rhinite atrophique du porc

CHAPITRE 2.8.2.
RHINITE ATROPHIQUE DU PORC
RÉSUMÉ
Définition de la maladie : la rhinite atrophique est une maladie infectieuse du porc, caractérisée
par un écoulement nasal séreux ou purulent, un raccourcissement et une torsion du groin, une
atrophie osseuse des cornets nasaux et une baisse de productivité. Elle peut survenir sous une
forme enzootique ou plus sporadique, en fonction de nombreux facteurs incluant l’immunité de
l’élevage. La forme progressive, la plus sévère, est causée lors de l’infection par des souches
toxigènes de Pasteurella multocida seules ou associées à Bordetella bronchiseptica. Les infections
monovalentes à B. bronchiseptica peuvent provoquer une atrophie des cornets nasaux sous une
forme modérée et non-progressive. L’atrophie des cornets nasaux peut n’être manifeste qu’à
l’abattoir ou être détectée chez l’animal vivant, en utilisant la radiographie ou la tomographie. Les
facteurs liés à l’environnement et à la conduite de l’élevage contribuent également à la sévérité et à
l’incidence de cette maladie. Une forte proportion des élevages de porcs cliniquement sains peut
être infectée par B. bronchiseptica ou par P. multocida non toxigène, et ne présenter qu’une
atrophie modérée des cornets ou une faible prévalence.
Identification des agents pathogènes : le diagnostic de la rhinite atrophique tient compte des
symptômes, des examens post mortem, ainsi que de l’isolement et de la caractérisation de
P. multocida et de B. bronchiseptica chez les porcs concernés. L’isolement des deux
micro-organismes est souvent rendu difficile par la présence d’autres bactéries à croissance plus
rapide. Les taux d’isolement sont améliorés par la conservation des écouvillons nasaux ou
amygdaliens entre 4 et 8 °C dans un milieu de transport non nutritif et par l’utilisation d’un milieu de
culture sélectif.
Pasteurella multocida et B. bronchiseptica peuvent être identifiées par des tests biochimiques
classiques. Les isolats de P. multocida peuvent, en outre, être caractérisés par leurs antigènes
capsulaires et somatiques. Le type capsulaire D est le plus répandu dans de nombreux pays dans
le monde, cependant le type A domine dans certaines régions. Les antigènes capsulaires peuvent
être distingués sérologiquement par l’hémagglutination indirecte ou l’immunofluorescence,
chimiquement par floculation en présence d’acryflavine ou par la sensibilité à la hyaluronidase. Les
types antigéniques somatiques peuvent être distingués par immunodiffusion en gélose, le type 3
étant celui qui est le plus fréquemment rencontré chez les porcs. Le caractère toxigène des isolats
de P. multocida peut être démontré en évaluant la toxicité sur des cultures cellulaires. Un test
immuno-enzymatique (ELISA) spécifique de la toxine est commercialisé et largement utilisé à
travers le monde pour différencier les souches toxigènes des souches non-toxigènes. D’autre part,
la détection d’une bactérie productrice de toxine peut être effectuée à partir de cultures cellulaires
de première explantation, sans qu’il soit nécessaire d’isoler et d’identifier individuellement des
colonies bactériennes.
Récemment, des épreuves fondées sur l’utilisation de sondes ADN ou sur l’amplification en chaîne
par polymérase (PCR) ont été développées et permettent une détection rapide, sensible et
hautement spécifique de B. bronchiseptica et de P. multocida (tant les souches toxinogènes que
les non toxinogènes) par les laboratoires qui ont la possibilité de les utiliser. Une PCR multiplex
pour le typage des antigènes capsulaires a également été décrit.
Épreuves sérologiques : la détection des anticorps dirigés contre P. multocida et
B. bronchiseptica n’a que peu d’intérêt puisque d’une part, des réactions croisées peuvent être
induites entre les antigènes des souches non-toxigènes de P. multocida et les antigènes des
souches toxigènes et que d’autre part, B. bronchiseptica est présente dans de très nombreux
élevages de porcs. Un test basé sur la détection des anticorps dirigés contre la toxine de
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1185
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
P. multocida est commercialisé mais son intérêt est limité dans la mesure où tous les porcs infectés
ne développent pas d’anticorps. La vaccination, par P. multocida sous la forme de toxoïde, induit la
synthèse d’anticorps, ce qui complique l’interprétation des résultats.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
plusieurs vaccins commerciaux sont disponibles et contiennent les bactérines de B. bronchiseptica
et un mélange de souches toxigènes et/ou non-toxigènes de P. multocida, ou P. multocida sous
forme de toxoïde ou sous une forme recombinante dans Escherichia coli.
A. INTRODUCTION
La rhinite atrophique est une maladie infectieuse du porc. Les signes cliniques précoces sont des éternuements,
du reniflement et du larmoiement qui aboutit à un écoulement de larmes foncées et un écoulement nasal qui varie
de séreux à mucopurulent ; dans certains cas, on peut noter de l’épistaxis. L’atrophie osseuse des cornets et une
déviation de la cloison nasale entraînent un raccourcissement et une torsion du groin et, dans les cas graves, une
difficulté à se nourrir. Deux formes ont été rapportées (9) :
a)
Une forme sévère et progressive causée par les souches toxigènes de Pasteurella multocida, le plus
fréquemment les types capsulaires A et D, seules ou en association avec Bordetella bronchiseptica.
b)
Une forme moins sévère avec une atrophie modérée des cornets nasaux, souvent sans modification
significative du groin, causée par B. bronchiseptica.
