these de doctorat de l`université paris xii etude des gènes

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ PARIS XII
Spécialité
BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
ETUDE DES GÈNES SUREXPRIMÉS AU COURS DU
SYNDROME NÉPHROTIQUE À
LÉSIONS GLOMÉRULAIRES MINIMES
Présentée et soutenue publiquement par
Philippe Grimbert
le 5 septembre 2003
Devant le jury composé de :
Pr Hubert NIVET
Président
Pr Philippe LESAVRE
Rapporteur
Dr Frédérique MICHEL
Rapporteur
Pr Philippe LANG
Examinateur
Dr Georges GUELLAËN
Directeur de thèse
1
SOMMAIRE
PRESENTATION
10
INTRODUCTION
14
I-La filtration glomérulaire
15
A-Structure et physiologie de la filtration glomérule
B-Physiopathologie de la protéinurie
15
21
II-Description anatomoclinique du SNLGM
23
A-Epidémiologie du SNLGM
B-Caractéristiques cliniques du SNLGM
C-Histologie
D-Traitement et évolution du SNLGM
E-Récidive de la maladie après transplantation rénale
23
23
27
28
30
III-Immunopathogénie du SNLGM
A-Position du problème
B-Arguments cliniques en faveur d’une origine immune
C-Perturbations des fonctions lymphocytaires T dans le SNLGM
D-Différentiation lymphocytaire T et SNLGM
E-Cytokines et SNLGM
F- Activation de la voie NFkB au cours du SNLGM
G- Immunité humorale et SNLGM
H-Le facteur de perméabilité glomérulaire
I- Autre particularité :le système HLA
32
32
34
35
37
41
44
46
48
52
2
IV- Les stratégies d’étude du SNI : synthèses et perspectives
54
A-Approche immunologique
B-Transfert d’activité protéinurique
C-Approche génétique
D-Modèle animal
E-Stratégies d’expression différentielle
54
54
55
56
56
V-Article 1 : Immunopathologie du SNLGM
60
METHODOLOGIE
61
I-Patients
62
II-Construction d’une banque d’ADNc
65
III-Analyse des séquences
70
IV- Caractérisation des clones inconnus
71
V- Expression des transcripts et des protéines au cours du
SNLGM
72
VI-Etude fonctionnelle des protéines c-mip/Tcmip
73
VII- Expression des SR protéines dans le SNLGM
75
VIII-Analyse protéomique
75
3
PREMIERE PARTIE
Construction et criblage d’une banque soustraite d’ADNc
entre poussée et rémission de SNLGM
Article 2
78
DEUXIEME PARTIE……………………………….
Caractérisation d’une voie de signalisation au cours du
SNLGM
I-Introduction
82
II-Article 3
86
III-Article 4
88
TROISIEME PARTIE
Anomalie de la maturation des ARN messagers au cours
du SNLGM
Article 5
92
4
AUTRE TRAVAUX
I-Identification du partenaire de c-mip par double-hybride
100
II-Analyse protéomique des sérums des patients avec et sans récidive
du SNI après transplantation rénale
103
DISCUSSION
106
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
117
ABREVIATIONS
120
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
122
5
A Muriel
A Clara et David
A mon père et ma mère
A Bernard Lebkiri et Francis Hofstein
Pour avoir fait de moi ce que je suis.
6
Remerciements
Je remercie Georges Guellaën pour m‘avoir accueilli dans son unité, pour avoir encadré
cette thèse, pour sa confiance, pour sa rigueur scientifique, l’originalité et la pertinence de
ses idées.
Je remercie Dil Sahali qui est à l’origine de ce projet et qui a dirigé ce travail, pour sa
patience, son enthousiasme, la qualité de ses compétences et de la curiosité scientifique
qu’il a su susciter.
Je remercie Philippe Lang d’avoir tant soutenu ce projet, de m’avoir permis de l’intégrer,
et pour avoir tant contribué à ma formation de néphrologue, en clinique comme en
recherche. Merci pour l’amitié dont il m’honore.
Je remercie Asta Valanciuté pour son aide précieuse, sa gaieté et sa tolérance extrème à
l’égard de mon sens inné du désordre.
Je remercie Sabine Le Gouvello, André Pawlak, Brigitte Solhone, Frédérique Bulle,
Adeline Guais, Edith Grandvilliers, ainsi que tous les membres de l’Unité 581 pour leur
aide et leurs conseils tant sur le plan théoriqu e que technique
Je remercie le Pr Hubert Nivet de m’avoir fait l’honneur de présider le Jury de cette thèse
Je remercie Philippe Lesavre pour son soutien tout au long de ma formation clinique et
scientifique. Je le remercie également ainsi que le Dr Frédérique Michel d’avoir accepté
aimablement d’être rapporteurs de cette thèse.
Merci enfin à Jean Pierre Grünfeld, Pierre Corvol, Xavier Jeunemaitre et Corine
Antignac.
Pour la qualité de ce qu’ils m’ont transmis.
7
BIBLIOGRAPHIE
2003 Grimbert P, Valanciute A, Audard V, Pawlak, A, Lang P, Guellaen G, Sahali D.
Truncation of c-mip, a new cytosolic adapter protein selectively induced in Minimal change
Nephrotic syndrrome, results in overinduction
of c-maf
transcription
factor
and
cytoskeleton reorganization. J Ex Med 2003 (En révision)
2003 Grimbert P, Valanciute A, Pawlak A, Lang P, Niaudet P, Bensman A, Guellaen G,
Sahali D. Altered expression of SR protéins and abnormal RNA processing in Minimal
Change Nephrotic Syndrome. Soumis
2003 Grimbert P, Audard V, Remy P, Lang P, Sahali D. Recent approaches to the
pathogenesis of minimal-change nephrotic syndrome. Nephrol Dial Transplant. 2003
Feb;18(2):245-8
2003 Valanciute A, , Le Gouvello S, Pawlak A, Grimbert P, Lang P, Guellaen G, Sahali D.
Inhibition of c-maf-induced Il4 by NFKB in Minimal change Nephrotic syndrome. J
Immunol (En révision)
8
2003 Sahali D, Grimbert P, Audard V, Valanciuté A, Le Gouvello S, Salomon R, Remy P,
Bensman A, Guellaen G, Lang P. Mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation
lymphocytaire T au cours du syndrome néphrotique à lésions glomérulaires minimes. Adv
Nephrol Necker Hosp, 2003 In press.
2003 Grimbert P, Valanciuté A, Guellaën G, Sahali D. Identification of Actin-Binding
protein Filamin-A, as a binding partner of human c-mip adaptor protein. En préparation
2002 Audard V, Grimbert P, Valanciute A, Lang P, Guellaen G, Sahali D. Recent
approaches to the pathogenesis of minimal change nephrotic syndrome. Nephrologie.
2002;23(7):367-9. Review.
2002 Sahali, D, Pawlak A, Valanciute A, Grimbert P, Lang P, Remy P, Guellaen G. A
novel approach to investigation of the pathogenesis of active minimal-change nephrotic
syndrome using substracted cDNA library screening. J Am Soc Nephrol, 2002 ; 13 : 12381247
9
Présentation
Le Syndrome néphrotique à lésions glomérulaires minimes (SNLGM), également
appelé néphrose lipoïdique, est défini par un syndrome néphrotique pur sans lésion
histologique rénale visible en microscopie optique, ni dépôt d’immunoglobulines et-ou de
fraction du complément détectables en immunofluorescence 1. Cette caractéristique signe
l’atteinte de la barrière de filtration glomérulaire, que l’on attribue à un facteur de
perméabilité dont la nature et le mécanisme d’action demeurent inconnus. Il s’agit de la
forme la plus fréquente de syndrome néphrotique idiopathique (SNI) qui inclut au moins deux
autres syndromes caractérisés par des lésions d’hyalinose segmentaire et focale (HSF) ou de
prolifération mésangiale 2. Nous verrons ultérieurement que malgré certaines disparités
anatomocliniques entre les formes communes de SNLGM et d’HSF, plusieurs arguments
plaident en faveur d’une pathogénie commune. Ces trois entités représentent 85-90 % des
néphropathies glomérulaires de l’enfant et environ 20-30% de celles de l’adulte 3 4 5.
Dans près de 85-90 %, la maladie est sensible aux glucocorticoïdes, mais plus de la
moitié des patients connaissent une évolution émaillée de rechutes lors de la baisse des doses
10
ou à l’arrêt du traitement. Ces patients développent souvent une forme chronique de la
maladie, faite de poussées et de rémissions, dont la durée peut s’étaler sur plusieurs années.
Dans près de 10 à 15 %, le syndrome néphrotique résiste aux glucocorticoïdes à doses
usuelles, mais reste le plus souvent sensible à des doses très élevées. Dans ces formes, ainsi
que dans celles qui sont devenues dépendantes des glucocorticoïdes, l’addition d’autres
agents immunosuppresseurs telle la ciclosporine ou des agents alkylants comme le
ciclosphosphamide, permettent d’éviter les rechutes fréquentes ou d’utiliser des doses
importantes et prolongées de corticoïdes. En dépit de ces traitements, certains patients
développent secondairement des lésions de hyalinose segmentaire et focale et certains
évoluent vers l’insuffisance rénale chronique nécessitant le recours à la dialyse et la
transplantation rénale. Dans un tiers des cas, la maladie récidive sur le greffon. Cette récidive,
immédiate et imprévisible, témoigne d’une activité persistante de la maladie. Chez ces
patients, la récidive est quasi-systématique lors d’une nouvelle transplantation, aboutissant à
une véritable impasse thérapeutique 6.
L’origine du SLGM est encore inconnue, mais de nombreux arguments suggèrent
l’existence d’une pathologie dysimmunitaire impliquant les lymphocytes T tels que,
l’efficacité des traitements immunosuppresseurs, l’association avec des hémopathies et des
phénomènes immunoallergiques ainsi que la disparition du syndrome néphrotique lors
d’infections virales. Diverses anomalies immunologiques étayent cette hypothèse : la
dépression
de
l’immunité
cellulaire,
l’expansion
de
certaines
sous-populations
lymphocytaires T ou le profil d’expression de certaines cytokines au cours de la maladie. Ces
formes se distinguent clairement des formes familiales de syndrome néphrotique,
d'
apparition précoce et d’emblée corticorésistantes qui correspondent à des anomalies
primitives (mutations ou délétions) d'
un composant essentiel de la barrière de filtration
glomérulaire.
11
Cette thèse à pour objectif de décrire une partie du travail réalisée dans l’unité
INSERM 581 consacrée à l’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans le
SNLGM. Dans l’introduction, sont rappelées la physiopathologie de la filtration glomérulaire
normale et pathologique, les principales caractéristiques anatomo-cliniques du SNLGM, les
principales caractéristiques immunopathologiques observées dans la maladie ainsi qu’une
présentation des différentes approches méthodologiques utilisées. Cette introduction s’achève
par un éditorial publié dans la revue “ Néphrologie, Dialysis and Transplantation ” résumant
les acquisitions récentes sur l’immunopathogénie de la maladie (Article1).
Les résultats sont présentés dans cette thèse sous forme d’articles et sont divisés en
quatre parties.
La première est consacrée à la description de notre approche méthodologique : faisant
l’hypothèse d’une affection liée à un désordre immunitaire, nous avons cherché à mettre en
évidence les gènes surexprimés dans les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)
des patients au cours des poussées de la maladie. Dans cette perspective, nous avons
entrepris la construction et le criblage d’une banque soustraite d’ADNc (complémentaires)
réalisée à partir des PBMC prélevés chez un patient en poussée et en rémission de la
maladie. Nous présentons dans le deuxième article les principaux résultats consacrés à
l’identification des transcripts différentiellement exprimés.
La deuxième partie (article 3 et 4) est consacrée à l’étude d’une voie de signalisation
recrutée au cours des phases actives de la maladie, identifiée par l’étude de certains
transcripts issus de la banque. Nous avons caractérisé sur le plan structurel et fonctionnel une
nouvelle protéine cytosolique adaptatrice (CAP) que nous avons appelé Tc-mip (Truncated cmaf inducing protéin) et démontré son implication dans l’induction d’une différentiation vers
la voie Th2 des lymphocytes T par l’intermédiare d’une activation du facteur de transcription
c-maf et dans la réorganisation du cytosquelette. La description de cette voie de signalisation
12
se poursuit par la mise en évidence de l’expression et du rôle du facteur de transcription cmaf au cours des phases actives de la maladie.
La troisième partie (article 5) est consacrée aux résultats de l’analyse d’un certain
nombre de clones inconnus, issus de la banque soustraite d’ADNc. L’analyse de ces clones a
mis en évidence la présence d’une anomalie générale dans les processus de maturation des
transcripts, spécifiquement régulée au cours de la maladie. Nous suggérons que ces anomalies
pouraient être secondaires à un défaut d’expression de certaines protéines impliquées dans
ces processus de maturation, les SR protéines (Serine-Arginine Rich proteins).
La quatrième partie regroupe les travaux, en cours dans le laboratoire, consacrés à
l’identification du partenaire protéique de Tc-mip/c-mip par la technique du double hybride,
ainsi que nos premiers résultats consacrés à l’analyse protéomique du sérum des patients
ayant présentés ou non une récidive de la maladie après transplantation rénale.
13
INTRODUCTION
14
I-La filtration glomérulaire
A- Structure et physiologie de la filtration glomérulaire
La principale fonction du rein est l’élaboration de l’urine grâce à laquelle est assurée
l’élimination des déchets toxiques de l’organisme et le maintien de l’homéostasie du milieu
intérieur. L’élaboration de l’urine définitive comporte une première étape d’ultrafiltration du
plasma assuré par les glomérules. Les glomérules, ou corpuscules rénaux, ont été décrits pour
la première fois par Malpighi en 1687. Le glomérule est formé par la capsule de Bowman qui
délimite la chambre urinaire et par un peloton de capillaires situé entre deux artérioles,
afférente et efférente (Figure 1). D’un aspect purement architectural, l’artériole afférente se
divise en trois à huit branches qui donnent naissance à des capillaires anastomosés
organisés
autour d’un axe tissulaire, l’axe mésangial, et constitue ainsi le lobule
glomérulaire.
15
Ces différents lobules se rejoignent ensuite pour former l’artériole efférente qui quitte
le glomérule au niveau du pôle vasculaire.
Figure 1 Structure générale du glomérule
Cap Glom : Capillaire glomérulaire
Les anses capillaires sont constituées de trois types d’éléments (Figure 2) : des
cellules endothéliales fenestrées, une membrane basale glomérulaire, et des cellules
épithéliales viscérales très différenciées, les podocytes 7. Ces trois éléments constituent la
barrière de filtration ou filtre glomérulaire. Aplaties et jointives, les cellules endothéliales
sont percées de pores de taille importante. La membrane basale glomérulaire, en continuité de
la lame basale de l’endothélium des artérioles, entoure l’endothélium des capillaires
glomérulaires. Enfin, les podocytes, qui forment une des parois de la chambre urinaire, sont
16
des cellules polarisées attachées à la membrane basale par une faible surface membranaire
appelée semelle podocytaire. Ils émettent de nombreux prolongements cytoplasmiques
(digitations de premier ordre) d’où se détachent une multitude de ramifications plus fines
(digitations de second ordre ou pédicelles) s’intriquant les unes dans les autres et recouvrant
les anses capillaires. L’intrication de ces pédicelles constitue les fentes de filtration.
Figure 2 : La barrière de filtration glomérulaire
MBG :Membrane basale glomérulaire
Le glomérule a pour caractéristique principale, de permettre par ultrafiltration du
plasma, la constitution de l’urine primitive. Cette filtration glomérulaire est dépendante de
certains paramètres hémodynamiques fondamentaux 8 :
17
-La différence de pression hydrostatique et oncotique entre la lumière capillaire
glomérulaire et l’espace de Bowman, suivant la loi de Starling.
-Le coefficient de filtration déterminé par la surface totale
de filtration
et la
perméabilité de la barrière.
-Le débit sanguin rénal.
La perméabilité de la barrière capillaire glomérulaire est un processus sélectif qui
dépend de la taille, la forme et la charge de la molécule filtrée 9. Ce phénomène fait intervenir
chacune des trois composantes de la barrière glomérulaire
1)-L’endothélium
Il est composé de cellules endothéliales de 12 nm d’épaisseur à fenestrations rondes
de 50 à 100 nm de diamètre qui occupent 30% de la surface endothéliale. Leur surface apicale
possède un glycocalyx de charge électrique négative, composé de sialoprotéines telles que la
dodocalyxine. Compte tenu de la taille des fenestrations, l’endothélium a une fonction de
tamisage grossier. Il est impliqué dans la perméabilité de taille.
2)- La membrane basale glomérulaire (MBG)
D’une épaisseur de 300 nm, c’est une structure acellulaire composée de trois couches :
La lamina rara interna, adjacente à l’endothélium, la lamina densa, zone centrale de la MBG,
et la lamina rara externa, en contact avec les podocytes. Ces couches sont constituées de
l’imbrication complexe de fibres de collagène IV et V, de protéoglycanes très anioniques en
raison de la présence d’heparan sulfate et d’acide hyaluronique, et de glycoprotéines
structurales : laminine, fibronectine et entactine-nidogène
10
,
11
. Les heparans-sulfate
confèrent une charge négative aux laminae rarae et sont responsables de la perméabilité
18
sélective (ou permsélectivité) de charge de la barrière de filtration 12,
13
tandis que la lamina
densa intervient dans la permsélectivité de taille par l’entrelacement de ses composants 14,
13 15
, .
3)- L’épithélium glomérulaire
Le feuillet épithélial, paroi interne de la chambre urinaire, est composé d’une couche
unique de cellules hautement différenciées de 80 nm d’épaisseur, les podocytes.
La cellule podocytaire est une cellule polarisée qui comporte un domaine basal réduit
en contact étroit avec la MBG, un domaine apical étendu, tourné vers l’espace urinaire, et des
pédicelles
qui s’intriquent
entre
eux pour définir un espace virtuel de filtration, le
diaphragme de fente (slit diaphragm). Les pédicelles possèdent un appareil contractile
complet (actine, α−actinine 4, myosine 2, taline vinculine) en liaison étroite avec la MBG
grâce à des récepteurs membranaires situés dans la semelle pédicellaire, les intégrines α3β1.
Ce système contractile leur permet de stabiliser la structure du glomérule, de limiter
l’extension de la matrice extracellulaire mais aussi de modifier le nombre et la taille des
fentes de filtration 16, 17. Un épais glycocalyx revêt leur face apico-latérale notamment au
niveau des fentes de filtration, leur conférant une charge électrique négative. La membrane
podocytaire qui est riche en protéoglycanes à heparan-sulfate et de glycoprotéines sialilés
comme la podocalyxine 18, joue un rôle capital dans la perméabilité de charge. L’épithélium
glomérulaire constitue également un élément fondamental de la sélectivité de taille grâce
au diaphragmes de fentes.
Nos connaissances de l’architecture et la physiopathologie des pédicelles et du
diaphragme de fente se sont récemment améliorées par la mise en évidence de nouvelles
protéines impliquées structurellement et fonctionnellement dans la barrière de filtration
(Figure 3). Ces protéines ont principalement été mises en évidence grâce à l’identification de
19
gènes impliqués dans des formes familiales de syndrome néphrotique par des études de
liaison.
