Table des matières

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
Faculté des Sciences de Luminy
Ecole Doctorale des Sciences de la vie et de la Santé
THESE DE DOCTORAT
En vue de l’obtention du grade de docteur de
l’Université de la Méditerranée
spécialité Neurosciences
Présentée et soutenue publiquement par
Nathalie BERNARD-MARISSAL
le 24 Octobre 2011
Implication de la Calréticuline et de CRMP4 dans la dégénérescence
des motoneurones dans la Sclérose Latérale Amyotrophique
Jury de Thèse
Pr. Smita SAXENA: Rapporteur
Pr. Frédéric CHARBONNIER: Rapporteur
Pr. Gwendal LE MASSON: Examinateur
Pr. Sophie CHAUVET: Président
Dr. Brigitte PETTMANN: Directeur de Thèse
1
Remerciements
REMERCIEMENTS
Des milliers de merci….
Tout d’abord, je souhaite remercier sincèrement les professeurs Smita Saxena, Frédéric
Charbonnier, Gwendal Le Masson et Sophie Chauvet, de m’avoir fait l’honneur d’accepter d’être les
membres de mon jury de thèse. Je leur souhaite une bonne lecture et une bonne expertise…
Mes remerciements se tournent ensuite vers les membres de mon équipe :
Brigitte, j’ai passé de très bonnes années à tes côtés et je te remercie de tout cœur de m’avoir choisie
en thèse. Merci de m’avoir initiée à la passion des motoneurones, de m’avoir permis d’aller à de nombreux
congrès, de ta disponibilité et d’avoir été à mon écoute, de m’avoir appris la patience, de m’avoir
soutenue quand ça ne marchait pas et de tes nombreuses lectures de mon manuscrit… je te souhaite une
bonne continuation dans tes nouveaux projets !
Cédric, un grand merci pour ton expertise scientifique, tes idées d’expériences qui «ne mange pas de
pain », ton écoute et ton soutien. Je t’adresse mes meilleurs vœux pour la continuité d’un avenir brillant !
Juju, lis celle-là : c’est deux oranges qui traversent la route et une d’entre elle se fait écraser, à ce
moment-là l’autre orange dit : « tu te presses Juju ? ». Tu ne la connaissais pas, n’est-ce pas Julianne ?
Blague à part, je te remercie d’avoir été ma voisine de bureau de gauche puis de droite et d’avoir si
patiemment supporté mes tentatives d’invasion de ton espace bureautique… Je garde de très bons
souvenirs de nos multiples expéditions, je te souhaite beaucoup de bonheur et de réussite.
Claire, un sincère merci pour tes connaissances techniques, pour ton aide aux cultures embryon par
embryon, pour tes fleurs sur tes tuniques et pour me faire rêver en me parlant aussi souvent de l’Italie…
Un grand merci à mon voisin de bureau Belka pour m’avoir permis de défouler mon index droit sur son
épaule, pour ton sens de l’orientation à Cambridge et pour tes blagues d’un niveau aussi élevé que les
miennes ;)
Merci à Anice pour ses chansonnettes à répétition, pour ses coups de main scientifique et pour sa
maîtrise technique du western blot !
Thibault, merci pour ta touche marseillaise et qu’est-ce-que tu joues bien au violon….
Keith, merci d’être anglais, de ton accent, de ton humour…
Ils sont partis avant, mais je ne les oublie pas…
Alexia, tes « quand est-ce qu’on mange ? » à 9 heures du matin me manquent, comme ta bonne humeur,
bonne continuation à Montpellier.
Isabelle (qui « a les yeux verts-noisette »), je te remercie pour ton aide précieuse, tes astuces, ta
bonne humeur, tes gâteaux.. Beaucoup de bonheur à toi et à tes hommes !
Karine et Laure, vous étiez là à la naissance de l’équipe, j’ai été ravi de passer quelques années avec vous
à bien rigoler !
Je remercie le directeur du laboratoire, Dr Alfonso Represa, de m’avoir accueillie dans son institut, au
sein duquel j’ai passé de très bonnes années.Merci à Bahija pour sa gentillesse et ses compétences.
Merci à l’AFM de m’avoir apportée son soutien pour ma 4ème année de thèse.
2
Remerciements
Je tiens à remercier également les amis du laboratoire et de la fac’
Romain, je nous compare un peu toi, Tom et moi, aux trois mousquetaires et leur un pour tous, tous pour
un (sans prétention) car, tous les trois nous nous sommes soutenus tout au long de cette thèse. Merci
pour nos franches rigolades et de ton amitié. Je vous souhaite beaucoup de bonheur et de réussite à toi
et Vaness.
Damien, je te remercie pour ton humour pince sans rire dont je suis assez fan et pour avoir été une
journée mon garde du corps ;). Bonne thèse à toi et du bonheur à votre couple.
En vrac je voudrais remercier l’ensemble de nos amis du « restaurant universitaire » : Raphaël et
Prunelle pour votre cynisme, Mikado pour ta gentillesse et ta joie de vivre communicatrice, Laurent
Günther pour ton calme olympien (et tes blagues), Lamine, Robin pour votre bonne humeur (bonne chance
les petits thésards), Aurélie, Sébastien, Jonathan pour votre si longue amitié…
Je suis très reconnaissante du soutien de ma famille…
Un grand merci à Papa et Maman pour m’avoir donnée toutes les clefs en main pour une belle vie et pour
votre amour ! Mention spéciale à ma maman Jocelyne pour m’avoir appris à être assidue et à beaucoup
travailler, pour ta présence et pour tes attentions.
Je remercie mes beaux-parents Flo et Clo pour leur gentillesse et leurs encouragements.
Merci à Chéchia pour sa lecture attentive et ses bons conseils, à Fabien et à Ananas pour leur bonne
humeur.
Plus largement, je remercie ceux qui sont là pour moi: mon papy, ma mamie, mes cousins que je considère
comme mon frère et ma sœur (lolo et fanny), Amandine, Jean-Luc et sa famille et tous ceux qui
assisteront à ma soutenance (cela me touche beaucoup).
Le meilleur se garde pour la fin et ce sera pour toi Thomas.
Pour toi ce sera mille mercis au moins pour ta présence, ton aide ô combien précieuse (tu connais
Calréticuline presque aussi bien que moi maintenant), tes blagues qui me font mourir de rire (bon ok pas
tout le temps), tes attentions et ton amour. Je nous prédis un avenir radieux !
3
Résumés
RESUME
Implication de la Calréticuline et de CRMP4 dans la dégénérescence des motoneurones dans la
Sclérose Latérale Amyotrophique
La Sclérose Latérale Amyotrophique se caractérise par la perte sélective de motoneurones (MNs) du cortex,
du tronc cérébral et de la moelle épinière. Les souris surexprimant le gène humain muté codant pour la
superoxide dismutase 1 (mSOD1) constitue un bon modèle d’étude. Les MNs mSOD1 présentent une
hypersensibilité à la mort après activation du récepteur Fas et la production d’oxyde nitrique (NO). Notre
étude protéomique a identifié deux effecteurs du NO, la calréticuline (CRT) et CRMP4. CRT est une protéine
chaperonne de stockage du calcium dans le réticulum endoplasmique. Nous montrons que, in vivo, CRT
diminue de moitié dans une sous-population de MNs mSOD1 dits vulnérables, car dégénérant les premiers. Sa
diminution est nécessaire et suffisante pour induire la mort des MNs mSOD1 en activant le stress du RE.
CRMP4 est une protéine de régulation de la croissance axonale, qui augmente in vivo dans les MNs mSOD1 à
un stade pré-symptomatique. Sa surexpression est suffisante pour induire une dénervation périphérique et la
dégénérescence de MNs mSOD1. Nos résultats mettent en évidence CRT et CRMP4 comme étant deux cibles
thérapeutiques potentielles dans la SLA.
Involvement of Calreticulin and CRMP4 in motoneuron degeneration in Amyotrophic Lateral
Sclerosis
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is characterized by the selective degeneration of upper and lower
motoneurons (MNs). The most common familial form and best characterized mouse model of ALS is linked to
mutations in the gene coding for the superoxide dismutase 1 (mSOD1). MNs expressing mSOD1 show an
increased sensitivity to the death induced by Fas/NO activation. Our proteomic study identified two
downstream effectors of NO, Calreticulin (CRT) and CRMP4. CRT is a chaperone-calcium-binding protein of
the endoplasmic reticulum, which is decreased two-fold in vivo, in an early degenerating MNs sub-population,
named vulnerable. The decrease in CRT expression is both necessary and sufficient to kill mSOD1 MNs
through ER stress activation. CRMP4 is a neurite outgrowth regulator which expression is increased in vivo in
mSOD1 MNs at a presymptomatic stage. CRMP4 overexpression is sufficient to induce peripheral denervation
and, through a dying-back effect, to kill mSOD1 MNs. Our results point out CRT and CRMP-4 as two potential
therapeutic targets for ALS.
4
5
Table des matières
Table des matières
REMERCIEMENTS
RESUME
Table des matières
Table des Figures
Table des Tableaux
Liste des abbreviations
INTRODUCTION
Avant propos :
I. La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA): une maladie dégénérative du motoneurone
A) Présentation générale
B) Epidémiologie
C) Diagnostic, symptômes cliniques, prise en charge du patient
D) Caractéristiques histopathologiques chez les patients SLA
1. Une perte neuronale associée à une gliose
2. Les inclusions
a) Les corps de Bunina
b) Les inclusions ubiquitinylées
c) Les inclusions neurofilamenteuses ou conglomérats de Hyaline
E) Les formes familiales et sporadiques dans la SLA
1. Les formes sporadiques
a) une implication de l’environnement
b) des gènes de susceptibilité ?
2. Les formes familiales
a) Gène codant pour une protéine à activité catalytique de défense contre les radicaux libres
b) Les gènes codant pour des protéines nucléaires de liaison à ADN/ARN :
c) Les gènes codant pour des protéines impliquées dans le trafic /transport vésiculaire
d) Le gène ANG codant pour une protéine à fonction angiogénique
e) Le gène VCP codant pour une protéine impliquée dans la dégradation des protéines
II. Les modèles d’étude de la SLA :
A) Les modèles murins
1. Les souris SOD1
a) La souris déficiente en SOD1
b) Les souris SOD1 mutantes transgéniques
c) Les souris transgéniques pour la SOD1 sauvage: SOD1WT
2. Les souris TDP-43
a) Les souris déficientes en TDP-43
b) Les souris surexprimant la protéine TDP-43 sauvage ou mutée
3. Les souris VAPB
4. Les souris Alsine
B) Autres modèles SLA in vivo
1. Le modèle rat
a) Les rats SOD1G93A
b) Les rats SOD1H46R
c) Les rats TDP-43
d) Les rats FusR521C
2. Le modèle canin: myélopathie dégénérative canine
3. Les modèles invertébrés : la drosophile et Caenorhabditis-elegans (C-elegans)
a) Les modèles drosophiles d’étude de la SLA
2
4
6
10
10
11
14
15
17
17
20
21
24
24
24
24
24
25
26
26
26
27
28
29
31
35
38
38
40
40
40
40
41
47
49
49
49
50
50
51
51
51
52
52
53
55
55
56
6
Table des matières
b) Le modèle C. elegans :
C) Les modèles in vitro d’étude de la SLA
1. Culture primaire de motoneurones :
2. Les lignées cellulaires « motoneuronales »
3. Les motoneurones issus des cellules souches embryonnaires
4. Les tranches organotypiques
III. Mécanismes physiopathologiques décrits dans les modèles souris de la SLA
A) Le stress oxydatif
B) Agrégation de la protéine SOD1 mutée
C) Défaillance du système ubiquitine-protéasome
D) Dysfonctionnement de la mitochondrie
E) Perturbation du transport axonal
1. Définition générale
2. Un transport axonal défectueux
3. Déplétion en neurotrophine
F) Perturbation des voies de sécrétion dans la SLA : mise en cause de l’appareil de Golgi et du réticulum
endoplasmique
1. Anomalies morphologiques du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi
2. Sécrétion de la SOD1 mutée: un nouveau mécanisme de toxicité
G) Participation des cellules environnantes dans la SLA
1. Mise en évidence de l’implication des cellules non-motoneuronales
2. Implication des cellules gliales
a) Activation astrocytaire et microgliale dans la SLA
b) Mise en évidence de l’implication des cellules gliales sur le déroulement de la maladie
3. Implication des muscles
H) L’excitotoxicité dans la SLA
1. Définition
2. Les motoneurones SOD1G93A, le glutamate et le calcium:
IV. Dysfonctionnement du Réticulum Endoplasmique (RE) dans la SLA :
A) Fonction et organisation du RE
B) La synthèse protéique et le service « contrôle qualité » du RE
1. L’entrée dans le RE
2. Le repliement et la maturation des polypeptides
3. Le service « contrôle-qualité » du RE
C) Le RE: une réserve majeure de calcium pour la cellule
1. Les protéines de liaison au calcium
2. L’entrée et la sortie de calcium
D) Le stress du Réticulum Endoplasmique : le yin et le yang
1. La réponse UPR (« Unfolded Protein Response »): le yin
2. La réponse apoptotique liée au RE : le yang
E) Le stress du RE dans la SLA: une signature pathologique précoce
1. Induction du stress du RE par la SOD1 mutée
a) Agrégation de la SOD1 mutée dans le RE:
b) Inhibition du processus de dégradation liée au RE : l’ERAD
2. Mise en évidence de la présence de marqueurs du stress du RE
3. Le stress du RE : une signature précoce de dégénérescence du motoneurone
4. Le stress du RE dans d’autres modèles de SLA
a) La protéine VAPB
b) La protéine TDP-43
V. Le motoneurone SOD1 mutant dans l’arène : le rituel de la mise à mort
A) Les premières banderilles: une dénervation séquentielle des muscles dans la SLA
1. Diversité des motoneurones
2. Une dénervation sélective selon le sous-type de motoneurones dans la SLA
3. Des candidats locaux pouvant participer à la dénervation des muscles dans la SLA
a) L’hypermétabolisme du muscle squelettique
56
57
57
58
59
60
62
62
66
68
69
70
70
70
72
73
74
74
76
76
77
78
79
80
81
81
81
85
85
86
86
86
88
90
90
91
93
93
96
98
98
98
98
99
99
101
101
102
103
103
104
106
108
108
7
Table des matières
b) Candidats moléculaires pouvant participer à la dénervation des muscles
B) L’estocade ou le coup d’épée mortel : la mort cellulaire par apoptose
Il existe plusieurs mécanismes de mort cellulaire:
1. Généralités sur l’apoptose
a) La voie extrinsèque de mort: les récepteurs de mort
(Figures 17 et 18)
b) la voie intrinsèque de l’apoptose
(Figure 18)
2. L’apoptose dans la SLA : implication de la voie intrinsèque
a) Aspects morphologiques et marqueurs apoptotiques chez les souris et les patients « SLA »
b) Activation de l’apoptose dans la SLA
3. L’apoptose dans la SLA : implication de la voie extrinsèque
a) p75 neurotrophin receptor (p75 NTR): le récepteur au NGF
b) Le récepteur au TNFα
c) Le récepteur à LIGHT: LT-βR
d) Le récepteur Fas et son ligand FasL
RESULTATS
108
110
110
111
111
111
114
114
117
117
119
121
121
122
123
124
130
I. Introduction des Résultats du projet Calréticuline
A) Contexte de l’étude
B) Synthèse des résultats
II) Article scientifique sur la Calréticuline
III. Introduction des résultats du projet CRMP4
A) Contexte de l'étude
B) Synthèse des résultats
IV) Article scientifique sur CRMP4
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
132
132
133
135
182
182
183
185
202
I. Discussion: Calréticuline, un facteur de vulnérabilité des motoneurones mSOD1
A) Mécanismes de la vulnérabilité d’une sous population de motoneurones exprimant la SOD1 mutée
(mSOD1): rôle du « cercle vicieux » Fas/NO?
B) La perturbation de l’homéostasie calcique dans les motoneurones mSOD1 vulnérables dans la maladie
1. Le calcium et la vulnérabilité des motoneurones: La mort des motoneurones mSOD1 par Fas/NO
implique des défauts d’homéostasie calcique
2. Le calcium et la vulnérabilité des motoneurones: pourquoi une forte concentration de calcium
intracellulaire est-elle toxique en particulier pour les motoneurones mSOD1 ?
C) Le stress du RE: un signal précoce de vulnérabilité des motoneurones mSOD1
1. L’augmentation du stress du RE, un signe pathologique précoce bien avant la mort des
motoneurones mSOD1 in vitro et in vivo
2. L’agrégation de protéines un facteur initiateur du stress du RE
D) La diminution de la calréticuline est un facteur de vulnérabilité des motoneurones mSOD1 à la mort
1. La diminution de la calréticuline tue les motoneurones mSOD1 en recrutant le stress du RE
2. Par quels mécanismes la Calréticuline peut elle être diminuée ?
E) L’implication des chaperonnes du RE dans d’autres maladies neurodégénératives
F) Une perturbation de l’homéostasie protéique dans les maladies neurodégénératives
1. Généralités sur le maintien de l’homéostasie protéique
2. L’implication des défauts d’homéostasie protéique dans les cas sporadiques, majoritaires, de ces
maladies
II) Perspectives du projet Calréticuline
A) Peut-on modifier le déroulement de la maladie en modulant les niveaux de calréticuline?
1. La diminution de la Calréticuline dans les souris SOD1G93A
2. La surexpression de la Calréticuline
III) Discussion : CRMP4, un facteur impliqué dans la dénervation périphérique et la mort des motoneurones
203
203
205
205
208
209
209
212
214
214
216
219
220
220
221
223
223
223
229
231
8
Table des matières
A) L’augmentation de CRMP4a dans les motoneurones induit une dégénérescence spécifique des
motoneurones in vitro
1. CRMP4 a un effet inhibiteur sur la croissance neuritique des motoneurones in vitro
2. CRMP4 induit la dégénérescence axonale et la mort des motoneurones
B) L’augmentation de CRMP4 in vivo est suffisante pour causer la mort des motoneurones par une
dégénérescence rétrograde
1. CRMP4 augmente dans les motoneurones mSOD1 dès les stades pré-symptomatiques
2. Comment la surexpression de CRMP4 peut-elle avoir un rôle dans la dénervation des jonctions
neuromusculaires des souris mSOD1?
C) Implication des protéines CRMPs dans d’autres maladies neurodégénératives
IV) Perspectives du projet CRMP4
V) Conclusion Générale
REFERENCES
231
231
234
235
235
236
238
239
242
246
9
Table des Figures et des Tableaux
Table des Figures
Figure 1 Présentation des neurones moteurs touchés dans la SLA........................................................18
Figure 2 Organisation de la voie pyramidale (voie corticospinal tract) ..................................................19
Figure 3 Les inclusions dans les neurones moteurs des patients SLA ...................................................25
Figure 4 Structure et fonction de la superoxyde dismutase 1 (SOD1) ..................................................30
Figure 5 Séquence d’apparition des événements cliniques et neuropathologiques chez les souris à
nombreuses copies SOD1G93A .......................................................................................................................44
Figure 6 Causes et conséquences du stress oxydatif dans la SLA..........................................................64
Figure 7 Production d’anions superoxides par la microglie en présence de SOD1 mutée ..................65
Figure 8 Toxicité liée à la formation d’agrégats de SOD1 mutée ...........................................................67
Figure 9 Rôle de la SOD1 mutée dans le processus d’excitotoxicité des motoneurones ....................83
Figure 10 Vue d’ensemble des mécanismes de toxicité dans la SLA liée à la SOD1 mutée ...............84
Figure 11 Contrôle-qualité des protéines du RE assuré par les chaperonnes Calréticuline et
Calnexine .........................................................................................................................................................89
Figure 12 Rôle physiologique du Réticulum Endoplasmique (RE) ..........................................................92
Figure 13 La réponse d’adaptation au stress du RE, la réponse UPR (« Unfolded Protein Response »)
..........................................................................................................................................................................95
Figure 14 La réponse apoptotique liée au stress du RE ...........................................................................97
Figure 15 Caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des motoneurones alpha ..................105
Figure 16 Séquence de dénervation des jonctions neuromusculaires des souris SOD1G93A .............107
Figure 17 La superfamille des TNFR et leurs ligands..............................................................................113
Figure 18 Les voies apoptotiques intrinsèques et extrinsèques dans la SLA ......................................116
Figure 19 Cellule apoptotique à un stade avancé de la maladie chez les souris SOD1G93A...............118
Figure 20 Les motoneurones SOD1 mutants sont vulnérables in vitro à la voie de mort Fas/NO ..126
Figure 21 La diminution de Calréticuline induit une augmentation du niveau protéique de CHOP.215
Figure 22 La SOD1 mutée co-immunoprécipite avec la calréticuline ...................................................217
Figure 23 Tests de comportements effectués..........................................................................................225
Figure 24 Résultats des tests comportementaux ....................................................................................227
Figure 25:Courbes de probabilités du déclenchement de la maladie et de la survie chez les souris
SOD1G93A et SOD1G93A/+ ; CRT+/- .................................................................................................................228
Figure 26 Test de fonctionnalité des AAV6-shRNA CRMP4 ....................................................................240
Figure 27 Schéma récapitulatif des rôles de Calréticuline et de CRMP4 dans le processus de mort du
motoneurone mSOD1 ..................................................................................................................................244
Table des Tableaux
Tableau 1 Définition du diagnostic de la SLA ................................................................................. 22
Tableau 2 Récapitulatif des gènes impliqués dans la SLA « adulte » ......................................... 33
Tableau 3 Récapitulatif des gènes impliqués dans la SLA « juvénile » et les Démences Frontotemporale ............................................................................................................................................. 34
Tableau 4 Les modèles souris et rat surexprimant la SOD1 mutée ............................................ 48
Tableau 5 Les modèles souris et rats TDP-43 et Fus .................................................................... 54
10
Liste des abbréviations
Liste des abbreviations
AAV6: “Adeno-Associated Virus 6”
ADN: Acide désoxyribonucléique
AG: Appareil de Golgi
AIF: “Apoptosis-Inducing Factor”
AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate
ANG: Angiogénine
ANT: “Adenin Nucleotide Translocator”
APAF-1: “Assembly from apoptotic Protease-Activating Factor-1”
ARN: Acide ribonucléique
ARNm: ARN messager
ASK-1: “Apoptosis Signal regulating Kinase 1”
ATF4: “Activating Transcription Factor-4”
ATF6: “Activating Transcription Factor 6”
ATP: Adénosine triphosphate
Bak: “Bcl-2 homologous Antagonist/Killer”
Bax: “Bcl-2–Associated X protein”
Bcl2: “B-Cell Lymphoma 2”
BDNF: “Brain-Derived Neurotrophic Factor”
Bid: “BH3-Interacting Domain death agonist”
BIM: “BCL-2-Interacting Mediator of cell death”
BIP: “Binding Immunoglobulin Protein”
CARD: “Caspase Recruitment Domain”
cFLIP: “cellular FLICE/caspase 8-like inhibitory protein”
CHG: Chromogranine B
CHOP: “CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) Homologous Protein”
CNTF: “Cilliary NeuroTrophic Factor”
CNX: Calnexine
CRD: “Cysteine Rich Domain”
CRMPs: “Collapsin Response Mediator Protein”
CRT: Calréticuline
DAXX: “Death Domain-Associated Protein”
DcR3: “Decoy Receptor 3”
DD: “Death Domain”
DED: “Death Effector Domain”
DFT: Démence Fronto-Temporale
DISC: “Death-Inducing Signaling Complex”
EAAT1/2: “Excitatory Amino-Acid Transporter 1 ou 2”
EDEM: “ER Degradation Enhancing Mannosidase like protein”
eIF2α: “eukaryotic Initiation Factor 2 alpha”
ERO1α: “ER Oxidoreductin 1”
ESC: “Embryonic Stem Cell”
FADD: “Fas-Associated protein with Death Domain”
FasL: Fas Ligand
FF: “Fast Fatigable”
FGF: “Fibroblast Growth Factor”
FR: “Fast Resistant”
FUS: “Fused in Sarcoma”
GDNF: “Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor”
GFAP: “Glial Fibrillary Acidic Protein”
GLAST: “Glutamate Aspartate Transporter”
GLT-1: “Glutamate Transporter 1”
11
Liste des abbréviations
GRP78: “Glucose-Regulated Protein 78 kDa”
HSP: “Heat Shock Protein”
HVEM: “Herpes Virus Entry Mediator”
IAP: “Inhibitor of Apoptosis Proteins”
INFγ:Interféron gamma
iNOS: Oxyde nitrique synthétase inductible
IP3R: Inositol 1,4,5-triphosphate
IRE1α: “Inositol-Requiring Enzyme 1α”
JIV: Jour in vitro
JNK: “c-Jun N-terminal kinases”
l’ERAD: “ER-Associated Degradation”
IGF-1: “Insuline-like Growth Factor I”
LIGHT: “Lymphotoxin-related Inducible ligand that competes for Glycoprotein D binding to Herpes
virus entry mediator on T cells”
LT-β-R: récepteur lymphotoxin-β
MAP1: “Microtubule-Associated-Protein1”
MN: Motoneurone
MND: Maladie Neurodégénérative
mPTP: Pore de transition à la membrane mitochondriale
mSOD1: Superoxyde Dismutase 1 mutée ou mutant
NADPH: Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate
NF: Neurofilaments
NF-E2: “Nuclear factor -erythroid-derived 2”
NFH: Neurofilaments à chaîne lourde
NFL: Neurofilaments à chaîne légère
NFM: Neurofilaments à chaîne moyenne
Nfr2: “NF-E2-related factor-2”
NGF: “Nerve Growth Factor”
NMDA: N-méthyl-D-aspartate
NMJ: “Neuromuscular junction
nNOS: Oxyde nitrique synthétase neuronale
NO: Oxyde nitrique
Nogo-A: “Neurite outgrowth inhibitor”
NOS: Oxyde nitrique synthétase
Nox2: NADPH oxidase 2
OPTN: Optineurine
PDI:Protein Disulfide Isomérase
P-eIF2α: eIF2α phosphorylé
PERK: “Protein Kinase-like ER Kinase”
PUMA: “P53 upregulated modulator of apoptosis”
RE: Réticulum Endoplasmique
ROS: Dérivés réactifs de l’oxygène
RyR: Récepteur à la Ryanodine
S: “Slow”
Sema3a: Sémaphorine 3A
SERCA: “Sarcoplasmic or Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase”
SETX: Sénataxine
Shh: “Sonic hedgehog”
SLA : Sclérose Latérale Amyotrophique
SLAF : SLA Familiale
SLAS: SLA Sporadique
Smac/DIABLO: “Second Mitochondria-derived Activator of Caspase/ Direct Inhibitor of ApoptosisBinding Protein with LOw pI”
SOD1: SuperOxyde Dismutase 1
12
Liste des abbréviations
TDP-43: “TAR DNA-binding Protein 43”
TNFR: “Tumor Necrosis Factor Receptor”
TNFα: “Tumor Necrosis Factor α »
TRADD:”TNF Receptor-Associated protein with Death Domain”
TRAF2:”TNF Receptor Associated Factor 2”
TrK: Tyrosine Kinase
UGGT: “UDP-glucose: Glycoprotein GlucosylTransferase”
UPR: “Unfolded Protein Response”
Vacht: “Vesicular Acetylcholin Transporter”
VAMP: “Vesicule Associated Membrane Protein”
VAPB: VAMP-Associated Protein type B
VCP: Valosine Containing Protein
VDAC: “Voltage-Dependent Anion Channel”
VEGF: “Vascular Endothelial Growth Factor”
VGF:”nerve growth factor inducible”
XBP1: “X-box Binding Protein 1”
XIAP: “X-linked IAP”
13
Introduction
INTRODUCTION
14
Introduction
Avant propos :
Les maladies neurodégénératives (MND) regroupent un ensemble de pathologies qui se
caractérisent par la dégénérescence progressive d’une population donnée de neurones entraînant, à
terme, une destruction d’une partie du système nerveux. Parmi les plus connues, la m aladie
d’Alzheim er est due à la dégénérescence sélective des neurones de projection du cortex
enthorinal vers le gyrus denté et des neurones pyramidaux de l’hippocampe CA1 (Hof and Morrison,
2004). Dans la m aladie de Parkinson , (Biskup and Moore, 2006) on observe une perte des
neurones dopaminergiques de la substance noire compacte. Dans le cas de la Sclérose Latérale
Am yotrophique (SLA) (Meininger, 2011), ce sont les neurones moteurs du cortex moteur, du
tronc cérébral et de la moelle épinière qui dégénèrent.
Selon les populations neuronales perdues, ces MNDs se manifestent par une atteinte majoritaire soit
des fonctions « cognitives » comme dans la maladie d’Alzheimer, soit des fonctions motrices dans la
maladie de Parkinson et la SLA, soit encore des deux fonctions comme dans le cas de la maladie de
Huntington.
Bien que certaines maladies neurodégénératives atteignent quelquefois l’enfant jeune ou le jeune
adulte (les Amyotrophies Spinales Infantiles et la maladie de Huntington), le facteur de risque
majeur est l’âge : elles se déclenchent essentiellement après 60 ans.
De multiples brochures de presse et les associations concernées soulignent l’augmentation du
nombre de personnes atteintes par ces maladies. En 2010, le nombre de patients Alzheimer dans le
monde s’élèvait à 35 millions de personnes (source le Monde.fr et Alzheimer Disease International)
et celui des Parkinsoniens à 4 millions (Le Monde .fr et National Parkinson Fundation); ces chiffres
devraient doubler d’ici 2030.
Enfin, la SLA est la maladie neurodégénérative la plus répandue après les maladies d’Alzheimer et
de Parkinson, ainsi que la première maladie touchant les motoneurones: 350 000 personnes environ
sont atteintes dans le monde. L’ensemble de ces maladies ne possède toujours pas de traitement
curatif, ce qui les place comme un réel problème de santé publique.
15
Introduction
La plupart de ces maladies liées à l’âge apparaissent de manière sporadique, c’est-à-dire qu’elles ne
sont pas liées à des antécédents familiaux, et seulement un petit pourcentage (entre 5 et 10%)
sont liées à l’implication de mutations dans des gènes. Ce qui reste étonnant, c’est que les gènes
impliqués dans ces maladies codent en général pour des protéines exprimées de manière
ubiquitaire, et non spécifiques à la sous classe de neurones préférentiellement touchée dans la
maladie (par exemple la superoxyde dismutase 1 pour la SLA, la parkine pour la maladie de
Parkinson, la presénilline 1 pour la maladie d’Alzheimer). Bien que les populations neuronales
ciblées soient différentes, des mécanismes physiopathologiques communs ont été identifiés : la
principale caractéristique commune est la présence d’agrégats et d’inclusions qui s’accumulent au
cours de l’évolution de la maladie. On retrouve également la présence d’agents oxydants et des
dysfonctionnements de certaines organelles (mitochondrie, réticulum endoplasmique).
De nombreux dysfonctionnements ont été identifiés en particulier dans la SLA (ils feront l’objet d’un
chapitre de cette thèse), mais la problématique réside dans la distinction entre « l’œuf et la poule »,
c'est-à-dire dans la détermination des liens de causalité que ces dysfonctionnements entretiennent,
afin d’identifier le (ou les) facteur(s) initiateur(s) de ces maladies. Dans cette optique, une stratégie
est de mettre en évidence les processus cellulaires qui sont perturbés très tôt -quelquefois bien
avant l’apparition des premiers symptômes- et qui pourraient être de bons candidats de thérapies
visant à empêcher l’initiation de ces pathologies.
L’équipe de recherche dans laquelle j’ai effectué ma thèse a l’ambition d’identifier des cibles
thérapeutiques potentielles pour la SLA, maladie dont nous présenterons les aspects généraux dans
une première partie. Pour cela, nous utilisons des souris exprimant la SOD1 humaine mutée qui
constituent le modèle le mieux caractérisé de la maladie (ce que nous verrons en partie II). Grâce à
ce modèle, de nombreux processus de toxicité affectant les motoneurones ont été mis en évidence;
ils seront traités dans la partie III, où nous décrirons plus spécifiquement le mécanisme de toxicité
le plus étudié pendant ma thèse, le stress du RE (partie IV). Ces processus de toxicité aboutissent à
une dégénérescence des motoneurones, que nous discuterons dans la partie V.
16
Introduction
I. La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA): une maladie
dégénérative du motoneurone
A)
Présentation générale
« Maladie de Lou Gehrig » aux Etats unis, « Motor Neuron Disease » en Grande Bretagne et
« maladie de Charcot » en Europe, sont autant d’appellations différentes pour désigner cette
maladie qu’est la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Historiquement, la SLA a été décrite en
1865 par un médecin français, Jean-Martin Charcot, chez des patients qui présentaient de fortes
contractures musculaires. Lors de l’autopsie des patients décédés de cette maladie, il observa une
sclérose (aspect fibreux du tissu) des cordons latéraux de la moelle épinière, causée par une
dégénérescence des motoneurones et par une invasion gliale, ce qu’il définit comme « sclérose
latérale ». Celle-ci s’accompagnait d’une atrophie des fibres musculaires entraînant une fonte des
muscles, d’où le terme « amyotrophie » (source ARS, (Wijesekera and Leigh, 2009).
La SLA est, par sa fréquence, la première maladie du motoneurone et se caractérise par une perte
progressive d’environ 50% des neurones moteurs (Figure 1) de la voie corticospinale, appelée
faisceau pyramidal (Figure 2), qui inclut les neurones du cortex cérébral (appelés motoneurones
supérieurs), ainsi que les neurones du tronc cérébral et de la moelle épinière (appelés
motoneurones inférieurs) (Meininger, 2011; Ticozzi et al., 2011) (Figure 2). Cette perte neuronale
est associée à une faiblesse, une atrophie et une spasticité musculaires, puis à une paralysie
progressive des membres qui aboutit à une mort généralement rapide du patient, environ 3 ans
après le diagnostic (Ticozzi et al., 2011). L’âge moyen du déclenchement de cette maladie se situe
entre 50 et 60 ans. D’un point de vue histologique, la SLA se caractérise par la présence d’inclusions
au sein des cellules nerveuses et également par une gliose astrocytaire et microgliale massive
(Bruneteau et al., 2004) (nous développerons ces caractères histopathologiques partie ID).
17
Introduction
Motoneurones
Supérieurs
Cerveau
(cortex moteur)
Tronc cérébral
Partie cervicale de la
moëlle épinière
Partie thoracique de la
moëlle épinière
Motoneurones
Inférieurs
Partie lombaire de la
moëlle épinière
Partie sacrale de la
moëlle épinière
Figure 1 Présentation des neurones moteurs touchés dans la SLA
La SLA est une maladie neurodégénérative dans laquelle on observe une perte des neurones du cortex
moteur appelés motoneurones supérieurs, et une perte des neurones du tronc cérébral et de la moelle
épinière, appelés motoneurones inférieurs. On distingue quatre parties de la moelle épinière : cervicale,
thoracique, lombaire et sacrale, la partie lombaire étant la partie la plus touchée dans la SLA.
18
Introduction
La majorité des cas de SLA sont de nature sporadique (SLAS), seulement 5 à 10 % sont d’origine
familiale, c’est-à-dire dus à une mutation dans un gène et se transmettant aux générations
suivantes (SLAF) (voir partie IE ), (Ticozzi et al.). Jusqu’à ce jour, la SLA reste incurable et le
seul médicament reconnu est le riluzole, un inhibiteur des voies excitotoxiques. Il a un effet
relativement faible, bien qu’il permette de retarder l’étape de trachéotomie, et prolonge
l’espérance de vie d’environ 3 mois (Bryson et al., 1996) (Bensimon et al., 1994).
Ligne médiane
Cortex moteur
Hémisphère cérébral
Tronc cérébral
1er motoneurone
Cervelet
Moelle épinière
2ème motoneurone
Jonction neuromusculaire
Muscle squelettique
Figure 2 Organisation de la voie pyramidale (voie corticospinal tract)
Le faisceau pyramidal est la voie responsable de la motricité volontaire. Cela désigne l’ensemble des axones
qui se rassemblent pour former un faisceau qui permet la transmission d’une commande du cortex cérébral
moteur jusqu’aux motoneurones de la corne antérieure dans la moelle épinière. Au niveau du tronc cérébral,
la majorité des fibres décussent (80 %) c’est-à-dire qu’ils croisent le plan médian. Ce faisceau pyramidal dit
latéral, met en relation l’hémisphère du cerveau avec des motoneurones contralatéraux. Les autres fibres
(20%, non représentées sur la figure) ne croisent pas la ligne médiane et forment le faisceau pyramidal direct
(informations obtenues de « Neuroanatomie fonctionelle », Docteur Boutillier et Outrequin)
19
Introduction
B)
Epidémiologie
L’épidémiologie est la science des relations entre les maladies et les divers facteurs
intervenant dans leur apparition et leur développement. Elle se quantifie notamment par des
facteurs comme la prévalence (le nombre de cas enregistrés) et l’incidence (le nombre de nouveaux
cas chaque année). Dans le cas de la SLA, la prévalence est autour de 4 pour 100 000 personnes,
un chiffre important et probablement sous-estimé compte tenu du faible temps de survie des
patients (Turner and Talbot, 2008). L’indice est de 2 pour 100 000. En France, 1 000 nouveaux cas
de SLA sont diagnostiqués chaque année (source ARS).
Le phénotype clinique des formes familiales n’est pas distinct de celui des SLAS. Il existe quelques
différences, dont le ratio homme/femme qui dans les SLAF est de 1 :1, alors qu’il est de 1.5 :1 dans
la SLAS, bien que ce ratio ait tendance à s’équilibrer de nos jours (Wijesekera and Leigh, 2009). En
outre, le déclenchement de la maladie apparaît environ 10 ans plus tôt et la durée de la maladie est
généralement plus courte dans les SLA familiales (Ticozzi et al., 2011).
Les causes de la SLA sont inconnues bien que certains facteurs de risques génétiques aient été
identifiés (partie E). L’hypothèse de facteurs environnementaux ou exogènes (régime alimentaire,
activité physique, tabagisme, toxines) a également été explorée, cependant il ne semble pas y avoir
d’association entre un seul facteur environnemental et le risque de développer la SLA. Les
chercheurs défendent donc plus la thèse d’une interaction multifactorielle, telle une interaction de
facteurs environnementaux et d’une mutation génique, comme réel facteur de causalité dans la SLA
(Wijesekera and Leigh, 2009).
20
Introduction
C)
Diagnostic, symptômes cliniques, prise en charge du
patient
Le diagnostic de la SLA est généralement long à établir car c’est une maladie complexe qui
présente un large spectre clinique avec une apparition variable de symptômes. C’est pourquoi la
fédération mondiale de Neurologie (WFN) des maladies des motoneurones a défini les critères de
diagnostic « El Escorial », révisés ensuite par les critères « Airlie House » en 2000. Le diagnostic,
fiable à 95%, prend en compte à la fois des critères d’inclusion et d’exclusion de syndromes
ressemblant à la SLA (Meininger, 2011), critères résumés dans le tableau 1. Les patients seront
alors classés comme souffrant d’une SLA « cliniquement définie », « cliniquement probable » ou
encore « cliniquement possible » (Wijesekera and Leigh, 2009)
Les deux tiers des patients présentent une SLA typique appelée « forme spinale », qui se
caractérise par une faiblesse musculaire pouvant commencer en position proximale ou distale dans
les membres supérieurs ou inférieurs. Les patients peuvent également ressentir des spasmes
musculaires involontaires (appelés fasciculations) ou des crampes qui précèdent de plusieurs mois
ou même années la fatigue musculaire. L’apparition des premiers symptômes, qui marque le
déclenchement de la maladie, est généralement asymétrique (un seul membre touché), puis
progresse vers une atteinte symétrique des deux membres, jusqu’à toucher les territoires bulbaires,
cervicaux, thoraciques et lombaires. La mort du patient est souvent due à des complications
pulmonaires et à une défaillance respiratoire.
Une forme plus rare de SLA est appelée « forme bulbaire ». Celle-ci implique d’abord une
dégénérescence des neurones du tronc cérébral et se traduit par des troubles de la parole, des
problèmes de déglutition, une exagération dans l’expression des émotions (pleurs et rires
incontrôlés), une faiblesse faciale bilatérale, avant de se manifester par une faiblesse progressive
des membres. Ce type de SLA touche plus fréquemment les femmes et la durée de la maladie est
généralement plus courte, de 1 ou 2 ans.
21
Introduction
Diagnostic de la SLA: critères d’inclusions:
1)
La preuve d’une dégénérescence des motoneurones supérieurs « MNS » après
examen clinique, electrophysiologique et neuropathologique
2)
La preuve d’une dégénérescence des motoneurones inférieurs « MNI » après examen
clinique
3)
Une propagation progressive des symptômes
Critères d’exclusions:
1)
Preuves électrophysiologiques ou pathologiques d’autres processus de maladies qui
pourraient expliquer la dégénérescence des MNI et MNS
2)
Preuves par imagerie neuronale d’autres maladies qui pourraient expliquer les
observations cliniques et électrophysiologiques
Degrés de certitude du diagnostique de SLA:
Cliniquement définie : preuve de signes des MNI et MNS dans la région bulbaire et au
moins 2 régions spinales ou seulement dans les 3 régions spinales
Cliniquement probable : 1) présence de signes des MNI et MNS
dans au moins 2
régions avec des signes des MNS rostraux à ceux des MNI 2) présence de signes des MNS
dans une plusieurs régions et des signes des MNI dans au moins deux régions
Cliniquement possible : 1) présence de signes des MNS et MNI dans une région ou 2)
présence de signes des MNS dans 2 ou plusieurs régions ou encore 3) présence de signes
des MNS et MNI dans 2 régions avec aucun signes des MNS rostraux aux signes des MNI
Tableau 1 Définition du diagnostic de la SLA
Résumé des critères de diagnostic de la SLA d’après « El Escorial Diagnostic Criteria for ALS » (Wijesekera
and Leigh, 2009). Le diagnostic de la SLA repose sur des examens cliniques, electrophysiologiques et
neuropathologiques Selon les signes pathologiques retrouvés et le nombre de régions touchées, la SLA est
classée selon des critères de certitudes (« cliniquement définie », « cliniquement probable » ou
« cliniquement possible »). Les critères de diagnostic considèrent quatre régions selon l’axe rostro-caudal,
chacune étant responsables de l’innervation d’un ensemble de muscles : 1) la région du tronc cérébral :
muscles de la face, du pharynx, larynx et de la langue 2) la région cervicale de la moelle épinière: muscles du
cou, des membres supérieurs et du diaphragme 3) la région thoracique de la moelle épinière: muscles du
thorax, du dos et de l’abdomen et 4) la région lumbo-sacrale de la moelle épinière: muscles des membres
inférieurs. A partir de l’examen des symptômes, l’implication des motoneurones supérieurs sera définie par la
présence de spasticité et des anomalies dans les réflexes ostéo-tendineux. L’implication des motoneurones
inférieurs pourra être définie par une atrophie, une faiblesse et des fasciculations musculaires.
22
Introduction
Il a été également observé chez certains patients SLA (environ 5% des cas) la présence
supplémentaire d’anomalies cognitives (changements de comportement, difficultés d’expression) qui
sont dues à des pertes de fonctions exécutives du cerveau frontale. D’un point de vue clinique, ces
patients sont diagnostiqués comme présentant des démences fronto-temporales (DFT) (Leigh et al.,
2003) .
La prise en charge du patient est très importante notamment pour optimiser sa qualité de vie et
préserver le plus longtemps possible son autonomie au cours des derniers stades de vie. L’objectif
du corps médical est alors de gérer l’aspect nutritionnel et respiratoire mais aussi de procurer un
soutien psychologique.
Afin de suivre le déclin de la fonction respiratoire, les médecins effectuent des mesures de la
capacité vitale de force ou de repos, et lorsque celles-ci diminuent jusqu’à un taux de 50%, une
ventilation non invasive est d’abord instaurée, suivie par une trachéotomie.
Enfin, les patients SLA souffrent souvent de troubles de la déglutition d’où leur difficulté à avaler la
nourriture, ce qui peut conduire à une malnutrition et à une déshydratation, et donc à une perte de
poids. De plus, ces patients présentent souvent un état d’hyper-métabolisme, d’où la nécessité
d’augmenter leur apport calorique et qui peut rendre indispensable une aide médicale à se nourrir,
comme une gastrotomie endoscopique percutanée ou un tube nasogastrique nourricier.
23
Introduction
D)
Caractéristiques histopathologiques chez les patients SLA
Comme nous l’avons abordé précédemment, l’autopsie des patients décédés de la maladie a permis
d’établir une série de caractéristiques posthumes associées à la maladie.
1.
Une perte neuronale associée à une gliose
Au niveau des neurones moteurs supérieurs, une perte des cellules de Betz de la couche 5 du
cortex moteur est observée, associée à une gliose astrocytaire variable des couches sous-corticales.
Il a également été constaté une perte axonale à l’intérieur de la voie motrice pyramidale
descendante ce qui se traduit visuellement par une pâleur de la myéline (Wijesekera and Leigh,
2009). L’atteinte des neurones moteurs inférieurs se traduit par une perte des neurones de la corne
ventrale de la moelle épinière et du tronc cérébral. A l’autopsie, on observe une perte de neurones
moteurs qui peut aller jusqu’à 50 %. Les neurones moteurs restants sont atrophiés et contiennent
des inclusions (D.2)
2.
Les inclusions
On distingue trois types d’inclusions cellulaires chez les patients SLA (Figure 3) :
a)
Les corps de Bunina
Ce sont de petites inclusions éosinophiles intracytoplasmiques souvent de morphologie angulaire,
qui sont positivement marquées pour la cystatine et la transferrine. Elles se retrouvent dans 85 %
des cas de SLA chez des patients sporadiques et familiaux. Ces inclusions sont présentes à la fois
dans les cellules de Betz du cortex moteur, dans le noyau subthalamique et dans les neurones
moteurs de la moelle épinière (Wijesekera and Leigh, 2009), (Kato, 2008)
b)
Les inclusions ubiquitinylées
Elles ont été décrites sur la base de leur immunoréactivité à l’ubiquitine et sont observées dans 95
% des cas de SLA. Elles se divisent en deux groupes selon leur morphologie :
24
Introduction
Les inclusions de type « skein » : Observées dans le corps cellulaire et les dendrites proximaux, ces
structures sont les plus fréquentes et présentent un profil filamenteux.
Les corps sphériques compacts : ces structures possèdent, comme leur nom l’indique, une
morphologie plutôt ronde et compacte et peuvent contenir des filaments. Elles sont faiblement
marquées comme inclusion éosinophile et peuvent présenter un halo périphérique. Elles sont
souvent comparées aux structures appelées corps de Lewy (retrouvés dans d’autres maladies
neurodégénératives). Ces inclusions sont en revanche peu retrouvées chez les patients SLA (moins
de 5%) et semblent plus associées aux SLAF.
c)
Les inclusions neurofilamenteuses ou conglomérats de Hyaline
Elles sont définies comme de larges inclusions argyrophiles entourant le noyau ou se logeant dans
les dendrites proximaux. Elles sont communément retrouvées dans les neurones moteurs de la
moelle épinière et sont immunoréactives aux neurofilaments (Kato, 2008)
A
B
C
D
Figure 3 Les inclusions dans les neurones moteurs des patients SLA
Illustration des inclusions retrouvées dans les motoneurones de la corne ventrale chez des patients SLA. A)
Motoneurone présentant des corps de Bunina, immnoréactifs pour la cystéine C (Okamoto et al., 2008) B)
Motoneurone présentant des inclusions « skein-like », immunopositifs à l’ubiquitine (van Welsem et al., 2002)
C) Motoneurone présentant des inclusions ubiquitinylées compactes et D) Motoneurone présentant des
inclusions appelées « conglomérats de hyaline » positifs pour les neurofilaments non phosphorylés (Ince et
al., 1998).
25
Introduction
E)
1.
Les formes familiales et sporadiques dans la SLA
Les formes sporadiques
Environ 90 % des cas de SLA sont de nature sporadique, l’étiologie de l’apparition de la SLA n’étant
toujours pas identifiée. Des données suggèrent un rôle potentiel de facteurs de risques dus à
l’environnement ou à la présence de gènes de susceptibilité.
a) une implication de l’environnement
Cette hypothèse a été élaborée suite à la découverte dans des régions du Pacifique de l’Ouest de
nombreux cas de SLA associés à un syndrome parkinsonien et à une démence, qui ne seraient pas
liés à des facteurs génétiques, mais plutôt à une consommation de graines de cycas contenant de
fortes concentrations de BMAA (B méthyl amino-L-alanine), qui est un modulateur des récepteurs
au glutamate (Kisby et al., 1992),(Migliore and Coppede, 2009). Par la suite, plusieurs facteurs
environnementaux ont été associés au développement de la SLA :
1) l’exposition à des métaux, pesticides, insecticides, neurotoxines : des travaux ont, par exemple,
lié l’inhalation chronique d’insecticides avec des désordres de neurones moteurs (Doi et al., 2006).
De même, l’exposition d’anciens soldats de la guerre du Golfe à des gaz neurotoxiques a été
également associée au développement d’une SLA accompagnée d’une forte diminution de l’enzyme
paraoxonase PON1, dont la fonction est de détoxifier les pesticides organophosphorés (Haley et al.,
1999)
2) la pratique du sport et les facteurs de risque associés : un risque accru de développer la SLA a
été établi chez les joueurs de football professionnels et amateurs, majoritairement en Italie. Il y a
néanmoins toujours débat quant à savoir s’il s’agit réellement d’une conséquence de l’activité
physique, et des traumatismes associés à cette activité, ou s’il est plutôt dû à des facteurs
chimiques tels que les produits dopants, les suppléments diététiques, ou encore les pesticides des
pelouses des stades (Belli and Vanacore, 2005) (Chen et al., 2007)
26
Introduction
3) le tabagisme : des études de cas contrôles et SLA ont montré un risque de développer la SLA
augmenté d’un facteur 0.8 à 1.67 chez les fumeurs (Weisskopf et al., 2004), (Fang et al., 2006). Le
tabagisme est d’ailleurs le seul facteur de risque avéré pour la SLA (Wijesekera and Leigh, 2009).
b) des gènes de susceptibilité ?
Un gène de susceptibilité ou de prédisposition est un gène qui tend à favoriser le développement
d'une maladie, en association avec d'autres gènes, des facteurs de l'environnement et/ou certains
modes de vie. Ce ne sont en aucun cas des gènes suffisants pour déclencher la maladie, comme
c’est le cas pour les gènes identifiés dans les cas de SLAF, lesquels seront décrits dans la partie II.
La présence de variants génétiques a donc été recherchée par des études d’association chez des
patients SLA sporadiques. De manière générale, ces variants génétiques regroupent une proportion
très faible de cas. Par exemple l’étude de patients aurait établi un facteur de risque de développer
la SLA avec des mutations dans des gènes codant pour les neurofilaments (NF). Les NFs constituent
la majorité des filaments intermédiaires exprimés chez les neurones adultes et sont formés par
l’assemblage de quatre sous-unités (NF à chaine légère NFL, moyenne NFM et lourde NFH et la
périphérine). L’accumulation anormale de NFs est d’ailleurs une caractéristique histopathologique
retrouvée chez les patients SLA. Des mutations dans le domaine de phosphorylation de NFH et
périphérine ont été associées à environ 1% des cas de SLAS (Al-Chalabi et al., 1999) (Tomkins et
al., 1998). Bien que les conséquences fonctionnelles de ces mutations restent inconnues
(implication dans le transport axonal, assemblage des NFL), elles sont considérées comme facteurs
de risque pour la SLA.
D’autres études se sont intéressées à un facteur angiogénique, le VEGF (Vascular endothelial
growth factor), après avoir identifié une délétion dans son domaine de réponse à l’hypoxie chez des
souris présentant des troubles moteurs (Oosthuyse et al., 2001). Une analyse de 1900 patients SLA
a permis d’identifier 3 polymorphismes dans la séquence de ce gène (Lambrechts et al., 2003),
mais cette observation n’a pas été confirmée par les études ultérieures.
D’autres études ont lié la présence de rares polymorphismes du gène de l’hémochromatose,
notamment le variant H63D, avec des cas de SLA sporadiques (Sutedja et al., 2007; Wang et al.,
27
Introduction
2004). Des mutations dans ce gène entraînent une surcharge en fer qui peut perturber la régulation
du stress oxydatif, connu pour être augmenté dans la SLA (ce que nous verrons dans la partie
III.A).
Par ailleurs, suite aux données indiquant que l’exposition aux insecticides et neurotoxines pourrait
être un facteur de risque de développer la SLA, des variants du gène de la paraoxonase (enzyme
nécessaire à la détoxification) ont été recherchés. Seule une étude a été positive sur des patients
sporadiques, montrant un lien entre un variant de PON1 et PON2 et un risque de SLA (Morahan et
al., 2007; Saeed et al., 2006; Slowik et al., 2006).
Enfin, des travaux ont montré l’implication de la chromogranine A et B (CHG) dans un mécanisme
de toxicité liée à la SOD1 mutée (partie III.F) et la première recherche de variants des
chromogranines chez les patients semblait prometteuse car elle associait un variant P413L de la
CHG B avec un risque de 2.2% de développer la SLA (Gros-Louis et al., 2009). Toutefois, deux
études effectuées ensuite dans des populations hollandaise et française n’ont pas permis de
confirmer ces résultats (Blasco et al., 2011; van Vught et al., 2011).
Ces études aux résultats contradictoires montrent que des populations plus importantes de patients
seront nécessaires pour confirmer ou les infirmer l’implication de ces gènes et soulignent la difficulté
à comprendre les causes des SLA sporadiques.
Les études se sont donc plus focalisées sur les formes familiales de la maladie, liées à des
mutations de gènes. En effet, les SLAS et les SLAF étant très proches d’un point de vue
phénotypique, on peut espérer que des mécanismes physiopathologiques trouvés en utilisant des
modèles SLAF pourront également s’appliquer aux SLAS, même si leur facteur déclencheur est
différent.
2.
Les formes familiales
Les formes familiales représentent seulement 10% des cas de SLA. L’identification de gènes mutés
dans cette maladie est primordiale car elle permettra d’étudier leur implication dans la pathologie en
utilisant des modèles in vitro de la maladie et/ou en créant des modèles animaux reproduisant les
caractéristiques de la maladie. Observation intéressante, les gènes mutés identifiés comme liés à la
28
Introduction
SLA codent pour des protéines que l’on peut regrouper en 5 grandes familles selon leur fonction
cellulaire, ce qui permet d’imaginer que ces protéines mutées pourraient, par leurs fonctions
proches, causer des processus de toxicité communs. L’ensemble des gènes liés à la SLA et leurs
caractéristiques sont résumés dans les tableaux 2 et 3. Ces gènes sont classés dans la partie ciaprès par familles de fonction de la protéine codée. Nous décrirons pour chaque cas les
circonstances de la découverte du gène, le type de syndrome de SLA associé, ainsi que la fonction
physiopathologique de la protéine concernée, lorsque celle-ci est connue.
a) Gène codant pour une protéine à activité catalytique de défense contre les
radicaux libres
•
Le gène SOD1 : premier gène identifié
L’association génétique de la SLA1 à la région chromosomique 21q22.1 a été décrite initialement en
1991 (Siddique et al., 1991) et l’identification du gène responsable SOD1 suivra deux ans plus tard
(Rosen, 1993). Ce gène code pour la superoxyde dismutase 1 à Cuivre et Zinc qui est une enzyme
dont le rôle est de catalyser les radicaux superoxyde en peroxyde d’hydrogène et oxygène (McCord
and Fridovich, 1969) (Figure 4). A ce jour, plus de 140 mutations ont été associées à ce gène,
toutes liées à une SLA: la majorité sont des substitutions faux-sens dispersées dans les 5 exons du
gène ; 8 sont des délétions et 5 des insertions aboutissant à une forme tronquée de la protéine
(Ticozzi et al., 2011) (Gros-Louis et al., 2006). L’ensemble de ces mutations représente environ 20
% des SLAF et crée un phénotype variable tant au niveau du déclenchement de la maladie que de
sa progression et de sa durée. Par exemple, la mutation A4V (exon 1), qui est la plus
communément retrouvée, est associée à une forme très agressive de la maladie avec un
déclenchement précoce et une durée d’environ 1 an (Cudkowicz et al., 1997), (Juneja et al., 1997).
A l’inverse, la mutation H46R, située dans le domaine du site de liaison au cuivre, entraîne un
phénotype modéré avec une survie des patients supérieure à 20 ans (Aoki et al., 1993). Des
modèles souris surexprimant la SOD1 mutée humaine (mSOD1) ont été créés et restent
29
Introduction
actuellement le modèle souris reproduisant le mieux les caractéristiques pathologiques de la SLA, et
donc le plus étudié (voir partie II.A)
A
B
C
SOD1
2O2- + 2 H+  O2 + H2O2
catalase
2H2O2  O2 + 2H2O
Figure 4 Structure et fonction de la superoxyde dismutase 1 (SOD1)
A) Illustration représentant l’ensemble des mutations dans le gène codant pour la SOD1, isolées chez des
patients SLA. Ces mutations (plus de 140) sont dispersées tout le long du gène. B) Représentation de la
structure 2D de la SOD1 qui est constituée de 8 feuillets (flèches) assemblés à l’aide de ponts disulfures (en
rouge). Les ions cuivre et zinc nécessaires à la fonction catalytique de la protéine sont représentés par des
boules verte et grise respectivement. C) Réaction catalysée par la SOD1. Elle convertit les anions superoxydes
O2- en peroxydes. Ensuite la catalase transformera ce peroxyde en molécules d’eau (Chattopadhyay and
Valentine, 2009).
30
Introduction
b)
•
Les gènes codant pour des protéines nucléaires de liaison à ADN/ARN :
Le gène TARDBP
Neumann et ses collaborateurs (Neumann et al., 2006) ont mis en évidence que la protéine TDP-43
(TAR DNA-binding protein 43) était présente dans des inclusions cytoplasmiques ubiquitinylées
retrouvées chez la majorité des patients SLA, constituant ainsi un marqueur postmortem de
diagnostic de la SLA. Ces observations ont amené à de nombreuses spéculations quant à un rôle
pathogénique de TDP43 dans la SLA. Des mutations dans ce gène ont été recherchées et identifiées
dans plusieurs populations, et sont présentes dans 5% des SLAF (Iida et al.) (Van Deerlin et al.,
2008), (Kabashi et al., 2010), (Sreedharan et al., 2008), (Yokoseki et al., 2008), (Corrado et al.,
2009; Gitcho et al., 2008). Les mutations dans le gène TARDBP causent une SLA similaire aux SLA
sporadiques et à celles associées à des démences.
TDP-43 est une protéine de liaison à l’ADN/ARN appartenant à la famille des hnRNPs
(« heterogeneous nuclear ribonucleoproteins »), ce qui l’implique dans la régulation de la
transcription de gènes, ainsi que dans l’épissage, le transport et la stabilisation de molécules d’ARN
messager (Buratti and Baralle, 2008). A une exception près, les mutations dans ce gène sont
rassemblées dans la zone codant pour la partie C terminale, responsable des interactions protéineprotéine. Le rôle de TDP43 dans la maladie n’est pas encore compris. Néanmoins, cette protéine,
normalement nucléaire, peut-être retrouvée agrégée dans le cytoplasme et dans le réticulum
endoplasmique des motoneurones de patients, et plus particulièrement sous une forme
hyperphosphorylée, ubiquitinylée ou encore clivée en position C-terminal (Sasaki et al., 2010).
•
Le gène FUS
Des mutations, essentiellement de type faux-sens, ont été identifiées dans le gène FUS (Fused in
Sarcoma) de la région chromosomique 16p12.1-q21 chez des patients présentant une SLA classique
à transmission autosomale dominante (Abalkhail et al., 2003), (Ruddy et al., 2003), (Sapp et al.,
2003) (Kwiatkowski et al., 2009) (Vance et al., 2009). Les études de patients ont permis d’établir
31
Introduction
que ces mutations concernaient 4% des SLAF. Les patients SLA avec des mutations FUS
développent souvent une SLA qui cible les neurones moteurs inférieurs, mais quelques mutations
ont été associées avec des cas de SLA à démences fronto-temporales (Yan et al., 2010).
Le gène FUS est un analogue fonctionnel de la protéine TDP-43 puisqu’il joue un rôle clé dans la
maturation des ARN messagers. De nombreuses mutations sont d’ailleurs situées dans la région
codante pour la partie C-terminale de la protéine, qui est requise pour sa liaison à l’ARN, ses
fonctions d’épissage et sa localisation nucléaire (Lagier-Tourenne et al.). Comme pour TDP43, il
reste encore à déterminer si la toxicité du mutant FUS est due à une perturbation de ses fonctions
de régulation du métabolisme de l’ARN et/ou à sa mauvaise localisation cellulaire, la forme mutée
de FUS étant retrouvée dans le cytoplasme des motoneurones chez les patients.
•
Le gène SETX
La SLA4 se définit comme une maladie du motoneurone autosomale dominante, rare, qui se
déclenche chez le jeune. A ce jour, trois mutations de type faux-sens dans le gène codant pour la
sénataxine y ont été associées (Chen et al., 2004).
La Sénataxine est une hélicase ADN/ARN exprimée de manière ubiquitaire, qui serait impliquée dans
la réparation des doubles brins d’ADN lors d’un stress oxydatif (Suraweera et al., 2007). Cette
protéine se lie également à la polymérase ARN II et pourrait alors être impliquée dans la régulation
transcriptionnelle.
Aucun lien n’a été fait à ce jour entre la mutation, la fonction de cette protéine et le déclenchement
de la maladie.
32
Introduction
Type de SLA
Mode de
transmission
(autosomal)
Locus
Gène
Nombre
de
mutations
Protéine
Références
SLA 1: SLA
typique
Dominant/
recessif rare
21q22.1
SOD1
> 140
Cu/Zinc « Superoxide
dismutase 1 »
Siddique et al., 1991,
Rosen et al., 1993
SLA3 : SLA
typique
dominant
18q21
inconnu
SLA6 : SLA
typique, et
associée avec
des DFT
dominant
16p11.2
FUS
SLA 7:
dominant
20p13
inconnu
SLA8 :SLA
typique, SLA
atypique et
amyotrophie
spinale à
déclenchement
tardif
dominant
20q13.33
VAPB
2
« Vesicle associated
membrane
protein(VAMP)associated protein B »
Nishimura et al., 2004
SLA 9: SLA
typique
dominant
14q11
ANG
15
Angiogenin
Wu et al.,2007, Conforti
et al., 2008, Gellera et
al.,2008, Paubel et
al.,2008,
SLA 10: SLA
typique et
associée avec
des DFT
dominant
1q36
TARDBP
30
« TAR-DNA Binding
Protein 43 »
Corrado L et al., 2009,
Van Deerlin et al.,
2008, Iida et al., 2010,
Sreedharan et al.,
2008, Gitcho et al.,
2008
SLA 11: SLA
typique et
maladie de
Charcot Marie
Tooth IV
dominant
6q21
FIG4
10
phosphatidylinositol
3,5-bisphosphate 5phosphatase
Chow et al., 2009
SLA 12
dominant/
récessif
10p15p14
OPTN
3
Optineurin
Maruyama et al., 2010,
Millecamps S et al.,
2011
Maladie
progressive lente
du neurone
moteur inférieur
dominant
2q13
DCTN1
4
Dynactine
Puls et al., 2003,
Munch et al.,2004
SLA classique et
associée à des
DFT
dominant
VCP
4
« Valosin Containing
Protein »
Johnson et al., 2010
Adulte:
Hand CK et al., 2002
30
« Fused in sarcoma »
Abalkhail H et al.,
2003; Sapp, PC et al.,
2003
Sapp PC et al., 2003
Tableau 2 Récapitulatif des gènes impliqués dans la SLA « adulte »
Les gènes peuvent être regroupés selon la fonction cellulaire des protéines pour lesquelles ils codent. Les
familles de protéines sont représentées selon un code couleur. Bleu: protéines impliquées dans une fonction
catalytique, ici la superoxide dismutase 1 ; vert : protéines de liaison à l’ADN/ARN (TDP-43, Fus); violet:
protéines impliquées dans le trafic ou transport vésiculaire (VAPB, FIG4, Optineurine et Dynactine), jaune :
protéines à activité angiogénique (l’angiogénine), enfin en orange: protéines associée à la dégradation et au
recyclage des protéines (VCP).
33
Introduction
Type de SLA
Mode de
transmission
(autosomal)
Locus
Gène
Nombre de
mutations
associées
Protéine
Références
SLA2: SLA
typique, sclérose
latérale primitive,
paraplégie
spastique
héréditaire
infantile
récessif
2q33-35
ALS2
10
Alsin
Eymard-Pierre et
al.,2002, Hadano et
al., 2001, Yang et
al., 2001, Kress et
al., 2005
SLA4 : SLA a
progression très
lente
dominant
9q34
SETX
3
Senataxin
Chen YZ et al.,
2004
SLA 5: SLA a
progression très
lente
récessif
15q1521
SPG11
12
spatacsine
Hentati et al., 1998,
Orlacchio et al.,
2010
SLA DFT1
adulte
dominant
9q21-22
inconnu
Finlayson et
al.,1973, Hosler et
al., 2000
SLA DFT2
juvénile
dominant
9p13.221.3
inconnu
Finlayson et
al.,1973, Hosler et
al., 2000
J uvénile:
SLA associée à
des démences
frontotemporales
Tableau 3 Récapitulatif des gènes impliqués dans la SLA « juvénile » et les Démences Frontotemporale
Nous avons classé les gènes selon la fonction cellulaire des protéines pour lesquelles ils codent. Vert:
protéines de liaison à l’ADN/ARN (Sénataxine) ; violet: protéines impliquées dans le trafic ou transport
vésiculaire (Alsine et spatacsine).
34
Introduction
c)
Les gènes codant pour des protéines impliquées dans le trafic /transport
vésiculaire
•
Le gène VAPB
La région chromosomique 20q13.33, responsable de la SLA8, a été isolée chez une famille
brésilienne qui présentait une forme de SLA autosomale dominante de progression lente (Nishimura
et al., 2004). Les individus de cette famille présentaient divers phénotypes décrits comme SLA
typique (progression rapide), ou comme SLA atypique avec une prépondérance des tremblements
ou encore comme des cas d’amyotrophie spinale. Ces personnes présentaient toutes une mutation
faux-sens P56S dans le gène codant pour la protéine VAPB (« VAMP- Associated protein B »)
(Nishimura et al., 2004). Récemment, chez un patient atteint de SLA typique, a été découverte une
nouvelle mutation faux-sens, T46I, qui se situe dans une région extrêmement bien conservée de la
protéine VAPB où se situe déjà la mutation P56S (Chen et al., 2010). La protéine VAPB est une
protéine exprimée de manière ubiquitaire et localisée dans le réticulum endoplasmique. Cette
structure s’associant aux microtubules suggère que VAPB jouerait un rôle dans le trafic
vésiculaire. Les recherches visant à déterminer le rôle de VAPB mutant seront développées dans la
partie IIA.3.
•
Le gène FIG4
Les travaux de Chow et collaborateurs (Chow et al., 2009) ont identifié en 2009 dix mutations dans
le gène FIG4 chez 2% des patients SLAF et également chez des patients présentant une sclérose
latérale primitive. Il s’agit à la fois de mutations faux-sens, non-sens, d’insertions et de délétions. La
mutation I41T de ce gène avait auparavant été isolée dans une neuropathie démyélinisante chez
l’enfant, la maladie de Charcot-Marie-Tooth IV (Chow et al., 2007). FIG4 code pour une
phosphatase phosphoinositide qui régule la synthèse d’un lipide (le phosphatidylinositol 3.5
biphosphate) impliqué dans le transport rétrograde de vésicules endosomales de l’appareil de Golgi
(Rutherford et al., 2006).
35
Introduction
Là encore, aucun lien n’a été fait à ce jour entre la mutation, la fonction de cette protéine et le
déclenchement de la maladie.
•
Le gène DCTN1
Une première mutation (G59S) dans le gène codant pour la dynactine a d’abord été trouvée chez
une famille de patients présentant une maladie du motoneurone proche d’une SLA, de type
autosomale dominante et à progression lente, impliquant une paralysie des cordes vocales. Par la
suite, trois nouvelles mutations faux-sens ont été identifiées chez des patients (Puls et al., 2003)
(Munch et al., 2004) présentant une SLA classique. La dynactine est une protéine aux multiples
sous-unités gérant la liaison entre la dynéine (moteur moléculaire) et les microtubules, et qui est
donc nécessaire pour le transport rétrograde axonal. La mutation G59S abolit sa liaison aux
microtubules, ce qui se traduit par une perturbation du transport axonal très dommageable pour les
motoneurones qui sont très dépendants de ce transport en raison de leur grande taille (ce que nous
verrons partie III.E).
•
Le gène Alsine
La région chromosomique 2q33-35 (où se situe le gène alsine) liée à la SLA 2 a été identifiée en
1994 par les travaux de Hentati et coll., puis l’identification de mutations dans le gène Alsine a suivi.
La SLA 2 est définie comme une maladie des motoneurones à transmission autosomale récessive et
qui se déclenche chez le jeune (Hentati et al., 1994).
Le gène Alsine aboutit, après épissage, à la production d’une forme longue et d’une forme courte de
la protéine. La majorité des mutations dans le gène Alsine sont des délétions qui résultent en la
production d’une version tronquée de la forme courte et/ou de la forme longue. Si les mutations
affectent à la fois les formes longue et courte de la protéine, le phénotype est celui d’une SLA
juvénile, alors que si les mutations touchent seulement la forme longue, le phénotype est plus
modéré et correspond à une sclérose latérale primitive juvénile ou une paraplégie spastique
familiale de l’enfant.
36
Introduction
La diversité des phénotypes observés selon les mutations a par ailleurs remis en question
l’appartenance du gène Alsine à la famille des gènes responsables de la SLA (Hadano et al., 2001),
(Devon et al., 2003; Yang et al., 2001), (Gros-Louis et al., 2003), (Eymard-Pierre et al., 2006),
(Panzeri et al., 2006).
Alsine est localisée à la surface cytosolique des membranes des endosomes et agit comme un
facteur d’échange de guanine pour Rab5 (petite GTPase des endosomes précoces), et serait donc
impliquée dans le trafic vésiculaire et l’organisation du cytosquelette (Otomo et al., 2003). On n’a
pour l’instant pas d’information supplémentaire sur le mécanisme d’action d’alsine mutée dans la
SLA.
•
Le gène SPG11
La SLA 5 est une maladie autosomale récessive du motoneurone qui a été associée à des mutations
dans le gène codant pour la spatacsine. Douze mutations, majoritairement non-sens ou décalant le
cadre de lecture, ont été identifiées (Orlacchio et al.). La spatacsine contient quatre domaines
transmembranaires, ce qui suggère qu’elle serait un récepteur ou un transporteur. Son rôle
physiopathologique est toujours inconnu mais elle pourrait être impliquée dans le transport axonal
(Salinas et al., 2008).
•
Le gène OPTN
Un autre gène identifié récemment chez des patients SLA code pour l’optineurine. Trois mutations
dont une mutation dominante faux-sens E478G, une mutation non-sens homozygote Q398X
(récessive) et une délétion homozygote (récessive) ont été identifiées chez des patients SLA
(Maruyama et al., 2010). Le phénotype clinique correspond à une maladie à progression lente.
L’optineurine a été retrouvée dans les inclusions à hyaline et « skein like » et est également
présente dans des inclusions TDP43 et/ou SOD1 positives, ce qui suggère que cette protéine mutée
pourrait partager un mécanisme de pathogénicité avec d’autres SLA.
37
Introduction
Cette protéine régule de nombreuses fonctions comme l’inhibition du facteur nucléaire NF-κB qui est
un facteur de transcription régulant la mort cellulaire. Elle participe également au maintien du
complexe golgien, au trafic membranaire, ainsi qu’au processus d’exocytose en interagissant avec la
myosine et Rab8 (petite protéine GTPase). Contrairement à la protéine sauvage, la forme mutée
E478G du gène forme des inclusions cytoplasmiques, ce qui pourrait perturber le fonctionnement
cellulaire.
d)
Le gène ANG codant pour une protéine à fonction angiogénique
En 2003, des études ont montré que des mutations dans le gène codant pour le VEGF pouvaient
représenter un facteur de susceptibilité chez des cas sporadiques de SLA (I.E.1). Ces données ont
conduit en 2004 à étudier si l’angiogénine, un effecteur en aval de VEGF, pouvait présenter des
formes mutées dans des cas de SLA. Quinze mutations à transmission autosomale dominante ont
été identifiées dans ce gène (Wu et al., 2007), (Conforti et al., 2008), (Millecamps et al.), (Gellera
et al., 2008), (Paubel et al., 2008).
L’angiogénine appartient à la famille des ribonucléases pancréatiques et possède diverses fonctions
cellulaires. Elle stimule la transcription des ARN de transfert, la formation des ribosomes,
la
traduction de protéines, la prolifération cellulaire et l’angiogénese (Moroianu and Riordan, 1994;
Smith and Raines, 2006). Des travaux in vitro ont montré que l’angiogénine protégeait les
motoneurones de la mort induite par différents stress cellulaires (privation de facteurs trophiques,
stress du réticulum endoplasmique ou encore hypoxie)(Kieran et al., 2008), alors que l’angiogénine
mutée perdait cette capacité (Sebastia et al., 2009). Par ailleurs, la surexpression d’angiogénine
mutée affecte la croissance neuritique et la survie des motoneurones in vitro (Subramanian et al.,
2008; Subramanian and Feng, 2007)
e)
Le gène VCP codant pour une protéine impliquée dans la dégradation des
protéines
Quatre mutations (R191Q, R159G, D592N et R155H) dans le gène VCP (« Valosine Containing
Protein ») ont été récemment identifiées dans une famille italienne. La fréquence de ces mutations
représente environ 2% des SLAFs (Johnson et al.). La majorité des patients présentait une SLA
38
Introduction
classique qui débutait majoritairement au niveau des membres inférieurs; une minorité présentait
quant à elle une SLA associée à une démence fronto-temporale.
Ce gène code pour un membre conservé de la famille des ATPase AAA+ ; sa fonction principale est
de réguler l’homéostasie protéique. Celle-ci participe à la dégradation associée au système
ubiquitine protéasome, mais également au processus d’autophagie et à la naissance des organelles
(Shaw, 2010).
Des inclusions TDP-43 sont visibles dans les neurones des patients SLA « VCP ». Cette observation
est intéressante car il a été montré in vitro et in vivo que la surexpression de VCP mutée induisait
une redistribution de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme (Gitcho et al., 2009). La toxicité de VCP
pourrait donc dépendre d’une mauvaise localisation de TDP-43. Les mutations de VCP pourraient
également perturber sa fonction dans la dégradation des protéines et aboutir à une accumulation
de protéines ubiquitinylées (van der Zee et al., 2009).
L’ensemble de ces gènes liés à la SLA cible cinq fonctions importantes pour la survie cellulaire. Qui
plus est, les motoneurones, en tant que cellules de grande taille, nécessitent une lourde machinerie
pour leur fonctionnement, des systèmes de production d’ARNm et de protéines constants ainsi
qu’un système de transport vésiculaire efficace. Ils doivent en outre être préservés de stress
cellulaires tels que l’accumulation de protéines ou de composants oxydants. Pour l’instant, bien que
de nouvelles pièces du puzzle soient découvertes régulièrement, il est encore difficile de
comprendre par quels mécanismes l’ensemble de ces gènes peut entraîner la mort du
motoneurone.
39
Introduction
II. Les modèles d’étude de la SLA :
La SLA est une maladie complexe qui est difficile à diagnostiquer et de progression rapide. Les
recherches chez les patients sont donc difficiles car elles ne peuvent se faire pour la majorité qu’à
l’étape post mortem. Afin de comprendre et de définir des mécanismes pouvant aboutir à la mort
des motoneurones, il est donc nécessaire de travailler sur des modèles animaux qui reproduisent la
maladie. Pour cela, de nombreux modèles ont été utilisés, chacun présentant des caractéristiques
distinctes. Parmi les modèles plus utilisés,on trouve les modèles de souris transgéniques,
développées à partir des gènes identifiés dans les SLAF (partie précédente). Nous décrirons pour
chaque modèle les symptômes in vivo et les caractéristiques histopathologiques associées.
A)
Les modèles murins
(Tableau 4 et 5)
1.
Les souris SOD1
En 1993, les travaux de Rosen et collaborateurs ont lié des mutations dans le gène SOD1 codant
pour la superoxyde dismutase à 20% des cas familiaux de SLA. A ce jour, environ 150 mutations
ont été mises en évidence dans ce gène. La SOD1 est une métalloenzyme cytosolique exprimée de
manière ubiquitaire et dont la fonction est de catalyser la dismutation des ions superoxydes (O2-),
toxiques pour la cellule. Les premiers travaux ont visé à déterminer si les mutations dans la SOD1
entraînaient un gain ou une perte de fonction et à développer un modèle animal de la maladie.
a)
La souris déficiente en SOD1
L’ensemble des mutations SOD1, dispersées tout au long des 5 exons du gène et conduisant toutes
au même syndrome neurologique, pouvait suggérer qu’une perte de fonction de la SOD1 était à
l’origine de la pathologie. Des souris homozygotes déficientes pour la SOD1 ont été produites
(Reaume et al., 1996), (Ho et al., 1998).
40
Introduction
Celles-ci sont plus sensibles que les souris sauvages à différents stress comme l’axotomie (Reaume
et al., 1996), ou la toxicité induite au paraquat (pesticide) (Ho et al., 1998). En outre, ces souris ne
présentent pas de dysfonctionnements moteurs hormis une axonopathie périphérique chronique liée
à l’âge, une sarcopénie (perte musculaire au profit de masse adipeuse) accélérée ainsi qu’une
dénervation des muscles des pattes arrière (50% à 4 mois et totale à 18 mois).
Cependant, il n’y a pas de perte motoneuronale ni de symptômes moteurs analogues à ceux de la
SLA (Flood et al., 1999), (Shefner et al., 1999), (Muller et al., 2006), (Fischer and Glass, 2007).
Si ces résultats ne permettent pas d’exclure les effets délétères de la perte de fonction de la SOD1
sur la fonction motrice, il est difficile à ce stade de lier cette perte de fonction à la SLA.
b)
Les souris SOD1 mutantes transgéniques
La découverte de mutations dans le gène SOD1 a conduit au développement de nombreuses souris
transgéniques exprimant de façon constitutive une forme mutée de la SOD1 humaine (Gurney et
al., 1994). Contrairement aux souris déficientes en SOD1, ces souris présentent des symptômes
moteurs létaux proches de ceux de la SLA. Le temps de latence et la durée de progression de la
maladie varient selon la mutation, le nombre de copies du gène, la stabilité et l’activité de la SOD1
mutée. Au total, quinze lignées différentes de souris transgéniques portant des mutations SOD1 ont
été produites, mais les modèles les plus utilisés en recherche sont les souris transgéniques
SOD1G93A, SOD1G85R, SOD1G37R et SODG86R.
•
Les souris SOD1G93A: (Figure 5)
Ce modèle est le plus couramment utilisé en recherche fondamentale, particulièrement les lignées
exprimant de nombreuses copies de SOD1 mutée qui développent rapidement les symptômes de la
maladie.
Ces souris à nombreuses copies (25) développées par Gurney et coll.(Gurney et al., 1994)
présentent une séquence d’événements bien reproductible: au jour postnatal 10, les souris
mutantes présentent un retard dans le réflexe du redressement postural et des erreurs de
placement des membres antérieurs (van Zundert et al., 2008); autour de 3 mois on détecte des
tremblements des pattes arrière et une faiblesse musculaire (que l’on assimile au point de
41
Introduction
déclenchement de la maladie). Ces symptômes coïncident avec des déficits moteurs, une hyperréflexivité, une amyotrophie et une paralysie progressive. Les souris présentent alors des difficultés
pour se mouvoir et se nourrir, et elles meurent prématurément, entre 4 et 5 mois (Shibata, 2001).
D’un point de vue cellulaire, les jonctions neuromusculaires sont dénervées entre 40 et 50 jours
mais seulement dans les muscles innervés par une sous-population de motoneurones appelés
vulnérables (dont nous discuterons partie V. A) (Fischer et al., 2004), (Pun et al., 2006). La perte
d’axones proximaux est maximale à partir de 80 jours, coïncidant avec l’apparition des problèmes
moteurs, et suivie par une perte de la moitié des neurones moteurs à 100 jours (Fischer et al.,
2004).
L’implication des neurones moteurs du cortex et du tronc cérébral dans ce modèle a longtemps été
négligée. Pourtant, on a pu noter une atrophie de la moelle épinière et des noyaux du tronc
cérébral à des stades avancés de la maladie (Shibata, 2001). Comme chez les patients, une perte
d’environ 30 % des neurones des noyaux moteurs du tronc cérébral a été quantifiée aux stades
finaux de la maladie chez ces souris (Ferrucci et al., 2010),(Lever et al., 2009). De plus, une étude
récente a montré qu’une dégénérescence des neurones moteurs de la couche 5 du cortex dès 60
jours aboutissait à une perte de 50% de ces cellules vers 100 jours (Ozdinler et al., 2011).
