fongiscreen® 4h 56504

Transcription

FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESTS
RAPID IDENTIFICATION OF THE PRINCIPAL YEASTS
OF MEDICAL IMPORTANCE
IVD
1- CLINICAL VALUE
In view of the incresing incidence of fungal infections over recent years,
essentially due to the frequent use of topical antibacterial agents, broad
spectrum antibiotics and invasive techniques (catheters, parenteral
nutrition), microbiology laboratories are increasingly frequently asked to
look for yeasts in pathological specimens.
A rapid and precise diagnosis is sometimes necessary in order to commence
appropriate treatment, especially in immunodepressed subjects.
Fongiscreen® 4H, a system based on the study of the enzymatic profile,
satisfies this demand as it is able to identify, within 4 hours: Candida
albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, yeasts which represent
about 90% of the isolates and Cryptococcus neoformans. It also guides
the diagnosis of other yeasts whose identification is completed by
studying sugar utilisation with the AUXACOLOR® 2 kit (code 56513).
2- PRINCIPLE OF THE TEST
The test is based on the use of dehydrated substrates by prerformed
fungal enzymes, resulting in a colour change either spontaneously or after
addition of a revelator reagent.
NATURE OF THE TESTS USED
• TTZ medium
This medium contains Triphenyltetrazolium (TTZ). The reduction of TTZ
results in the formation of a more or less intense pink colour, depending
on the species.
• PAP medium
This medium contains an enzymatic substrate allowing detection of
proline aminopeptidase activity.
• Urea + Trehalose medium (Ur./tre)
This medium allows the detection of urease activity, reflected by
alkalinisation of the medium with a colour change from green to blue of
the pH indicator (Bromothymol Blue). The metabolism of trehalose results
in acidification with colour change of the indicator from green to yellow.
• BGL medium
This medium contains an enzymatic substrate : p. Nitrophenyl-N-Acetyl-BD-Galactosaminide, allowing demonstration of galactosaminidase. This
2
test is more sensitive than the germtube test for the identification of
C. albicans (variable sensitivity according to different authors).
• AGL medium
It allows the detection of a-glucosidase activity.
• HAP medium
It allows the detection of L-Histidine aminopeptidase activity.
The BGL and AGL tests are performed in an acidic medium. Reading of
the result requires revelation using an alkaline reagent (BGL/AGL
reagent).
The HAP test is read after revelation with the HAP reagent.
The test is read after incubation for 4 hours at 37°C without CO2.
3- COMPOSITION OF THE KIT
FONGISCREEN® 4H includes:
• Microplate : 10 individually packaged 6-well microplates (diagram of
the microplate is indicated on the label).
• Suspension medium : 10 ready for use suspension media (1 ml)
• 1 vial of AGL/BGL reagent (3 ml)
• 1 vial of HAP reagent (2ml)
• 10 micropipettes
• 10 adhesive films
Each microplate is individually packaged under seal-foiled aluminum bag
with an adhesive film and a dessicant.
DIAGRAM OF THE MICROPLATE
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
3
Precautions of use / Health and safety instructions:
This kit contains dangerous reagents.
• 3 ml vial of AGL/BGL reagent containing 4% of NaOH 1N.
R 34 : Causes burns.
S 26-37/39-45 : In case of contact with eyes, rinse
immediately with plenty of water and seek medical advice.
Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of
C - Corrosive
accident or if you feel unwell, seek medical advice
immediately (show the label where possible).
• 2 ml vial of HAP reagent containing 66,5% of 95° ethanol .
R 11 : Highly flammable.
S 7-16 : Keep container tightly closed. Keep away from sources of
ignition - No smoking.
4- STORAGE
Reagents, stored at +2 - 8°C, are stable until the expiry date indicated on
the label (even once open).
...
5- MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
....
....
• Opacity control 6 Mac Farland: code 56499
...
• Incubator at 37°C
6- PROCEDURE
A)INOCULATION OF THE MICROPLATE
• Important : the opacity of the suspension must be
Suspension medium
100 µl or 3 drops
• Using a pure and fresh culture on Sabouraud,
Sabouraud Chloramphenicol, and/or Gentamicin
medium with a sufficient quantity of yeasts to
obtain an opacity greater than that of the opacity
control (code 56499) : in practice, 4 to 5 loops if
possible.
at least equal to that of the opacity control
• which defines the minimum level of turbidity.
• Homogenise the suspension using the micropipette
(or vortex if necessary), by aspirating and
expelling the contents of the vial several times.
4
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Collect the inoculum with the micropipette and distribute 3 drops
(100 µl) into each of the wells of the microplate.
• Cover the microplate with adhesive and incubate for 4 hours at 37°C.
B) READING OF THE RESULTS
• Remove the adhesive.
• Read the TTZ, PAP, Urea/trehalose results.
• Add 2 drops of BGL/AGL reagent into the BGL and AGL wells.
- read the BGL test immediately
- for the AGL test, the colour develops over 15 to 30 seconds.
• Add 2 drops of HAP reagent to the HAP well. The colour develops over
15 to 30 seconds.
TABLE OF RESULTS
TESTS
NEGATIVE
TTZ
COLOURLESS
POSITIVE
PROCEDURE
PALE PINK or
DIRECT READING (without addition of reagents)
DARK PINK
depending on the species
PAP
COLOURLESS
YELLOW
UR./TRE
GREEN
BLUE (alkalinisation)
or YELLOW
(acidification)
depending on the species
BGL
COLOURLESS
YELLOW
Add 2 drops of BGL/AGL reagent.
The colour appears immediately
(i.e. read immediately)
AGL
COLOURLESS
YELLOW
Add 2 drops of BGL/AGL reagent.
The colour develops over 15 to 30 seconds.
HAP
COLOURLESS
YELLOW
Add 2 drops of HAP reagent.
The colour develops over 15 to 30 seconds.
* The colour change to blue (alkalinisation of the medium) is associated
with metabolism of urea (Urea(+), Trehalose(+) or (-) strains); if a strain is
both Urea(+) and Trehalose(+), alkalinisation is predominant (change to
blue). The colour change to yellow (acidification of the medium) is
associated with the metabolism of Trehalose (Trehalose(+), Urea(-) strains.
5
7- INTERPRETATION OF THE RESULTS
• Compare the profile obtained with the specific profiles (cf. Table A);
the discriminant features are indicated in bold letters.
• If the profile is different, consider the PAP and urea tests and refer to
the corresponding paragraphs.
a) Legends
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
positive test
negative test
variable test
positive test in at least 90% of cases
negative test in at least 90% of cases
b) Specific profiles
TABLE A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Green or Yellow
+
+
+/-
Candida albicans
+
-
Yellow (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
+/-
-
Yellow
-
-
+
Candida glabrata
+/-
-
Blue
-
+(-)
-
Cryptococcus neoformans
(1) Only a frankly positive test (yellow) immediately identifies Candida
tropicalis.
In the case of a doubtful result (greenish colour) or negative result, the
identity of the strain must be confirmed (differential diagnosis with certain
strains of AGL + Saccharomyces cerevisiae).
(2) A pale yellow discolouration may sometimes be observed.
6
c) Other profiles
1-
PAP+
and
Urea-
yellow
species
green or yellow
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Green or Yellow
-
+/-
+/-
Candida parapsilosis
Candida lusitaniae
Candida guilliermondii
Candida famata
+/-
+
Green or Yellow
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2-
PAP-
and
Species
Urea-
colourless
species
green
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Additional
observations
+/-
-
Green
-
-
+(-)
/
+/-
-
Green
-
-
+(-)
Dry appearance
of colonies
+/-
-
Green
-
-
+(-)
Arthrospores
+/-
-
Green
-
+/-
+(-)
/
Species
Candida pseudotropicalis
Candida inconspicua
Candida rugosa
Candida krusei
Geotrichum species
Saccharomyces
cerevisae
7
3-
Urea+
and
HAP+
blue
TTZ
PAP
UR./TRE
yellow
BGL
AGL
HAP
Additional
observations
capsula
-
+/- +/-
Blue
species
+/-
+/-
+
{
+
-
-
pigment
-ation
-
+
-
Species
arthros
-pores
-
Crypto
-coccus
species
-
Rhodo
-torula
species
+
Tricho
-sporon
cutaneum
A positive test generally corresponds to a yellow colour on the BGL and
AGL tests; an orange or pink colour may be observed with Trichosporon
cutaneum, and is specific to this species.
In addition, colonies of T. cutaneum have a filamentous appearance.
8- PERFORMANCES
According to studies from Pasteur Institut in Paris and Broussais hospital in
Paris, FONGISCREEN ® 4H allows identification in four hours of
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. neoformans and orientation
of the diagnosis for other yeasts.
A retrospective clinical study has been established on a panel of 146
strains, representing 23 species of yeasts. FONGISCREEN® 4H permits to
detect 100% of C. albicans strains (18 tested strains), C. glabrata (24
strains), and C. neoformans (11 strains) and 94% of C. tropicalis strains
(18 tested strains). For these 4 strains, specificity of the test was 100%.
Other yeast species can be classified in 3 groups, according to a
distinctive, but not specific, profil of the species (for 99% of the strains).
8
9- LIMITS OF THE PROCEDURE
• BGL test sometimes takes a very pale yellow color difficult to interpret,
in particular for C. tropicalis strain.
• Some rare strains of C. tropicalis Trehalose (-) can be wrongfully
identified as S. cerevisiae.
10- QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER
All manufactured reagents are prepared according to our Quality System,
starting from reception of raw material to the final commercialization of
the product. Each lot is submitted to quality control assessments and is
only released to the market, after conforming to pre-defined acceptance
criteria. The records relating to production and control of each single lot
are kept within Bio-Rad.
11- REFERENCES
See French version.
9
10
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESTS
IDENTIFICATION RAPIDE DES PRINCIPALES LEVURES
D’INTÉRÊT MÉDICAL
IVD
1- INTÉRÊT CLINIQUE
Etant donné la recrudescence des infections fongiques ces dernières années,
dues notamment à l'utilisation fréquente de topiques antibactériens,
d'antibiotiques à large spectre et de techniques invasives (cathéters, nutrition
parentérale), la recherche des levures dans les produits pathologiques est
de plus en plus demandée au laboratoire.
Un diagnostic rapide et précis est parfois nécessaire en vue d'instaurer un
traitement adapté, surtout chez les sujets immunodéprimés.
Fongiscreen® 4H, système fondé sur l'étude d'un profil enzymatique, répond à
cette demande puisqu'il permet d'identifier en 4 heures : Candida albicans,
Candida glabrata, Candida tropicalis, levures qui représentent environ
90 % des isolements, et Cryptococcus neoformans. Il permet aussi une
orientation pour le diagnostic d'autres levures dont l'identification sera
alors complétée par l'étude de l'assimilation des sucres avec la galerie
AUXACOLOR® 2 (code 56513).
2- PRINCIPE
Il repose sur l'utilisation de substrats deshydratés par les enzymes fongiques
préformées, ce qui se traduit par un changement de couleur, soit
spontanément, soit après addition d'un réactif révélateur.
NATURE DES TESTS UTILISÉS
• Milieu TTZ
Ce milieu contient du Triphényltétrazolium (TTZ).
La réduction du TTZ se traduit par l'apparition d'une coloration rose plus
ou moins intense en fonction de l'espèce.
• Milieu PAP
Il contient un substrat enzymatique permettant de détecter l'activité proline
aminopeptidase.
• Milieu Urée + Tréhalose (Ur. / tre)
Ce milieu permet de détecter l'activité uréasique qui se traduit par une
alcalinisation du milieu avec virage du vert au bleu de l'indicateur de pH
(Bleu de Bromothymol). Le métabolisme du tréhalose entraîne lui, une
acidification avec virage de l'indicateur du vert au jaune.
12
• Milieu BGL
Il contient un substrat enzymatique : le P.Nitrophényl-N-Acétyl-B-DGalactosaminide permettant la mise en évidence de la galactosaminidase.
La sensibilité de ce test est supérieure à celle du test de germination pour
l'identification de C. albicans (sensibilité variable selon les auteurs).
• Milieu AGL
Il permet de détecter l'activité α - glucosidase.
• Milieu HAP
Il permet de détecter l'activité L-Histidine amino peptidase.
Les tests BGL et AGL sont réalisés en milieu acide. La lecture du résultat
nécessite une révélation à l'aide d'un réactif alcalin (réactif BGL/AGL). Le
test HAP est lu après révélation à l'aide du réactif HAP.
La lecture est réalisée après incubation pendant 4 heures à 37°C sans CO2.
3- COMPOSITION DU COFFRET
FONGISCREEN® 4H comprend :
• Microplate : 10 microplaques de 6 cupules sous emballage individuel
(le schéma des 16 cupules est reproduit sur une étiquette).
• Suspension medium :10 milieux de suspension de 1 ml
• 1 flacon réactif AGL/BGL de 3 ml
• 1 flacon réactif HAP de 2 ml
• 10 micropipettes
• 10 adhésifs
Chaque microplaque est conditionnée sous sachet individuel en
aluminium avec un adhésif et un sachet déshydratant.
