ROYAUME DU MAROC

Transcription

ROYAUME DU MAROC

UNIVERSITE MOHAMMED V
FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE -RABAT-
ANNEE: 2008
THESE N°: 70
Role du laboratoire dans le diagnostic
d’un cas humain de grippe aviaire a/h5n1
THESE
Présentée et soutenue publiquement le :………………………..
PAR
Mlle. Loubna ELATOUANI
Née le : 09 Octobre 1980 à Casablanca
Pour l'Obtention du Doctorat en Pharmacie
MOTS CLES: Grippe aviaire A/H5N1 – Risque pandémique – Diagnostic virologique moléculaire
(RT-PCR en temps réel) et conventionnel .
JURY
Mr. M. ZOUHDI
Professeur de Microbiologie
Mr. I. LAHLOU AMINE
Professeur Agrégé de Microbiologie
Mr. J. TAOUFIK
Professeur de Chimie Thérapeutique
Mr. S. MRANI
Professeur Agrégé de Virologie
Mr. H. HARMOUCHE
Professeur Agrégé de Médecine Interne
PRESIDENT
RAPPORTEUR
JUGES
‫«‬
‫سبحاًك ال علن لٌا إال ها علوتٌا‬
‫إًك أًت العلين الحكين‬
‫‪‬‬
‫سىرة البقرة‪ :‬اآليت‪13 :‬‬
‫اللهن إًا ًسألك علوا ًافعا وقلبا خاشعا‬
‫وشفاءا هي كل داء وسقن‬
UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI
FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE - RABAT
DOYENS HONORAIRES :
1962 – 1969
1969 – 1974
1974 – 1981
1981 – 1989
1989 – 1997
1997 – 2003
:
:
:
:
:
:
Docteur Ahdelmalek FARAJ
Professeur Abdellatif BERBICH
Professeur Bachir LAZRAK
Professeur Taieb CHKILI
Professeur Mohamed Tahar ALAOUI
Professeur Abdelmajid BELMAHI
ADMINISTRATION :
Doyen :
Professeur Najia HAJJAJ
Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et Estudiantines
Professeur Mohammed JIDDANE
Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération
Professeur Naima LAHBABI-AMRANI
Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie
Professeur Yahia CHERRAH
Secrétaire Général :
Monsieur Mohammed BENABDELLAH
PROFESSEURS :
Décembre 1967
1. Pr. TOUNSI Abdelkader
Pathologie Chirurgicale
Février, Septembre, Décembre 1973
2.
3.
4.
5.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ARCHANE My Idriss*
BENOMAR Mohammed
CHAOUI Abdellatif
CHKILI Taieb
Pathologie Médicale
Cardiologie
Gynécologie Obstétrique
Neuropsychiatrie
Janvier et Décembre 1976
6. Pr. HASSAR Mohamed
Pharmacologie Clinique
Février 1977
7. Pr. AGOUMI Abdelaziz
8. Pr. BENKIRANE ép. AGOUMI Najia
9. Pr. EL BIED ép. IMANI Farida
Parasitologie
Hématologie
Radiologie
Février Mars et Novembre 1978
10. Pr. ARHARBI Mohamed
11. Pr. SLAOUI Abdelmalek
Cardiologie
Anesthésie Réanimation
Mars 1979
12. Pr. LAMDOUAR ép. BOUAZZAOUI Naima
Pédiatrie
Mars, Avril et Septembre 1980
13. Pr. EL KHAMLICHI Abdeslam
Neurochirurgie
14. Pr. MESBAHI Redouane
Cardiologie
Mai et Octobre 1981
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
BENOMAR Said*
BOUZOUBAA Abdelmajid
EL MANOUAR Mohamed
HAMMANI Ahmed*
MAAZOUZI Ahmed Wajih
SBIHI Ahmed
TAOBANE Hamid*
Anatomie Pathologique
Cardiologie
Traumatologie-Orthopédie
Cardiologie
Chirurgie Cardio-Vasculaire
Chirurgie Thoracique
Mai et Novembre 1982
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ABROUQ Ali*
BENOMAR M’hammed
BENSOUDA Mohamed
BENOSMAN Abdellatif
CHBICHEB Abdelkrim
JIDAL Bouchaib*
LAHBABI ép. AMRANI Naïma
Oto-Rhino-Laryngologie
Chirurgie-Cardio-Vasculaire
Anatomie
Biophysique
Chirurgie Maxillo-faciale
Physiologie
Novembre 1983
29.
30.
31.
32.
33.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ALAOUI TAHIRI Kébir*
BALAFREJ Amina
BELLAKHDAR Fouad
HAJJAJ ép. HASSOUNI Najia
SRAIRI Jamal-Eddine
Pneumo-phtisiologie
Pédiatrie
Neurochirurgie
Rhumatologie
Cardiologie
Décembre 1984
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
BOUCETTA Mohamed*
EL OUEDDARI Brahim El Khalil
MAAOUNI Abdelaziz
MAAZOUZI Ahmed Wajdi
NAJI M’Barek *
SETTAF Abdellatif
Neurochirurgie
Radiothérapie
Médecine Interne
Anesthésie -Réanimation
Immuno-Hématologie
Chirurgie
Novembre et Décembre 1985
40. Pr. BENJELLOUN Halima
41. Pr. BENSAID Younes
42. Pr. EL ALAOUI Faris Moulay El Mostafa
43. Pr. IHRAI Hssain *
Maxillo-Faciale
44. Pr. IRAQI Ghali
45. Pr. KZADRI Mohamed
Cardiologie
Neurologie
Stomatologie et Chirurgie
Pneumo-phtisiologie
Oto-Rhino-laryngologie
Janvier, Février et Décembre 1987
46.
47.
48.
49.
50.
51.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
AJANA Ali
Radiologie
AMMAR Fanid
CHAHED OUAZZANI ép.TAOBANE Houria
Gastro-Entérologie
EL FASSY FIHRI Mohamed Taoufiq
Pneumo-phtisiologie
EL HAITEM Naïma
Cardiologie
EL MANSOURI Abdellah*
Chimie-Toxicologie Expertise
52. Pr. EL YAACOUBI Moradh
53. Pr. ESSAID EL FEYDI Abdellah
54. Pr. LACHKAR Hassan
Traumatologie Orthopédie
Gastro-Entérologie
Médecine Interne
55. Pr. OHAYON Victor*
56. Pr. YAHYAOUI Mohamed
Médecine Interne
Neurologie
Décembre 1988
57. Pr. BENHMAMOUCH Mohamed Najib
58. Pr. DAFIRI Rachida
59. Pr. FAIK Mohamed
60. Pr. FIKRI BEN BRAHIM Noureddine
Publique et Hygiène
61. Pr. HERMAS Mohamed
62. Pr. TOULOUNE Farida*
Chirurgie Pédiatrique
Radiologie
Urologie
Médecine Préventive, Santé
Médecine Interne
Décembre 1989 Janvier et Novembre 1990
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ABIR ép. KHALIL Saadia
Cardiologie
ACHOUR Ahmed*
Chirurgicale
ADNAOUI Mohamed
Médecine Interne
AOUNI Mohamed
Médecine Interne
AZENDOUR BENACEUR*
BENAMEUR Mohamed*
Radiologie
BOUKILI MAKHOUKHI Abdelali
Cardiologie
CHAD Bouziane
CHKOFF Rachid
FARCHADO Fouzia ép.BENABDELLAH
Pédiatrique
HACHIM Mohammed*
Médecine-Interne
HACHIMI Mohamed
Urologie
KHARBACH Aîcha
Gynécologie -Obstétrique
MANSOURI Fatima
Anatomie-Pathologique
OUAZZANI Taïbi Mohamed Réda
Neurologie
SEDRATI Omar*
Dermatologie
TAZI Saoud Anas
TERHZAZ Abdellah*
Ophtalmologie
Février Avril Juillet et Décembre 1991
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
AL HAMANY Zaîtounia
ATMANI Mohamed*
AZZOUZI Abderrahim
BAYAHIA ép. HASSAM Rabéa
BELKOUCHI Abdelkader
BENABDELLAH Chahrazad
BENCHEKROUN BELABBES Abdelatif
BENSOUDA Yahia
BERRAHO Amina
BEZZAD Rachid
CHABRAOUI Layachi
CHANA El Houssaine*
CHERRAH Yahia
Anatomie-Pathologique
Néphrologie
Chirurgie Générale
Hématologie
Pharmacie galénique
Ophtalmologie
Biochimie et Chimie
Ophtalmologie
Pharmacologie
94. Pr. CHOKAIRI Omar
95. Pr. FAJRI Ahmed*
96. Pr. JANATI Idrissi Mohamed*
97. Pr. KHATTAB Mohamed
98. Pr. NEJMI Maati
99. Pr. OUAALINE Mohammed*
Histologie Embryologie
Psychiatrie
Pédiatrie
Anesthésie-Réanimation
100. Pr. SOULAYMANI ép.BENCHEIKH Rachida
Pharmacologie
101. Pr. TAOUFIK Jamal
Chimie thérapeutique
Décembre 1992
102. Pr. AHALLAT Mohamed
103. Pr. BENOUDA Amina
Microbiologie
104. Pr. BENSOUDA Adil
105. Pr. BOUJIDA Mohamed Najib
Radiologie
106. Pr. CHAHED OUAZZANI Laaziza
Gastro-Entérologie
107. Pr. CHAKIR Noureddine
Radiologie
108. Pr. CHRAIBI Chafiq
Gynécologie Obstetrique
109. Pr. DAOUDI Rajae
Ophtalmologie
110. Pr. DEHAYNI Mohamed*
111. Pr. EL HADDOURY Mohamed
112. Pr. EL OUAHABI Abdessamad
Neurochirurgie
113. Pr. FELLAT Rokaya
Cardiologie
114. Pr. GHAFIR Driss*
Médecine Interne
115. Pr. JIDDANE Mohamed
Anatomie
116. Pr. OUAZZANI TAIBI Med Charaf Eddine
Gynécologie
Obstétrique
117. Pr. TAGHY Ahmed
118. Pr. ZOUHDI Mimoun
Microbiologie
Mars 1994
119. Pr. AGNAOU Lahcen
Ophtalmologie
120. Pr. AL BAROUDI Saad
121. Pr. ARJI Moha*
122. Pr. BENCHERIFA Fatiha
Ophtalmologie
123. Pr. BENJAAFAR Noureddine
Radiothérapie
124. Pr. BENJELLOUN Samir
125. Pr. BENRAIS Nozha
Biophysique
126. Pr. BOUNASSE Mohammed*
Pédiatrie
127. Pr. CAOUI Malika
Biophysique
128. Pr. CHRAIBI Abdelmjid
Endocrinologie et Maladies
Métabolique
129. Pr. EL AMRANI ép. AHALLAT Sabah
130. Pr. EL AOUAD Rajae
Immunologie
131. Pr. EL BARDOUNI Ahmed
Traumato Orthopédie
132. Pr. EL HASSANI My Rachid
Radiologie
133. Pr. EL IDRISSI LAMGHARI Abdennaceur
Médecine Interne
134. Pr. EL KIRAT Abdelmajid*
Chirurgie Cardio- Vasculaire
135. Pr. ERROUGANI Abdelkader
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ESSAKALI Malika
ETTAYEBI Fouad
HADRI Larbi*
HDA Ali*
HASSAM Badredine
IFRINE Lahssan
JELTHI Ahmed
MAHFOUD Mustapha
MOUDENE Ahmed*
MOSSEDDAQ Rachid*
OULBACHA Said
RHRAB Brahim
148. Pr. SENOUCI ép. BELKHADIR Karima
149. Pr. SLAOUI Anas
Immunologie
Médecine Interne
Médecine Interne
Dermatologie
Neurologie
Dermatologie
Chirurgie Cardio-vasculaire
Mars 1994
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ABBAR Mohamed*
ABDELHAK M’barek
BELAIDI Halima
BARHMI Rida Slimane
BENTAHILA Abdelali
BENYAHIA Mohammed Ali
BERRADA Mohamed Saleh
CHAMI Ilham
CHERKAOUI Lalla Ouafae
EL ABBADI Najia
HANINE Ahmed*
JALIL Abdelouahed
LAKHDAR Amina
MOUANE Nezha
Urologie
Chirurgie - Pédiatrique
Neurologie
Pédiatrie
Gynécologie -Obstétrique
Traumatologie -Orthopédie
Radiologie
Ophtalmologie
Neurochirurgie
Radiologie
Pédiatrie
Mars 1995
164. Pr. ABOUQUAL Redouane
Réanimation Médicale
165. Pr. AMRAOUI Mohamed
166. Pr. BAIDADA Abdelaziz
167. Pr. BARGACH Samir
168. Pr. BELLAHNECH Zakaria
Urologie
169. Pr. BEDDOUCHE Amoqrane*
Urologie
170. Pr. BENAZZOUZ Mustapha
Gastro-Entérologie
171. Pr. CHAARI Jilali*
Médecine Interne
172. Pr. DIMOU M'barek*
173. Pr. DRISSI KAMILI Mohammed Nordine*
174. Pr. EL MESNAOUI Abbes
175. Pr. ESSAKALI HOUSSYNI Leila
176. Pr. FERHATI Driss
177. Pr. HASSOUNI Fadil
178. Pr. HDA Abdelhamid*
Cardiologie
179.
180.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
IBEN ATTYA ANDALOUSSI Ahmed
IBRAHIMY Wafaa
BENOMAR ALI
BOUGTAB Abdesslam
ER RIHANI Hassan
EZZAITOUNI Fatima
KABBAJ Najat
LAZRAK Khalid (M)
OUTIFA Mohamed*
Urologie
Ophtalmologie
Neurologie
Oncologie Médicale
Néphrologie
Radiologie
Décembre 1996
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
AMIL Touriya*
BELKACEM Rachid
BELMAHI Amin
BOULANOUAR Abdelkrim
EL ALAMI EL FARICHA EL Hassan
EL MELLOUKI Ouafae*
GAMRA Lamiae
GAOUZI Ahmed
MAHFOUDI M’barek*
MOHAMMADINE EL Hamid
MOHAMMADI Mohamed
MOULINE Soumaya
OUADGHIRI Mohamed
OUZEDDOUN Naima
ZBIR EL Mehdi*
Radiologie
Chirurgie Pédiatrie
Chirurgie réparatrice et plastique
Ophtalmologie
Parasitologie
Pédiatrie
Radiologie
Médecine Interne
Pneumo-phtisiologie
Traumatologie – Orthopédie
Néphrologie
Cardiologie
Novembre 1997
204.
205.
206.
207.
208.
209.
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
217.
218.
219.
220.
221.
222.
223.
224.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ALAMI Mohamed Hassan
BEN AMAR Abdesselem
BEN SLIMANE Lounis
BIROUK Nazha
BOULAICH Mohamed
CHAOUIR Souad*
DERRAZ Said
ERREIMI Naima
FELLAT Nadia
GUEDDARI Fatima Zohra
HAIMEUR Charki*
KADDOURI Noureddine
KANOUNI NAWAL
KOUTANI Abdellatif
LAHLOU Mohamed Khalid
MAHRAOUI CHAFIQ
NAZZI M’barek*
OUAHABI Hamid*
SAFI Lahcen*
TAOUFIQ Jallal
YOUSFI MALKI Mounia
Novembre 1998
Gynécologie – Obstétrique
Urologie
Neurologie
O.RL.
Radiologie
Neurochirurgie
Pédiatrie
Cardiologie
Radiologie
Chirurgie – Pédiatrique
Physiologie
Urologie
Pédiatrie
Cardiologie
Neurologie
Psychiatrie
225. Pr. BENKIRANE Majid*
226. Pr. KHATOURI Ali*
227. Pr. LABRAIMI Ahmed*
Hématologie
Cardiologie
Novembre 1998
228. Pr. AFIFI RAJAA
229. Pr. AIT BENASSER MOULAY Ali*
230. Pr. ALOUANE Mohammed*
231. Pr. LACHKAR Azouz
232. Pr. LAHLOU Abdou
233. Pr. MAFTAH Mohamed*
234. Pr. MAHASSINI Najat
235. Pr. MDAGHRI ALAOUI Asmae
236. Pr. MANSOURI Abdelaziz*
237. Pr. NASSIH Mohamed*
Maxillo Faciale
238. Pr. RIMANI Mouna
239. Pr. ROUIMI Abdelhadi
Gastro - Entérologie
Pneumo-phtisiologie
Oto- Rhino- Laryngologie
Urologie
Neurochirurgie
Pédiatrie
Neurochirurgie
Stomatologie Et Chirurgie
Neurologie
Janvier 2000
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ABID Ahmed*
Pneumo-phtisiologie
AIT OUMAR Hassan
Pédiatrie
BENCHERIF My Zahid
Ophtalmologie
BENJELLOUN DAKHAMA Badr.Sououd
Pédiatrie
BOURKADI Jamal-Eddine
Pneumo-phtisiologie
CHAOUI Zineb
Ophtalmologie
CHARIF CHEFCHAOUNI Al Montacer
ECHARRAB El Mahjoub
EL FTOUH Mustapha
Pneumo-phtisiologie
EL MOSTARCHID Brahim*
Neurochirurgie
EL OTMANYAzzedine
GHANNAM Rachid
Cardiologie
HAMMANI Lahcen
Radiologie
ISMAILI Mohamed Hatim
ISMAILI Hassane*
KRAMI Hayat Ennoufouss
Gastro-Entérologie
MAHMOUDI Abdelkrim*
TACHINANTE Rajae
TAZI MEZALEK Zoubida
Médecine Interne
Novembre 2000
259.
260.
261.
262.
263.
264.
265.
266.
267.
268.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
AIDI Saadia
AIT OURHROUIL Mohamed
AJANA Fatima Zohra
BENAMR Said
BENCHEKROUN Nabiha
BOUSSELMANE Nabile*
BOUTALEB Najib*
CHERTI Mohammed
ECH-CHERIF EL KETTANI Selma
EL HASSANI Amine
Neurologie
Dermatologie
Gastro-Entérologie
Ophtalmologie
Neurologie
Cardiologie
Pédiatrie
269. Pr. EL IDGHIRI Hassan
270. Pr. EL KHADER Khalid
271. Pr. EL MAGHRAOUI Abdellah*
272. Pr. GHARBI Mohamed El Hassan
Métaboliques
273. Pr. HSSAIDA Rachid*
274. Pr. MANSOURI Aziz
275. Pr. OUZZANI CHAHDI Bahia
276. Pr. RZIN Abdelkader*
Maxillo-faciale
277. Pr. SEFIANI Abdelaziz
278. Pr. ZEGGWAGH Amine Ali
Urologie
Rhumatologie
Radiothérapie
Ophtalmologie
Génétique
Réanimation Médicale
PROFESSEURS AGREGES :
Décembre 2001
279. Pr. ABABOU Adil
280. Pr. AOUAD Aicha
281. Pr. BALKHI Hicham*
282. Pr. BELMEKKI Mohammed
283. Pr. BENABDELJLIL Maria
284. Pr. BENAMAR Loubna
285. Pr. BENAMOR Jouda
286. Pr. BENELBARHDADI Imane
287. Pr. BENNANI Rajae
288. Pr. BENOUACHANE Thami
289. Pr. BENYOUSSEF Khalil
290. Pr. BERRADA Rachid
291. Pr. BEZZA Ahmed*
292. Pr. BOUCHIKHI IDRISSI Med Larbi
293. Pr. BOUHOUCH Rachida
294. Pr. BOUMDIN El Hassane*
295. Pr. CHAT Latifa
296. Pr. CHELLAOUI Mounia
297. Pr. DAALI Mustapha*
298. Pr. DRISSI Sidi Mourad*
299. Pr. EL HAJOUI Ghziel Samira
300. Pr. EL HIJRI Ahmed
301. Pr. EL MAAQILI Moulay Rachid
302. Pr. EL MADHI Tarik
303. Pr. EL MOUSSAIF Hamid
304. Pr. EL OUNANI Mohamed
305. Pr. EL QUESSAR Abdeljlil
306. Pr. ETTAIR Said
307. Pr. GAZZAZ Miloudi*
308. Pr. GOURINDA Hassan
309. Pr. HRORA Abdelmalek
310. Pr. KABBAJ Saad
311. Pr. KABIRI EL Hassane*
312. Pr. LAMRANI Moulay Omar
313. Pr. LEKEHAL Brahim
Périphérique
Cardiologie
Ophtalmologie
Neurologie
Néphrologie
Pneumo-phtisiologie
Gastro-Entérologie
Cardiologie
Pédiatrie
Dermatologie
Rhumatologie
Anatomie
Cardiologie
Radiologie
Radiologie
Radiologie
Radiologie
Neuro-Chirurgie
Chirurgie-Pédiatrique
Ophtalmologie
Radiologie
Pédiatrie
Neuro-Chirurgie
Chirurgie-Pédiatnique
Chirurgie Vasculaire
314.
315.
316.
317.
318.
319.
320.
321.
322.
323.
324.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
MAHASSIN Fattouma*
MEDARHRI Jalil
MIKDAME Mohammed*
MOHSINE Raouf
NABIL Samira
NOUINI Yassine
OUALIM Zouhir*
SABBAH Farid
SEFIANI Yasser
TAOUFIQ BENCHEKROUN Soumia
TAZI MOUKHA Karim
Médecine Interne
Hématologie Clinique
Urologie
Néphrologie
Chirurgie Vasculaire Périphérique
Pédiatrie
Urologie
Décembre 2002
325. Pr. AL BOUZIDI Abderrahmane*
326. Pr. AMEUR Ahmed*
327. Pr. AMRI Rachida
328. Pr. AOURARH Aziz*
329. Pr. BAMOU Youssef *
330. Pr. BELGHITI Laila
331. Pr. BELMEJDOUB Ghizlene*
Métaboliques
332. Pr. BENBOUAZZA Karima
333. Pr. BENZEKRI Laila
334. Pr. BENZZOUBEIR Nadia*
335. Pr. BERADY Samy*
336. Pr. BERNOUSSI Zakiya
337. Pr. BICHRA Mohamed Zakarya
338. Pr. CHOHO Abdelkrim *
339. Pr. CHKIRATE Bouchra
340. Pr. EL ALAMI EL FELLOUS Sidi Zouhair
341. Pr. EL ALJ Haj Ahmcd
342. Pr. EL BARNOUSSI Leila
343. Pr. EL HAOURI Mohamed *
344. Pr. EL MANSARI Omar*
345. Pr. ES-SADEL Abdelhamid
346. Pr. FILALI ADIB Abdelhai
347. Pr. HADDOUR Leila
348. Pr. HAJJI Zakia
349. Pr. IKEN Ali
350. Pr. ISMAEL Farid
351. Pr. JAAFAR Abdeloihab*
352. Pr. KRIOULE Yamina
353. Pr. LAGHMARI Mina
354. Pr. MABROUK Hfid*
355. Pr. MOUSSAOUI RAHALI Driss*
356. Pr. MOUSTAGHFIR Abdelhamid*
357. Pr. MOUSTAINE My Rachid
358. Pr. NAITLHO Abdelhamid*
359. Pr. OUJILAL Abdelilah
360. Pr. RACHID Khalid *
361. Pr. RAISS Mohamed
Urologie
Cardiologie
Gastro-Entérologie
Biochimie-Chimie
Rhumatologie
Dermatologie
Gastro – Enterologie
Médecine Interne
Psychiatrie
Pédiatrie
Urologie
Dermatologie
Cardiologie
Ophtalmologie
Urologie
Pédiatrie
Ophtalmologie
Cardiologie
Médecine Interne
362. Pr. RGUIBI IDRISSI Sidi Mustapha*
363. Pr. RHOU Hakima
364. Pr. RKIOUAK Fouad*
Métaboliques
365. Pr. SIAH Samir *
366. Pr. THIMOU Amal
367. Pr. ZENTAR Aziz*
368. Pr. ZRARA Ibtisam*
Pneumo-phtisiologie
Néphrologie
Pédiatrie
Janvier 2004
369. Pr. ABDELLAH El Hassan
370. Pr. AMRANI Mariam
371. Pr. BENBOUZID Mohammed Anas
372. Pr. BENKIRANE Ahmed*
373. Pr. BENRAMDANE Larbi*
374. Pr. BOUGHALEM Mohamed*
375. Pr. BOULAADAS Malik
Maxillo-faciale
376. Pr. BOURAZZA Ahmed*
377. Pr. CHERRADI Nadia
378. Pr. EL FENNI Jamal*
379. Pr. EL HANCHI Zaki
380. Pr. EL KHORASSANI Mohamed
381. Pr. EL YOUNASSI Badreddine*
382. Pr. HACHI Hafid
383. Pr. JABOUIRIK Fatima
384. Pr. KARMANE Abdelouahed
385. Pr. KHABOUZE Samira
386. Pr. KHARMAZ Mohamed
387. Pr. LEZREK Mohammed*
388. Pr. MOUGHIL Said
389. Pr. NAOUMI Asmae*
390. Pr. SAADI Nozha
391. Pr. SASSENOU Ismail*
392. Pr. TARIB Abdelilah*
393. Pr. TIJAMI Fouad
394. Pr. ZARZUR Jamila
Ophtalmologie
Gastro-Entérologie
Chimie Analytique
Neurologie
Radiologie
Pédiatrie
Cardiologie
Pédiatrie
Ophtalmologie
Urologie
Ophtalmologie
Gastro-Entérologie
Pharmacie Clinique
Cardiologie
Janvier 2005
395. Pr. ABBASSI Abdelah
Plastique
396. Pr. AL KANDRY Sif Eddine*
397. Pr. ALAOUI Ahmed Essaid
398. Pr. ALLALI fadoua
399. Pr. AMAR Yamama
400. Pr. AMAZOUZI Abdellah
401. Pr. AZIZ Noureddine*
402. Pr. BAHIRI Rachid
403. Pr. BARAKAT Amina
404. Pr. BENHALIMA Hanane
Maxillo Faciale
Chirurgie Réparatrice et
Microbiologie
Rhumatologie
Néphrologie
Ophtalmologie
Radiologie
Rhumatologie
Pédiatrie
405. Pr. BENHARBIT Mohamed
406. Pr. BENYASS Aatif
407. Pr. BERNOUSSI Abdelghani
408. Pr. BOUKALATA Salwa
409. Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Mohamed
410. Pr. DOUDOUH Abderrahim*
411. Pr. EL HAMZAOUI Sakina
412. Pr. HAJJI Leila
413. Pr. HESSISSEN Leila
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415. Pr. KARIM Abdelouahed
416. Pr. KENDOUSSI Mohamed*
417. Pr. LAAROUSSI Mohamed
418. Pr. LYACOUBI Mohammed
419. Pr. NIAMANE Radouane*
420. Pr. RAGALA Abdelhak
421. Pr. REGRAGUI Asmaa
422. Pr. SBIHI Souad
Cytogénétique
423. Pr. TNACHERI OUAZZANI Btissam
424. Pr. ZERAIDI Najia
Ophtalmologie
Cardiologie
Ophtalmologie
Radiologie
Ophtalmologie
Biophysique
Microbiologie
Cardiologie
Pédiatrie
Radiologie
Ophtalmologie
Cardiologie
Chirurgie Cardio Vasculaire
Parasitologie
Rgumatologie
Histo Embryologie
Ophtalmologie
Avril 2006
425.
