Nouvelles approches métabolomiques en nutrition, apports et

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Estelle PUJOSGUILLOT1,2, *, Jean-Louis SÉBÉDIO1,2
Nouvelles approches métabolomiques
en nutrition, apports et limites de la
spectrométrie de masse
RÉSUMÉ
Le développement rapide de la métabolomique a été rendu possible grâce aux progrès des
techniques analytiques, telle que la spectrométrie de masse et les couplages qui lui sont
associés, en particulier celui avec la chromatographie liquide. La metabolomique peut être
définie comme l’analyse globale de petites molécules présentes dans une matrice biologique,
produites ou modifiées suite à un stimulus (intervention nutritionnelle, prise de médicaments…).
L’acquisition des données peut être conduite soit par une approche ciblée, dans laquelle des voies
métaboliques particulières sont analysées, soit par une approche globale, sans sélection préalable
des voies d’intérêt. Même si la spectrométrie de masse présente des atouts certains, l’application
de la métabolomique au domaine de la nutrition se heurte encore à de nombreux challenges
analytiques.
MOTS- CLÉS
Métabolique, spectrométrie de masse, nutrition
Nutrition metabolomic, approaches and tools
SUMMARY
Omique
qu
The rapidly expanding field of metabolomics has been driven by major advances in analytical tools such
as mass spectrometr y and hyphenated methods, in particular the coupling of mass spectrometr y with
high performance liquid chromatography. Metabolomics can be described as a global analysis of small
molecules of a biological matrix, which are produced or modified as a result of a stimuli (nutritional
inter vention, drug etc). The data acquisition and retrieval may be achieved by a targeted analysis where
specific pathways are analysed or an untargeted analysis where no prior selection of pathways is
performed. Even if mass spectrometr y has a high potential in this area, many challenges still exist in
nutritional metabolomics.
KEYWORDS
Metabolomic, mass spectrometry, nutrition
I - Introduction
En nutrition, l’approche traditionnelle a longtemps consisté à étudier l’effet d’un nutriment
donné sur une fonction particulière ou un organe cible, dans le but d’obtenir une meilleure
connaissance du mécanisme d’action des nutriments, notamment en tant que régulateurs des
voies métaboliques. Le récent développement
de techniques analytiques très performantes
et d’outils à haut débit ouvre maintenant un
champ d’investigation beaucoup plus large
permettant d’intégrer un ensemble de réponses
biologiques résultant de la complexité de l’aliment et des régimes alimentaires.
La métabolomique est définie comme la mesure quantitative des réponses métaboliques
multivariées de cellules, tissus, ou d’un organisme à un stimulus physiopathologique ou
environnemental, ou à une modification génétique (1). En nutrition, il s’agit de mesurer les
effets (ou conséquences métaboliques) d’une
intervention nutritionnelle, par la mesure du
changement de profil métabolique induit.
*Pour correspondance
1
INRA, UMR 1019 Nutrition Humaine, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, Centre de Recherche de Clermont-Ferrand/Theix, F-63122 St-Genès-Champanelle
2
Clermont Université, UFR médecine, UMR 1019 Nutrition Humaine, Clermont-Ferrand
SPECTRA ANALYSE n° 269 • Septembre - Octobre 2009
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Figure 1
Les étapes
d’une étude
métabolomique.
Acquisition de profils
Métaboliques (RMN, SM)
Collecte et traitement de l'échantillon
Voies métaboliques
METABOLOMIQUE
Traitements des données
Identification des métabolites Analyses statistiques multivariées
Bases de données
L’objectif peut également viser l’identification
des biomarqueurs de maladies métaboliques
(maladies cardiovasculaires, cancers, ostéoporose, stress oxydant…).
Une étude métabolomique est constituée de
différentes étapes (figure 1), impliquant des
outils et compétences diverses.
Chaque étude commence par l’analyse simultanée le plus souvent par RMN et/ou différents
couplages, HPLC-MS ou GC-MS, de quelques
centaines d’échantillons biologiques, sous divisés en différents groupes correspondant à différents phénotypes. Après une mise au point
méthodologique des étapes de prélèvement,
de préparation de l’échantillon (purification)
et d’analyses, les données sont collectées pour
chaque échantillon. La première étape de retraitement informatique consiste en l’alignement des données (correction en masse) et
l’intégration des pics chromatographiques.
