Etude de la protéine SAH3 (S-adenosyl-L

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Etude de la protéine SAH3 (S-adenosyl-L
GRACIA Magalie
HOARAU Gaëlle
ETUDE DE LA PROTEINE SAH 3
(S-ADENOSYL-L-HOMOCYSTEINE HYDROLASE 3)
Année 2006-2007
Projet tutoré par Laurence Nieto
-1-
SOMMAIRE
Résumé ....................................................................................................................................... 3
INTRODUCTION...................................................................................................................... 4
I.
Identification des gènes impliqués dans la voie de p53…………………..9
1.Caractéristiques des cellules utilisées ......................................................................... 9
2.Technique du code barre moléculaire ....................................................................... 10
3.Validation de l’intervention des gènes dans la voie de p53 ...................................... 12
4.Intervention de ces nouveaux gènes dans la régulation de p21................................. 13
II.
Projet de recherche : étude du gène KIAA0828 et sa protéine SAH3…..15
1.Généralité .................................................................................................................. 15
2.Etude de la voie de KIAA0828 ................................................................................. 16
3.Etudes des interactions protéine-protéine ................................................................. 17
a. Isoler le complexe……………………………………………………………..17
b. Séparation des protéines et identification des protéines du complexe………..18
c. Validation de l’interaction SAH 3 avec un partenaire Y in vitro……………..18
d. Validation de l’interaction in vivo…………………………………………….19
Conclusion................................................................................................................................ 21
Bibliographie............................................................................................................................ 22
-2-
RESUME
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un
tissu normal de l'organisme. Après une série de mutations, ces cellules ont acquis des
caractéristiques leur permettant de se diviser indéfiniment. Le cancer peut être induit par
différents gènes, les oncogènes activés par une mutation ou les gènes suppresseurs de tumeurs
désactivés par une mutation. Dans ces derniers on retrouve la protéine p53. Cette protéine
notamment appelée gardien du génome, intervient dans deux voie principales, l’arrêt du cycle
cellulaire en phase G1 et la mort cellulaire programmée par apoptose, permettant ainsi de
maintenir l’intégrité du génome.
La protéine p53 est retrouvée mutée dans plus de 50% des cancers humains c’est pourquoi
certaines stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses ciblent la protéine p53. Or la voie de p53
est complexe et fait intervenir de nombreux acteurs. Il serait alors intéressant de les identifier
et de les caractériser afin d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à lutter
contre le cancer.
Les auteurs de l’article intitulé « A large-scale RNAi screen in human cells identifies new
components of p53 pathway » ont réalisé une première approche en mettant en évidence par
criblage à l’aide d’une banque d’ARNsh et utilisation de la technique du code barre
moléculaire, cinq nouveaux gènes intervenant dans la voix de p53.
La plupart de ces gènes ayant déjà fait l’objet d’études plus ou moins approfondies, nous
avons orienté notre projet de recherche sur le gène le moins étudié, le gène KIAA0828 qui
code pour la protéine SAH 3. En effet, le gène KIAA0828 a été retrouvé dix fois moins
exprimé dans les carcinomes du colon que dans le tissu du colon. Cependant son rôle dans la
voie de p53 et au niveau d’autres cancers reste inconnu.
-3-
INTRODUCTION
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un
tissu normal de l'organisme. Après une série de mutations, ces cellules ont acquis des
caractéristiques leur permettant de se diviser indéfiniment. Le cancer peut être induit par
différents gènes :
-
les oncogènes activés par une mutation. (Ex : erb B qui code pour le récepteur à
l’Epidermal Growth Factor EGF)
-
les gènes suppresseurs de tumeurs désactivés par une mutation tel que p53.
La protéine p53 est une phosphoprotéine nucléaire de 53kDa, constituée de 393 acides aminés
(aa). Ce gène est localisé sur le bras court du chromosome 17. Cette protéine est constituée de
différents domaines dont un domaine de transactivation en N-terminal (aa : 1 à 42) qui régule
la stabilité et est nécessaire à l’interaction avec les composants de l’appareil transcriptionnel,
un domaine intervenant dans l’apoptose (aa : 63 à 97), un domaine central qui permet la
fixation à l’ADN (aa : 102 à 292), un domaine de tétramerisation (aa : 323 à 356) et un
domaine en C-terminal (aa : 363 à 393) qui permet la détection de l’ADN lésé et la régulation
négative (schéma 1 Walid Dridi et al., 2006).
schèma1. Les différents domaines de la protéine p53 et leurs rôles. aa 1 à 42: Domaine de
transactivation en N-terminal qui régule la stabilité et permet la fixation des facteurs de
transcription ; aa 63 à 97 : domaine intervenant dans l’apoptose ; aa 102 à 292 : domaine central
qui permet la fixation à l’ADN ; aa 323 à 356 : domaine de tétramerisation ; aa 363 à 393 : domaine
en C-terminal qui permet la détection de l’ADN lésé et la régulation négative.