Une microgliose ainsi qu’une astrocytose se développent à partir de 30 et 50 jours respectivement,
dans la moelle épinière de ces souris, et augmentent de façon progressive jusqu’à la mort (Saxena
et al., 2009) (Fischer et al., 2004). A partir de 60 jours postnataux, on observe une rupture partielle
de la barrière hémato-encéphalique et une diminution du flux sanguin (Zhong et al., 2008).
Des changements morphologiques et moléculaires dans les motoneurones ont été également décrits
chez ces souris: dès 30 jours, on observe une fragmentation de l’appareil de Golgi, une dilatation du
réticulum endoplasmique et des mitochondries, entraînant l’apparition de nombreuses vacuoles
dans les motoneurones. Bien avant les symptômes, il a été montré des dysfonctionnements dans la
fonction de la mitochondrie (Duffy et al., 2011), du réticulum endoplasmique (Nassif et al., 2010) et
dans le transport axonal (De Vos et al., 2008). Une accumulation de protéines et d’ubiquitine peut
être détectée à des stades asymptomatiques et augmente au cours de la progression de la maladie
42
Introduction
(Saxena et al., 2009). D’ailleurs, au déclenchement de la maladie, les motoneurones sont atrophiés
et présentent des inclusions positives aux neurofilaments et des inclusions ubiquitynylées contenant
la SOD1 mutée, des caractéristiques également retrouvées chez certains patients (Shibata et al.,
1998), (Dal Canto and Gurney, 1995).
La sévérité de la maladie chez les souris est proportionnelle au nombre de copies de la SOD1G93A.
Des lignées exprimant un taux faible de SOD1 mutée ont été également développées. Selon le
nombre de copies de ces lignées, le déclenchement de la maladie chez les souris apparaît entre 6 et
10 mois et la durée de la maladie est assez longue puisqu’elle s’étend entre 2 et 4 mois (Gurney,
1997) (Dal Canto and Gurney, 1997). Ce modèle est cependant moins utilisé que son alter ego, le
modèle SOD1G93A à nombreuses copies.
43
Phénotype
Introduction
Cellulaire
Clinique
Force motrice
Tremblement
Paralysie partielle
P10: Retard dans le
réflexe de redressement
Paralysie arrière
Motoneurones
Dénervation des FF
Perte d’axones
moteurs de 50%
Perte de motoneurones
de 50 %
Dénervation des
FR
Activation gliale
Moléculaire
Paralysie avant
et arrière
Fragmentation de l’AG; Dysfonctionnement du
transport axonal
vacuolisation du RE et de
la mitochondrie
de la mitochondrie
Diminution de l’activité du
protéasome
Agrégation
Stress du RE
FR
Stress du RE FF
Asymptomatique Pré-symptomatique
Dénervation des
S
Apoptose
(activation des caspases)
symptomatique
Mort
Figure 5 Séquence d’apparition des événements cliniques et neuropathologiques chez les souris à
nombreuses copies SOD1G93A
Evolution au niveau phénotypique, clinique, cellulaire et moléculaire de la maladie chez les souris SOD1G93A.
Les différents stades de la maladie sont définis comme : stade asymptomatique (de 0 et 60 jours postnatal),
le stade pré-symptomatique (de 60 à 90 jours postnatal), 90 jours est le point de déclenchement de la
maladie et donc le stade symptomatique (à partir de 90 jours jusqu’à la mort de la souris à partir de 120
jours). D’un point de vue phénotypique, les souris SOD1G93A présentent au déclenchement de la maladie, une
anomalie dans le réflexe des pattes arrière par rapport aux contrôles. En effet, celles-ci rétractent leurs pattes
arrière vers le tronc lorsqu’elles sont tenues par la queue alors que chez les contrôles les pattes restent
tendues. Leur force motrice diminue au cours du temps (courbe rouge) et cela s’accompagne de
tremblements des pattes arrière à 90 jours, d’une paralysie à partir de100 jours. Elles s’affaissent alors au
niveau des pattes arrière (cf phénotype) puis avant, ce qui les empêche de se déplacer et de se nourrir. D’un
point de vue cellulaire, on observe une perte de motoneurones (en vert) et une augmentation de l’activation
gliale (en bleue). La mise en place de la mort des motoneurones commence par la dénervation d’une souspopulation de motoneurones dits « vulnérables » très tôt (environ 45 jours), puis de la dénervation massive
des motoneurones dits résistants (vers 80 jours), ce qui mènera à la perte axonale puis motoneuronale à 100
jours. D’un point de vue cellulaire, la caractéristique majeure est l’augmentation de la proportion d’agrégats
au cours de la progression de la maladie (courbe orange), concomitants à l’apparition de dysfonctionnements
des motoneurones tels que des vacuolisations de la mitochondrie et du réticulum endoplasmique, du stress du
RE, de défaut dans le transport axonal, et dans le système ubiquitine protéasome, aboutissant à l’apoptose.
Illustration adaptée de la revue (Turner and Talbot, 2008).
44
Introduction
•
Les souris SOD1G37R:
Des travaux in vitro ont montré que la mutation SOD1G37R est celle qui conduit à la plus grande
augmentation d’activité dismutase de la SOD1 (Wong et al., 1995). Ces souris présentent des
symptômes moteurs similaires à ceux de la SOD1G93A à partir de 5 mois, et une progression rapide
avec une mort survenant vers 6 mois (Wong et al., 1995). La paralysie s’accompagne d’une perte de
motoneurones dans la corne ventrale des parties lombaire, thoracique et cervicale de la moelle
épinière et dans le tronc cérébral. Ces souris présentent comme les SOD1G93A, une pathologie
vacuolaire se traduisant par la présence de vacuoles liées à la membrane, probablement dérivées
des mitochondries, dans les axones et dendrites, et une astrogliose le long de la moelle épinière.
•
Les souris SOD1G85R:
Contrairement aux deux modèles précédents, la mutation G85R induit une pathologie à des niveaux
faibles d’expression de la SOD1 mutée, liés à l’instabilité de la protéine (Turner and Talbot, 2008)
(Fukada et al., 2001). Ce mutant présente aussi une activité dismutase négligeable qui semble
attribuable à une faible liaison au cuivre.
Les souris SOD1G85R présentent une pathologie du motoneurone à déclenchement tardif, autour de
8-10 mois. A partir du déclenchement, la progression est très courte : en deux semaines, 40 % des
motoneurones dégénèrent, ce qui conduit à une paralysie totale (Bruijn et al., 1997).
Des inclusions ubiquitinylées et de SOD1 sont observées bien avant les symptômes dans les
motoneurones et les cellules gliales de ces souris. Par ailleurs, une perte de GLT1, un transporteur
du glutamate glial, supporte l’hypothèse de l’implication d’un processus d’excitoxicité dans la maladie
(développé dans la partie III.H).
•
Les souris SOD1G86R:
Ces souris transgéniques surexpriment la forme mutée G86R de la SOD1 murine et sont l’équivalent
murin de la SOD1G85R (Ripps et al., 1995). Elles développent une faiblesse musculaire, qui progresse
vers une paralysie pour aboutir à la mort à 120 jours (Ripps et al., 1995). Aux stades terminaux, on
observe une perte de motoneurones et d’interneurones, des accumulations cytoplasmiques de
neurofilaments, et une astrocytose (Morrison et al., 1996).
45
Introduction
•
Autres modèles murins SOD1 mutant (moins utilisés):
Les souris A4V : la mutation A4V étant la plus fréquente chez les patients SLAF « SOD1 mutée »,
des souris surexprimant la mutation SOD1A4V ont été créées. Du fait de son caractère agressif chez
les patients, on pensait obtenir un modèle de maladie foudroyante. D’une manière surprenante, ces
souris ne développent pas de phénotype moteur et seuls quelques symptômes SLA sont retrouvés
chez des souris très âgées (Siddique and Deng, 1996).
En revanche, les souris SOD1A4V croisées avec des souris exprimant la SOD1 sauvage humaine
développent un phénotype SLA (Deng et al., 2006), qui pourrait s’expliquer par une
hétérodimérisation de la SOD1 mutée et sauvage qui stabiliserait la forme mutée A4V et conduirait
à une toxicité.
Les souris surexprimant des formes de la SOD1 humaine tronquées en C-terminal: les souris
SOD1L126X,
L126delTT
et
G127X
développent une maladie à déclenchement tardif (autour de 7-9 mois)
avec une progression rapide vers la mort (environ 10 mois) (Jonsson et al., 2004), (Wang et al.,
2005a), (Watanabe et al., 2005), (Deng et al., 2006). Ces souris expriment un faible niveau de
SOD1 mutée et présentent des inclusions SOD1 insolubles aux détergents dans la moelle épinière et
dans les compartiments somato-dendritiques. La progression de la maladie s’accompagne
également d’une perte de motoneurones et d’une astrogliose.
Les souris SOD1 « sans liaison au cuivre » SOD1H46R, SOD1H46R/H48Q et SOD1H46R/H48Q/H63G/H120G: une
partie ou la totalité des résidus de la SOD1 liant le cuivre ont été mutés, annulant la fonction
dismutase (Wang et al., 2003; Wang et al., 2002a), (Chang-Hong et al., 2005). Malgré la perte du
site catalytique du cuivre, ces souris développent une maladie à déclenchement tardif similaire au
modèle SOD1G85R, ce qui disqualifie une toxicité liée seulement à la fonction dépendante du cuivre
dans la SLA.
Bien que présentant un niveau de protéine mutée et d’activité dismutase très variable (tableau
souris), l’ensemble de ces souris présente une maladie des motoneurones. Ceci renforce l’hypothèse
d’un mécanisme de gain de fonction dominant, indépendant de l’activité de la SOD1.
46
Introduction
c)
Les souris transgéniques pour la SOD1 sauvage: SOD1WT
Les souris transgéniques surexprimant une forme mutée de la SOD1 n’ont été validées comme
modèles de SLA qu’après avoir vérifié que ce n’était pas la surexpression même de la SOD1
humaine non mutée qui pouvait entraîner la maladie.
A l’origine, les souris surexprimant la SOD1WT ont été développées comme modèles du syndrome de
Down et semblaient phénotypiquement normales (Epstein et al., 1987). Lorsqu’elles ont été
étudiées en parallèle des modèles souris exprimant la SOD1 mutée, on a observé qu’elles
présentaient une pathologie vacuolaire, une perte axonale et une dégénérescence des neurones
moteurs de la moelle épinière, mais seulement chez des animaux âgés de deux ans (Dal Canto and
Gurney, 1995), (Jaarsma et al., 2000; Jonsson et al., 2006). Bien qu’on ne puisse nier que la
surexpression de la SOD1 humaine cause des dégénérescences motrices, leur apparition très
tardive ne permet pas de les définir comme des SLA.
L’ensemble des données sur les différentes souris SOD1 indique que des seuils intermédiaires de
l’expression de SOD1 sont essentiels dans le maintien à long terme des neurones moteurs et de leur
connections axonales.
La découverte de mutations liées à la SLA dans d’autres gènes a amené à la création de nouveaux
modèles murins de la SLA, qui permettront de définir des éléments de toxicité communs et
importants pour la dégénérescence des motoneurones.
47
Introduction
Souris
SOD1
Mutation
de la protéine
humaine
Fonction
générale
Âge de
déclenchement
(mois)
Durée
caractéristiques
activité
dismutase/
SOD1
endogène
Publication
G93A,
nombreuses
copies (18 à
25)
Superoxyde
dismutase 1,
Catalyse la
dismutation des
ions
superoxydes,
néfastes pour la
cellule
3-4
1 à 2 mois
Inclusions
SOD+/Ubiquitine
(Ub+);
vacuolisations; perte
des neurones
moteurs supérieurs
(S) et inférieurs (I);
activation gliale
11 à 13
fois
Gurney et
al.,1994
G93A à faibles
copies (2 à
10)
idem
G1L(8): 6-8
2-3 mois
G5/G5 (10): 10
3-4 mois
G20 (2): > 10
-
Peu de pathologie
vacuolaire
contrairement aux
nombreuses copies
G37R
idem
5
1 mois
Agrégation SOD1,
vacuolisation
mitochondriale; perte
des neurones
moteurs S et I;
activation gliale
14,5 fois
Wong et al.,
1995
G85R
idem
8-10
15 j
Inclusions SOD1 Ub+
dans les
motoneurones et
astrocytes; perte de
motoneurones
0
Bruijn et al.,
1997
G86R
idem
3-4
1 mois
Accumulation de
neurofilaments dans
les motoneurones,
activation gliale,
perte des
motoneurones S et I
0
Ripps et al.,
1995
L126X,
L126delTT,G1
27X
idem
7-9
1 mois
Inclusions SOD1;
perte de
motoneurones;
activation gliale
0
Jonsson et
al.,2004, Wang
et al., 2005,
Watanabe et
al.,2005
H46R,
H46R/H48,
H46R/H48Q/H
63G/H120G,
idem
H46R: 5
1 mois
-
Inclusions SOD1 + et
Ub+, perte de
motoneurones
inférieurs, peu de
vacuolisations
0
H46R/H48 : 4-6
Wang et
al.,2002,2003,
ChangHong et
al., 2005
(forme murine
de G85R)
(forme
tronquée en Cterminale)
(déplétée en
métal)
Rat
7
1.6
Gurney et al.,
1997; Dal Canto
et Gurney et
al., 1997; Dal
Canto et
Gurney et al.,
1995
H46R/H48Q/H63G
/H120G: 8-12
-
G93A
idem
4
10j
Agrégats SOD+ Ub+,
perte de
motoneurones;
vacuolisation;
activation gliale
8 fois
Howland et
al.,2002, Nagai
et al.,2001
H46R
idem
5
25 j
Agrégats SOD1;
activation gliale;
perte de
motoneurones
0,2 fois
Nagai et al.,
2001
SOD1
Tableau 4 Les modèles souris et rat surexprimant la SOD1 mutée
Caractéristiques principales des différents modèles murins surexprimant une forme mutée de la SOD1. Selon
le niveau d’expression de la SOD1 mutée, le phénotype clinique sera plus ou moins rapide. Ces animaux
montrent en général une perte de neurones moteurs, des inclusions, une activation gliale et une progression
assez rapide de la maladie après le déclenchement des symptômes.
48
Introduction
2.
Les souris TDP-43
a) Les souris déficientes en TDP-43:
Les souris homozygotes déficientes en TDP-43 ne sont pas viables et meurent au stade
embryonnaire 7,5 jours, ce qui prouve la fonction essentielle de cette protéine au cours du
développement (Kraemer et al., 2010; Sephton et al., 2010; Wu et al., 2010). Les souris
hétérozygotes pour TDP-43 présentent une tardive et subtile faiblesse musculaire, mesurée par le
test de la force de prise, mais aucun symptôme d’une pathologie motoneuronale (Kraemer et al.,
2010). Elles ne semblent par conséquent pas constituer un bon modèle d’étude de la SLA.
b)
Les souris surexprimant la protéine TDP-43 sauvage ou mutée
Plusieurs groupes ont développé des souris surexprimant la TDP-43, soit sauvage soit mutée sous
différents promoteurs :
•
Les souris surexprimant TDP-43WT: des souris transgéniques surexprimant la forme sauvage
de TDP-43 sous le promoteur neuronal Thy-1 ou prion ont été développées (Wils et al.) (Xu et al.),
(Stallings et al.). De manière générale, la surexpression de TDP-43 sauvage peut provoquer une
dégénérescence neuronale et une mort dose-dépendantes : les souris de Wills et Xu, qui expriment
la protéine TDP-43 sauvage à forte dose sous le promoteur prion ou Thy-1 meurent entre 1 et 2
mois (Wils et al., 2010; Xu et al., 2010), alors que celles présentant un niveau plus faible ne
développent pas de symptômes moteurs avant 4 mois (Wils et al., 2010) voire aucun même à un
âge tardif (Stallings et al., 2010).
•
Les souris surexprimant des formes mutées de TDP-43: deux souris transgéniques
surexprimant sous le contrôle du promoteur prion la forme mutée humaine TDP-43 A315T et une
surexprimant la forme mutée M337V, ont été créées (Stallings et al., ; Wegorzewska et al., 2009).
Selon les lignées, ces souris ont un phénotype moteur entre 2 et 4 mois et ont une survie moyenne
entre 3 et 5 mois (Wegorzewska et al., 2009). Les souris mutantes présentent une faiblesse
particulièrement prononcée des membres inférieurs, une réduction de la force d’accroche et de la
49
Introduction
longueur des pas. De nombreux défauts tissulaires sont observés, comme des fibres musculaires
atrophiées et angulaires, correspondant à une dénervation, ainsi qu’une astrogliose. Elles
présentent, comme chez les patients, des agrégats ubiquitinylés dans la couche IV du cortex frontal
aussi bien que dans les motoneurones de la moelle épinière. La forme clivée de TDP-43 observée
chez des patients est également retrouvée dans le cerveau et la moelle épinière des souris TDP-43
A315T. De même, comme chez les patients (Igaz et al., 2008), TDP-43 est présent dans le
cytoplasme des motoneurones, mais seule sa forme phosphorylée colocalise avec les agrégats de
protéines ubiquitinylées. Au stade final, ces souris présentent une atrophie des axones et des fibres
musculaires, ainsi qu’une perte d’environ 20 % des motoneurones (Wegorzewska et al., 2009).
3.
Les souris VAPB
Tudor et collaborateurs (Tudor et al., 2010) ont créé des souris surexprimant la forme sauvage ou
mutée (P56S) de VAPB sous le promoteur du gène prion. Des inclusions VAPBP56S sont observées
chez les souris mutantes dans le cerveau et la moelle épinière. Divers tests de comportement et de
facultés motrices n’ont pas permis de détecter de phénotype moteur chez les souris VAPBWT et
VAPBP56S jusqu’à 2 ans. A 18 mois, les souris VAPBP56S présentent des inclusions ubiquitinylées
cytoplasmiques dans les neurones moteurs du cerveau et dans les motoneurones de la moelle
épinière. D’ailleurs, des inclusions cytoplasmiques assez larges et granulaires de TDP-43 sont
retrouvées chez les souris VAPBP56S, et colocalisent avec les inclusions ubiquitinylées. Aucune forme
clivée de TDP-43 n’est détectée dans le cerveau ou la moelle épinière de ces souris.
4.
Les souris Alsine
La mutation du gène Alsine liée à la SLA est de type autosomale récessive. Afin d’établir un modèle
murin, quatre groupes ont produit des souris déficientes en alsine (Cai et al., 2005), (Devon et al.,
2006), (Hadano et al., 2006), (Gros-Louis et al., 2008). L’ensemble de ces études montrent que la
délétion génétique d’alsine ne produit pas un phénotype moteur sévère. Cependant, Cai et coll. ont
observé que ces souris présentaient des problèmes de coordination motrice liés à l’âge, et d’un
point de vue tissulaire, Hadano et coll. ont montré une perte progressive des cellules du cervelet,
50
Introduction
une réduction des axones moteurs ventraux, une astrogliose et des déficits dans le trafic
endosomal, ces signes pathologiques apparaissant seulement chez les souris âgées. Enfin un
dernier groupe a observé une dégénérescence des axones de la voie corticospinale ainsi que des
défauts dans le transport axonal des souris alsine-/- (Gros-Louis et al., 2008).
De nombreux modèles de souris transgéniques ont été développés, cependant pour l’instant les
modèles SOD1G93A, SOD1G85R, SOD1G37R sont les plus convaincants et les plus utilisés. Toutefois, le
modèle souris reste un modèle très éloigné de l’homme et donc de portée limitée. Il est nécessaire,
afin de mieux comprendre la SLA, d’utiliser différents modèles animaux, notamment le modèle rat
ou encore le chien.
B)
1.
Autres modèles SLA in vivo
Le modèle rat
Le modèle rat est un bien meilleur modèle mammifère que la souris car il permet un plus large
champ d’approches expérimentales, comme l’administration aisée de drogues en intrathécal en
raison de sa grande taille, la transplantation de cellules souches, un échantillonnage plus grand de
fluide cérébrospinal, et la microchirurgie. Le rat est également utilisé afin d’étudier l’efficacité
thérapeutique et/ou la toxicité de composés. Son utilisation comme modèle est cependant limitée
car les rats transgéniques restent plus difficiles à produire que les souris transgéniques.
a)
Les rats SOD1G93A
Deux groupes ont développé des rats surexprimant la SOD1G93A: ces lignées développent des
symptômes moteurs très rapidement. Le déclenchement de la maladie qui apparaît vers 115-120
jours se caractérise par une posture anormale des pattes arrière, une faiblesse musculaire
(activité de marche spontanée diminuée) et une perte de poids (Nagai et al., 2001),(Howland et
al., 2002). Le stade terminal est atteint en moyenne 8 à 11 jours après les premiers symptômes.
51
Introduction
En général, la paralysie est d’abord asymétrique puis atteint l’autre membre en deux jours. D’un
point de vue histopathologique, les fibres musculaires sont angulaires et atrophiées ; les
neurones moteurs de la moelle épinière, du tronc cérébral et du cortex présentent des
vacuolisations à 100 jours et des agrégats positifs pour la
SOD1 et l’ubiquitine au
déclenchement de la maladie. La moitié des neurones moteurs sont perdus à 120 jours (Nagai et
al., 2001),(Howland et al., 2002).
b)
Les rats SOD1H46R
Comme chez les souris, ces rats présentent une activité faible de la SOD1 par rapport aux
contrôles, liée à une diminution de la liaison au cuivre. Ces rats développent également une
pathologie du motoneurone, cette fois-ci un peu plus tardive que chez les rats SOD1G93A. Le
début de la maladie se situe autour de 145 jours, et la durée de la maladie est d’environ 25 jours
(Nagai et al., 2001). Leurs motoneurones présentent une importante proportion d’agrégats. On
observe une augmentation des astrocytes et de la microglie activée, et une perte de
motoneurones à partir de 150 jours.
c)
Les rats TDP-43
Comme chez les souris, l’expression constitutive du mutant TDP-43M337V chez les rats induit un
phénotype extrêmement rapide (paralysie à 20 jours), ne permettant pas une reproduction des
fondateurs de la colonie (Zhou et al., 2010). Pour pallier ce problème, les auteurs ont utilisé un
système d’induction à la Tétracycline/Doxycycline afin de contrôler l’expression temporelle de
TDP43 mutée. Avec ce système, les auteurs ont pu induire l’expression du gène muté tdp-43 en
postnatal et non en embryonnaire. Ces rats mutants développent des symptômes moteurs
(définis dans cette étude par la réduction du temps de maintien sur le rotarod) autour de 35-40
jours et survivent environ 50 jours. Les rats surexprimant la forme sauvage de TDP43 dans des
conditions analogues ne présentent pas de phénotype jusqu’à 200 jours. D’un point de vue
histologique, une perte de motoneurones, une dégénérescence des axones, une dénervation des
fibres musculaires squelettiques, et une activation gliale sont visibles dès le déclenchement de la
52
Introduction
maladie. Enfin, comme dans les modèles souris, des inclusions positives à la TDP43 et à
l’ubiquitine et des fragments TDP43 ont été détectés chez ces animaux transgéniques à des
stades terminaux de la maladie (Zhou et al., 2010).
d)
Les rats FusR521C
Tout comme la protéine nucléaire TDP-43, Fus est également fortement exprimée au cours du
développement, amenant les auteurs à utiliser le système de contrôle d’induction expliqué cidessus.
Deux lignées surexprimant la forme mutée de Fus R521C ont été développées et présentent un
déclenchement de la maladie entre 30 jours et 50 jours environ, les rats surexprimant la forme
sauvage ne développant pas de phénotype moteur (Huang et al., 2011). Leur probabilité de
survie selon les lignées varie entre 35 et 65 jours. Une perte des jonctions musculaires a été
observée chez ces animaux mutants mais pas de perte de motoneurones. Cependant, les auteurs
ont noté une perte des neurones corticaux et hippocampaux, un phénotype retrouvé chez les
patients atteints de démence fronto-temporale. Des inclusions ubiquitinylées mais sans
colocalisation avec la protéine Fus elle-même ont été observées chez les rats portant la mutation
du gène Fus dans le cortex et la moelle épinière. Fus est retrouvée principalement dans le noyau
et ne diffuse que partiellement dans le cytoplasme chez les rats mutants, contrairement aux
patients chez qui on le retrouve délocalisé dans le cytoplasme.
53
Introduction
Modèle
murin
Mutation
de la protéine
humaine
Fonction
générale
Âge de
déclencheme
nt
Durée
caractéristiques
remarque
Publication
Souris
A315T
Protéine
de liaison à
l’ADN/ARN
2-4 mois
1 mois
Inclusions Ub+
dans le cortex
et moelle
épinière,
activation gliale,
TDP-43
cytoplasmique
Promoteur
prion
Wegorzewka
2009; Stallings
2010
M337V
idem
2-4 mois
1 mois
Inclusions Ub+
dans le cortex
et moelle
épinière,
activation gliale,
TDP-43
cytoplasmique
Promoteur
prion
Wegorzewka
2009; Stallings
2010
sauvage
idem
Possibilité de
dégénérescence
dose
dépendante
promoteur
thy-1 ou
prion
Stallings 2010,
Wills 2010
A315T
idem
1-1,5 mois
15j
Perte des
motoneurones,
activation gliale,
TDP-43
cytoplasmique
système
d’induction
Tétracycline/
Doxycycline
Zhou 2009
M337V
idem
1-1,5 mois
15j
Perte des
motoneurones,
activation gliale,
TDP-43
cytoplasmique
système
d’induction
Tétracycline/
Doxycycline
Zhou 2009
R521C
Protéine
de liaison à
l’ADN/ARN
1-1,5 mois
15-20j
Inclusions Ub+,
activation
gliale,perte des
jonctions
neuromusculaire
s, pas de perte
des neurones
corticaux et
hippocampaux
système
d’induction
Tétracycline/
Doxycycline
Huang 2011
TDP-43
Rat
TDP-43
FUS
Tableau 5 Les modèles souris et rats TDP-43 et Fus
Caractéristiques des modèles rongeurs, développés ces deux dernières années, surexprimant des formes
sauvages et mutées des protéines TDP-43 et Fus. Ces rongeurs développent des symptômes moteurs assez
précocement. Il semblerait que la surexpression de TDP-43 sauvage puisse aussi avoir un effet dose
dépendant.
54
Introduction
2.
Le modèle canin: myélopathie dégénérative canine
La myélopathie dégénérative canine, découverte il y a plus de 35 ans, est une maladie
motoneuronale qui se déclenche chez le chien adulte. Les premiers signes apparaissent vers 8
ans et se manifestent par une ataxie générale proprioceptive, c’est à dire des troubles de
l’équilibre dans les membres inférieurs. Il s’ensuit une faiblesse asymétrique et une atrophie
musculaire qui progresse en paraplégie ainsi qu’une atteinte des membres antérieurs. La durée
de la maladie ne s’étend pas sur plus de trois mois (Averill, 1973), (Griffiths and Duncan,
1975),(Coates et al., 2007), (Matthews and de Lahunta, 1985), (Bichsel et al., 1983).
Une mutation faux-sens E40K, à transmission autosomale récessive, a été identifiée dans le gène
SOD1, chez ces chiens. (Awano et al., 2009). Des études histopathologiques ont mis en évidence
la présence d’inclusions cytoplasmiques positives pour la SOD1 dans la moelle épinière, similaires
à celles retrouvées chez l’humain ou dans les modèles murins.
Ce modèle canin récapitule les symptômes de la SLA et il est plus similaire aux humains en taille,
dans la structure et la complexité du système nerveux ainsi que dans la durée de la maladie. De
plus, comme chez l’homme et contrairement aux modèles rongeurs, ces chiens n’ont pas besoin
de forts niveaux d’expression de la SOD1 mutée pour déclencher la maladie. L’utilisation de ce
modèle permettrait d’étudier des processus dégénératifs à un stade non final de la maladie,
puisque ces chiens sont souvent euthanasiés dès l’apparition des symptômes et pourraient
permettre des études thérapeutiques pour traiter la SLA.
3. Les modèles invertébrés : la drosophile et Caenorhabditis-elegans
(C-elegans)
Des modèles moins complexes en biologie comme la drosophile ou C-elegans ont comme
avantages de permettre de nombreux croisements génétiques de part leur court cycle de
reproduction et de présenter une facilité de manipulation de par leur petite taille, permettant
ainsi une étude de l’organisme entier. De plus, environ la moitié de leurs gènes possède au
moins un homologue chez l’homme.
55
Introduction
Afin d’étudier plus facilement certains processus ou mécanismes cellulaires, différents groupes
ont créé des drosophiles et des vers surexprimant différentes protéines mutées liées à la SLA. De
fait, on y retrouve de nombreuses caractéristiques communes aux modèles rongeurs SLA.
a)
Les modèles drosophiles d’étude de la SLA
L’expression de la SOD1 humaine sauvage ou mutée A4V ou G85R chez la drosophile induit des
déficits moteurs progressifs, notamment une difficulté à grimper sur une surface verticale. D’un
point de vue tissulaire, on retrouve chez ces animaux une accumulation de la SOD1 dans les
motoneurones, une activation de la glie, mais une absence de mort neuronale (Watson et al.,
2008).
La surexpression de la forme sauvage ou mutée A315T de TDP-43 chez la drosophile conduit à
une toxicité dans les motoneurones dépendante de leur niveau d’expression (Estes et al., 2011).
L’expression de la protéine Fus mutée chez la drosophile entraîne une accumulation de protéines
ubiquitinylées, une dégénérescence des neurones et une mort précoce. Fus mutée est localisée à
la fois dans le noyau et dans le cytoplasme alors que la forme sauvage est uniquement retrouvée
dans le noyau (Lanson et al., 2011).
D’autres travaux ont mis en évidence que la surexpression de VAPBP56S forme des agrégats qui
piègent VAPB sauvage. La toxicité liée à VAPB mutant pourrait s’exercer par un processus
dominant négatif (Ratnaparkhi et al., 2008). La mutation P56S, comme chez les rongeurs,
perturbe les processus de sécrétion (partie III. F) et favorise le développement d’inclusions
ubiquitynylées dans le réticulum endoplasmique et une réponse au stress du RE (Tsuda et al.,
2008) (partie IV.E.4)
b)
Le modèle C. elegans :
Wang et coll. (Wang et al., 2009a) ont montré que les vers surexprimant la SOD1 mutée G85R
présentent des défauts de locomotion, associés à la présence d’agrégats de la protéine SOD1G85R.
Une diminution des jonctions neuromusculaires et du nombre de vésicules synaptiques est
observée chez ces mutants.
56
Introduction
Les modèles in vitro d’étude de la SLA
C)
Bien que les études in vivo soient essentielles pour déterminer l’implication d’un candidat dans une
pathologie, les modèles in vitro sont quant à eux indispensables aux études des mécanismes
cellulaires, et permettent de quantifier ou d’analyser morphologiquement des cellules, ou encore de
tester les effets de l’application d’une drogue.
1.
Culture primaire de motoneurones :
Un des outils les plus précieux de notre laboratoire est la culture primaire de motoneurones. La
première culture de motoneurones effectuée à partir d’embryons de rat et de poulet a été décrite
en 1981(Schnaar and Schaffner, 1981). Ces cultures ont été ensuite adaptées au modèle souris,
permettant l’utilisation de souches de souris transgéniques.
Décrite brièvement, la technique consiste à disséquer la moelle épinière puis à isoler les
motoneurones en s’appuyant sur leur caractéristique principale : ce sont de grosses cellules de
faible densité. Leur séparation des autres cellules s’effectue donc par une centrifugation modérée
sur une solution permettant l’établissement d’un gradient de densité (à base de métrizamide ou
d’Optiprep). Les motoneurones se retrouvent groupés à l’interface gradient-milieu alors que la
majorité des autres cellules (interneurones, cellules gliales) se retrouve dans le culot. Afin
d’améliorer la pureté de la préparation et d’obtenir 90% de motoneurones, une étape de
purification supplémentaire utilisant des anticorps pour le récepteur de basse affinité au NGF,
p75
NTR
, (exprimé seulement par les motoneurones à ce stade du développement) est nécessaire
(Camu and Henderson, 1992), (Wiese et al., 2010). La survie des motoneurones en culture peut
aller jusqu’à deux semaines en présence de facteurs trophiques (cocktail de BDNF, CNTF et
GDNF) qui sont indispensables à la survie et compensent l’absence de production in vivo par les
cellules gliales ou les muscles (Henderson et al., 1993), (Kaal et al., 1997). Une fois en culture,
les motoneurones maintiennent leur polarité, développent des prolongements à caractéristiques
57
Introduction
dendritiques ou axonales. Ce modèle a été utilisé dans notre laboratoire principalement pour
étudier la mort cellulaire (partie V.D). Pour faciliter l’identification des motoneurones en culture,
nous avons également utilisé des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP
sous le promoteur de HB9, un gène homéoboîte permettant la spécification de l’identité
motoneuronale au stade embryonnaire (Arber et al., 1999).
Afin d’obtenir des cultures de motoneurones reproduisant mieux le contexte in vivo, des
systèmes de co-culture ont été développés. Les motoneurones isolés sont ensemencés sur un
tapis d’astrocytes préparé une à deux semaines auparavant. Dans ces conditions, les
motoneurones vivent plus longtemps, se développent mieux et présentent des caractéristiques
de motoneurones adultes comme la perte de la sous-unité GluR2 du récepteurs AMPA (Bar,
2000). Ces systèmes ont également permis d’étudier les interactions neurones/glie et de mettre
en évidence un rôle de la glie (astrocytes et microglie) dans la SLA liée à SOD1 mutée (partie
III.G).
2. Les lignées cellulaires « motoneuronales »
Ces lignées ont été développées par Cashman et collaborateurs il y a une vingtaine d’années afin
d’obtenir des cellules gardant la capacité de se multiplier tout en possédant de nombreuses
caractéristiques motoneuronales. Ces cellules sont avantageuses car elles sont plus faciles à
cultiver que les motoneurones primaires et permettent d’obtenir des quantités de matériel plus
importantes en vue d’études biochimiques.
La lignée la plus utilisée, les NSC-34 (« Neuroblastome X spinal cord »), est le résultat de la
fusion de motoneurones de rat purifiés avec un neuroblastome de souris. Les cellules dites
différenciées en « neurones », par une diminution de sérum dans le milieu de culture, sont des
cellules multipolaires adhérentes avec de longs neurites. Ces cellules possèdent également les
systèmes de capture, de synthèse, de stockage et de libération de l’acétylcholine et elles peuvent
établir des synapses cholinergiques avec des myotubes de souris mis en co-culture. D’un point
de vue histochimique, ces cellules, comme les motoneurones, expriment le gène homéoboîte
HB9, les neurofilaments et la protéine MAP1a (« Microtubule-Associated-Protein1a »), les
58
Introduction
récepteurs aux facteurs de croissance (Matusica et al., 2008) et le glutamate (Eggett et al.,
2000). Bien que ces cellules soient capables de générer des potentiels d’action, leurs
caractéristiques électrophysiologiques sont néanmoins différentes des motoneurones, traduisant
une différence de maturité. L’immortalité de ces cellules s’accompagne d’une augmentation du
facteur de transcription N-myc qui peut réprimer l’expression de certains gènes de maturation
(Cashman et al., 1992) et biaiser les mécanismes de mort cellulaire. Pour prendre en compte ce
paramètre lorsque des études sont réalisées avec ces cellules, il est important de confirmer les
résultats avec des cultures primaires et/ou dans des modèles in vivo.
3.
Les motoneurones issus des cellules souches embryonnaires
Les premières tentatives de production de motoneurones à partir de cellules souches
embryonnaires (ESC) ont été publiées par Renoncourt et coll. (Renoncourt et al., 1998), puis
développées et affinées par le groupe de Jessell (Wichterle et al., 2002).
La transformation de ESC en motoneurones requiert deux étapes: l’induction neurale et la
spécification en motoneurone (Wichterle et al., 2002). Les cellules souches sont maintenues à
l’état prolifératif sous la forme de petites sphères appelées corps embryoïdes. L’expression de
gènes neuronaux est activée par l’ajout d’acide rétinoïque et la spécification en motoneurones
nécessite l’ajout de la protéine « sonic hedgehog » (Shh), ce qui permet d’obtenir une proportion
d’environ 30 à 50 % de motoneurones.
Il est également possible de dériver des motoneurones à partir de cellules souches neurales qui
sont cultivées en neurosphères en présence de facteurs de croissance tels que le FGF. Elles se
différencient en motoneurones (environ 30 % d’entre elles) lorsqu’elles sont privées de facteurs
de croissance (Weiss et al., 1996), (MacDonald et al., 2003)
Il a été possible de dériver des motoneurones humains à partir de cellules souches
embryonnaires humaines (Li et al., 2005; Shin et al., 2005). De manière intéressante, un groupe
a réussi à reprogrammer des fibroblastes de patients SLA en cellules souches pluripotentes, par
introduction des gènes Klf4 (« Krueppel-like factor 4 »), Sox2 (« Sex determining region Y-box
59
Introduction
2 »), Oct4 (« Octamer-binding Transcription factor 4 ») et c-Myc. En culture, ces cellules
s’agrègent en corps embryoïdes et se différencient en motoneurones après traitement à l’acide
rétinoïque et au Shh (Dimos et al., 2008). Ces « motoneurones » de patients permettront
d’étudier et de comprendre certains mécanismes de mort communs aux formes familiales et
sporadiques.
4.
Les tranches organotypiques
Le modèle des tranches organotypiques est un bon modèle intermédiaire entre le in vitro et le in
vivo. En effet il conserve les avantages de la culture tout préservant la connectivité entre les
différents types cellulaires et la structure in vivo. La majorité des modèles de tranches
organotypiques de moelle épinière sont réalisés chez les embryons de souris ou chez les
souriceaux (entre le 2ème et 10ème jour postnatal) (Rothstein et al., 1993). Les tranches ont une
bonne survie de une à 3 semaines selon les études in vitro. Elles sont majoritairement utilisées
pour des études d’électrophysiologie et d’excitotoxicité, comparant des tranches issues de souris
sauvage ou SOD1G93A (Avossa et al., 2006; Rothstein et al., 1993), (Kosuge et al., 2009),
(Amendola et al., 2007). Peu d’études ont comparé la survie des motoneurones dans les
tranches « sauvages » par rapport aux « SOD1 mutée » et ces modèles restent plus des modèles
d’études développementaux que des modèles d’études de la maladie. C’est pourquoi un modèle
de tranche adulte a été développé dans notre laboratoire afin d’étudier la survie cellulaire, mais
également comme plateforme de criblage de nouveaux composés à visée thérapeutique.
Les études que nous avons effectuées sont basées sur le modèle de souris surexprimant la
SOD1G93A, in vivo et in vitro grâce à des cultures primaires de motoneurones. Nous allons donc
dans un premier temps décrire les principaux mécanismes de toxicité associés à la présence de
la SOD1 mutée et pouvant conduire à la mort des motoneurones (partie III et IV) puis dans un
60
Introduction
second temps nous décrirons les processus-même de dégénérescence des motoneurones, à
savoir la dénervation et surtout l’apoptose (mécanismes décrits partie V).
61
Introduction
III. Mécanismes physiopathologiques décrits dans les
modèles souris de la SLA
Les modèles de SLA ont permis de mettre en évidence une pléthore de dysfonctionnements dans
tous les compartiments cellulaires, que nous allons décrire ci-dessous.
A)
Le stress oxydatif
(Figures 6, 7 et 10)
Le stress oxydatif se définit comme l’agression des constituants de la cellule par des dérivés réactifs
de l’oxygène (ROS) tels que les radicaux libres, les ions oxygénés, les peroxydes, en particulier
l’anion superoxyde (O2-), le peroxyde d’oxygène (H2O2), l’oxyde nitrique (NO) ou encore le
peroxynitrite (ONOO-).
La fonction de la SOD1 étant d’assurer la catalyse des ions superoxydes, les mutations dans la
SOD1 pourraient conduire soit à une diminution de l’activité de capture des radicaux libres, soit à
une production aberrante de radicaux. Cependant, comme la déficience en SOD1 n’induit pas la
maladie et que des souris exprimant des SOD1 mutées développent la maladie alors même que leur
activité dismutase est préservée, la première hypothèse est peu probable. En revanche, une
augmentation de protéines oxydées a été observée chez les souris SOD1G93A, ce qui est en faveur
de la seconde hypothèse (Andrus et al., 1998). En effet, des dommages oxydatifs liés au
peroxynitrite ont été rapportés chez les souris SOD1G93A et chez les patients SLA (Bruijn et al.,
1997), (Beal et al., 1997), (Barber and Shaw, 2010).
Les ROS associés à la production de peroxynitrite conduisent à de nombreux dégâts cellulaires
comme la nitration de protéines qui change leur conformation ce qui peut aboutir à leur
dégradation; l’oxydation des lipides qui altère la dynamique de la membrane plasmique et enfin des
dommages à l’ADN et à l’ARN (Barber and Shaw, 2010). Récemment, une étude a montré que
l’ablation génétique de l’enzyme synthétisant l’oxyde nitrique (iNOS) améliore la survie des souris
SOD1G93A (Martin et al., 2007).
62
Introduction
La production de ROS peut provenir, chez les motoneurones, de mitochondries endommagées (voir
partie III.D) et aussi des cellules gliales environnantes. Par exemple, la SOD1 mutée dans la
microglie conduit à la production d’anions superoxydes: en effet, la SOD1 mutée se lie avec une
plus grande affinité que la SOD1 sauvage à une petite GTPase rac1 ce qui stimule l’activation de la
NADPH oxydase (« Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate ») et notamment de sa sous-unité
catalytique Nox2, induisant une production d’anions superoxydes (Figure 7) (Harraz et al., 2008),
(Ilieva et al., 2009). De plus la délétion génétique de la sous-unité Nox2 ou l’injection d’un
inhibiteur de l’activation des Nox, l’apocynine, retarde le déclenchement de la maladie et l’apocynine
à forte dose double la survie des souris (240 jours au lieu de 125 jours) (Harraz et al., 2008;
Marden et al., 2007).
Enfin, la SOD1 mutée peut également être oxydée ce qui peut participer à son agrégation (Karch et
al., 2009). Il est d’ailleurs intéressant de souligner que l’oxydation de la SOD1 sauvage lui procure
de nouvelles propriétés de SOD1 mutée, notamment celle de l’agrégation (Bosco et al., 2010),(Ezzi
et al., 2007).
63
Introduction
Endommagement
Agrégation de protéines
des mitochondries
Activation de
la microglie
Oxydation et Nitrosylation de
protéines
Dérivés réactifs de l’oxygène (ROS):
NO, O2-, H2O2, ONOO-
Activation
des astrocytes
Endommagement
des acides nucléiques
Oxydation des lipides
membranaires
Figure 6 Causes et conséquences du stress oxydatif dans la SLA
Le stress oxydatif se définit comme l’agression des constituants de la cellule par des dérivés réactifs de
l’oxygène (ROS) tels que les radicaux libres, les ions oxygénés, les peroxydes, notamment l’anion superoxyde
(O2-), le peroxyde d’oxygène (H2O2), le monoxyde d’azote ou oxyde nitrique (NO) et la peroxynitrite (ONOO-).
Les ROS peuvent être responsables du dysfonctionnement de compartiments de la cellule tels que le RE et la
mitochondrie, cette dernière pouvant en retour produire des ROS. Ces réactifs oxygénés peuvent causer
l’oxydation de lipides de la membrane, perturbant la structure de la surface membranaire, de protéines ce qui
peut entraîner la formation d’agrégats, et des dommages aux acides nucléiques. Les cellules gliales comme
les astrocytes et la microglie qui expriment la SOD1 mutée, sécrètent également des ROS (Barber and Shaw,
2010; Liu et al., 1999)
64
Introduction
Microglie activée
mSOD1
Rac
GTP
Nox2
O2-
cytoplasme
Espace
extracellulaire
p22
O2O2-
O2-
Figure 7 Production d’anions superoxides par la microglie en présence de SOD1 mutée
En conditions réductrices, la SOD1 mutée s’associe, avec une affinité supérieure à celle de la SOD1 sauvage,
à la petite protéine GTPase Rac1, laquelle va activer de manière constitutive le complexe de la NADPH
oxidase et notamment la sous-unité catalytique Nox2. Cette protéine activée va produire des ions
superoxydes, espèces réactives de l’oxygène (Harraz et al., 2008; Ilieva et al., 2009)
65
Introduction
B)
Agrégation de la protéine SOD1 mutée
(Figures 8 et 10)
Comme chez les patients SLA, l’agrégation est une des caractéristiques histopathologiques
prédominantes dans les modèles souris de la SLA. En effet les souris surexprimant les protéines
mutées SOD1, TDP-43, FUS ou encore VAPB présentent des agrégats dans le cytoplasme et dans
certaines organelles comme le réticulum endoplasmique ou encore la mitochondrie.
La structure et la fonction finales de la SOD1 nécessitent plusieurs étapes de maturation comme
une acétylation de la partie N-terminale, l’insertion des ions cuivre et zinc, la formation des ponts
disulfure et une dimérisation (Chattopadhyay and Valentine, 2009).
Or, la SOD1 mutée a tendance à ne pas être repliée correctement et peut s’associer avec d’autres
monomères de SOD1 et d’autres protéines, et former des agrégats (Furukawa et al., 2006) de poids
moléculaires importants, insolubles, qui se concentrent dans les tissus d’une manière dépendante
de l’âge (Bruijn et al., 1998), (Wang et al., 2005b),(Johnston et al., 2000) (Furukawa et al., 2006).
Ces agrégats sont localisés en plus grande proportion dans les motoneurones (Kabashi et al., 2004).
Leur accumulation au cours du temps s’effectue en parallèle à la progression de la mort des
motoneurones, ce qui suggère que ces agrégats pourraient être toxiques. De plus, la propension de
la SOD1 mutée à s’agréger serait corrélée liée à une survie plus courte des patients (Wang et al.,
2008).
L’accumulation de la SOD1 mutée peut perturber le fonctionnement de certaines organelles et
piéger des composés essentiels pour la cellule. Par exemple, la SOD1 mutée peut piéger les
protéines chaperonnes cytoplasmiques de la famille des HSPs (« Heat Shock Protein »), et diminuer
leur activité (Okado-Matsumoto and Fridovich, 2002) (Bruening et al., 1999) (Tummala et al.,
2005).
A l’inverse, l’augmentation des HSPs in vitro diminue le nombre d’agrégats et la mort cellulaire
(Bruening et al., 1999), (Patel et al., 2005),(Takeuchi et al., 2002). In vivo, bien que la
66
Introduction
surexpression génétique de la protéine HSP70 chez les souris SLA n’ait aucun effet sur la
progression de la maladie (Liu et al., 2005), le traitement des souris SOD1G93A avec l’arimoclomol,
une drogue induisant de forts niveaux des chaperonnes HSP70 et de HSP90, augmente la survie
des souris (Kieran et al., 2004). Plus généralement, l’agrégation de la SOD1 mutée peut avoir des
conséquences sur de nombreuses fonctions comme la sécrétion, la respiration mitochondriale, le
transport axonal et l’activité du protéasome (Boillee et al., 2006a).
SOD1 mutée mal-repliée
Agrégats de
protéines
Dysfonctionnement de …
Réticulum endoplasmique et
appareil de Golgi
mitochondrie
Transport axonal
Protéasome altéré, Chaperone piégées
dorfine piégée
Figure 8 Toxicité liée à la formation d’agrégats de SOD1 mutée
La SOD1 mutée possède une forte tendance à s’agréger et la formation de ces agrégats peut avoir des
conséquences importantes sur le fonctionnement cellulaire. En effet, ils peuvent piéger des composants
cytoplasmiques essentiels comme les chaperonnes ou encore bloquer l’activité du protéasome. Ces deux
phénomènes auront pour conséquence d’augmenter encore plus le nombre d’agrégats. A terme, ces agrégats
peuvent perturber la fonction du RE, de la mitochondrie et du transport axonal, mécanismes essentiels pour la
survie du motoneurone (Boillee et al., 2006a)
67
Introduction
C)
Défaillance du système ubiquitine-protéasome
(Figure 10)
Le protéasome est un complexe enzymatique multiprotéique chargé d’éliminer des protéines mal
repliées, traduites de façon incomplète, endommagées ou encore à courte durée de vie (Kabashi et
al., 2004). Ce système de dégradation étant important pour le fonctionnement cellulaire, il est
retrouvé dans presque tous les compartiments cellulaires: le noyau, le cytoplasme et également
associé au réticulum endoplasmique. Les protéines sont marquées pour la dégradation par l’ajout
d’ubiquitine, ceci nécessitant l’activation successive de trois enzymes (1,2,3).
Des études biochimiques ont permis d’observer une diminution de l’activité du protéasome à des
stades asymptomatiques de la maladie dans la partie lombaire de la moelle épinière de souris
SOD1G93A (Kabashi et al., 2004), (Cheroni et al., 2009). Des expériences in vitro ont confirmé ces
données et établit un lien direct entre la surexpression de la SOD1 mutée et la diminution de
l’activité du protéasome (Kabashi et al., 2004). Il semblerait que l’accumulation excessive de SOD1
mutée ubiquitinylée pourrait affecter la machinerie du protéasome et la dégradation de protéines,
dont celle de la SOD1 ce qui aggraverait la proportion d’agrégats SOD1 (Basso et al., 2006), (Niwa
et al., 2002), (Urushitani et al., 2004). D’un point de vue mécanistique, il a été montré que la SOD1
mutée est poly-ubiquitinylée et s’associe à une protéine E3 ligase, la Dorfine. La surexpression de
Dorfine diminue la quantité de ces agrégats en stimulant leur dégradation (Niwa et al., 2002).
68
Introduction
D)
Dysfonctionnement de la mitochondrie
(Figure 10)
La mitochondrie est une organelle cellulaire primordiale qui catalyse les processus énergétiques de
la cellule, via la production d’ATP. Elle participe également au stockage des ions calcium et peut
participer à l’apoptose cellulaire en libérant le cytochrome C (voir partie V.B).
Des dommages morphologiques (vacuolisation et dilatation) ainsi que fonctionnels de la
mitochondrie ont été décrits dans les muscles et la moelle épinière des patients SLA (Chung and
Suh, 2002), (Dupuis et al., 2003), (Echaniz-Laguna et al., 2002), (Vielhaber et al., 1999),
(Wiedemann et al., 2002) et chez des souris surexprimant différentes SOD1 humaines mutées, à
des stades présymptomatiques (Mattiazzi et al., 2002), (Liu et al., 2004), (Vijayvergiya et al., 2005),
(Vande Velde et al., 2008).
La SOD1 mutée mal repliée s’agrège dans la membrane mitochondriale et particulièrement au
niveau de la face cytoplasmique de la membrane externe de la mitochondrie (Vande Velde et al.,
2008). Elle s’y associe au canal anionique dépendant du voltage « VDAC », paralysant la
conductance des canaux de la mitochondrie. D’ailleurs, la perte de VDAC chez les souris SOD1G93A
réduit fortement leur survie (Israelson et al., 2010). D’autres défauts fonctionnels dans les
mitochondries ont été associés à la présence de la SOD1 mutée: une diminution de l’activité du
complexe de la chaîne respiratoire et par conséquence des niveaux d’ATP (Mattiazzi et al., 2002),
(Browne et al., 2006),(Jung et al., 2002), une diminution dans la capacité à tamponner le calcium,
ce qui favorise une augmentation du calcium dans le cytoplasme et par conséquent des processus
d’excitotoxicité (III.G) (Damiano et al., 2006) , (Coussee et al., 2011), et une production de
produits oxygénés réactifs (ROS) (Paradies et al., 2009). Enfin, les dommages des mitochondries
provoqués par la SOD1 mutée peuvent aussi altérer leur transport axonal (De Vos et al., 2008).
69
Introduction
E)
Perturbation du transport axonal
(Figure 10)
1.
Définition générale
Les motoneurones sont des cellules polarisées dont les axones peuvent mesurer jusqu’à un mètre
chez l’homme. Afin d’assurer une bonne répartition des protéines, des composants nutritifs et
trophiques ainsi que des organelles nécessaires à la survie du motoneurone, ces cellules possèdent
un système de transport efficace.
Le transport axonal fonctionne dans les deux sens: une direction antérograde, c’est-à-dire du corps
cellulaire vers la synapse, et une direction rétrograde, qui part de la synapse pour aller vers le corps
cellulaire. Ce transport bidirectionnel est possible grâce au support des microtubules polarisés et
aux moteurs moléculaires: ceux de la famille des kinésines qui assurent le transport antérograde et
ceux de la famille des dynéines qui assurent le transport rétrograde. Enfin, pour chacune des
directions, il existe deux types de transport: le transport rapide, celui des vésicules et des
mitochondries, et le transport lent qui régule les composants du cytosquelette (De Vos et al., 2008).
2.
Un transport axonal défectueux
Plusieurs études décrivent à la fois un dysfonctionnement du transport antérograde (Williamson and
Cleveland, 1999) (De Vos et al., 2007; Zhang et al., 1997) et du transport rétrograde à des stades
non symptomatiques, à partir de 35 jours postnataux (Bilsland et al., 2010). Plus précisément, des
études in vitro et in vivo ont montré que le mouvement antérograde des neurofilaments, des
vésicules synaptiques et des mitochondries est inhibé chez les souris SOD1G93A (Pun et al., 2006),
(Perlson et al., 2009) (De Vos et al., 2007).
70
Introduction
•
Le transport des mitochondries:
Celui-ci est primordial pour que les mitochondries puissent fournir de l’énergie sous forme d’ATP et
de métabolites dans les axones, et assurer un tamponnage de calcium. Leur transport est difficile à
étudier car leur déplacement comprend de nombreuses pauses et quelquefois un retour en sens
inverse (Duffy et al., 2011). Des études in vitro et in vivo ont montré un lien de causalité entre la
présence de la SOD1 mutée dans la mitochondrie et une perturbation du transport de celle-ci
(Magrane and Manfredi, 2009) (Vande Velde et al., 2011).
Globalement, les transports antérograde et rétrograde semblent ralentis, ce qui épuiserait les stocks
de mitochondries fonctionnelles au niveau des terminaisons axonales (De Vos et al., 2008). Une
idée a été de vouloir augmenter le transport des mitochondries chez les souris mSOD1, pour
augmenter le stock de mitochondries disponibles au niveau distal mais aussi pour recycler les
mitochondries endommagées au niveau des synapses. Pour cela les auteurs ont ingénieusement
annulé génétiquement la syntaphiline, qui est le récepteur d’ancrage des mitochondries axonales, et
ont croisé ces souris avec les SOD1G93A. Bien que le transport axonal augmente de deux fois dans
ces conditions, aucune répercussion positive sur la progression de la maladie n’a pu être observée.
Ces résultats suggèrent un impact mineur du défaut de transport mitochondrial sur la maladie (Zhu
and Sheng, 2011). Il reste qu’une insuffisance de mitochondries peut entraîner une déficience en
ATP, facteur énergétique nécessaire pour le fonctionnement d’autres cargos, et ne peut donc être
anodine pour un motoneurone subissant d’autres sources de stress.
•
Le transport des neurofilaments:
Les neurofilaments représentent un des cargos pouvant être endommagés par la SOD1 mutée. Leur
accumulation est une caractéristique pathologique de la SLA et d’ailleurs la surexpression seule des
neurofilaments de type léger ou lourd chez des souris conduit au développement d’une maladie de
neurones moteurs et à un défaut de transport axonal (Cote et al., 1993; Lee et al., 1994),(Xu et al.,
1993). Au contraire, la délétion de sous-unités légères ou moyennes des neurofilaments chez les
souris SOD1G93A conduit à une amélioration de la maladie (Lobsiger et al., 2005). En présence de la
71
Introduction
SOD1 mutée les sous-unités des neurofilaments sont hyperphosphorylées notamment par la
protéine kinase p38 (Ackerley et al., 2003), (Shea et al., 2004) ce qui entraînerait leur détachement
des moteurs moléculaires, leur agrégation, un ralentissement global du transport (Jung et al.,
2005), (Wagner et al., 2004) et à terme une toxicité dans les motoneurones.
•
Le transport axonal défectueux entraîne une maladie des neurones moteurs :
L’importance du transport axonal dans la SLA a été prouvée par la découverte de mutations dans
les constituants du complexe des moteurs moléculaires. En effet, des souris présentant une
mutation spontanée dans la dynéine (mutations loa et cra) possèdent un transport rétrograde
défectueux associé à une dégénérescence des neurones moteurs et /ou des neurones sensitifs
(Hafezparast et al., 2003), (LaMonte et al., 2002) (Kieran et al., 2005). De même, des mutations
dans la sous-unité P150
glued
de la dynactine, liée à la dynéine, entraînent un phénotype moteur
(Munch et al., 2005; Puls et al., 2003).
Néanmoins le croisement des souris loa et cra avec les mutants SOD1 a abouti à un résultat
surprenant avec un retard de la progression de la maladie au lieu d’une accélération. De plus, le
transport rétrograde défectueux est corrigé en partie chez ces doubles mutants (Kieran et al., 2005;
Teuchert et al., 2006). Une des hypothèses serait que la mutation de la dynéine pourrait retarder le
transport rétrograde de facteurs de stress et rétablir une homéostasie axonale (Perlson et al., 2009)
(voir ci-dessous).
3.
Déplétion en neurotrophine
Une des conséquences majeures du défaut dans le système de transport est l’épuisement des
motoneurones en neurotrophines qui sont produites par les cellules postsynaptiques (notamment
les muscles) et qui doivent être transportées de façon rétrograde afin d’effectuer leur fonction de
signalisation dans le corps cellulaire (Cosker et al., 2008). En effet, les facteurs neurotrophiques
interagissent au niveau du corps cellulaire avec leur récepteur TrKB (« Tyrosine Kinase B ») et
initient des cascades de signalisation régulant la croissance et la survie cellulaire (Strom et al.,
2008).
72
Introduction
Le niveau d’expression de facteurs neurotrophiques tels que le CNTF (« cilliary neurotrophic
factor ») (Giess et al., 2002), le VEGF ou encore le GDNF (« glial-derived neurotrophic factor ») a
été montré comme influençant fortement la survie des souris SOD1G93A (Lambrechts et al., 2003).
Ainsi in vivo, des injections intramusculaires de vecteurs viraux surexprimant le VEGF, le GDNF ou
l’IGF-1, permettent un transport rétrograde de ces facteurs jusqu’aux motoneurones et retardent le
déclenchement et la progression de la maladie (Azzouz et al., 2004; Wang et al., 2002b),
(Dobrowolny et al., 2005).
Des études in vitro et in vivo ont montré que la diminution significative du transport rétrograde chez
les souris SOD1G93A présymptomatiques conduit à la diminution du transport de facteurs pro-survie
(P-Trk, Erk1/2, Erk 5, NGF BDNF) au profit d’une augmentation du transport rétrograde de facteurs
de stress rétrograde (P-JNK, caspase 8, p75NTR) (Perlson et al., 2009), phénomènes qui peuvent
être critiques pour la survie des motoneurones.
F)
Perturbation des voies de sécrétion dans la SLA : mise en
cause de l’appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique
(Figure 10)
La voie de sécrétion des protéines implique l’action simultanée de deux compartiments
subcellulaires: le réticulum endoplasmique (RE) et l’appareil de Golgi (AG).
Le RE est le siège essentiel de la synthèse lipidique et protéique. Les protéines nouvellement
formées sont repliées afin d’acquérir une bonne conformation grâce à l’intervention de différents
partenaires (voir partie IV.A). Les protéines qui auront réussi ce « contrôle-qualité » sont ensuite
envoyées vers l’AG par l’intermédiaire de vésicules et de protéines associées, les COP II (« Coat
Protein »). Nous discuterons plus en détail les dysfonctionnements liés à cette organelle dans la
partie V.
L’appareil de Golgi (AG) est une structure essentielle constituée d’un réseau complexe de
membranes lisses qui permet la maturation protéique et qui assure le transport vers la membrane
73
Introduction
cellulaire ou le milieu extracellulaire. On distingue la partie cis-golgienne qui est la plus proche du
RE et la partie trans-golgienne qui est orientée vers le cytoplasme.
1. Anomalies morphologiques du réticulum endoplasmique et de
l’appareil de Golgi
Certains compartiments du RE, appelés citernes, sont dilatés dans les motoneurones des souris
SOD1G93A (Dal Canto and Gurney, 1994),(Dal Canto and Gurney, 1995). On observe également à
des stades précoces de la maladie (30 jours), une diminution du nombre de vésicules associées à
l’AG ainsi qu’une déstructuration du réseau golgien, appelée fragmentation de l’appareil de Golgi
(Nassif et al., 2010), (Mourelatos et al., 1996). Ces observations suggèrent que la voie de sécrétion
liée au RE-AG est une cible précoce de la toxicité liée à l’expression de la SOD1 mutée.
2.
Sécrétion de la SOD1 mutée: un nouveau mécanisme de toxicité
Plusieurs études ont montré que la SOD1 mutée pouvait être associée à cette voie de sécrétion. En
effet, bien que la SOD1 soit une protéine synthétisée dans le cytosol, sa forme mutée s’accumule de
manière âge-dépendante dans les motoneurones de la moelle épinière, sous forme d’espèces à haut
poids moléculaire. Cette accumulation s’effectue particulièrement dans la fraction microsomale, qui
comprend majoritairement des vésicules du RE et de l’AG (Urushitani et al., 2008) (Kikuchi et al.,
2006).
Dans ce contexte, les chromogranines A et B ont été identifiées comme de nouveaux partenaires de
la SOD1 mutée (Urushitani et al., 2006). Ce sont des protéines associées aux vésicules du réseau
RE-AG qui permettent l’exocytose dans les cellules neuronales et endocrines. L’association de la
SOD1 mutée avec la chromogranine conduit à sa sécrétion dans le milieu extracellulaire. D’ailleurs
la surexpression génétique de la chromogranine A chez les souris SOD1G93A accélère le
déclenchement de la maladie, ce qui montre l’importance de ce processus de sécrétion dans la
pathogénicité liée à la SOD1 mutée (Ezzi et al., 2010).
74
Introduction
Afin de prouver le rôle important joué par cette SOD1 mutée sécrétée et de tester une approche
thérapeutique, une procédure de vaccination a été mise en place. Pour cela, des souris SOD1G37R
ont reçu l’injection d’une protéine SOD1 mutée recombinante purifiée comme immunogène. En
suivant ce protocole, on observe une survie prolongée d’environ un mois. De même, l’injection
d’anticorps dirigés contre la SOD1 mutée par infusion cérébrale intraventriculaire, prolonge
également la survie des SOD1G93A (Urushitani et al., 2007). De plus, la diminution de l’activité du
protéasome, observée chez les souris SOD1G93A, peut être reproduite par un inhibiteur, la
lactacystine, et celle-ci augmente la sécrétion de la SOD1 mutée agrégée (Urushitani et al., 2006).
Ces résultats suggèrent que l’accumulation même de la SOD1 mutée promeut sa sécrétion. Le
complexe chromogranine–SOD1 mutée est sécrété à la fois par les motoneurones, les interneurones
et les astrocytes. Les agrégats SOD1 mutée peuvent, par ce biais, se propager de cellules en
cellules (Munch et al., 2011) ce qui met en avant un processus de toxicité de la SOD1 mutée
impliquant les cellules environnantes des motoneurones.
75
Introduction
G)
Participation des cellules environnantes dans la SLA
(Figure 10)
Dans une première partie, nous montrerons les travaux qui ont mis en évidence que la présence
seule de SOD1 mutée dans les motoneurones n’était pas suffisante pour induire la maladie. Dans
les parties suivantes, nous étudierons plus en détail les travaux faits sur l’implication des cellules
gliales, puis des muscles dans la maladie.
1.
Mise en évidence de l’implication des cellules non-motoneuronales
Dans un premier temps, on pensait que la toxicité liée à la SOD1 mutée dans les motoneurones
impliquait un processus cellule-autonome générant un certain nombre de dommages devenant
létaux au-delà d’un certain seuil. Cependant des études récentes ont montré que ce processus
pathologique possédait également une composante cellule non-autonome, impliquant les cellules
gliales et microgliales en contact proche avec les motoneurones (Lobsiger and Cleveland, 2007).
Ce concept de processus non-autonome est apparu lorsqu’il a été montré que la surexpression de la
SOD1 mutée (G37R, G85R, G93A) seulement dans les motoneurones n’induisait pas de pathologie
motrice (Lino et al., 2002; Pramatarova et al., 2001) ou bien une pathologie se déclenchant très
tardivement et progressant lentement chez des souris homozygotes (Jaarsma et al., 2008). De plus,
la surexpression de la SOD1 mutée seulement dans les astrocytes (Gong et al., 2000) ou dans la
microglie (Beers, 2006 #240} n’était pas non plus suffisante pour induire des phénotypes moteurs.
Ces résultats montrent donc que la dégénérescence motoneuronale est le résultat d’une
coopération entre plusieurs types cellulaires.
Afin de déterminer si l’environnement cellulaire des motoneurones SOD1 mutants influençait des
étapes précises de la maladie, des souris chimères ont été créées, contenant des cellules qui
expriment la SOD1 mutée entourées par une proportion variable de cellules sauvages. De manière
intéressante, plus la proportion des cellules sauvages est grande, plus la survie des motoneurones
76
Introduction
SOD1 mutants est préservée (Clement et al., 2003), (Yamanaka et al., 2008a). Par voie de
conséquence, la survie des souris est améliorée.
Dans le but de déterminer quels types cellulaires participaient aux différentes étapes de la maladie,
des excisions cellule-spécifique de la SOD1 mutée par le système cre/lox ont été réalisées.
L’excision de la SOD1 mutée G37R spécifiquement dans les motoneurones a été effectuée en
utilisant la Cre recombinase sous le promoteur Islet ou Vacht (vesicular acetylcholin transporter),
tous deux des marqueurs de populations motoneuronales (Boillee et al., 2006a), (Yamanaka et al.,
2008a), et celle de la SOD1 mutée G85R en combinant une excision dans les motoneurones et les
interneurones (Lhx3-cre, protéine à homéodomaine caractérisant le devenir neuronal) (Wang et al.,
2009b).
Trois étapes de la maladie ont été analysées: 1) le déclenchement de la maladie qui se définit
comme le pic du poids de la souris avant son déclin 2) la phase précoce de progression de la
maladie qui se définit comme la période entre le pic du poids de la souris et la perte de 10 % de
son poids maximal 3) la phase tardive de progression de la maladie qui se définit comme la période
allant de la perte de 10 % du poids maximal de la souris jusqu’à la mort de la souris (Boillee et al.,
2006b).
L’excision de la SOD1 mutée G37R ou G85R dans les motoneurones retarde efficacement le
déclenchement de la maladie (Yamanaka et al., 2008a), ainsi que la phase précoce de la
progression de la maladie (Boillee et al., 2006a; Wang et al., 2009b) mais n’a pas d’effet sur sa
progression tardive (Wang et al., 2009b) (Yamanaka et al., 2008a). Ces observations soulèvent la
question de la contribution des cellules environnantes dans les phases de progression de la maladie.
2.
Implication des cellules gliales
Les cellules gliales sont les cellules qui entourent les neurones et assurent de nombreuses
fonctions d’auxiliaires: elles apportent un support physique, nourricier (astrocytes) ou immunitaire
(microglie) et permettent la production de myéline (oligodendrocytes et cellules de Schwann).
77
Introduction
a)
•
Activation astrocytaire et microgliale dans la SLA
Les astrocytes: ces cellules constituent la majorité de la macroglie du système nerveux
central. On a présumé qu’elles jouaient un rôle dans la SLA en raison de leurs fonctions clés dans la
survie des motoneurones. Elles sont notamment une source de glucose, de métabolites et de
facteurs neurotrophiques pour les motoneurones. De plus elles recaptent le glutamate
extracellulaire, potentiellement toxique.
Chez les rongeurs SOD1G93A la majorité des astrocytes sont dits activés, c’est–à-dire qu’ils expriment
la protéine GFAP (glial fibrillary acidic protein) et forment de grands prolongements épais. Certains
présentent une morphologie sphéroïde et sont positifs pour l’ubiquitine et la caspase 3 (Barbeito et
al., 2010). Des travaux in vitro ont montré que des motoneurones sauvages mourraient lorsqu’ils
étaient cultivés sur un tapis astrocytaire exprimant la SOD1 mutée et provenant de souris, ou bien
de patients (Nagai et al., 2007; Vargas et al., 2006), (Di Giorgio et al., 2007; Haidet-Phillips et al.,
2011). Cette toxicité impliquerait la sécrétion par les astrocytes SOD1 mutants de facteurs toxiques
pour les motoneurones, notamment des facteurs oxydants tels que l’oxyde nitrique (Vargas and
Johnson, 2010). Fait intéressant, la stimulation du facteur Nrf2 (« NF-E2-related factor-2 »), qui
permet la production de facteurs antioxydants par les astrocytes, est bénéfique pour les
motoneurones et prolonge la survie des souris SOD1G93A (Vargas et al., 2008). Enfin la participation
des astrocytes SOD1 mutants à la mort des motoneurones proviendrait aussi de leur difficulté à
recapter le glutamate, favorisant ainsi l’excitotoxicité (voir partie III. H).
•
Les cellules microgliales: ces cellules forment la principale défense immunitaire du système
nerveux central. Selon le stimulus, la microglie est activée mais peut avoir une réponse pro-survie
ou cytotoxique (Henkel et al., 2009). Lorsque la microglie surexprime la SOD1 mutée ou lorsqu’elle
est mise en présence de SOD1 mutée extracellulaire, elle sécrète un ensemble de facteurs toxiques
notamment des produits oxygénés (des ions superoxydes (O2-), de l’oxide nitrique (NO), et des
cytokines pro-inflammatoires comme l’interleukine1 β et le TNFα (« Tumor necrosis factor ») (Xiao
et al., 2007), (Beers et al., 2006). La microglie activée par la SOD1 mutée est toxique pour les
motoneurones mis en co-culture (Urushitani et al., 2006).
78
Introduction
b) Mise en évidence de l’implication des cellules gliales sur le déroulement de
la maladie
L’excision de la SOD1G37R spécifiquement dans les astrocytes à l’aide de la Cre recombinase
exprimée sous le promoteur astrocytaire GFAP ralentit la progression de la maladie (surtout la
phase tardive), mais ne modifie pas le moment de son déclenchement. La survie des souris est
alors prolongée de 60 jours (Yamanaka et al., 2008b). En revanche, des travaux récents ont montré
que l’excision de la SOD1G85R dans les astrocytes, réalisée par la même méthode, pouvait retarder le
déclenchement de la maladie et la phase précoce de la progression mais non la phase tardive
(Wang et al., 2011a). La différence entre ces résultats pourrait être due à la différence dans les
propriétés des SOD1 mutées, la SOD1G37R, contrairement à la SOD1G85R, étant stable et active dans
sa fonction dismutase.
Enfin, la diminution des niveaux de la SOD1 mutée dans les cellules de lignage myéloïde (microglies
et les macrophages) au moyen de la Cre recombinase exprimée sous le promoteur CD11b (qui
contrôle spécification en lignage myéloïde) (Boillee et al., 2006b), (Wang et al., 2009b), ralentit la
progression de la maladie d’environ 75 jours. Une expérience complémentaire a été réalisée,
utilisant des souris SOD1 mutantes préalablement croisées avec des souris PU.1 déficientes, qui
sont incapables de produire des macrophages et de la microglie. La greffe d’une lignée myéloïde
exprimant la SOD1 mutée dans ces souris aboutit à une accélération de la maladie, prouvant ainsi la
contribution de la microglie dans la maladie (Beers et al., 2006).
Les cellules de Schwann: spécifiques au système nerveux périphérique, elles sont en contact
rapproché avec le motoneurone et sont à l’origine de la production de la gaine de myéline,
essentielle pour la transmission rapide des informations électriques. D’une manière surprenante,
l’excision de la SOD1 mutée G37R dans les cellules de Schwann n’a pas d’effet bénéfique mais au
contraire accélère la maladie (Lobsiger et al., 2009). L’hypothèse formulée par les auteurs serait
que les cellules de Schwann seraient dépendantes de l’activité dismutase de la SOD1G37R et qu’en
son absence elles n’assureraient plus leur rôle (Lobsiger et al., 2009). A ce jour, il n’y a donc pas de
preuve que les cellules de Schwann exprimant la SOD1 mutée soient délétères pour les
motoneurones.
79
Introduction
3.
Implication des muscles
La déconnexion des axones des motoneurones au niveau des jonctions neuromusculaires dans le
muscle est un événement précoce chez les souris modèles de la SLA (voir partie V.A). Une des
hypothèses proposée est que la présence de la SOD1 mutée dans les muscles provoquerait une
atrophie musculaire, ce qui endommagerait les jonctions neuromusculaires provoquant une
rétraction des axones (Fischer et al., 2004; Pun et al., 2006).
Si cette hypothèse était exacte, une diminution de la SOD1 mutée dans le muscle devrait être
bénéfique. Or, une diminutionde la SOD1G37R dans le muscle, par interférence-ARN ou par excision
de gène, n’a eu aucun effet bénéfique sur les souris (Miller et al., 2006; Towne et al., 2008).
Par contre, la surexpression de la SOD1 mutée (G93A et G37R) uniquement dans le muscle semble
avoir des effets nocifs car ces souris présentent à un âge tardif (autour de 12 mois) une faiblesse
musculaire, des dommages dans les muscles (perte des fibres musculaires) et au niveau des
jonctions neuromusculaires (perte des terminaisons présynaptiques) ainsi qu’une dégénérescence
motoneuronale (Dobrowolny et al., 2008) (Wong and Martin, 2010).
Afin d’empêcher l’atrophie musculaire et de développer une thérapie, des stimulations de la
myogénèse par inhibition de la myostatine ont été réalisées mais n’ont abouti à aucune amélioration
de la maladie (Holzbaur et al., 2006), (Miller et al., 2006). Bien que les muscles seuls ne semblent
pas avoir un rôle décisif dans le déroulement de la maladie, on ne peut nier qu’ils participent
toutefois, en association avec les autres types cellulaires, à la dénervation (voir partie V) et à la
dégénérescence des motoneurones (Dobrowolny et al., 2008) (Wong and Martin, 2010).
Ces études mettent en lumière l’importance de stratégies thérapeutiques ciblées, afin de pouvoir
induire la diminution de la SOD1 mutée seulement dans les types cellulaires qui sont impliqués dans
le processus de toxicité.
80
Introduction
H)
L’excitotoxicité dans la SLA
(Figures 9 et 10)
1.
Définition
L’excitotoxicité est un processus pathologique qui affecte la survie neuronale et qui consiste en une
stimulation excessive des récepteurs au glutamate suivie d’une entrée massive de calcium dans la
cellule.
Or, les motoneurones sont plus sensibles que d’autres types neuronaux à des perturbations de
l’homéostasie calcique (Langou et al., 2010) car ils sont peu armés contre ces phénomènes. En
effet, ils reçoivent des stimulations glutamatergiques fortes et expriment de nombreux récepteurs
AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4 propionate) qui sont hautement perméables au
calcium en raison de l’absence de la sous-unité GLUR2 dans ces récepteurs. Les motoneurones
possèdent également une faible capacité de tamponnage de calcium (Van Den Bosch et al., 2006),
(Heath and Shaw, 2002), (Kawahara et al., 2003). Cette faible capacité de tamponnage leur confère
l’avantage d’une facilité de mobilisation calcique qui leur permet d’effectuer des échanges
transitoires de calcium à faible coût énergétique pour ces cellules de taille importante. (Lips and
Keller, 1999). Cependant, dans un contexte pathologique, ces caractéristiques sont exacerbées et
peuvent précipiter la mort des motoneurones ou y participer.
2.
Les motoneurones SOD1G93A, le glutamate et le calcium:
La présence de niveaux élevés de calcium cytoplasmique est critique dans la mort des
motoneurones. En effet une étude a montré que les motoneurones dits vulnérables dans la maladie
présentent une capacité de tamponnage du calcium 5 à 6 fois moindre que les motoneurones
résistants à la maladie (du noyau oculomoteur par exemple) (Palecek et al., 1999), (Lips and Keller,
1998), (Vanselow and Keller, 2000).
De même, l’absence de la sous-unité GLUR2 qui est responsable de la perméabilité au calcium du
récepteur AMPA est cruciale dans la mort des motoneurones SOD1G93A: une déficience dans cette
81
Introduction
sous-unité accélère la progression de la maladie alors qu’au contraire sa surexpression augmente la
survie des souris (Tateno et al., 2004) (Van Damme et al., 2005).
La Calbindine D28 K et la parvalbumine sont des protéines tampons du calcium dans le cytoplasme
et sont diminuées dans la moelle épinière de patients SLA et des souris SOD1G93A (Alexianu et al.,
1994). Le rôle de tamponnage de calcium qu’elles assurent est important car la surexpression de la
parvalbumine chez les SOD1G93A est bénéfique (Beers et al., 2001).
Le tamponnage du calcium intracellulaire dans les motoneurones est également effectué au niveau
des mitochondries et du réticulum endoplasmique (Jahn et al., 2006). Or la présence de la SOD1
mutée dans ces deux organelles perturbe à la fois leur morphologie et leur fonctionnement, et rend
alors défectueuse leur capacité à tamponner le calcium (Kawamata and Manfredi, 2010). (Voir
également partie IV)
Une des fonctions des astrocytes est de réguler le glutamate du milieu extracellulaire afin d’éviter
son action neurotoxique. Cette régulation se fait grâce à la présence de transporteurs au glutamate
GLAST (glutamate aspartate transporter) et GLT-1 (glutamate transporter 1), dont les homologues
humains sont EAAT1 et 2. Or chez les souris SOD1G93A comme chez les patients, une perte sélective
de ce transporteur est observée (Fray et al., 1998) (Sasaki et al., 2000), (Bendotti et al., 2001),
(Howland et al., 2002). L’ablation partielle de GLT1 chez les souris SOD1G93A conduit à une perte
plus précoce des motoneurones et à une mort accélérée (Pardo et al., 2006), alors que la
surexpression de ce transporteur dans les astrocytes chez les souris mutantes retarde la
dégénérescence des neurones moteurs et des fonctions motrices mais ne présente aucun effet sur
la survie des souris (Guo et al., 2003).
Enfin des études ont montré en utilisant des systèmes de co-culture neurones/glie, que les
astrocytes exprimant la SOD1 mutée devenaient incapables de sécréter des facteurs (notamment
des facteurs neurotrophiques) qui activaient la transcription de la sous-unité GLUR2 dans les
motoneurones, amplifiant le processus d’excitotoxicité (Bogaert et al., ; Van Damme et al., 2007).
82
Introduction
Enfin, le seul composé utilisé actuellement ayant un effet sur la progression de la maladie des
patients est le riluzole, qui est un antagoniste de la libération glutamatergique. Ceci suggère un rôle
important du processus de l’excitotoxicité dans la SLA.
glutamate
Riluzole
calcium
calbindine
mSOD1
parvalbumine
3
AMPA récepteur
sans la GluR2
GLT-1
mSOD1
diminution
4
X
1
GluR2
2
MORT
Figure 9 Rôle de la SOD1 mutée dans le processus d’excitotoxicité des motoneurones
(1) La libération massive de glutamate par le neurone présynaptique active les récepteurs AMPA des
motoneurones postsynaptiques. Les motoneurones expriment une majorité de récepteurs AMPA perméables
au calcium, car ils possèdent peu de sous unité GluR2. (2) La stimulation de ces récepteurs AMPA va
entraîner un flux de calcium entrant. Les motoneurones possèdent peu de protéines tampon de calcium dans
le cytoplasme ; le calcium sera par conséquent capturé par la mitochondrie et le réticulum endoplasmique.