Figure 3 : Représentation architecturale moléculaire des pédicelles et des diaphragmes
de fente (d’après G Deschenes, Dyalog, ASN 2001)
FAK :Focal Adhesion Kinase
CD2AP : CD2 Associated Protein
UTR : Urotrophin
- La néphrine
impliquée
dans le syndrome néphrotique
finlandais
19
est une
molécule d’adhésion appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Les études
20
immuno-ultrastructurales à l’aide d’anticorps dirigés contre le domaine extracellulaire de la
protéine ont permis de montrer que la néphrine est exprimée sur la membrane
interpodocytaire. Elle rentre dans la constitution du diaphragme de fente en reliant entre eux
deux pédicelles 20
- Une seconde protéine impliquée dans la structure et le fonctionnement de la
barrière de filtration a été découverte de façon fortuite. En effet, les souris déficientes pour la
protéine associée au CD2 des lymphocytes T (CD2AP) développent un syndrome
néphrotique congénital avec des dépôts mésengiaux de matrice extracellulaire
21
. Ce
syndrome néphrotique n’est pas la conséquence d’un conflit immunitaire puisque les souris
sauvages pré-irradiées et transplantées avec les cellules souches hématopoïétiques de souris
KO pour le CD2AP n’ont aucune anomalie rénale. La fonction de CD2AP dans les cellules
T est d’ancrer au cytosquelette la molécule CD2 qui s’associe avec le récepteur clonotypique
des cellules T pour interagir avec les cellules présentatrices d’antigènes 22. La CD2AP exerce
au niveau glomérulaire un rôle similaire par son interaction avec la néphrine.
- Enfin, il a été plus récemment démontré que la podocine, une protéine identifiée
dans le syndrome néphrotique familial cortico-résistant
23
est une protéine de la famille des
stomatines, interagissant avec la néphrine via un attachement avec CD2AP mais également
avec des protéines du cytosquelette podocytaire, en particulier l’actine 24.
B- Physiopathologie de la protéinurie.
Par définition, le SNLGM est caractérisé par l’apparition d’une albuminurie sélective.
Diverses théories ont été élaborées pour expliquer ce phénomène.
21
La fuite massive d’une molécule anionique pourrait être secondaire à une altération de
l’electronégativité de la barrière de filtration glomérulaire. Ainsi, dans un modèle animal
l’injection de polycations neutralise les sites anioniques de la MBG et provoque une
protéinurie sélective et la fusion de quelques pédicelles 25. L’hypothèse a donc été émise d’un
facteur circulant polycationique fixant et neutralisant les sites heparan-sulfate ou d’une
enzyme dégradant de manière spécifique les molécules anioniques présentes sur la
membrane basale glomérulaire ou empêchant leur régénération. Néanmoins, les travaux
accomplis dans le but de prouver ces hypothèses sont restés non concluants
26 27
,
. De plus,
une altération isolée de la permsélectivité de charge ne permettrait pas de rendre compte de la
fuite urinaire de molécules de grande tailles telles les IgG (5,5 nm), éliminées en grandes
quantités dans le SNLGM.
L’hypothèse, actuellement la plus exploitée pour expliquer les anomalies, stipule
que le podocyte est la cible majeure au cours du SNLGM. Cette hypothèse s’appuie sur le
modèle “ isopores + shunt ” dans lequel on observe une diminution du nombre et du
diamètre des pores restrictifs et donc une diminution de la surface de filtration, et à l’inverse,
une augmentation de la voie des « shunts », permettant le passage de macromolécules 28, 29.
Cette hypothèse est largement confortée par la mise en évidence récente d’une liaison entre
syndrome néphrotique et altération de constituants du diaphragme de fente (néphrine,
podocyne, CD2AP,
actinine-4).
Pour conclure, il est néanmoins utile de rappeler que ces deux hypothèses principales
ne sont pas exclusives l’une de l’autre dans la mesure où les groupes de la paroi glomérulaire,
chargés négativement, sont importants au maintien de son intégrité structurale et que la
déplétion de ces groupements aboutit également à une altération de la sélectivité de taille.
22
II-Description anatomo-clinique du SNLGM
A- Epidémiologie du SNLGM
Le SNLGM est principalement une maladie de l’enfant, mais peut se rencontrer à tous
les âges. Il représente 63% 1 à 93% 30 des syndromes néphrotiques de l’enfant de moins de 6
ans, mais n’est retrouvé que dans environ 15% des syndromes néphrotiques de l’adulte. Son
incidence est estimée à 20-30 par million chez l’enfant tandis que chez l’adulte, elle est
d’environ de 3 par million
31
. Fait notable, si l’incidence de certaines glomérulopathies
semble décroître dans les pays occidentaux, en raison notamment d’une meilleure prévention
et d’un meilleur traitement des infections des voies aériennes supérieures, l’incidence du
SNLGM est elle en augmentation depuis les dix dernières années 32.
B- Caractéristiques cliniques du SNLGM.
Le SNLGM se traduit cliniquement par l’apparition brutale d’un syndrome
néphrotique pur, caractérisé par la présence d’une protéinurie >3 g/24 h et d’une
hypoalbuminémie (<30 g/l), généralement accompagné d’une rétention hydro-sodée se
traduisant par des œdèmes déclives et une prise de poids et d’une modification du profil
lipidique (hypercholestérolémie principalement). La protéinurie est dite sélective car
constituée au moins de 80% d’albumine. Par définition, la pression artérielle est normale, il
n’existe pas d’hématurie ou d’insuffisance rénale organique associée. L’apparition au cours
de l’évolution d’une hématurie et/ou d’une hypertension artérielle et/ou d’une insuffisance
23
rénale organique définit un syndrome néphrotique impur et témoigne habituellement d’une
transformation du SNLGM en HSF.
Physiopathologie de la rétention hydro-sodée et de la formation des oedèmes au cours du
syndrome néphrotique (SN).
Les oedèmes, objectivés
par une prise de poids, sont en général cliniquement
évidents : de type rénal (blanc, mou, indolore, gardant le godet), déclives (prédominant le
matin au niveau des paupières, dos des mains, lombes, le soir au niveau des membres
inférieurs), parfois massifs avec atteinte des séreuses (transudat). Leur physiopathologie fait
intervenir trois facteurs, qui peuvent du reste se succéder dans le temps chez un même
malade, rendant leur individualisation souvent difficile :
1) Une hypovolémie est notée dans les S.N. massifs, avec hypoalbuminémie < 20
gr/l, surtout chez l'
enfant, et à la phase d'
installation des oedèmes. On retient alors le schéma
traditionnel d'
une modification de l'
équilibre de Starling au niveau des anses capillaires :
hypoalbuminémie-----> baisse de la pression oncotique des protéines -----> augmentation de
l'
ultrafiltration du liquide plasmatique vers le secteur interstitiel -----> hypovolémie ----->
stimulation du système rénine-angiotensine et de la sécrétion d'
hormone anti-diurétique----->
accentuation de la rétention hydro-sodée. Dans ces cas, la perfusion d'
albumine déclenche
une excrétion sodée et une disparition des oedèmes.
2) Une diminution de l'
excrétion tubulaire du sodium : une volémie normale, parfois
même augmentée, est notée dans les S.N.installés à la phase d'
état, avec hypoalbuminémie
moins massive, surtout chez l'
adulte. L'
activité rénine plasmatique et l'
aldostéronémie sont
adaptées à la volémie, normale ou à la limite inférieure de la normale, et les pressions
24
oncotiques intravasculaires et interstitielles de l'
albumine s'
équilibreraient. Les oedèmes sont
secondaires à une rétention de sodium par le néphron distal liée à une activation de la Na-K
ATPase au niveau du tube collecteur, indépendante de l’aldostérone.
3) Une augmentation de la perméabilité capillaire.
Complication du syndrome néphrotique
A tout moment, l’évolution de la maladie peut être émaillée de complications
Accidents thromboemboliques
Il existe au cours du syndrome néphrotique un état d’hyper coagulabilité dont
l’origine est multifactorielle (perte urinaire de certains facteurs anticoagulants tels que
l’antithrombine III, augmentation de la synthèse hépatique de certains facteurs pro coagulants
(fibrinogène, facteurs V, VII), augmentation de l’aggrégabilité plaquettaire). Ces thromboses
touchent tous les territoires veineux et notamment les veines rénales, plus rarement les
territoires artériels.
Dyslipidémie
L'
hyperlipidémie est pratiquement constante, et le sérum lactescent de S.N. est connu
depuis longtemps. L'
augmentation du taux de cholestérol est précoce, supérieure à 3gr/l chez
plus de la moitié des patients, avec élévation des VLDL et baisse du HDL, et s'
accentue
lorsque le S.N s'
aggrave. L'
augmentation des triglycérides est moins importante. Cette
dyslipidémie s'
expliquerait par une augmentation de la synthèse hépatique des lipoprotéines
(l'
hypoalbuminémie, avec baisse de la pression oncotique, stimulerait la synthèse hépatique
25
d'
albumine et de lipoprotéines, sans que le mécanisme exact en soit élucidé). Actuellement on
retient plus volontiers une diminution du catabolisme du cholestérol avec ralentissement de la
cascade conduisant à la dégradation des VLDL en LDL due à une diminution de l'
activité de
la lipoprotéine-lipase. Enfin, la lipurie expliquerait la fuite urinaire d'
HDL. On notera que le
rôle athérogène, en particulier le risque coronarien, de ces troubles reste discuté.
Infections
Le risque infectieux est majoré durant la période néphrotique du fait de la fuite
urinaire des immunoglobulines (IgG ++) et d’un dysfonctionnement de l’immunité à
médiation cellulaire. La corticothérapie et les traitements immunosuppresseurs augmentent
eux aussi le risque infectieux. Ces infections sont préférentiellement à germes encapsulés
(pneumocoques, Haemophilus, Klebsielle). Il s’agit de pneumopathies, de cellulites,
méningites et de septicémies
.
Retard de croissance, malnutrition
Ils sont généralement en rapport avec la carence protidique et le traitement
cortisonique.
Hypovolémie
Rarement observée, elle peut être à l’origine d’un collapsus, d’une insuffisance
rénale fonctionnelle favorisée par le traitement diurétique.
Autres
La fuite urinaire d'
hormones liées aux protéines n'
a en général aucune conséquence.
Il existe une fuite de thyroxine T4, mais le sujet reste euthyroidien avec un rapport T3/T4 et
un taux de TSH normaux. De même pour la vitamine D avec fuite de calcidiol mais taux
26
normal de calcitriol (le calcium total est diminué du fait de l'
hypoalbuminémie, mais le
calcium ionisé est normal).
C-Etude histologique
Chez l’enfant, ou le SNLGM représente la plus grande majorité des syndromes
néphrotiques, la ponction biopsie rénale (PBR) n’est pas indiquée sauf en cas d’atypies
cliniques, biologiques (syndrome néphrotique impur notamment), ou de cortico-résistance.
Chez l’adulte, la PBR est toujours indiquée. Par définition, elle montre l’absence de lésions
glomérulaires significatives en microscopie optique et de dépôts d’immunoglobulines ou de
complément en immunofluorescence. On note parfois un certain degré d’hypertrophie des
cellules épithéliales et un élargissement modéré du mésangium sans hypercellularité. En
microscopie électronique, les pieds (pédicelles) des cellules épithéliales viscérales
(podocytes) sont fusionnés (Figure. 4). Néanmoins, ces anomalies apparaissent moins liées
spécifiquement au SNLGM qu’à l’état néphrotique (conséquence de la fuite protéique)
33
.
L’apparition au cours de l’évolution de lésions du floculus associant un épaississement du
matériel mésangial et des dépôts formés d’une substance amorphe qualifiée de hyaline sans
prolifération cellulaire, témoigne habituellement de la transformation du SNLGM en HSF.
27
Figure 4. Altération podocytaire en miroscopie electronique (d’après Kerjaschki)
A- Pédicelles normaux avec fentes de filtration distinctes. B-Effacement des pédicelles avec
réduction du nombre de fentes de filtrations. C-Etalement des podocytes, disparition des
fentes de filtration.
D- Traitement et évolution du SNLGM.
En plus d’un traitement symptomatique (traitement de la rétention hydro-sodé,
prévention des complications trombo-emboliques, lutte contre la déperdition protidique), le
SNLGM bénéficie
d’un traitement
étiologique bien qu’il existe une possibilité
fréquente (4 à 6%) de rémission spontanée 1,
peu
34
. Celui-ci, (clairement établi en pédiatrie) 35,
28
repose initialement sur la prescription de corticostéroïdes à la posologie de 60 mg/m2/j chez
l’enfant et 1-1,5 mgKhg/j chez l’adulte. Chez l’enfant, une réponse est obtenue en moyenne
en 10 à 15 jours, mais cette posologie est maintenue 4 semaines. La posologie est ensuite
réduite à 40 mg/m2, un jour sur deux, pendant 4 semaines. Ce type de traitement entraîne 95%
de réponse à 8 semaines et 98% de rémission à 26 semaines chez l’enfant. Chez l’adulte, le
traitement initial est poursuivi pendant 6 à 8 semaines et 80% d’entre eux entrent en
rémission après 8 semaines de traitement.
Le problème majeur posé par le SNLGM réside dans la dépendance aux
corticostéroïdes, se manifestant soit par la réapparition de la protéinurie pendant la phase de
décroissance, soit par la réapparition du syndrome néphrotique à une distance variable de
l’arrêt de la corticothérapie, fréquemment associée à un épisode infectieux chez l’enfant 36.
Ces rechûtes surviennent dans 60 à 70% des cas. Le traitement du premier épisode repose sur
les mêmes principes que celui utilisé lors de la première poussée. Néanmoins, des rechutes à
répétitions surviennent chez 40 à 50% des enfants 1 et 16% des adultes 37 nécessitant l’emploi
d’alternatives thérapeutiques. Dans ces cas, des agents alkylants tels que le chlorambucil et le
cyclophosphamide 38, 39, les inhibiteurs métaboliques tel que l’azathioprine, ou le levamisole
sont utilisés seuls ou en complément de la corticothérapie. En cas d’échec de ces
thérapeutiques chez l’enfant et souvent en première intention chez l’adulte, la ciclosporine A
est utilisée à dose élevée (5mg/kg/j) et de manière prolongée (1 an ou plus).
L’ensemble de ces thérapeutiques permettent généralement l’obtention d’une
rémission dans 60 à 80% des cas, mais conservent un risque élevé de récidive à l’arrêt du
traitement. De plus, les conséquences de ces traitements à court et à moyen terme sont
multiples et combinent les effets de la corticothérapie (aspect cushingoïde, HTA, retard de
29
croissance, ostéoporose, cataracte, désordres psychologiques), des immunosuppresseurs
(infertilité, risque néoplasique) et/ou de la ciclosporine (néphrotoxicité).
Entre 5 et 20% des SNLGM de l’enfant et de l’adulte sont corticorésistants. Chez
l’enfant, l’histologie retrouve souvent des lésions d’HSF associées. La ciclosporine A est
alors le traitement de référence avec obtention d’une rémission complète dans environ 50%
des cas
40
,
41
, 5. Des effets bénéfiques similaires ont été obtenus avec le FK606
42
et le
cyclophosphamide 43.
E- Récidive de la maladie après transplantation rénale.
En dépit des thérapeutiques envisagées précédemment, un certain nombre de patients
atteints initialement de SNLGM évoluent vers l’insuffisance rénale terminale nécessitant le
recours à l’épuration extra rénale et à la transplantation. L’incidence de cet événement est
beaucoup plus élevée (jusqu’à 80%) 44 chez les patients présentant un SNI associé d’emblée à
des lésions histologiques d’HSF. Après une première transplantation rénale, 20 à 30% des
patients
présentent une récidive du syndrome néphrotique. Ce risque est de 75 à 80% lors
d’une seconde greffe si la première s’est soldée par une récidive 45, 46, 47. L’apparition de la
récidive est généralement précoce, de quelques heures à quelques jours dans 80% des cas et
50% d’entre elles sont responsables d’une perte du greffon 45, 48 .
Les lésions post-transplantationelles précoces sont souvent superposables à celles
observées dans les SNLGM renforçant ainsi l’hypothèse d’une physiopathologie commune
entre les deux affections.
Il n’existe actuellement aucun marqueur prédictif du risque de récidive de la maladie
sur le greffon. Seuls, l’age d’apparition de la maladie, la présence d’une prolifération
30
mésangiale sur les reins propres et la rapidité d’évolution initiale de la maladie constituent
des facteurs de risque de cette récidive 49, 50, 48, 46.
Les thérapeutiques médicamenteuses (forte dose de ciclosporine, cyclophosphamide)
sont
souvent
peu
efficaces
chez
des
patients
traités
par
de
fortes
doses
d’immunosuppresseurs. L’implication potentielle d’un facteur plasmatique de perméabilité
glomérulaire a logiquement induit l’utilisation de thérapeutiques soustractives du sérum des
malades. Les échanges plasmatiques présentent des effets bénéfiques mais souvent
transitoires
51 52
. L’immunoadsorption du sérum des malades sur colonnes de protéine A,
connue pour adsorber, par leurs fragments Fc, les immunoglobulines G de sous classes 1, 2,
4 et à un moindre degré les IgG3, les IgM et les IgA
53
permet d’obtenir des résultats
54 55
nettement plus efficaces que les échanges plasmatiques
,
). Néanmoins, l’efficacité des
colonnes de protéine A sur des protéinuries de syndromes néphrotiques secondaires à des
glomérulonéphrite extra membraneuses ou diabétiques
56
, semblent indiquer une action non
spécifique dans le SNI.
31
III-Immunopathogénie du SNLGM
A- Position du problème
Le SNI est une vaste entité anatomo-clinique définie par la présence d’un syndrome
néphrotique associé à des lésons glomérulaires minimes ou des lésions d’HSF. La grande
majorité des cas de SNI sont de types sporadiques mais il existe également des formes
familiales de SNI principalement de type HSF (Figure 5).
Figure 5 : Classification des SNI
Syndrome
n é phrotique
Cortico résistant
Cortico sensible
G é netique
Mutations /délétions
immun
e
SNLGM
idiopathique
HSF
( Podocin
e
n é phrine ACTN-4, CD2AP,
WT1,
ADNmt,...)
Désorganisation
du
cytosquelette
Dysfonction
du podocyte
32
L’étude des formes familiales de SNI de type HSF a permis une avancée décisive
dans la compréhension de certains mécanismes moléculaires qui régissent le fonctionnement
de la barrière de filtration glomérulaire. En effet, les études génétiques, réalisées au sein de
familles atteintes de syndromes néphrotiques (Syndrome Néphrotique Finlandais, Syndrome
Néphrotique cortico-résistant familial)
19,23
, ont conduit à l’identification de protéines
exprimées par le podocyte (néphrine, podocine) dont l’altération, par mutation ou délétion
partielle, entraîne une rupture des interactions dynamiques entre le cytosquelette podocytaire
et les diaphragmes de fente. Ces pathologies sont, par définition, insensibles aux traitements
immunosuppresseurs et ne récidivent pas après transplantation rénale.
À l’inverse, l’étiologie des formes sporadiques de SNI (SNLGM et HSF), sporadique, de
sensibilité variable aux traitements immunosuppresseurs, et susceptibles de récidiver sur le
greffon après transplantation rénale, reste plus énigmatique. Les 2 pathologies (HSF
sporadique et SNLGM) se regroupent sur de nombreux points :
-Les deux entités ont une expression clinique souvent similaire ;
-Certaines perturbations immunes trouvées dans la néphrose ont également été décrites
dans la forme commune de HSF ;
-Les signes histologiques, comme les lésions de HSF peuvent compliquer l’évolution des
néphroses résistant au traitement ;
-L’examen des biopsies du greffon rénal, provenant de patients ayant une récidive de la
HSF, ne montre souvent que des glomérules optiquement normaux au cours des premières
semaines d’évolution ;
-Enfin, le pronostic des HSF qui répondent favorablement aux corticoïdes, est similaire à
celui des néphroses.
33
Ces observations suggèrent que LGM et HSF, bien que différentes dans leur expression
clinique et histologique, pourraient partager une physiopathologie commune dans laquelle le
syndrome
néphrotique résulterait de la sécrétion d’un facteur produit par des cellules
immunes dans le cadre d’une réponse immune anormale, susceptible d’altérer la barrière de
filtration glomérulaire. Cette thèse étant consacrée à l’étude du SNLGM nous nous limiterons
néanmoins à une description physiopathologique des anomalies immunes décrites dans cette
pathologie.
