Le RNA silencing: mécanisme d`inactivation de l

Le RNA silencing: mécanisme d’inactivation de
l’expression des gènes
Patrice Crété
Laboratoire de Génétique et de Biophysique des plantes
UMR6191,Faculté des Sciences de Luminy
INTRODUCTION
Chez les plantes, transgenèse utilisée en routine pour exprimer des gènes
d’intérêt dans la plante sauvage
Structure d’un ADN de transfert
BG
BD
gène de sélection
gène d’intérêt
Dans certains cas, pas d’expression du gène d’intérêt, phénomène
d’inactivation appelé “gene silencing”
Séquence nucléotidique parfaitement conforme mais pas d’expression,
Inactivation retrouvée dans la génération suivante : Inactivation épigénétique
Deux types d ’inactivation en fonction de leurs caractéristiques
Inactivation transcriptionnelle
Inactivation post-transcriptionnelle
Mise en évidence de l’inactivation épigénétique posttranscriptionnelle ou “post-transcriptional gene silencing” (PTGS)
Le « gene silencing » ou co-suppression de la chalcone synthase
mis en évidence chez les végétaux supérieurs en 1990 suite à l’introduction de
transgènes sens pour surexprimer certains gènes.
Pétunia Transgéniques 35S.chsA
Fleur de Pétunia sauvage
+
Transgène sens
p35S
chsA
Co-suppression
Van der Krol et al., 1990, Plant Cell. Pays-bas
Napoli et al., 1990, Plant Cell. Etats-Unis
Deux grandes questions
Quel est le mécanisme moléculaire de la co-suppression?
« The mechanism of suppression by sense genes may involve interference of
RNA strands with the transcription process itself. The transcription process
may be blocked by interaction of RNA with duplex DNA, resulting in a triple
helix structure. »
Est-ce que le mécanisme de la co-suppression correspond à un mécanisme
naturel de régulation de l’expression des gènes
« Finally, the question should be addressed whether the occurrence of the sense
effect is limited to transgenic systems or might be a naturally occurring
phenomenon. »
Inactivation épigénétique post-transcriptionnelle et résistance au virus
Lindbo et al., 1993, Plant Cell
Transgenèse utilisée pour conférer une résistance au virus par expression de
protéines virales
Exemple: expression d'un transgène exprimant la protéine d'enveloppe
En général, résistance liée à la forte expression du transgène
MAIS dans certains cas :
- les plantes les plus résistantes ont des niveaux très
faibles d’accumulation de l’ARN du transgène
- Résistance avec transgène produisant de l’ARN mais
pas de protéine (présence d’un codon stop)
Conclusions
résistance pas explicable par un modèle impliquant la production
de la protéine mais basée sur un modèle impliquant l'ARN
Dans les plantes résistantes avec très faible accumulation de
l’ARN du transgène et du virus, le niveau de transcription du
transgène reste très fort,
Donc mécanisme post-transcriptionnel, basé sur la dégradation
séquence-spécifique des ARNs ciblés
Andrew Fire et Craig C. Mello, 1998
Prix Nobel 2006
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC.
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans.
Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.
Inactivation de l’expression d’un transgène GFP chez C. elegans par injection
d’ARN double brin GFP : ARN interférence
CONCLUSIONS
Pas un simple mécanisme d’hybridation d’une molécule d’ARN antisens avec
une molécule d’ARN sens,
aspect catalytique, peu de molécules antisens nécessaires,
Transport de l’ARN car propagation de l’inactivation à partir du point
d’injection de l’ARNdb jusqu’à la lignée germinale,
un modèle de choix pour l’étude du « gene silencing »
La voie d’assimilation du nitrate chez les végétaux:
Nitrate
NO3
stockage
Vacuole
Étape limitante
NR : nitrate réductase
Dorlhac de Borne et al., 1994,
Équipe H. Vaucheret
INRA de Versailles
Nitrite
NO2
NiR : Nitrite réductase
Ammonium
NH4
Tabac transgénique 35S-NR
Acides aminés
La co-suppression du gène de la nitrate réductase chez le tabac
transgène
p35S
NR
Dorlhac de Borne et al., 1994, Palauqui et al., 1996. Équipe H. Vaucheret
Transmission de la co-suppression de la nitrate réductase par greffe
35S.NR
Non co-sup
35S.NR co-sup
35S.NR Non Co-sup
35S.NR Co-sup
Transmission
de la co-suppression
conclusions
Existence d’un signal mobile systémique déclenchant la co-suppression
Similaire au mécanisme de résistance au virus via de l ’ARN observé par
Lindbo et al. et d’inactivation de gène par ARNdb de Fire et Mello ?
Le signal déclenchant entraîne une dégradation séquence-spécifique des ARNs
du transgène et du gène endogène,
Nature du signal déclenchant? ARN ?
