GC-MS and LC-MS2 identification of suspicious chemicals

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
F. COTTIN1, G. BERNIER1, B. FRÈRE1, P. ARPINO*,2
Identification par GC-MS et LC-MS2 de substances chimiques suspectes
abandonnées de manière criminelle dans l’environnement
RÉSUMÉ
Le contenu chimique de bidons abandonnés dans l’environnement a été analysé pour en évaluer la nature,
estimer son risque potentiel, prendre les mesures pour nettoyer le site environnemental et obtenir des indices
pour rechercher les auteurs du dépôt. Les analyses par GC-MS en mode EI ou CI à l’acétonitrile et par LC-APCI+MS2 ont montré qu’il s’agissait de bidons remplis d’un mélange de triglycérides légers estérifiés principalement
par des acides gras saturés à 8 ou 10 atomes de carbone et ne présentant pas de dangers toxiques majeurs.
MOTS-CLÉS
GC-MS, acétonitrile CI, LC-MS2, APCI+, triglycérides, recherche criminalistique
GC-MS and LC-MS2 identification of suspicious chemicals unlawfully abandoned
in the environment
SUMMARY
The chemical content of drums unlawfully abandoned in an environment site was investigated in order to assess its
potential risks, to choose the appropriated method for site cleaning and to obtain indices from the dumping authors.The
content was identified by GC-MS under EI or acetonitrile CI, and by combined LC-APCI+-MS2 to a mixture of non toxic
light triglycerides, mostly containing glycerol esters of saturated fatty acids with 8 and 10 carbon atoms.
KEYWORDS
GC-MS, acetonitrile CI, LC-MS2, APCI+, triglycerides, forensic investigation
I - Introduction
Enquête
qu
L’unité d’expertise Environnement/Analyses Chimiques de l’Institut de Recherche Criminelle de la Gendarmerie Nationale (IRCGN) a pour mission d’identifier toutes substances exogènes découvertes sur une
scène de crime, quelle qu’en soit la soit la nature ou
la matrice - l’expression « scène de crime » devant
être prise au sens large. Les interactions entre l’auteur,
l’environnement, ainsi que la victime sont appelées
« principe d’échange de Locard » (1). Selon le contexte, le laboratoire possède des départements dédiés à
la recherche de substances explosives ou stupéfiantes.
Pour les autres cas qui incombent à l’unité d’expertise
Environnement/Analyses Chimiques, les composés à
rechercher sont parfois connus (par exemple, des traces de détergents sur les chaussures de l’auteur d’une
agression dans une buanderie ; la présence de substances lacrymogènes sur les vêtements de l’auteur d’une
agression ; la présence de liquide de frein sur un objet
contendant ayant servi à la détérioration d’un circuit
de freinage) ou inconnues.
L’analyse de substances a priori inconnues diffère notablement des recherches ciblées. Ces dernières, auxquelles l’IRCGN est fréquemment confronté, utilisent
généralement des protocoles analytiques strictement
définis et validés au laboratoire (recherche de cocaïne
ou d’héroïne, par exemples). Elles atteignent fréquemment des limites inférieures de détection de l’ordre
de quelques ppb dans l’échantillon initial. Dans une
recherche « à l’aveugle », la méthode de prélèvement
doit être adaptée afin de procurer des échantillons
représentatifs et en quantité suffisante. La détermination de la nature, organique ou inorganique, et des
propriétés de solubilités de l’échantillon constituent
habituellement les premières étapes de l’étude réalisée
au laboratoire. Leurs résultats orientent le choix des
méthodes d’analyses appliquées par la suite - souvent
une séquence de procédés en ligne dans laquelle on
cherche à minimiser le nombre d’étapes afin de limiter
les pertes de produits.
Comparativement à une recherche ciblée, l’analyse
de substances a priori inconnues se caractérise par
une limite inférieure de détection généralement relevée de plusieurs ordres de grandeur. Il en découle
la possibilité d’obtenir un résultat nul si la quantité
d’échantillon initiale est limitée, comme lors de prélèvement par frottis (comparaison de traces d’huile
moteur entre un véhicule et une victime lors d’un
accident de la circulation).