Cependant une entrée massive de calcium dans ces organelles peut perturber leur fonctionnement et
favoriser des voies apoptotiques. (3) Par ailleurs, les astrocytes SOD1 mutants, contrairement aux astrocytes
« sains » expriment peu le transporteur GLT-1 qui permet de recapturer le glutamate extracellulaire, afin de
diminuer l’activation excessive des récepteurs AMPA. (4) Enfin, les astrocytes SOD1 mutants perdent
également la capacité de réguler la synthèse de la sous unité GluR2. L’ensemble de ces dysfonctionnements
amplifie le processus d’excitotoxicité des motoneurones SOD1 mutants (Grosskreutz et al., 2010)
83
Introduction
1
Stress du RE : activation
de la voie UPR puis de
l’apoptose
Sécrétion de SOD1 mutée
extracellulaire en
association à la
chromogranine A/B
2
3
Production de ROS par la
microglie et les
astrocytes : activation de
la NADPH oxidase
9
O2-
NO
O2O2GLT-1/
EAAT2
1
NO
2
4
O2-
Nogo-A
NGF
IFNγ
5
4 Excitotoxicité :
6
augmentation de
calcium intracellulaire,
diminution de la
recapture du glutamate
Démantèlement de la
jonction neuromusculaire,
arrêt et perte des
vésicules synaptiques
O2-
NO
Diminution de l’activité
du protéasome, agrégats
de SOD1 mutée
3
SOD1 mutée
Sema3A
7
O2-
9
TNFα
FasL
8
5
Dysfonctionnement de la
mitochondrie: vacuolisation,
réduction de la production
d’ATP, du tamponnage de
calcium, production de ROS,
apoptose
6
Activation des
récepteurs de mort Fas,
p75 NTR , TNFR et à
LIGHT
8
7
Perturbation du transport axonal
antérograde et rétrograde :
accumulation de mitochondries
endommagées, de neurofilaments;
réduction du transport de facteurs
neurotrophiques
Figure 10 Vue d’ensemble des mécanismes de toxicité dans la SLA liée à la SOD1 mutée
1. Le stress du RE suite à l’accumulation de la SOD1 mutée dans le RE, le blocage des voies de dégradation
(ERAD) et l’emprisonnement des chaperonnes dans les agrégats. 2. La SOD1 mutée peut être sécrétée à
l’aide de l’association avec les chromogranines par les motoneurones mais aussi par la microglie. 3. Les
cellules gliales peuvent produire et sécréter des facteurs toxiques comme des ROS, des cytokines (IFNγ,
TNFα, le ligand au récepteur Fas, ou le NGF). 4. Le processus d’excitotoxicité chez les motoneurones SOD1
mutants est dû à la perte des mécanismes de recapture du glutamate et cause une augmentation du calcium
intracellulaire. 5. L’activité du protéasome est diminuée par une surcharge protéique, notamment d’agrégats
de la SOD1 mutée. 6. Dysfonctionnement de la mitochondrie dû à l’accumulation de la SOD1 mutée dans la
membrane mitochondriale. 7. Stimulation des récepteurs de mort Fas, p75NTR, TNFR et à LIGHT. 8. Transport
axonal antérograde et rétrograde défectueux qui est le système de communication entre le soma et la
synapse. 9. La dénervation est un événement précoce dans la SLA qui est concomittant à la perte de
vésicules des synapses distales. Des protéines impliquées dans le guidage axonal telles que Sema3A et Nogo
pourraient participer au processus de dénervation (Ilieva et al., 2009)
84
Introduction
IV. Dysfonctionnement du Réticulum Endoplasmique (RE)
dans la SLA :
Nous nous attacherons dans une première partie à décrire le fonctionnement physiologique du
réticulum endoplasmique, avant de décrire les défaillances qui surviennent dans le contexte de la
SLA.
A)
Fonction et organisation du RE
Le RE est défini comme un réseau continu de membranes qui forment des cavités aplaties
(appelées « citernes ») et des tubes membraneux (appelés « tubules »). Sa structure est très
plastique et peut être facilement remodelée selon les besoins de la cellule (Berridge, 2002). Cet
organite assure principalement deux types de fonctions : 1) le stockage du calcium intracellulaire 2)
la synthèse, le repliement, la maturation et la sécrétion des protéines vers l’AG.
On distingue trois parties du RE : la membrane nucléaire du RE qui est en continuité du noyau, le
RE rugueux et le RE lisse. Le RE rugueux est constitué de cavités aplaties empilées sur lesquelles
les ribosomes sont associés, ce qui donne l’aspect rugueux de la membrane en microscopie
électronique. Cette partie du RE est impliquée activement dans la synthèse protéique et la
maturation. Le RE lisse, quant à lui, est constitué principalement de tubules membranaires et assure
surtout la signalisation calcique dans les cellules neuronales et musculaires (Baumann and Walz,
2001),(Berridge, 2002).
Le RE a un rôle central dans la cellule, car outre son implication dans la maturation et sécrétion des
protéines, il présente des interfaces spécialisées avec les membranes d’autres organelles comme le
noyau, la mitochondrie, l’AG, les lysosomes et la membrane plasmique, ce qui lui permet d’intégrer
de nombreux signaux de stress (Saxena and Caroni, 2011).
85
Introduction
B)
RE
La synthèse protéique et le service « contrôle qualité » du
Le RE est spécialisé dans la synthèse d’un tiers des protéines totales de la cellule et plus
particulièrement dans celle des protéines sécrétées et membranaires. La genèse complète d’une
protéine nécessite une série de processus ordonnés : le transport du polypeptide dans le RE, son
repliement (Baumann and Walz, 2001). Les protéines nouvellement synthétisées subissent ensuite
un « contrôle qualité » pour vérifier leur bonne conformation avant leur export vers l’AG qui prend
en charge les étapes suivantes de la maturation protéique.
1.
L’entrée dans le RE
Le polypeptide naissant entre dans le RE grâce à une machinerie macromoléculaire appelée
translocon. Il est constitué principalement du complexe Sec61p dont les sous-unités forment un
canal permettant le passage du polypeptide (Gorlich et al., 1992).
2.
Le repliement et la maturation des polypeptides
Afin d’assurer leur fonction, les protéines doivent acquérir une bonne conformation par un
repliement adéquat. Le repliement des protéines inclut des modifications post-traductionnelles telles
que la glycosylation dans la partie N terminale ou la formation de ponts disulfures (Michalak et al.,
2009). Cette étape est assurée par un ensemble de protéines chaperonnes résidentes du RE.
On distingue trois familles de chaperonnes dans le RE: 1) les chaperonnes de la famille des « Heat
Shock Protein » (HSPs): BIP/GRP78 et GRP94/endoplasmine, 2) les chaperonnes de la famille des
lectines: Calréticuline (CRT) et Calnexine (CNX) et 3) les chaperonnes de la famille des thioloxydoréductases tels que PDI (« Protein Disulfide Isomérase ») et ERp57 (Ni and Lee, 2007) qui
utilisent l’environnement oxydant du RE pour créer des ponts disulfures. Toutes ces chaperonnes
possèdent une séquence tétrapeptidique de retenue dans le RE, appelée KDEL (Lys,Asp,Glu,Leuc)
Mon travail de thèse a consisté à étudier le rôle dans la SLA de l’une de ces chaperonnes du RE, la
calréticuline ; nous développerons donc plus en détails la structure et le rôle de cette chaperonne
dans le RE.
86
Introduction
Il y deux systèmes de chaperonnes associées qui permettent le repliement des protéines : celui
géré par l’association GRP78/GRP94 et celui de CRT/CNX.
•
Le système GRP78/GRP94 : ces chaperonnes se lient par des interactions hydrophobes aux
résidus non arrangés des polypeptides. Ces chaperonnes recrutent également d’autres chaperonnes
comme PDI. Ce complexe moléculaire permet en général d’établir l’assemblage ou l’oligomérisation
de protéines, notamment des protéines cargos.
•
Le système CRT/CNX: Ces chaperonnes s’occupent principalement du repliement des
protéines glycosylées (Figure 11)
CRT, qui es-tu ?
La CRT est une protéine de 46 kDa résidente du RE et qui assure à la fois des fonctions de
chaperonne et de tamponnage du calcium (voir partie IV.C). Elle comprend trois domaines : le
domaine N-terminal, le domaine central P et le domaine C-terminal. Les domaines N et P sont
essentiels pour la fonction chaperonne et créent une unité de repliement (Gelebart et al., 2005),
(Michalak et al., 2009). En effet, le domaine N présente une structure globulaire et possède des
résidus d’acides aminés qui contribuent à la liaison et la stabilité avec l’oligosaccharide. Le domaine
P forme une structure de bras flexible et assure à la fois la liaison aux oligosaccharides et le
recrutement d’autres chaperonnes notamment ERp57, une oxydoréductase responsable de la
constitution des ponts disulfures (Gelebart et al., 2005), (Michalak et al., 2009). Le domaine C de la
CRT assure principalement la fonction de liaison au calcium, que nous verrons plus loin.
La structure de CNX (90KDa) est quasiment identique à celle de CRT pour les domaines N et P. Par
contre, son domaine C-terminal code pour une fonction d’ancrage dans la membrane du RE.
La plupart des polypeptides nouvellement synthétisés entrant dans le RE sont glycosylés au niveau
de la partie N-terminale. Le cycle de repliement des chaperonnes CRT/CNX se déroule en plusieurs
étapes: (Rutkevich and Williams)
87
Introduction
1) Sous l’action de glucosidases, le polypeptide polyglycosylé devient monoglycosylé ce qui lui
permet d’être reconnu par les chaperonnes CRT et CNX
2) Le repliement du polypeptide est assuré par l’association de CRT/CNX avec ERp57 qui va
catalyser la formation de ponts disulfures nécessaires pour la maturation de la plupart des protéines
sécrétées et liées à la membrane.
3) Lorsque la protéine est correctement repliée, le sucre est enlevé de la protéine qui se détache
alors du complexe chaperonne.
4) La protéine repliée est transportée en dehors du RE (Gelebart et al., 2005) une fois l’étape du
« contrôle qualité » validée.
3.
Le service « contrôle-qualité » du RE
Ce système vérifie la conformation des protéines et effectue un choix parmi les suivants :
Valider la bonne conformation des protéines et permettre leur transport vers l’AG; ordonner le
retour des protéines mal repliées vers le cycle de repliement;ordonner la dégradation des protéines
mal repliées.
•
Le retour dans le cycle CRT/CNX :
Rôle de UGGT (« UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase »): L’ UGGT est une enzyme qui
détecte le niveau de repliement des protéines. Si la conformation optimale de la protéine n’est pas
atteinte, cette enzyme va ajouter un sucre sur la partie N terminale de la protéine, ce qui permettra
à la protéine de retourner dans le cycle CRT/CNX qui va tenter une nouvelle fois d’assurer le bon
repliement de la protéine.
•
Le système de dégradation des protéines mal-structurées du RE :
Rôle de l’ERAD (« ER-associated degradation ») : l’ERAD a pour but de favoriser l’élimination des
protéines mal repliées ou non-assemblées qui sont restées trop longtemps dans le cycle
chaperonne. Ces protéines sont alors reconnues par une protéine EDEM (« ER degradation
enhancing mannosidase like protein »), et retro-transloquées à travers un pore, du RE vers le
cytoplasme, afin d’être dégradées par le système ubiquitine-protéasome (Ni and Lee, 2007). Le
88
Introduction
pore de « rétrotranslocation » est composé du complexe sec61 (comme le canal d’entrée des
protéines), mais surtout des protéines Derline qui reconnaîtront les protéines à dégrader et qui
assisteront le processus de dégradation (Hebert et al., 2010). Une fois exportées hors du RE, elles
seront poly-ubiquitinylées et dégradées par la protéasome.
calcium
Protéine
monoglycosylée
EDEM
Translocon sec61
ribosome
calnexine
calréticuline
ERP57
Translocon
ERAD
Protéasome
AG
C
RE
1
2
P
P
N
N
2’
Glucosidase
-
Glucosidase
UGGT
+
3
C
4
-
5
ERAD
Figure 11 Contrôle-qualité des protéines du RE assuré par les chaperonnes Calréticuline et
Calnexine
Calréticuline joue un double rôle dans le RE car elle lie le calcium avec une grande affinité par son domaine C
et assure également une fonction chaperonne grâce à ses domaines N et P. (1) La protéine nouvellement
synthétisée entre dans le RE puis devient monoglycosylée. Elle est alors reconnue par la calréticuline (CRT)
et la calnexine (CNX) (2). Calréticuline va alors recruter la chaperonne ERp57 responsable de la formation
des ponts disulfure. (3) La protéine sera ensuite déglycosylée par une glucosidase. Si la protéine a atteint sa
bonne conformation, elle sera exportée vers l’appareil de Golgi afin de finir sa maturation et d’être sécrétée.
Dans le cas où elle n’est pas bien repliée, elle sera à nouveau glycosylée par une UGGT (UDP-glucose:
glycoprotein glucosyltransferase) (4) et sera à nouveau prise en charge par le cycle CRT/CNX. Si après
plusieurs cycles, la protéine n’est toujours pas bien repliée, elle sera transportée vers le système de
dégradation associé au RE, l’ERAD (5) (Gelebart et al., 2005).
89
Introduction
C)
Le RE: une réserve majeure de calcium pour la cellule
L’ion calcium est un second messager majeur dans la signalisation cellulaire, qui peut influencer de
nombreux processus. La concentration de ces ions doit être finement régulée afin de ne pas activer
des voies d’excitotoxicité. Pour le bon fonctionnement cellulaire, le calcium doit être disponible
rapidement et de manière transitoire, ce qui nécessite la possibilité d’être stocké.
Le RE constitue le site majeur de stockage de calcium; il permet de tamponner une concentration
de calcium d’environ 1mM, soit 10000 fois supérieur à celle qui est présente dans le cytoplasme. Il
conserve également une concentration élevée de calcium libre (200µM) afin de permettre une
libération rapide de ces ions hors du RE (Michalak et al., 2009),(Berridge, 2002). L’homéostasie
calcique dans cette organelle est maintenue par le biais de protéines de liaison au calcium, de
canaux et de pompes.
1.
Les protéines de liaison au calcium
Le tamponnage du calcium dans le RE est principalement pris en charge par des chaperonnes qui
assurent également le repliement des protéines. La moitié du calcium du RE est stocké grâce à
l’action de la CRT. En effet le domaine C-terminal de cette protéine permet de lier le calcium à
basse affinité et avec une forte capacité (Michalak et al., 2009).
D’ailleurs la modulation du niveau d’expression de la CRT seule permet de modifier significativement
la capacité de stockage du calcium : ainsi la surexpression de la CRT conduit à une augmentation
des niveaux intracellulaires de calcium (Bastianutto et al., 1995), (Arnaudeau et al., 2002), alors
que sa réduction entraîne une diminution des stocks de calcium (Mesaeli et al., 1999), (Nakamura
et al., 2001c).
Le tamponnage du calcium est également assuré par d’autres protéines chaperonnes de plus faible
capacité telles que GRP78, GRP94, CNX (Berridge, 2002). Il faut noter que la fonction de repliement
des protéines de ces chaperonnes est dépendante du calcium et donc qu’une diminution en calcium
peut les perturber et conduire au mauvais repliement de protéines.
90
Introduction
2.
L’entrée et la sortie de calcium
(Figure 12)
•
Les pompes SERCA (Sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase) gèrent les influx
de calcium vers le RE. Comme la concentration de calcium dans le RE est beaucoup plus importante
que celle du cytoplasme, cet influx à contre-courant de calcium dans le RE, nécessite de l’énergie
via l’hydrolyse de l’ATP (Schroder, 2008), (Vangheluwe et al., 2005). L’action de cette pompe est
finement régulée par les chaperonnes: lorsque les réserves en calcium du RE sont pleines, CRT,
CNX et Erp57 peuvent interagir avec SERCA afin de l’inhiber et de stopper l’entrée de calcium
supplémentaire (Li et al., 2004; Michalak et al., 1999).
•
La libération de calcium s’effectue par deux types de protéines du RE: le récepteur à la
ryanodine (RyR) et le récepteur à l’Inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R). La libération de calcium
dépendante des RyRs est induite par la liaison de calcium sur des sites du récepteur. Les IP3Rs sont
eux activés par l’Inositol 1,4,5-triphosphate qui est produit par activation de la phospholipase C
(Ruiz et al., 2009).
L’utilisation de drogues permet de stimuler et/ou de bloquer une libération du calcium du RE afin
d’en étudier les conséquences cellulaires. Par exemple, on peut induire la libération de calcium par
la caféine, qui stimule les récepteurs à la ryanodine (Langou et al., 2010) ou encore par la
thapsigargine qui inhibe la pompe SERCA et épuise alors le RE en calcium (Kanekura et al., 2006).
Pour au contraire bloquer la libération de calcium, on utilise le Dantrolène et la Xestopongine qui
inhibent la libération induite par les RyRs et IP3Rs respectivement (Langou et al., 2010).
Les fonctions de repliement des protéines et de la régulation du calcium nécessitent des contrôles
permanents car leur dysfonctionnement peut entraîner respectivement une accumulation de
protéines mal repliées et des entrées ou libérations de calcium abusives, ces deux phénomènes
pouvant amener à une situation de stress du réticulum endoplasmique (Schroder, 2008).
91
Introduction
BIP
CRT
calcium
IP3R
RyR
ATP
SERCA
IRE1
PERK
ATF6
Figure 12 Rôle physiologique du Réticulum Endoplasmique (RE)
En conditions physiologiques, le RE assure le bon repliement des protéines naissantes et le stockage du
calcium. L’entrée du calcium est gérée par la pompe SERCA (« Sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca2+
ATPase ») qui nécessite de l’ATP pour fonctionner; la sortie de calcium est assurée par deux canaux: les IP3R
(Inositol 1,4,5-triphosphate) et les RyRs (Ryanodine Receptor). Le RE possède des détecteurs au stress du
RE, IRE1α (« Inositol-Requiring Enzyme 1α »), PERK (« Protein Kinase-like ER kinase ») et ATF6 (« Activating
Transcription Factor 6 »), qui sont maintenus inactifs par la chaperonnes BIP en conditions non stressantes.
92
Introduction
D)
Le stress du Réticulum Endoplasmique : le yin et le yang
Le stress du RE est la conséquence de la perturbation des fonctions physiologiques du RE qui
aboutit à un choix entre une réponse pro-survie (la réponse UPR) et en cas d’échec de celle-ci, à un
choix pro-apoptotique.
1.
La réponse UPR (« Unfolded Protein Response »): le yin
(Figure 13)
Il s’agit d’un système conservé au cours de l’évolution qui a pour but de rétablir l’homéostasie et la
fonction normale du RE. Cela nécessite l’activation de programmes transcriptionnels induisant
l’expression de gènes capables de stimuler la capacité de repliement des protéines, et la
dégradation associée au RE des protéines mal formées (Kim et al., 2008).
La signalisation UPR est initiée par trois protéines transmembranaires, appelées « détecteurs de
stress » : IRE1α (« Inositol-Requiring Enzyme 1α »), PERK (« Protein Kinase-like ER kinase ») et
ATF6 (« Activating Transcription Factor 6 ») qui sont maintenus inactifs par leur interaction avec la
chaperonne BIP/GRP78 (Bertolotti et al., 2000) (Figure 12). Lors d’une accumulation de protéines
mal repliées, les chaperonnes se dissocient de ces détecteurs de stress pour tenter de replier
correctement ces protéines. On distingue trois voies d’activation de l’UPR:
•
IRE1α : cette protéine transmembranaire possède à la fois un domaine Sérine/Thréonine
kinase et un domaine d’endoribonucléase. Son activation nécessite sa dimérisation et sa
transphosphorylation. Son activité d’endoribonucléase permet d’effectuer l’épissage de l’ARNm de
XBP-1 (« X-box Binding Protein 1 ») et donc sa traduction en protéine. XBP-1 est un facteur de
transcription qui active la synthèse de gènes de chaperonnes et de facteurs de dégradation (Kim et
al., 2008).
•
PERK: cette protéine est une sérine/thréonine kinase qui s’active également par
oligomérisation et autophosphorylation. Elle inactive le facteur eIF2α (« Eukaryotic Initiation Factor
2 alpha ») en le phosphorylant ce qui freine la synthèse globale de protéines, mais favorise en
93
Introduction
revanche la transcription du gène ATF4 (« Activating Transcription Factor-4 »). L’arrêt de la
synthèse protéique permet de ne pas surcharger le RE et de mieux gérer l’accumulation des
protéines mal repliées. ATF4 est également un facteur de transcription qui comme XBP-1 promeut
la synthèse de chaperonnes, de protéines participant à la dégradation et de protéines à fonctions
anti-oxydantes(Nassif et al., 2010).
•
ATF6 : la libération d’ATF6 de GRP78/CRT, permet son transport vers l’AG où il est clivé par
des protéases, ce qui l’active comme facteur de transcription (Ye et al., 2000). ATF6 promeut alors
la transcription de XBP-1 et de la protéine EDEM.
Si les conditions physiologiques sont rétablies, la protéine GADD34, sous-unité de régulation de la
protéine phosphatase PP1, est synthétisée afin de limiter la réponse UPR. L’activation de PP1
permet de déphosphoryler le facteur eIF2α et d’arrêter l’inhibition de la traduction (Ma and
Hendershot, 2003)
Dans les conditions inverses, si ces réponses d’adaptation n’arrivent pas à rétablir l’homéostasie
cellulaire, le RE engage des voies apoptotiques.
94
Introduction
ROS
Calcium
Protéines mal-repliées/ mutantes
BIP
CRT
ERAD
Stress du RE : réponse UPR
2
AG
1
3
RE
4
5
P
P
Épissage de
XBP-1
IRE1
Clivage
d’ATF6
PERK
eIF2α
ATF6
P-eIF2α
XBP-1 épissé
Diminution de la
traduction
ATF4
Noyau
Activation de la
synthèse de
gènes
Chaperonnes BIP, PDI
Composants de la
dégradation EDEM,
protéines anti-oxidantes
ERSE
Figure 13 La réponse d’adaptation au stress du RE, la réponse UPR (« Unfolded Protein Response »)
Le stress du RE est activé suite à la perturbation des fonctions physiologiques du RE : ici, l’exemple de la
SOD1 mutée, mal repliée, qui s’accumule dans le RE (1) et qui bloque la machinerie ERAD en intéragissant
avec la Derline (2). Les détecteurs de stress du RE (voir figure 12) sont libérés des chaperonnes auxquelles ils
sont fixés et s’activent. (3) IRE1α se dimérise et s’autophosphoryle ce qui active son domaine
d’endoribonucléase et permet l’épissage de l’ARN messager de XBP-1. Ce dernier est un facteur de
transcription qui va réguler à la hausse des gènes UPR codant pour des chaperonnes ou pour la machinerie
de dégradation ERAD. (4) L’activation de PERK a pour but de diminuer la synthèse générale de protéines,
grâce à la phosphorylation du facteur d’initiation eIF2α. Ce facteur promeut en parallèle la traduction de l’ARN
messager ATF4, qui est un facteur de transcription qui va induire, comme XBP-1, des gènes UPR, mais aussi
des gènes impliqués dans des réponses antioxidantes. (5) Enfin, une troisième voie UPR est liée à l’activation
d’ATF6. Dans des conditions de stress, il est exporté vers l’appareil de Golgi où il est clivé, ce qui libère son
domaine cytosolique codant pour un facteur de transcription. Lorsqu’il est transloqué dans le noyau, il
augmente l’expression de gènes codant pour des chaperonnes et pour la machinerie ERAD (Nassif et al.,
2010) (Nishitoh et al., 2008).
95
Introduction
2.
La réponse apoptotique liée au RE : le yang
(Figure 14)
Lorsque l’engagement des voies PERK, IRE1α et ATF6 est maintenu de façon soutenue et à long
terme, un certain nombre de voies et d’effecteurs de mort sont activés :
•
Le facteur de transcription CHOP (« CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) Homologous
Protein ») : sa synthèse est activée par les protéines ATF4 et XBP1 (Kim et al., 2008),(Tabas and
Ron, 2011). Or pour être actif, CHOP doit être phosphorylé. L’activation soutenue d’IRE1α entraîne
sa liaison à une protéine adaptatrice TRAF2 (« TNF Receptor Associated Factor 2 ») qui recrute
alors la protéine ASK-1 (« Apoptosis Signal Regulating Kinase 1 »). Celle-ci va activer une série de
protéines kinases dont p38K et JunK (« c-JUN-N terminal Kinase »), p38K étant responsable de la
phosphorylation de CHOP (Wang et al., 1996). P-CHOP va alors inhiber la production de gènes prosurvie (bcl2) et promouvoir la synthèse de gènes pro-apoptotiques (BIM, Bak et Bax, partie V.B), et
ERO1α (« ER oxidoreductin 1 »). Cette dernière protéine est une oxydase qui provoque des
dommages oxydatifs (Marciniak et al., 2004) et qui stimule également les récepteurs IP3Rs,
favorisant des sorties de calcium vers le cytoplasme. A noter que la production de facteurs oxydants
et la libération de calcium peut entraîner des dommages à la mitochondrie et favoriser le
déclenchement de l’apoptose impliquant cette organelle (partie V). De plus les protéines proapoptotiques de type Bim, Bak et Bax ont un rôle majeur dans l’apoptose dépendante de la
mitochondrie.
•
La caspase 12: cette caspase est spécifiquement recrutée et activée lors d’un stress du RE
prolongé. Elle semble être activée de deux manières différentes : 1) l’élévation de calcium
cytoplasmique pourrait activer une protéase, la calpaïne, qui à son tour pourrait cliver la
procaspase12 et la rendre opérationnelle (Nakagawa et al., 2000) 2) IRE1α en conditions de stress
prolongées, interagirait avec une protéine adaptatrice TRAF2 qui recruterait la caspase 12 et
permettrait son activation (Yoneda et al., 2001).
96
Introduction
ERAD
bloqué
AG
RyR
IRE1
IP3R
PERK
P
calpaine
7
6
Caspase 12/4
JNK
ATF6
P
TRAF2
1
ASK-1
P38
3
ATF4
2
P CHOP
MORT
4
Clivage
d’ATF6
5
p53
p53
P CHOP
Noyau
CHOP, BIM;
PUMA; ERO1α
P
ERSE
XBP-1
ATF-4
Activation de la
synthèse de gènes
pro-apoptotiques
ATF-6
Figure 14 La réponse apoptotique liée au stress du RE
Lorsque le stress du RE devient chronique, c’est-à-dire que la réponse UPR n’est pas suffisante pour rétablir
l’homéostasie de la cellule, le RE peut engager des voies de mort. (1) IRE1α, activée de façon soutenue, va
interagir avec la protéine adaptatrice TRAF2 (« TNF Receptor Associated Factor 2 ») qui recrute la kinase
ASK-1 (« Apoptosis Signal Regulating Kinase 1 ») qui pourra alors recruter les kinases JNK (« c-JUN-N
terminal Kinase ») et p38, qui pourront induire l’apoptose. La p38 peut phosphoryler le facteur de
transcription CHOP (« CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) Homologous Protein »). (2) Ce dernier activé
promeut la synthèse de gènes pro-apoptotiques tels que les protéines BIM, Puma ou ERO1α. (3) La voie
PERK, en recrutant ATF4 et (4) ATF6 clivé, peuvent également activer la synthèse de CHOP. (5) La voie PERK
en recrutant le facteur p53 peut aussi favoriser la synthèse de protéines pro-apoptotiques telles que Puma.
(6) Enfin, la caspase 12 spécifique du RE peut être clivée suite à son activation par la protéine TRAF2 ou suite
à la calpaïne (7), cette dernière étant activée par une libération accrue de calcium D’après une adaptation de
la revue (Nassif et al., 2010)
97
Introduction
E)
Le stress du RE dans la SLA: une signature pathologique
précoce
1.
Induction du stress du RE par la SOD1 mutée
a)
Agrégation de la SOD1 mutée dans le RE:
Plusieurs études ont montré que la SOD1 mutée s’agrégeait dans le RE des cellules de la moelle
épinière de souris surexprimant différentes formes mutées de la SOD1 (G93A, G85R,G37R,G127X),
sous la forme de complexes moléculaires de grands poids moléculaires, et ceci de manière
dépendante de l’âge (Kikuchi et al., 2006), (Urushitani et al., 2008), (Bergemalm et al., 2010). Cette
accumulation massive de la SOD1 dans le RE a amené à étudier l’implication potentielle d’un stress
du RE dans la maladie. Des études in vitro ont pu corréler la présence de la SOD1 mutée à la
formation d’agrégats, à l’activation du stress du RE, et à la mort des cellules (Oh et al., 2008) (Atkin
et al., 2006).
b) Inhibition du processus de dégradation liée au RE : l’ERAD
L’accumulation excessive de la SOD1 mutée dans le RE peut impliquer un défaut du système
d’ERAD. Nishito et coll. (Nishitoh et al., 2008) ont en effet montré que la SOD1 mutée interagit avec
Derline 1, un composant du translocon qui permet la sortie des protéines qui vont être dégradées.
Cette interaction empêche une dégradation correcte des protéines, d’où leur accumulation à
l’intérieur du RE et l’activation du stress du RE. Dans ce sens, la surexpression in vitro de Derline
diminue la proportion des agrégats SOD1 mutée et du coup le stress du RE (Mori et al., 2011).
98
Introduction
2.
Mise en évidence de la présence de marqueurs du stress du RE
Les chaperonnes BIP, CRT, PDI et GRP94 ont été détectées dans les agrégats contenant la SOD1
mutée (Bergemalm et al., 2010), libérant ainsi les détecteurs de stress du RE (Bertolotti et al.,
2000).
Une augmentation de PERK, d’IRE1α et d’ATF6 clivé et de leur cibles p-eIF2α, ATF4, XBP1 épissé et
des chaperonnes PDI et ERp57, a été observée dans la moelle épinière des souris SOD1G93A aux
stades présymptomatiques ou symptomatiques de la maladie (Kikuchi et al., 2006), (Atkin et al.,
2006; Nagata et al., 2007).
Des marqueurs de stress du RE liés à l’apoptose tels que ASK-1, CHOP, ERO1α et la caspase 12
augmentent chez les souris SOD1G93A (Nishitoh et al., 2008), (Kikuchi et al., 2006),(Saxena et al.,
2009) (Wootz et al., 2004). De manière intéressante, le croisement de souris SOD1G93A avec des
souris déficientes pour ASK-1 prolonge leur survie de plus de quatre semaines, confirmant
l’implication du stress du RE dans la maladie (Nishitoh et al., 2008).
3. Le stress du RE : une signature précoce de dégénérescence du
motoneurone
Une étude élégante a montré que le stress du RE était une composante dans la dégénérescence
précoce d’une sous-population de motoneurones, appelés motoneurones « vulnérables ». Les
axones de ces motoneurones se détachent très tôt de leur muscle cible (autour de 45 jours
postnataux) puis les cellules dégénèrent (partie V .A)(Pun et al., 2006). Afin d’identifier les facteurs
participant à leur vulnérabilité, les auteurs ont injecté les muscles cibles de ces motoneurones avec
un marqueur rétrograde, puis ont analysé les changements de certains ARN messagers dans ces
motoneurones. Ils ont observé une forte augmentation des facteurs de stress tels que P-eIF2α,
ATF4 et BIP entre 30 et 40 jours postnataux, précédant de plusieurs jours la dénervation de ces
motoneurones (Saxena et al., 2009).
99
Introduction
Afin de prouver l’implication du stress du RE dans cette maladie et de mettre en évidence un
potentiel effet thérapeutique, des inhibiteurs du stress du RE ont été testés chez les sourisG93A.
Saxena et coll. ont traité des souris SOD1G93A avec du salubrinal (Boyce et al., 2005) qui inhibe la
déphosphorylation d’eIF2α et qui empêche la propagation du stress du RE, et ils ont observé une
augmentation de leur force musculaire et une prolongation de leur survie d’un mois.
Un autre groupe a identifié un nouveau composé, SUN N8075 qui a un rôle protecteur contre la
mort induite par le stress du RE. Son effet protecteur passe par l’induction du facteur de croissance
VGF (inducible nerve growth factor). Le traitement des souris SOD1G93A par le SUN N8075 retarde le
déclenchement de la maladie et prolonge la survie des SOD1G93A (Shimazawa et al., 2010). Ces
travaux mettent en lumière l’importance du rôle du stress du RE dans la progression de la maladie.
Chez l’humain, le stress du RE a pu réellement être démontré comme un processus pathologique de
la maladie lorsqu’il a été prouvé que des marqueurs du stress du RE favorisant les réponses prosurvie et pro-apoptotiques étaient activés chez les patients SLA (Atkin et al., 2008), (Ito et al.,
2009), (Hetz et al., 2009; Ilieva et al., 2007).Ces travaux ont notamment montré, par Western blots
effectués sur des extraits de moelle épinière, une augmentation de PERK, d’IRE1α, d’ATF6, de PDI
et ERp57, de p38K, de JunK, de CHOP et de la caspase 4, (équivalent humain de la caspase 12
souris). La chaperonne PDI a été retrouvée dans le liquide céphalo-rachidien de patients SLA, ce qui
suggère que les composants de la voie UPR pourraient servir de marqueurs biologiques de cette
maladie (Atkin et al., 2008). Il est très intéressant de noter que ces études ont été réalisées sur des
tissus de patients atteints de SLA sporadique, ce qui démontre que la réponse au stress du RE est
un mécanisme de toxicité communs entre les SLAF et les SLAS.
100
Introduction
4.
Le stress du RE dans d’autres modèles de SLA
a)
La protéine VAPB
VAPB est une protéine d’ancrage à la membrane localisée principalement dans le RE et dans les
vésicules RE-Golgi (Soussan et al., 1999), (Lev et al., 2008).
Une caractéristique marquante de la forme mutée de VAPB
P56S
est sa capacité à s’agréger
lorsqu’elle est surexprimée (Kanekura et al., 2006),(Langou et al., 2010). Des travaux ont cherché à
déterminer si ces agrégats pouvaient conduire à une activation du stress du RE. A ce jour, les
données restent contradictoires: la surexpression de VAPBWT dans des lignées est capable d’activer
la réponse UPR dépendante de IRE1α et XBP1, alors que la surexpression de la forme mutée P56S
exercerait un effet dominant négatif sur la forme sauvage en la piégeant dans les agrégats et
annulerait la capacité de VAPB à stimuler la réponse UPR (Kanekura et al., 2006), (Gkogkas et al.,
2008), (Suzuki et al., 2009).
Des travaux de notre laboratoire ont étudié les conséquences de la surexpression de VAPBWT et
VAPBP56S non dans des lignées, mais dans des motoneurones en culture, en infectant les
motoneurones avec des AAV6 (« Adeno-associated virus 6 »). L’infection par l’AAV6 a permis de
transduire 90% des motoneurones et de produire un niveau modéré d’expression des protéines
VAPB proche des niveaux d’expression plus physiologiques, par rapport à ceux obtenus par
transfection de lignées cellulaires. Ils ont montré que VAPB sauvage et mutant conduisaient tous les
deux à une mort motoneuronale mais de cinétique différente. En outre, tous les deux activaient les
voies de stress du RE via IRE1α et la caspase12. De plus, l’inhibition du stress du RE par le
salubrinal prévient la mort des motoneurones induite par VAPB (Langou et al., 2010).
Ceci est en accord avec d’autres travaux qui ont montré que la surexpression de VAPB mutée chez
la drosophile induisait une augmentation de la chaperonne BIP/GRP78 dans le cerveau de ces
animaux, et donc une activation de la voie UPR (Tsuda et al., 2008).
101
Introduction
b)
La protéine TDP-43
Des données préliminaires semblent en faveur d’un rôle potentiel du stress du RE dans la toxicité
associée à TDP-43. La protéine TDP-43, normalement nucléaire, est retrouvée agrégée dans le
cytoplasme et dans le RE des motoneurones des patients SLA (Sasaki et al., 2010). Il semblerait
que ce soit la mauvaise localisation de la protéine (causée par la mutation ou un stress cellulaire) et
son clivage qui participent à la toxicité sur le motoneurone.
De manière intéressante, la surexpression de TDP-43 dans des lignées motoneuronales active des
composants du stress du RE tels qu’ATF4, CHOP et XBP-1. De plus l’induction du stress du RE
participe au clivage de TDP-43 par la caspase-12, aboutissant à une forme toxique de TDP-43
(Suzuki et al., 2011). Des données supplémentaires sont nécessaires afin de démontrer un lien de
causalité du stress du RE dans la mort des motoneurones liée à TDP-43.
L’ensemble de ces données montre que le stress du RE est un mécanisme physiopathologique
commun à plusieurs gènes liés à des SLAF, mais aussi dans les SLAS. On peut donc espérer que des
thérapies visant à cibler le stress du RE identifiées dans les SLAF puissent également être
bénéfiques pour l’ensemble des SLA.
Dans les deux chapitres précédents, nous avons débattu des mécanismes par l’intermédiaire
desquels la SOD1 mutée pouvait perturber les fonctions cellulaires des motoneurones. Une des
principales caractéristiques de la SOD1 mutée est sa capacité à s’agréger. Cette accumulation de la
SOD1 mutée va alors troubler un ensemble de fonctions vitales pour le motoneurone tel que les
systèmes de synthèse et de sécrétion de protéines, de tamponnage du calcium, ceux fournissant de
l’énergie et le transport axonal. Ces dysfonctionnements vont sensibiliser les motoneurones et être
la cause de la mise en place de processus de dégénérescence. Dans la partie suivante, nous allons
donc décrire le processus de dégénérescence proprement dit du motoneurone, qui comprend deux
phases distinctes: la dénervation, au niveau des muscles, suivie de l’induction de la mort cellulaire,
au niveau du soma.
102
Introduction
V. Le motoneurone SOD1 mutant dans l’arène : le rituel de la
mise à mort
Afin de comprendre le processus même de la mort du motoneurone SOD1 mutant, il est nécessaire
de déterminer l’orchestration des intervenants dans la mort des motoneurones. Par exemple, la
dégénérescence commence-t-elle d’abord au niveau du corps cellulaire ce qui conduit à une
dégénérescence axonale et à une dénervation, ou bien au contraire le processus débute-t-il par un
démantèlement des jonctions neuro-musculaires qui provoque une dégénérescence axonale et une
mort du corps cellulaire?
Des études menées par Fischer et coll. (Fischer et al., 2004), dans lesquelles ils ont quantifié à
différents âges le nombre de motoneurones, d’axones dans les racines ventrales et le degré de
dénervation, ont permis d’établir que le processus de dégénérescence commençait par la
dénervation des muscles suivie par la perte d’axones moteurs puis de motoneurones.
A)
Les premières banderilles: une dénervation séquentielle
des muscles dans la SLA
Le corps humain possède plus de 300 paires de muscles bilatéraux qui contiennent plus de 100
millions de fibres musculaires, ces dernières étant innervées par plus de 120 000 motoneurones
dans la moelle épinière. Un motoneurone doit donc innerver au moyen de jonctions
neuromusculaires plusieurs fibres musculaires. L’ensemble formé par le motoneurone et les fibres
qu’ils innervent est appelé unité motrice. La jonction neuromusculaire comprend trois protagonistes
qui contribuent à son maintien : le motoneurone, la cellule musculaire et la cellule de Schwann.
Cependant, les motoneurones ne sont pas tous égaux et peuvent différer au niveau des
caractéristiques suivantes : le diamètre somatique, le calibre axonal, la capacité de décharge et les
muscles qu’ils innervent. Ces différences permettent de les classer en différentes catégories. Or des
études ont montré que les différentes classes de motoneurones ne présentent pas la même
sensibilité au processus de dénervation au cours de la SLA.
103
Introduction
1.
Diversité des motoneurones
On distingue deux classes principales de motoneurones:
1) les motoneurones alpha, les plus abondants et les plus gros en taille, qui innervent les muscles
squelettiques et sont donc responsables de la contraction musculaire ;
2) les motoneurones gamma, de petite taille et innervant le faisceau neuromusculaire (ou fibres
intrafusales) qui jouent un rôle important dans la proprioception statique (Kanning et al., 2010).
Seuls les neurones de type alpha semblent être impliqués dans la SLA.
Les unités motrices alpha sont sous-divisées en trois types fonctionnels (Figure 15): les unités
motrices lentes (« slow », S), les unités motrices rapides résistantes à un effort soutenu (« Fast
fatigue-resistant »,FR), et les unités motrices rapides et fatigables, c’est-à-dire peu résistantes à un
effort soutenu (« Fast Fatigable », FF).
Les motoneurones S possèdent un plus petit corps cellulaire et un axone de plus petit diamètre.
D’un point de vue fonctionnel, ils contribuent peu à la force musculaire lorsqu’ils sont activés mais
sont très résistants à la fatigue.
Les motoneurones FF, au contraire, sont des cellules de grande taille, dont les neurites sont très
branchés et qui permettent des conductions rapides. Lorsqu’ils sont stimulés, ils permettent de
mobiliser une force musculaire puissante mais s’épuisent rapidement.
Les motoneurones FR possèdent des propriétés intermédiaires (Frey et al., 2000).
Par leur petite taille, les motoneurones S, à l’inverse des motoneurones FF, ont besoin de moins
d’activation synaptique pour déclencher des potentiels d’action. Ils seront donc activés en premier
lors d’une contraction et les motoneurones FF en dernier. Concrètement les motoneurones FF
seront recrutés pour des tâches intenses de courte durée qui nécessitent une forte contraction
(courir ou sauter), alors que les motoneurones S seront recrutés pour des tâches posturales
(maintenir la station debout) (Kanning et al., 2010) qui nécessitent une faible activité musculaire.
104
Introduction
Les motoneurones alpha
α FF
α FR
IIb
IIa
Unités motrice à
contraction rapide et
peu résistante à
l’effort
Unités motrice à contraction
rapide et résistante à l’effort
αS
I
Unités motrice à
contraction lente et
résistante à l’effort
Figure 15 Caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des motoneurones alpha
Les motoneurones alpha se distinguent en sous-types selon la taille de leur soma, le diamètre de leur axone
et leur nombre de branchements. On distingue trois sous-types de montoneurones alpha selon le type
d’unités motrices, c'est-à-dire l’ensemble composé du motoneurone et de la fibre musculaire innervée. On
distingue alors les unités motrices FF (« Fast-twitch Fatiguable ») à fibres de type IIb ; les unités motrices FR
(« Fast-twitch Resistant ») à fibres de type IIa et les unités motrices S (« Slow-twitch ») à fibres de type I.
L’ordre, d’un point de vue taille et complexité morphologique, est FF > FR > S (Kanning et al., 2010)
105
Introduction
2. Une dénervation sélective selon le sous-type de motoneurones
dans la SLA
(Figure 16)
La dénervation correspond à la destruction de la jonction neuromusculaire, et est suivie par une
dégénérescence axonale. Dans la SLA, la dénervation est un événement précoce qui apparaît bien
avant la mort des motoneurones (Fischer et al., 2004).
Des données morphologiques, immunohistochimiques et électrophysiologiques ont montré une
perte sélective et synchrone des unités motrices FF du muscle gastrocnemius des pattes arrière
chez les souris SOD1G93A entre 42 et 50 jours postnataux (Frey et al., 2000; Pun et al., 2006).
Premiers à être touchés, ces motoneurones sont donc appelés « vulnérables ».
La dénervation des unités motrices FR a été observée plus tardivement, autour de 80 jours, et enfin
celle des unités motrices S n’apparait qu’aux stades finaux de la maladie, leurs motoneurones sont
donc appelés « résistants » (Fischer et al., 2004),(Pun et al., 2006). Cette sensibilité des
motoneurones FF à la dénervation est encore mal comprise, mais certaines hypothèses ont été
proposées et des données apportées: 1) les motoneurones FF sont les plus gros tant au niveau du
diamètre de leur corps cellulaire qu’au niveau du calibre de leur axone et assurent des fonctions
coûteuses en énergie. Or, comme cela a été décrit précédemment, la SOD1 mutée perturbe à la fois
le fonctionnement de la mitochondrie qui est une source d’énergie en ATP importante, et le
fonctionnement du transport axonal qui permet d’apporter des nutriments aux axones. Les
neurones pourraient alors se retrouver en dénutrition, et les motoneurones FF étant les plus
demandeurs en énergie, ils pourraient dégénérer en premier; 2) contrairement aux motoneurones
de type FR et S, les motoneurones FF possèdent peu de capacité de bourgeonnement après un
écrasement ou une section de l’axone, ce qui les rendrait plus vulnérables par un manque
d’adaptation à ce type de stress. A l’inverse, les motoneurones FR et S, présentant cette faculté de
bourgeonnement, seront capables de réinnerver les plaques motrices laissées vacantes par les
motoneurones de type FF (Duchen, 1973), (Frey et al., 2000),(Schaefer et al., 2005). Cette faculté
106
Introduction
permet de compenser fonctionnellement la perte des MNs FF et cela expliquerait pourquoi la
faiblesse musculaire n’est détectée que si tardivement (80 jours) par rapport à la perte des
motoneurones FF qui a lieu à 45 jours. La dénervation des motoneurones de type FR correspond à
l’âge de déclenchement de la maladie chez les souris SOD1G93A. Ces données ont d’ailleurs pu être
confirmées chez les patients SLA (Fischer et al., 2004).
Progression de la maladie
45 jours
α FF
α FR
IIb
IIa
αS
I
α FR
IIb
IIa
αS
I
Déclenchement de
la faiblesse
musculaire
80 jours
α FR
IIb
αS
IIa
I
IIb
IIa
αS
I
Déclenchement de
la paralysie
IIb
IIa
120 jours α S
I
Figure 16 Séquence de dénervation des jonctions neuromusculaires des souris SOD1G93A
Au stade asymptomatique (entre 40-50 jours), une dénervation massive affecte les fibres IIb, cibles des
motoneurones FF alors que les fibres de type IIa et I restent innervées par les motoneurones FR et S
respectivement. Les synapses vacantes sur les fibres IIb sont alors remplacées par les axones des
motoneurones FR ou S qui possèdent une capacité de re-croissance et de bourgeonnement. De manière
successive, on observera le démantèlement des jonctions neuromusculaires innervées par les motoneurones
FR aux stades pré-symptomatiques (80 jours), puis celles innervées par les motoneurones S à des stades
tardifs de la maladie (120 jours). D’après la revue (Kanning et al., 2010).
107
Introduction
3. Des candidats locaux pouvant participer à la dénervation des
muscles dans la SLA
La mort du motoneurone SOD1 mutant est dépendante de processus cellulaire-autonome et nonautonome. On peut donc supposer que le processus de dénervation lui-même pourrait être induit
par différents facteurs produits par des cellules environnantes comme le muscle ou la cellule de
Schwann.
a)
L’hypermétabolisme du muscle squelettique
Des travaux du groupe de Dupuis et Loeffler (Dupuis and Loeffler, 2008) ont suggéré que des
anomalies dans le métabolisme énergétique du muscle pouvaient être une cause directe de la
dénervation. Les souris SOD1 mutée présentent des déficits de poids par rapport aux souris
sauvages, avant le déclenchement de la maladie. Cet effet serait dû à une augmentation du taux de
métabolisme
basal,
ce
qu’on
appelle
un
hypermétabolisme.
Leur
hypothèse
est
que
l’hypermétabolisme des muscles chez ces souris entraînerait un déficit chronique en énergie qui
précèderait l’amyotrophie et la dénervation. Lorsque les souris SOD1 mutantes sont contraintes à
un régime alimentaire riche en acides gras insaturés, elles vivent plus longtemps et présentent une
réduction de la dénervation musculaire et de la perte motoneuronale (Dupuis et al., 2004), (Mattson
et al., 2007). Cependant, bien que ces résultats prouvent un lien entre un déficit énergétique et la
dénervation, ils ne montrent pas si la source du déficit énergétique provient des muscles.
b)
Candidats moléculaires pouvant participer à la dénervation des muscles
Les protéines du guidage axonal : au cours du développement, les protéines de guidage axonal
assurent le contrôle de l’extension d’un axone vers ses cibles. Pour cela, elles fonctionnent comme
des agents répulsifs ou attractifs, et peuvent être soit sécrétées, soit associées aux membranes.
Une fonction ou une expression aberrante de ces molécules pourrait contribuer à des changements
pathologiques précoces dans la connectivité des motoneurones des souris mSOD1 (Pasterkamp and
108
Introduction
Giger, 2009). Plus précisément, deux molécules ont suscité un intérêt grandissant dans cette
pathologie :
•
Nogo-A (réticulon-4A,
« Neurite outgrowth inhibitor ») (Figure10) : cette protéine se
définissant comme un inhibiteur de la croissance axonale, est exprimée de manière prédominante
dans les muscles squelettiques chez l’embryon et décroît chez l’adulte. De manière intéressante,
Nogo-A est surexprimé dans les muscles squelettiques des patients SLA et chez les souris
transgéniques SOD1G93A avant les symptômes de la maladie (Dupuis et al., 2002). Son
augmentation s’intensifie avec la sévérité de la maladie et elle est plus prononcée dans les fibres S
(Jokic et al., 2005). Une étude a montré que la surexpression de Nogo-A dans le muscle soleus
(innervé principalement par des motoneurones S) réduisait la taille des jonctions neuromusculaires
et causait une rétractation des terminaisons motrices (Jokic et al., 2006). Le croisement des souris
SOD1G86R avec des souris déficientes en Nogo-A augmente la survie de ces souris d’environ 20 jours
et diminue la dénervation musculaire (Jokic et al., 2006) alors qu’une étude récente a montré des
résultats inverses (Yang et al., 2009). Bien que nécessitant donc une confirmation, la majorité des
études jusqu’à présent vont dans le sens d’un rôle pro-dénervation de Nogo-A.
•
Sémaphorine 3A (Sema3a) (Figure 10): Sema3A est une glycoprotéine sécrétée qui joue un
rôle de facteur de répulsion chez les neurones. Cette protéine peut être exprimée et sécrétée par
les cellules de Schwann au niveau des jonctions neuromusculaires (De Winter et al., 2006). Des
travaux ont montré que l’expression de la Sema3A dans les cellules de Schwann augmentait chez
les souris SOD1G93A à des stades asymptomatiques (entre 5 et 8 semaines postnatales). Plus
intéressant encore, cette augmentation est restreinte aux sous-populations des jonctions
musculaires innervées par les motoneurones FF, et son augmentation est concomitante à la
dénervation de ces motoneurones (De Winter et al., 2006). La Sema3A pourrait alors agir
directement
sur
les
terminaisons
nerveuses
et
induire
leur
rétraction
des
jonctions
neuromusculaires. De plus, la présence de la Sema3A pourrait empêcher la faculté de
bourgeonnement de ces axones FF, ce qui participerait à leur dégénérescence (Kanning et al.,
2010).
109
Introduction
Dans ce contexte, une autre protéine impliquée dans le contrôle du guidage axonal nous a semblé
intéressante à étudier: la protéine CRMP4 (voir introduction des résultats)
•
Les
molécules
CRMPs (« Collapsin
Response
Mediator
Protein ») :
ce
sont
des
phosphoprotéines cytosoliques qui ont été caractérisées comme composants de la voie de
transduction du signal Sema3A (Charrier et al., 2003). Cinq CRMPs ont été identifiées, et
réguleraient la croissance axonale soit positivement soit négativement selon le type de CRMP. Ces
protéines sont surtout exprimées dans le système nerveux au cours du développement chez
l’embryon et dans la première semaine de vie dans le système nerveux, leur expression étant
inhibée chez l’adulte. Or, de manière intéressante, les protéines CRMPs peuvent être réexprimées
ou activées dans les maladies neurodégénératives telles que l’encéphalopathie spongiforme bovine
(Auvergnon et al., 2009) et la maladie d’Alzheimer (Yoshida et al., 1998). Un des projets auxquels
j’ai participé au cours de ma thèse consistait en l’étude de l’expression et du rôle de CRMP4 dans la
dénervation et la mort des motoneurones (voir la partie résultats).
B) L’estocade ou le coup d’épée mortel : la mort cellulaire par
apoptose
Il existe plusieurs mécanismes de mort cellulaire:
•
La nécrose, qui est un processus de mort cellulaire accidentelle et qui consiste
schématiquement en un gonflement des organelles, une rupture de la membrane et au
déversement de son contenu (Kim et al., 2006);
•
l’autophagie, qui est un processus d’autodigestion partielle du contenu d’une cellule par
fusion avec le lysosome, ce qui peut amener à la mort de la cellule (Kim et al., 2006);
•
l’apoptose, qui est un processus de mort cellulaire programmée, déclenché à la suite de
l’activation d’un signal et mettant en place une séquence d’événements génétiquement définis.
Parmi ces trois types de morts cellulaires, il semble à ce jour que ce soit l’apoptose qui joue un rôle
primordial dans le processus de mort des motoneurones. C’est donc ce type de mort cellulaire que
nous allons décrire, d’abord d’une manière générale, puis dans le contexte de la SLA.
110
Introduction
1.
Généralités sur l’apoptose
L’apoptose, appelée également mort cellulaire programmée ou suicide cellulaire, est un programme
d’autodestruction déclenché suite à l’activation d’un signal. Elle met en place une séquence
d’événements génétiquement définis. D’un point de vue cellulaire, elle se manifeste par un
rétrécissement cellulaire et nucléaire, une compaction et marginalisation de la chromatine nucléaire
et, plus tardivement dans le processus, une circonvolution de la surface membranaire. L’apoptose
n’induit pas de réponse inflammatoire (Hotchkiss et al., 2009).
On peut distinguer trois catégories principales de voies apoptotiques : la voie dépendante d’un
récepteur, la voie dépendante de la mitochondrie et la voie dépendante du réticulum
endoplasmique. Ces trois voies font intervenir à la fois des effecteurs communs aux trois voies et
des effecteurs spécifiques. Dans tous les cas, l’aboutissement sera l’activation de caspases. Les
caspases sont des cystéines protéases qui se divisent en caspases initiatrices et effectrices. Elles ne
sont activées elles-mêmes qu’après clivage et vont donc s’activer en chaîne pour former une
cascade de mort. Les caspases 2, 8, 9,10 composent le groupe des caspases initiatrices et les
caspases 3,6 et 7 sont des caspases effectrices. Les substrats des caspases incluent des protéines
du cytosquelette, des protéines structurales du noyau, et des enzymes.
A noter que certaines caspases sont quant à elles impliquées dans des processus d’inflammation,
comme les caspases 1, 4, 5, 11, 12, et 14 (Guegan and Przedborski, 2003).
a)
La voie extrinsèque de mort: les récepteurs de mort
(Figures 17 et 18)
•
Présentation des récepteurs de mort et de leur ligand
Les récepteurs de mort appartiennent à la superfamille des récepteurs TNFR (« Tumor Necrosis
Factor Receptor »). Ce sont des protéines transmembranaires de type I qui possèdent une partie Cterminale intracellulaire, une région transmembranaire et un domaine de liaison N terminal
extracellulaire. On trouve au niveau de leur domaine extracellulaire des domaines riches en cysteine
(« Cysteine Rich Domain »,CRD), dont le nombre (de 1 à 6) déterminera leur affinité pour un ligand
111
Introduction
donné. Les récepteurs de mort se distinguent des autres récepteurs par la présence d’une séquence
cytoplasmique appelée domaine de mort (« Death Domain », DD) et qui est essentielle pour
l’induction de l’apoptose.
Les récepteurs de mort sont activés par leurs ligands, des cytokines appartenant à la famille des
protéines TNF. Ce sont en majorité des protéines transmembranaires de type II qui possèdent un
domaine N terminal intracellulaire, une région transmembranaire et une partie C-terminale
extracellulaire (Guicciardi and Gores, 2009) (Ashkenazi, 2002).
•
L’apoptose liée aux récepteurs de mort :
L’initiation du signal de transduction nécessite l’oligomérisation du récepteur et la juxtaposition des
domaines intracellulaires. On pensait initialement que c’était la liaison du ligand sous forme
trimérique qui conduisait à la trimérisation du récepteur. Cependant, on a montré l’existence
d’oligomères de récepteurs préassemblés à la surface cellulaire par leurs domaines CRD. La liaison
du ligand entraînerait un changement de conformation du récepteur préassemblé, conduisant au
recrutement de différentes protéines adaptatrices qui interagissent avec les domaines de mort des
récepteurs. Plusieurs protéines adaptatrices ont été identifiées, les plus communes étant FADD
(« Fas-associated protein with death domain), TRADD (« TNF receptor-associated protein with
death domain) et DAXX (« Death Domain-associated Protein ») (Guicciardi and Gores, 2009). Ces
protéines font le lien entre le récepteur et les effecteurs de la mort cellulaire par des interactions au
niveau de leur domaine effecteur de mort (« Death Effector Domain », DED).
La signalisation de mort cellulaire la mieux établie est celle du récepteur Fas: son activation se fait
préférentiellement au niveau de microdomaines de la membrane plasmique, appelés « radeaux
lipidiques » (Ashkenazi, 2002),(Andera, 2009) Il recrute la protéine FADD pour former le complexe
DISC (« Death Inducing Signaling Complex »). Ce complexe s’associe aux caspases initiatrices 8 ou
10, et promeut leur activation. Selon les cellules, ces caspases activeront directement les caspases
effectrices 3, 6 et 7 (regroupées dans la famille des cellules de type I), ou bien la caspase 8 pourra
cliver la protéine Bid et l’activer (cellules de type II), amplifiant ainsi la mort induite par la voie
mitochondriale (Guicciardi and Gores, 2009) (Sathasivam and Shaw, 2005).
112
Introduction
Domaine de mort
CRD
P75 NTR
Troy
EDAR
XEDAR
EDA
CD40
DcR3
CD40L
Fas
FasL
OX40L
AITRL
OX40
AITR
CD30
HVEM
4-1BB
TNFR2
DR3
CD27
TNFR1
LTβR
RANK
CD30L
VEGI
LIGHT
4-1BBL
CD27L
LTα
TNF
LTβ
TACI
BCMA
TWEAK
APRIL
DR6
BLYS
OPG
RANKL
TRAIL
DR4
DR5
DcR1
DcR2
Figure 17 La superfamille des TNFR et leurs ligands
Au total, 28 récepteurs et 18 ligands ont été identifiés. La majorité de ces protéines sont des protéines
transmembranaires. C’est l’association de différents domaines riches en cystéine (CRD) des récepteurs qui
détermine leur spécificité à un ligand donné. Certains ligands peuvent lier de nombreux récepteurs, comme
TRAIL ou LIGHT (en gras). Les récepteurs détaillés dans l’introduction sont indiqués en rouge. Une sousclasse de ces récepteurs se distingue par une partie cytoplasmique contenant un domaine de mort
(représentés par un rectangle orange sur cette figure) et sont donc appelés récepteurs de mort. La
signalisation nécessite souvent que les récepteurs et les ligands soient oligomérisés, en général sous forme de
trimères.
113
Introduction
b)
la voie intrinsèque de l’apoptose
(Figure 18)
•
Dépendante de la mitochondrie:
La mort engagée par la mitochondrie peut être initiée suite à l’agression par des espèces
oxygénées, à des dommages dans l’ADN ou à une libération de calcium excessive dans le
cytoplasme. La voie principale de mort induite à travers la mitochondrie est celle qui dépend du
cytochrome c et de l’activation des caspases. Des conditions de surcharge de calcium dans la
mitochondrie, de stress oxydatif excessif peuvent favoriser une situation de perméabilisation de la
mitochondrie
qui implique la création d’un pore de transition à la membrane mitochondriale
(mPTP). Le mPTP est un canal transmembranaire poly-protéique (formé par association de VDAC,
ANT (« Adenin Nucleotide Translocator ») et de la cyclophiline D), qui libère des molécules proapoptotiques telles que le cytochrome c (Martin, 2010). Ce dernier, libéré dans le cytoplasme, va
s’associer avec APAF-1 (« Assembly from apoptotic Protease-Activating Factor-1 ») et la procaspase
9, et former un complexe appelé l’apoptosome. Ce complexe permet l’activation de la caspase 9 qui
à son tour activera les caspases effectrices 3 et 7, ce qui conduira finalement à une fragmentation
de l’ADN (Kim et al., 2006), (Nagley et al., 2010).
La mitochondrie peut libérer d’autres facteurs pro-apoptotiques en plus du cytochrome-c, comme
AIF (« Apoptosis-Inducing Factor ») et smac/DIABLO (« Second Mitochondria-derived Activator of
Caspase/ Direct Inhibitor of Apoptosis-Binding Protein with LOw pI qui déclencheront des voies
apoptotiques caspase-dépendantes et indépendantes.
L’activation de cette voie est finement régulée en amont par les protéines de la famille Bcl-2 (« BCell Lymphoma 2 ») que l'on peut classer par leur fonction et par leurs domaines d’homologie, BH14:
les protéines pro-survie telles que Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, A1 et Bcl-W qui conservent leurs 4 domaines
BH1 à 4. Les protéines Bcl-2 et Bcl-xL empêchent l’activation de protéines pro-apoptotiques (Bax et
Bak) dans la membrane mitochondriale.
114
Introduction
Les protéines pro-apoptotiques : on distingue deux classes : Bax et Bak qui possèdent une
séquence de conservation des domaines BH1 à 3 et les protéines Bid, Bad, Bim, Noxa, et Puma (ou
protéines BH3) qui possèdent une séquence de conservation seulement du domaine BH3 (Kim et
al., 2006), (Tsujimoto, 1998).
Les facteurs Bax et Bak sont aussi impliqués dans la libération du cytochrome c de la mitochondrie:
une fois activées, ces deux protéines s’oligomérisent et forment des pores dans la membrane
mitochondriale. Cette étape est possible grâce à l’intervention des protéines BH3 qui interagissent
d’une part avec les protéines Bcl-2 qui piègent Bax et Bak, ce qui va avoir pour conséquence de les
libérer, et qui d’autre part activent Bax et Bak pour favoriser leur oligomérisation (Rodriguez et al.,
2011).
Enfin, l’apoptose peut être inhibée par des protéines de la famille des IAP (« Inhibitor of Apoptosis
Proteins ») qui comprend les protéines XIAP (« X-linked IAP »), c-IAP et survivine. Ces protéines
peuvent se lier aux caspases 9, 3 et 7 par leur domaine CARD (« Caspase Recruitment Domain ») et
empêcher leur activation, et donc la mort cellulaire (Altieri, 2010).
•
Dépendante du Réticulum Endoplasmique: interaction avec la mitochondrie:
Comme cela a été expliqué précédemment, lors d’un stress du RE prolongé, une signalisation proapoptotique peut être initiée par cette organelle. L’engagement vers l’apoptose implique deux
protagonistes principaux:
1) la caspase 12 qui, lorsqu’elle est clivée, peut à son tour activer les caspases 9 et 3,
indépendamment de la voie mitochondriale.
2) CHOP et p53 qui sont des facteurs de transcription.
Ces derniers vont activer dans le noyau la synthèse de protéines proapoptotiques dont les protéines
de type BH3 (Galehdar et al., 2010) qui, dans le cytoplasme, vont activer Bax et Bak qui
transiteront ensuite vers la mitochondrie.
Par ailleurs, certaines protéines BH3, notamment Puma, sont localisées dans le RE et peuvent
induire une activation des récepteurs IP3R et conduire à une libération de calcium (Shibue and
115
Introduction
Taniguchi, 2006). Ce calcium en excès sera capturé en partie par la mitochondrie et pourra
contribuer à sa perméabilisation, ce qui va amener à la libération de molécules pro-apoptotiques
(voir partie précédente) (Kim et al., 2006).
FasL
Fas
DD
FADD
DED
Pro-caspase 8
C-FLIP
ROS Calcium
1
Caspase 8
Bid
Pro-caspase 3
Pro-caspase 9
PTP
Bax/Bak
APAF-1
2
Caspase 3
Calcium
Caspase 9
Cytochrome-c
Apoptosome
3
Procaspase12 Caspase 12
MORT
Figure 18 Les voies apoptotiques intrinsèques et extrinsèques dans la SLA
La voie apoptotique extrinsèque (en bleu 1) est la voie des récepteurs de mort (ici Fas). La liaison du ligand
FasL au récepteur Fas entraîne son activation. Au niveau de ces domaines de mort (« Death Domain », DD)
cytoplasmique, il recrute la protéine adaptatrice FADD (« Fas-associated protein with death domain ») qui par
la suite interagira avec la procaspase 8 au niveau de son domaine de mort effecteur (« Death Effector
Domain », DED). Ce complexe, appelé DISC (« Death Inducing Signaling Complex ») permettra de cliver la
caspase 8 qui clivera à son tour la caspase 3. La voie apoptotique intrinsèque de mort implique à la fois la
mitochondrie (2) et le RE (3). La perméabilisation de la mitochondrie (voie verte), qui peut être due à des
ROS ou une forte concentration de calcium, va promouvoir la libération de molécules pro-apoptotiques, dont
le cytochome c. Des pores transitoires perméables mitochondriaux (« Mitochondrial Pore Transition
Permeability » mPTP) ou ceux formés par l’oligomérisation de Bax et Bak vont permettre la sortie du
cytochrome-c qui va s’associer au facteur APAF-1 (« Assembly from apoptotic Protease-Activating Factor-1 »)
et former l’apoptosome qui activera la pro-caspase 9, qui à son tour activera la caspase 3. La caspase 8
impliquée dans la voie extrinsèque peut cliver et activer la protéine Bid qui activera les protéines Bax/Bak qui
pourront alors s’oligomériser. Enfin le RE, en conditions de stress prolongées, peut activer la caspase 12 qui à
son tour activera avec la caspase 9 puis la caspase 3.
116
Introduction
2.
L’apoptose dans la SLA : implication de la voie intrinsèque
a)
Aspects morphologiques et marqueurs apoptotiques chez les souris et les
patients « SLA »
•
Aspects morphologiques: afin de déterminer si les motoneurones mourraient par apoptose,
dans la SLA, des cellules à caractéristiques apoptotiques ont été recherchées sur la base de critères
tels qu’une condensation cytoplasmique et nucléaire, une compaction de la chromatine et une
préservation de la structure des organelles. Chez les souris et les patients SLA, la plupart des
motoneurones « malades » sont atrophiés, avec un cytoplasme vacuolisé (dilatation d’organelle), un
noyau condensé et une irrégularité de la surface membranaire. Au stade final, les motoneurones ne
mesurent plus que 20 % de leur taille initiale et sont de forme ronde ou fusiforme (Guegan and
Przedborski, 2003; Martin, 1999). Ces critères ne correspondent toutefois pas exclusivement à ceux
caractérisant l’apoptose, notamment à cause de l’absence de condensation de la chromatine. Au
stade final de la maladie chez les souris, un faible nombre de cellules en apoptose (figure 19) a pu
être mis en évidence dans des coupes de moelle épinière de souris transgéniques SLA. Ces résultats
sont le reflet de la difficulté à détecter les cellules apoptotiques au stade final car 50 % des
motoneurones sont déjà perdus. Le taux de mort par jour est très faible (estimé à 0.6%) à un
niveau donné de la moelle épinière, et les cellules arrivées au stade apoptotique disparaissent très
vite, probablement phagocytées (Chiu et al., 1995; Guegan and Przedborski, 2003). Il a donc fallu
compléter l’étude morphologique par l’expression de marqueurs apoptotiques, indiquant que les
voies de mort par apoptose étaient mises en place.
•
Expression de marqueurs apoptotiques: Une des caractéristiques de l’apoptose est la
fragmentation de l’ADN. Ce phénomène peut être évalué en marquant les extrémités 3’ libres par
deux techniques : TUNEL (« Terminal transferase-mediated dUTP Nick End-Labelling ») et ISEL
(« In Situ End Labelling »). Ces marquages chez des patients SLA et des souris transgéniques ont
donné des résultats contradictoires (He and Strong, 2000), (Migheli et al., 1994) (Migheli et al.,
1999). De plus ces techniques peuvent aussi marquer des cellules en nécrose.
117
Introduction
D’autres marqueurs plus fiables ont alors été testés:
L’antigène carbohydrate Le
Y
est exprimé lors de changement de glycosylation à la surface de la
cellule, ce qui traduit des changements morphologiques à la surface membranaire. Il est fortement
exprimé chez les patients SLA et chez les souris transgéniques (Yoshiyama et al., 1994) (Hiraishi et
al., 1993).
Le marqueur Fractine, qui est un produit de clivage de la β-actine par la caspase 3, permet
également d’identifier des cellules en apoptose. Son expression est augmentée dans la moelle
épinière des souris SOD1 mutée et non chez les contrôles (Vukosavic et al., 2000).
Enfin, des niveaux élevés de la protéine liée à l’apoptose Par-4 (« Prostate Apoptosis Response 4 »)
ont été observés à la fois chez les patients SLA et les souris SOD1 mutantes et non chez leurs
contrôles (Rangnekar, 1998).
L’ensemble de ces observations suggèrent fortement que les motoneurones meurent par apoptose.
Toujours dans le but d’évaluer le rôle de l’apoptose dans la SLA, des médiateurs moléculaires de la
mort cellulaire programmée ont été étudiés.
Figure 19 Cellule apoptotique à un stade avancé de la maladie chez les souris SOD1G93A
Illustration d’une cellule en apoptose identifiée morphologiquement, dans la moelle épinière de souris
SOD1G93A à un stade final de la maladie. La flèche indique la compaction de la chromatine en des masses
rondes dans le noyau, on peut également remarquer une condensation du cytoplasme de la cellule. D’après la
revue (Guegan and Przedborski, 2003).
118
Introduction
b)
•
Activation de l’apoptose dans la SLA
Activation des caspases:
Afin de démontrer une implication des caspases dans la SLA, des injections intraventriculaires d’un
inhibiteur général des caspases, z-VAD fmk, ont été réalisées. L’inhibition des cascades atténue la
mort induite chez les souris SOD1G93A (Li et al., 2000) et prolonge leur survie en retardant le
déclenchement de la maladie. D’autres études ont montré une activation de la caspase 9,
concomitante à la translocation de Bax à la mitochondrie, et une distribution cytoplasmique du
cytochrome c chez les souris SLA (Guegan et al., 2001), la caspase 9 activée et la libération du
cytochrome c ayant également été observées chez les patients (Guegan et al., 2001), (Inoue et al.,
2003). Ces données montrent l’implication de la voie mitochondriale dans la SLA.
L’activation des caspases effectrices 3, 7 et de la caspase 8 survient à des stades plus tardifs chez
les souris (Sathasivam and Shaw, 2005), (Spooren and Hengerer, 2000), la caspase 3 étant active
également dans les motoneurones des patients (Martin, 2010).
D’autres études ont montré que la caspase 12, rattachée au RE, était fortement exprimée chez les
souris symptomatiques SLA et les patients SLA (Guegan and Przedborski, 2003), (Atkin et al.,
2008). Enfin, des caspases impliquées dans des réponses inflammatoires, les caspases 1 et 11, sont
surexprimées dans la moelle épinière des souris SOD1G93A et leur augmentation coïncide avec le
développement de la réponse gliale (Kang et al., 2003),(Pasinelli et al., 2000),(Vukosavic et al.,
2000) 2000, (Pasinelli et al., 1998). D’ailleurs l’utilisation d’un dominant négatif de la caspase 1
retarde la progression de la maladie mais pas son déclenchement (Friedlander et al., 1997).
•
Diminution des protéines pro-survie au profit de l’augmentation de molécules pro-
apoptotiques:
L’expression des protéines pro-survie Bcl-2 et Bcl-xL est diminuée chez les souris SOD1
G93A
symptomatiques et chez les patients au profit d’une augmentation des protéines pro-apoptotiques
Bad et Bax (Vukosavic et al., 1999),(Mu et al., 1996). La diminution de Bcl-2 pourrait être due à sa
119
Introduction
séquestration dans des agrégats de grande taille de la SOD1 mutée, notamment dans la
mitochondrie (Pasinelli et al., 2004). La surexpression de Bcl-2 chez les souris transgéniques retarde
le déclenchement de la maladie et prolonge la survie des souris d’environ 2 semaines (Kostic et al.,
1997).
La protéine XIAP, qui inhibe l’activation des caspases, diminue également à des stades
symptomatiques chez les souris SOD1G93A; sa surexpression chez ces souris diminue la perte de
motoneurones et ralentit la progression de la maladie d’environ 12 jours, sans affecter son
déclenchement (Wootz et al., 2006)(Inoue, 2003 #470).
Des équipes ont étudié les effets d’une diminution de l’expression de protéines pro-apoptotiques.
Ainsi, la délétion chez les SOD1G93A de la protéine BH3 Puma, qui joue un rôle à la fois au niveau de
l’apoptose de la mitochondrie et du RE, retarde le déclenchement de la maladie d’environ 20 jours
ainsi que la perte des motoneurones (Kieran et al., 2007). De récents travaux ont montré que la
délétion génétique de Bax et Bak dans les neurnes retardait le déclenchement de la maladie et
prolongeait la survie des souris SOD1G93A d’environ 1 mois (Reyes et al., 2010). La délétion de ces
protéines diminue aussi la perte motoneuronale et notamment la proportion des cellules
apoptotiques, évaluée dans cette étude par un marquage de la caspase 3 clivée. Peut-être plus
surprenant, leur délétion diminue fortement la dénervation, ce qui va de pair avec l’amélioration
dans les résultats aux tests moteurs (rotarod) de ces souris.
La voie apoptotique dépendante de la mitochondrie jouerait donc un rôle direct dans les processus
de mort des motoneurones comprenant à la fois les processus dégénératifs (dénervation) de ces
cellules et l’exécution de la mort. (Reyes et al., 2010).
120
Introduction
3.
L’apoptose dans la SLA : implication de la voie extrinsèque
Une composante importante de l’apoptose est assurée par l’activation des récepteurs de mort. De
nombreuses études ont porté sur l’implication de ces récepteurs dans la SLA et ont montré que
quatre d’entre eux, p75, TNFR, LIGHTR et Fas, pourraient participer à des processus celluleautonome ou non-autonome de toxicité liée à la SOD1 mutée. Étant donné que les protéines que
j’ai étudiées au cours de ma thèse, CRT et CRMP4, sont des effecteurs de la voie Fas, l’importance
de ce récepteur dans la SLA sera particulièrement développée.
a)
p75 neurotrophin receptor (p75
NTR
): le récepteur au NGF
Le NGF (nerve growth factor) est une neurotrophine qui peut jouer sur différentes fonctions
cellulaires selon le récepteur qu’elle lie : un rôle dans la survie et la différentiation neuronale par
activation de son récepteur à haute affinité TrKA, ou un rôle dans la mort neuronale par activation
du récepteur à basse affinité p75NTR (Pehar et al., 2004). Les motoneurones expriment le récepteur
p75NTR au cours du développement embryonnaire, notamment pendant la période de mort
développementale, et l’activation de ce récepteur serait à l’origine de la mort d’une partie des
motoneurones au cours de la maladie. Son expression diminue chez l’adulte (Yan et al., 1988), mais
augmente à nouveau dans les motoneurones des patients et des souris transgéniques. Des travaux
ont montré que les motoneurones exprimant p75NTR étaient entourés par des astrocytes qui
exprimaient le ligand du récepteur p75NTR, le NGF (Pehar et al., 2004). Leurs auteurs ont montré
que des astrocytes rendus « réactifs » par de l’oxyde nitrique sécrétaient du NGF et pouvaient tuer
des motoneurones « sauvages » mis en co-culture, par un processus de mort dépendant de p75
(Domeniconi et al., 2007; Pehar et al., 2004). De plus, l’ajout de NGF aboutit à la mort des
motoneurones SOD1 mutants alors qu’il faut y ajouter de l’oxyde nitrique pour induire la mort des
motoneurones sauvages (Pehar et al., 2007).
121
Introduction
Des études, réalisées afin de tester l’effet du blocage de p75NTR sur l’évolution de la maladie,
montrent que la diminution du récepteur p75 au moyen de peptide anti-sens ou par ablation
génétique chez les souris SOD1G93A améliore de façon modeste la survie des souris (Turner et al.,
2003), (Kust et al., 2003). De plus, ces résultats modestes ne sont pas retrouvés par un autre
groupe qui utilise un antagoniste de la liaison du ligand à son récepteur (Turner et al., 2004).
b)
Le récepteur au TNFα
Le TNFα est une des principales cytokines pro-inflammatoires et exerce son effet par l’activation des
récepteurs TNFR1 et 2, dont seul le premier est impliqué dans une voie apoptotique. Le TNFα,
TNFR1 et TNFR2 sont tous trois exprimés par les neurones, les astrocytes et la microglie dans tout
le système nerveux (Park and Bowers, 2010).
Les processus d’inflammation dans la SLA implique l’activation des astrocytes et de la microglie qui
vont produire des cytokines, et notamment le TNFα, en présence de la SOD1 mutée (Zou and
Crews, 2005). Des travaux in vitro et in vivo ont montré que le TNFα pouvait provoquer la mort des
motoneurones en culture (Ugolini et al., 2003) mais les mécanismes ne sont pas connus, bien
qu’une étude récente ait montré que le TNFα pourrait provoquer une augmentation du transport
rétrograde des mitochondries conduisant à leur accumulation dans le soma (Stommel et al., 2007).
En étudiant le rôle potentiel du TNFα dans la SLA, il a été observé que l’expression du TNFα et des
caspases proinflammatoires 11 et 1 augmentait en parallèle à l’activation gliale à partir de 75 jours
chez les souris SOD1G93A (Yoshihara et al., 2002). De même une augmentation du récepteur de
TNFR1 est observée à partir du déclenchement de la maladie et durant toute sa progression
(Hensley et al., 2002), (Hensley et al., 2003) (Elliott, 2001). De plus, des niveaux élevés de TNFα et
de ses récepteurs ont été trouvés dans le plasma des patients SLA (Cereda et al., 2008), confortant
l’idée d’une implication potentielle de ce récepteur dans la maladie.
Divers traitements tels que la thalidomide, l’acide folique, l’IGF-1 et des chélateurs de métaux qui
aboutissent à une réduction des niveaux TNFα, ont des effets bénéfiques chez les souris
transgéniques (Dodge et al., 2008) (Kiaei et al., 2006; Petri et al., 2007; Zhang et al., 2008).
122
Introduction
Cependant ces études n’ont pas montré directement l’implication du couple TNFα/TNFR dans la
neurodégénérescence, et les effets bénéfiques pourraient être dus non pas à un effet de ces agents
pharmaceutiques sur le TNFα, mais à une diminution globale de l’inflammation par d’autres
mécanismes. Par ailleurs, le croisement de souris SOD1G93A ou SOD1G37R avec des souris déficientes
en TNFα n’affecte pas la survie de ces souris ni la perte des motoneurones, ce qui amène à douter
d’un rôle majeur de TNFα dans la dégénérescence des motoneurones liée à l’inflammation dans la
SLA.
c)
Le récepteur à LIGHT: LT-βR
LIGHT est une protéine transmembranaire de type II de la famille du TNF qui peut se lier à trois
récepteurs différents : le récepteur lymphotoxin-β (LT-β-R), le récepteur HVEM (« Herpes Virus
Entry Mediator ») et le récepteur Dcr3 (decoy 3). LIGHT joue un rôle important dans les processus
de l’immunité adaptative et innée (Ware, 2005).
D’élégantes études de notre laboratoire ont démontré l’existence d’une nouvelle voie de mort
sélective des motoneurones qui implique un mécanisme cellule-non-autonome. Nos collègues ont
montré que le ligand LIGHT pouvait induire 50 % de mort de motoneurones sauvages en activant le
récepteur LT-β-R et que cette mort pouvait être potentialisée par la cytokine INFγ (interféron
gamma). Cette voie de mort, indépendante de la mitochondrie, impliquerait l’activation de la kinase
p38, de la caspase 9 et de la caspase 6 comme effecteurs de mort.
Le modèle de pathogénicité liée à la SOD1 mutée in vitro est le suivant: 1) les motoneurones SOD1
mutants ne présentent pas une susceptibilité accrue à la mort induite par LIGHT ou IFNγ comparés
aux motoneurones contrôles, réduisant la possibilité d’un processus cellule-autonome 2) les
astrocytes SOD1 mutants sécrétent des toxines et notamment l’IFNγ. 3) les motoneurones cultivés
sur un tapis astrocytaire SOD1 mutant meurent, et cette mort est bloquée par l’ajout d’anticorps
neutralisants anti-IFNγ ou par inhibition de la voie LIGHT-LT-β-R.
In vivo, l’expression de LIGHT n’est pas différente entre les souris sauvages et SOD1G93A aux
différents stades de la maladie. En revanche, l’expression d’IFNγ augmente au déclenchement de la
123
Introduction
maladie (90j) d’abord surtout dans les astrocytes (Aebischer et al., 2011), (Wang et al., 2011b) puis
plus tard dans les motoneurones (entre 90 et 110 jours).
C’est donc l’augmentation des niveaux d’IFNγ qui va sensibiliser les motoneurones à mourir par
LIGHT. La délétion génétique de LIGHT chez les souris SOD1G93A retarde la progression de la
maladie et non son déclenchement, ce qui confirme l’implication d’un mécanisme de pathogénicité
de type cellule non-autonome de l’association IFNγ-LIGHT (Aebischer et al., 2011). De plus une
augmentation des niveaux d’IFNγ a été retrouvée dans le sérum et dans le fluide cérébrospinal des
patients SLA, indiquant un rôle potentiel de cette cytokine dans le processus de mort des
motoneurones SOD1 mutants (Tateishi et al., 2010).
d)
Le récepteur Fas et son ligand FasL
(Figure 20)
Au cours du développement des motoneurones de la moelle épinière, la moitié d’entre eux meurent
après avoir établi contact avec leur cible, selon un processus de mort cellulaire programmée
développementale (Pettmann and Henderson, 1998). De plus, des travaux antérieurs du laboratoire
ont montré une implication du récepteur Fas dans la mort développementale des motoneurones. En
effet, en l’absence de facteurs de survie ou en conditions de stress, les motoneurones activent une
voie de mort programmée au cours de laquelle la moitié meurt in vitro un jour après
ensemencement. Cette mort est inhibée par le blocage de l’interaction Fas/Fas ligand (FasL). En
outre, la privation de facteurs trophiques entraîne une activation de Fas, une production active de
FasL et une mort impliquant la caspase 8.
De plus, les auteurs ont montré que la mort par Fas pouvait être un processus actif car l’ajout de
FasL ou l’activation du récepteur Fas par des anticorps anti-Fas agonistes aboutit à 50 % de mort
des motoneurones en présence de facteurs trophiques. Cette voie de mort requiert l’activation de la
caspase 8 et est dépendante de l’activation de la voie mitochondriale. L’activation de Fas induit une
mort maximale de 50% à 48h, un pourcentage qui n’est pas augmenté les jours suivants, ce qui
suggère la présence d’une population résistante à cette mort. Dans ce sens, les auteurs ont montré
que cette résistance était due une synthèse accrue de la molécule cFLIP (« cellular FLICE/caspase
124
Introduction
8-like inhibitory protein ») au bout de trois jours de culture. cFLIP est un inhibiteur intra-cellulaire
de la caspase 8 qui s’associe à la protéine FADD, ce qui empêche son interaction avec la caspase 8,
et donc la mort des motoneurones (Raoul et al., 1999).
