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PLATELIA™ ASPERGILLUS Ag
96 TESTS
62794
PLATELIA™ ASPERGILLUS Ag EST UN TEST IMMUNOENZYMATIQUE DE TYPE SANDWICH SUR MICROPLAQUE POUR LA
DÉTECTION DE L'ANTIGÈNE GALACTOMANNANE D'ASPERGILLUS
DANS DES ÉCHANTILLONS DE SÉRUM ET DE LIQUIDE DE LAVAGE
BRONCHO-ALVÉOLAIRE(LBA)
TABLE DES MATIÈRES
30
1-
BUT ...............................................................................................................................31
2-
INDICATIONS D'UTILISATION .....................................................................................31
3-
INTERET CLINIQUE .....................................................................................................31
4-
PRINCIPE DE LA PROCEDURE...................................................................................31
5-
REACTIFS .....................................................................................................................32
6-
CONSIGNES D’HYGIENE ET DE SECURITE...............................................................33
7-
PRECAUTIONS D’UTILISATION ..................................................................................34
8-
PREPARATION ET CONSERVATION DES REACTIFS.................................................34
9-
ECHANTILLONS ...........................................................................................................35
10-
PROCEDURE................................................................................................................36
11-
CONTROLE DE QUALITE (CRITERES DE VALIDITE) .................................................38
12-
INTERPRETATION DES RESULTATS ...........................................................................39
13-
LIMITES D’UTILISATION ..............................................................................................40
14-
VALEURS ATTENDUES ................................................................................................42
15-
PERFORMANCES ........................................................................................................46
16-
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..........................................................................54
1- BUT
Platelia™ Aspergillus Ag est un test immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque pour la
détection de l'antigène galactomannane d'Aspergillus dans les échantillons de sérum d’adultes et
d’enfants et dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire (LBA).
Platelia™ Aspergillus Ag est un test qui, utilisé en association avec d'autres techniques de diagnostic
telles qu'une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et un examen radiographique,
peut être utilisé comme une aide pour le diagnostic de l'aspergillose invasive.
2- INDICATIONS D'UTILISATION
Platelia™ Aspergillus Ag est un test immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque pour
la détection de l'antigène galactomannane d' Aspergillus dans les échantillons de sérum d’adultes
et d’enfants et dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire (LBA).
Platelia™ Aspergillus Ag est un test qui, utilisé en association avec d'autres techniques de
diagnostic telles qu'une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et un examen
radiographique, peut être utilisé comme une aide pour le diagnostic de l'aspergillose invasive.
3- INTERET CLINIQUE
Les infections aspergillaires débutent habituellement dans le poumon suite à l’inhalation de spores
d’Aspergillus présents dans l'environnement. Les formes invasives, de plus en plus fréquentes
depuis ces 10 dernières années, représentent les infections les plus graves. Elles surviennent
principalement chez les patients neutropéniques (après un traitement anti-cancéreux), chez les
patients traités par immunosuppresseurs (transplantations d'organe et en particulier greffe de
moelle osseuse) et chez les patients sous corticostéroïdes 10.
Aspergillus est rarement isolé à partir d’hémocultures. Le diagnostic repose le plus souvent sur
des critères non spécifiques comme les symptômes cliniques ou le diagnostic radiologique( CT
scan, radiographie du thorax, etc.).
Le test de détection de l'antigène soluble galactomannane dans le sérum représente une méthode
sérologique capable de faciliter le diagnostic d’aspergillose invasive 9, 12, 23, 54, 62.
De plus, pour les patients receveurs d'une transplantation d'organe solide, la détection de
l'antigène galactomannane dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) s'est avérée
avantageuse pour le diagnostic d'aspergillose invasive 8,17,18.
4- PRINCIPE DE LA PROCEDURE
45
Le test Platelia™ Aspergillus Ag est une technique immuno-enzymatique de type sandwich, en une
étape, sur microplaque permettant la détection de l’antigène galactomannane dans le sérum et le
liquide de LBA humains. Les anticorps monoclonaux de rat EBA-2, dirigés contre le
galactomannane d'Aspergillus, caractérisés au cours d'études antérieures 25, 46 sont utilisés,(1) pour
sensibiliser les puits de la microplaque et se lier à l'antigène, et (2) pour détecter l'antigène fixé à
la microplaque sensibilisée (conjugué: anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase). Les
échantillons de sérum ou de liquide de LBA sont traités à la chaleur en présence d'EDTA afin de
dissocier les complexes immuns et de précipiter les protéines susceptibles d'interférer avec le
test 24. Les échantillons traités et le conjugué sont ajoutés dans les puits sensibilisés avec les
anticorps monoclonaux puis incubés. Un complexe anticorps monoclonal - galactomannane anticorps monoclonal / peroxydase se forme en présence de l'antigène galactomannane. Les
barrettes sont lavées pour éliminer tout matériel non lié. La solution de TMB chromogène est
ensuite ajoutée ; elle réagit avec les complexes liés au puits en formant une réaction de couleur
bleue. La réaction enzymatique est arrêtée par ajout d'acide, ce qui fait passer la couleur du bleu
au jaune. L'absorbance (densité optique) des échantillons et des contrôles est déterminée par un
spectrophotomètre réglé à une longueur d'ondes de 450 et 620/630 nm.
31
5- REACTIFS
Platelia™ Aspergillus Ag : code produit n° 62794 (96 tests)
Conserver le kit entre 2 et 8 °C. Porter tous les réactifs à température ambiante (18-25 °C) au
moins 30 minutes avant utilisation. Replacer tous les réactifs à une température de 2-8 °C
immédiatement après utilisation. Replacer les barrettes/microplaques non utilisées dans le sachet
et le refermer avec soin.
Tous les réactifs, à l’exception de la solution de lavage concentrée(R2) et de la solution d’arrêt
(R10), doivent être utilisés dans les 8 semaines suivant leur ouverture. Après ouverture, la solution
de lavage concentrée (R2) et la solution d’arrêt (R10) sont stables jusqu’à la date de péremption.
Les réactifs sont fournis en quantités suffisantes pour réaliser 96 tests en un maximum de 9 séries.
Composant
R1
Microwell
Strip
Plate
R2
Concentrated
Washing
Solution (20X)
R3
Contenu
Quantité
Microplaque :
- 96 puits (12 barrettes de 8 puits chacune) sensibilisés
avec les anticorps monoclonaux anti-galactomannane
- Onglets de barrettes marqués "85"
1 microplaque /
12 x 8 puits
Solution de lavage concentrée (20X) :
- Tampon Tris NaCl (pH 7,4)
- 2 % Tween® 20
- Conservateur : ProClin™ 300 <1,5 %
1 x 70 ml
Negative
Control
Serum
Sérum de contrôle négatif :
- Sérum humain négatif
- Testé négatif pour les anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2,
anti-VHC et pour l'Ag HBs
2 x 1,7 ml
R4
Cut-off
Control
Serum
Sérum de contrôle seuil :
- Sérum humain contenant du galactomannane
2 x 1,7 ml
R5
Positive
Control
Serum
Sérum de contrôle positif :
- Sérum humain contenant du galactomannane
2 x 1,7 ml
R6
Conjugate
Conjugué (prêt à l'emploi) :
- Anticorps monoclonal anti-galactomannane
marqué à la peroxydase
1 x 8 ml
R7
Sample
Treatment
Solution
Solution de traitement des échantillons (prête à
l'emploi) :
- Solution acide d'EDTA
1 x 13 ml
R9
Chromogen:
TMB
Solution
Solution de TMB chromogène (prête à l'emploi) :
- 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine§ (<0,1 %)
- H2O2 (<1,0 %)
1 x 28 ml
R10
Stopping
Solution
Solution d'arrêt (prête à l'emploi) :
- Solution d'acide sulfurique 1 N (H2SO4)
1 x 28 ml
Plate sealers
- Feuilles adhésives pour microplaques
1 x 8 feuilles
*Remarque : Le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) est un chromogène de la peroxydase non
carcinogène et non mutagène.
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6- CONSIGNES D’HYGIENE ET DE SECURITE
1. Pour diagnostic in vitro, uniquement.
2. Pour usage professionnel, uniquement.
3. L'utilisation de ce test avec des échantillons autres que du sérum et des liquides de LBA humains
n'est pas recommandée.
4. Le contrôle positif, le contrôle seuil et le contrôle négatif sont préparés à partir de sérum humain qui
a été testé négatif en antigène HBs ainsi qu’en anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2 et anti-VHC avec des
tests marqués CE. Cependant, tous les réactifs doivent être manipulés comme s’ils étaient
potentiellement infectieux. Tous les tests doivent être pratiqués conformément à la norme OSHA
relative aux agents pathogènes transmis par voie hématogène, niveau 2 de biosécurité, ou
conformément à d’autres pratiques de biosécurité adaptées.
5. Porter des vêtements de protection, notamment une blouse de laboratoire, un dispositif de protection
des yeux et du visage ainsi que des gants jetables (des gants synthétiques sans latex sont
recommandés) et manipuler les réactifs du kit ainsi que les échantillons de patients conformément
aux Bonnes Pratiques de Laboratoire requises. Se laver soigneusement les mains après avoir réalisé
le test.
