 2,68 ppm, les deux protons H-10 à 4,2 et 4,38 ppm et le proton anomère H-1' à 4,71 ppm). La différence réside en l’apparition d’un proton oléfinique à 5,79 ppm sous forme d’un singulet large indiquant la présence d’une double liaison trisubstitiuée au niveau du cycle pentanique. Cette dernière se situe très probablement en C7-C8 au vu de la multiplicité du signal du proton éthylénique H-7 (δ 5,79 ppm) si l’on tient compte du fait que l’alcool primaire (H-10) est porté généralement par le carbone C-8. Figure V. 8: Spectre RMN 1H du composé K 128 La localisation de la double liaison en C7-C8 est confirmée par expérience COSY H-H (Figure V.9) qui montre une corrélation entre le proton H-6 résonant à 4,47 ppm et un proton éthylénique à 5,79 ppm ne pouvant être que le proton H-7. Le proton H-6 dont le déplacement chimique (δ 4,47) indique qu’il est porteur d’un OH libre, est identifié du fait de sa corrélation avec le proton H-5, lui-même couplant avec les protons H-4, H-9 préalablement repérés sur le spectre proton. L’expérience COSY H-H (Figure V.9) permet d’identifier ce composé à un iridoїde commun à la famille Scrophulariaceae en général et le genre Verbascum [8,9,15] en particulier, à savoir l’aucubine qui est considérée à juste titre comme un marqueur chimiotaxonomique. Figure V. 9: Spectre COSY (génine) du composé K L’analyse des spectres HSQC J-modulé et HMBC a permis d’assigner les déplacements chimiques de tous les carbones de la molécule (Figure V.10). 129 Figure V. 10: Spectre RMN 13C du composé K Il se confirme, à l’issue de cette analyse spectrale, que les valeurs des déplacements chimiques des protons et carbones de ce composé (Tableau V.3) sont celles établies pour les protons et carbones de l’aucubine, isolée pour la première fois de Aucuba japonica [123]. HO H 4 6 3 5 9 7 8 HOH2C 1 H O 5' 1' O OH O HO OH HO Tableau V.3 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé K N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (C) 9 (CH) 10 (CH2) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 97,7 141,6 105,7 46,3 82,8 130,2 148,0 47,9 61,4 4,98 d 6,34 dd 5,12 dd 2,68 m 4,47 m 5,79 sl 2,92 t 4,2 d 4,38 d 7,1 1,7; 6,1 3,9; 6,1 99,9 74,9 77,9 78,3 71,5 62,6 4,71 d 3,24 dd 3,4 t 3,34 t 3,3 m 3,67 dd 3,89 dd 7,9 7,9; 9,2 9,2 9,2 130 7,4 15,4 15,4 5,5; 12,1 1,8; 12,1 Composé L HO OH 4 6 3 7 8 5 9 HO CH H 3 1 O O 5' 1' OH O HO OH HO Les spectres de masse ESI, enregistrés en modes positif (Figure V.11) et négatif (Figure V.12), montrent respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z = 387 [M+Na]+ et 399 [M+Cl]-, soit une masse moléculaire M = 364 correspondant à une formule brute en C15H24O10. Figure V. 11: Spectre de masse (mode positif) du composé L Figure V. 12: Spectre de masse (mode négatif) du composé L Le spectre RMN du 1H (Figure V.13) du composé L présente de fortes similitudes avec celui du composé A isolé de Verbascum ballii, l’ajugol. On identifie ainsi les deux protons éthyléniques à 6,31 ppm (H-3, d, J= 6.4 Hz) et 4,89 ppm (H-4, dd, J= 1,4 ; 6,4 Hz), les protons géminés H-7 à 1,82 (dd, J= 4 ; 14,2 Hz) et 2,86 ppm (d, J= 14,2 Hz), le signal multiplet du proton H-9 à 2,55 ppm, le proton anomère H-1' (δ 4,57, d, J= 7,9 Hz), le proton H-1 (δ 5,7, sl) et enfin un singulet à 1,24 ppm d’intégration 3H du groupement méthyle (H-10). La différence notable, illustrée par la multiplicité du proton H-3, se résume par l’absence du proton H-5. La différence de masse de 16 uma suggère la présence d’un groupement OH en C-5. Ceci est 131 confirmé par la totale similitude des spectres RMN 13 C à l’exception du signal du carbone C-5 apparaissant à 71,9 ppm au lieu de 40,7 ppm observé pour le composé A (Figure V.14). Figure V. 13: Spectre RMN 1H du composé L Figure V.14 : Spectre RMN 13C du composé L L’expérience COSY H-H (Figure V.15) montre les couplages attendus entre les protons H-3 et H-4, H-4 et H-9, H-9 et H-1, H7a et H-7b, H-7b et un proton résonant à 3,73 ppm attribué au 132 proton H-6. Le déplacement chimique de ce dernier indique que le carbone C-6 est porteur d’un OH libre. Elle confirme également la présence du β-glucose porté par le carbone C-1 de la génine. Figure V. 15: Spectre COSY H-H (génine) du composé L Les déplacements chimiques des protons et carbones (Tableau V.4) du composé L, assignés conjointement par expériences COSY H-H, HSQC, HMBC ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire ([α]D= -132, C 0,3=g/100ml, MeOH), permettent d’identifier ce dernier à l’harpagide [124] , iridoïde très présent au sein du genre Scrophularia (Scrophulariaceae) et considéré ainsi comme marqueur chimiotaxonomique spécifique. La dernière version 2008 du dictionnaire des produits naturels DNP [125] permet d’attester qu’il est cité ici pour la première fois dans le genre Verbascum. HO OH 4 6 7 3 5 1 HO CHH 3 O O 1' OH O HO OH HO Harpagide 133 Tableau V.4 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé L N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (C) 6 (CH) 7 (CH2) δc ( ppm) δH ( ppm) 91,7 141,8 106,0 71,9 77,6 44,9 8 (C) 9 (CH) 10 (CH3) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) 78,0 58,1 23,9 5,7 sl 6,31 d 4,89 dd 3,73 d 1,82 dd 1,86 d 2,55 sl 1,24 s (3H) J ( Hz ) 6,4 1,4; 6,4 4,0 4,0; 14,2 14,2 - 4,57 d 3,25 t 3,35 dd 3,28 t 3,32 m 3,73 dd 3,87 dd 97,7 72,6 75,8 69,9 76,1 61,3 7,9 8,6 8,6; 8,9 8,9 5,3; 12,1 2,4; 12,1 Composé M HO OH 4 6 3 5 7 8 9 O O 1 CH3 O HO O 5' 1' OH O OH HO Les spectres de masse ESI enregistrés en modes positif (Figure V.16) et négatif (Figure V.17) présentent respectivement des pics d’ions pseudo-moléculaires à m/z= 517 [M+Na]+ et 493 [M-H]-, soit une masse moléculaire M= 494 correspondant à une formule brute en C24 H30O11. Figure V. 16: Spectre de masse ESI (mode positif) du composé M 134 Figure V. 17: Spectre de masse ESI (mode négatif) du composé M Il en ressort, d’après le spectre RMN 1H (Figure V.18), que le composé M est de même squelette que le composé L. En effet, on y voit tous les signaux caractéristiques du noyau harpagide : H-3 (δ 6,4), H-1 (δ 6,22), H-4 (δ 4,89), H-1' (δ 4,64), H-9 (δ 2,95), H-7a (δ 2,29), H-7b (δ 1,95) et H-10 (δ 1,5). En outre, l’observation de signaux de deux protons d’une double liaison trans à 6,43 et 7,62 ppm (d, J= 16 Hz) et de cinq protons aromatiques entre 7,37 et 7,57 ppm suggère la présence d’un groupement trans-cinnamoyle, acylant le noyau harpagide. Figure V. 18: Spectre RMN 1H du composé M Le spectre RMN 13C en J-modulé (Figure 19) permet d’identifier tous les signaux carbones de l’harpagide (composé L) à l’exception du signal du carbone quaternaire C-8 apparaissant à 87,7 ppm au lieu de 78 ppm observé pour ce dernier. Ce déblindage de + 9,7 ppm indique que le groupement trans-cinnamoyle substitue l’harpagide à ce niveau. Ceci est confirmé par expérience HMBC (Figure V. 20) qui montre un couplage en 4JC-H entre le proton H-7b (δ 1,95) et le carbonyle (δ 167,6) du groupement trans-cinnamoyle. 