L’équipe a ensuite découvert l’existence d’une deuxième composante dans la voie de mort des
motoneurones activée par Fas. Ils ont ainsi montré que Fas activait, dans les motoneurones
seulement, une autre voie de mort en parallèle de la voie classique et impliquant les partenaires
suivants: la protéine adaptatrice DAXX, recrutant la kinase ASK-1, qui active en aval la kinase p38,
laquelle stimule la transcription de la nNOS (« neuronal Nitric Oxide Synthase ») et donc augmente
la production de NO. Les deux voies de mort agissent en synergie pour induire la mort des
motoneurones et la kinase p38 peut activer aussi bien la voie mitochondriale que la voie NO.
Dans la continuité du projet, l’implication de cette voie dans la pathologie liée à la SOD1 mutée a
été étudiée. De manière intéressante, les motoneurones SOD1 mutants présentent une sensibilité
accrue à la mort induite par FasL ou NO, mourant à des doses de 100 fois inférieures à celles
nécessaires pour tuer les motoneurones sauvages. De plus, la production de NO provoque une
synthèse de FasL et une phosphorylation de la p38 dans les motoneurones mutants, conduisant à
l’activation d’une boucle d’amplification de mort (Raoul et al., 2002),(Raoul et al., 2006).
Cette voie est aussi activée in vivo puisque de nombreux composants tels que FasL, Daxx, ASK-1 et
phosho-p38 augmentent chez les souris SOD1G93A à partir des stades asymptomatiques (Raoul et
al., 2006), (Ranganathan and Bowser), (Holasek et al., 2005). D’ailleurs le croisement de souris
SOD1G93A avec des souris exprimant une forme dominante négative de DAXX diminue le nombre de
motoneurones FasL positifs dans la moelle épinière de souris, montrant que la boucle
d’amplification existe également in vivo (Raoul et al., 2006).
L’importance de cette voie a été confirmée lorsque ses acteurs moléculaires ont été retrouvés
augmenter chez les patients SLA. Ainsi le sérum d’un quart des patients SLA sporadiques et
familiaux contient des niveaux anormaux d’anticorps anti-Fas (Sengun and Appel, 2003). Le
récepteur Fas lui-même est également augmenté dans les cornes ventrales de la moelle épinière
des patients SLA (de la Monte et al., 1998). Une expression plus intense de nNOS et de la phospho
125
Introduction
p38 (neuronal nitric oxide synthase) a été également observée dans la moelle épinière des patients
SLA (Phul et al., 2000),(Sasaki et al., 2001),(Bendotti et al., 2004), (Catania et al., 2001).
Serum/
microglie
FasL
A
Fas
DAXX
FADD
ASK-1
Caspase 8
Phospho-p38
Bid
Caspase 3
nN OS
NO
FasL
?
Cytochrome-c
MORT
Astrocytes/
microglie
NO
C
WT
SOD1G93A
% de survie des motoneurones
% de survie des motoneurones
B
WT
SOD1G93A
Figure 20 Les motoneurones SOD1 mutants sont vulnérables in vitro à la voie de mort Fas/NO
A) Les motoneurones meurent suite à l’activation du récepteur Fas en empruntant la voie de la caspase 8
mais aussi la voie de la mitochondrie. Une nouvelle voie de mort a été identifiée : le récepteur Fas suite à son
activation va interagir avec la protéine adaptatrice DAXX, qui recrutera la protéine ASK-1 qui activera en aval
la kinase p38. Cette dernière va augmenter transcriptionnellement la nNOS (« neuronal Nitric Oxide
Synthase »,) ce qui permettra la production de l’oxyde nitrique (NO). Le NO en retour va activer la synthèse
du ligand Fas, ce qui formera une boucle d’amplication Fas->NO->FasL->Fas. Le NO pourrait perturber le
fonctionnement de la mitochondrie et du réticulum endoplasmique, ou encore produire du peroxynitrite,
l’ensemble étant toxique pour la cellule. Les cellules environnantes des motoneurones peuvent sécréter des
agonistes à Fas (son ligand FasL) et du NO (Raoul 2002, 2006). B et C) Les motoneurones SOD1 mutants
présentent une sensibilité accrue à la mort induite par un anticorps anti-Fas agoniste ou par le NO. En effet,
les motoneurones SOD1 mutants meurent avec des doses 10 à 100 fois plus faibles d’agonistes de la voie Fas
par rapport aux motoneurones sauvages.
126
Introduction
Enfin, l’implication de cette voie Fas dans la maladie a pu être mise en évidence in vivo en inhibant
l’expression de certains de ses composants chez les souris SOD1G93A.
Deux études se sont intéressées à cibler Fas: La première étude a consisté à croiser des souris
SOD1G93A avec des souris FasLgld homozygotes qui présentent une mutation ponctuelle aboutissant à
une perte de fonction de la protéine. Les résultats obtenus sont modestes mais significatifs, les
souris SOD1G93A/FasLgld affichent une meilleure résistance au test moteur du rotarod, une extension
de survie de 7 jours et une perte de motoneurones diminuée (Petri et al., 2006). Dans la seconde
étude, des ARN interférants ciblant le messager de Fas ont été injectés en intrathécal au moment
du déclenchement de la maladie, à l’aide d’une mini-pompe osmotique permettant une libération
régulière du produit pendant 1 mois. Cette étude est particulièrement intéressante car elle s’inscrit
plus dans le cadre d’une approche thérapeutique. Les souris transgéniques injectées avec un ARN
interférant ciblant Fas présentent également une diminution de la perte des motoneurones, et un
retard dans le déclenchement de la maladie, mais peu d’effets dans sa progression. Les auteurs
mettent en cause la limitation de leur système qui ne peut délivrer les ARN interférants que pendant
4 semaines (Locatelli et al., 2007). Dans ces deux études, une diminution des composants de la
voie Fas/NO lorsque Fas est inhibé a également été observée.
Les deux voies de mort identifiées dans le laboratoire représentent deux processus de mort des
motoneurones: la voie Fas impliquerait plus un processus cellulaire-autonome, la présence même
de la SOD1 mutée dans le motoneurone conduisant à une sensibilité accrue à la voie de mort
Fas/NO et à une boucle d’amplification du système. La voie LIGHT, au contraire, dépendrait plus
d’une toxicité induite par la présence de la SOD1 mutée dans les astrocytes qui sécrètent de l’IFNγ
et sensibilisent les motoneurones à la mort par LIGHT. Ces deux voies sont ainsi complémentaires
et leur activation simultanée conduit à un effet additif, aboutissant à 70% de mort des
motoneurones in vitro (Aebischer et al., 2011).
Les nombreux travaux in vivo et chez les patients SLA ont démontré l’implication de la voie Fas dans
la maladie, confirmant que le modèle in vitro des motoneurones en culture constitue une bonne
approche expérimentale dans l’étude de la SLA.
127
Introduction
Le développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette maladie est une priorité. La SLA a
été découverte il y a plus de 140 ans et les premiers gènes associés à cette maladie ont été isolés il
y a presque 20 ans. L’utilisation des modèles transgéniques SOD1 mutant a permis d’établir de
nombreux mécanismes de toxicité de la SLA. Les essais de thérapie conduits chez les souris se sont
donc basés sur le blocage de processus toxiques et ont consisté en l’utilisation de composés
pharmacologiques (antioxydant, anti-agrégation...), de thérapies géniques ou anti-sens, de
transplantations cellulaires, ou encore d’immunisations. Malheureusement, hormis le riluzole, aucun
essai de thérapie modifiant significativement (> 10%) la survie des souris SOD1 mutant n’a eu
d’effet positif chez les patients.
Deux problèmes majeurs peuvent être à l’origine de ces échecs: d’une part les souris utilisées dans
les tests exprimaient en général des taux importants de la SOD1 mutée, contrairement à ce qui se
passe chez les patients. D’autre part, la majorité des tests thérapeutiques chez les souris ont été
lancés avant le déclenchement des symptômes, alors que la maladie est toujours diagnostiquée
après l’apparition des symptômes chez les patients.
Il faut donc chercher des traitements qui fonctionnent chez la souris à des stades de la maladie où
l’on effectue le diagnostic des symptômes chez l’homme.
Seules quelques études réalisées aux alentours du moment du déclenchement de la maladie chez
les souris SOD1G93A se sont révélées bénéfiques: l’injection intramusculaire de vecteurs viraux
codant pour l’IGF-1 et le VEGF et transportés de manière rétrograde vers les motoneurones rallonge
la survie des souris de 14 à 18%; l’inhibition par interférence de Fas accroît également la survie des
souris de 14%. Enfin, une étude récente a montré les effets bénéfiques de la natation forcée chez
les souris SOD1G93A qui prolonge d’environ 20% leur survie. La nage protégerait préférentiellement
les motoneurones appartenant aux unités motrices rapides et donc vulnérables dans la maladie
(Deforges et al., 2009). Ces dernières études élargissent ainsi le champ d’approches thérapeutiques
pour la SLA.
Dans ce contexte, nous avons voulu identifier de nouveaux candidats participant à la sensibilité des
motoneurones SOD1G93A en réalisant une étude protéomique sur des motoneurones mSOD1 et
128
Introduction
sauvages traités par Fas ou NO. L’identification de nouvelles molécules clés dans la maladie reste en
effet un vrai défi dans le développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour la SLA.
129
Résultats
RESULTATS
130
Résultats
Les mécanismes à l’origine de la mort sélective des motoneurones dans la SLA et le
déclenchement tardif de cette maladie sont encore mal compris. Des études ont montré que la
dégénérescence d’une partie des motoneurones alpha, dits « vulnérables ou FF » apparaît très tôt
chez les souris et chez les patients SLA, bien avant les premiers symptômes cliniques (Fischer et al.,
2004; Pun et al., 2006). Mais ce n’est que lorsque la dégénérescence des motoneurones résistants
intervient, que la maladie est déclarée et sa progression est alors rapide. Ces motoneurones
vulnérables ont peu de capacité d’adaptation et sont donc particulièrement sensibles au stress
(Saxena and Caroni, 2011). Nous avons voulu identifier des candidats moléculaires pouvant
participer à cette sélectivité de certain motoneurones à la mort précoce.
Notre équipe a montré précédemment que seule une sous-population de motoneurones mSOD1
présentait une sensibilité accrue in vitro à la mort induite par Fas/NO à 48 heures. Afin de
déterminer des changements moléculaires responsables de la vulnérabilité de ces motoneurones
mSOD1 à l’activation de Fas/NO, nous avons réalisé une étude protéomique bien avant la mort de
ces motoneurones (24 heures après traitement). Elle a permis de mettre en évidence le
changement de deux protéines uniquement dans les motoneurones mSOD1 traités par Fas Ligand
(FasL) ou NO: la protéine « Collapsin Response Mediator Protein 4 » (CRMP4) dont l’expression
double et la protéine Calréticuline (CRT) dont l’expression est diminuée d’un facteur deux (Duplan
et al., 2010). Mon projet principal de thèse a été d’évaluer le rôle de CRT dans cette mort sélective
des motoneurones (I et II). J’ai également participé à l’évaluation du rôle de CRMP4 dans la SLA
(III et IV).
131
Résultats
I. Introduction des Résultats du projet Calréticuline
A) Contexte de l’étude
CRT est une protéine du réticulum endoplasmique qui possède une fonction de chaperonne
et une fonction de tamponnage du calcium (Gelebart et al., 2005) (Michalak et al., 1999). Elle est
donc garante de deux fonctions essentielles du RE: l’homéostasie calcique et le repliement et
l’assemblage des protéines. Son expression doit-être finement régulée, sa délétion génétique étant
létale au stade embryonnaire (Mesaeli et al., 1999). D’un point de vue fonctionnel, son niveau
d’expression est capable de réguler la capacité de calcium à l’intérieur du RE (Nakamura et al.,
2001c) ainsi que son efficacité dans le repliement et dans le contrôle qualité des protéines (Molinari
et al., 2004). La perturbation de l’une ou l’autre de ces fonctions peut conduire à un stress du RE.
D’ailleurs, des études ont montré que des fibroblastes déficients pour la CRT (CRT -/-) activaient la
voie du stress du RE dépendante de PERK (Knee et al., 2003). Des défauts d’homéostasies
calciques (Kawamata and Manfredi, 2010; Palecek et al., 1999; Vanselow and Keller, 2000),
l’agrégation de protéines (Kabashi et al., 2004; Sau et al., 2007) et le stress du RE jouent un rôle
central dans la vulnérabilité des motoneurones dans la pathologie de la SLA. En effet, l’activation du
stress du RE précède la dégénérescence précoce des motoneurones à des stades asymptomatiques
(Saxena et al., 2009). Son inhibition allonge la survie des souris (Saxena et al., 2009; Shimazawa et
al., 2010), et il est retrouvé augmenté dans les motoneurones des patients (Atkin et al., 2008; Hetz
et al., 2009; Ilieva et al., 2007; Ito et al., 2009).
Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que CRT pouvait être un bon candidat moléculaire
dans la vulnérabilité sélective des motoneurones impliquant des défauts de l’homéostasie calcique
et l’activation du stress du RE.
132
Résultats
B) Synthèse des résultats
Nous avons tout d’abord confirmé in vitro que l’expression de la calréticuline (CRT) est
diminuée
de moitié seulement dans les motoneurones mSOD1 (G93A et G85R), et non les
sauvages, après 16 et 24 heures de traitement à FasL ou NO. Cette diminution est sélective à la fois
du type cellulaire car elle a lieu dans les motoneurones mais pas dans les neurones corticaux et
hippocampiques, et du type d’inducteur de mort car elle est induite suite à l’activation de Fas/NO
mais pas après la stimulation de la voie de mort LIGHT et la privation de facteurs trophiques. Une
faible expression de CRT est nécessaire et suffisante pour tuer les motoneurones. Elle participe
notamment à la surexpression de FasL et donc au processus d’amplification de la boucle Fas/NO.
De plus, l’expression de cette chaperonne diminue in vivo, dès 38 jours, uniquement dans les
motoneurones vulnérables (FF) de la partie lombaire des souris mSOD1. La diminution de CRT
apparaît donc dans la population de motoneurones où le stress du RE est activé et précède la
dénervation de ces motoneurones.
Comment la Calréticuline peut-elle influencer la mort des motoneurones mSOD1 ?
Nous avons mesuré in vitro une augmentation du calcium intracellulaire dans les motoneurones
mSOD1, bien avant la diminution de CRT, après seulement quelques heures de traitement à FasL.
Cette augmentation brutale de calcium pourrait perturber l’homéostasie calcique de la cellule à
cause d’un défaut de protéines tampon de calcium, notamment de la CRT. Ce défaut dans
l’homéostasie calcique serait alors critique pour la survie des motoneurones. Parallèlement à la
baisse de CRT, nous avons quantifié une augmentation de deux composants d’activation du stress
du RE en aval de la voie PERK, P-eIF2a et CHOP. Le blocage du stress du RE par un inhibiteur
prévient la mort des motoneurones mSOD1 provoquée par Fas/NO. Il semblerait donc que la mort
sélective des motoneurones mSOD1 dépende d’une difficulté à gérer des augmentations de calcium
intracellulaire, de la diminution de CRT et de l’activation du stress du RE. L’ensemble de ces stress
sensibilisent les motoneurones à mourir. Enfin, nous avons montré que le stress du RE est un
composant nécessaire dans la mort induite par la diminution de CRT et que c’est la diminution de
CRT qui stimulerait le stress du RE et la mort des motoneurones.
133
Résultats
Nos résultats montrent que les niveaux de CRT peuvent moduler la vulnérabilité des motoneurones
SLA en activant le stress du RE, et conduire à une mort sélective de ces cellules.
134
Résultats
II) Article scientifique sur la Calréticuline
Reduced calreticulin levels link ER stress and Fas-triggered cell death in motoneurons
vulnerable to ALS
Nathalie Bernard-Marissal1, Anice Moumen1, Claire Sunyach1, Christophe Pellegrino2, Keith
Dudley1, Christopher E. Henderson3, Cédric Raoul1 and Brigitte Pettmann1*
1. INSERM-Avenir team, The Mediterranean Institute of Neurobiology, INMED Marseille Cedex
09, France.
2. The Mediterranean Institute of Neurobiology, INMED, Marseille Cedex 09, France.
3. Center for Motor Neuron Biology and Disease, Columbia Stem Cell Initiative, Depts.
Pathology, Neurology and Neuroscience, Columbia University Medical Center, New York, NY
10032, USA.
*Corresponding author:
Brigitte Pettmann, PhD
INSERM-Avenir team, The Mediterranean Institute of Neurobiology,
INMED
163, route de Luminy
13273 Marseille Cedex 09, France
Phone: (33)491828198
Fax: (33)491828105
e-mail: [email protected]
Running title: CRT reductions drive motoneuron death in ALS
Number of characters excluding Material and Methods and references: 39 421
135
Résultats
ABSTRACT
Cellular responses to protein misfolding could play key roles in neurodegeneration. In the mutant
superoxide dismutase (mSOD1) model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), selective vulnerability
of motoneurons subsets has been correlated to ER stress and activation of the motoneuron-specific
Fas/NO pathway but how these mechanisms are related remained unclear. We show that Fas
activation leads, specifically in mSOD1 motoneurons, to decreased levels of calreticulin (CRT), an
ER chaperone. Reduction in CRT is necessary and sufficient to trigger mSOD1 motoneuron death
through the Fas/NO feedback-loop. In mSOD1 mice, reductions in CRT are restricted to vulnerable
motoneurons and precede muscle denervation. In vitro, Fas acts through reduced CRT to trigger the
ER stress required for death of vulnerable mSOD1 motoneurons. Our data reveal CRT as a critical
link between a motoneuron-specific death pathway and the ER stress response and point to a role
for CRT levels in modulating motoneuron vulnerability to ALS.
136
Résultats
INTRODUCTION
Protein misfolding and the cellular response and stress pathways it triggers are emerging as
common themes in the study of neurodegenerative disease (Frost and Diamond, 2010). Misfolding
may be caused by genetic mutations or may occur in response to external stressors or intracellular
pathways. Mechanisms of cellular homeostasis initially compensate for such changes but
progressively become unable to cope, leading to activation of catastrophic unfolded protein
responses that trigger degeneration (Roth and Balch, 2011). A model was recently proposed in
which multiple stressors converge to generate instability of proteostasis through vicious cycles of
cell stress and protein misfolding (Saxena and Caroni, 2011). However, the mechanisms through
which specific stressors interact with cellular stress pathways to generate neuronal class-specific
degeneration remain to be determined.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by the
selective loss of both upper and lower motoneurons in the cortex and spinal cord (Wijesekera and
Leigh, 2009). Most patients present with a sporadic form of the disease (sALS), but much of our
knowledge of the cellular and molecular pathogenic mechanisms comes from the study of familial
forms, which constitute ~10% of all cases. Approximately 20% of familial forms are caused by
dominant mutations in superoxide dismutase 1 (SOD1). Since ALS-causing point mutations are
found throughout the protein, it seems likely that protein misfolding plays a critical role in triggering
the disease (Wang et al., 2008) and indeed misfolding of wildtype SOD1 induced by external
stressors has been proposed to play a role in sporadic ALS (Bosco et al., 2010). Yet patients can
survive for decades without apparent clinical signs until the onset of a rapid, devastating
degenerative process, implying that a threshold of other causal factors needs to be reached
(Saxena and Caroni, 2011). Transgenic mice overexpressing mutant forms of SOD1 (mSOD1)
develop a motor neuron disease closely resembling ALS (Bruijn et al., 2004), reflecting both cellautonomous and non-autonomous toxic effects of mSOD1 (for review, (Boillee et al., 2006).
Moreover, the sequence of cellular events leading to motoneuron degeneration has been relatively
137
Résultats
precisely mapped (Kanning et al., 2010). However, the molecular pathways downstream of mSOD1
that regulate the specificity and timing of the disease process remain to be determined.
Mechanistic insights may be gained from the use of cellular models provided that conclusions are
validated in disease models in vivo. As one example, we reported that purified embryonic
motoneurons from mSOD1 mice display exacerbated susceptibility to death through a motoneuronspecific pathway induced by activation of the Fas/CD95 death receptor (Raoul et al., 2002; Raoul et
al., 1999). We further demonstrated that nitric oxide (NO), a downstream effector of Fas activation in
motoneurons, increases the expression of FasL and thereby leads, in mSOD1 motoneurons but not
in controls, to further production of NO in a vicious cycle (Raoul et al., 2006). This Fas/NO feedback
loop appears to play a role in disease in vivo since all elements of the pathway are misexpressed
before the onset of symptoms in mSOD1 mice in a Fas-dependent manner (Bendotti et al., 2004;
Kiaei et al., 2007; Locatelli et al., 2007; Raoul et al., 2006; Wengenack et al., 2004) and survival of
mSOD1 mice is extended by crossing with Fas ligand (FasL)-deficient (gld) mice (Petri et al., 2006)
or by intrathecal administration of small interfering RNA to Fas (Locatelli et al., 2007). The
observation that the Fas/NO pathway seems to be motoneuron-specific provides one potential
explanation for the selectivity of ALS pathology. However, the mechanism through which mSOD1
motoneurons are sensitized 10- to 100-fold to FasL/NO has not been elucidated, and it is not clear
whether this is an amplification of the pathway used by wildtype neurons or whether it involves a
new, disease-specific signaling pathway.
In parallel, studies of post mortem tissue from sporadic ALS patients and mSOD1 mice have
highlighted the potential role of endoplasmic reticulum (ER) stress in ALS pathogenesis (Atkin et al.,
2008; Ilieva et al., 2007; Kikuchi et al., 2006). ER stress is triggered when misfolded or unfolded
proteins accumulate in the lumen, leading to an unfolded protein response which, if excessive, can
trigger apoptosis (Breckenridge et al., 2003; Oyadomari and Mori, 2004; Rao et al., 2004). At early
presymptomatic stages in mSOD1 mice, high levels of chronic ER stress are restricted to subsets of
motoneurons known to be selectively vulnerable in ALS (Saxena et al., 2009). In accordance with a
functional role for ER stress in the degenerative process, treatment of mSOD1 mice with salubrinal,
an agent that can prevent the unfolded protein response, confers significant protection on
138
Résultats
vulnerable motoneurons. Nevertheless, given that mSOD1 is expressed at high levels in all cell
types, it remains unclear why an ER stress response should selectively occur in a subset of fastfatigable motoneurons and why these should subsequently prove more vulnerable.
Correct protein folding in normal conditions is assured by a complex array of molecular chaperones
and folding catalysts. Among these are calnexin and calreticulin, which interact with the protein
disulfide isomerases in the quality control of asparagine-linked glycoproteins (Rutkevich and
Williams, 2011). Calreticulin (CRT) is a calcium-binding chaperone protein found mainly in the
lumen of the ER (Smith and Koch, 1989). CRT shows a low affinity and a high binding capacity for
calcium and so increased levels of CRT raise the calcium storage capacity of the ER (Michalak et
al., 1999). CRT is thought to play an important role in quality control during protein synthesis and
folding (Hebert et al., 1996). Two strains of CRT knockout mice have been generated (Mesaeli et
al., 1999; Rauch et al., 2000), and in both cases, embryonic lethality is observed at 14.5 due to
defects in the developing hear, and present exencephaly in some cases. Perhaps because of these
central roles in cell metabolism, variations in CRT levels have negative consequences for cell
viability: fibroblasts cultured from homozygous crt-/- embryos activate ER stress (Knee et al., 2003),
while overexpression of CRT in the heart leads to cardiac block and sudden death (Nakamura et al.,
2001). Despite some observations of decreased CRT expression in neurons in several in vivo
pathological conditions, Alzheimer’s disease (Taguchi et al., 2000) or Parkinson’s disease (Lessner
et al., 2010), no study has specifically addressed the role of CRT in the nervous system.
We recently used an unbiased proteomic approach to identify molecular changes that occur
selectively in mSOD1 motoneurons in response to activation of the Fas/NO pathway, and therefore
might explain the exacerbated sensitivity of ALS model motoneurons to Fas/NO-triggered cell death
(Duplan et al., 2010). One of the very few changes detected was a 2-fold reduction in the levels of
CRT. We show here that motoneurons derived from mSOD1 embryos and treated with a Fas
activator present a decreased expression of CRT in vitro. The reduction in CRT is an integral part of
the Fas/NO death pathway and is both necessary and sufficient to trigger death of ALS-mutant
motoneurons. Moreover, a similar reduction occurs in vivo in presymptomatic mSOD1 mice and is
restricted to vulnerable motoneuron pools. Lastly, reductions in CRT trigger an ER stress response
139
Résultats
that occurs only in vulnerable mSOD1 motoneurons and is sufficient to explain their exacerbated
sensitivity to activation of the Fas/NO pathway. Our data reveal CRT as a critical link between the
ER stress response and a motoneuron-specific cell death pathway and suggest that modulating
CRT levels may in the future confer benefit in ALS patients.
RESULTS
Activation of the Fas/NO pathway in mSOD1 motoneurons leads to reductions in levels of
calreticulin
We sought to identify molecular changes responsible for the increased sensitivity of ALS mutant
motor neurons to death induced by Fas. In an earlier study (Duplan et al., 2010) we used 2D gel
electrophoresis and peptide sequencing to identify proteins whose levels change when primary
cultures of SOD1G85R motoneurons are exposed for 24 hr to the NO donor DETANONOate, which is
known to activate the Fas pathway in motor neurons and to kill half of them after 48 hr. One such
protein, reported in Supplementary Table 1 in (Duplan et al., 2010) but not further studied in that
paper, was calreticulin (CRT). Spot volumes for CRT expressed as a percentage of the signal for
untreated wildtype cultures did not differ significantly between untreated wildtype (100 ± 18; mean ±
SD, n=4) and untreated mSOD1 neurons (95 ± 18). In contrast, exposure to NO led to a 2-fold
reduction in CRT levels in mSOD1 (48 ± 17) but not in wildtype (132 ± 20) motoneurons. To
ascertain whether NO was acting as expected through activation of the Fas/NO feedback loop, we
exposed embryonic motoneurons to soluble Fas ligand (sFasL) for 24 hr and subsequently
performed quantitative immunocytochemistry for CRT. Like NO, sFasL triggered a 2-fold decrease
in CRT levels in SOD1G93A motor neurons but not in controls (Fig. 1A, B). This result was confirmed
by Western blot analysis (Fig. 1C, D). Moreover, the decrease in CRT induced by sFasL was
blocked by treatment with an inhibitor of NO synthase (Supplementary Fig. 1A). These results
demonstrate that activation of the Fas/NO cell death pathway in ALS model motoneurons triggers a
reduction in levels of CRT.
140
Résultats
We next asked whether CRT reduction was specific to mSOD1 models and the Fas/NO pathway.
Similar reductions were observed using motoneurons expressing either of two different ALS-linked
SOD1 mutations (SOD1G93A or SOD1G85R) but not non-transgenic (wildtype) motoneurons or those
expressing the wildtype form of human SOD1 (SOD1WT) (Fig. 1E). Strikingly, the reduction was
specific to motor neurons: cultures of cortical or hippocampal neurons from mSOD1 mice did not
show any reduction in CRT expression when treated with NO (Fig. 1F). Moreover, changes were
specific to the Fas pathway. LIGHT is a member of the TNF family that induces motoneuron death
through a mechanism distinct from that of Fas (Aebischer et al., 2011); it did not modify CRT
expression in mSOD1 neurons (Fig. 1B). Similarly, death induced by absence of trophic factors was
not accompanied by reductions in CRT (Supplementary Fig. 1B). Lastly, levels of another ERresident protein, protein disulfide isomerase (PDI), were increased rather than decreased in sFasLtreated SOD1G93A motoneurons (Fig. 1G). Therefore, one selective effect of activation of the Fas/NO
pathway - to which mSOD1 motoneurons show an exacerbated response - is down-regulation of the
ER chaperone CRT.
Reduced levels of CRT are sufficient to trigger motoneuron death through activation of the
Fas/NO pathway
It remained possible that reduced CRT levels were a secondary effect of Fas activation unrelated to
the death pathway. We therefore asked whether reduced levels of CRT expression are alone
sufficient to induce motoneuron death.
As a first approach, we knocked down CRT expression using RNA interference. We evaluated two
shRNAs to mouse CRT (sh1 and sh2) as well as a control, an shRNA to human osteonectin (shcontrol). Motoneuron-like NSC34 cells were co-transfected with each shRNA together with an
EGFP- expressing plasmid to identify transduced cells. Western blot analysis revealed a 25-50%
reduction in expression levels using the two shRNAs whereas no inhibition was observed with the
control shRNA (Supplementary Fig. 2A, B). Accordingly, immunolabeling intensity for CRT was
diminished by ~40% in motoneurons electroporated with sh1-CRT but not with sh-control
(Supplementary Fig. 2C, D).
141
Résultats
To determine whether reductions in CRT affect survival, motoneurons were electroporated with
each shRNA together with the EGFP plasmid and seeded in medium containing neurotrophic
factors. At 24 hr and 48 hr of culture the numbers of EGFP-positive motoneurons present were
expressed relative to values at the same time point for motoneurons electroporated with the EGFP
plasmid alone. Treatment with either sh1-CRT or sh2-CRT led to a ~ 50% decrease in survival,
concomitant with the degree of reduction in CRT levels (Fig. 2A). Treatment with sh-control did not
affect survival at either time point. However, it remained possible that the altered survival reflected
off-target effects of the shRNAs to CRT. We therefore isolated motoneurons from E12.5 embryos of
heterozygous calreticulin+/- (crt+/-) mice and wildtype littermates (Mesaeli et al., 1999). Even in the
presence of neurotrophic factors, crt+/- motoneurons showed a 20% decrease in survival compared
to wildtype after 24h, and a 40% decrease after 48h (Fig. 2B). Therefore, like Fas activation,
reduction of CRT levels can trigger motoneuron death even in the presence of an optimal cocktail of
survival factors.
Since CRT reduction is downstream of Fas/NO activation, it was possible that motoneuron death in
these conditions occurred through a different mechanism. However, since the Fas/NO pathway is a
self-amplifying loop, it was also possible that low CRT acted through activation of Fas. To
distinguish between these possibilities, CRT was silenced in motoneurons and cells were treated or
not with Fas-Fc, a soluble dominant-negative form of Fas that blocks activation of Fas by FasL.
Strikingly, Fas-Fc prevented most of the death induced by CRT knockdown after 48 hr (Fig. 2C).
Moreover, we found that reductions in CRT led to an increase in FasL immunoreactivity in
transduced motoneurons (Fig. 2D). These data point to a key role for decreased CRT expression in
the Fas/NO amplification loop, the diminution of CRT expression leading to upregulation of FasL
which in turn activates Fas, leading to a further decrease in CRT expression.
These findings suggested that the reduction in CRT might be essential for activity of the Fas/NO
loop to reach levels sufficient for cell killing. To test this directly, we studied the response to Fas
activation of motoneurons in which CRT was kept artificially high. SOD1G93A and wildtype
motoneurons were electroporated with a plasmid encoding mouse CRT tagged with hemagglutinin
(CRT-HA) or an empty vector control, together with an EGFP plasmid to identify electroporated
142
Résultats
motoneurons. Expression of CRT-HA was confirmed by motoneuron immunostaining (Fig. 2E).
Twenty-four hours after seeding, to allow time for CRT expression, cells were treated or not with
sFasL (or NO; Supplementary Fig. 2E) and survival was assessed 48 hr later by counting EGFPpositive motoneurons. Overexpression of CRT prevented death of ~60% of the SOD1G93A
motoneurons that were lost following sFasL treatment of controls (Fig. 2F). Unexpectedly, however,
raising CRT had no effect on the FasL-induced death of wildtype motoneurons (Fig. 2F). Two
conclusions could be drawn from these findings. First, the reduction in CRT is an integral part of the
Fas/NO death pathway and is both necessary and sufficient to trigger death of ALS-mutant
motoneurons through this feedback loop. Second, the cell death mechanism downstream of Fas in
mSOD1 motoneurons is distinct from, not just a simple amplification of, the death pathway through
which Fas kills wildtype motoneurons. This suggested that cellular events caused by low CRT may
be specific to ALS.
CRT expression is reduced in mSOD1 motoneurons in vivo before symptom onset
To strengthen the links to the disease, it was essential to confirm that CRT expression was also
modulated in mSOD1 mice in vivo. CRT levels were first assessed by double staining of lumbar
spinal cord sections for CRT and NeuN (labels all α-motoneurons) (Fig. 3A and Supplementary
Fig. 3), and CRT levels were calculated as ratios of CRT to NeuN fluorescence intensities. In
SOD1G93A mice, CRT levels at PND30 were identical to those in non-transgenic controls (wildtype).
Subsequently, starting at PND38, before overt symptoms can be detected, there was a two-fold
diminution in CRT expression that persisted to symptomatic stages (110 days) (Fig. 3B). Similar
results were obtained using SOD1G85R mice at symptomatic stages (350 days), whereas no
diminution was observed in SOD1WT mice (Fig. 3B). An overall reduction in CRT levels was also
detected by Western blot analysis of ventral spinal cord (Fig. 3C, D). These observations were
specific to motoneurons and CRT: levels in dorsal spinal interneurons at lumbar levels remained
high in mSOD1 mice (not shown), and levels of calnexin, another ER resident chaperone protein,
did not change in motoneurons (Fig. 3D). Thus, as in Fas-treated motoneurons in vitro, CRT
143
Résultats
downregulation in vivo is a selective response of motoneurons to expression of ALS-linked SOD1
mutants.
Reductions in CRT levels in vivo are restricted to ALS-vulnerable motoneurons
The fact that there was only partial loss of CRT in ALS motoneurons could reflect an overall 50%
decrease in expression levels or could indicate a diversity of the response in different motoneuron
populations. We compared different spinal levels and found that the diminution in CRT expression
was not observed in thoracic motoneurons of the mSOD1 spinal cord (Supplementary Fig. 1C).
The CRT change therefore seemed potentially limited to limb-innervating motoneurons, which are
known to be more vulnerable to ALS.
Even at lumbar levels, however, the loss of CRT was not complete, suggesting that different motor
pools might respond in different ways. Within the lumbar spinal cord, motoneurons innervating fast
fatigable muscles such as the tibialis anterior have been shown to be more vulnerable in SOD1G93A
mice than those innervating predominantly slow muscles such as the soleus (Frey et al., 2000; Pun
et al., 2006). We therefore asked whether the CRT decrease was restricted to vulnerable
motoneurons. Vulnerable and resistant motoneurons were retrogradely labeled by injecting PND30
wildtype or SOD1G93A mice with tetramethyl rhodamine dextran (TRITC-dextran) into the tibialis
anterior and soleus muscles, respectively. Eight days later (PND38), sections of spinal cord were
co-stained for CRT and NeuN and levels of CRT relative to NeuN were measured only in
retrogradely labeled neurons (Fig. 4A, B). Soleus motoneurons showed CRT levels that were
indistinguishable between non-transgenic and SOD1G93A mice (Fig. 4B). In contrast, levels of CRT
in vulnerable tibialis anterior motoneurons were reduced by 60% (Fig. 4B). As a positive control, we
checked (Supplementary Fig. 4) that P-eIF2a expression was increased specifically in vulnerable
motoneurons (Saxena et al., 2009). There is therefore a close correlation between decreased CRT
expression and vulnerability of motoneurons in SOD1G93A mice. Moreover, the reduction in CRT
precedes the axonal die-back that is the first morphological sign of degeneration in the vulnerable
populations.
144
Résultats
Defective calcium handling contributes to vulnerability of mSOD1 motoneurons to Fas/NOinduced death
We next considered how reductions in CRT might contribute to selective degeneration of
motoneurons expressing mSOD1. One key function of CRT is to maintain calcium homeostasis
(reviewed by (Verkhratsky, 2002)). We therefore first determined whether calcium handling was
modified in mSOD1 versus wildtype motoneurons treated or not with sFasL (100 ng/ml). Following
treatment for 3 hr with sFasL, cells were loaded with Fura-Red AM (see Methods) and fluorescence
intensity ratios F490/F440 were monitored before, during and after a brief (8 s) pulse of 25 mM KCl
to estimate Cai (Fig. 5A, B). We detected no significant difference between wildtype and mSOD1
motoneurons in their response to the KCl stimulus (Fig. 5D) or in the rate to return to basal levels
(Fig. 5E) suggesting that the cells were in good health. Both wildtype and mutant motoneurons
showed increases in the basal level of intracytoplasmic calcium following 3 hr of treatment with
sFasL. However, not only was the basal Cai level higher in SOD1G93A neurons but the increase in
Cai triggered by sFasL was 2-fold greater (Fig. 5C). The reduction in CRT may therefore amplify the
consequences of calcium homeostasis defects.
To determine whether the altered calcium homeostasis plays a functional role in motoneuron
vulnerability, motoneurons were cultured with or without 5 μg/ml BAPTA-AM, a cytoplasmic calcium
scavenger. BAPTA-AM did not affect the death of wildtype motoneurons treated with sFasL (100
ng/ml) but completely inhibited the death of mSOD1 motoneurons in the same conditions (Fig. 5F).
These results suggested that a supra-threshold increase in calcium might explain the increased
sensitivity of mSOD1 motoneurons to Fas activation. We reasoned that if this was correct, inducing
calcium release from the ER should be sufficient to trigger death of wildtype motoneurons exposed
to a low dose of sFasL normally only sufficient to kill mutant neurons. Wildtype motoneurons were
treated with caffeine, which depletes ER calcium stocks, in the presence or not of sFasL (1 ng/ml).
Induced calcium release from the ER indeed conferred enhanced sensitivity to Fas on wildtype
motoneurons (Fig. 5G). Our data suggest that although Cai increases following multiple treatments,
a threshold level is required to trigger death. This is reached in mSOD1 but not wildtype
145
Résultats
motoneurons exposed to Fas agonists and reflects a failure of wildtype motoneurons to release
calcium from the ER to the same degree.
ER stress contributes to enhanced vulnerability of mSOD1 motoneurons to Fas activation
Impairment of CRT function in other cell types leads to less efficient protein folding (Molinari et al.,
2004) and CRT-deficient fibroblasts activate PERK-dependent ER stress signaling pathways (Knee
et al., 2003). We therefore tested the hypothesis that ER stress could, as in vulnerable motoneurons
in vivo (Saxena et al., 2009), contribute to the increased susceptibility of mSOD1 motoneurons to
Fas activation.
We first determined whether treatment of cultured motoneurons with sFasL leads to ER stress as
revealed by two markers: phospho-eIF2α (phosphorylated following PERK activation) and CHOP
(transcribed following PERK activation). As a positive control, thapsigargin treatment of wildtype
neurons induced strong increases in levels of both (Fig. 6B, C). Levels of ER stress markers were
equivalent in untreated wildtype and mSOD1 motor neurons. When wildtype motoneurons were
treated for 16 hr with sFasL at 100 ng/ml, a concentration sufficient to trigger their subsequent
death, no increase in ER stress was detected (Fig. 6A-C). In contrast, exposure of SOD1G93A
motoneurons to the same concentration of sFasL clearly exacerbated ER stress (Fig. 6A-C). ER
stress is therefore not a general response of motoneurons to Fas signaling but is activated
selectively in mSOD1 motoneurons.
This suggested that the differential in the sensitivity of mSOD1 motoneurons to Fas/NO might reflect
a
functional
contribution
of
ER
stress.
Accordingly
salubrinal,
which
inhibits
eIF2α
dephosphorylation and therefore ER stress responses, provided strong protection against mSOD1
motoneuron death induced by Fas, but did not affect survival of wildtype motoneurons in the same
conditions (Fig. 6D). Similarly selective protection of mSOD1 neurons was provided by ATAD, an
inhibitor of caspase-12 (implicated in ER stress) and by MDL, an inhibitor of calpains (which cleave
caspase-12) (Figs. 6D and Supplementary Fig.1D). Thus ER stress can account for a significant
part of the exacerbated vulnerability of mSOD1 motoneurons to Fas activation.
146
Résultats
These data suggested that the lower sensitivity of wildtype neurons to Fas/NO reflects their failure
to activate ER stress. We therefore asked whether an ER stress inducer could mimic the effect of
mSOD1 expression on Fas vulnerability. We treated wildtype motoneurons with low-dose sFasL (1
ng/ml) in the presence or not of the ER stress inducers tunicamycin or thapsigargin. These were
added at concentrations that are alone insufficient to trigger death but capable of inducing ER stress
(data not shown). Strikingly, induction of a mild ER stress in wildtype motoneurons renders them
100-fold more susceptible to sFasL-induced death (Fig. 6E). Thus the ER stress response to Fas
activation in the presence of mSOD1 is sufficient to explain the exacerbated sensitivity of ALS
model motoneurons to activation of the Fas/NO pathway.
Reductions in CRT act through induction of ER stress to trigger death of mSOD1
motoneurons
Our results thus far showed that activation of Fas triggers a diminution of CRT and an increase in
ER stress only in mSOD1 motoneurons and that these events lead to the selective vulnerability of
ALS model motoneurons. Both changes occurred early (16 hr of sFasL treatment) but the relation
between the two remained unclear. To determine whether the CRT decrease was a consequence of
ER stress activation or vice versa, we asked whether the ER stress inhibitor salubrinal could prevent
the death of motoneurons induced by reduced CRT. We used two approaches to decrease CRT
levels – shRNA to CRT or motoneurons from crt+/- embryos – and showed that salubrinal was
indeed able to prevent cell death in both conditions (Fig. 7A, B). Thus activation of ER stress is
necessary for death induced by reduced CRT.
We next asked whether, conversely, reductions in CRT were potentially involved in death induced
by ER stress. To induce ER stress in vitro, we used the combined treatment of wildtype
motoneurons with sub-lethal sFasL and tunicamycin shown to lead to motoneuron death (Fig. 6E).
No reduction in CRT levels was detected (Fig. 7D). We also used sciatic nerve crush in one monthold mice to induce ER stress in motoneurons in vivo (Saxena et al., 2009). Three days after nerve
crush, ER stress monitored by BiP expression was clearly induced in motoneurons, but no decrease
in CRT expression was observed (Fig. 7E, F). Thus ER stress, which is itself sufficient to confer
147
Résultats
increased vulnerability on motoneurons, does not require CRT reduction in order to exert its effects
on survival.
These data suggested that ER stress was downstream of CRT reduction. To further examine this
we studied whether blocking ER stress in FasL-treated SOD1G93A motoneurons with salubrinal
would prevent the decrease in CRT expression. This was not the case (Fig. 7C). Thus, in ALS
model motoneurons, activation of the Fas pathway leads to reductions in CRT which in turn lead to
ER stress. Each element of this pathway is necessary and sufficient to explain the exacerbated
vulnerability of mSOD1 motoneurons to this death mechanism.
DISCUSSION
Our data suggest a unifying hypothesis to explain the selective loss of vulnerable populations of
motoneurons in the most widely studied animal model of ALS (Fig. 8). In mSOD1 but not wildtype
motoneurons, activation of the motoneuron-specific Fas/NO pathway leads to reductions in levels of
the ER chaperone calreticulin. Reductions in CRT in turn trigger two processes. First, they lead to
further activation of Fas signaling through upregulation of Fas ligand, creating a self-amplifying
vicious cycle. Second, they activate an ER stress response that, both in vitro and in vivo, plays a
critical role in triggering degeneration and death of vulnerable motoneurons. This model explains
the hypersensitivity of mSOD1 motoneurons to Fas activation and provides a crucial link between
motoneuron-specific events and ER stress. CRT lies at the fulcrum of the two pathways, suggesting
that if levels of CRT or its effectors can be maintained at normal levels, motoneuron degeneration in
ALS may be slowed.
Reductions in CRT have been previously reported in neurodegenerative contexts. In particular,
laser-captured motoneurons from presymptomatic mSOD1 mice showed a 30% decrease in CRT
mRNA (Perrin et al., 2005) and reduced CRT protein levels are apparent in symptomatic mSOD1
spinal cord (Teuling et al., 2007). Moreover, CRT is down-regulated in cortical neurons of
148
Résultats
Alzheimer’s patient brains (Taguchi et al., 2000) and in striatal neurons of hemiparkinsonian rats
(Lessner et al., 2010). Although no functional studies were carried out, it is striking that ER stress is
activated in all the above contexts (Lee et al., 2010; Lessner et al., 2010; Wang and Takahashi,
2007). Reductions in CRT may therefore play a general role in neurodegeneration.
Indeed, disruption of proteostasis has been proposed to underlie many of these diseases. A recent
stressor-threshold model (Saxena and Caroni, 2011) proposes that intrinsic genetic defects,
extrinsic stressors and instability of cellular homeostasis “combine to produce vicious cycles of
increasing stressor load and misfolding protein accumulation, eventually causing age-related
degeneration in selectively vulnerable neurons”. In genetically-predisposed mSOD1 motoneurons,
we have identified the Fas/NO/CRT pathway as a motoneuron-specific stressor that increases the
ER stress response to a threshold above which motoneurons undergo cell death. Even in the
absence of mSOD1, chronic activation of the Fas/NO feedback loop could lead, by reducing levels
of CRT, to the misfolding of other proteins including wildtype SOD1, which has been postulated to
play a role in sporadic forms of ALS (Bosco et al., 2010).
The mechanism leading to reductions of CRT in vulnerable mSOD1 motoneurons is not known.
Since we could not detect a change in CRT expression in vivo by in situ hybridization (not shown),
we favor the hypothesis of a post-translational decrease. This might potentially involve
mislocalization of CRT. Indeed, mass spectrometry-liquid chromatography analysis of protein
aggregates from end-stage mSOD1 mouse spinal cords revealed the presence of CRT together
with mSOD1, indicating a sequestration of CRT outside the ER (Bergemalm et al., 2010).
Alternatively CRT, as shown for mSOD1 (Urushitani et al., 2006) may be secreted from vulnerable
motoneurons. A mechanism of secretion involving S-nitrosylation of CRT has been described (Tarr
et al., 2010), in a striking parallel with the observation that that S-nitrosylation of PDI activates
mSOD1 aggregation (Walker and Atkin, 2011).
The association of CRT reductions with ER stress provides the first concrete link between the
vulnerability to ALS of distinct subpopulations of motoneurons in vivo and in vitro. In vivo, reduced
levels of CRT in vulnerable motoneurons fit well with lower calcium-buffering capacity of ALS149
Résultats
vulnerable motoneurons (Vanselow and Keller, 2000) and may be sufficient to explain the
upregulation of ER stress selectively in vulnerable motoneurons (Saxena et al., 2009). In vitro,
primary motoneuron cultures contain two populations with distinct susceptibility to ALS: the 50%
whose death is triggered by LIGHT, and the other half that are sensitive to the Fas/NO pathway
(Aebischer et al., 2011). Unlike the Fas-responsive subpopulation, motoneurons targeted by LIGHT
do not show altered properties when isolated from mSOD1 mice (Aebischer et al., 2011) and do not
show reduced CRT (Fig. 1b). Therefore, although it would be premature to assign presumptive
functional phenotypes to cultured embryonic motoneurons in vitro, it is striking that Fas-sensitive
motoneurons in vitro and FF motoneurons in vivo have in common a selective propensity to downregulate CRT and up-regulate ER stress in the presence of mSOD1. Our in vitro data suggest that a
qualitative difference sets them apart from more resistant populations (Fig. 8), potentially increasing
the chances of selective therapeutic intervention.
Blocking ER stress by salubrinal treatment delayed onset and extended survival of mSOD1 mice by
~20% (Saxena et al., 2009), but side effects of salubrinal may have diminished the final impact of
the treatment. There is likely a need to intervene more specifically in this pathway in motoneurons.
Our data suggest that correcting the down-regulation of CRT should be beneficial in ALS and
perhaps other neurodegenerative diseases, and raise the possibility that CRT and its effectors may
be potential therapeutic targets. However, CRT presents obvious challenges as a target since its
ubiquitous overexpression has been shown to provoke heart block in mice (Nakamura et al., 2001).
An alternative might be to express CRT selectively in neurons. However, our attempts to produce a
viral vector overexpressing CRT to evaluate functional benefit in mSOD1 mice in vivo have
encountered hurdles linked to cytotoxicity (not shown), suggesting that levels would need to be very
precisely maintained.
A more promising long-term strategy might therefore to intervene in the
process through which CRT is down-regulated. Despite these challenges, the identification of this
ALS-specific pathway linking motoneuron degeneration to ER stress generates multiple candidate
targets for future validation.
MATERIAL AND METHODS
150
Résultats
Animals
All animal experiments were performed in compliance with the European and national directives for
the care and use of laboratory animals. CD1 mice were purchased from Jackson laboratories,
transgenic mice expressing mutant G85R (SOD1G85R) and wild-type human SOD1 (SOD1WT) were
kindly provided by Prof. D. Cleveland (University of California at San Diego, La Jolla, CA) and Prof.
S. Przedborski (Columbia University, New York, NY) respectively; transgenic mice for mutant G93A
(SOD1G93A) were obtained from Transgenic Alliance. SOD1G85R (line 148) (Bruijn et al., 1997) and
SOD1WT mice (line 76) (Wong et al., 1995) were maintained as hemizygotes by crossing transgenic
males with non-transgenic females of the same C57BL/6 genetic background. SOD1G93A mice (line
G1H) (Gurney et al., 1994) were maintained as hemizygotes by crossing transgenic males with nontransgenic females of the same B6/SJL genetic background (Jackson laboratories). Offspring were
genotyped by separate PCR reactions for human SOD1 (Raoul et al., 2002), for exon 3 (PCR
primers: 5-TTCTGTTCCCTTCTCACTGT and 5-TCCCCTTTGGCACTTGTATT) and exon 5 (primers
TGTTGGGAGGAGGTAGTGATTA and 5-AGCAGAGTTGTGTTAGTTTTAG). In each PCR reaction,
the mouse globin gene was amplified with primers 5-GATCATGACCGCCGTAGG and 5CATGAACTTGTCCCAGGCTT. During the PCR for embryos genotyping (3h), embryos were kept at
4°C in Hibernate E medium (Invitrogen).
Mice deficient for calreticulin (calreticulin+/-, C57BL/6 x CD1 background) were kindly provided by
Prof. M. Michalak (University of Alberta at Edmonton). The crt+/-line was maintained as
hemizygotes by crossing transgenic males crt+/- with crt+/- females, the homozygous deletion being
embryonic lethal (Mesaeli et al., 1999). Offspring were genotyped by PCR for the NEO cassette
using the following primers:
Sense: 5-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT–3,
Antisense: 5-CGCGGATCCACCTCCCATGACAGCCATTTA – 3.
151
Résultats
Neuron cultures
Motoneuron cultures were prepared from E12.5 mice embryos as described previously (Raoul et al.,
2002). Briefly, cells were dissociated mechanically after trypsin treatment of the dissected spinal
cords. The largest cells were isolated using iodixanol density gradient purification. After a final BSA
cushion, motoneurons were plated onto poly-ornithine-laminin coated wells in supplemented
Neurobasal (Invitrogen) medium in the presence of a cocktail of neurotrophic factors (“NTFs”, 1
ng/mL BDNF, 100 pg/mL GDNF and 10 ng/mL CNTF), completed with 2% Horse serum, B27
supplement (Invitrogen), 0.05 mM L-glutamine, 25 µM L-glutamate, 25 µM β –Mercaptoethanol.
Hippocampal and cortical neurons were respectively prepared from E17.5 and E15.5 embryos from
transgenic mSOD1 and control mice. Neurons were dissociated mechanically after trypsin treatment
and plated onto poly-ornithine-laminin coated wells in Neurobasal complemented with 1 mM
glutamine and 2% B27 (Invitrogen).
For immunocytochemistry experiments, motoneurons in culture were generally treated 24 hours
after seeding and fixed 16 to 24h after. For survival assays, motoneurons were counted 48h after
treatment. Wherever indicated, motoneurons were electroporated before plating with DNA plasmids.
Briefly, cell pellets, obtained after the last centrifugation on a BSA cushion, were resuspended in an
electroporation buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 1.5 mM MgCl2, 10 mM glucose, 20 mM HEPES;
pH 7.4) at a density of 50,000 cells for 100 µl and 8 µg of plasmid pCCL-Ubc GFP (Langou et al.,
2010) with the same molar amount of the plasmid of interest were added. After 15 min of incubation,
motoneurons were transferred to a 4 mm cuvette (Eurogentec) and electroporated using a square
electroporator (BTX) (three pulses of 5ms at 200V with intervals of 1s).To evaluate motoneuron
survival, we used the following reagents: soluble Fas ligand (sFasL) and enhancer antibodies, FasFc, DETANONOate, L G-Nitro-L-arginine-methyl ester HCI (L-NAME) and L G-Nitro-D-argininemethyl ester-HCI (D-NAME), were purchased from Alexis Biochemical. Thapsigargin was purchased
from Calbiochem (San Diego CA, USA), Tunicamycin, and caffeine were from Sigma (St Louis, MO
USA).
Salubrinal
and
1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic
acid
152
Résultats
tetrakis(acetoxymethyl) ester (BAPTA/AM) were from Alexis Corporation (San Diego CA, USA), and
z-Ala-Thr-Ala-Asp(OME)-fmk(z-ATAD-fmk) was purchased from MBL international corporation
(Woburn, MA, USA).
NSC34 cells (Cashman et al., 1992) were maintained in Dulbecco Modified Eagle Medium
(Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum. The transfection of NSC-34 cells was
performed with the lipofectamine 2000 (Invitrogen), the ratio ADN/ lipofectamine was 1µg/2.5 µL
lipofectamine.
Expression vectors
An expression vector coding for CRT was PCR amplified from pCMV-sport6.1 (Open Biosystem) to
introduce FLAG/HA tags and cloned into the pcDNA3.1 vector with the following primers:
5-ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGCTCCTTTCGGTGCCGCTCC-3 (forward) and
5-TTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCAACAGCTCATCCTTGGCTTGG-3 (reverse). For coelectroporation and co-transfection, we used a pUbc-enhanced green fluorescent protein (EGFP)
(Langou et al., 2010), together with shRNA against calreticulin (sh1-CRT and sh-2-CRT) in plKO.1
vectors under the human U6 promoter, provided by Sigma). The shRNA control was also from
Sigma and targets a human gene (SPOCK) that does not cross-react with the mouse gene.
Immunocytochemistry
Cells were cultured at a density of 3,000 cells/well then fixed at indicated times with 4%
paraformaldehyde for 20 min at 4°C. Cells were washed 3x with PBS and blocked in PBS - 4%
Bovine serum albumin (BSA) - 4 % heat-inactivated goat serum, 0.1 % Triton for 1 hour and
incubated at 4°C overnight with one of the following primary antibodies: rabbit anti-calreticulin 1/500
(SPA 600, Stressgen), rabbit anti-calreticulin 1/1000 (PA3 900, ABR), mouse anti-Protein Disulfide
Isomerase (PDI) 1/250 (SPA 891, Stressgen), mouse anti- non-phosphorylated neurofilament H
(SMI32) 1/500 (Covance), rabbit anti-GADD 153 (F-168): sc-575 (CHOP) 1/150 (Santa Cruz), rabbit
anti-Phospho-eIF2α (Ser51) 1/200 (Cell Signaling), rabbit anti-EGFP 1/1000 (TP401, Torrey Pines
Biolabs (East Orange, NJ, USA).
153
Résultats
Cells were washed 3x with PBS, then incubated with the appropriate secondary antibody
(Invitrogen), washed 3x with PBS, stained with DAPI to visualize nuclei 1/10,000 (Sigma-Aldrich)
and mounted in Mowiol (Sigma) solution. Cells were observed under a LEICA DM IRB inverted
fluorescence microscope and images captured with a KAPPA camera. For immunoquantification
experiments, cell images were taken with a confocal Olympus (Tokyo, Japan) BX50WI laser
scanning microscope using a 40x objective and fluorescence was analysed using either ImageJ or
Metamorph softwares.
Immunohistochemistry
Mice were anaesthetized then perfused transcardiacally with PBS followed by paraformaldehyde
4% in PBS and the spinal cords were dissected out. After 5 hours of incubation in PFA 4%, spinal
cords were incubated in 25 % sucrose in PBS overnight, then embedded in Optimal Cutting
Temperature compound (OCT, CML). 18 µm thick cryosections were collected onto super plus frost
slides (CML), washed with PBS and incubated with PBS-4% BSA-4 % heat-inactivated goat serum0.1 % Triton for 1-2 hours. Sections were then incubated with the appropriate primary antibodies
overnight: rabbit anti-calreticulin 1/200 (PA3-900, ABR), chicken anti-CRT 1/400 (ab14234 ABCAM),
mouse anti-NeuN 1/600 (Millipore, clone A60), rabbit monoclonal anti-BiP 1/150 (Cell Signaling).
Spinal cord sections were washed 3x with PBS, incubated with the appropriate secondary antibody,
washed 3x with PBS and mounted in Mowiol mounting medium. Motoneurons pictures were taken
with an Apotome Axio Imager Z2 microscope using a 60x objective, immunoquantification was
performed using ImageJ software.
Western blot
Western blots were done on cell lysates from cultured motoneurons (30,000 cells = 5 µg) or NSC34
cells (300,000 cells = 30µg) harvested respectively at 48h (24h after treatment) or 48h after
transfection as well as on lysates from lumbar spinal cord dissected from wildtype or SOD1G93A mice
from 30 to 110 days and SOD1WT or SOD1G85R mice at 350 days. Samples were lysed in a lysis
buffer (50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA and 1% sodium dodecyl
sulfate) supplemented with a protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals,
154
Résultats
Indianapolis, IN, USA). Protein concentration was determined using the BCA kit (Pierce, Rockford,
IL, USA). Protein samples were separated by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel
electrophoresis and blotted to nitrocellulose membranes (Schleicher and Schuell, Whatman
International Ltd,Springfield Mill, UK). After blocking in 5% milk, the following primary antibodies
were used: rabbit anti-calreticulin 1/1,000 (Stressgen) and mouse anti-actin (AC40, Sigma,
1/20,000). After incubation of the blots with horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary
antibodies, proteins were revealed on autoradiograms using the chemiluminescent HRP substrate
(Millipore). Immunoblot images were quantified using the software Image J and normalized relative
to actin levels.
Motoneurons retrograde labeling
Wildtype or SOD1G93A 30-days-old mice were anesthesized with a mixture of Rompun and Imalgene
and then injected in two regions of the tibialis or the soleus muscles with 10µL of Tetramethylrhodamine (3000 MW anionic, lysine, 20 mg/mL fixable in H2O). Mice were anaesthesized, then
perfused with PBS followed by paraformaldehyde 4% in PBS one week later (38 days old) and
bilateral muscles (soleus and tibialis) as well as spinal cords were dissected. 35µm thick sections of
the muscles were cut and immediately examined by fluorescent microscopy to confirm proper
injection sites. 16 µm thick cryosections were collected and immunostained for CRT/NeuN or PeiF2a/NeuN.
CRT, P-eiF2a and NeuN immunofluorescence in Alexa positive neurons was quantified using Image
J software.
Calcium imaging
To monitor quantitative changes of [Ca2+]i in motoneurons we used a Fura-Red acetoxymethyl
ester (AM) dye (Invitrogen) that allows effective ratiometric fluorescence measurement. For dye
loading, coverlips, on which motoneurons were cultured for 24 hours and treated or not with sFasL
(100ng/ml) for three hours, were rinsed with an external solution containing 150 mM NaCl, 2 mM
KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, pH 7.4 and incubated in the same
155
Résultats
solution containing 4µM Fura-Red AM for 30 min in the dark at 20°C, the dye was washed off and
the coverslips reincubated in the dark for a further 60 min at 20°C to allow de-esterification of the
dye. After loading, coverslips were transferred to the stage of an NIKON Diaphot 300 microscope
(20x or 40x long distance lens). To selectively visualize Ca2+ in motoneurons we first focused on
transmitted light and thereafter acquired fluorescent images of Fura-Red. Fura-Red was alternately
excited at 440 (10) nm and 490 (10) nm using a xenon light source (Sutter Instruments, Novato, CA,
USA), and emission collected at 660 (50) nm using a CCD camera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ,
USA). All filters were bandpass with bandwidths indicated in parentheses (Chroma Technology
corp., Bellows Falls, VT, USA). Images were acquired at 5 s intervals and analyzed offline with
SimplePCI software (Hamamatsu). For [Ca2+]i analysis we first drew regions of interest on
motoneurons and then applied these regions of interest for analysis of Fura-Red images. [Ca2+]i
values were presented as the 490/440 nm ratio. During experiments, neurons were continuously
perfused with external solution. Fifteen seconds after beginning the experiment neurons were
activated by a brief (8 s) application of the external solution containing 25 mM KCl (replacing
equimolar amount of NaCl in the external solution), applied via a fast perfusion system. After KCl
application, the cells were perfused with the KCl-free solution for an additional 3 minutes in order to
let them recover.
Sciatic nerve crush
25 day- old BL6/SJL mice were anesthetized and nerve crush was performed as described by
(Magill et al., 2007). Briefly, skin was incised one millimeter posterior and parallel to the femur and
the sciatic nerve was pulled out of the biceps femoris. The sciatic nerve was then crushed for 30
seconds with a No.5 jeweler’s forceps, 5 mm proximal to its trifurcation. Closure of the muscle and
skin was achieved by suturing with a 6-0 nylon thread. Animals were anaesthetized and perfused
two days later; 20µm spinal cord cryosections were performed on the lumbar L3-L5 segments and
immunostained for BiP and calreticulin.
Calreticulin and BiP immunofluorescence was quantified using Image J software.
156
Résultats
Statistical methods
For survival and immunoquantification experiments, differences were evaluated for their statistical
significance by two-tailed, unpaired Student’s T test. Values were expressed as percents ± SD.
For calcium imaging, statistical analysis was performed using the GraphPad Instat software
(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Tests used were based on either parametric (unpaired ttest, Welch corrected) or non-parametric (Mann-Whitney) data depending on the normality test.
Significance was accepted as the level of p< 0.05 (p<0.05 *; p< 0.01 **; p< 0.001 ***).
References
Aebischer, J., P. Cassina, B. Otsmane, A. Moumen, D. Seilhean, V. Meininger, L. Barbeito, B. Pettmann, and C.
Raoul. 2011. IFNgamma triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to
the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death Differ. 18:754-68.
Atkin, J.D., M.A. Farg, A.K. Walker, C. McLean, D. Tomas, and M.K. Horne. 2008. Endoplasmic reticulum stress
and induction of the unfolded protein response in human sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Neurobiol Dis. 30:400-7.
Bendotti, C., C. Atzori, R. Piva, M. Tortarolo, M.J. Strong, S. DeBiasi, and A. Migheli. 2004. Activated p38MAPK
is a novel component of the intracellular inclusions found in human amyotrophic lateral sclerosis and
mutant SOD1 transgenic mice. J Neuropathol Exp Neurol. 63:113-9.
Bergemalm, D., K. Forsberg, V. Srivastava, K.S. Graffmo, P.M. Andersen, T. Brannstrom, G. Wingsle, and S.L.
Marklund. 2010. Superoxide dismutase-1 and other proteins in inclusions from transgenic
amyotrophic lateral sclerosis model mice. J Neurochem. 114:408-18.
Boillee, S., C. Vande Velde, and D.W. Cleveland. 2006. ALS: a disease of motor neurons and their
nonneuronal neighbors. Neuron. 52:39-59.
157
Résultats
Bosco, D.A., G. Morfini, N.M. Karabacak, Y. Song, F. Gros-Louis, P. Pasinelli, H. Goolsby, B.A. Fontaine, N.
Lemay, D. McKenna-Yasek, M.P. Frosch, J.N. Agar, J.P. Julien, S.T. Brady, and R.H. Brown, Jr. 2010.
Wild-type and mutant SOD1 share an aberrant conformation and a common pathogenic pathway in
ALS. Nat Neurosci. 13:1396-403.
Breckenridge, D.G., M. Germain, J.P. Mathai, M. Nguyen, and G.C. Shore. 2003. Regulation of apoptosis by
endoplasmic reticulum pathways. Oncogene. 22:8608-18.
Bruijn, L.I., M.W. Becher, M.K. Lee, K.L. Anderson, N.A. Jenkins, N.G. Copeland, S.S. Sisodia, J.D. Rothstein,
D.R. Borchelt, D.L. Price, and D.W. Cleveland. 1997. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage
to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron.
18:327-38.
Bruijn, L.I., T.M. Miller, and D.W. Cleveland. 2004. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron
degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27:723-49.
Cashman, N.R., H.D. Durham, J.K. Blusztajn, K. Oda, T. Tabira, I.T. Shaw, S. Dahrouge, and J.P. Antel. 1992.
Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev Dyn.
194:209-21.
Duplan, L., N. Bernard, W. Casseron, K. Dudley, E. Thouvenot, J. Honnorat, V. Rogemond, B. De Bovis, P.
Aebischer, P. Marin, C. Raoul, C.E. Henderson, and B. Pettmann. 2010. Collapsin response mediator
protein 4a (CRMP4a) is upregulated in motoneurons of mutant SOD1 mice and can trigger
motoneuron axonal degeneration and cell death. J Neurosci. 30:785-96.
Frey, D., C. Schneider, L. Xu, J. Borg, W. Spooren, and P. Caroni. 2000. Early and selective loss of
neuromuscular synapse subtypes with low sprouting competence in motoneuron diseases. J
Neurosci. 20:2534-42.
Frost, B., and M.I. Diamond. 2010. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci.
11:155-9.
Gurney, M.E., H. Pu, A.Y. Chiu, M.C. Dal Canto, C.Y. Polchow, D.D. Alexander, J. Caliendo, A. Hentati, Y.W.
Kwon, H.X. Deng, and et al. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn
superoxide dismutase mutation. Science. 264:1772-5.
158
Résultats
Hebert, D.N., B. Foellmer, and A. Helenius. 1996. Calnexin and calreticulin promote folding, delay
oligomerization and suppress degradation of influenza hemagglutinin in microsomes. Embo J.
15:2961-8.
Ilieva, E.V., V. Ayala, M. Jove, E. Dalfo, D. Cacabelos, M. Povedano, M.J. Bellmunt, I. Ferrer, R. Pamplona, and
M. Portero-Otin. 2007. Oxidative and endoplasmic reticulum stress interplay in sporadic
amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 130:3111-23.
Kanning, K.C., A. Kaplan, and C.E. Henderson. 2010. Motor neuron diversity in development and disease.
Annu Rev Neurosci. 33:409-40.
Kiaei, M., K. Kipiani, N.Y. Calingasan, E. Wille, J. Chen, B. Heissig, S. Rafii, S. Lorenzl, and M.F. Beal. 2007.
Matrix metalloproteinase-9 regulates TNF-alpha and FasL expression in neuronal, glial cells and its
absence extends life in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol.
205:74-81.
Kikuchi, H., G. Almer, S. Yamashita, C. Guegan, M. Nagai, Z. Xu, A.A. Sosunov, G.M. McKhann, 2nd, and S.
Przedborski. 2006. Spinal cord endoplasmic reticulum stress associated with a microsomal
accumulation of mutant superoxide dismutase-1 in an ALS model. Proc Natl Acad Sci U S A.
103:6025-30.
Knee, R., I. Ahsan, N. Mesaeli, R.J. Kaufman, and M. Michalak. 2003. Compromised calnexin function in
calreticulin-deficient cells. Biochem Biophys Res Commun. 304:661-6.
Langou, K., A. Moumen, C. Pellegrino, J. Aebischer, I. Medina, P. Aebischer, and C. Raoul. 2010. AAVmediated expression of wild-type and ALS-linked mutant VAPB selectively triggers death of
motoneurons through a Ca2+-dependent ER-associated pathway. J Neurochem. 114:795-809.
Lee, J.H., S.M. Won, J. Suh, S.J. Son, G.J. Moon, U.J. Park, and B.J. Gwag. 2010. Induction of the unfolded
protein response and cell death pathway in Alzheimer's disease, but not in aged Tg2576 mice. Exp
Mol Med. 42:386-94.
Lessner, G., O. Schmitt, S.J. Haas, S. Mikkat, M. Kreutzer, A. Wree, and M.O. Glocker. 2010. Differential
proteome of the striatum from hemiparkinsonian rats displays vivid structural remodeling processes.
J Proteome Res. 9:4671-87.
159
Résultats
Locatelli, F., S. Corti, D. Papadimitriou, F. Fortunato, R. Del Bo, C. Donadoni, M. Nizzardo, M. Nardini, S.
Salani, S. Ghezzi, S. Strazzer, N. Bresolin, and G.P. Comi. 2007. Fas small interfering RNA reduces
motoneuron death in amyotrophic lateral sclerosis mice. Ann Neurol. 62:81-92.
Magill, C.K., A. Tong, D. Kawamura, A. Hayashi, D.A. Hunter, A. Parsadanian, S.E. Mackinnon, and T.M.
Myckatyn. 2007. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal
microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207:64-74.
Mesaeli, N., K. Nakamura, E. Zvaritch, P. Dickie, E. Dziak, K.H. Krause, M. Opas, D.H. MacLennan, and M.
Michalak. 1999. Calreticulin is essential for cardiac development. J Cell Biol. 144:857-68.
Michalak, M., E.F. Corbett, N. Mesaeli, K. Nakamura, and M. Opas. 1999. Calreticulin: one protein, one gene,
many functions. Biochem J. 344 Pt 2:281-92.
Molinari, M., K.K. Eriksson, V. Calanca, C. Galli, P. Cresswell, M. Michalak, and A. Helenius. 2004. Contrasting
functions of calreticulin and calnexin in glycoprotein folding and ER quality control. Mol Cell. 13:12535.
Nakamura, K., M. Robertson, G. Liu, P. Dickie, K. Nakamura, J.Q. Guo, H.J. Duff, M. Opas, K. Kavanagh, and M.
Michalak. 2001. Complete heart block and sudden death in mice overexpressing calreticulin. J Clin
Invest. 107:1245-53.
Oyadomari, S., and M. Mori. 2004. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death
Differ. 11:381-9.
Perrin, F.E., G. Boisset, M. Docquier, O. Schaad, P. Descombes, and A.C. Kato. 2005. No widespread induction
of cell death genes occurs in pure motoneurons in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.
Hum Mol Genet. 14:3309-20.
Petri, S., M. Kiaei, E. Wille, N.Y. Calingasan, and M. Flint Beal. 2006. Loss of Fas ligand-function improves
survival in G93A-transgenic ALS mice. J Neurol Sci. 251:44-9.
Pun, S., A.F. Santos, S. Saxena, L. Xu, and P. Caroni. 2006. Selective vulnerability and pruning of phasic
motoneuron axons in motoneuron disease alleviated by CNTF. Nat Neurosci. 9:408-19.
160
Résultats
Rao, R.V., K.S. Poksay, S. Castro-Obregon, B. Schilling, R.H. Row, G. del Rio, B.W. Gibson, H.M. Ellerby, and
D.E. Bredesen. 2004. Molecular components of a cell death pathway activated by endoplasmic
reticulum stress. J Biol Chem. 279:177-87.
Raoul, C., E. Buhler, C. Sadeghi, A. Jacquier, P. Aebischer, B. Pettmann, C.E. Henderson, and G. Haase. 2006.
Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop
involving Fas, Daxx, and FasL. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:6007-12.
Raoul, C., A.G. Estevez, H. Nishimune, D.W. Cleveland, O. deLapeyriere, C.E. Henderson, G. Haase, and B.
Pettmann. 2002. Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas.
potentiation by ALS-linked SOD1 mutations. Neuron. 35:1067-83.
Raoul, C., C.E. Henderson, and B. Pettmann. 1999. Programmed cell death of embryonic motoneurons
triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol. 147:1049-62.
Rauch, F., J. Prud'homme, A. Arabian, S. Dedhar, and R. St-Arnaud. 2000. Heart, brain, and body wall defects
in mice lacking calreticulin. Exp Cell Res. 256:105-11.
Roth, D.M., and W.E. Balch. 2011. Modeling general proteostasis: proteome balance in health and disease.
Curr Opin Cell Biol. 23:126-34.
Rutkevich, L.A., and D.B. Williams. 2011. Participation of lectin chaperones and thiol oxidoreductases in
protein folding within the endoplasmic reticulum. Curr Opin Cell Biol. 23:157-66.
Saxena, S., E. Cabuy, and P. Caroni. 2009. A role for motoneuron subtype-selective ER stress in disease
manifestations of FALS mice. Nat Neurosci. 12:627-36.
Saxena, S., and P. Caroni. 2011. Selective neuronal vulnerability in neurodegenerative diseases: from stressor
thresholds to degeneration. Neuron. 71:35-48.
Smith, M.J., and G.L. Koch. 1989. Multiple zones in the sequence of calreticulin (CRP55, calregulin, HACBP), a
major calcium binding ER/SR protein. Embo J. 8:3581-6.
Taguchi, J., A. Fujii, Y. Fujino, Y. Tsujioka, M. Takahashi, Y. Tsuboi, I. Wada, and T. Yamada. 2000. Different
expression of calreticulin and immunoglobulin binding protein in Alzheimer's disease brain. Acta
Neuropathol. 100:153-60.
161
Résultats
Tarr, J.M., P.J. Young, R. Morse, D.J. Shaw, R. Haigh, P.G. Petrov, S.J. Johnson, P.G. Winyard, and P. Eggleton.
2010. A mechanism of release of calreticulin from cells during apoptosis. J Mol Biol. 401:799-812.
Teuling, E., S. Ahmed, E. Haasdijk, J. Demmers, M.O. Steinmetz, A. Akhmanova, D. Jaarsma, and C.C.
Hoogenraad. 2007. Motor neuron disease-associated mutant vesicle-associated membrane proteinassociated protein (VAP) B recruits wild-type VAPs into endoplasmic reticulum-derived tubular
aggregates. J Neurosci. 27:9801-15.
Urushitani, M., A. Sik, T. Sakurai, N. Nukina, R. Takahashi, and J.P. Julien. 2006. Chromogranin-mediated
secretion of mutant superoxide dismutase proteins linked to amyotrophic lateral sclerosis. Nat
Neurosci. 9:108-18.
Vanselow, B.K., and B.U. Keller. 2000. Calcium dynamics and buffering in oculomotor neurones from mouse
that are particularly resistant during amyotrophic lateral sclerosis (ALS)-related motoneurone
disease. J Physiol. 525 Pt 2:433-45.
Verkhratsky, A. 2002. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signalling. Cell Calcium. 32:393-404.
Walker, A.K., and J.D. Atkin. 2011. Mechanisms of neuroprotection by protein disulphide isomerase in
amyotrophic lateral sclerosis. Neurol Res Int. 2011:317340.
Wang, H.Q., and R. Takahashi. 2007. Expanding insights on the involvement of endoplasmic reticulum stress
in Parkinson's disease. Antioxid Redox Signal. 9:553-61.
Wang, Q., J.L. Johnson, N.Y. Agar, and J.N. Agar. 2008. Protein aggregation and protein instability govern
familial amyotrophic lateral sclerosis patient survival. PLoS Biol. 6:e170.
Wengenack, T.M., S.S. Holasek, C.M. Montano, D. Gregor, G.L. Curran, and J.F. Poduslo. 2004. Activation of
programmed cell death markers in ventral horn motor neurons during early presymptomatic stages
of amyotrophic lateral sclerosis in a transgenic mouse model. Brain Res. 1027:73-86.
Wijesekera, L.C., and P.N. Leigh. 2009. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet J Rare Dis. 4:3.
Wong, P.C., C.A. Pardo, D.R. Borchelt, M.K. Lee, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, S.S. Sisodia, D.W. Cleveland, and
D.L. Price. 1995. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron
disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria. Neuron. 14:1105-16.
162
Résultats
Acknowledgements
We thank all members of the Avenir team for their helpful comments throughout the work. We thank
Dr. M. Michalak (University of Alberta, Canada) for the generous gift of the crt heterozygous mice
as well as for helpful comments on the manuscript. We also wish to acknowledge valuable
suggestions from Dr. P. Caroni (Friedrich Miescher Institute, Switzerland). This work was supported
by the “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale” (Inserm), by MNRT and AFM
fellowships to N.B and by grants from the Association Française contre les Myopathies (AFM),
Association Française pour la Recherche sur la SLA (ARS), and by the European Union through the
Mitotarget Consortium (contract FP7-223388).
List of abbreviations
ALS:
amyotrophic lateral sclerosis
CHOP
CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein
CRMP4
collapsin-response mediator protein 4
CRT
calreticulin
eIF2α
eukaryotic translation initiation factor 2 alpha
ER
endoplasmic reticulum
mSOD1
mutated superoxide dismutase 1
SOD1
superoxide dismutase 1
NO
nitric oxide
PDI
protein disulfide isomerase
PERK
protein kinase (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase
163
Résultats
Figure Legends
Figure 1. Expression of CRT, a luminal ER protein, is decreased two-fold only in SOD1G93A
motoneurons (MNs) and only after sFasL or NO treatment. (A-D) Decrease in CRT expression
is Fas-dependent and happens only in SOD1G93A MNs and only after sFasL or NO treatment. CRT
staining was visualized (a) and quantified (b) in cells cultured for 24 hr, then treated for 24 hr with
sFasL (1 or 100 ng/ml), sLIGHT (100 ng/ml) or DetaNONOate, a nitric oxide donor (NO 10 µM).
Western blots of cultured MNs extracts (c) were quantified (d), confirming the immunostaining
results. CRT decreased expression occurs in MNs expressing different mutated SOD1, but not in
MNs expressing the human wildtype SOD1 (e). CRT fluorescence was quantified in MNs cultured
from SOD1G93A, SOD1G85R and SOD1WT embryos for 24 hr and treated with sFasL (100 ng/ml). CRT
decreased expression is specific to MNs (f). CRT fluorescence was quantified in MNS, cortical and
hippocampal neurons, cultured for 24 hr then treated for 24 hr with NO (20 µM). Scale bar 20 µm.
Protein disulfide isomerase (PDI), an ER stress marker shows increased expression in SOD1G93A
MNs after sFasL treatment (g). PDI fluorescence was quantified after sFasL (100 ng/ml) treatment
as in b. The mean intensity of CRT or PDI fluorescence was assessed using NHI Image J software.
Data are means ± SD of three independent experiments, * < p 0.05, ** < p 0.01 and *** <p 0.001.
Figure 2. CRT downregulation in wildtype motoneurons in vitro leads to death and implicates
the Fas signaling pathway. Downregulation of CRT leads to increased MN death (a, b). MN
survival was assessed 1 and 2 days after electroporation with the EGFP vector in combination with
empty vector (e.v.), shcrt1/2 or sh-control. All conditions were expressed relative to EGFP + e.v.
condition (a).
Wildtype and CRT heterozygous (crt+/-) MNs were cultured and cell counting
performed 1 and 2 days after seeding (b). The killing effect of CRT downregulation is dependent on
Fas activation (c, d). Wildtype MNs were electroporated as in (a). MNs were treated 24 hr later with
Fas-Fc (1 µg/ml) and survival assessed 48 hr later (c). Wildtype MNs were electroporated as in (a),
treated or not 12 hr later with DETANONOate and immunostained for Fas ligand 24 hr later. FasL
expression was quantified in EGFP positive cells and expressed relative to EGFP alone condition
(d). CRT overexpression prevents FasL/NO-induced death of SOD1G93A MNs (e, f). Wildtype or
164
Résultats
SOD1G93A MNs were electroporated with EGFP/empty vectors or EGFP/ CRT-HA vectors and were
immunostained 24 hr later for anti-HA to detect CRT and anti-VAPA to stain the ER (e), scale bar 20
µm. 24 hr after electroporation with the same vectors as in (e) , MNs were treated or not with sFasL
(100 ng/ml). Cell survival (EGFP positive cells) was assessed 48 hr later, and expressed relative to
wildtype (f). Data are from 3 independent experiments ± SD,*< p0.05, **< p 0.01, ***<0.001.
Figure 3. CRT expression is decreased in vivo in MNs in the SOD1G93A mice lumbar spinal
cord starting at asymptomatic stage (a-d) Immunostaining of CRT and NeuN was performed on
spinal cord sections at the L3-L5 levels in 30, 38, 45 day-old mice (asymptomatic), 60 day old mice
(pre-symptomatic), 90 day old mice (onset of the disease) and 110 day old mice (symptomatic)
(Illustrations of CRT expression at all times are shown in Supplementary Fig. 4). Panel (a) shows an
enlargement of the ventral horn of a 38 day-old mSOD1 spinal cord, scale bar 50 µm, long arrow =
low CRT expressor MN, short arrow = high CRT expressor MN. Quantification of CRT and NeuN
immunostaining was performed using NHI Image J software Data are expressed as the CRT mean
fluorescence in SOD1G93A
relative to CRT fluorescence in wildtype at the same age (b). Western
blot for CRT and Calnexin (CNX) from lumbar ventral spinal cord extracts was performed with mice
of the same age as in b. Quantification of the amounts of CRT and CNX using NHI Image J
software, expressed as a ratio to the age-matched wildtype (c, d). Data in b, c and d are from 3
independent experiments ± SD for each age compared to the WT, *< p0.05, **< p 0.01, ***<0.001.