6. Ne pas pipeter à la bouche.
7. Ne pas fumer, boire ni manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs du kit sont
manipulés.
8. Éviter les éclaboussures d’échantillons ou de solutions.
9. Les surfaces souillées par un liquide contaminant ne contenant pas d'acide, doivent être
soigneusement nettoyées avec un désinfectant efficace. Les désinfectants pouvant être utilisés
incluent (mais ne sont pas limités à) une solution d'eau de Javel à 10 % (solution d'hypochlorite de
sodium à 0,5 %), d'éthanol à 70 % ou de Wescodyne Plus™ à 0,5 %. Le matériel utilisé pour le
nettoyage devra être éliminé dans un container spécial pour déchets contaminés.
ATTENTION : Ne pas placer de solutions contenant de l'eau de Javel dans un autoclave.
10. Les surfaces souillées par un liquide contaminant contenant de l’acide doivent être essuyées (avec
absorption préalable du liquide) ou neutralisées avec du bicarbonate de sodium et la zone souillée
doit être rincée et séchée ; dans le cas où le liquide contaminant contiendrait des matières présentant
un danger biologique, nettoyer la zone avec l’un des désinfectants chimiques.
11. Éliminer l’ensemble des échantillons et du matériel utilisé pour réaliser le test comme s'ils étaient
potentiellement infectieux. L’élimination des déchets chimiques et biologiques dangereux doit
s’effectuer conformément aux exigences en vigueur.
12. ATTENTION : vous trouverez ci-dessous une liste des réactifs chimiques potentiels présentés
par certains composants du kit (se reporter au chapitre 5- REACTIFS) :
Xi-Irritant
ATTENTION : conformément aux exigences réglementaires de l'UE et des ÉtatsUnis, certains réactifs contiennent du ProClin™ 300 < 1,5 %.
R43* : Peut causer une sensibilisation par contact avec la peau
S23-24-37-60*: Ne pas respirer les vapeurs/aérosols. Éviter le contact avec la peau.
Porter des gants appropriés. Ces produits et leurs contenants doivent être éliminés
comme des déchets dangereux.
* Les phrases de Risques (R) et de Sécurité (S) (2001/59/EC) fournissent des informations sur les
préparations dangereuses.
Conformément aux exigences réglementaires en vigueur aux États-Unis, la solution
d'arrêt d'acide sulfurique 1,0 N (H2SO4) est très irritante ou corrosive pour la peau
et les yeux, selon la quantité et la durée d'exposition ; des expositions prolongées
peuvent entraîner des lésions oculaires, notamment des troubles définitifs de la
C-Corrosif
vision. En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment à
l’eau et consulter un médecin.
Conserver à l'écart des bases fortes et des agents réducteurs ; ne pas verser d'eau ni d'eau de
Javel dans ce réactif. Les déchets issus de ce produit sont considérés comme des déchets acides
dangereux mais, si la réglementation en vigueur l'autorise, ils peuvent être neutralisés à pH de 68 avant d’être éliminés comme des déchets non dangereux à condition que les utilisateurs soient
formés et équipés pour exécuter cette procédure.
13. La fiche de données de sécurité (FDS) est disponible sur demande ou sur www.bio-rad.com
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7- PRECAUTIONS D’UTILISATION
1. LES ÉCHANTILLONS DE SÉRUM OU DE LIQUIDE DE LBA CONGELÉS ET CONSERVÉS DANS
DES CONDITIONS INCONNUES PEUVENT DONNER DES RÉSULTATS FAUSSEMENT POSITIFS
EN RAISON D'UNE CONTAMINATION PAR DES CHAMPIGNONS ET/OU DES BACTÉRIES.
2. Ne pas utiliser le kit ni l’un des réactifs du kit au-delà de la date de péremption indiquée.
3. Ne pas mélanger de réactifs provenant d’autres kits portant des numéros de lot différents, à
l’exception de la solution de lavage (R2, identification* : 20x de couleur verte), du chromogène (R9,
identification* : TMB de couleur turquoise) et de la solution d'arrêt (R10, identification* : 1 N de couleur
rouge), à condition que ces réactifs soient strictement équivalents et qu’ils portent le même numéro
de lot pour une série donnée de tests.
*sur l'étiquette du flacon
REMARQUE : une solution de lavage (R2, identifiée* par la mention 20x en vert) ne peut être
mélangée à une solution de lavage (R2 identifiée* par la mention 10X en bleu) fournie dans les
kits de réactif Bio-Rad.
*sur l'étiquette du flacon
4. Porter tous les réactifs à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
5. Mélanger soigneusement tous les réactifs avant utilisation.
6. Mélanger soigneusement la solution de lavage concentrée (R2) avant de préparer la solution de lavage
diluée, en veillant à éviter toute contamination microbienne.
7. Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de
poussières qui pourraient altérer l’activité enzymatique du conjugué.
8. Lors du pipetage manuel des contrôles et des échantillons, utiliser un nouveau cône de distribution
pour chaque contrôle ou chaque échantillon de manière à éviter toute contamination.
9. Pour assurer un lavage adéquat des puits, respecter le nombre de cycles de lavage recommandé et
s'assurer que tous les puits soient entièrement remplis puis entièrement vidés. Le lavage ne doit pas
être réalisé manuellement avec un flacon déformable (« pissette »).
10. Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du cycle de lavages et l'ajout des réactifs.
11. Ne pas utiliser le même récipient pour le conjugué et la solution TMB chromogène.
12. Empêcher que le conjugué ou la solution de chromogèneTMB n’entrent en contact avec des métaux
ou des ions métalliques.
13. Éviter l'exposition de la solution chromogène TMB à toute lumière vive pendant la conservation ou
l'incubation. Ne pas laisser les solutions contenant le chromogène entrer en contact avec un agent
oxydant.
14. Éviter tout contact de la solution d'arrêt avec un quelconque agent oxydant. Empêcher que la solution
d'arrêt n’entre en contact avec des métaux ou des ions métalliques.
15. Utiliser du matériel (tubes, cônes de distribution, récipients, etc.)propre et sans poussières pour
minimiser le risque de contamination par des spores d'Aspergillus présents dans l'environnement.
Le galactomannane étant thermostable, la stérilisation du matériel utilisé ne garantit pas l'absence
d'antigène contaminant. L’utilisation de matériel apyrogène est optimale, mais il est possible d'utiliser
du matériel standard à condition d'appliquer des précautions adéquates.
16. Limiter toute exposition à l'air des solutions (sérum, liquide de LBA, solution de traitement de
l'échantillon, conjugué) ou des récipients ouverts (microplaques, tubes, pipettes).
17. Ne pas reverser dans son flacon d’origine, le surplus de conjugué non distribué.
18. La solution de chromogène TMB doit être incolore. Si cette solution est bleue, le réactif est contaminé
et il ne doit pas être utilisé.
8- PREPARATION ET CONSERVATION DES REACTIFS
Microplaque (R1)
Chaque cadre contenant 12 barrettes est emballé dans un sachet. Ouvrir le sachet avec des ciseaux juste
en dessous de la soudure. Ouvrir le sachet et en sortir le cadre. Replacer le cadre contenant les barrettes
inutilisées dans le sachet d'origine. Refermer le sachet soigneusement et conserver entre 2 et 8 °C.
Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées entre 2 et 8 °C dans leur sachet d'origine
soigneusement refermé sont stables pendant 8 semaines. Vérifier que le dessicant est toujours présent.
34
Solution de lavage (R2)
Préparer la solution de lavage diluée selon les besoins, en diluant 20 fois la solution de lavage concentrée
(R2) dans de l’eau désionisée ou distillée (une part de solution de lavage concentrée (R2) pour 19 parts
d'eau désionisée ou distillée). La solution de lavage ainsi diluée peut être conservée 14 jours à une
température de 2-30 °C. Préparer une quantité de solution de lavage diluée suffisante pour réaliser une
série complète (80 ml pour une barrette : 4 ml de R2 + 76 ml d'eau distillée).
Après ouverture, la solution de lavage concentrée, conservée à +2-30 °C, est stable jusqu'à la date de
péremption indiquée sur l'étiquette en l'absence de contamination.
Sérum de contrôle négatif (R3), sérum de contrôle seuil (R4) et sérum de contrôle positif
(R5)
Les contrôles doivent être traités à la chaleur en présence de la solution de traitement des échantillons
(R7) comme des échantillons de patient afin de servir de témoin de traitement.
Après ouverture, ces réactifs sont stables pendant 8 semaines s'ils sont conservés à +2-8 °C en
l'absence de contamination.
Conjugué (R6), Solution de traitement de l'échantillon (R7), Solution de chromogène TMB
(R9)
Ces réactifs sont prêts à l'emploi.
Après ouverture, ces réactifs sont stables pendant 8 semaines s'ils sont conservés à +2-8 °C en
l'absence de contamination.
Solution d'arrêt (R10)
Ce réactif est prêt à l'emploi.
