Pré-stationnaire

ÉTUDES DE CINÉTIQUES RAPIDES
Les études cinétiques à l’état stationnaire vis à déterminer les paramètres
Vmax et Km (le dernier ne représente que dans certains cas une constante de
dissociation réelle). En cas des réactions à plusieurs substrats, l’analyse des
données cinétiques en état stationnaire permet de proposer un mécanisme d’action
plausible (« ping-pong, au hasard, ordonné, etc.). Toutefois, ces méthodes
d’analyse à l’état stationnaire ne nous permettent pas de suivre l’évolution des
intermédiaires de réaction. Ces intermédiaires sont pourtant ce qu’il y a de plus
indicatifs des mécanismes moléculaires impliqués dans la réaction enzymatique.
Les études cinétiques rapides ou d’état pré-stationnaire consistent à étudier
l’apparition ou la disparition d’un ou de plusieurs intermédiaires impliqués dans
une réaction enzymatique donnée.
E+S
ES
ES'
EP
E+P
EA'
E+A+B
EA
EAB
EAB'
EPQ
E+P+Q
EB + A
Une considération importante est le temps de vie des intermédiaires. Le
turnover, kcat, dans beaucoup des enzymes est de l’ordre 100 s-1 ; cela veut dire 100
molécules de produites sont générés par seconde par une molécule d’enzyme,
impliquant que l’étape la plus lente de la réaction possède une demi-vie seulement
de l’ordre de quelques millisecondes.
Cinétique d’état pré-stationnaire
Exemple d’une réaction d’un seul substrat impliquant un seul intermédiaire:
k1
k2
E + S ⇌ ES ⇌ E + P
k-1
k-2
Le taux avec lequel [ES] changes en fonction du temps, t, s’exprime par la relation
suivante :
d [ES ]
 k1[ E ][S ]  k1[ ES ]  k2 [ ES ]  k2 [ E ][ P]
dt
S’il est assumé que [S]0 >> [E]0 et [P] est négligeable pour la période, t, dans ces
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Cinétique pré-stationnaire
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conditions, l’équation possède une solution analytique qui est montrée dans la
figure ci-bas
(b)
[Concentration]
[Concentration]
(a)
S
Partie
linéaire
E
P
P
ES
E
ES
Période
d’induction
Temps
pré-stationnaire
Temps
stationnaire
● il y a deux parties dans ce graphique : la région stationnaire (a) et préstationnaire (b)
o la partie linéaire en (a) de [P] vs temps représente la région
stationnaire et possède la pente correspondante à la vitesse de la
réaction donc :
k 2 [ E ]0 [ S ]0
K M  [ S ]0
o dans la partie pré-stationnaire en (b), il est possible de calculer la
quantité qui représente le temps d’induction de la période stationnaire
1
k 1 [ S ]0 + k 2 + k -1
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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o à partir de cette quantité, qui est mesurée typiquement en
milliseconde, il est possible d’estimer les constants microscopiques ki
en tenant compte de kcat et KM
Dans le cas d’un système plus compliqué, il n’y a plus de solution analytique
et la détermination de constantes cinétiques se fait par approximation en utilisant
des méthodes spectroscopiques qui détectent seulement des intermédiaires
caractéristiques d’une certaine étape de la réaction
o
Rappel du « burst » de la cinétique de la chymotrypsine
Pour pouvoir étudier l’apparition de ces complexes intermédiaires, les
conditions expérimentales suivantes doivent être remplies :

La quantité d’enzyme disponible doit être suffisante pour étudier les
espèces enzymatiques en concentration saturable de substrat. En effet, c’est
l’interaction de l’enzyme avec un ou plusieurs substrats et non la formation de
produits qui est étudiée.

On doit disposer d’une méthode de détection spectrophotométrique,
radioisotopique ou autre pour suivre l’apparition ou la disparition de
l’intermédiaire.