426.
427.
428.
429.
430.
431.
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433.
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448.
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450.
451.
452.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
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Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
ACHEMLAL Lahsen*
AFIFI Yasser
AKJOUJ Said*
BELGNAOUI Fatima Zahra
BELMEKKI Abdelkader*
BENCHEIKH Razika
BIYI Abdelhamid*
BOUHAFS Mohamed El Amine
BOULAHYA Abdellatif*
CHEIKHAOUI Younes
CHENGUETI ANSARI Anas
DOGHMI Nawal
ESSAMRI Wafaa
FELLAT Ibtissam
FAROUDY Mamoun
GHADOUANE Mohammed*
HARMOUCHE Hicham
HNAFI Sidi Mohamed*
IDRISS LAHLOU Amine*
JROUNDI Laila
KARMOUNI Tariq
KILI Amina
KISRA Hassan
KISRA Mounir
KHARCHAFI Aziz*
LMIMOUNI Badreddine*
MANSOURI Hamid*
NAZIH Naoual
Rhumatologie
Dermatologie
Radiologie
Dermatologie
Hematologie
O.R.L
Biophysique
Cardiologie
Gastro-Entérologie
Cardiologie
Urologie
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Microbiologie
Radiologie
Urologie
Pédiatrie
Psychiatrie
Médecine Interne
Parasitologie
Radiothérapie
O.R.L
453.
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456.
457.
458.
Pr;
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
Pr.
OUANASS Abderrazzak
SAFI Soumaya*
SEKKAT Fatima Zahra
SEFIANI Sana
SOUALHI Mouna
ZAHRAOUI Rachida
Psychiatrie
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Psychiatrie
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Pneumo-Phtisiologie
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1. Pr. ALAMI OUHABI Naima
2. Pr. ALAOUI KATIM
3. Pr. ALAOUI SLIMANI Lalla Naïma
4. Pr. ANSAR M'hammed
Chimique
5. Pr. BOUKLOUZE Abdelaziz
6. Pr. BOURJOUANE Mohamed
7. Pr. DRAOUI Mustapha
8. Pr. EL GUESSABI Lahcen
9. Pr. ETTAIB Abdelkader
10. Pr. FAOUZI Moulay El Abbes
11. Pr. HMAMOUCHI Mohamed
12. Pr. REDHA Ahlam
13. Pr. TELLAL Saida*
14. Pr. TOUATI Driss
15. Pr. ZELLOU Amina
* Enseignants Militaires
Biochimie
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Applications Pharmaceutiques
Microbiologie
Chimie Analytique
Pharmacognosie
Zootechnie
Pharmacologie
Chimie Organique
Biochimie
Biochimie
Pharmacognosie
Chimie Organique
DEDICACES
Moi, Loubna ELATOUANI, je dédie cette thèse….
A mes très chers parents,
Votre amour, votre générosité, vos prières et tant de sacrifices consentis avec
dévouement pour assurer mon bonheur font que ma dette envers vous est
immense.
Puisse Dieu vous procurer longue vie, santé, bonheur et prospérité. Et que ce
travail soit le gage de mon amour éternel et de ma reconnaissance à vos égards.
A la mémoire de mes très chers grands pères.
Hajj Abdessalam ELATOUANI
&
Hajj Mohamed JAMALI
Que ce travail soit une prière pour le repos de vos âmes.
Et puisse Dieu Le Très Haut vous avoir dans Sa Sainte Miséricorde.
A mes très chères grandes mères.
Vous êtes toujours dans mon cœur et dans mon esprit.
A mon très cher oncle et frère -Cdt Abdelattif JAMALI-.
Merci de m’avoir indiqué la bonne voie en me rappelant que la volonté fait
toujours les Grands Hommes.
A mon petit frère bien aimé Abdessalam et à mes très chères petites sœurs
Zineb et Hind.
A mon cousin et frère Ahmed ELATOUANI.
A mon très cher oncle Abdelhak ELATOUANI.
A ma très chère tante Souad et à son Mari Mhammed BENAZZOUZ et à
leurs filles Soufie et Mounira.
A toute la famille ELATOUANI, JAMALI, ELHEFFARI et RIANE.
A toutes mes amies.
Et à tous ceux dont le nom m’échappe mais qui vont rester à jamais ancrés
dans mon cœur.
Avec toute mon amitié je vous souhaite une vie agréable et pleine de succès.
Puisse ce travail être le témoignage de mon attachement et de ma profonde
affection.
REMERCIEMENTS
A Notre Maître et président de thèse, Monsieur Le Professeur Mimoun
ZOUHDI, Professeur de Microbiologie à la Faculté de Médecine et de
Pharmacie de Rabat.
Vous me faites un immense honneur en acceptant de présider ce jury de thèse.
Veuillez trouver ici, cher Maître, l’expression de mon indéfectible considération
et le témoignage de ma grande admiration.
A Notre Maître et rapporteur de thèse, Monsieur le Professeur Idriss
LAHLOU AMINE, Professeur Agrégé de Microbiologie à la Faculté de
Médecine et de Pharmacie de Rabat.
Vous m’avez décerné un grand honneur en me confiant ce travail.
Je resterai à jamais imprégnée par vos remarquables qualités humaines et
professionnelles ainsi qu’à votre dévouement qui n’ont cessé de susciter mon
admiration et mon respect.
Merci de m’avoir accordé si généreusement et si cordialement beaucoup de
votre temps et de m’avoir inculqué la rigueur scientifique tout au long de
l’élaboration de ce travail.
Et je vous prie, cher Maître, de croire en l’expression de ma haute considération
ainsi qu’à mon éternelle gratitude.
A Notre Maître et juge de thèse, Monsieur Le Professeur Jamal TAOUFIK,
Professeur de Chimie Thérapeutique à la Faculté de Médecine et de
Pharmacie de Rabat.
Vous me faites un grand honneur en acceptant d’apporter votre précieux
jugement à ce travail.
On songera toujours respectueusement à vous et à l’excellente qualité des cours
que vous nous avez prodigué durant notre cursus universitaire.
Et je vous prie, cher Maître, d’agréer mon indéfectible considération et de croire
en ma grande admiration.
A Notre Maître et juge de thèse, Monsieur Le Professeur Saâd MRANI,
Professeur Agrégé de Virologie à la Faculté de Médecine et de Pharmacie
de Rabat.
Merci d’avoir accepté avec grande amabilité de siéger parmi les membres de cet
honorable jury.
Vos compétences sont pour moi un objet d’admiration.
Veuillez trouvez ici, cher Maître, l’assurance de mon profond respect.
A Notre Maître et juge de thèse, Monsieur Le Professeur Hicham
Harmouche, Professeur Agrégé de Médecine interne à la Faculté de
Médecine et de Pharmacie de Rabat.
Merci d’avoir accepté de siéger parmi les membres de cet honorable jury.
Veuillez trouvez ici, cher Maître, l’expression de mon indéfectible
considération.
HOMMAGES
RESPECTUEUX
A Monsieur Le Professeur Said ZOUHAIR, Professeur-assistant de
Microbiologie à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat.
«Laboratoire de recherche et de biosécurité à l’Hôpital Militaire d’Instruction
Mohammed V -Rabat-».
A Monsieur le Docteur Jalal NOURLIL.
Et à mes chers amis:
Mlle Nadia FARIAT
Mlle Leïla BENABBASS
Dr. Abdellah FAOUZI
Mr Ahmed REGUIG
« Laboratoire de Virologie à l’Institut Pasteur -Casablanca-».
A Mr Abdelfettah AMEZIANE.
« reeechsoft -Casablanca-»
Tous les mots ne sauront exprimer avec fidélité l’estime et la gratitude que j’ai à
vos égards.
TABLE DES MATIERES
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION ............................................................................................
PREMIERE PARTIE ......................................................................................
I. Historique ........................................................................................................
II. Définition de la grippe aviaire.................................................................
III. Aspects virologiques .................................................................................
1. Agents pathogènes........................................................................................
1.1. Classification .........................................................................................
1.2. Caractères antigéniques, morphologiques et structuraux......................
1.2.1. Antigènes de l’enveloppe ............................................................
1.2.2. Antigènes internes .......................................................................
2. Cycle viral ....................................................................................................
IV. Epidémiologie de la grippe aviaire A/H5N1 .....................................
1. Réservoirs de virus ........................................................................................
2. Modes de transmission ..................................................................................
3. Modes de diffusion de la grippe aviaire A/H5N1 .........................................
3.1. Cas sporadiques ......................................................................................
3.2. Risque pandémique ................................................................................
4. Statistiques.....................................................................................................
5. Réseaux de surveillance ................................................................................
1
2
3
5
6
6
6
7
9
11
13
14
14
15
16
16
16
22
25
DEUXIEME PARTIE
V. Clinique de la grippe aviaire A/H5N1 .................................................. 30
VI. Définition des cas A/H5N1 ...................................................................... 32
VII. Rôle du Laboratoire dans le diagnostic virologique d’un cas
humain de grippe aviaire A/H5N1 .............................................................. 34
1. Précautions de manipulation : laboratoire de biosécurité de niveau 3
(NSB3) ...............................................................................................................
2. Diagnostic virologique direct ........................................................................
2.1. Prélèvements ..........................................................................................
2.1.1. Types de prélèvements ................................................................
35
43
43
43
2.1.2. Transport et acheminement des prélèvements au laboratoire
NSB3 ....................................................................................................
2.2. Diagnostic moléculaire...........................................................................
2.2.1. RT-PCR classique ........................................................................
2.2.2. RT-PCR en temps réel .................................................................
2.3. Diagnostic antigénique rapide................................................................
2.3.1. Détection antigénique du type grippal .........................................
2.3.1.1. Technique immunoenzymatique de type Elisa ...............
2.3.1.2. Technique immunoenzymologique sur membrane .........
2.3.1.3. Technique immunochromatographique sur
membrane.....................................................................................
2.3.1.4. Autres ..............................................................................
2.3.2. Détection antigénique du type et du sous-type grippal
A/H5N1 ..................................................................................................
2.3.2.1. Technique d’Immunofluorescence..................................
2.4. Culture cellulaire ....................................................................................
2.4.1. Systèmes cellulaires utilisés .........................................................
2.4.1.1. Isolement du virus sur oeuf de poule embryonné ...........
2.4.1.2. Isolement du virus sur cellules de rein de chien
MDCK ..........................................................................................
2.4.2. Détection virale ............................................................................
2.4.2.1. Observation de l’effet cytopathique ................................
2.4.2.2. Hémagglutination ............................................................
2.4.3. Identification du type, sous-type et variant viral .........................
2.4.3.1. Inhibition de l’hémagglutination.....................................
2.4.4. Méthodes d’études in vitro de la sensibilité des virus aux
Antiviraux...............................................................................................
2.4.4.1. Méthodes phénotypiques.................................................
2.4.4.2. Méthodes génotypiques...................................................
3. Diagnostic sérologique ..................................................................................
3.1. Prélèvements ..........................................................................................
3.2. Techniques utilisées ...............................................................................
45
47
47
52
64
65
65
66
68
71
75
75
78
79
79
79
80
81
82
83
83
84
85
86
88
88
89
TROISIEME PARTIE
VIII. Prophylaxie .............................................................................................. 92
1. Moyens non spécifiques ................................................................................
1.1. Stratégies de lutte contre la grippe aviaire chez l’animal ......................
1.2. Isolement des patients et barrières physiques de protection ..................
1.3. Chimioprophylaxie .................................................................................
92
92
95
97
2. Moyens spécifiques ....................................................................................... 98
2.1. Vaccination............................................................................................. 98
IX. Traitement.................................................................................................... 102
1. Traitement symptomatique............................................................................ 102
2. Traitement antiviral spécifique ..................................................................... 103
2.1. Inhibiteurs de la Neuraminidase............................................................. 103
2.2. Inhibiteurs de la protéine M2 ................................................................. 111
3. Immunothérapie ............................................................................................ 111
CONCLUSION .................................................................................................. 112
RESUME
ANNEXES
REFERENCES
LISTE DES ABREVIATIONS
ADNc
ALAT
ARN
ASAT
CDC
CNR
DASRI
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
EDTA
ELISA
FAO
FDA
: Acide désoxynucléique complémentaire
: Alanine aminotransférase
: Acide ribonucléique
: Aspartate aminotransférase
: Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA
: Centre National de Référence de la grippe
: Déchets d’Activité de Soins à Risque Infectieux
: didésoxy-adénosine triphosphate
: didésoxy-cytidine triphosphate
: didésoxy-guanosine triphosphate
: didésoxy-thymidine triphosphate
: Acide éthylène-diamine tétracétique
: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
: Food and Agriculture Organization of the United Nations
: Food and Drug Administration, U.S. Department of Health and
Human Services
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer aussi appelé Förster
Resonance Energy Transfer
H5N1 : Sous-type de virus Influenza type A
HA
: Hémagglutinine
HEF
: Hémagglutinine-Esterase facteur de fusion
HEPA : High Efficiency Particulate Air Filter ou Absorbing Filter
ICE
: Immunocapture Elisa
IF
: Immunofluorescence
IHA
: Inhibition d’hémagglutination
LCR
: Liquide céphalorachidien
M
: Matrix protein
MDCK : Madin-Darby canine kidney
NA
: Neuraminidase
NEP
: Nuclear Export Protein (NS2)
NP
: Nucléoprotéine
NS
: Nonstructural protein
dNTP : désoxynucléoside triphosphate
OIE
: Office International des Épizooties
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PA
: Protéine Acide
PB
: Protéine Basique
RDE
: Receptor destroying enzyme
RNP
: Ribonucléoprotéine
RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction
UN
: United Nations
VPN
: Valeur prédictive négative
VPP
: Valeur prédictive positive
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Circulation épidémique des virus grippaux A et B au cours du
XXe siècle .......................................................................................
Figure 2 : Electromicrophotographie du virus de la grippe A .........................
Figure 3 : Schéma d’un virus grippal de type A ..............................................
Figure 4 : Mécanismes de survenue des pandémies grippales .........................
Figure 5 : Propagation de la Grippe Aviaire A/H5N1 dans les élevages de
volailles et/ou l’avifaune sauvage ...................................................
Figure 6 : Radiographies pulmonaires de face de quatre patients atteints de
la grippe aviaire A/H5N1(Vietnam 2004) ......................................
Figure 7 : Pictogramme international de danger biologique ............................
Figure 8 : Laboratoire de biosécurité de niveau 3 (NSB3) ..............................
Figure 9 : Masque de protection respiratoire type FFP2..................................
Figure 10: Exemple d’un système de triple emballage de sécurité ...................
Figure 11: Produit d’amplification du génome des virus grippaux type
A/H5N1 (en utilisant des amorces spécifiques pour H5 (A) et N1
(B)) par RT-PCR après migration en gel d’agarose avec un
marqueur de taille.............................................................................
Figure 12: Modèles graphiques de la PCR en temps réel .................................
Figure 13: Mécanisme d’action des agents se liant à l’ADN double brin ........
Figure 14: Mécanisme d’action de La technologie Taqman .............................
Figure 15: Mécanisme d’action de La technologie HybProbes ........................
Figure 16: Mécanisme d’action des balises moléculaires .................................
Figure 17: Mécanisme d’action des Amorces scorpion ....................................
Figure 18: Résultat positif et résultat négatif pour le virus type A (Flu A
Directigen -Becton Dickinson-) .......................................................
Figure 19: Résultat positif et résultat négatif pour le virus type A (Flu A+B
Directigen -Becton Dickinson-) .......................................................
Figure 20: Résultat positif pour le virus type A (A+) et type B (B+) (Test
QuickVue Influenza A+B -Quidel-) ................................................
Figure 21: Résultat positif pour le virus type A (EZ Flu A+B Directigen
-Becton Dickinson-) .........................................................................
Figure 22: Résultat positif pour le virus type A ou type B (ZstatFlu
-Zymetex Inc-) .................................................................................
Figure 23: Microphotographie d’une immunofluorescence indirecte réalisée
4
8
12
20
23
31
36
40
40
46
50
66
56
57
59
61
62
67
67
69
70
72
sur cellules infectées par le virus A/H5N1 ...................................... 77
Figure 24: Tapis de monocouche cellulaire (MDCK) vue au microscope
Inversé ............................................................................................. 80
Figure 25: Analyse d’une réaction de séquencage après lecture sur un
séquenceur automatique .................................................................. 87
Figure 26: Arbre phylogénétique des virus A/H5N1 ........................................ 100
Figure 27: Électromicrophotographie des cellules MDCK infectées par le
virus de la grippe A en absence et en présence des inhibiteurs de
NA .................................................................................................... 104
Figure 28: Structures chimiques des Antineuraminidases ................................ 106
Figure 29: Mécanisme de résistance des virus grippaux type A à
l’Oseltamivir.................................................................................... 110
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Classification de l’OMS relative aux niveaux d’alerte à la
pandémie de grippe ......................................................................... 21
Tableau 2: Nombre cumulé de cas humains confirmés de Grippe Aviaire
A/H5N1 et de décès reportés par l’OMS (jusqu’au 3 Avril
2008)................................................................................................ 24
Tableau 3: Tableau comparatif de quelques exemples de tests de détection
antigénique rapide pour le diagnostic des virus grippaux............... 73
Tableau 4: Sensibilité et spécificité de l’IF en comparaison avec la culture
Cellulaire ......................................................................................... 76
Tableau 5: Inhibition de la NA des virus Influenza A et B .............................. 105
Tableau 6: Propriétés pharmacologiques du Zanamivir et de l’Oseltamivir .... 107
INTRODUCTION
L’émergence récente en Asie du Sud-Est de la grippe aviaire A/H5N1 suscite de
grandes craintes épidémiologiques en raison de l’ampleur des épizooties dans les
pays atteints, de la nature hautement pathogène du virus A/H5N1 isolé chez
l’être humain et de l’expansion géographique récente de la panzootie au
continent européen et africain.
Un abattage massif de centaines de millions de volatiles et de porcs
contaminateurs ou potentiellement contaminateurs et des mesures sanitaires
drastiques ont permis d’éviter l’apparition d’un variant ayant une haute capacité
de diffusion chez l’homme.
Toutefois l’épidémiologie, l’écologie de ce virus et l’impossibilité de l’éradiquer
font craindre aux experts une pandémie imminente, incitant à une surveillance
accrue.
Dans ce contexte, le diagnostic virologique de la grippe aviaire A/H5N1 est un
diagnostic d’urgence : il fait appel dans un premier temps aux méthodes
modernes de
biologie moléculaire en raison de leur rapidité, sensibilité et
spécificité, elles sont complémentaires du diagnostic virologique conventionnel
(l’isolement en culture cellulaire, l’identification de la souche virale et la
réalisation d’un antivirogramme pour la détection des résistances aux
antiviraux.).
Ces paramètres sont d’autant plus importants que la précocité du diagnostic
virologique aboutit à une prise en charge thérapeutique rapide et spécifique des
cas, ce qui permettra de contenir les premiers foyers de transmission d’un virus à
potentiel pandémique.
Le présent travail est une synthèse bibliographique du rôle du laboratoire dans le
diagnostic virologique d’un cas humain de grippe aviaire du au virus A/H5N1.
1
PREMIERE PARTIE
I. Historique
II. Définition de la grippe aviaire
III. Aspects virologiques
IV. Epidémiologie de la grippe aviaire A/H5N1
2
I. Historique
La Grippe est une maladie infectieuse virale, La langue Française a retenu son
aspect clinique puisque le mot pour la désigner souligne, le saisissement brutal
de l’individu infecté. Les Anglo-Saxons ont emprunté à l’Italien le terme
d’Influenza (…di freddo, influence du froid ou …di stelle, influence des
étoiles), mettant l’accent sur son aspect épidémique [1, 2].
La première description de ce qui pourrait être la grippe remonte aux époques
reculées - 412 avant Jésus-Christ - par Hippocrate [1]. Et la première pandémie
de maladie d’allure grippale qui a été bien décrite, remonte à 1580. Depuis cette
époque, 31 pandémies possibles de ce type ont été recensées, dont trois au XXe
siècles [3] ; La grippe « Espagnole » en 1918 qui a fait plus de 40 millions de
morts, était due au sous-type A/H1N1 c’est la pandémie la plus meurtrière de
tous les temps, elle aurait touché au total environ la moitié de la population
mondiale [1], les virus circulant chez l’homme avant étaient des sous types
A/H2N8 et A/H3N8. Les antibiotiques, qui auraient pu éviter de nombreux
décès par pneumonie bactérienne, n’avaient pas encore été découverts et un
vaccin efficace était inconcevable : le virus grippal ne sera pas isolé chez l’être
humain avant 1933 [4, 5]. Elle a été supplantée en 1957 par la grippe
« Asiatique » due au virus A/H2N2 -on a dénombré un peu plus de deux
millions de décès à l’échelle de la planète-, puis par la grippe de « Hong Kong »
en 1968 due au virus A/H3N2, elle a entraîné moins de décès (environ un
million). Et en 1977, les virus, aujourd’hui classés dans le sous-type A/H1N1
resurgirent, provoquant l’épidémie dite « grippe russe » suite à la remise en
circulation chez l’Homme du virus A/H1N1 par des essais de vaccination par un
« vaccin vivant » [6]. C’est ainsi qu’actuellement chez l’homme circulent deux
3
sous-types de virus de grippe A : A/H1N1 et A/H3N2, aux côtés des virus des
grippes B et C (Fig.1) [1, 4, 7, 8, 9].
Figure 1 : Circulation épidémique des virus grippaux A et B au cours du
XXe siècle. Trois hémagglutinines (H1, H2, H3) et deux neuraminidases
(N1, N2) ont été identifiées chez l’Homme pour les virus de type A [7].
Le chemin fut long pour aboutir à la connaissance de l’agent étiologique de cette
maladie. Les travaux de Louis Pasteur ont donné, à la fin du XIXème siècle,
naissance à la Microbiologie. Et sur les traces de ses travaux, Charles
Chamberland, un de ses collaborateurs, ouvrit, sans le savoir, la voie de la
Virologie grâce à sa méthode publiée en 1884 destinée à décontaminer l’eau afin
de la rendre exempte de germe à l’aide d’un filtre constitué par une bougie de
porcelaine « Bougie Chamberland » [10]. Et c’est au lendemain de la Grande
Guerre et de la première pandémie du vingtième siècle, que deux Français René
Dujarric de la Rivière, chercheur à l’Institut Pasteur, qui fut l’un des premiers
scientifiques à s’intéresser à la grippe au laboratoire, d’une part et Charles
Nicolle d’autre part démontrèrent indépendamment que l’agent étiologique de la
4
grippe était un « virus ultrafiltrable ». Il a fallu attendre 1931 pour que Richard
Shope, frappé par la concomitance de la grippe espagnole chez l’homme et
d’une maladie similaire chez le porc vers 1918-1919, isolât le premier virus de
type A chez le porc aux Etats-Unis. Et ce n’est que plus tard, en 1933, à la
faveur d’une épidémie de grippe en Grande-Bretagne, que trois chercheurs du
National Institute for Medical Research au nord de Londres (Wilson Smith,
Christopher Andrews et Patrick Laidlaw) isolèrent pour la première fois un virus
de grippe humaine. Par la suite, deux autres types de virus grippaux humains ont
été identifiés : en 1940, Francis et Magill découvrit le virus de la grippe B et, en
1947, Taylor isola le premier virus de grippe C [1, 2].
Le vaccin, d’abord mis au point par l’armée des États-Unis à partir de virions,
cultivés sur oeuf embryonné de poule et inactivés au formol, n’a véritablement
été utilisé qu’après la pandémie de 1957. Depuis de considérables progrès
technologiques ont permit d’obtenir des préparations vaccinales d’une pureté
optimale. En effet, le vaccin antigrippal doit sa performance actuelle à
l’adéquation entre les souches qui entrent dans sa composition et celles qui
circulent grâce à la surveillance mondiale de la grippe qui fut établie dès 1947
sous l’impulsion de l’OMS [1].