-4-
La protéine p53 est un facteur de transcription qui a pour cible de nombreux gènes tels que :
-
p21, qui est une protéine de 21kDa et qui inhibe les kinases dépendantes des cyclines
(Cdk).
-
Mdm2 (Mouse double minute 2), qui est une ubiquitine ligase. Celle-ci se fixe sur la
partie N terminale de p53 permettant le recrutement de l’histone déacétylase
(HDAC1). Ce complexe va entraîner l’ubiquitinylation de la partie C terminale de p53
et sa dégradation par la voie du protéasome.
-
BAX, qui entraîne les cellules en apoptose lorsqu’il est activé par p53 (Wei Li et al.,
2006)
La protéine p53 intervient dans deux voies principales : l’arrêt du cycle cellulaire entre la
phase G1 et la phase S et la mort cellulaire par apoptose.
-
L’arrêt du cycle cellulaire est déclenché en réponse à un stress qui endommage
l’ADN. Cet arrêt va ainsi permettre sa réparation avant sa réplication. En effet, lors
d’un stress, la protéine p14 qui appartient à la famille des inhibiteurs des kinases
dépendantes des cyclines (INK4), va être activée par l’expression d’oncogènes
(Pomerantz et al., 1998). Cette protéine p14 va alors se lier à Mdm2, l’empêchant
ainsi d’interagir avec p53. La protéine p53 est ainsi libérée et phosphorylée. Sous cette
forme, la protéine ne peut plus être dégradée. Sa stabilisation entraîne une
accumulation sous sa forme sauvage, ce qui va alors permettre la transcription du gène
p21. La protéine p21 va alors se lier à la kinase cdk2 et empêcher la formation du
complexe Cdk2/cyclineE. A l’origine, ce complexe Cdk2/cyclineE permet l’entrée en
phase S du cycle cellulaire, en phosphorylant la protéine Rb (retinoblastoma) du
complexe E2F/pRb. La protéine Rb phosphorylée libère ainsi le facteur de
transcription E2F, permettant la transcription des gènes impliqués dans la progression
du cycle cellulaire. Cependant p21 empêchant la formation du complexe
Cdk2/cyclineE, les cellules entrent dans l’arrêt du cycle cellulaire (schéma 2 Wei Li et
al., 2006).
- La voie de la mort cellulaire par apoptose intervient lorsque les dommages sur
l’ADN sont trop importants. Dans ce cas p53 activée par les lésions de l’ADN, active à son
tour le gène BAX. Les cellules entrent alors en apoptose.
-5-
C’est deux interventions de la p53 justifient ainsi les noms de suppresseur de tumeur ou
gardien du génome (schéma 2 Wei Li et al., 2006).
Il existe une autre voie permettant l’arrêt du cycle cellulaire. Cette voie ne requiert pas
l’intervention de p53 mais une nouvelle protéine, la p16. Cette protéine, comme p14, a la
capacité de contrôler la transition G1/S. Elle appartient à la famille des INK4. Lorsque p16 est
activée, elle se lie aux Cdk4/6, empêchant ainsi la formation du complexe Cdk4/6/cyclineD1.
Ce complexe est requis pour la phosphorylation de la protéine Rb. La phosphorylation ne
pouvant se faire, la protéine Rb reste liée au facteur E2F entraînant les cellules dans l’arrêt du
cycle cellulaire (schéma 2 Wei Li et al., 2006).
Il existe une protéine qui intervient au niveau des voies de p53 et p16, la protéine p27. C’est
une protéine inhibitrice des kinases dépendantes des cyclines, comme p21. Cette protéine
intervient dans le contrôle de la transition entre la phase G1 et la phase S. La protéine p27 est
fréquemment absente dans les cancers. Ceci suppose que p27 est un gène suppresseur de
tumeur (Merola et al., 2006).
Schéma 2. Représentation schématique de la voie de p53 et sa régulation dans l’arrêt du cycle
cellulaire et dans l’apoptose (voir texte) .