Figure 4. Decrease in CRT expression occurs only in vulnerable MNs. Immunostaining of CRT
was performed on lumbar spinal cord sections 7 days after injection of TRITC dextran in the Tibialis
(vulnerable
MNs)
or
in
the Soleus
(resistant
MNs)
muscle,
scale
bar
50
µm
(a).
Immunofluorescence of CRT was quantified using NHI Image J software, in TRITC dextran labelled
MNs in wildtype or SOD1G93A mice at 38 days, and data expressed relative to the wildtype (b). Data
in (b) were from 3 independent experiments ± SD for each age compared to the WT, *< p0.05, **< p
0.01, ***<0.001.
165
Résultats
Figure 5. Calcium signaling is involved in SOD1G93A MNs death triggered through Fas.
Ratiometric [Ca2+]i measurement in motoneurons. Representative motoneurons loaded with Fura
Red dye before, during and after 25 mM KCl stimulation. Top row represents the calcium insensitive
490 nm excitation wavelength, bottom row represents the calcium sensitive, 440 nm excitation
wavelength (a). Fura-Red fluorescence change when excited using 440 nm and 490 nm filters in
response to KCl application is illustrated as a ratio of fluorescence intensities (b). Basal level of
[Ca2+]i (c), amplitudes of neuronal response to application of 25 mM KCl (d), and 50% recovery time
after KCl application (e) were measured in different motoneurons, wild-type versus SOD, treated or
not with sFasL. Data are from 4 experiments with 20–30 neurons analyzed per experiment. Values
± S.E.M. p<0.01**. Chelating intracellular calcium with BAPTA prevents sFasL-induced death of
SOD1G93A MNs (f). Wildtype or SOD1G93A MNs were treated with sFasL (100ng/ml) in combination or
not with BAPTA-AM (5 µg/ml) and MN survival was assessed 48 hr after. Increasing cytoplasmic
calcium with caffeine treatment potentiates death triggered through Fas activation in wildtype MNs
(g). Wildtype MNs were cultured for 24 hr, then treated with a sub lethal dose of sFasL (1 ng/ml)
and/or caffeine (10 µg/ml) and cell survival was evaluated 48 hr after treatment. Data are means ±
SD of three independent experiments, * < p 0.05, ** < p 0.01 and *** <p 0.001.
Figure 6. ER stress is involved in SOD1G93A MN death triggered through Fas. ER stress
markers CHOP and P-eIF2α are upregulated in SOD1G93A MNs treated with sFasL (a-c). Wildtype or
SOD1G93A MNs were cultured for 24 hr, then treated with sFasL (100 ng/ml) or Tapsigargin (20 nM,
2 hr) and immunostained 24 hr after for CHOP (a, b) or P-eIF2α (c) in combination with a
motoneuronal marker, SMI32 (scale bar in a, 20 µm). The mean intensity of fluorescence was
quantified using Metamorph software. Inhibiting ER stress prevents sFasL-induced death of
SOD1G93A MNs (d). Wildtype or SOD1G93A MNs were cultured for 24 hr then treated for 24 hr with
sFasL (100 ng/ml) and/or salubrinal (ER stress inhibitor, 5µM) or Z-ATAD-fmk (caspase 12 inhibitor,
10 µM). Combined sub lethal doses of sFas ligand (sFasL) and ER stress inducers result in death of
wildtype MNs (e). Wildtype MNs were cultured for 24 hr, then treated for 48 hours with sub lethal
doses of sFasL (1 ng/ml) and/or of ER stress inducer, Tunicamycin (0.05 µg/ml) or Tapsigargin (0.1
166
Résultats
nM). Cell survival was measured and results for each condition expressed relative to the nontreatment condition. Data are means ± SD of three independent experiments, expressed relative to
untreated condition, * < p 0.05, ** < p 0.01 and *** <p 0.001.
Figure 7. CRT decreased expression is upstream and independent of ER stress activation.
Death of MNs induced by downregulation of CRT is dependent on ER stress (a, b). MNs were
electroporated with EGFP in combination with empty or sh-crt1/2 or sh-control vectors and treated
or not with salubrinal (5µM). Cell survival was assessed 48 hr after (a). Wildtype and crt+/- MNs
were treated with salubrinal 8 hours after seeding and assayed for survival at 48 hr (b). Blocking ER
stress does not prevent decrease in CRT in SOD1G93A (c). MNs were treated 24 hr after seeding with
sFasL (100 ng/ml) in combination or not with salubrinal (5 µM). CRT immunostaining was performed
24 hr later. Induction of ER stress in wildtype MNs does not lead to decreased expression of CRT
(d). Wildtype MNs were treated at 24 hr after seeding with sub-lethal doses of sFasL (1 ng/ml),
Tunicamycin (0.05 µg/ml) or Thapsigargin (0.1 nM), CRT/SMI32 double immunostaining was
performed 24 hr later and CRT expression was quantified relative to SMI32. Data are means ± SD
of three independent experiments. ER stress induced by nerve crush does not lead to CRT
decrease (e, f). CRT and BIP expression were visualized (e) and quantified (f) relative to NeuN in
L3-L5 sections of spinal cords from wildtype mice at 30 days, two days after sciatic nerve crush was
performed on one side. In (c), (d) and (e), immunostainings were quantified with NHI Image J
software and expressed relative to untreated and/or wildtype. Scale bar 50 µM, Data in (f) are
means ± SD of three independent experiments, * < p 0.05, ** < p 0.01 and *** <p 0.001.
Figure 8: Model of CRT reduction and ER stress contribution to the death of mSOD1
vulnerable motoneurons. While Fas activation leads in all motoneurons to activation of nNOS and
NO production, only in mSOD1 vulnerable motoneurons does this activation induce a decrease in
CRT leading to an ER stress response and death.
167
Résultats
Supplemental online material
Supplementary Figure 1. Specificity of CRT decreased expression (a-c): (a) Decreased levels
of CRT are dependent on NO; (b) CRT levels are not modified in the absence of NTFs; (c) Levels of
CRT decrease in lumbar, but not in thoracic spinal cord MNs and calpain involvement in Fasinduced death of SOD1G93A MNs (d): Calpain inhibitors prevent Fas-induced death of SOD1G93A
MNs
Supplementary Figure 2. Efficiency and specificity of CRT silencing with sh-CRTs in NSC34
cells (a, b) and in MNs (c, d). CRT overexpression prevents NO-induced death of SOD1G93A
MNs (e).
Supplementary Figure 3. CRT expression is decreased in vivo in MNs in the SOD1G93A mice
lumbar spinal cord starting at asymptomatic stage
Supplementary Figure 4. P-eIF2α expression is increased in vulnerable motoneurons
168
F
100
50
0
0
T
200
- +
G
wildtype
SOD1G93A
- +
- +
85
R
0
93
A
NO:
SO
D
1G
50
SO
D
1G
100
IG
H
T
no
ne
sF
as
L
sL
wildtype
SOD1G93A
sL
+
w
ild
ty
pe
SO
D
1W
sFasL
sF
a
+
CRT levels
(labeling intensities)
wildtype
CRT levels
(labeling intensities)
SOD1G93A
Calreticulin DAPI
no
ne
-
L
wildtype SOD1G93A
as
D
sF
C
CRT levels
(labeling intensities)
control
PDI levels
(labeling intensities)
no
ne
sFasL:
CRT
actin
co
r
hi
pp tica
l
oc
am
m
p
ot
on al
eu
ro
ns
CRT levels
(labeling intensities)
A
B
wildtype
SOD1G93A
*
100
50
0
E
150
*
*
100
*
50
- +
*
150
100
50
0
Figure 1
Bernard, N et al.
Fas-Fc
***
50
Figure 2
Bernard, N et al.
1 DIV
150
VAPA
100
t+
/-
t+
/+
% surviving motoneurons
(islet-1/-2+ neurons)
B
cr
cr
l
ro
nt
co
RT
RT
.v.
0
+
0
F
FP P/e
EG /e. .v
FP v +
EG /s NO
FP h2/s CR
hco T
nt
ro
l
EG
100
FasL immunoreactivity
(relative to EGFP)
h-
/s
FP
-C
h2
/s
FP
-C
/e
50
F
sF P/e
as .v
EG L
FP
/C
RT
EG
+ FP
sF /C
as RT
L
.v
EG
**
**
EG
HA
-C
RT
EG
EG
h1
/s
FP
FP
*
/e
.v.
none
h2
/s
EG
FP
/e
-C
RT
h1
FP
EG
EG
% surviving motoneurons
100
FP
EGFP
/s
EG
cell survival (%EGFP)
C
EG
FP
E
2 DIV
EG
EGFP/e.v.
1 DIV
% surviving motoneurons
EGFP/CRT-HA
A
100
2 DIV
**
***
50
0
D
**
*
100
50
0
F
wildtype
SOD1G93A
***
50
0
A
B
CRT
CRT levels
(labeling intensities)
SOD1G85R
SOD1WT
wildtype
SOD1G93A
150
100
NeuN
0
*
*
50
30 38
45
*
*
*
**
60 90 110 350 350
age (days)
CRT
CNX
actin
30
38
45
60
90
110
110
CRT levels
(relative to age matched WT)
T
C
w
ild
SO typ
D e
1G
w
ild 93A
SO typ
D e
1G
93
w
ild
A
SO typ
D e
1G
93
w
ild
A
t
y
SO p
e
D
1G
93
w
ild
A
t
SO yp
D e
1G
93
w
ild
A
SO typ
D e
w 1 G9
ild
3A
t
SO ype
D
1W
D
1.5
CRT
CNX
1
*
*
*
**
*
0.5
0
age (days): 30 38 45 60 90 110 110
SOD1G93A
age (days)
Figure 3
Bernard, N et al.
SOD1WT
A
wildtype
SOD1G93A
tibialis anteriror
B
wildtype
SOD1G93A
150
100
50
soleus
CRT levels
(labeling intensities)
**
0
tibialis
anterior
CRT / TRITC-dextran
Figure 4
Bernard, N et al.
soleus
10
0
F
100
1.5
wildtype
SOD1G93A
*
50
0
Figure 5
Bernard, N et al.
no
ne
sF
as
L
no
ne
sF
as
L
**
F490/ F440 ratio
440 nm
wildtype
SOD1G93A
n.s.
1
0.5
0
50% return to basal level
(normalized values)
490 nm
D
L non
(1
e
ng
/m
l)
ca
sF
ffe
as
in
+ L(
e
ca 1
ffe ng
in /m
e l)
**
B
as
20
after
sF
wildtype
SOD1G93A
% surviving motoneurons
30
during
no
ne
sF
as
L
before
no
ne
sF
as
L
**
ǻC/C0
(normalized values)
C
no
ne
sF
as
L
no
n
sF e
as
L
basal levels (F490/F440 ratio)
(% increase over untreated wildtype)
25 mM KCl
(1 sF
00 a
ng sL
/m
l)
BA
PT
AsF
AM
as
+ L(
BA 1
PT 00
A- ng/
AM m
l)
no
ne
% surviving motoneurons
A
2
1.5
1
25 mM KCl
C1
C0
0
50
time (s)
G
*
100
50
0
100
E
wildtype
SOD1G93A
1
0.5
0
sFasL
(100 ng/ml)
D
E
150
**
wildtype
SOD1G93A
**
100
50
0
no
ne
(1 sF
0 a
th 0 n sL
ap g/
si ml
ga )
rg
in
none
P-eiF2a levels
(labeling intensities)
C
no
ne
(1 sF
0 a
th 0 n sL
ap g/
si ml
ga )
rg
in
CHOP levels
(labeling intensities)
sFasL
(100 ng/ml)
Figure 6
Bernard, N et al.
L non
(1
e
ng
/m
tu
l)
n
sF
ic
a
a
+ sL m
y
tu (
ni 1 cin
ca ng
m /m
y
l
th cin )
sF ap
+ asL siga
th
ap (1 rgin
si ng
ga /m
rg l)
in
wildtype
none
as
thapsigargin
% surviving motoneurons
SOD1G93A
SMI32
sF
no
ne
(1 sF
00 a
ng sL
/m
l)
sa
lu
sF
br
as
in
L
al
+
(
1
sa 0
lu 0 n
br g
in /m
al l)
zAT
AD
sF
-fm
a
k
+ sL
z- (1
AT 00
AD n
-fm g/m
k l)
% surviving motoneurons
A
B
CHOP
200
200
wildtype
SOD1G93A
*
150
100
50
0
wildtype
SOD1G93A
**
150
100
50
0
100
***
***
50
0
NeuN
NeuN
BiP
CRT
non crushed
NeuN
NeuN
0
0
300
BiP
CRT
Figure 7
Bernard, N et al.
t+
/-
t+
/+
50
none
cr
cr
***
% surviving motoneurons
(% islet-1/-2+ neurons)
salubrinal
BiP or CRT levels
(labeling intensities)
50
no
ne
ng
/m
tu
l)
sF nic
a
a
+ s m
tu L
ni (1 ycin
ca n
m g/
th yci ml)
n
sF aps
i
+ as ga
th L
ap (1 rgin
si n
ga g/
rg ml
in )
l
ro
RT
nt
co
-C
.v.
RT
/e
-C
h2
h-
/s
FP
/s
FP
h1
FP
***
(1
EG
EG
/s
FP
EG
100
L
100
CRT levels
(labeling intensities)
C
EG
% surviving motoneurons
none
sF
as
(1 non
00
e
ng
/
sa ml)
sF
lu
as
br
L
in
+
(
al
1
sa 0
lu 0 n
br g
in /m
al l)
E
sF
as
L
CRT levels
(labeling intensities)
A
B
salubrinal
100
*
50
0
D
100
50
0
F
crushed
non crushed
crushed
***
200
100
0
BiP
CRT
Fas
Daxx
ASK-1
P-p38 kinase
NO
CRT decrease
FasL
ER stress
caspase-12
caspase-3
DEATH
ALS-VULNERABLE
MOTONEURONS
Figure 8
Bernard, N et al.
50
60
9
NTFs: +
0
90
age (days)
Supplementary Figure 1
Bernard, N et al.
+
-
wildtype
SOD1G93A
85
R
0
3A
SO
D
1G
CRT levels
(labeling intensities)
50
w
ild
ty
pe
SO
D
1G
D
ET
no
A
sF L (1 sFa NO ne
s N
as
L ng/m L (1 Oa
(1
te
ng l) + ng/
/m L- ml
N )
l)
+ AM
D
-N E
AM
E
as
sF
CRT levels
(labeling intensities)
100
ng
/m
M
l)
D
LsF
28
a
17
+ L(
M 10
0
D 0
L- n
28 g/
17 ml
0 )
100
(1
00
wildtype
SOD1G93A
no
ne
thoracic spinal cord
% surviving motoneurons
C
sF
as
L
CRT levels
(labeling intensities)
A
B
100
50
0
+ -
D
**
100
50
0
FP
.v
+
FP
N /e.
O v
EG
FP
/C
RT
EG
F
+ P/C
N R
O T
/e
150
WT
G93A
SOD1
*
0
EG
l
ro
RT
nt
co
-C
RT
.v.
FP
sh
-c
on
tro
l
sh
2C
RT
sh
1C
RT
EG
B
h-
/s
h2
-C
h1
/s
FP
FP
EG
/s
/e
CRT
FP
FP
EGFP
CRT levels
(labeling intensities)
actin
FP
EG
/e
FP
.v.
/s
h
EG
1C
FP
RT
/s
hco
nt
ro
l
EG
EG
EGFP/e.v.
CRT
EG
CRT levels
(labeling intensities)
EGFP/sh-control EGFP/sh1-CRT
C
EG
EG
E
% surviving motoneurons
A
*
**
100
50
0
D
**
100
50
0
100
50
Supplementary Figure 2
Bernard, N et al.
SOD1G93A
wildtype
SOD1WT
110 days
90 days
38 days
30 days
wildtype
Supplementary Figure 3
Bernard, N et al.
A
B
wildtype
SOD1G93A
SOD1G93A
TRITC-dextran
P-eIF2a
P-eIF2a levels
(labeling intensities)
wildtype
tibialis anterior
300
*
200
100
0
tibialis anterior
Supplementary Figure 4
Bernard, N et al.
Résultats
181
Résultats
III. Introduction des résultats du projet CRMP4
A) Contexte de l'étude
La protéine CRMP4 (Collapsin-Response Mediator Protein 4) est l’un des cinq membres d’une
famille de phosphoprotéines cytosoliques. Les gènes crmp sont des homologues du gène unc-33
des nématodes, chez lesquels la mutation de ce gène entraine des défauts de croissance et de
guidage axonal (Hedgecock et al., 1985). Vu le degré de conservation de ce gène chez les
rongeurs, il était probable que les protéines CRMPs jouent elles aussi un rôle dans ce type
d’évènement.
En effet, les CRMPs s’expriment dans le cône de croissance (lamelipodes et filipodes), dans l’axone,
et dans le corps cellulaire des neurones (Quinn et al., 1999). La majorité des études in vitro et in
vivo ont été réalisées sur les protéines CRMP2 et CRMP4, et ont montré que ces molécules
pouvaient moduler la croissance neuritique, leurs interacteurs cellulaires et leur état de
phosphorylation selon le type cellulaire (Schmidt and Strittmatter, 2007). D’une manière générale,
ces protéines semblent particulièrement impliquées dans le développement du système nerveux car
leur expression est majoritairement restreinte aux neurones et elles sont fortement exprimées dans
les stades embryonnaires tardifs, leur expression diminuant après la première semaine de vie,
jusqu’à être indétectable à 30 jours postnataux.
CRMP4 en particulier, est exprimée au cours du développement de structures préférentiellement
affectées dans la SLA. En effet, son expression est limitée aux motoneurones post-mitotiques
ventraux de la moelle épinière au jour embryonnaire (E) 12-13, puis elle s’élargit à toute la moelle
épinière (Quinn et al., 1999). Entre E16 et E20, CRMP4 est également exprimée au niveau de la
voie cortico-spinale en développement (Geschwind et al., 1996).
Chez l’adulte, les protéines CRMPs sont normalement réprimées, mais peuvent toutefois être réexprimées dans les neurones dans certaines situations pathologiques, notamment après une
dénervation périphérique provoquée par l’écrasement du nerf sciatique (Minturn et al., 1995), lors
182
Résultats
d’une ischémie (Liu et al., 2003) ou dans des cas de maladies neurodégénératives, comme la
maladie d’Alzheimer (Yoshida et al., 1998).
Dans ce contexte, la protéine CRMP4, dont l’expression est augmentée après induction de mort par
la voie Fas/NO dans les motoneurones mSOD1, apparaît comme un candidat intéressant à étudier
dans le cadre de la SLA.
Dans ce projet, j’ai participé à évaluer l’expression de CRMP4 dans la moelle épinière des souris
mSOD1 in vivo, puis j’ai étudié l’effet de l’inhibition de la protéine CRMP4 sur la survie des
motoneurones in vitro.
B) Synthèse des résultats
Nous avons montré, au moyen d’une étude protéomique et par quantification de
l’immunofluorescence, une augmentation d’un facteur 2 de la forme courte de la protéine
dénommée CRMP4a, uniquement dans les motoneurones mSOD1 (G93A et G85R), 24h après
traitement au NO. Cette augmentation est spécifique de la protéine CRMP4, car CRMP2, son
homologue le plus proche, ne subit pas d’augmentation dans ces conditions. Plus intéressant
encore, CRMP4 est augmentée in vivo dans les motoneurones mSOD1 dès les stades présymptomatiques (60 jours postnataux) et continue d’augmenter jusqu’au point de déclenchement
de la maladie (90 jours).
Nous avons ensuite montré in vitro qu’une augmentation de CRMP4a, induite par électroporation ou
par infection, dans des motoneurones sauvages, diminuait la longueur de l’axone de ces cellules de
60% à 24h. Cet effet est spécifique aux motoneurones car l’augmentation de CRMP4a n’a pas
d’effet sur la longueur axonale des neurones hippocampiques. De plus, cette diminution de la
longueur axonale est synonyme d’une dégénérescence car la survie des motoneurones diminue de
60%, à 48h. L’augmentation de CRMP4a est donc suffisante pour tuer les motoneurones, en
induisant une dégénérescence axonale. L’induction de CRMP4 est de plus nécessaire dans la mort
des motoneurones mSOD1, induite par Fas/NO, car l’inhibition de l’expression de cette protéine par
ARN interférence prévient totalement la mort des motoneurones mSOD1 traités au NO.
183
Résultats
In vivo, l’injection de virus AAV6 codant pour CRMP4a, dans les muscles des pattes arrière de souris
non transgéniques, induit 90 jours plus tard, une mort de 30% des motoneurones lombaires de la
moelle épinière et une dénervation de 20% des jonctions neuromusculaires.
Ces travaux mettent en lumière l’importance de la protéine CRMP4a dans le processus de
dégénérescence axonale et de mort des motoneurones, ce qui inscrit cette protéine comme une
cible thérapeutique potentielle pour cette maladie
184
Résultats
IV) Article scientifique sur CRMP4
185
The Journal of Neuroscience, January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 785
Neurobiology of Disease
Collapsin Response Mediator Protein 4a (CRMP4a) Is
Upregulated in Motoneurons of Mutant SOD1 Mice and Can
Trigger Motoneuron Axonal Degeneration and Cell Death
Laure Duplan,1,2 Nathalie Bernard,1,2 Wilfrid Casseron,2,3 Keith Dudley,1,2 Eric Thouvenot,4 Jérôme Honnorat,5
Véronique Rogemond,5 Béatrice De Bovis,6 Patrick Aebischer,7 Philippe Marin,4 Cédric Raoul,1,2
Christopher E. Henderson,8 and Brigitte Pettmann1,2
1Inserm-Avenir Team, Mediterranean Institute of Neurobiology, Inmed, 13273 Marseille, France, 2Aix-Marseille Université, Faculté des Sciences, 13288
Marseille, France, 3Service des Pathologies Musculaires, Centre de Référence Maladies du Motoneurone, Centre Hospitalier Universitaire Timone, 13005
Marseille, France, 4Institut de Génomique Fonctionnelle, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR 5203, Inserm U661, Universités
Montpellier I and II, 34094 Montpellier, France, 5Inserm, U842, Université de Lyon 1, UMR S842, 69003 Lyon, France, 6Centre d’Immunologie de Marseille
Luminy, CNRS, UMR 6102, Inserm, UMR 631, Université de la Méditerranée, 13288 Marseille, France, 7Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Fédérale
de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Switzerland, and 8Center for Motor Neuron Biology and Disease, Columbia University, New York, New York 10032
Embryonic motoneurons from mutant SOD1 (mSOD1) mouse models of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), but not wild-type motoneurons, can be triggered to die by exposure to nitric oxide (NO), leading to activation of a motoneuron-specific signaling pathway downstream of the death receptor Fas/CD95. To identify effectors of mSOD1-dependent cell death, we performed a proteomic analysis.
Treatment of cultured mSOD1 motoneurons with NO led to a 2.5-fold increase in levels of collapsin response mediator protein 4a
(CRMP4a). In vivo, the percentage of mSOD1 lumbar motoneurons expressing CRMP4 in mSOD1 mice increased progressively from
presymptomatic to early-onset stages, reaching a maximum of 25%. Forced adeno-associated virus (AAV)-mediated expression of
CRMP4a in wild-type motoneurons in vitro triggered a process of axonal degeneration and cell death affecting 60% of motoneurons, whereas silencing of CRMP4a in mSOD1 motoneurons protected them from NO-induced death. In vivo, AAV-mediated
overexpression of CRMP4a but not CRMP2 led to the death of 30% of the lumbar motoneurons and an 18% increase in denervation
of neuromuscular junctions in the gastrocnemius muscle. Our data identify CRMP4a as a potential early effector in the neurodegenerative process in ALS.
Introduction
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating neurodegenerative disease characterized by the selective and gradual loss of
both upper and lower motoneurons. Most patients present a sporadic form of the disease, but much of our knowledge of the
cellular and molecular pathogenic mechanisms comes from the
study of familial forms. Approximately 10% of ALS cases are
familial and of these up to 20% are caused by dominant mutations in superoxide dismutase 1 (SOD1). Correspondingly,
Received Nov. 2, 2009; accepted Nov. 30, 2009.
This work was supported by Inserm, an Agence Nationale de la Recherche fellowship to L.D., a Ministère de
l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie fellowship to N.B., a Society of Neurology fellowship to
W.C., and grants from the Association Française contre les Myopathies, Association Française pour la Recherche sur
la Sclérose Latérale Amyotrophique, and the European Union through the Network of Excellence “NeuroNE.” We are
especially thankful to V. Padrun and F. Pidoux (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Switzerland)
for AAV vector production. We thank all members of the Avenir team for their helpful comments throughout the
work and in particular A. Moumen and J. Aebischer for their technical help. We thank Prof. J. Bockaert (Institut de
Génomique Fonctionnelle, Montpellier, France) and Prof. J. Pouget (Centre Hospitalier Universitaire Timone, Marseille, France) for support and helpful discussions. Mass spectrometry experiments were performed using facilities of
the Functional Proteomics Platform of Montpellier Languedoc-Roussillon (Montpellier, France).
Correspondence should be addressed to Dr. Brigitte Pettmann at the above address. E-mail: pettmann@inmed.
univ-mrs.fr.
DOI:10.1523/JNEUROSCI.5411-09.2010
Copyright © 2010 the authors 0270-6474/10/300785-12$15.00/0
transgenic mice overexpressing mutant forms of SOD1
(mSOD1) develop a motor syndrome closely resembling ALS
(Bruijn et al., 2004). Multiple in vitro and in vivo studies have
demonstrated that the actions of mSOD1 on motoneurons are
both cell autonomous and nonautonomous (for review, see
Boillee et al., 2006), but the sequence of events leading to motoneuron degeneration and subsequent death remains to be precisely mapped.
We previously showed that purified embryonic motoneurons
from mSOD1 mice display increased susceptibility to activation of
the Fas death receptor, which triggers a motoneuron-specific pathway (Raoul et al., 1999, 2002). We demonstrated that nitric oxide
(NO), a downstream effector of Fas activation in motoneurons,
increases the expression of Fas ligand and leads, in mSOD1 motoneurons but not in controls, to further production of NO
through a feedback loop (Raoul et al., 2006b). This Fas/NO pathway is relevant in vivo since elements of the pathway are upregulated or misexpressed before the onset of symptoms in mSOD1
mice (Bendotti et al., 2004; Wengenack et al., 2004; Kiaei et al.,
2007). Moreover, both pathway activation and disease onset are
delayed by the intrathecal administration of siRNA to Fas (Locatelli et al., 2007). Therefore, a clearer understanding of the
786 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
transcriptional and posttranslational changes triggered by Fas
activation may potentially lead to identification of new therapeutic targets. In the present study, we used a proteomic approach to detect changes in motoneurons triggered by Fas in
the mSOD1 context. One major protein whose expression we
found to be upregulated was CRMP4 (collapsin response mediator protein 4).
CRMP4 is a member of a family of five developmentally regulated cytosolic phosphoproteins also known as TUCs or Ulips
(for review, see Charrier et al., 2003). Functional studies in vitro
and in vivo, focused mainly on CRMP2 and CRMP4, indicate that
CRMPs may have positive or negative effects on neurite outgrowth depending on the cell type and the CRMP family member
and isoforms (Quinn et al., 2003; Arimura et al., 2004; Quach et
al., 2004; Alabed et al., 2007). The expression of CRMPs is significantly altered in models of adult neurodegenerative disease
(Minturn et al., 1995; Yoshida et al., 1998; Pasterkamp and Verhaagen, 2001; Liu et al., 2003; Suzuki et al., 2003), but their precise links to the degenerative process have yet to be determined.
We show here that increased expression of CRMP4a, one of
two splice variants of CRMP4, is observed in a subpopulation of
lumbar motoneurons in mSOD1 mice starting at presymptomatic stages. Overexpression of CRMP4a in cultured motoneurons
leads to inhibition of neurite outgrowth followed by cell death.
On the contrary, inhibiting CRMP4 expression in NO-treated
mSOD1 motoneurons through shRNA-CRMP4a prevents NOtriggered cell death. Adeno-associated virus (AAV)-mediated
overexpression of CRMP4a in motoneurons in vivo leads to significant muscle denervation as well as reduction in motoneuron
cell numbers. These data identify CRMP4a as a candidate early
effector in motoneuron degeneration in the mSOD1 mouse
model of ALS.
Materials and Methods
Animals. All animal experiments were performed in compliance with the
European and national directives for the care and use of laboratory animals. CD1 mice were obtained from Iffa-Credo. Transgenic mice expressing mutant G85R (SOD1 G85R) and wild-type human SOD1
(SOD1 WT) were kindly provided by Prof. D. Cleveland (University of
California at San Diego, La Jolla, CA) and Prof. S. Przedborski (Columbia
University, New York, NY); transgenic mice for mutant G93A
(SOD1 G93A) were obtained from Transgenic Alliance. SOD1 G85R (line
148) (Bruijn et al., 1997) and SOD1 WT mice (line 76) (Wong and Borchelt,
1995) were maintained as hemizygotes by crossing transgenic males with
non-transgenic females of the same C57BL/6 genetic background.
SOD1 G93A mice (line G1H) (Gurney et al., 1994) were maintained as
hemizygotes by crossing transgenic males with non-transgenic females of
the same B6/SJL genetic background. Offspring were genotyped as previously described (Raoul et al., 2002). During PCR genotyping of embryonic tail DNA (3– 4 h), embryos were kept at 4°C in Hibernate E medium
(Invitrogen).
Reagents. DETANONOate, a NO donor, was purchased from Alexis
Biochemicals. Primary antibodies rabbit polyclonal anti-CRMP4 (source
1), rabbit polyclonal anti-CRMP-2, rabbit polyclonal anti-vesicular acetylcholine transporter (VAChT), and mouse monoclonal anti-neuronal
nuclei (NeuN) were purchased from Millipore. Rabbit polyclonal antiCRMP4 (source 2) was purchased from CovalAb. Mouse monoclonal
anti-myc (9E10) was from Santa Cruz Biotechnology. Mouse monoclonal anti-GFP antibodies (a mixture of 7.1 and 13.1) were from Roche
Diagnostics. Rabbit polyclonal anti-neurofilament (145 kDa) was from
Millipore. ␣-Bungarotoxin-tetramethylrhodamine conjugate was purchased from Invitrogen. Secondary antibodies Alexa Fluor 488 goat antimouse IgG, Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Cy3-conjugated
AffiniPure goat anti-mouse IgG, and Cy3-conjugated AffiniPure goat
anti-rabbit IgG were purchased from Invitrogen and Jackson ImmunoResearch Laboratories.
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
Expression constructs and recombinant adeno-associated virus vectors.
Expression vectors for CRMP4a and CRMP2 were PCR amplified from
pSG5-FLAG-CRMP4a and pSG5-FLAG-CRMP4a vectors (provided
by V.R.), and the products were cloned into PGK1 (phosphoglycerol
kinase 1)-6myc (pmyc) vectors using the following primers: CRMP4a,
5⬘-GGACATATGTCCCTACCAGGGCAAGAA-3⬘ (forward) and 5⬘AATTGAGTCCCTACACTACAAT-3⬘ (reverse); CRMP2, 5⬘-CCGAATTCCATGTCTTATCAGGGGAAGAAAAATATTC-3⬘ (forward) and
5⬘-GGCTCGAGTTAGCCCAGGCTGGTGATGTTG-3⬘ (reverse). Coding sequences for EGFP and myc-tagged CRMP2 or CRMP4a were
cloned into AAV under the control of PGK1 promoter (Towne et al.,
2008). shRNA stem sequences were as follows: sh1crmp4, 5⬘-AGTCCGATCTGAGTCCAAG-3⬘; sh2crmp4, 5⬘-AGTAGTAACTGCTAAGAGG-3⬘; sh1crmp4-mismatch, 5⬘-AGTCCTATATGAGTCCAAG-3⬘.
These shRNAs were cloned into a bipartite pAAV vector in which expression of EGFP was placed under the control of the cytomegalovirus
(CMV) promoter and the expression of the shRNAs under the control of
the H1 promoter (pAAV-CMV-EGFP:H1-shRNA) (Towne et al., 2008).
All clones were sequenced before use. Recombinant AAV serotype 6
vectors were produced using a helper-free system as previously described
(Towne et al., 2008). Immunofluorescence titration with antibodies to
GFP, CRMP2, and CRMP4a was achieved using NSC-34 cells and the
viral titer expressed as transducing units (TU) per milliliter.
Cell cultures. Motoneuron cultures were prepared from embryonic day
(E)12.5 mouse spinal cords essentially as described previously by Arce et
al. (1999), and modified by Raoul et al. (2002). Motoneurons were plated
onto polyornithine/laminin-coated tissue culture plastic (Nunc) in supplemented Neurobasal medium in the presence of a mixture of neurotrophic factors (referred to as “NTFs”; 1 ng/ml BDNF, 100 pg/ml GDNF,
10 ng/ml CNTF) added at the time of cell seeding. After 24 h in culture,
motoneurons were treated by addition of 10 ␮M DETANONOate (NO)
diluted in Neurobasal medium. Unless otherwise stated, motoneurons
were then incubated at 37°C for 24 h before fixation. Wherever indicated,
motoneurons were electroporated before plating with DNA plasmids as
described previously (Raoul et al., 2002) or infected after 24 h in vitro
with the indicated AAV vectors.
Primary hippocampal neurons were cultured from E17.5 embryos of
transgenic mSOD1 and control mice. Neurons were dissociated and
plated at a cell density of 10,000 cells per well onto polyornithine/
laminin-coated four-well plates in Neurobasal medium supplemented
with 1 mM glutamine and 2% B27 (Invitrogen).
Expression analysis of myc-tagged CRMP2 or CRMP4a was performed by Western blot after transfection using Fugene 6 following the
manufacturer’s instructions (Roche Diagnostics) or by immunocytochemistry after infection of NSC34 motoneuron-like cells (Cashman et
al., 1992) with the mentioned AAVs.
Expression inhibition analysis of EGFP-tagged CRMP4 or mismatched shRNAs was performed by Western blot of NSC34 cells after
transfection with Lipofectamine 2000 following the manufacturer’s instructions (Invitrogen) or by immunocytochemistry on motoneurons
electroporated with the corresponding plasmids.
Preparation of protein samples from cultured motoneurons and twodimensional gel electrophoresis. After 24 h of treatment [i.e., 2 days in vitro
(DIV)], cells were rinsed twice with PBS and lysed directly in the dish
with 100 ␮l of lysis buffer. This extract was pooled in an Eppendorf tube
with a 100 ␮l wash and proteins were precipitated for 1 h at 4°C with
trichloroacetic acid at a final concentration of 10% (w/v). After centrifugation at 15,000 rpm for 15 min, protein pellets were washed twice in
diethyl ether and resuspended in 350 ␮l of isoelectrofocusing medium
containing 7 M urea, 2 M thiourea, 4% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, 8 mg/ml ampholines (preblended; isoelectric point range, 3.5–9.5; GE Healthcare), 100 mM DTT, 0.2%
Tergitol NP7 (Sigma-Aldrich), and traces of bromophenol blue. Proteins
(30 ␮g/gel) were first separated according to their isoelectric point values
along nonlinear immobilized pH-gradient strips (pH 3–10; 18 cm long).
Proteins were then resolved on 10 –16% gradient gels and stained with
silver, as described previously (Delcourt et al., 2005). Gels to be compared were always processed and stained in parallel. Gels were scanned
using a computer-assisted densitometer. Spot detection, gel alignment,
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
and spot quantification were performed with the ImageMaster 2D Platinium software (GE Healthcare).
MALDI-TOF mass spectrometry and protein identification. Protein
spots were excised and digested in-gel using trypsin (Trypsin Gold; Promega), as described previously (Delcourt et al., 2005). Digested samples
were dehydrated in a vacuum centrifuge, solubilized in 10 ␮l of formic
acid (2%), desalted using C18 ZipTips [Millipore; elution with 10 ␮l of
0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in 50% acetonitrile], and concentrated to
a 1 ␮l volume. Aliquots of 0.3 ␮l, mixed with the same volume of
␣-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid (10 mg/ml 0.1% TFA in 50%
acetonitrile), were deposited on a 384-well matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) target using the dry droplet procedure and air
dried at room temperature. Analyses were performed using an UltraFlex
MALDI-time-of-flight (TOF)/TOF mass spectrometer (Bruker-Franzen
Analytik) operating in the reflectron mode with a 20 kV accelerating
voltage and a 70 ns delayed extraction. Mass spectra were acquired in the
automatic mode using the AutoXecute module of Flexcontrol ((BrukerFranzen Analytik ; laser power ranged from 30 to 70%, 500 shots). Spectra were analyzed using FlexAnalysis software (Bruker-Franzen Analytik)
and autoproteolysis peptides of trypsin (mass-to-charge ratios 842.51,
1045.56, and 2211.10) were used as internal calibrates. Peptides were
selected in the mass range of 900 – 4000 Da. Identification of proteins was
performed using the Mascot software package (version 2.1; Matrixscience) against the Swiss-Prot database. The following parameters were
used for database interrogation: mass tolerance of 50 ppm (although the
mass accuracy of our analyses was usually better than 20 ppm); fixed
chemical modification: carbamidomethylation of cysteine residues; variable chemical modification: oxidation of methionines; and matching
peptides with one missed cleavage accepted only when they included two
consecutive basic residues or when arginine or lysine residues were followed by one or several acidic residues inside the peptide amino acid
sequence. Mascot scores of ⬎53 were considered as significant (*p ⬍
0.05) for Swiss-Prot database interrogation.
AAV injections of mice. BL6/SJL 40-d-old female mice were anesthetized with a mixture of Rompun and Imalgene and then injected in three
different parts of the gastrocnemius muscles with 3 ⫻ 10 ␮l of PBS
containing in total 5 ⫻ 10 6 AAV infecting particles (infectious titer of
AAV preparations was determined by counting EGFP- or mycexpressing NSC34 cells 24 h after their infection with serial dilutions of
the AAV preparations). AAV-EGFP was injected into the left muscle
(contralateral side), whereas AAV-6myc-CRMP2 or AAV-6mycCRMP4a were injected into the right muscle (ipsilateral side).
Immunocytochemistry. Embryonic motoneurons from wild-type,
SOD1 G85R, SOD1 G93A, or SOD1 WT mice were cultured on glass coverslips at a density of 5000 cells/cm 2 and processed for immunocytochemistry as described previously (Raoul et al., 2002, 2005). Primary
antibodies used were rabbit polyclonal anti-CRMP4 (1:500) and polyclonal anti-CRMP2 (1:500). Secondary antibodies used were Alexa Fluor
488- or 555-conjugated donkey anti-rabbit. Cells were visualized with a
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope and images were captured with a Kappa camera. Analysis of fluorescence intensity was performed on at least 50 motoneurons per condition using NIH ImageJ
1.34s software (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Immunohistochemistry. Mice were perfused with PBS followed by 4%
paraformaldehyde in PBS and the spinal cord (SC) as well as gastrocnemius muscles immediately dissected out. Tissues were incubated for 6 h
in 4% paraformaldehyde at 4°C. Lumbar parts of the SC and whole
gastrocnemius muscles were incubated in 20% sucrose overnight at 4°C.
Tissues were embedded in optimal cutting temperature compound
(CML). Sixteen-micrometer-thick transverse cryosections of the lumbar
SC and 35-␮m-thick longitudinal sections of the gastrocnemius muscles
(Frey et al., 2000) were collected onto Superfrost Plus slides (CML).
Tissue sections were dried, permeabilized either in 0.1% Triton X-100PBS (SC) or in 1% Triton X-100-PBS (gastrocnemius muscles) for 1 h at
room temperature, and then incubated in 4% BSA (Sigma-Aldrich), 2%
goat serum (Invitrogen), and 0.1% Triton X-100 in PBS for 1 h to block
nonspecific binding. Primary antibodies were added in the same blocking solution and incubated at 4°C overnight. For SC sections, rabbit
polyclonal anti-CRMP4 (1:200) and rabbit polyclonal anti-CRMP2 (1:
J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 787
100) were used in combination with mouse monoclonal anti-NeuN (1:
800); for gastrocnemius muscle sections, rabbit polyclonal antineurofilament 145 kDa (1:1000) was used. Slides were incubated with
appropriate secondary antibodies and, in the case of gastrocnemius
muscle sections, together with ␣-bungarotoxin-tetramethylrhodamine conjugate (1:500) for 1.5 h at room temperature and then
stained with DAPI (1:10,000; Sigma-Aldrich) to visualize nuclei and
mounted using Mowiol mounting medium. Cells were visualized with
a Leica DM IRB inverted fluorescence microscope and images captured with a Kappa camera.
For AAV-injected mice, motoneuron immunohistochemistry in the
spinal cord was performed on alternate slices with either mouse monoclonal anti-EGFP (1:200) or mouse monoclonal anti-myc (1:500) together with rabbit polyclonal anti-VAChT (1:500).
Western blot. Lumbar spinal cords were dissected from SOD1 G93A at
various ages between 60 and 110 d. SDS-PAGE and Western blotting
were performed using protocols described previously (Raoul et al., 2002,
2005). Primary antibodies were anti-CRMP4 (pab0117, CovalAb;
1:2000) and anti-actin (AC-40, Sigma-Aldrich; 1:20,000). Proteins were
detected using horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies and visualized with the chemiluminescent HRP substrate (Millipore). Immunoblots images were quantified and normalized relative to
actin levels using the NIH ImageJ software.
Statistical methods. For quantification of 2D gel spots, a nonparametric
Kruskal–Wallis test was used. For all culture experiments in which the
number of surviving or immunoreactive motoneurons was determined,
three different experiments with three or four wells per condition
were performed. If not otherwise indicated, results are expressed as
percentages relative to control ⫾ SD. Differences between treatments
or genotypes were analyzed for their statistical significance by twotailed, unpaired Student’s t test. Results are expressed as percentages ⫾ SD (*p ⬍ 0.05; **p ⬍ 0.01; ***p ⬍ 0.001). To determine the
statistical significance of the in vivo AAV infection experiments, the
percentages of EGFPⴙ/VAChTⴙ and mycⴙ/VAChTⴙ in the spinal
cord or the percentage of NFⴙ/␣-bungarotoxinⴙ versus NF ⫺/␣bungarotoxinⴙ in the gastrocnemius muscle was subjected to a oneway ANOVA followed by a Bonferroni’s post hoc test using the
GraphPad Instat software.
Results
Proteomic analysis of molecular changes in mutant SOD1
motoneurons exposed to nitric oxide
To identify potential effectors of NO-induced death in mSOD1 motoneurons, we performed a differential proteomic analysis. Embryonic motoneurons isolated from E12.5 wild-type mice or mice
overexpressing the G85R mutant form of SOD1 (SOD1 G85R) were
cultured for 24 h in the presence of a mixture of neurotrophic
factors (see Materials and Methods) before being treated, or not,
for a further 24 h with the NO donor DETANONOate (referred
to here as NO). Figure 1 A shows a typical silver-stained 2D gel of
an extract of 100,000 motoneurons that yielded ⬃30 ␮g of total
protein. Quantification of proteins, expressed as spot volumes,
was performed from four different 2D gels per experimental condition, each obtained from different sets of cultured cells. The
volume of each spot was first processed by background removal
and then normalized relative to the volume of all spots. This
comparative analysis revealed only six spots whose intensity reproducibly changed when motoneurons were treated with NO. A
list of the analyzed proteins that showed changes is provided in
supplemental Figure 1 A (available at www.jneurosci.org as
supplemental material). The following different patterns were
observed: the basal levels of two spots—14-3-3 ␨ and peroxiredoxin-2—were higher in mSOD1 than in wild-type motoneurons, whereas the other four showed no difference. Levels of two
spots—HSP90 and peroxiredoxin-2—were increased by NO
treatment in both wild-type and mSOD1 motoneurons, whereas
788 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
E12.5 motoneurons. The CRMP4a isoform has an N-terminal
region of 13 aa that is absent in the CRMP4b isoform. Conversely,
the CRMP4b isoform has an N-terminal region of 126 aa that is
absent in the CRMP4a isoform. RT-PCR using primers specific to
the two different isoforms revealed significant expression of the
CRMP4a isoform but failed to detect CRMP4b even after 35 cycles of amplification (data not shown). In contrast, both forms
were identified when amplifying testis and cortex cDNA (data
not shown). This result is consistent with the apparent molecular
weight of spots identified as CRMP4 on 2D gels (⬇60 kDa),
which is similar to the theoretical molecular weight of CRMP4a
(62 kDa), and with the lack of detection of specific peptides of
the CRMP4b sequence in MALDI-TOF analyses. Thus, following treatment of mSOD1 motoneurons with concentrations of
NO that are sufficient to trigger mSOD1 motoneuron death
but not that of wild-type motoneurons, only CRMP4, of all the
proteins that can be detected at this level of sensitivity, appears
to be upregulated in a manner that correlates with neuronal
susceptibility.
Figure 1. Proteomic analysis of SOD1 G85R motoneurons exposed to nitric oxide reveals increased levels of CRMP4 expression. Whole-protein extracts from cultured motoneurons
(100,000 neurons per 30 ␮g of protein) were resolved on 2D gels (first dimension, pH 3–10
nonlinear gradient; second dimension, 10 –16% gradient). A, A representative silver-stained
gel of NO-treated SOD1 G85R motoneurons is shown. Arrows indicate the position of spots corresponding to CRMP4. IEF, Isoelectrofocusing. Mw, Molecular weight. B, Higher-magnification
views of gel areas containing CRMP4 spots showing an increased expression of both CRMP4
forms (1, basic; 2, acidic) in the NO-stimulated SOD1 G85R motoneurons. C, Quantification of the
levels of the two forms of CRMP4. Results (spot volume relative to the volume of all detected
spots) are means ⫾ SD of values obtained in four experiments performed on different sets of
cultured neurons. *p ⬍ 0.05 versus untreated wild-type motoneurons (nonparametric
Kruskal–Wallis test).
calreticulin showed an increase in wild-type and a decrease in
mSOD1 neurons. However, because our aim was to identify potential intermediates in the death pathway that is triggered by NO
only in motoneurons from SOD1 G85R mice, but not in wild-type
neurons, we focused on spots that only showed an NOdependent increase in mSOD1 motoneurons.
This pattern was observed only for two spots (Fig. 1 B, C), both
identified as CRMP4 by MALDI-TOF mass spectrometry (supplemental Fig. 1 B, available at www.jneurosci.org as supplemental material). Since two splice-variant isoforms of CRMP4,
named CRMP4a and CRMP4b, have been described (Quinn et
al., 2003), we analyzed their expression in extracts of purified
Exposure of cultured mSOD1 motoneurons to NO triggers
increased expression of CRMP4a but not of CRMP2
To validate and extend the conclusions from the proteomic analysis, we performed immunostaining to detect changes in CRMP4
levels in motoneurons from two different SOD1 mutants and
compared the results to those for another CRMP family member.
Motoneurons were isolated from wild-type, SOD1 G93A, or
SOD1 G85R E12.5 embryonic spinal cords, cultured for 24 h,
treated or not with 10 ␮M NO, and fixed 24 h later. Quantification
of immunofluorescence intensity revealed significant increases in
CRMP4 levels following NO treatment of motoneurons of both
SOD1 G93A (2.4 ⫾ 0.2-fold; ***p ⬍ 0.001) and SOD1 G85R (2.7 ⫾
0.2-fold; ***p ⬍ 0.001) genotypes (Fig. 2 A, B). Although the antibody used does not distinguish between isoforms, our reverse
transcription-PCR analysis strongly suggests that this must reflect an increase in CRMP4a. We will therefore refer to CRMP4 as
CRMP4a from here on. In contrast, no significant difference in
CRMP4a immunoreactivity was detected in wild-type or
SOD1 WT motoneurons treated with NO or in untreated mSOD1
motoneurons compared with controls (Fig. 2 A, B). Because
CRMP2 may have some functions in common with CRMP4, we
analyzed its expression in parallel. No increase in CRMP2 expression was observed in any condition (Fig. 2C,D). Thus, treatment
with NO at concentrations that lead to Fas-dependent death of
mSOD1 but not wild-type motoneurons specifically triggers
rapid accumulation of CRMP4a, but not of CRMP2, in an
mSOD1-dependent manner.
Increased levels of CRMP4a in vivo in lumbar spinal cord
motoneurons of presymptomatic mutant SOD1 mice
Our results thus far demonstrated specific upregulation of
CRMP4a in an in vitro paradigm thought to reflect the ALS disease process, but both the identification of CRMP4a and the validation of NO-triggered changes were based on embryonic
motoneurons. To determine whether analogous changes might
occur in adult motoneurons in the ALS disease context, we analyzed CRMP4a expression in vivo in SOD1 transgenic mice.
Transverse sections of spinal cords from wild-type mice and from
mice overexpressing the human wild-type SOD1 (SOD1 WT) or
the G93A or G85R mutant forms of the SOD1 protein were double immunostained for NeuN, a neuronal marker, and CRMP4a.
Immunostaining of mSOD1 tissues was performed in parallel
with age-matched wild-type controls of the corresponding ge-
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 789
Overexpression of CRMP4a triggers a
neurodegenerative process in cultured
motoneurons, but not in hippocampal
neurons
The increased expression of CRMP4a
observed in vivo could in principle reflect a role in the disease process but
could also be part of a protective response by motoneurons to other degenerative processes. To distinguish between
these possibilities, given the predictive
value of the in vitro motoneuron system,
we turned to it once again to investigate
functional activities of CRMP4a in spinal
motoneurons. We first focused on neurite
outgrowth, because CRMPs have been reported to either enhance or inhibit axonal
growth, depending on the CRMP isoform
and the neuronal cell type (Inagaki et al.,
2001; Quinn et al., 2003; Alabed et al.,
2007; Rogemond et al., 2008).
We first generated a vector encoding
myc-tagged CRMP4a under the control of
the CAGGS (chicken ␤-actin promoter
coupled to a CMV early enhancer) promoter and confirmed expression of the
tagged protein following transfection of
Figure 2. Exposure to NO in vitro induces an increase in CRMP4a, but not CRMP2, in mutant SOD1 motoneurons, but not the motoneuron-like NSC34 cell line by
controls. A, C, Immunostaining for CRMP4a (A) or CRMP2 (C) in cultured wild-type or SOD1 G85R motoneurons treated or not Western blotting for myc (supplemental
with NO for 24 h. Scale bar, 25 ␮m. B, Quantification of CRMP4a immunofluorescence intensity in wild-type (WT), SOD1 WT,
Fig. 2 A, available at www.jneurosci.org as
SOD1 G93A, or SOD1 G85R motoneurons treated or not with NO. D, Quantification of CRMP2 immunofluorescence in WT
supplemental material). As a control, beand SOD1 G85R motoneurons treated or not with NO. Analysis was performed using NIH ImageJ 1.34s software on 50
motoneurons in each experimental condition in three independent experiments. ***p ⬍ 0.001 versus untreated wild-type cause there have been many reports of the
effects of CRMP2 on axonal specification
neurons.
and/or growth, we used an analogous
netic background at different stages of disease, corresponding
construct for myc-CRMP2 (supplemental Fig. 2 A, available at
to the following postnatal ages: presymptomatic (150 d for
www.jneurosci.org as supplemental material). To determine the
SOD1 G85R; 45 and 60 d for SOD1 G93A) and early-onset (90 d
effects of CRMP4a overexpression, suspensions of E12.5 mofor SOD1 G93A) stages (Fig. 3A). As a control for effects of human
toneurons were coelectroporated with the myc-CRMP4a conSOD1 overexpression unrelated to ALS, we also stained SOD1 WT
struct and another vector encoding EGFP. Immunostaining for
spinal cord sections at 200 d. Following immunostaining, momyc 24 h after electroporation showed a coexpression of EGFP
toneurons were identified as large NeuN-positive neurons in the
and myc in 92 ⫾ 5% of the motoneurons (data not shown). One
ventral horn of the spinal cord, and the fraction of these expressday after seeding, we quantified neurite outgrowth of fluorescent
ing levels of CRMP4a significantly above background was quanmotoneurons and compared values to those in cultures electrotified (Fig. 3B). In SOD1 G93A mutant spinal cord, the fraction of
porated with empty myc vector together with the EGFP reporter.
motoneurons strongly expressing CRMP4a was indistinguishAs we reported previously, all neurons at this stage have a single
able from controls at 45 d, showed a 2.5-fold increase in 60-d-old
long process that corresponds to the axon because it expresses the
presymptomatic animals, and reached a peak at the early-onset
microtubule-associated protein tau (data not shown). Overexstage (90 d). In these mice, the fraction of motoneurons expresspression of CRMP4a led to a 60% reduction in axonal length in
ing CRMP4a was 25 ⫾ 5% (n ⫽ 3; **p ⬍ 0.01), a value ⬎6-fold
motoneurons (supplemental Fig. 2 B, C, available at www.
higher than that for SOD1 WT controls at 200 d (Fig. 3B). Values
jneurosci.org as supplemental material). In contrast, overexpresG85R
in SOD1
mice also were increased 3- to 4-fold above controls
sion of CRMP2 in a similar manner had no significant effect on
at presymptomatic stages, demonstrating that CRMP4a upreguaxonal outgrowth (supplemental Fig. 2 B, C, available at www.
lation is a shared feature of disease triggered by two SOD1 mujneurosci.org
as supplemental material). To determine whether
tants with quite different properties (Gurney et al., 1994; Bruijn et
the effects of CRMP4a are cell type specific, we performed the
al., 1997). Western blot analysis of wild-type and SOD1 G93A lumsame experiments using E17.5 hippocampal neurons, which have
bar spinal cord extracts probed with anti-CRMP4 confirmed a
been used for most studies on CRMP2. In marked contrast to the
2.5-fold increase in CRMP4a at 90 and 110 d (beginning of moresults with motoneurons, neither CRMP4a nor CRMP2 affected
toneuron loss), whereas no significant difference was seen at 60 d
neurite outgrowth from hippocampal neurons, even after 72 h in
(Fig. 3C,D). Therefore, as predicted by the in vitro proteomic
culture (supplemental Fig. 2 D, E, available at www.jneurosci.org
data, CRMP4a upregulation occurs at an early stage of the disease
as supplemental material). Thus, although there are many differprocess in vivo, making CRMP4a a candidate effector that could
ences between neurite outgrowth in vitro and axonal dieback in
potentially contribute to different aspects of the disease process,
including axon withdrawal and motoneuron cell death.
vivo, these data show that high levels of CRMP4a negatively affect
790 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
Figure 3. CRMP4a is upregulated in vivo in a subset of lumbar motoneurons of presymptomatic mutant SOD1 mice. A, Wild-type (90 d), presymptomatic (60 d), and early symptomatic (90 d) SOD1 G93A mice were perfused and cryosections of their lumbar spinal cords
were immunostained for NeuN (green) or CRMP4a (red). Scale bar, 100 ␮m. B, Quantification of CRMP4a-positive motoneurons as a percentage of NeuN-positive motoneurons
in different mice strains (wild type, SOD1 WT, SOD1 G85R, SOD1 G93A) at different stages of
the disease: presymptomatic (150 d for SOD1 G85R and 45 or 60 d for SOD1 G93A) and early
symptomatic (90 d for SOD1 G93A) (n ⫽ 3; *p ⬍ 0.05; **p ⬍ 0.01). C, D, Western blot and
quantification of CRMP4a in lumbar spinal cord extracts of wild-type and SOD1 G93A mice
at 60, 90, and 110 d. n ⫽ 2, mean ⫾ SEM.
axonal dynamics in a manner that is dependent on neuronal class
and is not shared by the close family member CRMP2.
It remained possible that the relatively stressful process of
electroporation had rendered motoneurons more sensitive to the
effects of CRMP4a. Moreover, we needed techniques for overexpression that could be used in vivo. We therefore developed vectors for viral delivery of CRMP cDNAs. We used AAVs, as they
have been shown to be efficiently retrogradely transported to
motoneurons when injected into muscles (Kaspar et al., 2003)
and to demonstrate long-lasting expression, in particular when
using the AAV-6 serotype (Towne et al., 2008). We produced
AAV-myc-CRMP2 and AAV-myc-CRMP4a as well as AAVEGFP serotype 6 viruses and first confirmed their functionality in
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
Figure 4. Overexpression of CRMP4a in motoneurons in vitro leads to decreased axonal
outgrowth and cell death. A, NSC34 cells were infected with 10 TU per cell of AAV-myc-CRMP2
or AAV-myc-CRMP4a. Immunostaining 24 h later using an anti-myc antibody shows strong
expression of both myc-CRMP2 and myc-CRMP4a. Scale bar, 10 ␮m. B–D, Motoneurons were
infected with 10 TU/cell AAV-EGFP, AAV-myc-CRMP4a, or AAV-myc-CRMP2, and axonal length
was measured directly (for AAV-EGFP) or after immunostaining for myc (AAV-myc-CRMP4a and
AAV-myc-CRMP2) using the Neuron J software. Results in B and C show reduced axonal outgrowth with AAV-myc-CRMP4a, but not with AAV-myc-CRMP2, compared with AAV-EGFP.
Scale bar (B), 30 ␮m. Survival of infected motoneurons measured 48 h after infection shows
that overexpression of CRMP4a, but not of CRMP2, leads also to 60% cell death (D). C and D
show the average results of three different experiments. *p ⬍ 0.05; **p ⬍ 0.01 versus control
(AAV-EGFP).
vitro. Following infection of NSC34 cells (10 TU/cell), myctagged proteins were detected at high levels by immunostaining
(Fig. 4 A). In cultured neurons (Royo et al., 2008) and motoneurons (K. Langou and C. Raoul, unpublished results), infection
efficiency with AAV serotype 6 was found to be ⬃90%. Motoneurons were therefore cultured for 24 h with neurotrophic factors
before infection with AAV-EGFP, AAV-myc-CRMP4a, or AAVmyc-CRMP2, and 24 h later axonal lengths of infected motoneurons expressing EGFP or stained using anti-myc were measured.
As with electroporation, viral overexpression of CRMP4a led to a
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 791
sion of the shRNAs under the control of
the H1 promoter (Towne et al., 2008). Using Western blots, we first quantified their
silencing effect in NSC34 cells transfected
with either a CRMP4a expression vector
(pmyc-CRMP4a) plus EGFP-shCRMP4
or the same expression vector plus
the negative control EGFP-shCRMP4 mis
(sh1CRMP4 with two mismatched nucleotides). Two different (sh1 and sh2)
shRNAs were shown to decrease CRMP4a
expression levels by 50%, whereas the
mismatched shRNA had no significant
effect (Fig. 5 A, B and data not shown).
Quantitative immunocytochemistry on
electroporated motoneurons yielded similar results with a 64% inhibition of the
fluorescence level with the CRMP4sh1RNA compared with the mismatched
shRNA (Fig. 5C and data not shown). We
then tested the ability of CRMP4 silencing
to prevent the death of NO-treated
mSOD1 motoneurons. We electroporated motoneurons isolated from either
wild-type or SOD1 G93A mice with the
same combinations of vectors as deFigure 5. Silencing of CRMP4a expression protects mSOD1 motoneurons against death induced by nitric oxide. A, B, Silencing scribed above, treated them or not 24 h
efficiency of sh1CRMP4 on CRMP4 and myc expression was shown by Western blots of NSC43 cells transfected with sh1CRMP4 or later with NO, and measured cell survival
sh1CRMP4 mis together with pPGK-myc-CRMP4a; n ⫽ 2; **p ⬍ 0.01. C, The silencing efficiency of sh1CRMP4 was confirmed by 48 h later. CRMP4a-specific shRNAs
immunocytochemistry on motoneurons transfected as in A and B; Scale bar, 40 ␮m; n ⫽ 2; **p ⬍ 0.01. D, Motoneuron survival (sh1CRMP4 and sh2CRMP4), but not
was assessed at 72 h in motoneurons electroporated at the time of seeding and treated or not with NO at 24 h. Electroporation with mismatched shRNA (sh1CRMP4 mis),
two different shRNAs to CRMP4 (sh1 and sh2), but not with the negative control sh1CRMP4 mis, prevented NO-induced death of prevented NO-induced death of mSOD1
mSOD1 motoneurons; n ⫽ 3; **p ⬍ 0.01.
motoneurons without altering overall
survival levels (Fig. 5D). Thus, this lossmarked decrease in axonal length (42 ⫾ 15% of control; *p ⬍
of-function approach indicated that the increased expression of
0.05) (Fig. 4 B, C). In contrast, viral overexpression of CRMP2
CRMP4a triggered by NO in mSOD1 motoneurons is responsible
had no effect on axon length, although the tagged protein was
for their death.
expressed at levels similar to those of CRMP4a (Fig. 4 B, C).
The reduction in axon length we observed could reflect either
In vivo overexpression of CRMP4a, but not of CRMP2, in
a slowing of normal development in vitro or the beginning of a
lumbar motoneurons induces motoneuron death and
process of neuronal degeneration. To distinguish between these
neuromuscular denervation in the gastrocnemius muscle
possibilities, we monitored survival of neurons infected with
The availability of AAV vectors allowed us to test whether inAAV-myc-CRMP4a over the first 2 d postinfection. After 24 h,
creased levels of CRMP4a, as found in motoneurons of presympsurvival of motoneurons infected with AAV-myc-CRMP4a was
tomatic mSOD1 mice, could potentially be sufficient to trigger
already reduced to 60 ⫾ 12% of AAV-EGFP control values
motoneuron degeneration and death. Intramuscular injection of
(data not shown). Neuronal loss continued over the next day
AAV viruses allows for highly efficient transduction of motoneuand, at 48 h postinfection, survival of CRMP4a-infected morons in the corresponding pool. Gastrocnemius muscles of two
toneurons was only 40 ⫾ 3% of the AAV-EGFP control value.
groups of 40-d-old wild-type mice were injected with AAV-mycThis cell death was a specific effect of CRMP4a, because moCRMP4a or AAV-myc-CRMP2, respectively, on one side, and
toneuron survival in cultures infected with AAV-myc-CRMP2
with AAV-EGFP on the contralateral side. Three weeks after inor AAV-EGFP was always ⬎80% and did not decrease with
jection, sections of lumbar spinal cord were coimmunostained
time (Fig. 4 D). Thus, expression of CRMP4a, but not CRMP2,
for vesicular acetylcholine transporter (VAChT), together with
in cultured embryonic motoneurons is sufficient to trigger a
either EGFP (Fig. 6A) or myc (Fig. 6 B, C). In each section, the
neurodegenerative process involving reduction in axon length
percentage of VAChT-positive motoneurons that were EGFP
and cell death.
positive or myc positive was counted (Fig. 6 D). No significant
difference in rate of infection (25–30% of lumbar motoneurons)
Inhibiting CRMP4a expression in mSOD1 motoneurons
was found between the three virus preparations, allowing us to
in vitro prevents their NO-induced death
compare the effects of overexpressing different CRMPs at signifTo test whether the increased expression of CRMP4a in mSOD1
icant levels in vivo with those of viral overexpression of EGFP,
motoneurons treated with NO played an essential role in their
which is known not to affect long-term survival (Towne et al.,
death, we designed several CRMP4-specific shRNAs and cloned
2008).
them into a bipartite vector in which expression of EGFP was
To evaluate the functional effects of CRMP overexpression,
placed under the control of the CMV promoter and the expreswe injected two groups of 10 40-d-old wild-type mice as in the
792 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
previous experiment. Three months after
injection (i.e., at 130 d), animals were
killed and alternate sections of the lumbar cord were immunostained for EGFP
and VAChT and for myc and VAChT, respectively (Fig. 7A,B). Throughout the extent of the lumbar enlargement of the cord,
numbers of surviving myc-positive and
VAChT-positive motoneurons were measured in alternate sections, while EGFPpositive and VAChT-positive motoneurons
were counted in the adjacent sections. Results were expressed as the percentage of
myc (CRMP)-positive motoneurons relative to the percentage of EGFP-positive motoneurons. Using AAV expressing CRMP2,
there was no significant decrease in motoneuron survival compared with that of
EGFP (Fig. 7C). However, as in vitro, forced
expression of CRMP4a, but not of CRMP2,
led to significant motoneuron loss: survival
of motoneurons expressing CRMP4a was
only 71 ⫾ 2% (*p ⬍ 0.05) of the value for
contralateral gastrocnemius motoneurons
expressing EGFP. Thus, overexpression of
CRMP4a is sufficient to induce motoneuron degeneration in vivo, supporting the hypothesis of an active role of CRMP4a in the
onset and/or progression of the disease in
mSOD1 mice. In vitro data indicated that
CRMP4a overexpression induced both motoneuron death and a reduction in axonal
length. We therefore asked whether overexpression of CRMP4a induced axonal
changes in vivo. Neuromuscular junctions
(NMJs) in AAV-treated mouse gastrocnemius muscles were examined for evidence
of denervation at 3 months after injection.
Longitudinal sections were stained for neurofilament and ␣-bungarotoxin (AChR).
Neurofilament-negative, ␣-bungarotoxinFigure 6. Characterization of viral infection efficiency in vivo. A–C, Experiment assessing the functionality and titration of the
positive NMJs were classified as denervated AAV vector preparations. Three weeks after injection with AAV-EGFP (contralateral side) and AAV-myc-CRMP2 or AAV-myc(Fischer et al., 2004), whereas neurofilament- CRMP4a (ipsilateral side) in the gastrocnemius muscle, double immunostaining for EGFP and VAChT (A) or myc and VAChT (B, C)
positive, ␣-bungarotoxin-positive NMJs was performed on lumbar spinal cord sections and shows good expression of all overexpressed proteins on the injected side and no
were counted as innervated (Fig. 7D). significant staining on the contralateral side. Scale bar (in A) A–C, 25 ␮m. D, Counting of EGFP-, myc-, and VAChT-positive
Quantification shows that denervation of motoneurons on serial sections through the lumbar spinal cord shows no statistically significant difference between the three
the gastrocnemius is significantly more preparations.
pronounced (18% of NMJs showing denervation) in mice injected with AAV-myc-CRMP4a than in
toneurons in vitro and in vivo is sufficient to trigger their degenmice injected with AAV-myc-CRMP2 or AAV-myc-EGFP (⬍5%
eration and death, whereas inhibiting CRMP4a expression in
denervation) (Fig. 7E). Thus, overexpression of CRMP4a in vivo
mSOD1 motoneurons prevents NO-induced death. These effects
triggers both motoneuron death and muscle denervation, two
are specific to CRMP4a and motoneurons as follows: the related
characteristic phenotypes of ALS in mSOD1 mice.
protein CRMP2 is not upregulated in mSOD1 mice and is not
sufficient to trigger motoneuron death, whereas hippocampal
Discussion
neurons are not affected by CRMP4a overexpression. These reWe have identified CRMP4a as a novel potential effector of
sults further validate our model of Fas/NO-triggered motoneuneurodegeneration in the mutant SOD1 model of ALS. Several
ron cell death as a reliable predictor of early ALS-related changes
arguments support such a role. First, CRMP4a is one of a very
in vivo.
small group of proteins that show significant upregulation in an
Definitive evidence for a role of CRMP4a in ALS pathogenesis
in vitro model of mSOD1-dependent motoneuron death. Secwill require loss-of-function approaches in mSOD1 mice in vivo.
ond, CRMP4a levels progressively increase in vivo in a subset of
One approach to reducing CRMP4a levels would be to use AAVmotoneurons in mSOD1 mice at presymptomatic and early
shRNA vectors (Raoul et al., 2005, 2006a). AAV2 vectors encodsymptomatic stages. Third, overexpression of CRMP4a in moing shRNA to human SOD1 were injected into hindlimb muscles
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 793
null-mutant mice have been developed
for CRMP1 (Charrier et al., 2006; Su et
al., 2007) and CRMP3 (Quach et al.,
2008a,b), no knock-out strains exist for
CRMP4.
The results of our initial proteomic approach are clearly validated by expression
studies on mSOD1 motoneurons in vitro
and in vivo. Yet, despite the existence of a
considerable number of prior microarray
and proteomic studies focusing on mutant SOD1 mice, this is the first report to
implicate CRMP4a. There are several potential explanations for this. One reason
may be the highly selective filter we put on
the proteomic data: we searched for proteins that would be specifically regulated
by NO only in the mutant SOD1 context.
Our published data led us to believe that
these would constitute a subset of proteins
activated by Fas and involved in SOD1related cell death (Raoul et al., 2002). In
contrast, a comparable proteomic study
analyzed the effects of stable overexpression of mSOD1 in the motoneuron-like
cell line NSC34 (Allen et al., 2003). This
study identified several changes that could
be confirmed in postmortem material
from ALS patients. However, these cells
are clearly not identical to primary motoneurons, and it is possible that high levels of CRMP4a were inconsistent with
generation of stable mSOD1 overexpressors. Several groups have used a proteomic approach to analyze spinal cord
extracts of mutant SOD1 mice at different
stages of the disease (Perluigi et al., 2005;
Massignan et al., 2007), but the fact that
the affected motoneurons represent only a
small minority of spinal cord cells may
conceal motoneuron-specific changes such
as the one we report. Using a microarray
approach, Saxena et al. (2009) recently reported a comparative analysis of longitudiFigure 7. Viral overexpression of CRMP4a in vivo leads to motoneuron degeneration and muscle denervation. A, B, Two cohorts nal molecular changes in vulnerable (fast)
of 10 mice were injected in the gastrocnemius muscle with AAV-EGFP on the contralateral side and either AAV-myc-CRMP2 (A) or and resistant (slow) motoneurons innerAAV-myc-CRMP4a (B) on the ipsilateral side. Ninety days later, mice were perfused with fixative, and spinal cords and muscle were vating different muscle compartments in
dissected. A–C, Double immunostaining was performed on alternate sections of the lumbar spinal cord, one for EGFP and VAChT,
mSOD1 mice. There are dynamic changes
the adjacent one for myc and VAchT. Scale bar (in B) A, B, 25 ␮m. C, Positive immunostained motoneurons were counted
in expression levels of multiple genes early
throughout the lumbar spinal cord. A 30% decrease in motoneuron survival is observed only in mice overexpressing CRMP4a,
compared with EGFP. D, E, Gastrocnemius muscle sections were immunostained for neurofilament (NF) and incubated with in the disease process, culminating in the
␣-bungarotoxin. NMJs were counted as innervated when NF and ␣-bungarotoxin (AChR) colocalized (D, top) and as denervated activation of an unfolded protein rewhen NF staining was absent (D, bottom). E, An 18% increase in denervated NMJs was specifically observed in mice overexpressing sponse specifically in vulnerable neurons.
Correspondingly, disease progression was
CRMP4a. *p ⬍ 0.05; **p ⬍ 0.01, ANOVA one-factor analysis.
slowed by salubrinal, which protects
against ER stress. Thus, analysis of early
of mSOD1 mice and led to a significant delay in the loss of grip
molecular changes in diseased neurons is a valid strategy for
strength (Miller et al., 2005). Nevertheless, because expression
identifying candidate therapeutics. However, although miwas restricted to a limited number of motoneurons, there was no
croarray approaches are extremely useful, they necessarily delong-term effect on survival or motor behavior. A more complete
tect modifications in accumulation or stability only of mRNA,
evaluation of the role of CRMP4 would involve crossing mice
not of protein.
with targeted deletions of CRMP4 with mSOD1 mice to deterTwo previous reports have linked CRMP family members to
mine whether this confers benefit for survival, muscle innervaneurodegenerative disorders. Increased expression of CRMPs has
tion, and/or motoneuron numbers. Unfortunately, although
been observed in Alzheimer’s disease, in which CRMP2 was
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
794 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
found to be associated with tangles (Yoshida et al., 1998). In
bovine spongiform encephalopathy (BSE), CRMP4 was specifically upregulated in the brain of BSE-infected mice (Auvergnon
et al., 2009). In both cases, it was unclear whether upregulation
reflected an attempt by the neurons to block degeneration, a
protective effect, or to accelerate the disease process. Our data on
the ability of CRMP4a to trigger axonal degeneration and motoneuron death argue for an active role in this and other degenerative processes. It will therefore be interesting to determine
whether CRMP4a is also upregulated during the development of
the SOD1-linked and sporadic forms of ALS in human patients.
In the microarray data of Jiang et al. (2005) on laser-captured
human postmortem motoneurons, CRMP4 mRNA levels show
no change in ALS, whereas CRMP2 is downregulated 2.7-fold.
This may reflect a difference between sporadic and SOD1-linked
ALS, but it is also possible that the most resistant motoneurons,
which persist in late-stage patients, do not overexpress CRMP4 to
a detectable extent.
Indeed, it was striking that in our study the fraction of motoneurons expressing high levels of CRMP4a in mSOD1 lumbar
spinal cord never exceeded 25%, whereas the percentage of motoneuron loss in the SOD1 G93A strain of mice we used has been
estimated at ⬃40% at symptomatic stages (Bendotti et al., 2004).
There are three potential explanations for this fractional labeling.
First, at any given point in time only a fraction of those motoneurons destined to die may express high levels of CRMP4, perhaps
reflecting the progressive loss of those motoneurons expressing
the highest levels of CRMP4a. Second, a subset of motoneurons
may die using other pathways/effectors. If the second hypothesis
were true, it would be intriguing to determine whether high
CRMP4 expressors correspond to particularly susceptible
groups, such as the fast fatigable motoneurons innervating the
lateral gastrocnemius muscle (Frey et al., 2000), and whether
CRMP4 fails to be expressed in the motor nuclei (oculomotor
and Onuf’s nucleus) known to be ALS resistant (Mannen et al.,
1982; Bergmann, 1993).
In evaluating the role of CRMP4 in ALS pathology, one important question concerns the relative timing of the changes described here and others reported in the literature. After a neonatal
period in which motoneuron excitability is altered (Durand et al.,
2006; van Zundert et al., 2008), the first morphological changes to
be detected are at the neuromuscular junction where motor axons die back, leading to skeletal muscle paralysis that is only
transiently overcome by regenerative axon sprouting (Frey et al.,
2000; Fischer et al., 2004; Schaefer et al., 2005). Fast motor units
are more vulnerable than slow motor units to axonal dieback,
even within the same muscle (Pun et al., 2006). Following this
phase, motoneuron cell bodies begin to die in the spinal cord
through a process with some features of programmed cell death
(Martin, 1999; Przedborski, 2004; Wengenack et al., 2004). In the
G1H line of mSOD1 G93A mice (the one we used), onset of the
disease is around 90 d, with motoneuron loss starting at around
110 d (for review, see Turner and Talbot, 2008). Our results
showing significant upregulation of CRMP4a in mSOD1 motoneurons from 60 d onward would position the action of
CRMP4a at onset and early disease. This would place it among
the earliest identified potential effectors in the mSOD1 G93A mice,
allowing it to potentially play a role in muscle denervation in the
most susceptible motor units.
How might elevated levels of CRMP4a contribute to the ALS
disease process? It is not possible from our data to determine
whether the effects on axonal length and on cell survival are part
of a single mechanism, but their close temporal coincidence
in vitro would argue for this. The fact that overexpressing
CRMP4a leads to both axonal dieback and motoneuron death
argues for a critical role of CRMP4a in ALS pathogenesis, as these
two features are hallmarks of the disease (Bruijn et al., 2004;
Fischer et al., 2004). Although little is known about cell death
triggered by CRMPs, a number of studies have implicated them
in regulation of neurite outgrowth. Proposed mechanisms for the
actions of CRMP2, the most studied, involve regulation of microtubule assembly (Fukata et al., 2002), endocytosis of adhesion
molecules (Nishimura et al., 2003), reorganization of actin filaments (Kawano et al., 2005), and axonal trafficking of proteins
(Kimura et al., 2005). However, no such mechanistic studies have
been reported for CRMP4. Because in our hands CRMP2 showed
no activity in motoneurons, and CRMP4a no activity in hippocampal neurons, the mechanisms of degeneration and death
triggered by CRMP4a are likely to be different from those activated by other CRMPs. If, like the Fas/NO pathway by which
CRMP4a expression is triggered, they are motoneuron specific,
they are of potentially high significance as therapeutic targets.
Overall, molecular profiling of an in vitro model of ALS has led
us to discover a potential effector whose pattern of expression in
mSOD1 ALS mice and whose properties when overexpressed, fit
it well for a role in the disease process. Further confirmation of
the significance of CRMP4a will require loss-of-function studies
in vivo and expression studies in human postmortem spinal cord,
but the pathways triggered by Fas, NO, and CRMP4a itself are
already worthy of further investigation as potential levels at
which to intervene therapeutically.
References
Alabed YZ, Pool M, Ong Tone S, Fournier AE (2007) Identification of
CRMP4 as a convergent regulator of axon outgrowth inhibition. J Neurosci 27:1702–1711.
Allen S, Heath PR, Kirby J, Wharton SB, Cookson MR, Menzies FM, Banks
RE, Shaw PJ (2003) Analysis of the cytosolic proteome in a cell culture
model of familial amyotrophic lateral sclerosis reveals alterations to the
proteasome, antioxidant defenses, and nitric oxide synthetic pathways.
J Biol Chem 278:6371– 6383.
Arce V, Garces A, de Bovis B, Filippi P, Henderson C, Pettmann B,
deLapeyriere O (1999) Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique.
J Neurosci Res 55:119 –126.
Arimura N, Menager C, Fukata Y, Kaibuchi K (2004) Role of CRMP-2 in
neuronal polarity. J Neurobiol 58:34 – 47.
Auvergnon N, Reibel S, Touret M, Honnorat J, Baron T, Giraudon P, Bencsik
A (2009) Altered expression of CRMPs in the brain of bovine spongiform encephalopathy-infected mice during disease progression. Brain
Res 1261:1– 6.
Bendotti C, Atzori C, Piva R, Tortarolo M, Strong MJ, DeBiasi S, Migheli A
(2004) Activated p38MAPK is a novel component of the intracellular
inclusions found in human amyotrophic lateral sclerosis and mutant
SOD1 transgenic mice. J Neuropathol Exp Neurol 63:113–119.
Bergmann M (1993) Motor neuron disease/amyotrophic lateral sclerosis–
lessons from ubiquitin. Pathol Res Pract 189:902–912.
Boillee S, Vande Velde C, Cleveland DW (2006) ALS: a disease of motor
neurons and their nonneuronal neighbors. Neuron 52:39 –59.
Bruijn LI, Becher MW, Lee MK, Anderson KL, Jenkins NA, Copeland NG,
Sisodia SS, Rothstein JD, Borchelt DR, Price DL, Cleveland DW (1997)
ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and
promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron 18:327–338.
Bruijn LI, Miller TM, Cleveland DW (2004) Unraveling the mechanisms
involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci
27:723–749.
Cashman NR, Durham HD, Blusztajn JK, Oda K, Tabira T, Shaw IT, Dahrouge S,
Antel JP (1992) Neuroblastoma ⫻ spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev Dyn 194:209 –221.
Charrier E, Reibel S, Rogemond V, Aguera M, Thomasset N, Honnorat J
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
(2003) Collapsin response mediator proteins (CRMPs): involvement in
nervous system development and adult neurodegenerative disorders. Mol
Neurobiol 28:51– 64.
Charrier E, Mosinger B, Meissirel C, Aguera M, Rogemond V, Reibel S, Salin
P, Chounlamountri N, Perrot V, Belin MF, Goshima Y, Honnorat J,
Thomasset N, Kolattukudy P (2006) Transient alterations in granule cell
proliferation, apoptosis and migration in postnatal developing cerebellum of CRMP1⫺/⫺ mice. Genes Cells 11:1337–1352.
Delcourt N, Jouin P, Poncet J, Demey E, Mauger E, Bockaert J, Marin P,
Galeotti N (2005) Difference in mass analysis using labeled lysines
(DIMAL-K): a new, efficient proteomic quantification method applied to
the analysis of astrocytic secretomes. Mol Cell Proteomics 4:1085–1094.
Durand J, Amendola J, Bories C, Lamotte d’Incamps B (2006) Early abnormalities in transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.
J Physiol Paris 99:211–220.
Fischer LR, Culver DG, Tennant P, Davis AA, Wang M, Castellano-Sanchez
A, Khan J, Polak MA, Glass JD (2004) Amyotrophic lateral sclerosis is a
distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp Neurol 185:232–240.
Frey D, Schneider C, Xu L, Borg J, Spooren W, Caroni P (2000) Early and
selective loss of neuromuscular synapse subtypes with low sprouting
competence in motoneuron diseases. J Neurosci 20:2534 –2542.
Fukata Y, Itoh TJ, Kimura T, Menager C, Nishimura T, Shiromizu T,
Watanabe H, Inagaki N, Iwamatsu A, Hotani H, Kaibuchi K (2002)
CRMP-2 binds to tubulin heterodimers to promote microtubule assembly. Nat Cell Biol 4:583–591.
Gurney ME, Pu H, Chiu AY, Dal Canto MC, Polchow CY, Alexander DD,
Caliendo J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, Chen W, Zhai P, Sufit RL,
Siddique T. (1994) Motor neuron degeneration in mice that express a
human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264:1772–1775.
