Structure-Activity Relationships(SARs) - ETH E-Collection

Diss. ETH Nr. 16674
Polycationic DendriticVectors for Gene Transfection:
Structure-Activity Relationships(SARs)
A dissertation submitted to the
ETH ZÜRICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presentedby
Marine NIECKOWSKI
Dipl. Ing. E.N.S.C.P., Paris,
France
born 06.05.1978
citizen of France
Accepted on the recommendationof
Prof. Dr. Francois Diederich, examiner
Prof. Donald Hilvert, co-examiner
Prof. Hans P.
Merkle, co-examiner
Zürich, 2006
Abstract
Abstract
synthesis and investigation of polycationic dendrimers for gene
transfection, that is, the delivery of foreign genetic material into the cell nucleus. The explicit
goal of this work is to establish relationships between the branched strueture, the biological
activity, and the physicochemical properties ofthe new molecules.
In the introduetory chapter, scope and limitations of gene transfection are illustrated by the
diversity of dendrimers developed and assayed so far for this purpose. Every optimization
strategy based on structuralmodificationis explained in detail. The Erst approach consists of
altering the strueture of dendrimers that are currently commercialized as gene-deliveryagents.
A number of ingenious examples that render the vectors more flexible, less toxic, or
amphiphilic have been reported. The second approach,probably more ambitious, is based on
new branch motifs that were
specificallydesigned for transfection. More generally, varying
the strueture of synthetic DNA carriers has now proved a valuable strategy to complement
knowledge gained by extensive biological studies. This clearly supports further development
This thesis presents the
of more advanced Systems.
The second chapterprovides a rationalefor the design of a new dendrimer library. Vector 2
was
previously
identified
systematically varied in
promising transfection agent and its strueture was
this project. The preparation of dendrimers 5-8, 15, and 17-19 with a
as
a
lipophilic group is described in the third chapter.
The fourth chapter presents biological results, namely transfection and toxicity assays in
eultured cells (in vitro) with our dendrimers. DNA delivery by lead Compound 2 was
compared in a variety of cell lines and rapid cell division seemed necessary to ensure nuclear
uptake ofthe foreign gene, as is the case for many synthetic vectors. Human epithelial cancer
cells (Heia cells) were thus selected for further evaluating the library of new vectors 5-15 and
17-19. Structural modifications applied to lead Compound 2 improved either the transfection
ability or the biocompatibility of the dendritic system. At this stage, correlations to
physicochemical properties were clearly required to explain differences in activity among the
new core or a new
new
vectors.
Abstract
Referencevectors:
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assays
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Toxicity assays
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biological experiment, RNA instead of DNA molecules were transfected with
vector 2. Our lead vector proved superior to a commercial synthetic vector with respect to the
In
a
last
transfected, but less efficient in consideration of the amount of RNA
delivered to each cell when compared to the widely used cell electroporation technique. This
result may be a consequence ofthe relatively small size ofthe DNA/dendrimer complex prior
number of cells
to transfection.
HEK293 cette
100
90
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IH-
electroporation technique
TM commercial reagent
s
Transmessenger
TM
In the fifth and last chapter, differences in the molecular assemblieswith and without DNA
large bilayers or
multilamellar vesicles could be observed in Solution by cryoTEM microscopy technique. Such
superstruetures are charactcristicfor efficient transfection vectors such as cationic lipids. The
are
analyzed in depth for vectors
Langmuir technique allowed
2 and 3. It is
further
study
only for lead vector
2 that
of fluid films of dendrimers at the air-water
Abstract
interface. DNA and HCl
biological stages
injeetions
into the watcr
subphase
of gene transfection. Sharp differences
of vectors 2 and 3:
they are linked to the relative
were
were
performed
observed between the
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*
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dendrimer2 in Tris-EDTA buffer
scale bars 100
The
the lead
dendrimer2/DNA complexes in Tris-EDTA buffer
scale bars 100
nm
self-assembling ability
Langmuir
ofthe
new
vectors
5-8, 11-15,
nm
and 17-19
lilms as well. The most active vectors in the library (7,
was
evaluated in
11-13) bchave shnilarly to
Compound 2, that is, they are capable of forming bilayers or üposomes, whereas
less active vectors
our
packing
size of their dendrons.
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&_.vi...._._
SM
mimic
to
small
prcferentially form micelles
in aqueous media. The transfection activity of
amphiphilic dendrimers was thus clearly related to their packing mode.
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80 100 120 140 160 180 200 220 240
Molecular area
[A7]
Resume
Resume
A travers la
Synthese et
l'etude de
nouveaux
dendrimeres
polycationiques,
cette these
genique. Nos molecules servent en effet ä
transporter efficacement du materiel genetique exogene jusqu'au noyau des cellules. Nous
avons plus particulierement tente d'etablirdes relations entre la strueture dendritique (c'est-ädire digitee ou en branches) de nouvelles molecules, leur activite biologique et leurs
proprietes physico-chimiques.
