Analyses nanoLC-MS/MS

Analyses nanoLC-MS/MS
Quand utiliser la nanoLC-MS/MS ?
MALDI-TOF(/TOF)
+
-
 Instrumentation simple et robuste
 Peptides sous forme [M+H]+ :
spectres simples à interpréter

Coût
 Mélange de protéines:
identification des protéines majoritaires
(max. 1-3)
 Compétition à l’ionisation:
certains peptides s’ionisent mieux que
d’autres
 Organisme non-séquencé:
obligation d’avoir des séquences en acides
aminés
nanoLC-MS/MS
 LC pour décomplexification:
idéal pour échantillon complexe (limite =
gamme dynamique de l’instrument)
 Sensibilité accrue:
faible quantité de matériel, couverture
maximale, protéine de faible PM …
 LC nano-débit:
bouchages fréquents des capillaires (95%
des pannes de couplage liés à la nanoLC)
 Digestion en solution:
attention si la digestion est mal contrôlée
(reste de la protéine entière)
 Peptides sous forme [M+2H]2+ et [M+3H]3+ :
spectres plus difficiles à interpréter
 Effet mémoire de la colonne HPLC : relargage de
peptides le run suivant→ contamination
CONCLUSION: Il faut utiliser la stratégie nanoLC-MS/MS quand :
l’ échantillon est complexe (sup. 3 protéines),
et/ou lorsque la quantité de matériel disponible est faible (coloration à l’argent ou IP par ex.),
et/ou s’il s’agit d’un organisme non-séquencé.
1) Remplir une demande d’analyse
Acquisitions nanoLC-MS/MS
MicroTOF Q
Bruker
Séparation des peptides par nanoHPLC
Transfert
en
vial en verre
Acquisition
Positionnement
dans le rack LC
100
2 gradients par défaut:
30 min
1h
Selon la complexité de l’échantillon
MS
MSMS
1
MSMS
2
MSMS
3
685.37
K S S L N M* A Q A F
1255.81
100
871.4 K S S L 766.5
N M* A Q A F
y6
628.5 (M+2H) 2+
1255.81
1000.49
6 292.1
100
b3
321.2
y2
695.5 965.6
0 100200300400500600700
%8009001000
K y5
S S L y8766.5
N
M* A Q A F
y6
363.2
628.5
(M+2H)
2+
894.6
292.1
548.4
1192.7
1255.81
120.1
100
y7
y4
b3
F 148.1 b4491.3
1112.7
b5 321.2
695.5
234.19;y1
% 427.27562.4
b6y2
y5 y9 965.6
766.5
y8
86.11
y6
363.2
628.5
(M+2H)
2+
894.6
292.1
548.4
1192.7
120.1
b4491.3
y7 M/z
b3
y4
0L
F 148.1
321.2
1695.5
200 1112.7
100200300400
500600
700
9001000
1100
b5800
y2
y9965.6
234.19;y1
% 427.27562.4
b6
y5
y8
86.11
363.2
894.6
548.4
1192.7
L
120.1
b4 491.3
y7 M/z
y4
0 100200300
F400
148.1
500
600
700
800
900
1000
1100
1
2001112.7
b5
427.27
562.4
y9
234.19;y1 b6
86.11
0L
M/z
1002003004005006007008009001000
1100
1200
%
Les peptides sont séparés sur une
colonne chromatographique C18
selon leur degré d’hydrophobicité:
ils arriveront donc séquentiellement
dans la source d’ionisation du
spectromètre de masse qui est de
type électrospray.
554.33
159.09
288.14
272.17
Réglages de l’appareil :
1 cycle « MS+3MSMS » dure environ 6 sec.
→Un peptide de masse identique peut être fragmenter 2 x au maximum.
Etat de charge : principalement (M2H)2+ et (M3H)3+
→Un peptide avec des états de charge différents
est fragmenté au maximum 2x, les états de charge favorisés sont 2+ et 3+
Pré-colonne C18
(dessalage et concentration)
Obtention de x spectres MSMS, stockés dans un seul fichier .mgf
X = 50 à 400 composés (tous ne seront pas exploitables)
L’information MS n’est pas exploitée.
Colonne C18 (séparation)
15cm X 75mID, 300 nL/min
Chaque spectre MSMS est caractérisé par la masse de l’ion parent, son
temps de rétention et les masses des fragments
2) Stratégie d’interrogation dans les banques de données,
analyses LC Q TOF
Rentrée des données processées dans Proteinscape:
Les échantillons et leurs résultats (fichiers mgf) sont rentrés dans le logiciel
Proteinscape. Les analyses vont être organisées hiérarchiquement par
demandeur et l’arborescence sera sauvegardée dans une base de données de
type LIMS (Laboratory Integrated Management System).
serveur
Proteinscape = LIMS
mascot
NAS 4.5To
Recherche envers une banque de données protéique:
Interrogation Mascot mode ion search ou PFF (idem MALDI MSMS)
Exceptée : pour un peptide de charge identique fragmenter 2 x, seul le score le
plus fort sera pris en compte
Validation selon critère Mascot : valeur seuil au delà de laquelle le hit est
significatif à plus de 95%
Validation par le service à l’aide de proteinscape
Contrôle mascot
Contrôle manuel de la qualité des spectres MSMS,
en particulier pour les protéines identifiées avec
1 ou 2 spectres.
Rapport d’analyse
Onglet « nanoLC-MS/MS » du fichier de résultats
Validation des résultats selon critères mascot
Code de validation du service
Identification : Qualité publication
Identification probable, non qualité publication
Onglet « Peptides » du fichier de résultats
Colonne A: FAUX indique qu’un spectre MSMS a été invalidé (séquence sur le spectre incorrect par rapport à la proposition de Mascot)
Colonne D: rapport masse sur charge mesuré pour le peptide en question (masse sélectionnée pour être fragmentée).
Colonne E: masse moléculaire du peptide sous forme monochargé.
Colonne F: charge du peptide (2+ ou 3+ généralement, contrairement à une analyse MALDI où les peptides sont sous forme 1+).
Colonne G: delta de masse en ppm entre les masses théorique et expérimentale du peptide.
Colonne
Colonne
Colonne
Colonne
Colonne
Colonne
Colonne
Colonne
H: temps de rétention du peptide sur le gradient chromatographique utilisé pour l’analyse LC.
I: score pondéré du peptide si plusieurs moteurs de recherche ont été utilisés (Phenyx en supplément de Mascot par exemple).
J: score donné par Mascot.
N: séquence du peptide identifié (peut servir à faire un BLAST par le demandeur pour savoir s’il s’agit d’un peptide unique).
O: modifications portées par le peptide (oxydation et carbamidométhylation apportées par le traitement de l’échantillon).
P: numéro de la recherche Mascot dans la base de données sous-jacente à Proteinscape.
Q: numéro de la protéine pour laquelle ce spectre a le meilleur score.
R: description de la protéine identifiée dans la banque de données interrogée.
Exemple : Apport de la LC MSMS pour une analyse de bande 1D
Remarque : Cas extrême
Tendance valable uniquement pour
mélange de protéines avec abondances
équivalentes