Chapitre 2.10.3.

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Chapitre 2.10.3.

CHAPITRE 2.10.3.
SALMONELLOSES
RÉSUMÉ
La salmonellose est une maladie infectieuse de l'homme et de l'animal dont sont responsables les
organismes de 2 espèces de Salmonella (Salmonella enterica et S. bongori). Bien que la bactérie soit
avant tout d'origine intestinale, les salmonelles diffusent largement dans l'environnement et sont
habituellement retrouvées dans les effluents d'élevage, les eaux usées d’origine humaine et au niveau
de matériels pouvant être sujet à une contamination fécale. Les salmonelles sont l'agent étiologique
d’infections diarrhéique et systémique chez l'homme, le plus souvent en tant que contaminant
secondaire d'aliment à partir de l'environnement, ou à partir de produits alimentaires provenant d'un
animal infecté. La salmonellose humaine est la plus fréquente et importante maladie zoonotique causée
par les salmonelles. Ce micro-organisme est aussi trouvé dans l'alimentation animale, entraînant des
maladies infectieuses chez l'animal, particulièrement chez les volailles et les porcs. La salmonellose a
été identifiée dans de nombreux pays, mais semble être plus fréquente dans les zones d'élevage
intensif, particulièrement de porcs et de vaches reproductrices et dans certains élevages de volaille en
confinement. Les reptiles sont aussi habituellement porteurs asymptomatiques de salmonelles. La
maladie peut atteindre toutes les espèces d'animaux domestiques ; les animaux jeunes et en gestation
ou lactation sont les plus sensibles. Les maladies entériques sont la manifestation la plus fréquente,
mais on peut observer une large variété de signes cliniques, tels qu’une septicémie aiguë, un
avortement, de l'arthrite et des signes respiratoires. Beaucoup d'animaux, en particulier, le porc et la
volaille peuvent être infectés mais sans montrer de signes cliniques. Ces animaux jouent un rôle
important dans la diffusion de l'infection entre les différents élevages et également en tant que source
de contamination des aliments et à l'origine de l'infection humaine.
La typhose et pullorose à S. pullorum, maladies des volailles causées par les salmonelles, sont
mentionnées dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre.
Identification de l'agent pathogène : Le diagnostic est basé sur l'isolement dans l'organisme à partir
soit de tissus prélevés aseptiquement lors de l’autopsie, soit de fèces ou d’échantillons prélevés par
écouvillonnage au niveau rectal, soit encore à partir de prélèvement réalisés sur le terrain, de produits
alimentaires ou destinés a l’alimentation animale. En cas d'infection des organes génitaux, lors
d’avortement ou au cours de la mise bas, il est nécessaire de mettre en culture le contenu stomacal du
fœtus, et des frottis placentaires et vaginaux. Dans le cas de volaille, il convient de mettre en culture
des œufs embryonnés.
Les salmonelles peuvent être isolées en utilisant des techniques variées, qui peuvent inclure un
pré-enrichissement pour revivifier les salmonelles moribondes, des milieux d'enrichissement contenant
des substances inhibitrices pour éliminer la flore compétitive, et des géloses pour l’isolement sélectif
afin de différencier les salmonelles des autres entérobactéries.
Divers tests biochimiques et sérologiques peuvent être appliqués sur une culture pure pour obtenir
confirmation de la souche isolée. Les salmonelles possèdent des antigènes de type somatique (O),
flagellaire (H) et de virulence (Vi), qui peuvent être mis en évidence par des sérums de typage, et le
sérovar peut être déterminé par référence à une formule antigénique du schéma de Kauffman-White.
De nombreux laboratoires envoient les isolats à un laboratoire de référence pour confirmer l'identité
sérologique complète et réaliser la détermination du lysotype et du génotype de la souche lorsque c'est
possible.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
1117
Chapitre 2.10.3. — Salmonelloses
Épreuves sérologiques : Des épreuves sérologiques peuvent être réalisées sur un échantillon
statistiquement représentatif de la population, mais sont de valeur limitée si la vaccination est
pratiquée. Chez les volailles, le test sur sang total est utilisé dans les élevages pour un diagnostic
rapide de S. Pullorum/Gallinarum, ce test étant relativement fiable dans certaines circonstances. Au
laboratoire, le test d'agglutination en tube est la méthode de choix pour les échantillons de toutes
espèces animales à des fins de diagnostic et d'exportation. Des épreuves immuno-enzymatiques sont
disponibles pour certains sérovars et peuvent être utilisées pour le diagnostic sérologique et la
surveillance, en particulier pour les élevages de volaille et de porc. La vaccination contribue à limiter la
valeur diagnostique des épreuves sérologiques.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
Plusieurs vaccins inactivés sont utilisés contre la salmonellose et des vaccins vivants sont
commercialement disponibles. Du fait de l'efficacité plutôt faible des vaccins inactivés, des adjuvants
huileux ou contenant des alhydrogels sont utilisés pour améliorer leurs propriété immunogènes. Les
données de terrain sur l'efficacité sont souvent manquantes, bien que les tests de laboratoire puissent
fournir des informations utiles. Des tests d'innocuité sont réalisés en animalerie et, dans le cas des
vaccins inactivés, des tests de stérilité utilisant des milieux de culture d'enrichissement sont réalisés.
D’autres précautions, tels que l'impact environnemental et la stabilité, sont nécessaires pour la
production de vaccins préparés par manipulation génétique. L'exclusion compétitive est utilisée pour
réduire l'infection salmonellique chez les volailles et dans d'autres espèces animales.
A. INTRODUCTION
La classification des salmonelles a été controversée pendant de nombreuses années. Selon la dernière
nomenclature, qui reflète les avancées récentes en taxonomie (33), le genre Salmonella comprend seulement
2 espèces : S. enterica and S. bongori (21, 32). Salmonella enterica est divisée en 6 sous-espèces, qui se distinguent
par certains caractères biochimiques et certains d'entre eux correspondent aux anciens sous-genres. Ces
sous-espèces sont :
•
•
•
•
•
•
Nomenclature ancienne
Sous-espèces I
=
Sous-espèces II
=
Sous-espèces IIIa =
Sous-espèces IIIb =
Sous-espèces IV
=
Sous-espèces VI
=
Nomenclature actuelle
Sous-espèces enterica
Sous-espèces salamae
Sous-espèces arizonae
Sous-espèces diarizonae
Sous-espèces houtenae
Sous-espèces indica
Pour le sérovar S. bongori, le symbole V a été retenu pour éviter toute confusion avec le nom de sérovar S. enterica
subsp. enterica. Les souches de Salmonella sont classées en sérovars sur la base de la diversité des antigènes (O)
des lipopolysaccharidiques (LPS) et des protéines flagellaires (H) en accord avec le schéma de Kauffmann-White ;
actuellement environ 2 500 sérovars sont reconnus (32, 33). Ce nombre est en croissance constante. Les sérovars
les plus fréquemment impliqués dans les infections humaine et animale appartiennent à la sous-espèce enterica. Les
sérovars des autres sous-espèces sont habituellement associés aux animaux à sang froid et à l'environnement, bien
que certains sérovars de S. arizonae and S. diarizonae aient été associés à des infections chez la dinde et le mouton.
Des noms ont été retenus seulement pour les sérovars appartenant à la sous-espèce enterica. Ces noms ne doivent
plus être écrits en italique. La première lettre est en capitale. Il n'est pas nécessaire d'indiquer le nom de sous-espèce
en pratique clinique, mais seulement le nom de sérovar de la sous-espèce enterica, par exemple, Typhimurium,
London ou Montevideo sont des sérovars de la sous-espèce enterica. En pratique, Le nom de Salmonella
Typhimurium peut être utilisé.
Dans ce chapitre, les abréviations des nouvelles conventions sont respectées, par exemple S. Typhimurium plutôt
que la nomenclature complète S. enterica, subsp. enterica sérovar Typhimurium.
