Cours Microbiologie 2016-2017 Programme - Web

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COURS DE
MICROBIOLOGIE
2016-2017
Directeurs du Cours
Françoise NOREL-BOZOUKLIAN
Christophe BELOIN
Chef de Travaux Pratiques
Ingrid GUILVOUT
PROGRAMME
Année universitaire 2016-2017
Cours de
MICROBIOLOGIE
2016-2017
CENTRE D’ENSEIGNEMENT de l’INSTITUT PASTEUR
Pavillon LOUIS MARTIN (Bât. 09)
28, rue du Docteur Roux
75724 PARIS Cedex 15
▼
Conférences
(Tronc commun) :
Salle de Cours 3, (Bât. Social 06, Institut Pasteur)
Travaux Pratiques I :
Biodiversité des communautés aquatiques
microbiennes
Salle TP et Salle 1
R.-de-ch du Centre d’Enseignement (PLM, Bât. 09, Institut Pasteur)
Travaux Pratiques II et III :
Mécanismes d’infection de cellules humaines par une bactérie pathogène,
Listeria monocytogenes
Salle TP et Salle 1
R.-de-ch du Centre d’Enseignement (PLM, Bât. 09, Institut Pasteur)
1
SOMMAIRE
Présentation du cours …………………………………………………………… 3
Conférences………………………………………………………………………. 4
Travaux pratiques :
Travaux pratiques I ……………………………………………………………… 6
Travaux pratiques II et III………………………………………………………… 8
Modalités des examens ………………………………………………………… 13
Noms et coordonnées des intervenants………………………………………. 15
2
PRESENTATION DU COURS
Ce cours théorique et pratique de neuf semaines présente les avancées les plus récentes en microbiologie moléculaire et cellulaire.
Cette formation à la recherche en microbiologie comprend des conférences, des travaux pratiques et des sessions de discussions
organisés en quatre modules.
Cycle de conférences (un module de 2 semaines)
Programme scientifique et encadrement : Françoise Norel et Christophe Beloin (Institut Pasteur)
Cet enseignement en anglais comporte, d'une part, des conférences ayant pour but d'actualiser les connaissances des participants
sur les différents domaines de la microbiologie procaryote et eucaryote et d'autre part, des conférences plus spécialisées sur les
thématiques en plein essor et les nouveaux outils permettant leur développement.
TP. 1. Travaux pratiques sur la biodiversité des communautés aquatiques microbiennes (un module de 2 semaines)
Programme scientifique et encadrement : Jean-François Humbert et Julie Leloup (iEES, Institut de l’Ecologie et des Sciences de
l’Environnement, UPMC Paris)
L'objectif de ces travaux pratiques est de présenter et mettre en oeuvre différentes approches méthodologiques utilisées dans
l'étude comparée de la diversité de communautés microbiennes (cytométrie de flux, bactériologie, biologie moléculaire,
spectrométrie de masse et bio-informatique). Une journée est organisée sur le site de Foljuif près de Nemours, afin d’effectuer des
prélèvements de différents écosystèmes aquatiques qui seront ensuite analysés. Ce site est une base d’enseignement et de
recherche de l’ENS, qui abrite des expérimentations de terrain et des laboratoires en Ecologie (CEREEP-Ecotron Ile De France
ENS/CNRS, http://www.foljuif.ens.fr/index.php).
TP. 2-3. Travaux pratiques sur les mécanismes d’infection de cellules humaines par une bactérie pathogène, Listeria
monocytogenes (5 semaines en 2 modules)
Programme scientifique et encadrement : Edith Gouin, David Ribet, Unité des Interactions Bactéries Cellules dirigée par Pascale
Cossart (Institut Pasteur http://www.pasteur.fr/en/research/cell-biology-infection/units-groups/bacteria-cell-interactions), Mélanie
Hamon (Groupe à 5 ans Chromatine et Infection - Chromatin and Infection)
Ces Travaux Pratiques seront centrés sur l’étude de la bactérie pathogène Listeria monocytogenes. Cette bactérie, de part ses
capacités d’invasion, de survie et de multiplication à l’intérieur des cellules de l’hôte, est un organisme pathogène modèle et un outil
exceptionnel pour la microbiologie cellulaire. Au cours de ces Travaux Pratiques, des approches classiques de microbiologie, ainsi
que des techniques de pointe comme la spectrométrie de masse ou l’ingénierie des génomes par CRISPR seront utilisées pour
décrypter les mécanismes utilisés par Listeria pour manipuler les cellules infectées.