-6-
La protéine p53 n’est active que sous forme de tétramère sauvage c'est-à-dire formée
de quatre monomères sauvages. En effet, les monomères p53 mutés peuvent se lier à des
monomères sauvages pour former un tétramère, mais la présence d’un monomère muté
entraîne l’inactivation du tétramère p53. Ce phénomène de liaison et d’inactivation des p53
mutées à l’égard des p53 sauvages est qualifié « effet dominant négatif » (schèma3 Walid
Dridi et al., 2006).
La protéine p53, sous forme sauvage, est faiblement exprimée dans les cellules normales car
elle est dégradée par la voix des protéasomes. En revanche, cette protéine est présente en
grande quantité sous forme mutée dans les cellules tumorales, car elle n’est plus prise en
charge par le mécanisme entraînant sa dégradation.
Schéma 3. modèle 3D de 4 sous unités de p53 liant
l’ADN. Les hélices H2 sont impliquées dans la
reconnaissance directe du sillon majeur de l’ADN.
Les lignes en pointillées indiquent que dans la liaison
du tétramère sauvage à l’ADN, les régions Nterminale sont localisées sur le coté externe de la
boucle d’ADN, alors que les région C-terminale sont
sur le coté interne ( les domaines de tetramerisation
et basique ne sont pas montrés. Les petites flèches
dénotent des interactions entre les fragments N riches
en proline et les domaines du noyau p53) Akhilesch
et al., 1999.
La protéine p53 est retrouvée mutée dans plus de 50% des cancers humains. 90% des
mutations se trouvent dans le domaine central de la protéine, c'est-à-dire dans le domaine de
fixation de l’ADN. Ces mutations sont essentiellement au niveau de trois codons clés, les
codons 175, 248 et 273.
Il existe différents types de mutations :
- des délétions d’un ou de deux allèles, inhibant l’expression de p53.
- des mutations non-sens et des mutations au sein du site d’épissage, produisant des
protéines tronquées incapables de s’oligomériser
-7-
- ou encore des mutations faux-sens des acides aminés du domaine central. Ces acides
aminés substitués peuvent se répartir en deux groupes : le premier comprenant les acides
aminés impliqués dans le maintien de la structure tridimensionnelle du domaine de liaison à
l’ADN, le second comprenant les acides aminés qui sont directement en contact avec l’ADN.
Ces deux groupes de mutations entraînent une incapacité partielle, voire totale, à se lier à
l’ADN (Walid Dridi et al., 2006).
C’est pourquoi aujourd’hui, les principales approches expérimentales ciblent le gène p53.
En effet les traitements anticancéreux ciblant p53sont basés sur trois stratégies :
- La première repose sur la restauration de la fonction de p53, en remplaçant le gène
muté par une copie fonctionnelle du type sauvage dans les cellules tumorales. Ainsi en
restaurant la fonction de p53, les auteurs espèrent bloquer le développement de tumeur.
L’approche serait d’utiliser la thérapie génique à l’aide d’un rétrovirus ou d’un adénovirus.
Cependant l’utilisation d’adénovirus pose certains problèmes car la présence d’anticorps
neutralisant ces virus entrave l’efficacité d’infection et donc la délivrance du gène à la cellule.
- La deuxième stratégie est d’utiliser des adénovirus modifiés.
- La troisième est d’augmenter la concentration de la protéine sauvage en inhibant son
interaction avec Mdm2. Par exemple, la protéine SuperTIP (Thioredoxin Insert Protein) entre
en compétition avec Mdm2 pour se lier à p53. SuperTIP active la transcription dépendante de
p53, amenant à une accumulation nucléaire de p53 et donc à l’arrêt du cycle cellulaire
(Bouchet et al., 2005).
Cependant ces stratégies ne ciblent que la protéine p53. Or la voie de p53 est complexe et fait
intervenir de nombreux acteur. De plus, les thérapies visant p53 n’étant pas encore
concluantes, il serait alors intéressant d’ identifier ces acteurs et de les caractériser afin
d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à lutter contre le cancer.
-8-
Une approche a été initiée dans l’article intitulé « A large-scale RNAi screen in human cells
identifies new components of p53 pathway » ou par la technique de criblage des ARNsh, les
auteurs ont essayé d’identifier de nouveaux composants de la voie de p53.
I.