Après ouverture, ce réactif est stable jusqu'à la date de validité indiquée sur l'étiquette s'il est conservé
à +2-8 °C, en l'absence de contamination.
9- ECHANTILLONS
Ce test est réalisé sur du sérum ou du liquide de LBA.
I. SERUM
Prélever les échantillons de sang conformément aux procédures standards de laboratoire. Les
échantillons de sérum ne doivent pas être contaminés par des spores de champignon ni par des
bactéries. Transporter et conserver les échantillons dans des tubes scellés et à l'abri de l'air. Les
échantillons non ouverts peuvent être conservés
à +2 -8 °C pendant 5 jours avant réalisation du test. Après la première ouverture, les échantillons peuvent
être conservés à + 2 -8 °C pendant 48 heures avant réalisation du test. Pour une conservation plus
longue, congeler le sérum à -70 °C.
Les échantillons de sérum peuvent supporter au maximum 4 cycles de congélation / décongélation.
Les échantillons préalablement congelés devront être soigneusement homogénéisés après
décongélation avant réalisation du test.
Les résultats ne sont pas affectés pour les échantillons contenant 20 mg/l de bilirubine, les échantillons
lipémiques contenant l'équivalent de 2 g/l de trioléine (triglycéride) ou les échantillons hémolysés contenant
500 mg/dl d'hémoglobine. Les interférences liées à une surcharge en albumine n'ont pas été testées.
Ne pas décomplémenter le sérum.
II. LIQUIDE DE LBA
Prélever les échantillons de liquide de LBA conformément aux procédures standards de laboratoire.
Les échantillons de liquide de LBA doivent être prélevés en solution saline stérile. Soit ils sont utilisés
tels quels, soit ce sont les surnageants
d’ échantillons centrifugés (à 10 000 tours/minute pendant 10 minutes) qui sont utilisés pour le traitement
à la chaleur en présence de solution acide d’EDTA, comme indiqué au chapitre 10.
Les échantillons de liquide de LBA ne doivent pas être contaminés par des spores de champignon ni
par des bactéries. Transporter et conserver les échantillons dans des tubes scellés et à l'abri de l'air.
Après la première ouverture, les échantillons peuvent être conservés à +2-8 °C pendant 24 heures au
maximum. Pour une conservation plus longue, conserver les échantillons de liquide de LBA congelés
(à -20°C ou à une température inférieure) pendant 5 mois au maximum.
35
Les échantillons de liquide de LBA peuvent supporter un maximum de 4 cycles de congélation /
décongélation. Les échantillons précédemment congelés doivent être soigneusement homogénéisés
après décongélation avant réalisation du test.
10- PROCEDURE
Matériel fourni
Voir la section REACTIFS.
Matériel nécessaire mais non fourni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Eau distillée ou désionisée pour la dilution de la solution de lavage concentrée.
Papier absorbant.
Gants à usage unique.
Lunettes de protection.
Hypochlorite de sodium (eau de Javel) et bicarbonate de sodium.
Pipettes ou multipipettes réglables ou fixes pour mesurer et distribuer des volumes de 50 µl, 100 µl,
300 µl et 1 000 µl.
7. Tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 ml avec bouchons étanches à l'air, capables
de supporter une chaleur de 120 °C (bloc chauffant) ou de 100 °C (bain-marie bouillant).
• Bouchons à vis et tubes : tubes coniques de 1,5 ml, réf. Bio-Rad #224-0100, ou équivalents.
OU
• Tubes avec capuchon attenant : tubes EZ Micro Test, 1,5 ml, réf. Bio-Rad #223-9480, ou
équivalents.
• Cavaliers de vérouillage(aux États-Unis : réf. Fischer Scientific # NC9346739) ou équivalents, en
dehors des États-Unis : réf. VWR #6054001 ou équivalent). Ces cavaliers ferment hermétiquement
les tubes avec capuchon attenant en empêchant l'ouverture des bouchons lors des changements
de température et de pression et permettent en outre de soulever facilement les tubes pour les
extraire du bloc chauffant ou du bain-marie bouillant.
8. Centrifugeuse de paillasse pour tubes en polypropylène de 1,5 ml permettant une centrifugation à
10 000 g (réf. Brinkman #22-36-280-1 ou réf. VWR Scientific #20901-051 ou équivalent).
9. Utilisation d'un bloc chauffant pour le traitement du sérum/liquide de LBA:
• Bloc chauffant. Les modèles suivants sont recommandés :
• Modèle à un bloc : Réf. Grant # QBD-1 L - en dehors des États-Unis : réf. Grant# QBD1 distribué
par VWR sous la référence# 460-0074)
• Modèle à deux blocs : Réf. Grant# QBD-2 L - en dehors des États-Unis : réf. Grant # QBD2
distribué par VWR sous la référence #460-0076)
• Bloc pour blocs chauffants : les deux blocs chauffants (QBD-1 L, QBD1 et QBD-2L, QBD2)
doivent être utilisés avec le bloc Grant réf. #QB-E1 distribué en dehors des États-Unis par VWR
sous la référence# 460-8517
10.
11.
12.
13.
Utilisation d'un bain-marie bouillant pour le traitement du sérum/liquide de LBA:
• Portoir de microcentrifugation rond flottant pour bécher d'1 l (aux États-Unis : réf. VWR Scientific
# 60986 -100 ou réf. Nalgene # 5974-1015 ou équivalent).
• Bain-marie bouillant à 100 °C.
Agitateur de type « vortex ».
Incubateur de microplaques pouvant être thermostaté à 37 ± 1 °C
Laveur de microplaques semi-automatique ou automatique.
Lecteur de microplaques équipé de filtres de 450 nm et de 620/630 nm.
Commentaires sur la procédure
Le contrôle négatif, le contrôle positif et le contrôle seuil doivent être testés lors de chaque série pour
valider les résultats du test.
36
Traitement du sérum/liquide de LBA
Tous les sérums de contrôle : négatif (R3), seuil (R4) et positif (R5) doivent être traités en même temps
que les échantillons de sérum/liquide de LBA :
1. Distribuer 300 µl de chaque sérum à tester/liquide de LBA et de chaque contrôle dans un tube en
polypropylène individuel de 1,5 ml.
2. Ajouter 100 µl de solution de traitement de l'échantillon (R7) dans chaque tube.
3. Homogénéiser le contenu des tubes en agitant vigoureusement ou en vortexant. Fermer
hermétiquement les tubes afin de prévenir leur ouverture pendant le chauffage.
4. Option bloc chauffant :
Chauffer les tubes pendant 6 minutes dans un bloc chauffant à 120°C. Les tubes ne doivent être
placés dans le bloc que lorsque la température prescrite est atteinte (*).
OU
Option bain-marie :
En cas d'utilisation d'un bain-marie bouillant : chauffer les tubes pendant 3 minutes à 100 °C (*).
Les tubes ne doivent être placés dans le bain-marie que lorsque la température prescrite est atteinte.
5. Retirer soigneusement les tubes chauds du bloc chauffant ou du bain-marie bouillant et les
placer dans une centrifugeuse. Centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 10 minutes. On utilise
le surnageant de centrifugation pour la détection de l'antigène galactomannane.
6. Tester les surnageants selon la procédure suivante. Après traitement de l’échantillon, le
surnageant peut être prélevé et conservé à +2 et 8 °C pendant 48 heures au maximum avant
réalisation du test. Si l'analyse des résultats indique qu'il faut retester l’échantillon, un autre
aliquot de cet échantillon doit être traité pour réalisation du test.
(*) Le strict respect des consignes de température et de durée ainsi que l'utilisation du matériel
recommandé sont essentiels à la réussite du test.
Ne pas se fier à la température affichée par l'appareil mais vérifier que la température est
conforme aux spécifications en utilisant une sonde thermique qui sera introduite dans un tube
contenant de l’ huile minérale : une température de 120 °C doit être atteinte à l'intérieur du tube
dans un bloc chauffant et une température de 100 °C doit être atteinte dans un bain-marie
bouillant.
Procédure EIA
Respecter strictement le protocole indiqué.
Respecter les bonnes pratiques de laboratoire.
1. Porter les réactifs à température ambiante (+18-25 °C) pendant au moins 30 minutes avant
utilisation.
2. Préparer la solution de lavage diluée.
3. Etablir le plan d’identification des échantillons de sérum/liquide de LBA à tester et des contrôles dans
la microplaque. Utiliser un puits pour le sérum de contrôle négatif (R3), deux puits pour le sérum de
contrôle seuil (R4) et un puits pour le sérum de contrôle positif (R5).
1
2
3
A
R5
S5
S13
B
R4
S6
C
R4
S7
D
R3
S8
E
S1
S9
F
S2
S10
G
S3
S11
H
S4
S12
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4. Retirer le support de microplaque et les barrettes (R1) du sachet. Remettre les barrettes non utilisées
dans le sachet avec le dessicant et refermer le sachet.
