Céline CAMUS - Université de Rennes 1

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1
sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : Biologie
Ecole doctorale Vie-Agro-Santé
présentée par
Céline CAMUS
Préparée à l’unité de recherche INSERM U1085
IRSET – équipe « Environnement Viral et Chimique & Reproduction »
UFR Sciences de la Vie et de l’Environnement
Effet du liquide séminal
sur l’infection par le
VIH-1 dans des modèles
cellulaires et tissulaires
et recherche des facteurs
modulateurs
Thèse soutenue à Rennes
le 19 décembre 2014
devant le jury composé de :
Thomas BOURLET
Professeur, Université Jean Monnet, Saint-Etienne,
rapporteur
Elisabeth MENU
Directeur de recherche, Institut Pasteur, Paris
rapporteur
Louis BUJAN
Professeur, Hôpital Paule de Viguier, Toulouse
examinateur
Célia RAVEL
Professeur, CECOS, Rennes
examinateur
Charles PINEAU
Directeur de recherche, Université Rennes 1
co-directeur de thèse
Nathalie DEJUCQ-RAINSFORD
Directeur de recherche, Université Rennes 1
directeur de thèse
Remerciements
Tout d’abord, je tiens sincèrement à remercier le Docteur Elisabeth Menu et le
Professeur Thomas Bourlet d’avoir accepté d’être les rapporteurs de cette thèse. Je
tiens également à remercier les Professeurs Célia Ravel et Louis Bujan pour avoir
accepté de juger ce travail.
Je tiens à remercier les membres de mon comité de thèse à savoir les Docteurs
Marie-Thérèse Dimanche-Boitrel et Denis Michel ainsi que le Docteur Karin Tarte
pour avoir été ma tutrice au cours de ces quatre années de thèse.
Ce projet a pu être réalisé grâce au soutien financier de l’ANRS et de
l’association SIDACTION que je tiens à remercier.
Je remercie le Docteur Bernard Jégou de m’avoir accueillie au sein de son unité
de recherche. Je tiens tout particulièrement à remercier le Docteur Nathalie DejucqRainsford pour m’avoir accueillie dans son équipe. Je la remercie également, ainsi
que le Docteur Charles Pineau, pour m’avoir encadrée avec patience et rigueur tout
au long de ma thèse et pour m’avoir fait bénéficier de leur expérience et de leur
expertise.
Je remercie l’équipe du secrétariat, en particulier Véronique et Catherine, qui
m’ont été d’une aide précieuse pour toutes les questions administratives et qui m’ont
fait gagner beaucoup de temps. Merci pour votre disponibilité, votre patience et votre
gentillesse, pour les gâteaux, les carrés de chocolat et les rires. Catherine un petit
match ?
Merci à Christine Monfort pour m’avoir aidée dans cet exercice difficile : les
statistiques.
Merci à Isabelle et Anne-Pascale de gérer toutes ces choses indispensables au
bon fonctionnement du labo. Merci pour votre patience et votre gentillesse. AnnePascale merci également pour tes conseils, les discussions scientifiques ou non et
toutes ces petites choses qui font que cela a été un réel plaisir de partager ce bureau
avec toi.
Merci à Anna, Giulia, Dominique et Florence pour votre sagesse, vos conseils,
votre expérience. Merci de m’avoir aiguillée tout au long de ma thèse, je suis ravie
d’avoir pu travailler avec vous. Et merci pour les moments passés en dehors du labo.
Flo un grand grand merci pour les corrections, la saisie de la biblio, etc. Julie : good
luck.
Merci aussi à Antoine, Fred et Aurélie pour les bons moments passer ensemble
au boulot et en dehors.
Merci à tous les membres de l’équipe et à tous les Gerhmistes, Christèle,
Laurianne, Séverine, Laurent, Soazic, Fabrice et Emmanuelle, avec qui je n’ai pas eu
l’occasion de travailler mais avec qui j’ai eu plaisir à discuter au détour d’un couloir
ou à la cafet.
Merci à tous ceux qui sont passé pour quelques mois ou un peu plus, Raquel,
Christophe, mini Claire et Vincent, ce fut un plaisir de vous rencontrer.
Un merci tout particulier à Tic et Tac, Dr B, Triboulet, TDB et Kisketufai. Vous
m’avez vendu du rêve.
Spéciale dédicaces à mes petites Moufettes : Lauriane, Audrey, Millissia.
Travailler dans la joie et la bonne humeur est toujours plus agréable et productif.
Merci pour les after-work, les after week, les fous rire, les délires et tous ces
moments de décompressions et de brainstorming. Millissia la prochaine c’est toi et
ne crois pas que tu échapperas aux traditions.