II. Définition de la grippe aviaire
Il s’agit d’une maladie mondialement répartie (tous les continents), elle a été
identifiée pour la 1ère fois en Italie en 1878 et dont le virus n’a été isolé qu’en
1955 [11].
5
La grippe ou peste aviaire, ou grippe du poulet, est une infection due au virus
Influenza A à tropisme respiratoire, entérique ou nerveux.
Chez l oiseau, cette maladie peut prendre des formes bénignes, se limitant à un
ébouriffage des plumes ou des problèmes de ponte, ou des formes hautement
pathogènes qui tue les volatiles en moins de 48 heures avec un taux de létalité
avoisinant 100 % [5, 11, 12].
Depuis 1997, les variants de A/H5N1 (génotype Z) caractérisés par une
virulence et une mortalité très élevée chez les oiseaux sauvages et domestiques,
ont montré leur capacité à infecter directement l’Homme (virus à potentiel
zoonotique) ; 383 cas ont été recensés jusqu’au 28 Mai 2008 dont 241 décès soit
une mortalité de plus de 60% [13, 14, 15]. Maintenant le sous-type H5 est classé
selon le code Zoosanitaire de l’OIE dans les virus influenza soumis à déclaration
obligatoire [16].
III. Aspects virologiques
1. Agents pathogènes
1.1. Classification
Les virus grippaux appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae -Ce nom
leur vient de leur affinité pour le mucus, ils peuvent se fixer sur les récepteurs
mucoprotéines des cellules épithéliales et des hématies- comprenant quatre
genres Influenzavirus répartis, selon les dernières propositions en date de
l’ICTV (Comité International de Taxonomie Virale) ; A, B, C (sans
immunogénicité croisée) et D ou Thogotovirus. Les trois genres A, B et C se
répartissent en fonction de la nucléoprotéine (NP) et les protéines (M). Les virus
6
A, eux seuls, divisés en sous-types selon les spécificités antigéniques et les
différences génétiques de leurs glycoprotéines de surface : hémagglutinine (HA)
et neuraminidase (NA). Ainsi, 16 sous-types de HA (H1 à H16) et 9 sous-types
de NA (N1 à N9) ont été identifiés. La plupart des combinaisons possibles entre
ces sous-types ont été isolées dans les espèces avicoles [15, 17].
La désignation officielle des souches est une formule qui décrit l’identité de la
souche et la nature de ses antigènes de surface (HA et NA), en mentionnant
successivement différentes informations séparées par un trait oblique: le type du
virus A, B ou C / l’espèce animale d’origine (oiseau, cheval, porc) si ce n’est pas
une souche humaine / l’origine géographique de l’isolement (ville ou pays) / le
numéro de référence de la souche / l’année d’isolement, ces indications sont
suivies par les sous-types d’HA et de NA pour les souches de type A mentionnés
entre parenthèses ;
Ex: A/Vietnam/1194/04 (H5N1) [1, 7, 8, 12, 18].
1.2. Caractères antigéniques, morphologiques et
Structuraux
La morphologie des virus (sphérique ou filamenteuse) est variable selon la façon
dont ils sont produits (Fig.2). Les formes sphériques mesurent de 80 à 100 nm
de diamètre et un peu plus de 100 à 120 nm de diamètre pour les virus de grippe
C. Les virus grippaux sont des virus enveloppés et comme tous les virus
enveloppés, leur infectivité peut être altérée par les détergents ou les
désinfectants, par les pH extrêmes, ainsi que par chauffage à une température
élevée.
7
La surface des virions est hérissée de spicules (HA et NA). Dans le cas du virus
de type C, il n’y a qu’une sorte de spicule (HEF) qui regroupe les fonctions
assurées par les HA et NA des autres virus grippaux.
Figure 2 : Electromicrophotographie du virus de la grippe A.
La barre correspond à 200 nm [1].
Le génome viral est un ARN simple brin, de polarité négative, segmenté (huit
segments distincts pour les virus A et B tandis que le virus C, lui, n’en comporte
que sept). Chaque segment d’ARN viral est associé au complexe de transcription
et de réplication du virus constitué des protéines PB1, PB2 et PA (ou P3 pour les
virus de type C), ainsi qu’à une nucléoprotéine NP majoritaire qui assure la
cohésion de l’ensemble pour former la RNP. L’ensemble est pelotonné dans une
enveloppe correspondant à la double couche phospholipidique empruntée à la
cellule hôte lors de la sortie des virions néosynthétisés, qui est sous-tendue par la
protéine virale M1. L’enveloppe comporte également une protéine M2
8
transmembranaire pour le type A, dénommée NB pour le type B et CM2 pour le
type C [1, 3, 7, 18].
1.2.1. Antigènes de l’enveloppe
 Hémagglutinine
L’HA ayant un aspect de bâtonnet est la plus représentée des glycoprotéines de
surface. Il y’a environ 350 à 500 spicules par particule virale [3].
Après bourgeonnement et formation des virions, l’HA est clivée en deux sousunités HA1 et HA2 au niveau d’un site centré sur une arginine. Le clivage est
réalisé par des protéases de type trypsine, sans doute produites par les cellules de
Clara présentes dans l’appareil respiratoire. Une séquence polybasique autour du
résidu arginine favorise le clivage qui peut alors être assuré dès le réticulum
endosplamique par d’autres types de protéases comme la furine [1]. L’infectivité
virale se manifeste après ce clivage [7].
A l’extrémité de la partie globulaire distale de l’HA1 se trouve le site de liaison
aux structures d’attachement présentes à la surface des cellules. Ce site est une
poche légèrement en dépression, dont la structure tridimensionnelle a été décrite
grâce aux coordonnées cristallographiques de l’HA. Toute variation de sa
composition en résidus aminoacides peut avoir des conséquences en affectant
l’affinité du virus pour son récepteur ou sa spécificité d’attachement [1]; dans la
forme aviaire du virus, l’HA contient deux acides aminés jouant un rôle clé, une
glutamine en position 226 et une glycine en position 228 : l’arrangement spatial
de ces deux acides aminés forme une petite poche qui se fixe sur la molécule
d’acide sialique α2,3 de la membrane cellulaire de la cellule hôte. D’un autre
coté, la forme humaine contient une leucine en position 226 et une sérine en
position 228, qui forme une poche plus large englobant préférentiellement la
9
forme α2,6 de l’acide sialique. Chez l’oiseau, l’acide sialique α2,3 est surtout
présent dans l’intestin tandis que chez l’homme, la forme α2,6 se trouve dans les
voies respiratoires supérieures (trachée), sur des cellules non-ciliées. Toutefois,
les cellules ciliées des bronchioles pulmonaires et les cellules conjonctivales
expriment la forme α2,3 de l’acide sialique reconnue par le virus aviaire. Ainsi,
pourvu des deux types de « récepteurs », le tractus respiratoire humain est
susceptible d’être infecté par des virus d’origine humaine tout comme par des
virus d’origine aviaire [19, 20, 21, 22, 23].
L’HA est très immunogène, il constitue un déterminant antigénique puissant et
la cible majeure des anticorps neutralisants. Cinq sites «épitopes» ont été décrits,
ils se situent au niveau ou à proximité de la partie globulaire distale. La
plasticité génétique de ces sites leur confère une haute labilité conformationnelle
permettant un échappement au système de défense immunitaire [3, 18, 24, 25,
26, 27].
 Neuraminidase
La NA est l’autre protéine de surface des virus grippaux des types A et B. La
forme renflée à l’extrémité distale donne aux spicules une allure de champignon.
Il existe environ cinq fois moins de NA que d’HA à la surface des particules
virales, soit environ 50 à 100 spicules. La NA a une activité enzymatique
impliquée dans le clivage de la liaison O-glycosidique entre l’acide sialique
terminal et le reste de la chaîne glucidique qui le porte.
La NA joue un rôle dans la diffusion globale des virus grippaux :
- en agissant à la surface des cellules, elle permet aux virions
néosynthétisés de ne pas se fixer sur la cellule dont ils sont issus, ou
de se dégager des cellules dans les quelles ils n’entrent pas ;
10
- elle empêche l’autoagrégation des virions qui, sans elle, porteraient
leurs propres récepteurs ;
- elle permet sans doute aux virions de se détacher du mucus riche en
acide sialique et qui constitue de véritables leurres pour les virus
participant ainsi aux mécanismes de défenses non spécifiques de
l’appareil respiratoire, en synergie avec les mouvements des cils de
l’épithélium respiratoire.
Il est à noter que le site actif de la NA des virus A et B est très conservé.
La NA est un antigène moins immunogène. Elle induit la production d’anticorps
inhibant la fonction sialidase, non neutralisants mais qui réduisent la quantité de
virus produits [1, 7, 8, 24].
 Protéine de matrice et canaux à ions
Dans le cas des virus de grippe A, La protéine M1 est la plus abondante : il y en
a environ 1100 copies par particule virale, elle assure en partie la structure des
virions. Elle présente des interactions, d’une part avec les queues
cytoplasmiques des deux glycoprotéines et avec la protéine M2, et d’autre part
avec les RNP.
Les protéines M2 délimitent des canaux transmembranaires où transitent les
ions, impliqués dans les phénomènes de fusion décapsidation des virus [1].
1.2.2. Antigènes internes
 Ribonucléoprotéines
Les nucléocapsides de symétrie hélicoïdale résultent chacune de l’association
d’une molécule d’ARN et de nombreuses molécules de NP. Il existe environ 600
11
à 650 copies de NP par virion. La NP a de nombreux rôles dans la structure des
RNP et dans le cycle de transcription/réplication [1, 7].
 Protéines NS1 et NS2
NS2 est associée à M1 dans la particule virale alors que NS1 Le produit le plus
abondant, est une protéine non structurale présente uniquement dans les cellules
infectées. La NS2 intervient dans l’exportation des RNP virales, néosynthétisées
à partir du noyau vers le cytoplasme. Quant à la protéine NS1, elle intervient
dans les étapes qui suivent la transcription en régulant l’expression de messagers
cellulaires et viraux [1, 7].
Les protéines de membrane et les nucléoprotéines sont des antigènes peu
immunogènes. Les anticorps dirigés contre eux ne sont pas neutralisants [3],
mais témoin de l’infection ; ils sont très utilisés dans les tests diagnostiques [6].
Figure 3 : Schéma d’un virus grippal de type A [7].
12
2. Cycle viral
A l’échelon cellulaire, le cycle de multiplication viral se schématise en plusieurs
étapes ; L’entrée du virus débute par l’attachement de l’hémagglutinine virale à
son récepteur -acide sialique ou acide N-acétyl neuraminique (Ac Neu)- [1, 7,
20, 21]. Après, la particule virale est endocytée. L’abaissement du pH de la
vésicule d’endocytose (généralement un pH autour de 5,0 ou 5,1), permet la
fusion entre la membrane endosomale cellulaire et la bicouche lipidique virale.
Pour les virus de type A, la protéine M2 permet de déstabiliser l’enveloppe
virale, notamment la protéine M1, et d’abolir principalement les interactions
entre les protéines M1 et les complexes RNP, permettant à ces dernières de
pouvoir migrer, libres, jusque dans le noyau [1, 8]. La transcription primaire du
génome en ARNm est catalysée par les complexes transcriptase/réplicase, et
comme il n’y a pas dans les cellules eucaryotes d’ARN polymérase ARNdépendante, les virus grippaux doivent en être « constitutivement » équipés pour
que les premières synthèses d’ARN puissent avoir lieu. L’amorçage de la
synthèse d’ARNm nécessite une coiffe qui est dérivée de transcrits cellulaires, il
se produit alors un remarquable basculement de la synthèse des protéines
cellulaires à celle des protéines grippales à cause du blocage de la traduction des
ARNm cellulaires privés de leur coiffe. Le cycle viral aboutit ainsi plus à
l’épuisement de la cellule infectée qu’à sa lyse [1].
Les segments complémentaires auront deux destinées : certains se comporteront
en messagers viraux en étant traduits en protéines et d’autres seront transcrits en
ARN complémentaires qui constitueront les génomes viraux des virions
néoformés [7].
13
Après leur synthèse au niveau cytoplasmique les protéines virales sont
enchâssées dans la bicouche lipidique à la surface cellulaire. A ce stade de la
multiplication virale, la protéine NEP permet le transfert des RNP néoformées
du compartiment nucléaire vers le cytoplasme et la protéine M1 assure leur
maintien dans le cytoplasme. La formation des virions néosynthétisés se fait par
bourgeonnement à la surface cellulaire, et la NA grâce à son activité sialidasique
assure la libération des nouveaux virions [1, 7].
IV. Epidémiologie de la grippe aviaire A/H5N1
1. Réservoirs de virus
Les oiseaux sauvages sont considérés comme le réservoir naturel majeur des
virus influenza A. Ils hébergent des virus porteurs de tous les types d’HA et de
NA connus, même si l’on n’a pu isoler toutes les combinaisons possibles de
sous-types. La plupart de ces virus se répliquent principalement dans le tractus
intestinal, ils apparaissent adaptés à leurs hôtes naturels et sont rarement
responsables d’infections dans les populations aviaires sauvages ; ils peuvent par
contre disséminer à grande échelle dans l’environnement (excréments,
sécrétions respiratoires, lacrymales, etc...). On suppose qu’en raison de leur
large distribution, les virus influenza A quittent de façon ponctuelle cet état
d’équilibre et vont coloniser d’autres espèces de vertébrés. L’hypothèse selon
laquelle les virus influenza aviaires sont les précurseurs des virus grippaux
adaptés et circulants surtout chez l’homme, prévaut actuellement [15].
14
2. Modes de transmission
 Transmission du réservoir aviaire vers l’homme
Les voies de contamination envisageables pour la transmission du virus
influenza aviaire A/H5N1 à l’homme sont :
Voie respiratoire – surtout si contact étroit et dose virale élevée.
Voie intraoculaire – Des contaminations ponctuelles et accidentelles par le
virus A/H5N1 par voie conjonctivale ont été déjà développées.
Voie digestive – L’ingestion de viande de volaille cuite dans les zones touchées
par la grippe aviaire à virus A/H5N1 est sans risque, car le virus est inactivé à la
température de 70 degrés. En revanche la manipulation de viande de volaille
contaminée crue congelée ou décongelée avant la cuisson peut comporter des
risques. La flambée importante observée chez des tigres en captivité, en
Thaïlande, serait liée au fait qu’ils ont été nourris avec des cadavres de poulets
entiers. A l’heure actuelle il n’y a pas de cas documenté de transmission
verticale Du virus A/H5N1. Cependant, les oeufs pondus 3 et 4 jours après
infection expérimentale peuvent être contaminés superficiellement et à
l’intérieur de l’oeuf. Encore il n'existe pas de preuve épidémiologique laissant
supposer que des êtres humains aient contracté la grippe aviaire en consommant
des oeufs ou des produits à base d'œufs. Toutefois, Les oeufs en provenance de
zones touchées par l’épizootie ne doivent pas être consommés crus ou
partiellement cuits (jaune encore liquide) [5, 15, 22, 28, 29].
 Transmission interhumaine
Il fut démontré que la transmission inter-humaine n’avait joué aucun rôle dans la
propagation du virus A/H5N1, les malades s’étant tous probablement
15
contaminés auprès de poulets infectés. Seules quelques suspicions très limitées
ont été évoquées au sein de groupes familiaux en Asie du Sud-Est. Cependant,
cette possible transmission n’a jamais donné lieu, jusqu’à présent, à une
contamination communautaire étendue engendrant de multiples générations de
transmission inter-humaine [28, 29, 30, 31]. Les études du tropisme cellulaire
des virus influenza démontrent que l’infection des cellules épithéliales
respiratoires non ciliées est indispensable à une réplication et à une transmission
efficaces du virus. Or, les cellules non ciliées possédent majoritairement des
récepteurs de type humain (α2,6) [16].
3. Modes de diffusion de la grippe aviaire A/H5N1
La grippe peut sévir selon 3 modes : sporadique, épidémique et pandémique [7].
A l’heure actuelle, La grippe aviaire A/H5N1 chez l’homme est responsable de :
3.1. Cas sporadiques
Ils sont le résultat du franchissement de la barrière d’espèces c’est-à-dire le
passage du poulet infecté vers l’homme sain.
3.2. Risque pandémique
Bien qu’il soit impossible de prédire avec précision quand et où la pandémie
débutera, les experts reconnaissent aujourd’hui que trois des quatre conditions
nécessaires au développement d’une pandémie sont actuellement réunies :
 Apparition et circulation d’une nouvelle souche virale contre
laquelle les humains ne possèdent aucune immunité. Par ailleurs, les
virus Influenza A possèdent la caractéristique particulière d’être
16
instables génétiquement avec pour corollaire des mutations
fréquentes.
 La vulnérabilité de l’organisme humain lorsqu’il n’a jamais été
exposé à un virus ou lorsqu’il y a été exposé il y a longtemps. Or, la
souche virale aviaire actuelle, A/H5N1, n’avait jamais infecté
l’humain avant les premiers cas documentés en 1997, à Hong Kong.
 Une virulence suffisamment forte qui frappe rapidement un grand
nombre de personnes et entraîne une morbidité élevée allant jusqu’à
la mortalité. Le fait qu’un virus n’atteigne pas seulement les
personnes les plus vulnérables est un signe de virulence. D’ailleurs,
les victimes actuelles du A/H5N1 se concentrent parmi les enfants et
les jeunes adultes en bonne santé.
Ainsi toutes les conditions préalables sont réunies, sauf une:
 L’établissement d’une transmission interhumaine efficace, qui peut
devenir une réalité par deux mécanismes [5, 9]:
- Mutation
Ce que l’on redoute à l’heure actuelle, c’est d’aboutir par mutations et sélections
successives, à l’émergence d’un variant du virus A/H5N1 adapté à l’homme qui
puisse faire l’objet d’une transmission interhumaine de plus en plus efficace et
donner éventuellement lieu à une pandémie. C’est ce type de mécanisme qui a
été à l’origine de la pandémie de 1918.
Les travaux de Taubenberger et Coll. et de Tumpey et Coll. confirment le fait
que la grippe espagnole a été le résultat d’une infection directe par le virus
aviaire qui a muté pour pouvoir se transmettre à l’homme. Alors qu’on ne s’y
attendait pas, les séquences des protéines polymérases PA, PB1 et PB2 du virus
17
de 1918 et des virus postérieurs humains diffèrent des séquences des virus
aviaires par seulement 10 aminoacides ! Et plusieurs de ces changements ont
déjà été répertoriés dans les virus très pathogéniques A/H5N1 qui ont provoqué
la mort des patients atteints par la grippe aviaire en Asie [23].
- Réassortiment viral
Il y a un deuxième mécanisme potentiel que l’on craint, à savoir le réassortiment
génétique : il correspond à un changement plus fondamental. Les virus
d’oiseaux, s’ils sont capables d’infecter directement les humains, se répliquent
souvent peu efficacement chez l’homme, et se transmettent très difficilement
d’un individu à l’autre. En effet, le déterminisme d’adaptation à l’hôte est
multigénique et concerne notamment les gènes dits internes (par exemple, ceux
qui
codent la NP et au
moins une des protéines du
complexe
réplicase/transcriptase). Il ne suffit donc pas à un virus aviaire d’être enveloppé
d’antigènes inconnus par les populations humaines, faut-il encore qu’il soit doué
d’une bonne capacité à se répliquer chez son nouvel hôte potentiel. C’est
exactement ces deux propriétés que possèdent les virus hybrides issus d’un
réassortiment entre deux virus parentaux : l’un humain et l’autre aviaire, selon le
principe suivant : à l’occasion d’une co-infection d’un Homme ou d’un porc par
un virus humain et un virus aviaire, comme les brins d’ARN génomiques viraux
sont physiquement indépendants les uns des autres, il peut se former une
particule virale hybride, au moment de la formation par bourgeonnement. Ce
virus hybride, ou virus réassortant, peut emprunter les gènes « internes
d’adaptation » à l’homme et les gènes HA et/ou NA de virus d’oiseau. Dans ce
phénomène, il y a changement complet d’une molécule de surface telle que
l’HA. Ce virus réassortant, « mi-humain-mi-aviaire », cumule l’avantage de
18
pouvoir se répliquer efficacement chez l’homme et celui de ne pas rencontrer de
défense spécifique contre lui car les HA et/ou NA aviaires ne correspondent pas
aux anticorps qui préexistent dans les populations humaines. Donc il s’agit bien
d’un sous type viral qui pourrait posséder à la fois la virulence de A/H5N1 et la
grande contagiosité interhumaine de la banale grippe hivernale. C’est alors un
virus nouveau chez l’homme, qui est potentiellement capable de provoquer une
pandémie [1, 4, 25].
C’est de cette façon qu’on pense que s’est effectué le passage à l’Homme des
souches A/H2N2 et A/H3N2 responsables des pandémies de 1957 et de 1968.
Le virus A/H2N2 serait un réassortant entre un virus de canard auquel il aurait
emprunté les segments HA, NA et PB1 et les 5 autres segments au virus
A/H1N1 humain en circulation à ce moment-là.
De la même façon le virus A/H3N2 serait le résultat d’un réassortiment
génétique, qui aboutit, notamment, à la substitution de l’HA et du PB1 du virus
A/H2N2 humanisé en circulation par une HA et un PB1 d’un virus aviaire
(canard) (Fig.4) [7, 20, 32].
19
Figure 4 : Mécanismes de survenue des pandémies grippales [17].
20
Six phases distinctes ont été définies pour faciliter la planification de la
préparation à une pandémie (Tab.1):
Tableau 1 : Classification de l’OMS relative aux niveaux d’alerte à la
pandémie de grippe [9, 11].
Nouvelles phases selon l’OMS
PERIODE INTER-PANDEMIQUE -PréparationPas de nouveau virus grippal
Phase 1
Situation 1
circulant chez l’Homme
Pas de nouveau virus grippal
Phase 2
Situations 2A et
dépisté
chez
l’Homme,
2B
malgré un virus animal
présentant un risque potentiel
de maladie humaine
PERIODE D’ALERTE PANDEMIQUE -Préparation et InterventionInfection humaine par un
Phase 3
Situation 3A et
nouveau virus (pas de
3B
Niveau d’alerte
transmission inter humaine
actuel***
ou cas rares et isolés liés à
des contacts rapprochés)
Cas groupés « clusters » de
Phase 4
Situation 4A et
transmission inter humaine
4B
limitée et localisée (virus
incomplètement adapté aux
humains)
Extension des cas groupés,
Phase 5
Situation 5A et
encore
géographiquement
5B
localisée (le virus s’adapte à
l’Homme impliquant des
grappes de transmission
interhumaine)
PERIODE PANDEMIQUE -InterventionForte transmission interPhase 6
Situation 6
humaine, avec extension
géographique rapide
21
La plupart des phases peuvent constituer le niveau d’entrée direct dans la crise,
sans avoir été précédées par les phases de degré inférieur. La pandémie peut
même avoir lieu sans le passage hiérarchique par tous les niveaux d’alerte. Et
partant de cette classification et compte tenu de la situation épidémiologique qui
prévaut au niveau international, le Monde se situerait à la Phase 3 [11].
4. Statistiques
Situation Mondiale et au Maroc
Du Sud-Est Asiatique, l’épizootie a progressé vers l’Est et l’Asie centrale, le
Moyen-Orient, l’Europe occidentale, l’Egypte et l’Afrique sub-saharienne
(-Fig.5-) [9, 12, 16, 35, 36, 37].
22
Figure 5 : Propagation de la Grippe Aviaire H5N1 dans les élevages de volailles et/ou l’avifaune
sauvage (14 Avril 2008) [38].
23
A ce jour 15 pays ont signalé des cas de grippe aviaire A/H5N1 chez les
humains, cependant il n’existe pas encore de preuves de transmission
interhumaine soutenue du virus aviaire A/H5N1 les cas humains rapportés sont
sporadiques, et localisés surtout en Asie (-Tab.2-) [9, 14].
Tableau 2 : Nombre cumulé de cas humains confirmés de Grippe Aviaire
A/H5N1 et de décès reportés par l’OMS (jusqu’au 28 Mai 2008) [14].
2003
Pays
cas
les
décès
2004
cas
les
décès
2005
cas
2006
2007
2008
Total
les
les
les
les
les
cas
cas
cas
cas
décès
décès
décès
décès
décès
L'Azerbaïdjan
0
0
0
0
0
0
8
5
0
0
0
0
8
5
Le Bangladesh
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
Le Cambodge
0
0
0
0
4
4
2
2
1
1
0
0
7
7
La Chine
1
1
0
0
8
5
13
8
5
3
3
3
30
20
Djibouti
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
L'Egypte
0
0
0
0
0
0
18
10
25
9
7
3
50
22
L'Indonésie
0
0
0
0
20
13
55
45
42
37
16
13
133 108
L'Irak
0
0
0
0
0
0
3
2
0
0
0
0
3
2
La République
Démocratique
Lao
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
0
0
2
2
Myanmar
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
Le Nigeria
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
1
Le Pakistan
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
0
0
3
1
La Thaïlande
0
0
17
12
5
2
3
3
0
0
0
0
25
17
La Turquie
0
0
0
0
0
0
12
4
0
0
0
0
12
4
Le Vietnam
3
3
29
20
61
19
0
0
8
5
5
5
106 52
Total
4
4
46
32
98
43
115 79
88
59
32
24
383 241
Le taux de mortalité parmi les sujets infectés par le virus A/H5N1 paraît élevé,
mais les statistiques ne tiennent pas compte des formes cliniques très bénignes ni
des infections ne s’accompagnant d’aucun symptôme ; dans les régions
24
concernées, seuls les cas graves font l’objet d’une investigation virologique.