37
5. Mélanger le contenu du flacon de conjugué (R6) par retournement du flacon avant utilisation. Ajouter
50 µl de conjugué (R6) dans chaque puits. Ajouter ensuite 50 µl du surnageant de sérum/LBA traité
dans chaque puits, comme indiqué ci-dessus. Ne pas ajouter les surnageants des échantillons de
sérum/liquide de LBA dans les puits avant d'ajouter le conjugué.
6. Couvrir la microplaque avec un film adhésif en appuyant bien sur toute la surface ou par un autre
moyen pour empêcher l'évaporation, en vérifiant que la totalité de la surface est recouverte afin
d’assurer l’étanchéité vis-à-vis de l'eau.
7. Incuber la microplaque dans un incubateur sec de microplaques pendant 90 ± 5 minutes at 37°C
(± 1°C).
8. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de chaque puits dans un container pour déchets (contenant
de l'hypochlorite de sodium). Laver la microplaque 5 fois avec un laveur de microplaques (en
utilisant 800 µl de solution de lavage diluée). Après le dernier lavage, retourner la microplaque et la
tapoter doucement sur du papier absorbant pour éliminer tout liquide restant.
9. Ajouter rapidement 200 µl de la solution chromogène de TMB (R9) dans chaque puits en évitant toute
exposition à une lumière vive.
10. Incuber la microplaque à l’obscurité à temperature ambiante (+18-25°C) pendant 30 ± 5 minutes. Ne
pas utiliser de film adhésif au cours de cette incubation.
11. Ajouter 100 µl de solution d'arrêt (R10) dans chaque puits en suivant le même ordre que pour l'ajout
de la solution chromogène de TMB. Bien mélanger.
12. Essuyer soigneusement le dessous de chaque plaque.
13. Lire la densité optique(DO) de chaque puits à 450 nm (filtre de référence de 620/630 nm) dans les
30 minutes suivant l'ajout de solution d'arrêt.
11- CONTROLE DE QUALITE (CRITERES DE VALIDITE)
Contrôle seuil : la DO de chaque sérum de contrôle seuil doit être
≥ 0,300 et ≤ 0,800.
Contrôle positif : l'index du sérum de contrôle positif doit être supérieur à 1,50.
I = DO du contrôle positif (R5)
DO moyenne du contrôle seuil
> 1,50
Contrôle négatif : l'index du sérum de contrôle négatif doit être inférieur à 0,40.
I = DO du contrôle négatif (R3)
< 0,40
DO moyenne du contrôle seuil
Si l'un des contrôles ne remplit pas les critères de validité décrits ci-dessus, le test est invalidé et les
résultats obtenus pour l'échantillon de patient ne doivent pas être pris en compte. L'utilisateur peut
décider de refaire le test après avoir passé en revue la procédure ou peut contacter le fabricant pour
obtenir une assistance. Si le test est répété, un nouvel aliquot de ce même échantillon doit être utilisé.
Exemple de calcul :
Échantillon
Contrôle négatif (R3)
Absorbance (DO)
0,116
Contrôle seuil (R4)
0,513
0,533
Contrôle positif (R5)
1,834
Calculs
Valeur moyenne de la DO du sérum de contrôle seuil (valeur seuil)
Pour calculer la DO moyenne du contrôle seuil (R4), additionner les valeurs de DO des deux puits
contenant le contrôle seuil et diviser le résultat par 2 :
(0,513 + 0,533) ÷ 2 = 0,523
38
Index du contrôle négatif
Pour calculer l'index du contrôle négatif, diviser la DO du contrôle négatif par la valeur seuil :
I = 0,116 = 0,22
0,523
Index du contrôle positif
Pour calculer l'index du contrôle positif, diviser la DO du contrôle positif par la valeur seuil :
I = 1,834 = 3,51
0,523
Validation de l’essai
• La DO de chaque contrôle seuil est ≥ 0,300 et ≤ 0,800, indiquant que le contrôle seuil est valide.
• L'index du contrôle négatif est < 0,40, indiquant que le contrôle négatif est valide.
• L'index du contrôle positif est > 1,50, indiquant que le contrôle positif est valide.
Dans cet exemple, le test est validé car les résultats remplissent les critères de validité pour chaque
contrôle.
12- INTERPRETATION DES RESULTATS
La présence ou l'absence de l'antigène galactomannane dans l'échantillon testé est déterminée par le
calcul d'un index pour chaque échantillon de patient. L'index (I) est la DO de l'échantillon divisée par la
valeur seuil.
Calcul de la valeur moyenne de la DO du contrôle seuil (valeur seuil) :
Additionner les DO des deux puits contenant le sérum de contrôle seuil (R4) et diviser le résultat obtenu
par 2.
Calcul d'un index (I) pour chaque échantillon testé :
Calculer le ratio suivant pour chaque échantillon testé :
I = DO de l’échantillon
Valeur seuil
Interprétation des résultats des sérums/liquides de LBA ayant un index < 0,50 :
Les sérums/liquides de LBA ayant un index < 0,50 sont considérés comme négatifs pour la
présence de l'antigène galactomannane.
Remarque : l'obtention d'un résultat négatif peut indiquer que le résultat du patient est inférieur au seuil
de détection du test. Les résultats négatifs n'excluent pas un diagnostic d'aspergillose invasive. Si une
aspergillose invasive est suspectée mais que le résultat du test est négatif, il conviendra de répéter le
test.
Interprétation des résultats des sérums/liquides de LBA ayant un index ≥ 0,50
Les sérums/liquides de LBA ayant un index ≥ 0,50 sont considérés comme positifs pour la
présence de l'antigène galactomannane.
Pour tous les patients positifs, il est recommandé de tester un nouvel aliquot du même échantillon
(sérum/LBA).
Remarque : Une valeur de DO inférieure à 0,000 peut indiquer une erreur dans la procédure ou une
erreur liée aux instruments, qu'il conviendra d'évaluer. Ce résultat est invalide et l'échantillon doit être
re-testé.
Un dépistage régulier (deux fois par semaine) d'échantillons de sérum de patients à haut risque est
recommandé afin d'accroître la sensibilité et la précocité de positivité du test.
Remarque : Le test Platelia™ Aspergillus Ag est destiné à être utilisé comme une aide au diagnostic
d'aspergillose invasive. Les résultats positifs obtenus avec le test Platelia™ Aspergillus Ag doivent être
interprétés en conjonction avec les résultats obtenus avec d'autres procédures diagnostiques telles
qu'une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et une radiographie.
39
Exemple de calcul :
Échantillon
Contrôle négatif (R3)
Contrôle seuil (R4)
Contrôle positif (R5)
Échantillon du patient # 1
Absorbance (DO)
0,116
0,513
0,533
1,834
0,134
0,436
1,196
Calculs
Se reporter au chapitre contrôle de qualité (critères de validité) pour un exemple de calcul permettant
de déterminer la validité des résultats obtenus avec les contrôles du test.
Valeur moyenne de la DO du sérum de contrôle seuil (valeur seuil)
Pour calculer la DO moyenne du contrôle seuil (R4), additionner les valeurs de DO des deux puits
contenant le contrôle seuil et diviser le résultat par 2 :
(0,513 + 0,533) ÷ 2 = 0,523
Pour calculer l'index de l'échantillon du patient n° 1, diviser la DO de l'échantillon du patient n° 1 par la
valeur seuil :
I = 0,134 = 0,26
0,523
Dans cet exemple, l'échantillon du patient n° 1 est négatif car l'index, égal à 0,26, est inférieur à 0,50.
Pour calculer l'index de l'échantillon du patient # 2, diviser la DO de l'échantillon du patient # 2 par la
valeur seuil :
I = 0,436 = 0,83
0,523
Dans cet exemple, l'échantillon du patient # 2 est positif car l'index, égal à 0,83, est ≥ 0,50.
Pour calculer l'index de l'échantillon du patient # 3, diviser la DO de l'échantillon du patient # 3 par la
valeur seuil :
I = 1,196 = 2,29
0,523
Dans cet exemple, l'échantillon du patient # 3 est positif car l'index, égal à 2,29, est ≥ 0,50.
Se référer au paragraphe sur l’interprétation des résultats positifs, au chapitre.12.
13- LIMITES D’UTILISATION
1. L'obtention d'un résultat négatif sur des échantillons de sérum et/ou de LBA n'exclut pas le
diagnostic d'aspergillose invasive. Un prélèvement de sérum doit être effectué deux fois par
semaine chez les patients à risque d'aspergillose invasive afin de réaliser le test.
2. La procédure et l'interprétation des résultats décrites pour le test Platelia™ Aspergillus Ag doivent
être respectées lors de la réalisation de la détection de l'antigène galactomannane dans les
échantillons. Il est recommandé à l'utilisateur du kit de lire attentivement la notice avant de réaliser
le test. La procédure du test doit être strictement respectée en particulier lors du pipetage des
échantillons et des réactifs, du lavage des microplaques et pour la durée des étapes d'incubation.
3. Si l'échantillon ou les réactifs ne sont pas ajoutés conformément aux instructions de la procédure, le
résultat du test peut être faussement négatif. La répétition du test sur un nouvel échantillon du
même patient doit être envisagée en cas de suspicion clinique d'aspergillose invasive ou
lorsqu'une erreur est survenue au cours de la procédure.