Identification des gènes impliqués dans la voie de p53
1. Caractéristiques des cellules utilisées
Les auteurs ont généré des fibroblastes humains (BJ) exprimant :
-
la sous unité catalytique de la télomèrase (TERT). Le gène TERT est exprimé dans les
cellules pour maintenir la longueur des télomères constante, sachant que les télomères
se raccourcissent progressivement à chaque division dans beaucoup de types
cellulaires.
-
et l’allèle de l’antigène grand T du Virus Simian 40 sensible à la température (tsLT).
Ces cellules BJ-TERT-tsLT sont capables de pousser à 32°C. En effet, à cette température le
tsLT se lie aux protéines p53 et pRb et les inhibe, permettrant aux cellules de se multiplier.
Par contre à 39°C, le tsLt devient inactif permettant aux protéines p53 et pRb d’être actives et
d’entraîner un arrêt de croissance cellulaire.
Les auteurs ont ensuite infecté les cellules BJ-TERT-tsLT avec des d’ARNsh afin d’éteindre
des gènes cibles. Dans une première expérience, les auteurs ont ciblé p53, dans une seconde
ils ont ciblé p16, et dans une dernière expérience, ils ont ciblé les deux protéines p16 et p53.
L’observation de ces cellules placées à 39°C, montre que le knockdown (kd) de p53 entraîne
une croissance cellulaire contrairement au kd de p16 qui entraîne un arrêt de la prolifération
cellulaire. Le kd des deux gènes permet une croissance plus forte, comparé au kd de p53 seul.
Ceci leur a permis de déduire que le kd de p16 augmentait le phénomène de croissance
cellulaire, mais que l’arrêt de prolifération dépendait essentiellement de p53 (Figure 4).
-9-
Figure 4. L’arrêt de croissance dépend essentiellement de p53. Infection des cellules BJ-TERT-tsLT
à 32°C par des ARNsh ciblant p16, p53 et p53/p16. Ces cellules sont transférées à 39°C et colorées
après 3 semaines.
2. Technique du code barre moléculaire
Afin d’identifier de nouveaux gènes intervenant dans la voie de p53, les auteurs ont utilisé la
technique du code barre moléculaire (figure 5).
C’est une technique qui permet l’expression d’un ARNsh dans les cellules, permettant de
créer un phénotype knock-down spécifique d’un gène et cet ARNsh intégré au génome
correspond à ce que l’on appelle la molécule code barre.
Les cellules BJ-TERT-tsLT sont infectées par une librairie de vecteurs d’ARNsh. Ce pool de
cellules est ensuite divisé en deux groupes :
-
le premier groupe est constitué de cellules placées à 39°C. Il représente le groupe
traité.
-
Le second groupe n’est pas traité, c’est le groupe témoin. Les cellules sont placées à
32°C.
Les auteurs réalisent ensuite une PCR sur l’ADN génomique des cellules afin d’amplifier tous
les ARNsh, puis la population traitée est colorée à la cyanine 5 et la population non traitée est
colorée à la cyanine 3.
Les deux populations sont ensuite mélangées puis hybridées sur une puce à ADNc où chaque
spot contient une séquence complémentaire à un ARNsh.
L’hybridation simultanée des fragments code barre marqués à la cyanine 5 (coloration rouge)
et à la cyanine 3 (coloration verte), permet l’identification de changements dans l’abondance
des vecteurs d’ARNsh en réponse au traitement de température.
L’interprétation de la puce se fait alors en fonction des différents spots de couleurs obtenus.
En effet, un spot vert signifie qu’il y a plus d’ARNsh dans la population témoin (32°C) que
- 10 -
dans la population traitée (39°C). Cela signifie donc qu’il y a un arrêt du cycle cellulaire à
39°C et qu’il n’y a pas d’ARNsh dirigé contre un gène de la voie de p53.
Un spot jaune signifie qu’il y a autant d’ARNsh dans la population traite que dans la
population non traitée. Alors, l’ARNsh intégré ne touche pas de gènes impliqués dans la voie
de p53.
un spot rouge signifie qu’il y une quantité d’ARNsh supérieure dans la population traitée que
dans la population témoin. Il y a donc une prolifération cellulaire à 39°C et les ARNsh
présents sont dirigé contre un gène impliqué dans la voie de p53.
32°C
Schéma 5. Technique du code barre moléculaire. (A)
Pool de cellules infectées par la librairie d’ARNsh
(ARNsh intégré = code barre). division du pool en 2
groupe : un groupe de cellules traitées à 39°C et en
un groupe de cellules non traitées à 32°C (témoin).