Schéma de la microplaque
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
13
Précautions d’utilisation / Consignes d’hygiène et de sécurité :
Ce kit contient des réactifs classés dangereux.
• Un flacon de 3 ml de réactif AGL/BGL contenant 4% de NaOH 1N.
R 34 : provoque des brûlures.
S 26-37/39-45 : En cas de contact avec les yeux, laver
immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un
C - Corrosif spécialiste. Porter des gants appropriés et Porter un appareil
de protection des yeux/du visage. En cas d'accident ou de
malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui
montrer l'étiquette).
• Un flacon de 2 ml de réactif HAP contenant 66,5% d’éthanol à 95°.
R 11 : Facilement inflammable.
S 7-16 : Conserver le récipient bien fermé. Conserver à l'écart de toute
flamme ou source d'étincelles - Ne pas fumer.
4- CONSERVATION
Les réactifs, conservés à +2-8°C, sont stables jusqu'à la date de péremption
indiquée sur le coffret (y compris après ouverture).
...
....
5- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI
....
...
• Opacity control 6 Mac Farland : code 56499
• Etuve à 37°C.
6- MODE OPÉRATOIRE
A) INOCULATION DE LA MICROPLAQUE
14
Milieu de suspension
100 µl ou 3 gouttes
• A partir d'une culture pure et fraîche sur milieu
Sabouraud, ou Sabouraud Chloramphénicol, et/ou
Gentamicine, ensemencer le milieu de suspension
avec une quantité de levures suffisante pour obtenir
une opacité supérieure au témoin d'opacité
(Opacity control 6 Mac Farland, code 56499) en
pratique 4 à 5 öses si possible.
• Important : L'opacité de la suspension doit être au
moins égale à celle du témoin d'opacité qui définit
le seuil de turbidité minimum.
• Homogénéiser la suspension à l'aide de la micropipette (ou vortexer si nécessaire) en aspirant et en
refoulant à plusieurs reprises le contenu du flacon.
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Prélever l'inoculum avec la micropipette et distribuer 3 gouttes (100 µl)
dans chacune des cupules de la microplaque.
• Recouvrir la microplaque avec l'adhésif et incuber 4 heures à 37°C.
B) LECTURE DES RÉSULTATS
• Décoller l'adhésif
• Lire les tests TTZ, PAP, Urée/tréhalose
• Ajouter 2 gouttes de réactifs BGL/AGL dans les cupules BGL et AGL.
- lire le test BGL immédiatement
- pour le test AGL, la coloration se développe en 15 à 30 secondes.
• Ajouter 2 gouttes du réactif HAP dans la cupule HAP; la coloration se
développe en 15 à 30 secondes.
TABLEAU DES RÉSULTATS
TESTS
NÉGATIFS
POSITIFS
TTZ
INCOLORE
rose pale ou
rose franc
selon l’espèce
PROCÉDURE
LECTURE DIRECTE (sans addition de réactifs)
PAP
INCOLORE
JAUNE
UR./TRE
VERT
BLEU (alcalinisation)
ou JAUNE
(acidification)
selon espèce
BGL
INCOLORE
JAUNE
Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL
La coloration apparaît immediatement
(ne pas différer la lecture)
AGL
INCOLORE
JAUNE
Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL
La coloration se developppe en 15 à 30 secondes.
HAP
INCOLORE
JAUNE
Ajouter 2 gouttes du réactif HAP
La coloration se developpe en 15 à 30 secondes.
* Le virage au bleu (alcalinisation du milieu) est associé au métabolisme
de l’urée (souches urée(+), Tréhalose(+) ou (-)); si une souche est à la fois
urée(+) et Tréhalose(+), l’alcalinisation se manifeste prioritairement
(virage au bleu). Le virage au jaune (acidification du milieu) est associé
au métabolisme du Tréhalose (souche Tréhalose(+), urée(-)).
15
7- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
• Comparer le profil obtenu avec les profils spécifiques (cf. tableau A),
les caractères discriminants apparaissant en caractères gras.
• Si le profil est différent, considérer les tests PAP et urée et se référer
aux paragraphes correspondants.
a) Légendes
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
test
test
test
test
test
positif
négatif
variable
positif dans au moins 90 % des cas
négatif dans au moins 90 % des cas
b) Profils spécifiques
tableau A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
+/-
+
+
-
+/+/-
HAP
Vert ou Jaune
+
+
+/-
Candida albicans
Jaune (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
-
Jaune
-
-
+
Candida glabrata
-
Bleu
-
+(-)
-
(1) Seul un test franchement positif (jaune) permet de conclure immédiatement
à Candida tropicalis.
Dans le cas d'un résultat douteux (coloration verdâtre) ou négatif, il est
nécessaire de confirmer l'identité de la souche (diagnostic différentiel
avec certaines souches de Saccharomyces cerevisiae AGL+).
(2) On peut parfois observer un léger voile jaune pâle.
16
c) Autres profils
1- Espèces
PAP +
et
jaune
Urée vert ou jaune
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Vert ou Jaune
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Vert ou Jaune
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2- Espèces
PAP -
et
jaune
Espèces
Urée vert ou jaune
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Observations
Complément.
Espèces
+/-
-
Vert
-
-
+(-)
/
+/-
-
Vert
-
-
+(-)
Aspect sec
des colonies
Candida krusei
+/-
-
Vert
-
-
+(-)
Arthrospores
Geotrichum species
+/-
-
Vert
-
+/-
+(-)
/
Candida inconspicua
Candida rugosa
Saccharomyces
cerevisae
17
3- Espèces
Urée +
et
HAP +
bleu
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
jaune
AGL
HAP
Observations
complément.
capsule
-
+/- +/-
Bleu
+/-
+/-
+
{
+
-
-
pigment
-ation
-
+
-
Espèces
arthros
-pores
-
Crypto
coccus
species
-
Rhodo
-torula
species
+
Tricho
sporon
cutaneum
Un test positif se traduit par une coloration généralement jaune des tests
BGL et AGL avec Trichosporon cutaneum, on peut observer une coloration
orange ou rose, spécifique de cette espèce.
De plus, les colonies de T. cutaneum apparaissent filamenteuses.
8- PERFORMANCES
D’après des études réalisées à l’Institut Pasteur de Paris et à l’hôpital Broussais
à Paris, la galerie FONGISCREEN® 4H permet d’identifier en 4 heures,
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis et C. neoformans et d’orienter le
diagnostic pour d’autres levures.
Une étude clinique rétrospective a été réalisée à l’aide d’un panel
constitué de 146 souches, représentant 23 espèces de levures. La galerie
FONGISCREEN® 4H a permis d’identifier 100% des souches de C. albicans
(18 souches testées), C. glabrata (24 souches), et C. neoformans (11 souches)
et 94% des souches de C. tropicalis (18 souches testées). Pour ces 4 espèces,
la spécificité du test est de 100%.
Les autres espèces de levures peuvent être classées en 3 groupes, selon
un profil caractéristique de l’espèce (pour 99 % des souches), mais non
spécifique.
18
9- LIMITES D'UTILISATION
• Le test BGL a parfois une coloration jaune très pâle difficile à
interpréter, en particulier pour la souche C. tropicalis.
• Quelques rares souches de C. tropicalis Tréhalose (–) peuvent être
faussement identifiées comme S. cerevisiae.
10- CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT
Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont
placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières
premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de
produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que
s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à
la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.
11- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance.
Manual of Clinical Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-541
2. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of
the most frequent clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-89
3. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and
yeast-like organisms identification methods accessible to a clinical
microbiology laboratory. (soumis à Clin. Microbiol. Rev.)
4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P.
KERVROEDAN, P. AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT.
Identification rapide de Candida albicans, Candida tropicalis,
Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H.
Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106.
5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier,
Paris. 1996.
6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337,
p.384. Abstr 86th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. American
Society for Microbiology. Washington D.C.
7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT.
1991. Abstr.1233, p.105 - 5th European Congress of Clinical
Microbiology and Infectious Diseases/Oslo
19
8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profil
enzymatique de levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull.
Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2, p. 227-230.
9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profil
enzymatique de quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989,
XVIII, N°1, p. 103-108.
20
FONGISCREEN® 4H
56504
10 PRUEBAS
IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE LAS PRINCIPALES
LEVADURAS DE INTERÉS MEDICO
IVD
1- INTERÉS CLINICO
Habida cuenta de la recrudescencia de las infecciones fúngicas durante los
últimos años, concretamente debidas a la frecuente utilización de tópicos
antibacterianos, antibióticos de amplio espectro y técnicas invasivas
(catéteres, nutrición parenteral), la búsqueda de levaduras en los productos
patológicos es cada vez más solicitada en laboratorio. A veces es
necesario un diagnóstico rápido y preciso a fin de instaurar un tratamiento
apropiado, sobre todo en los sujetos inmunodeficientes.
FONGISCREEN ® 4H, un sistema basado en el estudio de un perfil
enzimático, responde a esta demanda ya que permite identificar en 4 horas :
Candida albicans, Candida glabrata. Candida tropicalis, levaduras que
representan un 90% aproximadamente de los aislamientos y Cryptococcus
neoformans. También permite una orientación para el diagnóstico de otras
levaduras, cuya identificación se completará mediante el estudio de la
asimilación de los azúcares con el estuche AUXACOLOR®2 (56513)
2- PRINCIPIO DELA PRUEBA
El prueba se basa en la utilización de sustratos deshidratados por las
enzimas fúngicas preformadas lo cual, se manifiesta por un cambio de color
ya sea espontáneamente o bien, después de añadir un reactivo revelador.
TIPO DE PRUEBAS UTILIZADAS
• Medio TTZ
Este medio contiene Trifeniltetrazolio (TTZ).
La reducción del TTZ se evidencia por la aparición de una coloración
rosa mas o menos intensa en función de la especie.
• Medio PAP
Contiene un sustrato enzimático que permite detectar la actividad prolina
amoniopeptidasa.
• Medio Urea + Trehalosa (Ur. / tre)
Este medio permite detectar la actividad de ureasa que se manifiesta por
una alcalinización del medio con viraje del indicador de pH del verde al
azul (Azul de Bromotimol). El metabolismo de la trehalosa origina una
acidificación con viraje del indicador de verde al amarillo.
• Medio BGL
Contiene un sustrato enzimático: el p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D galactosaminida
22
que permite la puesta en evidencia de la galactosaminidasa. La
sensibilidad de esta prueba es superior a la de la prueba de germinación
para la identificación de C. albicans (sensibilidad variable según los
autores).
• Medio AGL
Permite detectar la actividad a-glucosidasa.
• Medio HAP
Permite detectar la actividad L-Histidina aminopeptidasa
Las pruebas BGL y AGL se realizan en medio ácido. La lectura del
resultado precisa un revelado con un reactivo alcalino (reactivo BGL/AGL).
La prueba HAP se lee después de revelado con el reactivo HAP.
La lectura se realiza después de la incubación durante 4 horas a 37°C
sin CO2.
3- COMPOSICIÓN DE LA CAJA
FONGISCREEN® 4H contiene :
• Microplate : 10 microplacas de 6 pocillos en embalaje individual (el
diagrama de la microplaca está indicado en la etiqueta)
• Suspension medium : 10 medios de suspensión, listos para su empleo (1ml)
• 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml)
• 1 frasco reactivo HAP (2 ml)
• 10 adhesivos
• 10 micropipetas
Cada microplaca está envasada individualmente en una bolsa sellada de
hoja de aluminio con una película adhesiva y un desecante.
ESQUEMA DE LA MICROPLACA
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
23
Precauciones de utilización / Recomendaciones de higiene y seguridad :
Este estuche contiene reactivos peligrosos.
• 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml) que contiene 4% de NaOH 1N.
R 34 : Provoca quemaduras.
S 26-37/39-45 : En caso de contacto con los ojos, lávense
inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.
Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
C - Corrosivo
En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al
médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
• 1 frasco reactivo HAP (2 ml) que contiene 66,5% de etanol al 95° .
R 11 : Fácilmente inflamable.
S 7-16 : Manténgase el recipiente bien cerrado. Conservar alejado de
toda llama o fuente de chispas - No fumar.
4- CONSERVACIÓN
Los reactivos conservados a +2-8°C son estables
hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
(incluso una vez abiertos).
5- MATERIAL NECESARIO NON
SUMINISTRADO
...
....
....
...
• Opacity control 6 Mac Farland: código 56499
• Incubador a 37°C
6- MODO OPERATIVO
• A partir de un cultivo puro y fresco en medio de
Sabouraud, o Sabouraud + cloranfenicol, y/o
Gentamicina, sembrar el medio de suspensión
con una cantidad de levaduras suficiente para
obtener una opacidad superior al testigo de
opacidad (Opacity control 6 Mac Farland,
código 56499), en la práctica de 4 a 5 dosis si
fuera posible.
• Importante : La opacidad de la suspensión debe ser
equivalente como múnimo a la del testigo de
opacidad que define el umbral mínimo de turbidez.