40
4. La contamination des puits contenant des échantillons de patients négatifs par des puits contenant
des contrôles positif ou des échantillons de patient positif est possible si le contenu d'un puits
déborde dans un autre puits du fait d'une manipulation maladroite de la microplaque ou en raison
d'une mauvaise technique de pipetage lors de l'addition des réactifs.
5. Les performances du test Platelia™ Aspergillus Ag n'ont pas été évaluées sur des échantillons
prélevés chez des nouveau-nés. La bibliographie Européenne relève une incidence plus élevée de
résultats faussement positifs pour la détection du galactomannane dans les échantillons prélevés
chez des nouveau-nés 13, 15, 33, 44.
6. Le test Platelia™ Aspergillus Ag peut présenter une sensibilité réduite dans la détection du
galactomannane chez les patients atteints de maladie granulomateuse chronique (CGD) et du
syndrome de Job 56, 58.
7. L'utilisation concomitante d'un traitement antifongique actif sur les moisissures, chez certains patients
atteints d'aspergillose invasive, peut conduire à une sensibilité réduite du test Platelia™
Aspergillus Ag 30, 31.
8. L'utilisation du test Platelia™ Aspergillus Ag sur le plasma ou sur d'autres types d'échantillons,
comme l'urine ou le LCR, n'a pas été évaluée.
9. Les performances du test Platelia™ Aspergillus Ag n'ont pas été établies pour une lecture manuelle
et/ou une détermination visuelle des résultats.
10. D'autres genres de champignons, tels que Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum et
Histoplasma, ont montré une réactivité avec les anticorps monoclonaux EBA-2 de rat, utilisés dans
le test de détection du galactomannane aspergillaire. L’histoplasmose doit être prise en compte dans
les zones endémiques, y compris dans certaines régions des États-Unis 36, 50, 59.
11. La réactivité croisée d’ échantillons de liquide de LBA contenant Mycoplasma pneumoniae ou des
anesthésiques/lubrifiants utilisés pour insensibiliser la gorge lors du processus d'aspiration n'a pas
été évaluée.
12. Réactions positives sans signe clinique :
Etant donné la précocité de détection de l’antigène galactomannane dans le sérum ou le liquide de
BAL avant même l’apparition de signes cliniques et/ou radiologiques, des réactions positives en
l’absence de signes cliniques sont régulièrement observées :elles correspondent à des résultats de
tests « vrais positifs » chez des patients pour lesquels un diagnostic d'Aspergillose Invasive Prouvée
ou Probable est ultérieurement établi 30.
Cependant, dans certains cas particuliers, certains facteurs doivent être pris en compte lors de
l'interprétation du test :
a. Des réactions positives sans développement de signes cliniques ont été rapportés, en particulier
chez les jeunes enfants 44. Bien que certains de ces cas puissent être associés à une véritable
circulation d'antigènes aspergillaires, la plupart des cas peuvent être considérés comme des faux
positifs 7.
b. Le galactofuranose a été mis en évidence dans divers aliments, en particulier les céréales, leurs
dérivés et les crèmes desserts 1, 27. Contrairement aux laits d’origine humaine, les formulations à
base de lait de vache contiennent fréquemment des concentrations élevées en galactomannane13.
Il convient donc, chez les jeunes enfants, et plus généralement chez tous les patients dont la
barrière intestinale peut être altérée, d’intégrer le facteur alimentaire dans l’interprétation de
l’évolution de l’antigénémie 6, 13. Toute antigénémie positive non accompagnée de signes cliniques
doit être interprétée avec encore plus de précautions dans cette population de patients.
c. Il a été rapporté des résultats de tests positifs pour la présence de galactomannane chez des
patients recevant de la pipéracilline/tazobactam. Certains lots de pipéracilline/ tazobactam ont
été testés positifs pour la présence de l'antigène galactomannane. Ainsi les résultats de tests
positifs chez les patients recevant de la pipéracilline / tazobactam doivent être interprétés avec
prudence et confirmés par d'autres techniques de diagnostic. La présence de galactomannane
a également été rapportée dans certains lots de préparations parentérales d'amoxicilline associée
à l’acide clavulanique. Ainsi, les traitements par des ß-lactamines semi-synthétiques doivent donc
être pris en compte lors de l'interprétation du test 1, 3, 32.
41
13.
14.
15.
16.
Néanmoins, Platelia™ Aspergillus Ag pouvant détecter l'antigène galactomannane bien avant
l'apparition des signes cliniques ou radiologiques, une aspergillose invasive ne peut être exclue.
Ainsi, les patients avec une antigénémie positive, traités avec de la pipéracilline/tazobactam
doivent être suivis avec attention.
d. Des réactions positives en l'absence de signes cliniques, peuvent être potentiellement observées
chez des patients recevant par voie parentérale ou par voie orale(en présence d'une altération de
la barrière intestinale) des produits contenant du galactomannane. La présence de
galactomannane dans ces produits est souvent expliquée par l'utilisation d'un procédé de
fermentation à partir de micro-organismes fongiques. Un résultat positif ne sera toutefois observé
chez le patient que si la concentration sérique du galactomannane exogène atteint ou dépasse
le seuil de détection du test.
Ainsi, en présence d'un résultat positif suspect en l'absence d'autres signes évocateurs, nous
recommandons d'enquêter sur les produits que reçoit le patient et en particulier sur leur procédé
de fabrication et sur l'origine des matières premières utilisées 14, 41, 49.
Des cas de résultats positifs pour la détection du galactomannane dans des sérums et des liquides
de lavage broncho-alvéolaires associés à du PLASMA-LYTE™ ont été rapportés dans plusieurs
études 14, 41. C'est pourquoi toute administration de PLASMA-LYTE™ doit être prise en compte pour
l'interprétation des résultats de ce test.
Les résultats du test Platelia™ Aspergillus Ag effectué sur des échantillons de liquide de lavage
broncho-alvéolaire (LBA) provenant de patients non immunodéprimés doivent être interprétés avec
précaution 37 .
Les résultats avec des valeurs d’index proches du seuil de positivité du test (0,5) doivent être
interprétés avec précaution et confortés par d'autres preuves d’aspergillose invasive, d’ordre
cliniques, radiologiques ou biologiques, étant donné qu’ aucune zone grise n'est incluse dans
l'interprétation des résultats de ce test.
De plus, les résultats du test Platelia™ Aspergillus Ag réalisé sur des échantillons de liquide de lavage
broncho-alvéolaire (LBA), donnant un index compris entre 0,5 et 1,0, ont une valeur prédictive
inférieure aux résultats donnant des valeurs d'index > 1,0; De ce fait, les résultats affichant des valeurs
d'index compris entre 0,5 à 1,0 doivent être contrôlés et étayés par d'autres arguments d’ordre
radiologiques ou biologiques, en faveur d’une aspergillose invasive 8, 17.
14- VALEURS ATTENDUES
I. SÉRUM
La prévalence de l'aspergillose invasive varie selon la population de patients ; des taux de 5 à 20 % ont
été rapportés 10, 16.
Les résultats suivants ont été obtenus au cours d'études cliniques réalisées aux Etats-Unis chez des
patients de pédiatrie (âge ≤ 21 ans) et en Amérique du Nord chez des patients adultes.
A-Patients pédiatriques
Afin de déterminer les performances du test Platelia™ Aspergillus Ag, une étude clinique menée dans
trois centres basés aux Etats-Unis, a été réalisée sur un total de 1954 échantillons de sérum , provenant
de 129 enfants immuno-déprimés (âge ≤ 21 ans), présentant un risque élevé d'aspergillose invasive (AI)
et de patients diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable. La distribution des
valeurs d'index pour ces populations est représentée dans les graphiques ci-dessous :
42
Enfants diagnostiqués sans aspergillose invasive (population témoin)
Figure 1
Distribution des valeurs d’index des
sérums de la population pédiatrique
témoin (N=1 625)
Nombre de sérums
Un total de 1 625* échantillons
de sérum obtenus sur 108
enfants immuno-déprimés, dans
trois centres basés aux EtatsUnis, ont été testés pour
déterminer les performances du
test Platelia™ Aspergillus Ag. La
distribution des valeurs d'index
pour ces échantillons est
représentée dans le graphique
suivant :
Index
*Remarque : 80 échantillons provenant de 4 patients de la population témoin et donnant des
résultats positifs pour l'antigène galactomannane suite à un traitement par
pipéracilline/tazobactam (Zosyn®) ont été exclus.
Enfants avec diagnostic d'aspergillose invasive
Figure 2
Index
Aspergillose prouvée/probable chez l’enfant
Ce diagramme de dispersion
Distribution de l’index Patients pédiatriques (N=17)
représente les résultats du test
de détection du
galactomannane pour les 249
échantillons de sérum provenant
des 17 patients de cette étude
ayant un diagnostic
d'aspergillose prouvée ou
probable, conformément aux
définitions EORTC/NIAID. Tous
les échantillons de sérum de
chaque patient ne sont pas
nécessairement positifs. La
prévalence attendue
Nombre de patients
d'aspergillose invasive varie
selon la population de patients ; des taux de 5-20 % ont été rapportés 10, 24. La prévalence dans cette
étude était de 13,6 %.