Dédicace très spéciale à mes ponettes. Je vous garde une place à vie quelque
part dans mon cœur, parce qu’on a partagé des bons moments mais aussi des
mauvais, de la complicité et des engueulades. Difficile d’écrire tout ce que j’ai à vous
dire sans tomber dans le mélo alors sachez que ces soirées qui s’éternisent au labo
et finissent au McDO, les apéro dinatoire avec désbat scientifico-politico-féministes,
les sessions statistiques, les protocoles griffonés sur une serviette de table et les
week-end extraordinaires ont fait de ces années de thèse partagées avec vous de
très très belles années. Et pour citer notre célèbre Dr Elastique Girl, même « si la vie
n’est pas une cour de récré » j’espère que vous vous amuserez toujours au boulot et
en dehors parce que c’est ce qui rend la vie plus belle.
Merci à mes petits schtroumphs (oui oui c’est comme ça que je vous appelle
secrètement) l’étudiante que j’étais a grandi avec vous et les cours en amphi n’ont
jamais été aussi drôles qu’avec vous. Merci pour ces bouffées d’air frais hors du
labo, merci de me faire rire avec vos histoires de profs et d’être là après toutes ces
années et pour longtemps encore. Merci pour cette belle amitié.
Merci à Faya, mon petit chacureil, pour les jeux, les gratte-grattes et les ronrons
apaisants.
Et puis surtout un énorme MERCI à ma famille. Merci à mes sisters d’avoir
toujours veillé sur moi. Merci aux minipousses parce qu’avec vous je peux avoir
quaqre ans tous les jours. Et puis surtout Merci Papa et Merci Maman de m’avoir
toujours soutenue, moralement et financièrement, dans mes études et mes choix
professionnels. Merci pour notre complicité. Merci d’avoir bousculé vos habitudes
pour que je retrouve ma chambre d’ado pour rédiger ma thèse et merci de m’avoir
supportée. Merci. Merci. Merci.
A mes trois amours partis trop tôt
et tous les jours dans mon cœur,
A mes parents,
A ma famille,
« Pour échapper à l’ennui, l’homme ou bien travaille au-delà de ce qu’exigent
ses besoins normaux ou bien il invente le jeu, c'est-à-dire le travail qui n’est plus
destiné à satisfaire aucun autre besoin que celui du travail par lui-même »
Nietzche 1878
"Soit A un succès dans la vie. Alors A = x + y + z, où x = travailler, y = s'amuser,
z = se taire."
Albert Einstein
Table des matières
INTRODUCTION
LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE : VIH.................................................... 10
I.
a.
La pandémie du SIDA en 2014 ............................................................................................ 10
b.
Le VIH : structure, génome et protéines ............................................................................. 11
c.
Récepteurs et tropisme du VIH ............................................................................................ 15
LA TRANSMISSION SEXUELLE DU VIH .............................................................................. 17
II.
a.
Les différentes voies de transmission sexuelles ................................................................ 17
b. Le tractus génital féminin et la muqueuse colorectale : principales voies d’entrée du
VIH présent dans le sperme ......................................................................................................... 20
c.
Les modes de transmission du VIH-1.................................................................................. 37
d. Les souches virales transmises : caractéristiques et mécanismes potentiellement
impliqués dans la sélection ........................................................................................................... 44
e.
Les facteurs influençant l’efficacité de la transmission ..................................................... 47
III.
LE SPERME : PRINCIPAL VECTEUR DU VIH ET MODULATEUR POTENTIEL DE
SA TRANSMISSION .......................................................................................................................... 53
a.
Elaboration et caractéristiques physiques et chimiques du sperme ............................... 53
b.
Le sperme en tant que vecteur du VIH ............................................................................... 59
c.
Le rôle du liquide séminal dans la transmission du VIH ................................................... 63
IV.
TRAITEMENT ET STRATEGIES DE PREVENTIONS CONTRE LE VIH-1 ................. 72
a.
Les traitements antirétroviraux (ARV) ................................................................................. 72
b.
Développement de vaccins ................................................................................................... 73
c.
Les stratégies de prévention ................................................................................................. 74
MATERIELS ET METHODES
Techniques de biologie cellulaire ............................................................................................. 83
I.
a.
Entretien des lignées cellulaires ........................................................................................... 83
b.
Isolement et culture des cellules primaires ......................................................................... 84
c.
Culture organotypique de tissus colorectaux et cervicaux humains ............................... 84
d.
Test enzymatique de viabilité pour les modèles cellulaires ............................................. 85
e.
