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Microscopie Moléculaire des Membranes (MMM)
UMR168 – Laboratoire Physico Chimie Curie
Daniel Lévy
Chef d'équipe
[email protected]
Tél : +33 1 56 24 67 82
Les protéines membranaires sont impliquées dans les
processus cellulaires majeurs, par exemple,
l’homéostasie cellulaire, la bioénergétique et la
communication. Près de 25 % des gènes codent une
protéine membranaire et plus de 50 % de ces protéines
constituent la cible d’agents thérapeutiques
actuellement utilisés.
Figure 1 :
Nous nous intéressons à l’analyse fonctionnelle et
structurale des protéines membranaires. Les
fonctions sont analysées après purification et
reconstitution dans des protéoliposomes. Les
structures sont déterminées par cryo-microscopie
électronique de pro
Les connaissances au niveau moléculaire
nécessaires à la conception de nouveaux outils
pharmacologiques sont bien en deçà de celui
des protéines cytoplasmiques. Cela est dû à
leur caractère amphiphile qui complique leur
manipulation, des étapes de surexpression à la
cristallisation en passant par celles de
purification.
Dans ce contexte, nous étudions la fonction des
protéines membranaires purifiées après
reconstitution dans des liposomes et leur
structure par microscopie électronique (Figure
1). Les protéines membranaires à l’étude sont
impliquées dans la détoxification et la multirésistance cellulaire aux médicaments, ainsi
que dans la bioénergétique cellulaire.
Les protéines membranaires purifiées en
détergent sont reconstituées dans une
membrane lipidique sous forme de
protéoliposomes afin d’étudier leur fonction
dans un système plus simple que la membrane
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native. Pour l’analyse structurale, nous utilisons
la cryo-microscopie électronique pour recueillir
des informations structurales à haute résolution
(1-2 nm) sur les protéines purifiées en
détergent et/ou après reconstitution dans un
environnement semblable à un environnement
membranaire.
Nous développons également de nouvelles
méthodes afin de réduire la quantité de
protéines par analyse et d’accéder aux
protéines membranaires humaines peu
exprimées.
Nos projets et résultats les plus significatifs au cours des dernières années comprennent :
Organisation supramoléculaire des protéines
membranaires
Les supercomplexes
de protéines
membranaires sont
l’assemblage
supramoléculaire de
protéines
membranaires
pouvant fonctionner
individuellement, mais
assemblées dans un
supercomplexe afin
d’augmenter le
rendement des
réactions catalytiques.
Les supercomplexes
ont été rapportés
dans la respiration, la
photosynthèse
bactérienne et chez
les plantes ou dans les
multirésistances aux
médicaments. Ce
concept récent dans le
cas des protéines
membranaires est le
plus avancé dans la
photosynthèse
bactérienne. Cela fait
Figure 2 : Image A: Appareil photosynthétique bactérien. Image B: (1)
Reconstruction 3D par cryo-microscopie électronique du core complexe de Rb.
veldkampii contenant une sous-unité PufX incapable de former des dimères. (2)
Carte de projection du core complexe dimérique de Rb. sphaeroides avec une
organisation de sous-unités comprenant une paire de Pufx maintenant le reste
du dimère. Image C: (1, 2) Membranes tubulaires de Rb. sphaeroides contenant
des core complexes dimériques. (3) Modèle d’un dimère de PufX maintenu par le
motif GXXXG présent dans Rb. sphaeroides et absent dans la séquence de PufX
de Rb. veldkampii. (5) L’angle entre les deux PufX conduit à la formation d’un
core complexe dimérique convexe qui courbe la membrane dans des zones
enrichies et conduit à des invaginations tubulaires. Image D: Proposition de
mécanisme d’assemblage de sous-unités au cours de la biosynthèse des core
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de ces protéines des
modèles intéressants
pour la
compréhension des
paramètres
structuraux impliqués
dans l’assemblage et
la stabilisation de
super-complexes de
protéines
membranaires. Une
large étude
structurale
comparative sur
plusieurs complexes
photosynthétiques
nous a permis de
mieux comprendre la
biosynthèse et
l’assemblage d’un
type de
supercomplexe
membranaire et
également d’apporter
de nouveaux éléments
à la compréhension
des chaînes de
transduction
énergétique dans les
cellules (Figure 2)
(1,2)
complexes. Chez Rb. sphaeroides, après dimérisation de PufX (ellipse rose), des
sous-unités α (cercles bleus) et β (cercles verts) sont assemblées par paires
conduisant à des antennes de courbure opposée qui ne peuvent se refermer
pour des raisons stériques. L’ouverture des antennes pourrait constituer un
passage de choix pour les quinones vers le cyt. bc1. Chez Rb. velkampii, Pufx ne
dimérise pas et les sous-unités α et β sont assemblées par paires jusqu’à la
fermeture.