B. Adultes
Afin de déterminer les performances du test Platelia™ Aspergillus Ag, une étude clinique menée dans
trois centres basés en Amérique du Nord, a été réalisée sur un total de 1 724 échantillons de sérums,
provenant de 172 patients ayant reçu une greffe de moelle osseuse et atteints de leucémie, avec ou
sans diagnostic d'aspergillose invasive. La distribution des valeurs d'index dans ces populations est
représentée dans les graphiques ci-dessous.
43
Adultes sans diagnostic d'aspergillose invasive (population témoin)
Figure 3
Distribution des valeurs d’index des sérums
de la population adulte témoin (N=1262)
Nombre de sérums
Un total de 1262 échantillons de
sérums provenant de 143
patients , hospitalisés dans trois
centres basés en Amérique du
Nord, ayant reçu une greffe de
moelle osseuse et atteints de
leucémie, ont été testés avec le
test Platelia™ Aspergillus Ag. La
distribution des valeurs d'index
est présentée dans le graphique
suivant.
Index
Adultes avec diagnostic d'aspergillose invasive
Figure 4
Aspergillose prouvée/probable chez l’adulte
Index
Ce diagramme de dispersion
Distribution de l’index/Patients adultes (N=29)
représente les résultats du test
de détection du
galactomannane pour les 462
échantillons de sérum des
29 patients de cette étude
présentant un diagnostic
d'aspergillose prouvée ou
probable, conformément aux
définitions EORTC/NIAID. Tous
les échantillons de sérum de
chaque patient ne sont pas
nécessairement positifs. La
Nombre de patients
prévalence attendue
d'aspergillose invasive varie
selon la population de patients ; des taux de 5 à 20 % ont été rapportés 10, 24. La prévalence dans
cette étude était de 16,9 %.
Les graphiques suivants représentent respectivement des exemples d'un patient sans signes cliniques
ni symptômes d'aspergillose invasive (négatif pour Aspergillus) et d'un patient atteint d'aspergillose
invasive prouvée ou probable (positif pour Aspergillus).
Figure 5
PATIENT TÉMOIN
Patient négatif
1,6
1,4
Index
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
Jours
44
40
50
60
Figure 6
PATIENT ATTEINT D’ASPERGILLOSE INVASIVE PROUVEE
Patient positif
Index
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Jours
II. LIQUIDE DE LBA
Afin de déterminer les performances du test Platelia™ Aspergillus Ag sur les échantillons de liquide de
lavage broncho-alvéolaire.(LBA), deux études ont été réalisées aux Etats-Unis ,sur un total de 449
échantillons de liquide de LBA provenant de 178 patients ayant reçu une transplantation d'organe solide
ou une transplantation de poumon et ayant été diagnostiqués avec ou sans aspergillose invasive.
403 de ces échantillons étaient des échantillons de LBA provenant de 167 transplantés receveurs
d'organe solide ou de poumon et ne présentant pas d’aspergillose invasive.
De plus, une analyse rétrospective a été effectuée sur des échantillons de LBA prélevés chez 99 patients
d’hématologie considérés à haut risque lors d’une étude réalisée en dehors des Etats-Unis et incluant
58 patients présentant une aspergillose invasive prouvée ou probable.
Les valeurs attendues dans les échantillons de LBA des transplantés receveurs d’organes solides ou
de poumons et n’ayant pas développé d’aspergillose invasive sont données dans le tableau suivant.
Les résultats sont présentés par échantillons de receveurs de transplantation présentant ou non une
colonisation par moisissure.
Tableau 1
Valeurs attendues par échantillon
Receveurs de transplantation d’organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive
N= 403 liquides de LBA
Diagnostic
N
Positif (%)
Négatif (%)
341
11/341 (3,2%)
330/341 (96,8%)
Témoins avec colonisation
62
12/62 (19,4%)
50/62 (80,6%)
Total des témoins
403
23/403 (5,7%)
380/403 (94,3%)
Témoins sans colonisation
45
Les valeurs attendues dans les échantillons de LBA des receveurs de transplantation d’organe solide
ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, sont présentées dans le tableau suivant, par type de
transplantation.
Tableau 2
Receveurs de transplantation d’organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, par
type de transplantation
Type de transplantation
N
Positif (%)
Négatif (%)
Coeur
28
3/28 (10,7%)
25/28 (89,3%)
Rein
25
3/25 (12,0%)
22/25 (88,0%)
Foie
23
1/23 (4,3%)
22/23 (95,7%)
Poumon
327
16/327 (4,9%)
311/327 (95,1%)
Total des témoins
403
23/403 (5,7%)
380/403 (94,3%)
Les valeurs attendues ont aussi été évaluées sur un total de 41 échantillons de LBA prélevés chez
41 patients d’hématologie sans aspergillose invasive. Ces valeurs sont présentées dans le tableau
suivant :
Tableau 3
Patients d’hématologie sans aspergillose invasive
N=41 liquides de LBA
Diagnostic
N
Positif (%)
Negatif (%)
Témoins
41
8/41 (19,5%)
33/41 (80,5%)
15. PERFORMANCES
A- REPRODUCTIBILITÉ
a) Études de reproductibilité dans les échantillons de sérum
Les variabilités inter-essais et intra-essai du test Platelia™ Aspergillus Ag ont été déterminées au
cours d'une étude utilisant un panel de 6 échantillons de sérum de patients groupés (un échantillon
négatif, un échantillon faiblement positif, deux échantillons positifs, et deux échantillons fortement
positifs) obtenus dans trois centres d'essai clinique en Amérique du Nord. Chacun des 6 membres
du panel a été testé en triple réplique (x3) sur trois jours différents, sur un lot, dans deux sites
(nombre total de répliques par centre = 9). Chacun des 6 membres du panel a été testé en double
réplique (x2) sur 3 jours différents, sur un lot, dans un troisième site (nombre total de répliques
dans le troisième centre = 6). Un opérateur a réalisé l’ensemble des tests de précision dans chaque
site. Les données ont été analysées conformément aux directives du Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) (anciennement National Committee for Clinical Laboratory Standards :NCCLS). La
densité optique (DO) moyenne et la valeur d'index moyenne, l'écart type(SD), le coefficient de
variation en pourcentage (CV%), la précision intra-essai et la précision entre les sites (inter-essais)
pour chacun des membres du panel et dans chaque site sont présentés dans les tableaux suivants.
46
0,00
N/A
0,04
N/A
0,002
N/A
0,036
N/A
0,01
N/A
0,03
N/A
0,006
N/A
0,006
N/A
Index
6
0,10
0,01
N/A
0,03
N/A
DO
6
0,049
0,003
N/A
0,012
N/A
Nég.
Index
9
0,10
DO
9
0,040
Nég.
Index
9
0,09
Nég.
DO
9
0,052
0,03
10,4%
0,08
4,4%
27,0%
0,19
13,0%
0,09
Index
9
0,70
20,0%
0,078
2,4%
0,009
DO
6
0,388
15,8%
0,13
2,4%
0,02
Index
6
0,81
Faible pos.
20,8%
0,058
14,5%
0,041
DO
9
0,280
Faible pos.
11,5%
0,051
4,8%
0,022
Index
9
0,74
Faible pos.
DO
9
0,445
0,09
11,6%
0,14
7,6%
19,8%
0,18
7,6%
0,07
Index
9
0,89
10,5%
0,068
12,5%
0,082
DO
6
0,652
11,1%
0,15
12,2%
0,17
Index
6
1,36
Pos. #1
22,7%
0,083
6,4%
0,023
DO
9
0,364
Pos. #1
10,0%
0,07
8,4%
0,059
Index
9
1,17
Pos. #1
DO
9
0,702
0,08
15,7%
0,25
5,1%
18,7%
0,28
7,1%
0,11
Index
9
1,49
12,5%
0,104
8,2%
0,068
DO
6
0,830
14,3%
0,25
8,2%
0,14
Index
6
1,73
Pos. #2
9,5%
0,057
7,5%
0,045
DO
9
0,602
Pos. #2
4,7%
0,044
4,7%
0,044
Index
9
1,563
Pos. #2
DO
9
0,931
²NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2; Page 25, Equation (C3) et Equation (C4)
NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2; Page 24, Equation (C2)
1
N/A = non applicable
N
Moyenne
SD intra1
essai
%CV
SD inter2
essai
%CV
Site 3
Membre
du panel
N
Moyenne
SD intraessai 1
%CV
SD interessai 2
%CV
Site 2
Membre
du panel
N
Moyenne
SD intra1
essai
%CV
SD interessai 2
%CV
Site 1
Membre
du panel
0,09
14,3%
0,29
4,4%
26,5%
0,53
4,8%
0,10
Index
9
2,01
7,1%
0,082
8,1%
0,094
DO
6
1,158
6,2%
0,15
8,2%
0,20
Index
6
2,41
Fort pos. #1
5,3%
0,042
5,7%
0,046
DO
9
0,801
Fort pos. #1
4,7%
0,058
4,2%
0,051
Index
9
2,06
Fort pos. #1
DO
9
1,227
0,17
11,9%
0,58
3,6%
29,2%
1,00
3,2%
0,11
Index
9
3,43
4,7%
0,111
5,3%
0,126
DO
6
2,378
6,8%
0,34
5,1%
0,25
Index
6
4,96
Fort pos. #2
5,8%
0,079
3,5%
0,047
DO
9
1,361
Fort pos. #2
5,9%
0,169
3,1%
0,089
Index
9
4,83
Fort pos. #2
DO
9
2,887
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,08
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,18
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,059
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,12
Contrôle nég.
