CREF : microbiologie

CRef biotechnologies – 2004/2005 – Anne MARTINEL
Techniques bactériologiques
Selon les équipements disponibles salle banalisée ou laboratoire on sera amené à manipuler des germes de
classe 1 ou de classe 2 jamais de classe 3.
Pour connaître la liste des microorganismes de classe 2 et 3 se reporter à la liste des agents pathogènes
(Arrêté du 18 juillet 94 + 30 juin 98 site « 3rb » : www.3rb-bgb.com).
Si l’on ne dispose que d’une salle banalisée (avec becs bunsen ou becs électriques) et que l’on n’a pas
d’autoclave on doit travailler obligatoirement avec des germes de classe 1 ou des prélèvements issus de
l’environnement (ce qui ne dispensera pas de décontaminer).
Matériel indispensable :
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Ensemenseurs : manche pasteur avec anse ou anses stériles jetables, pipettes Pasteur stériles +
poires adaptées, pipettes verre (1,5, 10 mL) + propipettes adaptées (pi-pump)
Becs bunsen ou électriques
Microscopes munis d’objectifs X40 et X100 (immersion)
Bacs à eau de javel individuels (hauts) pour la récupération des déchets contaminés en
particulier pipettes souillées
Solutions et colorants de base : bleu de méthylène phéniqué, colorants de Gram (violet de
gentiane ou violet de cristal), lugol (solution iodo iodurée), alcool dénaturé, safranine de
préférence ou fushine), eau de javel du commerce à diluer au moment de l’emploi (voir 3rb) et
à répartir en pissettes, eau du réseau en pissettes pour les rinçages de lames,
Bacs à coloration avec supports pour lames (à défaut : pots en verre type yaourt permettant le
dépôt de la lame sur les bords) ou Borrels remplis de colorants (permettant de se passer de
pissettes à colorants)
Pinces à bords plats
Matériel permettant la stérilisation par la chaleur humide : autoclave (121°C- 20 min) ou
cocotte minute permettant de stériliser les milieux de culture et de décontaminer les
préparations (30 minute de fonctionnement de la soupape, T° environ 110°C)
Tubes de culture à vis standards et étroits (type VF) + portoirs faciles à décontaminer (métal
ou plastique autoclavable), boites de Pétri, lames/lamelles, huile à immersion,
Ingrédients de base pour la préparation des milieux de culture : agar, extrait de viande, extrait
de levure, peptone, NaCl, glucose
Autres milieux de culture que l’on peut acheter soit prêt à l’emploi en tubes ou boites soit
deshydratés que l’on préparera en conditionnera à sa convenance en prévoyant des flacons
autoclavables.
Balance type trébuchet, agitateur magnétique, vortex
Système de chauffage type gazinière 2 feux (ou bec bunsen + trépied+ grille) pour préparation
milieux de culture.
Etuve thermostatée (on peut s’en passer en augmentant les temps d’incubation surtout en
climat tropical et si l’on fait les lectures d’une semaine sur l’autre)
Séance 1 : Matériel – Sécurité
Objectifs : Matériel /sécurité, installation poste de travail microbiologique, manipulation stérile
simple
Matériel :
- 1 tube de BO/élève
- 1 P.Pasteur + poire
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Solution de glucose 30% stérile
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Présentation du matériel et du laboratoire
Règles de sécurité : ce qu’il ne faut pas faire/ ce que l’on doit s’astreindre à faire
Installation du poste de travail pour droitiers et gauchers => notion d’ergonomie en rapport
avec la zone de stérilité présentant des risques de brûlures, main fixe /main mobile.
Démonstration / explications des gestes de base en zone stérile :
o ouverture d’un bouchon à vis, flambage du col,
o utilisation de la P.Pasteur avec poire distribution d’un nombre précis de gouttes.
Application = Manipulation stérile simple :
o Introduction stérile à la pipette Pasteur de 5 gouttes d’une solution de glucose stérile à
30% dans un bouillon stérile ; incubation une semaine : le tube doit rester limpide.
o Faire en parallèle un tube contaminé pour qu’ils visualisent bien les conséquences
d’un développement microbien.