Découverte de petits ARN complémentaires des cibles de l’inactivation
épigénétique post-transcriptionnelle
A. J. Hamilton and D. C. Baulcombe, 1999, Science.
Non
co-sup co-sup
Tomate
35S-ACO
Non
co-sup co-sup
Découverte de petits ARN complémentaires des cibles de l’inactivation
épigénétique post-transcriptionnelle
N. benthamiana
expression
35S-GFP
inactivation
A. J. Hamilton and D. C. Baulcombe, 1999, Science
Petits ARN complémentaires, associés à l’inactivation post-transcriptionnelle appelés
small interfering RNA (siRNA)
Mécanisme de l’ARN interférence
ARN double brin GFP
(Fire et Mello)
gène endogène
DICER
siRNA 21nt
(Hamilton et Baulcombe)
RISC
RISC
RISC
AAA
ARNm
RISC
RISC: RNA Interference Silencing Complex
RISC
AAA
RISC
AAA
RISC
AAA
Mécanisme de l’ARN interférence
RISC
AAA
Clivage
RISC
AAA
processus catalytique
Dégradation
RISC
RISC
AAA
AAA
ARN interférence/RNA silencing
Clivage et dégradation
Comment obtenir de l’ARN antisens à partir d’un transgène sens ?
Transgène sens
GFP
RISC
AAA
AAA
ARNm
?
Dégradation
AAA
RNA silencing
siRNA
Obtention de mutants affectés dans le RNA silencing à partir de transgène
sens chez Arabidopsis thaliana
Découverte de l’implication d’un gène codant une ARN polymérase ARN
dépendante (RDR)
RNA silencing post-transcriptionnel d’un transgène sens
Transgène sens
GFP
ARNsb aberrant
AAA
ARNm
RDR
ARN
RDR
Double brin
RISC
RISC
AAA
Dégradation
AAA
RNA silencing
siRNA
Co-suppression
Transgène sens
Gène endogène
CHS
CHS
ARNsb aberrant
RDR
RDR
RISC
siRNA
RISC
Co-suppression
Transgène sens
Gène endogène
CHS
CHS
AAA
AAA
ARNm
RISC
ARNm
RISC
AAA
Dégradation
AAA
Dégradation
AAA
RNA silencing/co-suppression
AAA
Conservation du mécanisme d’ARN interférence à travers les règnes
Végétaux
Champignons
A. thaliana, N. Benthamiana,
N. tabacum Petunia,
Chlamydomonas, …
N. crassa, Aspergillus, S. pombe
Invertébrés
Trypanosome, C. elegans,
Drosophile, …
Vertébrés
Poisson, Souris,
cellules humaines,…
Clonage à partir de plantes sauvages de siRNAs et de miRNAs
d’origine endogène
L’ARN interférence: mécanisme naturel de régulation des gènes ?
L’ARN interférence: mécanisme naturel de régulation des gènes ?
Oui, chez les plantes, régulation de gènes impliqués dans le développement
(architecture foliaire) et adaptation des plantes à l’environnement
Gène non codant
Gène codant
ARNsb
AAA
AAA
ARNm
RDR
RISC
RDR
RISC
AAA
Dégradation
siRNA
AAA
Plante sauvage
Mutant dans RDR
Conditions optimales de croissance
L’ARN interférence,
Mécanisme de lutte contre
les virus chez les plantes
ARN viral
RDR
siRNAs antiviraux
Sauvage
Mutant RDR
Sauvage
Infectés par virus
Présence de gènes homologues aux RDRs de plantes chez les champignons
Saccharomyces pombe
Aspergilus
Neurospora
Présence de gènes homologues aux RDRs de plantes chez les animaux
Caenorhabditis elegans
Chez les autres animaux pas d’homologues Æ activité RDR ?
ARN interférence via les microARNs
RISC
30nt
AAA
miRNA
Précurseurs de microARN
Clivage des ARNs
PLANTES
animaux
Rôles des microARNs
Développement chez les plantes et les animaux
Adaptation des plantes à l’environnement
Lutte contre les virus chez les animaux
Lutte contre les bactéries chez les plantes
L’ARN interférence comme outil d’inactivation de l’expression des gènes
Microinjection ARNdb
effet transitoire
ARN double brin
Transgène
Transgène ORFs Inversées Répétées (IR-PTGS)
P
ORF A
ORF A
DICER
siRNA 21nt
RISC
Effecteur de l’ARN interférence
Transmission
à descendance
Transgène
Transgène ORFs Inversées Répétées (IR-PTGS)
P
ORF A
ORF A
Plusieurs centaines de nt
RNA interférence
Plusieurs siRNAs de 21nt
L’ARN interférence comme outil d’inactivation de l’expression des gènes
ARN double brin
DICER
Microinjection siRNA
effet transitoire
siRNA 21nt
Transgène produisant un siRNA
(Surtout chez mammifères)
RISC
Effecteur de l’ARN interférence
Transmission
à descendance
Long ARNdb problème chez les mammifères
Réponse interféron
Mort cellulaire
Solution: transgène
P
Seq A
« short hairpin RNA »
Seq A
shRNA
21nt
DICER
siRNA
ARN interférence
Applications de l’ARN interférence
Découverte de la fonction des gènes
Lutte antivirale
Maladies neurodégénératives
Cancers
L’ARN interférent ou comment éteindre un gène
avec de l’ARN double brin
Inactivation épigénétique transcriptionnelle et siRNAs
pNOS
pNOS
p35S
ARNdb de séquence promotrice
DICER
siRNAs complémentaires du promoteur pNOS, siRNA (24 nt)
RITS : RNA-induced transcriptional silencing
RITS
Méthylation
de l ’ADN
pNOS
pNOS
Association avec des
facteurs de remodelage
de la chromatine
Blocage de la
transcription
Inactivation épigénétique transcriptionnelle (TGS)
MERCI DE VOTRE ATTENTION
Cell. 1995 May 19;81(4)
par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos,
encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.
Guo S, Kemphues KJ.