altona - Qiagen

altona
altona
DIAGNOSTICS
DIAGNOSTICS
RealStar®
Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
04/2015
altona Diagnostics GmbH
Mörkenstr. 12
22767 Hamburg
Germany
phone +49 40 548 06 76 - 0
fax
+49 40 548 06 76 - 10
e-mail [email protected]
www.altona-diagnostics.com
always a drop ahead.
RealStar®
Filovirus Screen
RT-PCR Kit 1.0
Pour utilisation avec
Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene)
VERSANT® kPCR Molecular System AD (Siemens)
ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems)
LightCycler® 480 Instrument II (Roche)
Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research)
Rotor-Gene® Q5/6 plex Platform (QIAGEN)
CFX96™/Dx Real-Time System (BIORAD)
Usage en diagnostic in vitro No de produit: 441013
96 réactions
MAN-441010-FR-02
Conserver à -25°C ... -15°C
Avril 2015
altona Diagnostics GmbH • Mörkenstraße 12 • D-22767 Hamburg
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Content
1.
2.
Usage prévu ...........................................................................................8
Composants du kit ................................................................................8
11.
Evaluation des performances .............................................................25
11.1
Sensibilité analytique .............................................................................25
11.2
Spécificité analytique .............................................................................28
11.3Précision ................................................................................................31
3.Conservation ..........................................................................................8
4.
5.
6.
7.
12.
Limitations et précautions ..................................................................35
13.
Contrôle qualité ....................................................................................36
14.
Assistance technique ..........................................................................36
15.
Marques commerciales et avis de non-responsabilité ....................36
16.
Explications des symboles .................................................................37
Matériel requis non fournis ...................................................................9
Informations générales .......................................................................10
Description du produit ........................................................................14
Mises en garde et précautions ...........................................................16
8.
Mode d‘emploi ......................................................................................17
8.1
Préparation de l‘échantillon ...................................................................17
8.2
Préparation du Mastermix ......................................................................18
8.3
Préparation de la réaction .....................................................................20
9.
Programmation des instruments de PCR en temps réel .................20
9.1Paramètres ............................................................................................21
9.2
Marqueurs de fluorescence (fluorophores) ............................................21
9.3
Profil de température et aquisition du fluorophore ................................22
10.
Analyse des données ..........................................................................22
10.1
Validité du test de diagnostic .................................................................22
10.1.1 Test de diagnostic valide (qualitatif) .......................................................22
10.1.2 Test de diagnostic invalide (qualitatif) ....................................................23
10.2
6
Interprétation des résultats ....................................................................24
7
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
1.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
• La conservation à +4°C ne doit pas excéder une période de deux heures.
Usage prévu
• Le Master A et le Master B doivent être conservés à l’abri de la lumière.
Le kit RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, est un test de diagnostic in vitro,
basé sur la technologie de PCR en temps réel, pour la détection qualitative et la
différenciation de l’ARN spécifique des virus Ebola et Marburg.
2.
Composants
Nombre de
flacons
Volume
[µL/tube]
Matériel requis non fournis
• Instrument adapté à la PCR en temps réel (Chapitre 6: Description du produit)
Composants du kit
Couleur de
couvercle
4.
• Système ou kit approprié à l’extraction des acides nucléiques
• Centrifugeuse de paillasse avec rotor pour tubes réactionnels de 2 mL
Bleu
Master A
Violet
Master B
Vert
Contrôle
interne1
Rouge
Contrôle
positif
Cible Ebola
Orange
Blanc
96 puits de réaction
Contrôle
positif
Eau
Cible
ultra-pure2
Marburg
8
1
1
1
1
60
180
1000
250
250
500
contrôle interne (CI), internal control (IC)
2
pour biologie moléculaire, PCR grade water
• Vortex
• Plaques de 96 puits ou tubes de réaction avec matériel de fermeture (optique)
correspondant
8
1
• Centrifugeuse avec rotor pour microplaques, si vous utilisez des plaques de
3.Conservation
• Le kit RealStar Filovirus Screen PCR Kit 1.0 est expédié sous glace carbo®
• Pipettes (réglables)
• Cônes avec filtres (jetables)
• Gants non talqués (jetables)
NOTE
Merci de vous assurer que les instruments ont été installés,
calibrés, vérifiés et entretenus selon les instructions et les recommandations du fabricant.
nique. Les composants du kit doivent arriver congelés. Si un ou plusieurs
composants ne sont pas congelés à la réception, ou si l’un des tubes a été
endommagé pendant le transport, merci de contacter altona Diagnostics
GmbH pour assistance.
• Tous les composants doivent être conservés à -20°C dès leur réception.
• Il convient d’éviter les cycles répétitifs de congélation-décongélation (plus de
deux fois) car cela peut affecter les performances du test. Les réactifs doivent
être congelés en aliquote en cas d’utilisation occasionnelle.
8
9
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
5.
Informations générales
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
particulier ceux dont l’issue de la maladie est fatale) ne développent aucun titre
d´anticorps détectables au cours de la maladie [9].