B-Arguments cliniques en faveur d’une origine immune.
Avant toutes données expérimentales, de simples observations cliniques ont permis
de suspecter l’origine immune de la maladie et de proposer les premières hypothèses
physiopathologiques. Dans environ deux tiers des cas, la néphrose survient dans un contexte
d’activation du système immunitaire déclenchée par une infection banale (virose) ou une
agression (piqûre d’insectes, vaccination). Une susceptibilité au développement de réactions
allergiques est observée chez environ un tiers des patients 57, tandis qu’une désensibilisation
spécifique ou un régime d’éviction pourraient prévenir simultanément la crise allergique et la
protéinurie
étiologique
58
,
59
. Néanmoins, il reste difficile à déterminer si l’allergie est un facteur
déterminant
ou si elle témoigne de l’expression d’un terrain immunitaire
particulier. Plus rarement, la néphrose survient en association avec certaines proliférations
lymphoïdes malignes comme la maladie de Hodgkin 60, la leucémie à LGL (Lymphocyte T à
larges granules)
61
certains lymphomes T
62
et de thymomes
63
. Enfin les médicaments qui
inhibent le système immunitaire (corticoïdes, immunosuppresseurs) permettent le contrôle de
la maladie. De même, une infection par le virus de la rougeole, connue pour générer une
34
immunosuppression prononcée, est susceptible d’induire une rémission du syndrome
néphrotique
64
. C’est en s’appuyant sur ces arguments cliniques toujours d’actualité que
Shalhoub fut le premier à émettre l’hypothèse qu’une altération du système immunitaire T
des patients atteints de SNLGM serait responsable de la secrétion d’un médiateur circulant
toxique pour le glomérule 65.
Figure 6 : Hypothèse d’un facteur circulant d’origine immune
C-Perturbations des fonctions lymphocytaires T dans le SNLGM
Une altération possible des fonctions lymphocytaires T à l’origine des néphroses a
été évoquée, il y a une trentaine d’années, à la suite de nombreuses observations cliniques et
expérimentales. En effet, les patients atteints de SNI expriment souvent un déficit de
l’immunité cellulaire et ont tendance à développer des infections bactériennes. Ainsi, une
35
lymphocytopénie T a été décrite par certains auteurs
66
,
67 68
mais contestée par d’autres
travaux 69 70. D’autres études rapportent des anomalies souvent controversées de la répartition
des sous-populations lymphocytaires avec diminution du ratio CD4+ :CD8+ au cours des
poussées de SNLGM 67 71 et une élévation du nombre de cellules NK 71. D’autres équipes ont
rapporté au cours des rechutes, une expansion des lymphocytes T CD4+ qui expriment le
marqueur CD25, ainsi que des lymphocytes T CD4+ CD8+ qui expriment le marqueur
CD45RO, caractéristique des lymphocytes T mémoires 72. L’expression de l’antigène CD 25
(chaîne
du récepteur de l’IL-2) au cours des poussées pourrait refléter une activation des
lymphocytes T CD4+ ou bien traduire le recrutement d’une sous-population CD4+ CD 25+
dotée de fonctions suppressives. Les lymphocytes T CD8+ semblent également intervenir
dans ces mécanismes, particulièrement chez les patients dont l’évolution est émaillée de
rechutes fréquentes, où il a été mis en évidence un recrutement sélectif de certaines familles
de gènes V qui forment la région variable CDR3 de la chaîne bêta 73.
Ces derniers résultats sont compatibles avec certaines études fonctionnelles qui ont
montré une altération de l’immunité à médiation cellulaire au cours de la maladie, appréciée
par des tests cutanés d’hypersensibilité retardée (type IV dans la classification de Gell et
Combs) et de GvH locale (Graft versus Host)
66 74
ainsi qu’une réduction de la capacité des
lymphocytes T à proliférer en présence de mitogènes (PHA, Con A, PWM)75
76 77 78
,
. Le
sérum des patients en poussée de SNLGM serait en fait responsable de l’inhibition des
fonctions T : il serait toxique pour les lymphocytes
blastogenèse de lymphocytes normaux
et aux alloantigènes
80
,
77
contrôles
79
et il inhiberait la
ainsi que les réponses prolifératives aux mitogènes
81 82
. Toutes ces modifications ont cependant été retrouvées dans
d’autres formes étiologiques de syndromes néphrotiques
75 82 80
et ne seraient donc pas
spécifiques du SNLGM.
36
Ces observations, anciennes pour la plupart, sont difficiles à interpréter et les
conclusions souvent hypothétiques. Les techniques utilisées sont peu précises, le choix des
contrôles et des groupes de patients souvent peu rigoureux. Néanmoins, toutes concordent
pour rapporter des anomalies lymphocytaires T dans les poussées de SNLGM.
Une étude plus récente a consisté à analyser le répertoire T périphérique de six
patients atteints de SNLGM
73
. Ces patients présentaient tous, par rapport aux individus
témoins sains, des profils de répertoires T particuliers mais sans qu’une réponse publique
correspondant à un clone T spécifique soit mis en évidence. Il est néanmoins intéressant de
noter que les altérations constatées en poussées de la maladie persistaient au cours des
rémissions thérapeutiques et impliquaient d’autre part majoritairement les lymphocytes T
CD8+.
D- Différentiation lymphocytaire T et SNLGM
1- Rappel sur les bases moléculaires de la différentiation T
Lors d’une stimulation antigénique, le système immunitaire développe une réponse
qui implique une action coordonnée entre les cellules présentatrices d’antigène et les
lymphocytes T et B. La réponse immune à prédominance cellulaire (réactions inflammatoires,
hypersensibilité de type retardé) ou humorale (production d’anticorps) est sous la dépendance
de classes distinctes de lymphocytes T auxiliaires CD4+, Th1 et Th2 respectivement, qui
secrètent chacune un profil particulier de facteurs de croissance et de cytokines
83
. Les
lymphocytes T CD4+ de type 1 (Th1) produisent surtout l’IL2, l’IL18, l’interféron γ (IFNγ) et
37
du TNFα Ces cellules sont recrutées principalement dans les pathologies inflammatoires
comme les défenses antibactériennes.
Les lymphocytes T CD4+ de type 2 (Th2) secrètent l’IL4, l’IL5, l’IL6 et l’IL13. L’IL10
semble produite de façon égale par les deux types cellulaires ainsi que par les monocytes
chez l’homme 84. Les lymphocytes CD4+ de type Th2 sont spécialisés dans l’activation des
lymphocytes B et ces voies d’activations sont principalement recrutées dans les pathologies
auto immunes et les maladies immunoallergiques.
Généralement, on considère que l’expression relative de l’INFγ et de l’IL4 permet de
différencier clairement les lymphocytes T CD4+ de type Th1 ou Th2, respectivement.
Parallèlement à ce profil sécrétoire spécifique, les cellules Th1 et Th2 se distinguent
également par l’expression restreinte de certains récepteurs membranaires 85. La chaîne β2 du
récepteur de l’IL12, le récepteur de l’IL18, les récepteurs des chémokines CXR3 et CCR5
sont sélectivement exprimés par les cellules Th1. Par contre, les récepteurs des chémokines
CCR3, CCR4 et CCR8, le récepteur pour ST2 sont préférentiellement exprimés par les
cellules Th2.
Les bases moléculaires qui régissent la différenciation des cellules T CD4+ précurseurs
vers la voie Th1 ou Th2 impliquent au moins trois mécanismes qui interviennent à des
niveaux distincts de l’activation cellulaire(Figure 7) :
1- Expression sélective de certains facteurs de transcription comme T-bet dans les cellules Th1
86 87
,
ou GATA-3, Stat6 et c-maf dans les cellules Th2
88 89 90
2- Régulations post-transcriptionnelles : la protéine JunB est exprimée à des taux élevés dans les
cellules Th2 alors que le niveau du transcrit est similaire dans les deux types cellulaires 91.
38
3- Recrutement de voies de signalisation distinctes : la voie p38 MAP kinase est
préférentiellement activée lors de la différenciation des cellules Th1 où elle joue un rôle-clé
dans l’induction de l’IFNγ 92. La production à l’état stable de l’IFNγ nécessite l’amplification
du signal p38 MAP kinase avec la co-activation de JNK 1 et JNK2 qui interviennent en
stimulant l’expression de la chaîne β2 du récepteur de l’IL12 et en bloquant la transactivation
de l’IL4 par NFATc, respectivement 92.
Figure 7 : Schéma de la différentiation lymphocytaire T
La génération de lymphocytes T de type Th1 ou Th2 à partir des cellules T
précurseurs dépend donc de la nature et la dose de l’antigène, mais surtout de la concentration
locale en IL12 et IL4 au site d’initiation de la réponse immune. L’IL4 et l’IL12 activent la
voie JAK-STAT en agissant sur des cibles différentes. L’IL4 stimule JAK1 et JAK3 qui en
retour activent STAT6 lequel migre dans le compartiment nucléaire et transactive GATA3.
L’IL12 stimule JAK2 et TYK2 lesquels activent STAT4 chez l’homme
83
. Les sources
39
initiales de l’IL12 et de l’IL4 à l’origine de la polarisation des lymphocytes T précurseurs ne
sont pas clairement identifiées. Il est possible que les cellules dendritiques et les cellules T
naturel killer (NKT), présentes dans l’environnement du stimulus antigénique, produisent des
quantités suffisantes d’IL12 et d’IL4 permettant la différentiation des cellules T vers la voie
Th1 ou Th2, respectivement.
2- Différentiation lymphocytaire T et SLGM
Les voies de signalisation spécifiquement recrutées et conduisant à l’activation
lymphocytaire T au cours du SLGM sont encore inconnues. Un certain nombre d’arguments
cliniques plaident néanmoins pour une pathologie associée à une activation des lymphocytes
T de type Th2 :
-Il n’existe pas de syndrome inflammatoire clinique ou histologique au cours du
SNLGM ;
-Les patients présentent souvent un défaut de réponse aux tests cutanés
d’hypersensibilité retardée ainsi que leur susceptibilité accrue à certaines infections
bactériennes, deux caractéristiques qui dépendent des lymphocytes Th1 ;
-Il existe dans cette pathologie une fréquence accrue des manifestations allergiques et
des taux élevés d’IgE par rapport à la population générale ;
-Le levamisole, thérapeutique immunosuppressive très efficace dans le SNLGM
cortico-dépendant de l’enfant, est un puissant inducteur de la voie Th1 93
Sur le plan immunologique, nous allons voir au chapitre suivant que les arguments sont plus
discordants.
E - Cytokines et SNLGM.
40
De nombreux travaux ont été consacrés à l’étude des profils de cytokines dans les
néphroses avec une grande variabilité dans les résultats présentés. Plusieurs explications
peuvent être avancées pour interpréter ces discordances ; i) Il existe un défaut évident
d’appariement des patients et des sujets témoins dans la plupart des études rapportés, compte
tenu notamment de la variabilité naturelle du taux d’expression d’une cytokine donnée selon,
l’âge, la situation immunologique antérieure etc.… ; ii) De nombreuses études ont été
accomplies sur des cellules stimulées in vitro. Ces expériences ne tiennent donc pas compte
des contraintes cellulaires et moléculaires qui prévalent in vivo ; iii) Le nombre de patients
présentant un terrain atypique est rarement pris en compte dans l’analyse des résultats ; iv)
Les méthodes de mesure du niveau d’expression des cytokines varient souvent d’une étude à
l’autre. Le tableau 1 résume les résultats des principales études.
-La production d’IL1 n’est pas augmentée d’après la plupart des études. Toutefois, sa
production par les monocytes des patients atteints de SNI est diminuée, peut-être par
inhibition par des prostaglandines 94
-L’interleukine 2 (IL2) est trouvée augmentée dans le plasma des patients SNI 71 mais
inchangée dans le plasma et l’urine sur d’autres cohortes
95
. Néanmoins, l’administration
d’IL2, dans un modèle de rein de rat isolé perfusé, diminue le nombre de sites anioniques
glomérulaires et provoque une protéinurie
96
. De même, l’IL2 recombinante, utilisée en
cancérologie à forte dose, peut induire une protéinurie transitoire 97.
-L’interleukine 4 (Il4) joue un rôle clef dans la régulation de la production d’IgE et la
réponse allergique, deux éléments fréquemment retrouvés dans le SNLGM. De plus, il a été
41
démontré qu’elle pouvait agir via un récepteur spécifique, directement sur les podocytes en
diminuant la résistance de la barrière glomérulaire, et donc en augmentant sa perméabilité 98.
Néanmoins si des taux élevés d’IL4 ont été retrouvés dans le surnageant lymphocytaire de
patients atteints de SNLGM
99
, ces résultats n’ont pas été confirmés dans d’autres études
71,100
.
-Une augmentation de l’interleukine 8 (IL8) dans le sérum et le surnageant
lymphocytaire des patients en poussée de SNLGM a été mis en évidence dans une seule étude
101
. Il a été néanmoins démontré que la perfusion d’IL8 chez le rat provoque une albuminurie,
augmente le catabolisme des heparans-sulfate des glycosaminoglycans, et réduit leurs charges
anioniques
102
. De plus, l’injection d’anticorps, anti-IL8 abolit l’effet albuminurique du
surnageant monocytaire des patients atteints de SNI.
-L’expression transcriptionelle cytoplasmique de l’interleukine 13 (IL13), une
cytokine Th2 immunomodulatrice est augmentée dans les lymphocytes CD4+ et CD8+ des
patients atteints de SNLGM en poussée 100. L’IL13, comme l’IL4 semble agir directement sur
l’épithélium glomérulaire en augmentant sa perméabilité 98.
-Le TNFα (Tumor Nécrosis Factor) est fréquemment retrouvé à des taux élevés dans
le plasma et l’urine de patients atteints de différentes glomérulonéphrites dont le SNLGM ou
son niveau de production est accru dans les monocytes des patients en poussée
103
. Ces
résultats sont concordants avec d’autres études expérimentales qui montrent que
l’augmentation du TNFα coïncide avec le pic de protéinurie dans un modèle de SN induit par
l’aminonucleoside de puromycine
104
ou que des stratégies de blocage du TNFα préviennent
l’apparition de la glomérulopathie 105.
42
Tableau 1 :Synthèse des données de la littérature concernant le niveau d’expression des
cytokines dans le SNLGM. Les points coorespondent aux données rapportées dans les
publications référencées à droite du tableau.
Cytokine
IL-1
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10
Augmentée
Diminuée
Inchangée
Auteurs
Matsumoto, 1989 98
Daniel, 1997 71
Koyama, 199199
Saxena, 1993 100
Daniel, 1997 71
Koyama, 199199
Yap, 1999 101
Bustos, 1994 94
Suranyi, 1993 102
Neuhaus, 1995 103
Hulton, 1997 104
Daniel, 1997 71
Koyama, 1991 99
Yap, 1999 101
Cho, 1999 113
Chen, 1994 105
Garin, 1994 106
Yap, 1999 101
Daniel, 1997 71
Neuhaus, 1995 100
Matsumoto, 1995 107
IL-12
Stefanovic, 1998 108
Matsumoto 1999 109
IL-13
Yap, 1999 101
Kimata, 1995 110
TNFα
Koyama, 1991 99
Bustos, 1994 94
Suranyi, 1993 102
Daniel, 1997 71
Yap, 1999 101
Neuhaus, 1995 100
IFNγ
Enfin, les corticostéroïdes et la Ciclosporine A modulent la production de TNFα 115
43
-La production par les monocytes des patients atteints de SNLGM d’’INFγ
(Interféron) serait augmentée
108
tandis que l’expression de son mRNA lymphocytaire ne
différait pas des contrôles 100.
Comme nous le voyons, il paraît difficile en raison du caractère souvent contradictoire
des résultats, d’établir un profil cytokiniques caractéristique du SNLGM. Si l’augmentation
de l’IL13 renforce les arguments cliniques en faveur d’une pathologie de type Th2, l’absence
d’IL4 chez de nombreux auteurs, et la présence d’INF
suggèrent l’existence d’autres voies
d’activation ou d’inhibition encore indéterminées.
F- Activation de la voie NFkB au cours du SNLGM
Une étude récente, réalisée dans le laboratoire à permis la caractérisation dans le
SNLGM d’une voie de signalisation impliquée dans la production accrue de certaines
cytokines : la voie NF B/I Bα
(Figure 8). Il a en effet été
démontré que la voie NF B était fortement activée dans les lymphocytes T CD4+ au cours
des poussées de néphrose lipoïdique et réprimée en rémission. De façon surprenante,
l’activation de la voie NF B persiste tant que la maladie est active alors que dans les
situations physiologiques, elle est rapidement réprimée du fait du rétrocontrôle négatif par
l’inhibiteur naturel de NFkB, I Bα, suggérant une rupture de la boucle de régulation,
d’autant plus que l’expression de I Bα reste faible voire indétectable durant cette phase. Au
cours des rémissions, la restauration du niveau d’expression de I Bα est associée à
l’inhibition de l’activation NF B et à la diminution de la production de nombreuses
cytokines comme le TNFα, l’IL-13 et l’IFNγ. Les mêmes travaux ont également démontré
44
que deux mécanismes au moins contribuaient à la dérégulation de la voie NF B/I Bα au
cours de la maladie : i).une sur activation du protéasome, mise en évidence par des
expériences de culture de lymphocytes T des malades avec un inhibiteur puissant du
protéasome (MG132); ii) une dégradation accrue de l’ARNm codant pour I B
associé à un
défaut de transactivation du gène I Bα Ces résultats pourraient en partie expliquer le mode
d’action des thérapeutiques immunosuppressives dans la maladie. En effet, de nombreuses
observations cliniques montrent que les corticoïdes seuls sont parfois incapables de contrôler
une poussée de SNLGM tandis que l’association à la ciclosporine a permis d’obtenir une
rémission. Ces données suggèrent que les mécanismes par lesquels la ciclosporine et les
corticoïdes induisent des rémissions du syndrome néphrotique ne sont pas nécessairement
similaires mais plutôt complémentaires. Cette hypothèse est confortée par des données
expérimentales qui montrent que l’activation NF B dans les cellules mononucléées
périphériques, et les lymphocytes T des patients en poussée, est inhibée ex vivo par le
MG132 qui bloque la dégradation de I Bα par le protéasome, lui-même étant une des cibles
d’action de la ciclosporine
116
. En revanche, les corticoïdes induisent la transactivation du
gène, I Bα contribuant ainsi à séquestrer le complexe NF B dans le cytoplasme et à
éteindre cette voie d’activation 117.
Figure 8 : Activation de la voie NFkB/IkBα
α
Dans les lymphocytes T inactivés, l’hétérodimère principal NFκB p50/p65 est séquestré
dans le compartiment cytoplasmique par son inhibiteur IκBα. L’activation de NFkB
45
requiert donc l’élimination de l’inhibiteur IκBα. La phosphorylation (P) au niveau de
résidus sérines en position 32 et 36 de IκBα par action de IκKα et IκKβ (pour IκB kinase
α et β) permet le recrutement d’une ubiquitine ligase qui fixe des molécules d’ubiquitine
au niveau de résidus Lysine 21 et 23 de IκBα. Cette modification constitue un signal de
reconnaissance pour la dégradation de IκBα par le protéasome, libérant ainsi le complexe
NFκB qui migre dans le noyau, se lie à ses éléments de réponse présents sur les
promoteurs des gènes cibles dont il active la transcription
G- Immunité humorale et SNLGM
Des anomalies de la répartition des différentes sous-classes d’immunoglobulines ont
été décrites au cours du SNLGM. Les IgG sont diminuées au cours des poussées (jusqu’à
40% par rapport aux valeurs normales) et de façon proportionnelle (fuite urinaire) à la baisse
de l’albuminémie
118
. En rémission, les taux d’IgG s’élèvent sans retrouver néanmoins leurs
valeurs initiales. Les IgM sont par contre fortement augmentées au cours de poussées (210%
46
des valeurs normales). Les IgA tendent à diminuer au cours des SNI corticorésistants. Ce
profil immunologique pourrait s’expliquer par une anomalie du switch dans le processus de
conversion des IgM en IgGA.