24
Medio de suspensión
100 µl o 3 gotas
A) INOCULACION DE LA MICROPLACA
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Homogeneizar la suspensión con la micropipeta (o utilizar el vortex si fuerte
necesario) aspirando y expulsando varias veces el contenido del frasco.
• Extraer el inóculo con la micropipeta y distribuir 3 gotas (100 µl) en
cada una de los pocillos de la microplaca.
• Cubrir la microplaca con el adhesivo e incubar 4 horas a 37°C.
B) LECTURA DE LOS RESULTADOS
Despegar el adhesivo
• Leer ls pruebas TTZ, PAP, Urea/trehalosa.
• Añadir 2 gotas de reactivos BGL/AGL en los pocillos BGL y AGL.
- Leer la prueba BGL inmediatamente
- Para la prueba AGL, la coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.
• Añadir 2 gotas del reactivo HAP en la cúpula HAP ; la coloración se
desarrolla en 15 a 30 segundos.
TABLA DE RESULTADOS
PRUEBA NEGATIVOS
TTZ
INCOLORO
POSITIVOS
PROCEDIMIENTO
ROSA CLARO o
ROSA FUERTE
según la especie
LECTURA DIRECTA (sin adición de reactivos)
PAP
INCOLORO
AMARILLO
UR./TRE
VERDE
AZUL (alcalinización)
o AMARILLO
(acidificación)
según especie
BGL
INCOLORO
AMARILLO
Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL.
La coloración aparece inmediatamente
(realizar la lectura inmediatamente)
AGL
INCOLORO
AMARILLO
Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL.
La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.
HAP
INCOLORO
AMARILLO
Añadir 2 gotas del reactivo HAP.
La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos.
* El viraje al azul (alcalinización del medio) esta asociado con el
metabolismo de la urea (cepas urea (+), Trehalosa (+) o (-)), si una cepa
es a la vez Urea (+) y Trehalosa (+), la alcalinización se manifiesta
prioritariamente (viraje al azul). El viraje al amarillo (acidificación del
25
medio) esta asociado con el metabolismo de la Trehalosa (cepas
Trehalosa (+), urea (-)).
7- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
• Comparar el perfil obtenido con los perfiles específicos (ver cuadro A),
los caracteres discriminantes aparecen en negrilla.
• Si el perfil es diferente, considerar las pruebas PAP y Urea y remitirse a
los apartados correspondientes.
a) Textos
+
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
:
prueba
prueba
prueba
prueba
prueba
prueba
positiva
positiva
negativa
variable
positiva en al menos un 90% de los casos
negativa en al menos un 90% de los casos
b) Características específicas
TABLA A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
+/-
+
+
-
+/+/-
HAP
Verde o amarillo
+
+
+/-
Candida albicans
Amarillo (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
-
Amarillo
-
-
+
Candida glabrata
-
Azul
-
+(-)
-
(1) Sólo una prueba claramente positiva (amarillo) permite concluir
inmediatamente en Candida tropicalis.
En caso de resultados dudoso (coloración verdosa) o negativo, es
necesario confirmar la identidad de la cepa (diagnóstico diferencial con
ciertas cepas de Saccharomyces cerevisiae AGL+).
(2) A veces puede observarse una ligera coloración amarillo claro.
26
c) Otras características
1- Especies
PAP+
y
amarillo
Ureaverde o amarillo
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
ESPECIES
+/-
+
Verde o amarillo
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Verde o amarillo
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2- Especies
PAP-
y
incolora
Ureaverde o amarillo
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP OBSERVACIONES
COMPLEMENTARIAS
ESPECIES
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
/
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
Aspecto seco
de colonias
Candida krusei
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
Artrosporas
Geotrichum species
+/-
-
Verde
-
+/-
+(-)
/
Candida inconspicua
Candida rugosa
Saccharomyces
cerevisae
27
3- ESPECIES
UREA +
Y
HAP +
azul
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
amarillo
AGL
HAP
OBSERVACIONES
complementarias
cápsula
-
+/-
+/-
Azul
+/-
+/-
+
{
ESPECIES
pigment
-ación
artros
-poras
+
-
-
-
+
-
Cryptococcus
Rhodoorula
Trichosporon
cutaneum
-
-
+
Una prueba positiva también se manifiesta por una coloración amarilla
de las pruebas BGL y AGL; con Trichosporon cutaneum, puede
observarse una coloración naranja o rosa, específica de esta especie.
Además, las colonias de Trichosporon cutaneum aparecen filamentosas.
8- ESPECIFICACIONES
Según los estudios del Instituto Pasteur de París y del hospital Broussais
de París, FONGISCREEN® 4H permite la identificación en cuatro horas
de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. neoformans, así como la
orientación diagnóstica de otras levaduras.
Un estudio clínico retrospectivo ha establecido un grupo de 146 cepas
que representan 23 especies de levaduras. FONGISCREEN® 4H permite
detectar el 100% de las cepas de C. albicans (18 cepas sometidas a
prueba), C. glabrata (24 cepas), y C. neoformans (11 cepas) y el 94%
de C. tropicalis strains (18 cepas sometidas a prueba). La especificidad
de la prueba fue del 100% para estas 4 cepas
Otras especies de levaduras se pueden clasificar en 3 grupos, de
acuerdo con características distintivas, pero no específicas, de las
especies (para el 99% de las cepas).
28
9- LÍMITES DE LA PRUEBA
• La prueba BGL a veces adquiere un color amarillo claro difícil de
interpretar, sobre todo con la cepa C. tropicalis.
• Algunas cepas raras de C. tropicalis Trehalosa (-) se pueden identificar
erróneamente como S. cerevisiae.
10- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE
Todos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema de
calidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materias
primas hasta la comercialización del producto.
Cada lote se somete a exámenes de control de calidad y únicamente se
autoriza su introducción en el mercado tras cumplir los criterios de
aceptación predefinidos.
Bio-Rad conserva los expedientes relativos a la producción y el control de
cada uno de los lotes.
11- BIBLIOGRAFIA
Véase la versión francesa.
29
30
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESTS
TESTKIT FÜR DIE SCHNELLE IDENTIFIZIERUNG DER
WICHTIGSTEN, KLINISCH BEDEUTSAMEN HEFEN
IVD
1- KLINISCHES INTERESSE
Durch die in den letzten Jahren steigende Zahl von Pilzinfektionen, die
hauptsächlich auf die häufige Anwendung von lokalen oder BreitbandAntibiotika sowie von invasiven Techniken (Katheter, Parenteralernährung)
zurückzuführen ist, müssen in den mikrobiologischen Labors immer
häufiger Hefebestimmungen an pathologischem Untersuchungsmaterial
durchgeführt werden.
In manchen Fällen ist eine schnelle und präzise Diagnose erforderlich,
damit, vor allem bei immunsupprimierten Patienten, rasch mit einer
geeigneten Therapie begonnen werden kann.
FONGISCREEN® 4H ist speziell für diese Fälle geeignet: basierend auf
der Untersuchung des Enzymprofils ermöglicht dieser Test innerhalb
von 4 Stunden den Nachweis der in 90% aller Fälle isolierten Hefen
Candida albicans, Candida glabrata und Candida tropicalis, sowie den
Nachweis von Cryptococcus neoformans. Er liefert darüber hinaus eine
Orientierungshilfe für die Identifizierung anderer Hefen, die anschließend
im Zuckerassimilationstest mit dem AUXACOLOR® 2-System (Code 56513)
genauer bestimmt werden können.
2- TESTPRINZIP
Das Testprinzip beruht auf der Verwendung dehydrierter Substrate durch
die jeweils vorhandenen Pilzenzyme. Spontan oder nach Zusatz eines
Entwicklungsreagenzes tritt ein Farbumschlag auf.
ENTHALTENE TESTS
• TTZ-Nährboden
Dieser Nährboden enthält Triphenyltetrazolium (TTZ). Bei Reduktion von TTZ
tritt je nach Spezies eine mehr oder weniger intensive Rosafärbung auf.
• PAP-Nährboden
Enthält ein Enzymsubstrat zum Nachweis der Prolinaminopeptidase-Aktivität.
• Harnstoff + Trehalose-Nährboden (Ur./Tre)
Ermöglicht den Nachweis der Ureaseaktivität durch die Alkalisierung des
Nährbodens mit Farbumschlag des pH-Indikators von grün nach blau
(Bromthymolblau). Der Trehalosemetabolismus bewirkt eine Ansäuerung
mit Indikatorumschlag von grün nach gelb.
• BGL-Nährboden
Enthält das Enzymsubstrat p-Nitrophenyl-N-Acetyl-ß-D-Galactosamid zum
32
Nachweis der Galactosamidase. Dieser Test für den Nachweis von
C.albicans ist empfindlicher als der Keimschlauchtest (unterschiedliche
Empfindlichkeitsangaben je nach Autor).
• AGL-Nährboden
Zum Nachweis der a-Glucosidase-Aktivität.
• HAP-Nährboden
Zum Nachweis der L-Histidinaminopeptidase-Aktivität.
Die Tests BGL und AGL werden im sauren Bereich durchgeführt. Zur
Ablesung der Ergebnisse muss als Farbentwickler ein alkalisches Reagenz
(BGL/AGL-Reagenz) zugesetzt werden.
Der HAP-Test wird nach Entwicklung durch das HAP-Reagenz abgelesen.
Die Testauswertung erfolgt nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C (ohne CO2).
3- ZUSAMMENSETZUNG DER TESTPACKUNG
FONGISCREEN® 4H enthält :
• Microplate : 10 einzeln verpackte Mikroplatten mit je 6 Vertiefungen
(Schema der Mikroplatte siehe Etikett).
• Suspension medium : 10 gebrauchsfertige Suspensionslösungen (1 ml)
• 1 Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz (3 ml)
• 1 Fläschchen mit HAP-Reagenz (2 ml)
• 10 Mikropipetten
• 10 Klebestreifen
Jede Mikroplatte ist einzeln in einem versiegelten Aluminiumbeutel mit
Klebefolie und Trockenmittel verpackt.
SCHEMA DER MIKROPLATTE
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
33
Vorsichtsmaßnahmen / Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften:
Diese Testpackung enthält gefährliche Reagenzien.
• 3 ml-Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz mit 4% NaOH 1N.
R 34: Verursacht Verätzungen.
S 26-37/39-45: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich
mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei der Arbeit
geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz
C - Ätzend
tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn
möglich, dieses Etikett vorzeigen).
• 2 ml-Fläschchen HAP-Reagenz mit 66,5% 95° Ethanol.
R 11: Leichtentzündlich.
S 7-16: Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen.
4- LAGERUNG
Alle Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum stabil, wenn sie bei +2 - 8°C gelagert werden (selbst nach
der Öffnung).
...
....
5- ZUSÄTZLICH WERDEN BENÖTIGT
....
...
• Opacity control 6 Mac Farland: Kat. Nr. 56499
• Inkubator bei 37°C
6- ARBEITSANLEITUNG
A)BEIMPFUNG DER MIKROPLATTE
34
Suspensionmedium
100 µl oder 3 Tropfen
• Ausgehend von einer reinen und frischen Kultur auf
Sabouraud-Nährboden bzw, Sabouraud +
Chloramphenicol und/oder Gentamycin wird das
Suspensionsmedium mit einer Hefemenge beimpft,
ausreichend um eine Suspensionsdichte zu erhalten,
deren Trübung stärker als die des Trübungsstandards
(Opacity control 6 Mac Farland, Kat. Nr. 56499)
ist: erfahrungsgemäß entspricht dies etwa 4-5
Impfösen.
• WICHTIG : Die Trübung der Suspension muss
mindestens der des Trübungsstandards entsprechen,
da dieser nur die minimale Trübungsgrenze definiert.
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Die Suspension mit der Mikropipette durch mehrmaliges Ansaugen und
Zurückfließen des Fläschcheninhalts homogenisieren (wenn nötig, mit
dem Vortex mischen).
• Das Inoculum mit der Mikropipette entnehmen und 3 Tropfen (100 µl)
in jede Vertiefung der Mikroplatte pipettieren.
• Die Mikroplatte mit dem Klebestreifen bedecken und 4 Stunden bei
37°C inkubieren.
2. ABLESEN DER ERGEBNISSE
• Den Klebestreifen abziehen
• Die Tests TTZ, PAP, Harnstoff/Trehalose ablesen.
• Jeweils 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz in die Vertiefungen BGL und AGL geben.
- den BGL-Test sofort ablesen
- bei dem AGL-Test tritt der Farbumschlag nach 15 bis 30 Sekunden auf.
• 2 Tropfen HAP-Reagenz in die HAP-Vertiefung geben; der
Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden auf.
ERGEBNISTABELLE
TESTS
NEGATIV
POSITIV
DURCHFÜHRUNG
TTZ
FARBLOS
HELLROSA oder
KRÄFTIGES ROSA
je nach Spezies
PAP
FARBLOS
GELB
UR./TRE
GRÜN
BLAU (Alkalisierung)
oder GELB
(Säuerung)
je nach Spezies
BGL
FARBLOS
GELB
2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen.
Der Farbumschlag tritt sofort ein
(sofort ablesen)
AGL
FARBLOS
GELB
2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen.
Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein.
HAP
FARBLOS
GELB
2 Tropfen HAP-Reagenz zusetzen.
Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein.
DIREKT ABLESEN (ohne Reagenzienzusatz)
* Der Farbumschlag nach Blau (Alkalisierung des Nährbodens) ist auf
den Harnstoffmetabolismus zurückzuführen (Stämme: Harnstoff (+),
35
Trehalose (+) oder (-)); ist ein Stamm gleichzeitig Harnstoff (+) und
Trehalose (+), dominiert die Alkalisierung: Farbumschlag nach blau. Eine
Gelbfärbung (Ansäuerung des Nährbodens) steht im Zusammenhang mit
dem Trehalose-Metabolismus (Stämme: Trehalose (+), Harnstoff (-)).
7- AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
• Vergleich des gefundenen Testprofils mit den spezifischen Profilen der
Tabelle A. Die für die Identifizierung entscheidenden Merkmale sind
jeweils fett gedruckt.
• Lässt sich das ermittelte Testprofil keinem der in der Tabelle A
aufgeführten Profile zuordnen, sind für eine orientierende Bestimmung
die Testergebnisse des PAP- bzw. Harnstofftests mit den
entsprechenden Ergebnissen der unter c) aufgeführten Tabellen zu
vergleichen.
a) Zeichenerklärung
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
positiver Test
negativer Test
variables Testergebnis
in mindestens 90% der Fälle positiver Test
in mindestens 90% der Fälle negativer Test
b) Spezifische Profile
TABELLE A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Grün oder Gelb
+
+
+/-
Candida albicans
+
-
Gelb (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
+/-
-
Gelb
-
-
+
Candida glabrata
+/-
-
Blau
-
+(-)
-
(1) Nur ein deutlich positives (gelb) Testergebnis gestattet den sofortigen
Rückschluss auf das Vorhandensein von Candida tropicalis. Wenn das
Ergebnis zweifelhaft (grünliche Färbung) oder negativ ist, muss eine
Bestätigung der Stammidentität (Differentialdiagnose mit bestimmten AGL
+ Stämmen von Saccharomyces cerevisiae) vorgenommen werden.
(2) Manchmal ist ein leichter, hellgelber Schleier zu beobachten.
36
c) Andere Profile
1-
PAP+
und
Harnstoff -
gelb
Spezies
grün oder gelb
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
GRÜN ODER GELB
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
GRÜN ODER GELB
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2-
PAP -
und
Spezies
Harnstoff -
farblos
Spezies
grün
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Zusätzliche
BEOBACHTUNGEN
Spezies
+/-
-
GRÜN
-
-
+(-)
/
+/-
-
GRÜN
-
-
+(-) Trockenes Aussehen Candida krusei
der Kolonien
+/-
-
GRÜN
-
-
+(-)
Arthrosporen
+/-
-
GRÜN
-
+/-
+(-)
/
Candida inconspicua
Candida rugosa
Geotrichum-Spezies
Saccharomyces
cerevisae
37
3- HARNSTOFF +
und
HAP + SPEZIES
blau
TTZ
PAP
UR./TRE
gelb
BGL
AGL
HAP
Zusätzliche
Beobachtungen
Kapseln
-
+/- +/-
Blue
+/-
+/-
+
{
+
pigment
-rung
-
Spezies
Arthro
-sporen
-
Cryptoc
-occus
-Spezies
Rhodoorula
-Spezies
-
-
+
-
-
+
Tricho
-sporon
-cutaneum
Ein positiver Test zeichnet sich im Allgemeinen durch Gelbfärbung der
Tests BGL und AGL aus. Bei Trichosporon cutaneum kann eine für diese
Spezies spezifische orange oder rosa Färbung beobachtet werden.
Darüber hinaus sehen die Trichosporon cutaneum Kolonien ”faserig“ aus.
8- TESTEIGENSCHAFTEN
Gemäß Studien des Pasteur-Instituts in Paris und im Broussais-Hospital in
Paris ermöglicht FONGISCREEN® 4H innerhalb von vier Stunden die
Identifizierung von C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis und
C. neoformans und gibt eine Orientierungshilfe für die Diagnose anderer
Hefen.
Eine retrospektive klinische Studie wurde mit einem Panel von 146
Stämmen von 23 Hefespezies durchgeführt. Mit FONGISCREEN® 4H
wurden 100% von C. albicans (18 getestete Stämme), C. glabrata (24
Stämme) und C. neoformans (11 Stämme) und 94% von C. tropicalis (18
getestete Stämme) nachgewiesen. Für diese 4 Stämme lag die Spezifität
des Tests bei 100%.
38
Andere Hefespezies können nach einem charakteristischen, aber nicht
spezifischen Profil der Spezies (für 99% der Stämme) in 3 Gruppen
eingeteilt werden.
9- GRENZEN DES TESTS
• Der BGL-Test nimmt gelegentlich eine sehr hellgelbe Farbe an, die nur
schwer interpretierbar ist, insbesondere für C. tropicalis-Stämme.
• Manche seltenen Stämme von C. tropicalis Trehalose (-) können
fälschlicherweise als S. cerevisiae identifiziert werden.
10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS
Alle Reagenzien unterliegen unserem Qualitätssicherungssystem, vom
Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Produkte. Jede fertige
Produktionscharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann
für den Markt freigegeben, wenn sie den vorgegebenen
Abnahmekriterien entspricht. Die Produkt- und Kontrolldokumentation
jeder einzelnen Charge wird bei Bio-Rad aufbewahrt.
11- LITERATUR
Siehe Französische Version.
39
40
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TEST
IDENTIFICAZIONE RAPIDA DEI PRINCIPALI LIEVITI DI
RILEVANZA MEDICA
IVD
1- INTERESSE CLINICO
A causa dell’aumentata incidenza delle infezioni micotiche nel corso
degli ultimi anni, dovute essenzialmente all’impiego frequente di farmaci
antibatterici per uso topico, di antibiotici ad ampio spettro e di tecniche
invasive (cateteri, alimentazione parenterale), ai laboratori di analisi
microbiologiche viene sempre più di frequente richiesto di identificare i
lieviti presenti nei campioni patologici.
Una diagnosi rapida e precisa si rende talvolta necessaria per avviare un
trattamento adeguato, specialmente in soggetti immunodepressi.
Fongiscreen® 4H, un metodo basato sullo studio del profilo enzimatico,
soddisfa questa richiesta in quanto è in grado di identificare, entro 4 ore :
la Candida albicans, la Candida glabrata e la Candida tropicalis, lieviti
che rappresentano il 90% circa degli isolati e il Cryptococcus
neoformans. Il test consente inoltre di dirigere la diagnosi di altri lieviti
che saranno completamente identificabili attraverso lo studio dell’utilizzo
degli zuccheri mediante il kit AUXACOLOR® 2 (codice 56513).
2- PRINCIPIO DEL TEST
Il test si basa sull’uso di substrati deidratati mediante enzimi fungini
preformati, che danno origine a un cambiamento di colore spontaneo o
in seguito all’aggiunta di un reagente rivelatore.
NATURA DEI TEST IMPIEGATI
• Terreno TTZ
Questo terreno di coltura contiene trifeniltetrazolio (TTZ). La riduzione di
TTZ comporta l’apparizione di un colore rosa più o meno intenso,
secondo le specie.
• Terreno PAP
Questo terreno contiene un substrato enzimatico che consente la
rivelazione dell’attività della prolina aminopeptidasi.
• Terreno Urea + Trealosio (Ur./tre)
Questo terreno consente la rivelazione dell’attività dell’ureasi, riflessa
dall’alcalinizzazione del terreno con un cambiamento di colore dal verde
al blu dell'indicatore di pH (blu di bromotimolo). Il metabolismo del
trealosio causa l'acidificazione con un cambiamento di colore
dell’indicatore da verde a giallo.
• Terreno BGL
Questo terreno di coltura contiene un substrato enzimatico,
42
il p. Nitrofenil-N-acetil-B-D-galattosamina, che consente di dimostrare la
presenza di galattosaminidasi. Questo test è più sensibile del test di
filamentazione (germ tube test) per l’identificazione della C. albicans (a
causa, secondo certi autori, della sensibilità variabile).
• Terreno AGL
Consente la rivelazione dell’attività dell’á-glucosidasi
• Terreno HAP
Consente la rivelazione dell’attività della L-istidina aminopeptidasi
I test su BGL e AGL sono eseguiti in un terreno acido. Per la lettura dei
risultati è necessario procedere alla rivelazione mediante un reagente
alcalino (reagente BGL/AGL).
La lettura del test HAP è possibile dopo la rivelazione con il reagente HAP.
La lettura del test viene eseguita dopo un’incubazione di 4 ore a 37°C in
assenza di CO2.
3- COMPOSIZIONE DEL KIT
FONGISCREEN® 4H comprende:
• Microplate : 10 micropiastre da 6 pozzetti confezionate singolarmente
(lo schema di composizione della micropiastra è indicato sull’etichetta).
• Suspension medium : 10 mezzi di sospensione pronti per l’uso (1 ml)
• 1 fiala di reagente AGL/BGL (3 ml)
• 1 fiala di reagente HAP (2ml)
• 10 micropipette
• 10 pellicole adesive
Ciascuna micropiastra è confezionata singolarmente in un sacchetto
foderato di alluminio contenente una pellicola adesiva e un essiccante.
SCHEMA DI COMPOSIZIONE DELLA MICROPIASTRA
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient: ..............................................................
Date: .................................................................
43
Precauzioni per l’uso / Istruzioni per la salute e la sicurezza:
Il presente kit contiene reagenti pericolosi.
• Una fiala di reagente AGL/BGL da 3 ml contiene il 4% di NaOH 1 N.
R 34: Provoca ustioni.
S 26-37/39-45: In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare
C - Corrosivo un medico. Usare guanti adatti e proteggersi gli occhi/la
faccia. In caso di incidente o di malessere consultare
immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta).
• Una fiala di reagente HAP da 2 ml contiene il 66,5% di etanolo a 95°.
R 11: Facilmente infiammabile.
S 7-16: Conservare il recipiente ben chiuso. Conservare lontano da
fiamme e scintille - Non fumare.
4- CONSERVAZIONE
I reagenti, conservati a +2-8°C, sono stabili fino alla data di scadenza
indicata sulla targhetta (anche dopo l’apertura)
5- MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
• Opacity control 6 Mac Farland: codice 56499
• Incubatore con termostato a 37°C
...
....
....
...
6- PROCEDURA
A)INOCULAZIONE DELLA MICROPIASTRA
44
Mezzi do sospensione
100 µl o 3 gocce
• Mediante una coltura pura e fresca su terreno con
Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol, e/o
Gentamicina e una quantità di lieviti sufficiente a
ottenere un'opacità superiore all’opacità di
controllo (Opacity control 6 Mac Farland, codice
56499): in pratica 4 - 5 anse, se possibile.
• Importante: l’opacità della sospensione deve essere
almeno uguale a quella dell’opacità di controllo che
definisce il livello minimo di torbidezza.
• Omogeneizzare la sospensione mediante la
micropipetta (o vortex se necessario), aspirando ed
espellendo numerose volte il contenuto della fiala.
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Raccogliere l’inoculo con la micropipetta e dispensare 3 gocce (100 µl)
in ciascun pozzetto della micropiastra.
• Coprire la micropiastra con un foglio adesivo e incubare per 4 ore a 37 °C.
B) LETTURA DEI RISULTATI
• Rimuovere l’adesivo.
• Leggere i risultati del TTZ, PAP e Urea/trealosio.
• Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL nei pozzetti BGL e AGL.
- leggere immediatamente il test BGL
- per il test AGL, il colore si rivela in 15 - 30 secondi.
• Aggiungere 2 gocce di reagente HAP nel pozzetto HAP. Il colore si
rivela in 15 - 30 secondi.
TABELLA DEI RISULTATI
TEST
NEGATIVO
POSITIVO
TTZ
INCOLORE
ROSA CHIARO o
ROSA SCURO
secondo le specie
PROCEDURA
LETTURA DIRETTA (senza aggiunta di reagenti)
PAP
INCOLORE
GIALLO
UR./TRE
VERDE
BLU (alcalinizzazione)
o GIALLO
(acidificazione)
secondo la specie
BGL
INCOLORE
GIALLO
Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL.
Il colore si manifesta immediatamente
(cioè lettura immediata)
AGL
INCOLORE
GIALLO
Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL.
Il colore si rivela in 15 - 30 secondi.
HAP
INCOLORE
GIALLO
Aggiungere 2 gocce di reagente HAP.
Il colore si sviluppa in 15 - 30 secondi.
* Il fatto che il colore diventi blu (alcalinizzazione del terreno) è
associato con il metabolismo dell’urea (ceppi di Urea (+), Trealosio (+)
oppure (-)); se un ceppo è sia Urea (+) sia Trealosio (+), l’alcalinizzazione è
predominante (colorazione blu). Il fatto che il colore diventi giallo
(acidificazione del terreno) è associato con il metabolismo del Trealosio
(ceppi di Trealosio (+), Urea (-)).