Toutefois l’existence de formes asymptomatiques passées inaperçues est réelle,
en témoignent les différentes études effectuées dans le cadre des actions de
surveillance séroépidémiologique du virus A/H5N1, à Hong Kong ; la présence
d’anticorps sériques anti-H5 a été démontrée chez des personnes exposées
professionnellement et chez des sujets contacts de cas confirmés de grippe
A/H5N1 [15].
Au Maroc en l’absence actuelle de foyers animaux, le risque d’infection
humaine est virtuel. Au moment où ces lignes sont écrites, aucun cas humain
acquis au Maroc n’a encore été sérieusement suspecté ou diagnostiqué, mais ce
ne sera peut-être plus le cas le jour où ce travail paraîtra ! Quoi qu’il en soit, il
est clair que le risque n’est désormais plus nul, le statut de territoire indemne
d’une maladie n’entraîne pas pour autant de garantie absolue d’absence de la
maladie dans le futur. L’actualité récente a remarquablement illustré cet aspect
temporaire, menacé en permanence, du dit statut de territoire indemne d’une
maladie. Surtout que le Maroc, de par ses caractéristiques écologiques, ainsi que
sa situation géographique sur l’axe du couloir de migration paléarctique
occidental; (2 grandes voies migratoires, terrestre et maritime -voir Annexe 1-),
constitue une zone de passage, d’hivernage et de reproduction pour environ 200
espèces sauvages [11, 39, 40].
5. Réseaux de surveillance
 Chez l’animal
Une surveillance efficace de l’avifaune par l’autorité vétérinaire compétente
constitue un système de pré-alerte pour les menaces réelles ou potentielles.
L’insistance portant tout particulièrement sur la sauvagine et les oiseaux de
25
rivage ayant migré d’autres pays et continents. La surveillance de l’avifaune doit
se faire au moins une fois par an, durant les périodes où les déplacements ou
l’arrivée d’oiseaux migrateurs peuvent faire courir un risque accru à la volaille
domestique. Les programmes de surveillance doivent prévoir des méthodes
actives et passives et inclure des échantillonnages d’oiseaux vivants et d’oiseaux
morts. Les avertissements permettraient au secteur de l’élevage de la volaille
d’adopter des mesures de biosécurité accrues et de cibler les programmes de
surveillance de la volaille sur les populations ou les compartiments les plus à
risque.
Les laboratoires chargés de tester les virus de l’influenza aviaire doivent être
autorisés ou agréés par le laboratoire de référence de l’OIE pour ce qui est des
méthodes de contrôle employées et ils devront suivre les procédures et les tests
recommandés dans le Manuel de tests diagnostiques et de vaccins des animaux
terrestres de l’OIE. Cela s’entend des tests sérologiques, de l’identification et de
l’isolement du virus, (au Maroc deux laboratoires sont impliqués dans le
diagnostic : LNCMV -le Laboratoire National de Contrôle des Médicaments
Vétérinaires- et Biopharma -société d’Etat-). Le signalement doit s’appuyer sur
la « norme reconnue » qui comprend l’isolement du virus, le sous-typage
complet de toute souche H5, le séquençage du site de clivage du gène de
l’hémagglutinine et le test de l’indice de pathogénécité intraveineuse (IPIV)
chez le poulet. L’isolement et l’identification du virus devront être
systématiquement confirmés par un laboratoire de référence. Un point également
essentiel est la déclaration de la maladie à l’OIE qui dispose d’un réseau d’alerte
précoce global permettant d’informer tous les pays des cas de foyers déclarés.
Ce réseau est lié dans ce cas de maladie zoonotique au réseau de l’OMS [41].
26
 Chez l’Homme
On notifiera aux autorités locales de santé publique tous les patients pour
lesquels le diagnostic d'infection grippale à virus A/H5N1 est envisagé.
On recherche les contacts, ainsi que toute personne pouvant avoir été exposée à
une source commune d'infection. On surveillera ces personnes pendant 7 jours
après leur dernière exposition au patient concerné ou à la source commune
d'infection et on leur demandera de contrôler deux fois par jour leur température.
Si une de ces personnes développe une fièvre (> 38 °C), de la toux, ou une
dyspnée, on la traite immédiatement [42].
Le réseau de surveillance de l’OMS repose sur l’activité d’environ 112 CNR,
répartis dans 83 pays et de quatre centres mondiaux de référence situés en
Australie, aux Etats-Unis, au Japon et au Royaume-Uni. Au sein de ce réseau,
les missions attribuées aux CNR consistent à recueillir, à analyser et à
communiquer les informations épidémiologiques, à recueillir des prélèvements
pour l’identification précise des virus et pour les comparer aux souches de
référence reconnues par les instances internationales, à faire parvenir aux centres
mondiaux de la grippe des échantillons des souches isolées, surtout, toute
souche présentant des caractères anormaux lors des épreuves d’identification,
afin d’accélérer la détection de souches nouvelles pouvant représenter un danger
épidémique ou pandémique.
La fonction essentielle des centres mondiaux est l’identification précise des
souches de virus grippal adressées par les laboratoires nationaux. Ils centralisent
les virus isolés, comparent leurs caractères antigéniques et effectuent des
analyses génétiques. Il s’agit donc d’une fonction essentiellement virologique.
Les conclusions sont capitales, car elles conditionnent la prise de décisions
importantes lorsqu’un nouveau variant à potentiel épidémique ou encore
27
pandémique apparaît. Ces résultats constituent la base des recommandations
pour la composition vaccinale [1].
L’OMS a mis en place dans les pays dont le système de santé publique fait
défaut, un programme de surveillance, investigation et de réponse aux risques
infectieux émergents. Ainsi, l’OMS peut en cas de risque sérieux proposer une
assistance scientifique et technique au pays affecté avant que celui-ci n’en fasse
officiellement la demande, le plus souvent quant il est débordé [43].
28
DEUXIEME PARTIE
V. Clinique de la grippe aviaire A/H5N1
VI. Définition des cas A/H5N1
VII. Rôle du Laboratoire dans le diagnostic virologique d’un cas
humain de grippe aviaire A/H5N1
29
V. Clinique de la grippe aviaire A/H5N1
Les données actuelles indiquent que la durée d’incubation se situe entre 2 à 8
jours et peut même atteindre éventuellement 17 jours ; "L’OMS recommande
actuellement de partir du principe d’une durée d’incubation de 7 jours pour les
investigations sur le terrain et le suivi des sujets contacts" [4, 42, 44, 45].
 Symptomatologie clinique
Les paramètres cliniques sont marqués par l’existence d’une fièvre (38.5 40°C), myalgie, toux, dyspnée, fréquence respiratoire élevée (avec une
fréquence entre 28 à 70 cycles/min, soit une moyenne de 55 cycle/min), détresse
respiratoire, des crépitants à l’auscultation pulmonaire, diarrhée et plus rarement
une conjonctivite [4, 15, 44].
 Signes biologiques non spécifiques
Les données biologiques incluent une forte déplétion leucocytaire avec une
lymphopénie précoce synonyme de l’évolution vers une forme sévère, une
anémie, une thrombopénie, des troubles de coagulation (coagulation
intravasculaire disséminée), une altération de la fonction hépatique suite à la
nécrose des hépatocytes, avec des taux élevés des ASAT et ALAT sériques, une
atteinte de la fonction rénale avec augmentation de la créatinémie et une
hypoxémie sévère [4, 44, 45].
 Evaluation radiologique
Les radiographies pulmonaires présentent des anomalies type:
30
- Collapsus lobaires
- Opacités focalisées
- Syndrome interstitiel (Voir Fig.6) [4, 44].
Figure 6 : Radiographies pulmonaires de face de quatre patients atteints
de la grippe aviaire A/H5N1 (Vietnam 2004).
Les radiographies A, B et C appartenant a trois patients différents
mettant en évidence des opacités pulmonaires diffuses, un collapsus
lobaire et un syndrome interstitiel.
Les trois autres radiographies D, E et F présentent l’évolution de l’état
d’un patient au 5éme, 7éme et 10éme jours respectivement de sa
maladie[44].
Au fur et à mesure de l’évolution, les poumons prennent un aspect en verre
dépoli, de façon diffuse et bilatérale [15].
31
VI. Définition des cas A/H5N1
L’OMS a élaboré (en tenant compte de l’évolution de la situation
épidémiologique mondiale), les définitions de cas possible, confirmé et exclu de
grippe aviaire :
En dehors des zones d’épizooties à virus aviaires hautement pathogènes est
considérée comme "cas possible" ou suspect :
 Toute personne présentant un syndrome respiratoire aigu fébrile, ayant eu
dans les sept jours précédant les symptômes :
-une exposition professionnelle à des cas humains ou animaux, avérés ou
présumés, de grippe aviaire, ou à tout lieu ou matériel biologique avéré ou
présumé contaminé par le virus A/H5N1 ;
-ou un contact direct, prolongé, répété, ou à moins d’un mètre dans les pays avec
épizooties et cas humains de grippe A/H5N1, avec des oiseaux vivants ou morts,
sauvages ou domestiques, ou leurs fientes ;
-ou un contact proche et répété avec une personne infectée par un virus
influenza A/H5N1 ou fortement suspectée de l’être.
 Toute personne présentant un syndrome grippal avec détresse respiratoire
aiguë:
-de retour d’un pays atteint par les épizooties de grippe aviaire A/H5N1, depuis
moins de sept jours ;
-de retour d’un pays où le virus A/H5N1 a été détecté chez les oiseaux sauvages
et qui a eu un contact direct avec des oiseaux sauvages malades ou morts.
32
L’analyse des cas possibles se fait en fonction des listes des pays atteints par la
grippe humaine d’origine aviaire et par les épizooties de grippe A/H5N1 ; ces
listes sont actualisées en permanence et sont disponibles respectivement sur le
site de l’OMS [http://www.who.int/en/] et le site de l’OIE [http://www.oie.int].
En zone d’épizooties à virus grippal aviaire hautement pathogène :
Dans les pays où une activité grippale aviaire est suspectée ou identifiée, le
diagnostic de grippe humaine d’origine aviaire fait partie du diagnostic
différentiel des pneumonies aiguës sévères.
Cas possible :
 pendant les sept jours précédant les symptômes, toute personne ayant été
en contact avec :
-des oiseaux sauvages ou de la volaille domestique, vivants ou morts, à une
distance de moins d'un mètre ;
-des élevages de volaille domestique ayant fait l’objet d’un confinement dans les
six semaines précédentes ;
-toute personne faisant l’objet d’une suspicion ou d’un diagnostic de grippe
A/H5N1 ;
-toute personne décédée à la suite d’une pneumopathie aiguë inexpliquée.
 toute personne exposée professionnellement à des isolats cliniques
humains ou animaux de virus influenza hautement pathogènes, pendant
les sept jours précédant le début de la symptomatologie.
Tout cas possible doit faire l’objet d’investigations virologiques [15].
- Cas confirmé : Cas de grippe avec isolement du virus A/H5N1 par un
laboratoire agréé, national ou international.
33
- Cas exclu : Cas probable avec recherche négative du virus A/H5N1 par un
laboratoire agréé, national ou international [46].
VII. Rôle du Laboratoire dans le diagnostic
virologique d’un cas humain de Grippe Aviaire
A/H5N1
Le diagnostic de certitude de la Grippe Aviaire due au virus A/H5N1 en période
est virologique (toutefois, en cas de pandémie déclarée, la valeur prédictive
positive ou VPP du diagnostic clinique sera tellement grande qu’il suffira à lui
seul pour établir le diagnostic sans confirmation virologique).
Il s’agit d’un diagnostic d’urgence permettant l’instauration d’un traitement
antiviral approprié à temps pour éviter une évolution vers des formes graves et
le décès.
Il
constitue
par
épidémiologique
ailleurs
axée
sur
un
moyen
incontournable
l’identification
d’agrégats
de
surveillance
spatio-temporels,
permettant de contenir les premiers foyers de transmission d’un virus à potentiel
pandémique.
Le diagnostic virologique spécifique d’un cas humain de grippe aviaire A/H5N1
comprend le diagnostic direct et indirect.
Le diagnostic direct repose sur la mise en évidence du virus (culture cellulaire)
ou un de ses composants (détection immunologique rapide) ou de son ARN
génomique par des méthodes de biologie moléculaire (RT-PCR en temps réel)
qui sont rapides, sensibles et spécifiques.
Ce diagnostic direct est à privilégier et constitue l’essentiel du diagnostic.
34
Le sérodiagnostic fournit un diagnostic très tardif et n’a en pratique clinique
qu’un intérêt rétrospectif surtout dans les enquêtes épidémiologiques et le
contrôle de l’efficacité vaccinale [7, 12, 24, 46, 47, 48, 49, 50].
Tous les résultats de laboratoire concernant la grippe A/H5 pendant les périodes
interpandémiques et les périodes d’alerte à la pandémie du plan mondial OMS
de préparation à une pandémie de grippe, doivent être confirmés par un
laboratoire OMS de référence pour le virus A/H5N1 ou par un laboratoire
recommandé par l’OMS [51].
Les centres de référence nationaux et mondiaux, ainsi que les laboratoires agréés
effectuant le diagnostic des cas humains suspects de A/H5N1 doivent employer
les tests recommandés par l'OMS et interpréter les résultats selon des lignes
directrices bien définies [52].
REGLE D’OR. Les échantillons cliniques prélevés chez l’homme et le porc ou
chez les oiseaux ne doivent jamais être analysés dans le même laboratoire [51].
1. Précautions de manipulation : laboratoire de
biosécurité de niveau 3 (NSB3)
Les prélèvements suspects seront manipulés au sein d’un Laboratoire de
biosécurité de Niveau 3 (NSB3), homologué par les autorités sanitaires
compétentes, nationales ou internationales. Le laboratoire NSB3 est en
dépression par rapport au milieu ambiant, garantissant ainsi son confinement
ainsi que la protection de l’opérateur et de l’environnement.
La conception et l’aménagement d’un Laboratoire de confinement de Niveau 3
(NSB3) doivent faire appel à des organismes spécialisés dans le domaine de la
35
biosécurité. Les procédures de fonctionnement et les techniques mises en œuvre
dans ce type de laboratoire doivent s’appuyer sur une documentation appropriée.
Figure 7 : Pictogramme international de danger biologique [53].
Le code de bonnes pratiques d’un Laboratoire de biosécurité de Niveau 3
(NSB3), s’applique comme suit :
 Le panneau de danger biologique (fig.7) apposé sur la porte du
laboratoire doit indiquer le niveau de sécurité biologique, le nom du
chef de laboratoire responsable de l’accès aux locaux et préciser en
outre les conditions particulières d’entrée dans la zone.
 Avant d'entrer dans un laboratoire de niveau 3, le personnel doit retirer
ses vêtements de ville et ses bijoux et doivent être rangés hors du
laboratoire de confinement.
 Les vêtements protecteurs à porter obligatoirement avant l’accès au
laboratoire, sont à usage unique et doivent être du type suivant :
combinaisons spéciales (type Tyvek®) avec cagoule et recouvrant tout
le corps, bottes et surchausses, masques respiratoires FFP2. Des
36
lunettes de protection doivent être portés par le manipulateur (fig.8 et
9).
 Tous les matériels potentiellement infectieux doivent normalement être
manipulés dans une enceinte de sécurité biologique (poste de sécurité
microbiologique de catégorie II).
 Le laboratoire doit disposer d’un autoclave à double entrée pour la
décontamination
conformément
des
à la
déchets
avant
réglementation
leur
élimination
internationale
en
et
ce,
vigueur
actuellement.
 Un programme de gestion de la biosécurité doit avoir été mis en place
avec les autorités compétentes pour contrôler les pratiques de sécurité
et de confinement.
 Toutes les personnes qui pénètrent dans le laboratoire de confinement
doivent avoir suivi un cours de formation sur les procédures du
laboratoire et montrer qu'elles ont bien compris les instructions. La
formation doit être attestée, et un document doit être signé par le
personnel et par le responsable.
 Le personnel qui travaille dans la zone de confinement doit connaître
les détails de la conception et de l'aménagement des lieux (p. ex.,
gradients de pression entre les différentes zones, direction des flux
d'air, signaux d'alarme en cas de panne du système de pression de l'air,
périmètre de confinement).
 Le protocole du fonctionnement du laboratoire doit être conçu et lu par
le personnel, qui doit certifier par écrit en avoir bien compris les
instructions. Celui-ci doit expliquer les procédures d'entrée et de sortie
37
des personnes, des appareils, des échantillons et des déchets. En plus
du protocole de base, chaque projet doit avoir son propre protocole.
 Le personnel doit avoir prouvé sa maîtrise des techniques et des
pratiques de microbiologie.
 Le personnel de laboratoire doit périodiquement faire des tests de
fumée (placer une poire à fumée à la porte séparant le sas de la zone de
confinement, et les autres portes, le cas échéant) pour vérifier le
courant d'air directionnel. Il est également nécessaire de vérifier le
confinement (vérifier les indications du dispositif de surveillance de
pression) avant de pénétrer dans ce type de laboratoire.
 Personne ne doit entrer dans une zone de confinement sans être
parfaitement préparé et sans avoir prévu tout le matériel nécessaire. En
cas d'oubli, respecter les circuits établis (ne pas repartir chercher ce qui
a été oublié, mais plutôt téléphoner pour se faire apporter le nécessaire
ou encore sortir de l'enceinte en respectant les protocoles en vigueur).
 Le nettoyage du laboratoire doit être fait par le personnel qui utilise les
installations de confinement ou par des employés spécialisés, formés
pour cette tâche.
 Les portes du laboratoire de confinement doivent toujours être fermées
à clé.
 Les agents infectieux devraient être conservés à l'intérieur du
laboratoire de confinement. Ceux qui sont conservés à l'extérieur de
cette zone doivent être mis sous clé, dans des récipients étanches. En
pareil cas, les procédures d'intervention en cas d'urgence doivent tenir
compte de l'existence de ces agents à l'extérieur du niveau de
confinement 3.
38
 Les échantillons de laboratoire peuvent être apportés dans la zone de
confinement par un passe-plat.
 Les animaux qui ont été expérimentalement infectés doivent demeurer
dans le laboratoire ou dans une animalerie de niveau de confinement
approprié.
 En cas d'exposition probable ou avérée à des aérosols, des protocoles
fondés sur des analyses de risque faites localement doivent prévoir s'il
est nécessaire de prendre une douche avant de quitter le laboratoire.
 Les appareils thermolabiles qui ne peuvent être stérilisés en autoclave
avant de sortir du niveau 3 doivent être décontaminés dans la barrière
de confinement (par ex., par fumigation avec de la formaldéhyde,
vaporisation de peroxyde d'hydrogène ou autre solution appropriée, par
désinfection au moyen de produits chimiques ou selon toute autre
méthode ayant prouvé son efficacité).
 Les procédures d'urgence en cas de panne des systèmes de ventilation
ou autres procédures d'urgence associées à un bris de confinement
doivent être écrites, facilement accessibles et respectées.
 En cas d'extrême urgence, la santé et la sécurité des personnes sont
prioritaires. Les protocoles de sortie doivent prévoir la possibilité de
court-circuiter les procédures usuelles de sortie. En pareil cas, une
zone désignée doit avoir été préalablement déterminée afin de procéder
à d'autres mesures de décontamination (désinfection des chaussures,
douches, changement de vêtements, etc.).
 Limiter au maximum les risques de contamination cutanée au moment
d'enlever sa tenue et ses chaussures avant de quitter la zone de
confinement.
39
Figure 8 : Laboratoire de biosécurité de niveau 3 (NSB3)
Figure 9 : Masque de protection respiratoire type FFP2
40
Les recommandations relatives à la conception et à l’aménagement d’un
Laboratoire de biosécurité de Niveau 3 (NSB3) sont les suivantes :
 Le laboratoire doit être séparé des zones de passage non réglementé, à
l’intérieur du bâtiment. On peut compléter l’isolement en plaçant le
laboratoire au fond d’un couloir sans ouverture sur l’extérieur, en
construisant une cloison munie d’une porte ou encore en n’ouvrant
l’accès que par un vestibule (par exemple un sas à double entrée ou le
laboratoire de base – sécurité biologique niveau 2) délimitant une zone
spécialement conçue pour maintenir une différence de pression entre le
laboratoire et les espaces contigus. Le vestibule doit être aménagé pour
la séparation des vêtements protecteurs sales et propres et disposer
d’une douche si nécessaire.
 Les portes du vestibule doivent être à fermeture automatique et à
verrouillage asservi de sorte qu’une seule porte puisse être ouverte à la
fois. Un panneau à briser en cas d’urgence peut être prévu.
 Présence optionnelle d’une fenêtre d’observation ou d’un système
équivalent permettant de voir les occupants.
 La surface des murs, des sols et des plafonds doit résister à l’eau et être
facile à nettoyer. Les orifices ménagés dans ces surfaces (pour la
tuyauterie par exemple) doivent être scellés pour faciliter la
décontamination des salles.
 Le laboratoire doit pouvoir être fermé hermétiquement pour être
décontaminé. Des gaines seront installées pour permettre une
désinfection gazeuse.
 Les fenêtres doivent être fermées hermétiquement et résister aux
chocs.
41
 Un lavabo pouvant être commandé sans l’aide des mains sera placé
près de chaque porte de sortie.
 Le système de ventilation doit créer un courant d’air dirigé de la zone
d’accès vers l’intérieur de la salle. Un dispositif de contrôle visuel,
muni ou non d’une alarme, doit être installé, de manière que le
personnel puisse s’assurer que le flux d’air est toujours correctement
dirigé.
 Le système de ventilation doit être construit de manière à ce que l’air
qui sort du laboratoire de confinement – sécurité biologique niveau 3,
ne soit pas recyclé dans d’autres zones du bâtiment. L’air peut être
filtré au moyen d’un filtre à particules de haute efficacité (HEPA),
reconditionné et recyclé à l’intérieur de ce laboratoire. L’air évacué du
laboratoire (autre que celui qui sort des enceintes de sécurité
biologique) sera rejeté directement à l’extérieur du bâtiment, de façon
à être dispersé loin des bâtiments occupés et des prises d’air. Selon les
agents utilisés, on pourra évacuer cet air en le faisant passer au
préalable à travers des filtres HEPA. On pourra installer un système de
régulation du chauffage, de la ventilation et de la climatisation ce qui
évite toute surpression permanente dans le laboratoire. On peut
envisager l’installation d’un dispositif d’alarme acoustique ou visuel
parfaitement distinct pour prévenir le personnel en cas de panne du
système de régulation.
 Les filtres HEPA doivent tous être installés de manière à permettre la
décontamination gazeuse ou les essais de fonctionnement.
42
 Les enceintes de sécurité biologique doivent être situées hors des
zones de passage et des courants d’air entre les portes et les systèmes
de ventilation.
 L’air qui sort des enceintes de sécurité, après passage au travers des
filtres HEPA, doit être évacué sans perturber le flux d’air, ni dans
l’enceinte, ni dans le système d’aération du bâtiment.
 Il faut disposer, dans la salle même du laboratoire, d’un autoclave pour
la décontamination des déchets. Si des déchets infectieux doivent être
transportés à l’extérieur du laboratoire de confinement pour
décontamination et élimination, le transport doit s’effectuer dans des
conteneurs
incassables,
hermétiquement
fermés
et
étanches,
conformément à la réglementation nationale ou internationale, selon le
cas.
 L’alimentation en eau sera munie de dispositifs anti-retour. Les
conduites d’aspiration (circuit de vide) devront être protégées par des
pièges à liquide désinfectant, des filtres HEPA ou des dispositifs
équivalents. Les pompes à vide devront également être protégées par
des pièges et des filtres [10, 53].
2. Diagnostic virologique direct
2.1. Prélèvements
2.1.1. Types de prélèvements
Les prélèvements nasaux et pharyngés sont indiqués. Ils consistent, au niveau du
nez, à prélever d’un geste ferme, à l’aide d’un écouvillon stérile, le maximum de
cellules de l’épithélium cilié, et au niveau de la gorge, à gratter fort les
43
amygdales et ramener beaucoup de mucosités. La réalisation de lavages
nasopharyngés donne de meilleurs résultats que l’écouvillonnage. Les
aspirations bronchiques et les lavages bronchoalvéolaires réalisées sous contrôle
fibroscopique et anesthésie locale conviennent encore plus pour le virus
A/H5N1 qui a un tropisme élevé pour les cellules du tractus respiratoire
inférieur [54, 55, 56], mais ils ne sont effectués que par un personnel spécialisé
[57].
D’autres prélèvements sont envisageables: plasma, prélèvement rectal surtout si
le patient est diarrhéique et enfin le LCR en cas de suspicion d’une méningite
[49]. La neurovirulence du virus A/H5N1 est documentée chez les mammifères,
son neurotropisme a été démontré expérimentalement chez la souris. Il est donc
important, pour faire le diagnostic, de ne pas se focaliser seulement sur les
manifestations et les prélèvements respiratoires [15].
On respectera toujours scrupuleusement les précautions d’usage, notamment en
appliquant des barrières physiques de protection au moment de prélever les
échantillons sur les patients (surcombinaisons imperméables, Gants d’examen
non stériles, Lunettes ou visières de protection réutilisables, masques de
protection respiratoire munis de filtres à particules -type N95/FFP2-, Charlottes
et Surbottes à usage unique) [12, 49]. Les échantillons sont prélevés au début de
la maladie car ils contiendront les titres viraux les plus élevés [50].
Dès la fin de la réalisation des prélèvements chez le patient suspect, les déchets
de type DASRI sont recueillis dans un sac qui sera hermétiquement fermé et par
la suite éliminé selon les directives sanitaires.