118 58
. Ces dernières anomalies tendent à disparaître au cours
des rémissions 119.
Une élévation importante du taux d’IgE chez environ 30% des patients atteints de
SNLGM a été rapportée
d’IL13 dans la maladie
120
. Le taux élevé d’IgE pourrait être secondaire à la production
114
. Certains auteurs ont par ailleurs suggéré l’existence d’un lien
entre le taux d’IgE et le profil évolutif de la maladie : pronostic péjoratif
121
ou
corticosensibilité 119.
L’effet bénéfique du traitement par immunoadsorption extracorporelle sur colonne de
protéines A
54
, suggère l’implication des immunoglobulines dans la pathogenèse du SNI.
Néanmoins, l’injection au rat de l’éluat de ces colonnes a montré que l’activité albuminurique
résidait dans un filtrat de poids moléculaire inférieur à 100kD, incompatible avec
l’implication d’une Ig entière. De plus, aucun auto anticorps n’a jamais été isolé dans le sang
périphérique ou les PBR des patients atteints de SNLGM. Si la responsabilité directe d’une Ig
dans l’apparition du syndrome néphrotique semble écartée, le rôle d’un dysfonctionnement de
l’immunité humorale dans la pathologie de la maladie reste à démontrer.
H-Le Facteur de Perméabilité Glomérulaire.
47
L’observation fondamentale plaidant en faveur de l’existence d’un facteur circulant
dans la pathogenèse du SNI est la récidive immédiate de la maladie initiale après
transplantation rénale. D’autres arguments, comme l’effet bénéfique des échanges
plasmatiques,
48 51
, des immunoadsorptions
54
et la transmission materno-fœtale
122
sont,
depuis, venus renforcer cette hypothèse.
En regroupant différents arguments cliniques, comme la sensibilité aux traitements
immunosuppresseurs, l’association avec certaines maladies immunitaires et la susceptibilité
envers certaines infections, Shalhoub, des 1974, a émis l’hypothèse que ce facteur circulant
était d’origine lymphocytaire. Depuis près de 30 ans, de nombreux travaux ont tenté d’isoler
et de caractériser ce facteur. Ces travaux sont résumés dans le tableau 2. Nous détaillons les
plus significatifs d’entre eux, dans deux cadres méthodologiques distincts, : les expériences
de transfert de la maladie humaine à l’animal par injection de sérum et d’autres part les
études de caractérisation de l’activité du facteur par des expériences in vitro.
1- Transfert de l’activité protéinurique chez l’animal
Les premiers auteurs à avoir utilisé les expériences de transfert d’activité
protéinurique, ont assimilé l’augmentation de la perméabilité glomérulaire à une
augmentation de la perméabilité vasculaire et ont ainsi mis au point un test appelé test
d’Ovary, permettant de visualiser les changements de la perméabilité vasculaire cutanée 123.
48
Tableau 2 : Identification d’un facteur de perméabilité : Résumé des travaux.
Auteurs
Méthode
Origine des
échantillons
Activité
biologique
Nom du
facteur/Poids
Lagrue, 1975 Test d’ovary (TO) LGM :surnageant
lymphocytaire T
Heslan , 1986
(SLT)
Beale, 1980
LGM :Sérum-urine
Schnaper,
SLT
1985
Schnaper
1987
Cheng 1989
Boulton 1983
Inhibition des
plages cellulaires
(IPC)
IPC
LGM : SLT
Bakker 1988
Cheung 2000
TO
LGM : Plasma
Levin 1989
Méthode de
Whiteman (1)
Incorporation de
SO4 dans la MBG
Injection intraarterielle
LGM : Plasma et
urine
SNI : Surnageant
de PBMC
LGM : Plasma
Garin
1985/1992
Wilkinson
1989
LGM : Sérum
Yoshisawa
Injection
1989
intraveineuse
Tanaka 1992
Koyama 1991 Injection
intraveineuse
Savin 1992
Test sur
(a)
glomérules isolés
1996 (b)
SNI : Surnageant
de PBMC
Dantal 1994
HSF : Eluat de
protéine A
HSF : Plasma
Le Berre
2000
Injection
intraveineuse
Injection intra
veineuse/intra
arterielle
LGM : Surnageant
d’hybridomes T
HSF : Plasma
Perméabilité
vasculaire
Moléculaire
VPF
12kD
Régulation de la
prolifération T
SIRS
110-150kD
Activation de la
production du
SIRS
Protéinurie,
effacement des
pédicelles
Protéinurie,
induction de
LGM
Inhibition de la
précipitation (1)
Diminution des
sites anioniques
Protéinurie et
diminution des
sites anioniques
Protéinurie,
induction de
LGM
Protéinurie
Substance
activatrice du
SIRS 13-18kD
VPF like
Isoforme de
l’hémopexine
80-100 kD
>100kD
Lymphokine
29kD
Non caractérisé
GPF (2)
GPF
60-160kD
Augmentation de HFSH (3)
la perméabilité à 100-120kD (a)
l’albumine
30-50 kD (b)
Albuminurie
< 100kD
Albuminurie
Orosomucoide
43kD
49
(1) Précipitation du complexe Bleu Alcian-GAGs
(2) Glomérular permeability factor
(3) Human focal sclerosis factor
Ainsi, l’injection intradermique à des cobayes de surnageant de culture lymphocytaire
stimulée de patients atteints de SNLGM, provoque une extravasation capillaire d’un colorant
(le Bleu Evans) injecté préalablement, et quantitativement proportionnelle à la sécrétion d’un
facteur vasoactif nommé VPF (Vascular permeability factor). Lagrue a ainsi démontré que les
lymphocytes de patients atteints de SNLGM stimulés par la ConA, secrétaient davantage de
VPF que les lymphocytes contrôles
123
Le VPF possède un poids moléculaire de 12kD 96. Il
est produit principalement par les lymphocytes T CD4+
124
. Sa responsabilité directe dans
l’albuminurie du SNLGM n’a néanmoins jamais été démontrée.
Un second facteur, entraînant également une augmentation de la perméabilité cutanée et
une diminution du nombre de sites anioniques de la MBG sur un modèle de rein isolé perfusé
à été identifié 125. Ce facteur de perméabilité glomérulaire a un poids moléculaire de 80100kD et serait proche de l’hemopexine
poussée de SNLGM
sites anioniques
126
126
. Son activité est augmentée chez les patients en
125
. Il semble agir directement sur la MBG en réduisant le nombre de
et son injection artérielle entraîne un syndrome néphrotique chez le rat.
Néanmoins, ce facteur a été décrit chez les individus sains et ne semble pas spécifique du
SNLGM.
Dans une autre étude
127
, l’injection de surnageant de PBMC, stimulés à la ConA, de
patients SNLGM, déclenche une perméabilité avec altérations glomérulaires, par libération
d’un facteur de perméabilité nommé GPF (Glomerular Permeability Factor).
50
Le surnageant de culture d’un hybridome T, résultant de la fusion des cellules T d’un patient
SNLGM et d’une lignée de cellules pro-thymocytaire de souris, provoque une protéinurie
transitoire chez l’animal 106. Ce GPF serait une lymphokine d’un poids moléculaire de 60-160
kD douée d’activités cytotoxiques.
Plus récemment, l’équipe de Savin a tenté de purifier graduellement un “ FSGS ”
factor par précipitation séquentielle 128. Un facteur ainsi concentré de 30-50kD déclenche une
protéinurie après injection chez le rat. Il n’a jamais été séquencé.
2- Les tests de caractérisation in vitro.
Un suppresseur soluble de la prolifération lymphocytaire, induite par stimulation
mitogénique et allogénique, a été mis en évidence dans le sérum et l’urine des patients
atteints de SNLGM
82
. Ce facteur régulateur de la fonction lymphocytaire T, appelé SIRS
(Soluble Immune Response Suppressor) est détecté grâce à sa capacité à inhiber la formation
de plages cellulaires de lymphocyte T stimulés
129 130
. Ce facteur de 100-150kD n’est pas
spécifique du SNI et peut être induit par un composé sérique retrouvé dans le surnageant des
lymphocytes CD4+ 129 Néanmoins, il n’a pas été mis en évidence de relation directe entre le
SIRS ou son facteur régulateur et les modifications de la perméabilité glomérulaire au cours
de la maladie.
L’utilisation de glomérules isolés de rats, incubés dans du surnageant de PBMC issus
de patients SNLGM, à permis la mise en évidence d’une altération de l’électronégativité de la
MBG mesurée par l’incorporation de [35S]O4 au niveau des sites heparans-sulfate
131
. Ces
51
anomalies seraient secondaires à la présence d’une lymphokine d’un poids moléculaire de
29kD, isolée dans les mêmes surnageants 132 et structurellement très proche de l’IL8 133.
La perméabilité de la barrière de filtration glomérulaire a également été étudié sur des
glomérules isolés mesure des variations du volume glomérulaire après choc oncotique
134
.
Ces techniques ont permis l’isolement d’un facteur, partiellement purifié, d’un poids
moléculaire de 30-50kD 128 et dont l’activité est inhibée par la ciclosporine A 135.
Jusqu’à présent, aucun des nombreux travaux réalisés n’a permis l’isolement et la
caractérisation moléculaire d’un facteur de perméabilité pouvant rendre compte du
syndrome néphrotique observé chez l’ensemble des patients atteints de SNLGM/HSF.
I – Autres particularités : le Système HLA
Une
augmentation
de
la
fréquence
de
certains
antigènes
d’histocompatibilité (HLA) a été décrite chez les patients SNLGM.
leucocytaires
Elle concerne une
association entre les antigènes HLA-B8 et B44 136, HLA-DR13 137, DR8 138 et surtout DR7 en
particulier dans les formes corticosensibles de l’enfant
139 140
. L’ag HLA-B12 est lui
augmenté chez les patients SNLGM présentant un terrain allergique 136 .
Les antigènes associés aux molécules HLA de classe I sont reconnus par les
lymphocytes CD8+ cytotoxiques alors que ceux associés aux molécules HLA de classe II le
sont par les lymphocytes T helper CD4+. La spécificité de la réponse immune liée aux
cellules T dépend donc de la nature du stimuli antigénique mais également des molécules
52
HLA du soi. L’existence d’une activation lymphocytaire T spécifique après stimulation par
des agents peptidiques communs (viraux, allergènes) pourrait être liée à ces molécules HLA.
53
IV Les stratégies d’étude du SNI : synthèses et perspectives
A-Approche immunologique
Comme nous l’avons vu précédemment, la plupart des travaux immunologiques
concluent à une implication des lymphocytes T dans la pathogenèse de la maladie. Si
certaines anomalies de l’immunité cellulaire ont été bien caractérisées, l’identification précise
de la ou des sous-populations lymphocytaires T impliqués ainsi que les voies d’activation
spécifiquement recrutées au cours des poussées de la maladie sont encore imparfaitement
connues.
De nombreux arguments cliniques et expérimentaux suggèrent que les anomalies
observées dans la maladie sont secondaires à une réponse immune anormale à des stimuli les
plus souvent exogènes. Dans ce contexte, les stratégies visant à analyser directement la
réponse immune au cours des phases actives de la maladie, semblent les plus prometteuses.
B-Transfert d’activité protéinurique.
Nous l’avons vu précédemment, l’ensemble des travaux ayant pour but l’identification
d’un facteur de perméabilité par l’isolement et le transfert à l’animal d’une activité
protéinurique, a conduit à l’identification d’une multitude de facteurs dont aucun n’a pu être
caractérisé ni rendre compte des anomalies observées chez l’ensemble des patients atteints de
SNLGM. Une synthèse de l’ensemble des résultats disponibles suggère l’implication d’un
facteur de petite taille (<100kD), thermosensible et de structure proche d’une lymphokine.
Les derniers travaux de cette nature, utilisant le plasma de patients atteints de SNI ayant
54
récidivé après transplantation rénale, ont abouti à l’isolement d’une fraction dont l’analyse a
montré qu’il s’agissait de l’orosomucoide, une molécule de maintien de la sélectivité
glomérulaire mais sans aucune spécificité d’action dans le SNI 141. Les auteurs concluent sur
la non-fiabilité de ces modèles dans l’identification du facteur protéinurique.
C-Les approches génétiques
Des études génétiques récentes des formes familiales de SNI ou de modèles
d’animaux génétiquement modifiés, ont conduit à l’identification de nouvelles protéines du
podocytes et ont permis une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques
de la filtration glomérulaire. Le clonage positionnel a ainsi permis l’identification des gènes
codant pour l’ACTN4 (alpha actinine 4), la néphrine et la podocine, toutes impliquées dans
des formes familiales de syndromes néphrotiques cortico-résistants. Bien que le SNLGM soit
une maladie sporadique impliquant des désordres immunitaires, la présence de facteurs
génétiques ne doit pas être totalement négligée. En effet, des formes familiales de SNLGM
sensibles aux traitements immunosuppresseurs ont été décrites
142
et pourraient permettre, si
leur nombre et leurs informativité génétique l’autorisaient, le clonage d’autres gènes
potentiellement relevant dans les formes sporadiques de la maladie. D’autre part, des
mutations dans le gène NPHS2 (codant pour la podocine) ont été identifiées chez des patients
atteints de formes sporadiques de SNI corticoresistants
143
. La possibilité d’une affection
“ bipolaire ”, associant une activation lymphocytaire T secondaire à un stimulus exogène à
facteurs de prédisposition génétique (protéines podocytaires, système HLA…) ne peut doncêtre totalement exclue.
55
D-Modèle animal
La présence d’un modèle animal adéquat faciliterait grandement l’étude de la maladie.
Le rat Buffalo/Mna est un modèle spontané de syndrome néphrotique présentant des lésions
histologiques rénales de types HSF, associé à un thymome et une myasthenie
144
. Il a été
récemment démontré que la maladie rénale initiale récidivait, après transplantation rénale
d’un rein sain à ces animaux, alors que la protéinurie disparaissait quand le rein Buffalo/Mna
est transplanté chez un receveur sain 145. La proximité de ces résultats expérimentaux avec la
clinique humaine fait de ce modèle un outil précieux pour la compréhension des désordres
immunitaires T impliqués dans le SNLGM. De plus, si la pathologie animale fait clairement
intervenir des processus immuns (association au thymome et à la myasténie, récidive après
transplantation, sensibilité de la néphropathie à certains immunosuppresseurs (Leberre,
soumis), une composante génétique a également été identifiée. En effet, une analyse de
ségrégation a permis la localisation d’un gène candidat, le gène Pur1 localisé sur le
chromosome 13, correspondant chez l’homme au locus ou le gène NPHS2 a été identifié
146
.
La coexistence d’évènements immuns et génétique dans ce modèle animal, renforce
l’hypothèse émise précédemment chez l’homme.
E Rationnel d’une étude de la réponse immune par des stratégies d’expression
différentielle
Les méthodes d’analyse de l’expression des gènes, dans des conditions
physiologiques ou pathologiques, se sont particulièrement développées au cours des dix
56
dernières années. L’expression des gènes, dans un type cellulaire particulier, à un stade de
développement donné, ou dans une situation clinique bien caractérisée, peut désormais être
analysée à grande échelle par les différentes techniques d’analyse de l’expression
différentielle des ARN messagers (transcriptome) et des protéines (protéome). Ces approches
concernent des entités moléculaires certes liées dans le fonctionnement cellulaire (ARN et
protéines), mais possédant des propriétés physico-chimiques totalement différentes, des
durées de vie non corrélées et jouant des rôles physiologiques tout à fait distincts. Les
supports technologiques et méthodologiques à la base de ces deux approches, sont également
très différents.
1) Expression différentielle des transcripts
Pour sélectionner les ARN spécifiquement régulés dans une pathologie, une situation
clinique, un stade de développement tissulaire ou cellulaire, différentes stratégies peuvent être
utilisées : i) le tri différentiel d’une génothèque ; ii) le mRNA Differential Display ; iii) des
protocoles de soustraction, tel le cDNA-RDA (Representational Difference Analysis) 147 et la
PCR suppressive 148. La plupart de ces technologies nécessitent la transformation des ARN en
ADNc (ADN complémentaires)
-Dans le tri différentiel, deux répliques de la banque (génothèque ou banque d’ADNc)
sont hybridées avec des sondes ADN simples brins marquées correspondant aux deux
situations que l’on veut comparer. La différence d’intensité des signaux d’hybridation
observée pour un clone donné, indique qu’il correspond à ARNm exprimé de manière
différentielle.
57
-Dans le mRNA Differential display, les ARN sont transformés en ADNc et amplifiés
par PCR. Les produits de PCR sont séparés sur un gel d’acrylamide et la comparaison de
l’intensité des bandes obtenues dans les différentes situations analysées, permet d’identifier
les ARNm régulés.
-Dans les techniques de soustraction, la population d’ARNm contenant les transcripts
spécifiques est épuisée par hybridation avec un excès d’ARNm ne contenant pas ces
transcrits. Différents protocoles permettent ensuite de séparer les séquences spécifiques de
l’ARN “ entraîneur ”. La technique d’hybridation soustractive dites « PCR suppressive » sera
largement détaillée dans le chapitre « Méthodologie ».
L’obtention de banques d’ADNc organisées permet la réalisation de filtres ou plaques
à haute densité. Ces membranes (ou plaques) sont ensuite hybridées avec sondes
différentielles permettant d’établir un profil d’hybridation pour chacun des clones. Ces
sondes sont constituées alternativement d’oligonucléotides préalablement synthétisés ou
synthétisés in situ (Affymetrix). Le développement de la miniaturisation de ces différentes
technologies, permet le dépôt de milliers de séquences sur des membranes de quelques cm2 .
Ce sont les “ microarrays et macroarrays ” et les puces ADN ou “ DNA chips ”.
2) Expression différentielle des protéines.
L’analyse protéomique a pour objet d‘étudier le contenu en protéines d’un organisme à
un instant et dans un environnement donné et de comparer plusieurs états.
58
L’étape initiale consiste à séparer les protéines contenues dans l’échantillon
biologique étudié par électrophorèse mono ou bidimensionnelle, en gel ou en capillaire, ou
par chromatographie. La deuxième étape consiste à établir une carte protéique d’une situation
ou d’un tissu donné, en comparant les différences qualitatives et quantitatives des protéines
entre deux échantillons. La troisième étape est l’identification et la caractérisation des
protéines, le plus souvent réalisée grâce à la spectrométrie de masse.
3) Application des stratégies d’expression différentielle au SNLGM
Les techniques d’expression différentielle des ARN et des protéines permettent d’une
part d’identifier et de caractériser des transcrits et des protéines spécifiquement régulées dans
une situation donnée, et d’autre part d’établir une véritable signature de cette situation par
l’établissement d’un profil spécifique d’expression. Cette approche nous est apparue
particulièrement adaptée à l’étude de la pathogenèse du SNLGM pour deux raisons :
i) la nature des situations cliniques est généralement bien caractérisée grâce à la présence
ou la disparition du syndrome néphrotique au cours des différentes phases de la maladie:
poussée et rémission inaugurale, sensibilité aux traitements immunosuppresseurs, récidive ou
non de la maladie après transplantation rénale. Cet élément permet une comparaison
rigoureuse de l’expression différentielle des ARNm et des protéines, à condition de prendre
en compte les modifications induites par la fuite protéique (nécessité d’utiliser des situations
cliniques contrôles) ;
ii) l’ensemble des données cliniques et expérimentales permettent de supposer que les
évènements à l’origine du syndrome néphrotique se situent dans les cellules mononucléées
59
des patients, qui produisent secondairement un facteur circulant dans le sérum des malades.
L’étude d’expression différentielle peut donc être réalisée en comparant : i) différentes
populations d’ARNm extraits des PBMC des patients en poussée et en rémission de la
maladie ; ii) l’expression des protéines dans le sérum des malades ou les éluats
d’immunoadsorption réalisés chez les patients présentant ou non une récidive de la maladie
après greffe.