Des techniques expérimentales variées seront abordées: biologie moléculaire (clonage, qRT-PCR, immunoprécipitation, western
blot), biologie cellulaire (culture cellulaire, transfection, siRNA), réalisation de mutants de Listeria, purification de toxines
bactériennes, infection de cellules eucaryotes par Listeria, spectrométrie de masse, ingénierie des génomes eucaryotes (CRISPR),
imagerie et analyse d’images (microscopie à fluorescence, microscopie électronique).
*Légende figure couverture : Observation en microscopie à fluorescence d’une cellule infectée par Listeria. Les bactéries (en rouge)
se multiplient dans la cellule infectée et se déplacent en utilisant un constituant de cette cellule nommé actine (en vert). Le noyau de
la cellule infectée est ici coloré en bleu.
(Crédits : Edith Gouin & Pascale Cossart, Institut Pasteur)
3
COURS DE MICROBIOLOGIE 2016-2017
PROGRAMME DES CONFERENCES
- 1ère Semaine -
Jeudi 01 Septembre 2016
9:30 - 10:45
Accueil des Participants - Formalités administratives
Introduction
Secrétariat de la Scolarité
Françoise NOREL-BOZOUKLIAN
Christophe BELOIN
Ingrid GUILVOUT
Hervé WAXIN
Isabelle LEQUEUTRE
(INSTITUT PASTEUR – 75 PARIS)
11:00 - 12:30
(1 h 30)
African trypanosomes: A thousand tricks to escape
the host immune response
14:00 - 15:30
(1 h 30)
Host-pathogen interactions in the context of blood vessels
15:45 - 17:15
(1 h 30)
The peptidoglycan as a signaling molecule in the host during
homeostasis, disease, and dysbiosis
Philippe BASTIN
Guillaume DUMENIL
Ivo BONECA
Vendredi 02 Septembre 2016
9:00 - 10:30
(1 h 30)
Recherche partenariale et transfert de technologies
Propriété intellectuelle
Cas d’étude: Société Eligo Bioscience
Karine MIGNON
Corinne SARRAZIN
Xavier DUPORTET et David BIKARD
10:45 - 12:15
(1 h 30)
How a pathogen infects both host and vector and produces a
transmissible infection: the example of Yersinia pestis
14:00 - 15:30
(1 h 30)
The many roles of horizontal gene transfer in microbial evolution
15:45 - 17:15
(1 h 30)
RNA turnover and post-transcriptional regulation in
Gram-positive bacteria
4
Florent SEBBANE
(INSTITUT PASTEUR LILLE – 59 LILLE)
Eduardo ROCHA
Ciaran CONDON
(IBPC – 75 PARIS)
PROGRAMME DES CONFERENCES
- 2ème Semaine -
Lundi 05 Septembre 2016
9:00 - 10:30
10:45 - 12:15
14:00 - 15:30
15:45 - 17:15
(1 h 30)
(1 h 30)
(1 h 30)
(1 h 30)
Why metabolism matters ? understanding bacterial biofilms
through the prism of a resurrected research field
Jean-Marc GHIGO
Evolution of molecular chaperones towards the control
of toxin-antitoxin systems
Pierre GENEVAUX
(UNIVERSITE PAUL SABATIER – 31 TOULOUSE)
Horizontal gene transfer in bacteria: a molecular
and structural biology perspective
Rémi FRONZES
Man and microbes: a (almost) perfect symbiosis
Philippe SANSONETTI
Mardi 06 Septembre 2016
9:00 - 10:30
(1 h 30)
Human genome variability and adaptation to pathogen pressures
10:45 - 12:15
(1 h 30)
Emergence of multicellularity: lessons from a « simple » bacterium
14:00 - 15:30
(1 h 30)
Molecular and structural dissection of the bacterial type VI secretion
system (T6SS) paving the way for the identification of virulence blockers
15:45 - 17:15
(1 h 30)
Bacteriophages, a solution to antibiotics crisis ?