Une matrice est alors constituée avec l’ensemble des ions détectés dans chaque échantillon,
caractérisés par leurs temps de rétention, leurs
masses exactes, et leurs intensités. Cette matrice est ensuite soumise à des analyses statistiques, dans le but d’identifier les ions variant
de façon significative d’un phénotype à l’autre.
A l’issue de cette étape, l’objectif est d’effectuer
une identification de ces ions dans le but de
comprendre les principales voies métaboliques
affectées.
L’interprétation des données est complexe notamment en raison du degré de redondance de
l’information contenue dans la matrice des marqueurs. En effet, un ion peut être un métabolite,
mais aussi son isotope, un adduit ou un fragment de ce métabolite, généré lors du processus
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SPECTRA ANALYSE n° 269 • Septembre - Octobre 2009
Intégration des données
d’ionisation au sein de la source du spectromètre de masse. L’identification des métabolites est
aujourd’hui envisagée soit par comparaison avec
les bases de données chimiques et biochimiques
existantes, soit par des analyses complémentaires en spectrométrie de masse (fragmentations
MSn) ou par d’autres techniques (RMN…).
Ce type d’approche génère un challenge analytique important. En effet, il s’agit de développer des méthodes permettant la détection d’un
grand nombre de métabolites, d’une grande diversité chimique (pKa, polarité, masse) et présents à des concentrations très variables dans des
matrices complexes. La spectrométrie de masse
offre, de part la multiplicité de ses techniques,
une certaine universalité, une grande sensibilité
et permet l’accès à des informations structurales et quantitatives. Cependant, un choix de
la technique séparative, du type d’ionisation et
du type d’analyseur, ainsi qu’une optimisation
des paramètres analytiques sont indispensables
pour obtenir ce niveau de performance.
II - Avantages de la spectrométrie
de masse
Si la RMN a été la technique qui a permis à la
métabolomique de voir le jour, la spectrométrie de masse et les différents couplages qu’elle
permet de mettre en œuvre ont joué un rôle essentiel dans son essor (2, 3). La combinaison de
plusieurs plateformes analytiques est souvent
nécessaire pour couvrir les différentes classes de
métabolites et leur large gamme de concentrations dans les matrices biologiques (4-6).
Technologie appliquée
Nouvelles approches métabolomiques en nutrition,
apports et limites de la spectrométrie de masse
La chromatographie en phase gazeuse couplée
à la spectrométrie de masse (GC-MS) permet
d’obtenir des données très reproductibles. En
particulier, l’ionisation par impact électronique
permet l’obtention de spectres standardisés facilitant l’étape d’identification dans les bases
de données. En revanche, elle ne permet l’accès
qu’à un nombre limité de métabolites et elle requiert généralement de longues étapes de préparation de l’échantillon. Ainsi, une réaction de
dérivation est très souvent nécessaire pour réduire la polarité des molécules, augmenter leur
stabilité thermique et les rendre plus volatiles
(2). Afin d’accroître le nombre de métabolites
séparés, l’utilisation de la chromatographie
multidimensionnelle fait l’objet d’un intérêt
croissant (7, 8). Cependant le traitement des
données est rendu encore plus complexe et
aucune solution informatique efficace n’est
aujourd’hui disponible (8).
Les progrès réalisés dans le domaine du couplage de la chromatographie et de la spectrométrie de masse (electrospray et APCI) en font
une technique de choix pour une prise d’empreintes métaboliques. Les échantillons d’urine
peuvent être injectés directement après une
simple dilution alors que l’analyse du plasma
requiert au préalable une précipitation des protéines (9). Le principal problème de la LC-MS
est le phénomène de suppression d’ionisation
qui dépend de la nature des composés de la
matrice et qui est fréquent en particulier lorsque l’electrospray est utilisé comme méthode
d’ionisation. Palier ce problème nécessite le
développement de séparations chromatographiques de plus en plus performantes (10, 11).