45
7- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
• Confrontare il profilo ottenuto con i profili specifici (vedere Tabella A);
gli aspetti discriminanti sono indicati in grassetto.
• Se il profilo è diverso, considerare i test PAP e urea e fare riferimento
ai relativi paragrafi.
a) Legende
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
test
test
test
test
test
positivo
negativo
variabile
positivo in almeno il 90% dei casi
negativo in almeno il 90% dei casi
b) Profili specifici
TABELLA A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
+/-
+
+
-
+/+/-
HAP
Verde o giallo
+
+
+/-
Candida albicans
Giallo (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
-
Giallo
-
-
+
Candida glabrata
-
Blu
-
+(-)
-
(1) Soltanto un test chiaramente positivo (giallo) consente di identificare
immediatamente la Candida tropicalis
In caso di risultato dubbio (colore verdastro) o negativo, si dovrà
procedere alla conferma dell’identità del ceppo (diagnosi differenziale
con certi ceppi di AGL + Saccharomyces cerevisiae).
(2) A volte è possibile osservare una scoloritura giallo pallido.
46
c) Altri profili
1- SPECIE
PAP+
E
giallo
UREA
verde o giallo
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Verde o giallo
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Verde o giallo
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2- SPECIE
PAP-
E
incolore
Specie
UREA
verde
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Osservazioni
aggiuntive
+/-
-
verde
-
-
+(-)
/
+/-
-
verde
-
-
+(-)
Apparizione di
colonie a secco
+/-
-
verde
-
-
+(-)
Artrospore
+/-
-
verde
-
+/-
+(-)
/
Specie
Candida inconspicua
Candida rugosa
Candida krusei
specie Geotrichum
Saccharomyces
cerevisae
47
3- SPECIE
UREA+
E
HAP+
blu
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
giallo
AGL
HAP
Osservazioni
capsula
-
+/- +/-
Blu
+/-
+/-
+
{
+
pigment
-azione
-
Specie
Artros
-pore
-
Specie
Cryptococ
-cus
Specie
Rhodoorula
-
+
Trichosporo
n cutaneum
-
-
+
Un test positivo corrisponde generalmente a una colorazione gialla sui
test BGL e AGL; una colorazione arancione o rosa si può osservare per il
Trichosporon cutaneum ed è specifica di questa specie. Inoltre, le colonie
di T. cutaneum hanno un aspetto filamentoso.
8- PRESTAZIONI
In base agli studi condotti dall’Istituto Pasteur di Parigi e dall’ospedale
Broussais di Parigi, il FONGISCREEN® 4H consente in quattro ore di
identificare la C. albicans, la C. glabrata, la C. tropicalis e la C. neoformans
e di orientare la diagnosi di altri lieviti.
Uno studio clinico retrospettivo è stato condotto su un panel di 146 ceppi
rappresentanti di 23 specie di lieviti. FONGISCREEN® 4H consente di
rivelare il 100% dei ceppi di C. albicans (18 ceppi testati), C. glabrata
(24 ceppi) e C. neoformans (11 ceppi) e il 94% di ceppi di C. tropicalis
(18 ceppi testati). Per questi 4 ceppi, la specificità dei test è risultata del
100%.
Altre specie di lievito possono essere classificate in 3 gruppi, secondo un
profilo distintivo, ma non specifico, delle specie (per il 99% delle specie).
48
9- LIMITI DELLA PROCEDURA
• Il test BGL assume a volte una colorazione gialla molto chiara difficile
da interpretare, in particolare per il ceppo di C. tropicalis.
• Alcuni rari ceppi di C. tropicalis Trealosio (-) possono essere
erroneamente interpretati come S. cerevisiae
10- CONTROLLO DI QUALITA DEL PRODUTTORE
Tutti i reagenti sono prodotti in base al nostro sistema di assicurazione di
qualità a cominciare dal ricevimento delle materie prime fino alla
distribuzione del prodotto finito. Ciascun lotto è sottoposto a controllo di
qualità ed è immesso sul mercato solo quando è conforme ai criteri di
accettazione. I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singolo
lotto sono conservati negli archivi Bio-Rad.
11- BIBLIOGRAFIA
Vedere la versione francese.
49
50
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESTS
IDENTIFICAÇÃO RAPIDA DOS PRINCIPAIS FUNGOS
CLINICAMENTE IMPORTANTES
IVD
1- IMPORTANCIA CLINICA
Perante a crescente incidência de infecções a fungos nos últimos anos,
essencialmente devida à utilização frequente de agentes antibacterianos
de aplicação tópica, antibióticos de largo espectro e técnicas invasivas
(cateteres, alimentação por via parentérica), os laboratórios de
microbiologia são cada vez mais solicitados para detectar a presença de
fungos em amostras patológicas.
Um diagnóstico rápido e preciso torna-se, por vezes, necessário, para dar início
ao tratamento apropriado, em especial no caso de indivíduos imunodeprimidos.
Fongiscreen® 4H, um sistema baseado no estudo do perfil enzimático,
vem satisfazer esta necessidade, visto ser capaz de identificar, no prazo
de 4 horas: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis,
fungos que representam cerca de 90% dos isolados, e Cryptococcus
neoformans. Este sistema permite ainda orientar o diagnóstico de outros
fungos cuja identificação será completada pela análise da utilização de
açúcar, com o dispositivo AUXACOLOR® 2 (ref. 56513).
2- PRINCIPIO DO TESTE
O teste baseia-se na utilização de substratos desidratados por enzimas
fúngicos pré-formados, o que resulta numa alteração de cor espontânea
ou mediante adição de um reagente de revelação.
NATUREZA DOS TESTES UTILIZADOS
• Meio TTZ
Este meio contém Trifeniltetrazólio (TTZ). A redução de TTZ resulta na formação
de uma coloração rosa mais ou menos intensa, consoante as espécies.
• Meio PAP
Este meio contém um substrato enzimático que permite a detecção da
actividade prolina aminopeptidase.
• Meio Ureia + Trealose (Ur./tre)
Este meio permite a detecção da actividade urease, reflectida pela
alcalinização do meio, com uma alteração da cor verde para azul no
indicador de pH (Azul de Bromotimol). O metabolismo da trealose resulta em
acidificação, com alteração de cor do indicador, de verde para amarelo.
• Meio BGL
Este meio contém um substrato enzimático: p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D52
Galactosaminide, que permite a demonstração da galactosaminidase.
Este teste é mais sensível do que o teste de tubo germinativo para
identificação de C. albicans (sensibilidade variável, de acordo com
diferentes autores).
• Meio AGL
Permite a detecção da actividade a-glucosidase.
• Meio HAP
Permite a detecção da actividade L-Histidina aminopeptidase.
Os testes BGL e AGL são realizados em meio acídico. A leitura do
resultado requer revelação, utilizando um reagente alcalino (reagente
BGL/AGL).
O teste HAP é lido após revelação com o reagente HAP.
O teste é lido após incubação durante 4 horas a 37°C sem CO2.
3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO
FONGISCREEN® 4H inclui:
• Microplate : 10 microplacas de 6 poços, em embalagem individual (o
diagrama da microplaca está indicado na etiqueta).
• Suspension medium : 10 meios de suspensão prontos a utilizar (1 ml).
• 1 frasco de reagente AGL/BGL (3 ml)
• 1 frasco de reagente HAP (2ml)
• 10 micropipetas
• 10 fitas adesivas
Cada microplaca é apresentada em embalagem individual, num saco de
alumínio hermeticamente fechado, com uma fita adesiva e um
dessecante.
DIAGRAMA DA MICROPLACA
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : .............................................................
date : ..................................................................
53
Precauções / Advertências e Instruções de segurança:
Este dispositivo contém reagentes perigosos.
• Frasco de 3 ml de reagente AGL/BGL contendo 4% de NaOH 1N.
R 34: Provoca queimaduras.
S 26-37/39-45: Em caso de contacto com os olhos, lavar
imediata e abundantemente com água e consultar um
especialista. Usar luvas e equipamento protector para os
C - Corrosivo
olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de
indisposição, consultar imediatamente um médico (se
possível, mostrar-lhe o rótulo).
• Frasco de 2 ml de reagente HAP contendo 66,5% de etanol a 95°.
R 11: Facilmente inflamável.
S 7-16: Manter o recipiente bem fechado. Manter afastado de qualquer
chama ou fonte de ignição – Não fumar.
4- ARMAZENAMENTO
Conservados à temperatura de +2 - 8°C, os reagentes
mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade
indicado na etiqueta (mesmo depois de abertos).
5- MATERIAL NECESSARIO NÃO FORNECIDO
...
....
....
...
• Opacity control 6 Mac Farland: código 56499
• Incubadora a 37°C
6- PROCEDIMENTO
A)INOCULAÇÃO DA MICROPLACA
54
meio de suspensão
100 µl ou 3 gotas
• Utilizar uma cultura pura e fresca em meio
Sabouraud, Sabouraud Cloramfenicol, e/ou
Gentamicina, com uma quantidade de fungos
suficiente para se obter uma opacidade superior à
do controlo de opacidade (Opacity control 6 Mac
Farland, código 56499): na prática, 4 a 5 arcos, se
possível.
• Importante: a opacidade da suspensão deverá
ser, pelo menos, igual à do controlo de opacidade
que define o nível mínimo de turvação.
TTZ
PAP
Ur/Tre.
BGL
AGL
HAP
• Homogeneizar a suspensão utilizando a micropipeta (ou vortex, se
necessário), aspirando e expelindo o conteúdo do frasco, várias
vezes.
• Recolher o inóculo com a micropipeta e distribuir 3 gotas (100 µl) em
cada um dos poços da microplaca.
• Cobrir a microplaca com fita adesiva e incubar durante 4 horas a
37°C.
B) LEITURA DOS RESULTADOS
• Retirar a fita adesiva.
• Ler os resultados de TTZ, PAP, Ureia/trealose.
• Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL nos poços de BGL e AGL.
- proceder imediatamente à leitura do teste BGL
- quanto ao teste AGL, a cor é revelada nos próximos 15 a 30
segundos.
• Adicionar 2 gotas de reagente HAP no poço HAP. A cor é revelada
nos próximos 15 a 30 segundos.
TABELA DE RESULTADOS
TESTES NEGATIVO
TTZ
INCOLOR
POSITIVO
PROCEDIMENTO
ROSA PÁLIDO ou
ROSA ESCURO,
consoante as espécies
LEITURA DIRECTA (sem adição de reagentes)
PAP
INCOLOR
AMARELO
UR./TRE
VERDE
AZUL (alcalinização)
ou AMARELO
(acidificação),
consoante as espécies
BGL
INCOLOR
AMARELO
Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL.
A cor surge imediatamente
(ou seja, leitura imediata).
AGL
INCOLOR
AMARELO
Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL.
A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos.
HAP
INCOLOR
AMARELO
Adicionar 2 gotas de reagente HAP.
A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos.
* A alteração de cor para azul (alcalinização do meio) está associada
ao metabolismo da ureia (estirpes Ureia(+), Trealose(+) ou (-); se uma
55
estirpe for simultaneamente Ureia(+) e Trealose(+), predomina a
alcalinização (alteração para azul). A alteração de cor para amarelo
(acidificação do meio) está associada ao metabolismo da Trealose
(estirpes Trealose(+), Ureia(-) ).
7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
• Comparar o perfil obtido com os perfis específicos (ver Tabela A); os
valores discrepantes são indicados a cheio.
• Se o perfil for diferente, proceder aos testes de PAP e ureia e reportarse aos parágrafos correspondentes.
a) Legendas
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
teste
teste
teste
teste
teste
positivo
negativo
variável
positivo em pelo menos 90% dos casos
negativo em pelo menos 90% dos casos
b) Perfis específicos
TABELA A
TTZ
+/-
PAP
UR./TRE
+ Verde ou Amarelo
BGL
AGL
+
+
HAP
+/-
Candida albicans
+
+(-)
Candida tropicalis
+
-
Amarelo (1)
-(+)(2)
+/-
-
Amarelo
-
-
+
Candida glabrata
+/-
-
Azul
-
+(-)
-
(1) Só um teste francamente positivo (amarelo) permite identificar
imediatamente Candida tropicalis.
No caso de um resultado duvidoso (cor esverdeada) ou de um resultado
negativo, a identidade da estirpe deverá ser confirmada (diagnóstico
diferencial com certas estirpes de AGL + Saccharomyces cerevisiae).
(2) Por vezes, pode observar-se uma descoloração para amarelo pálido.