Les salmonelloses sont des maladies infectieuses humaines ou animales dont deux espèces de Salmonella sont
responsables (Salmonella enterica et S. bongori). Bien que la bactérie soit avant tout d'origine intestinale, les
salmonelles diffusent largement dans l'environnement et sont habituellement retrouvées dans les effluents d'élevage,
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les eaux usées d’origine humaine et au niveau de matériels pouvant être sujet à une contamination fécale. La
salmonellose a été identifiée dans de nombreux pays, mais semble être plus fréquente dans les zones d'élevage
intensives, particulièrement dans les élevages de volaille et de porc.
La maladie peut atteindre toutes les espèces d'animaux domestiques ; les animaux jeunes et les femelles en
gestation sont les plus sensibles. La maladie entérique présentant souvent une diarrhée profuse aqueuse ou
sanglante avec hyperthermie est la manifestation clinique la plus fréquente, mais il est possible d'observer une large
variété de signes cliniques tels qu’une septicémie aiguë, des avortements, des arthrites, une nécrose des extrémités
et des signes respiratoires. Les signes et les lésions ne sont pas pathognomoniques. Beaucoup d'animaux,
particulièrement les volailles et les porcs peuvent aussi être infectés sans présenter de signes cliniques (46). Ces
animaux jouent un rôle important dans la diffusion de l'infection entre les différents élevages et également en tant que
source de toxi-infection alimentaire. Ces dernières apparaîtront lorsque ces animaux entreront dans la chaîne
alimentaire conduisant à des produits alimentaires contaminés (45, 46).
L'évolution de l'infection, les signes cliniques, les examens post mortem et les profils épidémiologiques varient selon
le sérovar et l'espèce animale atteinte. Certains sérovars n'affectent que certains hôtes, par exemple S. Gallinarum
pour les volailles ou S. Choleraesuis chez le porc, bien que la plupart des sérovars puissent être responsables
d'infections chez une grande variété d'espèces animales (37). Beaucoup de sérovars (incluant ceux adaptés à l'hôte)
ont été à l'origine de toxi-infections alimentaires chez l'homme, concomitantes de celles des animaux au préalable, les
vétérinaires et les personnels en abattoir peuvent être infectés directement au cours de leur travail, de même que le
personnel de laboratoire.
La maladie est couramment référencée comme une salmonellose, bien que le terme paratyphoïde puisse être
employé, comme par exemple, la paratyphoïde porcine. En volaille, les termes de pullorose ou diarrhée blanche
bacillaire et de typhose sont souvent utilisés pour décrire l'infection causée par S. Pullorum et S. Gallinarum,
respectivement (37). La typhose et la pullorose sont traitées en détails dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre.
Lors d’enquêtes épidémiologiques approfondies, l'identification de la souche est nécessaire et de telles enquêtes sont
classiquement basées sur les méthodes biochimiques et sérologiques, la lysotypie de certains sérovars et
l'antibiogramme. L'analyse génotypique de l'agent pathogène par des techniques d'empreintes moléculaire de l'ADN a
été utilisée avec de bons résultats ces dernières années. L'analyse des profils plasmidiques est une méthode rapide
et relativement facile pour typer les souches, et a été utilisée à la fois en médecine humaine et vétérinaire pour
étudier la diffusion des Salmonella. Cette technique a ses limites car toutes les souches de Salmonella ne portent pas
de plasmides, et les plasmides peuvent être facilement acquis ou être de taille identique bien que génétiquement
différents. D’autres méthodes génétiques, telles que l'électrophorèse en champ pulsé et le ribotypage ont été utilisées
en complément du profil plasmidique (25, 39). Le génotypage est un domaine qui s'est rapidement étendu et de
nombreuses nouvelles techniques ont été développées ces dernières années. Il importe de savoir qu'une seule
méthode ne fonctionne pas pour tous les isolats et qu'il peut être nécessaire d'évaluer un certain nombre de
techniques différentes pour trouver une méthode ou une combinaison de méthodes satisfaisantes et capables de
différencier les clones d'un sérovar ou d’un lysotype donné.
L'isolement et l'identification des salmonelles ne dépendent pas seulement de la qualité de l'échantillon, mais aussi
des milieux de culture et des caractéristiques de croissance du sérovar, en particulier pour ceux adaptés à une
espèce d'hôte. Une étude complète des infections à Salmonella chez l'animal domestique a été récemment publiée
(46).
Des mesures nationales ont été mises en place dans de nombreux pays de façon à contrôler les infections à
Salmonella chez l'animal afin de protéger le consommateur. La directive Zoonoses 92/117/CEE de l'Union
Européenne recommande la surveillance des élevages de plus de 250 animaux et des couvoirs pour S. Enteritidis et
S. Typhimurium (9). Les cultures à partir des litières des boîtes de transport des poulets et des poussins morts ou
réformés sont réalisées le jour de l'arrivée. Après 4 semaines et 2 semaines avant la ponte, un mélange de fèces
(jusqu'à 60 échantillons selon la taille de l'élevage) est mis en culture. Par la suite, les animaux adultes sont prélevés
toutes les 2 semaines. Au niveau des couvoirs, le meconium ou les embryons morts sont mis en culture toutes les
2 semaines. La surveillance sérologique est autorisée si les épreuves sérologiques peuvent offrir des garanties
équivalentes au système d'inspection dans les couvoirs et si la vaccination n'a pas été utilisée. Au Danemark, la
surveillance sérologique pour Salmonella est utilisée pour les élevages de porc et les élevages commerciaux de
ponte. Au moment où ce chapitre est écrit, la directive Zoonose est en cours de révision si bien que les conditions
d'échantillonnage pourraient être modifiées.
1119
Les infections à Salmonella des animaux de rente jouent un rôle important en santé publique et particulièrement en
ce qui concerne la sécurité des aliments, car les produits alimentaires sont considérés comme la principale source
des infections humaines à Salmonella (45). Des programmes spéciaux ont été mis en oeuvre pour la surveillance des
volailles, des porcs et des bovins incluant la surveillance des animaux sains porteurs asymptomatiques de la bactérie
Salmonella. Les contaminations croisées au cours de la transformation dans le secteur agro-alimentaire sont
également surveillées du fait qu’il peut exister une contamination à partir des manipulateurs sains (46).
La contamination de l’alimentation animale est une cause fréquente d’infection chez l’animal. Les produits pour
l‘alimentation animale tels que les repas à base de viande et d’os devraient être analysés pour la recherche de
salmonelles car les salmonelles responsables de la contamination des aliments pour animaux appartiennent à des
sérovars impliqués en santé publique (46).
Les échantillons d’alimentation humaine ou animale analysés pour la recherche de Salmonella devraient être
vraiment représentatifs. Des étapes appropriées devraient être mises en oeuvre pour prévenir les endommagements
survenant durant le transport ou le stockage (17, 18). En raison de la grande variété de produits alimentaires pour
l’homme et l’animal, il n’existe pas de méthode d’échantillonnage appropriée pour tous les produits. Cependant
différentes méthodes spécifiques au produit doivent être utilisées (10, 19).
L’Organisation mondiale de la santé (OMS) apporte des informations sur la mise en œuvre de mesures appropriées
pour la prévention et la maîtrise des maladies transmises par les aliments, incluant les infections à Salmonella chez
l’homme. Les oeufs et les ovoproduits, la viande de volaille et la viande des autres animaux de rente, ainsi que les
produits carnés sont le plus fréquemment impliqués dans la transmission de l’infection. Salmonella Enteritidis et
S. Typhimurium sont les sérovars les plus largement identifiés dans les pays européens alors que S. Typhimurium est
le sérovar dominant dans l’Amérique du Nord (45).