Les virus Ebola et Marburg sont des genres de la famille des Filoviridae. Le genre
Plusieurs protocoles de RT-PCR pour la détection des filovirus ont été publiés, mais
Marburgvirus contient une espèce unique appelée Marburgvirus Marburg (MARV).
aucun d’entre eux n’inclut un contrôle interne d’amplification ou ne permet la détec-
Le genre Ebolavirus contient cinq espèces : Ebolavirus Bundibugyo (BEBOV), Ebo-
tion et le typage du Ebolavirus et du Marburgvirus en une seule réaction de PCR
lavirus Reston (RESTV), Ebolavirus Soudan (SEBOV), Ebolavirus Forêt de Taï
en temps réel. Le protocole publié par Panning et ses collègues en 2007, qui cible
(TAFV) et Ebolavirus Zaïre (ZEBOV) [1].
le gène L, s’est avéré être un test sensible et spécifique [10]. Depuis, il a été utilisé
par plusieurs laboratoires de référence dans le monde entier pour le diagnostic des
Toutes les espèces connues d’Ebolavirus et de Marburgvirus sont endémiques en
filovirus. Néanmoins, les dernières données de séquençage disponibles et
Afrique, à l’exception de RESTV qui est endémique en Asie du Sud-Est. Les hôtes
l’apparition de nouvelles espèces Ebola (BEBOV) ont montré la nécessité de con-
naturels des filovirus sont les roussettes [2] [3]. Une fois transmis aux humains, les
tinuellement vérifier et mettre à jour les méthodes existantes. Le test de 2007 ci-
filovirus peuvent causer une fièvre hémorragique aiguë avec un taux de mortalité
blant le gène L présente certaines lacunes. Par conséquent, un nouveau test basé
relativement élevé, de 20 à 90% (selon les espèces et les souches de chaque
sur le gène L des filovirus a été développé par altona Diagnostics GmbH.
épidémie) [4]. Le mode de transmission est souvent difficile à déterminer. La
chasse, l’abattage et la consommation d’animaux sauvages constituent des modes
Le gène L des filovirus, codant pour la polymérase virale, contient des éléments de
d’introduction potentiels du virus dans la population humaine. Il a également été
séquence hautement conservés. Les mutations dans les zones codant pour des
montré qu’un contact direct avec les chauve-souris constituait un mode d’infection
sites présentant une activité enzymatique donnent généralement lieu à une perte
potentiel [5]. De nombreuses espèces mammaliennes sont sujettes aux infections
de fonction. Ces mutants disparaîtront des quasi-espèces virales et n’auront au-
par les filovirus. En particulier, les chimpanzés et les gorilles ont été largement
cune conséquence négative sur la spécificité du test de RT-PCR. Par conséquent,
touchés par des épidémies d’Ebolavirus, ce qui a entraîné une réduction consi-
nous avons décidé d’utiliser le gène L comme séquence cible pour le RealStar®
dérable de populations des grands singes [6].
Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0. Le gène L des virus à ARN en tant que cible pour
Les symptômes sont en général non spécifiques au début de la maladie: malaise
les RT-PCR destinées au diagnostic a été utilisé avec succès dans le passé pour
général, fièvre et douleurs dans différentes parties du corps [7]. Au début des épi-
le virus Lassa, les filovirus et d’autres virus à ARN [10–12].
démies, la maladie est souvent confondue avec le paludisme, la fièvre typhoïde ou
d’autres maladies fébriles courantes en Afrique subsaharienne.
Le RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 est recommandé comme test de
Le titres infectieux du virus et le titre d’ARN pendant la phase aiguë de la maladie
diagnostic de première intention. Il est conçu pour détecter toutes les espèces
sont généralement élevés, et le niveau de virémie est inversement proportionel à
pertinentes de filovirus. altona Diagnostics GmbH propose également un test de
la gravité de l´issue de la maladie. [8]. Les saignements et autres hémorragies sont
deuxième intention. Le RealStar® Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 cible d’autres
également des indicateurs de l’issue fatale des fièvres Ebola et Marburg [7].
séquences du génome du virus, et permet donc de générer un résultat de diagnos-
Les diagnostics de laboratoire sont effectués de préférence à l’aide d’une RT-PCR
tic de confirmation. En outre, le RealStar® Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 permet de
d’échantillons de plasma, de sérum ou même de sang total. Les tests sérologiques
différencier les différentes espèces de tous les filovirus pertinents.
constituent un soutien au diagnostic, mais ne sont pas nécessaires pour le diagnostic primaire de la maladie. En fait, il a été montré que de nombreux patients (en
10
11
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
La suspicion et la confirmation d’infections par filovirus ont un grand impact sur la
[9]
santé publique et la gestion de cas. Tous les cas doivent être immédiatement sig-
profiles in patients infected with the newly discovered Bundibugyo ebolavirus. Virology
nalés aux autorités respectives responsables de la santé publique et de la biosé-
2012;423:119–24.
curité (en Allemagne : Robert Koch Institut, Berlin; et les « Landesgesundheitsäm-
[10]
ter » locaux). Il est nécessaire de discuter de la procédure de diagnostic (p. ex.
Diagnostic Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Kit for Filoviruses Based on
diagnostic de différenciation recommandé, utilisation possible d’échantillon A et B)
the Strain Collections of all European Biosafety Level 4 Laboratories.
avec des institutions d’experts de référence.