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,074
Contrôle nég.
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,046
Contrôle nég.
0,02
0,03
2,8%
0,03
3,4%
0,9%
0,01
1,1%
0,01
Index
6
1,00
5,8%
0,028
5,8%
0,028
DO
6
0,480
4,1%
0,04
5,8%
0,06
Index
6
1,00
Sérum seuil
22,7%
0,094
1,1%
0,00
DO
6
0,415
Sérum seuil
16,9%
0,102
3,7%
Index
6
1,00
Sérum seuil
DO
6
0,606
3,3%
0,12
N/A
N/A
Index
3
3,67
18,2%
0,54
N/A
N/A
Index
3
2,97
3,4%
0,056
N/A
N/A
DO
3
1,652
6,6%
0,23
N/A
N/A
Index
3
3,45
Contrôle pos.
5,7%
0,068
N/A
N/A
DO
3
1,197
Contrôle pos.
14,3%
0,317
N/A
N/A
DO
3
2,216
Contrôle pos.
Tableau 4
47
b) Reproductibilité dans le liquide de LBA
La variabilité inter-essais et intra-essai pour le test Platelia™ Aspergillus Ag a été déterminée au cours
d'une étude utilisant un panel de 4 échantillons groupés de LBA de patients, chargés en
galactomannane purifié (un échantillon négatif, un échantillon fortement négatif, un échantillon
faiblement positif et un échantillon avec une positivité moyenne) dans trois centres (deux sites aux ÉtatsUnis et un site en interne). Chacun des 4 membres du panel, ainsi que les contrôles, ont été testés en
double réplique (x2) dans 2 séries par jour, sur 5 jours différents, sur un lot (nombre total de résultats
dans chaque site = 120). Deux (2) opérateurs ont réalisé l’ensemble des tests de précision sur chaque
site. Les données ont été analysées conformément aux directives du Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) (anciennement National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). La
densité optique (DO) moyenne et la valeur d'index moyenne, l'écart type, le coefficient de variation en
pourcentage (CV%), la précision intra-essai et la précision entre les sites (inter-essais) pour chaque
membre du panel sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau 5 - Résultats tous sites réunis
Fortement
négatif
Négatif
Résumé
N= 60
SD interessais
N=60
N=60
Positivité
moyenne
N=60
Contrôle
positif
Contrôle
négatif
N=60
N=60
DO
Index
DO
Index
DO
Index
DO
Index
DO
Index
DO
Index
0,121
0,29
0,214
0,50
0,375
0,88
0,575
1,35
1,580
3,72
0,047
0,11
Écart
type
N/A
N/A
0,037
0,103
0,035 0,078% 0,029
0,067
0,111
0,265
N/A
N/A
%CV
N/A
N/A
17,4% 20,5%
9,3%
8,9%
5,0%
5,0%
7,0%
7,1%
N/A
N/A
Écart
type
N/A
N/A
0,042
0,061
0,122
0,070
0,138
0,190
0,438
N/A
N/A
%CV
N/A
N/A
19,6% 18,9% 16,2% 13,9% 12,2% 10,2% 12,0% 11,8%
N/A
N/A
Moyenne
SD intraessai
Faiblement
positif
0,095
*Une (1) valeur statistique aberrante a été retirée de l'analyse.
B- RÉACTIONS CROISÉES
Une étude a été menée avec un lot de Platelia™ Aspergillus Ag afin d’évaluer l'effet de pathologies sans
lien avec l'aspergillose invasive qui pourraient potentiellement interférer avec le test. Les échantillons
de sérum suivants ont été testés afin de déterminer leur réactivité croisée avec le test Platelia™
Aspergillus Ag. Au total, 151 sérums ont été testés.
Tableau 6
Pathologie
Facteur rhumatoïde
Positif pour les AAN
Hypergammaglobulinémie à IgG
Hypergammaglobulinémie à IgM
Cancer*
Cirrhose non virale (biliaire primitive ;
alcoolique ; médicamenteuse)
Transfusions multiples
Femmes multipares
Nbre d'échantillons testés
10
10
10
10
11
Nbre de positifs
0
0
0
0
0
10
10
10
0
0
0
VHA
10
0
VHC
10
0
Rubéole
CMV
10
10
0
0
Syphilis (RPR+)
10
0
Toxoplasmose
10
0
Mycoplasme
10
0
48
* Un cas de chaque cancer suivant : vessie, sein (2), côlon, endomètre, poumon, prostate, rein et
adénome squameux (3).
C- ETUDES CLINIQUES
Etudes cliniques en amerique du nord
I. ÉCHANTILLONS DE SÉRUM
Des études cliniques ont été réalisées pour évaluer la sensibilité, la spécificité et la valeur prédictive
du test Platelia™ Aspergillus Ag chez des enfants (≤ 21 ans) dans trois sites situés aux États-Unis
et chez des adultes dans trois sites situés en Amérique du Nord. Ces études ont été menées sur
un total de 1 954 échantillons de sérum, prélevés chez 129 enfants et sur un total de1 724
échantillons de sérum prélevés chez 172 adultes issus des populations suivantes* :
• Patients sans signe d'aspergillose invasive (patients témoins)
• Patients avec aspergillose invasive probable
• Patients avec aspergillose invasive prouvée
* Le groupe de coopération sur les infections fongiques invasives (IFIGC, Invasive Fungal Infection
Cooperative Group) de l'organisation Européenne pour la recherche et le traitement du cancer
(EORTC, European Organization for Research and Treatment of Cancer) et le groupe d'étude des
mycoses (MSG, Mycosis Study Group) de l'institut national de l'allergie et des maladies
infectieuses (NIAID, National Institute of Allergy and Infectious Diseases) ont défini en 2002 des
critères de diagnostic de l'aspergillose invasive (AI) chez les patients atteints d’hémopathies
malignes ou ayant bénéficié d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques 2.
SENSIBILITÉ
A. Enfants
Les résultats de cette étude ont été analysés en termes de sensibilité par patient. L’étude de sensibilité
a été réalisée en utilisant le test Platelia™ Aspergillus Ag dans trois sites, sur un total de 17 enfants
immunodéprimés, diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable.
Tableau 7
Nombre de patients
Sensibilité
Intervalle de
confiance 95 %
Aspergillose prouvée
9
44,4% (4/9)
18,9-73,3%
Aspergillose probable
8
62,5% (5/8)
30,6-86,3%
17*
52,9% (9/17)
31,0-73,8%
Diagnostic
Aspergilloses prouvée et probable,
réunies
*Remarque : 8 des 17 patients ont eu des résultats négatifs pour l'antigène galactomannane
d'Aspergillus. Les 8 patients présentant des résultats négatifs pour l'antigène galactomannane
d'Aspergillus suivaient un traitement incluant plusieurs agents antifongiques. L'utilisation
concomitante d'un traitement antifongique actif sur les moisissures, chez certains patients
atteints d'aspergillose invasive, peut réduire la sensibilité du test 31.
B. Adultes
L’étude de sensibilité a été réalisée en utilisant le test Platelia™ Aspergillus Ag dans trois sites, sur un
total de 29 patients adultes ayant bénéficié d’une greffe de moelle osseuse ou atteints de leucémie et
diagnostiqués avec une aspergillose invasive prouvée ou probable.
Tableau 8
Diagnostic
Nombre de patients
Sensibilité
Intervalle de
confiance 95 %
11
81,8% (9/11)
52,3-94,9%
18
77,8% (14/18)
54,8-91,0%
Aspergilloses prouvée et probable,
réunies
29
79,3% (23/29)
61,6-90,2%
49
SPÉCIFICITÉ
A. Enfants
Spécificité par patient pédiatrique
L’étude de spécificité a été réalisée en utilisant le test Platelia™ Aspergillus Ag dans trois sites, sur un
total de 108* enfants immunodéprimés sans signes d'aspergillose invasive (patients témoins).
Tableau 9
Site
Nombre de patients
Spécificité
Intervalle de
confiance 95 %
1
44
86,4 % (38/44)
73,3-93,6%
2
59
86,4 % (51/59)
75,5-93,0%
3
5
100% (5/5)
56,6-100%
Tous sites réunis
108
87,0% (94/108)
79,4-92,1%
*Remarque : 4 patients ayant des résultats positifs pour l'antigène galactomannane coïncidant
avec un traitement par pipéracilline/tazobactam ont été exclus.