Une maîtrise réglementaire de Salmonella dans un but de santé publique devrait couvrir toutes les étapes de « la
fourche à la fourchette » ou de « l’étable à la table ». Cela inclut l’obligation de déclarer tous les foyers épidémiques
de la maladie (12), et de tester l’alimentation animale (46). La surveillance de l’alimentation animale comprend
également les composants de l’alimentation et les matières premières d’origine animale de même que
l’échantillonnage durant la fabrication des produits destinés à l’alimentation animale. Des enquêtes épidémiologiques
à l’échelle mondiale devraient être faites pour surveiller la transmission des Salmonella et encourager les contrôles
réglementaires de Salmonella.
Les contrôles sanitaires à l’abattoir sont essentiels et des précautions spéciales devraient être appliquées quand
l’abattage concerne des troupeaux infectés. Des mesures de décontamination devraient être mises en place tout au
long de l’opération.
Un autre élément essentiel dans la prophylaxie de la salmonellose humaine est l’éducation du consommateur, en
particulier l’attention portée à la manipulation et au stockage des aliments, l’hygiène des cuisines et une cuisson
appropriée pour limiter le risque d’infection.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
La fréquence d’échantillonnage et le type d’échantillons obtenus dépendront largement des investigations cliniques,
des équipements du laboratoire, des données épidémiologiques et des objectifs.
Des échantillons individuels sont collectés le plus aseptiquement possible pour des tests bactériologiques et avant
que tout traitement antibiotique ait été commencé. Les échantillons sont collectés préférablement durant la phase
aiguë de la maladie ou le plus prêt possible après le décès. Dans le cas d’élevage intensif des troupeaux de volaille,
des échantillons d’environnement prélevés sur le sol tels que la litière, la poussière ou des prélèvements réalisés sur
les bottes à l’aide d’un écouvillon (4), peuvent être le meilleur moyen efficace d’identifier les troupeaux infectés. Des
précautions doivent être prises pour éviter les contaminations croisées des échantillons durant leur attente et au
laboratoire. Les emballages doivent être gardés au froid et accompagnés d’informations adéquates. Pour les espèces
animales plus petites, il est préférable de transmettre un nombre représentatif de malades ou d’animaux récemment
décédés au laboratoire si c’est possible (44). Des sérovars adaptés à l’hôte sont plus difficiles à isoler à partir de
fèces, et si ces derniers sont suspectés, des tissus infectés devront être mis en culture dans la mesure où cela est
possible.
1120
Une attention particulière doit être portée à l’isolement de salmonelles à partir d’animaux présentant une infection
sub-clinique, du fait que ceux-ci peuvent excréter la bactérie de façon intermittente et en faible nombre.
L’augmentation de la taille de l’échantillon, du nombre d’échantillons représentant plus d’individus associée au
poolage des échantillons et à un échantillonnage répété peuvent augmenter la sensibilité du diagnostic. Dans de
telles situations, les méthodes bactériologiques ou sérologiques devraient être utilisées pour identifier un troupeau
infecté plutôt que pour identifier un animal infecté individuellement.
•
Culture
De nombreuses méthodes sont largement utilisées à travers le monde pour l’isolement de Salmonella (8, 13, 16, 23,
34, 44). Celles qui sont les plus communes sont décrites ci-dessous. Tous les milieux de culture préparés doivent
subir un contrôle de qualité et doivent permettre la croissance du micro-organisme recherché à partir d’un inoculum
faible. Une souche de référence doit être cultivée en parallèle avec l’échantillon à étudier de façon à vérifier que les
tests fonctionnent correctement.
a)
Milieux de préenrichissement
Le nombre de salmonelles dans les fèces d’un animal asymptomatique, dans les échantillons d’environnement,
dans les produits d’alimentation animale ou humaine est très souvent faible, et il est nécessaire d’utiliser des
milieux d’enrichissement tels que l’eau peptonnée tamponnée, ou le bouillon universel de pré-enrichissement
pour permettre l’isolement. Ceci permet aux faibles nombres de salmonelles, qui autrement auraient été tuées
par les effets toxiques des milieux d’enrichissement, de se multiplier, ou cela peut aider à revivifier des
salmonelles qui ont été stressées par des traitements au froid, à la chaleur, à une exposition aux biocides ou par
la dessiccation. Le pré-enrichissement peut ne pas être la meilleure méthode pour l’isolement des souches de
Salmonella moins vigoureuses, telles que celles adaptées à un hôte, à partir des fèces du fait d’une croissance
importante de la flore compétitive durant la phase de pré-enrichissement non sélective.
b)
Milieux d’enrichissement
Les milieux d’enrichissement sont des milieux liquides ou gélosés semi-solides qui contiennent des additifs qui
permettent sélectivement la croissance de salmonelles alors que la croissance des autres bactéries est inhibée.
Néanmoins, certains peuvent être toxiques pour certains sérovars de Salmonella, comme par exemple, le
sélénite qui inhibe S. Choleraesuis ou le vert brillant qui est toxique pour beaucoup de souches de S. Dublin.
Des températures élevées ont aussi été utilisées pour augmenter la sélectivité du milieu d’enrichissement, et
une température de 43°C est utilisée dans certains laboratoires, bien que cela puisse être inhibiteur avec
certains milieux, par exemple, le tétrathionate et le Rappaport-Vassiliadis inhibe les souches sensibles à la
température, particulièrement S. Dublin, et une température de 41,5°C est maintenant recommandée pour
l’incubation du bouillon Rappaport-Vassiliadis. L’enrichissement sélectif par mobilité peut être aussi utilisé pour
augmenter la sensibilité d’isolement de Salmonella et un milieu d’enrichissement semi-solide comme par
exemple le milieu Rappaport-Vassiliadis semi-solide ou le Diagnostic Semi-Solid Salmonella medium
(DIASALM), peut permettre une sensibilité plus grande (42). La formulation du milieu, la température et le temps
d’incubation et le volume des échantillons utilisés pour ensemencer le milieu peuvent concourir à améliorer le
taux d’isolement et ces paramètres doivent toujours être pris en compte. Des exemples de milieu sélectif
d’enrichissement sont le tétrathionate de sodium comme le bouillon Muller-Kauffman, le sélénite F, le sélénite
cystéine, le bouillon vert brillant et les bouillons Rappaport-Vassiliadis ou le milieu Rappaport-Vassiliadis
semi-solide. Du Ferrioxamine E peut aussi être ajouté aux milieux sélectifs pour améliorer l’isolement de
Salmonella à partir de fer ou d’échantillons peu nutritifs tels que les oeufs, l’eau ou le sol (34).
c)
Milieux d’isolement sélectif
Il existe des géloses sélectives solides qui permettent la croissance différentielle à des degrés variables. Ils
inhibent la croissance des autres bactéries que Salmonella et donnent des informations sur les principales
caractéristiques biochimiques différentielles - habituellement l’absence de fermentation du lactose et la
production de sulfate d’hydrogène (H2S). Les résultats sont lus après 24 et 48 h d’incubation à 37°C. Les
salmonelles forment des colonies caractéristiques sur de tels milieux qui sont habituellement distinguables des
autres bactéries de la boîte, avec certaines exceptions pour Proteus, Pseudomonas et Citrobacter. Les
salmonelles fermentant le lactose peuvent parfois être isolées et la production d’H2S peut être variable. De telles
souches atypiques peuvent être plus facilement détectées quand un milieu sélectif semi-solide est utilisé. Le
milieu DIASALM est particulièrement utile dans ce cas. La confirmation par agglutination sur lame en utilisant
des antisérums polyvalents O ou H ou des antisérums spécifiques peut être réalisée sur la zone de croissance
liquide de la boîte. Salmonella Abortusovis est un sérovar à croissance lente et il est fréquent d’incuber les boîte
jusqu’à 72 h et d’utiliser des géloses au sang non sélectives. Des exemples de milieux sélectifs sont la gélose
1121
au vert brillant, la gélose au xylose lysine désoxycholate, la gélose au déoxycholate/citrate, la gélose Rambach,
et la gélose au sulfate de bismuth, et bien d’autres encore peuvent être identifiées dans la littérature et les
catalogues de milieux de cultures.