L’augmentation de la sévérité est associée à une concentration excessive des animaux et de mauvaises
conditions de logement et d’environnement. Une productivité réduite est généralement associée à une forme
modérée à sévère de rhinite atrophique, sans qu’une relation précise n’ait été établie entre l’infection par ces
bactéries et la réduction pondérale des animaux. B. bronchiseptica et les souches toxigènes de P. multocida sont
fréquemment isolées chez de nombreuses espèces animales, domestiques et sauvages, ce qui pourrait
exacerber la transmission de la bactérie à des élevages de porcs.
Bordetella bronchiseptica ou les souches toxigènes de P. multocida peuvent être présentes dans un élevage,
sans manifestation clinique de la maladie, en particulier lorsque d’autres agents pathogènes respiratoires sont
absents et lorsque les conditions d’environnement et de conduite d’élevage sont optimales. De tels élevages,
porteurs asymptomatiques, constituent un risque de transmission de ces agents à d’autres élevages, au sein
desquels la maladie peut survenir sous une forme sévère.
Le diagnostic de la rhinite atrophique se fonde sur les signes cliniques, l’anatomopathologie et les résultats
microbiologiques, ces derniers revêtant une importance capitale pour les élevages concernés par une infection
subclinique. Il est généralement admis qu’un élevage, dont les animaux hébergent une souche toxigène de
P. multocida, est atteint de rhinite atrophique progressive, que les signes cliniques de la maladie soient, ou non,
présents (26). Ainsi, dans de nombreux pays, le contrôle est axé sur la détection de l’infection, même si les
animaux asymptomatiques sont considérés comme des porteurs potentiels.
L’atrophie des cornets nasaux peut n’être observée qu’à l’abattoir, lors de l’examen des sections de groins,
effectuées au niveau des premières ou secondes prémolaires supérieures, L’évaluation subjective de l’atrophie
des cornets nasaux est pratique et souvent utile pour gérer les élevages (9), mais des échelles de mesures
objectives ont également été décrites (16) et sont plus adaptées aux études exigeant des résultats d’analyses. La
radiographie (12) et la tomographie (24) sont également utilisées pour détecter les lésions chez l’animal vivant ; la
tomographie ne révèle pas seulement les lésions graves, mais aussi des changements légers qui peuvent ne pas
apparaître à la radiographie. Cependant, ces techniques sont d’usage limité en raison de l*équipement et de
l’expérience nécessaires. Le diagnostic est facilité par la détection des changements histopathologiques incluant
un remplacement fibreux des cloisons osseuses de la volute ventrale avec divers degrés d’inflammation et de
remaniements.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification des agents pathogènes
a)
Culture
Pasteurella multocida colonise préférentiellement les amygdales ; ainsi les écouvillonnages ou les biopsies
d’amygdales fournissent-ils le taux d’isolement le plus élevé (1). Les écouvillonnages nasaux sont
1186
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
préférables pour l’isolement de B. bronchiseptica. Dans le cas où les prélèvements d’amygdales ne sont pas
réalisables, l’écouvillonnage des cavités nasales suffit à l’isolement des deux micro-organismes. Les
écouvillonnages doivent être réalisés avec des écouvillons à tige flexible ; chez les porcelets, les
prélèvements seront plus facilement réalisés avec des mini-écouvillons. Un simple écouvillon permet de
réaliser les prélèvements au niveau des cavités nasales, à gauche et à droite, il est ensuite placé dans un
milieu de transport non-nutritif (un tampon phosphate) et gardé entre 4 et 8 °C pendant le transport, afin
d’éviter le développement d’autres bactéries à croissance plus rapide. Le temps du transport ne doit pas
excéder 24 h.
Bien que P. multocida et B. bronchiseptica se multiplient facilement sur une gélose au sang, un milieu
sélectif est cependant préférable afin de limiter l’envahissement par d’autres bactéries, présentes en plus
grand nombre, qui interfèrent souvent avec leur détection. Une autre difficulté apparaît, liée à
B. bronchiseptica dont la croissance est plus lente que celle de la plupart des autres bactéries présentes
dans les échantillons issus d’examens cliniques. Des milieux, aux formules variées, contenant des
antibiotiques sont utilisés pour l’isolement de P. multocida, mais la comparaison des études rapportées dans
la littérature montrent que le taux d’isolement le plus élevé est obtenu avec le milieu modifié de Knight
(gélose au sang de bovin, contenant 5 µg/ml de clindamycine, 0,75 µg/ml de gentamycine) (22) ou KPMD
(gélose au sang de bovin contenant 3,75 U/ml de bacitracine, 5 µg/ml de clindamycine, 0,75 µg/ml de
gentamycine et 2,25 µg/ml d’amphotéricine B) (1). La gélose de MacConkey avec 1 % de glucose et
20 µg/ml de furaltadone est utilisée par de nombreux laboratoires, comme milieu sélectif pour l’isolement de
B. bronchiseptica, à partir d’écouvillonnages nasaux, mais le milieu de Smith-Baskerville modifié (une
gélose peptone contenant 20 µg/ml de pénicilline, 20 µg/ml de furaltadone et 0,5 µg/ml de gentamycine)
semble supérieur, en particulier quand le nombre de B. bronchiseptica présentes est faible (22, 35). Une
amélioration supplémentaire du taux d’isolement a été rapportée par l’utilisation d’une gélose au sang
contenant 40 µg/ml de céphalexine (22). Une gélose au sang sélective pour l’isolement simultané de
P. multocida et B. bronchiseptica, contenant 5 mg/litre de clindamycine-HCl, 0,75 mg/litre de gentamycine
sulfate, 2,5 mg/litre de tellurite de potassium, 5 mg/litre d’amphotéricine-B et 15 mg/litre de bacitricine, a
aussi été décrite (10). Cependant, il faut prendre garde au fait que le telluritede potassium a parfois entraîné
une inhibition de la croissance de P. multocida de type D (22).