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Séance 2 : Diversité du monde microbien (sur macérat végétal + yaourt)
Observation des tubes séance 1 : conclusions sur la qualité des manipulations.
¾ Prolongements : questionnement sur l’origine des contaminants et le développement
microbien. Les tubes contaminés pourront éventuellement être observés au cours de la
séance 2.
Objectifs :
- Technique de l’état frais + technique de coloration simple au bleu de méthylène d’un frottis
réalisé à l’anse
- Observation diversité microbienne
Matériel :
- Macérat végétal pour l’état frais (herbe + fragments végétaux mis en suspension dans de l’eau
ou mieux de l’eau peptonnée en cristallisoir pour l’oxygène si on veut des paramécies) préparé
3 à 4 jours avant et laissé à température ambiante (un peu au soleil si température basse)
- Yaourt pour coloration simple au bleu de méthylène
- Lames, lamelles, anse, tubes eau stérile.
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Technique EF : on peut utiliser la fiche à 3 colonnes 3rb « Etat frais à partir d’une
suspension » et essayer de la leur faire bâtir.
o Faire une démonstration des gestes corrects et d’un montage sur microscope avec mise
au point. Montrer l’importance des conditions d’éclairement pour l’observation
d’objets de petite taille quasi transparents .
Pour la mise au point : la faire sur une bulle d’air qui est un objet bien visible en milieu
transparent au X 10 puis passer au X 40 pour observer.
o Observation de la diversité des microorganismes : protozoaires, bactéries, spores,
levures, mycètes.
- Technique du frottis + coloration simple au bleu de méthylène sur yaourt :
o Démonstration réalisation frottis (l’exploitation de la technique sera vue en séance 3)
o Observations
- Compte rendu.
Séance 3 : Observations détaillées de bactéries fixées (coloration différentielle de Gram)
Objectifs : réalisation d’un frottis selon les BPL, coloration de Gram / description détaillée de la
morphologie bactérienne.
Matériel :
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yaourt
3 souches pures de classe 1 en BO :
o coques gram+ ex Microccoccus ;
o bacille gram+ ex Bacillus
o bacille gram – ex E.coli
- Lames, colorants de Gram, microscope
Technique :
o Faire un frottis du yaourt seul et sur une seule lame 2 frottis réunissant un Gram+ et un
Gram- pour qu’ils visualisent la réussite de la coloration et qu’ils apprennent à coder
une lame G/D.
o Rappeler (séance 2) comment on fait un frottis selon les BPL => exploitation
sécurité/BPL comme à la séance précédente => tableau d’identification des
dangers/prévention (on travaille ici avec l’anse qui génère des aérosols => procédure
BPL de stérilisation de l’anse).
o Fixation du frottis
o Coloration de Gram
- Exploiter les observations : CR à l’aide fiche morphologie au Gram
Séance 4 : Préparation de milieux de culture sous diverses formes à partir des ingrédients.
Objectifs : à partir d’une composition de base (BN/GN cf fiche) leur montrer que l’on peut obtenir
3 consistances différentes : solide / liquide / semi solide en jouant sur la quantité d’agar sans
modifier les qualités nutritives et que l’on a le choix du conditionnement avant stérilisation.
Calculs en commun des quantités à peser en fonction des volumes à préparer. Les milieux préparés
seront exploités à la séance suivante.
Matériel :
- balance tébuchet + coupelles pesée, casserole + système de chauffage
- Ingrédients : extrait de levure, extrait de viande, peptone, NaCl, eau ordinaire, papier pH,
NaOH concentrée
Maniulation :
- Pesée, dissolution sous agitation (on peut le faire dans la casserole), mesure du pH au papier,
ajustement par solution de base concentrée.
- On fait faire pour l’ensemble de la classe 3 préparations différentes :
o bouillon nutritif = BN
o GN solide à 15g/L d’agar,
o GN semi solide à 6,5 g/L,
Ajouter l’agar en dernier en chauffant sur le gaz (volume d’agar négligé ainsi que pertes par évaporation
=> approximation microbio)
- Conditionnement : distribution au distributeur ou à la pipette (gélose chaude sinon risque de
prise en masse) + capsulage
o 5 mL GN semi solide/ tube : en tubes pour culots droits,
o 7 mL GN semi solide/ tube : en tubes étroits (tubes VF)
o 7,5 mL GN solide/ tube : en tubes pour gélose inclinée,
o 15 mL GN solide/ tube : pour boites de Pétri,
o 5mL BN/ tube : pour bouillons.