L’utilisation de ces stratégies dans le SNLGM répond à plusieurs objectifs : analyser la nature
de la réponse immune au cours des phases actives de la maladie par l’étude des gènes et des
protéines surexprimés et d’autre part, déterminer des marqueurs de la maladie, en particulier
prédictifs du risque de récidive de la maladie. La méthodologie utilisée pour l’étude de
l’expression différentielle des transcrits a consisté à construire et cribler une banque
soustraite de cDNA réalisée à partir des PBMC prélevés chez un patient en poussée et en
rémission de la maladie. Nous en présenterons les résultats et leurs interprétations ainsi que
les conséquences obtenues par l’analyse d’un gène inconnu dérégulé au cours de la maladie.
Nous présenterons également nos résultats préliminaires concernant l’analyse protéomique du
sérum des patients ayant présenté ou non une récidive de la maladie après transplantation par
la technologie des ProteinChip® Arrays 149.
60
METHODOLOGIE
61
I- Les patients
Les travaux expérimentaux présentés dans cette thèse ont pu être réalisés grâce aux
prélèvements sanguins obtenus chez les patients après obtention de leur consentement éclairé
ou celui des parents pour les individus mineurs. (Annexe 1). Ils proviennent des centres de
néphrologie pédiatrique et adulte d’Ile de France suivants :
-Néphrologie pédiatrique : Hôpital Trousseau (Pr Bensman), Hôpital Necker (Pr
Niaudet) Hôpital Robert Debré (Pr Loirat).
-Néphrologie adulte : Hôpital Henri Mondor (Pr Lang) Hôpital Necker (Pr Grunfeld)
Hôpital Tenon (Pr Ronco).
Ces prélèvements ont été réalisés sur une cohorte d’enfants et d’adultes atteints de
SNLGM et chez des patients adultes ayant présentés une récidive du syndrome néphrotique
après transplantation rénale. Chez les enfants, le diagnostic de SNLGM a été retenu dans tous
les cas selon les critères de “ l’International Study of Kidney Diseases in Children ”.35 Chez
les adultes, le diagnostic de MCNS était confirmé dans tous les cas par la réalisation d’une
biopsie rénale. Les caractéristiques cliniques des patients sont résumées dans le tableau 3. Au
moment du diagnostic clinique de SNLGM, tous les patients présentaient un syndrome
néphrotique pur défini par la présence d’une protéinurie>3 g/24h (40 mg/kg/24 h chez
l’enfant) associé à une hypoalbuminémie <30 g/l. Tous les prélèvements en poussée
inaugurale ou en rechute de la maladie ont été réalisés en l’absence de traitement par les
corticostéroïdes ou les immunosuppresseurs. Le diagnostic de récidive de la maladie sur le
greffon reposait sur l’apparition d’une protéinurie survenant au cours de la première année
62
suivant la transplantation chez un patient dont la maladie initiale était un SNI
(SNLGM/HSF), associée à une histologie rénale évocatrice de récidive (microscopie optique
normale, prolifération segmentaire des cellules épithéliales, épaississement de la matrice
mésangiale).
Tableau 3 : Caractéristiques cliniques des patients SNLGM et des contrôles étudiés au
cours de la thèse.
Adulte
Enfants
récidive du SNI récidive
avec
normaux
post-greffe
GEM
Enfant
Adultes
Adultes avec
avec
avec
SNLGM
SNLGM
Adulte sans
du SNI
Adultes normaux
post-greffe
Nombre de
45
16
8
5
12
25
16
9,7
31
25
22
39,6 (28- 11,4
24,4
(3-17)
(19-50)
(11-42)
(13-38)
52)
(9-17)
(23-27)
13/17
10/6
6/2
3/2
3/2
3/2
4/1
8 (3-12)
12(4-15)
-
-
6 (5-15)
-
-
ND
ND
50 (47-
ND
ND
ND
ND
patients
Age
(années)
Sexe
(HommeFemme)
Protéinurie
(g-jour)
Protidémie
(N:65-78 g/l)
CRP
43 (39-53) 46 (38-54)
56)
20 (15-30) <15
ND
ND
<15
ND : Non déterminé CRP : Serum Reactive Protein (Marqueur de l’inflamation)
63
Les prélèvements en rémission ont été réalisés en période de quiescence clinique,
définie par une protéinurie < 0,2g/24h, en dehors de tout traitement par stéroïdes ou
immunosuppresseurs à l’exception de 6 patients sous glucocorticoïdes (<15mg/24h) au
moment du prélèvement. Les prélèvements contrôles ont été réalisés chez des sujets sains,
appariés selon l’age et chez des sujets présentant un syndrome néphrotique définit par la
présence d’une protéinurie >3 g/24h secondaire à une glomérulopathie extra membraneuse
(GEM) primitive prouvée histologiquement. Ce dernier contrôle nous a paru essentiel pour
éliminer les transcrits ou les protéines dérégulés en raison de l’état néphrotique non
spécifique. Pour les récidives post-greffes, les contrôles sont constitués par des patients
transplantés pour un SNI depuis au moins un an et n’ayant pas présenté de récidive de la
maladie au moment du prélèvement
Ce protocole a reçu l’avis favorable du comité d’éthique (CCPPRB).
Les cellules sélectionnées pour la construction de la banque soustraite ont été
prélevées chez un patient de 24 ans adressé par son médecin traitant pour une poussée
inaugurale SNLGM. Aucune anomalie clinique n’etait retrouvée en dehors des oedèmes. La
protéinurie des 24 heures était de 30 g, faite de plus de 80% d’albumine. La recherche des
autoanticorps de la série lupique, de cryoglobuline, d’anomalie du complément était négative.
Les sérologies pour l’EBV, la maladie de Lyme, les hépatites B et C, la yersiniose étaient
négatives, à l’exception d’une infection ancienne à CMV. L’examen histologique rénal
montrait sur 25 glomérules présents, l’absence de prolifération mésangiale, d’infiltration
cellulaire, de hyalinose segmentaire et focale ainsi que l’absence de marquage fluorescent
pour les immunoglobulines A, M, G, pour le complément ou le fibrinogène. Le patient a été
traité avec 70 mg/jour de prednisone pendant six semaines puis la dose a progressivement été
réduite. La rémission complète a été obtenue dix jours après le début du traitement. Les
64
prélèvements sanguins ont été réalisés en phase néphrotique avant la mise en route du
traitement, et quatre mois après la rémission, en l’absence de corticostéroïdes.
II- Construction d’une banque soustraite d’ADNc
Cette stratégie a pour objectif l’identification des transcrits spécifiquement dérégulés
au cours des poussées de SNLGM. Elle a été réalisée à partir d’un prélèvement de sang
périphérique (PBMC) réalisé chez un même patient en phase de poussée et de rémission de la
maladie (cf. supra). Plusieurs étapes sont nécessaires à la construction et au criblage de la
banque (Figure 9)
a-Construction d’une population d’ADNc soustraits:
Les cellules mononucléées périphériques ont été isolées sans stimulation exogène.
L’ARN total est extrait par la méthode au thiocyanate de guanidium couplée à une
ultracentrifugation sur un coussin de chlorure de césium. L’ARN poly (A) est purifié à l’aide
du kit oligotex mRNA (Qiagen). La synthèse des cDNAs provenant de cellules prélevées en
phase de poussée ("P") versus rémission ("R") est accomplie avec la reverse transcriptase SII
(Gibco BRL). L’hybridation soustractive est accomplie avec le kit PCR-select cDNa
subtraction (Clontech) essentellement comme décrit par
148
excepté que le rapport "R"/"P"
utilisé lors de la première étape de soustraction est de 60 et que le nombre de cycles PCR a
été réduit à 24. La construction de populations d’ADNc qui ont été soustraits de manière
reverse (R-P) a été réalisée selon une stratégie similaire.
65
Figure 9 : Stratégie utilisée pour identifier les gènes surexprimés et /ou induits
dans la néphrose lipoïdique (clonage soustractif et différetiel)
b-Clonage des cDNAs soustraits dans le plasmid bluescript SK (-): Un aliquot de six
de cDNA soustraits (P-R) a été traité avec 4
l de Proteinase K (20 mg/ml) dans 50
g
l à 45°,
66
1 heure, ensuite extrait au phenol-chloroforme et alcool isoamylique (25:24:1) et précipité.
L’ADNc est resuspendu dans 16
l d’eau et les extrémités sont rendues franches avec 30 UI
de DNA polymerase I pendant 60 min, les nucléotides triphosphates sont ajoutés trente min
après le début de la réaction. Cinq
g de cDNA double brins à bout francs sont ligués à 5
d’adaptateurs Xho 1-Not 1 (500 pmol) (stratagene) dans 35
g
l contenant 400 UI de DNA
ligase (1 l), pendant 24 heures à 16°C. Ensuite, l’ADNc est précipité, resuspendu dans l’eau
et digéré par Not 1 pendant 3 heures à 37°C dans 50
l. L’ADNc est purifié par filtration sur
gel sur une colonne de sephacryl 400 (Pharmacia). Les fractions de 30
l sont collectées et
précipitées la nuit à -20°C, avec 1/10 de volume d’acetate de sodium 3M pH 5.2 et 2.5
volume d’ethanol. Parallèlement, 2
g de plasmide Bluescript SK(-) (stratagene) sont digérés
avec 20 UI de Not1 puis purifié sur Qiaex II (Qiagen SA). L'
ADNc (150 ng) est ligué au
vecteur (100 ng) dans 20
l de réaction contenant 4 unités de T4 ADN ligase (Gibco BRL).
La transformation est réalisée par choc thermique à 42°C pendant 50 sec, avec 100
l de
cellules supercompetentes E. coli XL-1 blue (Stratagene) et 1/10 du produit de ligation. Le
titre de la banque est déterminé selon les protocoles habituels (Maniatis).
c-Criblage differentiel de la banque: environ 15 000 clones ont été étalés sur des filtres de
nitrocellulose puis chacun est répliqué en 2 exemplaires tandis que l’original est conservé à 20°C. L’un des exemplaires est hybridé avec les sondes soustraites "P-R" (pousséerémission) tandis que l’autre est hybridé avec les sondes soustraites "R-P". Pour éliminer les
clones dérégulés en raison de l’état néphrotique les filtres ont également été hybridés avec
une sonde provenant d’ARNm d’un patient atteint de GEM
d-Préparation de sondes soustraites : 2
g d'
ADNc double brins amplifiés par PCR sont
digérés par la protéinase K, purifiés et incubés avec 20 unités de l’enzyme de restriction
67
RSA1 (BioLabs) à 37°, 90 mn dans 50
l. Ensuite, 20 unités de Sma1 sont ajoutées et la
réaction est poursuivie pendant 90 mn, à temperature ambiante. L’ADNc est précipité dans
l’acétate d’ammonium (2 M final), resuspendu dans l'
eau et digéré encore avec 20 unités de
l’enzyme de restriction Eag-1, dans 20
chroma spin-100 dans 40
l, pendant 60 min. L'
ADNc est purifié sur une
l. Quatre-vingt ng des ARN "P" et "R" sont marqués avec 5
l de
32 P dCTP (3000 Ci/mmol). Chaque exemplaire est incubé avec une sonde soustraite (2 106
cpm/ml solution hybridation) à 72°pendant 16 heures, puis lavé 4 fois dans du 2x SSC
(Standard Sodium Citrate, 0,15Mm NaCl, 0,0156 m citrate tri-sodique) /0,5% SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate) et deux fois dans du 0,2x SSC/0,5% SDS à 68°.
e-Selection des clones d’intérêt : Les clones ayant donné après hybridation avec la sonde
“ P ”, un signal spécifique et aucun signal avec la sonde “ R ” ou la sonde provenant d’un
patient atteint de GEM, correspondent aux ADNc surexprimés spécifiquement au cours des
poussées de la maladie (Figure 10) Ces clones sont sélectionnés pour le séquençage, après
vérification du signal en Dot-blot.
68
Figure 10 : Sélection des clones d’intérêt (isolement des clones surexprimés ↓
ou
sousexprimés ↓ au cours des poussées )
GEM : Glomérulopathie extramembraneuse.
f-Analyse des ARN par Dot-blot : 2
g d'
ARN total denaturé, extrait de cellules
mononucléées périphériques prélevées durant les phases de poussée et de rémission sont
déposés sur une membrane hybond-N+ (Amersham) à l'
aide d'
un appareil de dot-blot
(Bioblock). Après fixation de l'
ARN, les bandes de membrane contenant chacune un
échantillon d'
ARN correspondant aux poussées et aux rémissions sont coupées avec un rasoir
et préhybridées dans du 5x SSPE (Sodium Salt Phosphate EDTA) /50% formamide/2x
Denhard'
s (5g de Ficoll, 5g de polyvinylpyrrolidone, 5g de d’abumine bovine)
/0.5%SDS/100 g/ml d'
ADN de saumon. Les sondes générées à partir de clones sélectionnés
sont ajoutées à 2 106 cpm/ml et hybridés 12 heures à 42°C. Les membranes sont ensuite
69
sucessivement lavées dans du 2XSSC/0,5% SDS (4 x 30 min) puis du 0,1X SSC/0,5% SDS
(2 x 30min) et exposées au phosphoimager.
f-Sequençage:
Les plasmides recombinants double-brins sont préparés à l'
aide du kit
purification Qiagen (Qiagen S.A.) et séquencés aux deux extrémités en utilisant les primers
fluorescents direct et reverse selon la méthode de Sanger. Les concentrations des plasmides
sont ajustées à 300 ng/ l. Les réactions de sequençage sont accomplies dans l'
appareil PCR
9600 (Perkin-Elmer cetus). Les produits de la réaction sont analysés sur un séquenceur
automatique 373A (Applied biosystem).
III-Analyse des séquences
L'
analyse des séquences est établie à l'
aide des bases de données disponibles :
GenBank (base de données du National Center for Biotechnology, NCBI)
150
, EMBL
(European Molecular Biology Laboratory) 151 et DDBJ (DNA Databank of Japan). Ces bases
de données contiennent les résultats des séquences nucléiques et protéiques. En outre, depuis
l’essor des projets de séquences partielles d’ADNc, le NCBI possède une base de données
(dbEST) spécifiquement consacrée aux EST (Expressed Sequence Tag), annotée (tissu
d’origine, nature de la banque d’ADNc, sens du clonage…) et périodiquement comparées
avec l’ensemble des séquences présentes dans les autres bases de données. La comparaison
des séquences nucléiques obtenues dans la banque soustraite a été effectuée grâce à
l’utilisation du programme “ Basic Local Alignnent Search Tool ” (BLAST)152 et plus
particulièrement :
70
Blastn compare une séquence nucléique aux bases de données nucléiques et permet la
localisation de la séquence sur le génome et l’identification des ARNm et des EST similaires
et identiques.
blastx compare une séquence nucléique traduite dans les six phases de lecture aux bases de
données protéiques
tblastx compare une séquence nucléique traduite dans les six phases avec les séquences des
bases de données nucléiques traduites dans les six phases.
Au terme de ces analyses, les séquences ont été réparties en trois groupes: les clones
correspondant à des gènes connus, dont la fonction est déterminée, les clones correspondant à
des gènes connus dont la fonction est inconnue et les clones correspondant à des gènes
inconnus (article 2).
IV-Caractérisation des clones inconnus
Certains clones inconnus ont fait l’objet d’un clonage du cDNA complet. En effet,
l'
efficacité de la soustraction étant inversement proportionnelle à la taille des ADNc, nous
avons privilégié la stratégie décrite en II-b pour la construction de la banque soustraite, mais
les clones d'
intérêt qui ont été isolés sont des fragments compris entre 400 et 700 bp. Ils ont
donc été utilisés comme sondes pour cloner les ADNc complets à partir d'
une banque
construite avec le même ARN qui a servi à la soustraction. Un
g d'
ARN poly(A) (isolé à
partir de cellules ayant été prélevées en phase de poussée) a été transcrit en ADNc comme
précédemment, exceptée que le premier brin a été synthétisé en présence de deux
oligonucléotides commercialisés par Clontech (cDNA library construction kit). Plusieurs
modifications sont introduites au protocole. Après amplification par PCR, 5
g d'
ADNc
71
double brin sont rendus à bouts francs avec l'
ADN polymerase I (fragment large de Klenow)
puis, après purification, ligués avec 500 pmol d'
adaptateurs "EcorI-NotI-SalI", pendant 24
heures à 14°C. Les fragments inférieurs à 0,5 kb sont éliminés par filtration sur une colonne
de séphacryl 400 (Pharmacia). Soixante dix ng de bluescript SK(-), prédigérés par EcoRI et
déphosphorylés, sont incubés avec 200 ng d'
ADNc (> 0,5 kb), dans 10
l de réaction pendant
20 heures à 16°C. Le titre de la banque est déterminé comme précédemment. Environ deux
millions de clones sont criblés avec les sondes marquées au [32P] correspondant aux clones
d'
intérêt. Les filtres sont traités de manière analogue et exposés à -70°C. Les colonies
positives sont purifiées en deux étapes de repiquage puis les plasmides sont purifiés sur des
colonnes de Qiagen et séquencés. La distribution de l'
expression de chaque clone d'
intérêt
dans les différents organes et tissus est étudiée par Northern-blot sur des membranes
précommercialisées (Clontech).
V Expression des transcrit et des protéines au cours du SNLGM.
Les méthodes utilisées pour l’analyse des différents clones (RT-PCR semi
quantitative, Northern blot, Western Blot, Etude immunocytochimique, expérience de retard
sur gel) de même que la nature des primers, des sondes et des anticorps utilisés, sont détaillés
dans les chapitres « Materials and Methods » au sein des différents articles. Les études
d’expression des différents clones ont été réalisées sur notre cohorte de patients SNLGM. Les
contrôles sont issus de l’expression des clones chez des individus normaux appariés et chez
des patients atteints de GEM.
72
VI- Etude fonctionnelle des protéines c-mip/Tcmip.
L’étude fonctionnelle des protéines c-mip/Tcmip à été réalisée selon deux approches
1) Surexpression de la protéine dans une lignée lymphocytaire de type Jurkat
Les séquences codantes de c-mip et de Tc-mip ont été sous-clonées dans un vecteur
d’expression plasmidique (pcDNA3.1/V5-His TOPO) et transfectées par électroporation dans
une lignée lymphocytaire T n’exprimant peu ou pas la protéine (lignée Jurkat). Les
phénotypes lymphocytaires des cellules transfectées avec chacune des séquences codantes ont
été étudiés par RT-PCR semi quantitative, Western blot, immunocytochimie, expérience de
retard sur gel et étude de l’expression de gènes rapporteurs (cf. article 3)
2) Recherche du partenaire de la protéine c-mip /Tc-mip par la technique du double hybride
Le système utilisé pour identifier le partenaire de c-mip est le système de double
hybride Matchmaker LexA 153. Le principe est de révéler une interaction dans un système de
levure entre d’une part la protéine appât (c-mip) fusionné à la protéine LEX A (un répresseur
des gènes SOS dans E Coli) qui constituera le domaine de liaison à l’ADN et d’autre part une
protéine « proie » issue d’une banque fusionnée à une protéine d’E Coli (B42) qui constitue
le domaine activateur de la transcription chez la levure (Figure 11). Cette construction
hybride douée d’activité trancriptionelle, active un gène rapporteur (Lac Z) situés en aval
d’opérateurs LEX A, détectable phénotypiquement (coloration bleu des colonies sur le milieu
de culture contenant le substrat chromogenic X-gal). L’interaction ayant induit l’activation du
gène rapporteur, permet d’isoler le partenaire protéine de la protéine appât (c-mip)
73
Figure 11 : Principe du système de double-hybride LexA
Dans un premier temps, la séquence codante complète de c-mip a été sous clonée dans le
vecteur pLexA. Parallèlement est effectué le sous clonage des protéines issues d’une banque
de lymphoblastes humain (CEMC7-RP) dans le vecteur Pb42AD qui comporte le promoteur
du gène GAL1. Les deux vecteurs (100
g de chaque plasmides) sont ensuite cotransformés
dans la levure (PEG/LiAc, Hybrigenics). Les levures ont été préalablement transformées avec
le vecteur (p80p-lacZ) qui comporte huit copies de l’opérateur LexA en amont du gène LacZ.
