EFFICACITE DU DICHLOROMETHYLENE BIPHOSPHONATE

EFFICACITE DU DICHLOROMETHYLENE BIPHOSPHONATE (Cl2MBP) POUR LA DEPLETION
FONCTIONNELLE EN MACROPHAGE IN VIVO CHEZ LE POULET
Quéré Pascale1, Rivas Christelle1, van Rooijen Nico2
1
INRA, BioAgresseurs, Santé et Environnement, 37380 Nouzilly,
Department of Cell Biology and Immunology, Faculty of Medecine, Vrije Universiteit, Amsterdam, Pays-Bas.
2
Résumé
L’objectif de cette étude est de déterminer si le traitement par le dichloromethylène biphosphonate (Cl2MBP),
encapsulé dans des liposomes (Lip/ Cl2MBP) déplète efficacement les macrophages chez le poulet. Trois jours
après l’injection intraveineuse de Lip/ Cl2MBP, la réponse proliférative des lymphocytes aux mitogènes T in
vitro est fortement réduite dans la rate. La production de NO (monoxyde d’azote) par les macrophages de la rate,
spontanée ou inductible par l’interféron-γ, diminue. Néanmoins, la capacité des monocytes à produire du NO in
vitro n’est pas modifiée. En parallèle, la capacité globale de l’organisme à produire du NO dans le sang, mesurée
par le taux de nitrates sériques après injection de lipopolysaccharide (LPS), s’avère réduite de moitié de 3 à 9
jours après le traitement. Le traitement intraveineux par les Lip/ Cl2MBP augmente, par contre, la réponse
systémique en anticorps contre un antigène thymo-dépendant. En conclusion, les Lip/ Cl2MBP injectés par voie
intraveineuse chez le poulet sont capables d’affecter transitoirement les macrophages et leur fonction, au niveau
de la rate essentiellement, et d’inhiber la réponse effectrice en NO. NO étant une molécule inhibant la réplication
de nombreux virus, cette méthode de déplétion en macrophages in vivo présente un intérêt pour définir le rôle du
NO et du macrophage dans certaines affections virales chez le poulet.
Introduction
L’élimination des virus par l’hôte dépend des
mécanismes d’immunité innée et acquise. Les
effecteurs non-spécifiques tels que interférons,
cellules NK, monocytes du sang et macrophages
tissulaires limitent la réplication virale durant la phase
précoce d’infection avant la génération de la réponse
immune spécifique des antigènes (anticorps et
lymphocytes T cytotoxiques). Les macrophages sont
des cellules multifonctionnelles qui ont en particulier
un rôle clef dans l’orchestration des réponses
immunes innées et spécifiques. Outre leur rôle
important dans le processus de l’inflammation et
comme cellules phagocytaires éliminant les agents
infectieux, les macrophages stimulent l’activité
antivirale des cellules NK et les lymphocytes T via la
sécrétion de cytokines et de chimiokines.
La déplétion sélective des macrophages in vivo est
une approche employée pour étudier leurs divers
rôles. Chez le poulet, comme chez la souris,
l’injection de différents composés a été employée
comme la silice, le bleu de trypan, les carraghénanes
et les sérums anti-macrophage. Néanmoins, certains
composés peuvent affecter d’autres cellules, en
particulier les lymphocytes, et donc les effets de ces
traitements ne seraient pas dus à la seule action sur le
macrophage. De plus, ces composés peuvent n’avoir
qu’une action variable, n’affectant que certaines
fonctions du macrophage (Wirth et al., 1980 ; Kagan
and Hartman, 1984 ; Pinto et al., 1989). Van Rooijen
et collègues (1989) ont donc développé une nouvelle
stratégie de déplétion des macrophages, plus
spécifique et plus efficace, reposant sur la
phagocytose ciblée d’un composé toxique pour le
macrophage (le dichlorométhylène biphosphonate,
Cl2MBP) car encapsulé dans des liposomes (van
Rooijen et Sanders, 1994).