J Infect Dis 2007;196:S199–S204.
Gupta M, MacNeil A, Reed ZD, Rollin PE, Spiropoulou CF. Serology and cytokine
Panning M, Laue T, Ölschlager S, Eickmann M, Becker S, Raith S, et al.
[11]
[1]
Carroll SA, Towner JS, Sealy TK, McMullan LK, Khristova ML, Burt FJ, et al.
Blasdell KR, Adams MM, Davis SS, Walsh SJ, Aziz-Boaron O, Klement E, et al. A
reverse-transcription PCR method for detecting all known ephemeroviruses in clinical sam-
Molecular Evolution of Viruses of the Family Filoviridae Based on 97 Whole-Genome
ples. J Virol Methods 2013;191:128–35.
Sequences. J Virol 2013;87:2608–16.
[12]
[2]
for detection of Lassa virus and related Old World arenaviruses targeting the L gene. Trans
Towner JS, Amman BR, Sealy TK, Carroll SAR, Comer JA, Kemp A, et al. Isolation
of Genetically Diverse Marburg Viruses from Egyptian Fruit Bats. PLoS Pathog
Vieth S, Drosten C, Lenz O, Vincent M, Omilabu S, Hass M, et al. RT-PCR assay
R Soc Trop Med Hyg 2007;101:1253–64.
2009;5:e1000536.
[3]
Leroy EM, Epelboin A, Mondonge V, Pourrut X, Gonzalez J-P, Muyembe-Tamfum
J-J, et al. Human Ebola Outbreak Resulting from Direct Exposure to Fruit Bats in Luebo,
NOTE
Democratic Republic of Congo, 2007. Vector-Borne Zoonotic Dis 2009;9:723–8.
[4]
Kortepeter MG, Bausch DG, Bray M. Basic Clinical and Laboratory Features of
En raison de l’évolution moléculaire des filovirus, tout système de
Filoviral Hemorrhagic Fever. J Infect Dis 2011;204:S810–S816.
test basé sur la technologie de PCR présente le risque inhérent
[5]
qu’une accumulation de mutations dans le temps entraîne des ré-
Van Paassen J, Bauer MP, Arbous MS, Visser LG, Schmidt-Chanasit J, Schilling
S, et al. Acute liver failure, multiorgan failure, cerebral oedema, and activation of proangio-
sultats faussement négatifs.
genic and antiangiogenic factors in a case of Marburg haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis
2012;12:635–42.
[6]
Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquière S, Kilbourne A, Froment J-M, et al.
Multiple Ebola virus transmission events and rapid decline of central African wildlife. Science
2004;303:387–90.
[7]
Roddy P, Howard N, Van Kerkhove MD, Lutwama J, Wamala J, Yoti Z, et al. Clinical
Manifestations and Case Management of Ebola Haemorrhagic Fever Caused by a Newly
Identified Virus Strain, Bundibugyo, Uganda, 2007–2008. PLoS ONE 2012;7:e52986.
[8]
Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, et al. Rapid
Diagnosis of Ebola Hemorrhagic Fever by Reverse Transcription-PCR in an Outbreak Setting
and Assessment of Patient Viral Load as a Predictor of Outcome. J Virol 2004;78:4330–41.
12
13
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
6.
Description du produit
Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 est un test de diagnostic in vitro, basé
sur la technologie de PCR en temps réel, pour la détection qualitative de l’ARN
spécifique du filovirus. Le test est conçu pour détecter toutes les espèces de filovirus constituant des pathogènes humains pertinents, ainsi que le virus Reston. Le
kit comprend un système d’amplification hétérologue (contrôle interne, internal
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Le test consiste en trois procédures réalisées dans un même tube à essai:
• Transcription inverse de l’ARN cible en ADNc
• Amplification par PCR de l’ADNc et du contrôle interne (IC)
• Détection simultanée des amplicons de PCR par des sondes marquées par
un colorant fluorescent
control, (IC)) afin d´identifier d´éventuelles inhibitions de la PCR et de confirmer
l’intégrité des réactifs du kit.
Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 a été développé et validé pour être utilisé
avec les instruments de PCR en temps réel suivants:
Le test repose sur la technologie de transcription inverse couplée à une réaction
d’amplification en chaîne (RT-PCR) qui utilise la transcription inverse (RT) pour
convertir l’ARN en ADN complémentaire (ADNc), la réaction d’amplification en
chaîne (PCR) pour l’amplification de séquences cibles spécifiques, ainsi que des
sondes spécifiques aux cibles pour la détection de l’ADN amplifié. Les sondes sont
marquées par un reporter fluorescent et un quencher.
• Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene)
• Versant® kPCR Molecular System AD (Siemens)
• ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems)
• LightCycler® 480 Instrument II (Roche)
• Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research)
Les sondes spécifiques à l’ARN de l’Ebolavirus sont marquées par le fluorophore
FAM. Les sondes spécifiques à l’ARN du Marburgvirus sont marquées par un fluorophore présentant les mêmes caractéristiques que le Cy5. La sonde spécifique
• Rotor-Gene® Q 5/6 plex Platform (QIAGEN)
• CFX96™/Dx Real-Time System (BIORAD)
pour la cible du contrôle interne (CI) est marquée par le fluorophore JOE. L’utilisation
de sondes associées à des colorants discernables permet de détecter et de dif-
Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 est composé de:
férencier simultanément l’ARN spécifique à Ebolavirus et celui spécifique à Marburgvirus, ainsi que le contrôle interne dans les canaux de détection correspondants de l’instrument de PCR en temps réel.