PCR sur l’ensemble des cellules et coloration cy3
(vert) ou cy5 (rouge) des 2 populations cellulaires.
Mélange des 2 populations et hybridation sur puce à
ADN
microarray
contenant une
séquence
complémentaire à un ARNsh. (B) puce àADN
microarray. spot vert = plus d’ARNsh dans la
population témoin (32°C) que dans la population
traitée (39°C) donc arrêt du cycle cellulaire à 39°C,
pas d’ARNsh dirigé contre un gène de la voie de p53.
spot jaune = autant d’ARNsh dans la population
traité que dans la population témoin. Les ARNsh
intégrés ne touchent pas de gènes impliqués dans la
voie de p53. spot rouge = plus d’ARNsh dans la
population traitée que dans la population témoin
donc prolifération cellulaire à 39°C, présence
d’ARNsh dirigés contre un gène impliqué dans la
voie de p53.
39°C
Ainsi cette méthode a permis d’identifier des ARNsh ciblant cinq nouveaux gènes :
•RPS6KA6 (ribosomal S6 kinase 4, RSK4)
•HTATIP (histone acetyl transferase TIP60)
•HDAC4 (histone deacetylase 4)
•KIAA0828 (a putative S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, SAH3)
•CCT2 (T-complex protein 1, β-subunit) (Berns et al.,2004).
- 11 -
L’infection des cellules BJ-TERT-tsLT par des vecteurs d’ARNsh ciblant l’un de ces gènes
induit une prolifération cellulaire malgré le fait que les cellules soient placées à 39°C (figure
6).
Figue 6. Le knockdown des 5 nouveaux gènes identifiés permet la croissance des cellules BJ-TERTtsLT à 39°C.
3. Validation de l’intervention des gènes dans la voie de p53
Afin de valider l’intervention de ces gènes dans la voie de p53, les auteurs ont co-transfecté
des cellules U2-OS avec (figure7) :
-
des vecteurs d’ARNsh ciblant : soit un des cinq nouveaux gènes, soit le gène HDM2
orthologue de Mdm2 et donc inhibiteur de p53, soit p53
-
et l’histone H2B marquée à la GFP pour sélectionner les cellules transfectées.
Ces cellules sont ensuite soumises à des radiations ionisantes (IR) et analysées par FACS
(fluorescence-activated cell sorting).
1
2
3
4
5
6
Figure 7. Observation de la croissance cellulaire
après radiations ionisantes. Les cellules U2-OS sont
cotransféctées avec des vecteurs d’ARNsh indiqués et
H2B-GFP, puis irradiées. Les cellules positives à la
GFP sont analyées par FACS.
7
8
9
- 12 -
Ces expériences (1 et 2) montrent que l’exposition des cellules aux IR entraîne une
augmentation du nombre de cellules en phase G1 et G2. Ceci s’explique par le fait que la p53
sous l’effet des IR va bloquer les cellules. Ceci est confirmé dans l’expérience où p53 est
knock-down (3) car la protéine p53 est absente et les cellules entrent donc en division et
continue leur progression en phase G2.
Lorsque un des cinq nouveaux gènes sont knock-down (5, 6, 7, 8, et 9), le profil cellulaire est
le même que pour l’expérience où p53 est knock-down (3). En effet, il y a progression des
cellules dans le cycle cellulaire jusqu’en phase G2.
Ceci confirme que ces gènes sont impliquées dans la voie de p53 et que lorsqu’ils sont éteints
les cellules peuvent progresser dans le cycle cellulaire.
Quand HDM2 est knock-down (4), la majorité des cellules sont bloquées en phase G1. En
éteignant HDM2, inhibiteur de p53, on favorise l’accumulation des cellules en phase G1 car
p53 est activée.
Ainsi ces expériences confirment l’intervention de ces cinq nouveaux gènes dans la voie de
p53.
4. Intervention de ces nouveaux gènes dans la régulation de p21
p21 est un gène cible de p53. Afin de tester si ces cinq nouveaux gènes affectent l’expression
de p21, les cellules U2-OS sont infectées stablement avec un rétrovirus exprimant un vecteur
ARNsh ciblant soit un des cinq nouveaux gènes, soit le gène HDM2, soit p53. Les extraits
cellulaires sont immunoblottées avec des anticorps contre p53, p21 et BAX et on observe les
expressions des protéines et des ARNm (figure 8).