Test enzymatique de cytotoxicité sur les cultures de tissus colorectaux et cervicaux 85
f.
Cytométrie en flux (ou FACS) ............................................................................................... 86
1
Techniques de Virologie ............................................................................................................ 89
II.
a.
Production des virus ............................................................................................................... 89
b.
Infection des modèles cellulaires ......................................................................................... 89
c.
Infection des cultures organotypiques de tissus colorectaux et cervicaux humains .... 90
d.
Dosage de la protéine virale P24 ......................................................................................... 90
e.
Dosage de l’activité β-galactosidase ................................................................................... 91
Techniques de biologie moléculaire .................................................................................... 91
III.
a.
Lyse des PBMC congelées à sec ........................................................................................ 91
b.
Extraction d’ARN totaux à partir de PBMC congelées à sec ........................................... 92
c.
Transcription inverse des ARN ............................................................................................. 92
d.
Extraction d’ADN totaux à partir de tissus humains congelés à sec .............................. 92
e.
La PCR en temps réel............................................................................................................ 92
IV.
i.
Quantification des ARNm cellulaires et proviraux ......................................................... 92
ii.
Quantification de l’ADN proviral ....................................................................................... 93
Techniques de biochimie ....................................................................................................... 95
a.
Dosage des cytokines par LUMINEX .................................................................................. 95
b.
Dosage de la prostaglandine E2 .......................................................................................... 95
c.
Dosage du TGF-β actif et total ............................................................................................. 96
d.
Dosage de SEVI ..................................................................................................................... 97
e.
Dosage des fragments de séménogéline SEM1 et SEM2 ............................................... 97
Techniques d’histologie ............................................................................................................. 98
V.
a.
Traitement des échantillons .................................................................................................. 98
b.
Immunohistochimie................................................................................................................. 98
VI.
Techniques de protéomique (en collaboration avec la plateforme de protéomique
Biogenouest) ..................................................................................................................................... 100
a.
Fractionnement du liquide séminal par HPLC échangeuse d’anions ........................... 100
b.
Fractionnement du liquide séminal par HPLC gel filtration ............................................ 101
c.
Fractionnement du liquide séminal par HPLC en phase inverse .................................. 101
d.
Gel d’électrophorèse avec coloration au nitrate d’argent ............................................... 102
e.
Analyse par nano-LC-MS/MS OrbiTrap ............................................................................ 103
f.
Test d’activité biologique des fractions.............................................................................. 106
2
RESULTATS
Chapitre I : Effet du sperme d’hommes infectés par le VIH-1 sur l’infection des cellules T
CD4+ : différences avec le sperme d’hommes non infectés Synthèse de l’article ................. 109
OBJECTIFS ET METHODOLOGIE ........................................................................................... 109
RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................. 110
CONCLUSION .............................................................................................................................. 111
Chapitre II : Effet du liquide séminal sur l’infection d’explants cervicaux et colo-rectaux ..... 163
INTRODUCTION .......................................................................................................................... 163
OBJECTIFS ET STRATÉGIES EXPÉRIMENTALES ............................................................. 163
MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................................... 164
RÉSULTATS ................................................................................................................................. 166
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 169
Chapitre III : Fractionnement du liquide séminal et identification des facteurs à activité
biologique sur l’infection par le VIH-1 ............................................................................................ 184
OBJECTIFS ET STRATÉGIES EXPÉRIMENTALES ............................................................. 184
MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................................... 184
RÉSULTATS ................................................................................................................................. 185
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 190
DISCUSSION GENERALE
Avantages et limites de nos modèles d’études .................................................................... 213
I.
a. Les modèles d’étude pour l’analyse de la transmission par voie sexuelle du VIH :
avantages et inconvénients. ....................................................................................................... 213
b.
Les souches virales utilisées .............................................................................................. 216
c.
Le statut des donneurs de LS ............................................................................................. 217
Perspectives et autres stratégies d’étude ............................................................................. 218
II.
a.
Effet du LS d’hommes infectés et non infectés sur l’infection des LT CD4+ ............... 218
i.
Effet du LS sur l’infection des modèles cellulaires par différentes souches R5 et X4
de VIH-1 ................................................................................................. Erreur ! Signet non défini.
ii. Exploration du rôle de l’expression de CCR5 à la surface des LT CD4+ dans l’effet
différentiel observé entre les LS d’hommes sains et VIH+ ............ Erreur ! Signet non défini.
iii. Analyse du rôle éventuel des anticorps du sperme (neutralisants ou médiant
l’ADCC ou Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity). .................. Erreur ! Signet non défini.
iv.
Effets du LS sur l’infection de cellule à cellule des LT CD4+ ....... Erreur ! Signet non
défini.