En raison de l’évolution moléculaire relativement rapide des virus à ARN, tout système de test basé sur la technologie RT-PCR présente le risque inhérent qu’une
accumulation de mutations dans le temps entraîne des résultats faussement négatifs. Le concept du test repose sur les données de séquence publiées dans la
• Deux Master: (Master A et Master B)
• Contrôle interne (IC) avec matrice
• Deux contrôles positifs : contrôle positif ciblant Ebola
contrôle positif ciblant Marburg
• Eau ultra-pure (pour biologie moléculaire)
GeneBank à partir de décembre 2013. En raison de l’apparition constante de nou-
Les réactifs Master A et Master B contiennent tous les composants nécessaires
velles souches et espèces encore inconnues, l’actualisation du système d’amorces/
(tampon, enzymes, amorces et sondes) afin de réaliser la transcription inverse,
de sondes peut s’avérer nécessaire.
l’amplification par PCR et la détection des cibles (ARN spécifique aux filovirus et
contrôle interne) en une seule étape de réaction.
14
15
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
7.
Mises en garde et précautions
• L’utilisation de ce produit est limitée au personnel qualifié et formé aux techniques de PCR en temps réel et aux procédures de diagnostic in vitro.
• Manipuler les échantillons comme s’ils étaient infectieux et/ou dangereux, en
accord avec les procédures de sécurité en vigueur dans le laboratoire.
• Porter des gants jetables non talqués, une blouse de laboratoire et des
lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons.
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
8.
Mode d‘emploi
8.1
Préparation de l‘échantillon
L’ARN extrait constitue l’échantillon de départ pour le kit RealStar® Filovirus Screen
PCR 1.0. La qualité de l’ARN extrait a un impact important sur la performance de
l’ensemble du test. Il est important de s’assurer que le système d’extraction des
acides nucléiques utilisé est compatible avec la technologie de PCR en temps réel.
• Eviter les contaminations microbiennes et nucléaires (par ADNase/ARNase)
de l’échantillon et des composants du kit.
• Toujours utiliser des pipettes à cônes jetables avec filtre, non contaminées par
de l’ADNase et de l’ARNase.
• Toujours porter des gants de protection non talqués lors de la manipulation
des composants du kit.
• Utiliser des zones de travail séparées les unes des autres pour les différentes
activités de (i) préparation des échantillons, (ii) préparation de la réaction et
(iii) les étapes d’amplification/détection. Le sens de travail dans le laboratoire
doit être unidirectionnel. Porter des gants dans chaque zone de travail et les
Le kit d’extraction des acides nucléiques suivant a été validé pour être utilisé avec
le kit RealStar® Filovirus Screen PCR Kit 1.0:
• QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)
Si la préparation des échantillons s’effectue sur une colonne comportant des tampons de lavage à l’éthanol, une étape de centrifugation supplémentaire de 10 minutes à environ 17000 x g (~ 13000 tr/min), dans un nouveau tube à essai, est vivement recommandée avant l’élution des acides nucléiques. changer avant d’entrer dans une zone différente.
• Dédier des fournitures et du matériel pour chaque zone de travail et ne pas
les déplacer d’une zone à une autre.
• Conserver le matériel positif et/ou potentiellement positif séparément des
autres composants du kit.
• Ne pas ouvrir les tubes/plaques de réaction après l’amplification afin d’éviter
toute contamination par les amplicons.
• Des témoins additionnels peuvent devoir être testés selon les directives des
organisations locales/gouvernementales ou des organismes d’accréditation.
NOTE
L’utilisation d’ARN porteur (carrier) est crucial pour l’efficacité de
l’extraction et la stabilité de l’acide nucléique extrait.
L’éthanol est un fort inhibiteur de la PCR en temps réel. Si votre
système de préparation des échantillons utilise des tampons de
lavage à l’éthanol, assurez vous d’éliminer toute trace d’éthanol
avant de procéder à l’élution de l’acide nucléique.
• Ne pas utiliser les composants au-delà de leur date d’expiration.
• Eliminer les échantillons et les déchets de l’essai conformément aux règles
de sécurité.
16
17
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Pour toute information complémentaire ou assistance technique sur le pré-
• Si le contrôle interne (IC) est utilisé comme contrôle de préparation de
traitement et la préparation des échantillons, merci de contacter notre support
l’échantillon et d‘inhibition de la PCR, le contrôle interne (IC) doit être ajouté
technique:
au moment de la procédure d’extraction de l’acide nucléique.
e-mail:
[email protected]
téléphone:+49-(0)40-5480676-0
• Quelque soit la méthode ou le système utilisé pour l’extraction de l’acide
nucléique, le contrôle interne (IC) ne doit jamais être ajouté directement à
l’échantillon. Il doit toujours être ajouté au mélange échantillon/tampon de
lyse. Le volume de IC à ajouter dépend toujours et uniquement du volume
8.2
Préparation du Mastermix
d’élution. Il doit représenter 10% du volume d’élution. Par exemple si l’acide
nucléique doit être élué dans 60 µL de tampon d’élution ou d’eau, 6 µL de IC
Tous les réactifs doivent être complètement décongelés, homogénéisés (par
par échantillon doivent être ajoutés au mélange échantillon/tampon de lyse.
pipetage ou léger vortexage) et brièvement centrifugés avant l’utilisation.