L’utilisation de techniques de chromatographie
liquide multidimensionnelle est envisagée pour
la caractérisation de matrices biologiques très
complexes (12, 13) ces techniques requiert toutefois des compétences pointues.
La mise en œuvre de phases particulaires de
très petit diamètre, dites sub-2-micrométriques, constitue une solution d’intérêt pour analyser avec une résolution maximale des mélanges complexes de métabolites (14). Plusieurs
études ont montré que l’utilisation de l’UPLC®
(UltraPerformance LC, une technique due à la
société Waters) en métabolomique permettait
notamment de détecter un plus grand nombre
de métabolites, avec des rapports signal/bruit
améliorés facilitant l’intégration des pics mais
également l’interprétation des spectres (15).
Enfin, la miniaturisation des sources et plus particulièrement l’utilisation des sources nanospray
est une perspective intéressante, en particulier
pour les analyses en infusion directe (16).
L’électrophorèse capillaire constitue également
une technique pouvant présenter un intérêt en
métabolomique grâce à son importante capacité
séparative. Cependant, les temps de migration
ne sont souvent pas assez reproductibles pour
les besoins des études métabolomiques (5).
L’utilisation de sources MALDI a également été
envisagée, mais ce processus d’ionisation est généralement moins quantitatif pour les petites molécules que l’ionisation par electrospray (17).
III - Applications à la nutrition :
deux types d’approche
Compte tenu de la complémentarité des différentes techniques, la tendance actuelle est d’utiliser
une approche multi-plateformes, qui permet de
couvrir un domaine plus important de polarité,
structures chimiques et concentrations (5, 18, 19).
Deux principaux types d’approches sont envisagées en nutrition pour permettre l’analyse de fluides biologiques.
La première consiste en une approche de métabolomique non ciblée. Elle s’est révélée très
prometteuse notamment pour caractériser des
biomarqueurs de la consommation de phytomicronutriments, elle a également permis de mieux
comprendre leur métabolisme, leurs effets biologiques et le rôle qu’ils peuvent jouer dans la prévention nutritionnelle de pathologies comme le cancer et les maladies cardiovasculaires (20). Autre
exemple, une étude de Williams et al. portant sur
la caractérisation de profils plasmatiques de rats
obèses, ou non, illustre également la plus-value
associée à une approche multi-plateformes dans
le cadre de la caractérisation de biomarqueurs de
pathologies.
La seconde approche est quant-à elle plus ciblée,
elle a été plus particulièrement développée dans le
domaine de l’analyse des lipides. La « lipidomique »
a été définie comme « La caractérisation complète
des molécules lipidiques du vivant et leur organisation supramoléculaire, mais aussi la caractérisation
de leur rôle biologique propre ou via leur interaction
avec les protéines, aboutissant in fine à la régulation des gènes cibles » (21). La tendance actuelle est
de développer une méthode permettant l’analyse
simultanée des centaines de structures moléculaires composants l’extrait lipidique (22, 23). Cette
stratégie d’analyse globale inclut soit l’infusion directe de l’extrait lipidique dans le spectromètre de
masse, technique appelée « shotgun lipidomics »
ou la chromatographie liquide haute performance
couplée à la spectrométrie de masse.
IV - Limitations actuelles
et perspectives
1. Préparation d’échantillon
En nutrition, la variabilité des échantillons est
souvent plus forte que les changements induits
par les interventions nutritionnelles. Il est donc
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
particulièrement important de quantifier et minimiser la variabilité analytique. Les principales
sources de variations d’une étude humaine ont
été décrites par Maher et al. (24), elles incluent
la collecte d’échantillons, leur stockage et
pré- traitement, la stabilité instrumentale et les
variations intra et inter-individuelles. L’étude
menée par Bruce et al. (25) a décrit une méthode permettant d’évaluer un protocole métabolomique de l’étape de préparation d’échantillons jusqu’à celle de traitement des données.