- Stérilisation à l’autoclave (ou cocotte) : réalisée par la préparatrice ou le prof => on en profite
pour expliquer le fonctionnement (attention aux capsules qui ne doivent pas être vissées à
bloc : expliquer pourquoi). Les tubes de géloses inclinées seront réalisés lors de la sortie du
cycle de stérilisation.
- CR : calculs des quantités des différents ingrédients, récapitulatif des préparations
¾ Prolongement : reflexion sur les nutriments nécessaires à la croissance bactérienne et quel
ingrédient apporte quel nutriment et pourquoi.
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Séance 5 : Les diverses méthodes d’ensemencement des milieux de culture
Objectifs : mettre en œuvre des différentes techniques d’ensemencement à partir d’une souche
pure de bactéries non exigeantes .
Matériel :
- Fournir des cultures pures de germes non exigeants :
o au moins une bien mobile ex Pseudomonas fluorescens = souche pigmentée
o coque Gram+ ex Staphylococcus epidermidis
o bacille Gram- ex Serratia marcescens
- Utiliser les milieux préparés à la séance 4 penser à incliner au préalable les gélose préparées
par les élèves en tubes de 7,5 mL.
- Fournir également un mélange des 2 souches précédentes coques Gram+ (ex Staphylococcus
epidermidis) / bacille gram – (ex Serratia marcescens) à isoler sur une gélose non sélective
différentielle telle que BCP en boite de Pétri
Manipulation :
o Couler une gélose en boite de Pétri : GN 15 mL
o Ensemencer un milieu semi gélosé par piqûre droite à la pipette boulée => geste utilisé
pour test de mobilité
o ensemencer en spirales un tube étroit avec la même pipette boulée => geste utilisé
pour le type respiratoire en VF
o ensemencement à l’anse d’une GN inclinée => geste du repiquage
o Inoculer les BN à la pipette pasteur ouverte.
o Isoler à l’anse selon la technique des 4 quadrants avec flambage sur la boite de Pétri
solidifiée.
o Isoler également le mélange sur la gélose BCP en boite fournie
o Incuber.
- Démonstrations en insistant sur la sécurité et les BPL (anse/aérosol, flambage cols…)
- Révision EF et Gram sur la souche pure fournie : CR d’observations microscopiques.
Séance 6 : Lecture cultures précédentes – Mise en évidence de propriétés biochimiques 1.
Objectifs :
- Exploitation des cultures précédentes : notion de colonie = clone, visualisation de différents
types de colonies correspondant à différents types de bactéries vues au Gram, lecture du
caractère lactose+/- avec le mélange isolé sur BCP, notion de mobilité confirmée ou non par
l’examen à l’EF précédent sur tube GN semi-solide.
- Etude macroscopique des colonies isolées en boite à l’aide d’une fiche.
- Utilisation de milieux réitérant les techniques d’ensemencement déjà utilisées et permettant la
lecture de propriétés biochimiques introduisant les méthodes d’identification phénotypiques
classiques.
Matériel :
- les mêmes cultures pures que précédemment à distribuer aux mêmes élèves
- les milieux : VF (tube étroit), mannitol mobilité nitrate = MMN (culot pour piqûre droite),
BCP en boite de Pétri, + 2 milieux sélectifs différentiels (par ex Drigalski et Chapman) en
boite de Petri.
-
Techniques d’ensemencement déjà utilisées :
o Spirale dans VF après régénération (expliquer pourquoi c’est indispensable)
o Piqûre droite dans MMN
o Isolements : BCP, Drigalski, Chapman.
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-
Donner des fiches milieux incomplètes (par ex seulement la composition globale) qui seront à
compléter après lecture à la séance suivante.
Séance 7 : Lecture cultures précédentes - Mise en évidence de propriétés biochimiques 2.