On doit pouvoir faire les mesures très rapidement puisque les vitesses
de réaction peuvent être de l’ordre de 10-7 sec. Il nous faut donc pouvoir suivre la
réaction presque instantanément après le mélange des réactifs (enzyme +
substrat(s)).
Plusieurs méthodes ont été développées pour pouvoir satisfaire cette dernière
condition :
Mesure en flot continu
En 1923, Hartridge et Roughton introduisent la technique de mesure en flot
continu qui est illustrée ci-dessous.
t=d/x
d
Points d’observation
Ainsi, plusieurs points d’observation sont aménagés à la sortie de la chambre
de mélange, ce qui permet de suivre l’évolution de la réaction dans le temps, et ce,
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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presque instantanément après le mélange. À une vitesse d’écoulement constante,
l’âge de la solution du point de mixage est proportionnel de façon linéaire avec la
distance écoulée. Si la vitesse d’écoulement est 10 m s -1, alors à 1 cm de distance
de la chambre du mélangeur, la solution possède un âge de 1milliseconde, 10 cm
de la chambre, l’âge est 10 ms, etc. Le déplacement du fluide est laminaire
(absence de turbulence) dans le canal d’écoulement à condition que la vitesse
d’écoulement ne dépasse pas une vitesse critique et ceci afin d’éviter le mixage par
turbulence. En bas de la vitesse critique, le mixage sera seulement par diffusion
dans le canal d’écoulement, ce qui est comparativement très lent.
Le « temps mort » qui correspond au temps entre le mixage et la première
observation peut être très court lorsque cette technique est utilisée. Ce temps mort
peut être de l’ordre de micro-secondes. Cependant, il est nécessaire d’utiliser de
grandes quantités d’enzymes et de substrats pour réaliser cette technique.
Mesure en flot arrêté
Cette technique a été mise au point pour minimiser les quantités d’enzymes
et de substrats nécessaires. L’enzyme et le substrat sont d’abord acheminés dans la
chambre de mixage, mais le flot est immédiatement interrompu. Le parcours de la
réaction est donc suivi dans le temps en un point unique d’observation. Le « temps
mort » associé à cette technique est de l’ordre de 500 micro-secondes. Cependant,
la réaction peut être observée pour de longues périodes de temps sans les
problèmes techniques de la mesure en flot continu (longueur démesurée du tube).
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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« Quenching » rapide
Les deux techniques décrites plus haut présupposent que l’on peut suivre la
modification (spectrophotométrie ou radio-isotope) découlant de la réaction
enzymatique, par observation directe, ce qui n’est pas toujours le cas. Le
« quenching » rapide consiste à arrêter la réaction à un temps donné par l’addition
d’un troisième réactif (ex. acide), ce qui permet l’analyse ultérieure de
l’échantillon. Des « quenchs » à plusieurs temps différents permettent de suivre le
développement de la réaction.
« Flash photolyse »
Cette technique, qui ne peut être utilisée que dans certains cas bien précis,
permet d’initier la réaction enzymatique littéralement à la vitesse de la lumière.
Cette technique tire avantage de l’existence de liens chimiques photosensibles. Le
précurseur inactif d’un substrat est mis en présence de l’enzyme et le substrat est
activé par une photolyse lors d’un « flash » lumineux. La réaction ainsi initiée
peut donc être suivie dès son initiation. Un exemple d’un tel substrat nous est
donné par l’ATP « en cage ». Ce substrat peut être utilisé pour étudier toutes les
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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enzymes qui utilisent l’ATP comme substrat.
CH3
CH3
O
O
O
2 Adenine
CH O P O P O P O CH
O
O
O
O
H
H
NO2
HO OH
h
C
+ ATP
O
NO2
[Concentration]
Technique de relaxation
Il s’agit d’étudier le retour à l’équilibre (relaxation à l’équilibre) d’une
réaction suite à une perturbation de cet équilibre. Un changement de température
de 5 ou 10 degrés, par laser infrarouge, perturbe l’équilibre réactionnel. Le
rétablissement de l’état d’équilibre sous les nouvelles conditions peut être assimilé
à un nouvel état stationnaire. La constant de la vitesse de relaxation à l’équilibre,
désignée par le symbole τ,
est un paramètre très utilisé
dans l’analyse mathémaT20
Concentration
tique des études de
du nouvel
cinétiques rapides.
équilibre
Cette méthode ne
s’applique pas à des
réactions enzymatiques qui
sont quasiment irréversibles. Elle est utilisée dans
les situations où il s’agit de
la liaison simple par des
ligands (NAD+ par les
déshydrogénases), la liaison
d’inhibiteur ou change-
Relaxation
exponentielle vers le
nouvel équilibre
Concentration
à l’équilibre
initial
T10
Saut en température de 5-10C
en 0.1 à 1 μs
Temps
ments conformationnels. Voici comment se définit τ :
k
1.
1
A
B
kf
2.
A
B
kr
kon
3.
E+S