Lluis QUINTANA-MURCI
Tâm MIGNOT
(IMM – 13 MARSEILLE)
Eric DURAND
(IMM – 13 MARSEILLE)
Laurent DEBARBIEUX
Mercredi 07 Septembre 2016
9:00 - 10:30
(1 h 30)
Sepsis
Jean-Marc CAVAILLON
10:45 - 12:15
(1 h 30)
Cell wall polymers in Aspergillus fumigatus and
host-pathogens interactions
14:00 - 15:30
(1 h 30)
Breaking the Barrier Between Commensalism and Pathogenicity
15:45 - 17:15
(1 h 30)
CRISPR: from a prokaryotic immune system to biotechnological tools
Thierry FONTAINE
Eric OSWALD
(INSERM – 31 TOULOUSE)
David BIKARD
Jeudi 08 Septembre 2016
9:00 - 10:30
(1 h 30)
The Cryptococcus neoformans transcriptome dynamics
10:45 - 12:15
(1 h 30)
Acquisition of host-derived nutrient, a critical aspect of the
intracellular life cycle of Francisella
14:00 - 15:30
15:45 - 17:15
(1 h 30)
(1 h 30)
Fluxomics & Metabolomics: tools for functional analysis
of microbial metabolic systems
Guilhem JANBON
Alain CHARBIT
(INSTITUT NECKER-ENFANTS MALADES – 75 PARIS)
Fabien LETISSE
(LISBP-INSA – 31 TOULOUSE)
From Bench to bed and vice versa: Towards the prevention
Claire POYART
of Group B streptococcus neonatal meningitis
(GROUPE HOSPITALIER COCHIN - St VINCENT DE PAUL – 75 PARIS)
Vendredi 09 Septembre 2016
9:00 - 10:30
(1 h 30)
The bacterial pathogen Listeria monocytogenes:
a unique model in biology
10:45 - 12:00
(1 h 15)
Paludisme: tour d'horizon
13:00 - 14:00
(1 h 00)
Phylogenomics and the Tree of Life:
diversity and evolution of microorganisms
Pascale COSSART
Robert MENARD
14:15 – 15 :45
(1h 30)
Préparation Table Ronde en deux demi-groupes
16:00 - 18:30
(2 h 30)
Discussion Table ronde et présentations par les étudiants
5
Simonetta GRIBALDO
Simonetta GRIBALDO
Simonetta GRIBALDO
TRAVAUX PRATIQUES I
Biodiversité des communautés aquatiques microbiennes
- 3ème Semaine Lundi 12 septembre 2016
• Matin : 8h30, Présentation des Travaux Pratiques I (F. Norel-Bozouklian/C. Beloin et J. F. Humbert)
10h, Départ en car pour Foljuif.