3
b.
Effet du LS sur l’infection des muqueuses........................................................................ 220
ii. Etude de l’effet du LS sur l’infection des explants cervicaux par des isolats primaires
de VIH-1 ................................................................................................. Erreur ! Signet non défini.
c.
Identification des facteurs à activité biologique sur l’infection par le VIH-1 ................. 223
4
LISTE DES ABREVIATIONS
A
AA : Acide aminé
B
BSA : Bovine serum albumine
ADCC : Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
ADNv : Acide désoxyribonucléique viral
ADNmt : Acide désoxyribonucléique mitochondriaux
AEC : 3-amino-9-ethylcarbazole
AID50 : Animal infectious dose 50%
APOBEC : Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic
polypeptide
ARN : Acide ribonucléique
ARNm : Acide ribonucléique messager
ARNt : Acide ribonucléique de transfert
ARNv : Acide ribonucléique viral
ATP : Acide tri-phosphate
AZT : Zidovudine
C
D
CA : Capside
DAB :
3,3 Diamino-benzidine
CCR : C-C chemokine receptor
DC : Cellules dendritiques (dendritic cell)
CCL : C-C chemokine ligand
DC-SIGN : DC-specific Icam 3 grabbing non-integrin
CL : Cellule de Langherans
DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium
CPA : Cellule présentattrice d’antigène
DNase : Désoxyribonucléase
Ct : Cycle threshold
dNTP :
CTL : Cytotoxic T lymphocytes
DTT : Dithiothréitol
Désoxyribonucléotide triphosphate
CVP : Charge virale plasmatique
CVS : Charge virale séminale
CXCR : C-X-C chemokine receptor
5
E
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
F
FACS : Fluorescence activated cell sorting
EBV : Epstein-Barr virus
Env : Enveloppe virale
G
GalCer : Galactosyl ceramide
H
HAART : Highly active antiretroviral treatment
HBV : Hepatitis B virus
HCMV : Human cytomegalovirus
HCV : Hepatitis C virus
HLA : Histocompatibility leucocyte antigen
HRP : Horseradish peroxydase
HSPG : Héparane sulfate de protéoglycane
HSV : Herpes simplex virus
HBD2 : Human β-defensin 2
HPLC : High Pressure Liquid Chromatography
I
ICAM-1 : Intercellular adhesion molecule-1
K
KDa : Kilo Dalton
IFN: Interféron
Ig : Immunoglobuline
IL : Interleukine
IN : Intégrase
INNTI : Inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse
INTI : Inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse
IP : Inhibiteur de protéase
IST : Infections sexuellement transmissibles
6
L
M
LAV-1 : Lymphadenopathy Associated Virus type 1
MA : Matrice
LC-MS/MS : Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
MBL : Mannose Binding Lectin
LDH : lactate deshydrogénase
MCLR : Mannose dépendant C type Lectine Receptors
LEDGF : Lens epithelium–derived growth factor
MDR : Multidrug resistance
LFA-1 : Lymphocyte function-associated antigen-1
MIP-1 : Macrophage inflammatory protein-1
LS : Liquide séminal
miRNA : Micro ribonucleic acid
LT : Lymphocyte T
MMR : Macrophage mannose receptor
LTR : Long terminal repeat
MUC : Mucine
MOI : Multiplicity Of Infection
N
O
NK : Natural killer
OMS : Organisation mondiale de la santé
NC : Nucléocapside
ONUSIDA : Organisation des nations unies/SIDA
P
PAP : Prostatic acid phosphatase
R
RANTES : Regulated on activation normal T-cell expressed
and secreted
PBMC : Peripheral blood mononuclear cell
RNaseH : Ribonucléase H
PBS : Phosphate buffer salin
RPMI : Roswell Park Memorial Institute Medium
PCR : Polymerase chain reaction
RT : Reverse transcriptase
PFA : Paraformaldéhyde
RT-PCR : Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
PHA : Phytohémagglutinine
PIC : Pre-initiation complex
PIP : Prolactin-inducible protein
PR : Protéase
PSA : Prostatic specific antigen
S
SAMHD-1 : Sterile alpha motif and histidine/aspartic acid
domain–containing protein 1
T
TCR : Récepteur des cellules T
TGF : Tractus génital feminin
SDF-1 : Stromal cell-derived factor-1
TGFβ : Transforming growth factor beta
SEM : Séménogéline
TGM : Tractus génital mâle
SEVI : Semen-derived enhancer of viral infection
TLR : Toll Like Receptor
7
SH : Serum humain
TM : Protein trasnmembranaire
SIDA : Syndrome de l’immunodéficience acquise
Tm : Tissu resident memory T cells
SLPI : Secretory leukocyte protease inhibitor
TNF : Tumor necrosis factor
SRM : Single Reaction Monitoring
TUNEL : TdT-mediated dUTP nick end-labeling
Su : Protéine de surface
SVF : Sérum de veau fœtal
V
VIH : Virus de l’immunodéficience humaine
VS : Vésicule séminale
8
AVANT PROPOS
Actuellement 35 millions de personnes vivent avec le VIH et environ 2,4 millions
de personnes sont nouvellement infectées chaque année. 80% de ces nouvelles
infections se font par voie sexuelle. Dans les pays en voie de développement, la
transmission est principalement hétérosexuelle et affecte principalement les femmes
(60% des nouvelles infections en Afrique Subsaharienne) alors que dans les pays
développés, la transmission est principalement homosexuelle. En majorité, les
infections ont lieu suite à une exposition à du sperme contaminé.