56
c) Outros perfis
1- Amostras
PAP+
e
amarelo
Ureiaverde ou amarelo
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Verde ou Amarelo
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Verde ou Amarelo
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2- Amostras
PAP-
e
incolor
Espécies
Ureiaverde
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Observações
adicionais
Espécies
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
/
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
Aspecto seco
das colónias
Candida krusei
+/-
-
Verde
-
-
+(-)
Artrosporos
Espécies Geotrichum
+/-
-
Verde
-
+/-
+(-)
/
Candida inconspicua
Candida rugosa
Saccharomyces
cerevisae
57
3- Amostra
Ureia+
e
HAP+
azul
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
amarelo
AGL
HAP
Observações
Adicionais
cápsula
-
+/- +/-
Azul
+/-
+/-
+
{
+
-
-
pigment
-ação
-
+
-
Espécies
artros
-poros
-
Espécies
Crypto
-coccus
-
Espécies
Rhodo
-orula
+
Tricho
-sporon
cutaneum
Um teste positivo corresponde geralmente a uma coloração amarela nos
testes BGL e AGL; poderá observar-se uma coloração laranja ou rosa
com Trichosporon cutaneum, e é específica desta espécie.
Além disso, as colónias de T. cutaneum apresentam um aspecto filamentoso.
8- DESEMPENHOS
De acordo com os estudos realizados pelo Instituto Pasteur em Paris e pelo
Hospital Broussais em Paris, FONGISCREEN® 4H permite a identificação, em
quatro horas, de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. neoformans,
bem como a orientação do diagnóstico de outros fungos.
Um estudo clínico retrospectivo foi realizado num painel de 146 estirpes,
representando 23 espécies de fungos. FONGISCREEN® 4H permite
detectar 100% das estirpes de C. albicans (18 estirpes testadas),
C. glabrata (24 estirpes) e C. neoformans (11 estirpes) e 94% das
estirpes de C. tropicalis (18 estirpes testadas). Para estas 4 estirpes, a
especificidade do teste foi de 100%.
As outras espécies de fungos podem ser classificadas em 3 grupos, de
acordo com um perfil distintivo, mas não específico das espécies (para
99% das estirpes).
58
9- LIMITES DO METODO
• O teste BGL adquire, por vezes, uma coloração amarela muito clara
que se torna difícil de interpretar, em particular no caso da estirpe
C. tropicalis .
• Algumas estirpes raras de C. tropicalis Trealose (-) podem ser
erradamente identificadas como S. cerevisiae.
10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO
Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso
Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até à
comercialização final do produto. Cada lote é submetido a um controlo
de qualidade, sendo lançado no mercado apenas quando em
conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos
relativos à produção e controlo de cada lote são arquivados pela BioRad.
11- REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS
Veja a versão francesa.
59
60
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TEST
SNABB IDENTIFIERING AV HUVUDSAKLIGA
JÄSTSVAMPAR AV MEDICINSK BETYDELSE
IVD
1- KLINISK BETYDELSE
Mot bakgrund av den ökade förekomsten av svampinfektioner de senaste
åren, främst pga. den frekventa användningen av topiska antibakteriella
medel, antibiotika med brett spektrum samt invasiva tekniker (katetrar,
parenteral nutrition), ombeds allt oftare mikrobiologiska laboratorier att
söka efter jästsvampar i patologiska prover.
En snabb och precis diagnos är ibland nödvändig för att kunna påbörja
en lämplig behandling, särskilt hos patienter med nedsatt immunförsvar.
Fongiscreen® 4H, ett system baserat på studien av den enzymatiska
profilen, tillgodoser det här behovet då systemet inom 4 timmar kan
identifiera Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis,
jästsvampar som representerar cirka 90 % av isolaten och Cryptococcus
neoformans. Systemet är även till hjälp vid diagnos av andra
jästsvampar, vars identifiering slutförs genom att studera sockerintag med
AUXACOLOR® 2-kitet (kod 56513).
2- TESTPRINCIP
Testet är baserat på användningen av dehydrerade substrat av utförda
svampenzymer, vilket resulterar i en färgändring, spontant eller efter
tillsats av ett framkallningsreagens.
TYPER AV TEST SOM ANVÄNDS
• TTZ-medium
Detta medium innehåller trifenyltetrazolium (TTZ). Minskningen av TTZ
resulterar i bildandet av en mer eller mindre intensiv rosa färg, beroende
på proverna.
• PAP-medium
Detta medium innehåller ett enzymatiskt substrat som möjliggör detektion
av aktivitet hos prolin-aminopeptidas.
• Urea + Trehalos-medium (Ur./tre)
Detta medium möjliggör detektion av ureasaktivitet, reflekterat av
alkalisering av mediet med en färgändring från grönt till blått på pHindikatorn (bromtymolblått). Metabolismen av trehalos resulterar i
försurning med färgändring av indikatorn från grönt till gult.
• BGL-medium
Detta medium innehåller ett enzymatiskt substrat: p. nitrofenyl-N-acetyl-B62
D-galactosaminid, och möjliggör påvisande av galaktosaminidas. Testet
är mer sensitivt än germtube-testet för identifiering av C. albicans
(varierande sensitivitet enligt olika författare).
• AGL-medium
Detta medium möjliggör detektion av aktivitet hos a-glukosidas.
• HAP-medium
Detta medium möjliggör detektion av aktivitet hos L-histidinaminopeptidas.
BGL- och AGL-test utförs i ett surt medium. Avläsning av resultatet kräver
framkallning med hjälp av ett alkaliskt reagens (BGL-/AGL-reagens).
HAP-testet avläses efter framkallning med HAP-reagens.
Testet avläses efter inkubering i 4 timmar i 37 °C utan CO2.
3- TESTETS BESTÅNDSDELAR
FONGISCREEN® 4H omfattar:
• Microplate : 10 separat förpackade mikroplattor med vardera 6
brunnar (diagram för mikroplattan visas på etiketten).
• Suspension medium : 10 suspensionsmedel, färdiga att använda (1 ml)
• 1 vial med AGL/BGL-reagens (3 ml)
• 1 vial med HAP-reagens (2ml)
• 10 mikropipetter
• 10 självhäftande folier
Varje mikroplatta är separat förpackad i en försluten foliebelagd
aluminiumpåse med självhäftande folie och torkmedel.
DIAGRAM FÖR MIKROPLATTAN
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
63
Försiktighetsåtgärder/hälso- och säkerhetsinstruktioner:
Detta test innehåller farliga reagenser.
• Vial med 3 ml AGL/BGL-reagens innehållande 4 % NaOH 1N.
R 34: Frätende.
S 26-37/39-45: Vid kontakt med ögonen, spola genast med
mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga
C - Frätende skyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vid
olycksfall, illamående eller annan påverkan kontakta
omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten.
• Vial med 2 ml HAP-reagens innehållande 66,5 % 95-procentig etanol.
R 11: Mycket brandfarligt.
S 7-16: Förpackningen förvaras väl tillsluten. Förvaras åtskilt från
antändningskällor - Rökning förbjuden.
4- FÖRVARING
Reagenserna är stabila till angivet utgångsdatum på etiketten, om de
förvaras vid +2-8°C (gäller även öppnad förpackning).
5- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR
• Opacity control 6 Mac Farland: kod 56499
• Inkubator, 37°C
...
....
....
...
6- FÖRFARANDE
A) INOKULERING AV MIKROPLATTAN
64
suspensionsmedel
100 µl eller 3 droppar
• Använd en ren och färsk odling på Sabouraud,
Sabouraud kloramfenikol och/eller Gentamicinmedium med en tillräcklig kvantitet av jästsvampar
för att erhålla en opacitet större än
opacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland,
kod 56499): i praktiken 4 till 5 öglor om möjligt.
• Viktigt: opaciteten hos suspensionen måste vara
minst lika med opacitetkontrollen
• vilket definierar lägsta nivån av grumlighet.
• Homogenisera suspensionen med mikropipetten
(eller vortexa om det behövs) genom att suga upp
och tömma vialens innehåll upprepade gånger.
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
• Samla upp inokulatet med mikropipetten och fördela 3 droppar (100 µl)
i varje brunn på mikroplattan.
• Täck mikroplattan med självhäftande folie och inkubera i 4 timmar i 37 °C.
B) AVLÄSA RESULTATEN
• Ta bort den självhäftande folien.
• Läs resultaten för TTZ, PAP, Urea/trehalos.
• Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens i BGL- och AGL-brunnarna.
- BGL-testet avläses omedelbart
- hos AGL-testet utvecklas färgen under 15 till 30 sekunder.
• Tillsätt 2 droppar HAP-reagens till HAP-brunnen. Färgen utvecklas under
15 till 30 sekunder.
RESULTATTABELL
TEST
NEGATIVT
POSITIVT
TTZ
FÄRGLÖST
LJUST ROSA eller
MÖRK ROSA
beroende på proverna
FÖRFARANDE
DIREKT AVLÄSNING (utan tillsats av reagenser)
PAP
FÄRGLÖST
GULT
UR./TRE
GRÖNT
BLÅTT (alkalisering)
eller GULT
(försurning)
beroende på proverna
BGL
FÄRGLÖST
GULT
Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens.
Färgen visas omedelbart
(dvs. läs av omedelbart)
AGL
FÄRGLÖST
GULT
Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens.
Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder.
HAP
FÄRGLÖST
GULT
Tillsätt 2 droppar HAP-reagens.
Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder.
* Färgändringen till blått (alkalisering av mediet) är associerad med
metabolism av urea (urea(+), trehalos(+) eller (-)-stammar). Om en stam är
både urea(+) och trehalos(+) är alkalisering dominerande (ändring till
blått). Färgändringen till gult (försurning av mediet) är associerad med
metabolism av trehalos (trehalos(+), urea(-)-stammar.
65
7- UTVÄRDERING AV RESULTATEN
• Jämför den erhållna profilen med de specifika profilerna (tabell A). De
utmärkande punkterna anges med fetstil.
• Om profilen är annorlunda ska du ta hänsyn till PAP- och ureatesten
och referera till motsvarande avsnitt.
a) Teckenförklaring
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
positivt test
negativt test
variabelt test
positivt test i minst 90 % av fallen
negativt test i minst 90 % av fallen
b) Specifika profiler
TABELL A
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
+/-
+
+
-
+/+/-
HAP
Grönt eller gult
+
+
+/-
Candida albicans
Gult (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
-
Gult
-
-
+
Candida glabrata
-
Blått
-
+(-)
-
(1) Endast ett klart positivt test (gult) identifierar omedelbart Candida
tropicalis.
Vid ett tveksamt resultat (grönaktig färg) eller ett negativt resultat måste
stammens identitet bekräftas (differentialdiagnos med särkilda stammar av
AGL + Saccharomyces cerevisiae).
(2) En svagt gul missfärgning kan ibland observeras.
66
c) Övriga profiler
1-
PAP+
och
ureaprover
gult
grönt eller gult
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Grönt eller gult
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Grönt eller gult
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2-
PAP-
och
Prover
ureaprover
färglöst
grönt
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Övriga
observationer
+/-
-
Grönt
-
-
+(-)
/
+/-
-
Grönt
-
-
+(-)
Kolonier med
torrt utseende
+/-
-
Grönt
-
-
+(-)
Artrosporer
+/-
-
Grönt
-
+/-
+(-)
/
Prover
Candida inconspicua
Candida rugosa
Candida krusei
Geotrichum species
Saccharomyces
cerevisae
67
3-
Urea+
och
HAP+
blått
TTZ
PAP
UR./TRE
gult
BGL
AGL
HAP
Övriga
observationer
kapsel
-
+/- +/-
Blått
-prover
+/-
+/-
+
{
+
-
-
pigment
-aering
-
+
-
Prover
artros
-porer
-
Crypto
coccus
-prover
-
Rhodo
-orula
-prover
+
Tricho
sporon
cutaneum
Ett positivt test motsvarar vanligtvis en gul färg på BGL- och AGL-test. En
orange eller rosa färg kan observeras med Trichosporon cutaneum, och
är specifikt för dessa prover.
Vidare har kolonier av T. cutaneum ett trådlikt utseende.
8- TESTRESULTAT
Enligt studier från Pasteur Institut i Paris och Broussais-sjukhuset i Paris
möjliggör FONGISCREEN ® 4H identifiering inom fyra timmar av
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis och C. neoformans samt en
orientering av diagnosen för andra jästsvampar.
En retrospektiv klinisk studie har utförts på en panel bestående av 146
stammar som representerar 23 prover av jästsvampar. FONGISCREEN®
4H gör det möjligt att upptäcka 100 % av C. albicans (18 testade
stammar), C. albicans (24 stammar) och C. albicans (11 stammar) samt
94 % av C. albicans (18 testade stammar). För dessa fyra stammar var
specificiteten för testet 100 %.
Övriga jästprover kan klassificeras i tre grupper enligt en distinkt, dock ej
specifik, profil hos proverna (för 99 % av stammarna).
68
9- TESTETS BEGRÄNSNINGAR
• BGL-testet antar ibland en mycket ljust gul färg som är svårtolkad,
särskilt för C. tropicalis-stam.
• Vissa sällsynta stammar av C. tropicalis-trehalos (-) kan felaktigt
identifieras som S. cerevisiae
10- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL
Alla reagenser tillverkas och prepareras i enlighet med vårt
kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga
marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll
och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med
fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion
och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad.
11- REFERENSER
Se den franska versionen.