1
= kf + kr

1
ES
koff
BCM 2505
= k
Cinétique pré-stationnaire

= koff + kon[S]
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Analyses des cinétiques pré-stationnaire et de relaxation
Théorie de la cinétique de l’état pré-stationnaire
La cinétique pré-stationnaire se concentre donc sur la détection et l’analyse
des espèces enzymatiques transitoires dans la partie précoce de la réaction
 les processus cinétiques sont généralement caractérisés par des vitesses de
premier ordre en concentration dans la transformation d’une espèce en une autre
o donc leur évolution en fonction du temps suit une relation exponentielle
plutôt qu’une relation linéaire
o à noter : pendant la phase pré-stationnaire, le « turnover » de l’enzyme n’est
pas multiple comme dans le cas de l’état stationnaire, mais se fait seulement
une fois
Cas simple exponentiel
Dans une réaction réversible, A ne transforme pas complètement en B; il y a
une concentration équilibre d’A, Aeq et Beq avec Keq = [B]eq /[A]eq = kf / kr.
A
kf
B
Si à t = 0, [A]t = [A]0 et [B]t = 0  [A]t+[B]t=[A]0,
kr
L’équation de vitesse est
d [A]
= - k f [A] + k r [B] = - k f [A] + k r ( [A] 0 - [A])
dt
la solution de cette équation différentielle donne pour la disparition d’A et
l’apparition d’B,
[A] 0 k f
k
( exp [- ( k f + k r ) t] + r )
kf
k f + kr
[ A]0 k f
(1  exp [- ( k f + k r ) t] )
[B] t =
k f  kr
[A] t =
Donc, lorsque t =   [ B]eq 
[ A]0 k f
k f  kr
Représentation paramétrique, [B]t = amplitude * (1 - e-t/)
où 1/τ = kf + kr , et amplitude = [A0] kf / (kf + kr)
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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L’évolution de [B] dans le temps est divisée en deux facteurs :
1)
Le terme exponentiel avec une constante de vitesse ou relaxation, 1/τ,
2)
Le facteur d’amplitude, kf / (kf + kr)
 la vitesse avec laquelle le système atteint son équilibre est plus vite que prédit
par les constantes de vitesse individuelle, kf et kr, et dépend en effet de la
somme de ces constantes de vitesse
o Une réaction réversible approche l’équilibre plus vite qu’une réaction
irréversible parce que [A] ne doit pas diminuer autant
 [A] = [A]eq vs [A] = 0
 à noter : il n’est pas possible de déterminer kf et kr individuellement à partir de
la forme de la courbe exponentielle sans connaissance du facteur d’amplitude
Association enzyme et substrat
Dans le cas de la réaction
kon
E+S
ES
koff
si [S] >> [E], la réaction est essentiellement de premier ordre puisque [S] ne
change pas.
On peut donc écrire
vu que
d [ ES ]
 k on [ S ][ E ]  k off [ ES ] et la quantité kon [S] est constante.
dt
 Si on identifie kf avec kon[S] et kr avec koff précédemment, on obtient une
constante de relaxation
1/τ = koff + kon [S]
Deux points importants à noter :
1) Une dépendance sur la concentration qui permet la résolution de k on de koff
sans facteur d’amplitude parce que les constantes de vitesse sont quasi
unimoléculaires
2) La limite inférieure à 1/τ est koff. La détermination de cette valeur dépend de
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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l’instrumentation utilisée. Des valeurs de l’ordre de 1000 s-1 ou moins sont
mesurables; cependant, les constantes de dissociation de beaucoup