Figure 8. Régulation de p21. a. Les cellules
U2-OS sont infectées stablement avec un
rétrovirus exprimant un vecteur ARNsh ciblant
soit un des cinq nouveaux gènes, soit le gène
HDM2, soit p53. Les extraits cellulaires sont
immunoblottées avec des anticorps contre p53,
p21 et BAX. b. Niveau d’ARNm de p21 et de
BAX dans les cellules U2-OS infectées. L’ARN
est marqué au bromure d’ethidium.
- 13 -
On constate que le knock-down d’un de ces cinq nouveaux gènes entraîne une forte réduction
des niveaux d’expression des protéines et de l’ARNm de p21 (a et b), mais n’affecte pas le
niveau d’expression des protéines de p53 (a), ni le niveau d’expression des protéines et de
l’ARNm de BAX (a et b).
Ainsi dans cette expérience, les auteurs ont mis en évidence que ces cinq nouveaux gènes
intervenaient dans la régulation de l’expression de p21.
Parmi ces cinq nouveaux gènes, certains ont déjà fait l’objet d’études approfondies.
HTATIP montre des propriétés similaires au suppresseur de tumeur p53. Son rôle dans la voie
de p53 a été identifié par l’étude de son knock-down dans des cellules U2OS (Legube et
al.,2004).
La protéine RSK4 pourrait être un médiateur indirect de p53 en induisant les effecteurs avals
comme par exemple en phosphorylant une protéine dans le complexe d’activation
transcriptionnelle de p53 sur le promoteur p21 ou en stimulant la stabilité de l’ARNm de p21
dans le cytoplasme. Ceci a été démontré en étudiant l’activité de RSK4 par
immunoprécipitation (Bettina et al., 2005).
La protéine HDAC4 a été étudiée par immunofluorescence par immunoprécipitation de
chromatine (CHIP) et par des expériences de transfection dans des lignées cellulaires HCT116
humaines et NIH. Cette protéine est transloquée du cytoplasme au noyau après un dommage à
l’ADN pour s’associer à des promoteurs. Son recrutement sur les promoteurs se fait par
l’intermédiaire des lysines C terminale de p53 qui sont modifiées par acétylation et
méthylation (Basile et al., 2006)
En revanche, le gène KIAA0828 est un gène très peu étudié, c’est pourquoi nous allons
orienter notre projet de recherche sur l’étude de ce gène et de sa protéine SAH3.
- 14 -
II.
Projet de recherche : étude du gène KIAA0828 et sa protéine SAH3
1. Généralité
Le gène KIAA0828 code pour la protéine SAH 3 (S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase 3).
SAH 3 est une enzyme cytoplasmique qui catalyse la réaction d’hydrolyse du S-adenosyl-Lhomocystéine en L-homocystéine et en adénosine. La S-adenosyl-L-homocystéine est un
inhibiteur de transméthylation. En catalysant l’hydrolyse du S-adenosyl-L-homocystéine,
SAH 3 favorise le phénomène de transméthylation. Les transméthylations sont impliquées
dans de nombreux phénomènes tels que :
-
la méthylation des promoteurs
-
la formation de la coiffe des ARNm
-
la stabilité et l’export des ARNm
-
l’initiation de la traduction,
favorisant ainsi l’expression de certains gènes (D. Kloor et al., 2004).
Cependant il a été démontré par PCR en temps réel que le gène KIAA0828 est dix fois moins
exprimé dans les carcinomes du colon que dans les tissus de colon sain (Figure 9). De plus, sa
séquence est identique dans les tissus normaux et cancéreux permettant aux auteurs d’en
Relative mRNA values
déduire que le gène n’est pas muté dans les carcinomes (Lleonart et al.,2006).
Figure 9. Relative quantification
values of mRNA levels from 20
patients with colon carcinoma.
Cependant, son mécanisme d’action dans les cancers et son implication dans la voie de p53
n’est pas connue. Actuellement, aucune étude n’a été réalisée sur ce sujet.
- 15 -
2. Etude de la voie de KIAA0828
L’objectif de cette étude est d’identifier des gènes impliqués dans la voie de KIAA0828. Le
protocole de l’étude réalisé pour l’identification des cinq nouveaux gènes de la voie de p53
nous servira de référence. Nous utiliserons donc des cellules U2-OS et le plasmide
pRETROSUPERCAM (figure 10) dans le but de réaliser le knock-down (kd) de KIAA0828.