Objectifs :
o Savoir lire et exploiter les milieux d’identification ou d’isolement précédents =>
propriétés biochimiques conduisant à la notion de phénotype permettant de s’orienter
dans la classification bactérienne.
o Etude macroscopique des colonies
o Constater la sélectivité des géloses d’isolement (Drigalski/Chapman) => mise en
commun nécessaire => répondre à la question quel type de bactérie pousse sur quel
type de milieu et pourquoi ? => permettra de remplir les fiches incomplètes
Cette opération passe nécessairement par la réalisation de Gram à partir des colonies
ayant cultivé et est un exercice d’organisation et de rigueur.
- Expliquer comment on va lire :
o Lactose sur BCP, mannitol sur MMN
o Mobilité sur MMN
- Leur laisser interpréter seuls les lectures associées à Drigalski et Chapman (basées sur les
mêmes principes)
- Compléter au final en commun les fiches BCP, Drigalski, Chapman et conclure
- CR : récapitulatif sous la forme d’un tableau à trous
Séance 8 : TP contrôle reprenant la totalité des opérations déjà abordées
Objectifs : Evaluation des gestes techniques abordés
Matériel :
- souche pure fournie en BO (CG+ ou BG-)
- Gélose BCP en boite de Pétri, VF régénéré en surfusion, MMN
Manipulation :
- Etude microscopique : EF (mobilité) + Gram (description détaillée)
- Ensemencements de : Gélose BCP (isolement), MMN, VF (on évaluera certains gestes
techniques)
Séance 9 : Lecture du TP contrôle et CR + Tests d’hygiène
-
Prévoir un cadre type pour le CR avec cases à remplir et leur laisser 1h-1h30 pour rédiger. (On
aura préalablement noté leurs ensemencements au plan technique et évalué quelques gestes ou
techniques précis à la séance précédente.)
Objectifs tests d’hygiène :
- Montrer l’efficacité d’une procédure de lavage de mains correctement menée et l’inefficacité
de certaines pratiques.
Matériel : 2 GN en boite/élève
Manipulation :
- On peut partir de la procédure préconisée par le 3rb en la démontant et en essayant de voir la
pertinence de chaque opération.
- Leur faire « salir » leurs mains en les passant dans les cheveux, et dans l’environnement en
général => faire plusieurs empreintes « doigts sales » sur 1/2 boite.
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Faire un nettoyage sommaire des mains à l’eau => empreintes sur l’autre 1/2 boite
Faire un nettoyage selon la procédure correcte => empreinte 1/2 boite
Faire un nettoyage correct suivi de l’utilisation d’un torchon collectif ayant déjà servi => autre
1/2 boite.
Séance 10 : Lecture tests d’hygiène – Action d’antiseptiques/antibactériens (eau de Javel)
-
Lectures tests d’hygiène séance 9 => interprétations => justification du protocole proposé
¾ Prolongement : procédure de désinfection des paillasses et des locaux au sens large =>
fiche 3rb notion d’antiseptique (eau de Javel)
Effets de l’eau de Javel sur la fabrication du yaourt
Objectifs : réalisation technique d’une gamme de dilutions sérielles, visualisation de l’effet
inhibiteur de coagulation du lait par l’eau de Javel
Matériel :
- 1 tube contenant eau de Javel commerciale
- 5 tubes d’eau stérile calibrés à 9 mL (pour dilutions au 1/10)
- pipettes stérile de 1 mL et de 5 mL+ propipette
- vortex
- lait UHT+ yaourt
Manipulation :
o Diluer l’eau de javel jusqu’à la dilution 10-5 en tubes de 9 mL
o Distribuer 4 mL de lait par tube de dilution (y compris dans le produit commercial)
o Rajouter 1 mL de yaourt par tube
o Homogénéiser au vortex
o Incuber à 37°C
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Séance 11 : Exploitation résultats séance 10
Lire la présence ou l’absence de coagulation
Conclure sur la dilution de l’eau de Javel inhibant la fermentation lactique
¾ Prolongements : antibactériens effets, modes d’action, fermentations alimentaires.
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