•
Identification des colonies suspectes (caractéristiques)
Les colonies suspectes sont mises en culture sur des géloses sélectives et non sélectives pour s’assurer l’absence
de contaminants tels que Proteus spp. En présence d’une culture pure abondante, les colonies suspectes peuvent
être testées par agglutination sur lame à l’aide de sérums polyvalents pour le typage des Salmonella (22, 32). Dans
certains cas, la colonie suspecte peut ne pas donner d’agglutination et il est nécessaire d’utiliser des tests
biochimiques pour confirmer l’identité. Ces tests peuvent être réalisés en eau peptonnée additionnée de sucres ou à
l’aide de systèmes commerciaux (tels que le système API (Analytical Profile Index) ou des milieux composés (tel que
la gélose TSI [Triple Sugar Iron]) peuvent être utilisés pour l’identification des micro-organismes (11).
La détermination des facteurs antigéniques O et H, et dans certains cas de l’antigène Vi, est réalisée par agglutination
directe sur lame ou par agglutination en tube en utilisant des antisérums spécifiques. En cas de micro-organisme
biphasique, il est nécessaire de déterminer les 2 phases par inversion de phase - cela entraîne un passage en gélose
semi-solide contenant l’antisérum correspondent à la phase connue. L’orientation est facilitée par la disponibilité
d’antisérums dirigés contre plusieurs facteurs, qui peut ensuite être poursuivie par l’utilisation de sérums de typage
monovalent. Bien que la plupart des laboratoires peuvent identifier les sérotypes les plus fréquents, il est nécessaire
d’avoir recours à un Laboratoire de référence pour confirmer l’identité d’un isolat et lorsque cela est possible pour
obtenir une information sur le lysotype, si un schéma est disponible, et le profil génétique.
Des tests biochimiques additionnels peuvent être nécessaires pour identifier certains variants de sérotype, par
exemple le d-tartrate qui permet de différencier S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Les isolats peuvent aussi
être testés pour leur sensibilité aux antibiotiques.
•
Méthodes d’identification immunologiques et moléculaires
De nombreuse méthodes alternative sont utilisées et commercialement disponibles (3, 5, 7, 27, 35, 36, 38, 40, 47).
Elles comprennent des méthodes basées sur la conductance et l’impédancemétrie, sur la séparation
immuno-magnétique, sur les techniques de type immuno-enzymatique (ELISA), sur des sondes géniques pour
réaliser une amplification en chaîne par polymérase (PCR) incluant l’amplification de séquences nucléiques (NASBA)
(15). Plusieurs de ces méthodes n’ont pas été validées sur des échantillons fécaux ou prélevés dans l’environnement
et, en outre, elles sont plus adaptées à l’analyse des échantillons alimentaires destinés à l’alimentation humaine
(31). Les méthodes rapides sont souvent plus coûteuses que la méthode bactériologique conventionnelle, mais
peuvent être économiquement intéressantes pour le tri d’échantillons lorsqu’il existe une faible prévalence de
contamination ou lorsque les produits tels que les produits pour l’alimentation animale sont attendus être négatifs au
test. Actuellement, aucune méthode rapide n’est capable de réaliser une détection directe des Salmonella, si bien que
des étapes d’enrichissement sélectif ou non sélectif sont nécessaires (29). Ceci entraîne plus d’étapes et nécessite
du temps dans la procédure de détection. Pour les méthodes basées sur la détection de l’ADN, l’inhibition de la
réaction PCR par des éléments de la matrice présents dans l’échantillon pose problème et nécessite des extractions
d’ADN adaptées (20). Des méthodologies rapides d’isolement peuvent être liées à des systèmes sophistiqués de
détection, telles que les biosensors (30). Il y a beaucoup de variations et de développements de méthodes rapides
pour la détection des Salmonella mais aucune n’a montré de façon satisfaisante qu’elle pouvait remplacer la culture
de l’échantillon vétérinaire dans toutes les circonstances. C’est pourquoi il n’est pas possible de détailler toutes les
méthodes dans ce chapitre ou de faire des recommandations, mais les articles cités ci-dessus donneront de plus
amples informations. Les recherches sur internet sont aussi une source utile d’information. Des efforts sont
actuellement en cours pour standardiser l’utilisation de certaines méthodes rapides au niveau international (24), mais
il reste encore un travail considérable à faire.
•
Exemple de procédures pour l‘isolement Salmonella à partir de produits alimentaires pour
l’homme et l’animal, d’échantillons fécaux et de l’environnement
i)
Ajouter 10 à 25 g d’échantillon à ×10 volumes d’eau peptonnée tamponnée à température ambiante.
(NB : pour de nombreux sérovars adaptés à l’hôte et pour certains sérovars arizonae, il est préférable
d’ajouter à l’échantillon le milieu sélectif d’enrichissement tel que le bouillon sélénite cystéine, et de tester
des échantillons de tissus si cela est possible [incluant l’isolement direct] ; voir la méthode de culture pour
S. Pullorum/Gallinarum dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre).
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ii)
Incuber l’eau peptonnée tamponnée à 37°C pendant 16 à 20 h ;
iii)
Ensemencer 20 ml de Rappaport-Vassiliadis modifié semi-solide ou DIASALM dans une boîte de Petri
avec 0,2 ml du bouillon d’eau peptonnée tamponnée incubée ;
iv)
Ensemencer 10 ml de bouillon tétrathionate avec 1 ml de bouillon d’eau peptonnée tamponnée incubée ;
v)
Incuber les bouillons Rappaport-Vassiliadis modifié semi-solide ou DIASALM à 41,5°C et tétrathionate à
37°C (s’assurer que la marque du tétrathionate est adaptée pour une utilisation à 37°C) ;
vi)
Après 24 et 48 h d’enrichissement sélectif, isoler le Rappaport-Vassiliadis modifié semi-solide ou DIASALM
en prenant à l’aide d’une anse 1 µl de produit à partir de la périphérie de la zone de croissance et isoler en
stries une boîte de gélose Rambach ou de gélose au vert brillant et une boîte de gélose xylose lysine
desoxycholate additionnée de novobiocine ;
vii)
Isoler 10 µl du bouillon tétrathionate sur une gélose Rambach ou une gélose au vert brillant et sur une
gélose xylose lysine desoxycholate additionnée de novobiocine ;
viii) Incuber les boîtes à 37°C pendant 24 h ;
ix)
Vérifier jusqu’à 5 colonies suspectes (rouge/rose avec un rougissement du milieu sur la gélose au vert
brillant, cramoisi avec les bords pâles ou orange/transparentes sur la gélose Rambach, rouge avec un
centre noir xylose lysine desoxycholate) en utilisant les sérums poly « O » et poly « H » (phase 1 et
phase 2) ou des milieux biochimiques composés ;
x)
Une culture de colonies hautement suspectes qui ne donnent pas de réactions d’agglutination avec les
antisérums poly « H »sur des milieux non sélectifs doit être re-testée. Si une agglutination franche avec les
poly « O » et poly « H » peut être obtenue, ceci est suffisant pour une confirmation présomptive. De tels
isolats peuvent ensuite être sérogrouper. Si le résultat de l’agglutination n’est pas clair, il faut procéder aux
tests biochimiques en utilisant les milieux composés tels que le TSI ou les tests ONPG (o-nitrophenyl-betad-galactopyranoside) et de l’urée ou des tests biochimiques commerciaux tels que la galerie API ID 32 E.
2.