L’injection intraveineuse de liposomes contenant du
Cl2MBP élimine physiquement de façon efficace les
macrophages de la rate et du foie. Néanmoins, la
suppression est transitoire. En particulier au niveau de
la rate, différentes catégories de macrophages sont
affectées avec un temps de repopulation différent
après le traitement selon la sous-population
considérée (van Rooijen et al., 1989). L’objectif de
cette étude est d’évaluer, chez le poulet, la capacité
d’un traitement intraveineux par les liposomes
contenant du Cl2MBP à dépléter la fonction
macrophagique au niveau de la rate et à affecter les
réponses immunes.
1. Matériels et méthodes
1.1. Animaux
Les poulets Leghorn blancs (SPF) des lignées
histocompatibles B13/B13 et B21/B21, respectivement
très sensibles et résistants à la maladie de Marek, sont
utilisés à l’âge de 4-6 semaines.
1.2. Schéma expérimental
Les poulets sont répartis en deux lots de 10-12, l’un
traité par les liposomes contenant du Cl2MBP (Lip/
Cl2MBP) (0.3 ml/poulet) et l’autre par des liposomes
(Lip). L’effet du traitement sur la fonction
Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003
macrophagique est testé 3 et 9 jours après (5-6 poulets
par lot et par jour).
1.3. Préparation des cellules de rate
Les rates sont broyées sur une grille métallique. Les
suspensions cellulaires sont centrifugées à 400g pour
éliminer les érythrocytes (Djeraba et Quéré, 2000).
1.4. Mesure de la production de monoxyde d’azote
(NO)
La production de NO par les splénocytes est mesurée
par la quantité de nitrites (NO2-) produits dans le
milieu de culture. Les splénocytes sont stimulés par
de l’IFN-γ de poulet (50 U/ml) ou de la PHA
(Phytohémagglutinine : 10 µg/ml) pendant 48h
(Djeraba et Quéré, 2000). La mesure des nitrates
(NO3-) sériques est effectuée avant et 5h après
injection du stimulant LPS (Lipopolysaccharide). Les
nitrates sont réduits en nitrites par du cadmium
(Djeraba et Quéré, 2000). Les nitrites sont dosés par
la méthode de Griess.
1.5. Mesure
de la réponse proliférative aux
mitogènes T
Les splénocytes sont stimulés avec les mitogènes
Concanavaline A (Con A : 2,5 et 5 µg/ml) ou PHA (5
et 20 µg/ml) pendant 48h. La prolifération
lymphocytaire est quantifiée par l’incorporation de
thymidine tritiée (Djeraba et Quéré, 2000).
1.6. Mesure de la réponse spécifique anti-KLH
Les poulets sont immunisés par injection
intraveineuse de KLH (Keyhole limpet hemocyanin :
100 µg/poulet). Le sérum et la rate sont prélevés 7
jours après. Les anticorps (IgM et IgG) spécifiques
anti-KLH sont dosés dans le sérum par ELISA (Quéré
et Girard, 1999). La prolifération spécifique anti-KLH
des lymphocytes de rate est mesurée par incorporation
de thymidine tritiée 4 jours après restimulation in
vitro (5 µg/ml) (Quéré et Girard, 1999).
1.7. Analyse statistique
Les résultats sont exprimés par la moyenne des
valeurs (écart type de la valeur). L’analyse de
variance et la comparaison des moyennes sont
effectuées par un test non-paramétrique (Simstat, N.
Peladeau, Provalis Research, Canada).
2. Résultats
NO est une molécule qui a de puissantes propriétés
antivirale et antitumorale (Liew et Cox, 1991). NO est
produit en grande quantité par le macrophage à partir
de la L-arginine sous l’action de l’enzyme NO
synthase activée par des stimuli comme LPS et l’
IFN-γ (Xie et Nathan, 1994). NO a un temps de demivie très bref : il est immédiatement transformé en
nitrites dans le surnageant de culture et en nitrates
dans le sérum. Le taux de nitrates sériques après
activation par le LPS permet d’évaluer la réponse
systémique en NO reflétant la capacité globale
d’activation des macrophages (Smith et al., 1997). La
rate et le foie sont les organes impliqués
majoritairement dans cette production de NO
(Salkowski et al., 1997). Nous avons observé une
forte réduction, mais incomplète (de moitié), de la
quantité de nitrates sériques en réponse au LPS 3 et 9
jours après le traitement par le Cl2MBP à la fois pour
les poulets B13/B13 et B21/B21 (Tableau 1), comme
chez la souris (Salkowski et al., 1997). Au niveau de
la rate, la production de nitrites par les macrophages,
spontanée ou en réponse à l’IFN-γ, apparaît
significativement réduite au 3ème jour post-traitement
(Tableau 2). Par contre, la capacité de production en
NO est récupérée au 9ème jour post-traitement.