1
Département Environnement, Incendie, Explosifs (ECX) – Institut de Recherche Criminelle de la Gendarmerie Nationale (IRCGN) – 93111 Rosny-sous-Bois
* Pour correspondance
2
Laboratoire Électrochimie et Chimie Analytique – UMR 7575 CNRS-ENSCP-Université Paris 6 – École Nationale Supérieure de Chimie de Paris – 75231 Paris 05 E-Mail :
[email protected]
SPECTRA ANALYSE n° 259 • Décembre 2007
19
TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Figure 1
Tracé du courant
ionique total restitué
après analyse GCEI/MS. Conditions de
température : pallier
à 100 °C (5 min) /
rampe 100 °C - 200 °C
(6 °C/min)/rampe
200 - 320 °C
(10 °C/min)/ pallier
final à 320 °C (12 min).
L’incertitude du résultat final, outre les erreurs méthodologiques inhérentes aux méthodes analytiques, est
parfois accrue si un standard authentique ne peut être
obtenu à des fins de comparaison directe, ou ne figure
pas au catalogue d’une banque de données spectrales.
Sur un plan qualitatif, cette dernière situation aboutit à
une présomption, qui peut ultérieurement conduire à
des prises de décisions concrètes rapides (par exemple,
l’interdiction de distribution d’eau à une population en
cas de pollution d’une nappe par un agent chimique
présumé toxique).
Si la quantité trouvée est un renseignement important pour une enquête et si la séquence analytique
employée est inédite, des études complémentaires de
validation doivent être menées. Ces études seront réalisées après obtention de la substance pressentie afin
que le résultat ne puisse pas ensuite être contesté par
aucune des parties lors du jugement de l’affaire judiciaire pouvant lui être liée.
Dans l’exemple rapporté ici, une vingtaine de bidons
furent découverts dans l’environnement (aucun détail ne peut être apporté ici, par souci du respect des
règles de procédure pénale). Afin de pouvoir évaluer
les risques potentiels des produits laissés sur place, et
retrouver les auteurs de cette décharge sauvage, l’enquêteur a souhaité déterminer la nature du contenu
des bidons, évaluer ses propriétés physico-chimiques
pour en connaître ses risques. Préalablement, dans le
but d’identifier l’ensemble des personnes qui ont été
en contact avec les bidons, le gendarme a procédé à la
recherche des traces papillaires (empreintes digitales),
des substances biologiques (recherche d’ADN), des
empreintes de pas ou de pneumatiques laissés par des
véhicules. Enfin, un prélèvement du liquide fut placé
sous scellé puis acheminé au laboratoire de Rosnysous-Bois afin d’identifier rapidement sa composition.
II - Matériel et méthodes
Les analyses GC-MS ont été effectuées à l’aide
d’un chromatographe Varian (Palo alto, CA, EtatsUnis), modèle Trace CP3800, équipé d’une colonne capillaire Restek (Bellefonte, PA, Etats-Unis),
2
Intensité relative
1.0
III - Résultats et discussion
La substance prélevée dans les bidons était un
liquide visqueux, translucide sans teinte particulière, dépourvu d’odeur, et disponible en quantités
abondantes. Sa bonne solubilité dans l’isooctane à
froid a conduit à envisager directement son étude
par couplage GC-MS, sans autres étapes de préfractionnement.
1. Analyse GC-MS en mode EI
0.5
1
3
4
5
20
RXI-5MS (30 m x 0,25 mm d.i. ; 0,25 μm d’une phase
à 5 % diphényl, 95 % diméthylpolysiloxane), et éluée
par de l’hélium. La colonne était couplée à une trappe
ionique Varian, modèle Saturn 2100T, en mode d’ionisation électronique (EI) ou en mode d’ionisation chimique (CI) initiée par des vapeurs d’acétonitrile, issues
d’un réservoir externe et effusant au travers d’un orifice étroit. Les données ont été traitées par un logiciel
MS Workstation 6.42.
Les analyses LC ont été acquises à l’aide d’un ensemble
Thermo Fisher Scientific (San José, CA, Etats-Unis)
équipé d’un module de pompage quaternaire HPLC
Surveyor, d’un contrôleur de gradient, d’un passeur
automatique d’échantillons, d’une colonne Waters
(Bedford, MA, USA) X-Terra MS (3,0 x 150 mm garnie de particules de 3,5 μm de silice greffée C18), éluée
par une phase mobile, constituée d’un mélange 50 %
eau (0,1 % CH3COOH, 0,5 mM CH3COONH4)/50 %
de méthanol, (v/v), à un débit de 0,55 mL/min.