Le sperme renferme des cellules (spermatozoïdes, macrophages, lymphocytes
T, cellules germinales immatures…) dans un fluide très complexe, le liquide séminal
(LS). Le VIH est présent dans le sperme sous la forme de virions libres ou dans des
leucocytes infectés, et il pourrait également être attaché à la surface des
spermatozoïdes. Le LS contient plus de 2 500 protéines et peptides, des lipides, des
glucides. Parmi ces composants, certains possèdent une action antimicrobienne ou
immunorégulatrice qui pourrait influencer la transmission sexuelle du VIH-1, soit
directement par interaction avec le virus ou les cellules cibles, soit par la mise en
place d’un environnement pro- ou anti- inflammatoire dans les muqueuses.
La transmission du VIH-1 par les muqueuses a fait l’objet de nombreuses
études ces dernières années et plusieurs mécanismes non exclusifs de passage du
virus à travers la barrière épithéliale ont été proposés : infection via des brèches,
transcytose de particules virales à travers les cellules épithéliales, transmigration de
cellules infectées, capture de virons par les cellules dentritiques (DC).
L’objet de ma thèse a été d’une part d’étudier l’effet du LS d’hommes
séropositifs ou non sur l’infection par le VIH-1 de cellules cibles dans des modèles in
vitro mais aussi dans un contexte plus complexe et physiologique de muqueuses
cervicale et colo-rectale, et d’autre part de chercher à identifier les facteurs du
sperme susceptibles de moduler l’infection par le VIH-1.
9
INTRODUCTION
I.
LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE : VIH
a. La pandémie du SIDA en 2014
De nos jours, le VIH/SIDA (Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise) reste l’un
des principaux problèmes de santé publique dans le monde. La pandémie du SIDA a
fait plus de 30 millions de mort en trente ans. Depuis 2001, l’incidence mondiale de
l’infection à VIH, l’agent causatif du SIDA, s’est stabilisée et a commencé à diminuer
dans de nombreux pays développés. En 2013, 35 millions de personnes vivaient
avec le VIH et l’on estime que 2,4 millions de personnes ont été nouvellement
infectées en 2013. Ceci correspond à un recul des nouvelles infections de 33% par
rapport aux 3,4 millions (3,1-3,7 millions) de 2001, ce chiffre atteignant 50% ou plus
dans 26 pays. Mais d’autres pays ne sont pas en passe d’atteindre cet objectif,
soulignant la nécessité d’intensifier les efforts de prévention. Néanmoins, les
perspectives de renforcement des efforts de prévention n’ont jamais été aussi
prometteuses (RAPPORT ONUSIDA 2013, THE GAP REPORT 2014).
Les données actuelles montrent que le risque de transmission du VIH pourrait
diminuer jusqu’à 96% grâce aux thérapies antirétrovirales, d’environ 60% grâce à la
circoncision masculine médicale volontaire et de plus de 40% grâce à la prophylaxie
préexposition chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes.
Malheureusement, sur les 35 millions de personnes vivants avec le VIH-1, la
proportion de personnes n’ayant pas accès aux traitements antirétroviraux est de
70% : environ 80% au Nigéria, 58% en Afrique du Sud, 64% en Inde.
En outre, malgré les campagnes d’incitation à la circoncision masculine
volontaire médicale, moins de 30% des hommes sont circoncis dans les pays
subsahariens en dehors du Kenya et de l’Ethiopie où l’on atteint les 50%.
Dans ce contexte, il est primordial de comprendre l’ensemble des mécanismes
conduisant à la transmission sexuelle du virus afin de développer de nouvelles
stratégies de prévention pour atteindre un jour les objectifs ambitieux fixés par
l’ONUSIDA et l’OMS pour 2015 : zéro nouvelle infection, zéro discrimination et zéro
décès lié au SIDA (RAPPORT ONUSIDA 2013, THE GAP REPORT 2014).