Épreuves sérologiques
•
Identification sérologique des animaux, élevages et troupeaux infecté
Un certain nombre d’épreuves sérologiques ont été développés pour le diagnostic d’infection à Salmonella chez
l’animal. En volaille, le test sur sang total, qui utilise un antigène coloré, et le test d’agglutination du sérum SAT
(Serum Agglutination Test) ont été utilisés avec succès depuis plus de 50 ans pour l’identification des élevages
infectés par S. Pullorum/Gallinarum. Du fait que S. Enteritidis possède le même groupe antigénique somatique D que
S. Pullorum/Gallinarum, le test sur sang total et les tests reliés peuvent être utilisés pour le diagnostic de l’infection
mais la sensibilité est faible. Plus récemment, d’autres tests tels que les ELISA (2, 41) ont été développés pour le
diagnostic d’infections à S. Enteritidis et à S. Typhimurium en volaille et pour d’autres sérovars pour les animaux
d’élevage. Les tests ELISA ont été utilisés efficacement pour identifier les bovins sérologiquement porteurs de
S. Dublin et peuvent être appliqués au lait de mélange pour le dépistage dans les élevages laitiers. Le mix-ELISA est
utilisé au Danemark sur le sérum ou le liquide provenant des échantillons de muscle congelés qui sont décongelés
pour détecter les infections à Salmonella chez le porc (26). Un test similaire est utilisé pour la détection d’anticorps
dirigés contre S. Enteritidis et S. Typhimurium dans le jaune d’œuf à partir des élevages commerciaux de poules
pondeuses (12).
Certains tests ELISA sont maintenant utilisés en routine et un certain nombre sont commercialement disponibles.
L’objectif de cette section est de prendre en considération les épreuves sérologiques qui ont été pleinement évaluées
et utilisées en routine pour le diagnostic d’une salmonellose chez l’animal. D’autres épreuves qui sont encore au
stade du développement ne seront pas examinées. De nouvelles épreuves sont fréquemment développées pour le
diagnostic à Salmonella, une recherche sur internet est souvent le meilleur moyen d’obtenir des informations
actualisées.
•
Facteurs impliqués dans le diagnostic sérologique
1.
Des méthodes sérologiques peuvent être utilisées pour identifier un élevage/troupeau infecté plutôt que
d’identifier individuellement un animal infecté, bien que des tests répétés puissent être utilisés en élevage
comme une aide dans l’élimination sélective des animaux porteurs chroniques. Des épreuves sérologiques sont
habituellement connues pour détecter un nombre limité de sérovars ou de sérogroupes de Salmonella.
1123
2.
Il est maintenant bien reconnu que certains animaux présentant une réponse positive peuvent ne plus être
infectés avec le micro-organisme Salmonella. De même et à l’inverse, des animaux qui sont excréteurs actifs de
salmonelles, peuvent être sérologiquement négatifs. Des observations similaires peuvent aussi être appliquées
aux méthodes de cultures bactériologiques, et des résultats négatifs de culture de fèces peuvent ne pas signifier
automatiquement que l’animal n’est pas infecté. Néanmoins, aucune de ces situations ne doit être considérée
comme un problème majeur si suffisamment de tests sont réalisés. Des animaux qui sont sérologiquement
positifs peuvent avoir cessés d’excréter des salmonelles bien que des taux élevés d’immunoglobulines puissent
circuler. D’autres animaux de l’élevage peuvent être encore infectés. Des animaux sérologiquement négatifs
peuvent être la conséquence d’une infection récente avec une excrétion avant la production maximale
d’immunoglobulines ou d’infection avec des sérotypes moins invasifs. Des animaux infectés récemment
devraient, en toute probabilité, être détectés sérologiquement par un programme de surveillance approprié
durant toute la durée de vie de l’élevage/troupeau.
3.
Les animaux nouveau-nés sont immunologiquement immatures et ne répondent pas sérologiquement au LPS
de l’antigène somatique jusqu’à l’âge de 2 à 3 semaines. Ils doivent, néanmoins, produire une réponse
sérologique à la protéine de l’antigène flagellaire. Les bovins peuvent ne pas donner de réponse jusqu’à l’âge de
10 à 12 semaines.
Les poulets peuvent aussi acquérir des anticorps anti-Salmonella passivement à partir des parents par
l’intermédiaire de la vésicule ombilicale ; cela peut signifier un élevage de parentaux infectés. Les mammifères
peuvent acquérir les anticorps maternels par le colostrum.
4.
Suite à une infection à Salmonella, le taux d’immunoglobulines peut se maintenir élevé pendant 2 à 3 mois. Une
réponse à IgM indique une infection récente.
5.
L’immunisation a été utilisée depuis de nombreuses années pour contrôler l’infection à Salmonella dans les
élevages, et si le diagnostic sérologique est utilisé, il est nécessaire de différencier la réponse vaccinale d’une
infection en cours. Beaucoup de vaccins vivants par voie orale ne donnent pas de réponse significative en
anticorps.
6.
Les effets de l’antibiothérapie sur la réponse sérologique restent peu clairs. Certains travaux ont trouvés des
titres diminués suite à une thérapie, alors que d’autres ne trouvent aucun effet. La sérologie peut néanmoins
être une technique de diagnostic de salmonellose plus utile que la bactériologie si l’antibiothérapie a été utilisée.
7.
Il existe approximativement 2 500 sérovars différents de Salmonella. En fonction de l’antigène et du test utilisé,
des réactions sérologiques croisées entre différent sérovars peuvent se produire, par exemple entre
S. Typhimurium and S. Enteritidis.
8.
Chez les volailles, la recherche d’immunoglobulines à Salmonella peut être réalisée sur le jaune d’oeuf et les
œufs peuvent fournir une méthode pour le dépistage chez les troupeaux. Cette approche est utilisée pour la
surveillance des élevages de poules pondeuses au Danemark. Chez les bovins, les anticorps anti-Salmonella
peuvent être recherchés dans le lait afin de réaliser un dépistage quotidien parmi le troupeau.
9.
L’emploi de disques de papier filtre pour la collection de sérums élimine la nécessité de séparer le sérum. Les
disques fournissent une conservation à long terme et diminue le coût du transport au laboratoire. La sensibilité
du test peut être légèrement diminuée comparée aux tests effectués sur des sérums frais.
a)
Test sur sang total
Le test sur sang total fourni un test rapide de détection de la typhoïde aviaire et de l’infection à pullorum qui peut
être mis en œuvre à la ferme. La sensibilité du test sur sang total est faible et des résultats faux positifs et faux
négatifs liés à l’inexpérience peuvent survenir.
Une description détaillée du test sur sang total est donnée dans le Chapitre 2.7.5. concernant la typhoïde aviaire
et l’infection à Pullorum.
b)
Test rapide d’agglutination sur lame
Le sérum (0,02 ml) est mélangé avec un antigène polyvalent coloré au cristal violet (0,02 ml). Le mélange est
doucement agité pendant 2 min, après cela le test est lu. Les réactifs du test sont gardés à 4°C doivent être
remis à température ambiante avant d’être utilisés.
1124
Les sérums à tester doivent être exempts de contamination ou d’hémolyse. Il peut être utile de réaliser une
centrifugation des échantillons qui ont été conservés pendant un certain temps.
Si des réactions faussement positives non spécifiques sont redoutées, les sérums suspects positifs doivent être
re-testés après un traitement à la chaleur à 56°C pendant 30 min.
c)
Test d’agglutination du sérum
Le SAT est relativement peu sensible et beaucoup d’animaux âgés ont des niveaux faibles d’agglutinines dans
leur sérum dus aux entérobactéries autre que Salmonella. Les échantillons individuels analysés ont peu de
valeur hormis pour effectuer un dépistage dans l’élevage ou pour faire un tri préliminaire. Pour confirmer une
infection en cours, il est nécessaire d’analyser les échantillons en double. Le test est relativement peu coûteux ;
les antigènes peuvent être préparés facilement et il n’est pas nécessaire de disposer d’équipement coûteux. Le
SAT peut être adapté au format des microplaques et peut être facilement utilisé pour déterminer les titres
somatiques et flagellaires. Il est conseillé de disposer de sérums standards pour le contrôle qualité de(s) la
préparation(s) d’antigènes du SAT.