Les analyses LC-MS et LC-MS2 en mode d’ionisation
chimique positive à pression atmosphérique (APCI+)
ont été conduites en infusant une solution de l’échantillon dans la même phase mobile que ci-dessus, directement introduite dans la source APCI d’une trappe
ionique Thermo Fisher Scientific, modèle LCQ Advantage. Les paramètres opératoires étaient les suivants : température du vaporiseur (350 °C) ; tension de
la décharge couronne (6kV) température du capillaire
de transfert (150 °C) ; gaz auxilliaires (azote ultra pur)
dont gaz principal (70 unités arbitraires) et gaz de séchage (6 unités arbitraires). Les expériences en mode
MS/MS ont été obtenues par collision dans la trappe
avec de l’hélium. Cet ensemble était piloté par le logiciel Xcalibur 1.3.
Les données expérimentales des analyses GC-MS et
LC-MS2 ont également été lues et exploitées à l’aide du
logiciel MS Manager version 10 d’ACDLabs (Toronto,
Canada).
10
15
20
25
30
35
Temps de rétention (mn)
SPECTRA ANALYSE n° 259 • Décembre 2007
40
45
L’injection directe d’un échantillon de la dilution
dans l’iso-octane en mode split, suivie de l’analyse
en mode d’ionisation électronique a révélé la présence de trois constituants majeurs à hauts points
d’ébullition (figure 1) - à cause de leurs températures d’élution élevées sur cette colonne moyennement polaire -, et fonctionnalisés par des groupements chimiques leur conférant une certaine
polarité, en raison de la forme asymétrique des
pics chromatographiques, notamment une traînée
des fronts descendants.
Technologie appliquée
Identification par GC-MS et LC-MS2 de substances chimiques suspectes
abandonnées de manière criminelle dans l’environnement
+
2. Analyse GC-MS en mode CI à l’acétonitrile
Par auto-ionisation dans une trappe, l’acétonitrile forme facilement des espèces réactives, dont
CH3CNH+, susceptible de protoner une grande
variété de classes de molécules de plus grande
affinité protonique, ou de conduire à un adduit,
à m/z = (M+40)+ dans le cas d’hydrocarbures à
longues chaînes, identifié comme provenant de
l’addition du cation C2H4N+ (5). Il se forme également un cation réactif intéressant à m/z=54, le
cation CH2=C=N=CH2+ (6), capable par cycloaddition sur les insaturations d’acides gras ou de tri-
100
57
Pic 1
Abondance relative %
127
+
CH -(CH ) -CO
327
DG+(C8:0/C8:0)
201 242
355
429
0
50
100
150
200
250
300
350
m/z
glycérides de conduire à un ion (M+54)+, qui après
activation collisionnelle à l’hélium dans une trappe,
produit des fragments diagnostiques permettant de
localiser les positions des doubles liaisons (7, 8, 9).
L’analyse GC-MS de l’échantillon d’huile dans ces
conditions n’a pas apporté les renseignements
souhaités concernant les masses moléculaires, y
compris pour le pic 1 (aucun signal pour un éventuel ion MH+ à m/z=471), mais des fragments majeurs aux mêmes masses que celles de l’analyse EI,
sans les fragments mineurs qui les accompagnent
(figure 3). L’absence d’adduits à (M+54)+ a indiqué
l’absence probable d’insaturations dans les chaînes
alkyles. Sous ionisation chimique, les triglycérides
saturés protonés obtenus par une variété de réactifs
différents éliminent très facilement une molécule
d’acide gras RiCOOH, et conduisent aux mêmes
ions de type DG+(AG1(n1 :m1)/ AG2(n2 : m2)),
400
450
500
Figure 2
Spectre de masse
sous ionisation
électronique à 70 eV
du pic 1.
Figure 3
Spectre de masse
sous ionisation
chimique à
l’acétonitrile du pic 2,
dans les mêmes
conditions GC que
Figure 1.
100
355
DG+(C8:0/C10:0)
Abondance relative %
La recherche des spectres de masse EI dans la bibliothèque NIST05 (2) a abouti à l’obtention d’une
liste de résultats. Le premier pic a été identifié au
tricaprylate de glycérol (tricapryline), C27H50O6,
M=470, ou TG(8:0/8:0/8:0) selon la nomenclature
recommandée des triglycérides (3), bien que ne
présentant pas d’ion moléculaire visible, grâce aux
valeurs élevées des coefficients de recherche issus
de l’analyse des principaux fragments (coefficient
direct : 775 ; coefficient inverse : 773). Ces coefficients étaient faibles pour les deux pics suivants,
laissant présager leur absence dans la bibliothèque
NIST05, mais la présence de fragments communs
aux masses apparentes inférieures à m/z= 300, a
présagé des similitudes entre ces trois composés.