135 Figure V. 19: Spectre RMN 13C du composé M Figure V. 20: Spectre HMBC du composé M Tous les déplacements chimiques des protons et carbones (Tableau V.5) déterminés conjointement par les expériences COSY H-H, HSQC et HMBC ainsi que la valeur du pouvoir rotatoire ([α]D= - 13°, C= 0,3 g/100ml, MeOH), permettent d’identifier le composé M á l’harpagoside B, isolé initialement de Harpagophytum procumbens identifié dans les parties aériennes de Rogeria adenophylla [127] [126] . Il a été également et les racines de Verbascum lasianthum [128]. Ce composé a montré une activité antidiabétique significative [129]. 136 HO OH 4 6 3 5 7 8 1 9 O O CH3 O HO O 5' 1' OH O OH HO 8-O-trans-cinnamoyle harpagide Le tableau suivant reproduit les déplacements chimiques de tous les carbones et protons du composé M. Tableau V.5 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé M N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (C) 6 (CH) 7 (CH2) δc ( ppm) δH ( ppm) 93,3 145,1 104,7 72,3 76,3 45,0 8 (C) 9 (CH) 10 (CH3) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) 87,7 53,9 38,6 6,22 sl 6,4 d 4,89 dd 3,79 d 1,95 dd 2,29 d 2,95 sl 1,50 s (3H) Cinnamoyle 1'' 2'',6'' 3'',5'' 4'' α β CO 98,6 72,8 76,1 70,3 76,4 61,9 4,64 d 3,28 dd 3,46 t 3,35 nd 3,4 m 3,75 dd 3,95 dd 134,1 128,0 128,7 131,O 118,6 143,0 167,6 7,57 m 7,51 m 7,37 m 6,43 d 7,62 d - Composé N HO H 4 3 6 7 HO 1 8 CH3 H 10 O O 5' 1' O O O HO OH HO 3" 4" OH 137 OCH3 J ( Hz ) 6,5 1,5; 6,5 4,3 4,3; 15,4 15,4 - 7,9 7,9; 8,9 8,9 6,0; 12,2 2,3; 12,2 16,0 16,0 Le spectre de masse ESI, enregistré en mode positif (Figure V.21), présente un pic d’ion pseudo-moléculaire à m/z= 521 [M+Na]+, soit une masse moléculaire M= 498 correspondant à une formule brute en C23H30O12. Figure V. 21: Spectre de masse (mode positif) du composé N Le composé N présente, à l’instar des molécules décrites ci-dessus, toutes les caractéristiques physico-chimiques d’un iridoїde. Le spectre RMN 1H (Figure V.22) laisse reconnaître les protons H-3 (δ 6,17, dd, J= 2 ; 6,2 Hz), H-1 (δ 5,23, d, J= 2,4 Hz), H-4 (δ 4,78, dd, J= 2,7 ; 6,2 Hz), H-1' (δ 4,64, d, J= 7,9 Hz) et H-9 (δ 2,69, m). La multiplicité du proton H-3 traduit cette fois ci la présence du proton H-5. Figure V. 22: Spectre RMN 1H du composé N L’identification des autres protons de la génine a été effectuée au moyen du spectre de corrélation bidimensionnelle COSY H-H (Figure V.23). Il est observé les corrélations entre les 138 protons H-3 et H-4, H-4 et un signal d’intégration 1H attribué au proton H-5 (δ 2,62), ce dernier corrélant avec le proton H-9 (δ 2,69) et un signal résonant à 3,73 ppm attribué au proton H-6. La valeur de son déplacement chimique indique une substitution à ce niveau par un groupement OH. Le proton H-7 (δ 3,69) est identifié sur la base de sa corrélation avec le proton H-6. La valeur de son déplacement chimique indique que le carbone C-7 est également porteur d’un groupement OH. Il corrèle avec un signal à 2,13 ppm (m) attribué au proton H-8, lui même corrélant avec le proton H-9 et les protons méthyliques H-10. Le groupement méthyle est porté donc par le carbone C-8 de la génine. Figure V. 23: Spectre COSY H-H du composé N (génine) Partant du proton anomère H-1' (δ 4,64, d, J= 7,9 Hz), le spectre COSY H-H (Figure V.24) permet d’identifier un β-D-glucose selon une analyse largement détaillée précédemment. Celle-ci a permis de relever que les protons H-6' sont déplacés inhabituellement vers les champs faibles (δ 4,48 et 4,6) et d’indiquer par voie de conséquence une acylation en C-6 du glucose. 139 Figure V. 24: Spectre COSY H-H du composé N (glucose) Les déplacements chimiques des protons et carbones (Tableau V.6) du composé N, assignés sans ambiguїté par expériences COSY H-H, HMBC, HSQC, sont identiques à ceux de l’angéloside isolé pour la première fois de Angelonia integerrima (Scrophulariaceae) [130] , à l’exception des déplacements chimiques des protons H-6'a et H-6'b du glucopyranose. Différence qui nous a permis logiquement de déduire que notre composé est acylé à ce niveau. HO H 4 3 6 7 HO 1 8 CH3 H 10 O O 1' O HO 6' OH OH HO Angéloside La stéréochimie de ce composé est établie par analyse du spectre NOESY (Figure V.25). Ce dernier montre des corrélations entre le proton H-1α et les protons méthyliques H-10 eux méme couplant avec le proton H-7. D’autres corrélations sont observées également entre les deux protons H-5β et H-9β, H-9β et H-8. 140 HO HO H H H 7 H H HO 5 H 9 8 CH3 O 1 Glc H Figure V.25 : Spectre NOESY du composé N En plus des signaux de protons décrits précédemment, le spectre RMN 1H montre un signal singulet à 3,91 ppm s’intégrant pour trois protons, caractéristique d’un groupement méthoxyle. Il est également observé la présence d’un système ABX constitué par trois protons aromatiques apparaissant à 6,85 (d, J= 8,3 Hz), 7,52 (d, J= 1,8 Hz) et 7,59 ppm (dd, J= 1,8 ; 8,3 Hz). L’expérience HMBC (Figure V.26) met en évidence des couplages hétéronucléaires longue distance entre les deux protons H-6'a et H-6'b du glucopyranose et un carbonyle résonant à 166,7 ppm, confirmant la substitution du proton de la fonction hydroxyle en C-6' du glucopyranose par 141 un groupement acylant de nature aromatique. En effet, le carbone du carbonyle corrèle avec les deux protons aromatiques (δH 7,52 et 7,59) déjà cités. Le spectre HMBC montre également des couplages entre le proton aromatique à 7,52 ppm (H-2") et deux autres carbones aromatiques. L’un résonant à 146,9 ppm (C-3") et corrélant avec les protons du groupement méthoxyle, indique que ce dernier est positionné en