Les
cellules
U2-OS
sont
issues
d’ostéosarcomes
humains
et
le
plasmide
pRETROSUPERCAM est un vecteur retroviral basé sur le virus des cellules souches de souris
(MSCV).
Figure 10. le plasmide RETROSUPERCAM (pRSC)
contient le promoteur H1, puro ( puromycine) :
marqueur de sélection de sélection mammifère, CAM
(chloramphénicol) et AMP (ampicilline) : 2 marqueurs
de sélection bactériens, PGK (Phosphoglycerate
kinase) : promoteur qui dirige l’expression du
marqueur puro.LTR = long terminal repeat. ΔLTR=
LTR délété inactif
Nous
utiliserons
des
ARNsh
dirigés
contre
KIAA0828
et
introduits
dans
le
pRETROSUPERCAM fournis par l’équipe de Berns. Nous réaliserons alors une transfection
stable des cellules U2-OS. L’observation de la prolifération des cellules sur milieu gélosé
permettra de déterminer l’implication de KIAA0828 dans la voie de p53.
Nous réaliserons ensuite des puces à ADNc afin d’identifier les gènes impliqués dans la voie
de KIAA0828. Pour cela, nous utiliserons deux groupes de cellules :
-
des cellules KIAA0828kd qui seront colorées à la cyanine 3
-
des cellules KIAA0828 sauvages qui seront colorées à la cyanine 5
Après mélange des deux populations cellulaires et leurs hybridations sur microarray à ADN
contenant des ADNc, nous pourrons alors observer les gènes touchés par le knock-down de
KIAA0828.
- 16 -
3. Etudes des interactions protéine-protéine
Afin d’identifier un ou plusieurs partenaires de la protéine SAH3, nous procéderons en
plusieurs étapes.
Dans un premier temps nous isolerons le complexe SAH3/partenaire(s) puis dans un second
temps nous identifierons les protéines qui le composent. Une fois l’identification réalisée,
nous validerons l’interaction in vitro puis in vivo.
a. Isoler le complexe
Afin d’isoler le complexe, nous construirons une protéine de fusion constituée de notre
protéine d’intérêt SAH 3 doublement taguée par Flag et myc.
Le gène codant pour SAH 3 sera inséré dans le plasmide pFLAG-Myc-CMV (figure 11)
produit par la société SIGMA-ALDRICH.
Figure 11. Le plasmide pFLAG-Myc-CMV de la société SIGMA-ALRICH.
Ce plasmide sera ensuite transfecté de façon transitoire dans des cellules U2-OS.
Dans un premier temps, on comparera la prolifération des cellules U2-OS transfectées par ce
plasmide, soumises ou non à des irradiations ionisantes, et on les analysera par FACS.
Sachant qu’après transfection on a sur-expression du gène KIAA0828 car il est sous le
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contrôle du promoteur CMV, nous pourrons alors connaître l’effet de la sur-expression de
KIAA0828 sur la prolifération cellulaire.
Dans un second temps, nous isolerons le complexe formé par la protéine SAH 3 et ses
partenaires. En effet, après transfection, il y aura production de la protéine SAH 3 doublement
taguée et celle-ci pourra alors interagir in vivo avec ses partenaires. Le double tag permettra
de récupérer les complexes formés et la purification se fera en deux étapes :
-
une première chromatographie d’affinité avec des billes de sépharose couplées à des
anticorps anti-myc suivi d’une élution par compétition avec le peptide c-myc produit
par la société Genscript
-
Une seconde chromatographie d’affinité avec des billes de sépharose couplées à des
anticorps monoclonaux anti-FLAG M1, suivi d’une élution grâce au clivage par
l’entérokinase.
Cela nous permettra de purifier la protéine SAH 3 complexée à ses partenaires.
b. Séparation des protéines et identification des protéines du complexe
Les protéines obtenues seront séparées sur gel SDS-PAGE et soumises à une digestion
trypsique. Celle-ci consiste à cliver du côté C-terminal au niveau des acides aminés basiques
(lysine et arginine). Nous obtiendrons alors des fragments peptidiques qui pourront être
soumis à une HPLC (high performance liquid chromatography) couplée à une analyse en
MS/MS. Cette analyse permettra de séquencer les peptides. Ces séquences seront alors
comparées à des banques de données (par exemple Expasy) afin d’identifier les protéines du
complexes.
c. Validation de l’interaction SAH 3 avec un partenaire Y in vitro
Pour valider l’interaction entre SAH 3 et un partenaire (qu’on appellera Y) in vitro, nous
procéderons à l’extraction des ARN messagers de Y par RT PCR. L’ADNc obtenu sera cloné
dans le vecteur d’expression pET-15 produit par la société Novagen. Ce vecteur contient une
séquence codant pour un tag histidine, ce qui permettra l’expression de la protéine Y taguée.