•
Préparation des antigènes somatiques
i)
Isoler une culture de Salmonella à partir d’une culture appropriée sur une gélose au sang (BAB) ou un
autre milieu adapté, pour la croissance de colonies isolée. Incuber toute la nuit à 37°C (±2°C) ;
ii)
Sélectionner une colonie régulière et réaliser une agglutination sur lame de façon à vérifier que l’antigène
somatique visé est présent ;
iii)
Inoculer la pente d’une gélose nutritive à l’aide d’une anse stérile à partir de la colonie sélectionnée.
iv)
incuber la culture pendant 8 à 12 h à 37°C (±2°C) ;
v)
Laver la culture à l’aide d’une pipette Pasteur, de préférence à l’intérieur d’un espace sécurisé avec
approximativement 2 ml d’alcool absolu et transférer dans un récipient universel stérile ;
vi)
Laisser l’antigène pendant 4 à 6 h à température ambiante pour permettre à l’alcool de tuer les bactéries et
de détacher les flagelles.
vii)
Centrifuger le récipient universel à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 1 000 g.
Eliminer le liquide et ajouter suffisamment de sel de phénol pour obtenir une opacité d’antigène équivalente
au tube de Brown No. 2 (approximativement 108 colonies formant unité/ml) ou à un autre standard
approprié ;
viii) Réaliser le titrage standard avec un sérum connu pour s’assurer que l’antigène correspond au facteur
souhaité ;
ix)
Garder au froid à 4°C jusqu’à l’utilisation.
•
Préparation des antigènes flagellaires
i)
Isoler une culture de Salmonella à partir d’une culture appropriée sur une gélose au sang (BAB) ou un
autre milieu adapté, pour la croissance de colonies isolées. Incuber toute la nuit à 37°C (±2°C) ;
ii)
Réaliser un passage en gélose semi-solide (à approximativement 0,3 %) dans un tube de Craigie, ou un
autre récipient adapté pour induire une expression optimale des antigènes flagellaires visés. Si le sérovar
est biphasique, un antisérum H correspondant à la phase que l’on souhaite supprimer est ajouté à la
gélose ;
iii)
Utiliser l’agglutination sur lame pour vérifier que la salmonelle est dans la phase souhaitée. Si cela est
correct, inoculer une anse de culture dans 20 ml de bouillon nutritif. Incuber pendant 12 à 18 h à 37°C
(±2°C) pour une croissance optimale (si la phase est incorrecte, refaire un passage sur gélose
semi-solide) ;
iv)
Pipetter 250 µl de 40 % formol dans la suspension antigénique (utiliser des gants et travailler de préférence
en poste de sécurité), et laisser une nuit ;
v)
Tester l’antigène par le SAT en utilisant un sérum test approprié ;
1125
d)
•
Protocole
i)
Il est plus facile de tester les sérums à une dilution de 1/20 ; 0,25 ml d’antigène est additionné à 0,25 ml de
sérum pré-dilué au 1/10 dans une solution saline ;
ii)
Les échantillons sont incubés au bain Marie à 50°C pendant 24 h dans le cas des antigènes somatiques et
pendant 4 h pour les antigènes flagellaires. La dilution et le temps d’incubation peuvent varier selon les
antisérums utilisés ;
iii)
Les sérums donnant une réaction positive sont dilués au 1/20 jusqu’au 1/320 et retestés avec les antigènes
appropriés.
Méthodes immuno-enzymatiques pour Salmonella Enteritidis
Deux principaux types de méthodes existent pour la détection des IgG (IgY) spécifiques de S. Enteritidis :
l’ELISA indirect (2) et la méthode ELISA compétitive de type « sandwich » (41).
Le test ELISA indirect comprend l’utilisation d’un antigène de détection fixé sur les puits de la microplaque.
Après l’application d’un réactif de blocage de la réaction pour réduire la fixation non spécifique, les échantillons à
tester sont introduits dans les puits. Un lien spécifique à l’anticorps de l’échantillon est détecté par l’addition d’un
anticorps couplé à un conjugué enzymatique. Différents antigènes comprenant le LPS, les flagelles, les fimbriae
SEF14, les protéines de la membrane externe et des préparations d’extrait d’antigènes cellulaires ont été
utilisés.
La méthode ELISA de compétition de type sandwich utilise un réactif spécifique – un anticorps monoclonal
(AcM) ou polyclonal – pour la fixation de l’antigène aux puits. Ceci est suivi par une préparation d’antigène
purifiée ou non. Les échantillons sont testés suivi de l’addition d’un anticorps conjugué, qui ne se fixera pas à
l’antigène si l’échantillon contient les anticorps spécifiques. La durée de l’essai peut être raccourcie en ajoutant
ensemble l’échantillon à tester et le conjugué. Les AcMs ont été préparés pour le LPS, les flagelles et le
SEF14 de S. Enteritidis.
Les 2 systèmes présentent des avantages et des inconvénients. L’essai indirect est plus simple et les réactifs
sont disponibles pour tous les sérotypes de Salmonella provenant de poulet, dinde, canard et de mammifères.
L’ELISA de compétition peut être appliqué à toutes les espèces animales et il montre, en général, une spécificité
plus importante. Quoiqu’il en soit, les réactifs ne sont pas commercialement disponibles pour tous les sérotypes.
Il y a aussi des problèmes d’affinité et il peut être moins sensible que le test indirect. En pratique, les 2 systèmes
ont montré des réactions faussement positives et dans certains cas le tri avec un test ELISA indirect sur le LPS
peut être suivi d’une confirmation avec un ELISA de compétition sur les flagelles.
Les méthodes peuvent être utilisées avec du sérum, du jaune d’oeuf ou du sang séché reconstitué à partir de
disque de papier filtrer. Un ELISA mixte (ou ELISA sur jus de viande) est utilisé au Danemark pour détecter
l’infection chez le porc (28). Cet ELISA contient les antigènes LPS « O » 1, 4, 5, 6, 7 et 12, de S. Typhimurium et
de S. Choleraesuis, qui rend ce test capable de détecter sérologiquement plus de 95 % des sérogroupes de
Salmonella trouvés chez les porcs danois. Le sérum est utilisé pour effectuer un dépistage dans les élevages de
multiplication et les troupeaux reproducteurs alors qu’à l’abattoir, le test est réalisé sur le liquide tissulaire (jus de
viande) qui est libéré lorsque 10 g d’un échantillon de muscle congelé est décongelé.
Avec certains ELISAs, une différenciation peut être faite entre les infections produites par des sérotypes de
Salmonella appartenant à différents sérogroupes. Certaines réactions croisées peuvent se produire entre les
groupes B et D et d’autres sérovars invasifs. Néanmoins, il y a habituellement une réponse sérologique plus
grande lorsque le LPS d’un sérotype homologue est utilisé dans le test ELISA. La méthode optimale pour choisir
le seuil de la valeur d’absorbance, au delà de laquelle les sérums sont considérés comme provenant d’un
troupeau infecté à S. Enteritidis sans produire des taux inacceptables de faux positifs, n’a pas encore été fixée
par un accord international.
Les ELISAs sont facilement adaptables à l’automatisation et par conséquent à des programmes de contrôle à
grande échelle. Un problème majeur est l’équipement coûteux nécessaire et beaucoup de réactifs sont aussi
très coûteux. Plusieurs trousses de diagnostic ELISA pour S. Enteritidis, S. Typhimurium et un ELISA mixte pour
le groupe B/C sont commercialement disponibles. Ils devraient idéalement être validés par des essais circulaires
internationaux avant d’être adoptés à des fins de surveillance.