C-3", l’autre de déplacement chimique égal à 150 ppm (C-4") est porteur d’un groupement hydroxyle. HO 7 HO 6 4 5 9 8 CH3 10 H 3 1 O O 1' HO O O O OH 2" 1" 3" H " 6 HO H H 5" OCH3 4" OH Figure V. 26 : Spectre HMBC du composé N 142 Le spectre MS/MS du composé N (Figure V.27) montre un pic de fragmentation à m/z = 353 [M-168+Na]+, correspondant à la perte de l’acide vanilloique. HO -168 HO 353 O O CH3 O O O HO OH OCH3 HO OH Figure V. 27: Spectre ESI MS/MS du composé N L’identification de tous les carbones (Figure V.28) de ce composé est réalisée conjointement par les expériences HSQC J-modulé et HMBC. Figure V. 28: Spectre RMN 13C du composé N 143 Ce composé identifié comme étant le 6'-O-vanilloyle angéloside, n’a fait l’objet d’aucune citation antérieure. HO H 4 3 6 7 HO 1 8 CH3 H O O O 5' 1' 10 O O HO OH 3" HO OCH3 4" OH 6'-O-vanilloyle angéloside Les déplacements chimiques des protons et carbones du composé N sont regroupés dans le tableau ci-dessus. Tableau V.6 : Déplacements chimiques des protons et carbones du composé N N° Aglycone 1 (CH) 3 (CH) 4 (CH) 5 (CH) 6 (CH) 7 (CH) 8 (CH) 9 (CH) 10 (CH3) Glucose 1' (CH) 2' (CH) 3' (CH) 4' (CH) 5' (CH) 6' (CH2) vanilloyle 1" (C) 2" (CH) 3" (C) 4" (C) 5" (CH) 6" (CH) OCH3 CO δc ( ppm) δH ( ppm) J ( Hz ) 93,2 140,0 104,2 36,6 76,6 79,2 37,6 38,2 13,4 5,23 d 6,17 dd 4,78 dd 2,62 m 3,73 m 3,69 m 2,13 m 2,69 m 1,03 d (3H) 2,4 2,0 ; 6,2 2,7 ; 6,2 97,4 72,9 76,0 70,1 74,0 63,6 4,64 d 3,30 t 3,48 t 3,42 t 3,61 m 4,48 dd 4,60 dd 7,9 7,9 8,9 9,2 122,0 112,1 146,9 150,0 114,8 124,0 55,6 166,7 7,52 d 6,85 d 7,59 dd 3,91 s (3H) - 144 7,3 6,2 ; 11,9 2,1 ; 11,9 1,8 8,3 1,8; 8,3 CONCLUSION 145 Au cours du présent travail, deux espèces toxiques du genre Verbascum ont été, pour la première fois, investies chimiquement. Il s’agit de Verbascum ballii et Verbascum dentifolium. A l’issue de cette investigation, 14 composés dont 2 nouveaux, ont été isolés et caractérisés. L’étude de l’extrait méthanolique des parties aériennes de Verbascum ballii a conduit à l’isolement et l’identification de cinq iridoїdes : ajugol (A), scrospioside A (B), scropolioside B (C), 6-O-[(3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol (D), saccatoside (E) ainsi que de trois saponosides: mimengoside A (F), songarosaponine A (G) et mimengoside B (H). Il est à rappeler que la toxicité de V. ballii serait due à la présence justement de saponosides. Six iridoїdes ont été isolés de l’extrait acétate d’éthyle des racines de Verbascum dentifolium : pulverulentoside I (I), 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-cis-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-Lrhamnopyranosyl]-catalpol (J), aucubine (K), harpagide (L), harpagoside (M) et 6'-O-vanilloyle angéloside (N). Les deux composés (J) et (N) sont isolés pour la première fois dans le cadre de ce travail. Aucubine et harpagide pourraient être responsables de la toxicité établie de la plante en question, de même que son activité anti-inflammatoire. L’isolement de tous ces composés a été effectué à l’aide de méthodes chromatographiques. L’élucidation des structures a été surtout réalisée grâce à des moyens spectroscopiques (RMN, SM, IR et UV) et par comparaison avec les données de la littérature. Cette étude a permis de compléter nos connaissances quant à la composition chimique des plantes du genre Verbascum en particulier et Scrophulariaceae en général. Elle a en outre démontré leur intérêt comme source de nouveaux produits naturels. Sur le plan chimiotaxonomique, la constitution chimique est tout à fait en accord avec les plantes du genre Verbascum et de la famille Scrophulariaceae. Plantes où saponines et iridoïdes sont omniprésents. Ajugol, aucubine, catalpol, harpagide et leurs dérivés sont considérés comme des marqueurs chimiotaxonomiques spécifiques du genre Verbascum. Cependant cette étude appelle à être complétées par des travaux pharmacologiques et biologiques. 146 HO H 4 6 3 5 9 7 8 10 OH O 1 H 1' O OH O HO OH HO Composé A : Ajugol 1''' O OCOCH3 O H3COCO H3C O 1" O H 4 6 O 7 3 5 9 H HO O 1 8 OH 1' O 10 O OH HO OH Composé B : 6-O-[(2",4"-di-O-acétyl-3"-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 1''' O 1'''' O OCOCH3 O O H3C O 1" 5" O H 4 6 3 5 O 7 9 1 8 HO O H 10 1' O 5' OH O HO OH HO Composé C : 6-O-[(2"-O-acétyl-3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 1''' O 1 '''' O O O H3C OH O 1" 5" O H 4 6 7 3 O 5 9 8 HO 10 1 H O O 5' 1' OH O HO OH HO Composé D : 6-O-[(3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 147 HO O HO O HO H3C O 1" O 4 6 7 5 3 O 9 8 HO O 1 1' 10 O OH O HO OH HO Composé E : 6-O-[(2"-p-coumaroyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 12 Glc H3C 4 O 3 O O 2 3 O O CH2OH 23 OH HO H3C HO 28 HO OH Rha O 11 Fuc OH O O HO HO HO O OH OH Glc' Composé F : 3-O-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyranosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}-13β,28-époxyoléan-11-èn-23-ol Fuc CH2OH Glc HO H3 C OH Rha O O CH2OH O O HO H3 C HO O O OH OH O HO HO HO O OH OH Glc' Composé G : 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyrnosyl(1→2)]-β-d-fucopyranosyl}-oléan-11-13(18)-diène23α,28diol 148 H3CO Fuc CH 2OH Glc HO H3C OH Rha O CH2OH O O OH HO H3C HO O O OH O O HO HO HO O OH OH Glc' Composé H : 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-Dglucopyrnosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}- 11α-méthoxyoléan-12-ène-23,28diol 1"' O OCH3 H3COCO O HO H3C O 1" O 4 6 5 7 9 8 HO 3 O 10 O 1 OH 1' O O OH HO OH Composé I : 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-trans-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]catalpol 1"' O H3COCO HO H3 C OCH3 O O 1" O H 4 6 7 3 O 1 8 HO 10 H O O OH 1' O OH HO OH Composé J : 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-cis-cinnamoyl-3"-O-acétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol 149 HO H 4 6 3 5 9 7 O 1 8 H HOH2C 1' O OH O HO OH HO Composé K : Aucubine HO OH 4 6 3 5 7 1 HO CHH 3 O 1' O OH O HO OH HO Composé L : Harpagide HO OH 4 6 3 5 7 9 O 1 O CH3 O HO O 1' OH O OH HO Composé M : 8-O-trans-cinnamoyle harpagide HO 7 HO H 4 3 6 1 8 CH3 H 10 O O 1' O O O HO OH HO 3" OCH3 4" OH Composé N : 6'-O-vanilloyle angéloside 150 CHAPITRE VI PARTIE EXPERIMENTALE 151 VI.1. Matériel et méthodes VI.1.1. Matériel végétal et extraction Les deux plantes, objet de ce travail, ont été récoltées dans leur habitat naturel. La détermination botanique des espèces a été réalisée par le Professeur Bachir OUDJEHIH du Département d’Agronomie de l’Université de Batna. Après la récolte, le matériel végétal est séché à température ambiante puis broyé de manière à ce que la surface de contact avec le solvant soit la plus grande possible, pour une optimisation maximale des rendements de l’extraction. La méthode routinière d’extraction se résume à une macération successive au moyen de trois solvants de polarité croissante. Le rapport entre le matériel à extraire et le volume de solvants utilisés est de 1g/10ml. Les extraits obtenus sont ensuite stockés à basse température et à l’abri de la lumière jusqu’à leur exploitation. VI.1.2. Techniques analytiques de séparation VI.1.