10
b. Le VIH : structure, génome et protéines
Le VIH est un lentivirus appartenant à la famille des Retroviridae. Comme tous
les rétrovirus, le VIH-1 est un virus enveloppé qui possède la caractéristique de
transcrire son génome d’acide ribonucléique (ARN) en acide désoxyribonucléique
(ADN) à l’intérieur de la cellule hôte par la transcriptase inverse. Le génome du VIH1, constitué de 2 copies d’ARN simple brin et de polarité positive, a une taille
d’environ 10kb. Les lentivirus sont des rétrovirus non oncogènes qui infectent
principalement les cellules du système immunitaire. Ils sont responsables de
maladies chroniques, à évolution lente, caractérisées par une immunodéficience
[pour revue (Adamson and Freed 2007 ; Kuzembayeva et al. 2014)]. La structure
d’une particule virale et du génome du VIH-1 sont schématisés Figures 1 et 2.
Parmi les 15 protéines codées par le génome du VIH se trouvent des protéines
structurales (Matrice (MA), Capside (CA), nucléocapside (NC) , Protéase (PR),
transcriptase inverse (RT), Intégrase (IN), protéines d’enveloppe (SU pour surface) et
(TM pour transmambranaire)) et des protéines auxilaires (dont le rôle sera détaillé en
II-b-5-g) : l’activateur transcriptionnel (Tat), le régulateur d’expression des protéines
virales (Rev), la protéine virale U (Vpu), la protéine virale R (Vpr), le facteur
d’infectiosité virale (Vif) et l’effecteur négatif (Nef). Toutes ces protéines jouent un
rôle essentiel dans la réplication virale et l’infectiosité. Un grand nombre de ces
protéines interagit avec des molécules cellulaires afin d’optimiser la réplication et le
rendement de la production virale [pour revue (Adamson and Freed 2007; Ambrose
and Aiken 2013)]. Les principales étapes du cycle de réplication du virus sont
présentées Figure 3.
11
Figure 1 : Représentation schématique des éléments viraux composant la particule virale du
VIH-1. La particule virale mature et infectieuse se présente sous une forme plus ou moins sphérique d’environ
100 nm de diamètre. Cette particule se compose d’une bicouche lipidique dérivée de la cellule hôte dans
laquelle sont imbriquées des glycoprotéines de surface (Gp120 et Gp41), c’est l’enveloppe virale (Env). Les
glycoprotéines de surface sont associées sous forme de trimères : 3 protéines Gp41, enchâssées dans la
membrane sont liées de façon covalente à trois protéines Gp120. Directement attaché à l’enveloppe se
trouve un collier de protéines sphériques : la matrice (MA). Au centre de la particule virale mature se trouve
un corps en forme de cône composé de protéines de capside (CA) contenant différents éléments viraux. On y
trouve des enzymes virales : la reverse transcriptase (RT), l’intégrase (IN) ainsi que la nucléocapside (NC)
qui sont toutes directement liées au génome viral constitué de deux simples brins d’ARN positif identiques
[pour revue (Adamson and Freed 2007; Briggs and Krausslich 2011)].
12
Figure 2 : Représentation schématique du génome viral et des protéines
encodées. Le génome est flanqué par deux régions non transcrites : 5’LTR et 3’LTR. Chaque brin
d’ARN est identique et est composé de 9181 nucléotides. Le génome viral comporte : 3 gènes
principaux de strucure, gag, pol et env et des gènes régulateurs vif, vpr, vpu, tat, rev, nef et dans
certains isolats tev. L’épissage du génome viral aboutit à 3 ARNv de tailles différentes (9, 4 et 2kb)
dont la traduction conduit à la formation de trois protéines Gag, Gag/pol et Env qui sont les
précurseurs des protéines et enzymes virales. Le clivage par des protéases cellulaires ou/et virales
de ces précurseurs aboutit aux différentes protéines virales : de capside (P24, MA, NC), d’enveloppe
(Gp120, Gp41) et les enzymes (RT, IN, PR). Les autres protéines Vif, Vpu, Vpr, Nef, Tat et Rev sont
issues d’un transfert primaire de l’ARNm épissé.
Abréviations : LTR : long terminal repeat; RRE: Rev-Responsive Element; MA: matrice; CA:
capside; NC: nucléocapside; Pr: protéase; RT : transcriptase inverse; IN : integrase; P, protéine; Gp,
glycoprotéine.