1126
Un exemple d’ELISA validé est celui développé au Laboratoire de référence de l’OIE au VLA de Weybridge (voir
Tableau dans la partie 3 de ce Manuel terrestre pour l’adresse). Les exigences sont mentionnées ci dessous.
•
Équipement
Plaques en PVC de type Falcon microtest III ; des pipettes adaptées et des éprouvettes ; laveur de plaques ;
lecteur de plaques ELISA ; filtre pour le test à 405-410 nm et filtre de référence à 630 nm.
•
Antigène
i)
L’extrait au phénol de LPS de S. Enteritidis est commercialement disponible (Sigma Cat. No. L6011).
Celui-ci est reconstitué avec 1 ml d’eau désionisée et conservé à –20°C dans 100 µl en aliquots dans une
solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, à une concentration de 2,5 mg/ml. Lors de
l’utilisation, l’antigène sera décongelé dans le tampon de fixation à la concentration appropriée ;
ii)
L’antigène LPS peut aussi être préparé par la technique de Westphal & Luderitz (43) et standardisé pour
sa concentration en carbohydrate, selon la méthode de Gerhardt (14), et ajusté à 1 000 µg/ml.
•
Diluant du sérum et du conjugué
Ajouter la sérumalbumine bovine (BSA) (2 g) et le Tween 20 (0,05 ml) au PBS (100 ml) (alternativement, la
poudre de lait [1 g] peut remplacer le BSA). Conserver à 4°C et faire une solution fraîche toutes les semaines.
Tampon de fixation : ajouter du carbonate de sodium (1,59 g) et du bicarbonate de sodium (2,93 g) à l’eau
désionisée (1 litre) et ajuster au pH 9,6 (alternativement, dissoudre un comprimé de 0,05 M Sigma de tampon
carbonate/bicarbonate [Cat. No. C-3041] dans l’eau désionisée [100 ml]). Conserver à 4°C et renouveler toutes
les 2 semaines.
Tampon du substrat : faire une solution de diéthanolamine à 10 % dans l’eau désionnisée. Le diethanolamine
doit être préchauffé à 37°C avant de l’utiliser et le pH de la solution doit être ajusté à pH 9,8 avec 1 M d’acide
hydrochlorique. Conserver à 4°C et renouveller toutes les 2 semaines.
Conjugué enzymatique : immunoglobulines anti-poulet de chèvre conjuguées à la phosphatase alcaline (par
exemple ICN Immunobiologicals, fournisseur alternatif Sigma: A9171) ou globulines anti-poulet d’autres
espèces. Conserver à 4°C dilué dans le diluant à une concentration appropriée et renouveler chaque semaine.
Substrat enzymatique : Dissoudre un comprimé de phosphate disodique de p-nitrophényl (5 mg) dans le tampon
du substrat (5 ml) pas plus de 30 min avant la répartition et conserver à l’obscurité.
•
Standards
i)
Les antisérums témoins positifs sont préparés par inoculation intramusculaire de 4 poulets âgés de
1 semaine et exempts d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS) avec un inoculum contenant
106 S. Enteritidis. Le sérum est alors obtenu 3 à 4 semaines plus tard quand les titres sont maximaux ;
ii)
Le sérum A témoin négatif provient de 4 oiseaux EOPS âgés de 1 semaine ;
iii)
Le sérum B témoin négatif provient de 58 oiseaux d’élevage âgés de 1 semaine et connus pour être
indemnes d’infections à Salmonella. Les sérums sont mélangés et conservés dans 100 µl à –20°C.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES
À USAGE DIAGNOSTIQUE
Beaucoup de vaccins inactivés sont utilisés contre les salmonelloses causées par différents sérovars chez différentes
espèces animales, comprenant un vaccin combiné à S. Enteritidis et S. Typhimurium pour un usage chez les
volailles. L’inactivation est généralement obtenue soit par chauffage soit par l’utilisation de formol et d’un adjuvant tel
que l’alhydrogel, fréquemment utilisé. Les vaccins vivants ont également été utilisés dans de nombreux pays ; ils
comprennent les souches semi-rough tels que 9R pour la typhoïde aviaire et HWS51 pour les infections à S. Dublin
(26). D’autres vaccins atténués contiennent des mutants auxotrophes, qui sont souvent utilisés pour prévenir les
infections à Salmonella chez l’animal d’élevage en Allemagne et pour S. Enteritidis au Royaume-Uni. Des vaccins de
mutants raisonnablement atténués par des techniques de biologie moléculaire de délétion de gènes ont été
1127
développés pour la volaille et d’autres espèces ; ils comprennent les aroA mutants et les souches avec des mutations
dans les gènes codant l’adénylate cyclase (cya) et la protéine du récepteur monophosphate cyclic (crp) (6), qui est
disponible aux États-Unis d’Amérique. En Europe, les organismes génétiquement modifiés ne sont normalement pas
autorisés pour les vaccins.
Les lignes directrices pour la production de vaccins vétérinaires sont indiquées dans le Chapitre I.1.7., « Principes de
fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les lignes directrices données ici et dans le Chapitre I.1.7. sont
générales et peuvent être complétées par des exigences nationales ou régionales.
1.
Gestion des semences bactériennes
a)
Caractéristiques de la semence bactérienne
Pour les vaccins inactivés ou vivants, la souche bactérienne doit être un organisme le plus proche possible des
souches de terrain circulant. Elle doit être choisie avec attention à partir des cas cliniques et sa virulence et sa
production d’antigène doivent être estimées. Il est préférable de tester un panel de souches potentielles dans ce
but avant de tester la sélection finale. La souche vaccinale finale doit être identifiée par des données historiques
et caractérisée par des marqueurs phénotypiques et/ou génotypiques stables. Les souches vaccinales vivantes
doivent être marquées par des caractères stables permettant la distinction d’avec les souches sauvages. Des
marqueurs tels que la résistance aux antibiotiques, par exemple à la rifampicine peuvent être utilisés.
L’atténuation de la virulence doit être stable et obtenue de préférence par 2 mutations indépendantes.
b)
Méthode de culture
La culture est propagée et maintenue en utilisant des milieux adaptés, parmi lesquels beaucoup ont été décrits
(se reporter à la littérature scientifique sur le sujet) pour la croissance de Salmonella. Les milieux utilisés ne
doivent pas contenir de sérums ou de tissus d’origine animale. Les cultures peuvent se réaliser sur des milieux
solides, en flacon de Roux, ou en milieu liquide, auquel cas des équipements de fermentation à large échelle
peuvent être utilisés. La restriction en fer ou l’incubation à basse température sur un milieu minimal peut
augmenter la production d’antigène LPS par la souche vaccinale.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
i)
Pureté
La souche vaccinale doit être vérifiée selon les critères suivants :
ii)
•
Coloration d’un étalement d’une suspension bactérienne sur une lame de verre par la coloration de
Gram.
•
Homogénéité de la culture sur milieu non sélectif.
•
Exigences métaboliques comme celles indiquées par les tests biochimiques.
•
Détection des marqueurs et lysotypie.
•
Agglutination avec des sérums spécifiques.
Innocuité
La DL50 (50 % de la dose létale) ou DI50 (50 % de la dose infectieuse) doivent être déterminées sur la
souris. Dix fois la dose vaccinale vivante de terrain et 2 fois la dose du vaccin inactivé doivent être
administrées à des espèces cibles avec des exigences d’âge et de voies d’administration. Les animaux
sont maintenus en observation. La stabilité et la non réversibilité de la virulence doivent être démontrées
pour les vaccins vivants après plusieurs passages sur des espèces sensibles. Il est aussi nécessaire de
considérer les vaccinations répétées. Les vaccins vivants doivent montrer qu’ils ne persistent pas
longtemps chez l’animal vacciné ou qu’ils ne sont pas transmis au lait ou à l’œuf qui pourraient être
consommés, et les méthodes d’utilisation ne doivent pas présenter de danger pour l’opérateur.
iii)
Efficacité
Les analyses de laboratoire et les essais de terrain doivent être utilisés pour montrer que le vaccin est
effectif. Les essais de laboratoire consistent à réaliser des tests d’infection pour apprécier la vaccination
dans l’espèce ciblée à la dose et à la période recommandée. Les résultats d’efficacité peuvent aussi être
utilisés comme base pour une série de test d’activité. Les essais de terrain sont plus à intégrer dans les
tests d’activité du fait de la difficulté de standardiser l’essai et d’obtenir des témoins appropriés.