Inagaki N, Chihara K, Arimura N, Menager C, Kawano Y, Matsuo N, Nishimura
T, Amano M, Kaibuchi K (2001) CRMP-2 induces axons in cultured hippocampal neurons. Nat Neurosci 4:781–782.
Jiang YM, Yamamoto M, Kobayashi Y, Yoshihara T, Liang Y, Terao S,
Takeuchi H, Ishigaki S, Katsuno M, Adachi H, Niwa J, Tanaka F, Doyu
M, Yoshida M, Hashizume Y, Sobue G (2005) Gene expression profile of spinal motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Ann Neurol 57:236 –251.
Kaspar BK, Lladó J, Sherkat N, Rothstein JD, Gage FH {2003) Retrograde
viral delivery of IGF-1 prolongs survival in mouse ALS model. Science
301:839 – 842.
Kawano Y, Yoshimura T, Tsuboi D, Kawabata S, Kaneko-Kawano T,
Shirataki H, Takenawa T, Kaibuchi K (2005) CRMP-2 is involved in
kinesin-1-dependent transport of the Sra-1/WAVE1 complex and axon
formation. Mol Cell Biol 25:9920 –9935.
Kiaei M, Kipiani K, Calingasan NY, Wille E, Chen J, Heissig B, Rafii S, Lorenzl
S, Beal MF (2007) Matrix metalloproteinase-9 regulates TNF-alpha and
FasL expression in neuronal, glial cells and its absence extends life in a
transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol
205:74 – 81.
Kimura T, Watanabe H, Iwamatsu A, Kaibuchi K (2005) Tubulin and
CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1. J Neurochem
93:1371–1382.
Liu PC, Yang ZJ, Qiu MH, Zhang LM, Sun FY (2003) Induction of CRMP-4
in striatum of adult rat after transient brain ischemia. Acta Pharmacol Sin
24:1205–1211.
Locatelli F, Corti S, Papadimitriou D, Fortunato F, Del Bo R, Donadoni C,
Nizzardo M, Nardini M, Salani S, Ghezzi S, Strazzer S, Bresolin N, Comi
GP (2007) Fas small interfering RNA reduces motoneuron death in
amyotrophic lateral sclerosis mice. Ann Neurol 62:81–92.
Mannen T, Iwata M, Toyokura Y, Nagashima K (1982) The Onuf’s nucleus
and the external anal sphincter muscles in amyotrophic lateral sclerosis
and Shy-Drager syndrome. Acta Neuropathol 58:255–260.
Martin LJ (1999) Neuronal death in amyotrophic lateral sclerosis is apoptosis: possible contribution of a programmed cell death mechanism. J Neuropathol Exp Neurol 58:459 – 471.
Massignan T, Casoni F, Basso M, Stefanazzi P, Biasini E, Tortarolo M,
Salmona M, Gianazza E, Bendotti C, Bonetto V (2007) Proteomic analysis of spinal cord of presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis G93A
SOD1 mouse. Biochem Biophys Res Commun 353:719 –725.
Miller TM, Kaspar BK, Kops GJ, Yamanaka K, Christian LJ, Gage FH, Cleveland
DW (2005) Virus-delivered small RNA silencing sustains strength in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 57:773–776.
J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796 • 795
Minturn JE, Fryer HJ, Geschwind DH, Hockfield S (1995) TOAD-64, a gene
expressed early in neuronal differentiation in the rat, is related to unc-33,
a C. elegans gene involved in axon outgrowth. J Neurosci 15:6757– 6766.
Nishimura T, Fukata Y, Kato K, Yamaguchi T, Matsuura Y, Kamiguchi H,
Kaibuchi K (2003) CRMP-2 regulates polarized Numb-mediated endocytosis for axon growth. Nat Cell Biol 5:819 – 826.
Pasterkamp RJ, Verhaagen J (2001) Emerging roles for semaphorins in neural regeneration. Brain Res Brain Res Rev 35:36 –54.
Perluigi M, Fai Poon H, Hensley K, Pierce WM, Klein JB, Calabrese V, De
Marco C, Butterfield DA (2005) Proteomic analysis of 4-hydroxy-2nonenal-modified proteins in G93A-SOD1 transgenic mice–a model of
familial amyotrophic lateral sclerosis. Free Radic Biol Med 38:960 –968.
Przedborski S (2004) Programmed cell death in amyotrophic lateral sclerosis: a mechanism of pathogenic and therapeutic importance. Neurologist
10:1–7.
Pun S, Santos AF, Saxena S, Xu L, Caroni P (2006) Selective vulnerability
and pruning of phasic motoneuron axons in motoneuron disease alleviated by CNTF. Nat Neurosci 9:408 – 419.
Quach TT, Duchemin AM, Rogemond V, Aguera M, Honnorat J, Belin MF,
Kolattukudy PE (2004) Involvement of collapsin response mediator
proteins in the neurite extension induced by neurotrophins in dorsal root
ganglion neurons. Mol Cell Neurosci 25:433– 443.
Quach TT, Massicotte G, Belin MF, Honnorat J, Glasper ER, Devries AC,
Jakeman LB, Baudry M, Duchemin AM, Kolattukudy PE (2008a)
CRMP3 is required for hippocampal CA1 dendritic organization and
plasticity. FASEB J 22:401– 409.
Quach TT, Glasper ER, Devries AC, Honnorat J, Kolattukudy PE, Duchemin
AM (2008b) Altered prepulse inhibition in mice with dendrite abnormalities of hippocampal neurons. Mol Psychiatry 13:656 – 658.
Quinn CC, Chen E, Kinjo TG, Kelly G, Bell AW, Elliott RC, McPherson PS,
Hockfield S (2003) TUC-4b, a novel TUC family variant, regulates neurite outgrowth and associates with vesicles in the growth cone. J Neurosci
23:2815–2823.
Raoul C, Henderson CE, Pettmann B (1999) Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol
147:1049 –1062.
Raoul C, Estevez AG, Nishimune H, Cleveland DW, deLapeyriere O, Henderson
CE, Haase G, Pettmann B (2002) Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas. potentiation by ALS-linked SOD1 mutations. Neuron 35:1067–1083.
Raoul C, Abbas-Terki T, Bensadoun JC, Guillot S, Haase G, Szulc J, Henderson
CE, Aebischer P (2005) Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through
RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model
of ALS. Nat Med 11:423– 428.
Raoul C, Barker SD, Aebischer P (2006a) Viral-based modelling and correction of neurodegenerative diseases by RNA interference. Gene Ther
13:487– 495.
Raoul C, Buhler E, Sadeghi C, Jacquier A, Aebischer P, Pettmann B, Henderson
CE, Haase G (2006b) Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx,
and FasL. Proc Natl Acad Sci U S A 103:6007– 6012.
Rogemond V, Auger C, Giraudon P, Becchi M, Auvergnon N, Belin MF,
Honnorat J, Moradi-Ameli M (2008) Processing and nuclear localization of CRMP2 during brain development induce neurite outgrowth inhibition. J Biol Chem 283:14751–14761.
Royo NC, Vandenberghe LH, Ma JY, Hauspurg A, Yu L, Maronski M,
Johnston J, Dichter MA, Wilson JM, Watson DJ (2008) Specific AAV
serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures
with high efficiency and low toxicity. Brain Res 1190:15–22.
Saxena S, Cabuy E, Caroni P (2009) A role for motoneuron subtypeselective ER stress in disease manifestations of FALS mice. Nat Neurosci
12:627– 636.
Schaefer AM, Sanes JR, Lichtman JW (2005) A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.
J Comp Neurol 490:209 –219.
Su KY, Chien WL, Fu WM, Yu IS, Huang HP, Huang PH, Lin SR, Shih JY, Lin
YL, Hsueh YP, Yang PC, Lin SW (2007) Mice deficient in collapsin response mediator protein-1 exhibit impaired long-term potentiation and
impaired spatial learning and memory. J Neurosci 27:2513–2524.
Suzuki Y, Nakagomi S, Namikawa K, Kiryu-Seo S, Inagaki N, Kaibuchi K,
796 • J. Neurosci., January 13, 2010 • 30(2):785–796
Aizawa H, Kikuchi K, Kiyama H (2003) Collapsin response mediator
protein-2 accelerates axon regeneration of nerve-injured motor neurons
of rat. J Neurochem 86:1042–1050.
Towne C, Raoul C, Schneider BL, Aebischer P (2008) Systemic AAV6 delivery mediating RNA interference against SOD1: neuromuscular transduction does not alter disease progression in fALS mice. Mol Ther 16:
1018 –1025.
Turner BJ, Talbot K (2008) Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent
models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol
85:94 –134.
van Zundert B, Peuscher MH, Hynynen M, Chen A, Neve RL, Brown RH Jr,
Constantine-Paton M, Bellingham MC (2008) Neonatal neuronal cir-
Duplan et al. • Role of CRMP4a in Motoneuron Death
cuitry shows hyperexcitable disturbance in a mouse model of the adultonset neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci
28:10864 –10874.
Wengenack TM, Holasek SS, Montano CM, Gregor D, Curran GL, Poduslo JF
(2004) Activation of programmed cell death markers in ventral horn
motor neurons during early presymptomatic stages of amyotrophic lateral sclerosis in a transgenic mouse model. Brain Res 1027:73– 86.
Wong PC, Borchelt DR (1995) Motor neuron disease caused by mutations
in superoxide dismutase 1. Curr Opin Neurol 8:294 –301.
Yoshida H, Watanabe A, Ihara Y (1998) Collapsin response mediator
protein-2 is associated with neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease.
J Biol Chem 273:9761–9768.
A
normalized spot volume (x10,000)
Protein
name
Accession
number
Peptides
Coverage
(%)
14-3-3 zeta
P63101
12/32
37
Calreticulin
P14211
10/18
CRMP4-1
Q62188
CRMP4-2
Mascot
score
wildtype
wildtype
+ NO
SOD1G85R
SOD1G85R
+ NO
63
20.5 ± 4.3
22.8 ± 5.3
44.6 ± 6.9
48.0 ± 7.7
26
71
28.6 ± 5.3
37.8 ± 7.7
27.3 ± 5.1
13.8 ± 2.4
12/15
27
154
9.7 ± 3.8
8.5 ± 2.4
9.0 ± 4.2
24.5 ± 5.8
Q62188
8/11
19
91
5.2 ± 1.8
5.1 ± 1.5
7.4 ± 2.5
10.2 ± 2.6
HSP 90-B
P11499
23/37
29
118
7.2 ± 2.6
14.3 ± 3.7
7.9 ± 2.9
14.8 ± 3.8
Peroxiredoxin-2
Q61171
5/6
26
111
15.1 ± 2.6
21.9 ± 5.0
34.0 ± 6.7
40.0 ± 5.9
0
800
1000
1200
1400
1600
1800
m/z
Supplementary figure 1
Duplan, L et al.
2030.913
1710.789
1725.832
1748.972
1787.785
Supplementary figure 1
Duplan, L et al.
2052.914
2
1622.821
1141.654
4
1031.557
6
1009.518
Intensity x 10-4
(arbitrary units)
8
992.558
B
2000
2200
co
nt
yc
ro
-C
l
R
M
pm
yc P4a
-C
R
M
P2
4a
D
EGFP
Supplementary figure 2
Duplan, L et al.
P2
M
l
a
P4
M
60
R
-C
yc
pm
ro
nt
co
R
-C
yc
pm
axonal length (% control)
EGFP
axonal length (% control)
P2
p
+ myc
pE -C
G R
FP M
p
+ myc
pE -C
G R
FP M
P
electroporated motoneurons
FP
p
+ m yc
pE -C
G R
FP M
4a
P2
p
+ m yc
pE -C
G R
FP M
P
e
+ .v
pE
G
B
pm
FP
e
+ .v
pE
G
electroporated
hippocampal neurons
pm
yc
-C
R
M
P4
a
ed
P2
ct
M
fe
R
ns
-C
tra
yc
npm
no
A
myc
actin
C
140
120
100
80
*
40
20
0
E
140
120
100
80
60
40
20
0
Supplementary Figure 1. Table of proteins showing a reproducible modified expression in different
culture conditions and MALDI-TOF MS analysis of a CRMP4 tryptic digest
A, Identification by MALDI-TOF MS of all detected proteins showing reproducibly modified expression in
mSOD1 motoneurons treated or not with NO compared with wildtype motoneurons treated or not with NO. B,
Peptide masses matching mouse CRMP4 sequence (Swiss-Prot Acc No. Q62188, Mascot score 154,
sequence coverage, 27%) are depicted on the spectrum. Note that no specific peptide of the basic or the
acidic spot was detected.
Supplementary figure 2. Overexpression of CRMP4a by electroporation leads to decreased axonal
outgrowth in motoneurons
A, Expression of the myc-tagged-CRMP vectors was tested by Western blot in NSC34 motoneuron-like cells.
Embryonic motoneurons (B, C) or hippocampal neurons (D, E) from wildtype mice were co-electroporated
with pmyc-CRMP4a or pmyc-CRMP2 + pEGFP or pmyc (e.v) + pEGFP. After 1 DIV for motoneurons and
3DIV for hippocampal neurons, axonal lengths were measured directly on EGFP positive cells or after
immunostaining for CRMP4a or for CRMP2 using Image J software. Panels C, E show the average results of
three different experiments. ** P < 0.01 versus control. Scale bar = 25 µm.
Résultats
201
Discussion et Perspectives
DISCUSSION et PERSPECTIVES
202
Discussion et Perspectives
I. Discussion: Calréticuline, un facteur de vulnérabilité des
motoneurones mSOD1
Nous avons pu montrer que la diminution de l’expression de la calréticuline est un élément critique
dans la vulnérabilité des motoneurones dans la SLA. La diminution de cette protéine est nécessaire
et suffisante pour induire la mort liée à l’activation de la voie Fas/NO. Dans la souris mSOD1, CRT
est diminuée à partir de 38 jours, un stade qui correspond au pic d’activation du stress du RE dans
les motoneurones vulnérables, et qui précède de plusieurs jours la dénervation de cette population
de motoneurones. La CRT contribue à la fois à l’activation en boucle de la voie Fas/NO et au
recrutement de voies de stress cellulaire, notamment le stress lié au calcium et le stress du RE. La
combinaison de défauts dans l’homéostasie calcique, de la diminution de CRT et de l’activation du
stress du RE caractériseraient la vulnérabilité et la mort sélective d’une population de motoneurones
Au cours de cette discussion, nous aborderons dans un premier temps l’implication de la voie
Fas/NO, du calcium, du stress du réticulum endoplasmique et de la diminution de la calréticuline
dans la vulnérabilité de certain motoneurones mSOD1. Ensuite, nous discuterons de la diminution
de la calréticuline dans d’autres modèles de maladie neurodégénératives. Enfin, nous traiterons de
la défaillance des systèmes d’homéostasie protéique dans les maladies neurodégénératives et liée à
l’âge, qui favorisent les processus d’agrégation et de stress cellulaires.
A) Mécanismes de la vulnérabilité d’une sous population de
motoneurones exprimant la SOD1 mutée (mSOD1): rôle du
« cercle vicieux » Fas/NO?
Bien que cette hypothèse puisse dépendre du type de mSOD1, des travaux ont montré que, si la
progression de la maladie chez les souris mSOD1 était plutôt dépendante des cellules environnantes
aux motoneurones, telles que les astrocytes et la microglie, le déclenchement de la maladie
semblait lui dépendant d’un processus cellule-autonome dicté par la présence même de la SOD1
mutée dans les motoneurones (Boillee et al., 2006b).
203
Discussion et Perspectives
Ce déclenchement serait la conséquence de l’activation chronique d’un certain nombre de stress
cellulaires, dus à la présence de la SOD1 mutée, qui atteindraient un seuil critique pour la survie du
motoneurone.
Or les travaux antérieurs de l’équipe dans laquelle j’ai effectué ma thèse avaient montré qu’une
sous-population de motoneurones exprimant la SOD1 mutée présentait une hypersensibilité à la
voie de mort Fas/NO et mourrait à des doses de FasL ou de NO 10 à 100 fois plus faibles que celles
nécessaires à la mort des motoneurones sauvages. Cependant les mécanismes à la base de cette
hypersensibilité restaient mal compris. L’équipe a ensuite démontré l’existence in vitro et in vivo
d’une boucle d’amplification Fas --> NO --> FasL --> Fas, liée d’une manière inconnue à la
présence de la mSOD1. Cette boucle permettrait d’expliquer la nature cumulative du processus
dégénératif aboutissant à la mort progressive des motoneurones. La mise en évidence de
l’ensemble des acteurs de cette boucle dès les stades pré-symptomatiques de la maladie, aussi bien
chez les souris mSOD1 que chez les patients SLA sporadiques et familiales (Holasek et al., 2005;
Ranganathan and Bowser, 2010; Raoul et al., 2006) a souligné l’importance de cette voie de mort
dans la maladie. Sur un plan plus fonctionnel, des travaux ont montré que l’inhibition de la voie Fas,
au moment du déclenchement de la maladie allongeait la survie des souris mSOD1 (Locatelli et al.,
2007). Comme précisé plus haut, la nature de la liaison entre la susceptibilité accrue des
motoneurones mSOD1 à Fas/NO et la vulnérabilité sélective de sous-populations de motoneurones
mSOD1 demeuraient mal connue. Nous avons voulu identifier des effecteurs de la mort Fas/NO qui
pouvaient jouer dans la vulnérabilité des motoneurones mSOD1.
Au sein du laboratoire de Chris Henderson, une étude de protéomique a été réalisée afin d’identifier
des effecteurs moléculaires qui seraient recrutés après stimulation à la voie Fas/NO spécifiquement
dans les motoneurones mSOD1. C’est par cette technique que nous avons pu mettre en évidence
une diminution de moitié de l’expression de la calréticuline uniquement dans les motoneurones
mSOD1 traités par FasL ou par NO. Nos travaux ont montré que la diminution de la calréticuline
d’une part était nécessaire et suffisante pour induire la mort des motoneurones, d’autre part
entrainait la surexpression de FasL participant activement à l’amplification de la boucle Fas/NO.
204
Discussion et Perspectives
Nous avons également montré que la diminution de l’expression de la CRT était restreinte aux
motoneurones vulnérables à la SLA, suggérant un rôle important de ce phénomène dans leur mort
Fas-dépendante.
B)
La
perturbation
de
l’homéostasie
calcique
dans
les
motoneurones mSOD1 vulnérables dans la maladie
Nos travaux in vitro ont montré que les motoneurones stimulés par Fas, présentaient
séquentiellement une augmentation intracellulaire de calcium à 3h, puis une diminution de CRT et
une augmentation de stress du RE à 16h. Ces phénomènes participeraient tous trois à la
vulnérabilité des motoneurones dans la SLA:
1. Le calcium et la vulnérabilité des motoneurones: La mort des
motoneurones mSOD1 par Fas/NO implique des défauts d’homéostasie
calcique
Les motoneurones ont besoin de pouvoir disposer rapidement de calcium pour assurer leurs
fonctions. Par contre, par rapport à d’autres types neuronaux, ils ont plus de difficulté à gérer
d’importantes augmentations de calcium intracellulaire (Langou et al., 2010).
Nous avons montré que la concentration de calcium intracellulaire ([Ca2+i]) augmentait dans les
motoneurones, soit suite à l’ajout de FasL soit en présence de mSOD1. Cependant, la combinaison
ajout de FasL et présence de mSOD1 conduit à une concentration deux fois plus élevée de [Ca2+i].
L’une des raisons de cette augmentation de Ca2+i pourrait être due d’une part, à un mauvais
tamponnage du calcium par les organelles (mitochondrie et réticulum endoplasmique) dans ces
motoneurones et d’autre part à une activation de canaux calciques qui permettrait un entrée de
calcium du milieu extracellulaire.
Notre technique de mesure du Ca2+i au Fura red AM ne nous a pas permis de mesurer la [Ca2+i]
dans la mitochondrie ou le RE, cependant des travaux ont montré que des défauts de tamponnage
205
Discussion et Perspectives
du calcium intracellulaire pouvaient être à l’origine d’une augmentation du calcium intracellulaire
dans les motoneurones mSOD1.
En effet, les auteurs, ont comparé les niveaux de concentration de calcium dans la mitochondrie,
dans le RE et dans le cytoplasme dans des cultures mixtes de motoneurones-neurones sensoriels
après avoir effectué des microinjections de mSOD1 ou de SOD1WT dans les motoneurones. Ils ont
observé à un jour in vitro (JIV), une augmentation significative du calcium dans la mitochondrie des
motoneurones mSOD1, suivie à 3 JIV d’une augmentation dans le RE, et enfin à 5 JIV seulement,
une augmentation du calcium cytosolique, bien qu’il y ait déjà une tendance à l’augmentation à 3
JIV (Tradewell et al., 2011). Cette augmentation plus tardive de calcium cytoplasmique serait
causée par la libération de calcium de la mitochondrie et du RE, dont la capacité de tamponnage a
été montrée diminuée in vitro et in vivo (Damiano et al., 2006; Jaiswal and Keller, 2009). Nos
résultats diffèrent en termes de cinétique puisque nous observons des défauts de l’homéostasie
calcique dès 1 JIV après un traitement avec FasL de 3h. Cette différence peut s’expliquer d’une part
par l’utilisation de motoneurones issus d’embryons mSOD1 ou sauvage, et non de cellules
microinjectées pour exprimer la mSOD1, d’autre part par le fait que nos cultures sont des
motoneurones purifiés et non une culture mixte motoneurones-neurones sensoriels.
Nos résultats montrent que la combinaison de la présence de la mSOD1 et de FasL double la [Ca2+i]
par rapport aux motoneurones mSOD1, et que cette concentration est toxique pour les
motoneurones puisque l’ajout du chélateur de calcium intracellulaire BAPTA-AM permet de sauver
uniquement les motoneurones mSOD1 traités par FasL. Au contraire, la modeste augmentation de
calcium observée dans les motoneurones sauvages après stimulation de Fas ne semble pas
suffisante pour entrainer la mort de ces motoneurones. Des travaux sur des cellules Jurkat ont
établi que l’activation du récepteur Fas pouvait conduire à une libération de calcium du RE par les
récepteurs à l’inositol triphosphate (IP3R) et qu’une libération massive de calcium pouvait conduire à
l’apoptose (Wozniak et al., 2006). Nous aurions pu vérifier cette hypothèse, en utilisant un
inhibiteur de la sortie de calcium du RE, comme le dantrolène (Langou et al., 2010). Si l’activation
de Fas induit une sortie plus importante de calcium dans les motoneurones mSOD1, l’ajout de
206
Discussion et Perspectives
dantrolène pourrait, comme le BAPTA, empêcher la mort des motoneurones. On peut supposer, sur
la base de nos résultats et de la littérature, que la présence de la mSOD1 pourrait entraîner un
défaut de tamponnage de calcium dans les organelles et que la stimulation de Fas pourrait induire
une libération de calcium du RE. La présence de la mSOD1 cumulée à la stimulation de Fas,
permettrait d’atteindre une concentration de calcium intracellulaire suffisante pour provoquer la
mort des motoneurones. Par ailleurs, nous avons montré que la combinaison de doses non létales
de FasL et de caféine, un inducteur de libération de calcium du RE vers le cytoplasme, induisait la
mort de motoneurones sauvages.
Ces données, qui vont dans le sens d’une libération de calcium dans le cytoplasme en provenance
d’organelles intracellulaires, n’excluent pas l’hypothèse d’une entrée de calcium liée aux canaux
perméables au calcium, comme les récepteurs AMPA ou NMDA qui sont impliqués dans les
processus d’excitotoxicité des motoneurones dans la SLA (Grosskreutz et al., 2010).
On pourrait envisager des modifications de la perméabilité au calcium des canaux NMDA et AMPA
dans les motoneurones mSOD1 traités à Fas /NO, ce qui participerait à une entrée importante de
calcium intracellulaire, pouvant même conduire à un stress excitoxique (Van Den Bosch et al.,
2000). En effet, des travaux sur des neurones corticaux ont montré que la production de NO par
des astrocytes pouvait potentialiser la mort induite par la simulation des récepteurs NMDA (Hewett
et al., 1994). Afin de déterminer si une entrée de calcium à travers ces récepteurs pourrait
participer à la vulnérabilité des motoneurones mSOD1, on peut vérifier si l’ajout d’un inhibiteur de
ces canaux, comme le NBQX qui bloque les canaux AMPA/Kainate, préviendrait la mort des
motoneurones induite par Fas/NO. Et en effet, une expérience préliminaire de notre équipe semble
confirmer la participation des récepteurs AMPA dans la mort des motoneurones, l’ajout de NBQX
empêchant la mort des motoneurones mSOD1 traités au NO.
207
Discussion et Perspectives
2. Le calcium et la vulnérabilité des motoneurones: pourquoi une forte
concentration de calcium intracellulaire est-elle toxique en particulier
pour les motoneurones mSOD1 ?
Une augmentation de calcium intracellulaire peut être fatale pour des cellules qui sont, à la base,
peu armées pour tamponner une concentration excessive de calcium. Plusieurs études ont d’ailleurs
corrélé la vulnérabilité de motoneurones de la moelle épinière et du tronc cérébral (noyau
hypoglossal) dans la SLA a leur faible capacité de tamponnage du calcium, cette dernière étant 5 à
6 fois moins importante que celle des motoneurones résistants (qui ne meurent pas ou peu dans la
SLA, comme les neurones oculomoteurs) (Lips and Keller, 1998; Palecek et al., 1999). Ces
observations peuvent s’expliquer par la diminution des protéines tampons du calcium
cytoplasmique, telles que la parvalbumine et la calbindine dans les populations de motoneurones
vulnérables et non chez les résistants (Alexianu et al., 1994; Palecek et al., 1999). Chez les souris
mSOD1, la diminution de la parvalbumine et de la calbindine a été observée dès les stades
présymptomatiques et symptomatiques, respectivement (Sasaki et al., 2006).
Le calcium semblerait donc jouer un rôle important dans la vulnérabilité des motoneurones.
Cependant, il n’a pas été déterminé si, au sein des motoneurones de la moelle épinière, les
motoneurones FF (les premiers atteints dans la maladie), présentent des défauts de surcharge de
calcium ou de déficience dans leur système de tamponnage précédant leur dégénérescence.
L’excès de calcium peut être délétère pour le fonctionnement des organelles comme la mitochondrie
et le RE. Dans le cas de la mitochondrie, ce calcium entraîne une dépolarisation de la membrane
mitochondriale, la production de ROS (Petrosillo et al., 2004) et favorise le processus de
perméabilisation transitoire de la mitochondrie, conduisant à la libération de facteurs proapoptotiques (Petrosillo et al., 2004). Dans le cas du RE, des défauts d’homéostasie calcique
peuvent en autre, conduire à l’activation du stress du RE. En effet la déplétion en calcium du RE
peut amener successivement à une diminution de l’activité des chaperonnes (Berridge, 2002), donc
208
Discussion et Perspectives
à un repliement moins efficace, à des agrégations et à une activation des capteurs de stress. Des
études ont montré auparavant que l’activité globale des chaperonnes diminuait en présence de la
SOD1 mutée, dès les stades asymptomatiques (Tummala et al., 2005).
Les travaux de Tradewell et coll. et de Kim et coll. ont par aillleurs corrélé la perturbation de
l’homéostasie calcique, et notamment une augmentation de calcium intracellulaire avec la formation
d’agrégats. Ce mécanisme serait dépendant d’une surexpression de NO (Kim et al., 2007).
L’augmentation du Ca2+ et du stress oxydatif peut induire un mauvais repliement de la mSOD1
(Carriedo et al., 2000; Roy et al., 1998; Tateno et al., 2004). De plus, il a été rapporté que
l’augmentation de calcium inhibait l’activation du protéasome (Realini and Rechsteiner, 1995) qui
diminue d’ailleurs dans les modèles de SLA (Kabashi et al., 2004). Bien que nous n’ayons pas
exploré la présence d’agrégats mSOD1 dans notre modèle de culture, nous observons également
dans ces motoneurones une augmentation de calcium intracellulaire et une surexpression de NO,
qui sont en accord avec les observations ci-dessus.
Les défauts d’homéostasie calcique jouent un rôle important dans la vulnérabilité des motoneurones
mSOD1 à la mort. Le manque de tamponnage du calcium dans des sous-types de motoneurones
favorise l’augmentation de la concentration de calcium cytoplasmique, qui peut induire la production
de stress oxydatif et perturber le fonctionnement d’organelle comme le RE.
C) Le stress du RE: un signal précoce de vulnérabilité des
motoneurones mSOD1
1. L’augmentation du stress du RE, un signe pathologique précoce bien
avant la mort des motoneurones mSOD1 in vitro et in vivo
Nous avons montré dans notre étude que le stress du RE était nécessaire dans la mort des
motoneurones mSOD1 traités par FasL/NO. En effet, l’utilisation d’un inhibiteur de ce stress, tel que
le salubrinal, ou d’un inhibiteur de la caspase 12 (caspase recrutée lors d’un stress du RE), prévient
209
Discussion et Perspectives
la mort uniquement des motoneurones mSOD1 traités à Fas/NO. De plus, une augmentation des
marqueurs P-eIF2a et CHOP est observée uniquement dans les motoneurones mSOD1, dès 16
heures après l’activation de Fas. A ce même temps, l’expression de CRT est déjà diminuée d’un
facteur 2. P-eIF2a et CHOP sont des effecteurs de la voie PERK du stress du RE, et augmentent in
vitro et in vivo dans les motoneurones mSOD1 (Atkin et al., 2008; Oh et al., 2008; Saxena et al.,
2009). D’autres voies telles que celles dépendantes d’IRE1α (XBP-1) et d’ATF6 sont aussi activées
dans la SLA (Kikuchi et al., 2006). Nous avons choisi d’évaluer les effecteurs de la voie PERK car
d’une part cette voie est déclenchée préférentiellement dans les cellules déficientes en CRT et
d’autre part c’est la voie la plus rapidement initiée lors d’un stress du RE (Knee et al., 2003). En
effet, lors d’une activation du stress du RE, la réponse la plus rapide est de diminuer l’afflux de
protéines dans le RE par la phosphorylation du facteur eIF2a, cette étape ne nécessitant pas au
préalable une translocation dans le noyau, comme les facteurs XBP-1, ATF4 et ATF6 clivé. Ces
derniers facteurs seront impliqués dans la deuxième phase de stress afin de promouvoir la synthèse
de protéines impliquées dans le repliement et le contrôle qualité (chaperonnes, composants de la
dégradation) (Rutkowski and Kaufman, 2004; Woehlbier and Hetz, 2011). Nous avons observé à la
fois une augmentation de P-eIF2α, qui un facteur de la réponse UPR et de CHOP, qui est un facteur
lié à l’apoptose dépendante du RE, augmenté également chez les patients sporadiques SLA (Ito et
al., 2009). Nos résultats sont en accord avec l’idée d’un stress du RE chronique jusqu’à un seuil
critique conduisant à l’apoptose des motoneurones mSOD1. D’ailleurs la combinaison de doses non
létales de FasL et d’activateurs de stress du RE comme la thapsigargine, qui cause un stress du RE
dépendant du calcium ou la tunicamycine, induisant un stress du RE par inhibition de la
glycosylation, entraîne la mort de motoneurones sauvages. Le stress du RE serait donc un élément
important dans la vulnérabilité des motoneurones mSOD1 in vitro.
Des études élégantes ont démontré la vulnérabilité des motoneurones mSOD1 au stress du RE in
vivo. Pour cela, les différentes sous-populations de motoneurones vulnérables et résistants ont été
marquées en injectant un marqueur rétrograde dans le muscle latéral du gastrocnemius qui est
composé essentiellement d’unités motrices FF et dans le muscle soleus qui est composé d’unités
210
Discussion et Perspectives
motrices résistantes (Pun et al., 2006; Saxena et al., 2009). Un pic d’activation de la réponse UPR
c’est-à-dire une augmentation de P-eIF2a, de PERK et d’ATF4, est observé à 38 jours dans les
motoneurones vulnérables FF, soit environ 15 jours avant leur dénervation périphérique. Ces
marqueurs diminuent ensuite, pour être augmentés à nouveau autour de 60 jours dans les
motoneurones résistants FR, soit environ 20 jours avant leur dénervation.
L’augmentation de P-eIF2α a également été notée dans des neurones de la couche V du cortex,
qui correspond à la zone du cortex moteur touchée dans la maladie (Saxena et al., 2009). Une
étude récente a démontré, dans d’autres souris mSOD1, la présence de signes de dégénérescence
d’une sous-population de neurones qui sont des motoneurones cortico-bulbaires dès 30 jours, suivie
par une mort significative dès 60 jours et qui augmente à 100 jours (Ozdinler et al., 2011). Il serait
particulièrement intéressant de déterminer si la dégénérescence séquentielle de ces neurones est
précédée d’une augmentation des niveaux de stress du RE.
L’activation du stress du RE semble critique dans le processus de dégénérescence des
motoneurones car l’administration quotidienne de salubrinal avant l’augmentation de ses marqueurs
et durant toute la durée de la maladie, retardent la diminution des capacités motrices des souris
mSOD1 et augmente significativement leur espérance de vie. Le salubrinal diminue les marqueurs
de stress du RE comme BIP, et réduit aussi l’activation de la microglie (Saxena et al., 2009). Un
autre groupe (Shimazawa et al., 2010) a utilisé un autre composé, le SUN N8075, qui sauve les
cellules de la mort induite par un inducteur de stress du RE en induisant le VGF (nerve growth
factor inducible), et a montré qu’il avait un effet bénéfique sur la survie des souris SOD1G93A. Par
contre, ces auteurs n’ont pas observé de diminution des composants du stress du RE après
traitement avec ce composé ou avec du VGF. On ne peut donc pas exclure un effet neuroprotecteur
indépendant d’une inhibition du stress du RE. Le salubrinal présente donc à priori un profil de
thérapie intéressant par son effet sur la maladie, mais l’ensemble de ses actions est encore mal
connu. Il réduirait la fonction du complexe phosphatase PP1/GADD34 responsable de la
déphosphorylation d’eIF2α. Cependant le salubrinal affecterait également la mémoire à long terme
chez les souris (Costa-Mattioli et al., 2007), ce qui pourrait être gênant dans le cas de thérapies
211
Discussion et Perspectives
chroniques. Les espoirs se reportent également sur une nouvelle molécule d’inhibition du stress du
RE qui a été récemment isolée : le Ganabenz. Comme le salubrinal, cette molécule maintient la
phosphorylation d’eIF2α en perturbant l’assemblage du complexe PP1/GADD34 d’une manière dosedépendante, en se liant sur le fragment C-terminal de GADD34, qui contient le site de liaison à la
phosphatase PP1 (Tsaytler et al., 2011). Son effet sur des modèles de SLA n’a pas encore été
évalué.
2. L’agrégation de protéines un facteur initiateur du stress du RE
Dans nos travaux, nous avons montré que l’induction d’un stress du RE dépendant d’une libération
de calcium du RE (Thapsigargine) ou d’une inhibition de la glycosylation (Tunicamycine), était
capable de sensibiliser les motoneurones sauvages à une faible stimulation à FasL. Dans le cas de la
Tunicamycine, l’inhibition de la glycosylation a des conséquences néfastes sur la reconnaissance de
ces protéines par les protéines chaperonnes et donc sur leur bon repliement. Le stress du RE dans
les motoneurones mSOD1 pourrait donc dépendre d’une composante calcique et de défauts de
repliements des protéines.
Durham et coll. ont montré que la surexpression de la forme mutée de la SOD1 mais pas celle de la
forme sauvage entraînait la formation d’agrégats dans des motoneurones in vitro qui précédait la
mort par apoptose de ces cellules. La formation de ces agrégats était spécifique des motoneurones
car aucun agrégat n’était observé dans des neurones hippocampiques ou sensoriels (Durham et al.,
1997) .
D’autres études in vitro ont montré que la surexpression de la mSOD1 dans des lignées neuronales
provoquait également l’apparition d’inclusions contenant de la SOD1 dans environ 20 à 30 % des
cellules, dès 24 heures après transfection en parallèle d’une activation des voies du stress du RE et
suivie d’une mort d’environ la moitié des cellules 24 heures plus tard (Oh et al., 2008; Walker et al.,
2010). Il a été proposé que l’accumulation de la mSOD1 mal repliée puisse être responsable, dans
ce modèle, de l’activation du stress du RE, puis de l’induction de la mort. En effet, le traitement des
212
Discussion et Perspectives
cellules au salubrinal permet de réduire significativement la mort cellulaire, en diminuant
notamment l’activation du stress du RE et la formation d’agrégats (Oh et al., 2008).
Plusieurs études in vivo ont décrit l’accumulation d’agrégats au cours du temps dans la moelle
épinière des souris mSOD1 dans le cytoplasme et dans les organelles, notamment le RE (Bruijn et
al., 1998), (Wang et al., 2005b),(Johnston et al., 2000) (Furukawa et al., 2006) (Urushitani et al.,
2008). La prépondérance de ces agrégats a été corrélée à la diminution de l’activité du système
ubiquitine protéasome (Cheroni et al., 2009). Kabashi et coll. ont montré que les tissus affectés
dans la SLA comme la moelle épinière (lombaire) étaient sujets à une diminution de l’activité du
protéasome, mesurée dès 45 jours postnataux (Cheroni et al., 2009; Kabashi et al., 2004). Saxena
et coll. (Saxena et al., 2009) ont même observé une augmentation des signaux liés à l’ubiquitination
entre 26 et 32 jours postnataux dans les motoneurones mSOD1. Ces signaux diminuent ensuite,
parallèlement à l’augmentation des gènes liés à la réponse UPR, comme P-eIF2a. Cette
accumulation de signaux liés à l’ubiquitination pourrait traduire entre autre l’accumulation de la
SOD1 mutée (connue pour être mal repliée), observée dès 30 jours postnataux dans la moelle
épinière de souris mSOD1 par Johnston et coll. (Johnston et al., 2000)
Cependant, cette accumulation anormalement élevée d’ubiquitine est présente dans l’ensemble des
motoneurones alpha de la partie lombaire (vulnérables FF et résistants FR), alors que seule une
sous-population des motoneurones (FF) ayant des niveaux supérieurs d’ubiquitine est également
positive pour le marqueur de la réponse UPR, P-eIF2a. Ce sont donc les populations activant une
réponse UPR suite à l’accumulation d’agrégats, qui sont définies comme vulnérables et qui donc
dégénéreront en premier.
En conclusion, des défauts d’homéostasie calcique et l’accumulation de protéines mal repliées sont
des caractéristiques spécifiques aux motoneurones qui meurent au cours de la maladie. Ces
facteurs vont sensibiliser certaines populations qui activeront rapidement et de façon intense une
réponse au stress du RE, réponse qui maintenue de façon chronique affaiblira alors la résistance
des motoneurones à la maladie.
213
Discussion et Perspectives
D) La diminution de la calréticuline est un facteur de
vulnérabilité des motoneurones mSOD1 à la mort
1. La diminution de la calréticuline tue les motoneurones mSOD1 en
recrutant le stress du RE
La diminution de la calréticuline apparaît très tôt in vitro et in vivo bien avant la mort des
motoneurones. In vitro nous avons montré que sa diminution était spécifique du type neuronal, car
la CRT ne diminue pas dans les neurones hippocampaux et corticaux mSOD1 traités au NO. La
diminution de CRT est aussi spécifique de la nature de l’inducteur de mort car les niveaux de CRT
sont inchangés après traitement à LIGHT ou après privation de facteurs trophiques. Cette dernière
observation est importante car elle signifie que l’expression de CRT ne diminue pas dès qu’un
processus de mort est enclenché et qu’elle est spécifique de la voie Fas/NO. Il y a également une
spécificité vis-à-vis des protéines régulant l’homéostasie du calcium car la calnexine par exemple
n’est pas modifiée. La diminution de CRT n’est pas non plus due à une dégradation générale des
chaperonnes du réticulum endoplasmique car, PDI, une autre chaperonne du RE augmente dans les
motoneurones mSOD1 traités à Fas/NO. Par ailleurs, PDI augmente in vivo au cours de la
progression de la maladie, ce qui montre que notre modèle in vitro est un bon modèle de la maladie
(Atkin et al., 2006).
Dans les résultats présentés dans la publication, nous avons montré une diminution de moitié de
l’expression de la CRT à 38 jours postnataux, qui correspond à l’activation maximale de la réponse
UPR dans les motoneurones vulnérables (FF). Cependant, nous avons voulu déterminer plus
précisément si la diminution de la CRT pouvait précéder le pic d’activation de la réponse UPR à 38
jours, et nous avons pour cela analysé son niveau d’expression à 34 jours postnataux. Nous avons
observé que la CRT diminuait entre 30 et 34 jours chez les souris mSOD1, que son expression était
déjà diminuée de plus de 40% à 34 jours postnataux (souris sauvages: 100% ± 20 et souris
mSOD1 : 57 % ± 14, SD).
214
Discussion et Perspectives
La diminution de CRT apparaît entre 30 et 34 jours postnataux, et est donc concomitante au pic
d’augmentation de BIP à cette période. L’augmentation de BIP reflète les premiers signes
d’augmentation d’un stress du RE, avant le déclenchement de la réponse UPR. Lors d’un stress du
RE du à l’accumulation de protéines de mauvaises conformations, BIP libère les détecteurs de stress
du RE afin d’assurer le repliement de ces protéines (Bertolotti et al., 2000). La diminution de la CRT
pourrait contribuer à augmenter la proportion de protéines mal repliées et amplifier le niveau de
stress jusqu’à activer une réponse UPR. Knee et coll. ont en effet montré que la déficience en CRT
dans des fibroblastes augmentait la proportion de protéines mal repliées dans la fraction
microsomale (enrichie en RE). D’ailleurs la diminution de CRT a été clairement liée à l’activation de
la réponse UPR caractérisée par l’augmentation des niveaux de PERK et d’eIF2α phosphorylés et
d’IRE1α, ainsi que des chaperonnes BIP et GRP94 (Knee et al., 2003). Dans une expérience
complémentaire, j’ai observé également une augmentation du niveau d’expression de CHOP dans
les moelles épinières de souris CRT+/- (voir Figure 21).
A
Moelle épinière lombaire
Niveau d’expression de CHOP
(% WT)
B
250
200
150
100
50
0
WT
CRT+/-
Figure 21 La diminution de Calréticuline induit une augmentation du niveau protéique de CHOP
A) Western blot de la protéine CHOP et l’actine, réalisé sur des tronçons de moelle épinière lombaire de
souris sauvages (n=2) ou hétérozygotes pour la CRT (n=2). En contrôle, des cellules Cos-7 (lignées
cellulaire à partir de cellules reinales de singes) ont été traitées avec un inducteur de stress du RE, la
thapsigargine. B) Quantification des niveaux protéique de CHOP. L’intensité des bandes correspondantes à
CHOP et à l’actine a été quantifiée à l’aide du logiciel Image J. Les niveaux de la protéine CHOP ont été
normalisés par rapport à ceux de l’actine, puis exprimés en pourcentage des niveaux de CHOP dans les
souris sauvages.
215
Discussion et Perspectives
Par ailleurs, la diminution de la CRT pourrait participer à l’accumulation du calcium dans le
cytoplasme des motoneurones mSOD1 traités à Fas/NO. En effet, les fibroblastes déficients en CRT
possèdent une quantité de calcium diminuée de deux fois dans le RE par rapport aux cellules
contrôles (Nakamura et al., 2001c). De plus, en condition de basse concentration de calcium dans le
RE, la conformation de la CRT peut être modifiée, ce qui peut favoriser sa dégradation et diminuer
encore la capacité de tamponnage du calcium du RE (Corbett and Michalak, 2000). Ces données
suggèrent que la diminution de calréticuline observée dans les motoneurones mSOD1 traités à FasL
pourrait compromettre le contrôle de l’équilibre calcique effectué par le RE et promouvoir la
persistance de niveaux élevés de calcium intracellulaire, ce qui pourrait engager des voies de mort.
Enfin, nos expériences montrent que les niveaux de CRT sont critiques pour la survie des
motoneurones. La diminution de CRT est nécessaire et suffisante pour tuer les motoneurones par
un processus non seulement dépendant de l’activation de Fas mais également capable d’induire une
surexpression de FasL. Cette mort induite par la diminution de la CRT nécessite le recrutement du
stress du RE. Un point qui reste à déterminer est s’il existe un lien entre la surexpression de FasL et
l’activation du stress du RE. En quantifiant les niveaux de FasL dans les cellules déficientes en CRT
traitées par un inhibiteur du stress du RE, le salubrinal, on pourrait déterminer si le stress du RE fait
partie du cercle vicieux d’amplification de la voie Fas, ou bien s’il crée un autre cercle vicieux
indépendant.
2. Par quels mécanismes la Calréticuline peut elle être diminuée ?
La diminution de CRT est observée 16 h après traitement par FasL, ce qui paraît un temps assez
long pour une régulation transcriptionelle. Nous avons réalisé une hybridation in situ de la CRT sur
des coupes de moelles épinières sauvages et SOD1G93A, et n’avons pas observé, après
quantification, de différence dans les niveaux de messagers de la CRT. Un autre groupe a
néanmoins observé dans une étude de microarrays, une diminution d’environ 30 % de l’ARN
messager de CRT à des stades présymptomatiques (60 jours postnatal) chez les souris SOD1G93A
(Perrin et al., 2005). Une différence de sensibilité de méthode pourrait expliquer que nous n’ayons
216
Discussion et Perspectives
pu quantifier de différence et une régulation transcriptionnelle de la CRT ne peut donc pas être
exclue.
Comme la CRT est une protéine chaperonne, une autre hypothèse est qu’elle pourrait être piégée
dans des agrégats. Une étude protéomique des agrégats contenant la SOD1 mutée dans la moelle
épinière a permis d’y détecter la présence de 4 protéines du réticulum endoplasmique, dont la
calréticuline (Bergemalm et al., 2010). Ceci pourrait avoir comme conséquence une diminution de
CRT fonctionnelle. D’ailleurs d’après cette même étude et d’autres, plusieurs autres chaperonnes
sont piégées dans les agrégats mSOD1, notamment BIP (Kikuchi et al., 2006) et PDI (Atkin et al.,
2006). Nous avons réalisé une expérience d’immunoprécipitation de la CRT et avons confirmé que
la CRT était capable d’interagir avec la mSOD1 dès les stades pré-symptomatiques (60 jours) (voir
Figure 22).
Immunoprécipitation Calreticuline
60 jours
110 jours
Anti-SOD1
Figure 22 La SOD1 mutée co-immunoprécipite avec la CRT
Expérience de co-immunoprécipitation de la CRT avec la mSOD1 réalisée sur des tronçons de moelle
épinière lombaire de souris sauvages ou SOD1G93A à un stade pré-symptomatique (60 jours postnataux) et
symptomatique (110 jours postnataux). Les lysats de moelle ont été incubés avec des billes couplées à la
protéine-A-sépharose et l’anticorps anti-CRT, ce qui permet d’isoler la CRT et les protéines qui
interagissent avec elle. Un gel SDS-PAGE, suivi d’un Western blot incubé avec des anticorps contre la
SOD1 humaine ont permis de déterminer si les immunoprécipitations de CRT contenaient de la SOD1. Dès
les stades pré-symptomatiques, on retrouve, uniquement chez les souris SOD1G93A, la protéine mSOD1
dans les immunoprécipitations de la CRT.
217
Discussion et Perspectives
La CRT pourrait être également sécrétée hors du RE, et donc diminuer le contenu de cette organelle
en CRT. De fait, plusieurs études ont montré que la CRT pouvait être exportée du RE vers la surface
cellulaire, par la voie de la sécrétion RE-Golgi, dans différentes cellules dont des lignées neuronales
(Xiao et al., 1999). Une étude a même montré qu’une sécrétion de CRT vers le cytoplasme et la
surface cellulaire avait lieu après traitement à Fas ou après ajout d’un donneur de NO (Tarr et al.,
2010). De plus, dans une étude sur le prion, il a été montré que les protéines CRT mais aussi PDI
et ERp57, étaient exportées du RE. Ces trois protéines interagiraient avec des protéines prions mal
repliées à la surface cellulaire, et pourraient donc participer à l’accumulation du prion et à sa
transmission de cellule à cellule (Provansal et al., 2010). Des études ont montré que la mSOD1
pouvait se propager à d’autres cellules de deux manières: la première, en étant sécrétée dans le
milieu extracellulaire, transportée par la chromogranine A ou B qui sont des protéines associées aux
vésicules du RE-Appareil de Golgi, (Urushitani et al., 2006) ; la seconde en étant transférée à
d’autres neurones par macropynocytose (Munch and Bertolotti, 2011). La CRT pourrait être
sécrétée dans nos conditions de culture, avec la mSOD1 grâce aux chromogranines (Urushitani et
al., 2006). Nous avons essayé d’évaluer cette possibilité, mais nous n’avons pas pu mettre en
évidence de colocalisation entre la CRT et la chromogranine.
Enfin, la CRT pourrait également être nitrosylée suite à l’augmentation du NO. La nitrosylation de
protéines peut conduire à leur dégradation, à des changements de conformation ou d’interactions
protéines-protéines ou encore à une inhibition de la fonction de la protéine (Hess et al., 2005). Les
chaperonnes PDI et ERp57 sont nitrosylées dans la moelle épinière des souris SOD1G93A et chez des
patients SLA (Basso et al., 2006; Walker et al., 2010). Dans le cas de la PDI, la S-nitrosylation
semblerait cibler les sites actifs des résidus cystéines et conduirait à l’inhibition de l’activité
enzymatique de cette chaperonne (Walker et al., 2010).
218
Discussion et Perspectives
E) L’implication des chaperonnes du RE dans d’autres maladies
neurodégénératives
Comme les SLA pour lesquelles des mutations dans diverses protéines provoquent leur agrégation
(SOD1, VAPB, FUS, TDP43 mutées), les maladies d’Alzheimer et de Parkinson se caractérisent
également par des accumulations d’agrégats protéiques qui pourraient être la conséquence d’un
défaut dans l’efficacité des chaperonnes (Ali et al., 2010). Il est intéressant de noter que, comme
pour la SLA, la CRT diminue dans les cerveaux de patients Alzheimer et de modèle rongeur de
Parkinson. En effet, une diminution du messager de CRT et de la protéine a été mesurée dans le
cerveau de patients Alzheimer (Taguchi et al., 2000). Cette protéine est également détectée dans le
fluide cérébrospinal de ces patients, en complexe avec des peptides β-amyloides (Erickson et al.,
2005). L’expression de la CRT est aussi réduite dans le cerveau d’un modèle de rats parkinsoniens
injectés unilatéralement par la neurotoxine 6 hydroxydopamine (6 OHDA) (Lessner et al., 2010). De
même, la chaperonne PDI serait impliquée dans ces maladies, car elle est nitrosylée dans les tissues
des cerveaux de patients sporadiques Alzheimer et Parkinson (Uehara et al., 2006).
Ces données suggèrent que ces protéines chaperonnes du RE représentent de bonnes cibles
thérapeutiques pour un plus grand nombre de maladies neurodégénératives que la SLA. Elles
montrent également qu’un mécanisme élucidé dans une de ces maladies peut être applicable à
d’autres maladies neurodégénératives, tout en ciblant une population neuronale précise.
219
Discussion et Perspectives
F) Une perturbation de l’homéostasie protéique dans les
maladies neurodégénératives
1. Généralités sur le maintien de l’homéostasie protéique
Une des caractéristiques communes à ces maladies liées à l’âge est la perturbation de l’homéostasie
protéique, ce qui les définit comme « protéinopathie » (Saxena and Caroni, 2011). Dans des
conditions physiologiques, le maintien de l’homéostasie protéique dépend du bon fonctionnement
de trois modules cellulaires : le module de synthèse (ribosome et contrôle de la traduction), le
module d’assemblage (système chaperonne, modifications post-traductionelles) et le module de
dégradation (système ubiquitine protéasome, autophagie par les voies des lysosomes, les
protéases) (Morimoto and Cuervo, 2009; Powers et al., 2009). L’ensemble de ces systèmes est
plastique afin de pouvoir répondre à des conditions de stress, ou à une demande physiologique
importante (besoin de sécrétion). Ces composants sont donc eux-mêmes régulés par des voies de
signalisation comme la réponse UPR, la réponse « Heat Shock », la concentration de calcium dans
les compartiments, l’augmentation de la taille du RE (Schuck et al., 2009), ou encore les réponses
inflammatoires (Powers et al., 2009). En outre, des stress environnementaux, des mutations de
protéines ou encore l’âge peuvent également modifier ces composants et perturber ce réseau.
Or, comme développé plus haut, le module d’assemblage et de dégradation est sévèrement
perturbé dans la SLA : L’activité des chaperonnes cytosoliques (Tummala et al., 2005) et du
protéasome diminuent (Kabashi et al., 2004), les principales chaperonnes du RE sont prise au piège
d’agrégats ou inhibées (Bergemalm et al., 2010); de plus, le système de dégradation lié au RE,
ERAD est défaillant car obstrué par la SOD1 mutée (Nishitoh et al., 2008)...
220
Discussion et Perspectives
2. L’implication des défauts d’homéostasie protéique dans les cas
sporadiques, majoritaires, de ces maladies
Dans le cas des mutations dans un gène, comme celui de la SOD1, la mutation peut d’une part
altérer la stabilité de la protéine et modifier ses propriétés conformationelles, et d’autre part
diminuer le fonctionnement de certains modules cellulaires (chaperonnes, protéasome) et donc
aggraver la proportion d’agrégats. La question est de savoir si la propriété de mauvais assemblage
est forcément liée à la présence d’une mutation.
Il faut déjà souligner qu’environ 1/3 des protéines, du fait de leur structure moléculaire complexe,
aurait une tendance au mauvais repliement (Roth and Balch, 2011). La combinaison de sources de
stress
intrinsèques
(contexte
génétique,
l’âge)
et
environnementales
(toxines,
infection,
traumatismes physiques) au cours du temps peuvent aussi influencer l’état de repliement d’une
protéine. Un bon exemple est la SOD1 sauvage. De récents travaux de Bosco et coll. ont montré
que la SOD1 sauvage, une fois oxydée, présente des défauts de conformation semblables à ceux de
la SOD1 mutée, et acquière des propriétés toxiques (inhibition du transport axonal). Par ailleurs, il a
été montré qu’avec l’âge, les systèmes de maintien de l’homéostasie protéique sont moins présents.
Par exemple, les chaperonnes HSP90 et la CRT diminuent dans le cerveau des souris dès l’âge de 3
mois (Yang et al., 2008) (Gray et al., 2003). Des composants du système ubiquitine protéasome
(sous-unité du protéasome et des enzymes de conjugaison à l’ubiquitine) diminuent également
(Gray et al., 2003). Les niveaux d’expression de VCP (« Valosin-Containig–Protein »), une protéine
participant à des processus d’homéostasie protéique comme la dégradation de protéines ou
l’autophagie (Yang et al., 2008) baissent. Plusieurs mutations de ce gène ont d’ailleurs été
associées à des cas de SLA.
On peut considérer que des cas sporadiques de ces maladies pourraient être initiés par des
perturbations liées à l’âge ou à l’environnement qui pourraient fragiliser le fonctionnement de
facteurs importants dans l’homéostasie protéique. Ces dysfonctionnements pourraient favoriser le
mauvais repliement de protéines, comme peuvent le faire les mutations liées à la SLA. Ces
protéines mal repliées se comporteraient comme des cofacteurs toxiques en affaiblissant et/ou en
221
Discussion et Perspectives
inhibant les processus d’homéostasie protéique et en augmentant les niveaux de stress cellulaire
jusqu’à enclencher « un point de non retour » comme le stress du RE « apoptotique ». Ainsi, ce
facteur cryptogénique (lié à l’âge ou à l’environnement) déclencherait les mêmes voies de mort
qu’au cours des SLA initié par un facteur génétique.
En conclusion, la perturbation de composants critiques de l’homéostasie cellulaire pourrait
contribuer à la vulnérabilité sélective des motoneurones. Ces perturbations (hyperexcitabilité,
calcium, agrégation) peuvent s’amplifier de manière chronique et finalement dépasser le seuil de
tolérance des cellules. Ces dysfonctionnements peuvent se propager et être amplifiés par les
cellules environnantes. Par exemple, la sécrétion de la mSOD1 extracellulaire par les motoneurones
active les cellules microgliales qui peuvent à leur tour sécréter des facteurs toxiques pour les
motoneurones (cytokines, stress oxydatif), et amplifier les niveaux de stress cellulaire des
motoneurones (Urushitani et al., 2006).
Le stress induit par la voie Fas/NO nous a permis de mettre en évidence une diminution de la
calréticuline. Cette diminution peut participer à la vulnérabilité des motoneurones, notamment à
l’affaiblissement de l’homéostasie cellulaire (protéique et calcique) et contribuer à engager des voies
apoptotiques, en recrutant le stress du RE. De ce fait, la CRT, s’inscrit comme une cible
thérapeutique intéressante dans les processus de vulnérabilité et de mort des motoneurones. Pour
évaluer cette possibilité, il faudra modifier les niveaux de l’expression de CRT in vivo dans des
modèles murins de SLA et en analyser les conséquences sur le déroulement de la maladie et la
survie des souris.
222
Discussion et Perspectives
II) Perspectives du projet Calréticuline
A) Peut-on modifier le déroulement de la maladie en modulant
les niveaux de calréticuline?
Nos travaux in vitro montrent que les niveaux de CRT modulent la survie des motoneurones. La
diminution de la CRT est suffisante pour tuer des motoneurones sauvages et à l’inverse, la
surexpression de la CRT empêche la mort des motoneurones mSOD1 traités à Fas/NO. Notre projet
est donc de tester si les niveaux de CRT peuvent moduler la survie des motoneurones et des souris
SOD1G93A in vivo.
Nous avons d’abord voulu savoir si la gravité de la maladie pouvait être dose dépendante des
niveaux de CRT. En d’autre terme, une diminution plus importante de la CRT peut-elle accélérer la
maladie ? Dans un second temps, nous évaluerons si la surexpression de calréticuline peut à
l’inverse, avoir un effet positif sur l’évolution de la maladie.
1. La diminution de la Calréticuline dans les souris SOD1G93A
Cette partie a déjà été partiellement réalisée au cours de ma thèse. Nous avons utilisé des souris
hétérozygotes pour la calréticuline, car sa déficience totale est létale au stade embryonnaire.
Ces souris ont été développées par le laboratoire du professeur Michalak (Mesaeli et al., 1999). La
plupart des défauts physiologiques sont observés chez les embryons déficients en CRT (CRT-/-) et
non chez les CRT+/- (Mesaeli et al., 1999; Rauch et al., 2000). Les embryons CRT-/- meurent
prématurément vers E14.5 à cause d’un défaut du développement cardiaque, ce qui souligne
l’importance de la CRT dans le développement du coeur. Cependant, peu d’études ont été réalisées
sur les effets d’un défaut de CRT dans le système nerveux. Il a été montré qu’une partie des
embryons CRT-/- présentait une exencéphalie qui serait due à une fermeture incorrecte du tube
neural cranien (Rauch et al., 2000). Le niveau d’expression de CRT pourrait influencer l’adhésion
223
Discussion et Perspectives
cellulaire et la migration cellulaire, processus importants pour la fermeture du tube neural. D’ailleurs
l’expression de la CRT est plus abondante dans le cerveau au stade embryonnaire que chez l’adulte
(Zhang et al., 2007). Nous avons donc utilisé les souris CRT+/- qui sont viables et qui, contrairement
aux CRT-/- ne présentent pas de défauts majeurs au cours du développement. Nous avons vérifié
que ces souris présentaient bien une diminution de la protéine CRT. Après croisement avec les
SOD1G93A, nous avons obtenu et comparé les groupes suivants: (wt ; CRT+/+), (wt ; CRT+/),(SOD1G93A ; CRT+/+), (SOD1G93A, CRT+/-). Notre hypothèse était que les souris (SOD1G93A, CRT+/-),
présentant un niveau encore plus bas de CRT que les souris SOD1G93A (confirmé par western blot),
pourraient développer la maladie plus tôt et aurait une survie plus courte. Nous avons comparé
l’âge de probabilité de déclenchement de la maladie et l’espérance de survie des souris SOD1G93A ;
CRT+/+et SOD1G93A, CRT+/-. Afin d’analyser les symptômes moteurs des souris, nous avons réalisé
deux tests comportementaux différents à partir de 50 jours postnataux: le test de la piscine (Raoul
et al., 2005) et le test des empreintes de pattes (Brooks and Dunnett, 2009) (Figure 23).
224
Discussion et Perspectives
Figure 23 Tests de comportements effectués
A) Test de la piscine (Raoul 2005). Les souris doivent nager dans un couloir d’eau jusqu’à une plateforme.
Le temps de la traversée est mesuré 5 fois de suite et les trois meilleurs temps sont retenus. Pour une
souris sauvage, le temps de traversée moyen est de 3 secondes. Dès 90 jours, les souris SOD1G93A
réalisent des temps de traversée significativement plus longs (entre 5 et 10 secondes). Au stade
symptomatique, les souris ont de plus en plus de difficulté à nager, compte tenu de la diminution de leur
force motrice. Nous avons fixé un temps maximal de traversée de 25 secondes, c’est-à-dire que si une
souris n’arrive plus à nager, son temps sera fixé à 25 secondes. B) Test de l’empreinte des pas. Les pattes
avant et arrière des souris sont peintes en bleu et rouge, respectivement. On fait marcher la souris sur une
bande de papier, ce qui permet d’obtenir un tracé de ses pas. On mesure alors la distance entre chaque
pas (1) et l’écart de chevauchement entre l’empreinte de la patte avant et de la patte arrière (2). En
comparant les souris sauvages et les souris SOD1G93A, on remarque à partir du stade symptomatique, que
les pas des souris SOD1G93A sont plus courts et que l’écart entre l’empreinte de la patte avant et arrière
augmente.
225
Discussion et Perspectives
Lorsque nous avons comparé les souris SOD1G93A ; CRT+/+avec les souris SOD1G93A, CRT+/-, nous
n’avons pas observé de changements au niveau du temps d’apparition des premiers défauts
moteurs, de la durée de la progression de la maladie ou de l’espérance de vie de ces souris (Figure
24 et 25).
Il semblerait donc qu’une diminution accentuée de la CRT n’ait pas d’effet sur la maladie. On peut
supposer qu’une diminution de l’expression plus importante que 50 % de la CRT n’aggrave pas le
phénotype. L’une des hypothèses pour expliquer ces résultats est qu’une diminution de moitié de la
CRT dans les motoneurones serait déjà suffisante pour atteindre un seuil de stress qui permet
d’enclencher des voies de stress du RE et d’apoptose. Cette hypothèse est confortée par nos
observations dans les motoneurones sauvages in vitro, où, lorsque nous avons diminué la CRT
artificiellement en utilisant des shRNA, les deux shRNA ont diminué la survie de 50%, alors qu’ils
n’avaient pas la même efficacité pour diminuer la CRT (par Western blot, le SH1 CRT diminue la
CRT de 25 % et le SH2 de 50 %). On peut également envisager qu’une sous-population de
motoneurones soit résistante à la diminution de la CRT, car la diminution homogène de la CRT dans
les motoneurones des embryons CRT+/-, ne cause pas 100% de mort. Une dernière hypothèse
mettrait en jeu des phénomènes de compensation des chaperonnes. Des travaux ont en effet
montré que les cellules CRT-/- présentaient une augmentation d’expression de chaperonnes dont la
calnexine (Uvarov and Mesaeli, 2008), qui travaille en tandem avec la CRT. Pour palier à ce
problème, il faudrait utiliser un système d’induction de la diminution de la CRT, chez l’adulte, à un
temps qui précède juste la réponse UPR.
226
Discussion et Perspectives
WT
A
B
SOD1G93A
8
SOD1G93A ; CRT+/-
7
6
5
4
3
2
1
0
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Age (semaines)
WT ; CRT+/SOD1G93A
Écartement latéral pattes
avant/arrière (cm)
Longueur des pas (cm)
WT
WT ; CRT+/-
2,5
SOD1G93A ; CRT+/-
2
1,5
1
0,5
0
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Age (semaines)
C
WT
Temps de nage (s)
30
WT ; CRT+/SOD1G93A
25
SOD1G93A ; CRT+/-
20
15
10
5
0
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Age (semaines)
Figure 24 Résultats des tests comportementaux
La progression des défauts moteurs a été comparée pour les quatre groupes de souris (n=10 ou 12): les
souris sauvages (WT), les souris hétérozygotes pour la CRT (WT ; CRT+/-), les souris SOD1G93A et les souris
(SOD1G93A ; CRT+/-). A) Graphique présentant l’analyse de la longueur des pas des souris. Comme on peut
l’observer, dès la 12ème semaine postnatale, on observe une diminution de la longueur des pas chez les
souris SOD1G93A et les souris (SOD1G93A ; CRT+/-). Cependant les souris (SOD1G93A ; CRT+/-) ne présentent
pas de phénotype aggravé. B) Graphique présentant l’analyse du chevauchement des pattes avant et
arrière. Les souris (SOD1G93A ; CRT+/-) ont tendance à avoir moins de chevauchement par rapport aux
souris SOD1G93A mais le résultat n’est pas significatif. C) Analyse des temps de traversée de la piscine. Dès
la 12ème semaine postnatale, on observe des temps de traversée plus longs aussi bien des souris SOD1G93A
que des souris SOD1G93A ; CRT+/-.
227
Probabilité de
déclenchement de la maladie (%)
Discussion et Perspectives
SOD1G93A
100
SOD1G93A ; CRT+/-
90
80
70
Point de déclenchement de la maladie (en jours)
SOD1G93A = 87 ± 4;
SOD1G93A ; CRT+/- = 87 ± 3
60
50
40
30
20
10
0
0
25
50
75
100
SOD1G93A
100
SOD1G93A ; CRT+/-
90
Probabilité de survie(%)
125
80
70
Moyenne de la survie (en jours):
SOD1G93A =127 ± 3;
SOD1G93A ; CRT+/- = 126 ± 4
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
Figure 25:Courbes de probabilités du déclenchement de la maladie et de la survie chez les souris
SOD1G93A et SOD1G93A/+ ; CRT+/Les probabilités du déclenchement de la maladie et de la survie ont été comparées pour les quatre groupes
suivants de souris (n=10 ou 12): les souris sauvages (WT), les souris hétérozygotes pour la CRT (WT ; CRT+/), les souris SOD1G93A et les souris (SOD1G93A ; CRT+/-). A) Le point de déclenchement de la maladie de chaque
souris correspond à l’âge auquel les souris atteignent le maximum de la courbe de leur poids (Boillee 2006).
Nous n’avons observé aucune différence dans l’âge de déclenchement de la maladie chez les souris SOD1G93A
ou SOD1G93A;CRT+/- B) De même, nous n’avons pas observé de différence dans la survie des souris SOD1G93A
et des souris SOD1G93A, CRT+/-. La mortalité des souris correspond à l’âge auquel elles ne sont plus capables
de se retourner par elles-mêmes lorsqu’elles sont posées sur le dos.
228
Discussion et Perspectives
2. La surexpression de la Calréticuline
Le projet que nous développons actuellement est de surexprimer la calréticuline dans les souris
SOD1G93A et d’en analyser les conséquences sur le déroulement de la maladie. Nous avons déjà
montré in vitro que la surexpression de la CRT prévient la mort des motoneurones induits à mourir
par l’activation de la voie Fas/NO.
La surexpression de CRT doit être ciblée car sa surexpression dans le coeur entraîne un arrêt
cardiaque et une mort subite des souris (Nakamura et al., 2001a). Comme nous avons montré que,
chez les souris SOD1G93A, la diminution de la CRT était restreinte aux motoneurones, nous avons
voulu déterminer si sa surexpression dans ces cellules pourrait les empêcher de mourir.
Notre idée était de surexprimer la CRT de manière inductible dans les motoneurones, chez les
souris SOD1G93A. Pour cela, nous avons croisé des souris CRT–HA, possédant un codon stop encadré
par des cassettes loxp, qui empêche donc l’expression de cette CRT-HA, avec des souris cre–
recombinase (qui par son action enlèvera les sites loxp et donc le codon stop) sous un promoteur
motoneuronal (Chat: Acétylcholine transférase), afin de surexprimer la CRT uniquement dans les
motoneurones. L’expression de la cre-recombinase étant inductible par le Tamoxifène, nous
pouvions de plus décider à quel moment surexprimer la CRT. La dernière étape était le croisement
des souris (CRT-HA
loxp/+
;Chat-cre) avec les souris SOD1G93A.
Nous avons dans un premier temps testé le système d’induction de la CRT-HA, après stimulation de
la chat-cre-recombinase au Tamoxifène. Cependant, nous n’avons pu obtenir que si peu de cellules
HA
ou
CRT
positives
après
divers
traitement
au
Tamoxifène
(gavage,
ou
injections
intrapéritonéales), que nous ne pouvions espérer un quelconque bénéfice pour les souris SOD1G93A.
Il s’est avéré que cette souche de souris chat-cre, obtenue de Jackson Laboratories n’était pas
fonctionnelle. Nous avons ensuite essayé d’induire l’expression de la CRT-HA en injectant en
intramusculaire des AAV6-cre recombinase commerciaux. Les AAV6 injectés en intramusculaire chez
les nouveaux nés, transduisent efficacement les motoneurones par transport rétrograde (Towne et
229
Discussion et Perspectives
al., 2008). Malheureusement, ces AAV6 commerciaux ont bien infecté le muscle injecté mais n’ont
pas été transportés de façon rétrograde jusqu’aux motoneurones, ce qui pourrait-être du à une
différence dans les méthodes de purification de ces virus. Cette technique, non plus, ne nous a
donc pas permis de surexprimer la CRT-HA à un temps donné.
Nous avons alors décidé d’utiliser des souris Nestin-cre, qui nous permettront de surexprimer la CRT
dans tous les neurones, dont les motoneurones. Nous sommes actuellement en train de croiser les
souris CRT-HAloxp/+ avec les souris Nestin-cre. Nous allons vérifier dans un premier temps si la CRTHA est bien exprimée dans les souris CRT-HAloxp/+ ; Nestincre/+. Si c’est le cas, nous réaliserons le
croisement de ces souris avec les SOD1G93A et nous évaluerons l’effet de la surexpression de la CRT
sur l’évolution de la maladie (déclenchement et survie, tests moteurs) et sur la survie des
motoneurones (nombre de motoneurones, dénervation).
Si nous obtenons des résultats positifs, nous aurons alors fait la démonstration du potentiel
thérapeutique d’une surexpression de CRT dans les motoneurones atteints de SLA.
230
Discussion et Perspectives
III) Discussion : CRMP4, un facteur impliqué dans la
dénervation périphérique et la mort des motoneurones
A) L’augmentation de CRMP4a dans les motoneurones induit une
dégénérescence spécifique des motoneurones in vitro
1. CRMP4 a un effet inhibiteur sur la croissance neuritique des
motoneurones in vitro
Nous avons réalisé une étude protéomique sur nos cultures de motoneurones qui a permis
d’identifier CRMP4a comme un effecteur de la voie de mort Fas/NO des motoneurones mSOD1. A
E12.5, âge auquel nous réalisons nos cultures, l’expression de CRMP4 est modérée et spécifique des
motoneurones ventraux. L’ajout de NO, qui induit un signal de mort dans les motoneurones mSOD1
double les niveaux d’expression de CRMP4, et ceci 24 h avant la mort de ces motoneurones.
Nous avons voulu déterminer la spécificité de l’augmentation de CRMP4 en la comparant à son plus
proche homologue, CRMP2 (Charrier et al., 2003). Bien que CRMP2 soit également exprimée par les
motoneurones à ce stade, l’ajout de NO ne provoque pas de changements d’expression de cette
protéine, ce qui montre bien que CRMP4 est un effecteur spécifique de la voie Fas/NO. Ces résultats
sont à mettre en parallèle avec une étude in vitro dans laquelle une surexpression de CRMP4 suite à
l’ajout de divers agents neurotoxiques induisant une mort cellulaire dans des neurones corticaux
(comme la staurosporine ou le glutamate) a été observée (Siman et al., 2004). Ces résultats
suggèrent que l’augmentation de CRMP4a pourrait être un signal général précédant la mort de
neurones.
Nous avons ensuite montré que l’augmentation de CRMP4 induisait une diminution de 60% de la
longueur axonale des motoneurones uniquement, et pas des axones des cellules de l’hippocampe. A
l’inverse, la surexpression de CRMP2 n’induit pas de changement dans la longueur neuritique des
231
Discussion et Perspectives
motoneurones et une augmentation très modérée dans les neurones hippocampiques. Nos travaux
sont en accord avec des études antérieures qui ont montré que la surexpression de CRMP4 a peu
d’effet sur la croissance des neurones hippocampiques (Cole et al., 2006; Cole et al., 2004). Par
contre, ils ne sont pas totalement en accord avec le groupe de Kaibuchi qui a montré que la
surexpression de CRMP2 induisait une élongation des neurites des cellules hippocampiques (Fukata
et al., 2002; Inagaki et al., 2001). Ces différences sont peut-être dues à l’utilisation de protocoles
différents : leurs études de quantification ont été effectuées à 9-10 jours in vitro alors que nous
avons évalué la longueur neuritique 72 heures après électroporation pour les neurones
hippocampiques.
A la vue des résultats décrits précédemment, on peut se demander quelles sont les mécanismes
pouvant expliquer les effets distincts des différentes formes de CRMP sur des types cellulaires
différents.
Le rôle exact des CRMPs est encore mal connu et complexe. Jusqu’à présent, la majorité des études
se sont focalisées sur la protéine CRMP2. Toutefois, cette protéine jouerait surtout un rôle dans la
polarité des neurones c’est-à-dire dans le choix d’un prolongement de devenir axone ou dendrite
(Arimura et al., 2005; Fukata et al., 2002). Il ressort des travaux publiés que les protéines CRMPs
peuvent moduler positivement ou négativement la croissance axonale en fonction de plusieurs
paramètres parmi lesquels le type cellulaire, leur isoforme, leur état de phosphorylation et leur
interaction avec différents partenaires cellulaires. Nous allons discuter quelques uns de ces
paramètres:
La protéine CRMP4 peut se présenter sous deux formes après épissage, une forme plus courte au
niveau de la partie N-terminale, appelée forme (a) et une forme plus longue au niveau de la partie
N-terminale, appelée (b). Quinn et coll (Quinn et al., 2003) ont montré que les formes (a) et (b) de
CRMP4 avaient des rôles antagonistes: la surexpression de la forme (b) de CRMP4 stimule la
croissance neuritique et le branchement axonal des neurones des ganglions spinaux, alors que la
forme (a) a l’effet inverse. Ceci est en parfait accord avec notre observation selon laquelle, dans
232
Discussion et Perspectives
nos conditions, seule le forme (a) est augmentée et corrélée avec une diminution de la croissance
neuritique des motoneurones.
Un autre paramètre de modulation de l’activité des CRMPs est leur état de phoshorylation. Les
CRMPs peuvent être phosphorylées par de nombreuses kinases, telles que Rho/ROCK, DYRK, cdk5
ou encore GSK3β. Ces kinases peuvent elles-mêmes être régulées par des protéines du guidage
axonal et de la régulation de la croissance neuritique, comme la sémaphorine 3A (voir ci-dessous)
et Nogo (inhibiteur associé à la myéline).
Il a été montré que CRMP4 pouvait être phosphorylé par la kinase GSK3β, ce qui avait pour effet de
stimuler la croissance neuritique des neurones en modulant les filaments d’actine (Cole et al.,
2006). Deux études ont ensuite montré qu’en présence de Nogo, la kinase GSK3β était inhibée (par
phosphorylation) et donc incapable d’activer CRMP4. Ceci avait pour conséquence de renforcer la
liaison de CRMP4 à une petite GTPase, RhoA au niveau du cône de croissance et d’induire, au
contraire, une inhibition de la croissance neuritique (Alabed et al., 2007) (Alabed et al., 2010). Il
semblerait donc que ce soit la forme non phosphorylée de CRMP4 qui joue un rôle d’inhibition de la
croissance neuritique.
Nous n’avons pas étudié l’état de phosphorylation de CRMP4 dans nos conditions, mais dans l’étude
protéomique, la forme augmentée de CRMP4a semblait clairement être la forme non phosphorylée.
L’ensemble des protéines CRMPs peut également former des complexes avec la sémaphorine et ses
récepteurs (Deo et al., 2004). La protéine CRMP2 a d’ailleurs été découverte (et dénommée)
comme un interacteur nécessaire à la transduction d’une signalisation sémaphorine pour induire le
collapse du cône de croissance (Goshima, 1997). La Sema3A est une protéine sécrétée qui agit
comme un signal de répulsion dans le guidage axonal. Après stimulation de cellules par la Sema3A,
la protéine CRMP2 est hyperphosphorylée successivement par la kinase cdk5, puis par la kinase
GSK3β (Cole et al., 2006), ce qui réduit son affinité pour les dimères de tubuline nécessaires à
l’assemblage des microtubules, et inhibe de ce fait la croissance neuritique (Arimura et al., 2005;
Uchida et al., 2005). Ces exemples montrent que l’activité des protéines CRMPs peut dépendre de
nombreux facteurs, notamment post-traductionnels comme la phosphorylation.
233
Discussion et Perspectives
Une autre régulation post-traductionelle pourrait être la nitrosylation de CRMP4 par le NO. Dans nos
conditions, la protéine CRMP4 est une cible du NO. Or, plusieurs études ont montré que le NO
pouvait induire une destruction du cône de croissance et une rétraction de l’axone (Hess et al.,
1993; Stroissnigg et al., 2007), notamment en nitrosylant la protéine MAP-1 (« Microtubule
Associated Protein-1 ») qui régule la stabilité des microtubules. Il est tentant de proposer que
CRMP4 serait nitrosylée dans nos conditions, ce qui pourrait changer son interaction avec des
partenaires moléculaires et avec les filaments d’actine.
2. CRMP4 induit la dégénérescence axonale et la mort des
motoneurones
La diminution de la longueur axonale observée après surexpression de CRMP4 dans les
motoneurones pourrait refléter soit un retard dans le développement, soit le début d’un processus
de dégénérescence. Nous avons observé une diminution de 60 % de la longueur des
prolongements après surexpression de CRMP4 à 24h, et 24 h plus tard, nous avons observé une
diminution de la survie motoneuronale de 60%. Le fait que la proportion de cellules à courts
prolongements à 24h et celle de motoneurones morts un jour plus tard soit équivalente, suggère
que les neurones à courts prolongement meurent 24 h plus tard. Nous avons d’ailleurs montré que
l’augmentation de CRMP4 était un élément nécessaire dans la voie de mort Fas/NO, car son
inhibition prévient entièrement la mort des motoneurones mSOD1 induite par NO.
Une autre étude a également montré que l’augmentation de CRMP4 pouvait induire la mort
cellulaire, puisque la surexpression d’une forme clivée de CRMP4 induisait 30% de mort de
neurones corticaux 48h après transfection, (Liu et al., 2009). La protéine CRMP4 peut, suite à
l’induction d’un signal apoptotique, être clivée par la protéase calpaïne au niveau de la partie Cterminale et elle perd alors sa capacité à rassembler les filaments d’actine (Rosslenbroich et al.,
2005).
234
Discussion et Perspectives
Dans nos conditions, il est cependant peu probable que CRMP4 soit clivée car la bande, observée en
Western blot, qui augmente dans les souris mSOD1 correspond à la protéine CRMP4a non clivée
(64kDa).
B) L’augmentation de CRMP4 in vivo est suffisante pour causer
la mort des motoneurones par une dégénérescence rétrograde
1. CRMP4 augmente dans les motoneurones mSOD1 dès les stades
pré-symptomatiques
La protéine CRMP4 est normalement indétectable chez l’adulte. Après avoir quantifié le nombre de
cellules CRMP4 positives, nous avons observé un doublement de leur proportion entre 45 jours et
60 jours postnataux uniquement chez les souris mSOD1 (= 12% de motoneurones positifs pour
CRMP4) et cette proportion double encore entre 60 et 90 jours (25 % de motoneurones CRMP4
positifs).
Il est possible que, comme pour CRT, l’augmentation de CRMP4 soit spécifique aux motoneurones
vulnérables (FF) ou aux résistants (FR), mais nous n’avons pas évalué si l’augmentation de CRMP4
était restreinte à des sous-populations de motoneurones. Contrairement à la diminution de CRT qui
se déroule entre 30 et 34 jours postnataux, l’augmentation de CRMP4 est plus tardive et augmente
entre 45 et 60 jours puis entre 60 et 90 jours postnataux. Or Fischer et coll. et Pun et coll. ont
montré que la dénervation des fibres FF et des FR se déroulait autour de 50 et de 80 jours
respectivement. On peut proposer que la diminution de CRT dans les motoneurones soit un signe
de stress, anticipant la dénervation périphérique, alors que CRMP4 interviendrait plus tardivement
et participerait par sa fonction de régulateur de la croissance axonale à la dénervation (Fischer et
al., 2004; Pun et al., 2006).