En parallèle dans la rate, la réponse aux mitogènes T,
comme la PHA pour les poulets B13/B13 et la Con A
pour les poulets B21/B21, est drastiquement réduite au
3ème jour post-traitement, mais retourne aussi à la
normale au 9ème jour post-traitement (Tableau 3). La
réponse aux mitogènes T est en effet dépendante de la
présence des macrophages en culture, qui produisent
des cytokines.
Par contre, la réponse spécifique en anticorps, IgM et
IgG, dans le sérum après immunisation par un
antigène thymo-dépendant,
apparaît augmentée
significativement (Tableau 4). Ceci avait déjà été
observé par Jeurissen et al. (1998), chez le poulet,
après traitement par le Cl2MBP. La réponse
proliférative des lymphocytes de rate en réponse à
l’antigène immunisant KLH reste fortement inférieure
chez les poulets traités par les liposomes contenant du
Cl2MBP comparativement à ceux traités par les
liposomes seuls 3 et 9 jours post-traitement. Ce défaut
de prolifération pourrait être le résultat d’un défaut de
présentation de l’antigène en culture lors de la
restimulation in vitro du fait d’un déficit numérique
en macrophages, alors que les lymphocytes
répondants sont bien présents.
Conclusion
Le traitement intraveineux par les liposomes
contenant le Cl2MBP apparaît efficace chez le poulet
pour dépléter majoritairement les macrophages de la
rate. Jeurissen et al. (1998) avait observé une
disparition physique des macrophages spléniques dès
48h post-traitement avec un début de repopulation dès
la première semaine post-traitement. Nos résultats
montrent que cette disparition des macrophages
s’accompagne
fonctionnellement d’un défaut
drastique de production de NO in vivo et in vitro,
accompagnée d’un défaut in vitro de stimulation dans
la réponse aux mitogènes ou de présentation de
l’antigène. Elle est transitoire, le défaut étant
maximum au 3ème jour post-traitement. Cette méthode
de déplétion en macrophages in vivo pourrait donc
présenter un intérêt pour définir le rôle du NO et du
macrophage dans certaines affections virales chez le
poulet.
Références bibliographiques
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A.,
Quéré
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Xie Q., Nathan C., 1994. J. Leukoc. Biol., 56,
TABLEAU 1 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la production de nitrates sériques
Lip/Cl2MBP
Lip
13
13
Poulets B /B
J+3
J+9
Poulets B21/B21
J+3
J+9
0
LPS
0
LPS
15,2 (± 1,7)
286,1 (± 16,1)
11,2 (± 1,1)
269,7 (± 31,3)
0
LPS
0
LPS
9,2 (± 0,7)
138,5 (± 10,7)
9,3 (± 0,9)
147,0 (± 12,5)
NO3-+NO2- (µM)
14,6 (± 2,7)
207,8 (± 19,1)∗∗
20,1 (± 3,0)∗∗
143,2 (± 19,8)∗∗
6,0 (± 0,2)∗∗
75,2 (± 5,9)∗∗
8,2 (± 0,9)
75,4 (± 7,9)∗∗
3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls (Lip), le taux de nitrate
sérique est mesuré avant et 5 heures après injection intraveineuse de LPS (5 à 6 poulets par lot). Les différences
significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).