b)
Caractéristiques biochimiques
P. multocida est une bactérie à Gram négatif, bipolaire, bacilliforme, douée de pléomorphisme, non
hémolytique, se présentant sous forme de colonies grisâtres sur gélose au sang avec une odeur douceâtre
caractéristique (29). Cette bactérie ne se développe pas sur une gélose de MacConkey, possède une
catalase et une oxydase et produit de l’indole.
B. bronchiseptica est également une bactérie à Gram négatif, bacilliforme, formant des colonies convexes
de 1-2 mm de diamètre, généralement hémolytique sur une gélose au sang ou un milieu de Bordet-Gengou,
après 48 h d’incubation (30). Elle est ne fermente pas les sucres, mais possède une oxydase, une catalase,
utilise le citrate et l’urée et se multiplie en présence de 6,5 % de NaCl.
Les tests d’agglutination, utilisant des anticorps spécifiques ont été décrits pour confirmer l’identité
présomptive d’un isolat de B. bronchiseptica, mais les sérums appropriés ne sont pas largement disponibles
pour cet usage.
•
Typage capsulaire de Pasteurella multocida
Le typage capsulaire de P. multocida est utile dans le cadre d’objectifs épidémiologiques. La sérotypie par
hémagglutination indirecte a traditionnellement été utilisée (3), mais très peu de laboratoires dans le monde
produisent et entretiennent les antisérums nécessaires. Cependant, des méthodes chimiques plus simples
peuvent en principe distinguer la plupart des souches d’origine porcine. Celles qui correspondent au type
capsulaire D floculent abondamment en présence d’une solution aqueuse d’acriflavine au 1/1 000 (5), alors
que les souches de type capsulaire A peuvent être identifiées par inhibition de la croissance en présence de
hyaluranidase (4). Une faible proportion des souches d’origine porcine est non-capsulée.
•
Protocole d’utilisation du test à l’acriflavine pour les souches de Pasteurella multocida de type
capsulaire D
i)
Ensemencer un tube contenant 3 ml de bouillon cœur-cerveau (BHI), en utilisant une culture fraîche,
récoltée sur une gélose au sang de bovin, pour chacune des souches de P. multocida faisant l’objet
d’une analyse. Inclure une souche connue de type D et une souche connue de type A, comme témoins
positif et négatif ;
ii)
Incuber les tubes ensemencés à 37 °C pendant 18 à 24 h ;
iii)
Sédimenter les bactéries par centrifugation et éliminer 2,5 ml de surnageant ;
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1187
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
iv)
Ajouter 0,5 ml d’une solution aqueuse d’acriflavine neutre au 1/1 000. La solution d’acriflavine doit être
renouvelée chaque semaine et stockée à 4 °C, à l’abri de la lumière ;
v)
Mélanger, afin de remettre le culot bactérien en suspension et incuber le tube à la température de la
pièce, sans agiter ;
vi)
Observer la présence d’un important précipité floconneux, après 5 min.
•
Protocole d’utilisation du test à la hyaluronidase pour les souches de Pasteurella multocida de type
capsulaire A
i)
Préparer des cultures fraîches des isolats à analyser, sur gélose au sang de bovin. Inclure une souche
connue de type A et une souche connue de type D, comme témoins positif et négatif ;
ii)
Ensemencer, séparément, chacune des souches faisant l’objet d’un examen, sur boîte de gélose à la
trypticase-soja contenant 6 % de sang de bovin, par la méthode des stries parallèles séparées par 3 à
5 mm, en utilisant tout le diamètre de la boîte. Pour une production maximale d’acide hyaluronique, il
est important que les boîtes de gélose soient fraîches et non déshydratées ;
iii)
Effectuer l’ensemencement d’une souche de Staphylococcus aureus productrice de hyaluronidase, par
une large strie perpendiculaire à la culture de P. multocida ;
iv)
Incuber les boîtes de gélose à 37 °C, en atmosphère humide, en les observant régulièrement jusqu’à
24 h. Les souches de type capsulaire A montreront une inhibition nette de la croissance dans la région
adjacente à la zone de croissance de Staphylococcus aureus ;
•
Typage de l’antigène somatique de Pasteurella multocida
Le typage de l’antigène somatique est basé sur les variations du lipopolysaccharide de la paroi des souches
de P. multocida. Seize types peuvent être distingués par immunodiffusion en gélose (18), le type 3 étant le
plus fréquemment rencontré chez les porcs. Bien que les antisérums nécessaires ne soient pas disponibles
aisément, beaucoup de laboratoires de références et quelques laboratoires de diagnostic réalisent le typage
de l’antigène somatique.