Dans le chapitre d'introduction,nous illustrons l'etendue et les limites de cette biotechnique
en montrant la diversite des dendrimeres developpes et testes jusqu'ä present en transfection
genique. Nous passons en revue deux strategies d'optimisation par des modifications
contrölees de strueture chimique. (i) Une premiere approche consiste ä changer la stmeture
des dendrimeres dejä connus qui sont commercialises comme vecteurs de genes. De
nombreuses etudes cherchent ingenieusement ä rendre ces dendrimeres plus flexibles, moins
toxiques ou amphiphiles.(ii) Une seconde approche plus fondamentale ambitionne de creer de
nouveaux motifs dendritiques, coneus de maniere specifique pour la transfection genique.
Plus generalement, faire varier la strueture de ces distributeurs synthetiques d'ADN permet de
completer les cormaissances acquises lors de tests biologiques detailles. Les informations
collectees ainsi se revelent essentielles pour dcvelopper des vecteurs de plus en plus
contribue
aux
recherches sur la transfection
performants.
chapitre expose nos motivations pour la definition et la synthesc d'une nouvcllc
famille de dendrimeres.Au depart de notre etude, le vecteur 2 etait dejä connu et avait ete
precedemment identifie comme prometteur pour la transfection genique. Sa strueture a done
ete l'objet des modifications contrölees exposees dans ce travail. La synthese de ses variantes,
Le second
les dendrimeres 5 ä
8,
15 et 17 ä 19 pourvus d'un nouvel espaceur ou d'un
lipophilique, est decrite au troisiemc chapitre.
Le
quatrieme chapitre presente
transfection et les tests de toxicite de
distribution d'ADN par le vecteur 2
les resultats
nos
a
ete
biologiques,
nouveau
groupe
c'est-ä-dire les essais de
molecules sur des cultures de cellules (in
comparee pour differentes cellules et
vitro). La
une
division
Resume
cellulaire rapide semble necessaire pour pcrmettre au materiel
noyau, comme il est observe pour de nombreux autres vecteurs
epithelialescancereuses (cellules Heia) ont ainsi
ete
chimique appliquees au
synthetiques.
generale,
dans le
Des cellules
selectionnees pour l'cvaluationde
vecteurs 5 ä 15 et 17 ä 19. De maniere
nouveaux
genetique d'entrer
tous
les
les modifications de strueture
pouvoir de
transfection soit la tolerabilite biologique. A ce stade, des rapprochements avec les proprietes
physico-chimiques semblaient necessaires pour expliquer les differences d'aetivite entre les
compose de reference vecteur 2 ameliorent soit le
vecteurs.
nouveaux
Reference vectors:
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Tests de transfection
genique
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Charge Excsw (-+A
Dans
une
derniere etude biologique,
distribution d'ARN
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nous avons
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teste le vecteur 2 de reference pour la
plus actif qu'un produit commercial
quant au nombre de cellules transfectees, mais moins efficace que la technique traditionelle
d'electroporation si c'est la quantite d'ARN distribuee ä chaque cellule transfectee qui est
prisc en compte. Ceci pourrait provenir de la faible taille des complexes ARN/dendrimere
au
lieu d'ADN. Ce vecteur s'est avere
formes avant la transfection.
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EL
electroporation
50
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vecteur commercial
40
vecteur 2
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30
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20
TM
Dans le dernier chapitre, les differences d'assemblage moleculaire avec et
le vecteur 2 et le vecteur 3 sont
analysees
en
sans
detail. La miscroscopie cryoTHM
d'observer des Solutions de dendrimeres et seul le vecteur 2 est
ADN entre
nous a
permis
capable de former des
bicouches ou des vesicules multilamellaires. De telles superstruetures sont caraetcristiques des
vecteurs de transfection efficaces, tels les lipides cationiques. La technique de Langmuir a
.10
Resume
ensuite
etc
appliquee ä
des films de dendrimeres formes ä l'interface air-eau. Des
sous-phase aqueuse devaient permettrede modcliser les etapes cles
d'ADN et d'HCI dans la
transfection
m§
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De nettes differences entre les vecteurs 2 et 3 sont observecs pour
elles sont liecs ä la taille relative de leurs dendrons.
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vecteur 2 dans la Solution
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tampon Tris-EDTA (echelle
100 nm)
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complexes
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entre le vecteur 2 et et
l'ADN dans
Solution tampon Tris-EDTA (echelle 100 nm)
L'aptitudc ä l'auto-assemblagc des nouveaux vecteurs 5 ä 8, 11 ä 15 et 17 ä 19 a aussi ete
etudiee avec leurs films de Langmuir. Les vecteurs les plus actifs dans cette famille (7, 11 ä
1.3)
sc
coinportent
liposomes. Les
comme
le compose de reference
plutöt en micelles dans un milieu aqueux.
transfection de vecteurs dendrit.iqu.es ont ainsi etc
vecteurs moins actifs s'assemblent
premiere fois,
prop.riet.es de
correlees ä leur mode d'assemblage.
Pour la
2, pouvant former des bicouches ou des
les
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B
50
0
CO
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3^&«up
11
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Molecular area
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