1128
iv)
Aspects environnementaux
Les souches de vaccins vivants doivent être testées pour leur possibilité de survivre dans l’environnement
et d’infecter des cibles non spécifiques, telles que les rongeurs et les oiseaux sauvages, qui peuvent y être
exposées. Une persistance prolongée de vaccins vivants dans les fèces et la litière peut être considérée
comme un risque inacceptable pour l’environnement lorsque ces matériels sont enlevés des bâtiments.
2.
Méthode de fabrication
Les vaccins doivent être produits dans des locaux adaptés propres dans lesquels ont accès seulement les personnes
autorisées. Des précautions doivent être prises pour éviter les contaminations croisées entre les zones où
l’organisme est vivant et les autres zones. Il ne doit y avoir aucune contamination des opérateurs et/ou de
l’environnement et la préparation vaccinale doit être localisée dans une zone séparée du travail de diagnostic sur
culture. Les opérateurs ne doivent pas travailler avec les vaccins lorsqu’ils sont malades et ne doivent pas être
sensibles aux conditions d’immunosuppression ou aux médicaments. Le personnel doit porter des vêtements de
protection en zone de production et dans les animaleries.
Les lots de cultures sont préparés à partir d’un lot primaire et le nombre de passages dépend de la validation du
procédé. Les vaccins peuvent être préparés par inoculation d’un milieu adapté, tel qu’un bouillon nutritif, avec une
culture fraîche et une incubation à 37°C pendant 24 h, avec ou sans oxygénation. Les organismes sont récupérés par
sédimentation ou centrifugation. Alternativement, les organismes peuvent être mis en culture et récupérés sur un
milieu solide, tel que la gélose nutritive. Dans le cas de vaccin vivant, la suspension est diluée en PBS, pH 7,0, et
peut être congelée déshydratée.
Le temps d’inactivation d’un vaccin inactivé doit être au moins de 33 % de plus que celui nécessaire à la diminution
d’un nombre viable de cellules jusqu’à un taux indétectable. Le procédé d’inactivation doit être appliqué à l’ensemble
du volume des cellules vaccinales collectées.
Les agents de conservation, les excipients de lyophilisation, les stabilisateurs pour les conteneurs multidose ou les
autres substances ajoutées ou combinés avec la préparation vaccinale ne doivent pas avoir d’effets délétères sur le
potentiel immunogène du produit.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Les points suivants doivent retenir l’attention :
•
Contrôle visuel de la suspension, homogénéité par la coloration de Gram, culture sur milieu non sélectif.
•
Agglutination sur lame par des antisérums spécifiques.
•
Titrage des bactéries par turbidimétrie et/ou dénombrement sur boîte.
•
Test d’inactivation effective (vaccin inactivé) par isolement sur milieu non sélectif ou utilisation d’un milieu qui
donne une chance optimale de culture, par exemple milieu de production avec neutralisation des agents
d’inactivation.
•
Titrage des bactéries viables (vaccin vivant) avant et après lyophilisation.
4.
Contrôle des lots
a)
Stérilité
Les tests de stérilité et d’absence de contamination des matériels biologiques peuvent être trouvés au Chapitre
I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
b)
Innocuité
Un test de laboratoire sur souris qui a montré précédemment une corrélation avec l’innocuité sur les espèces
cibles peut être utilisé pour déterminer la DL50 et/ou la DI50. Chaque lot doit être testé sur les espèces cibles à la
période et aux voies d’administration recommandées, en utilisant au moins 2 fois la dose de terrain pour les
vaccins inactivés et 10 fois pour les vaccins vivants.
1129
c)
Activité
L’activité est testé par une épreuve d’infection pour apprécier la vaccination sur souris et/ou autres espèces,
comprenant (si possible) les espèces cibles et la réponse immunologique des espèces cibles.
d)
Durée de l’immunité
La période d’immunité est probablement variable selon les produits, les régimes de vaccination et les individus
vaccinés. L’immunité à Salmonella est normalement spécifique du sérogroupe. Des consultations auprès de
collègues suggèrent que les vaccins inactivés procurent une protection de 6 mois, alors que les vaccins vivants
apportent une immunité plus longue, qui peut aller jusqu’à 1 an ou plus. Il doit être rappelé, toutefois, qu’une
pression d’infection forte, telle que celle observée dans une ferme continuellement contaminée ou lors de
rongeurs continuellement infectés, peut déborder l’immunité vaccinale.
e)
Stabilité
Les informations manquent sur la stabilité des vaccins inactivés. La stabilité peut varier selon les conditions de
conservation et par la présence de micro-organismes contaminants poussant dans le produit. La stabilité est
évaluée par des tests d’activité répétés à un intervalle de temps approprié. La stabilité des vaccins vivants peut
être donnée par la réalisation de dénombrement des organismes viables répété à des intervalles de temps
appropriés.
f)
Agents de conservation
Des produits chimiques avec une activité antimicrobienne tels que le thiomersal, le phénol ou le crystal violet,
sont souvent inclus comme agents de conservation dans les vaccins bactériens inactivés.
g)
Précautions d'emploi et mise en garde
Certain vaccins inactivés peuvent occasionnellement engendrer des avortements du fait du LPS présent et, pour
les mêmes raisons, les vaccins à virus vivants doivent être utilisés avec prudence chez les femelles en
gestation. Cependant, Il est souvent nécessaire de vacciner les femelles en gestation afin de permettre le
transfert de l’immunité maternelle à leur progéniture. Il peut être utile d’inclure des tests de recherche
d’endotoxine dans le programme d’innocuité de manière à ce que les taux puissent être comparés à ceux
garantis comme sûrs dans les tests de double dose. Des vaccins peuvent aussi causer des tuméfactions au
point d’injection.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Les vaccins inactivés sont testés par le test de double dose, et les vaccins vivants sont testés en utilisant 10 fois
la dose sur les espèces cibles.
b)
Activité
Si possible, le contrôle de l’activité doit être relié à l’efficacité du vaccin dans les espèces cibles, et des critères
adaptés doivent être appliqués pour valider les lots. Il peut être possible d’évaluer la réponse d’un vaccin
inactivé par la réponse d’anticorps contre O et H produits, quoiqu’il faille se souvenir que la réponse anticorps
est seulement une part des mécanismes de protection de l’hôte contre Salmonella. Alternativement, l’activité du
vaccin peut être obtenue par les effets de la DL50 chez la souris.
D. EXCLUSION COMPÉTITIVE
La sensibilité à l’infection à Salmonella chez la volaille peut être réduite sensiblement par un traitement par spray ou
oral avant l’exposition (idéalement dans l’écloserie) avec une culture en anaérobie de microflore caecale qui inhibe la
colonisation par Salmonella. Ce traitement est largement utilisé dans certains pays mais uniquement comme une aide
à la décontamination d’élevage infectés de façon persistante entre autres (1, 27).
1130
REMERCIEMENT
Des parties de ce chapitre ont été prises ou sont basées sur le chapitre salmonelloses de l’édition précédente du
Manuel terrestre.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
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*
* *
NB : Il existe des Laboratoires de référence de l’OIE pour les Salmonelloses (se reporter à la liste de la partie 3 de ce
Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
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Chapitre 2.10.3.

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