TABLEAU 2 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la production de NO par les monocytes et
splénocytes
Traitement
13
13
Monocytes B /B
J+3
J+9
Splénocytes B13/B13
J+3
J+9
Lip/Cl2MBP
Lip
0
IFN-γ
LPS
0
IFN-γ
LPS
2,7 (± 0,7)
20,9 (± 3,5)
4,8 (± 0,5)
3,0 (± 0,5)
39,6 (± 4,2)
4,4 (± 0,8)
0
IFN-γ
PHA
0
IFN-γ
PHA
5,2 (± 1,1)
14,3 (± 1,7)
12,0 (± 1,2)
3,4 (± 2,2)
12,7 (± 1,6)
9,2 (± 1,4)
NO2- (µM)
4,5 (± 0,7)
24,2 (± 4,3)
5,4 (± 1,2)
2,6 (± 0,5)
33,6 (± 8,2)
3,1 (± 0,5)
2,5 (± 0,9)
8,22 (± 1,1)∗
5,6 (± 0,5)∗∗
8,5 (± 0,9)∗
12,4 (± 1,4)
11,3 (± 1,3)
3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes
seuls (Lip) (5 à 6 poulets par lot), les leucocytes du sang et de la rate sont mis en culture, puis stimulés pendant 48 heures
avec de l’IFN-γ (SnREV, 50 U/ml) ou du mitogène PHA (10 µg/ml). La production de nitrite (NO2-) est mesurée par la
réaction de Griess. Les différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).
TABLEAU 3 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la prolifération lymphocytaire
induite par les mitogènes T
Traitement (µg/ml)
Lip/Cl2MBP
Lip
Incorporation de thymidine-H3 (CPM +/-SEM)
splenocytes B13/B13
J+3
J+9
splenocytes B21/B21
J+3
J+9
0
PHA 5
PHA 20
677 (± 120)
12062 (± 1801)
102822 (± 7628)
392 (± 29)∗
5573 (± 459)∗∗
58704 (± 4241)∗∗
0
PHA 5
PHA 20
784 (± 111)
24996 (± 4801)
128210 (± 12197)
568 (± 94)
24634 (± 6483)
129479 (± 20200)
0
PHA 5
PHA 20
Con A 2
Con A 5
125 (± 11)
5052 (± 492)
25868 (± 2513)
16140 (± 5674)
68220 (± 11340)
132 (± 3)
4293 (± 1159)
20745(± 4267)
1669 (± 901)∗
18829 (± 4267)∗∗
0
PHA 5
PHA 20
Con A 2
Con A 5
257 (± 48)
4895 (± 975)
33686 (± 5935)
15004 (± 62064)
68025 (± 16064)
154 (± 10)
4095 (± 595)
39470 (± 6418)
20478 (± 8209)
81127 (± 14692)
3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls
(Lip) (5 à 6 poulets par lot), les leucocytes de la rate sont mis en culture, puis stimulés pendant 48 heures avec les
mitogènes PHA ou Con A. La prolifération lymphocytaire est mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée. Les
différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).
TABLEAU 4 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la réponse immune spécifique contre un antigène
T-dépendant (KLH)
Lip/Cl2MBP
Lip
DO
Réponse sérique en anticorps anti-KLH
J+3
J+9
IgM (1 :80)
IgG (1 :2560)
IgM (1 :80)
IgG (1 :2560)
Réponse proliférative splénique anti-KLH
J+3
J+9
0
+ KLH
0
+ KLH
0,578 (± 0,076)
0,434 (± 0,110)
0,698 (± 0,056)
0,925 (± 0,140)
0,601 (± 0,079)
0,629 (± 0,165)∗
0,842 (± 0,110)
1,548 (± 0,133)∗∗
Incorporation de thymidine-H3 (CPM +/-SEM)
480 (± 99)
34234 (± 5385)
564 (± 54)
18487 (± 5612)
338 (± 86)
15432 (± 3689)∗∗
290 (± 72)∗
9586 (± 4386)∗
3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls
(Lip) (5 à 6 poulets par lot), l’antigène KLH (100 µg/poulet) est injecté par voie intraveineuse. Le sérum et la rate sont prélevés
7 jours après. Les anticorps spécifiques anti-KLH sont mesurés par ELISA (IgG, phosphatase ; IgM, peroxydase). Les résultats
sont exprimés en densité optique (DO). Les leucocytes de la rate sont mis en culture et stimulés pendant 4 jours avec KLH. La
prolifération lymphocytaire anti-KLH est mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée. Les différences significatives sont
indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).