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique analytique rapide, simple et peu coûteuse, utilisée au cours de la séparation et de l’identification des métabolites. Elle est employée également pour la recherche du système de solvants avant d'entreprendre une étape de séparation. Elle repose principalement sur le phénomène d’adsorption. Dans notre étude, nous avons utilisé essentiellement des plaques de silicagel 60 F254 prêtes à l’emploi, à support en aluminium (Merck). Le développement des plaques s’effectue dans des cuves en verre saturées avec l’éluant approprié. La phase mobile est constituée d’un mélange binaire ou tertiaire de solvants selon le type de séparation souhaitée. Nous avons également utilisé des plaques de silice RP-18 prêtes à l’emploi à support en aluminium (Merck). Les systèmes de solvants utilisés sont constitués principalement de mélanges méthanol/eau. Les plaques ont été observées sous lampe UV à 254 et 366 nm avant révélation par la vanilline sulfurique. Les plaques sont pulvérisées avec ce réactif, puis chauffées avec un sèchecheveux jusqu’à apparition de taches de diverses couleurs en fonction du type de composés. 152 VI.1.3. Techniques préparatives de séparation VI.1.3.1. Chromatographie sur colonne ouverte (CC) Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont été mis en oeuvre dans des colonnes en verre. La taille et le diamètre de la colonne sont choisis en fonction de la quantité d’échantillon à purifier et de la résolution souhaitée. Chromatographie d’adsorption sur colonne Pour les chromatographies d’adsorption, la phase stationnaire utilisée est le gel de silice 60 (230-400 Mesh) et le polyamide SC6. L’élution est réalisée par simple gravité. La quantité de silice utilisée est généralement 40 fois supérieure à la quantité d’échantillon déposée pour la silice normale et 10 fois pour le polyamide. Le choix des conditions d’élution, le suivi de la séparation et le rassemblement final des fractions sont effectués sur la base d’analyses par CCM. Chromatographie d’exclusion Les chromatographies d’exclusion sont réalisées sur gel de Sephadex LH-20 avec le méthanol comme phase mobile. Les échantillons à séparer ont été introduits sous forme liquide après dissolution dans un volume d’éluant le plus petit possible. Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM. VI.1.3.2. Chromatographie préparative sur couche épaisse (CCE) Les plaques en verre utilisées ont 1 mm d’épaisseur (Merck 60 F254 et Merck RP-18). L’échantillon à séparer est solubilisé dans un solvant adéquat de manière à obtenir une dissolution totale. Il est ensuite déposé sur la plaque à l’aide d’une micropipette. La quantité d’échantillons appliquée sur la plaque chromatographique est de l’ordre de 15 mg. La plaque est développée dans une cuve saturée contenant l’éluant adéquat. Comme dans la CCM analytique, la plaque est séchée à température ambiante ou avec un sèche-cheveux. Les taches des constituants sont examinées sous lumière UV ou révélées sur une frange de la plaque par pulvérisation avec la vanilline sulfurique. A l’aide d’une spatule, on récupère les composés d’intérêt fixés sur la silice. Cette dernière est ensuite dispersée dans une petite quantité de solvant, puis filtrée afin de permettre la récupération des composés d’intérêt. 153 VI.1.4. Méthodes physicochimiques VI.1.4.1. Spectrométrie UV Les spectres UV des composés isolés ont été mesurés dans le méthanol à l’aide d’un spectrophotomètre de type Beckman Du-600 pour les composés de l’espèce V. ballii. Pour les composés isolés de V. dentifolium, il a été utilisé un spectrophotomètre de type UVIKON 941 plus, de l’Institut de Chimie Moleculaire de Reims-France (UMR CNRS 6229). VI.1.4.2. Spectrométrie IR Les spectres infra-rouge des molécules ont été réalisés au moyen d’un spectrophotomètre Shimadzu IR-470, du département de Chimie de l’Université de Batna. Les échantillons sont déposés sur des pastilles de KBr. Pour cela, une quantité de 2 mg d’échantillon a été mélangée à 200 mg de KBr. Les nombres d'ondes sont exprimés en cm-1. VI.1.4.3. Spectrométrie de masse Les spectres ESI ont été enregistrés en modes positifs et négatifs sur un spectromètre de type Brüker LC-MS/MS type esquire-LC, du Centre de recherche sur les Substances Naturelles UMS CNRS-Pierre Fabre 2597-Toulouse (France). VI.1.4.4. Spectrométrie de RMN Les spectres de résonance magnétique nucléaire ont été enregistrés sur des appareils de type Brüker Avance à 500 MHz (RMN 1H) et 125 MHz (RMN 13 C), du Centre de recherche sur les Substances Naturelles de Toulouse (UMS CNRS-Pierre Fabre 2597) et de l’Institut de Chimie Moleculaire de Reims (UMR CNRS 6229). Les échantillons ont été solubilisés dans les solvants deutérés CDCl3 et CD3OD. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane (TMS); les constantes de couplage sont exprimées en Hz. 154 VI.1.4.5. Pouvoir rotatoire Les pouvoirs rotatoires spécifiques sont mesurés sur un polarimètre électronique PerkinElmer 241 du département de Pharmacie de l’Université de Batna. La source de lumière utilisée est la raie D du sodium (589 nm). La cuve employée est d’une longueur de 10 cm. Le solvant de solubilisation et la concentration sont indiqués dans chaque cas. VI.1.5. Méthodes chimiques VI.1.5.1. Hydrolyse acide du composé F 42 mg du composé F, solubilisés dans 10 ml de méthanol + 1 ml de solution d’acide chlorhidrique 1 N, sont maintenus à reflux pendant 5 h. La solution aqueuse est neutralisée avec une solution aqueuse de Na2CO3 jusquà pH 6. Après filtration sur papier filtre, la solution est évaporée à sec et le résidu repris dans 1ml de MeOH afin de déterminer l’identité des sucres, par comparaison sur CCM avec des échantillons témoins. VI.2. Contrôle chromatographique des extraits Les extraits acétate d’éthyle de V. dentifolium et méthanolique de V. ballii qui se sont avérés être les plus riches en métabolites secondaires, ont été retenus comme sujets d’étude. VI.2.1. Extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii L’extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii, examiné par CCM (éluant : CHCl3/MeOH 70/30), montre sous la lumière UV (254 et 366 nm) plusieurs taches de coloration marron après révélation à la vanilline sulfurique. D’autres taches invisibles en UV et donnant différentes colorations (rose, bleu et mauve) à la vanilline sulfurique, ont été également mises en évidence. VI.2.2. Extrait acétate d’éthyle de V. dentifolium Les CCM effectuées sur l’extrait acétate d’éthyle des racines de V. dentifolium (éluant : CHCl3/MeOH 70/30) montrent, après examen UV et révélation à la vanilline sulfurique, plusieurs taches de Rf voisins et de couleurs marron ou rose. 155 VI.3. Séparation et purification VI.3.1. Extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii VI.3.1.1. Séparation et purification de l’extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii 10 grammes de l’extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii sont mis à chromatographier sur colonne de polyamide SC6. L’élution est effectuée par l’eau, puis par un gradient H2O/MeOH. Des fractions de 50 ml ont été receuillies à chaque fois. 59 fractions ont été obtenues et analysées par chromatographie sur couche mince. Les plaques ont été examinées à la lumière UV et révélées à la vanilline sulfurique puis chauffées à 100 °C. Cinq lots ont été obtenus, après rassemblement des fractions présentant des similitudes. Tableau VI.1 : Fractrionnement de l’extrait méthanolique des parties aériennes de V. ballii Eluant Lots Masse (mg) H2O 1 3700 // 2 1200 H2O/MeOH 80/20 3 150 H2O/MeOH 50/50 4 800 H2O/MeOH 20/80 5 1500 Le lot 2 (150 mg) est mis à chromatographier sur une colonne de gel de silice (6g) en phase et pression normales. L’élution est réalisée successivement par le chloroforme puis par un mélange CHCl3/MeOH/H2O à différents gradients : 95/5/0,5, 90/10/1 et 80/20/2. Des fractions de 10 ml ont été receuillies, examinées par CCM en phase normale (éluant : CHCl3/MeOH/H2O 90/10/1), pour être finalement rassemblées en 5 sous lots. Le sous lot 1 (19 mg), chromatographié sur une colonne de gel de silice avec comme éluant CHCl3, a permis d’obtenir 9 mg du composé A à l’état pur. Le sous lot 3 (34 mg) soumis à une chromatographie préparative sur plaque de silice RP-18 (éluant : MeOH/H2O 70/30) a permis d’obtenir les deux composés B (12 mg) et C (10 mg). Ces derniers sont finalement filtrés sur Sephadex LH-20 dans le méthanol. Le lot 3 (15 mg) soumis à une chromatographie préparative sur plaque de silice RP-18 au moyen d’un mélange MeOH/H2O 70/30, puis une filtration sur Sephadex LH-20 dans le méthanol, a permis d’isoler le composé D (8,5 mg) à l’état pur. 156 Le fractionnement du lot 4 (200 mg) a été mené sur une colonne de gel de silice (8g) en phase normale, éluée successivement par CHCl3 puis des mélanges CHCl3/MeOH/H2O 90/10/1 et 80/20/2. L’analyse par CCM (éluant : CHCl3/MeOH/H2O 90/10/1) des fractions obtenues a permis de les regrouper en 4 sous lots. Le sous lot 3 (30 mg) est mis à chromatographier sur une colonne de gel de silice normale (1,2 g). L’élution réalisée par le système CHCl3/MeOH/H2 O 90/10/1, a permis de recueillir le composé E pur (7 mg). Le fractionnement du lot 5 (1 g) a été réalisé sur une colonne de gel de silice en phase normale (40 g). L’élution est effectuée par CHCl3 puis par des mélanges CHCl3/MeOH/H2O 90/10/1 et 80/20/2. Le rassemblement des fractions similaires a donné 10 sous lots. Une chromatographie préparative sur plaque de silice RP-18 du sous lot 10 (30 mg) avec un mélange MeOH/H2O 90/10 comme système d’élution, a permis d’obtenir les trois composés F (5 mg), G (5 mg) et H (6 mg) à l’état pur. VI.3.1.2. Composés isolés de l’espèce V. ballii Composé A HO Ajugol H Formule brute : C15H24O9 O [α]D -169 ° (c 0,3, CHCl3) OHH MS : ESI (mode positif) m/z : 371 [M+Na]+ O OH O HO (mode négatif) m/z : 383 [M+Cl]- OH HO RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+MeOD) (tableau IV.1, page 63) Composé B 6-O-[(2",4"-di-O-acetyl-3"-O-trans-cinnamoyl)- O α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol O Formule brute : C34H22O17 OCOCH3 [α]D - 27° (c 0.21 , MeOH) H3COCO H3C + MS : ESI (mode positif) m/z : 745 [M+Na] , O O 685 [(M+Na)-60]+, 495 [(M+Na)-60- O 190]+ (mode négatif) m/z : 721 [M-H] H O - HO RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) H O OH O OH HO OH dans (CDCl3+CD3OD) (tableau IV.2, page 70) 157 Composé C 6-O-[(2"-O-acetyl-3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)- O α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol O Formule brute : C41H46O17 O H3C [α]D - 14 ° (c 0,21, MeOH) OCOCH3 O O O H MS : ESI (mode positif) m/z : 833 [M+Na]+, O 685 [(M+Na)-162]+, 495 [(M+Na)- O H HO 162-190]+ O OH O HO OH (mode négatif) m/z : 845 [M+Cl]- HO RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+CD3OD) (tableau IV.3, page 74) Composé D 6-O-[(3",4"-di-O-trans-cinnamoyl)-α-L- O rhamnopyranosyl]-catalpol O Formule brute : C39H44O16 O H3C [α]D - 58° (c 0,2, MeOH) OH O O O H + MS : ESI (mode positif) m/z : 791 [M+Na] , O 643 [(M+Na)-148]+, 495 [(M+Na)- O H HO 148-148]+ O OH O HO OH (mode négatif) m/z : 803 [M+Cl]- HO RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+MeOD) (tableau IV.4, page 78) Composé E 6-O-[(2"-O-p-coumaroyl)-α-L- HO O rhamnopyranosyl]-catalpol HO O Formule brute : C30H38O16 HO H3C [α]D - 200 ° (c 0,2, MeOH) O O MS : ESI (mode négatif) m/z : 653 [M-H]- H O RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) O dans (CDCl3+MeOD) (tableau IV.5, page 84) HO H O OH HO 158 OH O HO Composé F 3-O-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-DO glucopyranosyl-(1→3)-[β-DHO glucopyranosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}- H3C OH O O O Formule brute : C54H88O21 OH HO H3C HO CH2OH O O 13β,28-époxyoléan-11-èn-23-ol OH O O HO HO HO O OH OH [α]D +28.8 ° (c 0.32 , MeOH) MS : ESI (mode positif) m/z : 1095 [M+Na]+ (mode négatif) m/z : 1071 [M-H]-, 909 [(M-H)162]-, 763 [(M-H)-162146]-, 601 [(M-H)-162-146-162]RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+CD3OD) (tableau IV.6, page 96) Composé G 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-Dglucopyranosyl-(1→3)-[β-D- CH2 HO glucopyrnosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}- H3C OH O O O oléan-11-13(18)-diène23α,28diol Formule brute : C54H88O21 OH HO H3C HO CH2OH O O OH O O HO HO HO O OH OH [α]D + 26° (c 0,3, MeOH) MS : ESI (mode positif) m/z : 1095 [M+Na]+ (mode négatif) m/z : 1107 [M+Cl]RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+MeOD) (tableau IV.7, page 101) Composé H 3-O-{α-L-rhamnopyrnosyl-(1→4)-β-DH3CO glucopyranosyl-(1→3)-[β-D- CH2OH HO glucopyrnosyl(1→2)]-β-D-fucopyranosyl}- 11α- H3C OH méthoxyoléan-12-ène-23,28diol O OH MS : ESI (mode négatif) m/z : 1103 [M-H]RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+MeOD) (tableau IV.8, page 107) 159 CH2OH OH OH HO HO HO [α]D + 27° (c 0,3, MeOH) O O HO H3 C HO Formule brute : C55H92O22 O O O O O OH VI.3.2. Extrait acétate d’éthyle de V. dentifolium VI.3.2.1. Séparation et purification de l’extrait acétate d’éthyle des racines de V. dentifolium Le fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle (12 grammes) est effectué sur une colonne de gel de silice en phase et pression normales avec des gradients éther de pétrole/acétate d’éthyle et acétate d’éthyle/méthanol. 362 fractions de 50 ml sont recueillies et regroupées en 11 lots sur la base de l’analyse par CCM. Tableau VI.2 : Fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle des racines de V. dentifolium Eluant Lot Masse (mg) EP 1 5 EP/AcOEt 90/10 2 160 EP/AcOEt 80/20 3 258 EP/AcOEt 50/50 4 1610 EP/AcOEt 20/80 5 6200 AcOEt 6 123 AcOEt/MeOH 95/5 7 149 AcOEt/MeOH 90/10 8 200 AcOEt/MeOH 80/20 9 560 AcOEt/MeOH 70/30 10 50 AcOEt/MeOH 30/70 11 1500 Le lot 9 (167 mg) est mis á fractionner sur une colonne de gel de silice (7 g) en phase normale. L’élution menée par le chloroforme pur puis par deux gradients CHCl3 /MeOH/H2O 90/10/1 et 80/20/2, a donné après rassemblement des fractions similaires 2 sous lots. Une filtration sur colonne de Sephadex LH-20 dans le méthanol, du sous lot 2 (11 mg) a permis d’obtenir le composé M (7 mg) à l’état pur. Le sous lot 2 (21 mg) contenant les deux isomères I et J, est à son tour filtré sur colonne de Sephadex LH-20 dans le méthanol. Le fractionnement du lot 10 (50 mg) est effectué sur une colonne de gel de silice (2 g) en phase normale. L’élution menée par le chloroforme puis par des mélanges CHCl3/MeOH/H2 O 90/10/1 et 80/20/2, a donné 63 fractions de 10 ml. Le rassemblement des fractions similaires a fourni 5 sous lots. Une chromatographie préparative sur silice RP-18 du sous lot 3 (30 mg), dans un mélange MeOH/H2O 40/60, a permis d’isoler les deux composés K (4,5 mg) et L (8 mg). 160 Le lot 8 (200 mg) soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : CHCl3/MeOH/H2O), a permis d’obtenir le composé N à l’état pur. VI.3.2.2. Composés isolés de l’espèce V. dentifolium Composé I 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-trans-cinnamoyl-3"-OH3COCO Formule brute : C33H42O17 O MS : ESI (mode positif) m/z : 733 [M+Na] (mode négatif) m/z : 745 [M+Cl] OCH3 O acétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol + HO H3C - O RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) O dans (CDCl3+MeOD) (tableau V.1, page H O O 1187) H HO OH O O OH HO OH Composé J 6-O-[(2"-O-p-méthoxy-cis-cinnamoyl-3"-Oacétyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-catalpol Formule brute : C33H42O17 MS : ESI (mode positif) m/z : 733 [M+Na]+ (mode négatif) m/z : 745 [M+Cl] - O H3COCO HO H3 C OCH3 O O O RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) H O dans (CDCl3+MeOD) (tableau V.2, page 119) O HO H O OH O OH HO OH 161 Composé K Aucubine HO H Formule brute : C15H22O9 O [α]D – 171,4° (c 0,2, MeOH) H HOH2C MS : ESI (mode positif) m/z : 369 [M+Na]+ (mode négatif) m/z : 399 [M+Cl]- O OH O HO OH HO 345 [M-H]-, 183 [M-162]RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CD3OD) (tableau V.3, page 122) Composé L Harpagide HO OH Formule brute : C15H24O10 O [α]D - 132° (c 0,3, MeOH) HO CHH 3 MS : ESI (mode positif) m/z : 387 [M+Na]+ (mode négatif) m/z : 399 [M+Cl]1 O OH O HO OH 13 RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) HO dans (CDCl3+CD3OD) (tableau V.4, page 126) Composé M HO Harpagoside OH Formule brute : C24 H30O11 O [α]D - 13 (c 0,3,MeOH) H O MS : ESI (mode positif) m/z : 517 [M+Na] + O O (mode négatif) m/z : 493 [M-H]- 1' OH O HO OH HO RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) dans (CDCl3+CD3OD) (tableau V.5, page 129) Composé N HO 6'-O-vanilloyle angéloside Formule brute : C23H30O12 HO [α]D - 262 ° (c 0.08 , MeOH) O CH3 MS : ESI (mode positif) m/z : 521 [M+Na]+, 353 [(M+Na)-168] H H O O O O HO OH OCH3 HO + RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) OH dans (CDCl3+CD3OD) (tableau V.6, page 136) 162 BIBLIOGRAPHIE 163 [1] Poletti, A. Fleurs et plantes médicinales,2ème ed.Delachaux & Niestlé, Neuchâtel Suisse, 1988. [2] Ozenda, P. Flore du Sahara , Ed.CNRS Paris France, 1991 3 Boukef, M. K. Médecine Traditionnelle et pharmacopée Les plantes de la médecine traditionnelle tunisienne, Agence de Coopération Culturelle et Technique, Paris, France. [4] Kosch, A. Handbuch der Deutchen Arzneipftanzen, Springer, Berlin, 1939 [5] Martindale The Extra Pharmacopoeia, 27 edn, London, 1977 [6] Turker, A. U., Camper, N. D. Journal of Ethnopharmacology, 82, 117-125, 2002 [7] McCutcheon, A. R., Roberts, T. E., Gibbons, E., Ellis, S. M., Babiuk, L. A., Hancock, R. E. W., Towers, G. H. N. Journal of Ethnopharmacology, 49, 101-110, 1995 [8] Senatore, F., Rigano, D., Formisano, C., Grassia, A., Basile, A., Sorbo, S. Fitoterapia, in press, 2007 [9] Kupeli, E., Tatli, I. I., Akdemir, Z. S., Yesilada, E. Journal of Ethnopharmacology,110, 444-450, 2007 [10] Sengul, M., Ogutcu, H., Adiguzel, A., Sahin, F., Kara, A. A., Karaman, I., Gulluce, M. Turk. J. Biol., 