La production de cette protéine se fera chez Escherichia coli.
- 18 -
La présence du tag histidine permettra la purification de la protéine Y sur colonne Ni-NTA
(Nickel-nitrilo tiacetic acid, figure 12).
Figure 12. Purification sur colonne Ni-NTA
(Nickel-nitrilo tiacetic acid). En rouge, le
NTA ; En bleu, la protéine avec des histidines.
Les noyaux imidazoles se lient au nickel
complexé au NTA.
Acide nitrilo-triacétique
Protéine taguée
On réalise une histidine pull-down pour vérifier l’interaction entre SAH 3 et Y.
d. Validation de l’interaction in vivo.
•
Colocalisation : immunofluorescence
Premièrement, nous allons vérifier la colocalisation de SAH 3 et de son partenaire Y par
immunofluorescence. Pour cela, nous produirons la protéine Y couplée à la GFP chez E.Coli.
Nous utiliserons un système Gateway enfin de transfecter de façon transitoire la protéine Y
couplée à la GFP dans les cellules U2-OS. Les sites attB1 et attB2 seront ajoutés à notre
ADNc par PCR à l’aide des amorces. Nous utiliserons des vecteurs produits par la société
Invitrogen (vecteur donneur/d’entrée : pENTR™/D-TOPO entouré des sites attP1 et attP2 et
vecteur de destination/expression : pcDNA6.2/cGeneBLAzer-DEST entouré des sites attR1 et
attR2). En injectant des anticorps anti-SAH 3 couplés à la rhodamine (rouge) dans les cellules
exprimant la protéine Y couplée à la GFP (vert), nous pourrons alors conclure sur la
localisation des protéines SAH 3 et Y.
- 19 -
•
Détermination de l’interaction : FRET
Afin de déterminer l’interaction de SAH 3 et Y, nous réaliserons des expériences de FRET à
l’aide de la protéine SAH 3 couplée à la blue GFP et de la protéine Y couplée à la green GFP.
Le FRET est une technique qui permet de détecter la proximité de deux molécules.
Quand il y a interaction entre les deux molécules, les deux colorants fluorescents sont alors à
proche l’un de l’autre entraînant un nouveau signal de fluorescence. Ce signal peut être suivi
en microscope à fluorescence.
•
Etude du knock-down du gène y
Dans une dernière expérience, nous étudierons le knock-down du gène y afin de voir s’il
perturbe la voie de p53. Pour cela, nous utiliserons des ARNsh ciblant le gène de Y et un
contrôle. Comme précédemment, le protocole de l’étude réalisé pour l’identification des cinq
nouveaux gènes de la voie de p53 nous servira de référence. Nous utiliserons donc des
cellules U2-OS et le plasmide pRETROSUPERCAM dans le but de réaliser le knock-down du
gène y. Nous utiliserons des ARNsh dirigés contre le gène y et introduits dans le
pRETROSUPERCAM fournis par l’équipe de Berns. Nous réaliserons alors une transfection
stable des cellules U2-OS. L’observation de la prolifération des cellules sur milieu gélosé
permettra de déterminer l’implication du gène y dans la voie de p53.
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CONCLUSION
La protéine p53, activée lors d’un dommage à l’ADN, intervient dans deux voies principales :
l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose, ce qui permet de maintenir l’intégrité du génome.
Cependant, cette protéine est retrouvée mutée dans plus de 50% des cancers. De plus, le
cancer représente aujourd’hui la deuxième cause de mortalité en France et les stratégies
thérapeutiques ne visent que p53. C’est pourquoi, l’identification de nouvelles protéines
intervenant dans cette voie semble nécessaire afin d’envisager de nouvelles thérapies. Les
auteurs de l’article« A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of
p53 pathway » ont mis en évidence cinq nouveaux gènes intervenant dans cette voie,
RPS6KA6, HTATIP, HDAC4, CCT2 et KIAA0828. Le gène KIAA0828 et sa protéine SAH3
étant très peu étudiés, nous espérons à travers notre étude les caractériser afin de mieux
comprendre son rôle dans la voie de p53 en vue de développer de nouvelles molécules anticancéreuses.
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