Les ratios entre nombres de cellules et la quantité de plasmides (1,5ml de cellules
compétentes pour 50
g de plasmides) sont calculés de manière à obtenir 1x104 cfu/ g soit
106 colonies. Le produit des transformations est ensuite étalé sur milieu X-gal. Les colonies
positives (colorées en bleu) sont isolées et les clones correspondants sont ensuite séquencés
selon la méthode utilisée dans les banques soustraites.
74
VII Expession des SR protéines dans le SNLGM
L’étude de l’expression des protéines de type SR a été réalisée par RT-PCR semiquantitative à l’aide de primers spécifiques des SRp40 et SRp75 et par Western blot, à l’aide
d’un anticorps monoclonal de type IgM provenant d’un plasmocytome de souris (ATCC). Cet
anticorps (Mab104) reconnaît un domaine phosphorylé conservé chez l’ensemble des
protéines de la famille SR et permet donc d’étudier simultanément le profil d’expression de la
plupart des protéines SR (cf. article 5)
VIII- Analyse protéomique du sérum des patients présentant une récidive du SNI après
transplantation rénale . (Collaboration avec la société Ciphergen)
L’expression des protéines dans le sérum des patients ayant secondairement présentés
une récidive du SNI après transplantation rénale a été comparée à celle des patients n’ayant
pas présentés de récidive un an après la transplantation, par une technique de protéine-ship
Array 149. Les prélèvements ont été réalisés le jour de la transplantation (JO) chez des patients
présentant une insuffisance rénale chronique secondaire au SNI, en l’absence de tout
traitement immunosupresseur. Cette technique permet l’analyse rapide d’échantillons
biologiques, par rétention sélective des molécules biologiques sur des surfaces chimiquement
actives, suivie d’une détection en spectrométrie de masse (SELDI-TOF-MS).
Dans un premier temps, les échantillons contenants 20
l de sérum à la concentration en
protéines de 1 g/ l sont mélangés en volumes égaux aux tampons de liaisons spécifiques et
ont été déposés sur des barrettes définies par leurs affinités physico-chimiques sélectives
(Tableau 4)
75
Les protéines non retenues sont éliminées par 5 lavages successifs dans un tampon
AcNa 50mM pH 4.5, Triton X-100 dans du PBS 10X. Les barrettes sont ensuite rincées en
1mM HEPES (pH 4.5) pendant 30 s et séchées avant d’être saturées avec une solution d’acide
3,5-dimethoxy-4hydroxyciannic (SPA) dans une solution d’acétonitrile 50% et d’acide
trifluoroacétique 0,5%. Les échantillons sont ensuite analysés dans le lecteur “ Ciphergen
Protein ” (modèle PBSII). Dans un premier temps l’analyse par SELDI-TOF-MS réalise la
désorption entre les protéines et leurs surfaces d’affinité par un laser nitrogène (337nm) .
L’analyse en spectrométrie de masse est réalisée par environ 80 tirs au laser avec une
intensité de 220-240 (Unités arbitraires). Les résultats (expression différentielle des protéines
dans le groupe avec et sans récidive) sont ensuite analysés par le logiciel
“ CiphergenExpressTM Biomarker System ”.
Tableau 4 : Materiel utilisé pour l’analyse protéomique des sérums des patients avec et
sans récidive de SNI.
♠ Concentration intiale des sérums utilisés
Récidive (R)
Non récidive (NR)
R1 : 63 mg/ml
R2 : 35 mg/ml
R3 : 85 mg/ml
R4 : 55 mg/ml
NR1: 70 mg/ml
NR2 : 64 mg/ml
NR4 : 70 mg/ml
NR4 : 73 mg/ml
♠ Support utilisés :
Echangeur de cation (WCX2), pH 4.5, 6.0, 7.0
Echangeur d’anion (SAX2), pH 7.0, 8.0, 9.5
Capture par affinité métallique (IMMAC3), Ni, Zn, Mn, Ca
Phase réverse (H4), ACN 5%
Au Total : 8 échantillons ont été analysés dans 11 conditions expérimentales soit 88 analyses
76
PREMIERE PARTIE
Construction et criblage d’une banque soustraite d’ADNc
entre poussée et rémission de SNLGM
77
Article 2
Les poussées de SNLGM sont associées à un état d’activation d’origine immune.
L’étude des gènes surexprimés et/ou induits dans les cellules mononuclées du sang
périphérique (PBMC) des patients en poussée de SNLGM peut permettre d’identifier les
voies de signalisations recrutées, et leurs effecteurs potentiels.
Parmi les techniques permettant d’identifier les transcrits diférentiellement exprimés,
la construction et le criblage d’une banque d’ADNc par la technique dite « d’hybridation
soustractive »148 est particulièrement sensible et, permet grâce aux procédés d’enrichissement
en ARN, d’isoler des transcrits faiblement représentés dans une cellule et/ ou des transcrits
inconnus 154. Un certain nombre de gènes impliqués dans la signalisation lymphocytaire T ont
ainsi pu être mis en évidence par cette méthode 155 156.
Nous décrivons dans l’article 2 la méthodologie et les résultats obtenus par la construction et
le criblage d’une banque d’ADNc provenant des ARNm des PBMC d’un patient en poussée
et en rémission de SNLGM.
78
Notre stratégie de clonage soustractif et différentiel nous a permis d’isoler 84
transcrits dont 42 correspondent à des gènes de fonction connue, 12 à des gènes
précédemment identifiés mais dont la fonction est inconnue, et 30 sont des transcrits
totalement inconnus.
L’analyse des gènes connus a permis de mettre en évidence la présence d’une régulation
différentielle (poussée versus rémission) de l’expression de certains transcrits au cours de la
maladie, impliqués notamment dans l’activation lymphocytaire T, la transduction de signaux,
la division cellulaire, et l’activation transcriptionelle.
-Dix huit transcrits sont impliqués dans les voies de signalisation recrutées lors de
l’activation du complexe récepteur T. En particulier, le niveau d’expression de Fyb/Slap,
Grancalcine et de la l-plastine, trois protéines impliquées dans la réorganisation du
cytosquelette et la redistribution des intégrines dans le lymphocyte T, est élevé au cours des
poussées et diminué en phase de rémission.
-La sur-expression du facteur de transcription c-maf et l’absence d’expression de la
chaîne
2 du récepteur de l’IL12 (IL-12Rβ2), un marqueur de la différentiation Th1 des
lymphocytes Cd4+, renforcent l’hypothèse d’une assignation du SNLGM à une affection de
type Th2.
-D’autres gènes connus sont des composants de la voie NF B, ou sont impliqués dans
la régulation de cette voie, qui contrôle la transcription de nombreuses cytokines. Il s’agit de
gènes codant pour l’IL-1β, Rantes, p38 Map kinase, Traf6, Macropain (sous-unité α2 du
79
protéasome). Ces données confirment d’une manière radicalement différente, le recrutement
de cette voie de signalisation au cours de l’activation des lymphocytes T dans la maladie (cf.
intro).
Cette approche méthodologique constitue un support scientifique direct aux
nombreuses observations cliniques suggérant que le lymphocyte T est un acteur essentiel de
la maladie. Bien qu’elle ne permette pas l’analyse des évènements situés en amont de
l’activation lymphocytaire, elle permet une première description moléculaire des voies
d’activation recrutées au cours de la maladie. L’utilisation, lors du criblage de la banque
soustraite, de sondes provenant de patients atteints de GEM permet de contrôler la spécificité
de l’expression différentielle de certains transcripts en évitant les biais induits par l’état
néphrotique. Enfin cette technique, contrairement à d’autres méthodes d’analyse d’expression
différentielle (Micro et macroarrays, SAGE) permet d’isoler de nombreux transcrits
correspondants à des gènes de structure et/ou de fonction inconnues. La suite de cette thèse
est consacrée à l’étude des clones inconnus. L’analyse de ces clones a pour objectif de
complèter l’analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation des
lymphocytes au cours de la maladie et d’isoler les facteurs d’origine lymphocytaire
potentiellement impliqués dans la survenue de la protéinurie. Dans un premier temps, nous
présentons les résultats de l’analyse structurelle et fonctionnelle de l’un de ces clones,
totalement inconnu d’après l’analyse des bases de données, lors de l’initiation de ce travail.
80
DEUXIEME PARTIE
Caractérisation d’une voie de signalisation au cours du
SNLGM
81
Introduction aux articles 3 et 4
Les résultats de la banque soustraite, en accord avec de nombreux travaux
expérimentaux
antérieurs révèlent une activation lymphocytaire T au cours des phases
actives de la maladie. Cette activation induit certaines voies de signalisation qui conduisent à
la synthèse d’effecteurs (cytokines, facteurs de perméabilité…) responsables parallèlement du
syndrome néphrotique et des altérations de l’immunité de type cellulaire.
L’activation lymphocytaire T est initiée par la liaison du récepteur T (TCR) à un
peptide immunogène présenté par une cellule présentatrice d’antigènes (APC) dans un
contexte restreint par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC). Cette
liaison induit une cascade d’évènements qui aboutissent à la constitution d’un complexe
macromoléculaire appelé signalosome du TCR. Il constitue (en association avec l’activation
des molécules de co-stimulation), l’étape initiale conduisant à l’activation des gènes des
facteurs de transcriptions et des cytokines ou aux phénomènes de réorganisation du
cytosquelette et d’adhésion ou de migration cellulaire (Figure 12).
Dans un premier temps, cette liaison active des protéines associées aux récepteurs de
type tyrosine kinase comme Lck, Fyn et Lyn qui vont phosphoryler certaines protéines dont
82
les tyrosines des domaines de signalisation appelés ITAM (immunoreceptor tyrosine-based
activations moifs), situées dans la partie cytoplasmique des chaînes
molécule CD3
,
,
et
de la
157
. Ces domaines phosphorylés sont reconnus par des protéines à domaine
SH2 comme ZAP70
158
qui ainsi activées, phosphorylent à leur tour d’autres molécules
comme LAT, une molécule adaptatrice transmembranaire. Celles-ci recrutent différentes
molécules de signalisation (SLP-76, Itk, Gads) à la membrane de la cellule sous forme de
complexes 159.
Figure 12 : Schéma illustrant les évènements de signalisation proximaux dans un
lymphocyte T (d’après Leo A, JCI 2002).
83
Ces complexes activent une enzyme clé, la PI3 kinase qui phosphoryle en position 3
les phosphoinositides (PI) membranaires. La PI3K peut également être activée par des
récepteurs de co-stimulation comme CD28. L’activation de la PI3 kinase est associée à
différents mécanismes et notamment la mobilisation de Ca2+ intracellulaire, et l’activation de
molécules comme les protéines G et les protéines de la famille PKC (160 (Figure 13). Parmi
celles-ci, certaines protéines comportant un domaine pleckstrine (PH) comme vav, sont
activées directement par la PI3kinase du fait d’une interaction entre leur domaine PH et les PI
161
. L’ensemble de ces évènements contrôle la régulation des gènes des cytokines,
l’organisation du cytosquelette, les phénomènes d’adhésion cellulaire et la formation de la
synapse immunologique.
84
Figure 13 : Voies de transduction des signaux impliquant la PI3 kinase (PI3K) dans un
lymphocyte (D’après Koyasu, 2003)
PI : Phosphatidylinositol
Ces évènements proximaux participent également à la différentiation lymphocytaire T
selon des mécanismes et des voies de signalisation spécifiques encore inconnus. Les articles 3
et 4 ont pour objet l’étude de deux gènes isolés dans la banque d’ADNc. Ces travaux nous ont
permis de mettre en évidence l’une des voies de signalisation recrutée dans les lymphocytes T
des patients au cours des phases actives de la maladie et de proposer un lien moléculaire entre
85
les signaux proximaux et l’expression d’un facteur de différentiation des lymphocytes CD4+
vers la voie Th2.
Article 3
Le clonage soustractif et différentiel a clairement mis en évidence une différence
d’expression d’une molécule impliquée dans la signalisation lymphocytaire au cours du
SNLGM, le facteur de transcription c-maf.
c-maf est un proto-oncogène, membre de la famille des facteurs de transcription à
fermeture éclair à leucine, physiologiquement impliqué dans l’induction du gène de l’Il4 et la
différentiation vers la voie Th2 des lymphocytes T CD4+ et dont l’expression basale est très
faible ou indétectable dans le lymphocyte T normal.
Nous avons montré par des techniques de retard sur gel, immunoblots et par
immunfluorescence, que c-maf est spécifiquement recruté au cours des néphroses lipoïdiques.
Dans les lymphocytes T CD4+, l’expression de c-maf est détectée dans le noyau (forme
active) au cours des poussées et dans le cytoplasme (forme inactive) au cours des rémissions.
Le niveau d’expression de c-maf en rémission reste élevé chez les patients qui présentent des
rechutes fréquentes. La seule cytokine connue régulée par c-maf est l’IL4
90
Nous avons
montré que l’IL4 ne pouvait pas être le gène cible de c-maf puisque le niveau d’expression de
l’IL4, étudié par RT-PCR quantitative, est très faible durant les poussées alors que c-maf est
86
présent dans le compartiment nucléaire et actif puisqu’il se fixe à ses éléments de réponse in
vitro. Compte tenu de l’activation concomitante des protéines NFκB (p50, p65), nous avons
recherché si les complexes p50/p65 pouvaient interférer avec la transactivation du gène de
l’IL-4 par c-maf. Deux types d’expérience ont été accomplies pour tester cette hypothèse.
Premièrement, nous avons montré que l’incubation des lymphocytes T, de patients prélevés
en poussée, avec le MG132 (inhibiteur de la voie NFκB), entraîne une augmentation
significative de l’expression de l’IL4, comparativement aux mêmes cellules incubées en
présence du milieu seul. Nous avons cotransfecté une construction contenant le promoteur du
gène de l’IL4 en amont d’un gène rapporteur et un vecteur codant pour la protéine c-maf.
Cette cotransfection révèle une forte activation de la transcription du gène rapporteur par la
protéine c-maf. Cette activation est abolie si l’on cotransfecte un troisième vecteur codant
pour la protéine NFkB/p65. Ces résultats suggèrent que la transactivation du gène de l’IL4
par c-maf est bloquée par l’hyperactivité NFκB au cours du SNLGM.
Des données récentes ont montré que c-maf inhibe la polarisation des lymphocytes T
CD4+ helper vers la voie Th1 par un mécanisme inconnu indépendant de l’IL-4 162. La mise
en évidence d’une surexpression de c-maf lors des poussées, ainsi qu’une inhibition de
l’expression du récepteur de l’IL-12
163
suggèrent fortement que les poussées de néphrose
lipoïdique sont précocement associées à une polarisation des lymphocyte T malades vers la
voie Th2. Ces résultats peuvent expliquer deux types d’anomalies souvent rencontrées chez
ces patients : i) un défaut de réponse aux tests cutanés d’hypersensibilité retardée, ainsi
qu’une susceptibilité accrue à certaines infections bactériennes, deux propriétés qui requièrent
des lymphocytes Th1 fonctionnels ; ii) une fréquence accrue des manifestations allergiques et
des taux élevés d’IgE par rapport à la population générale, traduisant une réponse effectrice
de type Th2.
87
Article 4
L’analyse de l’un des transcrits inconnus, nous a permis d’identifier une nouvelle
protéine impliquée dans la transduction de signaux proximaux dans les lymphocytes CD4+.
Nous avons appelé cette protéine Tc-mip (Truncated c-maf inducing protein). Le transcrit Tcmip est produit par épissage de l’ARN primaire codant pour un gène localisé en 16q21. Cet
épissage supprime le premier exon qui code pour la partie N-terminale du domaine
pleckstrine de la protéine normale, appelée c-mip. L’ARN messager de Tc-mip, ainsi que la
protéine, ne sont pas présents dans les PBMC des individus normaux ainsi que chez les
patients atteints d’autres glomérulopathies (glomérulopahie extramembraneuse) alors qu’ils
sont fortement exprimés chez les patients suivis pour un SNLGM. L’ARNm de Tc-mip est
exprimé principalement dans les lymphocytes T CD4+ de type Th2, le foie fœtal et le thymus
alors que c-mip est fortement exprimé dans les PBMC et le rein. Nous avons pu démontrer
par des expériences de transfection dans une lignée lymphocytaire T (Jurkat), que la protéine
Tc-mip, stimule les signaux membranaires normalement induits par l’activation du récepteur
T, en provoquant des phénomènes d’adhésion intercellulaire. Ce mécanisme est associé à une
réorganisation du cytosquelette comme en témoigne la redistribution de la l-plastine. D’autre
part, la transfection de T-cmip induit la synthèse et la migration nucléaire du facteur de
transcription c-maf et participe à la polarisation des cellules Jurkat vers la voie Th2. Ces
phénomènes ne sont pas ou peu observés avec c-mip.
88
Tc-mip a la structure d’une molécule cytosolique adaptatrice (cytosolic adapter
protein, CAP). Elle est localisée dans le cytoplasme, dépourvue d’activité enzymatique ou
transcriptionnelle et elle possède un domaine d’interaction protéine-protéine et/ou protéineslipides. Les analyses immunocytochimiques ont montré que la délétion du domaine PH
modifiait la localisation cellulaire de la protéine, vraisemblablement par une altération de la
liaison de la protéine par son domaine PH aux phosphatidilinositols membranaires. Les
protéines CAP exprimées dans le lymphocyte T sont fréquemment impliquées dans la
transmission de signaux proximaux émanant du TCR et conduisent à des phénomènes aussi
variés que la réorganisation du cytosquelette, préalable aux phénomènes de migration et
d’adhésion cellulaire ou la régulation spécifique des gènes. A la différence d’autres CAPs,
Tc-mip est la seule protéine dont l’expression est prédominante dans les lymphocytes CD4 de
type Th2 (Tableau 5). Comme la plupart des CAPs, exprimés dans les lymphocytes, T-cmip
est impliqué dans la transduction de signaux proximaux émanant des récepteurs (BCR ou
TCR). Dans son cas, il semblerait qu’elle relie les signaux membranaires du TCR à des voies
de signalisation impliquées dans l’induction du facteur de transcription c-maf et, comme
d’autre molécules CAPs comme SLP-76
164
ou FYB
165
, qu’elle soit impliquée dans la
réorganisation du cytosquelette et l’adhésion lymphocytaire.
Ces travaux démontrent également qu’une délétion du domaine PH d’une protéine, est
susceptible de modifier sa localisation cellulaire et d’induire un gain de fonction. Des
observations expérimentales similaires ont été décrites avec d’autres protéines à domaine PH
comme vav et PKD (cf article 3), mais c’est la première fois qu’elles sont rapportées au cours
89
d’une pathologie humaine. Les anomalies d’épissage, constatées sur le trancrit issu de la
banque, ont donc des conséquences fonctionnelles majeures.
Tableau 5: Protéines cytosoliques adaptatrices (CAPs) (Leo A, 2002)
NOM
DOMAINE
Gads
SH3-SH2
EXPRESSION
Cellule T, NK, macrophage
Plaquettes, mastocytes
Grb2
SH3-SH2
Ubiquitaire
Nck
SH3-SH2
Ubiquitaire
SAP
SH2
Cellules T, NK
PH-SH3-Coiled-Coil
Ubiquitaire
SLAP/FYB
Région riche en proline- SH3
Cellule T, cellules myéloides
SLP-65/BLNK
Région riche en proline- SH2 Cellules B, macrophages
SLP-76
Région riche en proline- SH2
SKAPHOM /55R
Cellules
T,
macrophages,
NK,
plaquettes,
mastocytes
c-mip
PH- région riche en leucine
Cellules T, B, monocytes,
macrophages, rein
Tc-mip
PH (t)- région riche
leucine
en
Lymphocytes CD4+ (Th2),
Foie fœtal, thymus
90
TROISIEME PARTIE
Anomalie de la maturation des ARN messagers au cours
du SNLGM
91
Article 5
Cet article est consacré à l’analyse structurelle des autres transcrits inconnus. Il
montre que les anomalies d épissage observés lors de l’étude du transcrit de Tc-mip ne sont
pas isolées et suggèrent l’existence d’une anomalie plus générale dans les processus de
maturation des ARN au cours des phases actives de la maladie.