Le RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 contient un contrôle interne (IC)
NOTE
hétérologue pouvant être utilisé soit en tant que contrôle d’inhibition de la RT-PCR
soit en tant que contrôle de la procédure de préparation des échantillons (extractiondes acides nucléiques) et en tant que contrôle d’inhibition de la RT-PCR.
Ne jamais ajouter le contrôle Interne directement avec l‘échantillon!
• Si le contrôle interne est utilisé en tant que contrôle d’inhibition de la RTPCR, mais non en tant que contrôle lors de la procédure de préparation des
échantillons, le Mastermix est préparé selon le schéma de pipetage suivant:
• Si le contrôle interne a été ajouté pendant la phase de préparation de
l’échantillon, le Mastermix doit être préparé selon le schéma de pipetage
1
12
Master A
5 µL
60 µL
Master B
15 µL
180 µL
Contrôle interne
1 µL
12 µL
Volume Mastermix
21 µL
252 µL
Nombre de réactions (rxns)
18
suivant:
1
12
Master A
5 µL
60 µL
Master B
15 µL
180 µL
Volume Mastermix
20 µL
240 µL
Nombre de réactions (rxns)
19
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
8.3
Préparation de la réaction
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
9.1Paramètres
• Pipeter 20 µL de Mastermix dans chacun des puits nécessaires d’une plaque
• Définir les paramètres suivants:
96 puits ou d’un tube réactionnel permettant les réactions optiques.
• Ajouter 10 µL de l‘échantillon (éluat issu de l’extraction des acides nucléiques)
Paramètres
ou 10 µL des contrôles (étalons, contrôles positifs ou négatifs).
Volume de réaction
• Veiller à ce qu´au moins un contrôle positif et un contrôle négatif soient utilisé
par essai.
Taux de rampe
• Homogénéiser avec soin les échantillons et les contrôles avec le Mastermix
30 µL
par défaut
Référence passive
aucune
par pipettage.
• Couvrir la plaque de 96 puits avec un film adhésif transparent approprié et les
tubes réactionnels à l’aide des couvercles appropriés.
9.2
Marqueurs de fluorescence (fluorophores)
• Centrifuger les plaque de 96 puits à l’aide d’un rotor à microplaques pendant
30 secondes à environ 1000 x g (~ 3000 tr/min).
Préparation de la réaction
Mastermix
Echantillon ou contrôle
Volume total
20 µL
10 µL
30 µL
• Définir les marqueurs fluorescence (fluorophores):
Detection
Nom du marqueur
Reporter
Quencher
ARN spécifique
au Ebolavirus
Ebolavirus
FAM
(aucun)
ARN spécifique
au Marburgvirus
Marburgvirus
Cy5
(aucun)
IC
JOE
(aucun)
Contrôle interne (IC)
9.
Programmation des instruments de PCR en temps réel
Pour obtenir des informations générales sur la préparation et la programmation des
différents instruments de PCR en temps réel, veuillez consulter les manuels
d’utilisation des instruments respectifs. Pour des instructions de programmation
relative à l’utilisation du kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 avec un instrument
de PCR en temps réel spécifique, merci de contacter notre support technique.
20
21
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
9.3
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Profil de température et aquisition du fluorophore
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Nom du contrôle
• Définir le profil de température et l’aquisition du fluorophore:
Etape
Aquisition
Temperature
Durée
Cy5
JOE
Canal de
Canal de
détection
détection
détection
Contrôle positif
Ebolavirus
POSITIF
NÉGATIF
POSITIF
Transcription
inverse
Stationnaire1
1
-
55 °C
20:00 min
Contrôle positif
Marburgvirus
NÉGATIF
POSITIF
POSITIF
Dénaturation
Stationnaire1
1
-
95 °C
2:00 min
Contrôle negatif
NÉGATIF
NÉGATIF
POSITIF
-
95 °C
0:15 min
-
58 °C
0:45 min
√
72 °C
0:15 min
Amplification
1
Nombre cycles
FAM
Canal de
Cyclique2
45
hold, 2 cycle
10.1.2 Test de diagnostic invalide (qualitatif)
Un test de diagnostic qualtitatif est invalide, (i) si l’essai n’est pas complet ou (ii)
si les différentes conditions de contrôle pour un test de diagnostic valide ne sont
10.
Analyse des données
pas remplies.
En cas d’invalidité du test de diagnostic, répéter le test avec les acides nucléiques
Pour des informations de base concernant l’analyse des données sur un instrument
purifiés restants ou bien en recommencant avec l’échantillon de départ.
spécifique de PCR en temps réel, merci de se référer au manuel concerné. Pour
.
des informations détaillées concernant l’analyse des données avec le kit
RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 sur des différents instruments de PCR en
temps réel, merci de contacter notre support technique.