•
Détection des toxines de Pasteurella multocida
Le diagnostic de la rhinite atrophique progressive dépend de la détection du caractère toxigène des souches
de P. multocida. La toxine thermolabile de P. multocida produit une dermonécrose chez le cobaye, elle est
létale pour la souris après une injection intrapéritonéale. Le caractère toxigène peut également être mis en
évidence in vitro en évaluant l’effet cytopathogène sur des cultures de cellules embryonnaires de poumons
de bovin (34), sur des cellules de rein de singe vert d’Afrique (cellules Vero) (28) ou des cellules bovines de
cornets (13). Les bactéries sont cultivées en bouillon cœur-cerveau (BHI), incubées à 37 °C pendant 24 h
puis récoltées par centrifugation. Le surnageant est stérilisé par filtration et titré sur cultures cellulaires
préparées en microplaques. Après une incubation à 37 °C, pendant 2 à 3 jours, les cellules en monocouche
sont colorées au crystal violet, puis examinées en microscopie optique afin de détecter les effets
cytopathogènes. Un test rapide sur cultures cellulaires, dans lequel les colonies suspectes sont cultivées sur
une gélose recouverte de cellules embryonnaires de poumons de bovins (6), permet une analyse plus
efficace d’un grand nombre de souches.
Un test immuno-enzymatique (ELISA), utilisant des anticorps monoclonaux peut détecter la toxine dans un
mélange de bactéries isolées à partir d’un milieu d’isolement primaire (14). Ceci représente un sérieux
avantage, car le porc peut être infecté simultanément par un mélange de souches toxigènes et non
toxigènes (1, 9). Les méthodes utilisant les cultures cellulaires exigeraient pour atteindre le niveau de
sensibilité de l’ELISA que chacune des colonies de P. multocida issues de l’échantillon soient testées, ce
qui n’est pas possible en pratique.
1
Ce test ELISA est disponible et commercialisé en Europe et dans quelques autres régions du monde (mais
pas aux États-Unis d’Amérique), il est largement utilisé dans de nombreuses régions et privilégié pour la
détection des animaux porteurs et le contrôle de la rhinite atrophique progressive. Bien que très spécifique,
un résultat positif sans un épisode antérieur de la maladie, ou sans symptômes suspects doit être
parfaitement investigué afin de détecter les souches toxigènes à partir des échantillons provenant des
animaux.
1
Disponible auprès du laboratoire DakoCytomation Denmark A/S, Produktionsvej 42, DK-2600 Gloistrup, Danemark;
http://www.dakocytomation.com..
1188
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
c)
Méthodes d’identification des acides nucléiques
La morphologie des colonies et les tests biochimiques constituent, dans de nombreux laboratoires, la base
pour l’identification des souches de P. multocida toxigènes et des souches de B. bronchiseptica. Cependant,
un certain nombre de tests récemment décrits, fondés sur l’utilisation des sondes ADN (20, 32) ou sur
l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) (19, 23, 25, 31) pour la détection des souches toxigènes de
P. multocida et des souches de B. bronchiseptica isolées chez le porc, se révèlent être des outils de
diagnostic prometteurs, de par leur plus grande rapidité, sensibilité et spécificité. Les laboratoires de
diagnostic utilisent de plus en plus la PCR pour l’identification des ces agents pathogènes depuis que le
matériel et l’expertise se sont généralisés. Une validation appropriée réalisé par le laboratoire grâce à des
témoins connus et normalisés est indispensable, ainsi qu’une procédure de contrôle de qualité (voir
Chapitre 1.1.5. ; « Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses » de ce Manuel terrestre).
Un test PCR multiplexe pour le typage capsulaire de P. multocida, qui semble apporter des résultats plus
fiables que les méthodes phénotypiques, a été récemment décrit (37) et pourrait se révéler utile dans les
laboratoires correctement équipés.
Diverses techniques d’analyse de profil de migrations en gel de l’ADN (DNA fingerprinting) y compris
l’analyse par les endonucléases de restriction (Restriction endonuclease analysis = REA), le typage
ribonucléique, l’électrophorèse en champs pulsés et des méthodes basées sur la PCR ont été évaluées par
plusieurs groupes avec comme objectif la différentiation des isolats de P. multocida. Peu d’études
comparatives entre les méthodes ont été réalisées avec des souches provenant de porcs atteints de rhinite
atrophique, mais la REA semble être la méthode de choix pour les enquêtes épidémiologiques car elle
autorise un haut niveau de discrimination sans équipements ni réactifs spécialisés (11, 15, 17).
2.
Épreuves sérologiques
Actuellement, il n’existe pas d’épreuves sérologiques satisfaisantes qui puissent détecter d’une manière fiable les
animaux infectés par des souches de P. multocida toxigènes et capables de développer ou de transmettre la
maladie. La détection des anticorps dirigés contre P. multocida n’est pas utile, car les souches non-toxigéniques
possèdent des antigènes entraînant de nombreuses réactions croisées avec les souches toxigéniques. Un ELISA
pour la détection des anticorps dirigés contre la toxine de P. multocida a été décrit (14), il est disponible et
commercialisé en Europe et dans quelques autres régions du monde (voir la note de bas de page n°1).
Cependant, de nombreux animaux infectés par P. multocida toxigénique ne produisent pas d’anticorps contre la
toxine, et la très large utilisation des vaccins sous forme de toxoïde limite la valeur diagnostique de cet ELISA aux
élevages sans historique de vaccination ou à la détection d’une réponse vaccinale dans les élevages vaccinés.