13
Figure 3 : Le cycle viral du VIH-1 [d’après (Peterlin and Trono 2003) et (Arhel et al. 2007)].
(1) Attachement : Le virus se fixe sur la cellule cible, par reconnaissance entre la protéine virale gp120 et des
protéines cellulaires.
(2) Fusion : Les deux membranes (du virus et de la cellule cible) fusionnent à la membrane cellulaire ou dans
l’endosome, ce qui permet la pénétration de la nucléocapside, il s’ensuit la décapsidation et la libération de
l'ARN viral dans le cytoplasme.
(3) Transcription inverse: Grâce à la transcriptase inverse virale, l'ARN viral est rétro-transcrit en ADN viral.
(4) Intégration : Cet ADN pénètre dans le noyau, où il s'intègre au génome cellulaire (provirus).
(5) Transcription : Il est ensuite transcrit en ARN messager et génomique.
(6) Traduction : Après avoir été transcrits par l'ARN polymérase de la cellule, les ARN messagers viraux sont
traduits en trois précurseurs protéiques. Ces précurseurs sont clivés par des protéases cellulaires et virales,
pour donner les différentes protéines virales.
(7) Assemblage : Les protéines virales et l'ARN viral sont associés pour former de nouvelles particules virales
au niveau de la membrane cellulaire ou au niveau de vésicules cellulaires. Puis le virus bourgeonne.
(8) Maturation : Les virions subiront une étape de maturation avant de devenir infectieux.
14
c. Récepteurs et tropisme du VIH
1) Récepteurs impliqués dans l’entrée du virus par fusion avec la
membrane cellulaire
Le VIH-1 utilise une grande variété de récepteurs présents sur la membrane
cellulaire pour infecter les cellules. Le récepteur principal du VIH est la glycoprotéine
CD4, exprimée à la surface des lymphocytes (LT), des monocytes/macrophages et
de certaines cellules dendritiques (DC).
Lorsque la cellule hôte est infectée, l’expression du récepteur CD4 à la
membrane cellulaire est sous-régulée par les protéines virales Nef et Vpu pour
empêcher l’infection de novo [pour revue (Dube et al. 2010; Wilen et al. 2012)].
La liaison des protéines d’enveloppe virales Gp120 et Gp41 à un corécepteur
est également necessaire à l’entrée du virus dans la cellule. Les premiers et
principaux co-récepteurs décrits sont les récepteurs de chimiokines
CXCR4 et
CCR5, exprimés à la surface des cellules de la lignée hématopoïétique dont les
lymphocytes T CD4+, les cellules dendritiques, les macrophages, au niveau du
système nerveux central, et sur les cellules épithéliales [pour revue (Pollakis and
Paxton 2012 ; Wilen et al. 2012)].
Le ligand naturel de CXCR4 est SDF-1 (Stromal Derived Factor-1 ou CXCL12)
dont la fixation induit l’internalisation de CXCR4 membranaire et sa dégradation
partielle [pour revue (Pollakis and Paxton 2012; Wilen et al. 2012 ; Arnolds and
Spencer 2014)]. CCR5 se lie principalement à RANTES, MIP-1α et MIP-1β, MCP-1,
cytokines sécrétées par les LT CD8+ et inhibant la réplication du VIH-1. La fixation
de RANTES induit l’internalisation de CCR5 qui est ensuite redistribué à la
membrane plasmique [pour revue (Pollakis and Paxton 2012 ; Wilen et al. 2012)].
L’identification de CCR5 et CXCR4 a permis de comprendre les différences de
tropisme des souches et donc de définir deux types de virus : les souches utilisant le
co-récepteur CXCR4 (typiquement exprimé par les LT) définies par le terme « virus
X4, lympho-tropique » et les souches utilisant le co-récepteur CCR5 (exprimé
notamment par les macrophages et les lymphocytes T mémoires) définies comme «
virus R5, macrophage- tropique ». Cependant, la capacité des isolats primaires R5 à
se multiplier dans des macrophages est variable (Loftin et al. 2010). Certaines
15
souches sont dual-tropiques et peuvent utiliser les 2 types de co-récepteur, elles sont
nommées souches R5X4. Les virus à tropisme R5 sont majoritairement transmis par
voie sexuelle et sont prédominants au début de l’infection. Puis, au cours de la
maladie, des virus à tropisme X4 et à tropisme R5X4 émergent. Ces derniers plus
virulents, se répliquent plus rapidement et sont associés au déclin des LT CD4+
[pour revue (Naif 2013)]. Cette évolution d’un tropisme R5 vers un tropisme X4 est
liée à des mutations affectant la protéine virale Gp120 en particulier au niveau de la
boucle V3 (motif d’acides aminés modifiant la conformation, charge, glycosylation).