Il pouvait s’agir de triglycérides homologues, se
distinguant par des longueurs de chaînes alkyles
différentes. En effet, les masses moléculaires égales ou supérieures à 470 Da, ainsi que la polarité
globale induite par les trois fonctions esters, sont
compatibles avec les températures d’élution des
pics, et leurs formes. L’ionisation électronique des
triglycérides (4) n’engendre aucun ion moléculaire,
ni de fragments abondants à son voisinage proche
(figure 2), mais des fragments abondants de type
M+∙ - RiCOO∙, correspondant à la perte sous forme
radicalaire de l’un des acides gras du triglycéride.
Le fragment obtenu équivaut à un diglycéride,
noté DG+(AG1(n1 :m1)/ AG2(n2 :m2)), ‘n’ étant
le nombre d’atomes de carbone et ‘m’ le nombre
d’insaturations des acides gras, AG1 et AG2, encore
présents. Un seul fragment DG+ apparaît lorsque
le TG est le triester du même acide gras, comme
dans le cas du pic 1 (figure 2) ; deux fragments
pour les TG combinés à deux acides gras, et trois
fragments distincts dans le cas général. Les spectre
des pic 2 et 3 ne montraient que deux fragments
abondants à respectivement m/z=327 ; 355 et
m/z=355 ; 383, laissant supposer qu’il pouvaient
s’agir de deux triglycérides ne contenant les esters
que de deux acides gras à 8 ou 10 atomes de carbone.
L’analyse en GC-EI/MS laissait encore un doute
sur l’identité du premier pic, sur les valeurs des
masses moléculaires des autres analytes et sur la
structure des chaînes alkyles. Toutefois, l’identification pouvait être poursuivie en assumant que
les bidons abandonnés contenaient un mélange de
triglycérides.
Pic 2
DG+(C8:0/C8:0)
327
0
100
150
200
250
300
350
m/z
400
450
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500
21
TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Figure 4
TG +NH
APCI-INFUSION
2
100
516.1
TG +NH
1
+
4
+
4
488.1
Abondance relative %
Spectres sous APCI+
d’un échantillon des
bidons en solution
dans un mélange
50 % eau (0,1 %
CH3COOH, 0,5 mM
CH3COONH4)/50 %
méthanol, (v/v)).
TG +NH
3
544.1
HO
2
470.5
419.1
H2 O
498.3
HO
2
+
4
TG +NH
4
526.2
+
4
572.0
663.3 680.0
0
420
440
460
480
500
520
540
que ceux obtenus sous EI. Toutefois, ils ne forment
fréquemment pas d’espèces moléculaires intactes
abondantes.
Le spectre du pic 2 montré à titre d’exemple (figure 3)
confirme les ions de type DG+ à m/z 327 et 355
déjà observés sous EI, ainsi que l’absence de tout
autres fragments mineurs ; celui du pic 3, non
présenté, montrait deux pics à m/z = 355 et 383.
Ces fragments décalés de 28 Da/z par rapport à
ceux du pic 1 pouvant être attribués à la présence de chaînes allongées de deux unités méthylènes, telles celles d’esters de l’acide caprique
AG10:0 = C10H20O2.
3. Analyses LC-MS en mode APCI+.
Plusieurs méthodes récentes d’analyse de triglycérides par spectrométrie de masse, dont la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) (10) couplée
à la chromatographie liquide, ou la désorption laser
assistée par matrice (MALDI) (11) ont occasionnellement été décrites. Cependant les études les plus
nombreuses ont utilisé l’ionisation chimique à pression atmosphérique couplée à la chromatographie en
phase liquide pour l’analyse qualitative (12, 13, 14) ou
quantitative (15, 16). L’APCI en mode positif des triglycérides apporte en effet des informations précises
sur la position et les longueurs de chaîne des acides
gras au sein d’un TG de type ABC, et différencie ceux
de type ABA et AAB (17).