d’enzymes sont plus vites.
Exemple : Analyse de liaison E + S ⇌ ES. Figure montre l’évolution du
complexe binaire ES pour [ET] constante et [ST] variable. Évolution de [ES] en
fonction de t décrit par la relation [ES]=C (1-exp{-t/τ}) ou 1/τ ≡ kobs = koff + kon [S]
et C=[ET] x fraction de sites liées en état stationnaire {=kon [S] / (kon[S] + koff) }. La
graphique montre uniquement la courbe de croissance exponentielle pour des
raisons de clarté soit [ES]= (1-exp{-t/τ}).
[Conc] en
densité
optique
normalisée
kobs
125 s
[S]
-1
20 µM
-1
10 µM
-1
5 µM
-1
2 µM
-1
1 µM
75 s
50 s
35 s
30 s
0
20
60
40
Millisecondes
Figure : Analyse de la
liaison de la tyrosine
au tyrosyl-tRNA
synthétase de Bacillus
stearothermophilus
BCM 2505
Figure : La relation
entre la constante
exponentielle 1/τ et
[S]
80
Courbes créées
avec les
constantes de
vitesse
koff = 25 s-1
kon = 5 x 106 M-1 s-1
100
Pente = kon
Cinétique pré-stationnaire
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Mesures en cinétiques rapides
i) constantes de vitesse
Exemple de la lactate déshydrogénase :
L-lactate + NAD+ ⇌ pyruvate + NADH + H+
La liaison de NADH à l'enzyme est couplée à une
augmentation de la fluorescence d’NADH (figure montrant la
liaison de NADH avec malate déshydrogénase)
k1
E + NADH ⇌ E∙NADH
k-1
 Pour le cas de l’isozyme-5 de la lactate déshydrogénase, avec l’analyse des
données en fonction d'un modèle d’association réversible, on obtient à partir
d’une analyse du facteur exponentiel, 1/τ = k-1 + k1[S],
 k1 = 6.3 X 107 M-1 s-1 et k-1 ~ 450 s-1
o cependant k-1 diffère de kcat (80 s-1) déterminé pour la réaction
correspondante à la formation de NADH à partir de NAD+ et lactate; donc
l’étape de dissociation de NADH ne correspond pas à la vitesse catalytique
 Des travaux supplémentaires en flot arrêté avec des mutants de l’isozyme ont
démontré que l'étape lente de la réaction globale donc kcat correspond au
mouvement d’une boucle dans une région flexible de l'enzyme
Hydrophilique
Hydrophobique
o
Ce mouvement a comme résultat
de fermer le site actif lors de la liaison
NADH
o
Ceci a été démontré par
l’introduction d’un Trp (W) dans la
boucle par la mutagenèse dirigée. La
fluorescence de Trp est très intense et
différente que celle de NADH et dépend
de son environnement permettant ainsi
le
suivi
du
changement
en
environnement du Trp entre la position
de la boucle ouverte (hydrophilique) et
fermée (hydrophobique) – voir figure.
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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ii) Identification des espèces intermédiaires
La détection des espèces intermédiaires dépend de leur concentration sur
l'enzyme.
 Des concentrations de 10nM en intermédiaires enzymatiques peuvent être
facilement détectées par des méthodes spectroscopiques (fluorescence)
 Du point de vue temps, le balayage rapide d'un spectre de l'ordre de 200nm
permet l’identification des espèces ayant une demi-vie aussi courte que
1milliseconde
Autres variations sur la même approche :
1) Flot continu pour des réactions ayant des chromophores
2) « quench » rapides - l'addition de l'acide et suivi de la modification de
l’intermédiaire découlant de la réaction enzymatique due à
l’acidification
« Analyse ultérieure de l'échantillon »