10.1
Validité du test de diagnostic
10.1.1 Test de diagnostic valide (qualitatif)
Pour qu’un test de diagnostic qualitatif soit valide, les valeurs suivantes des
contrôles doivent être obtenues:
22
23
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
10.2
Interprétation des résultats
Échantillon
Canal de
Canal de
Canal de
détection
détection
détection
FAM
Cy5
JOE
Interprétation
des résultats
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
11.
Evaluation des performances
11.1
Sensibilité analytique
La sensibilité analytique du kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 est définie comme étant la concentration (copies par µL d’éluat) de molécules d’ARN spécifique à
A
POSITIF
POSITIF
POSITIF*
ARN spécifique à Ebolavirus
détecté.
POSITIF*
ARN spécifique à Marburgvirus détecté.
POSITIF
Pas d’ARN de Ebolavirus ou
de Marburgvirus détecté.
L’échantillon ne contient pas
de quantité détectable de
ces ADN spécifiques.
Ebola- ou Marburgvirus pouvant être détectées avec un taux de positivité à ≥ 95%.
La sensibilité analytique a été déterminée en analysant des séries de dilution de
transcrits in vitro transcripts (IVT) de concentration connue, spécifiques à MARV
B
C
D
NÉGATIF
NÉGATIF
NÉGATIF
NÉGATIF
NÉGATIF
NÉGATIF
NÉGATIF
Inhibition de la PCR ou défaillance des réactifs. Répéter le
test à partir de l’échantillon
d’origine ou bien prélever et
tester un nouvel échantillon.
* La détection du contrôle interne (IC) dans le canal de détection JOE n’est pas requise pour
les résultats positifs dans le canal de détection FAM ou le canal de détéction Cy5. Une charge
élevée de filovirus dans l’échantillon peut conduire à des signaux du contrôle interne réduits
ou absents.
24
Popp, SEBOV Gulu et ZEBOV Gabon 2003.
Les données générées pour le calcul de la limite de détection de 95% sont résumées dans les tableaux 1, 2 et 3 ci-dessous pour MARV Popp, ZEBOV Gabon 2003
et SEBOV Gulu, respectivement.
Tableau 1: Résultats de PCR utilisés pour le calcul de la sensibilité analytique du RealStar®
Filovirus Screen PCR 1.0 pour l´ARN spécifique au MARV
MARV Popp
[C] initiale
[copies/µL]
Nombre de
cycles
Nombre de
positifs
Pourcentage
de détéction
[%]
Contrôle
interne
31.6
12
12
100
valide
10
12
12
100
valide
3.16
12
12
100
valide
1.0
12
12
100
valide
0.316
12
8
66.7
valide
0.1
12
2
16.7
valide
0.03
12
0
0
valide
0.01
12
1
8.3
valide
NTC
12
0
0
valide
25
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Tableau 2: Résultats de PCR utilisés pour le calcul de la sensibilité analytique du RealStar®
Tableau 3: Résultats de PCR utilisés pour le calcul de la sensibilité analytique du RealStar®
Filovirus Screen PCR 1.0 pour l´ARN spécifique au ZEBOV
Filovirus Screen PCR 1.0 pour l´ARN spécifique au SEBOV
ZEBOV Gabon 2003
SEBOV Gulu
[C] initiale
[copies/µL]
Nombre de
cycles
Nombre de
positifs
Pourcentage
de détéction
[%]
Contrôle
interne
31.6
12
12
100
10
12
12
3.16
12
1.0
[C] initiale
[copies/µL]
Nombre de
cycles
Nombre de
positifs
Pourcentage
de détéction
[%]
Contrôle
interne
Valide
31.6
12
12
100
Valide
100
Valide
10
12
12
100
Valide
12
100
Valide
3.16
12
7
58.3
Valide
12
11
91.7
Valide
1.0
12
1
8.3
Valide
0.316
12
7
58.3
Valide
0.316
12
0
0
Valide
0.1
12
4
33.3
Valide
0.1
12
0
0
Valide
0.03
12
1
8.3
Valide
0.03
12
0
0
Valide
0.01
12
0
0
Valide
0.01
12
0
0
Valide
NTC
12
0
0
Valide
NTC
12
0
0
Valide
La sensibilité analyique du kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 a été déterminée
par analyse Probit.