69
70
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESTS
HURTIG IDENTIFIKATION AF PRIMÆRE GÆRARTER
AF MEDICINSK VIGTIGHED
IVD
1- KLINISK VÆRDI
I betragtning af den øgede udbredelse af svampeinfektioner i løbet af de
seneste år, grundlæggende på grund af den hyppige brug af aktuelle
antibakterielle stoffer, bredspektrede antibiotika og invasive teknikker
(katetre, parenteral ernæring), bliver mikrobiologiske laboratorier stadigt
oftere bedt om at lede efter gærarter i patologiske prøver.
En hurtig og præcis diagnose er ofte nødvendig for at iværksætte den
rette behandling, især hos personer med nedsat immunforsvar.
Fongiscreen® 4H er et system, der er baseret på undersøgelsen af den
enzymatiske profil, og som opfylder dette behov, idet testen kan
idenficere følgende inden for 4 timer: Candida albicans, Candida
glabrata, Candida tropicalis, gærarter, der repræsenterer ca. 90 % af
isolaterne og Cryptococcus neoformans. Det styrer også diagnosen for
andre gærarter, hvis identifikation opnås ved at studere sukkerforbruget
med AUXACOLOR® 2-sættet (kode 56513).
2- ANALYSEPRINCIP
Testen er baseret på brugen af dehydrerede substrater ved hjælp af
præformede svampeenzymer, hvilket resulterer i en farveændring enten
spontant eller efter tilsætning af en afsløringsreagens.
KARAKTERISTIKA FOR DE ANVENDTE TESTS
• TTZ-medium
Dette medium indeholder Triphenyltetrazolium (TTZ). Reduktionen af TTZ resulterer
i dannelsen af en mere eller mindre lyserød farve, afhængigt af arterne.
• PAP-medium
Dette medium indeholder et enzymatisk substrat, der muliggør
konstatering af prolin aminopeptidase-aktivitet.
• Urea + Trehalose-medium (Ur./tre)
Dette medium muliggør konstatering af urea-aktivitet, som afspejles i
alkalinisering af mediet med en farveændring fra grøn til blå i pHindikatoren (Bromothymolblå). Metabolismen i trehalose resulterer i
syredannelse med en farveændring af indikatoren fra grøn til gul.
• BGL-medium
Dette medium indeholder et enzymatisk substrat: p. Nitrophenyl-N-AcetylB-D-Galactosaminid som muliggør påvisning af galactosaminidase.
72
Denne test er mere sensitiv end bakterierørtesten til identifikation af
C. albicans (variabel sensitivitet ifølge forskellige forfattere).
• AGL-medium
Det muliggør konstatering af a-glucosidaseaktivitet.
• HAP-medium
Det muliggør konstatering af L-Histidin aminopeptidaseaktivitet.
BGL- og AGL-testene udføres i et surt medium. Aflæsning af resultaterne
kræver afsløring ved hjælp af en alkalisk reagens (BGL/AGL-reagens).
HAP-testen aflæses efter afsløring med HAP-reagensen.
Testen aflæses efter inkbation i 4 timer ved 37°C uden CO2.
3- SÆTTETS SAMMENSÆTNING
FONGISCREEN® 4H indeholder:
• Microplate : 10 enkeltpakkede mikroplader med 6 brønde
(mikropladens diagram er angivet på etiketten).
• Suspension medium : 10 brugsklare suspensionsmidler (1 ml)
• 1 flaske AGL/BGL-reagens (3 ml)
• 1 flaske HAP-reagens (2 ml)
• 10 mikropipetter
• 10 selvklæbende film
Hver mikroplade er pakket for sig i en forseglet aluminiumspose med
selvklæbende film og tørremiddel.
MIKROPLADENS DIAGRAM
FONGISCREEN® 4H
TTZ
PAP
Ur./tre
BGL
AGL
HAP
Patient : ..............................................................
Date : .................................................................
73
Forholdsregler for brug/Sundheds- og sikkerhedsmæssige instruktioner:
Dette sæt indeholder farlige reagenser.
• 3 ml flaske med AGL/BGL-reagens, der indeholder 4% NaOH 1N.
R 34: Ætsningsfare.
S 26-37/39-45: Kommer stoffet i øjnene, skylles straks
grundigt med vand og læge kontaktes. Brug egnede
C - Ætsende beskyttelseshandsker og briller/ansigtsskærm under arbejdet.
Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående
lægebehandling nødvendig. Vis etiketten, hvis det er muligt.
• 2 ml flaske HAP-reagens, der indeholder 66,5 % 95° ethanol.
R 11: Meget brandfarlig.
S 7-16: Emballagen skal holdes tæt lukket. Holdes væk fra
antændingskilder – Rygning forbudt.
4- OPBEVARING
Reagenserne er stabile indtil udløbsdatoen på
etiketten, hvis de opbevares ved +2 – 8°C (også når
de har været åbnet en enkelt gang).
5- KRÆVET MATERIALE, DER IKKE
MEDFØLGER
...
....
....
...
• Opacity control 6 Mac Farland: kode 56499
• Inkubator ved 37°C
6- PROCEDURE
• Brug af en ren og frisk kultur på medierne
Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol og/eller
Gentamicin med en tilstrækkelig mængde gær til at
opnå en opacitet, der ligger over resultatet fra
opacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland,
kode 56499): i praksis 4 – 5 udstrygningsløkker,
hvis det er muligt.
• Vigtigt: suspensionens opacitet skal mindst svare til
resultatet i opacitetskontrollen, som definerer det
minimale niveau for turbiditeten.
74
suspensionsmidler
100 µl eller 3 dråber
A) INOKULATION AF MIKROPLADEN
TTZ
PAP
Ur/Tre.
BGL
AGL
HAP
• Homogenisér suspensionen ved hjælp af mikropipetten (eller bland den
i Vortex-mixeren, hvis det er nødvendigt) ved at suge indholdet af
flasken op og presse det ud flere gange.
• Indsaml podestoffet med mikropipetten og fordel 3 dråber (100 µl) i de
enkelte brønde på mikropladen.
• Tildæk mikropladen med selvklæbende film, og inkubér i 4 timer ved 37°C.
B) AFLÆSNING AF RESULTATERNE
• Fjern den selvklæbende film.
• Aflæs resultaterne for TTZ, PAP, Urea/trehalose.
• Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens i BGL- og AGL-brøndene.
- aflæs straks BGL-testen
- for AGL-testen udvikles farven i løbet af 15 – 30 sekunder.
• Tilsæt 2 dråber HAP-reagens i HAP-brønden. Farven udvikles i løbet af
15 – 30 sekunder.
TABEL OVER RESULTATER
TESTS
NEGATIV
POSITIV
TTZ
FARVELØS
LYSERØD eller
PINK, afhængigt
af arterne.
PROCEDURE
DIREKTE AFLÆSNING
(uden tilsætning af reagenser)
PAP
FARVELØS
GUL
UR./TRE
GRØN
BLÅ (alkalinisering)
eller GUL
(syredannelse),
afhængigt af arterne.
BGL
FARVELØS
GUL
Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens.
Farven vises straks
(dvs. aflæses straks).
AGL
FARVELØS
GUL
Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens.
Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder.
HAP
FARVELØS
GUL
Tilsæt 2 dråber HAP-reagens.
Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder.
* Når farven ændres til blå (alkalinisering af mediet), er det forbundet
med metabolismen i urea (stammerne Urea (+), Trehalose (+) eller (-)).
Hvis en stamme er både Urea (+) og Trehalose (+), er alkalinisering
fremherskende (ændring til blåt). Når farven ændres til gul (syredannelse
75
i mediet), er det forbundet med metabolismen i Trehalose (stammerne
Trehalose (+) og Urea (-)).
7- FORTOLKNING AF RESULTATERNE
• Sammenlign den opnåede profil med de specifikke profiler (jf. Tabel A).
De varierende karakteristiska er angivet med fed skrift.
• Hvis profilen er forskellig, skal du overveje PAP- og ureatests. Læs de
tilsvarende afsnit.
a) Forklaringer
+
+/+(-)
-(+)
:
:
:
:
:
positiv test
negativ test
variabel test
positiv test i mindst 90 % af tilfældene
negativ test i mindst 90 % af tilfældene
b) Specifikke profiler
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
+/-
+
+
-
+/+/-
HAP
Grøn eller gul
+
+
+/-
Candida albicans
Gul (1)
-(+)(2)
+
+(-)
Candida tropicalis
-
Gul
-
-
+
Candida glabrata
-
Blå
-
+(-)
-
(1) Kun en udelukkende positiv test (gul) identificerer straks Candida
tropicalis.
I tilfælde af et tvivlsomt resultat (grønlig farve) eller et negativt resultat,
skal stammens identitet bekræftes (forskellige diagnoser for bestemte
stammer af AGL + Saccharomyces cerevisiae).
(2) Af og til kan der observeres en lysegul affarvning.
76
c) Andre profiler
1-
PAP+
og
Urea-
gul
arter
grøn eller gul
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Grøn eller gul
-
+/-
+/-
Candida lusitaniae
Candida famata
+/-
+
Grøn eller gul
-
-
+/-
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2-
PAP-
og
Arter
Urea-
farveløs
arter
grøn
TTZ
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
Supplerende
observationer
Arter
+/-
-
Grøn
-
-
+(-)
/
+/-
-
Grøn
-
-
+(-)
Kolonierne
virker tørre
Candida krusei
+/-
-
Grøn
-
-
+(-)
Arthrosporer
Geotrichum-arter
+/-
-
Grøn
-
+/-
+(-)
/
Saccharomyces
cerevisae
Candida inconspicua
Candida rugosa
77
3-
Urea+
og
HAP+
blå
TTZ
PAP
UR./TRE
gul
BGL
AGL
HAP
Supplerende
observationer
kapsel
-formet
-
+/- +/-
Blå
-arter
+/-
+/-
+
{
+
-
-
pigment
-ering
-
+
-
Arter
arthros
-porer
-
Crypto
coccus
-arter
-
Rhodo
-orula
-arter
+
Tricho
-sporon
cutaneum
En positiv test svarer generelt til en gul farve ved BGL- og AGL-tests. Der
kan observeres en orange eller pink farve ved Trichosporon cutaneum,
hvilket kun gælder for disse arter.
Derudover kan kolonier af T. cutaneum have et filamentøst udseende.
8- YDEEVNE
Ifølge undersøgelser fra Pasteur Institut i Paris og Broussais-hospitalet i
Paris muliggør FONGISCREEN ® 4H identifikation på fire timer af
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis og C. neoformans og orientering
af diagnosen for andre gærarter.
Der blev udført en retrospektiv, klinisk undersøgelse på et panel af 146
stammer, som repræsenterede 23 gærarter. FONGISCREEN® 4H gør det
muligt at konstatere 100 % af stammerne for C. albicans (18 testede
stammer), C. glabrata (24 stammer) og C. neoformans (11 stammer) og
94 % af C. tropicalis-stammerne (18 testede stammer). For disse 4
stammer var testens specificitet 100 %.
Andre gærarter kan klassificeres i 3 grupper ifølge en særskilt, men ikke
specifik, profil for arterne (for 99 % af stammerne).
78
9- PROCEDURENS BEGRÆNSLINGER
• BGL-testen får af og til en meget lys gul farve, som er svær at fortolke,
især for C. tropicalis-stammen.
• Nogle sjældne stammer for C. tropicalis Trehalose (-) kan blive
identificeret forkert som S. cerevisiae.
10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL
Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem,
lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af
slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun,
hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation
vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for
virksomheden.
11- REFERENCER
Se den franske version.
79
80
81
FONGISCREEN® 4H
56504
10 TESZT
GYORSTESZT PATOGÉN ÉLESZTŐGOMBÁK AZONOSÍTÁSÁRA
1- KLINIKAI JELENTŐSÉG
A gombás fertőzések utóbbi években tapasztalható felszaporodására való tekintettel, amely
szükségképpen az éppen divatos antibakteriális szerek, széles spektrumú antibiotikumok és
invazív technikák (katéterek, parenteralis táplálás) gyakori használatával függ össze, a
mikrobiológiai laboratóriumoknak egyre gyakrabban kell élesztőkre vizsgálnia a klinikai
mintákat.
A gyors és pontos diagnózis olykor éppen azért szükséges, hogy meg lehessen kezdeni a
megfelelő kezelést, különösen akkor, ha immunszupprimált betegről van szó.
A Fongiscreen® 4H, egy, az enzimprofil vizsgálatára alapuló rendszer eleget tesz ennek a
követelménynek, mivel 4 órán belül képes identifikálni a Candida albicans-t, a Candida
glabrata-t, a Candida tropicalis-t, olyan élesztőket, amelyek az izolátumok nagyjából 90%-át
teszik ki, valamint a Cryptococcus neoformans-t. Egyéb élesztők diagnózisát is elősegíti,
amelyek identifikálásához még cukorhasznosítást is kell vizsgálni AUXACOLOR® 2 kittel
(kódszám 56513).
2- A TESZT ALAPELVE
A teszt dehidrált szubsztrátok prerformált gombaenzimekkel történő bontásán alapul, ami
vagy spontán, vagy valamely előhívó anyaggal történő kezelés után színváltozást okoz.