• Après-midi : Prélèvements d’eau, cytométrie en flux, filtrations, étalements sur boîtes
• Soir : Retour sur Paris
Mardi 13 septembre 2016
• Matin :
o Présentation du Centre d'enseignement et de la salle de TP (I. Lequeutre)
o Extraction des ADN sur filtres
o Ensemencement des Ecoplate™
o Conférence de J.F. Humbert : Les cyanobactéries, the good and the bad
• Après-midi :
o PCR, préparation des gels pour l’électrophorèse
o Présentation de la Partie isolement, caractérisation phénotypique par I. Lequeutre et I. Guilvout
o Migration des PCR sur gels
Mercredi 14 septembre 2016
• Matin :
o Clonage des fragments de PCR
o Isolements et étalements / Examens microscopiques
• Après-midi :
o Suite des isolements et étalements / examens microscopiques
o Souche de référence : examens microscopique / tests d'identification
o Lecture spectrophotométrique des Ecoplate™
Jeudi 15 septembre 2016
• Matin :
o Suite Identification bactérienne (Souches du milieu aquatique et de référence)
o Présentation de l'identification par spectrométrie de masse (D. Clermont)
• Après-midi :
o PCR sur colonies suite au clonage
o PCR sur colonies suite aux isolements
Vendredi 16 septembre 2016
• Matin :
o Vérification sur gel des PCR résultant de l’approche « biologie moléculaire» et de l’approche « bactériologie »
o Suite Identification bactérienne : résultats des identifications
o Spectrométrie de masse
• Après-midi :
o Bilan
6
TRAVAUX PRATIQUES I
Biodiversité des communautés aquatiques microbiennes
- 4ème Semaine -
Lundi 19 septembre 2016
• Matin : Suite identification bactérienne
• Matin (fin) : Répartition des séquences entre les différents binômes.
• Après-midi : Constitution d’un fichier dans GeneDoc et création des séquences consensus à partir des lectures sur les deux brins.
• Conférence de V. Caro (15h00) (Institut Pasteur 75 Paris) : Les méthodes de séquençage à haut débit
Mardi 20 septembre 2016
• Matin : Recherche des séquences chimériques.
• Conférence de M. Gugger (11h00) (Institut Pasteur 75 Paris) : From genomic investigations of Cyanobacteria to their natural
products
• Après-midi : Alignement des séquences dans ClustalW ; Approche phylogénétique ; Définition des OTUs
Mercredi 21 septembre 2016 :
• Matin (fin) : Définition des OTUs (fin).
• Conférence de L. Frangeul (11h00) (Institut Pasteur 75 Paris) : Les banques de séquences et blast
• Après-midi : Assignation taxonomique des OTUs (Blast et RdP) ; Analyse de la diversité ; courbes de raréfaction ; estimateur de
Chao1.
Jeudi 22 septembre 2016
• Comparaison de la composition des communautés bactériennes obtenues dans les quatre échantillons par trois méthodes
d’analyse.
• Conférence de S. Brisse (14h00) (Institut Pasteur 75 Paris) : Génomique des populations et épidémiologie des bactéries
pathogènes
Vendredi 23 septembre 2016
• Bilan comparé des deux approches mise en culture / biologie moléculaire.
• Discussion générale, critique sur les approches utilisées et réflexion sur les méthodologies d’avenir.
7
Travaux Pratiques II et III
Infection mechanisms used by Listeria monocytogenes
- 5ème Semaine -
Monday September 26th 2016
• General presentation of the practical works
• Generation of Listeria mutants – Practical
o Preparation of electrocompetent Listeria monocytogenes cells
• Generation of Listeria mutants – Theoretical
o Bibliography analysis for selection of Listeria mutants (Part 1)
Tuesday September 27th 2016
Conference de F. Impens (UIBC, Gent, Belgique): Functional proteome analysis by mass spectrometry
• Generation of Listeria mutants – Theoretical
o Bibliography analysis for selection of Listeria mutants (Part 2)
o In silico design of pMAD plasmids for generation of Listeria mutants
o Student’s presentation of selected Listeria mutants
o Preparation of electrocompetent Listeria monocytogenes cells
Wednesday September 28th 2016
Examen oral TP1 : Biodiversité
• Genome engineering of eukaryotic cells using CRISPR/Cas9 technique
o
Introduction to genome engineering using CRISPR/Cas9 technique
o Selection of gRNAs and in silico design of mutagenesis strategies.