235
Discussion et Perspectives
En effet, nous avons montré que l’injection de virus AAV6-CRMP4a (et non d’AAV6-CRMP2) dans les
muscles des pattes arrière de souris sauvages, conduit à une mort de 30% des motoneurones et à
une dénervation périphérique de 20%, 90 jours après les injections virales. CRMP4 pourrait tuer les
motoneurones en induisant le détachement de leurs axones des muscles et une dégénérescence
rétrograde (appelé effet« dying-back »). Pour confirmer ce point, il nous faudrait analyser le
pourcentage de dénervation des jonctions musculaires à un temps antérieur à la mort des
motoneurones, par exemple 60 jours après les injections d’AAV6-CRMP4a, 1 mois avant la mort de
motoneurones.
2. Comment la surexpression de CRMP4 peut-elle avoir un rôle dans la
dénervation des jonctions neuromusculaires des souris mSOD1?
Comme mentionné plus tôt, la protéine CRMP4 est impliquée dans la régulation des faisceaux
d’actine F. Nous avons également vu que l’action des protéines CRMPs peut être gouvernée par des
signaux d’inhibition de la croissance neuritique telle que la sémaphorine3A ou Nogo.
Une étude élégante a montré que, dans les souris mSOD1, l’expression de la Sema3A était
fortement augmentée entre 5 et 8 semaines postnatales, dans les cellules de Schwann qui
entourent les synapses, et plus particulièrement dans les fibres musculaires IIb, c’est-à-dire celles
innervées par des motoneurones vulnérables (FF) (De Winter et al., 2006). Cette augmentation a
été corrélée au processus de dénervation des jonctions neuromusculaires dans une expérience
d’écrasement du nerf sciatique. En effet, ce protocole induit une semaine après une dénervation
massive des jonctions neuromusculaires du muscle gastronecmius; puis le processus de
réinnervation s’établit entre 2 et 3 semaines pour aboutir à une réinnervation complète 6 semaines
après l’opération. Dans ces conditions, la Sema3A est fortement exprimée dans les cellules de
Schwann entre 5 et 14 jours après écrasement du nerf sciatique, donc pendant le processus de
dénervation, puis diminue pendant la période de réinnervation. Les auteurs proposent que cette
protéine, une fois sécrétée active ses récepteurs plexine A1 et neuropilline 1 qui sont exprimés par
236
Discussion et Perspectives
les motoneurones, et provoque une répulsion des axones des motoneurones au niveau des fibres
musculaires (Schmidt et al., 2009). Une autre étude a montré que la protéine CRMP4 augmente
également dans les motoneurones 5 jours après écrasement du nerf sciatique, donc à une période
identique à celle de l’augmentation de la Sema3A et qui correspond à la dénervation des jonctions
neuromusculaires. Ces auteurs n’ont cependant pas étudié l’expression de CRMP4 à des stades plus
tardifs (Minturn et al., 1995). Il est intéressant de noter que l’un des rares endroits où CRMP4 est
encore exprimé chez l’adulte est au niveau des sites synaptiques des jonctions neuromusculaires
(Byk et al., 1996). On pourrait alors imaginer que, dans les souris mSOD1, le complexe Sema3AplexineA1-neuropilline1 recrute CRMP4 au moment de l’augmentation de son expression vers 60
jours pour induire une rétraction des axones des fibres musculaires.
Enfin, comme la surexpression de CRMP4 est maximale entre 60 et 90 jours postnataux, CRMP4
pourrait participer à la dénervation et à la dégénérescence principalement des motoneurones
résistants : il a en effet été montré que Nogo-A est surexprimé dans les muscles squelettiques des
souris mSOD1 et chez les patients SLA (Dupuis et al., 2002) et de manière plus robuste dans les
fibres musculaires de type I (résistantes) (Jokic et al., 2005). De plus, Nogo peut inhiber la
croissance neuritique in vitro en recrutant CRMP4 (Alabed et al., 2007; Alabed et al., 2010). On
peut donc proposer qu’in vivo, où l’on observe une surexpression de Nogo et de CRMP4, ces deux
protéines coopèrent à la dénervation des fibres résistantes.
En conclusion, nos travaux montrent que l’augmentation de CRMP4 joue un rôle important dans la
dégénérescence des motoneurones mSOD1. D’un point de vue mécanistique, elle pourrait répondre
à des signaux Sema3A et/ou de Nogo, afin d’induire la rétraction des axones des fibres musculaires
dans les souris.
237
Discussion et Perspectives
C) Implication des protéines CRMPs dans d’autres maladies
neurodégénératives
Des changements d’expression des protéines CRMPs ont été observés dans diverses pathologies et
notamment dans des cas de maladies neurodégénératives.
Récemment, Auvergnon et coll. ont décrit un pic d’augmentation significative de la protéine CRMP4
à un stade non symptomatique de l’évolution de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (du prion) chez les
souris. CRMP4 pourrait participer à la pathogénéicité induite par le prion, notamment au niveau de
la désorganisation neuritique. Une augmentation d’une autre protéine CRMP, CRMP2 et plus
précisément de sa forme tronquée a également été observée à des stades finaux de la maladie
prion chez les souris.
La protéine CRMP2, sous une forme hyperphosphorylée, augmente également dans les cerveaux de
souris modèles de la maladie d’Alzheimer et s’associe aux accumulations des neurofibrilles (Cole et
al., 2006; Good et al., 2004; Uchida et al., 2005; Yoshida et al., 1998). L’hyperphosphorylation de
ces protéines inhibe leur fonction dans la modulation de l’assemblage des microtubules ce qui
pourrait participer à la dégénérescence des neurones corticaux dans la maladie d’Alzheimer.
Cependant, l’ensemble de ces études n’a pas établi de lien direct entre la surexpression de protéine
CRMP et la mort de la population de neurones atteints dans ces maladies.
Par nos travaux, nous avons mis en évidence un facteur important dans le processus de mort des
motoneurones mSOD1. L’augmentation de CRMP4a, normalement réprimée chez l’adulte, peut
promouvoir le démantèlement des jonctions neuromusculaires et la dégénérescence des
motoneurones. Dans ce contexte, inhiber l’expression de CRMP4 pourrait constituer une thérapie
potentielle dans la SLA.
238
Discussion et Perspectives
IV) Perspectives du projet CRMP4
La suite du projet sera donc d’évaluer si la diminution de CRMP4 in vivo peut avoir un effet sur le
déroulement de la maladie chez les souris mSOD1. Pour ce faire, le plus simple aurait été de croiser
les souris mSOD1 avec des souris déficientes génétiquement pour CRMP4. Cependant, il n’existe
pas pour l’instant de lignée de souris CRMP4-/-. Par ailleurs, les protéines CRMPs jouent un rôle
important dans le développement du système nerveux (différenciation, migration, croissance des
prolongements), et leur inhibition totale dès le stade embryonnaire pourrait donc entraîner des
défauts cellulaires graves dans ces structures. Par exemple, des souris déficientes pour CRMP1 ont
été crées, chez lesquelles les cellules granulaires de l’hippocampe présentent de graves anomalies
du développement, (Charrier et al., 2006), associées à des perturbations fonctionnelles dans
l’apprentissage de la mémoire spatiale (Su et al., 2007).
Nous avons donc choisi d’inhiber l’expression de CRMP4 en utilisant les ARN interférents (shRNA),
déjà testés in vitro. Avant de les injecter dans les souris, nous les avons reclonés dans des vecteurs
viraux AAV6, qui ont été produits en collaboration avec le laboratoire de Patrick Aebischer à
Lausanne (EPFL). Ces virus permettent de transduire les motoneurones par un transport rétrograde
après injection en intramusculaire. De plus, leur expression est stable et ils sont peu immunogènes
(Towne et al., 2008).
Nous avons dans un premier temps évalué la fonctionnalité des virus AAV6-shRNA in vitro :
Nous avons obtenu un pourcentage d’efficacité d’infection de motoneurones, d’environ 80-90%
24h après infection, comme décrit par Langou et coll. Nous avons quantifié les niveaux d’expression
de CRMP4 dans les cellules GFP positives (les shRNA étant étiquetés GFP) et nous avons obtenu
une diminution d’environ 50 % de la protéine (Figure 26). De plus, comme observé après
électroporation des plasmides, l’infection des motoneurones par les AAV6-sh CRMP4 peut sauver les
motoneurones mSOD1 traités au NO (Figure 26).
239
Discussion et Perspectives
A
shCRMP4amis
crmp4
shCRMP4amis + NO
crmp4
B
sh2CRMP4 + NO
crmp4
C
Figure 26 Test de fonctionnalité des AAV6-shRNA CRMP4
Les motoneurones issus d’embryons SOD1G93A sont infectés 12 heures après ensemencement, puis traités
au NO 12 heures après l’infection. Un jour après le traitement au NO, les motoneurones sont fixés et
immunomarqués pour la protéine CRMP4. A) Illustration du marquage CRMP4 dans les conditions shRNAcontrôle, shRNA-contrôle traité au NO et shRNA-CRMP4 traité au NO. B) Quantification de
l’immunofluorescence de CRMP4. En présence du shRNA-CRMP4 et traitement au NO, on observe une
diminution de moitié de l’intensité du signal de CRMP4 par rapport aux conditions shRNA-contrôle traité au
NO (flèches). C) Evaluation de la survie suite à l’inhibition de CRMP4. Les motoneurones sont comptés 48
heures après le traitement au NO. Les deux shRNA-CRMP4 sauvent les motoneurones mSOD1 de la mort
induite par le NO (flèches).
240
Discussion et Perspectives
La seconde étape sera d’évaluer l’effet de l’inhibition de CRMP4 sur la dénervation des jonctions
neuromusculaires et la mort des motoneurones chez les souris mSOD1. Pour cela, nous injecterons
des virus codant pour un shRNA ciblant CRMP4 ou un shRNA contrôle, dans des nouveau–nés (P5)
de souris mSOD1. En effet, contrairement à l’injection intramusculaire dans la patte arrière chez
l’adulte qui permet de transduire environ 30% des motoneurones de la partie lombaire, l’injection
chez les nouveaux-nés dans le muscle triceps surae (gastrocnemius et soleus) de la patte arrière
permet de transduire environ 60% des motoneurones, avec une quantité de virus moindre (Towne
et al., 2008).
Nous injecterons du côté ipsilatéral les AAV6-shCRMP4 et du côté contralatéral les AAV6-shRNAcontrôle. Nous évaluerons d’abord le pourcentage d’infection des motoneurones à 60 jours
postnataux, à différents niveaux de la moelle épinière (cellules GFP+). Dans ces mêmes souris,
nous quantifierons ensuite les jonctions neuromusculaires, dont environ 50% sont dénervées à 60
jours chez les souris mSOD1. Si CRMP4 est bien un effecteur dans la dénervation des jonctions
neuromusculaires, nous devrions, en diminuant son expression, observer une diminution du nombre
de jonctions neuromusculaires dénervées. Nous évaluerons ensuite le nombre de motoneurones
survivant à 100 jours, un stade auquel on observe une perte de 40% des motoneurones (Fischer et
al., 2004). Si la diminution de CRMP4 a un effet protecteur sur le processus de dénervation chez les
souris mSOD1, nous devrions obtenir un effet bénéfique sur la survie des motoneurones également.
Ces résultats confirmeraient le potentiel thérapeutique d’une diminution de l’expression de CRMP4
dans la SLA.
241
Discussion et Perspectives
V) Conclusion Générale
La SLA est, comme l’ensemble des maladies neurodégénératives, une maladie aux mécanismes
complexes et mal définis. La découverte, il y a presque 20 ans de mutations dans le gène codant
pour la superoxyde dismutase 1 liées au développement d’une SLA, fut suivie du développement
des premiers modèles animaux de cette maladie. Bien que l’étude de ces animaux mSOD1 nous ait
permis de découvrir de nombreux mécanismes impliqués dans la mort des motoneurones, les
candidats thérapeutiques identifiés n’ont pour l’instant pas montré d’efficacité chez les patients.
C’est pourquoi l’identification de nouvelles molécules à visée thérapeutique reste une priorité.
La voie de mort Fas/NO des motoneurones mSOD1 représente un bon modèle in vitro de la
maladie. En effet, une étude protéomique nous a permis d’isoler deux molécules distinctes liées de
manière spécifique à la mort des motoneurones mSOD1 traités à sFasL/NO: la calréticuline et
CRMP4. Ces deux candidats se sont révélés très intéressants car leur modulation est spécifique aux
motoneurones mSOD1, ils participent à des dysfonctionnements cellulaires distincts, mais à l’issue
commune : la mort des motoneurones, et leur modulation semble concerner des étapes différentes
de la maladie.
Plus concrètement, nous avons démontré par nos travaux que la calréticuline diminue très tôt dans
la maladie, ce qui perturbe l’homéostasie calcique et protéique, et favorise l’activation de la réponse
UPR et la mort des motoneurones. La diminution de la CRT et la réponse UPR, apparaît comme un
signal de la vulnérabilité d’une sous-population de motoneurones mSOD1, signal précédant la
dénervation périphérique et la dégénérescence des motoneurones de plusieurs semaines.
La protéine CRMP4 augmente à un stade plus tardif de la maladie et participe activement au
processus de dénervation des jonctions neuromusculaires et à la dégénérescence rétrograde des
motoneurones mSOD1 (Figure 27).
Le site d’action de la CRT se déroule dans le corps cellulaire du motoneurone alors que celui de
CRMP4 se déroule plutôt au niveau de la terminaison de l’axone. Bien que la CRT et CRMP4 soient
toutes les deux des cibles de la voie Fas/NO et qu’elles induisent toutes les deux la mort des
242
Discussion et Perspectives
motoneurones, nous ne savons pas, à l’heure actuelle, si la diminution de la CRT et l’augmentation
de CRMP4 sont liées. Un lien possible entre ces deux protéines pourrait être le transport axonal, qui
pourrait être l’intermédiaire par lequel les deux compartiments (soma/ terminaison nerveuse)
s’affectent mutuellement. Or des perturbations dans le transport axonal antérograde et rétrograde
sont observées très tôt dans les motoneurones mSOD1 (Pun S, Bisland 2010). Des défauts de
transport dans un sens ou l’autre peuvent affecter les besoins du motoneurone en nutriments,
facteurs trophiques, et vésicules synaptiques, et participer à l’induction de stress du motoneurone
et à sa vulnérabilité. En support de cette idée, les travaux de Pun et coll. et Saxena et coll.ont
montré que l’administration du facteur neurotrophique CNTF à des souris mSOD1 rétablissait la
fonctionnalité du transport axonal, empêchait l’accumulation des signaux ubiquitines, l’activation de
la réponse UPR et la dénervation périphérique des motoneurones vulnérables. Mais les liens
moléculaires entre ces éléments ne sont pas encore connus.
Cibler la CRT et CRMP4 revient à pointer deux étapes de la maladie différentes : empêcher la
diminution de la CRT et donc l’activation du stress du RE correspondrait à bloquer un élément
initiateur dans la vulnérabilité du motoneurone et à empêcher très tôt la mise en place de processus
de dégénérescence; alors que diminuer l’expression de CRMP4 permettrait de jouer sur la première
étape « mécanique » du processus de dégénérescence du motoneurone qui est le détachement des
axones des fibres musculaires. Les patients ne sont diagnostiqués pour la SLA qu’après l’apparition
des premiers symptômes, ce qui sous- entend une perte déjà importante de motoneurones. Limiter
la dénervation et la dégénérescence de ceux restants pourrait permettre de ralentir l’apparition des
symptômes et d’augmenter la survie des patients.
Nos perspectives in vivo sur la calréticuline et sur CRMP4 nous permettront d’évaluer ces deux
candidats comme une thérapie potentielle de la SLA-mSOD1. Il serait intéressant dans le futur
d’évaluer ces cibles sur d’autres modèles murins de SLA comme les souris TDP43, pour déterminer
si ces cibles thérapeutiques sont communes à l’ensemble des SLA.
243
Discussion et Perspectives
Cellule de Schwann
FasL/Fas
sem a3A
- -- - -- - -
NTFs
NO
CR T
Ca 2 +
CR M P 4
CR M P 4
Muscle
squelettique
Dénervation
Stress du R E
vulnérabilité
N ogo-A
FasL
-- -- -- --
Vésicules
synaptiques
-
sem a3A
séma3A sécrétée
Nogo-A
Figure 27 Schéma récapitulatif des rôles de CRT et de CRMP4 dans le processus de mort du
motoneurone mSOD1
L’activation du récepteur Fas conduit à la production de NO qui induit un changement d’expression de
deux protéines uniquement dans les motoneurones mSOD1. Il diminue la protéine chaperonne et de
stockage du calcium du réticulum endoplasmique, la calréticuline et il augmente la protéine CRMP4.
La diminution de la CRT diminue d’une part, la capacité de stockage du calcium du RE, ce qui contribue à
son augmentation dans le cytoplasme, et d’autre part la capacité de repliement des protéines. Le
dysfonctionnement de ces deux processus conduit à l’activation de voies du stress du RE (flèche bleue). La
diminution de la CRT participe également au processus d’amplification de la voie Fas/NO. Le stress du RE
et l’activation de la voie Fas/NO contribuent à la vulnérabilité d’une sous population de motoneurone
mSOD1.
L’augmentation de la protéine CRMP4, qui est une protéine de régulation de la croissance axonale, peut
répondre aux signaux inhibiteurs de la Sema3A et de Nogo-A. La sema3A est sécrétée par les cellules de
Schwann qui entourent les synapses, aux niveaux des motoneurones. Nogo-A est augmenté dans les
muscles squelettiques des souris mSOD1. Ces deux signaux peuvent activer leurs récepteurs aux niveaux
des motoneurones, recruter un ensemble de protéines kinases et la protéine CRMP4. Cette signalisation
aura pour but de déstabiliser la structure des synapses et de conduire à la dénervation des jonctions
neuromusculaires (flèche jaune).
Les flèches en pointillés représentent les défauts dans le transport antérograde et rétrograde qui
apparaissent très tôt. Le transport peut affecter à la fois le soma par le ralentissement du transport de
neurotrophines importantes pour la survie cellulaire, de protéines, de mitochondries ; et à la fois les
terminaisons synaptiques par la diminution du transport des vésicules synaptiques. Des défauts de
transport chronique peuvent participer à un stress cellulaire au niveau du soma et des terminaisons
synaptiques.
244
Discussion et Perspectives
245
Références
REFERENCES
246
Références
Abalkhail, H., J. Mitchell, J. Habgood, R. Orrell, and J. de Belleroche. 2003. A new familial amyotrophic lateral
sclerosis locus on chromosome 16q12.1-16q12.2. Am J Hum Genet. 73:383-9.
Ackerley, S., P. Thornhill, A.J. Grierson, J. Brownlees, B.H. Anderton, P.N. Leigh, C.E. Shaw, and C.C. Miller.
2003. Neurofilament heavy chain side arm phosphorylation regulates axonal transport of
neurofilaments. J Cell Biol. 161:489-95.
Aebischer, J., P. Cassina, B. Otsmane, A. Moumen, D. Seilhean, V. Meininger, L. Barbeito, B. Pettmann, and C.
Raoul. 2011. IFNgamma triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to
the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death Differ. 18:754-68.
Al-Chalabi, A., P.M. Andersen, P. Nilsson, B. Chioza, J.L. Andersson, C. Russ, C.E. Shaw, J.F. Powell, and P.N.
Leigh. 1999. Deletions of the heavy neurofilament subunit tail in amyotrophic lateral sclerosis. Hum
Mol Genet. 8:157-64.
Alabed, Y.Z., M. Pool, S. Ong Tone, and A.E. Fournier. 2007. Identification of CRMP4 as a convergent
regulator of axon outgrowth inhibition. J Neurosci. 27:1702-11.
Alabed, Y.Z., M. Pool, S. Ong Tone, C. Sutherland, and A.E. Fournier. 2010. GSK3 beta regulates myelindependent axon outgrowth inhibition through CRMP4. J Neurosci. 30:5635-43.
Alexianu, M.E., B.K. Ho, A.H. Mohamed, V. La Bella, R.G. Smith, and S.H. Appel. 1994. The role of calciumbinding proteins in selective motoneuron vulnerability in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol.
36:846-58.
Ali, Y.O., B.M. Kitay, and R.G. Zhai. 2010. Dealing with misfolded proteins: examining the neuroprotective
role of molecular chaperones in neurodegeneration. Molecules. 15:6859-87.
Altieri, D.C. 2010. Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms. Biochem J. 430:199-205.
Amendola, J., J.P. Gueritaud, B.L. d'Incamps, C. Bories, S. Liabeuf, C. Allene, A. Pambo-Pambo, and J. Durand.
2007. Postnatal electrical and morphological abnormalities in lumbar motoneurons from transgenic
mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Arch Ital Biol. 145:311-23.
Andera, L. 2009. Signaling activated by the death receptors of the TNFR family. Biomed Pap Med Fac Univ
Palacky Olomouc Czech Repub. 153:173-80.
Andrus, P.K., T.J. Fleck, M.E. Gurney, and E.D. Hall. 1998. Protein oxidative damage in a transgenic mouse
model of familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 71:2041-8.
Aoki, M., M. Ogasawara, Y. Matsubara, K. Narisawa, S. Nakamura, Y. Itoyama, and K. Abe. 1993. Mild ALS in
Japan associated with novel SOD mutation. Nat Genet. 5:323-4.
Arber, S., B. Han, M. Mendelsohn, M. Smith, T.M. Jessell, and S. Sockanathan. 1999. Requirement for the
homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity. Neuron. 23:659-74.
Arimura, N., C. Menager, Y. Kawano, T. Yoshimura, S. Kawabata, A. Hattori, Y. Fukata, M. Amano, Y. Goshima,
M. Inagaki, N. Morone, J. Usukura, and K. Kaibuchi. 2005. Phosphorylation by Rho kinase regulates
CRMP-2 activity in growth cones. Mol Cell Biol. 25:9973-84.
Arnaudeau, S., M. Frieden, K. Nakamura, C. Castelbou, M. Michalak, and N. Demaurex. 2002. Calreticulin
differentially modulates calcium uptake and release in the endoplasmic reticulum and mitochondria.
J Biol Chem. 277:46696-705.
Ashkenazi, A. 2002. Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily. Nat Rev
Cancer. 2:420-30.
Atkin, J.D., M.A. Farg, B.J. Turner, D. Tomas, J.A. Lysaght, J. Nunan, A. Rembach, P. Nagley, P.M. Beart, S.S.
Cheema, and M.K. Horne. 2006. Induction of the unfolded protein response in familial amyotrophic
lateral sclerosis and association of protein-disulfide isomerase with superoxide dismutase 1. J Biol
Chem. 281:30152-65.
Atkin, J.D., M.A. Farg, A.K. Walker, C. McLean, D. Tomas, and M.K. Horne. 2008. Endoplasmic reticulum stress
and induction of the unfolded protein response in human sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Neurobiol Dis. 30:400-7.
Auvergnon, N., S. Reibel, M. Touret, J. Honnorat, T. Baron, P. Giraudon, and A. Bencsik. 2009. Altered
expression of CRMPs in the brain of bovine spongiform encephalopathy-infected mice during disease
progression. Brain Res. 1261:1-6.
247
Références
Averill, D.R., Jr. 1973. Degenerative myelopathy in the aging German Shepherd dog: clinical and pathologic
findings. J Am Vet Med Assoc. 162:1045-51.
Avossa, D., M. Grandolfo, F. Mazzarol, M. Zatta, and L. Ballerini. 2006. Early signs of motoneuron
vulnerability in a disease model system: Characterization of transverse slice cultures of spinal cord
isolated from embryonic ALS mice. Neuroscience. 138:1179-94.
Awano, T., G.S. Johnson, C.M. Wade, M.L. Katz, G.C. Johnson, J.F. Taylor, M. Perloski, T. Biagi, I. Baranowska,
S. Long, P.A. March, N.J. Olby, G.D. Shelton, S. Khan, D.P. O'Brien, K. Lindblad-Toh, and J.R. Coates.
2009. Genome-wide association analysis reveals a SOD1 mutation in canine degenerative
myelopathy that resembles amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:2794-9.
Azzouz, M., G.S. Ralph, E. Storkebaum, L.E. Walmsley, K.A. Mitrophanous, S.M. Kingsman, P. Carmeliet, and
N.D. Mazarakis. 2004. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a
mouse ALS model. Nature. 429:413-7.
Bar, P.R. 2000. Motor neuron disease in vitro: the use of cultured motor neurons to study amyotrophic
lateral sclerosis. Eur J Pharmacol. 405:285-95.
Barbeito, A.G., P. Mesci, and S. Boillee. 2010. Motor neuron-immune interactions: the vicious circle of ALS. J
Neural Transm. 117:981-1000.
Barber, S.C., and P.J. Shaw. 2010. Oxidative stress in ALS: key role in motor neuron injury and therapeutic
target. Free Radic Biol Med. 48:629-41.
Basso, M., T. Massignan, G. Samengo, C. Cheroni, S. De Biasi, M. Salmona, C. Bendotti, and V. Bonetto. 2006.
Insoluble mutant SOD1 is partly oligoubiquitinated in amyotrophic lateral sclerosis mice. J Biol Chem.
281:33325-35.
Bastianutto, C., E. Clementi, F. Codazzi, P. Podini, F. De Giorgi, R. Rizzuto, J. Meldolesi, and T. Pozzan. 1995.
Overexpression of calreticulin increases the Ca2+ capacity of rapidly exchanging Ca2+ stores and
reveals aspects of their lumenal microenvironment and function. J Cell Biol. 130:847-55.
Baumann, O., and B. Walz. 2001. Endoplasmic reticulum of animal cells and its organization into structural
and functional domains. Int Rev Cytol. 205:149-214.
Beal, M.F., R.J. Ferrante, S.E. Browne, R.T. Matthews, N.W. Kowall, and R.H. Brown, Jr. 1997. Increased 3nitrotyrosine in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 42:644-54.
Beers, D.R., J.S. Henkel, Q. Xiao, W. Zhao, J. Wang, A.A. Yen, L. Siklos, S.R. McKercher, and S.H. Appel. 2006.
Wild-type microglia extend survival in PU.1 knockout mice with familial amyotrophic lateral sclerosis.
Proc Natl Acad Sci U S A. 103:16021-6.
Beers, D.R., B.K. Ho, L. Siklos, M.E. Alexianu, D.R. Mosier, A.H. Mohamed, Y. Otsuka, M.E. Kozovska, R.E.
McAlhany, R.G. Smith, and S.H. Appel. 2001. Parvalbumin overexpression alters immune-mediated
increases in intracellular calcium, and delays disease onset in a transgenic model of familial
amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 79:499-509.
Belli, S., and N. Vanacore. 2005. Proportionate mortality of Italian soccer players: is amyotrophic lateral
sclerosis an occupational disease? Eur J Epidemiol. 20:237-42.
Bendotti, C., C. Atzori, R. Piva, M. Tortarolo, M.J. Strong, S. DeBiasi, and A. Migheli. 2004. Activated p38MAPK
is a novel component of the intracellular inclusions found in human amyotrophic lateral sclerosis and
mutant SOD1 transgenic mice. J Neuropathol Exp Neurol. 63:113-9.
Bendotti, C., M. Tortarolo, S.K. Suchak, N. Calvaresi, L. Carvelli, A. Bastone, M. Rizzi, M. Rattray, and T.
Mennini. 2001. Transgenic SOD1 G93A mice develop reduced GLT-1 in spinal cord without
alterations in cerebrospinal fluid glutamate levels. J Neurochem. 79:737-46.
Bensimon, G., L. Lacomblez, and V. Meininger. 1994. A controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral
sclerosis. ALS/Riluzole Study Group. N Engl J Med. 330:585-91.
Bergemalm, D., K. Forsberg, V. Srivastava, K.S. Graffmo, P.M. Andersen, T. Brannstrom, G. Wingsle, and S.L.
Marklund. 2010. Superoxide dismutase-1 and other proteins in inclusions from transgenic
amyotrophic lateral sclerosis model mice. J Neurochem. 114:408-18.
Berridge, M.J. 2002. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32:23549.
Bertolotti, A., Y. Zhang, L.M. Hendershot, H.P. Harding, and D. Ron. 2000. Dynamic interaction of BiP and ER
stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol. 2:326-32.
248
Références
Bichsel, P., M. Vandevelde, J. Lang, and S. Kull-Hachler. 1983. Degenerative myelopathy in a family of
Siberian Husky dogs. J Am Vet Med Assoc. 183:998-1000, 965.
Bilsland, L.G., E. Sahai, G. Kelly, M. Golding, L. Greensmith, and G. Schiavo. 2010. Deficits in axonal transport
precede ALS symptoms in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 107:20523-8.
Biskup, S., and D.J. Moore. 2006. Detrimental deletions: mitochondria, aging and Parkinson's disease.
Bioessays. 28:963-7.
Blasco, H., P. Corcia, C. Veyrat-Durebex, C. Coutadeur, C. Fournier, W. Camu, P. Gordon, J. Praline, C.R.
Andres, and P. Vourc'h. 2011. The P413L chromogranin B variation in French patients with sporadic
amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler. 12:210-4.
Bogaert, E., P. Van Damme, K. Poesen, J. Dhondt, N. Hersmus, D. Kiraly, W. Scheveneels, W. Robberecht, and
L. Van Den Bosch. VEGF protects motor neurons against excitotoxicity by upregulation of GluR2.
Neurobiol Aging. 31:2185-91.
Boillee, S., C. Vande Velde, and D.W. Cleveland. 2006a. ALS: a disease of motor neurons and their
nonneuronal neighbors. Neuron. 52:39-59.
Boillee, S., K. Yamanaka, C.S. Lobsiger, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, G. Kassiotis, G. Kollias, and D.W.
Cleveland. 2006b. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and
microglia. Science. 312:1389-92.
Bosco, D.A., G. Morfini, N.M. Karabacak, Y. Song, F. Gros-Louis, P. Pasinelli, H. Goolsby, B.A. Fontaine, N.
Lemay, D. McKenna-Yasek, M.P. Frosch, J.N. Agar, J.P. Julien, S.T. Brady, and R.H. Brown, Jr. 2010.
Wild-type and mutant SOD1 share an aberrant conformation and a common pathogenic pathway in
ALS. Nat Neurosci. 13:1396-403.
Boyce, M., K.F. Bryant, C. Jousse, K. Long, H.P. Harding, D. Scheuner, R.J. Kaufman, D. Ma, D.M. Coen, D. Ron,
and J. Yuan. 2005. A selective inhibitor of eIF2alpha dephosphorylation protects cells from ER stress.
Science. 307:935-9.
Brooks, S.P., and S.B. Dunnett. 2009. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat Rev
Neurosci. 10:519-29.
Browne, S.E., L. Yang, J.P. DiMauro, S.W. Fuller, S.C. Licata, and M.F. Beal. 2006. Bioenergetic abnormalities
in discrete cerebral motor pathways presage spinal cord pathology in the G93A SOD1 mouse model
of ALS. Neurobiol Dis. 22:599-610.
Bruening, W., J. Roy, B. Giasson, D.A. Figlewicz, W.E. Mushynski, and H.D. Durham. 1999. Up-regulation of
protein chaperones preserves viability of cells expressing toxic Cu/Zn-superoxide dismutase mutants
associated with amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 72:693-9.
Bruijn, L.I., M.W. Becher, M.K. Lee, K.L. Anderson, N.A. Jenkins, N.G. Copeland, S.S. Sisodia, J.D. Rothstein,
D.R. Borchelt, D.L. Price, and D.W. Cleveland. 1997. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage
to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron.
18:327-38.
Bruijn, L.I., M.K. Houseweart, S. Kato, K.L. Anderson, S.D. Anderson, E. Ohama, A.G. Reaume, R.W. Scott, and
D.W. Cleveland. 1998. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant
independent from wild-type SOD1. Science. 281:1851-4.
Bruijn, L.I., T.M. Miller, and D.W. Cleveland. 2004. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron
degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27:723-49.
Bruneteau, G., S. Demeret, and V. Meininger. 2004. [Physiopathology of ALS: therapeutic approach]. Rev
Neurol (Paris). 160:235-41.
Bryson, H.M., B. Fulton, and P. Benfield. 1996. Riluzole. A review of its pharmacodynamic and
pharmacokinetic properties and therapeutic potential in amyotrophic lateral sclerosis. Drugs.
52:549-63.
Buratti, E., and F.E. Baralle. 2008. Multiple roles of TDP-43 in gene expression, splicing regulation, and
human disease. Front Biosci. 13:867-78.
Byk, T., T. Dobransky, C. Cifuentes-Diaz, and A. Sobel. 1996. Identification and molecular characterization of
Unc-33-like phosphoprotein (Ulip), a putative mammalian homolog of the axonal guidanceassociated unc-33 gene product. J Neurosci. 16:688-701.
249
Références
Cai, H., X. Lin, C. Xie, F.M. Laird, C. Lai, H. Wen, H.C. Chiang, H. Shim, M.H. Farah, A. Hoke, D.L. Price, and P.C.
Wong. 2005. Loss of ALS2 function is insufficient to trigger motor neuron degeneration in knock-out
mice but predisposes neurons to oxidative stress. J Neurosci. 25:7567-74.
Camu, W., and C.E. Henderson. 1992. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a
monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. J Neurosci Methods. 44:59-70.
Carriedo, S.G., S.L. Sensi, H.Z. Yin, and J.H. Weiss. 2000. AMPA exposures induce mitochondrial Ca(2+)
overload and ROS generation in spinal motor neurons in vitro. J Neurosci. 20:240-50.
Cashman, N.R., H.D. Durham, J.K. Blusztajn, K. Oda, T. Tabira, I.T. Shaw, S. Dahrouge, and J.P. Antel. 1992.
Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons. Dev Dyn.
194:209-21.
Catania, M.V., E. Aronica, B. Yankaya, and D. Troost. 2001. Increased expression of neuronal nitric oxide
synthase spliced variants in reactive astrocytes of amyotrophic lateral sclerosis human spinal cord. J
Neurosci. 21:RC148.
Cereda, C., C. Baiocchi, P. Bongioanni, E. Cova, S. Guareschi, M.R. Metelli, B. Rossi, I. Sbalsi, M.C. Cuccia, and
M. Ceroni. 2008. TNF and sTNFR1/2 plasma levels in ALS patients. J Neuroimmunol. 194:123-31.
Chang-Hong, R., M. Wada, S. Koyama, H. Kimura, S. Arawaka, T. Kawanami, K. Kurita, T. Kadoya, M. Aoki, Y.
Itoyama, and T. Kato. 2005. Neuroprotective effect of oxidized galectin-1 in a transgenic mouse
model of amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 194:203-11.
Charrier, E., B. Mosinger, C. Meissirel, M. Aguera, V. Rogemond, S. Reibel, P. Salin, N. Chounlamountri, V.
Perrot, M.F. Belin, Y. Goshima, J. Honnorat, N. Thomasset, and P. Kolattukudy. 2006. Transient
alterations in granule cell proliferation, apoptosis and migration in postnatal developing cerebellum
of CRMP1-/- mice. Genes Cells. 11:1337-52.
Charrier, E., S. Reibel, V. Rogemond, M. Aguera, N. Thomasset, and J. Honnorat. 2003. Collapsin response
mediator proteins (CRMPs): involvement in nervous system development and adult
neurodegenerative disorders. Mol Neurobiol. 28:51-64.
Chattopadhyay, M., and J.S. Valentine. 2009. Aggregation of copper-zinc superoxide dismutase in familial
and sporadic ALS. Antioxid Redox Signal. 11:1603-14.
Chen, H., M. Richard, D.P. Sandler, D.M. Umbach, and F. Kamel. 2007. Head injury and amyotrophic lateral
sclerosis. Am J Epidemiol. 166:810-6.
Chen, H.J., G. Anagnostou, A. Chai, J. Withers, A. Morris, J. Adhikaree, G. Pennetta, and J.S. de Belleroche.
2010. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral
sclerosis. J Biol Chem. 285:40266-81.
Chen, Y.Z., C.L. Bennett, H.M. Huynh, I.P. Blair, I. Puls, J. Irobi, I. Dierick, A. Abel, M.L. Kennerson, B.A. Rabin,
G.A. Nicholson, M. Auer-Grumbach, K. Wagner, P. De Jonghe, J.W. Griffin, K.H. Fischbeck, V.
Timmerman, D.R. Cornblath, and P.F. Chance. 2004. DNA/RNA helicase gene mutations in a form of
juvenile amyotrophic lateral sclerosis (ALS4). Am J Hum Genet. 74:1128-35.
Cheroni, C., M. Marino, M. Tortarolo, P. Veglianese, S. De Biasi, E. Fontana, L.V. Zuccarello, C.J. Maynard, N.P.
Dantuma, and C. Bendotti. 2009. Functional alterations of the ubiquitin-proteasome system in motor
neurons of a mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet. 18:82-96.
Chiu, A.Y., P. Zhai, M.C. Dal Canto, T.M. Peters, Y.W. Kwon, S.M. Prattis, and M.E. Gurney. 1995. Agedependent penetrance of disease in a transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral
sclerosis. Mol Cell Neurosci. 6:349-62.
Chow, C.Y., J.E. Landers, S.K. Bergren, P.C. Sapp, A.E. Grant, J.M. Jones, L. Everett, G.M. Lenk, D.M. McKennaYasek, L.S. Weisman, D. Figlewicz, R.H. Brown, and M.H. Meisler. 2009. Deleterious variants of FIG4,
a phosphoinositide phosphatase, in patients with ALS. Am J Hum Genet. 84:85-8.
Chow, C.Y., Y. Zhang, J.J. Dowling, N. Jin, M. Adamska, K. Shiga, K. Szigeti, M.E. Shy, J. Li, X. Zhang, J.R. Lupski,
L.S. Weisman, and M.H. Meisler. 2007. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale
tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448:68-72.
Chung, M.J., and Y.L. Suh. 2002. Ultrastructural changes of mitochondria in the skeletal muscle of patients
with amyotrophic lateral sclerosis. Ultrastruct Pathol. 26:3-7.
Clement, A.M., M.D. Nguyen, E.A. Roberts, M.L. Garcia, S. Boillee, M. Rule, A.P. McMahon, W. Doucette, D.
Siwek, R.J. Ferrante, R.H. Brown, Jr., J.P. Julien, L.S. Goldstein, and D.W. Cleveland. 2003. Wild-type
nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302:113-7.
250
Références
Coates, J.R., P.A. March, M. Oglesbee, C.G. Ruaux, N.J. Olby, R.D. Berghaus, D.P. O'Brien, J.H. Keating, G.S.
Johnson, and D.A. Williams. 2007. Clinical characterization of a familial degenerative myelopathy in
Pembroke Welsh Corgi dogs. J Vet Intern Med. 21:1323-31.
Cole, A.R., F. Causeret, G. Yadirgi, C.J. Hastie, H. McLauchlan, E.J. McManus, F. Hernandez, B.J. Eickholt, M.
Nikolic, and C. Sutherland. 2006. Distinct priming kinases contribute to differential regulation of
collapsin response mediator proteins by glycogen synthase kinase-3 in vivo. J Biol Chem. 281:165918.
Cole, A.R., A. Knebel, N.A. Morrice, L.A. Robertson, A.J. Irving, C.N. Connolly, and C. Sutherland. 2004. GSK-3
phosphorylation of the Alzheimer epitope within collapsin response mediator proteins regulates
axon elongation in primary neurons. J Biol Chem. 279:50176-80.
Conforti, F.L., T. Sprovieri, R. Mazzei, C. Ungaro, V. La Bella, A. Tessitore, A. Patitucci, A. Magariello, A.L.
Gabriele, G. Tedeschi, I.L. Simone, G. Majorana, P. Valentino, F. Condino, F. Bono, M.R. Monsurro, M.
Muglia, and A. Quattrone. 2008. A novel Angiogenin gene mutation in a sporadic patient with
amyotrophic lateral sclerosis from southern Italy. Neuromuscul Disord. 18:68-70.
Corbett, E.F., and M. Michalak. 2000. Calcium, a signaling molecule in the endoplasmic reticulum? Trends
Biochem Sci. 25:307-11.
Corrado, L., A. Ratti, C. Gellera, E. Buratti, B. Castellotti, Y. Carlomagno, N. Ticozzi, L. Mazzini, L. Testa, F.
Taroni, F.E. Baralle, V. Silani, and S. D'Alfonso. 2009. High frequency of TARDBP gene mutations in
Italian patients with amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mutat. 30:688-94.
Cosker, K.E., S.L. Courchesne, and R.A. Segal. 2008. Action in the axon: generation and transport of signaling
endosomes. Curr Opin Neurobiol. 18:270-5.
Costa-Mattioli, M., D. Gobert, E. Stern, K. Gamache, R. Colina, C. Cuello, W. Sossin, R. Kaufman, J. Pelletier, K.
Rosenblum, K. Krnjevic, J.C. Lacaille, K. Nader, and N. Sonenberg. 2007. eIF2alpha phosphorylation
bidirectionally regulates the switch from short- to long-term synaptic plasticity and memory. Cell.
129:195-206.
Cote, F., J.F. Collard, and J.P. Julien. 1993. Progressive neuronopathy in transgenic mice expressing the
human neurofilament heavy gene: a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Cell. 73:35-46.
Coussee, E., P. De Smet, E. Bogaert, I. Elens, P. Van Damme, P. Willems, W. Koopman, L. Van Den Bosch, and
G. Callewaert. 2011. G37R SOD1 mutant alters mitochondrial complex I activity, Ca(2+) uptake and
ATP production. Cell Calcium. 49:217-25.
Cudkowicz, M.E., D. McKenna-Yasek, P.E. Sapp, W. Chin, B. Geller, D.L. Hayden, D.A. Schoenfeld, B.A. Hosler,
H.R. Horvitz, and R.H. Brown. 1997. Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in
amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 41:210-21.
Dal Canto, M.C., and M.E. Gurney. 1994. Development of central nervous system pathology in a murine
transgenic model of human amyotrophic lateral sclerosis. Am J Pathol. 145:1271-9.
Dal Canto, M.C., and M.E. Gurney. 1995. Neuropathological changes in two lines of mice carrying a transgene
for mutant human Cu,Zn SOD, and in mice overexpressing wild type human SOD: a model of familial
amyotrophic lateral sclerosis (FALS). Brain Res. 676:25-40.
Dal Canto, M.C., and M.E. Gurney. 1997. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human
Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble
those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93:537-50.
Damiano, M., A.A. Starkov, S. Petri, K. Kipiani, M. Kiaei, M. Mattiazzi, M. Flint Beal, and G. Manfredi. 2006.
Neural mitochondrial Ca2+ capacity impairment precedes the onset of motor symptoms in G93A
Cu/Zn-superoxide dismutase mutant mice. J Neurochem. 96:1349-61.
de la Monte, S.M., Y.K. Sohn, N. Ganju, and J.R. Wands. 1998. P53- and CD95-associated apoptosis in
neurodegenerative diseases. Lab Invest. 78:401-11.
De Vos, K.J., A.L. Chapman, M.E. Tennant, C. Manser, E.L. Tudor, K.F. Lau, J. Brownlees, S. Ackerley, P.J. Shaw,
D.M. McLoughlin, C.E. Shaw, P.N. Leigh, C.C. Miller, and A.J. Grierson. 2007. Familial amyotrophic
lateral sclerosis-linked SOD1 mutants perturb fast axonal transport to reduce axonal mitochondria
content. Hum Mol Genet. 16:2720-8.
De Vos, K.J., A.J. Grierson, S. Ackerley, and C.C. Miller. 2008. Role of axonal transport in neurodegenerative
diseases. Annu Rev Neurosci. 31:151-73.
251
Références
De Winter, F., T. Vo, F.J. Stam, L.A. Wisman, P.R. Bar, S.P. Niclou, F.L. van Muiswinkel, and J. Verhaagen.
2006. The expression of the chemorepellent Semaphorin 3A is selectively induced in terminal
Schwann cells of a subset of neuromuscular synapses that display limited anatomical plasticity and
enhanced vulnerability in motor neuron disease. Mol Cell Neurosci. 32:102-17.
Deforges, S., J. Branchu, O. Biondi, C. Grondard, C. Pariset, S. Lecolle, P. Lopes, P.P. Vidal, C. Chanoine, and F.
Charbonnier. 2009. Motoneuron survival is promoted by specific exercise in a mouse model of
amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 587:3561-72.
Deng, H.X., Y. Shi, Y. Furukawa, H. Zhai, R. Fu, E. Liu, G.H. Gorrie, M.S. Khan, W.Y. Hung, E.H. Bigio, T. Lukas,
M.C. Dal Canto, T.V. O'Halloran, and T. Siddique. 2006. Conversion to the amyotrophic lateral
sclerosis phenotype is associated with intermolecular linked insoluble aggregates of SOD1 in
mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:7142-7.
Deo, R.C., E.F. Schmidt, A. Elhabazi, H. Togashi, S.K. Burley, and S.M. Strittmatter. 2004. Structural bases for
CRMP function in plexin-dependent semaphorin3A signaling. EMBO J. 23:9-22.
Devon, R.S., J.R. Helm, G.A. Rouleau, Y. Leitner, T. Lerman-Sagie, D. Lev, and M.R. Hayden. 2003. The first
nonsense mutation in alsin results in a homogeneous phenotype of infantile-onset ascending spastic
paralysis with bulbar involvement in two siblings. Clin Genet. 64:210-5.
Devon, R.S., P.C. Orban, K. Gerrow, M.A. Barbieri, C. Schwab, L.P. Cao, J.R. Helm, N. Bissada, R. Cruz-Aguado,
T.L. Davidson, J. Witmer, M. Metzler, C.K. Lam, W. Tetzlaff, E.M. Simpson, J.M. McCaffery, A.E. ElHusseini, B.R. Leavitt, and M.R. Hayden. 2006. Als2-deficient mice exhibit disturbances in endosome
trafficking associated with motor behavioral abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:9595-600.
Di Giorgio, F.P., M.A. Carrasco, M.C. Siao, T. Maniatis, and K. Eggan. 2007. Non-cell autonomous effect of glia
on motor neurons in an embryonic stem cell-based ALS model. Nat Neurosci. 10:608-14.
Dimos, J.T., K.T. Rodolfa, K.K. Niakan, L.M. Weisenthal, H. Mitsumoto, W. Chung, G.F. Croft, G. Saphier, R.
Leibel, R. Goland, H. Wichterle, C.E. Henderson, and K. Eggan. 2008. Induced pluripotent stem cells
generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321:1218-21.
Dobrowolny, G., M. Aucello, E. Rizzuto, S. Beccafico, C. Mammucari, S. Boncompagni, S. Belia, F. Wannenes,
C. Nicoletti, Z. Del Prete, N. Rosenthal, M. Molinaro, F. Protasi, G. Fano, M. Sandri, and A. Musaro.
2008. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8:425-36.
Dobrowolny, G., C. Giacinti, L. Pelosi, C. Nicoletti, N. Winn, L. Barberi, M. Molinaro, N. Rosenthal, and A.
Musaro. 2005. Muscle expression of a local Igf-1 isoform protects motor neurons in an ALS mouse
model. J Cell Biol. 168:193-9.
Dodge, J.C., A.M. Haidet, W. Yang, M.A. Passini, M. Hester, J. Clarke, E.M. Roskelley, C.M. Treleaven, L. Rizo,
H. Martin, S.H. Kim, R. Kaspar, T.V. Taksir, D.A. Griffiths, S.H. Cheng, L.S. Shihabuddin, and B.K.
Kaspar. 2008. Delivery of AAV-IGF-1 to the CNS extends survival in ALS mice through modification of
aberrant glial cell activity. Mol Ther. 16:1056-64.
Doi, H., H. Kikuchi, H. Murai, Y. Kawano, H. Shigeto, Y. Ohyagi, and J. Kira. 2006. Motor neuron disorder
simulating ALS induced by chronic inhalation of pyrethroid insecticides. Neurology. 67:1894-5.
Domeniconi, M., B.L. Hempstead, and M.V. Chao. 2007. Pro-NGF secreted by astrocytes promotes motor
neuron cell death. Mol Cell Neurosci. 34:271-9.
Duchen, L.W. 1973. The effects of tetanus toxin on the motor end-plates of the mouse. An electron
microscopic study. J Neurol Sci. 19:153-67.
Duffy, L.M., A.L. Chapman, P.J. Shaw, and A.J. Grierson. 2011. Review: The role of mitochondria in the
pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuropathol Appl Neurobiol. 37:336-52.
Duplan, L., N. Bernard, W. Casseron, K. Dudley, E. Thouvenot, J. Honnorat, V. Rogemond, B. De Bovis, P.
Aebischer, P. Marin, C. Raoul, C.E. Henderson, and B. Pettmann. 2010. Collapsin response mediator
protein 4a (CRMP4a) is upregulated in motoneurons of mutant SOD1 mice and can trigger
motoneuron axonal degeneration and cell death. J Neurosci. 30:785-96.
Dupuis, L., F. di Scala, F. Rene, M. de Tapia, H. Oudart, P.F. Pradat, V. Meininger, and J.P. Loeffler. 2003. Upregulation of mitochondrial uncoupling protein 3 reveals an early muscular metabolic defect in
amyotrophic lateral sclerosis. FASEB J. 17:2091-3.
Dupuis, L., J.L. Gonzalez de Aguilar, F. di Scala, F. Rene, M. de Tapia, P.F. Pradat, L. Lacomblez, D. Seihlan, R.
Prinjha, F.S. Walsh, V. Meininger, and J.P. Loeffler. 2002. Nogo provides a molecular marker for
diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 10:358-65.
252
Références
Dupuis, L., and J.P. Loeffler. 2008. [Amyotrophic lateral sclerosis: role of energy deficiency in neuromuscular
junction dismantlement]. Med Sci (Paris). 24:1077-82.
Dupuis, L., H. Oudart, F. Rene, J.L. Gonzalez de Aguilar, and J.P. Loeffler. 2004. Evidence for defective energy
homeostasis in amyotrophic lateral sclerosis: benefit of a high-energy diet in a transgenic mouse
model. Proc Natl Acad Sci U S A. 101:11159-64.
Durham, H.D., J. Roy, L. Dong, and D.A. Figlewicz. 1997. Aggregation of mutant Cu/Zn superoxide dismutase
proteins in a culture model of ALS. J Neuropathol Exp Neurol. 56:523-30.
Echaniz-Laguna, A., J. Zoll, F. Ribera, C. Tranchant, J.M. Warter, J. Lonsdorfer, and E. Lampert. 2002.
Mitochondrial respiratory chain function in skeletal muscle of ALS patients. Ann Neurol. 52:623-7.
Eggett, C.J., S. Crosier, P. Manning, M.R. Cookson, F.M. Menzies, C.J. McNeil, and P.J. Shaw. 2000.
Development and characterisation of a glutamate-sensitive motor neurone cell line. J Neurochem.
74:1895-902.
Elliott, J.L. 2001. Cytokine upregulation in a murine model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res
Mol Brain Res. 95:172-8.
Epstein, C.J., K.B. Avraham, M. Lovett, S. Smith, O. Elroy-Stein, G. Rotman, C. Bry, and Y. Groner. 1987.
Transgenic mice with increased Cu/Zn-superoxide dismutase activity: animal model of dosage effects
in Down syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 84:8044-8.
Erickson, R.R., L.M. Dunning, D.A. Olson, S.J. Cohen, A.T. Davis, W.G. Wood, R.A. Kratzke, and J.L. Holtzman.
2005. In cerebrospinal fluid ER chaperones ERp57 and calreticulin bind beta-amyloid. Biochem
Biophys Res Commun. 332:50-7.
Estes, P.S., A. Boehringer, R. Zwick, J.E. Tang, B. Grigsby, and D.C. Zarnescu. 2011. Wild-type and A315T
mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Hum Mol Genet.
20:2308-21.
Eymard-Pierre, E., K. Yamanaka, M. Haeussler, W. Kress, F. Gauthier-Barichard, P. Combes, D.W. Cleveland,
and O. Boespflug-Tanguy. 2006. Novel missense mutation in ALS2 gene results in infantile ascending
hereditary spastic paralysis. Ann Neurol. 59:976-80.
Ezzi, S.A., R. Lariviere, M. Urushitani, and J.P. Julien. 2010. Neuronal over-expression of chromogranin A
accelerates disease onset in a mouse model of ALS. J Neurochem. 115:1102-11.
Ezzi, S.A., M. Urushitani, and J.P. Julien. 2007. Wild-type superoxide dismutase acquires binding and toxic
properties of ALS-linked mutant forms through oxidation. J Neurochem. 102:170-8.
Fang, F., R. Bellocco, M.A. Hernan, and W. Ye. 2006. Smoking, snuff dipping and the risk of amyotrophic
lateral sclerosis--a prospective cohort study. Neuroepidemiology. 27:217-21.
Ferrucci, M., A. Spalloni, A. Bartalucci, E. Cantafora, F. Fulceri, M. Nutini, P. Longone, A. Paparelli, and F.
Fornai. 2010. A systematic study of brainstem motor nuclei in a mouse model of ALS, the effects of
lithium. Neurobiol Dis. 37:370-83.
Fischer, L.R., D.G. Culver, P. Tennant, A.A. Davis, M. Wang, A. Castellano-Sanchez, J. Khan, M.A. Polak, and
J.D. Glass. 2004. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp
Neurol. 185:232-40.
Fischer, L.R., and J.D. Glass. 2007. Axonal degeneration in motor neuron disease. Neurodegener Dis. 4:43142.
Flood, D.G., A.G. Reaume, J.A. Gruner, E.K. Hoffman, J.D. Hirsch, Y.G. Lin, K.S. Dorfman, and R.W. Scott. 1999.
Hindlimb motor neurons require Cu/Zn superoxide dismutase for maintenance of neuromuscular
junctions. Am J Pathol. 155:663-72.
Fray, A.E., P.G. Ince, S.J. Banner, I.D. Milton, P.A. Usher, M.R. Cookson, and P.J. Shaw. 1998. The expression
of the glial glutamate transporter protein EAAT2 in motor neuron disease: an immunohistochemical
study. Eur J Neurosci. 10:2481-9.
Frey, D., C. Schneider, L. Xu, J. Borg, W. Spooren, and P. Caroni. 2000. Early and selective loss of
neuromuscular synapse subtypes with low sprouting competence in motoneuron diseases. J
Neurosci. 20:2534-42.
Friedlander, R.M., R.H. Brown, V. Gagliardini, J. Wang, and J. Yuan. 1997. Inhibition of ICE slows ALS in mice.
Nature. 388:31.
Frost, B., and M.I. Diamond. 2010. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci.
11:155-9.
253
Références
Fukada, K., S. Nagano, M. Satoh, C. Tohyama, T. Nakanishi, A. Shimizu, T. Yanagihara, and S. Sakoda. 2001.
Stabilization of mutant Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) protein by coexpressed wild SOD1
protein accelerates the disease progression in familial amyotrophic lateral sclerosis mice. Eur J
Neurosci. 14:2032-6.
Fukata, Y., T.J. Itoh, T. Kimura, C. Menager, T. Nishimura, T. Shiromizu, H. Watanabe, N. Inagaki, A. Iwamatsu,
H. Hotani, and K. Kaibuchi. 2002. CRMP-2 binds to tubulin heterodimers to promote microtubule
assembly. Nat Cell Biol. 4:583-91.
Furukawa, Y., R. Fu, H.X. Deng, T. Siddique, and T.V. O'Halloran. 2006. Disulfide cross-linked protein
represents a significant fraction of ALS-associated Cu, Zn-superoxide dismutase aggregates in spinal
cords of model mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:7148-53.
Galehdar, Z., P. Swan, B. Fuerth, S.M. Callaghan, D.S. Park, and S.P. Cregan. 2010. Neuronal apoptosis
induced by endoplasmic reticulum stress is regulated by ATF4-CHOP-mediated induction of the Bcl-2
homology 3-only member PUMA. J Neurosci. 30:16938-48.
Gelebart, P., M. Opas, and M. Michalak. 2005. Calreticulin, a Ca2+-binding chaperone of the endoplasmic
reticulum. Int J Biochem Cell Biol. 37:260-6.
Gellera, C., C. Colombrita, N. Ticozzi, B. Castellotti, C. Bragato, A. Ratti, F. Taroni, and V. Silani. 2008.
Identification of new ANG gene mutations in a large cohort of Italian patients with amyotrophic
lateral sclerosis. Neurogenetics. 9:33-40.
Geschwind, D.H., G.M. Kelly, H. Fryer, H. Feeser-Bhatt, and S. Hockfield. 1996. Identification and
characterization of novel developmentally regulated proteins in rat spinal cord. Brain Res Dev Brain
Res. 97:62-75.
Giess, R., B. Holtmann, M. Braga, T. Grimm, B. Muller-Myhsok, K.V. Toyka, and M. Sendtner. 2002. Early
onset of severe familial amyotrophic lateral sclerosis with a SOD-1 mutation: potential impact of
CNTF as a candidate modifier gene. Am J Hum Genet. 70:1277-86.
Gitcho, M.A., R.H. Baloh, S. Chakraverty, K. Mayo, J.B. Norton, D. Levitch, K.J. Hatanpaa, C.L. White, 3rd, E.H.
Bigio, R. Caselli, M. Baker, M.T. Al-Lozi, J.C. Morris, A. Pestronk, R. Rademakers, A.M. Goate, and N.J.
Cairns. 2008. TDP-43 A315T mutation in familial motor neuron disease. Ann Neurol. 63:535-8.
Gitcho, M.A., J. Strider, D. Carter, L. Taylor-Reinwald, M.S. Forman, A.M. Goate, and N.J. Cairns. 2009. VCP
mutations causing frontotemporal lobar degeneration disrupt localization of TDP-43 and induce cell
death. J Biol Chem. 284:12384-98.
Gkogkas, C., S. Middleton, A.M. Kremer, C. Wardrope, M. Hannah, T.H. Gillingwater, and P. Skehel. 2008.
VAPB interacts with and modulates the activity of ATF6. Hum Mol Genet. 17:1517-26.
Gong, Y.H., A.S. Parsadanian, A. Andreeva, W.D. Snider, and J.L. Elliott. 2000. Restricted expression of G86R
Cu/Zn superoxide dismutase in astrocytes results in astrocytosis but does not cause motoneuron
degeneration. J Neurosci. 20:660-5.
Good, P.F., D. Alapat, A. Hsu, C. Chu, D. Perl, X. Wen, D.E. Burstein, and D.S. Kohtz. 2004. A role for
semaphorin 3A signaling in the degeneration of hippocampal neurons during Alzheimer's disease. J
Neurochem. 91:716-36.
Gorlich, D., E. Hartmann, S. Prehn, and T.A. Rapoport. 1992. A protein of the endoplasmic reticulum involved
early in polypeptide translocation. Nature. 357:47-52.
Goshima, Y. 1997. [Regulation of growth cone motility by the repulsive factor collapsin/semaphorin: a role of
collapsin response mediator protein (CRMP)]. Seikagaku. 69:1389-92.
Gray, D.A., M. Tsirigotis, and J. Woulfe. 2003. Ubiquitin, proteasomes, and the aging brain. Sci Aging
Knowledge Environ. 2003:RE6.
Griffiths, I.R., and I.D. Duncan. 1975. Chronic degenerative radiculomyelopathy in the dog. J Small Anim
Pract. 16:461-71.
Gros-Louis, F., P.M. Andersen, N. Dupre, M. Urushitani, P. Dion, F. Souchon, M. D'Amour, W. Camu, V.
Meininger, J.P. Bouchard, G.A. Rouleau, and J.P. Julien. 2009. Chromogranin B P413L variant as risk
factor and modifier of disease onset for amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A.
106:21777-82.
Gros-Louis, F., C. Gaspar, and G.A. Rouleau. 2006. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral
sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762:956-72.
254
Références
Gros-Louis, F., J. Kriz, E. Kabashi, J. McDearmid, S. Millecamps, M. Urushitani, L. Lin, P. Dion, Q. Zhu, P.
Drapeau, J.P. Julien, and G.A. Rouleau. 2008. Als2 mRNA splicing variants detected in KO mice rescue
severe motor dysfunction phenotype in Als2 knock-down zebrafish. Hum Mol Genet. 17:2691-702.
Gros-Louis, F., I.A. Meijer, C.K. Hand, M.P. Dube, D.L. MacGregor, M.H. Seni, R.S. Devon, M.R. Hayden, F.
Andermann, E. Andermann, and G.A. Rouleau. 2003. An ALS2 gene mutation causes hereditary
spastic paraplegia in a Pakistani kindred. Ann Neurol. 53:144-5.
Grosskreutz, J., L. Van Den Bosch, and B.U. Keller. 2010. Calcium dysregulation in amyotrophic lateral
sclerosis. Cell Calcium. 47:165-74.
Guegan, C., and S. Przedborski. 2003. Programmed cell death in amyotrophic lateral sclerosis. J Clin Invest.
111:153-61.
Guegan, C., M. Vila, G. Rosoklija, A.P. Hays, and S. Przedborski. 2001. Recruitment of the mitochondrialdependent apoptotic pathway in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci. 21:6569-76.
Guicciardi, M.E., and G.J. Gores. 2009. Life and death by death receptors. FASEB J. 23:1625-37.
Guo, H., L. Lai, M.E. Butchbach, M.P. Stockinger, X. Shan, G.A. Bishop, and C.L. Lin. 2003. Increased
expression of the glial glutamate transporter EAAT2 modulates excitotoxicity and delays the onset
but not the outcome of ALS in mice. Hum Mol Genet. 12:2519-32.
Gurney, M.E. 1997. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug
studies. J Neurol Sci. 152 Suppl 1:S67-73.
Gurney, M.E., H. Pu, A.Y. Chiu, M.C. Dal Canto, C.Y. Polchow, D.D. Alexander, J. Caliendo, A. Hentati, Y.W.
Kwon, H.X. Deng, and et al. 1994. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn
superoxide dismutase mutation. Science. 264:1772-5.
Hadano, S., S.C. Benn, S. Kakuta, A. Otomo, K. Sudo, R. Kunita, K. Suzuki-Utsunomiya, H. Mizumura, J.M.
Shefner, G.A. Cox, Y. Iwakura, R.H. Brown, Jr., and J.E. Ikeda. 2006. Mice deficient in the Rab5
guanine nucleotide exchange factor ALS2/alsin exhibit age-dependent neurological deficits and
altered endosome trafficking. Hum Mol Genet. 15:233-50.
Hadano, S., C.K. Hand, H. Osuga, Y. Yanagisawa, A. Otomo, R.S. Devon, N. Miyamoto, J. Showguchi-Miyata, Y.
Okada, R. Singaraja, D.A. Figlewicz, T. Kwiatkowski, B.A. Hosler, T. Sagie, J. Skaug, J. Nasir, R.H.
Brown, Jr., S.W. Scherer, G.A. Rouleau, M.R. Hayden, and J.E. Ikeda. 2001. A gene encoding a
putative GTPase regulator is mutated in familial amyotrophic lateral sclerosis 2. Nat Genet. 29:16673.
Hafezparast, M., R. Klocke, C. Ruhrberg, A. Marquardt, A. Ahmad-Annuar, S. Bowen, G. Lalli, A.S. Witherden,
H. Hummerich, S. Nicholson, P.J. Morgan, R. Oozageer, J.V. Priestley, S. Averill, V.R. King, S. Ball, J.
Peters, T. Toda, A. Yamamoto, Y. Hiraoka, M. Augustin, D. Korthaus, S. Wattler, P. Wabnitz, C.
Dickneite, S. Lampel, F. Boehme, G. Peraus, A. Popp, M. Rudelius, J. Schlegel, H. Fuchs, M. Hrabe de
Angelis, G. Schiavo, D.T. Shima, A.P. Russ, G. Stumm, J.E. Martin, and E.M. Fisher. 2003. Mutations in
dynein link motor neuron degeneration to defects in retrograde transport. Science. 300:808-12.
Haidet-Phillips, A.M., M.E. Hester, C.J. Miranda, K. Meyer, L. Braun, A. Frakes, S. Song, S. Likhite, M.J. Murtha,
K.D. Foust, M. Rao, A. Eagle, A. Kammesheidt, A. Christensen, J.R. Mendell, A.H. Burghes, and B.K.
Kaspar. 2011. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nat
Biotechnol.
Haley, R.W., S. Billecke, and B.N. La Du. 1999. Association of low PON1 type Q (type A) arylesterase activity
with neurologic symptom complexes in Gulf War veterans. Toxicol Appl Pharmacol. 157:227-33.
Harraz, M.M., J.J. Marden, W. Zhou, Y. Zhang, A. Williams, V.S. Sharov, K. Nelson, M. Luo, H. Paulson, C.
Schoneich, and J.F. Engelhardt. 2008. SOD1 mutations disrupt redox-sensitive Rac regulation of
NADPH oxidase in a familial ALS model. J Clin Invest. 118:659-70.
He, B.P., and M.J. Strong. 2000. Motor neuronal death in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is not
apoptotic. A comparative study of ALS and chronic aluminium chloride neurotoxicity in New Zealand
white rabbits. Neuropathol Appl Neurobiol. 26:150-60.
Heath, P.R., and P.J. Shaw. 2002. Update on the glutamatergic neurotransmitter system and the role of
excitotoxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26:438-58.
Hebert, D.N., R. Bernasconi, and M. Molinari. 2010. ERAD substrates: which way out? Semin Cell Dev Biol.
21:526-32.
255
Références
Hebert, D.N., B. Foellmer, and A. Helenius. 1996. Calnexin and calreticulin promote folding, delay
oligomerization and suppress degradation of influenza hemagglutinin in microsomes. Embo J.
15:2961-8.
Hedgecock, E.M., J.G. Culotti, J.N. Thomson, and L.A. Perkins. 1985. Axonal guidance mutants of
Caenorhabditis elegans identified by filling sensory neurons with fluorescein dyes. Dev Biol. 111:15870.
Henderson, C.E., W. Camu, C. Mettling, A. Gouin, K. Poulsen, M. Karihaloo, J. Rullamas, T. Evans, S.B.
McMahon, M.P. Armanini, and et al. 1993. Neurotrophins promote motor neuron survival and are
present in embryonic limb bud. Nature. 363:266-70.
Henkel, J.S., D.R. Beers, W. Zhao, and S.H. Appel. 2009. Microglia in ALS: the good, the bad, and the resting. J
Neuroimmune Pharmacol. 4:389-98.
Hensley, K., J. Fedynyshyn, S. Ferrell, R.A. Floyd, B. Gordon, P. Grammas, L. Hamdheydari, M. Mhatre, S.
Mou, Q.N. Pye, C. Stewart, M. West, S. West, and K.S. Williamson. 2003. Message and protein-level
elevation of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) and TNF alpha-modulating cytokines in spinal
cords of the G93A-SOD1 mouse model for amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 14:74-80.
Hensley, K., R.A. Floyd, B. Gordon, S. Mou, Q.N. Pye, C. Stewart, M. West, and K. Williamson. 2002. Temporal
patterns of cytokine and apoptosis-related gene expression in spinal cords of the G93A-SOD1 mouse
model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 82:365-74.
Hentati, A., K. Bejaoui, M.A. Pericak-Vance, F. Hentati, M.C. Speer, W.Y. Hung, D.A. Figlewicz, J. Haines, J.
Rimmler, C. Ben Hamida, and et al. 1994. Linkage of recessive familial amyotrophic lateral sclerosis
to chromosome 2q33-q35. Nat Genet. 7:425-8.
Hess, D.T., A. Matsumoto, S.O. Kim, H.E. Marshall, and J.S. Stamler. 2005. Protein S-nitrosylation: purview
and parameters. Nat Rev Mol Cell Biol. 6:150-66.
Hess, D.T., S.I. Patterson, D.S. Smith, and J.H. Skene. 1993. Neuronal growth cone collapse and inhibition of
protein fatty acylation by nitric oxide. Nature. 366:562-5.
Hetz, C., P. Thielen, S. Matus, M. Nassif, F. Court, R. Kiffin, G. Martinez, A.M. Cuervo, R.H. Brown, and L.H.
Glimcher. 2009. XBP-1 deficiency in the nervous system protects against amyotrophic lateral
sclerosis by increasing autophagy. Genes Dev. 23:2294-306.
Hewett, S.J., C.A. Csernansky, and D.W. Choi. 1994. Selective potentiation of NMDA-induced neuronal injury
following induction of astrocytic iNOS. Neuron. 13:487-94.
Hiraishi, K., K. Suzuki, S. Hakomori, and M. Adachi. 1993. Le(y) antigen expression is correlated with
apoptosis (programmed cell death). Glycobiology. 3:381-90.
Ho, Y.S., M. Gargano, J. Cao, R.T. Bronson, I. Heimler, and R.J. Hutz. 1998. Reduced fertility in female mice
lacking copper-zinc superoxide dismutase. J Biol Chem. 273:7765-9.
Hof, P.R., and J.H. Morrison. 2004. The aging brain: morphomolecular senescence of cortical circuits. Trends
Neurosci. 27:607-13.
Holasek, S.S., T.M. Wengenack, K.K. Kandimalla, C. Montano, D.M. Gregor, G.L. Curran, and J.F. Poduslo.
2005. Activation of the stress-activated MAP kinase, p38, but not JNK in cortical motor neurons
during early presymptomatic stages of amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice. Brain Res.
1045:185-98.
Holzbaur, E.L., D.S. Howland, N. Weber, K. Wallace, Y. She, S. Kwak, L.A. Tchistiakova, E. Murphy, J. Hinson, R.
Karim, X.Y. Tan, P. Kelley, K.C. McGill, G. Williams, C. Hobbs, P. Doherty, M.M. Zaleska, M.N.
Pangalos, and F.S. Walsh. 2006. Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of
amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 23:697-707.
Hotchkiss, R.S., A. Strasser, J.E. McDunn, and P.E. Swanson. 2009. Cell death. N Engl J Med. 361:1570-83.
Howland, D.S., J. Liu, Y. She, B. Goad, N.J. Maragakis, B. Kim, J. Erickson, J. Kulik, L. DeVito, G. Psaltis, L.J.
DeGennaro, D.W. Cleveland, and J.D. Rothstein. 2002. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2
in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl
Acad Sci U S A. 99:1604-9.
Huang, C., H. Zhou, J. Tong, H. Chen, Y.J. Liu, D. Wang, X. Wei, and X.G. Xia. 2011. FUS transgenic rats develop
the phenotypes of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. PLoS Genet.
7:e1002011.
256
Références
Igaz, L.M., L.K. Kwong, Y. Xu, A.C. Truax, K. Uryu, M. Neumann, C.M. Clark, L.B. Elman, B.L. Miller, M.
Grossman, L.F. McCluskey, J.Q. Trojanowski, and V.M. Lee. 2008. Enrichment of C-terminal
fragments in TAR DNA-binding protein-43 cytoplasmic inclusions in brain but not in spinal cord of
frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Pathol. 173:182-94.
Iida, A., T. Kamei, M. Sano, S. Oshima, T. Tokuda, Y. Nakamura, and S. Ikegawa. 2010. Large-scale screening
of TARDBP mutation in amyotrophic lateral sclerosis in Japanese. Neurobiol Aging.
Ilieva, E.V., V. Ayala, M. Jove, E. Dalfo, D. Cacabelos, M. Povedano, M.J. Bellmunt, I. Ferrer, R. Pamplona, and
M. Portero-Otin. 2007. Oxidative and endoplasmic reticulum stress interplay in sporadic
amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 130:3111-23.
Ilieva, H., M. Polymenidou, and D.W. Cleveland. 2009. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative
disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187:761-72.
Inagaki, N., K. Chihara, N. Arimura, C. Menager, Y. Kawano, N. Matsuo, T. Nishimura, M. Amano, and K.
Kaibuchi. 2001. CRMP-2 induces axons in cultured hippocampal neurons. Nat Neurosci. 4:781-2.
Ince, P.G., J. Lowe, and P.J. Shaw. 1998. Amyotrophic lateral sclerosis: current issues in classification,
pathogenesis and molecular pathology. Neuropathol Appl Neurobiol. 24:104-17.
Inoue, H., K. Tsukita, T. Iwasato, Y. Suzuki, M. Tomioka, M. Tateno, M. Nagao, A. Kawata, T.C. Saido, M.
Miura, H. Misawa, S. Itohara, and R. Takahashi. 2003. The crucial role of caspase-9 in the disease
progression of a transgenic ALS mouse model. EMBO J. 22:6665-74.
Israelson, A., N. Arbel, S. Da Cruz, H. Ilieva, K. Yamanaka, V. Shoshan-Barmatz, and D.W. Cleveland. 2010.
Misfolded mutant SOD1 directly inhibits VDAC1 conductance in a mouse model of inherited ALS.
Neuron. 67:575-87.
Ito, Y., M. Yamada, H. Tanaka, K. Aida, K. Tsuruma, M. Shimazawa, I. Hozumi, T. Inuzuka, H. Takahashi, and H.
Hara. 2009. Involvement of CHOP, an ER-stress apoptotic mediator, in both human sporadic ALS and
ALS model mice. Neurobiol Dis. 36:470-6.
Jaarsma, D., E.D. Haasdijk, J.A. Grashorn, R. Hawkins, W. van Duijn, H.W. Verspaget, J. London, and J.C.
Holstege. 2000. Human Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) overexpression in mice causes
mitochondrial vacuolization, axonal degeneration, and premature motoneuron death and
accelerates motoneuron disease in mice expressing a familial amyotrophic lateral sclerosis mutant
SOD1. Neurobiol Dis. 7:623-43.
Jaarsma, D., E. Teuling, E.D. Haasdijk, C.I. De Zeeuw, and C.C. Hoogenraad. 2008. Neuron-specific expression
of mutant superoxide dismutase is sufficient to induce amyotrophic lateral sclerosis in transgenic
mice. J Neurosci. 28:2075-88.
Jahn, K., J. Grosskreutz, K. Haastert, E. Ziegler, F. Schlesinger, C. Grothe, R. Dengler, and J. Bufler. 2006.
Temporospatial coupling of networked synaptic activation of AMPA-type glutamate receptor
channels and calcium transients in cultured motoneurons. Neuroscience. 142:1019-29.
Jaiswal, M.K., and B.U. Keller. 2009. Cu/Zn superoxide dismutase typical for familial amyotrophic lateral
sclerosis increases the vulnerability of mitochondria and perturbs Ca2+ homeostasis in SOD1G93A
mice. Mol Pharmacol. 75:478-89.
Johnson, J.O., J. Mandrioli, M. Benatar, Y. Abramzon, V.M. Van Deerlin, J.Q. Trojanowski, J.R. Gibbs, M.
Brunetti, S. Gronka, J. Wuu, J. Ding, L. McCluskey, M. Martinez-Lage, D. Falcone, D.G. Hernandez, S.
Arepalli, S. Chong, J.C. Schymick, J. Rothstein, F. Landi, Y.D. Wang, A. Calvo, G. Mora, M. Sabatelli,
M.R. Monsurro, S. Battistini, F. Salvi, R. Spataro, P. Sola, G. Borghero, G. Galassi, S.W. Scholz, J.P.
Taylor, G. Restagno, A. Chio, and B.J. Traynor. 2010. Exome sequencing reveals VCP mutations as a
cause of familial ALS. Neuron. 68:857-64.
Johnston, J.A., M.J. Dalton, M.E. Gurney, and R.R. Kopito. 2000. Formation of high molecular weight
complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral
sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:12571-6.
Jokic, N., J.L. Gonzalez de Aguilar, L. Dimou, S. Lin, A. Fergani, M.A. Ruegg, M.E. Schwab, L. Dupuis, and J.P.
Loeffler. 2006. The neurite outgrowth inhibitor Nogo-A promotes denervation in an amyotrophic
lateral sclerosis model. EMBO Rep. 7:1162-7.
Jokic, N., J.L. Gonzalez de Aguilar, P.F. Pradat, L. Dupuis, A. Echaniz-Laguna, A. Muller, O. Dubourg, D.
Seilhean, J.J. Hauw, J.P. Loeffler, and V. Meininger. 2005. Nogo expression in muscle correlates with
amyotrophic lateral sclerosis severity. Ann Neurol. 57:553-6.
257
Références
Jonsson, P.A., K. Ernhill, P.M. Andersen, D. Bergemalm, T. Brannstrom, O. Gredal, P. Nilsson, and S.L.
Marklund. 2004. Minute quantities of misfolded mutant superoxide dismutase-1 cause amyotrophic
lateral sclerosis. Brain. 127:73-88.
Jonsson, P.A., K.S. Graffmo, T. Brannstrom, P. Nilsson, P.M. Andersen, and S.L. Marklund. 2006. Motor
neuron disease in mice expressing the wild type-like D90A mutant superoxide dismutase-1. J
Neuropathol Exp Neurol. 65:1126-36.
Juneja, T., M.A. Pericak-Vance, N.G. Laing, S. Dave, and T. Siddique. 1997. Prognosis in familial amyotrophic
lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn
superoxide dismutase. Neurology. 48:55-7.
Jung, C., C.M. Higgins, and Z. Xu. 2002. A quantitative histochemical assay for activities of mitochondrial
electron transport chain complexes in mouse spinal cord sections. J Neurosci Methods. 114:165-72.
Jung, C., S. Lee, D. Ortiz, Q. Zhu, J.P. Julien, and T.B. Shea. 2005. The high and middle molecular weight
neurofilament subunits regulate the association of neurofilaments with kinesin: inhibition by
phosphorylation of the high molecular weight subunit. Brain Res Mol Brain Res. 141:151-5.
Kaal, E.C., E.A. Joosten, and P.R. Bar. 1997. Prevention of apoptotic motoneuron death in vitro by
neurotrophins and muscle extract. Neurochem Int. 31:193-201.
Kabashi, E., J.N. Agar, D.M. Taylor, S. Minotti, and H.D. Durham. 2004. Focal dysfunction of the proteasome:
a pathogenic factor in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 89:1325-35.
Kabashi, E., L. Lin, M.L. Tradewell, P.A. Dion, V. Bercier, P. Bourgouin, D. Rochefort, S. Bel Hadj, H.D. Durham,
C. Vande Velde, G.A. Rouleau, and P. Drapeau. 2010. Gain and loss of function of ALS-related
mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19:671-83.
Kanekura, K., I. Nishimoto, S. Aiso, and M. Matsuoka. 2006. Characterization of amyotrophic lateral sclerosislinked P56S mutation of vesicle-associated membrane protein-associated protein B (VAPB/ALS8). J
Biol Chem. 281:30223-33.
Kang, S.J., I. Sanchez, N. Jing, and J. Yuan. 2003. Dissociation between neurodegeneration and caspase-11mediated activation of caspase-1 and caspase-3 in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J
Neurosci. 23:5455-60.
Kanning, K.C., A. Kaplan, and C.E. Henderson. 2010. Motor neuron diversity in development and disease.
Annu Rev Neurosci. 33:409-40.
Karch, C.M., M. Prudencio, D.D. Winkler, P.J. Hart, and D.R. Borchelt. 2009. Role of mutant SOD1 disulfide
oxidation and aggregation in the pathogenesis of familial ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:7774-9.
Kato, S. 2008. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: similarities and differences.
Acta Neuropathol. 115:97-114.
Kawahara, Y., S. Kwak, H. Sun, K. Ito, H. Hashida, H. Aizawa, S.Y. Jeong, and I. Kanazawa. 2003. Human spinal
motoneurons express low relative abundance of GluR2 mRNA: an implication for excitotoxicity in
ALS. J Neurochem. 85:680-9.
Kawamata, H., and G. Manfredi. 2010. Mitochondrial dysfunction and intracellular calcium dysregulation in
ALS. Mech Ageing Dev. 131:517-26.
Kiaei, M., K. Kipiani, N.Y. Calingasan, E. Wille, J. Chen, B. Heissig, S. Rafii, S. Lorenzl, and M.F. Beal. 2007.
Matrix metalloproteinase-9 regulates TNF-alpha and FasL expression in neuronal, glial cells and its
absence extends life in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol.
205:74-81.
Kiaei, M., S. Petri, K. Kipiani, G. Gardian, D.K. Choi, J. Chen, N.Y. Calingasan, P. Schafer, G.W. Muller, C.
Stewart, K. Hensley, and M.F. Beal. 2006. Thalidomide and lenalidomide extend survival in a
transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci. 26:2467-73.
Kieran, D., M. Hafezparast, S. Bohnert, J.R. Dick, J. Martin, G. Schiavo, E.M. Fisher, and L. Greensmith. 2005. A
mutation in dynein rescues axonal transport defects and extends the life span of ALS mice. J Cell Biol.
169:561-7.
Kieran, D., B. Kalmar, J.R. Dick, J. Riddoch-Contreras, G. Burnstock, and L. Greensmith. 2004. Treatment with
arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med.
10:402-5.
Kieran, D., J. Sebastia, M.J. Greenway, M.A. King, D. Connaughton, C.G. Concannon, B. Fenner, O. Hardiman,
and J.H. Prehn. 2008. Control of motoneuron survival by angiogenin. J Neurosci. 28:14056-61.
258
Références
Kieran, D., I. Woods, A. Villunger, A. Strasser, and J.H. Prehn. 2007. Deletion of the BH3-only protein puma
protects motoneurons from ER stress-induced apoptosis and delays motoneuron loss in ALS mice.
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:20606-11.
Kikuchi, H., G. Almer, S. Yamashita, C. Guegan, M. Nagai, Z. Xu, A.A. Sosunov, G.M. McKhann, 2nd, and S.