La comparaison des séquences partielles (EST) des clones issus du criblage différentiel
de la banque cDNA soustraite avec les séquences présentes dans les bases de données, a
permis en effet d’isoler 30 clones ne correspondant à aucun ARNm de structure connue. Ces
séquences, d’environ 400 paires de bases, ont été positionnées sur le génome humain, grâce
au programme BLAST du NCBI. Pour 16 clones, les séquences correspondent à des
séquences introniques de gènes de structures connues mais de fonctions connues ou non. Les
gènes connus sont impliqués dans des fonctions diverses : transduction de signaux
intracellulaires (GNAQ,YWHAB, PIP5K2A, PRKACB), trafic protéique intracellulaire,
(USP16, TRAM), régulation du cycle et de la prolifération cellulaire (SYCP1, CNCP1,
NOTCH2), organisation du cytosquelette (ACTR2), facteurs de transcription
(RUNX1,
HNF1) ou cytokines (PBCEF) (cf article 5). Nous avons ensuite vérifié que ces EST ne
92
correspondaient pas à un artéfact de la banque. Pour cela, nous avons étudié leur expression
sur une cohorte importante de malades par RT-PCR semi-quantitative. Nos résultats montrent
clairement que ces EST sont majoritairement exprimées en poussée de la maladie par rapport
aux rémissions, aux sujets normaux ou chez des patients atteints de GEM. La structure
complète de certains des clones a pu être déterminée soit par le criblage et le séquençage de la
banque contenant les clones entiers (“ banque full length”) soit par une analyse des extrémités
5’ et 3’ (5’ et 3’ RACE). Nous avons ainsi répertorié deux groupes de clones : i) ceux
correspondant à des structures introniques non codante sans lien structurel avec les exons des
gènes adjacents ; ii) ceux correspondant à des anomalies d’épissage des gènes (présence d’un
exon supplémentaire) susceptible de modifier la structure et la fonction des protéines
correspondantes. Dans ce dernier cas, nous avons démontré la présence de protéines de taille
anormale pour 4 des clones étudiés.
L’ensemble de ces résultats semble indiquer une anomalie de la maturation (épissage)
des ARNmdes lymphocytes T au cours de la maladie.
L’objectif physiologique du processus d’épissage est d’éliminer les séquences
introniques du transcrit primaire, au cours de la maturation des ARN messagers. Il nécessite
l’intervention de ribonucleoprotéines, les snRNPs U1, U2, U4/U6 et U5 associés à de petits
RNA nucléaires , les snRNA (small nuclear RNA) qui vont permettre la constitution de
l’unité fonctionnelle d’épissage appelée splicéosome 166. Cette unité se constitue en plusieurs
étapes, dans le noyau (Figure. 14)
1) Association d’un snRNAU1 sur un site dit “ donneur ” de l’ARNm, situé en 5’ de
l’intron à exciser (séquence consensus GU) et coupure en 5’ du G de cette séquence
93
consensus. Cette reconnaissance nécessite un facteur protéique appelé SF2. Le snRNA U2 se
fixe au niveau d’un site dit de branchement, situé une vingtaine de bases en amont de
l’extrémité 3’ terminale de l’intron. Cette fixation nécessite un facteur protéique U2AF
2) L’extrémité 5’ libérée du site donneur vient réaliser une liaison phosphodiester
G5’
2A’ avec le A du site de branchement auquel s’est fixé RNA U2 à laquelle s’associent
les RNA U4 et U6. Le RNA U5 se fixe lui au niveau d’un site dit accepteur situé à
l’extrémité 3’ de l’intron
3) La dernière étape est celle de la trans-esterification au site accepteur. La formation
du splicéosome fait que l’extrémité 5’ OH de l’exon libérée se trouve en face du site
accepteur. Cette trans-esterification va entraîner sa ligation à l’extrémité 5’ de l’exon suivant,
ayant pour effet de raccorder les deux exons. L’intron, lui, est libéré sous forme de lasso
grâce à l’action d’une enzyme, l’«human debranching enzyme ».
94
Figure 14 : Mécanisme de l’épissage des ARNm (d’Après Kaplan et Delpech, in Biologie
Moléculaire et médecine, Flamarion)
Exon1GU
AG Exon2
A
RNA U1
RNA U2
Protéines
Exon1 GU
A
AG
Exon2
U2
U1
RNA U4
RNA U6
Exon1
GUAGGGUAU
CAUUCAUAG m3
U6
U4 U
G
A
RNA U1
A
Ex
on
1
5’
3’
AG
Exon2
5’
U2
Spliceosome
U5
Lasso
AG
Exon1Exon2
95
L’épissage est un processus régulé par des facteurs trans-activateurs en se fixant sur des
séquences dites “ splicing enhancers ” ou inhibiteurs en se fixant sur des séquences dites “
splicing silencers ”
167
. Ces séquences peuvent être introniques ou exoniques. Ces facteurs
sont responsables de la régulation de l’expression des gènes au cours du développement ou
des spécificités tissulaires de l’expression des différents transcrits. Ils incluent les SR
protéines (Serine/Arginine rich proteins)
protéin)
170
168 169
, les protéines de la famille CELF
, les PTB (Polypyrimidine tract binding
171
, et certains facteurs de régulations tissus-
spécifiques (NOVA1 dans le système nerveux central) 172.
Des travaux récents
173
ont mis en évidence que l’activation lymphoytaire T était
associée à d’importantes variations dans l’expression de certaines SR protéines. Les SR
protéines sont une famille conservée de protéines comprenant au moins neuf membres qui ont
déjà été identifiés (SF2/ASC, SC35, SRp20, SRp40, SRp75, SRp55, 9G8, SRp30c). Elles
possèdent toutes un domaine d’interaction avec l’ARN appelé RRM (RNA recognition motif)
et un domaine C-terminal riche en serine/arginine, d’interaction proteines-protéines appelé le
domaine RS 174. Leur rôle, est précoce au cours de la constitution du splicéosome,et est triple
175
(Figure 15)
1) Elles induisent l’interaction du snRNA U1 au site donneur en se liant aux snRNA U1
de manière compétitive avec des protéines, les hnRNPs impliquées dans la répression du
splicing.
2) Les SR protéines peuvent se lier à des séquences exoniques activatrices, les ESE
(exonic splicing enhancers) situées sur les exons adjacents et induisent la fixation de U2AF
au site de branchement.
96
3) Elles peuvent à l’inverse, exercer un effet inhibiteur sur la régulation de l’épissage en se
fixant à des ESS (exonic splicing silencers), inhibant la liaison de U2AF au site de
branchement.
Figure 15 : Fonction des SR protéines (d’après Caceres J, Trends In Genetics 2001)
SR
1
2
U1
U1
Site proximal 5’
U1
hnRNPA1
Site distal 5’
U1
65
GU
bp
GU
bp
AG
py
3
65
35
35
AG
SR
ESE
SR
ESE
hnRNPA1
ESS
py
hnRNPA1 : Human ribonucleoprotein A1
ESE : Exonic splicing enhancer
ESS : Exonic splicing silencer
97
Les fonctions des différentes SR protéines sont partiellement redondantes, mais elles possèdent
néanmoins des spécificités de substrats liées aux ESE et aux ESS
176
. Pour certaines SR
protéines, des motifs consensus ont ainsi été définis, et sont en partie responsables de la
régulation tissu-dépendante de l’épissage alternatif
177
. L’activité des SR protéines est régulée
par des phénomènes de phosphorylation et il semblerait que les protéines kinases impliquées
dans ce processus jouent également par cet intermédiaire un rôle dans la régulation de
l’épissage alternatif 178.
Afin de comprendre l’origine des anomalies observées au cours du SNLGM, nous
avons voulu étudier certains facteurs physiologiquement impliqués dans ces phénomènes de
maturation des ARNm. Nous avons dans un premier temps, étudié l’expression d’une
protéine jouant un rôle fondamental dans l’excision des introns : l’ « human débranching
enzyme », sans mettre en évidence de résultats significatifs au cours de la maladie (figure 16).
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’expression des SR protéines et avons
mis en évidence des au cours des poussées, un défaut d’expression de deux d’entre elles,
SRp40 et SRp75. Les implications potentielles de ces résultats sont évoquées dans l’article 3
et seront commentées dans la discussion.
Figure 16 : Expression de l’Human Debranching Enzyme (RT-PCR) chez les patients et
les sujets normaux.
Patients en poussée
Sujets normaux
1
1
2
3
4
2
3
.
98
AUTRES TRAVAUX
99
I-Identification du partenaire protéique de c-mip/Tc-mip par la technique du double
hybride
Les protéines c-mip/ Tc-mip sont caractérisées par la présence d’un domaine PH,
impliqué principalement dans les interactions protéines-protéines. Nous avons donc poursuivi
notre analyse fonctionnelle de la protéine par la recherche de son partenaire potentiel. Ce
travail a été réalisé avec le système levure Lex A (cf Matériels et Méthodes) appliqué à une
banque de lymphoblastes humains dans laquelle nous avions préalablement vérifié
l’expression de notre protéine appât (c-mip).
Ce travail a permis d’identifier 23 clones représentant au total 6 partenaires protéiques
potentiels de c-mip (Tableau 6). Des expériences de co-immunoprécipitation de c-mip et de
ses différents partenaires sont en cours dans le laboratoire pour confirmer la spécificité de ces
résultats.
-La Filamine A appartient à la famille des protéines de liaison à l’actine, permettant
notamment la liaison des filaments d’actine
aux membranes cellulaires (179. Elle lie
100
également les intégrines et participe ainsi à l’organisation du cytosquelette et aux
phénomènes d’adhésion cellulaire 180. Dans le lymphocyte T, la filamine est phosphorylée par
p56 (Lck)
181
), une protéine tyrosine kinase de la famille src, associée notamment aux
glycoprotéines de surface comme CD4 et CD8, et stimulée lors de l’activation du TCR. De
plus, la Filamine A est un partenaire protéique de la protéine cytosolique adaptatrice (CAP)
Lnk, impliquée dans la signalisation de l’activation lymphocytaire T
182
. C-mip représente
donc potentiellement la deuxième protéine de type CAP se liant à la filamine. Les
modifications du cytosquelette observées par la transfection de Tc-mip dans les cellules
Jurkat pourraient donc être médiées par la Filamine A. La confirmation de cette interaction
protéique et de ses conséquences devrait permettre de mieux comprendre le rôle de notre
protéine dans les phénomènes d’adhésion cellulaire.
Tableau 6 : Identification des partenaires protéiques de c-mip.
Nom
Numéro d’acces
Fonction
genbank (GI)
Filamine A
4503744
Nombre de
clones
Organisation du
2
cytosquelette
Adaptateur
de
la
27477131
Signalisation
phosphatidylinositol-3
cellulaire
phosphate3-phosphatase
proximale
DKFZP566J153
7661653
(Gène PRPF31)
Amplified
Squamous
3
ARNm
hGASC1
(Gene
Épissage du pré
8
24307986
Inconnue
6
5453604
Maturation de
1
in
Cell
Carcinoma 1)
CCT4
101
(Chaperonin Containing
la Cycline E
TCP1, subunit 4)
MIB ( Mind bomb)
30348953
Ligase des
3
ubiquitines
-La protéine adaptatrice de la phosphatidylinositol 3 phosphate 3-phosphatase est
la sous-unité adaptatrice d’une phosphatase impliquée dans l’hydrolyse des phosphatidilinostol
PI(3)P et PI(3,4)P(2)
183
. Cette enzyme est donc comme un inhibiteur potentiel de la voie de
phosphorylation des PI, induite par la PI3 kinase, impliquée dans la phosphorylation des
phospholipides de membranes, au cours de l’activation du récepteur T. Cette voie conduit
physiologiquement à la production de seconds messagers comme l’inositol triphosphate et
permet la transduction de signaux aboutissant à l’expression de gènes spécifiques. Nous avons
démontré que Tc-mip induisait des voies de signalisation conduisant à l’activation de c-maf et
à la réorganisation du cytosquelette, phénomènes peu ou pas observés avec c-mip. En
modulant la production de PI3, la PI3 phosphatase pourrait être impliquée dans les variations
observées.
-La protéine DKFZP566J153 codée par le gène PRPF31 est l’homologue de la
protéine Prp31p de levure, impliquée dans les deux espèces dans les interactions entre les
snRNP et les protéines U4/U6 et U5
184 185
. Ces interactions sont fondamentales dans le
processus de maturation des ARNm (cf article 5).. L’implication potentielle de cette protéine
et de c-mip dans la maturation des ARNm au cours de la maladie reste à démontrer.
-
Les autres protéines identifiées n’ont pas encore de fonctions connues ou possèdent des
fonctions qu’il est difficile de relier au rôle de c-mip/Tc-mip dans l’état actuel de nos
102
connaissances. Elles nécessiteront des études plus approfondies pour vérifier ces interactions
et comprendre leurs significations.
II- Analyse protéomique des sérums des patients avec et sans récidive du SNI après
greffe rénale.
De nombreux arguments cliniques et expérimentaux plaident en faveur de la présence
d’un facteur sanguin circulant dans le sérum des patients, susceptible d’altérer la barrière de
filtration glomérulaire (cf introduction). Parallèlement aux études que nous avons entreprises
au niveau transcriptionnel, nous avons décidé d’étudier le syndrome néphrotique par analyse
d’expression différentielle au niveau protéomique. Pour cette étude, l’analyse différentielle
des sérums des patients en poussée et en rémission de SNLGM nous a paru d’un intérêt
limité en raison même de l’état néphrotique qui altère considérablement les profils
d’expression protéique. Pour cette raison, nous avons étudié les sérums des patients prélevés
le jour de la transplantation rénale, en l’absence de tout traitement immunosuppresseur,
nettement plus homogène. L’intérêt d’une approche protéomique de cette situation clinique
est double. D’une part, il permet d’établir un profil d’expression protéique associé au risque
ultérieur de survenue d’une récidive de la maladie sur le greffon et d’envisager, après
validation sur une cohorte importante de patients, la validation d’un test prédictif de récidive
de la maladie. En effet, le taux de récidive est élevé, souvent associé à une perte du greffon
(50%), et il n’existe actuellement, en période de pénurie de greffons, aucun facteur prédictif
de cette récidive. D’autre part, cette stratégie pourrait permettre d’isoler puis de caractériser
103
les facteurs protéiques exprimés chez les patients présentant une récidive, conduisant ainsi à
l’identification d’un ou plusieurs facteurs déterminants dans la survenue du syndrome
néphrotique.
Nous présentons ici nos résultats préliminaires, obtenus chez 8 patients par la technique
des protéines-Chips Arrays. Quatre d’entre eux n’ont présenté aucune récidive de la maladie
un an après la transplantation (NR1→NR4) et quatre ont présenté une récidive de la maladie
moins d’un mois après la greffe, prouvée histologiquement dans tous les cas (R1→R4).
Résultats
Les huit échantillons ont été analysés dans 11 conditions expérimentales différentes, ce qui
représente un total de 88 analyses. Cinq marqueurs potentiels associés à la récidive de la
maladie après transplantation ont été identifiés dans les conditions suivantes
Barrette IMAC 3 Zn : 2marqueurs –5.1 kD et 13.6 kD
Barrette IMAC 3 Zn/Mn : 2 marqueur – 4.8 kD et 8.3 kD
Barrette SAX2 Ph 8 : 1 marqueur – 10.7 kD
La figure 17 illustre les résultats concernant l’identification de 2 de ces marqueurs
Figure 17
A : Identification d’un marqueur de 5.1kD sur une barrette IMAC3 Zn
555555YYYY
5 .1kD
5000
6000
7000
8000
R1
5000
6000
7000
8000
5000
6000
7000
8000
5000
6000
7000
8000
5000
6000
7000
8000
5000
6000
7000
8000
5000
6000
7000
8000
R2
R3
R4
NR1
NR2
NR3
104
B Identification d’un marquer de 4.8kD sur une barrette IMAC3 Zn
B : Identification d’un marqueur de 4,8kD sur une barrette IMAC3 Zn /Mn
3
2
M/Z
1
4400
4500
4600
4700
4800
4900
0
Non recidive
Recidive
-1
-2
-3
4400
4800
4833.9+H
R1
R1 (10 ug) Zn
10
15
10
4600
-4
20
4453.8+H4481.8+H
0
4400
5
0
Log Normalized Intensity
4615.1+H
4600
4400
7.5
5
2.5
0
6
4
2
0
4400
40
30
20
10
4400
4600
4614.4+H
4705.4+H
4724.2+H
4600
4479.0+H
4453.8+H
4476.0+H
4612.6+H
4800
4613.7+H
4705.9+H
4600
4832.6+H
4911.7+H
4833.5+H
4705.0+H
4724.2+H
4707.3+H
4724.2+H
4912.4+H
4913.8+H
4800
4832.3+H
4613.7+H
4400
2
0
4
4472.2+H
4454.2+H
4400
2
4600
4610.8+H
4400
4400
4607.9+H
4600
4600
4833.3+H
4913.9+H
4800
4913.0+H
4724.2+H
4703.9+H
4600
4453.3+H
4478.1+H
0
4724.2+H
4703.0+H
4833.3+H
4911.1+H
4800
R3 (10 ug) Zn
R4 (10 ug) Zn
NR9 (10 ug) Zn
4800
4453.8+H
0
4
R2
R3
R4
NR1
NR2
NR3
NR4
R2 (10 ug) Zn
4912.5+H
4800
4600
4453.8+H
4474.4+H
4833.2+H
4705.9+H
4724.2+H
4452.5+H
4473.8+H
4400
4912.5+H
4800
4612.4+H
4453.8+H
4473.7+H
10
7.5
5
2.5
0
4707.2+H
4724.2+H
NR10 (10 ug) Zn
NR11 (10 ug) Zn
NR12 (10 ug) Zn
4724.2+H
4833.3+H
4800
4800
Ces résultats démontrent l’intérêt potentiel de cette stratégie et sont encourageants pour
l’identification de marqueurs de la récidive de la maladie après transplantation. Ils doivent
néanmoins être validés sur une cohorte plus importante de patients, pour évaluer la validité de
ces marqueurs et afin d’évaluer leurs sensibilité et leur spécificité dans l’objectif de
l’établissement d’un test prédictif. Les protéines correspondant à chacun des marqueurs sont
en cours d’identification, en collaboration avec l’unité U492 (Pr Dantal, Nantes). Elles seront
d’abord isolées par chromatographie spécifique puis séquencées. A terme, une telle stratégie
d’analyse protéomique pourrait conduire à l’identification du facteur de perméabilité
impliqué dans le SNI.
105
DISCUSSION
106
Le travail présenté dans cette thèse à pour objectif l’identification des mécanismes
moléculaires impliqués dans le SNLGM par la caractérisation de certains gènes, isolés par
clonage soustractif et différentiel et potentiellement impliqués dans la physiopathologie de la
maladie. En raison de nombreux arguments cliniques et expérimentaux, le SNLGM apparaît
comme une pathologie dysimmunitaire. Nous avons donc cherché à mettre en évidence les
gènes activés dans les PBMC des patients au cours des poussées de la maladie. Cette stratégie
nous a permis d’isoler un certain nombre de clones qui ont séquencé et comparé aux
informations déposées dans les bases de données. La stratégie utilisée confirme sur une base
moléculaire, que le lymphocyte T est un acteur majeur de l’immunopathogénie de la maladie.