Quoi qu’il en soit, si de nombreuses études
donnent des recommandations pour le traitement des échantillons biologiques, aucune procédure standardisée n’est encore disponible
2. Outils de traitement de données
et bioinformatique
De nombreuses difficultés sont aujourd’hui
liées au traitement des très importantes quantités de données générées. L’étape d’extraction
des différents chromatogrammes et spectres
est critique puisque les analyses statistiques
dépendent de la justesse de cette opération. De
nombreux logiciels d’extraction automatique
ont été développés, à la fois par les constructeurs sous des formats propriétaires et par des
équipes académiques sous forme de logiciels libres. Tous utilisent des algorithmes complexes
et parfois peu explicités, nécessitant l’optimisation de nombreux paramètres lors de chaque
utilisation. En effet, la variabilité induite par les
variations des temps de rétention, des valeurs
de masses, et d’intensité (notamment dues à
l’encrassement de la source) sont souvent la
cause d’un mauvais alignement des données et
de la présence d’ions dupliqués dans la matrice
des biomarqueurs, posant problème lors des
analyses statistiques.
3. Base de données et identification
des métabolites
L’identification des métabolites est certainement l’étape limitante de l’utilisation de la
spectrométrie de masse en métabolomique. La
principale raison est la grande diversité de molécules présentes dans les matrices biologiques.
Les mesures de masses exactes, en particulier
réalisées grâce à des spectromètres très haute
résolution, permettent la détermination de
formules brutes mais il existe de nombreuses
structures pour une même composition atomique. Des expériences de fragmentation MS/MS
faisant appel à la spectrométrie de masse en
tandem sont ensuite souvent appliquées afin
d’obtenir des informations structurales, mais
l’identification reste difficile souvent par manque de signal et de spécificité lors des fragmentations. Stoll et al. (26) ont développé une stratégie d’identification basée sur l’utilisation des
44
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ratios isotopiques afin de réduire le nombre de
formules brutes potentielles. Un algorithme
dérivé de sept règles heuristiques a été proposé
par Kind et Fiehn pour permettre la détermination d’une formule brute à partir d’un spectre
haute résolution (28).
Une approche complémentaire consiste à effectuer une identification au moyen de requêtes
automatisées dans des bases de données, telles que KEGG (http://www.genome.jp/kegg/),
à partir des masses exactes mesurées. Cependant, en fonction de l’espèce et du type de métabolisme étudié, ces bases peuvent se révéler
incomplètes.
Les bases de données les plus utiles à l’identification sont celles contenant des spectres de
masses de composés standard purs, comme
Metlin (http://metlin.scripps.edu), HMDB, ou
Mass bank (http://www.massbank.jp). Cependant, peu de composés sont aujourd’hui répertoriés et aucun standard n’a été encore établi
par la communauté internationale concernant
les conditions analytiques d’acquisition des
spectres, pour pouvoir réellement mutualiser
les différentes bases et couvrir la grande diversité des métabolites étudiés.
V - Conclusion
Nous avons assisté ces dernières années à une
évolution des méthodes utilisées dans le domaine de la biologie et les approches métabolomiques ouvrent des perspectives nouvelles
dans le domaine de la nutrition. Le développement rapide de la métabolomique n’est pas seulement lié au progrès des techniques d’analyse
mais également à l’utilisation d’outils bioinformatiques. Les nouveaux développements
visent en particulier une intégration des données obtenues à plusieurs niveaux d’investigation sub-cellulaires de manière à appréhender
les liens entre génotypes et phénotypes. Cependant, l’identification des métabolites reste
aujourd’hui le facteur limitant. La constitution
de bases de données en nutrition devrait faciliter l’interprétation biologique des jeux données obtenues. La plateforme d’exploration du
métabolisme de l’UMR 1019 INRA/Université
d’Auvergne participe à ce développement en
partenariat avec le Centre de Bioinformatique
de Bordeaux (CBIB, www.cbib.u-bordeaux2.fr) en
particulier dans le cadre de l’ANR Metaprofile.
L’objectif poursuivi est de structurer une base
de données en nutrition incluant non seulement
des données de métabolomique mais également
des données complémentaires de transcriptomique et de protéomique afin d’interroger et de
croiser les différents jeux de données et, ainsi,
obtenir l’ensemble des informations des gènes
aux métabolites.
Technologie appliquée
Nouvelles approches métabolomiques en nutrition,
apports et limites de la spectrométrie de masse
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