29, 105-110, 2005 [11] Barbour, E. K., Al Sharif, M., Sagherian V. K., Habre, A. N., Tlhouk, R. S., Talhouk, S. N. Journal of Ethnopharmacology, 93, 1-7, 2004 [12] Magiatis, P., Spanakis, D., Mitaku, S., Tsitsa, U., Mentis, A., Harvala, C. Journal of Natural Production, 64, 1039-1044, 2001 [13] Guarino, C. Bulletin of Chinese Farming, 141, 238-242, 2002 [14] Tepe, B., Sokmen, M., Akpulat, A., Yumrutas, O., Sokmen, A. Food Chemistry, in press, 2005 164 [15] Pardo, F., Perich, F., Torres, R., Delle Monach, F. Biochemical Systematics and Ecology,32, 367-370, 2004 [16] Bianco, A., Guiso, M., Iavarone, C., Passacantilli, P., Trogolo, C. Phytochemistry, 19, 571-573, 1980 [17] Bianco, A., Guiso, M., Iavarone, C., Passacantilli, P., Trogolo, C. Phytochemistry, 20, 465-468, 1981 [18] Agababyan, E. Y., Arutyunyan, L. S., Mnatsakanyan, V. A., Baitts, E. G., Radich, L. Plenum Publishing Corporation, 412-417, 1983 [19] Klimek, B. Phytochemistry, 43, 6, 1281-1284, 1996 [20] Akdemir, Z. S., Tatli, I. I., Bedir, E., Khan, I. A. Z. Naturforsch, 60b, 113-117, 2005 [21] Tatli, I. I., Khan, I. A., Akdemir, Z. S. Z. Naturforsch, 61b, 1183-1187, 2006 [22] Tatli, I. I., Akdemir, Z. S., Bedir, E., Khan, I. A. Turk. J. Chem., 28, 111-122, 2004 [23] Seifert, K., Preiss, A., Johne, S., Schmidt, J., Lien, N. T., Lavaud, C., Massiot, G. Phytochemistry, 30, 10, 3395-3400, 1991 [24] Hartleb, I., Seifert, K. Phytochemistry, 35, 1009, 1994 [25] Hartleb, I., Seifert, K. Phytochemistry, 38,1, 221-224, 1995 [26] Klimek, B., Lavaud, C., Massiot, G. Phytochemistry, 31, 12, 4368-4370, 1992 [27] Miyase, T., Horikoshi, C., Yabe, S., Miyasak, S., Melek, F. R., Kusano, G. Chem. Pharm. Bull. 45, 12, 2029-2033, 1997 [28] Abou Gazar, H., Tasdemir, D., Ireland, C. M., Calis, I. Biochemical Systematics and Ecology, 31, 433-436, 2003 [29] Paskov, D., Statkov, P., Ninova, P. Acta Med. (Sofia), 43, 4, 416-423, 1964 [30] Drandarov, K Tetrahedron Letters, 36, 4, 617-620,1995 [31] Koblicova, Z., Turecek, F., Ninova, P., Trojanek, J., Blaha, K. Tetrahedron Letters, 24, 40, 4381-4384, 1983 165 [32] Drandarov, K. Phytochemistry, 44, 5, 971-973, 1997 [33] Akdemir, Z. S., Tatli, I. I., Bedir, E., Khan, I. A. Turk. J. Chem., 28, 227-234, 2004 [34] Kalpoutzakis, E., Aligiannis, N., Mitakou, S., Skaltsounis, A. L. J. Nat. Prod., 62, 342-344, 1999 [35] Warashina, T., Miyase, T., Ueno, A. Phytochemistry, 31, 3, 961-965, 1992 [36] Khuroo, M. A., Qureshi, M. A., Razdan, T. K., Nichols, P. Phytochemistry, 27, 11, 3541-3544, 1988 [37] Afifi, M. S. A., Ahmed, M. M., Pezzuto, J. M., Kinghorn, D. Phytochemistry, 34, 3, 839-841, 1993 [38] Evan, W.C. Trease and Evan-Pharmacognosy 15 eme ed. W.B. Sanders Company Limited, 2002 [39] Dewick, P. M. Medicinal naturral products A biosynthetic approach. 2eme Ed.wiley, 2002 [40] De Moura, V. M., Dos Santos, A. R., Nurnberg, V., De Souza, M. C. et De Oliveira Santin, S. M. Biochemical Systematics and Ecology, 33, 451-453, 2005 [41] Bruneton, J. Pharmacognosie-Phytochimie-Plantes médicinales 3 eme ed. Tec & Doc, Paris, 1999 [42] Lu, T., Zhang, W. D., Pei, Y. H., Zhang, C., Li, J. C. et Schen, Y. H. Chinese Chemical Letters, 18, 1512-1514, 2007 [43] Tomassini, L., Foddai, S., Nicoletti, M., Cometa, M. F., Palazzino, G. et Galeffi, C. Phytochemistry, 46, 6, 901-905, 1997 [44] Zeng, Y. B., Mei, W. L., Zhao, Y. X., Zhuang, L., Hong, K. et Dai, H. F. Chinese Chemical Letters, 18, 1509-1511, 2007 [45] Alipieva, K. I., Taskova, R. M., Jensen, S. R. et Handjieva, N. V. Biochemical Systematics and Ecology, 34, 88-91, 2006 [46] Dominguez, M., ,Marin, C., Esquivel, B. et Céspedes, C. L. Phytochemistry, 68, 1762-1766, 2007 166 [47] Zhou, X. Q., Bi, Z. M., Li, P., Tang, D. et Cai, H. X. Chinese Chemical Letters, 18, 1221-1223, 2007 [48] Djoudi, R., Bertrand, C., Fiasson, K.,Fiasson, J. L., Comte, G., Fenet, B. et Rabesa, Z. A. Biochemical Systematics and Ecology, 35, 314-316, 2007 [49] Taskova, R. M., Gotfredsen, C. H. et Jensen, S. R. Phytochemistry, 66, 1440-1447, 2005 [50] Albach, D. C., Gofredsen, C. H. et Jensen, S. R. Phytochemistry, 65, 2129-2134, 2004 [51] Samuelsen, A. B. Journal of Ethnopharmacology, 71, 1-21, 2000 [52] Wei, X., Xie, H., Ge, X. et Zhang, F. Phytochemistry, 53, 837-840, 2000 [53] Song, Y., Li, S. L., Wu, M. H., Li, H. J. et Li, P. Analytice Chimica Acta, 564, 211-218, 2006 [54] Jensen, S. R., Franzyk, H. Et Wallander, E. Phytochemistry, 60, 213-231, 2002 [55] Gruenwald, J., Brendler, T. et Jaenicke, C. PDR for Herbal Medicine, Medical Economics Company, Montlave, 2000 [56] Graikou, K., Aligiannis, N., Chinou, I. B. et Harvala, C. Z. Naturforsch, 57c, 95-99, 2002 [57] Hamdi, H. K. Et Castellon, R. Biochemical and Biophysical Research cccommunications, 334, 769-778, 2005 [58] Raju, B. L., Lin, S. J., Hou, W. C., Lai, Z. Y., Liu, P. C. et Hsu, F. L. Natural Product Research, 18, 4, 357-364, 2004 [59] Bas, E., Recio, C., Abdallh, M., Manez, S., Giner, R. M., Cerda-Nicolas, M. et Rios, G. L. Journal of ethnopharmacology, 110, 419-427, 2007 [60] Kupeli, E., Harput, U. S., Varel, M., Yesilada, E. et Saracoglu, I. Journal of Ethnopharmacology, 102, 170-176, 2005 [61] Baruah, C. C., Gupta, P. P., Nath, A., Patnaik, L. G. K. et Dhawan, B. N. Pharmacological Research, 38, 6, 1998 [62] Mathad, V. T., Raj, K., Bhaduri, A. P., Sahai, R., Puri, A., Tripathi, L. M. et Srivastava, V. M. L. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 6, 605-611, 1998 167 [63] Fiebich, B. L, Heinrich, M., et Hiller, K. O. Phytomedicine, 8, 1, 28, 2001 [64] Franconi, F., Coinu, R., Carta, S., Urgeghe, P. P., Ieri, F., Mulinacci, N. et Romani, A. J. Agric. Food Chem., 54, 3121-3125, 2006 [65] Kuo, W. H., Chou, F. P., Young, S. C., Chang, Y. C. et Wang, C. J. Toxicology and Applied Pharmacology, 208, 155-162, 2005 [66] Moon, M. K., Choi, B. M., Oh, G. S., Pae, H. O., Kim, J. D., Oh, H., Oh, C. S., Kim, D. H., Rho, Y. D., Shin, M. K., Lee, H. S. et Chung, H. T. Toxicology Letters, 145, 46-54, 2003 [67] Tan, R. X., Kong, L. D. et Wei, H. X. Phytochemistry, 47, 7, 1223-1226, 1998 [68] Ancolio, C., Azas, N., Mahiou, V., Ollivier, E., Di Giorgio, C., Keita, A., TimonDavid, P., Balansard, G. Phytother Res., 16, 646-649, 2002 [69] Sampaio-Samtos, I. et C.Kaplan, A. J. Braz. Chem. Soc.,12,144-153,2001 [70] Yamamoto, H., Katano, N., Ooi, A. et Inouye, K. Phytochemistry, 50, 417, 1999 [71] Damtoft, S. Phytochemistry., 22,1929,1983 [72] Damtoft, S., Jensen, S.R. et Schacht, M. Phychemistry,39,549,1995 [73] Frederiksen, L. B., Damtoft, S. Et Jensen, S. R. Phytochemistry, 52, 1409, 1999 [74] Iserin, P., Larousse Encyclopédie des plantes médicinales, Ed. Larousse, 2001 [75] Hamed, A. I., Oleszek, W., Stochmal, A., Pizza, C. et Piacente, S. Phytochemistry, 65, 2935-2945, 2004 [76] Zhang, Y., Zhang, Y. J., Jacob, M. R., Li, X. C. et Yang, C. R. Phytochemistry, 69, 264-270, 2008 [77] D’Abrosca, B., DellaGreca, M., Fiorentino, A., Monaco, P., Natale, A., Oriano, P. et Zarrelli, A. Phytochemistry, 66, 2681-2688, 2005 [78] Sautour, M., Miyamoto, T. et Lacaille-Dubois, M. A. Phytochemistry, 68, 2554-2562, 2007 168 [79] Xu, R., Fazio, G. C. Et Mtsuda, S. P. T. Phytochemistry, 65, 261-291, 2004 [80] Park, S. Y., Chang, S. Y., Oh, O. J., Yook, C. S., Nohara, T. Phytochemistry, 59, 379-384, 2002 [81] Wandji, J., Tillequin, F., Mulholland, D. A., Shirri, J. C., Tsabang, N., Seguin, E., Verite, P., Libot, F. et Fomum, Z. T. Phytochemistry, 64, 845-849, 2003 [82] Kanchanapoom, T., Kasai, R. et Yamasaki, K. Phytochemistry, 59, 215-228, 2002 [83] Zhang, Z., Li, S., Zhang, S. et Gorenstein, D. Phytochemistry, 784-794, 2006 [84] Waffo-Téguo, Voutquenne, L., Thoison, O., Domonter, V., Nguyen, V. H. et Lavaud, C. Phytochemistry, 65, 741-750, 2004 [85] Voutquenne, L., Guinot, P., Froissard, C., Thoison, O., Litaudon, M. et Lavaud, C. Phytochemistry, 66, 825-835, 2005 [86] Voutquenne, L., Lavaud, C., Massiot, G. et La Men-Olivier, L. Pharmaceutical Biology, 40, 4, 253-262, 2002 [87] Arthan, D., Svasti, J., Kittakoop, P., Pittayakhachonwut, Tanticharoen, M. et Thebtaranonth, P. Phytochemistry, 59, 459-463, 2002 [88] Escalante, A. M., Santecchia, C. B., Lopez, S. N., Gattuso, M. A., Ravelo, A. G., Monache, F. D., Sierra, M. G. et Zacchino, S. A. Journal of Ethnopharmacology, 82, 29-34, 2002 [89] Katerere, D. R., Gray, A. I., Nash, R. J. et Waigh, R. D. Phytochemistry, 63, 81-88, 2003 [90] Corea, G., Iorizzi, M., Lanzotti, V., Cammareri, M., Conicella, C., Laezza, C. et Bifulco, M. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12, 4909-4915, 2004 [91] Yang, X. W., Zhao, J., Cui, Y. S., Liu, X. H., Ma, C. M., Hattori, M. et Zhang, L. H. Journal of Natural Products, 62, 11, 1510, 1999 [92] Zheng, L., Zheng, J., Zhao, Y., Wang, B., Wu, L. et Liang, H. Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters, 16, 2765-2768, 2006 [93] Ozipek, M., Donmez, A. A., Calis, I., Brun, R., Ruedi, P. et Tasdemir, D. Phytochemistry, 66, 1168-1173, 2005 169 [94] Haralampidis,K., Trojanowska, M. et Osbown,A.E. Biothecnology,75,31-49,2002 [95] Guignard, J.L. Abrégé de biochimie végétale 2eme édition .Masson Paris, New york, Barcelone, Milan,1979 [96] Spivey, A. C. Biosynthesis & Bioginetic Synthesis of Isoprenoids: Terpenes Imperial College, London, 2005 [97] Hostettman, K.A., Marston, A Chemistry and pharmacology of natural products. Cambridge university, Press, Cambridge, UK,1995 [98] Qaiser, M. Flora of libya 88, 26, 1982 [99] Quezel, F.et Santa, S. Nouvelle flore de l’Algérie et des régions désertiques meriodionales. Vol.1-2.Ed.CNRS, Paris France, 1962, 1963 [100] Battandier, J. A., Trabut, L. C. Flore de l’Algérie, Dicotylédone, Ed. A. Jourdan & F. Savy, 1890 [101] Huber-Morath, A. Bauhinia, 5 (1), 7, 1973 [102] Bellakhdar,J. Médecine arabe ancienne et savoir populaires La pharmacopée marocaine traditionnelle, Ibis Press, 1997 [103] Arrif, S. Thèse de magister « Etude des composés chimiques de Celsia ballii », Université de Batna, 2003-2004 [104] Zhang, W., Yang, H., Liu, Y. et Yang, C. Yunnan Zhiu Yanjiu, 14, 437, 1992 [105] Calis, I., Zor, M. et Basaran, A. A. J. Nat. Prod., 56, 606, 1993 [106] Pachaly, P., Barion, J. et Sin, K. S. Pharmazie, 49, 150, 1994 [107] Calis, I, Gross, G. A., Winkler,T. et Sticher, O. Planta Medica, 54, 168-170, 1988 170 [108] De Santos, J., Fernandez, L., Diaz, A. M., Rubio, B., Olivier, E., Faure, E. et Balansard, G. Pharmazie, 53, 427, 1998 [109] Hosny, M. et Rosazza, J. P. N. J. Nat. Prod., 61, 734, 1998 [110] Ahmed, B., Al-Rehaily, A. J., Al-Howiriny, T. A., El-Sayed, K. A. et Ahmad, M. S. Biol. Pharm. Bull., 26, 462, 2003 [111] Taskova, R. M., Gotfredsen, C. H. et Jensen, S. R. Phytochemistry, 67, 286-301, 2006 [112] Mnatsakanyan, V. A., Arutyunyan, L. S. et Eribekyan Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1, 38-41, 1983 [113] Tori, K., Yoshimura, Y., Seo, S., Sakurawi, K., Tomita,Y. et Ishii, H. Tetrahedron Lett., 46, 4163-4166, 1976 [114] Bhandari, S. P. S., Babu, U. V. et Garg, H. S. Phytochemistry, 45, 8, 1717-1719, 1997 [115] Massiot, G., Lavaud, C. et Besson, V. Bull. Soc. Chem. Fr., 127, 440-445, 1995 [116] Agarwal, P. K. Phytochemistry, 31, 10, 3307-3330, 1992 [117] Tschesche, R., Sepulveda, S. et Brun, T. M. Chem. Ber., 113, 1754, 1980 [118] Klimek, B., Lavaud, C. et Massiot, G. Phytochemistry, 31, 4368, 1992 [119] Calis, I., Zor, M. et Basarn, A. A. Helvetica Chimica Acta, 76, 1352, 1993 [120] Ding, N., Yahara, S. et Nohara, T. Chem. Pharm. Bull., 40, 780, 1992 [121] Emam, A. M., Moussa, A. M., Faure, R., Elias, R. et Balansard, G. Journal of ethnopharmacology, 58, 215-217, 1997 [122] Seifert, K., Lien, N. T., Schmidt, J., Johne, S., Popov, S. S. et Porzel, A. Planta Medica, 55, 470-473, 1989 [123] Eroz, T., Yalcin, F. N., Tasdemir, D., Sticher, O. et Calis, I. Turk. J. Sci., 28, 397-400, 1998 [124] Li, Y. M., Jiang, S. H., Gao, W. Y. et Zhu, D. Y. Phytochemistry, 50, 101-104, 1999 171 [125] Dictionary of Natural Products sur CD-ROM, Version 16 :2, Janvier 2008 Chapman et Hall/CRC, London, UK [126] Kikuchi, T., Matsuda, S., Kubo, Y. et Namba, T. Chem. Pharm. Bul., 2296, 1983 [127] Potterat, O., Saadou, M. et Hostettmann, K. Planta Medica, 55, 1989 [128] Zeliha, S., Akdemir, I., Irem, T., Erdal, B. et Ikhlas, A.K. Turk. J. Chem., 28, 227-234, 2004 [129] Ahmed, B., Al-Rehaily, A.J., Al-Howiriny, T.A., El-Sayed, K.A. et Ahmed, M. S. Biol. Pharm. Bull., 26, 462-467, 2003 [130] Von Poser, G. L., Damtoft, S., Schripsema, J., Henriques, A. T. et Jensen, S. R. Phytochemistry, 46, 2, 371-373, 1997 172