Analyse structurale de transporteurs MDR (multirésistance aux xénobiotiques)
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Figure 3 :
Les protéines de multi-résistance aux molécules
hydrophobes hydrolysent l’ATP pour l’efflux de
divers xénobiotiques. Trois transporteurs MDR
humains ont été trouvés dans des cellules
tumorales et transportent plusieurs médicaments
Un effort particulier est consacré à la
détermination de la structure des transporteurs
membranaires dits ABC qui hydrolysent l’ATP
pour le transport transmembranaire de divers
xénobiotiques et la détoxification cellulaire.
Certains ABC confèrent un phénotype de multirésistance aux médicaments (MDR), des
bactéries pour la résistance aux antibiotiques à
l’homme pour l’élimination de médicaments
anti-cancéreux. Notre projet comprend
l’analyse structurale de transporteurs MDR
humains et d’homologues bactériens impliqués
dans le transport des médicaments anticancéreux avec l’objectif final de contribuer au
développement de nouveaux inhibiteurs (Figure
3). Nous avons récemment décrit le transport
de substrats au niveau moléculaire par BmrA,
un transporteur MDR homologue à la Pgp
humaine (3).
Nouvelles méthodes pour l’analyse structurale de
protéines membranaires peu exprimées
En parallèle, nous développons de nouvelles
méthodes afin de réduire au niveau de la
picomole, la quantité de protéines pour
l’analyse structurale pour accéder aux
protéines membranaires humaines peu
exprimées. Le concept de base repose sur la
concentration de protéines présentes dans un
volume vers une surface, par exemple, une
surface fonctionnalisée de lipides ou une
bicouche plane supportée. Les deux stratégies
sont utilisées pour l’analyse des transporteurs
MDR eucaryotes (Fig 4) (4).
Figure 4 :
Nouvelles stratégies visant à réduire la quantité de
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protéines membranaires pour l’analyse structurale.
A) Cristallisation 2D sur un film lipidique contenant
un ligand lipidique des protéines.
Publications clés
Année de publication : 2016
A Bertin, E Nogales (2016 Jul 31)
Preparing recombinant yeast septins
and their analysis by electron
microscopy.
Methods in cell biology : 21-34 : DOI :
10.1016/bs.mcb.2016.03.010
Aurélie Bertin, Eva Nogales (2016 Jan 15)
Characterization of Septin
Ultrastructure in Budding Yeast Using
Electron Tomography.
Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) :
113-23 : DOI : 10.1007/978-1-4939-3145-3_9
Année de publication : 2014
Guillaume van Niel, Ptissam Bergam, Aurelie
Di Cicco, Ilse Hurbain, Alessandra Lo Cicero,
Florent Dingli, Roberta Palmulli, Cecile Fort,
Marie Claude Potier, Leon J Schurgers,
Damarys Loew, Daniel Levy, Graça Raposo
(2014 Nov 13)
Apolipoprotein E Regulates Amyloid
Formation within Endosomes of
Pigment Cells.
Cell reports : 43-51 : DOI :
10.1016/j.celrep.2015.08.057
Lin Jia, Di Cui, Jérôme Bignon, Aurelie Di
Cicco, Joanna Wdzieczak-Bakala, Jianmiao Liu,
Min-Hui Li (2014 May 19)
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Reduction-responsive cholesterolbased block copolymer vesicles for
drug delivery.
Biomacromolecules : 2206-17 : DOI :
10.1021/bm5003569
Ayako Yamada, Alexandre Mamane, Jonathan
Lee-Tin-Wah, Aurélie Di Cicco, Coline Prévost,
Daniel Lévy, Jean-François Joanny, Evelyne
Coudrier, Patricia Bassereau (2014 Apr 7)
Catch-bond behaviour facilitates
membrane tubulation by nonprocessive myosin 1b.
Nature communications : 3624 : DOI :
10.1038/ncomms4624
Année de publication : 2013
Bibiana Peralta, David Gil-Carton, Daniel
Castaño-Díez, Aurelie Bertin, Claire Boulogne,
Hanna M Oksanen, Dennis H Bamford, Nicola
G A Abrescia (2013 Oct 3)
Mechanism of membranous tunnelling
nanotube formation in viral genome
delivery.
PLoS biology : e1001667 : DOI :
10.1371/journal.pbio.1001667
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