3) « flash » photolyse permet d'initier la réaction à des temps précis et
très rapides
 Par exemple, quand le substrat sous forme de précurseur s'est lié à
l'enzyme, l'échantillon est exposé à un « flash » de lumière pour
photo-activer et cliver le lien entre le substrat et son précurseur
afin d'initier la réaction
Exemple : l’étude des réactions utilisant l’ATP en « cage »
iii) Exemples
Méthode « T – jump »
Un pulse de laser infrarouge peut augmenter la température d’une solution
de 5 à 10 C en 1μs.
 La vitesse de relaxation a été suivie par une méthode spectroscopique.
 La constante d'association du NADH à la malate déshydrogénase a été mesurée
et une valeur de 5 x 108 M-1 s-1 a été obtenue ce qui est très proche de la
constante de diffusion ~ 109 M-1 s-1  la constante de vitesse d'association
maximale.
o Donc, chaque collision entre enzyme et substrat donne lieu à un complexe
productif.
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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Exemple qui combine deux techniques - la phosphatase alcaline d’E.coli
L’enzyme catalyse l'hydrolyse de toutes sortes d'esters de phosphate R-O-P en
passant par la formation et la décomposition d'un phospho-enzyme intermédiaire
E-P dans le schéma réactionnel ci-bas
k1
E + R O P
k2
E R O P
k3
E* R O P
E
P
+ ROH
k4
Pi + E
Puisque la vitesse de la réaction catalysée est largement indépendante du
type de groupe substituant R, il a été postulé que l'hydrolyse du phosphate de
l'intermédiaire, k4, représente l'étape limitante de l'hydrolyse des phosphoestères
différents
 Par flot arrêté, l’étape k4 a été démontrée plus rapide que la vitesse de la
réaction, kcat
 L’étape lente de la réaction a été trouvée à partir des expériences « T-jump »
avec un analogue du substrat qui n’est pas hydrolysable
Lien non-hydrolysable
O
H
N
O
C
PO32-
H
 L’analogue permet uniquement l'étude des deux premières
réactions
 Les résultats ont démontré qu'il y a un changement structural de
l'enzyme après la liaison de l'inhibiteur et c’est ce qui correspond à
l'étape lente de la réaction globale
Dans le schéma, c’est k2 qui représente l'étape lente et k2 ~ kcat
Les réactions chimiques sont généralement plus vites que les
changements conformationnels de l’enzyme en question.
BCM 2505
Cinétique pré-stationnaire
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Simplification des calculs de constantes de vitesse
Il est possible de réduire les constantes de vitesse pour une série de réactions
en une seule constante afin de simplifier les mécanismes réactionnels et isoler la
cinétique de l’étape en observation;
o mettons la séquence des réactions suivantes ;
k1
A
k2
B
k3
k4
C
D
k5
E
F
k-1
k-2
k-3
k-4
Il est possible de remplacer cette séquence par une réaction plus simplifiée
en considérant la réaction suivante
X
k1
k-1
Y
k2
Z
Dans ce cas, la vitesse d’X à être transformé en Z en passant par
l’intermédiaire Y correspond à la vitesse de convertir X en Y, soit k1[X], fois la
probabilité d’Y à être transformé en Z au lieu de retourner en X et qui est égal à k2
/ (k-1 + k2).
Mathématiquement ceci revient à dire,
d [Y ]
d[Z ]
 k1 [ X ]  k 1 [Y ]  k 2 [Y ]  0
 k 2 [Y ] et dû à l’état stationnaire
dt
dt
Donc, [Y ] 
d [ Z ] k2 k1[ X ]
k2
k1