Une fois qu’on n’est plus en contact avec le patient, retirer, dans l’ordre suivant,
le masque, la casaque, les gants (les mettre dans le sac à déchets en plastique qui
44
devra ensuite être détruit selon les règles d’hygiène en vigueur) et enfin les
lunettes qui doivent être lavées avec du savon puis se laver les mains avec du
savon ou une solution hydro-alcoolique [12, 46, 49].
2.1.2 : Transport et acheminement des
prélèvements au laboratoire NSB3
Les prélèvements réalisés sont placés dans des milieux de transport
commercialisés de type (COPAN Universal Transport Medium) et (Eagle
Minimum Essential Medium ou E-MEM). Alternativement un milieu de
transport artisanal pour la collecte des prélèvements peut être préparé par le
laboratoire contenant du Sérum de Veau fœtal (SVF), des antibiotiques (sulfate
de gentamicine) et des antifongiques (amphotéricine B). La stérilisation se fait
par filtration [49].
Le prélèvement ainsi introduit dans le milieu de transport, est placé dans un
triple emballage -voir Fig.10 et Annexe 2- (qui constitue le meilleur système
pour le transport des matières infectieuses ou potentiellement infectieuses)
normalisé type 6.2 de l’OMS pour préserver son intégrité, et accompagné par
une fiche signalétique pré-imprimée comportant les renseignements clinques
(date du début de la maladie et symptômes), l’anamnèse de voyage (pays, lieu et
durée du séjour du patient) et des informations sur le patient suspect de grippe à
virus influenza aviaire hautement pathogène avec la date et le type de
prélèvement -Annexe 3- [12].
45
Figure 10 : Exemple d’un système de triple emballage de sécurité
Le Kit OMS de prélèvement viral (matériel pour prélèvement, protection, fiche
de renseignements, triple emballage de transport), est fourni par le laboratoire
national de référence, destiné aux professionnels de santé réalisant des
prélèvements chez des patients classés "possibles".
Ce Kit doit être utilisé dés lors qu’une transmission interhumaine a été mise en
évidence ou en cas de suspicion d’un virus hautement pathogène [12, 46].
Une fois effectué, le prélèvement est aussitôt adressé aux CNR de la zone
géographique concernée (Laboratoire de recherche et Biosécurité de l’Hôpital
Militaire Mohammed V de Rabat, Institut Pasteur de Casablanca -au Maroc-).
Si besoin, des échantillons biologiques seront adressés à un des centres
nationaux de référence français (Institut Pasteur de Paris et le centre national de
référence OMS de la grippe à la faculté de médecine de Lyon -en France-) ou
tout autre laboratoire de référence international OMS pour contre-expertise. Les
laboratoires de référence doivent être prévenus de cette réception.
46
Le transport se fait à température ambiante, la conservation à +4°C ne doit pas
excéder 48 heures. Au-delà de ce délai, il est nécessaire de congeler le
prélèvement à une température égale ou inférieure a -70°C; cette température
préserve bien les particules virales et les acides nucléiques mais détruit les
structures cellulaires. On évitera les congélations et décongélations successives
pour préserver le pouvoir infectieux de l’échantillon.
On peut garder les sérums à +4°C pendant une semaine environ, mais au-delà il
faut congeler ensuite à -20°C. Le stockage à cette température permet de
conserver les anticorps.
Les échantillons sont transportés dans de la glace ou de l’azote liquide. Les
échantillons pour la grippe ne doivent être ni conservés, ni transportés sur de la
glace carbonique, à moins que ce ne soit dans du verre scellé ou dans un sac en
plastique scellé ou scotché et en double épaisseur. La glace carbonique peut
inactiver rapidement les virus grippaux si elle s’infiltre jusqu’à l’échantillon du
fait de la rétraction des tubes au cours de la congélation. Le récipient principal et
l’emballage secondaire doivent pouvoir résister sans fuite à une pression interne
équivalente à un différentiel qui ne doit pas être inférieur à 95 kPa (0.95 bar). Le
délai et la qualité des prélèvements ont une grande influence sur les résultats de
laboratoire [58].
2.2. Diagnostic moléculaire
2.2.1. RT-PCR classique
A- Généralités
Les techniques d’amplification génique ont été appliquées avec succès aux
génomes des virus grippaux constitués d’un ARN monocaténaire. Elles
47
consistent à synthétiser dans un premier temps un brin d’ADN complémentaire
(ADNc) à l’ARN génomique, grâce à l’action d’une polymérase, la transcriptase
inverse ou reverse transcriptase (RT) puis d’une amplification de tout ou partie
de l’ADN à l’aide d’une ADN polymérase thermostable. Il s’agit alors de
reverse transcriptase-PCR ou RT-PCR [57].
La méthode d’amplification de l’ARN (RT-PCR) exige deux types d’amorces
oligonucléotidiques. Ces deux amorces sont conçues à partir des séquences des
gènes HA et NA des sous-types grippaux A/H5N1. Ces amorces spécifiques
n’amplifieront donc que l’ARN viral d’un seul sous-type. L’ADN obtenu peut
être ensuite analysé par des techniques de génétique moléculaire comme le
séquençage.
Les séquences d’amorces recommandées par le réseau de laboratoires OMS de
référence pour le virus A/H5N1 sont décrites dans l’Annexe 4. Un groupe de
travail technique de l’OMS est actuellement constitué pour veiller à la mise à
jour et à l’élaboration des amorces en temps utile [51].
B- Méthodologie
1-Extraction de l’ARN viral de l’échantillon clinique à l’aide de kits
standardisés prêts à l’emploi (Ex : mini kit QIAamp viral RNA ou un kit
d’extraction équivalent). Celle-ci se réalise conformément aux instructions du
fabricant [59].
2-Amplification : One step RT-PCR (H5 ou N1)
Elle consiste à rajouter tous les réactifs à des concentrations et volumes définis
par le protocole opératoire : mélange dNTP (désoxy-nucléotide triphsphate) +
48
tampon + amorces sens et antisens H5 ou N1 + mélange d’enzymes + inhibiteur
de la RNase + eau (qualité moléculaire) + ARN viral extrait.
Les conditions d’amplification sont les suivantes pour H5 et N1 :
Transcription inverse : 30 min à 50° C
Activation initiale de la PCR : 15 min à 95° C
Amplification en 3 étapes : Nombre de cycles 40
 Dénaturation : 30 sec à 94° C
Elle consiste à déshybrider l’ADN, casser et dénaturer les structures et enzymes
secondaires, homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique, et
activer les ADN polymérases.
 Hybridation : 30 sec à 50° C
Des amorces sens et anti-sens « s’accrochent » aux ADN matrices en raison
d’une température thermodynamiquement favorable.
 Extension : 30 sec à 72° C
L’ADN complémentaire est synthétisé par les polymérases à partir des dNTPs
libres dans le milieu réactionnel.
 Extension finale : 2 min à 72° C
3-Révélation de l’ADN amplifié par migration électrophorétique en gel
d’agarose ; les produits de PCR sont déposés dans des puits, la migration se fait
en tampon Tris Borate EDTA (TBE). La visualisation de la bande spécifique est
effectuée par transillumination sous lumière ultraviolette par rapport à un
marqueur de taille moléculaire.
49
C- Interprétation des résultats
La taille attendue des produits de la PCR pour la grippe A/H5 est de 219 pb, et
pour la grippe A/N1 de 616 pb (voir Fig.11).
Figure 11 : Produit d’amplification du génome des virus grippaux type
A/H5N1 (en utilisant des amorces spécifiques pour H5 (A) et N1 (B)) par
RT-PCR après migration en gel d’agarose avec un marqueur de taille.
5, 6, 7, 8, 9, 10 : échantillons testés ; H5 : témoin positif ; H1, H3, W1, W2 :
témoin négatif. Adaptée de : [44, 51].
50
Si le test est effectué sans témoin positif, les produits doivent être confirmés par
séquençage et comparaison avec des séquences présentes dans des bases de
données déposées [51], ce qui permettra une compréhension meilleur de
l’évolution des virus dans le temps, et de leur relation phylogénétique. Le
séquençage est devenue actuellement la technique de référence, grâce au partage
des données dans des banques génétiques internationales [60].
La détection de séquences virales par polymérisation en chaîne après
transcription inverse (RT-PCR) en utilisant des amorces spécifiques est devenue
la méthode de diagnostic la plus sensible [54]. Le niveau d’information et le
type (M) et le sous type viral (HA & NA) [61]. La viabilité des virus n’est pas
nécessaire non plus des cellules infectées intactes [48, 62, 63]. En général, la
RT-PCR est plus sensible que la culture. Avec un taux de détection supérieur à
celui de la culture de 2 à 13% [62].
Les écueils en sont :
 Le risque de faux négatif du à la présence d’inhibiteurs dans les
prélèvements, la mauvaise qualité des acides nucléiques extraits ou
des variations génétiques (mutations) de l’acide nucléique viral cible
qui n’est pas reconnu par les amorces spécifiques.
 Le risque de résultats faussement positifs doit aussi être pris en
considération: il est dû à la contamination par de petites quantités
d’ADN cible provenant en particulier des réactions d’amplification
précédentes. Ce risque de contamination impose de grandes
précautions dans les manipulations et une sectorisation très précise
des différentes étapes de l’amplification génique dans les laboratoires
qui la pratiquent [60].
51
 En plus la PCR classique et les méthodes développées par la suite, se
prêtent mal au diagnostic rapide en raison d’un délai de réponse
variant de 3 à 16h. Le recours à l’électrophorèse ou au séquençage
pour caractériser les produits amplifiés augmente les délais [64].
L’absence des bons produits de la PCR (c’est-à-dire un résultat négatif) ne
permet pas d’exclure la présence du virus grippal. Les résultats doivent être
interprétés avec les données cliniques et épidémiologiques disponibles.
Les prélèvements provenant de malades pour qui la probabilité d’une infection
par le virus de la grippe A/H5 est élevée doivent être testés par d’autres
méthodes de diagnostic afin d’écarter une infection par le virus grippal (A/H5) :
-Méthodes rapides immunologiques pour le typage du virus grippal (tests
d’immunochromatographie et d’immunofluorescence indirecte),
-Culture virale : nécessaire pour l’isolement de la souche, identification du type
sous-type et variant viral par IHA,
-Sérologie : dans le cadre d’une enquête épidémiologique [51].
2.2.2. RT-PCR en temps réel
A- Généralités
Dans ces méthodes de détection qualitative et quantitative des acides nucléiques
en temps réel, les phases d’amplification et de révélation se déroulent en une
seule étape dans un système de tubes fermés ce qui minimise ou élimine les
problèmes de contamination et réduit le temps d’analyse. Par ailleurs, la durée
de la phase d’extraction des acides nucléiques peut être raccourcie en raison de
l’automatisation possible de cette étape (l’exemple de MagNA Pure LC -Kit et
instrument- de Roche). Le processus complet peut être donc automatisé du début
52
à la fin rendant ainsi cette technologie intéressante pour des applications
d’analyses à grande échelle [61, 65].
B- Principe de la PCR en temps réel
Il s’agit de thermocycleur combiné à un spectrofluorimètre, et repose sur une
réaction moléculaire permettant de coupler la PCR avec une émission de
fluorescence à chaque cycle, de façon proportionnelle à la quantité d’amplicons
générés, visualisable (détection et quantification) en temps réel, à l’opposé de la
PCR conventionnelle où les amplicons ne sont détectés qu’à la fin du processus
[65].
1-Aspect qualitatif :
La spécificité de cette méthode est intimement liée à la pertinence des amorces
et des sondes utilisées [65].
2-Aspect quantitatif :
Théoriquement, il existe une relation quantitative entre la quantité de la
séquence cible de départ et la quantité du produit amplifié à n’importe quel
cycle grâce à la nature exponentielle de cette technique.
Le concept du « cycle seuil » est à la base d’une quantification précise et
reproductible pour les techniques fluorescentes en PCR ; plus il y’a de matrices
à amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé sera le nombre de cycle
requis pour atteindre un point où le signal d’émission de fluorescence sera
statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce point est
défini comme étant le cycle seuil Ct (Cycle threshold) et apparaîtra toujours au
cours de la phase exponentielle d’amplification. Par conséquent, la
53
quantification n’est pas affectée par l’épuisement d’un des réactifs comme lors
de la phase plateau ce qui explique la reproductibilité du système en temps réel
(Fig.12).
La valeur du Ct peut être traduite en un résultat quantitatif en la comparant avec
les valeurs du Ct générées avec des matrices de titres connus [65].
Figure 12 : Modèles graphiques de la PCR en temps réel [66].
54
C- Technologie de détection (Sybr Green, sondes fluorogéniques)
Actuellement la technologie de la PCR bénéficie de multiples avancées :
utilisation
de
fluorochromes,
dont
le
Sybr
Green
et
des
sondes
oligonucléotidiques fluorogéniques, dont les plus couramment utilisées sont les
sondes d'hydrolyse (système TaqMan), les sondes d'hybridation (HybProbes et
fluorescence energy transfert ou FRET), balises moléculaires (Molecular
Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers). Ces différentes technologies
de détection sont à la base des différentes trousses commercialisées. Elles ont
une sensibilité équivalente avec une différence au niveau de la spécificité [64].
1-Agents se liant à l’ADN double brin
Il y’a deux classes: les agents intercalants comme le bromure d’éthidium, le YOPRO-1, le SYBR Green I -le plus fréquemment utilisé- et les agents se fixant au
sillon mineur comme le Hoeschst 33258.
Lors de la réaction d’amplification par PCR, le colorant libre en solution émet
peu de fluorescence. Durant l’étape d’élongation, une augmentation de la
fluorescence est associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin
naissant. Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence
est observée pendant l’étape de polymérisation et l’émission fluorescente décroît
complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante. Conséquemment,
l’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation
pour chacun des cycles (Fig.13). Cette technologie ne nécessite aucune sonde
fluorescente mais sa spécificité repose entièrement sur ses amorces [65].
55
Figure 13 : Mécanisme d’action des agents se liant à l’ADN double brin.
2-Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay)
La technologie Taqman est basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq
polymérase pour hydrolyser une sonde hybridée à sa séquence cible sur
l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR. Un fluorochrome
émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé à l’extrémité 5’ de
la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un second fluorochrome
suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex. TAMRA : 6-carboxytetramethyl-rhodamine). Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfert son
énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence
resonance energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt
que d’émettre de la fluorescence. Étant donné que l’activité 5’-exonucléasique
de la Taq polymérase est spécifique à l’ADN double brin, les sondes libres en
solution demeurent intactes et aucune fluorescence n’est émise. Lors de l’étape
56
d’hybridation, la sonde et les amorces se fixent à leurs séquences
complémentaires respectives. A l’étape suivante, la Taq polymérase débute
l’élongation du nouveau brin d’ADN à partir de l’amorce jusqu’à ce qu’elle
rencontre sur son passage la sonde hybridée qu’elle déplace et hydrolyse avec
son activité 5’-exonucléasique. Le reporter est alors libéré de l’environnement
du suppresseur permettant ainsi l’émission de fluorescence qui augmente à
chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde (Fig.14) [65].
Figure 14 : Mécanisme d’action de la technologie Taqman.
57
3-Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes)
Cette technologie est aussi connue sous le nom de HybProbes et repose sur
l’utilisation de deux sondes linéaires complémentaires à une séquence cible pour
maximiser la spécificité du signal. Une première sonde, bloquée à son extrémité
3’ afin de prévenir son extension durant l’étape d’élongation, transporte en 3’ un
fluorochrome donneur (FITC) qui produit une lumière fluorescente verte lorsque
excité par une source de lumière. Son spectre d’émission est plus large que celui
du fluorochrome accepteur (Red 640 ou Red 705) attaché à l’extrémité 5’ d’une
seconde sonde.
En solution, les deux sondes sont libres et séparées. Étant donné que le transfert
d’énergie par le principe FRET dépend de la distance entre les deux
fluorochromes, il en résulte alors seulement un bruit de fond de fluorescence
verte émis par le fluorochrome donneur.
Pendant l’étape d’hybridation, les deux sondes se fixent à leurs séquences cibles
respectives localisées à moins de 10 nucléotides dans un arrangement en tête-àqueue. La proximité des deux fluorochromes permet le transfert énergétique de
la fluorescéine verte par le principe FRET au fluorochrome accepteur rouge et
provoque son émission fluorescente. Pendant l’étape de polymérisation, les deux
sondes retournent de façon indépendante en solution ce qui supprime l’émission
de fluorescence rouge (Fig.15). L’accroissement de la fluorescence rouge est
proportionnel à la quantité d’ADN synthétisé durant la réaction PCR. Cette
technologie possède donc une grande spécificité et permet aussi une grande
flexibilité dans le design des sondes. De plus, comme les sondes ne sont pas
hydrolysées, elles sont réutilisées à chacun des cycles [65].
58
Figure 15 : Mécanisme d’action de la technologie HybProbes.
4-Balises moléculaires (sonde d’hybridation en épingle à cheveux :
Molecular Beacons)
Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN en forme d’épingle à
cheveux. La portion de la sonde qui compose la boucle est complémentaire à la
séquence cible d’ADN. Le tronc de la balise moléculaire est formé de deux bras
avec des séquences complémentaires. Un émetteur fluorescent (FAM, TAMRA,
TET, ROX) est fixé à l’extrémité d’un des bras et un suppresseur (quencher) (4(4’-dimethylamino-phenylazo)- benzene: DABCYL) est fixé à l’extrémité de
l’autre bras. Le suppresseur est un chromophore non-fluorescent qui dissipe en
chaleur l’énergie du fluorochrome émetteur par le principe FRET. Les sondes
libres adoptent en solution une structure en épingle à cheveux et le tronc
maintient les bras ensemble pour une suppression efficace de l’émission de
59
fluorescence. Pendant l’étape d’hybridation, lorsque la sonde rencontre une
séquence qui lui est complémentaire, elle adopte une conformation transitoire
qui force le tronc à se séparer libérant ainsi les 2 bras. La sonde s’hybride alors
préférentiellement à sa séquence complémentaire cible sur la matrice. Dans cette
conformation, le fluorochrome émetteur est éloigné de son suppresseur
restaurant ainsi l’émission de fluorescence qui peut être détectée alors que les
autres balises moléculaires demeurent en structure d’épingle à cheveux (position
fermée). Si la séquence d’ADN cible ne correspond pas parfaitement à la
séquence de la balise moléculaire aucune hybridation et, par conséquent, aucune
émission fluorescente ne survient. Ceci est principalement dû aux propriétés
thermodynamiques de la structure de la balise moléculaire qui favorisent surtout
la formation de l’épingle à cheveux sauf en cas d’hybridation parfaite des
séquences (Fig.16). La spécificité de cette technologie est telle qu’elle permet de
détecter les différences de séquences au nucléotide près, ce qui peut être parfois
difficile à réaliser avec les technologies de sondes linéaires. Le désavantage le
plus important associé à l’utilisation des balises moléculaires est le design des
sondes d’hybridation. Un design optimal du tronc des balises moléculaires est
crucial. Avec un design non adéquat, le tronc pourrait adopter une conformation
différente qui éloignerait le fluorochrome émetteur de l’environnement
immédiat du suppresseur résultant ainsi en une population de sondes mal
supprimées et un bruit de fond important. En contrepartie, si les forces
d’hybridation du tronc (dépendantes de la longueur et de la composition des
séquences complémentaires des bras) sont trop importantes, elles peuvent
interférer avec l’hybridation de la balise moléculaire à sa séquence
complémentaire cible et l’émission de fluorescence [65].
60
Figure 16 : Mécanisme d’action des balises moléculaires
5-Amorces scorpion (Scorpion primer: self-fluorescing amplicon)
Les amorces scorpion représentent une variante de la technologie des balises
moléculaires. Les fluorochromes et la sonde (partie balise moléculaire) sont
intégrés à même l’amplicon de façon irréversible durant l’amplification par
PCR. Le design d’une amorce/sonde scorpion est pratiquement similaire à celui
des balises moléculaires. L’ajout d’une molécule d’hexéthylène glycol (HEG),
aussi appelé bloqueur (stopper), est nécessaire pour empêcher la réplication de la
balise moléculaire par l’ADN polymérase pendant la réaction de PCR. Le HEG
est donc situé après le fluorochrome supresseur et est suivi d’une région amorce.
Le fluorochrome émetteur porté en 5’ de la région balise moléculaire peut être le
FAM ou le ROX et le suppresseur est normalement le rouge de méthyl. La
région amorce du scorpion permet donc d’intégrer la balise moléculaire dans le
61
nouvel amplicon pendant la réaction de PCR. La boucle de l’épingle à cheveux
est dessinée dans le but de permettre l’hybridation de la sonde à sa séquence
complémentaire cible située sur l’amplicon (Fig.17). Cette hybridation force
l’épingle à cheveux à changer de conformation permettant ainsi l’émission de
fluorescence [65].
Figure 17 : Mécanisme d’action des Amorces scorpion.
D- Kits commerciales et instrumentation
Au-delà de la mise à disposition de trousses commercialisées par différentes
firmes (Kit LightMix®, Kit Taq Man®,…), des progrès considérables ont été
62
réalisés dans le domaine de l’instrumentation [67]. Au moins 12 instruments de
PCR quantitative (amplification et détection) sont aujourd’hui disponibles, dont
le LightCycler® (Roche Diagnostics) qui représente une avancée technologique
majeure, largement mise à profit dans le cadre du diagnostic rapide. Cet
instrument peut réaliser la PCR en moins d'une heure grâce à un chauffage et un
refroidissement très rapides des capillaires avec de l'air pulsé.
Le LightCycler possède trois canaux de détection ; F1, F2 et F3 ; leur utilisation
simultanée permet d'élargir les possibilités d'analyse par multiplexage [64].
E- Application à la grippe aviaire A (H5N1)
Une RT-PCR en temps réel ciblant un fragment du gène de l'hémagglutinine H5
permet un diagnostic spécifique de la grippe A/H5N1. Des procédures
standardisées par l’OMS sont actuellement en place dans les laboratoires de
virologie afin de diagnostiquer les cas humains de grippe aviaire A/H5N1 [51,
55, 68].
En conclusion la RT-PCR en temps réel affiche de remarquables performances :
-spécificité,
-meilleure sensibilité [68],
-rapidité d’obtention des résultats - 1 à 2 heures - [68],
-bonne résistance aux contaminations par l’ADN du fait de l’absence
d’ouverture du tube réactionnel.
L’amplification génique en temps réel est aussi maintenant largement utilisée de
façon qualitative sans nécessité d’une gamme étalon [60, 69].
63
L’intérêt se tourne actuellement vers l’utilisation de techniques de PCR en
temps dites multiplex. Elles sont plus sensibles que les RT-PCR classiques et
encore plus sensibles que les RT-PCR en temps réel avec un seul type
d’amorces et de sondes [68], en réalisant des amplifications de plusieurs gènes :
M, HA, NA…(typage et sous-typage) en un seul passage par l’utilisation de
plusieurs couples d’amorces et de sondes, en un temps et dans une même
réaction, ou encore l’amplification de deux régions différentes du même gène
(H5) pour faire face aux faux négatifs dus aux mutations [7, 10, 57, 68]. Pour un
multiplexage performant le choix des amorces et des sondes doit prendre en
considération l’uniformité des températures de dissociation (Tm) -melting
temperature- [68].
Ainsi avec l’avènement des techniques en temps réel, l’amplification génique
représente un outil d’avenir pour le diagnostic. Cependant, la culture cellulaire
conserve encore sa place.
Au laboratoire, le développement d’outils moléculaires est poursuivi qui,
couplés à la culture cellulaire, peuvent contribuer à renforcer la qualité des
programmes de surveillance virologique [70, 71].
2.3. Diagnostic antigénique rapide
Il s’agit de la mise en évidence directe d’antigènes viraux dans les prélèvements,
avec ou sans amplification par passage sur culture cellulaire pour accroître la
sensibilité.
Les méthodes de diagnostic immunologique sont peu coûteuses. L’arrivée des
anticorps monoclonaux a amélioré leur sensibilité et leur spécificité, et a
contribué à faciliter la lecture et l’interprétation des résultats [1].
64
2.3.1. Détection antigénique du type grippal
2.3.1.1. Technique immunoenzymatique de type
Elisa
Cette technique permet la mise en évidence directe des antigènes viraux dans le
prélèvement. Bien qu’il soit souhaitable de prélever des cellules infectées, il
n’est pas nécessaire qu’elles soient intactes. Il est donc possible d’analyser par
cette méthode des prélèvements datant de plusieurs jours conservés à +4°C.
L’ICE est basée sur l’utilisation d’anticorps de capture pour la sensibilisation
des plaques qui améliore la sensibilité et la spécificité de la technique par
rapport à l’ELISA. Le choix de ces anticorps est fonction des conditions
épidémiologiques, c’est-à-dire qu’il tient compte des virus potentiellement ou
réellement en circulation chez l’homme : il est important de ne pas utiliser des
anticorps trop spécifiques d’un variant particulier (sérums de furet ou anticorps
monoclonaux) car, si un autre variant était présent dans le prélèvement, il ne
serait pas détecté. Il s’agit souvent de mélanges d’anticorps de lapins.
L’antigène ainsi piégé est ensuite détecté par un anticorps monoclonal de souris
spécifique de type. Cet anticorps est dirigé contre une protéine interne, la NP,
qui porte la spécificité du type et qui est hautement conservée elle est moins
variable que l’HA, ce qui élimine les problèmes de dérive antigénique.
Cette méthode a l’avantage d’être automatisable, elle est sensible, rapide et peu
coûteuse ; le résultat est obtenu après 4 à 5 h de réaction, toutefois le niveau
d’information est limité au type viral [10, 12]. La technique ELISA a peu
d’intérêt pour le sous-typage car une réactivité croisée a été signalée entre
différents sous-types [15].