Przedborski. 2006. Spinal cord endoplasmic reticulum stress associated with a microsomal
accumulation of mutant superoxide dismutase-1 in an ALS model. Proc Natl Acad Sci U S A.
103:6025-30.
Kim, H.J., W. Im, S. Kim, S.H. Kim, J.J. Sung, M. Kim, and K.W. Lee. 2007. Calcium-influx increases SOD1
aggregates via nitric oxide in cultured motor neurons. Exp Mol Med. 39:574-82.
Kim, I., W. Xu, and J.C. Reed. 2008. Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and
therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 7:1013-30.
Kim, R., M. Emi, K. Tanabe, S. Murakami, Y. Uchida, and K. Arihiro. 2006. Regulation and interplay of
apoptotic and non-apoptotic cell death. J Pathol. 208:319-26.
Kisby, G.E., M. Ellison, and P.S. Spencer. 1992. Content of the neurotoxins cycasin (methylazoxymethanol
beta-D-glucoside) and BMAA (beta-N-methylamino-L-alanine) in cycad flour prepared by Guam
Chamorros. Neurology. 42:1336-40.
Knee, R., I. Ahsan, N. Mesaeli, R.J. Kaufman, and M. Michalak. 2003. Compromised calnexin function in
calreticulin-deficient cells. Biochem Biophys Res Commun. 304:661-6.
Kostic, V., V. Jackson-Lewis, F. de Bilbao, M. Dubois-Dauphin, and S. Przedborski. 1997. Bcl-2: prolonging life
in a transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Science. 277:559-62.
Kosuge, Y., K. Sekikawa-Nishida, H. Negi, K. Ishige, and Y. Ito. 2009. Characterization of chronic glutamatemediated motor neuron toxicity in organotypic spinal cord culture prepared from ALS model mice.
Neurosci Lett. 454:165-9.
Kraemer, B.C., T. Schuck, J.M. Wheeler, L.C. Robinson, J.Q. Trojanowski, V.M. Lee, and G.D. Schellenberg.
2010. Loss of murine TDP-43 disrupts motor function and plays an essential role in embryogenesis.
Acta Neuropathol. 119:409-19.
Kust, B.M., N. Brouwer, I.J. Mantingh, H.W. Boddeke, and J.C. Copray. 2003. Reduced p75NTR expression
delays disease onset only in female mice of a transgenic model of familial amyotrophic lateral
sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 4:100-5.
Kwiatkowski, T.J., Jr., D.A. Bosco, A.L. Leclerc, E. Tamrazian, C.R. Vanderburg, C. Russ, A. Davis, J. Gilchrist, E.J.
Kasarskis, T. Munsat, P. Valdmanis, G.A. Rouleau, B.A. Hosler, P. Cortelli, P.J. de Jong, Y. Yoshinaga,
J.L. Haines, M.A. Pericak-Vance, J. Yan, N. Ticozzi, T. Siddique, D. McKenna-Yasek, P.C. Sapp, H.R.
Horvitz, J.E. Landers, and R.H. Brown, Jr. 2009. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16
cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Science. 323:1205-8.
Lagier-Tourenne, C., M. Polymenidou, and D.W. Cleveland. 2010. TDP-43 and FUS/TLS: emerging roles in RNA
processing and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 19:R46-64.
Lambrechts, D., E. Storkebaum, M. Morimoto, J. Del-Favero, F. Desmet, S.L. Marklund, S. Wyns, V. Thijs, J.
Andersson, I. van Marion, A. Al-Chalabi, S. Bornes, R. Musson, V. Hansen, L. Beckman, R. Adolfsson,
H.S. Pall, H. Prats, S. Vermeire, P. Rutgeerts, S. Katayama, T. Awata, N. Leigh, L. Lang-Lazdunski, M.
Dewerchin, C. Shaw, L. Moons, R. Vlietinck, K.E. Morrison, W. Robberecht, C. Van Broeckhoven, D.
Collen, P.M. Andersen, and P. Carmeliet. 2003. VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in
mice and humans and protects motoneurons against ischemic death. Nat Genet. 34:383-94.
LaMonte, B.H., K.E. Wallace, B.A. Holloway, S.S. Shelly, J. Ascano, M. Tokito, T. Van Winkle, D.S. Howland,
and E.L. Holzbaur. 2002. Disruption of dynein/dynactin inhibits axonal transport in motor neurons
causing late-onset progressive degeneration. Neuron. 34:715-27.
Langou, K., A. Moumen, C. Pellegrino, J. Aebischer, I. Medina, P. Aebischer, and C. Raoul. 2010. AAVmediated expression of wild-type and ALS-linked mutant VAPB selectively triggers death of
motoneurons through a Ca2+-dependent ER-associated pathway. J Neurochem. 114:795-809.
Lanson, N.A., Jr., A. Maltare, H. King, R. Smith, J.H. Kim, J.P. Taylor, T.E. Lloyd, and U.B. Pandey. 2011. A
Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and
TDP-43. Hum Mol Genet.
259
Références
Lee, J.H., S.M. Won, J. Suh, S.J. Son, G.J. Moon, U.J. Park, and B.J. Gwag. 2010. Induction of the unfolded
protein response and cell death pathway in Alzheimer's disease, but not in aged Tg2576 mice. Exp
Mol Med. 42:386-94.
Lee, M.K., J.R. Marszalek, and D.W. Cleveland. 1994. A mutant neurofilament subunit causes massive,
selective motor neuron death: implications for the pathogenesis of human motor neuron disease.
Neuron. 13:975-88.
Leigh, P.N., S. Abrahams, A. Al-Chalabi, M.A. Ampong, L.H. Goldstein, J. Johnson, R. Lyall, J. Moxham, N.
Mustfa, A. Rio, C. Shaw, and E. Willey. 2003. The management of motor neurone disease. J Neurol
Neurosurg Psychiatry. 74 Suppl 4:iv32-iv47.
Lessner, G., O. Schmitt, S.J. Haas, S. Mikkat, M. Kreutzer, A. Wree, and M.O. Glocker. 2010. Differential
proteome of the striatum from hemiparkinsonian rats displays vivid structural remodeling processes.
J Proteome Res. 9:4671-87.
Lev, S., D. Ben Halevy, D. Peretti, and N. Dahan. 2008. The VAP protein family: from cellular functions to
motor neuron disease. Trends Cell Biol. 18:282-90.
Lever, T.E., A. Gorsek, K.T. Cox, K.F. O'Brien, N.F. Capra, M.S. Hough, and A.K. Murashov. 2009. An animal
model of oral dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 24:180-95.
Li, M., V.O. Ona, C. Guegan, M. Chen, V. Jackson-Lewis, L.J. Andrews, A.J. Olszewski, P.E. Stieg, J.P. Lee, S.
Przedborski, and R.M. Friedlander. 2000. Functional role of caspase-1 and caspase-3 in an ALS
transgenic mouse model. Science. 288:335-9.
Li, X.J., Z.W. Du, E.D. Zarnowska, M. Pankratz, L.O. Hansen, R.A. Pearce, and S.C. Zhang. 2005. Specification of
motoneurons from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23:215-21.
Li, Y., M. Ge, L. Ciani, G. Kuriakose, E.J. Westover, M. Dura, D.F. Covey, J.H. Freed, F.R. Maxfield, J. Lytton, and
I. Tabas. 2004. Enrichment of endoplasmic reticulum with cholesterol inhibits sarcoplasmicendoplasmic reticulum calcium ATPase-2b activity in parallel with increased order of membrane
lipids: implications for depletion of endoplasmic reticulum calcium stores and apoptosis in
cholesterol-loaded macrophages. J Biol Chem. 279:37030-9.
Lino, M.M., C. Schneider, and P. Caroni. 2002. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons
does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22:4825-32.
Lips, M.B., and B.U. Keller. 1998. Endogenous calcium buffering in motoneurones of the nucleus hypoglossus
from mouse. J Physiol. 511 ( Pt 1):105-17.
Lips, M.B., and B.U. Keller. 1999. Activity-related calcium dynamics in motoneurons of the nucleus
hypoglossus from mouse. J Neurophysiol. 82:2936-46.
Liu, D., J. Wen, J. Liu, and L. Li. 1999. The roles of free radicals in amyotrophic lateral sclerosis: reactive
oxygen species and elevated oxidation of protein, DNA, and membrane phospholipids. FASEB J.
13:2318-28.
Liu, J., C. Lillo, P.A. Jonsson, C. Vande Velde, C.M. Ward, T.M. Miller, J.R. Subramaniam, J.D. Rothstein, S.
Marklund, P.M. Andersen, T. Brannstrom, O. Gredal, P.C. Wong, D.S. Williams, and D.W. Cleveland.
2004. Toxicity of familial ALS-linked SOD1 mutants from selective recruitment to spinal
mitochondria. Neuron. 43:5-17.
Liu, J., L.A. Shinobu, C.M. Ward, D. Young, and D.W. Cleveland. 2005. Elevation of the Hsp70 chaperone does
not effect toxicity in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 93:875-82.
Liu, P.C., Z.J. Yang, M.H. Qiu, L.M. Zhang, and F.Y. Sun. 2003. Induction of CRMP-4 in striatum of adult rat
after transient brain ischemia. Acta Pharmacol Sin. 24:1205-11.
Liu, W., X.W. Zhou, S. Liu, K. Hu, C. Wang, Q. He, and M. Li. 2009. Calpain-truncated CRMP-3 and -4
contribute to potassium deprivation-induced apoptosis of cerebellar granule neurons. Proteomics.
9:3712-28.
Lobsiger, C.S., S. Boillee, M. McAlonis-Downes, A.M. Khan, M.L. Feltri, K. Yamanaka, and D.W. Cleveland.
2009. Schwann cells expressing dismutase active mutant SOD1 unexpectedly slow disease
progression in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:4465-70.
Lobsiger, C.S., and D.W. Cleveland. 2007. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous
neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10:1355-60.
260
Références
Lobsiger, C.S., M.L. Garcia, C.M. Ward, and D.W. Cleveland. 2005. Altered axonal architecture by removal of
the heavily phosphorylated neurofilament tail domains strongly slows superoxide dismutase 1
mutant-mediated ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:10351-6.
Locatelli, F., S. Corti, D. Papadimitriou, F. Fortunato, R. Del Bo, C. Donadoni, M. Nizzardo, M. Nardini, S.
Salani, S. Ghezzi, S. Strazzer, N. Bresolin, and G.P. Comi. 2007. Fas small interfering RNA reduces
motoneuron death in amyotrophic lateral sclerosis mice. Ann Neurol. 62:81-92.
Ma, Y., and L.M. Hendershot. 2003. Delineation of a negative feedback regulatory loop that controls protein
translation during endoplasmic reticulum stress. J Biol Chem. 278:34864-73.
MacDonald, S.C., I.G. Fleetwood, S. Hochman, J.G. Dodd, G.K. Cheng, L.M. Jordan, and R.M. Brownstone.
2003. Functional motor neurons differentiating from mouse multipotent spinal cord precursor cells
in culture and after transplantation into transected sciatic nerve. J Neurosurg. 98:1094-103.
Magill, C.K., A. Tong, D. Kawamura, A. Hayashi, D.A. Hunter, A. Parsadanian, S.E. Mackinnon, and T.M.
Myckatyn. 2007. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal
microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207:64-74.
Magrane, J., and G. Manfredi. 2009. Mitochondrial function, morphology, and axonal transport in
amyotrophic lateral sclerosis. Antioxid Redox Signal. 11:1615-26.
Marciniak, S.J., C.Y. Yun, S. Oyadomari, I. Novoa, Y. Zhang, R. Jungreis, K. Nagata, H.P. Harding, and D. Ron.
2004. CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic
reticulum. Genes Dev. 18:3066-77.
Marden, J.J., M.M. Harraz, A.J. Williams, K. Nelson, M. Luo, H. Paulson, and J.F. Engelhardt. 2007. Redox
modifier genes in amyotrophic lateral sclerosis in mice. J Clin Invest. 117:2913-9.
Martin, L.J. 1999. Neuronal death in amyotrophic lateral sclerosis is apoptosis: possible contribution of a
programmed cell death mechanism. J Neuropathol Exp Neurol. 58:459-71.
Martin, L.J. 2010. The mitochondrial permeability transition pore: a molecular target for amyotrophic lateral
sclerosis therapy. Biochim Biophys Acta. 1802:186-97.
Martin, L.J., Z. Liu, K. Chen, A.C. Price, Y. Pan, J.A. Swaby, and W.C. Golden. 2007. Motor neuron
degeneration in amyotrophic lateral sclerosis mutant superoxide dismutase-1 transgenic mice:
mechanisms of mitochondriopathy and cell death. J Comp Neurol. 500:20-46.
Maruyama, H., H. Morino, H. Ito, Y. Izumi, H. Kato, Y. Watanabe, Y. Kinoshita, M. Kamada, H. Nodera, H.
Suzuki, O. Komure, S. Matsuura, K. Kobatake, N. Morimoto, K. Abe, N. Suzuki, M. Aoki, A. Kawata, T.
Hirai, T. Kato, K. Ogasawara, A. Hirano, T. Takumi, H. Kusaka, K. Hagiwara, R. Kaji, and H. Kawakami.
2010. Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 465:223-6.
Matthews, N.S., and A. de Lahunta. 1985. Degenerative myelopathy in an adult miniature poodle. J Am Vet
Med Assoc. 186:1213-5.
Mattiazzi, M., M. D'Aurelio, C.D. Gajewski, K. Martushova, M. Kiaei, M.F. Beal, and G. Manfredi. 2002.
Mutated human SOD1 causes dysfunction of oxidative phosphorylation in mitochondria of
transgenic mice. J Biol Chem. 277:29626-33.
Mattson, M.P., R.G. Cutler, and S. Camandola. 2007. Energy intake and amyotrophic lateral sclerosis.
Neuromolecular Med. 9:17-20.
Matusica, D., M.P. Fenech, M.L. Rogers, and R.A. Rush. 2008. Characterization and use of the NSC-34 cell line
for study of neurotrophin receptor trafficking. J Neurosci Res. 86:553-65.
McCord, J.M., and I. Fridovich. 1969. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein
(hemocuprein). J Biol Chem. 244:6049-55.
Meininger, V. 2011. ALS, what new 144 years after Charcot? Arch Ital Biol. 149:29-37.
Mesaeli, N., K. Nakamura, E. Zvaritch, P. Dickie, E. Dziak, K.H. Krause, M. Opas, D.H. MacLennan, and M.
Michalak. 1999. Calreticulin is essential for cardiac development. J Cell Biol. 144:857-68.
Michalak, M., E.F. Corbett, N. Mesaeli, K. Nakamura, and M. Opas. 1999. Calreticulin: one protein, one gene,
many functions. Biochem J. 344 Pt 2:281-92.
Michalak, M., J. Groenendyk, E. Szabo, L.I. Gold, and M. Opas. 2009. Calreticulin, a multi-process calciumbuffering chaperone of the endoplasmic reticulum. Biochem J. 417:651-66.
Migheli, A., C. Atzori, R. Piva, M. Tortarolo, M. Girelli, D. Schiffer, and C. Bendotti. 1999. Lack of apoptosis in
mice with ALS. Nat Med. 5:966-7.
261
Références
Migheli, A., P. Cavalla, S. Marino, and D. Schiffer. 1994. A study of apoptosis in normal and pathologic
nervous tissue after in situ end-labeling of DNA strand breaks. J Neuropathol Exp Neurol. 53:606-16.
Migliore, L., and F. Coppede. 2009. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in
neurodegenerative diseases. Mutat Res. 667:82-97.
Millecamps, S., F. Salachas, C. Cazeneuve, P. Gordon, B. Bricka, A. Camuzat, L. Guillot-Noel, O. Russaouen, G.
Bruneteau, P.F. Pradat, N. Le Forestier, N. Vandenberghe, V. Danel-Brunaud, N. Guy, C. ThauvinRobinet, L. Lacomblez, P. Couratier, D. Hannequin, D. Seilhean, I. Le Ber, P. Corcia, W. Camu, A. Brice,
G. Rouleau, E. LeGuern, and V. Meininger. 2010. SOD1, ANG, VAPB, TARDBP, and FUS mutations in
familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med Genet. 47:554-60.
Miller, T.M., R.A. Smith, and D.W. Cleveland. 2006. Amyotrophic lateral sclerosis and gene therapy. Nat Clin
Pract Neurol. 2:462-3.
Minturn, J.E., D.H. Geschwind, H.J. Fryer, and S. Hockfield. 1995. Early postmitotic neurons transiently
express TOAD-64, a neural specific protein. J Comp Neurol. 355:369-79.
Molinari, M., K.K. Eriksson, V. Calanca, C. Galli, P. Cresswell, M. Michalak, and A. Helenius. 2004. Contrasting
functions of calreticulin and calnexin in glycoprotein folding and ER quality control. Mol Cell. 13:12535.
Morahan, J.M., B. Yu, R.J. Trent, and R. Pamphlett. 2007. A gene-environment study of the paraoxonase 1
gene and pesticides in amyotrophic lateral sclerosis. Neurotoxicology. 28:532-40.
Mori, A., S. Yamashita, K. Uchino, T. Suga, T. Ikeda, K. Takamatsu, M. Ishizaki, T. Koide, E. Kimura, S. Mita, Y.
Maeda, T. Hirano, and M. Uchino. 2011. Derlin-1 overexpression ameliorates mutant SOD1-induced
endoplasmic reticulum stress by reducing mutant SOD1 accumulation. Neurochem Int. 58:344-53.
Morimoto, R.I., and A.M. Cuervo. 2009. Protein homeostasis and aging: taking care of proteins from the
cradle to the grave. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64:167-70.
Moroianu, J., and J.F. Riordan. 1994. Nuclear translocation of angiogenic proteins in endothelial cells: an
essential step in angiogenesis. Biochemistry. 33:12535-9.
Morrison, B.M., J.W. Gordon, M.E. Ripps, and J.H. Morrison. 1996. Quantitative immunocytochemical
analysis of the spinal cord in G86R superoxide dismutase transgenic mice: neurochemical correlates
of selective vulnerability. J Comp Neurol. 373:619-31.
Mourelatos, Z., N.K. Gonatas, A. Stieber, M.E. Gurney, and M.C. Dal Canto. 1996. The Golgi apparatus of
spinal cord motor neurons in transgenic mice expressing mutant Cu,Zn superoxide dismutase
becomes fragmented in early, preclinical stages of the disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 93:5472-7.
Mu, X., J. He, D.W. Anderson, J.Q. Trojanowski, and J.E. Springer. 1996. Altered expression of bcl-2 and bax
mRNA in amyotrophic lateral sclerosis spinal cord motor neurons. Ann Neurol. 40:379-86.
Muller, F.L., W. Song, Y. Liu, A. Chaudhuri, S. Pieke-Dahl, R. Strong, T.T. Huang, C.J. Epstein, L.J. Roberts, 2nd,
M. Csete, J.A. Faulkner, and H. Van Remmen. 2006. Absence of CuZn superoxide dismutase leads to
elevated oxidative stress and acceleration of age-dependent skeletal muscle atrophy. Free Radic Biol
Med. 40:1993-2004.
Munch, C., and A. Bertolotti. 2011. Self-propagation and transmission of misfolded mutant SOD1: prion or
prion-like phenomenon? Cell Cycle. 10:1711.
Munch, C., J. O'Brien, and A. Bertolotti. 2011. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1
misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:3548-53.
Munch, C., A. Rosenbohm, A.D. Sperfeld, I. Uttner, S. Reske, B.J. Krause, R. Sedlmeier, T. Meyer, C.O.
Hanemann, G. Stumm, and A.C. Ludolph. 2005. Heterozygous R1101K mutation of the DCTN1 gene in
a family with ALS and FTD. Ann Neurol. 58:777-80.
Munch, C., R. Sedlmeier, T. Meyer, V. Homberg, A.D. Sperfeld, A. Kurt, J. Prudlo, G. Peraus, C.O. Hanemann,
G. Stumm, and A.C. Ludolph. 2004. Point mutations of the p150 subunit of dynactin (DCTN1) gene in
ALS. Neurology. 63:724-6.
Nagai, M., M. Aoki, I. Miyoshi, M. Kato, P. Pasinelli, N. Kasai, R.H. Brown, Jr., and Y. Itoyama. 2001. Rats
expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral
sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J Neurosci. 21:9246-54.
Nagai, M., D.B. Re, T. Nagata, A. Chalazonitis, T.M. Jessell, H. Wichterle, and S. Przedborski. 2007. Astrocytes
expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons. Nat
Neurosci. 10:615-22.
262
Références
Nagata, T., H. Ilieva, T. Murakami, M. Shiote, H. Narai, Y. Ohta, T. Hayashi, M. Shoji, and K. Abe. 2007.
Increased ER stress during motor neuron degeneration in a transgenic mouse model of amyotrophic
lateral sclerosis. Neurol Res. 29:767-71.
Nagley, P., G.C. Higgins, J.D. Atkin, and P.M. Beart. 2010. Multifaceted deaths orchestrated by mitochondria
in neurones. Biochim Biophys Acta. 1802:167-85.
Nakagawa, T., H. Zhu, N. Morishima, E. Li, J. Xu, B.A. Yankner, and J. Yuan. 2000. Caspase-12 mediates
endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature. 403:98-103.
Nakamura, K., M. Robertson, G. Liu, P. Dickie, J.Q. Guo, H.J. Duff, M. Opas, K. Kavanagh, and M. Michalak.
2001a. Complete heart block and sudden death in mice overexpressing calreticulin. J Clin Invest.
107:1245-53.
Nakamura, K., M. Robertson, G. Liu, P. Dickie, K. Nakamura, J.Q. Guo, H.J. Duff, M. Opas, K. Kavanagh, and M.
Michalak. 2001b. Complete heart block and sudden death in mice overexpressing calreticulin. J Clin
Invest. 107:1245-53.
Nakamura, K., A. Zuppini, S. Arnaudeau, J. Lynch, I. Ahsan, R. Krause, S. Papp, H. De Smedt, J.B. Parys, W.
Muller-Esterl, D.P. Lew, K.H. Krause, N. Demaurex, M. Opas, and M. Michalak. 2001c. Functional
specialization of calreticulin domains. J Cell Biol. 154:961-72.
Nassif, M., S. Matus, K. Castillo, and C. Hetz. 2010. Amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: a journey
through the secretory pathway. Antioxid Redox Signal. 13:1955-89.
Neumann, M., D.M. Sampathu, L.K. Kwong, A.C. Truax, M.C. Micsenyi, T.T. Chou, J. Bruce, T. Schuck, M.
Grossman, C.M. Clark, L.F. McCluskey, B.L. Miller, E. Masliah, I.R. Mackenzie, H. Feldman, W. Feiden,
H.A. Kretzschmar, J.Q. Trojanowski, and V.M. Lee. 2006. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal
lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314:130-3.
Ni, M., and A.S. Lee. 2007. ER chaperones in mammalian development and human diseases. FEBS Lett.
581:3641-51.
Nishimura, A.L., M. Mitne-Neto, H.C. Silva, A. Richieri-Costa, S. Middleton, D. Cascio, F. Kok, J.R. Oliveira, T.
Gillingwater, J. Webb, P. Skehel, and M. Zatz. 2004. A mutation in the vesicle-trafficking protein
VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet.
75:822-31.
Nishitoh, H., H. Kadowaki, A. Nagai, T. Maruyama, T. Yokota, H. Fukutomi, T. Noguchi, A. Matsuzawa, K.
Takeda, and H. Ichijo. 2008. ALS-linked mutant SOD1 induces ER stress- and ASK1-dependent motor
neuron death by targeting Derlin-1. Genes Dev. 22:1451-64.
Niwa, J., S. Ishigaki, N. Hishikawa, M. Yamamoto, M. Doyu, S. Murata, K. Tanaka, N. Taniguchi, and G. Sobue.
2002. Dorfin ubiquitylates mutant SOD1 and prevents mutant SOD1-mediated neurotoxicity. J Biol
Chem. 277:36793-8.
Oh, Y.K., K.S. Shin, J. Yuan, and S.J. Kang. 2008. Superoxide dismutase 1 mutants related to amyotrophic
lateral sclerosis induce endoplasmic stress in neuro2a cells. J Neurochem. 104:993-1005.
Okado-Matsumoto, A., and I. Fridovich. 2002. Amyotrophic lateral sclerosis: a proposed mechanism. Proc
Natl Acad Sci U S A. 99:9010-4.
Okamoto, K., Y. Mizuno, and Y. Fujita. 2008. Bunina bodies in amyotrophic lateral sclerosis. Neuropathology.
28:109-15.
Oosthuyse, B., L. Moons, E. Storkebaum, H. Beck, D. Nuyens, K. Brusselmans, J. Van Dorpe, P. Hellings, M.
Gorselink, S. Heymans, G. Theilmeier, M. Dewerchin, V. Laudenbach, P. Vermylen, H. Raat, T. Acker,
V. Vleminckx, L. Van Den Bosch, N. Cashman, H. Fujisawa, M.R. Drost, R. Sciot, F. Bruyninckx, D.J.
Hicklin, C. Ince, P. Gressens, F. Lupu, K.H. Plate, W. Robberecht, J.M. Herbert, D. Collen, and P.
Carmeliet. 2001. Deletion of the hypoxia-response element in the vascular endothelial growth factor
promoter causes motor neuron degeneration. Nat Genet. 28:131-8.
Orlacchio, A., C. Babalini, A. Borreca, C. Patrono, R. Massa, S. Basaran, R.P. Munhoz, E.A. Rogaeva, P.H. St
George-Hyslop, G. Bernardi, and T. Kawarai. 2010. SPATACSIN mutations cause autosomal recessive
juvenile amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 133:591-8.
Otomo, A., S. Hadano, T. Okada, H. Mizumura, R. Kunita, H. Nishijima, J. Showguchi-Miyata, Y. Yanagisawa, E.
Kohiki, E. Suga, M. Yasuda, H. Osuga, T. Nishimoto, S. Narumiya, and J.E. Ikeda. 2003. ALS2, a novel
guanine nucleotide exchange factor for the small GTPase Rab5, is implicated in endosomal dynamics.
Hum Mol Genet. 12:1671-87.
263
Références
Ozdinler, P.H., S. Benn, T.H. Yamamoto, M. Guzel, R.H. Brown, Jr., and J.D. Macklis. 2011. Corticospinal motor
neurons and related subcerebral projection neurons undergo early and specific neurodegeneration
in hSOD1G(3)A transgenic ALS mice. J Neurosci. 31:4166-77.
Palecek, J., M.B. Lips, and B.U. Keller. 1999. Calcium dynamics and buffering in motoneurones of the mouse
spinal cord. J Physiol. 520 Pt 2:485-502.
Panzeri, C., C. De Palma, A. Martinuzzi, A. Daga, G. De Polo, N. Bresolin, C.C. Miller, E.L. Tudor, E. Clementi,
and M.T. Bassi. 2006. The first ALS2 missense mutation associated with JPLS reveals new aspects of
alsin biological function. Brain. 129:1710-9.
Paradies, G., G. Petrosillo, V. Paradies, and F.M. Ruggiero. 2009. Role of cardiolipin peroxidation and Ca2+ in
mitochondrial dysfunction and disease. Cell Calcium. 45:643-50.
Pardo, A.C., V. Wong, L.M. Benson, M. Dykes, K. Tanaka, J.D. Rothstein, and N.J. Maragakis. 2006. Loss of the
astrocyte glutamate transporter GLT1 modifies disease in SOD1(G93A) mice. Exp Neurol. 201:120-30.
Park, K.M., and W.J. Bowers. 2010. Tumor necrosis factor-alpha mediated signaling in neuronal homeostasis
and dysfunction. Cell Signal. 22:977-83.
Pasinelli, P., M.E. Belford, N. Lennon, B.J. Bacskai, B.T. Hyman, D. Trotti, and R.H. Brown, Jr. 2004.
Amyotrophic lateral sclerosis-associated SOD1 mutant proteins bind and aggregate with Bcl-2 in
spinal cord mitochondria. Neuron. 43:19-30.
Pasinelli, P., D.R. Borchelt, M.K. Houseweart, D.W. Cleveland, and R.H. Brown, Jr. 1998. Caspase-1 is
activated in neural cells and tissue with amyotrophic lateral sclerosis-associated mutations in
copper-zinc superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95:15763-8.
Pasinelli, P., M.K. Houseweart, R.H. Brown, Jr., and D.W. Cleveland. 2000. Caspase-1 and -3 are sequentially
activated in motor neuron death in Cu,Zn superoxide dismutase-mediated familial amyotrophic
lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:13901-6.
Pasterkamp, R.J., and R.J. Giger. 2009. Semaphorin function in neural plasticity and disease. Curr Opin
Neurobiol. 19:263-74.
Patel, Y.J., M.D. Payne Smith, J. de Belleroche, and D.S. Latchman. 2005. Hsp27 and Hsp70 administered in
combination have a potent protective effect against FALS-associated SOD1-mutant-induced cell
death in mammalian neuronal cells. Brain Res Mol Brain Res. 134:256-74.
Paubel, A., J. Violette, M. Amy, J. Praline, V. Meininger, W. Camu, P. Corcia, C.R. Andres, and P. Vourc'h.
2008. Mutations of the ANG gene in French patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Arch Neurol. 65:1333-6.
Pehar, M., P. Cassina, M.R. Vargas, R. Castellanos, L. Viera, J.S. Beckman, A.G. Estevez, and L. Barbeito. 2004.
Astrocytic production of nerve growth factor in motor neuron apoptosis: implications for
amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 89:464-73.
Pehar, M., M.R. Vargas, K.M. Robinson, P. Cassina, P.J. Diaz-Amarilla, T.M. Hagen, R. Radi, L. Barbeito, and
J.S. Beckman. 2007. Mitochondrial superoxide production and nuclear factor erythroid 2-related
factor 2 activation in p75 neurotrophin receptor-induced motor neuron apoptosis. J Neurosci.
27:7777-85.
Perlson, E., G.B. Jeong, J.L. Ross, R. Dixit, K.E. Wallace, R.G. Kalb, and E.L. Holzbaur. 2009. A switch in
retrograde signaling from survival to stress in rapid-onset neurodegeneration. J Neurosci. 29:990317.
Perrin, F.E., G. Boisset, M. Docquier, O. Schaad, P. Descombes, and A.C. Kato. 2005. No widespread induction
of cell death genes occurs in pure motoneurons in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.
Hum Mol Genet. 14:3309-20.
Petri, S., N.Y. Calingasan, O.A. Alsaied, E. Wille, M. Kiaei, J.E. Friedman, O. Baranova, J.C. Chavez, and M.F.
Beal. 2007. The lipophilic metal chelators DP-109 and DP-460 are neuroprotective in a transgenic
mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 102:991-1000.
Petri, S., M. Kiaei, E. Wille, N.Y. Calingasan, and M. Flint Beal. 2006. Loss of Fas ligand-function improves
survival in G93A-transgenic ALS mice. J Neurol Sci. 251:44-9.
Petrosillo, G., F.M. Ruggiero, M. Pistolese, and G. Paradies. 2004. Ca2+-induced reactive oxygen species
production promotes cytochrome c release from rat liver mitochondria via mitochondrial
permeability transition (MPT)-dependent and MPT-independent mechanisms: role of cardiolipin. J
Biol Chem. 279:53103-8.
264
Références
Pettmann, B., and C.E. Henderson. 1998. Neuronal cell death. Neuron. 20:633-47.
Phul, R.K., P.J. Shaw, P.G. Ince, and M.E. Smith. 2000. Expression of nitric oxide synthase isoforms in spinal
cord in amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 1:259-67.
Powers, E.T., R.I. Morimoto, A. Dillin, J.W. Kelly, and W.E. Balch. 2009. Biological and chemical approaches to
diseases of proteostasis deficiency. Annu Rev Biochem. 78:959-91.
Pramatarova, A., J. Laganiere, J. Roussel, K. Brisebois, and G.A. Rouleau. 2001. Neuron-specific expression of
mutant superoxide dismutase 1 in transgenic mice does not lead to motor impairment. J Neurosci.
21:3369-74.
Provansal, M., S. Roche, M. Pastore, D. Casanova, M. Belondrade, S. Alais, P. Leblanc, O. Windl, and S.
Lehmann. 2010. Proteomic consequences of expression and pathological conversion of the prion
protein in inducible neuroblastoma N2a cells. Prion. 4:292-301.
Puls, I., C. Jonnakuty, B.H. LaMonte, E.L. Holzbaur, M. Tokito, E. Mann, M.K. Floeter, K. Bidus, D. Drayna, S.J.
Oh, R.H. Brown, Jr., C.L. Ludlow, and K.H. Fischbeck. 2003. Mutant dynactin in motor neuron disease.
Nat Genet. 33:455-6.
Pun, S., A.F. Santos, S. Saxena, L. Xu, and P. Caroni. 2006. Selective vulnerability and pruning of phasic
motoneuron axons in motoneuron disease alleviated by CNTF. Nat Neurosci. 9:408-19.
Quinn, C.C., E. Chen, T.G. Kinjo, G. Kelly, A.W. Bell, R.C. Elliott, P.S. McPherson, and S. Hockfield. 2003. TUC4b, a novel TUC family variant, regulates neurite outgrowth and associates with vesicles in the
growth cone. J Neurosci. 23:2815-23.
Quinn, C.C., G.E. Gray, and S. Hockfield. 1999. A family of proteins implicated in axon guidance and
outgrowth. J Neurobiol. 41:158-64.
Ranganathan, S., and R. Bowser. 2010. p53 and Cell Cycle Proteins Participate in Spinal Motor Neuron Cell
Death in ALS. Open Pathol J. 4:11-22.
Rangnekar, V.M. 1998. Apoptosis mediated by a novel leucine zipper protein Par-4. Apoptosis. 3:61-6.
Raoul, C., T. Abbas-Terki, J.C. Bensadoun, S. Guillot, G. Haase, J. Szulc, C.E. Henderson, and P. Aebischer.
2005. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and
progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11:423-8.
Raoul, C., E. Buhler, C. Sadeghi, A. Jacquier, P. Aebischer, B. Pettmann, C.E. Henderson, and G. Haase. 2006.
Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop
involving Fas, Daxx, and FasL. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:6007-12.
Raoul, C., A.G. Estevez, H. Nishimune, D.W. Cleveland, O. deLapeyriere, C.E. Henderson, G. Haase, and B.
Pettmann. 2002. Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas.
potentiation by ALS-linked SOD1 mutations. Neuron. 35:1067-83.
Raoul, C., C.E. Henderson, and B. Pettmann. 1999. Programmed cell death of embryonic motoneurons
triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol. 147:1049-62.
Ratnaparkhi, A., G.M. Lawless, F.E. Schweizer, P. Golshani, and G.R. Jackson. 2008. A Drosophila model of
ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS
One. 3:e2334.
Rauch, F., J. Prud'homme, A. Arabian, S. Dedhar, and R. St-Arnaud. 2000. Heart, brain, and body wall defects
in mice lacking calreticulin. Exp Cell Res. 256:105-11.
Realini, C., and M. Rechsteiner. 1995. A proteasome activator subunit binds calcium. J Biol Chem. 270:296647.
Reaume, A.G., J.L. Elliott, E.K. Hoffman, N.W. Kowall, R.J. Ferrante, D.F. Siwek, H.M. Wilcox, D.G. Flood, M.F.
Beal, R.H. Brown, Jr., R.W. Scott, and W.D. Snider. 1996. Motor neurons in Cu/Zn superoxide
dismutase-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury. Nat
Genet. 13:43-7.
Renoncourt, Y., P. Carroll, P. Filippi, V. Arce, and S. Alonso. 1998. Neurons derived in vitro from ES cells
express homeoproteins characteristic of motoneurons and interneurons. Mech Dev. 79:185-97.
Reyes, N.A., J.K. Fisher, K. Austgen, S. VandenBerg, E.J. Huang, and S.A. Oakes. 2010. Blocking the
mitochondrial apoptotic pathway preserves motor neuron viability and function in a mouse model of
amyotrophic lateral sclerosis. J Clin Invest. 120:3673-9.
265
Références
Ripps, M.E., G.W. Huntley, P.R. Hof, J.H. Morrison, and J.W. Gordon. 1995. Transgenic mice expressing an
altered murine superoxide dismutase gene provide an animal model of amyotrophic lateral sclerosis.
Proc Natl Acad Sci U S A. 92:689-93.
Rodriguez, D., D. Rojas-Rivera, and C. Hetz. 2011. Integrating stress signals at the endoplasmic reticulum: The
BCL-2 protein family rheostat. Biochim Biophys Acta. 1813:564-74.
Rosen, D.R. 1993. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic
lateral sclerosis. Nature. 364:362.
Rosslenbroich, V., L. Dai, S.L. Baader, A.A. Noegel, V. Gieselmann, and J. Kappler. 2005. Collapsin response
mediator protein-4 regulates F-actin bundling. Exp Cell Res. 310:434-44.
Roth, D.M., and W.E. Balch. 2011. Modeling general proteostasis: proteome balance in health and disease.
Curr Opin Cell Biol. 23:126-34.
Rothstein, J.D., L. Jin, M. Dykes-Hoberg, and R.W. Kuncl. 1993. Chronic inhibition of glutamate uptake
produces a model of slow neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:6591-5.
Roy, J., S. Minotti, L. Dong, D.A. Figlewicz, and H.D. Durham. 1998. Glutamate potentiates the toxicity of
mutant Cu/Zn-superoxide dismutase in motor neurons by postsynaptic calcium-dependent
mechanisms. J Neurosci. 18:9673-84.
Ruddy, D.M., M.J. Parton, A. Al-Chalabi, C.M. Lewis, C. Vance, B.N. Smith, P.N. Leigh, J.F. Powell, T. Siddique,
E.P. Meyjes, F. Baas, V. de Jong, and C.E. Shaw. 2003. Two families with familial amyotrophic lateral
sclerosis are linked to a novel locus on chromosome 16q. Am J Hum Genet. 73:390-6.
Ruiz, A., C. Matute, and E. Alberdi. 2009. Endoplasmic reticulum Ca(2+) release through ryanodine and IP(3)
receptors contributes to neuronal excitotoxicity. Cell Calcium. 46:273-81.
Rutherford, A.C., C. Traer, T. Wassmer, K. Pattni, M.V. Bujny, J.G. Carlton, H. Stenmark, and P.J. Cullen. 2006.
The mammalian phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase (PIKfyve) regulates endosome-to-TGN
retrograde transport. J Cell Sci. 119:3944-57.
Rutkevich, L.A., and D.B. Williams. Participation of lectin chaperones and thiol oxidoreductases in protein
folding within the endoplasmic reticulum. Curr Opin Cell Biol. 23:157-66.
Rutkevich, L.A., and D.B. Williams. 2011. Participation of lectin chaperones and thiol oxidoreductases in
protein folding within the endoplasmic reticulum. Curr Opin Cell Biol. 23:157-66.
Rutkowski, D.T., and R.J. Kaufman. 2004. A trip to the ER: coping with stress. Trends Cell Biol. 14:20-8.
Saeed, M., N. Siddique, W.Y. Hung, E. Usacheva, E. Liu, R.L. Sufit, S.L. Heller, J.L. Haines, M. Pericak-Vance,
and T. Siddique. 2006. Paraoxonase cluster polymorphisms are associated with sporadic ALS.
Neurology. 67:771-6.
Salinas, S., L.G. Bilsland, and G. Schiavo. 2008. Molecular landmarks along the axonal route: axonal transport
in health and disease. Curr Opin Cell Biol. 20:445-53.
Sapp, P.C., B.A. Hosler, D. McKenna-Yasek, W. Chin, A. Gann, H. Genise, J. Gorenstein, M. Huang, W. Sailer,
M. Scheffler, M. Valesky, J.L. Haines, M. Pericak-Vance, T. Siddique, H.R. Horvitz, and R.H. Brown, Jr.
2003. Identification of two novel loci for dominantly inherited familial amyotrophic lateral sclerosis.
Am J Hum Genet. 73:397-403.
Sasaki, S., T. Komori, and M. Iwata. 2000. Excitatory amino acid transporter 1 and 2 immunoreactivity in the
spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 100:138-44.
Sasaki, S., N. Shibata, and M. Iwata. 2001. Neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity in the spinal cord
in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 101:351-7.
Sasaki, S., T. Takeda, N. Shibata, and M. Kobayashi. 2010. Alterations in subcellular localization of TDP-43
immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett.
478:72-6.
Sasaki, S., H. Warita, T. Komori, T. Murakami, K. Abe, and M. Iwata. 2006. Parvalbumin and calbindin D-28k
immunoreactivity in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene. Brain Res. 1083:196-203.
Sathasivam, S., and P.J. Shaw. 2005. Apoptosis in amyotrophic lateral sclerosis--what is the evidence? Lancet
Neurol. 4:500-9.
Sau, D., S. De Biasi, L. Vitellaro-Zuccarello, P. Riso, S. Guarnieri, M. Porrini, S. Simeoni, V. Crippa, E. Onesto, I.
Palazzolo, P. Rusmini, E. Bolzoni, C. Bendotti, and A. Poletti. 2007. Mutation of SOD1 in ALS: a gain of
a loss of function. Hum Mol Genet. 16:1604-18.
266
Références
Saxena, S., E. Cabuy, and P. Caroni. 2009. A role for motoneuron subtype-selective ER stress in disease
manifestations of FALS mice. Nat Neurosci. 12:627-36.
Saxena, S., and P. Caroni. 2011. Selective neuronal vulnerability in neurodegenerative diseases: from stressor
thresholds to degeneration. Neuron. 71:35-48.
Schaefer, A.M., J.R. Sanes, and J.W. Lichtman. 2005. A compensatory subpopulation of motor neurons in a
mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490:209-19.
Schmidt, E.F., and S.M. Strittmatter. 2007. The CRMP family of proteins and their role in Sema3A signaling.
Adv Exp Med Biol. 600:1-11.
Schmidt, E.R., R.J. Pasterkamp, and L.H. van den Berg. 2009. Axon guidance proteins: novel therapeutic
targets for ALS? Prog Neurobiol. 88:286-301.
Schnaar, R.I., and A.E. Schaffner. 1981. Separation of cell types from embryonic chicken and rat spinal cord:
characterization of motoneuron-enriched fractions. J Neurosci. 1:204-17.
Schroder, M. 2008. Endoplasmic reticulum stress responses. Cell Mol Life Sci. 65:862-94.
Schuck, S., W.A. Prinz, K.S. Thorn, C. Voss, and P. Walter. 2009. Membrane expansion alleviates endoplasmic
reticulum stress independently of the unfolded protein response. J Cell Biol. 187:525-36.
Sebastia, J., D. Kieran, B. Breen, M.A. King, D.F. Netteland, D. Joyce, S.F. Fitzpatrick, C.T. Taylor, and J.H.
Prehn. 2009. Angiogenin protects motoneurons against hypoxic injury. Cell Death Differ. 16:1238-47.
Sengun, I.S., and S.H. Appel. 2003. Serum anti-Fas antibody levels in amyotrophic lateral sclerosis. J
Neuroimmunol. 142:137-40.
Sephton, C.F., S.K. Good, S. Atkin, C.M. Dewey, P. Mayer, 3rd, J. Herz, and G. Yu. 2010. TDP-43 is a
developmentally regulated protein essential for early embryonic development. J Biol Chem.
285:6826-34.
Shaw, C.E. 2010. Capturing VCP: another molecular piece in the ALS jigsaw puzzle. Neuron. 68:812-4.
Shea, T.B., Y.L. Zheng, D. Ortiz, and H.C. Pant. 2004. Cyclin-dependent kinase 5 increases perikaryal
neurofilament phosphorylation and inhibits neurofilament axonal transport in response to oxidative
stress. J Neurosci Res. 76:795-800.
Shefner, J.M., A.G. Reaume, D.G. Flood, R.W. Scott, N.W. Kowall, R.J. Ferrante, D.F. Siwek, M. Upton-Rice,
and R.H. Brown, Jr. 1999. Mice lacking cytosolic copper/zinc superoxide dismutase display a
distinctive motor axonopathy. Neurology. 53:1239-46.
Shibata, N. 2001. Transgenic mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis with superoxide
dismutase-1 mutation. Neuropathology. 21:82-92.
Shibata, N., A. Hirano, M. Kobayashi, M.C. Dal Canto, M.E. Gurney, T. Komori, T. Umahara, and K. Asayama.
1998. Presence of Cu/Zn superoxide dismutase (SOD) immunoreactivity in neuronal hyaline
inclusions in spinal cords from mice carrying a transgene for Gly93Ala mutant human Cu/Zn SOD.
Acta Neuropathol. 95:136-42.
Shibue, T., and T. Taniguchi. 2006. BH3-only proteins: integrated control point of apoptosis. Int J Cancer.
119:2036-43.
Shimazawa, M., H. Tanaka, Y. Ito, N. Morimoto, K. Tsuruma, M. Kadokura, S. Tamura, T. Inoue, M. Yamada,
H. Takahashi, H. Warita, M. Aoki, and H. Hara. 2010. An inducer of VGF protects cells against ER
stress-induced cell death and prolongs survival in the mutant SOD1 animal models of familial ALS.
PLoS One. 5:e15307.
Shin, S., S. Dalton, and S.L. Stice. 2005. Human motor neuron differentiation from human embryonic stem
cells. Stem Cells Dev. 14:266-9.
Siddique, T., and H.X. Deng. 1996. Genetics of amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet. 5 Spec
No:1465-70.
Siddique, T., D.A. Figlewicz, M.A. Pericak-Vance, J.L. Haines, G. Rouleau, A.J. Jeffers, P. Sapp, W.Y. Hung, J.
Bebout, D. McKenna-Yasek, and et al. 1991. Linkage of a gene causing familial amyotrophic lateral
sclerosis to chromosome 21 and evidence of genetic-locus heterogeneity. N Engl J Med. 324:1381-4.
Siman, R., T.K. McIntosh, K.M. Soltesz, Z. Chen, R.W. Neumar, and V.L. Roberts. 2004. Proteins released from
degenerating neurons are surrogate markers for acute brain damage. Neurobiol Dis. 16:311-20.
Slowik, A., B. Tomik, D. Partyka, W. Turaj, J. Pera, T. Dziedzic, P. Szermer, D.A. Figlewicz, and A. Szczudlik.
2006. Paraoxonase-1 Q192R polymorphism and risk of sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Clin
Genet. 69:358-9.
267
Références
Smith, B.D., and R.T. Raines. 2006. Genetic selection for critical residues in ribonucleases. J Mol Biol.
362:459-78.
Smith, M.J., and G.L. Koch. 1989. Multiple zones in the sequence of calreticulin (CRP55, calregulin, HACBP), a
major calcium binding ER/SR protein. Embo J. 8:3581-6.
Soussan, L., D. Burakov, M.P. Daniels, M. Toister-Achituv, A. Porat, Y. Yarden, and Z. Elazar. 1999. ERG30, a
VAP-33-related protein, functions in protein transport mediated by COPI vesicles. J Cell Biol.
146:301-11.
Spooren, W.P., and B. Hengerer. 2000. DNA laddering and caspase 3-like activity in the spinal cord of a
mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 46:63-9.
Sreedharan, J., I.P. Blair, V.B. Tripathi, X. Hu, C. Vance, B. Rogelj, S. Ackerley, J.C. Durnall, K.L. Williams, E.
Buratti, F. Baralle, J. de Belleroche, J.D. Mitchell, P.N. Leigh, A. Al-Chalabi, C.C. Miller, G. Nicholson,
and C.E. Shaw. 2008. TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Science. 319:1668-72.
Stallings, N.R., K. Puttaparthi, C.M. Luther, D.K. Burns, and J.L. Elliott. 2010. Progressive motor weakness in
transgenic mice expressing human TDP-43. Neurobiol Dis. 40:404-14.
Stommel, E.W., R.M. van Hoff, D.J. Graber, K.K. Bercury, G.M. Langford, and B.T. Harris. 2007. Tumor
necrosis factor-alpha induces changes in mitochondrial cellular distribution in motor neurons.
Neuroscience. 146:1013-9.
Stroissnigg, H., A. Trancikova, L. Descovich, J. Fuhrmann, W. Kutschera, J. Kostan, A. Meixner, F. Nothias, and
F. Propst. 2007. S-nitrosylation of microtubule-associated protein 1B mediates nitric-oxide-induced
axon retraction. Nat Cell Biol. 9:1035-45.
Strom, A.L., P. Shi, F. Zhang, J. Gal, R. Kilty, L.J. Hayward, and H. Zhu. 2008. Interaction of amyotrophic lateral
sclerosis (ALS)-related mutant copper-zinc superoxide dismutase with the dynein-dynactin complex
contributes to inclusion formation. J Biol Chem. 283:22795-805.
Su, K.Y., W.L. Chien, W.M. Fu, I.S. Yu, H.P. Huang, P.H. Huang, S.R. Lin, J.Y. Shih, Y.L. Lin, Y.P. Hsueh, P.C. Yang,
and S.W. Lin. 2007. Mice deficient in collapsin response mediator protein-1 exhibit impaired longterm potentiation and impaired spatial learning and memory. J Neurosci. 27:2513-24.
Subramanian, V., B. Crabtree, and K.R. Acharya. 2008. Human angiogenin is a neuroprotective factor and
amyotrophic lateral sclerosis associated angiogenin variants affect neurite extension/pathfinding
and survival of motor neurons. Hum Mol Genet. 17:130-49.
Subramanian, V., and Y. Feng. 2007. A new role for angiogenin in neurite growth and pathfinding:
implications for amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet. 16:1445-53.
Suraweera, A., O.J. Becherel, P. Chen, N. Rundle, R. Woods, J. Nakamura, M. Gatei, C. Criscuolo, A. Filla, L.
Chessa, M. Fusser, B. Epe, N. Gueven, and M.F. Lavin. 2007. Senataxin, defective in ataxia
oculomotor apraxia type 2, is involved in the defense against oxidative DNA damage. J Cell Biol.
177:969-79.
Sutedja, N.A., R.J. Sinke, P.W. Van Vught, M.W. Van der Linden, J.H. Wokke, C.M. Van Duijn, O.T. Njajou, Y.T.
Van der Schouw, J.H. Veldink, and L.H. Van den Berg. 2007. The association between H63D
mutations in HFE and amyotrophic lateral sclerosis in a Dutch population. Arch Neurol. 64:63-7.
Suzuki, H., K. Kanekura, T.P. Levine, K. Kohno, V.M. Olkkonen, S. Aiso, and M. Matsuoka. 2009. ALS-linked
P56S-VAPB, an aggregated loss-of-function mutant of VAPB, predisposes motor neurons to ER stressrelated death by inducing aggregation of co-expressed wild-type VAPB. J Neurochem. 108:973-985.
Suzuki, H., K. Lee, and M. Matsuoka. 2011. TDP-43-induced death is associated with altered regulation of
BIM and Bcl-xL and attenuated by caspase-mediated TDP-43 cleavage. J Biol Chem. 286:13171-83.
Tabas, I., and D. Ron. 2011. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum
stress. Nat Cell Biol. 13:184-90.
Taguchi, J., A. Fujii, Y. Fujino, Y. Tsujioka, M. Takahashi, Y. Tsuboi, I. Wada, and T. Yamada. 2000. Different
expression of calreticulin and immunoglobulin binding protein in Alzheimer's disease brain. Acta
Neuropathol. 100:153-60.
Takeuchi, H., Y. Kobayashi, T. Yoshihara, J. Niwa, M. Doyu, K. Ohtsuka, and G. Sobue. 2002. Hsp70 and Hsp40
improve neurite outgrowth and suppress intracytoplasmic aggregate formation in cultured neuronal
cells expressing mutant SOD1. Brain Res. 949:11-22.
268
Références
Tarr, J.M., P.J. Young, R. Morse, D.J. Shaw, R. Haigh, P.G. Petrov, S.J. Johnson, P.G. Winyard, and P. Eggleton.
2010. A mechanism of release of calreticulin from cells during apoptosis. J Mol Biol. 401:799-812.
Tateishi, T., R. Yamasaki, M. Tanaka, T. Matsushita, H. Kikuchi, N. Isobe, Y. Ohyagi, and J. Kira. 2010. CSF
chemokine alterations related to the clinical course of amyotrophic lateral sclerosis. J
Neuroimmunol. 222:76-81.
Tateno, M., H. Sadakata, M. Tanaka, S. Itohara, R.M. Shin, M. Miura, M. Masuda, T. Aosaki, M. Urushitani, H.
Misawa, and R. Takahashi. 2004. Calcium-permeable AMPA receptors promote misfolding of mutant
SOD1 protein and development of amyotrophic lateral sclerosis in a transgenic mouse model. Hum
Mol Genet. 13:2183-96.
Teuchert, M., D. Fischer, B. Schwalenstoecker, H.J. Habisch, T.M. Bockers, and A.C. Ludolph. 2006. A dynein
mutation attenuates motor neuron degeneration in SOD1(G93A) mice. Exp Neurol. 198:271-4.
Teuling, E., S. Ahmed, E. Haasdijk, J. Demmers, M.O. Steinmetz, A. Akhmanova, D. Jaarsma, and C.C.
Hoogenraad. 2007. Motor neuron disease-associated mutant vesicle-associated membrane proteinassociated protein (VAP) B recruits wild-type VAPs into endoplasmic reticulum-derived tubular
aggregates. J Neurosci. 27:9801-15.
Ticozzi, N., C. Tiloca, C. Morelli, C. Colombrita, B. Poletti, A. Doretti, L. Maderna, S. Messina, A. Ratti, and V.
Silani. 2011. Genetics of familial amyotrophic lateral sclerosis. Arch Ital Biol. 149:65-82.
Tomkins, J., P. Usher, J.Y. Slade, P.G. Ince, A. Curtis, K. Bushby, and P.J. Shaw. 1998. Novel insertion in the
KSP region of the neurofilament heavy gene in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Neuroreport.
9:3967-70.
Towne, C., C. Raoul, B.L. Schneider, and P. Aebischer. 2008. Systemic AAV6 delivery mediating RNA
interference against SOD1: neuromuscular transduction does not alter disease progression in fALS
mice. Mol Ther. 16:1018-25.
Tradewell, M.L., L.A. Cooper, S. Minotti, and H.D. Durham. 2011. Calcium dysregulation, mitochondrial
pathology and protein aggregation in a culture model of amyotrophic lateral sclerosis: mechanistic
relationship and differential sensitivity to intervention. Neurobiol Dis. 42:265-75.
Tsaytler, P., H.P. Harding, D. Ron, and A. Bertolotti. 2011. Selective inhibition of a regulatory subunit of
protein phosphatase 1 restores proteostasis. Science. 332:91-4.
Tsuda, H., S.M. Han, Y. Yang, C. Tong, Y.Q. Lin, K. Mohan, C. Haueter, A. Zoghbi, Y. Harati, J. Kwan, M.A.
Miller, and H.J. Bellen. 2008. The amyotrophic lateral sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted,
and acts as a ligand for Eph receptors. Cell. 133:963-77.
Tsujimoto, Y. 1998. Prevention of neuronal cell death by Bcl-2. Results Probl Cell Differ. 24:137-55.
Tudor, E.L., C.M. Galtrey, M.S. Perkinton, K.F. Lau, K.J. De Vos, J.C. Mitchell, S. Ackerley, T. Hortobagyi, E.
Vamos, P.N. Leigh, C. Klasen, D.M. McLoughlin, C.E. Shaw, and C.C. Miller. 2010. Amyotrophic lateral
sclerosis mutant vesicle-associated membrane protein-associated protein-B transgenic mice develop
TAR-DNA-binding protein-43 pathology. Neuroscience. 167:774-85.
Tummala, H., C. Jung, A. Tiwari, C.M. Higgins, L.J. Hayward, and Z. Xu. 2005. Inhibition of chaperone activity
is a shared property of several Cu,Zn-superoxide dismutase mutants that cause amyotrophic lateral
sclerosis. J Biol Chem. 280:17725-31.
Turner, B.J., I.K. Cheah, K.J. Macfarlane, E.C. Lopes, S. Petratos, S.J. Langford, and S.S. Cheema. 2003.
Antisense peptide nucleic acid-mediated knockdown of the p75 neurotrophin receptor delays motor
neuron disease in mutant SOD1 transgenic mice. J Neurochem. 87:752-63.
Turner, B.J., S.S. Murray, L.G. Piccenna, E.C. Lopes, T.J. Kilpatrick, and S.S. Cheema. 2004. Effect of p75
neurotrophin receptor antagonist on disease progression in transgenic amyotrophic lateral sclerosis
mice. J Neurosci Res. 78:193-9.
Turner, B.J., and K. Talbot. 2008. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85:94-134.
Uchida, Y., T. Ohshima, Y. Sasaki, H. Suzuki, S. Yanai, N. Yamashita, F. Nakamura, K. Takei, Y. Ihara, K.
Mikoshiba, P. Kolattukudy, J. Honnorat, and Y. Goshima. 2005. Semaphorin3A signalling is mediated
via sequential Cdk5 and GSK3beta phosphorylation of CRMP2: implication of common
phosphorylating mechanism underlying axon guidance and Alzheimer's disease. Genes Cells. 10:16579.
269
Références
Uehara, T., T. Nakamura, D. Yao, Z.Q. Shi, Z. Gu, Y. Ma, E. Masliah, Y. Nomura, and S.A. Lipton. 2006. Snitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration. Nature.
441:513-7.
Ugolini, G., C. Raoul, A. Ferri, C. Haenggeli, Y. Yamamoto, D. Salaun, C.E. Henderson, A.C. Kato, B. Pettmann,
and A.O. Hueber. 2003. Fas/tumor necrosis factor receptor death signaling is required for axotomyinduced death of motoneurons in vivo. J Neurosci. 23:8526-31.
Urushitani, M., S.A. Ezzi, and J.P. Julien. 2007. Therapeutic effects of immunization with mutant superoxide
dismutase in mice models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:2495-500.
Urushitani, M., S.A. Ezzi, A. Matsuo, I. Tooyama, and J.P. Julien. 2008. The endoplasmic reticulum-Golgi
pathway is a target for translocation and aggregation of mutant superoxide dismutase linked to ALS.
FASEB J. 22:2476-87.
Urushitani, M., J. Kurisu, M. Tateno, S. Hatakeyama, K. Nakayama, S. Kato, and R. Takahashi. 2004. CHIP
promotes proteasomal degradation of familial ALS-linked mutant SOD1 by ubiquitinating Hsp/Hsc70.
J Neurochem. 90:231-44.
Urushitani, M., A. Sik, T. Sakurai, N. Nukina, R. Takahashi, and J.P. Julien. 2006. Chromogranin-mediated
secretion of mutant superoxide dismutase proteins linked to amyotrophic lateral sclerosis. Nat
Neurosci. 9:108-18.
Uvarov, A.V., and N. Mesaeli. 2008. Enhanced ubiquitin-proteasome activity in calreticulin deficient cells: a
compensatory mechanism for cell survival. Biochim Biophys Acta. 1783:1237-47.
Van Damme, P., E. Bogaert, M. Dewil, N. Hersmus, D. Kiraly, W. Scheveneels, I. Bockx, D. Braeken, N.
Verpoorten, K. Verhoeven, V. Timmerman, P. Herijgers, G. Callewaert, P. Carmeliet, L. Van Den
Bosch, and W. Robberecht. 2007. Astrocytes regulate GluR2 expression in motor neurons and their
vulnerability to excitotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:14825-30.
Van Damme, P., M. Dewil, W. Robberecht, and L. Van Den Bosch. 2005. Excitotoxicity and amyotrophic
lateral sclerosis. Neurodegener Dis. 2:147-59.
Van Deerlin, V.M., J.B. Leverenz, L.M. Bekris, T.D. Bird, W. Yuan, L.B. Elman, D. Clay, E.M. Wood, A.S. ChenPlotkin, M. Martinez-Lage, E. Steinbart, L. McCluskey, M. Grossman, M. Neumann, I.L. Wu, W.S.
Yang, R. Kalb, D.R. Galasko, T.J. Montine, J.Q. Trojanowski, V.M. Lee, G.D. Schellenberg, and C.E. Yu.
2008. TARDBP mutations in amyotrophic lateral sclerosis with TDP-43 neuropathology: a genetic and
histopathological analysis. Lancet Neurol. 7:409-16.
Van Den Bosch, L., P. Van Damme, E. Bogaert, and W. Robberecht. 2006. The role of excitotoxicity in the
pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762:1068-82.
Van Den Bosch, L., W. Vandenberghe, H. Klaassen, E. Van Houtte, and W. Robberecht. 2000. Ca(2+)permeable AMPA receptors and selective vulnerability of motor neurons. J Neurol Sci. 180:29-34.
van der Zee, J., D. Pirici, T. Van Langenhove, S. Engelborghs, R. Vandenberghe, M. Hoffmann, G. Pusswald, M.
Van den Broeck, K. Peeters, M. Mattheijssens, J.J. Martin, P.P. De Deyn, M. Cruts, D. Haubenberger,
S. Kumar-Singh, A. Zimprich, and C. Van Broeckhoven. 2009. Clinical heterogeneity in 3 unrelated
families linked to VCP p.Arg159His. Neurology. 73:626-32.
van Vught, P.W., J.H. Veldink, and L.H. van den Berg. 2011. P413L CHGB is not associated with ALS
susceptibility or age at onset in a Dutch population. Proc Natl Acad Sci U S A. 107:E77; author reply
E78.
van Welsem, M.E., J.A. Hogenhuis, V. Meininger, W.P. Metsaars, J.J. Hauw, and D. Seilhean. 2002. The
relationship between Bunina bodies, skein-like inclusions and neuronal loss in amyotrophic lateral
sclerosis. Acta Neuropathol. 103:583-9.
van Zundert, B., M.H. Peuscher, M. Hynynen, A. Chen, R.L. Neve, R.H. Brown, Jr., M. Constantine-Paton, and
M.C. Bellingham. 2008. Neonatal neuronal circuitry shows hyperexcitable disturbance in a mouse
model of the adult-onset neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci.
28:10864-74.
Vance, C., B. Rogelj, T. Hortobagyi, K.J. De Vos, A.L. Nishimura, J. Sreedharan, X. Hu, B. Smith, D. Ruddy, P.
Wright, J. Ganesalingam, K.L. Williams, V. Tripathi, S. Al-Saraj, A. Al-Chalabi, P.N. Leigh, I.P. Blair, G.
Nicholson, J. de Belleroche, J.M. Gallo, C.C. Miller, and C.E. Shaw. 2009. Mutations in FUS, an RNA
processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6. Science. 323:1208-11.
270
Références
Vande Velde, C., K.K. McDonald, Y. Boukhedimi, M. McAlonis-Downes, C.S. Lobsiger, S. Bel Hadj, A. Zandona,
J.P. Julien, S.B. Shah, and D.W. Cleveland. 2011. Misfolded SOD1 Associated with Motor Neuron
Mitochondria Alters Mitochondrial Shape and Distribution Prior to Clinical Onset. PLoS One.
6:e22031.
Vande Velde, C., T.M. Miller, N.R. Cashman, and D.W. Cleveland. 2008. Selective association of misfolded
ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A.
105:4022-7.
Vangheluwe, P., L. Raeymaekers, L. Dode, and F. Wuytack. 2005. Modulating sarco(endo)plasmic reticulum
Ca2+ ATPase 2 (SERCA2) activity: cell biological implications. Cell Calcium. 38:291-302.
Vanselow, B.K., and B.U. Keller. 2000. Calcium dynamics and buffering in oculomotor neurones from mouse
that are particularly resistant during amyotrophic lateral sclerosis (ALS)-related motoneurone
disease. J Physiol. 525 Pt 2:433-45.
Vargas, M.R., D.A. Johnson, D.W. Sirkis, A. Messing, and J.A. Johnson. 2008. Nrf2 activation in astrocytes
protects against neurodegeneration in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis. J
Neurosci. 28:13574-81.
Vargas, M.R., and J.A. Johnson. 2010. Astrogliosis in amyotrophic lateral sclerosis: role and therapeutic
potential of astrocytes. Neurotherapeutics. 7:471-81.
Vargas, M.R., M. Pehar, P. Cassina, J.S. Beckman, and L. Barbeito. 2006. Increased glutathione biosynthesis
by Nrf2 activation in astrocytes prevents p75NTR-dependent motor neuron apoptosis. J Neurochem.
97:687-96.
Verkhratsky, A. 2002. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signalling. Cell Calcium. 32:393-404.
Vielhaber, S., K. Winkler, E. Kirches, D. Kunz, M. Buchner, H. Feistner, C.E. Elger, A.C. Ludolph, M.W. Riepe,
and W.S. Kunz. 1999. Visualization of defective mitochondrial function in skeletal muscle fibers of
patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 169:133-9.
Vijayvergiya, C., M.F. Beal, J. Buck, and G. Manfredi. 2005. Mutant superoxide dismutase 1 forms aggregates
in the brain mitochondrial matrix of amyotrophic lateral sclerosis mice. J Neurosci. 25:2463-70.
Vukosavic, S., M. Dubois-Dauphin, N. Romero, and S. Przedborski. 1999. Bax and Bcl-2 interaction in a
transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 73:2460-8.
Vukosavic, S., L. Stefanis, V. Jackson-Lewis, C. Guegan, N. Romero, C. Chen, M. Dubois-Dauphin, and S.
Przedborski. 2000. Delaying caspase activation by Bcl-2: A clue to disease retardation in a transgenic
mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci. 20:9119-25.
Wagner, O.I., J. Ascano, M. Tokito, J.F. Leterrier, P.A. Janmey, and E.L. Holzbaur. 2004. The interaction of
neurofilaments with the microtubule motor cytoplasmic dynein. Mol Biol Cell. 15:5092-100.
Walker, A.K., and J.D. Atkin. 2011. Mechanisms of neuroprotection by protein disulphide isomerase in
amyotrophic lateral sclerosis. Neurol Res Int. 2011:317340.
Walker, A.K., M.A. Farg, C.R. Bye, C.A. McLean, M.K. Horne, and J.D. Atkin. 2010. Protein disulphide
isomerase protects against protein aggregation and is S-nitrosylated in amyotrophic lateral sclerosis.
Brain. 133:105-16.
Wang, H.Q., and R. Takahashi. 2007. Expanding insights on the involvement of endoplasmic reticulum stress
in Parkinson's disease. Antioxid Redox Signal. 9:553-61.
Wang, J., G.W. Farr, D.H. Hall, F. Li, K. Furtak, L. Dreier, and A.L. Horwich. 2009a. An ALS-linked mutant SOD1
produces a locomotor defect associated with aggregation and synaptic dysfunction when expressed
in neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5:e1000350.
Wang, J., H. Slunt, V. Gonzales, D. Fromholt, M. Coonfield, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, and D.R. Borchelt.
2003. Copper-binding-site-null SOD1 causes ALS in transgenic mice: aggregates of non-native SOD1
delineate a common feature. Hum Mol Genet. 12:2753-64.
Wang, J., G. Xu, V. Gonzales, M. Coonfield, D. Fromholt, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, and D.R. Borchelt.
2002a. Fibrillar inclusions and motor neuron degeneration in transgenic mice expressing superoxide
dismutase 1 with a disrupted copper-binding site. Neurobiol Dis. 10:128-38.
Wang, J., G. Xu, H. Li, V. Gonzales, D. Fromholt, C. Karch, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, and D.R. Borchelt.
2005a. Somatodendritic accumulation of misfolded SOD1-L126Z in motor neurons mediates
degeneration: alphaB-crystallin modulates aggregation. Hum Mol Genet. 14:2335-47.
271
Références
Wang, J., G. Xu, H.H. Slunt, V. Gonzales, M. Coonfield, D. Fromholt, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, and D.R.
Borchelt. 2005b. Coincident thresholds of mutant protein for paralytic disease and protein
aggregation caused by restrictively expressed superoxide dismutase cDNA. Neurobiol Dis. 20:943-52.
Wang, L., D.H. Gutmann, and R.P. Roos. 2011a. Astrocyte loss of mutant SOD1 delays ALS disease onset and
progression in G85R transgenic mice. Hum Mol Genet. 20:286-93.
Wang, L., K. Sharma, G. Grisotti, and R.P. Roos. 2009b. The effect of mutant SOD1 dismutase activity on noncell autonomous degeneration in familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 35:234-40.
Wang, L.J., Y.Y. Lu, S. Muramatsu, K. Ikeguchi, K. Fujimoto, T. Okada, H. Mizukami, T. Matsushita, Y.
Hanazono, A. Kume, T. Nagatsu, K. Ozawa, and I. Nakano. 2002b. Neuroprotective effects of glial cell
line-derived neurotrophic factor mediated by an adeno-associated virus vector in a transgenic
animal model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci. 22:6920-8.
Wang, Q., J.L. Johnson, N.Y. Agar, and J.N. Agar. 2008. Protein aggregation and protein instability govern
familial amyotrophic lateral sclerosis patient survival. PLoS Biol. 6:e170.
Wang, R., B. Yang, and D. Zhang. 2011b. Activation of interferon signaling pathways in spinal cord astrocytes
from an ALS mouse model. Glia. 59:946-58.
Wang, X.S., S. Lee, Z. Simmons, P. Boyer, K. Scott, W. Liu, and J. Connor. 2004. Increased incidence of the Hfe
mutation in amyotrophic lateral sclerosis and related cellular consequences. J Neurol Sci. 227:27-33.
Wang, X.Z., B. Lawson, J.W. Brewer, H. Zinszner, A. Sanjay, L.J. Mi, R. Boorstein, G. Kreibich, L.M. Hendershot,
and D. Ron. 1996. Signals from the stressed endoplasmic reticulum induce C/EBP-homologous
protein (CHOP/GADD153). Mol Cell Biol. 16:4273-80.
Ware, C.F. 2005. Network communications: lymphotoxins, LIGHT, and TNF. Annu Rev Immunol. 23:787-819.
Watanabe, Y., K. Yasui, T. Nakano, K. Doi, Y. Fukada, M. Kitayama, M. Ishimoto, S. Kurihara, M. Kawashima,
H. Fukuda, Y. Adachi, T. Inoue, and K. Nakashima. 2005. Mouse motor neuron disease caused by
truncated SOD1 with or without C-terminal modification. Brain Res Mol Brain Res. 135:12-20.
Watson, M.R., R.D. Lagow, K. Xu, B. Zhang, and N.M. Bonini. 2008. A drosophila model for amyotrophic
lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. J Biol Chem. 283:24972-81.
Wegorzewska, I., S. Bell, N.J. Cairns, T.M. Miller, and R.H. Baloh. 2009. TDP-43 mutant transgenic mice
develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A.
106:18809-14.
Weiss, S., C. Dunne, J. Hewson, C. Wohl, M. Wheatley, A.C. Peterson, and B.A. Reynolds. 1996. Multipotent
CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci.
16:7599-609.
Weisskopf, M.G., M.L. McCullough, E.E. Calle, M.J. Thun, M. Cudkowicz, and A. Ascherio. 2004. Prospective
study of cigarette smoking and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Epidemiol. 160:26-33.
Wengenack, T.M., S.S. Holasek, C.M. Montano, D. Gregor, G.L. Curran, and J.F. Poduslo. 2004. Activation of
programmed cell death markers in ventral horn motor neurons during early presymptomatic stages
of amyotrophic lateral sclerosis in a transgenic mouse model. Brain Res. 1027:73-86.
Wichterle, H., I. Lieberam, J.A. Porter, and T.M. Jessell. 2002. Directed differentiation of embryonic stem cells
into motor neurons. Cell. 110:385-97.
Wiedemann, F.R., G. Manfredi, C. Mawrin, M.F. Beal, and E.A. Schon. 2002. Mitochondrial DNA and
respiratory chain function in spinal cords of ALS patients. J Neurochem. 80:616-25.
Wiese, S., T. Herrmann, C. Drepper, S. Jablonka, N. Funk, A. Klausmeyer, M.L. Rogers, R. Rush, and M.
Sendtner. 2010. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal
cord of individual mouse embryos. Nat Protoc. 5:31-8.
Wijesekera, L.C., and P.N. Leigh. 2009. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet J Rare Dis. 4:3.
Williamson, T.L., and D.W. Cleveland. 1999. Slowing of axonal transport is a very early event in the toxicity of
ALS-linked SOD1 mutants to motor neurons. Nat Neurosci. 2:50-6.
Wils, H., G. Kleinberger, J. Janssens, S. Pereson, G. Joris, I. Cuijt, V. Smits, C. Ceuterick-de Groote, C. Van
Broeckhoven, and S. Kumar-Singh. 2010. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and
neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proc Natl Acad Sci
U S A. 107:3858-63.
Woehlbier, U., and C. Hetz. 2011. Modulating stress responses by the UPRosome: a matter of life and death.
Trends Biochem Sci. 36:329-37.
272
Références
Wong, M., and L.J. Martin. 2010. Skeletal muscle-restricted expression of human SOD1 causes motor neuron
degeneration in transgenic mice. Hum Mol Genet. 19:2284-302.
Wong, P.C., C.A. Pardo, D.R. Borchelt, M.K. Lee, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, S.S. Sisodia, D.W. Cleveland, and
D.L. Price. 1995. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron
disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria. Neuron. 14:1105-16.
Wootz, H., I. Hansson, L. Korhonen, and D. Lindholm. 2006. XIAP decreases caspase-12 cleavage and calpain
activity in spinal cord of ALS transgenic mice. Exp Cell Res. 312:1890-8.
Wootz, H., I. Hansson, L. Korhonen, U. Napankangas, and D. Lindholm. 2004. Caspase-12 cleavage and
increased oxidative stress during motoneuron degeneration in transgenic mouse model of ALS.
Biochem Biophys Res Commun. 322:281-6.
Wozniak, A.L., X. Wang, E.S. Stieren, S.G. Scarbrough, C.J. Elferink, and D. Boehning. 2006. Requirement of
biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol.
175:709-14.
Wu, D., W. Yu, H. Kishikawa, R.D. Folkerth, A.J. Iafrate, Y. Shen, W. Xin, K. Sims, and G.F. Hu. 2007.
Angiogenin loss-of-function mutations in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 62:609-17.
Wu, L.S., W.C. Cheng, S.C. Hou, Y.T. Yan, S.T. Jiang, and C.K. Shen. 2010. TDP-43, a neuro-pathosignature
factor, is essential for early mouse embryogenesis. Genesis. 48:56-62.
Xiao, G., T.F. Chung, R.E. Fine, and R.J. Johnson. 1999. Calreticulin is transported to the surface of NG108-15
cells where it forms surface patches and is partially degraded in an acidic compartment. J Neurosci
Res. 58:652-62.
Xiao, Q., W. Zhao, D.R. Beers, A.A. Yen, W. Xie, J.S. Henkel, and S.H. Appel. 2007. Mutant SOD1(G93A)
microglia are more neurotoxic relative to wild-type microglia. J Neurochem. 102:2008-19.
Xu, Y.F., T.F. Gendron, Y.J. Zhang, W.L. Lin, S. D'Alton, H. Sheng, M.C. Casey, J. Tong, J. Knight, X. Yu, R.
Rademakers, K. Boylan, M. Hutton, E. McGowan, D.W. Dickson, J. Lewis, and L. Petrucelli. 2010.
Wild-type human TDP-43 expression causes TDP-43 phosphorylation, mitochondrial aggregation,
motor deficits, and early mortality in transgenic mice. J Neurosci. 30:10851-9.
Xu, Z., L.C. Cork, J.W. Griffin, and D.W. Cleveland. 1993. Increased expression of neurofilament subunit NF-L
produces morphological alterations that resemble the pathology of human motor neuron disease.
Cell. 73:23-33.
Yamanaka, K., S. Boillee, E.A. Roberts, M.L. Garcia, M. McAlonis-Downes, O.R. Mikse, D.W. Cleveland, and
L.S. Goldstein. 2008a. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes
accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:7594-9.
Yamanaka, K., S.J. Chun, S. Boillee, N. Fujimori-Tonou, H. Yamashita, D.H. Gutmann, R. Takahashi, H. Misawa,
and D.W. Cleveland. 2008b. Astrocytes as determinants of disease progression in inherited
amyotrophic lateral sclerosis. Nat Neurosci. 11:251-3.
Yan, J., H.X. Deng, N. Siddique, F. Fecto, W. Chen, Y. Yang, E. Liu, S. Donkervoort, J.G. Zheng, Y. Shi, K.B.
Ahmeti, B. Brooks, W.K. Engel, and T. Siddique. 2010. Frameshift and novel mutations in FUS in
familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75:807-14.
Yan, Q., W.D. Snider, J.J. Pinzone, and E.M. Johnson, Jr. 1988. Retrograde transport of nerve growth factor
(NGF) in motoneurons of developing rats: assessment of potential neurotrophic effects. Neuron.
1:335-43.
Yang, S., T. Liu, S. Li, X. Zhang, Q. Ding, H. Que, X. Yan, K. Wei, and S. Liu. 2008. Comparative proteomic
analysis of brains of naturally aging mice. Neuroscience. 154:1107-20.
Yang, Y., A. Hentati, H.X. Deng, O. Dabbagh, T. Sasaki, M. Hirano, W.Y. Hung, K. Ouahchi, J. Yan, A.C. Azim, N.
Cole, G. Gascon, A. Yagmour, M. Ben-Hamida, M. Pericak-Vance, F. Hentati, and T. Siddique. 2001.
The gene encoding alsin, a protein with three guanine-nucleotide exchange factor domains, is
mutated in a form of recessive amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet. 29:160-5.
Yang, Y.S., N.Y. Harel, and S.M. Strittmatter. 2009. Reticulon-4A (Nogo-A) redistributes protein disulfide
isomerase to protect mice from SOD1-dependent amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci.
29:13850-9.
Ye, J., R.B. Rawson, R. Komuro, X. Chen, U.P. Dave, R. Prywes, M.S. Brown, and J.L. Goldstein. 2000. ER stress
induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell.
6:1355-64.
273
Références
Yokoseki, A., A. Shiga, C.F. Tan, A. Tagawa, H. Kaneko, A. Koyama, H. Eguchi, A. Tsujino, T. Ikeuchi, A. Kakita,
K. Okamoto, M. Nishizawa, H. Takahashi, and O. Onodera. 2008. TDP-43 mutation in familial
amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 63:538-42.
Yoneda, T., K. Imaizumi, K. Oono, D. Yui, F. Gomi, T. Katayama, and M. Tohyama. 2001. Activation of caspase12, an endoplastic reticulum (ER) resident caspase, through tumor necrosis factor receptorassociated factor 2-dependent mechanism in response to the ER stress. J Biol Chem. 276:13935-40.
Yoshida, H., A. Watanabe, and Y. Ihara. 1998. Collapsin response mediator protein-2 is associated with
neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease. J Biol Chem. 273:9761-8.
Yoshihara, T., S. Ishigaki, M. Yamamoto, Y. Liang, J. Niwa, H. Takeuchi, M. Doyu, and G. Sobue. 2002.
Differential expression of inflammation- and apoptosis-related genes in spinal cords of a mutant
SOD1 transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem. 80:158-67.
Yoshiyama, Y., T. Yamada, K. Asanuma, and T. Asahi. 1994. Apoptosis related antigen, Le(Y) and nick-end
labeling are positive in spinal motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol.
88:207-11.
Zhang, B., P. Tu, F. Abtahian, J.Q. Trojanowski, and V.M. Lee. 1997. Neurofilaments and orthograde transport
are reduced in ventral root axons of transgenic mice that express human SOD1 with a G93A
mutation. J Cell Biol. 139:1307-15.
Zhang, X., S. Chen, L. Li, Q. Wang, and W. Le. 2008. Folic acid protects motor neurons against the increased
homocysteine, inflammation and apoptosis in SOD1 G93A transgenic mice. Neuropharmacology.
54:1112-9.
Zhang, Z.Y., X.H. Liu, X.S. Guo, and F.Y. Liu. 2007. [Calreticulin is involved in ischemic postconditioninginduced attenuation of ischemia/reperfusion injury in rat skeletal muscle.]. Sheng Li Xue Bao.
59:643-50.
Zhong, Z., R. Deane, Z. Ali, M. Parisi, Y. Shapovalov, M.K. O'Banion, K. Stojanovic, A. Sagare, S. Boillee, D.W.
Cleveland, and B.V. Zlokovic. 2008. ALS-causing SOD1 mutants generate vascular changes prior to
motor neuron degeneration. Nat Neurosci. 11:420-2.
Zhou, H., C. Huang, H. Chen, D. Wang, C.P. Landel, P.Y. Xia, R. Bowser, Y.J. Liu, and X.G. Xia. 2010. Transgenic
rat model of neurodegeneration caused by mutation in the TDP gene. PLoS Genet. 6:e1000887.
Zhu, Y.B., and Z.H. Sheng. 2011. Increased Axonal Mitochondrial Mobility Does Not Slow Amyotrophic Lateral
Sclerosis (ALS)-like Disease in Mutant SOD1 Mice. J Biol Chem. 286:23432-40.
Zou, J.Y., and F.T. Crews. 2005. TNF alpha potentiates glutamate neurotoxicity by inhibiting glutamate uptake
in organotypic brain slice cultures: neuroprotection by NF kappa B inhibition. Brain Res. 1034:11-24.
274