Pour l´ARN spécifique au MARV: 1.16 copies/µL d´éluat
[intervalle de confiance de 95%:
0.22 to 11.67 copies cibles/µL]
Pour l´ARN spécifique au ZEBOV: 1.39 copies/µL d´éluat
[intervalle de confiance de 95%:
0.69 to 5.32 copies cibles/µL]
Pour l´ARN spécifique au SEBOV: 6.75 target copies/µL
[intervalle de confiance de 95%:
26
4.25 to 24.58 copies cibles/µL]
27
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
11.2
Spécificité analytique
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Tableau 4: Les organismes testés afin de démontrer la spécificité analytique du kit RealStar®
Filovirus Screen PCR 1.0
La spécificité analytique du kit RealStar Filovirus Screen PCR 1.0 est assurée par
®
RealStar® Filovirus Screen PCR Kit 1.0
une sélection approfondie des oligonucléotides (amorces et sondes). Les séquences de ces derniers ont été comparées aux séquences publiques disponibles afin de
s’assurer que toutes les souches intéressantes d`Ebola- et Marburgvirus seront
Canal
FAM
(Cible Ebola)
Canal
Cy5
(Cible Marburg)
Canal
JOE
(IC)
Virus de l'encéphalite japonaise
Positif
Négatif
Valide
Virus de l'encéphalite de Saint Louis
Négatif
Positif
Valide
Virus du Nil occidental, NY99
Négatif
Négatif
Valide
Virus du Nil occidental, Ouganda
Négatif
Négatif
Valide
Virus de la fièvre jaune
Négatif
Négatif
Valide
Virus de l'encéphalite de la Murray
Valley
Négatif
Négatif
Valide
Virus Zika
Négatif
Négatif
Valide
Virus des encéphalites transmises
par les tiques
Négatif
Négatif
Valide
Virus Usutu
Négatif
Négatif
Valide
Virus de la dengue 1
Négatif
Négatif
Valide
Virus de la dengue 2
Négatif
Négatif
Valide
Virus de la dengue 3
Négatif
Négatif
Valide
Virus de la dengue 4
Négatif
Négatif
Valide
Virus de l’hépatite C
Négatif
Négatif
Valide
Virus du Nil occidental NY99 D
Négatif
Négatif
Valide
Virus de l’hépatite A
Négatif
Négatif
Valide
Virus de l’hépatite E
Négatif
Négatif
Valide
CCHFV Afg09-2990
Négatif
Négatif
Valide
Virus Lassa Nig08-A37
Négatif
Négatif
Valide
Virus Lassa CSF
Négatif
Négatif
Valide
Virus Lassa Lib05-1580/121
Négatif
Négatif
Valide
Organismes
détectées.
La spécificité analytique du RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 a été évaluée
®
en testant un panel d’ARN/ADN génomique extrait de différents pathogènes liés à
Marburgvirus et à Ebolavirus et/ou susceptibles de causer des symptômes
similaires.
28
29
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Suite du tableau 4, : Les organismes testés afin de démontrer la spécificité analytique du kit
11.3Précision
RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Les données de précision pour le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 ont été
déterminées comme étant la variabilité intra-essai (variabilité au sein d’une expéri-
Canal
FAM
(Target Ebola)
Canal
Cy5
(Target Marburg)
Canal
JOE
(IC)
Virus Lassa AV
Négatif
Négatif
Valide
Les données de variabilité sont exprimées en termes de valeur moyenne, d’écart
Junin virus XJ
Négatif
Négatif
Valide
type, de variance et de coefficient de variation, sur la base des valeurs de cycle
Machupo virus Carvallo
Négatif
Négatif
Valide
seuil (Ct). La variabilité intra-essai, la variabilité inter-essai et la variabilité inter-lot
Sabia virus SPH114202
Négatif
Négatif
Valide
Guanarito-Virus INH-95551
Négatif
Négatif
Valide
VSV Indiana
Négatif
Négatif
Valide
Rift-Valley fever virus MP 12
Négatif
Négatif
Valide
Hantaan virus 76-118
Négatif
Négatif
Valide
ZEBOV Gabon 2003
Positif
Négatif
Valide
ZEBOV Mayinga
Positif
Négatif
Valide
ZEBOV 2014/Gueckedou-C05
Positif
Négatif
Valide
SEBOV Gulu
Positif
Négatif
Valide
TAFV
Positif
Négatif
Valide
RESTV
Positif
Négatif
Valide
MARV Musoke
Négatif
Positif
Valide
MARV Popp
Négatif
Positif
Valide
MARV Leiden
Négatif
Positif
Valide
Organismes
Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 n’a présenté aucune réaction croisée
avec l’un des organismes spécifiés ci-dessus.
ence), la variabilité inter-essai (variabilité entre différentes expériences) et la variabilité inter-lot (variabilité entre différents lots de production).
d’au moins six réplicats par échantillon ont été analysées. La variance totale a été
calculée en combinant les trois analyses
Tableau 5: Données de précision pour le système de détéction spécifique à l`ARN du ZEBOV
du kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0
Précision
Variabilité
Intra-essai
Variabilité
Inter-essai
Variabilité
Inter-Lot
Variance
totale
30
[C]
moyenne
(copies/µL)
Valeurs
Ct
moyennes
Écart type
Variance
Coefficient
de
Variation
(%)
30
31.56
0.17
0.03
0.54
10
32.80
0.12
0.01
0.36
30
31.85
0.32
0.10
1.02
10
33.07
0.34
0.12
1.04
30
31.76
0.40
0.16
1.26
10
33.03
0.44
0.20
1.35
30
31.70
0.35
0.12
1.10
10
32.95
0.38
0.15
1.16
31
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Tableau 6: Données de précision pour le système de détéction spécifique à l`ARN du MARV
Tableau 7: Données de précision pour le système de détection du contrôle interne du
du kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, pour des échantillons de 30 copies cibles/μL en
Précision
Variabilité
Intra-essai
Variabilité
Inter-essai
Variabilité
Inter-Lot
Variance
totale
Coefficient
de
Variation
(%)
[C]
moyenne
(copies/µL)
Valeurs
Ct
moyennes
Écart type
30
30.71
0.27
0.07
0.88
10
31.82
0.25
0.06
0.80
30
30.86
0.24
0.06
0.79
10
32.06
0.32
0.10
0.99
30
30.83
0.21
0.05
0.69
10
32.03
0.30
0.09
0.93
30
30.79
0.23
0.05
0.75
10
31.96
0.29
0.09
0.92
Variance
ZEBOV et de MARV, respectivement.