De nombreuses variantes de la méthode ELISA existent. Les réactions
immunoenzymatiques peuvent être également effectuées sur des membranes de
65
nitrocellulose. Le principe reste le même que celui de l’immunocapture, sauf
que, dans ce cas, il n’y a pas sensibilisation du support sur lequel se fixent les
antigènes viraux [10].
Des kits commerciaux, comme le Flu A Directigen (Becton Dickinson). Utilise
ce principe [1, 62, 63].
Tous les Kits sont conçu pour détecter la NP excepté Zstat Flu détectant la NA
[72, 73].
2.3.1.2. Technique immunoenzymologique sur
Membrane
A- Principe
Elle repose sur la détection rapide, directe et qualitative de l’antigène de
l’influenza de type A et/ou B et emploie une méthode de dosage immunologique
sur membrane filtrante.
L’antigène cible des tests actuellement commercialisés (Flu A Directigen
Becton Dickinson) est la NP spécifique du type viral. La réactivité est mise en
évidence par le développement d’une coloration visible à l’œil nu : en effet, lors
du passage de l’échantillon à travers la membrane, tout antigène de l’influenza
de type A présent se lie de façon non spécifique à la surface de la membrane.
Les anticorps monoclonaux conjugués spécifiques de l’antigène nucléoprotéique
de l’influenza de type A se lient à l’antigène piégé après ajout à la membrane.
Deux substrats sont alors ajoutés l’un après l’autre Les anticorps monoclonaux
conjugués sont liés à l’antigène piégé. Le chromogène est alors ajouté après
lavage de la membrane et incubés pendant cinq minutes, ce qui entraîne
l’apparition d’un triangle pourpre sur la membrane en cas de test positif (Fig.18)
[74].
66
Il existe des tests combinés et différentiels reposant sur le même principe (Flu
A+B Directigen Becton Dickinson) pour la détection directe et qualitative
d’antigènes du virus influenza de type A et B. Par conséquent les antigènes du
virus influenza de type A peuvent être distingués de ceux du virus influenza de
type B dans un seul test (Fig.19) [74, 75].
B- Résultats et interprétation
Figure 18 : Résultat positif (à gauche) et résultat négatif (à droite) pour le
virus type A
(Flu A Directigen -Becton Dickinson-)
Figure 19 : Résultat positif (à gauche) et résultat négatif (à droite) pour le
virus type A
(Flu A+B Directigen -Becton Dickinson-)
67
Pour les deux tests si:
-Test positif pour le type A: Un triangle violet (quelle qu’en soit l’intensité)
apparaît dans le puits A de la membrane du ColorPAC. Le fond devra être de
couleur jaune clair à violet clair. Un point de contrôle violet devrait pouvoir être
observé au centre du triangle sauf s’il est masqué par une réaction positive
intense [74, 75].
2.3.1.3. Technique immunochromatographique
sur membrane
A- Principe
Elle repose sur la détection rapide, directe et qualitative de l’antigène de
l’influenza de type A ou B (NP) et emploie une méthode immunologique
chromatographique sur membrane. Des tests différentiels, commercialisés
(QuickVue Influenza A+B -Quidel-, EZ Flu A+B Directigen -Becton
Dickinson-) utilisant des anticorps monoclonaux hautement sensibles. Les tests
permettent de distinguer les antigènes viraux d’influenza A de ceux d’influenza
B à partir d’un même échantillon analysé sur un même dispositif.
L’échantillon à tester est déposé à l’une des extrémités d’une membrane de
nitrocellulose. Si l’antigène recherché est présent, il se lie à des anticorps antivirus influenza, conjugués à des particules de visualisation sur les bandelettes
réactives A et B correspondantes. Sous l’effet d’un tampon de lyse–migration,
les complexes antigènes–anticorps migrent par capillarité vers la zone
réactionnelle ou ils sont arrêtés par des anticorps fixés sur la membrane
(l’antigène sera capturé en sandwich). Un résultat positif se traduit par
l’apparition d’une ligne colorée.
68
L’excès de conjugué va continuer à migrer et va être immobilisé par un
anticorps qui peut être anti-lapin ou anti-souris, l’accumulation de complexes
colorés va là aussi entraîner l’apparition d’une ligne colorée : cette seconde ligne
ou ligne contrôle valide le bon fonctionnement de la réaction. En cas de réaction
négative seule la ligne contrôle doit être positive. En règle générale en cas de
positivité des tests, l’apparition des bandes est rapide : de l’ordre de 1 à 2
minutes. Pour la plupart des tests, la réaction doit être lue dans les 15 minutes.
Les tests dont la bande réactive s’est positivée plusieurs heures après la réaction
sont à considérer comme négatifs [76, 77].
B- Résultats et interpretation
Test QuickVue Influenza A+B -Quidel-
Figure 20 : Résultat positif pour le virus type A (A+) et type B (B+)
(Test QuickVue Influenza A+B -Quidel-) [77]
Si les antigènes (NP) de la grippe A ou B sont contenus dans l'échantillon
extrait, une ligne test rose à rouge apparaîtra avec une ligne de contrôle bleue
sur la bandelette indiquant un résultat positif.
69
La ligne test pour la grippe A ou B apparaîtra à des emplacements spécifiques
distincts sur la même bandelette test.
Si les antigènes du virus A ou B ne sont pas présents, ou sont présents à des taux
très faibles, seule la ligne de contrôle bleue apparaîtra.
Maintenir la bandelette test la flèche pointée vers le bas.
Si :
-La ligne rouge se situe au-dessus de la ligne de contrôle, le résultat du test est
positif pour le type A.
-La ligne rouge se situe au-dessous de la ligne de contrôle, le résultat du test est
positif pour le type B. (Fig.20)
Test EZ Flu A+B Directigen -Becton Dickinson-
Figure 21 : Résultat positif pour le virus type A
(Test EZ Flu A+B Directigen -Becton Dickinson-)
70
Un résultat positif pour l’influenza A apparaît sous forme de ligne rouge pourpre
à la position "T" de test et à la position "C" de contrôle dans la fenêtre de lecture
de Directigen EZ Flu A ( Fig.21).
Un résultat positif pour l’influenza B apparaît sous forme de ligne rouge pourpre
à la position "T" de test et à la position "C" de contrôle dans la fenêtre de lecture
de Directigen EZ Flu B [76].
2.3.1.4. Autres
La détection rapide d’antigènes d’Influenza peut également concerner la
recherche de neuraminidase. La technique actuellement commercialisée
(ZstatFlu -Zymetex Inc-) repose sur une méthode non immunœnzymatique, mais
enzymologique sans intervention d’anticorps monoclonaux. Dans le cas de ce
test, c’est l’activité intrinsèque de la NA virale elle-même qui est mise en
évidence. Un substrat étroitement spécifique des virus grippaux est mis en
contact avec le prélèvement. S’il y a des virus grippaux, ce substrat synthétique
se loge dans le site catalytique de la NA. Grâce à un chromogène lié au substrat
synthétique, la présence de ce dernier, et par conséquent de NA virale (Virus A
ou B) dans un prélèvement, est mise en évidence par réaction colorimétrique par
clivage du chromogène. Toute résultat positif se traduit par une coloration bleue
due à la précipitation du chromogène libéré (Fig.22) [1, 78].
71
Figure 22 : Résultat positif pour le virus type A ou type B
(Test le ZstatFlu -Zymetex Inc-)
72
Tableau 3 : Tableau comparatif de quelques exemples de tests de détection
antigénique rapide pour le diagnostic des virus Influenza A & B [8, 50, 62,
74, 75, 79].
Test
-FirmeDirectigen
Flu A
-Becton
DickinsonDirectigen A/B
-Becton
Dickinson-
Durée
(mn)
15
Sensibilité*
(%)
91
Spécificité**
(%)
95
Remarques
Détecte
uniquement
l’influenza de
type A
15
86.2
90.7
Détecte A et
B
(test
différentiel
entre A et B)
15
85.8
99.4
Détecte A et
Directigen EZ
B
A/B
-Becton
(test
Dickinsondifférentiel
entre A et B)
10
79.2
82.6
Détecte A et
Quick Vue
-QuidelB
(test
différentiel
entre A et B)
30
71
83
Détecte A et
ZstatFlu
-Zymetex IncB
(sans
distinction
entre les
deux)
*, ** ; pour l’Influenza type A uniquement en comparaison avec la culture
cellulaire.
Sensibilité : c’est le pourcentage de ―vrai cas de grippe‖ détecté comme positifs
par un test.
Spécificité : c’est le pourcentage de ―vrai cas de non-grippe‖ détecté comme
négatifs par un test.
73
Rq : c’est ce qui explique que ce que l’on gagne en sensibilité on le perd en
spécificité.
N.B. :
La comparaison des sensibilités et spécificités des trousses commerciales qui sont publiées par
les manufacturiers dans leurs monographies requièrent de la prudence puisque leurs études ont
été effectuées avec des groupes de patients qui diffèrent et dont les spécimens variables ont été
prélevés à différents moments après le début des symptômes
[55].
Ces méthodes sont rapides et le niveau d’information est, pour la grippe, le
type viral A ou B (absence de distinction entre la grippe saisonnière et la grippe
aviaire) [1, 8, 62, 68, 70, 80].
La rapidité de mise en œuvre de ces tests en font des tests de détection de
l’antigène de l’influenza de type A adapté au diagnostic d’urgence, en particulier
face à une suspicion de grippe aviaire chez l’homme due au virus A/H5N1 [74].
Les performances de ces tests dépendent de la charge en antigène et ne sont pas
nécessairement corrélées aux résultats obtenus en culture cellulaire pour le
même échantillon [73, 74], l’antigène présent dans l’échantillon peut être
inférieure à la limite de détection du test [50, 70].
En général l’utilisation des tests de détection rapide n’est pas recommandée par
l’OMS pour le diagnostic de la grippe aviaire A/H5N1. Ces tests ne doivent pas
être utilisés comme seuls fondements du traitement ou autres décisions de
gestion, surtout que seules quelques firmes ont fait des évaluations concernant la
réactivité de leurs Kits vis-à-vis de certains virus influenza d’origine animale.
C’est pourquoi, tous les résultats négatifs par ces tests doivent être confirmés par
culture cellulaire ou RT-PCR car les résultats négatifs n’excluent pas une
infection par un virus Influenza.
74
En fait, les valeurs prédictives positives et négatives dépendent étroitement de la
prévalence. Au tout début de l’activité, les VPN sont plus élevées et les VPP
plus faibles, les résultats faussement positifs seront alors plus probables.
Pendant un pic d'activité, les VPP seront plus élevées générant peu de faux
positifs pendant que les VPN seront un peu plus faibles [62, 75, 80, 81].
2.3.2. Détection antigénique du type et du soustype grippal A/H5N1
2.3.2.1. Technique d’Immunofluorescence
A- Généralités
Les prélèvements à analyser (obtenus dès que possible après le début des
symptômes -moins de 48 voire 24 heures- car le nombre de cellules infectées
présentes diminue au fur et à mesure que l’infection évolue) ne doivent donc pas
être congelés et doivent être acheminés le plus rapidement possible au
laboratoire de virologie à + 4 °C.
Il est préférable de pratiquer l’épreuve d’IF sur des cultures cellulaires inoculées
car cela permet d’amplifier tout virus présent [1, 51].
Cette méthode permet la mise en évidence des antigènes viraux au sein des
cellules infectées à partir de prélèvements cliniques ou de cultures cellulaires. La
technique de base des tests d’IF consiste à colorer les échantillons fixés sur les
puits d'une lame porte-objet au moyen d’anticorps à marqueurs fluorescents et à
les observer en microscopie à fluorescence [50].
En immunofluorescence directe (IFD), la présence d’antigènes viraux est
visualisée par un mélange d’anticorps monoclonaux spécifiques des types
grippaux A et B et par un mélange d’anticorps monoclonaux spécifiques du
sous-type grippal A/H5 marqués par un fluorochrome.
75
Dans le cas de l’immunofluorescence indirecte (IFI), ce n’est pas l’anticorps
spécifique des antigènes viraux qui est couplé à un fluorochrome, mais un
anticorps anti-espèce. (Ex : anticorps monoclonal de souris spécifique du soustype grippal A/H5 et conjugué IgG anti-souris marqués FITC -Isothiocyanate de
fluorescéine-).
Cette méthode nécessitant une étape supplémentaire est un peu plus longue,
mais elle permet d’augmenter la sensibilité de la détection.
Tableau 4 : tableau comparatif entre l’IF et la culture cellulaire
Sensibilité et spécificité de l’IF en comparaison avec la culture cellulaire
[15].
70-100%
Sensibilité
80-100%
Spécificité
B- Méthodologie
Cette épreuve doit être effectuée conformément aux instructions figurant dans la
trousse de réactifs OMS [51].
Les cellules épithéliales sont débarrassées de tout mucus contaminant par
centrifugation, puis fixées et colorées avec les anticorps monoclonaux
spécifiques. Les cellules de l’épithélium respiratoire infectées présentes dans un
prélèvement clinique sont très fragiles et facilement endommagées : elles
doivent donc être gardées au froid sur de la glace au cours de l’analyse et ne pas
être centrifugées à plus de 500 g.
Des lames témoins avec des cellules infectées par les sous-types A/H3 et A/H1
(et, lorsqu’il y en a, avec des cellules infectées par le sous-type A/H5) et des
76
cellules non infectées doivent être jointes pour permettre un contrôle approprié
des anticorps monoclonaux et du conjugué et aider à l’interprétation.
C- Interprétation des résultats
La coloration spécifique doit être une fluorescence vert pomme intracellulaire
intense. On peut observer une fluorescence dans le noyau et/ou le cytoplasme. Il
est important de veiller à ce que la densité cellulaire soit suffisante. La présence
d’une ou plusieurs cellules intactes montrant une fluorescence intracellulaire
spécifique peut être acceptée comme un résultat positif (Fig.23).
Figure 23 : Microphotographie d’une immunofluorescence indirecte
réalisée sur cellules infectées par le virus A/H5N1
Les anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce pour le sous typage
des virus grippaux A/H1 ont montré des réactions croisées avec les sous-types
A/H5, les tests de confirmation doivent être effectués au moyen de l’anticorps
monoclonal fourni dans la trousse OMS qui contient un pool d’anticorps
77
monoclonaux spécifiques du type A/H5, un pool dirigé contre le type A et B et
un pool spécifique de A/H1 et A/H3 [15, 51].
Les résultats de l’IF sont rapidement disponibles (1 à 2 h). Mais malgré sa
simplicité apparente et sa très large diffusion, l’IF nécessite beaucoup de savoirfaire et des manipulateurs expérimentés pour la lecture et l’interprétation [60].
2.4. Culture cellulaire
Cette méthode de référence pour le diagnostic de laboratoire, présente
l’avantage de permettre l’isolement de la souche, son identification, sa
caractérisation antigénique et génétique approfondie, ainsi que l’étude de la
sensibilité aux antiviraux et la préparation de vaccins. Elle est particulièrement
indiquée dans le cas où les prélèvements sont pauvres en virions ou en antigènes
viraux, elle permet d’améliorer la sensibilité de la détection directe car elle
représente un moyen efficace d’amplification de la quantité d’antigènes viraux
initiale [10, 45, 78], permettant l’obtention d’un matériel infectant qui peut
servir aussi à l’élaboration d’anticorps spécifiques, Elle présente, en outre,
l’avantage de permettre l’archivage des souches -virothéque- (par congélation)
pour des études ultérieures [23].
La culture cellulaire, malgré sa lenteur (donne des résultats en 2 à 10 jours),
reste une méthode très sensible. Actuellement la culture cellulaire est considérée
comme étant le Gold standard pour le diagnostic d’une infection par le virus
A/H5N1 [10, 24, 51, 71].
78
2.4.1. Systèmes cellulaires utilisés
2.4.1.1. Isolement du virus sur Œuf de poule
embryonné
L’œuf de poule embryonné a longtemps été le meilleur moyen d’isoler les virus
grippaux, car il présentait de nombreux avantages, dont la sensibilité et le faible
coût [57].
Actuellement, ce système est délaissé au profit des cultures sur monocouches
cellulaires particulièrement pour le H5 et le H7 qui sont létaux pour les
embryons de poulet [4, 5, 57].
2.4.1.2. Isolement du virus sur Cellules de rein
de chien MDCK
En effet, l’inoculation aux cellules canine MDCK est devenue la méthode de
référence pour l’isolement des virus grippaux. Cette lignée continue de rein de
chien présente l’avantage d’être cultivée facilement et donne de très bons
rendements et permet des isolements faciles des virus grippaux [57].
Contrairement aux autres souches du virus grippal A, le virus grippal A/H5
poussera également dans d’autres lignées cellulaires courantes telles les cellules
Hep-2 et RD.
Les méthodes classiques de cultures cellulaires en laboratoire doivent être
suivies pour la multiplication des cultures cellulaires, l’inoculation des
échantillons
et
la
récolte
des
cellules
infectées
pour
l’épreuve
d’immunofluorescence ou du surnageant de culture pour l’hémagglutination et
l’inhibition de l’hémagglutination.
79
 La multiplication des cellules est effectuée dans un milieu stérile, sur un
support plastique auquel elles adhèrent pour former une couche
monocellulaire [60]. Généralement la confluence du tapis cellulaire est
atteinte en 24 à 48h [10].
Figure 24 : Tapis de monocouche cellulaire (MDCK) vue au microscope
inversé.
 Les conditions de culture les plus favorables ont été bien définies : milieu
sans sérum (pour éviter l’inhibition de la Trypsine), adjonction de trypsine
pour cliver le précurseur de l’HA et faciliter la diffusion du virus,
inoculation par centrifugation du prélèvement, l’incubation se fait à 35°C
en atmosphère humide à 5% de CO2 [12, 82].
2.4.2. Détection virale
Comme les autres virus grippaux; le virus A/H5N1 ne donne pas d’effet
cytopathique spécifique. Sa détection et son identification peuvent être fait à
partir des cellules en culture :
80
-Par hémagglutination des surnageants de culture cellulaire suivie d’une analyse
antigénique (sous-typage) par IHA au moyen d’un panel d’immunsérums de
référence. On peut ainsi distinguer les sous types et dans un sous type, les
variants.
-Par IF avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine NP.
-D’autres méthodes comme la RT-PCR ou éventuellement l’IF, peuvent aussi
être utilisées pour différencier les sous-types de grippe A.
-De même, il est possible de caractériser la NA en utilisant une réaction
d’inhibition de cette activité à l’aide de sérum spécifique (anticorps
monoclonaux de spécificité connue) [12, 15, 51, 57, 60, 83].
2.4.2.1. Observation de l’effet cytopathique
Pour juger du résultat de l’isolement, on observe les cultures sous le microscope
inversé : les cellules infectées sont détruites et les cultures dégénèrent
rapidement.
On peut gagner du temps en éprouvant le surnageant de culture dés le deuxième
jour suivant l’inoculation, pour y rechercher l’HA –le virus présent agglutine
efficacement les globules rouges et le titre obtenu est souvent suffisant pour
permettre l’identification directe par IHA–, ou en grattant des cellules pour y
détecter des protéines virales par IF. Lorsque la quantité de virus présente dans
le prélèvement est faible, il arrive que l’infection ne se manifeste que
tardivement et il est recommandé d’observer le système tant que les cellules
survivent, en ajoutant du milieu frais si nécessaire pour compenser la quantité
retirée pour les épreuves d’hémagglutination. Il est possible que la présence
d’anticorps en faible quantité dans le prélèvement ralentisse l’activité du virus
qui peut se dissocier tardivement des complexes immuns. Les cultures restent
81
viables jusqu’à 10 ou 12 jours et les isolements sont encore possibles jusqu’à
cette limite [10].
2.4.2.2. Hémagglutination
Le virus grippal possède la capacité d’agglutiner les hématies de différentes
espèces animales de façon quantitative et visible macroscopiquement.
L’agglutination est due à l’attachement des molécules d’HA par leur «site
récepteur» aux acides sialiques des hématies, qui sont portés par des
sialoglycoprotéines (glycophorines) et des sialolipides (gangliosides).
L’HA est un antigène de surface de la particule virale et l’évaluation de sa
quantité permet d’apprécier celle du virus grippal dans une suspension ainsi La
découverte de la propriété à hémagglutiner que possèdent les virus grippaux a
fourni aux virologistes un outil simple et efficace de détection puis de titrage.
L’hémagglutination du virus grippal peut être inhibée par des anticorps
spécifiques de la souche virale, mais aussi par des inhibiteurs non spécifiques,
que l’on retrouve dans le sérum de la plupart des espèces animales. Ce sont des
glycoprotéines (ou des lipoprotéines), plus ou moins analogues aux récepteurs
spécifiques du virus, qui se trouvent sur la membrane des hématies ou des
cellules sensibles. Il convient donc de se débarrasser auparavant des inhibiteurs
non spécifiques par un prétraitement du sérum au RDE (filtrat de culture de
Vibrio cholerae) ou au trypsine/périodate, selon l’espèce. On doit aussi éliminer
des sérums les agglutinines naturelles pour les globules rouges par une étape
d’adsorption [1, 24, 51].
82
 Principe de l’hémagglutination (Titrage des antigènes)
Après mise en contact des suspensions virales (une série de dilution) avec une
concentration standard d’hématies, observer leur sédimentation après 60 ou 90
min à température ambiante. Puis, lire le titre de l’antigène [10, 24].
 Résultats et interprétations
Le titre de l’antigène est indiqué par la dilution du virus la plus élevée donnant
encore une hémagglutination complète est considérée comme étant le point final
de la réaction qui correspond à une « unité » hémagglutinante.
N.B.: Il ne s’agit pas d’une vraie unité mais d’une concentration qui porte mal
son nom : une « unité » hémagglutinante est la concentration pour laquelle un
volume V de suspension virale agglutine un volume V de suspension d’hématie
à 0,5% ou 1% selon le protocole employé [10, 24].
2.4.3. Identification du type, sous-type et variant
Viral
2.4.3.1. Inhibition de l’hémagglutination
 Principe
L’antigène est dilué de façon à titrer 4 unités hémagglutinantes (la dilution à
appliquer est obtenue en divisant par 4 le dénominateur du titre défini
précédemment), puis on procède à une série de dilution. L’antigène sera mis en
présence de sérums de référence dirigés contre le virus soupçonné. Laisser une
heure à la température ambiante, après mise en contact avec les hématies. On
peut mettre une nuit à +4°C : la lecture n’en sera pas affectée.
83
La technique du coulage facilite cette lecture. Pour cela, mettre la plaque en
position quasi-verticale pendant quelques minutes.
Lire les titres des sérums et déterminer le type du virus [10, 28].
Le point final de la réaction de l’IHA est la dernière dilution d’immunsérum qui
inhibe complètement l’hémagglutination. Le titre est exprimé sous la forme de
l’inverse de la dernière dilution. L’identification de l’isolement s’effectue en
comparant les résultats de cet isolement inconnu à ceux du témoin antigénique.
On considère qu’un isolement appartient à un sous-type grippal A précis si le
titre IHA spécifique de sous-type est au moins égal à quatre fois le titre obtenu
avec l’autre immunsérum.
L’IHA est la méthode de référence, elle est simple, peu coûteuse et permet la
détermination du type, sous-type et même du variant en cause. Le choix des
antigènes de référence est étroitement lié à la connaissance des souches en
circulation [10].
2.4.4. Méthodes d’études in vitro de la sensibilité
des virus aux antiviraux
La réalisation de l’antivirogramme ou étude de la sensibilité des souches isolées
aux antiviraux est fondamentale car elle permet d’aider le clinicien à faire le bon
choix thérapeutique (quand c’est possible) et permet en outre une surveillance
épidémiologique de la résistance des souches circulantes.
84
La détection de la résistance d’un virus à un ou plusieurs antiviraux est basée sur
des méthodes phénotypiques et/ou génotypiques dont les principes sont les
suivants :
2.4.4.1. Méthodes phénotypiques
Elles sont basées sur la culture in vitro du virus, isolé à partir du matériel
biologique prélevé sur le malade, en présence d’une gamme de concentrations
de l’antiviral. Plusieurs passages sont obligatoires avant d’obtenir un titre
suffisant. Toutefois, Il est possible d’opérer directement à partir du prélèvement
s’il est suffisamment riche en particules virales. L’ensemencement du système
de culture cellulaire (SCC) par la suspension virale dans des micro-plaques de
24 ; 48 ; ou 96 puits doit respecter certains impératifs :
- Ajuster l’inoculum viral à 10 à 100 fois la TCID 50 -Tissue Culture
Infectious Dose 50 %- /ml ou bien 10 à 100 UFP -Unité formant plage/puit ;
- Incuber préalablement le SCC avant de substituer les concentrations de
l’antiviral au surnageant pour permettre l’infection des cellules ;
On utilise souvent 5 à 6 concentrations progressives d’antiviral et une culture
témoin sans antiviral. La mesure de la réplication est approchée de différentes
manières, dont la plus classique est la quantification directe de l’effet
cytopathique (Technique de réduction de plage de lyse). Chaque concentration
de l’antiviral est testée en présence de plusieurs replicats de titre connu. La
concentration pour laquelle on observe 50 % (respectivement 10 %) de replicats
correspond à la CI 50 concentration de l’ATV diminuant de 50 % le niveau de la
réplication virale ; (respectivement CI 90).