 k1[ X ]
[ X ] , ce qui implique
ci-haut
dt
k1  k2
k1  k2
k 1  k 2
 Si on veut remplacer la réaction réversible X ⇌ Y ci haut par une réaction
irréversible X  Y, la constante de vitesse nette, k’1 correspondante, est obtenue
en rappelant pour la réaction irréversible X  Y,
l’équation s’écrit par 
d[ X ]
 k 1' [ X ] .
dt
d[X ]
d [Z ]
d[X ]
d [Z ]
 k1' [ X ]  

, on obtient
, et qui en substituent pour
dt
dt
dt
dt
d [Z ]
d[ X ]
kk
 1 2 [ X ] . Donc la constante de vitesse nette, k’1, soit :
donne 
dt
k1  k2
dt
Puisque
k1' 
BCM 2505
k1k2
k1  k2
Cinétique pré-stationnaire
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Par le même développement, les constantes de vitesse nettes s’expriment
pour D  E par k’4 = k4k5/(k-4+k5)
pour C  D par k’3 = k3k’4 / (k-3+k’4).
Ceci peut être répété jusqu’à la réaction A  B, k’1 = k1k’2 / (k-1+k’2). Donc on a
k'1
A
k'2
B
k'3
k'4
C
D
k5
F
E
Utilisation des temps de transit au lieu des constantes de vitesse
La valeur de Vmax ou kcat correspondant à une série de réactions séquentielles
peut être déterminé en considérant le temps de réaction de chaque étape
Les dimensions de vitesse, v, sont moles par seconde et les dimensions de
1/v sont secondes par mole ou autrement dit le temps pour transformer une mole de
substrats en produits
 De façon similaire, 1 / kcat = [ET] / Vmax, possède les dimensions de temps,
secondes, et représente le temps pour une molécule pour traverser toute une
voie métabolique en état stationnaire et à des concentrations saturantes
o La constante réciproque représente par conséquent le temps de transit
Considérons la série des réactions suivantes,
k1
EP1
k2
EP2
k3
EP3
k4
EP4
kn-1
EPn
Le temps total pour un métabolite pour traverser de P1 jusque Pn est donc 1/k
qui est la somme des temps de transit pour chaque étape
1 1
1
1
1
1
 



k k1 k 2 k 3 k 4
k n 1
où 1 / k = 1 / kcat = [ET] / Vmax pour des conditions saturantes tandis que quand les
conditions ne sont pas saturantes, le temps de transit devient = [ET] / v.
Cette approche permet d’écrire de façon très nette les équations cinétiques.
Par exemple, mettons la réaction
k1
E+S
BCM 2505
k-1
k2
ES
E+P
Cinétique pré-stationnaire
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Si [S] >> [E] et [S] reste assez constante (vitesse initiale), cette réaction se
résume par le schéma réactionnel suivant
k1[S]
E
k-1
k2
ES
E+P
 La réaction E + S  ES est devenue de 1er ordre vu que la concentration de S
n’est pas influencée par la réaction.
Si on représente la même réaction en deux étapes irréversibles, par
k'1
E
k2
ES
E+P
'
 La constante de vitesse de la réaction nette, E  ES, est k1 
k1[ S ] k 2
k 1  k 2
1 1 1 [ ET ]
  
 Le temps total de transit est donc,
k k1' k 2
v et qui est :
[ ET ] k -1 + k 2 1
=
+
v
[
S
]
k 1 k 2 k2

1 Km 1
1


v Vmax [ S ] Vmax
o Équation de Lineweaver-Burk
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