Précision
Variabilité
Intra-essai
Variabilité
Inter-essai
Variabilité
Inter-Lot
Variance
totale
30 copies/
µL en
Valeurs
Ct
moyennes
Écart type
Variance
Coefficient
de
Variation
(%)
ZEBOV
28.98
0.05
0.00
0.19
MARV
28.90
0.09
0.01
0.32
ZEBOV
29.32
0.36
0.13
1.23
MARV
29.26
0.39
0.15
1.32
ZEBOV
29.26
0.43
0.19
1.48
MARV
29.22
0.43
0.18
1.47
ZEBOV
29.16
0.37
0.14
1.29
MARV
29.11
0.38
0.15
1.31
Les données de précision générées pour le système de détection du contrôle internesont résumées dans les tableaux 7 et 8 pour des échantillons contenant 30 et
10 copies virales cibles respectivement.
32
33
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Tableau 8: Données de précision pour le système de détection du contrôle interne du
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, pour des échantillons de 10 copies cibles/μL en
ZEBOV et de MARV, respectivement.
Précision
Variabilité
Intra-essai
Variabilité
Inter-essai
Variabilité
Inter-Lot
Variance
totale
12.
Limitations et précautions
• L’utilisation de ces produits est limitée au personnel compétent et formé aux
techniques de PCR en temps réel et aux procédures de diagnostic in vitro.
Coefficient
de
Variation
(%)
• Le respect des bonnes pratiques de laboratoire est essentiel pour garantir le
Valeurs
Ct
moyennes
Écart type
ZEBOV
29.09
0.05
0.00
0.17
MARV
29.02
0.07
0.01
0.26
ZEBOV
29.41
0.34
0.12
1.16
MARV
29.34
0.34
0.12
1.17
méthodes appropriées d’extraction des acides nucléiques doivent être
ZEBOV
29.32
0.43
0.19
1.48
• La présence d’inhibiteurs de PCR est susceptible d’entraîner des résultats
MARV
29.28
0.41
0.17
1.40
ZEBOV
29.24
0.37
0.14
1.26
vertes par l’amorce et/ou les sondes du test peuvent empêcher la détection
MARV
29.19
0.35
0.13
1.21
• Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR Kit 1.0 est un test de diagnostic. En
10 copies/
µL en
Variance
bon fonctionnement de ce test. Une attention particulière doit être apportée à
la préparation des échantillons afin de préserver la pureté des composants
du kit. Tous les réactifs doivent faire l’objet d’une surveillance étroite afin
d´éviter impuretés et contaminations. Tout réactif suspect doit être éliminé.
• Il est nécessaire de respecter les procédures de prélèvement, de transport,
de conservation et de traitment des échantillons afin d’assurer les performances optimales du test.
• Ce test n’est pas destiné à être utilisé directement sur l’échantillon. Des
employées avant son utilisation.
faussement négatifs ou erronés.
• De potentielles mutations dans les zones cibles du génome du virus coude pathogènes.
conséquence, ses résultats doivent être interprétés en prenant en considération l´ensembles des symptômes cliniques et des résultats obtenus en
laboratoire.
34
35
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
13.
Contrôle qualité
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
16.
Explications des symboles
Conformément au système de management de la qualité d´altona Diagnostics
GmbH, certifié ISO EN 13485, chaque lot du RealStar® Filovirus Screen PCR Kit
1.0 est testé selon des spécifications prédéfinies afin de garantir une qualité con-
Dispositif medical de diagnostic in vitro
stante des produits.
14.
Assistance technique
Pour obtenir une assistance sur nos produits, merci de contacter notre support
technique:
Référence produit
Numéro de lot
e-mail:[email protected]
téléphone:
+49-(0)40-5480676-0
Contient le nombre suffisant pour réaliser „n“ tests (rxns)
15.
Limites de température
Marques commerciales et avis de non-responsabilité
RealStar® (altona Diagnostics GmbH); Mx 3005P™ (Stratagene); ABI Prism®
(Applied Biosystems); HighPure®, LightCycler® (Roche); Rotor-Gene®, QIAamp®
Version
(QIAGEN); VERSANT® (Siemens).
Utiliser avant
Les noms et marques déposés cités dans ce document, même si non mentionnés
comme tels, ne doivent pas être considérés comme non protégés par la loi.
Attention
Le kit RealStar® Filovirus Screen PCR 1.0 est un test de diagnostic in vitro, marqué
CE conformément à la Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs de
diagnostic in vitro.
Produit distribué dans certains pays uniquement.
Se reporter au manuel d‘utilisation
Fabricant
© 2015 altona Diagnostics GmbH; tous droits réservés.
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