L’analyse en infusant directement une solution du
contenu des bidons dans la source APCI+-MS du
LCQ a confirmé la présence des trois pics majeurs
de l’analyse GC-MS précédente, et de traces d’homologues supérieurs. Les spectres en balayage complet
de chacun d’eux, dans l’intervalle m/z =100 – 800
(figure 4) montrent des informations moléculai22
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560
580
600
620
640
660
680
m/z
res intactes majoritairement de type (M+NH4)+,
en raison de la présence d’ions NH4+ dans la solution éluante – respectivement à m/z= 488 ; 516
; 544 – et des fragments mineurs correspondant
à (M+NH4-H2O)+ – respectivement à m/z = 470 ;
498 ; 526 – selon la règle de Field qui prévoit l’expulsion du fragment neutre de plus faible affinité
protonique (PA) (ici, la perte de H2O (PA=773,8
kJ/mol ), plutôt que la perte de NH3 (PA =857,7
kJ/mol) (18, 19).
Les spectres de deuxième génération, après isolement
et activation dans la trappe des ions précurseurs de
type (M+NH4)+ ont permis d’obtenir la structure
complète des trois TGs majoritaires (figure 5). Les
dissociations des TGs en APCI+ ou en GC-CI/MS
conduisent aux mêmes ions diglycérides DG+, par
élimination de l’un des trois acides gras AGn:m =
RiCO2H des chaînes latérales. La fragmentation de la
chaîne en position sn-2 étant estimée être la plus défavorable, d’un point de vue énergétique, ce fragment
DG+ est en principe le moins abondant des ions DG+
possibles (17), ce qui achève de donner la structure
de chaque TG analysé (schéma 1).
POSITION
/
SN
(#
/
2
SN
(#
/
2
SN
(#
/
/
.(
4'2I#/
2
/
MZ4'
MZ$'4'(!'NM
Schéma 1
Principaux fragments observés dans le spectre MS2 de
l’adduit ammonium d’un triglycéride (TG).
Technologie appliquée
Identification par GC-MS et LC-MS2 de substances chimiques suspectes
abandonnées de manière criminelle dans l’environnement
100
Figure 5
APCI-Infusion-488MSMS
Spectres MS2 des adduits NH4+ des trois
composés majeurs du mélange, après
isolement des précurseurs et activation par
collision avec de l’hélium.
327.1
Abondance relative %
+
DG (C8:0/C8:0)
-H2O
470.4
488.1
0
200
100
250
300
350
400
450
500
APCI-Infusion-516MSMS
355.1
Abondance relative %
DG+(C8:0/C10:0)
DG+(C8:0/C8:0)
327.1
-H2O 516.1
498.4
0
200
300
APCI-Infusion-7-544MSMS_1
350
400
450
500
355.1
DG+(C8:0/C10:0)
Abondance relative %
100
250
383.1
DG+(C10:0/C10:0)
-H2O
526.0
544.
327.2
0
200
250
300
350
En conséquence, les trois constituants majeurs
du contenu du bidon sont identifiés comme
étant le tricaprylate de glycérol, TG1(C 8 :0/
C8 :0/C8 :0), M=470,7 ; le dicaprylate-caprate de
glycérol, TG 2(C8 :0/C10 :0/C8 :0), M=498,7 ; le caprylate-dicaprate de glycérol, TG3(C10 :0/C 8 :0/
C10 :0), M=526,8 . La présence d’un homologue
mineur à M=554 a été également observée au
cours de l’analyse en mode APCI+ (figure 4). Ces
triglycérides possèdent des chaînes latérales
relativement courtes, d’où les propriétés liquides du contenu des bidons abandonnés, mais
sont considérés comme n’étant pas toxiques.
400
450
500
IV - Conclusions
Les analyses au laboratoire de l’IRCGN ont permis de
conclure rapidement que le contenu des bidons abandonnés dans l’environnement était un mélange de triglycérides saturés d’origine végétale, connu pour être
utilisé pour ses propriétés lubrifiantes, ou pour servir
de solvant ou d’émollient en pharmacie et en cosmétique. Il ne présentait pas de risque toxique immédiat
pour l’environnement, mais a nécessité d’être enlevé et
détruit par une entreprise spécialisée. Ces résultats ne
mettent pas un terme à l’enquête, à charge pour l’officier de police judiciaire de trouver l’auteur de l’abandon
puisqu’il peut désormais orienter ses investigations sur
l’industrie susceptible d’utiliser ce produit.
Cet exemple est représentatif des problèmes analytiques a priori inconnus susceptibles d’être traités, et des
moyens mis en œuvre par les personnels qualifiés de
l’IRCGN.
SPECTRA ANALYSE n° 259 • Décembre 2007
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
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