• Generation of Listeria mutants - Practical
o Transformation of Listeria
Thursday, September 29th 2016
o Cloning of gRNAs into pX330 plasmid (Part 1)
Friday, September 30th 2016
• Phenotypic analysis of Listeria mutants
o Characterization of Listeria mutants using specific plates
o Cloning of gRNAs into pX330 plasmid (Part 2): Colony PCR
8
- 6ème Semaine Monday, October 3rd 2016
Conference de L. Radoshevich (Institut Pasteur 75 Paris): Scientific Ethics-Principles and discussion
o Chromosomal integration of transformed plasmid (Part 1)
• Analysis of interactions between host and bacterial proteins using mass spectrometry
o Plating of HeLa cells for transfection
Tuesday, October 4th 2016
o Transfection of HeLa cells with expression vectors for FLAG-tagged bacterial proteins and control vector
o Plating of HeLa and RAW 264.7 cells for infection
o Preparation of Listeria cultures
Wednesday, October 5th 2016
o Sequence analysis
o Plating of HeLa cells for transfection
o Preparation of Listeria cultures for infection.
o Preparation of HeLa and RAW 264.7 cells for infection (≈ 2h before infection).
o Plating of Listeria cultures: Numeration of the inoculum
o Infection of HeLa and RAW 264.7 cells.
o Lysis of cells and plating of live intracellular bacteria (2 h post-infection)
o Fixation of cells for immunofluorescence analysis (5h post-infection)
Thursday October 6h 2016
o Transfection of HeLa cells with pX330-encoding gRNAs plasmids
o Labeling of cells for immunofluorescence analysis
o Quantification of live intracellular bacteria
o Immunoprecipitation of FLAG-tagged proteins and their interactors (Part 1)
Friday October 7th 2016
• Maintenance of tissue culture cells
o Passage of HeLa cells
o Isolation of clonal cell lines by dilution (Part 1)
o Evaluation of Cas9-mediated DNA cleavage efficiency (Part 1)
o Control of transfection efficiency
o Immunoprecipitation of FLAG-tagged proteins and their interactors (Part 2)
9
- 7ème Semaine Monday October 10th 2016
o Plasmid excision
o In silico analysis of mass spectrometry data
o Control of immunoprecipitation by Western Blot (Part 1)
o Microscopy analysis of infections
Tuesday October 11th 2016
Conference de J. Pizzaro-Cerda (Institut Pasteur 75 Paris): Frontiers in Imaging Approaches
• Analysis of Listeria gene expression
o Bacterial growth (Part 1)
o Control of immunoprecipitation by Western Blot (Part 2)
• Analysis of the role of host genes in Listeria infection using siRNA
o Transfection of HeLa cells with siRNA
Wednesday October 12th 2016
o Plasmid elimination
o Bacterial growth (Part 2)
Thursday October 13th 2016
o Preparation of HeLa cells for infection (≈ 2h before infection).
o Preparation of cell lysates to control siRNA efficiency.
o Plating of Listeria culture: Numeration of the inoculum
o Infection of HeLa cells.
o Lysis of cells and plating of live intracellular bacteria (2h post-infection)
o Fixation of cells for immunofluorescence analysis (5h post-infection)
o Selection of Listeria clones which lost the plasmid
o RNA preparation
o Reverse transcription reaction
o Labeling of cells for immunofluorescence analysis
o Quantification of live intracellular bacteria
10
- 8ème Semaine Monday October 17th 2016
o Selection of Listeria clones which lost the gene of interest
o qPCR reaction
o Electron microscopy of Listeria (Part 1)
o Control of siRNA efficiency by Western Blot (Part 1)
o Control of siRNA efficiency by Western Blot (Part 2)
• Purification of bacterial pore-forming toxins
o Preparation of bacteria cultures
• Purification of bacterial pore-forming toxins (Part 1)
Friday October 21st 2016
o Control of pore-forming toxins purification:
- Measure concentration of purified pore-forming toxins using Bradford reagent
- SDS-PAGE analysis of purified proteins and Coomassie staining
o
Hemolytic activity of supernatants from Listeria mutants (Part 1)
11
- 9ème Semaine -
Monday October 24th 2016
o
Hemolytic activity of supernatants from Listeria mutants (Part 2)
o Quantitative analysis of immunofluorescence data by ICY (Part 1)
o Duplicate isolated clones
o Hemolytic activity of Listeria mutants on plates
o Hemolytic activity of supernatants from Listeria mutants on red blood cells
• Purification of bacterial pore-forming toxins
o Hemolytic activity of purified toxins
o Analysis of the SDS-PAGE gel
o Validation of clones (Part 1)
o Analysis of the qPCR results
o Analysis of electron microscopy images
o Validation of clones (Part 2)
• Final analysis of results
• Preparation for oral exam
• Oral exam
12
MODALITES DES EXAMENS
Examen sur la partie "conférences" (note sur 20)
- Un compte-rendu écrit doit être remis en 3 exemplaires au secrétariat des Enseignements avant le 27 Septembre 2016 à 16h00.