Spécificité par échantillon pédiatrique
total de 1 625* échantillons prélevés sur 108 enfants immunodéprimés, sans signes d'aspergillose
invasive (patients témoins).
Tableau 10
Site
Nombre de patients
Spécificité
Intervalle de
confiance 95 %
1
794
98,9% (785/794)
97,9-99,4%
2
731
97,8% (715/731)
96,5-98,6%
3
100
100% (100/100)
96,3-100%
Tous sites réunis
1625
98,5% (1600/1625)
97,7-99,0%
*Remarque : 80 échantillons prélevés sur 4 patients ayant des résultats positifs pour l'antigène
galactomannane coïncidant avec un traitement par pipéracilline/tazobactam ont été exclus.
B. Adultes
Spécificité par patient adulte
total de 143 patients adultes ayant bénéficié d’une greffe de moelle osseuse ou atteints de leucémie,
sans signe d'aspergillose invasive (patients témoins).
Tableau 11
50
Site
Nombre de patients
Spécificité
Intervalle de
confiance 95 %
1
28
78,6% (22/28)
60,5-89,8%
2
77
93,4% (71/77)
84,0-96,4%
3
38
89,5% (34/38)
75,9-95,8%
Tous sites réunis
143
88,8% (127/143)
82,9-93,0%
Spécificité par échantillon d'adultes
total de 1 262 échantillons prélevés chez 143 patients adultes ayant bénéficié d’une greffe de moelle
osseuse ou atteints de leucémie, sans signe d'aspergillose invasive (patients témoins).
Tableau 12
Site
Nombre de patients
Spécificité
Intervalle de
confiance 95 %
1
349
98,0% (342/349)
95,9-99,0%
2
560
98,6% (552/560)
97,2-99,3%
3
353
98,9% (349/353)
97,1-99,6%
Tous sites réunis
1262
98,5% (1243/1262)
97,0-99,0%
VALEUR PRÉDICTIVE
Les valeurs prédictives positives et négatives (VPP, VPN) ont été analysées pour la population de patients
étudiée au cours de cette étude. Étant donné la moyenne réelle du taux de prévalence observée au
cours de cette étude, de 13,6% dans la population pédiatrique et de 16,9 % dans la population
d'adultes, les valeurs prédictives positives et négatives ont été calculées comme suit :
A. Enfants
Prévalence dans cette étude : 13,6 %
VPP : 39.1%
Intervalle de confiance 95 % : 22.2-59.2%
VPN : 92.2%
B. Adultes
Prévalence dans cette étude : 16,9%
VPP : 59.0%
VPN : 95.5%
La prévalence attendue pour l’aspergillose invasive varie selon la population de patients ; des taux de
5 à 20 % ont été rapportés 10, 24.
Pour les populations de patients dont la prévalence est proche des valeurs basses publiées, les valeurs
prédictives positive et négative a été re-calculées en se fondant sur un taux de prévalence à 5 %.
A. Enfants
Prévalence calculée à 5 %
VPP : 17.6%
VPN : 97.2%
B. Adultes
Prévalence calculée à 5 %
VPP : 27.2%
VPN : 98.8%
II. ÉCHANTILLONS DE LIQUIDE DE LBA - PERFORMANCES
La sensibilité et la spécificité du test Platelia™ Aspergillus Ag sur les échantillons de liquide de LBA ont
été évaluées au cours de deux études effectuées aux États-Unis et réalisées sur 116 échantillons
prélevés chez 62 patients receveurs d'une transplantation d'organe solide et sur 333 échantillons
prélevés chez 116 patients receveurs d'une transplantation de poumon et d’une étude réalisée en dehors
des Etats-Unis sur 99 échantillons prélevés chez 99 patients d’hématologie considérés à haut risque et
présentant ou non une aspergillose invasive.
A. Sensibilité
La sensibilité a été évaluée chez des receveurs de transplantation d'organe solide ou de transplantation
de poumon, diagnostiqués avec une aspergillose invasive conformément aux critères EORTC/MSG.
51
I. Receveurs de transplantation d'organe solide présentant une aspergillose invasive
Lors d’une étude portant sur un total de 116 échantillons prélevés chez 62 receveurs de transplantation
d'organe solide, la sensibilité a été évaluée chez 5 receveurs diagnostiqués avec une aspergillose
invasive, comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
Tableau 13
Sensibilité du test Platelia™ Aspergillus Ag, par patient
Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation d'organe solide
Diagnostic
N
Index ≥ 0.5
Sensibilité
Intervalle de
confiance 95 %
2
2
2/2 (100%)
34,2 - 100%
3
3
3/3 (100%)
43,8 - 100%
Aspergillose prouvée et
probable, réunies
5
5
5/5 (100%)
56,5 - 100%
Tableau 14
Sensibilité du test Platelia™ Aspergillus Ag, par type de transplantation
Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation d'organe solide
N
Index ≥ 0.5
Sensibilité
Intervalle de
confiance 95 %
Coeur
1
1
1/1 (100%)
20,6 - 100%
Rein
3
3
3/3 (100%)
43,8 - 100%
Foie
1
1
1/1 (100%)
20,6 - 100%
Total
5
5
5/5 (100%)
56,5 - 100%
II. Receveurs de transplantation de poumon présentant une aspergillose invasive
Lors d’une autre étude, sur un total de 333 échantillons prélevés chez 116 receveurs de transplantation
de poumon, la sensibilité a été évaluée chez 6 receveurs diagnostiqués avec une aspergillose invasive,
comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
Tableau 15
Sensibilité du test Platelia™ Aspergillus Ag, par patient
Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des receveurs de transplantation de poumon
Intervalle de
confiance 95 %
Diagnostic
N
Index ≥ 0.5
Sensibilité
2
1
1/2 (50,0%)
9,4 - 90,6%
4
3
3/4 (75,0%)
30,0 - 95,4%
probable, réunies
6
4
4/6 (66,7%)
30,0 - 90,3%
III. Patients d’hématologie avec aspergillose invasive
La sensibilité a aussi été évaluée lors d’une troisième étude réalisée sur 58 échantillons de LBA
prélevés chez 58 patients d’hématologie diagnostiqués avec une aspergillose invasive comme
indiqué dans le tableau suivant. A partir de cette étude utilisant Platelia™ Aspergillus EIA, une
analyse rétrospective a été effectuée sur des échantillons de LBA prélevés chez des patients
d’hématologie à haut risque. Les données obtenues lors de cette étude publiée ont été utilisées
pour établir les performances de Platelia™ Aspergillus EIA sur les liquides de LBA 29.
52
Tableau 16
Aspergillose invasive prouvée ou probable chez des patients d’hématologie
Sensibilité
Intervalle de confiance
95 %
Diagnostic
N
Index ≥ 0.5
31
31
31/31 (100%)
89,0 - 100%
27
26
26/27 (96,3%)
81,7 - 99,3%
probable, réunies
58
57
57/58 (98,3%)
90,8 - 99,7%
B. Spécificité
La spécificité a été évaluée sur un total de 98 échantillons de liquide de LBA, provenant de 57 receveurs
de transplantation d’organe solide et sur 305 échantillons de liquide de LBA provenant de 110 receveurs
de transplantation de poumon, ne présentant pas d’aspergillose invasive.
Les résultats sont présentés dans les tableaux ci-dessous:
Tableau 17
Spécificité par échantillon
Receveurs de transplantation d’organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive
N
Index < 0.5
Négatif (%)
Intervalle de
confiance 95 %
Témoins sans colonisation
341
330
330/341(96,8%)
94,3 - 98,2%
Témoins avec colonisation
62
50
50/62 (80,6%)
69,1 - 88,6%
Total des témoins
403
380
380/403(94,3%)
91,6 - 96,2%
Diagnostic
La spécificité obtenue avec les échantillons de liquide de LBA provenant de receveurs de transplantation
d’organe solide ou de transplantation de poumon, réunis, sans aspergillose invasive (témoins), est
présentée par type de transplantation dans le tableau 18 ci-dessous:
Tableau 18
Receveurs de transplantation d’organe solide ou de poumon, réunis, sans aspergillose invasive, par
type de transplantation.
N
Index < 0.5
Négatif (%)
Intervalle de
confiance 95 %
Coeur
28
25
25/28 (89,3%)
72,8 - 96,3%
Rein
25
22
22/25 (88,0%)
70,0 - 95,8%
Foie
23
22
22/23 (95,7%)
79,0 - 99,2%
Poumon
327
311
311/327 (95,1%)
92,2 - 97,0%
Total des témoins
403
380
380/403 (94,3%)
91,6 - 96,2%
53
La spécificité a aussi été évaluée sur un total de 41 échantillons de LBA prélevés chez 41 patients
d’hématologie sans aspergillose invasive. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant.
Tableau 19
Patients d’hématologie sans aspergillose invasive
N=41
Diagnostic
N
Index < 0.5
Negatif (%)
Intervalle de confiance
95%
Témoins
41
33
33/41 (80,5%)
66,0 – 89,8%
16- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
54
16- BIBLIOGRAPHY
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