85
L’intérêt de ces méthodes est grand dans la mesure où elles sont d’interprétation
aisée car elles évaluent directement la résistance d’une souche virale en présence
de l’antiviral. Ces méthodes assurent un diagnostic de certitude et sont de ce fait
considérées comme techniques de référence. Par ailleurs, l’emploi de certaines
techniques telles que la colorimétrie et la cytométrie de flux pour évaluer l’effet
cytopathique, permet leur automatisation et un gain de temps non négligeable.
2.4.4.2. Méthodes génotypiques
Elles utilisent les techniques de biologie moléculaire pour la détection de
mutations prouvées responsables du caractère résistant en partant soit des
prélèvements biologiques soit des isolats de SCC. Elles démontrent que les
codons à certains endroits des gènes sont normaux (sauvages) ou mutés. Ces
méthodes sont plus rapides et moins coûteuses que les techniques classiques. La
mutation responsable de la résistance est nécessaire, bien qu’insuffisante pour
une conclusion formelle.
La méthode la plus utilisée à l’heure actuelle est le séquençage.
- Séquençage : Total ou partiel du gène porteur de la mutation responsable de
résistance. Cette technique représente la référence en matière de tests
génotypiques.
La méthode de Sanger est utilisée pour le séquençage de routine. C'est une PCR,
au cours de laquelle on ajoute des didéoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP) marqués par un fluorochrome au mélange réactionnel habituel. La
polymérase synthétise l'ADN en utilisant, au hasard, soit les déoxynucléotides,
soit les didéoxynucléotides. Chaque fois qu'un didéoxynucléotide est incorporé
dans la chaîne d'ADN, l'élongation de la chaîne s'arrête, car ces molécules ne
86
permettent pas la liaison phospho-diester suivante. La réaction de séquence
aboutit donc à la fabrication de fragments d'ADN de toutes les tailles possibles
(par exemple, pour un fragment d'ADN recopié de 200 nucléotides, de 1 à 200).
Les séquenceurs « automatiques » permettent la détection automatique du
fluorochrome sur ces fragments d’ADN, par électrophorèse. Celle-ci est réalisée
soit en gel vertical d’acrylamide, soit dans des capillaires de silice remplis de
polymère. L’interprétation se fait à l’aide d’un logiciel spécialisé, sur un
ordinateur directement connecté au séquenceur (Fig.25).
Figure 25 : Analyse d’une réaction de séquencage après lecture sur un
séquenceur automatique : les deux brins d’ADN, sens et anti-sens, ont été
séquencés (deux électrophorégrammes) et les séquences sont comparées
entre elles et à une séquence de référence connue. Le « consensus »
représente la séquence finale, obtenue après correction humaine des
ambiguïtés non résolues par le séquenceur automatique [84].
87
A côté des techniques modernes de séquençage (dont le pyroséquençage), il
existe d’autres techniques indirectes pour confirmer ou infirmer la présence d’un
gène muté :
- PCR sélective : Il s’agit d’une PCR orientée vers une mutation précise,
corrélée à la résistance. On effectue l’extraction de l’acide nucléique viral et on
amplifie la région suspecte. On mène deux PCR en parallèle : l’une avec une
amorce spécifique de la séquence sauvage et l’autre avec une amorce spécifique
de la région mutée. Selon les résultats, on conclut à l’absence ou à la présence
de la souche sensible.
Toute PCR positive doit être validée par l’analyse du produit d’amplification par
de nombreuses méthodes dont la RFLP -Restriction Fragments Length Profile-.
En conclusion, les techniques génotypiques permettent la détection des
mutations fréquentes et documentées associées à la résistance aux antiviraux.
Toutefois et contrairement aux tests phénotypiques qui constituent une certitude
diagnostique, ils ne permettent pas, en toute rigueur, d’affirmer que la souche
étudiée a perdu sa sensibilité in vivo lorsque l’échec thérapeutique n’est pas
constaté cliniquement [85].
3. Diagnostic sérologique
3.1. Prélèvements
Pour mettre en évidence une infection virale à A/H5N1, il faut une paire de
sérums prélevée à partir du même patient, l’un pendant la première semaine de
la maladie et l’autre plus tard après 2 à 4 semaines, et mettre ainsi en évidence
une augmentation significative des titres en anticorps (séroconversion).
88
La nécessité d’un second sérum limite l’utilisation de la sérologie dans cette
maladie aiguë. Elle permet, toutefois, d’avoir un diagnostic de certitude lorsque
aucun prélèvement respiratoire n’a pu être réalisé [10, 24].
3.2. Techniques utilisées
Les tests sérologiques dont on dispose pour la mesure des anticorps spécifiques
de la grippe A comprennent les tests de neutralisation virale, d’IHA, et les tests
immunoenzymatiques.
Le microtest de neutralisation étant le plus sensible est celui que l’OMS
recommande pour la mesure des anticorps spécifiques dirigés contre le virus de
la grippe aviaire A/H5N1 hautement pathogène [51, 80, 82, 86].
C’est le test de choix pour la mise en évidence d’anticorps dirigés contre les
virus aviaires hautement pathogènes. Il permet la détection d’anticorps
spécifiques anti-HA, à des titrages que ne permettent pas les techniques d’IHA
[15, 82].
Le recours aux tests de neutralisation virale pour la détection des anticorps
spécifiques dirigés contre le virus de la grippe aviaire A/H5N1 est restreinte aux
laboratoires disposant d’installations de confinement de niveau 3 et tout le
personnel doit utiliser une protection respiratoire en raison de l’utilisation de
virus vivants. [17, 51, 80, 82]
 Principe
Les anticorps sont dits neutralisants lorsqu’ils ont la capacité d’empêcher un
virus d’infecter des cellules sensibles.
89
Le principe de la séroneutralisation est de mettre en présence du sérum à étudier
(en série de dilution), des suspensions virales connues (titre, type et sous-type).
Après incubation, le mélange est inoculé à des monocouches de cellules.
Si après une période d’incubation variable en fonction du virus étudié, il n’est
pas possible de mettre en évidence le virus ou ses composants, c’est que le
sérum testé comportait des anticorps neutralisants spécifiques du virus avec
lequel il a été mis en contact.
Le titre du sérum testé en séroneutralisation pour une suspension virale donné
est la valeur inverse du taux de dilution de sérum le plus haut pour lequel il y a
eu neutralisation.
Une des applications pour lesquelles cette méthode est utile est l’étude des
anticorps post-vaccinaux car elle permet la mise en évidence, in vitro,
d’anticorps protecteurs. [10, 80]
90
TROISIEME PARTIE
VIII. Prophylaxie
IX. Traitement
91
VIII. Prophylaxie
1. Moyens non spécifiques
1.1. Stratégies de lutte contre la grippe aviaire chez
l’animal
 Quarantaine et contrôle des déplacements
L’imposition immédiate d’une quarantaine étroitement contrôlée sur tous les
lieux suspectés d’être infectés est essentielle pour le succès du programme
d’éradication. Les conditions de la levée de quarantaine sont stipulées comme
suit: 21 jours pour le point d’infection et la zone d’infection après un traitement
strict conformément aux exigences techniques standard et plus de 14 jours pour
la zone menacée où tous les oiseaux sensibles doivent être vaccinés. Le principal
composant immunogénétique du vaccin est la protéine de l’hémagglutinine. Elle
doit être du même sous-type que le virus du foyer (pour l’actuelle panzootie
c’est le H5). L’antigène de la neuraminidase peut être le même que la souche du
foyer. Cependant, si une sérologie différentielle doit être entreprise pour suivre
la réponse au vaccin ou l’activité virale, alors une neuraminidase différente
devrait être utilisée dans le vaccin (par exemple, H5N2 ou H5N9). Il est
également possible de laisser non vaccinés un petit nombre d’oiseaux sentinelles
identifiés qui aideront à assurer le suivi de l’infection du troupeau. Si les oiseaux
sentinelles présentent des symptômes de la maladie ou meurent, l’isolation du
virus et des tests sérologiques doivent être effectués pour confirmer l’infection.
Et après qu’aucun nouveau cas n’apparaisse, elle est inspectée et les résultats
validés par les autorités concernées.
92
 Abattages des animaux
La méthode privilégiée est le gazage au dioxyde de carbone. L’égorgement est
une méthode à proscrire car l’effusion de sang peut être un facteur
supplémentaire de diffusion du virus.
 Elimination sécurisée des carcasses
Enfouissement – C’est la meilleure élimination des oiseaux morts, des fientes
de volaille et autres déchets contaminés. De la chaux peut être ajoutée aux puits
d’enfouissement pour empêcher les vers de terre d’apporter du matériel
contaminé à la surface après la fermeture du puits. Il est suggéré de couvrir les
carcasses avec 40 cm de terre, et d’ajouter une couche intacte de chaux éteinte
[Ca(OH)2] avant que le remplissage ne soit achevé. La chaux ne doit pas être
placée directement sur les carcasses car elle ralentit, et pourrait même empêcher,
la décomposition. L’enfouissement n’est parfois pas souhaitable parce que cela
aurait des effets négatifs sur l’environnement, tels que la contamination
potentielle de l’eau souterraine des nappes phréatiques.
Compostage – La décomposition biologique, ou le compostage, est un moyen
efficace de traiter le fumier et les fientes de volaille et peut être faite dans les
abris ou autrement sur le site, résolvant ainsi le risque de dissémination du virus
pendant le transport.
Incinération – Le principe est de placer les carcasses sur du matériel de
combustion suffisant, assurant le feu le plus chaud et la combustion la plus
complète dans le temps le plus court. On peut utiliser du diesel ou de l’huile de
chauffage (pas d’essence) et préparer les points d’ignition tous les 10 mètres sur
toute la longueur du fossé d’incinération. Ceux-ci peuvent être faits avec des
torchons imbibés de kérosène. Un feu bien construit brûlera toutes les carcasses
93
en 48 heures. Les cendres doivent être enfouies et le site restauré aussi bien que
possible.
Equarrissage – L’équarrissage est un système clos pour un traitement
mécanique et thermique des déchets.
 Décontamination
(Voir Annexe 7).
 Période de réduction des troupeaux
Après
l’achèvement
des
procédures
d’abattage,
d’élimination
et
de
décontamination, les sites doivent être vidées des espèces sensibles (réduction
des troupeaux) pendant un certain temps, déterminé par le temps estimé de
survie du pathogène dans l’environnement spécifique. Le repeuplement ne doit
pas se produire avant au moins 21 jours après qu’un nettoyage et une
désinfection satisfaisants aient été effectués et que le foyer ne soit sous contrôle
dans la zone. Le repeuplement doit être entrepris en introduisant d’abord un petit
nombre de volailles, et que celles-ci soient suivies chaque jour pour les signes de
maladie. Si cela se produit, le signalement aux autorités doit être immédiat et le
prélèvement des oiseaux malades ou morts doit être fait pour déterminer la
cause. Si les volailles restent en bonne santé, un repeuplement complet peut être
fait. Bien entendu, une amélioration de la biosécurité doit être instituée à tous les
stades de la production pour réduire la probabilité de réapparaître la grippe
aviaire sur les sites après rétablissement. Après le repeuplement, le suivi doit
être continu par le biais de prélèvements sur des oiseaux morts pour déterminer
si une nouvelle infection s’est produite.
94
L’OMS recommande que les personnes chargées de l’abattage des volailles
portent des vêtements protecteurs -une surcombinaison ou une surblouse à usage
unique, un masque de protection respiratoire (au moins de type chirurgical), des
lunettes ou une visière de protection, une charlotte, des gants et des surbottes à
usage unique. Les protections individuelles jetables doivent être retirées dès la
sortie du bâtiment contaminé. Elles sont jetées dans un sac poubelle qui sera
hermétiquement fermé et qui sera éliminé selon les recommandations des
services vétérinaires- et reçoivent un traitement antiviral par mesure de
précaution. La vaccination contre la grippe saisonnière normale a également été
recommandée, afin de réduire la probabilité que ce groupe à haut risque puisse
contracter à la fois un virus aviaire et un virus humain, donnant ainsi aux virus
l’occasion d’une réorganisation génétique. L'état de santé du personnel
d'abattage, et des membres de leur famille sera contrôlé. Ils doivent signaler aux
services sanitaires toute difficulté respiratoire, maladies ressemblant à une
grippe ou infection des yeux. Et une surveillance sérologique sera mise en place
[5, 11, 46, 87].
1.2. Isolement des patients et barrières physiques de
protection
La lutte contre l'infection et prévention de la propagation nosocomiale de la
grippe à virus A/H5N1 est fondamentale. En effet, la grippe humaine se
transmet par des gouttelettes respiratoires et de fines particules en suspension
dans l'air. On sait qu'il peut y avoir transmission par contact direct ou indirect. A
ce jour, rien n'indique qu'il y ait eu une transmission par voie aérienne au cours
des flambées actuelles. Toutefois, l'OMS recommande actuellement d'utiliser
des masques de haute protection en plus de prendre les précautions d'usage pour
95
les contacts et l'inhalation des gouttelettes. De plus, elle recommande que les
salles soient, dans la mesure du possible, équipées d'un système d'aspiration de
l'air.
Il convient d'isoler le patient dans une chambre individuelle. S'il n'y en a pas, on
regroupe ces patients dans des chambres ou des salles communes réservées à la
grippe aviaire. Il doit y avoir un écart de plus d'un mètre entre deux lits et il est
préférable d'installer une séparation physique (rideau, panneau ou paravent).
L'équipement de protection individuel (EPI) devant être porté par tous ceux qui
entrent dans les chambres où sont hospitalisés les malades se compose d'un
masque (masque de haute protection si possible ou masque chirurgical), d'un
tablier, de lunettes de protection et de gants.
On limitera le nombre de soignants en contact direct avec les patients et ce
personnel ne devra pas s'occuper d'autres malades. Le nombre des autres
employés de l'hôpital (personnel d'entretien ou de laboratoire) autorisés à se
trouver dans le voisinage des patients doit également être limité. Les soignants
qui ont été désignés doivent tous avoir été suffisamment formés aux mesures de
précautions à prendre contre les infections. On limitera le nombre des visiteurs
et on leur donnera l'EPI nécessaire en leur montrant comment s'en servir.
On demandera aux soignants en contact direct avec les patients de contrôler
deux fois par jour leur température et de signaler immédiatement aux
responsables de l'hôpital toute poussée fébrile. Un soignant qui présente de la
fièvre (> 38 °) et qui a été en contact direct avec un patient doit être traité
immédiatement. On proposera la prophylaxie post-exposition à tout soignant qui
a été potentiellement en contact avec des gouttelettes infectieuses émises par un
patient alors qu'il ne portait pas un EPI suffisant. Les soignants qui ne se sentent
pas en forme ne devraient pas assurer directement les soins des patients, car ils
96
sont alors plus vulnérables et courent un risque plus grand de développer une
forme sévère de la maladie s'ils sont exposés à des virus A/H5N1.
Les déchets devront être éliminés en les mettant dans des sacs étanches et
scellés, portant la mention « Risque biologique » de manière bien visible. Ils
devront être incinérés. Il faut manipuler et désinfecter séparément le linge et le
matériel réutilisable en contact avec les patients [42].
1.3. Chimioprophylaxie
La chimioprophylaxie est en fait une ―prévention immédiate‖ dans la mesure où
contrairement au vaccin son effet protecteur ne dure que pendant son
administration [22, 88].
Les médicaments antiviraux (les inhibiteurs de la euraminidase) constituent un
apport important à la prophylaxie de la grippe. Ils n’ont pas vocation à se
substituer à la vaccination grippale qui demeure le traitement préventif de
référence. Ils constituent une alternative à titre préventif chez le non-vacciné ou
en cas de souche pandémiogène non incluse dans le vaccin. Toutefois il faut
rester vigilant vis-à-vis de l’émergence des mutés résistants [1, 18, 57, 89, 90,
91].
La combinaison de l’utilisation des antiviraux en prophylaxie en anneau autour
des premiers cas, combinée à des mesures de distanciation, pourraient permettre
de contenir les premiers foyers de transmission d’un virus à potentiel
pandémique [92].
L’OMS recommande l’utilisation de l’Oseltamivir chez les personnes en contact
avec un sujet atteint par le virus A/H5N1, à la dose de 75 mg par jour chez
l’adulte pendant sept à dix jours, et à des doses adaptées en fonction du poids
97
chez l’enfant de plus d'un an. Pour les expositions prolongées et/ou répétées,
notamment pour le personnel soignant et les personnes impliquées dans les
opérations de destruction des élevages de volaille, des cures préventives,
répétitives ou un traitement continu peut être nécessaire. Les mesures d'hygiène
doivent être renforcées, notamment pour les enfants de moins d’un an qui ne
peuvent bénéficier de la chimio-prophylaxie [93].
2. Moyens spécifiques
2.1. Vaccination
Elle reste sans conteste l’arme ultime face à une pandémie.
 Le vaccin antigrippal classique annuel
Le vaccin annuel contre le virus de la grippe humaine circulant de la saison en
cours est un vaccin trivalent constitué d’antigènes provenant de trois souches,
elles-mêmes définies deux fois par an par l’OMS pour tenir compte de la
mutation du virus : une contre le virus grippal type B, et deux contre les virus
grippaux type A (H1N1 et H3N2). La saison vaccinale commence en septembre
dans l’hémisphère nord, et en février dans l’hémisphère sud [4, 93].
L’OMS recommande la vaccination par le vaccin saisonnier, des populations
potentiellement exposées aux virus A/H5N1, dans les régions atteintes par les
épizooties. Cette vaccination ne protège pas contre les souches virales d’origine
aviaire. Elle se justifie par la crainte de voir apparaître des réassortiments entre
les virus aviaires et humains, en cas d’infection mixte. De tels échanges de
gènes pourraient favoriser l’apparition de redoutables souches humanisées [15].
98
 Le vaccin pré-pandémique
Le vaccin dirigé contre le virus de A/H5N1 circulant actuellement est surtout
destiné aux groupes présumés à haut risque (le personnel de santé exposé à des
patients infectés par le virus A/H5N1, le personnel avicole, les personnes
impliqués dans les opérations de décontamination des lieux d’élevage et
d’élimination des animaux malades ou suspectés d’être infectés, etc…) [53].
 Le vaccin pandémique
Récemment, on a observé la division des virus H5N1 en clades et sous-clades
distincts du point de vue génétique et antigénique (Fig.26), chacun tendant à
prédominer dans une zone géographique déterminée. Cette divergence
complique davantage la sélection de la souche vaccinale avant l’émergence du
virus pandémique, surtout que pour acquérir la capacité de se transmettre dans
l’espèce humaine, cela supposerait une évolution antigénique des souches
actuelles. Dans certains vaccins potentiels contre A/H5N1, on a observé une
protection croisée dans les études sur les animaux contre les différentes souches,
mais l’efficacité de la protection croisée chez l’homme reste encore inconnue
[14, 33, 42, 94, 95].
99
Figure 26 : Arbre phylogénétique des virus A/H5N1 [95].
100
Le délais entre l’isolément de la souche pandémique et la fabrication en grande
quantité d’un vaccin adapté est de plusieurs mois vu la capacité de production
limitée des industries. Des essais précliniques chez la souris ont testé le pouvoir
immunogène de vaccins vectorisés utilisant un adénovirus humain non réplicatif
comme vecteur d’expression de l’hémagglutinine d’une souche A/H5N1.
 Le vecteur est porteur du gène HA d’une souche A/Hong Kong/156/97
(H5N1) ou d’une souche A/Vietnam/1203/04 (H5N1).
 La vaccination induit une sécrétion d’anticorps spécifiques anti HA et une
stimulation de l’immunité cellulaire.
 L’immunisation donne une protection efficace contre une dose létale de
virus A/H5N1.
 La production du vaccin vectorisé par génie génétique est rapide, 36 jours
après la détermination de la séquence du gène viral. l’avantage de cette
technique est de simplifier la logistique dans une certaine mesure et
permettre de vacciner les personnes allergiques aux œufs. Cette technique
permet également de réduire de quelques semaines le cycle de producion,
raccourcissant ainsi le délais de mise sur le marché.
Et un certain nombre d’adjuvants, en raison de leurs capacités à booster la
réponse immune, ont fait l’objet d’études expérimentales. Le MF59 a donné des
taux de séroconversion plus élevés qu’un vaccin sans adjuvant, dans un essai
clinique de vaccin expérimental contre une souche H5, ainsi l’inclusion
d’adjuvants immunologiques dans les vaccins anti-grippaux permettra
l’utilisation des doses faibles d’antigènes [15].
101
IX. Traitement
Si l'état clinique l'exige, hospitaliser les patients en prenant les précautions qui
conviennent.
Si, après examen, l'état clinique ne requiert pas l'hospitalisation, on informera le
patient et sa famille des mesures d'hygiène personnelle et de lutte antiinfectieuse à prendre (lavage des mains, port d'un masque chirurgical en papier
par le malade, limitation des contacts avec d'autres personnes) et on conseillera
de consulter rapidement un médecin en cas d'aggravation de l'état.
Si les ressources le permettent, on assurera le suivi de ces patients par des visites
à domiciles ou en téléphonant régulièrement [42].
1. Traitement symptomatique
Faire le traitement symptomatique requis :
-Contrôler la saturation en oxygène et compenser par l'oxygénothérapie une
désaturation éventuelle (la saturation doit être maintenue au-dessus de 90 %).
-Prélever des séries d'échantillons respiratoires et sanguins pour vérifier
l'apparition éventuelle de surinfections bactériennes. Le diagnostic fait appel en
général à l'hémoculture, la coloration de Gram et la culture des expectorations.
On envisagera une antibiothérapie par voie intraveineuse pour endiguer ce type
d'infection.
-On évitera d'administrer des salicylés (comme l'aspirine) chez les enfants et les
adolescents de moins de 18 ans en raison du risque de syndrome de Reye. On
prescrira plutôt du paracétamol ou de l'Ibuprofène, soit par voie orale, soit en
suppositoire, pour traiter la fièvre.
102
-Les corticoïdes souvent utilisés pour traiter les atteintes pulmonaires aiguës dus
à l'infection à virus A/H5N1, sans doute en raison de leur action
antiinflammatoire et préventive de la fibrose. Mais aucun avantage clinique n'a
été cependant clairement observé et la plupart des patients infectés par ce virus
et sous corticoïdes sont morts [42].
2. Traitement antiviral spécifique
2.1. Inhibiteurs de la Neuraminidase
 Mécanisme d’action
La NA agit en fin de réplication en clivant le pont entre les particules virales et
la membrane de la cellule infectée. Ce clivage a pour conséquence la libération
dans l’organisme des virus néoformés. Les antineuraminidases inhibent par
compétition spécifique l’action de la NA en bloquant de façon irréversible le site
actif de l’activité sialidase. Il s’ensuit alors une entrave au relarguage des virons
qui s’agrègent à la surface de la cellule hôte par liaison de leur HA aux résidus
d’acide sialique non clivé. La dissémination virale s’en trouve ainsi diminuée
(Fig.27) [59, 89, 96].
103
Figure 27 : Electromicrophotographie des cellules MDCK infectées par le
virus de la grippe A.
(A)Libération et diffusion des particules virales en absence des inhibiteurs
de NA.
(B) Agglutination et immobilisation des particules virales à la surface des
cellules en présence des inhibiteurs de NA.
La barre correspond à 1µm [59].
les résultats de l’analyse cristallographique de la NA complexée avec son
substrat et la mise en oeuvre de moyens matériels et logiciels informatiques
puissants ont ouvert la voie à la création rationnelle assistée par ordinateur de
deux antineuraminidases -analogues isostériques de l’acide sialique- : Zanamivir
(GG167, Relenza®) développé en 1993 par le laboratoire GlaxoWellcome et
l’Oseltamivir (GS4104, Tamiflu®) en 1997 par Roche, agissant à la phase
tardive sur la libération des virions néoformés, les deux molécules sont approuvé
104
par le FDA [1, 83, 89]. Un autre inhibiteur de la neuraminidase encore plus
puissant qui s’est avéré efficace contre les 9 sous-type NA ; le Peramivir, RWJ270201® (Johnson & Johnson -1999-) est actuellement en phase clinique -Voir
Tab.5 et Fig.28- [81, 83, 97].
Tableau 5 : Inhibition de la NA des virus Influenza A et B [59].
Inhibition (CI50%, nmol/L)
L’Antineuraminidase
A/N1
A/N2
B
Zanamivir
0.5-2.5
0.9-5.6
1.0-7.9
Oseltamivir
0.3-1.0
0.2-0.8
1.7-18.3
RWJ-270201
0.2-1.4
0.5-0.9
0.6-11.0
CI50% = la concentration réduisant l’activité de l’enzyme par 50%.
 Forme d’administration
Le Zanamivir se présente sous la forme d’une poudre sèche destinée à
l’inhalation orale à l’aide d’un diskhaler similaire à celui utilisé dans le
traitement de l’asthme. Les groupements hydrophiles du Zanamivir expliquent le
faible franchissement de la barrière gastro-intestinale. L’estérification
permettant de « masquer » ce groupement carboxyle et ainsi d’accroître le
franchissement de la barrière digestive [8, 89], donne l’Oseltamivir (administré
per os sous forme de gélules et de poudre pour suspension buvable) [98].
Pour le Peramivir les essais de la phase I et II chez l’homme ont montré une
excellente tolérance et une bonne efficacité en diminuant la charge virale après
administration orale. Mais, en raison de sa faible biodisponibilité par cette voie,
le développement de cette forme galénique a été stoppé et une forme à usage
parentéral, par voie intramusculaire ou intraveineuse qui a donné d’excellents
résultats est en cours d’évaluation. En raison de la longueur des procédures
105
d’autorisation de mises sur le marché, délivrées par la FDA américaine, il est
prévu d’utiliser le péramivir uniquement dans le contexte d’une pandémie de
grippe. L’administration par voie parentérale est particulièrement intéressante
dans le cas de patients critiques, chez lesquels l’utilisation de la voie orale n’est
pas possible, et la possibilité d’une dose unique prophylactique par voie
intramusculaire, dans le contexte d’une pandémie fait l’objet de recherches [15].