- La participation des étudiants durant les conférences et les Tables rondes sera évaluée
Format et contenu du compte rendu :
Le document de 4 pages maximum doit être écrit en Times new roman 11, interligne 1,5, marges de 2 cm. La langue sera l’anglais ou le français
au choix.
Le texte doit traiter un des sujets proposés par les encadrants (chaque sujet correspond à un thème abordé dans au moins trois conférences). Il
s’agit de faire une synthèse sur un sujet, en aucun cas de résumer une ou plusieurs conférences.
Le compte-rendu comprendra :
le titre du sujet,
le titre des conférences et les noms des conférenciers évoqués,
un résumé synthétique de 5 lignes en anglais,
une introduction à la thématique,
une présentation des éléments provenant de chacune des conférences sélectionnées,
une partie de discussion/perspectives sur le sujet,
une page de figures pourra être fournie en annexe (pas obligatoire),
quelques références bibliographiques pourront être citées.
Examens sur la partie Travaux Pratiques de laboratoire (note sur 60)
Partie I : Biodiversité (note sur 20)
- L’implication des étudiants durant les TPs sera évaluée par les encadrants (note sur 5)
- Examen oral le 28 Septembre 2016 (note sur 15)
Il s’agit de présenter, sous forme de communication orale, les résultats obtenus, de les analyser, d’en faire une synthèse et de les discuter.
Proposer dans la dernière diapositive un projet de recherche pour poursuivre cette étude.
Durée: 10 mn
Questions du jury: 5 mn
Organisation de la présentation : exposé non public de chaque étudiant devant le jury
Diapositives (logiciel Power Point) en anglais
Partie II et III: Infection mechanisms used by Listeria monocytogenes
Premier Module : note sur 20
- Le cahier de laboratoire sera noté (note sur 5)
- Un compte rendu écrit doit être remis en 4 exemplaires au secrétariat des Enseignements (note sur 10) avant le 18 novembre 2016 à 16h00
Format et contenu du compte rendu
Contenu : Un article scientifique relatant une partie des résultats obtenus dans les TP (le sujet à traiter sera décidé par les encadrants).
Format : le document de 4 pages maximum doit être écrit en Times new roman 11, interligne 1,5, marges de 2 cm. La langue sera l’anglais ou le
français.
Le compte-rendu comprendra :
Titre et auteurs
Résumé (6 à 10 lignes maximum)
Introduction (1/2 page)
Matériel et méthodes (1/2 page)
Résultats (propres au binôme) (2 pages)
Discussion (1 page)
Bibliographie (10 références maximum)
Figures (3 pages maximum de figures et tableaux accompagnés de légendes)
13
Second Module : note sur 20
- Le cahier de laboratoire sera noté (note sur 5)
- Examen oral le 28 Octobre 2016 (note sur 10)
Format et contenu de l’examen oral
Il s'agit de répondre à l'une des 10 questions sur les travaux pratiques qui seront posées par les encadrants quelques jours avant l’examen.
Un document Power Point unique répondant aux 10 questions sera préparé par l'ensemble des étudiants et servira de support lors de l’examen oral.
Chaque binôme tirera au sort une question au moment de l'oral et y répondra devant le jury (chaque binôme doit donc être capable de répondre aux 10
questions).
L'ensemble des étudiants assistera à la session d'oral.
Durée : 6 mn (2 x 3 mn)
Question du jury : 5 mn
14

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