L’infection à B. bronchiseptica peut être sérologiquement détectée par un test d’agglutination avec des bactéries
traitées par le formol ou par un test ELISA plus sensible (38). À moins qu’il s’agisse de contrôler le statut d’un
élevage négatif, la sérologie B. bronchiseptica n’a que peu de valeur puisque la bactérie est présente dans de
nombreux élevages apparemment sains.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Il existe plusieurs vaccins commerciaux disponibles qui contiennent des cellules entières sous forme de
bactérines de B. bronchiseptica ainsi qu’un mélange de souches toxigénique et non-toxigénique de P. multocida,
ou P. multocida sous forme de toxoïde. Des vaccins vivants ou atténués, destinés à prévenir l’infection à
B. bronchiseptica sont également disponibles. Les vaccins contenant uniquement B. bronchiseptica ne
conviennent pas pour contrôler la rhinite atrophique, mais peuvent présenter un avantage dans les élevages
concernés par une forme non progressive de la maladie. Les vaccins contre P. multocida et B. bronchiseptica
semblent réduire le niveau de colonisation par ces bactéries, mais ne peuvent ni les éliminer ni diminuer
l’infection.
La toxine de P. multocida est un antigène simple et le plus protecteur dans le cadre de la rhinite atrophique
progressive. Les vaccins fondés sur une forme toxoïde de P. multocida induisent une protection spécifique contre
l’action de la toxine, qui, par elle-même, peut être utilisée pour produire l’ensemble des manifestations majeures
de cette maladie (voir la réf. 14 de la bibliographie). Le taux de toxine produite par P. multocida est relativement
faible et la réponse, en anticorps spécifiques de la toxine, induite par les vaccins sous forme de bactérines
seules, peut ne pas être optimale. La difficulté et les dépenses engendrées par une purification à grande échelle
ne permettent pas l’incorporation en routine de toxoïde purifié dans les vaccins. Des études de terrain ont montré
qu’un dérivé de la toxine recombinante de P. multocida, dans lequel manque un segment de la portion de
l’extrémité aminée de la protéine, était non toxique, mais immunogène et d’une efficacité supérieure chez le porc
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1189
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
(2, 27). Plus récemment, une forme toxoïde recombinante complète dans laquelle deux acides aminés ont été
substitués (ce qui supprime le pouvoir toxinogène) s’est aussi révélée très efficace (36). Il a été démontré qu’un
vaccin ADN codant une forme toxoïde complète, mais inactive au plan enzymatique, était hautement
immunogène chez les porcs, mais son efficacité n’a pas, pour l’instant, été évaluée par épreuve virulente (33).
Bordetella bronchiseptica produit une variété de toxines et d’adhésines qui sont des facteurs de virulence
potentiels pour le porc. Seule la pertactine, une protéine de la membrane externe, s’est montrée capable de
protéger le porc contre la maladie (21). En dépit de ce fait, une toxine dermonécrosante produite par
B. bronchiseptica, unique pour la toxine produite par P. multocida, a traditionnellement été considérée comme le
facteur de virulence primaire et l’immunogène produisant une protection chez le porc (9). De nombreuses études
impliquent fortement la toxine comme facteur de virulence et son rôle sans équivoque dans la pathogénie, voire
dans la protection. Cependant, le rôle de la pertactine dans la protection ainsi que celui de plusieurs autres
facteurs de virulence sont vraisemblablement aussi importants voire supérieurs à celui de la toxine.
Bordetella bronchiseptica est sujette à des variations phénotypiques dans certaines conditions de culture
(ex, températures au-dessous de 37 °C ou la présence de médiateurs chimiques comme MgSO4 ou l’acide
nicotinique), dans lesquelles la production de la plupart des facteurs de virulence est stoppée d’une manière
réversible. Des mutants apparaissent spontanément, définitivement incapables de produire la plupart des facteurs
de virulence, et à faible fréquence pendant la culture. En examinant soigneusement la morphologie des colonies,
dans une zone de la boîte présentant des colonies bien isolées, il est essentiel de choisir les cultures en
+
phase I (également connues sous le nom de Bvg ), la forme virulente. Les colonies en phase I sont petites (1 à
2 mm de diamètre), bombées, hémolytiques sur gélose au sang. La perte de l’hémolyse et l’apparition de
colonies plus grandes et plates indiquent le passage à la forme non-virulente. À chaque fois que cela est
possible, les cultures doivent être multipliées en utilisant des colonies isolées et hémolytiques, afin de réduire
l’accumulation de clones avirulents dans la population bactérienne.
Les valeurs de référence et les détails précis concernant la production de vaccins commerciaux et efficaces ne
10
sont pas disponibles, mais on sait qu’ils contiennent 10 cellules formolées-tuées de B. bronchiseptica et 10 µg
de P. multocida sous forme de toxoïde, par dose. Il est également établi que la forme toxoïde purifiée (inactivée
par le formol) est plus immunogène que la toxine brute, et que l’immunogénicité de la forme inactivée n’est pas
affectée par l’association à une bactérine de B. bronchiseptica. La toxine de P. multocida, sous sa forme
recombinante tronquée, a été inactivée par délétion d’une portion du gène, ce qui ne semble pas compromettre
l’immunogénicité et le rôle protecteur. Tous les vaccins commerciaux disponibles contiennent soit un adjuvant
huileux soit un gel d’hydroxyde d’aluminium.