Figure 28 : Structures chimiques du Neu5Ac et des Antineuraminidases
(poisons compétitifs) [59].
106
Tableau 6 : Propriétés pharmacologiques du Zanamivir et de l’Oseltamivir
[59, 89].
Spectre
Absorption orale (%)
Voie
Distribution
Demi vie
Zanamivir
Virus A+B
faible (<5)
inhalée
pharynx 80%
VRI 10-20%
3-5 heures
Oseltamivir
Virus A+B
élevée (~80)
orale
VRS+VRI
6-10 heures
-VRI : voie respiratoire inférieure
-VRS : voie respiratoire supérieure
 Posologie
L’utilisation de l’Oseltamivir « Tamiflu® », l’antiviral considéré comme
efficace contre l’infection de l’Homme par le virus A/H5N1, reste une
alternative pour le traitement des malades avant la disponibilité du vaccin [46].
L’OMS recommande le traitement par Oseltamivir, à la dose de 75 mg chez
l’adulte, deux fois par jour, pendant cinq jours et à doses adaptées en fonction du
poids, chez l’enfant de plus de un an (Voir notice du Tamiflu® -Annexe 8[99]), ceci dans les formes modérées. Dans les formes graves, des doses de 150
mg/jour pendant sept à dix jours ont été suggérées, chez l’adulte. Le Zanamivir
en inhalation n’a jamais été utilisé dans les cas de grippe A/H5N1 [15].
L’administration du médicament en nébulisation à des patients infectés par le
virus A/H5N1, comporte des risques de transmission éventuelle du virus par le
biais d'aérosols [42].
107
 Données cliniques
Les antineuraminidases, actifs sur les virus de type A et B, n’empêchent pas le
développement de la réponse immunitaire après vaccination ou infection [89]. A
titre curatif, leur efficacité n’est cependant nette que lorsqu’ils sont prescrits
précocement dans les 24 à 48 premières heures de la maladie [1, 18, 59, 89, 90].
L’utilisation des ces antiviraux en curatif devrait diminuer substantiellement
l’impact épidémiologique de la pandémie, voire la proportion de la population
atteinte, dans l’hypothèse où le traitement curatif réduirait la durée de la phase
infectieuse. Ce qui est en faveur de la constitution de stocks d’antiviraux
destinés à couvrir, au minium les besoins dans le traitement des cas [92].
Actuellement, on ne dispose pas de données suffisantes permettant d’apprécier
l’efficacité curatif et prophylactique de ces antiviraux, dans le cadre d’une
pandémie de grippe [12, 15].
 Résistances aux inhibiteurs de la neuraminidase
Certains travaux sur la sensibilité à l’Oseltamivir des souches A/H5N1 isolées
en Asie du sud-est, ont mis en évidences des cas humains de résistance partielle
Du virus A/H5N1 à l’Oseltamivir [100]. Le premier a été documenté en 2005 au
Vietnam : Il s’agissait d’une jeune fille de 14 ans de la région de Hanoï. Elle
avait reçu une dose prophylactique (75 mg une fois par jour) d’Oseltamivir
pendant 4 jours. Son état s’aggravant elle reçut un traitement à pleine dose (75
mg deux fois par jour) pendant 7 jours. La patiente a survécu. Un virus A/H5N1
porteur d’une mutation H274Y (remplacement d’une histidine par une tyrosine à
la position 274) a été isolé. Cette mutation confère une résistance de haut niveau
à l’Oseltamivir, la dose requise pour avoir 50% de l’inhibition de l’activité
108
neuraminidase (CI50) de cet isolat a été 90 nM, alors que la CI50 pour les
souches sensibles à l’Oseltamivir est de (0.1- 10 nM) [90].
Chez les virus grippaux type A pour s’adapter à la chaîne latérale de
l'Oseltamivir, le site de liaison de la neuraminidase doit subir un réarrangement
pour créer une poche (Fig.29 -A-). Plusieurs mutations limitant ce
réarrangement moléculaire peuvent diminuer l'attachement de l'Oseltamivir à sa
cible. (Fig.29 -B-)
D’après l'analyse moléculaire, (Fig.29 -C-) La poche est crée par la rotation de
l'acide aminé nommé E276 et sa liaison par la suite à R224, événements qui sont
empêchés par les mutations R292K, N294S et H274Y ; ayant pour résultat la
résistance à l'Oseltamivir. Aucune de ces mutations n’empêche l'attachement de
la neuraminidase à l’acide sialique, son substrat naturel, les virus subissant ces
mutations peuvent ainsi survivre et se propager. En revanche, et fort
heureusement la mutation H274Y conférant une résistance des souches A/H5N1
à l’Oseltamivir ne donne pas de résistance croisée avec le Zanamivir,
l'attachement de cette drogue n'exige aucune réorientation des acides aminés.
Les données disponibles à ce stade n’indiquent pas que les virus présentant ces
mutations soient plus facilement transmissibles ou plus virulents [101, 102].
109
Figure 29 : Mécanisme de résistance des virus grippaux type A à
l’Oseltamivir [102].
En faite l’échec thérapeutique et l’émergence des résistances peuvent survenir
suite à une ou plusieurs mutations simultanées ou cumulées en un ou plusieurs
sites de la cible de l’antiviral. D’où l’intérêt, pour mieux guider la thérapeutique,
de recourir aux tests phénotypiques et/ou génotypiques de détection de la
résistance d’un virus à un ou plusieurs antiviraux pour déterminer le rôle précis
des mutations, dans la résistance et de la nécessité éventuelle d’avoir recours à
des doses plus importantes d’Oseltamivir pendant des durées de traitement plus
longues [85].
110
2.2. Inhibiteurs de la protéine M2
On évitera de prescrire l'Amantadine ou la Rimantadine (Inhibiteurs de la
protéine M2, actifs uniquement sur le virus de type A), car on risque alors
d'accroître la pression sélective favorable à l'apparition d'un virus grippal
résistant et potentiellement pandémique. Les résultats préliminaires des
centres collaborateurs de l'OMS donnent à penser que les virus A/H5N1
récemment isolés à partir de cas humains sont résistants à l'Amantadine et à la
Rimantadine [42].
3. Immunothérapie
L'administration d'anticorps anti-H5N1 spécifiques sous la forme d'anticorps
monoclonaux ou d'un sérum polyclonal (sérum de convalescent ou après
vaccination) s'est avérée efficace sur les modèles d'infection chez l'animal.
L'administration précoce de dérivés sanguins prélevés chez des convalescents
pourrait avoir eu une certaine utilité thérapeutique chez les patients présentant
une pneumonie au cours de la pandémie de 1918.
Deux patients infectés par le virus A/H5N1 ont été traités à la fois à l'oseltamivir
et avec du plasma de convalescent extrait de patients ayant survécu. Si l'on y a
recours, les interventions de ce type devraient être entreprises de préférence dans
le cadre d'essais cliniques contrôlés, avec un suivi clinique et virologique
rigoureux [42].
111
CONCLUSION
Le virus A/H5N1 sévit toujours en Asie, en Europe et en Afrique. Le risque
pandémique est selon les experts, fort probable. Le rôle du laboratoire de
virologie est d’une importance capitale dans la détection et la surveillance
épidémiologique. Il met en œuvre un ensemble de méthodes directes et
indirectes qui permettent de confirmer ou d’infirmer une infection par un virus
aviaire A/H5N1.
Parmi toutes les méthodes de diagnostic disponibles, les techniques de biologie
moléculaire occupent une place de choix en raison de leur rapidité, sensibilité et
spécificité. Grâce aux automates utilisant les techniques d’amplification génique
par RT-PCR en temps réel et de séquençage disponibles dans le marché, ces
techniques sont désormais standardisées et sont utilisées à grande échelle. Elles
nécessitent toutefois une maîtrise de la biologie moléculaires afin d’assurer une
interprétation biologique optimale des résultats.
Ces
techniques
sont
complémentaires
du
diagnostic
virologique
conventionnel qui repose sur l’isolement en culture cellulaire, l’identification de
la souche virale et la réalisation d’un antivirogramme pour la détection des
résistances aux antiviraux.
Dans ce contexte de risque pandémique, le diagnostic d’un cas humain de grippe
aviaire A/H5N1 constitue un diagnostic d’urgence permettant de mettre en place
des mesures prophylactiques et d’instituer rapidement un traitement antiviral
spécifique.
112
RESUME
L’épizootie aviaire due au virus Influenza A/H5N1, qui sévit depuis 1997 en
Asie du Sud-est s’est propagée vers l’Est, l’Asie centrale, le Moyen-Orient,
l’Europe occidentale, l’Egypte et l’Afrique sub-Saharienne.
Elle constitue un risque pandémique chez l’homme en raison du
franchissement de la barrière d’espèces : en effet, le nombre de cas humains
enregistrés au 28.5.2008 est de 383 et le nombre de décès est de 241, soit une
mortalité dépassant 60%.
Dans ce contexte, le diagnostic virologique d’un cas humain de grippe aviaire
A/H5N1 est une urgence. Sa réalisation technique nécessite le recours à un
laboratoire de biosécurité de référence de niveau 3.
Parmi toutes les méthodes de diagnostic disponibles, le recours aux méthodes
modernes de biologie moléculaire, en particulier les techniques d’amplification
génique par RT-PCR en temps réel sont à privilégier en raison de leur rapidité,
sensibilité et spécificité. Elles sont complémentaires du diagnostic virologique
conventionnel qui repose sur l’isolement en culture cellulaire, l’identification de
la souche virale et la réalisation d’un antivirogramme pour la détection des
résistances aux antiviraux.
Les tests de diagnostic rapide immunologique, de moindre sensibilité, en
particulier ceux réalisés par immunochromatographie sur membrane ne
permettent qu’un diagnostic d’orientation et précisent uniquement le type
grippal en cause. Le diagnostic sérologique ne permet qu’un diagnostic
rétrospectif : il est donc réservé à la surveillance épidémiologique et à
l’évaluation de l’efficacité vaccinale.
113
La précocité du diagnostic virologique permet de mettre en place rapidement des
mesures prophylactiques et d’instituer un traitement antiviral spécifique des cas,
permettant ainsi de contenir les premiers foyers humains de transmission d’un
virus à potentiel pandémique.
114
SUMMARY
The spread of the epizootic of avian influenza A/H5N1, which prevail since
1997 in Asia of South-east, to the East, the Central Asia, the Middle
East, Western Europe, Egypt and sub-Saharan Africa, constitutes a pandemic
risk because of the crossing of the barrier of species. Until 28.5.2008, 383
confirmed cases human of influenza A/H5N1 were identified and 241 of the
patients died (mortality up to 60%).
In this context, the virological diagnosis of a human case of Avian Influenza
A/H5N1 is an urgency.
The diagnosis confirmation of avian influenza A/H5N1 virus is restricted to a
Word Health Organization (WHO) A/H5N1 Reference Laboratory certified
Biosafety Level (BSL)-3+.
Molecular techniques especially by real-time reverse transcription-polymerase
chain reaction technology, provides a rapid, sensitive and specific means for
detection.
Molecular diagnosis complements the standard techniques as Cell culture,
viruses identification and antivirogramme used to study the resistance to
antiviral drugs.
Commercially available rapid assays for influenza-antigen detection such as
Rapid Chromatographic Immunoassay have poor clinical sensitivity for the
detection of influenza A/H5N1 virus and they do not differentiate between
human and avian subtypes of influenza A viruses.
Serologic testing can’t give an early diagnosis; however, it’s the important tool
reserved to epidemiologic surveillance and evaluation of vaccine efficacy.
115
A highly rapid virological diagnostic, facilitate early prophylaxis and specific
antiviral therapy of the cases, for containment and elimination of an emergent
pandemic strain of influenza at the point of origin.
116
‫هلخص‬
‫رّىٕذ اٌفبشٍخ إٌبجّخ ػٓ فٍش‪ٚ‬ط صوبَ اٌطٍ‪ٛ‬س (‪ )A5H/N1‬اٌزً رصٍت اٌذ‪ٚ‬اجٓ جٕ‪ٛ‬ة ششق‬
‫آسٍب ِٕز ‪ ِٓ 1997‬اجزٍبح وً ِٓ ششق آسٍب‪ ٬‬آسٍب اٌ‪ٛ‬سطى‪ ٬‬اٌششق األ‪ٚ‬سػ‪ ٬‬أ‪ٚ‬س‪ٚ‬ثب‬
‫اٌغشثٍخ‪ِ ٬‬صش ‪ ٚ‬إفشٌمٍب جٕ‪ٛ‬ة اٌصذشاء‪.‬‬
‫أصجخ فٍش‪ٚ‬ط (‪ٌ )A5H/N1‬شىً ر‪ٙ‬ذٌذا ‪ٚ‬ثبئٍب ثؼذ رّىٕٗ ِٓ اخزشاق اٌذ‪ٛ‬اجض اٌمبئّخ ثٍٓ‬
‫األٔ‪ٛ‬اع‪ .‬إٌى دذ‪ٚ‬د ‪ 2008.05.28‬ثُ رسجًٍ ‪ 383‬إصبثخ ثششٌخ ‪ ٚ‬ثٍغ ػذد اٌ‪ٛ‬فٍبد‪ٌٍ 241‬ف‪ٛ‬ق‬
‫ثزٌه ِؼذي اٌ‪ٛ‬فبح ‪.%60‬‬
‫‪ ٚ‬فً ٘زا اإلغبس ٌزطشق ٘زا اٌجذث إٌى اسزؼجبٌٍخ اٌزشخٍص اٌفٍش‪ٌٛٚ‬جً ٌّشض صوبَ‬
‫اٌطٍ‪ٛ‬س (‪ )A5H/N1‬ػٕذ اإلٔسبْ‪.‬‬
‫‪ٚ‬دذ٘ب ِخزجشاد ِٕظّخ اٌصذخ اٌؼبٌٍّخ اٌّشجؼٍخ ِخ‪ٌٛ‬خ ٌزأوٍذ ٘زا اٌزشخٍص‪.‬‬
‫ٌؼزّذ اٌزشخٍص اٌفٍش‪ٌٛٚ‬جً اٌّجبشش ػٍى اٌجٍ‪ٌٛٛ‬جٍب اٌجضٌئٍخ خبصخ رمٍٕبد (‪)PT-RCP‬‬
‫فً اٌ‪ٛ‬لذ اٌذً ‪ ٚ‬اٌزً رّىٓ ِٓ اٌذص‪ٛ‬ي ػٍى ٔزبئج سشٌؼخ دٍث وشفذ اٌذساسبد ػٓ‬
‫دسبسٍخ جٍذح ‪ٛٔ ٚ‬ػٍخ ػبٌٍخ‪.‬‬
‫إظبفخ إٌى اٌطشق اٌّشجؼٍخ ٌٍىشف ػٓ اٌفٍش‪ٚ‬ط وبخزجبس اٌضساػخ اٌخٍ‪ٌٛ‬خ ‪ ٚ‬رمٍٕبد‬
‫رصٍٕف اٌفٍش‪ٚ‬ط ‪ ٚ‬دساسخ دسبسٍخ اٌفٍش‪ٚ‬سبد ٌٍؼمبلٍش اٌّسزؼٍّخ ‪.‬‬
‫فً اٌّمبثً رؼزجش االخزجبساد اٌسشٌؼخ (اٌىش‪ِٚ‬ز‪ٛ‬غشافٍب إٌّبػٍخ ف‪ٛ‬ق غشبء) الً أٍّ٘خ‪٬‬‬
‫دٍث رؼجض ػٓ اٌزفشٌك ثٍٓ اٌضوبَ اٌؼبدي ‪ ٚ‬صوبَ اٌطٍ‪ٛ‬س‪ ٚ .‬رٕذصش أٍّ٘خ اٌزشخٍص‬
‫اٌّصٍى فً ِشالجخ أزشبس اٌفٍش‪ٚ‬ط ‪ ٚ‬رمٍٍُ ٔجبػخ اٌٍمبح‪.‬‬
‫ٌؤدي اٌزشخٍص اٌفٍش‪ٌٛٚ‬جً اٌّجىش إٌى ارخبر إجشاءاد ‪ٚ‬لبئٍخ ‪ٚ‬ػالجٍخ ٔ‪ٛ‬ػٍخ سشٌؼخ ِٓ‬
‫شأٔ‪ٙ‬ب اٌذذ ِٓ أزشبس اٌ‪ٛ‬ثبء أطاللب ِٓ اٌجؤس األ‪ٌٚ‬ى‪.‬‬
‫‪117‬‬
ANNEXES
118
ANNEXE 1 : Courants migratoires des espèces aquatiques. [87]
119
ANNEXE 2 : Système de triple emballage et son étiquetage destiné aux
substances infectieuses type A (dont fait partie le virus de la Grippe Aviaire
A/H5N1). [10, 50, 53, 103]
 Récipient primaire
(En verre ou en plastique) hermétique, parfaitement étanche, et son contenu doit
être indiqué sur une étiquette. Ce premier récipient est enveloppé dans un
volume suffisant de matériau absorbant pour qu’en cas de bris ou de fuite, tout
le liquide de l’échantillon soit absorbé.
 Emballage secondaire
(En métal ou plastique) également hermétique et étanche, qui sert de protection.
Plusieurs récipients primaires enveloppés de matériau absorbant peuvent être
placés dans un même emballage secondaire.
 Emballage extérieur
(Peut être en bois, en métal, en carton ou encore en plastique) protège
l’emballage secondaire contre les dommages matériels qui pourraient se
produire en cours de transport.
120
"MATIERE INFECTIEUSE"
"En cas de dommage ou de fuite avertir immédiatement les autorités de la
santé publique"
Dimensions minimales : 100 × 100 mm
(pour les petits emballages : 50 × 50 mm)
Nombre d’étiquettes par emballage : 1
Couleur : noir et blanc
Etiquette de sens de manutention
Dimensions minimales : Standard A7 (74 × 105 mm)
Nombre d’étiquettes par emballage : 2 de cotés opposés
Couleur : noir et blanc ou rouge et blanc
121
ANNEXE 3 : Dossier d’investigation d’un cas suspect de Grippe Aviaire
A/H5N1. « Ministère de la Santé -Royaume du Maroc-». [46]
122
ANNEXE 4 : Réactifs et matériel de base nécessaires à la réalisation d’une
RT-PCR classique spécifique au virus grippal A/H5N1. [51]
• QIAamp Viral RNA Mini Kit ou kit d’extraction équivalent
• Kit QIAGEN One Step RT-PCR (Qiagen)
• Inhibiteur de la RNase (ABI) 20U/µl
• Tubes à microcentrifugation stériles, 0,2, 0,5 et 1,5 ml
• Séries d’amorces
• Témoin positif
• Pipettes ajustables
• Bouts filtreurs jetables
• Microcentrifugeuse
• Agitateur-mélangeur Vortex
• Thermocycleur
• Plateau support de gel d’agarose, cuve d’électrophorèse
• Source de lumière UV
• Séquences des amorces sens et anti-sens pour HA et NA
*Amorces du gène HA pour amplification de H5 (Yuen et al., 1998) :
H5 sens : GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
H5 anti-sens : CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG
Taille du produit attendu : 219 pb.
*Amorces du gène NA pour amplification de N1 (Wright et al., 1995) :
N1 sens : TTG CTT GGT CGG CAA GTG C
N1 anti-sens : CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC
Taille du produit attendu : 616 pb.
123
ANNEXE 5 : Réactifs et matériel de base nécessaires à la réalisation de la
technique d’immunofluorescence indirecte. [51]
• Trousse de réactifs OMS pour l’identification du virus grippal A/H5 (version
1997-1998, 2003 ou 2004).
Les réactifs de cette trousse pour l’immunofluorescence sont les suivants :
− mélange d’anticorps monoclonaux spécifiques du sous-type grippal A/H5
− mélanges d’anticorps monoclonaux spécifiques des types grippaux A et B
− anticorps monoclonaux spécifiques des sous-types grippaux A/H1 et A/H3.
• Conjugué IgG anti-souris FITC.
• Lames pour microscope.
• Lamelles, 24 x 60 mm.
• Milieu de montage.
• Acétone.
• Microscope à fluorescence.
124
ANNEXE 6 : Réactifs et matériel de base nécessaires à la réalisation de la
Culture cellulaire, la Détection et l’Identification du virus grippal A/H5N1.
[51, 82]
• Cellules «MDCK », ATCC CCL34 (avec un nombre de passage inférieur à
25)
• Trousse de réactifs OMS servant à l’identification du virus grippal A/H5 en
culture :
− Antigène témoin de la grippe A/H5 : virus inactivé
− Sérum de chèvre anti-A/Tern/South Africa/61/H5
− Sérum de poulet (mélange) anti-A/Goose/Hong Kong/437-4/99
• Enzyme de destruction des récepteurs (RDE)
• Hématies (de poulets, de dindes, humaines type 0, ou hématies de cobayes)
dans une solution d’Alsever (anti-coagulant).
125
ANNEXE 7 : Sélection et application de procédures de décontamination.
[87]
126
ANNEXE 8 : Notice du Tamiflu® -ROCHE-. [99]
127
128
129
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&tbnw=81&prev=/images%3Fq%3Dlight%2Bcycler%26start%3D280%26nds
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‫قسن الصيذلي‬
‫بسن هللا الرحواى الرحين‬
‫أقسن باهلل العظين‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫أْ أسالت هللا فً ِ‪ٕٙ‬زً‬
‫أْ أثجً أسبرزرً اٌزٌٓ رؼٍّذ ػٍى أٌذٌ‪ِ ُٙ‬جبدئ ِ‪ٕٙ‬زً ‪ٚ‬أػزشف ٌ‪ُٙ‬‬
‫ثبٌجًٍّ ‪ٚ‬أثمى د‪ِٚ‬ب ‪ٚ‬فٍب ٌزؼبٌٍّ‪.ُٙ‬‬
‫أْ أصا‪ٚ‬ي ِ‪ٕٙ‬زً ث‪ٛ‬اصع ِٓ ظٍّشي ٌّب فٍٗ صبٌخ اٌصذخ اٌؼّ‪ٍِٛ‬خ‪٬‬‬
‫‪ٚ‬أْ ال ألصش أثذا فً ِسؤ‪ٌٍٚ‬زً ‪ٚٚ‬اججبرً رجبٖ اٌّشٌط ‪ٚ‬وشاِزٗ‬
‫اإلٔسبٍٔخ‪.‬‬
‫أْ أٌزضَ أثٕبء ِّبسسزً ٌٍصٍذٌخ ثبٌم‪ٛ‬أٍٓ اٌّؼّ‪ٛ‬ي ث‪ٙ‬ب ‪ٚ‬ثأدة اٌسٍ‪ٛ‬ن‬
‫‪ٚ‬اٌششف‪ٚ ٬‬وزا ثبالسزمبِخ ‪ٚ‬اٌزشفغ‪.‬‬
‫أْ ال أفشً األسشاس اٌزً لذ رؼ‪ٙ‬ذ إٌى أ‪ ٚ‬اٌزً لذ أغٍغ ػٍٍ‪ٙ‬ب أثٕبء اٌمٍبَ‬
‫ثّ‪ٙ‬بًِ‪ٚ ٬‬أْ ال أ‪ٚ‬افك ػٍى اسزؼّبي ِؼٍ‪ِٛ‬برً إلفسبد األخالق أ‪ٚ‬‬
‫رشجٍغ األػّبي اإلجشاٍِخ‪.‬‬
‫ألدعى ثزمذٌش إٌبط إْ أٔب رمٍذد ثؼ‪ٛٙ‬دي‪ ٬‬أ‪ ٚ‬أدزمش ِٓ غشف‬
‫صِالئً إْ أٔب ٌُ أف ثبٌزضاِبرً‪.‬‬
‫"‪ٚ‬هللا ػٍى ِب أل‪ٛ‬ي‬
‫ش‪ٍٙ‬ذ"‬
‫‪Serment de Galien‬‬
‫‪Je jure en présence des maîtres de cette faculté :‬‬
D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de
mon art et de leur témoigner ma reconnaisse en restant
fidèle à leur renseignement.
D’exercer ma profession avec conscience, dans l’intérêt de la
santé public, sans jamais oublier ma responsabilité et mes
devoirs envers le malade et sa dignité humain.
D’être fidèle dans l’exercice de la pharmacie à législation
en vigueur aux règles de l’honneur, de la probité et du
désintéressement.
De ne pas dévoiler à personne les secrets qui m’auraient été
confiés ou dont j’aurais eu connaissance dans l’exercice de
ma profession, de ne jamais consentir à utiliser mes
connaissances et mon état pour corrompre les mœurs et
favoriser les actes criminels.
Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à
mes promesses, que je sois méprisé de mes confrères si je
‫جامعة محمد الخامس‬
manquais à mes engagements.
‫كلية الطب والصيدلة بالرباط‬
70 :‫أطروحت رقن‬
2008 : ‫سٌـت‬
‫س اٌّخزجش فً رشخٍص دبٌخ ثششٌخ‬ٚ‫د‬
(A/H5N1) ‫س‬ٍٛ‫ٌضوبَ اٌط‬
‫أطروحة‬
..............................: ‫قذهت وًىقشت عالًيت يىم‬
‫من طرف‬
‫ لبٌى العطىاًي‬: ‫اآلًست‬
‫ بالبيضاء‬0099 ‫ أكتوبر‬90 :‫املزدادة يف‬
‫أعضاء‬

ROYAUME DU MAROC

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