A TESZT ÖSSZETEVŐI
•
TTZ közeg
Ez a közeg trifenil-tetrazóliumot (TTZ) tartalmaz. A TTZ redukálása erősebb vagy gyengébb
rózsaszínt eredményez, a kérdéses fajtól függően.
•
PAP közeg
Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, s detektálható vele a prolin-aminopeptidáz aktivitás.
•
Urea + trehalóz közeg (Ur./tre)
Ezzel a közeggel detektálható az ureáz aktivitás. A közeg lúgossá válik, s a pH-indikátor
(brómtimolkék) zöldből kékbe csap át. A trehalóz átalakulása savasodást okoz, s az indikátor
zöldből sárga színűre vált át.
•
BGL közeg
Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, a p-nitrofenil-N-acetil-B-D-galaktózaminidot,
amellyel kimutatható a galaktózaminidáz. Ez a teszt érzékenyebb, mint a C.albicans
identifikálására használt csíratömlő teszt (amelynek a különböző szerzők szerint változó az
érzékenysége).
•
AGL közeg
Ezzel kimutatható az -glükozidáz aktivitás.
•
HAP közeg
Ezzel kimutatható az L-hisztidin-aminopeptidáz aktivitás.
A BGL és az AGL tesztet savas közegben végezzük. Az eredmény leolvasásához lúgos
előhívószert kell használnunk (BGL/AGL reagens).
A HAP tesztet a HAP reagenssel történő előhívás után olvassuk le.
A tesztet 4 órán át tartó, 37°C-os, CO2.-mentes atmoszférában végzett inkubálás után
olvassuk le.
3- A KIT ÖSSZETÉTELE
A FONGISCREEN® 4H az alábbiakat tartalmazza:
• 10 külön-külön csomagolt, 6-tesztlyukas mikrolemez (a mikrolemez kiosztása a címkén
látható).
• 10 felhasználásra kész szuszpendáló közeg (1 ml)
• 1 fiola AGL/BGL reagens (3 ml)
• 1 fiola HAP reagens (2ml)
• 10 mikropipetta
• 10 öntapadó fólia.
Mindegyik mikrolemeznek önálló csomagolása van a hegesztett alufólia csomagoláson belül,
saját öntapadó fóliával, és nedvszívóval.
A MIKROLEMEZ KIOSZTÁSA
Kezelési és munkavédelmi előírások:
A kit veszélyes reagenseket tartalmaz.
• A 3 ml-es, AGL/BGL reagenst tartalmazó fiola 66,5%-ban 95°-os etanolt
tartalmaz.
R 34 : Égési sérüléseket okoz.
S 26-37/39-45 : Ha szembe kerül, azonnal mossuk ki bő vízzel, és forduljunk
orvoshoz. Viseljünk megfelelő védőkesztyűt, védőszemüveget vagy arcmaszkot. Balesetkor,
vagy ha rosszul érezzük magunkat, azonnal forduljunk orvoshoz (ha lehetséges, mutassuk fel
az anyag címkéjét).
•
A 2 ml-es, HAP reagenst tartalmazó fiola 4%-ban 1N nátrium-hidroxidot tartalmaz.
R 11 : Erősen tűzveszélyes.
S 7-16 : Tartsuk szorosan lezárva az edényt. Tartsuk távol tüzet
veszélyforrásoktól. Tilos a dohányzás.
okozó
4- TÁROLÁS
A +2 - 8°C között tárolt reagensek a címként feltüntetett szavatossági ideig stabilak (felbontás
után is).
5- A VIZSGÁLATHOZ SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK
•
•
1 MacFarland egységnek megfelelő denzitású standard: kódszám 56499
37°C-os inkubátor
6- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ
A) A MIKROLEMEZ BEOLTÁSA
•
Egy Sabouraud, chloramphenicolos és/vagy gentamicines Sabouraud
táptalajon tenyésztett tiszta, friss kultúrából vegyünk elegendő mennyiségű
élesztőt, hogy a denzitási kontrollnál (kódszám 56499) nagyobb denzitású
szuszpenziót kapjunk. A gyakorlatban ez legyen 4 - 5 kacsnyi, ha
lehetséges. Fontos: a szuszpenzió denzitása legyen legalább akkora,
mint a kontrollé, amely a minimális turbiditást adja meg.
•
Egy mikropipettával (vagy vortex keverővel, ha szükséges) homogenizáljuk a
szuszpenziót
a
fiola
tartalmának
többszöri
fölszívásával
és
visszaengedésével.
•
Mikropipettával szívjuk fel az inokulumot, és 3-3 cseppnyit (100 µl) mérjünk
be a mikrolemez mindegyik tesztlyukába.
•
Öntapadó fóliával fedjük le a mikrolemezt, és inkubáljuk 4 órán át, 37°C-on.
B) AZ EREDMÉNYEK LEOLVASÁSA
•
Vegyük le az öntapadó fóliát.
•
Olvassuk le a TTZ, PAP, Urea/trehalóz eredményeket.
•
Adjunk 2 cseppnyi BGL/AGL reagenst a BGL és AGL tesztlyukakhoz.
- a BGL tesztet azonnal olvassuk le,
- az AGL teszt esetében 15 -- 30 másodpercet kell várni a szín
kifejlődéséig.
•
Adjunk 2 cseppnyi HAP reagenst a HAP tesztlyukhoz. A szín 15 -- 30 másodperc múlva
fejlődik ki.
EREDMÉNYTÁBLÁZAT
TESZTEK
NEGATÍV
TTZ
SZÍNTELEN
PAP
SZÍNTELEN
ÚR./TRE
ZÖLD
BGL
SZÍNTELEN
AGL
SZÍNTELEN
HAP
SZÍNTELEN
POZITÍV
ELJÁRÁS
HALVÁNY RÓZSASZÍN, vagy
SÖTÉT RÓZSASZÍN, a speciestől
függően
KÖZVETLEN LEOLVASÁS
SÁRGA
(reagens hozzáadása nélkül)
KÉK (lúgosodás) vagy SÁRGA
(savasodás), a speciestől
függően(*)
Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst.
SÁRGA
A szín azonnal megjelenik (vagyis azonnal
leolvasható)
Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst.
SÁRGA
A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg.
Adjunk hozzá 2 csepp HAP reagenst.
SÁRGA
A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg.
* Az átcsapás kékbe (a közeg lúgosodása) a karbamid átalakításával függ össze (Urea(+),
Trehalóz(+) vagy (-) törzsek); ha egy törzs egyszerre Urea(+) és Trehalóz(+), akkor a
lúgosodás dominál (átcsapás kékbe). Az átcsapás sárgába (a közeg savasodása) a trehalóz
átalakításával függ össze (Trehalóz(+), Urea(-) törzsek).
7- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE
•
•
Hasonlítsuk össze a kapott profilt a specifikus profilokkal (l. A táblázat); a
megkülönböztető tulajdonságokat félkövér betűkkel szedtük
Ha a profil ettől különbözik, akkor vizsgáljuk meg a PAP és urea tesztet, és nézzük át a
megfelelő bekezdéseket.
a) Jelmagyarázat
+ : pozitív teszt
- : negatív teszt
+/- : változó teszt
+(-) : pozitív teszt az esetek legalább 90%-ában
-(+) : negatív teszt az esetek legalább 90%-ában
b) Specifikus profilok
A TÁBLÁZAT
TTZ
+/+
+/+/-
PAP
+
-
UR./TRE
Zöld vagy sárga
Sárga (1)
Sárga
Kék
BGL
+
- (+) (2)
-
AGL
+
+
+(-)
HAP
+/(-)
+
-
Species
Candida albicans
Candida tropicalis
Candida glabrata
(1) Csak egyértelműen pozitív teszt (határozott sárga szín) identifikálja azonnal a Candida
tropicalis-t.
Ha kétséges az eredmény (zöldes szín), vagy negatív, akkor a törzs azonosságát konfirmálni
kell (differenciáldiagnózis AGL + Saccharomyces cerevisiae egyes törzseivel).
(2) Halványsárga elszíneződést is meg lehet olykor figyelni.
c) Egyéb profilok
1-
PAP+
és
sárga
TTZ
Urea-
fajok
zöld vagy sárga
PAP
UR./TRE
BGL
AGL
HAP
+/-
+
Zöld vagy sárga
-
+/-
+/-
+/-
+
Zöld vagy sárga
-
-
+/-
Species
Candida lusitaniae
Candida famata
Candida zeylanoides
Candida inconspicua
2-
PAP- és
Urea- faj
színtelen
zöld
TTZ
+/-
PAP
-
UR./TRE
Zöld
BGL
-
AGL
-
HAP
+(-)
+/+/+/-
-
Zöld
Zöld
Zöld
-
+/-
+(-)
+(-)
+(-)
3-
TTZ
Urea+ és
HAP+
kék
sárga
PAP
UR./TRE
BGL
faj
AGL
HAP
+/-
+/-
Kék
+/-
További megfigyelések
Species
/
Candida inconspicua
Candida rugosa
Száraz kinézetű telepek Candida krusei
Arthrospórák
Geotrichum spp
/
Saccharomyces
cerevisae
+/-
+
További megfigyelések
Species
tok
pigmentáció
arthrospórák
+
-
-
Cryptococcus spp
-
+
-
Rhodoorula spp
-
-
+
Trichosporon cutaneum
A pozitív eredmény általában azt jelenti, hogy sárga színt kapunk a BGL és az AGL tesztben,
narancssárga vagy rózsaszín figyelhető meg a Trichosporon cutaneum-nál, és ez specifikus
erre a fajra.
Ráadásul a T.cutaneum telepeinek fonalas a szerkezetük.
8- MINŐSÉG
A párizsi Pasteur Intézet és a Broussais kórház vizsgálatai szerint a FONGISCREEN® 4H-val
négy óra alatt identifikálható a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és a C. neoformans, és
egyéb élesztőkre nézve is tájékoztató adatokat nyerhetünk ennyi idő alatt.
Egy 146 törzsből álló, 23 élesztő speciest reprezentáló panelen retrospektív klinikai
vizsgálatot végeztek. A FONGISCREEN® 4H-val ki lehet mutatni az összes C. albicans
törzset (18 vizsgált törzs), az összes C. glabrata-t (24 törzs), és az összes C. neoformans-t
(11 törzs), valamint a C. tropicalis törzsek 94%-át (18 vizsgált törzs). E négy törzsre nézve
100%-os volt a teszt specificitása.
A többi élesztőfajt 3 csoportba sorolhatjuk egy jól megkülönböztethető, de nem specifikus
species profil szerint (ez a törzsek 99%-ára érvényes).
9- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI
•
•
A BGL teszt olykor nagyon halvány sárga színt produkál, amely nehezen értelmezhető,
különösen a C. tropicalis törzs esetében.
A C. tropicalis egyes, ritkán előforduló törzseinél a Trehalose (-) eredményt tévesen, S.
cerevisiae–ként lehet identifikálni.
10- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS
Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag
átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét
ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított
kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a
Bio-Radnál.
11- HIVATKOZÁSOK
1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance. Manual of Clinical
Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-541
2. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of the most frequent
clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-89
3. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and yeast-like organisms
identification methods accessible to a clinical microbiology laboratory. (soumis à Clin.
Microbiol. Rev.)
4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P. KERVROEDAN, P.
AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT. Identification rapide de Candida albicans,
Candida tropicalis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H.
Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106.
5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier, Paris. 1996.
6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337, p.384. Abstr 86th
Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. American Society for Microbiology. Washington
D.C.
7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT. 1991. Abstr.1233,
p.105 - 5th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases/Oslo
8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profil enzymatique de
levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2,
p. 227-230.
9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profil enzymatique de
quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989, XVIII, N°1, p. 103-108.
- CE jelzés
(Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről)
- Csak in vitro
diagnosztikai felhasználásra!
- Katalógusszám
- Gyártó
- Meghatalmazott Képviselet
- Gyártási szám
- Szavatossági idő
- Tárolási hőmérsékleti határok
- Lásd a használati utasítást
A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi
képviseleteinél megtalálható.
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
EC REP
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
- Temperatura limite
- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegränsning
- Temperaturbegrænsning
82
REF
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expiração AAAA/MM/DD
- Utgångsdatum År/Månad/Dag
- Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
i
- Consult Instruction for use
- Consulter le mode d'emploi
- Consulte la instrucción para el uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consultare le istruzioni per uso
- Consulte o folheto informativo
- Se instruktionsanvisning vid användning
- Se instruktion før brug
The other languages which are required in conformity to the European
Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.
Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles
auprès de votre représentant Bio-Rad local.
Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva
Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.
Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD
Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad
Niederlassung.
Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee
possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.
As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva
Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima
de si.
Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din
lokala Bio-Rad-representant.
De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved
henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.
83
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
84
10/2003
code: 8xxxxxx

fongiscreen® 4h 56504

Transcription

Documents pareils

beech five (rnav)

Guide de Conversation (coréen)

Dance and Sing - Edition Peters

720 Happy Birthday/Joyeux an.

IHDENT® Dentatrend® orange Schnelldesinfektion

Notes - BD Molecular Diagnostics