Bordetella bronchiseptica, utilisée dans la production des vaccins doit se trouver sous la forme d’une culture
virulente en phase I et les isolats de P. multocida doivent être toxigènes. L’identification des semences de
B. bronchiseptica et de P. multocida ainsi que l’historique des passages doivent être documentés par les moyens
conventionnels. Un nombre défini de passages est retenu pour la production de la culture. Bordetella
bronchiseptica doit être inactivée par le formol. La toxine de P. multocida étant intracellulaire et produite par la
lyse cellulaire pendant la phase stationnaire, le surnageant de culture doit être récolté approximativement 48 h
après la fin de la phase exponentielle de croissance.
1.
Gestion des semences bactériennes
a)
Caractéristiques de la semence bactérienne
Le système des lots de semence doit être employé pour les souches bactériennes utilisées pour préparer
les cellules entières sous forme de bactérines, ainsi que pour les souches à partir desquelles les antigènes
purifiés sont dérivés.
Dans le cas des cellules entières sous forme de bactérines, l’origine et l’historique des souches de
P. multocida et de B. bronchiseptica doivent être décrits et la caractérisation complète des lots de semence
doit être établie dans le protocole de production d’un lot de semence primaire.
Les semences utilisées pour une production de vaccin doivent dériver du lot de semence et doivent être
contrôlées vis-à-vis de toutes les propriétés essentielles, ainsi que le décrit le protocole de production d’un
lot de semence primaire.
b)
Méthode de culture
Toutes les souches bactériennes doivent être cultivées en milieu adéquat permettant d’obtenir une culture
satisfaisante, ainsi que l’expression des antigènes importants.
1190
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
i)
Pureté
Le lot de semences primaires, ainsi que les semences de production doivent être des cultures pures,
indemnes de contaminations par des bactéries, des champignons, des mycoplasmes et des virus.
L’identification des espèces bactériennes et la production des antigènes essentiels doivent être
confirmées.
ii)
Innocuité
Bien que l’inactivation des cultures bactériennes par une méthode validée soit une procédure
normalisée, pour les deux espèces bactériennes qui produisent des toxines dermonécrosantes, la
détoxification de ces toxines doit être confirmée lorsque les toxoïdes sont utilisées comme composants
de vaccins. Des contrôles d’innocuité par des tests normalisés, utilisés pour les vaccins inactivés,
doivent être conduits (7, 8).
iii)
Efficacité
L’efficacité d’une épreuve vaccinale doit être mesurée par la vaccination de lots de truies gestantes.
Les porcelets qui en sont issus doivent être infectés expérimentalement par des cultures de
B. bronchiseptica virulentes et de P. multocida toxigènes. Une protection significative doit être obtenue,
vis-à-vis des signes cliniques de la forme progressive de la rhinite atrophique, ex : atrophie des cornets
nasaux. Les signes cliniques induits chez les animaux témoins et chez les animaux vaccinés doivent
être comparés selon l’échelle des scores établie par Done (12).
2.
Méthode de fabrication
Les cultures de B. bronchiseptica et de P. multocida doivent être multipliées séparément sur un milieu permettant
une culture satisfaisante et une expression optimale des antigènes nécessaires à la production des anticorps
protecteurs. Bordetella bronchiseptica doit être confirmée en phase I de culture et, pour P. multocida, il est
nécessaire de confirmer la production de la toxine, à un taux suffisant.
Les cellules de B. bronchiseptica, et celles de P. multocida et/ou la toxine, sont inactivées, détoxifiées et
associées à un adjuvant. Les adjuvants courants sont des sels d’aluminium ou des émulsions huileuses.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Pendant le processus industriel, les contrôles suivants doivent être entrepris :
a)
Pureté et identification des cultures de semences
Les cultures sont ensemencées sur une gélose au sang puis incubées. Aucune colonie non spécifique ne
doit se développer sur ces boîtes.
b)
Pureté et identification des cultures de production
Les cultures sont ensemencées sur une gélose au sang puis incubées. Aucune colonie non spécifique ne
doit se développer sur ces boîtes.
c)
Inactivation des cultures avant les traitements ultérieurs
Les cultures sont inactivées par le formol. Des tests sont réalisés afin de contrôler l’efficacité du processus
d’inactivation et d’évaluer le formol résiduel.
d)
Quantification des antigènes
Ceci est effectué par un comptage cellulaire global, en utilisant une enceinte de comptage des bactéries,
par la numération des cellules entières ou par la détermination des antigènes définis, ex : la toxine de
P. multocida par une épreuve immuno-enzymatique.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1191
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
4.
Contrôles des lots
a)
Stérilité
Chaque lot de vaccin doit être testé pour sa stérilité selon un protocole normalisé (voir Chapitre
1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ») décrit par la
Commission Européenne de la Pharmacopée ou par le code de réglementation fédéral des États-Unis
d’Amérique.
b)
Innocuité
Chaque lot de vaccin doit être testé pour son innocuité chez l’espèce animale cible, en donnant une double
dose par la voie de vaccination recommandée, et dans un deuxième temps, une simple dose, 2 semaines
plus tard. Aucune réaction locale ou systémique anormale ne doit apparaître.
c)
Activité
Chaque lot de vaccin doit être évalué pour son activité en utilisant une épreuve sérologique validée, en
corrélation avec la protection obtenue dans l’essai d’efficacité, comme décrit dans la section C.1.c.iii. Le test
d’activité n’est pas nécessairement conduit chez l’espèce animale cible – souris ou lapins peuvent être
utilisés. Dans ces derniers cas, une corrélation avec le taux des anticorps protecteurs chez l’animal cible
doit être démontrée.
d)
Durée de l’immunité
Normalement, le vaccin est utilisé dans la dernière phase de la gestation, ainsi les porcelets seront-ils
protégés par les anticorps d’origine colostrale.