Au cours de ce travail, nous avons identifié une nouvelle protéine adaptatrice impliquée dans
transmission des signaux proximaux d’activation cellulaire T qui semble jouer un rôle clé dans
la voie de signalisation Th2 dépendante du facteur de transcription c-maf. Ce travail a
également permis de mettre en évidence des anomalies inattendues de la maturation des
ARNm au cours des phases actives de SNLGM, décrites pour la première fois au cours d’une
affection dysimmunitaire.
1- Identification d’une voie de signalisation Tc-mip-cmaf, selectivement recrutée dans
les lymphocytes T des patients atteints de SNLGM.
107
Comme nous l’avons vu dans l’introduction, de nombreux arguments cliniques et
expérimentaux suggèrent que le SNLGM est une affection dysimmunitaire, liée à une réponse
T anormale. Cette réponse T pourrait initier la production d’effecteurs spécifiques, capable
d’altérer le fonctionnement du podocyte et d’entraîner des déficits acquis de l’immunité
cellulaire. Plusieurs éléments cliniques (susceptibilité aux maladies allergiques, élévation des
IgE) suggèrent qu’une des réponses immunes, secondaires à l’activation lymphocytaire T, est
plutôt de type Th2. L’induction du facteur de transcription c-maf, associée à l’absence
d’expression de la chaîne
2 du récepteur de l’IL12 (IL-12R 2) chez les patients renforcent
considérablement ces hypothèses.
La génération de lymphocytes CD4+ de type Th2 à partir des cellules T précurseurs
dépend de plusieurs facteurs dont principalement la concentration locale en IL4. Nous avons
démontré de manière rigoureuse que l’Il4 n’était pas augmentée dans la maladie alors qu’il
est actuellement le seul gène cible connu de c-maf. En fait, nous avons montré que la coactivation de la voie NFkB au cours de la maladie bloquait l’induction de l’Il4 par c-maf.
La mise en évidence d’une différenciation Th2 dépendante de c-maf mais indépendante
de l’Il4, soulève certaines questions relatives aux mécanismes d’activation lymphocytaire T
au cours du SNLGM. La génération de lymphocytes Th2 au cours d’une réponse immune est
généralement dépendante de la nature de l’antigène et de la concentration locale en cytokines
Th2, principalement l’Il4. Il est difficile de concevoir que le SNLGM résulte d’un conflit
immunitaire impliquant un antigène ubiquitaire, entraînant une réponse Th2 sans Il4. Ce
constat est en accord avec les observations cliniques qui montrent que seul un tiers des
patients développe des poussées de la maladie à l’occasion d’une infection banale, alors que
108
dans la majorité des cas, le syndrome néphrotique survient en l’absence d’infection apparente
et n’est accompagné d’aucune réaction inflammatoire.
En se basant sur les résultats rapportés dans ce travail, nous proposons une autre
hypothèse susceptible de réconcilier les observations cliniques et les données expérimentales.
En effet, nous avons caractérisé sur le plan fonctionnel la protéine Tc-mip, présente chez tous
les patients testés et capable d’induire c-maf et de provoquer une réorganisation du
cytosquelette en l’absence d’activation exogène du TCR. Ce résultat suggère la possibilité
d’une activation T indépendante d’une stimulation antigénique. La protéine Tc-mip pourrait
ainsi induire la voie de différentiation Th2 dépendante de c-maf et bloquerait la voie Th1 par
l’intermédiaire de cytokines de type Th2 encore non identifiées à ce jour
162
. Ces travaux
renforcent des hypothèses antérieures suggérant que c-maf n’est en effet pas majoritairement
induit par des cytokines mais par des signaux émanant du TCR
85
, contrairement à d’autres
facteurs de transcriptions impliqués dans la polarisation des lymphocytes CD4+ comme Tbet
(Th1) ou GATA3 (Th2). Les voies de signalisation impliquées dans ces évènements
proximaux, et les molécules qui les constituent (protéines kinases, protéines adaptatrices),
sont encore très mal connues.
La protéine Tc-mip est la première protéine adaptatrice de type CAP susceptible de
relier de manière indépendante, les étapes proximales de la différentiation des lymphocytes T
vers la voie Th2. Elle paraît également impliquée dans l’adhésion cellulaire. L’ensemble de
ces effets paraissent en partie liés à une altération de l’ancrage de la molécule aux
phosphoinositides de la membrane par son domaine PH,. dans la mesure où ils ne sont pas ou
peu observés avec la protéine normale (c-mip).
109
Les mécanismes moléculaires susceptibles de rendre compte des modes d’action de Tcmip/c-mip sont résumés sur la figure 18. Ils sont en cours d’étude dans le laboratoire. Les
résultats du double hybride devraient permettre de mieux appréhender certaines des voies de
signalisation impliquées dans ces mécanismes.
Figure 18 : Voie d’activation impliquant les protéines c-mip et T-cmip
TCR
PI3P
Y-P
Y-P PI(3)p
x
PI(3, 4)p2
?
C-mip
PI3K
Wortmanine
PI(3, 4, 5)p3
AkT
Ras
Vav
Tc-mip
?
x
PKC
Cytosquelette
c-maf
PI :Phosphatidylinositol
PKC : Protéine kinase C
TCR : T cell receptor
110
En effet, nos résultats indiquent que Tc-mip agit de manière indépendante de l’action
de la PI3 kinase. Les résultats du double hybride indiquent que c-mip pourrait se lier à la
sous-unité adaptatrice de la PI3-phosphatase (PI3P). L’activation de la PI3P bloque la
génération des phosphatidylinositols qui permettent l’ancrage des protéines cytosoliques
impliquées dans la transmission de signaux proximaux. Les différences observées après
transfection des séquences codantes de c-mip et de Tc-mip pourraient en partie être
expliquées par une altération des interactions entre Tc-mip et la PI3 phosphatase qui ne serait
alors activée que par c-mip. Cet aspect demande à être confirmé par des expériences de coimmunoprécipitation de la PI3 phosphatase à partir des cellules transfectées respectivement
avec c-mip ou T-cmip. La co-immunoprécipitation de la PI3 phosphatase avec c-mip mais
pas avec Tc-mip confirmerait cette hypothèse.
Les expériences de double hybride ont également mis en évidence une possible
interaction de c-mip avec la Filamine A, une protéine du cytosquelette. Des modifications de
l’architecture cellulaire induites par la transfection de Tc-mip pourraient donc être liées à son
interaction avec cette protéine. La Filamine A est également le partenaire d’une autre protéine
de signalisation de type CAP, la protéine Lnk
182
. Lnk est impliquée dans le contrôle de
l’expression de certains facteurs de croissance et la régulation de certaines voies de
signalisation médiées par les cytokines dont la voie JAK2 186. Cette protéine CAP partage de
nombreux points communs avec Tc-mip. Outre leur partenaire protéique potentiel commun,
les deux protéines CAP sont exprimées principalement dans le lymphocyte et elles possèdent
toutes les deux un domaine PH
osseuse
187
187
. De plus, Lnk est fortement exprimée dans la moelle
et des expériences d’invalidation du gène ont démontré son implication majeure
dans l’hématopoïèse
188
. La mise en évidence d’une expression marquée de Tc-mip dans le
111
foie fœtal suggère qu’elle pourrait également jouer un rôle dans l’hématopoïèse
embryonnaire.
2-SNLGM et maturation des ARN messagers
L’étude de l’ensemble des clones isolés à partir de la banque soustraite à montré
d’importantes anomalies de maturation des ARNm dans les lymphocytes des patients atteints
de SNLGM. Nous avons démontré que la présence de ces séquences n’était pas liée à un
artéfact de la banque soustraite et que pour la majorité d’entre eux, l’expression des clones
était spécifiquement régulée au cours des phases actives de la maladie et majoritairement
dans les lymphocytes T. L’analyse complète des messagers a été réalisée pour un certain
nombre de clones, mettant en évidence soit la présence d’ARN non codant soit la présence
d’anomalie d’épissage de gènes impliqués dans des fonctions diverses : signalisation, facteurs
de transcription, régulation du cycle cellulaire. L’ensemble de ces résultats a évoqué
l’existence d’une anomalie générale dans le processus de maturation des ARNm liée aux
phases d’activités de la maladie.
Les introns relargués lors de l’épissage des gènes, comme les ARN non codants
(eRNAs), ont longtemps été considérés comme des structures non fonctionnelles. Néanmoins
ceux qui ont été spécifiquement étudiés ont démontré leurs implications fonctionnelles. Ainsi,
ils peuvent contrôler de nombreux processus physiopathologiques comme l’inactivation du
112
chromosome X chez la femelle
189
, la réponse au stress oxidatif chez les mammifères, la
réponse aux antigènes viraux, la progression des cancers et de plus être impliqués dans
190
certaines pathologies comme l’ataxie spinocérébelleuse
,
191 192
. D’une manière plus
générale, leur régulation spécifique au cours du développement et leur rôle dans le contrôle le
plus souvent négatif de l’expression des gènes (RNA interférence, extinction des transgènes,
methylation, co-suppression) ont clairement été établis
193
. La fonction de ces ARN dans la
maladie est encore inconnue. Néanmoins, ces transcrits pourraient participer à l’extinction de
certains gènes et ainsi à la réponse T à l’origine du déficit de l’immunité à médiation
cellulaire au cours des phases actives de la maladie. L’analyse des clones de la banque
soustraite, réprimés au cours des poussées par rapport aux rémissions et aux contrôles
pourrait nous permettre de vérifier cette hypothèse.
L’épissage des introns des gènes codants est connu comme un des mécanismes
régulateurs de l’expression des gènes, responsable en très grande partie de la diversité
structurale et fonctionnelle des protéines. C’est notamment un des mécanismes susceptibles
de rendre compte de la discordance entre la diversité protéique (selon les tissus ou les stades
de développement) et le faible nombre de gènes identifiés par le séquençage complet du
génome humain soit environ 35000 gènes, c’est-à-dire à peine une fois et demi de plus que le
génome de la drosophile. A titre d’exemple, un gène intitulé Drosophilia Dscam, codant pour
une protéine membranaire impliquée dans la connexion neuronale chez la drosophile, pourrait
générer par épissage alternatif du pré-RNA messager, 38016 protéines différentes soit plus du
double du nombre de gènes totaux identifiés dans le génome de la drosophile 194,195.
En pathologie humaine, on estime que 15% des maladies génétiques sont liées à des
anomalies d’épissage de certains gènes
196
et des anomalies similaires sont de plus en plus
113
fréquemment identifiées dans certains cancers et affections neuro-dégénératives
197 198 199
,
ou
le contrôle des phénomènes d’apoptoses 200.
Comme nous l’avons vu avec T-cmip, ces anomalies d’épissage peuvent générer des
protéines tronquées induisant des variations fonctionnelles majeures. Pour l’instant, nous
avons démontré l’expression anormale de 3 autres protéines au cours des poussées de la
maladie : RUNX1, un facteur de transcription impliqué dans certaines leucémies, ACTR2,
une protéine du cytosquelette et USP16, une ubiquitine hydrolase. Une analyse fonctionnelle
de chacune d’entre elles doit être réalisée pour déterminer si ces anomalies structurelles ont
ou non des conséquences fonctionnelles. Il est intéressant de noter que les anomalies
d’épissage constatées sur USP16 induisent une disparition de l’un des domaines fonctionnels
de la protéine (UCH2) impliqués dans la dégradation de certaines protéines par la voie du
protéasome 201. Une hyperactivité du protéasome au cours des phases actives de la maladie a
précédemment été décrite
202
, responsable entre autres d’une hyperactivité de la voie NFkB.
Le rôle d’USP16 dans ces observations reste à clarifier.
Afin de déterminer l’origine de ces anomalies générales de la maturation des ARNm,
nous avons étudié le profil d’expression des SR protéines et établi une corrélation entre
l’absence d’expression de SRp40 et SRp75, et ces anomalies de maturations. Y a-t-il un lien
direct entre ces deux phénomènes ?
Il a précédemment été démontré que le profil d’expression des SR protéines dans un
lymphocyte T variait selon l’état d’activation de la cellule et pouvait rendre compte des
variations d’épissage des transcrits codants pour certaines protéines comme CD45
173
.
Néanmoins, pour répondre de manière formelle à cette question, nous envisageons
114
l’extinction de ces deux SR protéines par des expériences de RNA interférence (RNA)i, dans
une lignée lymphocytaire T, afin de déterminer si elles reproduisent ou non les anomalies
d’épissage observées dans la maladie.
La figure 19 résume nos principales hypothèses sur l’immunopathogénie de la maladie.
Le SNLGM est induit par une réponse lymphocytaire T anormale. Cette réponse est liée à
l’expression anormale de facteurs impliqués dans la régulation de la maturation des ARNm
(les SR protéines ?) qui entraînent l’apparition d’ARN immatures (codant ou non). Certains
de ces transcrits primaires produisent des protéines anormales dont T-cmip. Tc-mip est
capable d’autoactiver le lymphocyte T indépendamment d’une sollicitation antigénique
exogène. Tc-mip déclenche l’activation de la voie Th2 dépendante de c-maf. La coactivation
de NFkB bloque l’induction de l’Il4 par c-maf mais pas l’activation d’autres cytokines
bloquant la voie Th1. Les mécanismes par lesquels le lymphocyte T altère la physiologie du
podocyte sont encore inconnus.
115
Figure 19 : Hypothèses sur la physiopathologie de la réponse immune au cours du
SNLGM.
116
Conflit immunologique
Anomalie de maturation des ARN
ARN non codants et prot ines anormales (Tc-mip)
Activation des signaux membranaires proximaux
d pendant du TCR
!"
Activation de facteurs de
transcription (c-maf)
!"
R ponse T anormale
Cytokines Th2
?
Inhibition des fonctions Th1
(d ficit immunitaire)
Facteur de
permeabilit
Syndromen phrotique
117
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
118
Dans ce travail, nous avons présenté une partie des résultats consacrés à l’identification
des mécanismes moléculaires impliqués dans le SNLGM. Les informations apportées sur la
pathogénie de la maladie et les perspectives de travail qui en découlent, illustrent la
pertinence de la stratégie utilisée.
La voie de signalisation, que nous décrivons partiellement, éclaire l’immunopathologie
de la maladie mais également les mécanismes moléculaires impliqués dans la différentiation
lymphocytaire T. Ces mécanismes sont fondamentaux, dans la mesure ou ils impliquent de
nombreux processus physiopathologiques : affections auto-immunes, immunoallergie,
phénomènes de tolérance en transplantation. La poursuite de l’analyse moléculaire des voies
d’activation induites par Tc-mip nous paraît donc importante. Nous envisageons d’une part,
l’exploitation des données du double-hybride, en particulier l’étude du rôle de la PI3
phosphatase et de la Filamine A dans ces voies de signalisation et d’autre part l’étude de Tcmip dans un modèle in vivo par des expériences de transgénèse. De plus, la mise en évidence
d’une forte expression de l’ARNm de c-mip dans le rein et, dans des résultats préliminaires
non présentés ici, dans les fractions glomérulaires de rein humain normal, nous incite a
étudier l’expression et la distribution des protéines c-mip et Tcmip dans les reins normaux et
ceux des patients SNLGM, par des expériences d’hybridation in situ et par
immunohistochimie. Après CD2AP, c-mip/Tc-mip pourrait constituer une seconde entité à
expression bipolaire (glomérulaire et lymphocytaire), impliqué dans la survenue d’un
syndrome néphrotique.
Nous suggérons également pour la première fois au cours d’une affection
dysimmunitaire, l’implicaion potentielle d’anomalies de la maturation des ARNm et nous
119
suggérons leurs liens avec une anomalie dans l’expression des protéines SR. Les
conséquences de ces anomalies comme la fonction des ARN non codants, dont l’expression
est régulée au cours des phases actives de la maladie, restent à établir. D’autres protéines
tronquées comme le facteur de transcription RUNX1 ou l’USP16, impliquées dans l’activité
du protéasome, seront étudiées dans le laboratoire afin de déterminer si les anomalies
d’épissages constatées sur ces transcrits ont des conséquences fonctionnelles. A terme, ces
résultats pourraient initier des voies de recherche future sur l’implication de ces processus
dans la survenue d’autres affections d’orgines immunes.
120
ABREVIATIONS
ACTN4
Alpha Actinine 4
ADNc
ADN complémentaire
ARNm
ARN messager
ATCC
American Type Culture Collection
BCR
B Cell Receptor
BLAST
Basic Local Alignnent Search Tool
CAP
Cytosolic Adaptor Protein
CD2AP
CD2 Associated Protein
c-mip
c-maf inducing protein
ConA
ConcavalineA
DDBJ
DNA Databank of Japan
EMBL
European Molecular Biology Laboratory
ESE
Exonic Splicing Enhancer
ESS
Exonic Splicing Silencer
EST
Expressed Sequence Tag
GPF
Glomerular Permeability Factor
HFSH
Human Focal Sclerosis Factor
HSF
Hyalinose Segmentaire et Focale
HTA
Hypertension Arterielle
Ig
Immunoglobulne
Il
Interleukine
INF
Interferon
121
ISKDC
International Society of Kidney Disease in Children
kD
kilodalton
LGL
Large Granular Lymphocyte
MBG
Membrane Basale Glomérulaire
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NK
Natural Killer
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBR
Ponction Biopsie Rénale
PH
Pleckstrine Homology
PI
Phosphatidilinositol
RDA
Representational Difference Analysis
RT-PCR
Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SIRS
Soluble Immune Response Supressor
SNI
Syndrome Néphrotique Idiopathique
SNLGM (LGM)
Syndrome Néphrotique à Lesions Glomérulaires Minimes
SnRNA
Small nuclear RNA
SR
Serine-Arginine Rich (Proteins)
Tc-mip
Truncated c-maf inducing protein
TCR
T Cell Receptor
TNF
Tumar Necrosis Factor
VPF
Vascular Permeability Factor
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Résumé
Le syndrome néphrotique à lésions glomérulaires minimes (SNLGM) est une
glomérulopathie fréquente dont l’étiologie reste mystérieuse. Bien que de nombreux
arguments cliniques et expérimentaux suggèrent son origine immune, aucun des
facteurs, responsables à la fois du syndrome néphrotique et des anomalies de
l’immunité observées, n’ont été jusqu’à présent identifiés. Affin d’isoler les gènes
activés au cours des phases actives de la maladie, nous avons entrepris la construction
et le criblage différentiel d’une banque d’ADNc (ADN complémentaire) réalisé à
partir des cellules mononuclées du sang périphérique d’un patient en poussée et en
rémission de SNLGM. L’étude de certains des gènes ainsi isolés a permis
l’identification d’une voie de signalisation recrutée dans les lymphocytes T des
patients en poussée de SNLGM. Cette voie de signalisation comporte une nouvelle
protéine adaptatrice que nous avons appelé Tc-mip (c-maf inducing protéin),
impliquée dans l’activation du facteur de transcription c-maf et la différentiation vers
la voie Th2 des lymphocytes T CD4+. Le facteur de transcription c-maf n’induit pas
son gène cible, l’IL4, vraisemblablement en raison d’une co-activation de la voie
NFkB au cours des phases actives de la maladie. Tc-mip participe également à la
réorganisation du cytosquelette lors de l’activation du lymphocyte T, possiblement par
une liaison avec la filamine A, un partenaire de l’actine. L’analyse de nombreux
transcripts, isolés par clonage soustractif et différentiel, nous a également permi de
mettre en évidence une anomalie de maturation de certains ARN messagers dans les
lymphocytes T des patients lors des poussées de SNLGM. Ces anomalies sont
associées à une anomalie dans l’expression de certaines protéines impliquées dans ce
processus de maturation les SR protéines SRp75 et SRp 40. Ces travaux permettent,
grâce à la stratégie utilisée, une progression significative dans notre compréhension de
l’immunopathologie du SNLGM.
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