Lorsque la vaccination est appliquée sans tenir compte du stade de la gestation, la durée de l’immunité
devrait être de 6 mois au moins, aussi les rappels de vaccination 2 fois par an devraient-ils maintenir les
taux d’anticorps protecteurs.
e)
Stabilité
Chaque lot de vaccin doit faire l’objet d’un test de durée de vie accélérée, qui doit être corrélée avec
l’épreuve de durée de vie en temps réel.
f)
Agents de conservation
Lorsqu’un agent de conservation est utilisé, la concentration doit être mesurée pour chaque lot. Il ne doit
pas excéder le niveau maximal autorisé.
g)
Précautions d'emploi et mise en garde
Lorsqu’une émulsion huileuse est utilisée comme adjuvant, l’injection accidentelle peut provoquer une
réaction locale chez l’opérateur. Un examen médical doit être immédiatement pratiqué, effectuer une
aspiration au niveau de la blessure à l’aide d’une pompe.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Chaque lot de vaccin doit être testé pour son innocuité, comme décrit dans la section C.4.b.
b)
Activité
Chaque lot de vaccin doit être testé pour son activité, comme décrit dans la section C.4.c.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
ACKERMANN M.R., DEBEY M.C., REGISTER K.B., LARSON D.J. & KINYON J.M. (1994). Tonsil and turbinate
colonization by toxigenic and nontoxigenic strains of Pasteurella multocida in conventionally raised swine. J.
Vet. Diagn. Invest., 6, 375–377.
1192
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
2.
BORDING A., NYMARK K. & SMIDT E. (1994). Field trials with a new genetically engineered vaccine for
protection against progressive atrophic rhinitis in pigs. Acta Vet. Scand., 35, 155–163.
3.
CARTER G.R. (1955). Studies on Pasteurella multocida. I. A hemagglutination test for the identification of
serological types. Am. J. Vet. Res., 16, 481–484.
4.
CARTER G.R. & RUNDELL S.W. (1975). Identification of type A strains of P. multocida using staphylococcal
hyaluronidase. Vet. Rec., 96, 343.
5.
CARTER G.R. & SUBRONTO P. (1973). Identification of type D strains of Pasteurella multocida with acriflavine.
Am. J. Vet. Res., 34, 293–294.
6.
CHANTER N., RUTTER J.M. & LUTHER P.D. (1986). Rapid detection of toxigenic Pasteurella multocida by an
agar overlay method. Vet. Rec., 119, 629–630.
7.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1992). Commission Directive 92/18/EEC of the 20th March
1992 modifying the annex to Council Directive 81/852/EEC on the approximation of the laws of member
states relating to analytical, pharmotoxicological and clinical standards and protocols in respect of the testing
of veterinary medical products. Off. J. European Communities.
8.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1994). CVMP Working Party on the Efficacy of Veterinary
Medicines. Note for Guidance. Rue de la Loi 200, B-1049, Brussels, Belgium.
9.
DE JONG M.F. (2006). In: Diseases of Swine, Ninth Edition, Straw B.E., Zimmerman J.J., d’Allaire S..& Taylor
D.J., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, 577–602.
10. DE JONG M.F. & BORST G.H. (1985). Selective medium for the isolation of P. multocida and B. bronchiseptica.
Vet. Rec., 116, 167.
11. DJORDJEVIC S.P., EAMENS G.J., HA H., WALKER M.J. & CHIN J.C. (1998). Demonstration that Australian
Pasteurella multocida isolates from sporadic outbreaks of porcine pneumonia are non-toxigenic (toxA-) and
display heterogeneous DNA restriction endonuclease profiles compared with toxigenic isolates from herds
with progressive atrophic rhinitis. J. Med. Microbiol., 47, 679–688.
12. DONE J.T. (1976). Porcine atrophic rhinitis: snout radiography as an aid to diagnosis and detection of the
disease. Vet. Rec., 98, 23–28.
13. EAMENS G.J., KIRKLAND P.D., TURNER M.J., GARDNER I.A., WHITE M.P. & HORNITZKY C.L. (1988). Identification
of toxigenic Pasteurella multocida in atrophic rhinitis of pigs by in vitro characterisation. Aust. Vet. J., 65,
120–123.
14. FOGED N.T. (1992). Pasteurella multocida toxin. The characterisation of the toxin and its significance in the
diagnosis and prevention of progressive atrophic rhinitis in pigs. APMIS Suppl., 25, 1–56.
15. GARDNER I.A., KASTEN R., EAMENS G.J., SNIPES K.P. & ANDERSON R.J. (1994). Molecular fingerprinting of
Pasteurella multocida associated with progressive atrophic rhinitis in swine herds. J. Vet. Diagn. Invest., 6,
442–447.
16. GATLIN C.L., JORDAN W.H., SHRYOCK T.R. & SMITH W.C. (1996). The quantitation of turbinate atrophy in pigs
to measure the severity of induced atrophic rhinitis. Can. J. Vet. Res., 60, 121–126.
17
HAREL J., CÔTÉ S. & JACQUES M. (1990). Restriction endonuclease analysis of porcine Pasteurella multocida
isolates from Quebec. Can. J. Vet. Res., 54, 422–426.
18. HEDDLESTON K.L., GALLAGHER J.E. & REBERS P.A. (1972). Fowl cholera: gel diffusion precipitation test for
serotyping Pasteurella multocida from avian species. Avian Dis., 16, 925–936.
19. KAMP E.M., BOKKEN G.C., VERMEULEN T.M., DE JONG M.F., BUYS H.E., REEK F.H. & SMITS M.A. (1996). A
specific and sensitive PCR assay suitable for large-scale detection of toxigenic Pasteurella multocida in
nasal and tonsillar swabs specimens of pigs. J. Vet. Diagn. Invest., 8, 304–309.
20. KAMPS A.M., BUYS W.E., KAMP E.M. & SMITS M.A. (1990). Specificity of DNA probes for the detection of
toxigenic Pasteurella multocida subsp. multocida strains. J. Clin. Microbiol., 28, 1858–1861.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
1193
Chapitre 2.8.2. — Rhinite atrophique du porc
21. KOBISCH M. & NOVOTNY P. (1990). Identification of a 68 kilodalton outer membrane protein as the major
protective antigen of Bordetella bronchiseptica by using specific-pathogen-free piglets. Infect. Immun., 58,
352–357.
22. LARIVIERE S., LEBLANC L., MITTAL K.R. & MARTINEAU G.P. (1993). Comparison of isolation methods for the
recovery of Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida from the nasal cavities of piglets. J. Clin.
Microbiol., 31, 364–367.
23. LICHTENSTEIGER C.A., STEENBERGEN S.M., LEE R.M., POLSON D.D. & VIMR E.R. (1996). Direct PCR analysis for
toxigenic Pasteurella multocida. J. Clin. Microbiol., 34, 3035–3039.
24. MAGYAR T., KOVÁCS F., DONKÓ T., BÍRÓ H., ROMVÁRI R., KOVÁCS M. & REPA I. (2003). Turbinate atrophy
evaluation in pigs by computed tomography. Acta Vet. Hung., 51, 485–491.
25. NAGAI S., SOMENO S. & YAGIHASHI T. (1994). Differentiation of toxigenic from nontoxigenic isolates of
Pasteurella multocida by PCR. J. Clin. Microbiol., 32, 1004–1010.
26. PEDERSEN K.B., NIELSEN J.P, FOGED N.T., ELLING F., NIELSEN N.C. & WILLEBERG P. (1988). Atrophic rhinitis in
pigs: proposal for a revised definition. Vet. Rec., 122, 190–191.
27. PEJSAK Z., WASIŃSKA B., MARKOWSKA-DANIEL I. & HOGG A. (1994). Field evaluation of thirteen regimens for the
control of progressive atrophic rhinitis. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 17, 125–132.
28. PENNINGS A.M. & STORM P.K. (1984). A test in vero cell monolayers for toxin production by strains of
Pasteurella multocida isolated from pigs suspected of having atrophic rhinitis. Vet. Microbiol., 9, 503–508.
29. QUINN P.J., CARTER M.E., MARKEY B. & CARTER G.R. (1994). Pasteurella species. In: Clinical Veterinary
Microbiology. Wolfe Publishing, London, United Kingdom, 254–258.
30. QUINN P.J., CARTER M.E., MARKEY B. & CARTER G.R. (1994). Bordetella species. In: Clinical Veterinary
Microbiology. Wolfe Publishing, London, United Kingdom, 280–283.
31. REGISTER K.B. & DEJONG K.D. (2006). Analytical verification of a multiplex PCR for identification of Bordetella
bronchiseptica and Pasteurella multocida from swine. Vet. Microbiol., 117, 201–210.
32. REGISTER K.B., LEE R.M. & THOMSON C. (1998). Two-color hybridization assay for simultaneous detection of
Bordetella bronchiseptica and toxigenic Pasteurella multocida from swine. J. Clin. Microbiol., 36, 3342–3346.
33. REGISTER K.B., SACCO R.E. & BROCKMEIER S.L. (2007). Immune response in mice and swine to DNA vaccines
derived from the Pasteurella multocida toxin gene. Vaccine, 25, 6118–6128.
34. RUTTER J.M. & LUTHER P.D. (1984). Cell culture assay for toxigenic Pasteurella multocida from atrophic
rhinitis of pigs. Vet. Rec., 114, 393–396.
35. SMITH I.M. & BASKERVILLE A.J. (1979). A selective medium facilitating the isolation and recognition of
Bordetella bronchiseptica in pigs. Res. Vet. Sci., 27, 187–192.
36. TO H., SOMENO S. & NAGAI S. (2005). Development of a genetically modified nontoxigenic Pasteurella
multocida toxin as a candidate for use in vaccines against progressive atrophic rhinitis in pigs. Am. J. Vet.
Res., 66, 113–118.
37. TOWNSEND K.M., BOYCE J.D., CHUNG J.Y., FROST A.J. & ADLER B. (2001). Genetic organization of Pasteurella
multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol., 39, 924–
929.
38. VENIER L., ROTHSCHILD M.F. & WARNER C.M. (1984). Measurement of serum antibody in swine vaccinated
with Bordetella bronchiseptica: comparison of agglutination and enzyme-linked immunosorbent assay
methods. Am. J. Vet. Res., 45, 2634–2636.
*
* *
1194
Manuel terrestre de l’OIE 2008