Les régions V1 et V2 de la Gp120 sont également impliquées dans le tropisme viral
(augmentation de la charge et glycosylation) [pour revue (Hartley et al. 2005; Connell
and Lortat-Jacob 2013)].
2) Récepteurs impliqués dans l’attachement du VIH aux cellules
Outre les principaux récepteurs du VIH, CD4 et CCR5 ou CXCR4, d’autres
récepteurs cellulaires sont également impliqués dans l’attachement du virus aux
cellules, et permettent par exemple le « portage » de virions par ces cellules en
l’absence d’infection productive (cas des cellules dendritiques) ou l’entrée du VIH par
endocytose.
Trois grandes familles de récepteurs alternatifs capables de fixer le VIH-1 et
dans de nombreux cas de l’internaliser ont été mises en évidence :
- Le galactosylcéramide (GalCer) ou les dérivés apparentés en particulier les
formes sulfatées ;
- Les lectines de type C comprenant les Macrophages Mannose Receptor
(MMR), les Mannose Binding Lectin (MBL), les langerines et enfin, la molécule DCSIGN ;
- Les héparanes sulfate de protéoglycane (HSPG) qui se composent de trois
familles : les syndéglycanes, les glypicanes et les perlécanes.
Plus récemment, l’intégrine α4β7 a été identifiée pour se lier à la protéine virale
Gp120 via un motif tripeptidique (LDV) de la boucle V2 de cette dernière. L’intégrine
α4β7 n’est pas un récepteur d’entrée mais elle permet de faciliter l’attachement des
virions aux cellules cibles. En effet, la liaison de l’intégrine α4β7 à la Gp120 induit
16
l’activation des intégrines LFA-1 et ainsi la formation de synaspe virologique (Arthos
et al. 2008; Cicala et al. 2009). L’attachement du VIH aux cellules via cette intégrine
pourrait jouer un rôle important au niveau muqueux car elle est exprimée par les
lymphocytes T intestinaux (cf chapitre II, paragraphe sur les cellules cibles dans la
muqueuse).
D’autre part, des études récentes ont montré que le recépteur CD169 (ou
SIGLEC-1 ou Sialoadhésine), qui lie les acides sialiques, était impliqué dans la
capture du VIH et la transinfection des cellules LT CD4+. En effet, Izquierdo et al ont
montré que des anticorps dirigés contre Siglec-1 inhibaient la capture par les DC du
VIH-1 de façon dose-dépendante et qu’un KO par siRNA réduisait fortement cette
capture ainsi que la transinfection des LT CD4+ (Izquierdo-Useros et al. 2012).
L’expression de Siglec-1 est induite par le LPS, l’IFNα et le TGFβ (Puryear et al.
2013; De Saint Jean et al. 2014). D’autre part, une étude in vivo a montré que Siglec1 était surexprimé très tôt après l’infection par le SIV et que son expression était
maintenue dans les modèles pathogènes favorisant la dissémination de l’infection
(Jaroenpool et al. 2007).
A cela s’ajoutent de nombreuses autres molécules pouvant également servir de
corécepteur et permettre l’entrée de certains variants de VIH-1 in vivo [pour revue
(Berger et al. 1999; Pollakis and Paxton 2012)].
II.
LA TRANSMISSION SEXUELLE DU VIH
Le VIH se transmet principalement lors de l’exposition des muqueuses à un
fluide contaminant tel que le sang, le sperme, les sécrétions vaginales ou le lait
maternel. La contamination se fait à l’occasion de rapports sexuels non protégés, lors
d’une transfusion de sang contaminé, lors de l’échange de seringues contaminées,
ou de la mère à l’enfant pendant la grossesse, l’accouchement ou l’allaitement.
a. Les différentes voies de transmission sexuelles
La
transmission
sexuelle
est
la principale
voie
de
transmission du
VIH 1 puisqu’elle est à l’origine de plus de 80 % des nouvelles infections. La
probabilité de transmission par voie sexuelle par exposition varie de 1/20 à 1/3000
(Tableau 1) et dépend de nombreux facteurs. Il a été montré que la transmission par
voie anale réceptive est beaucoup plus efficace que la transmission par voie vaginale
17
réceptive, et que ces deux voies sont elles-mêmes plus efficaces que les voies anale
et vaginale insertives. De plus, les risques de transmission lors d’activités sexuelles
orales, bien que nettement moins à risque que la pénétration, sont avérés, avec une
incidence plus élevée chez les homosexuels et un risque accru lors de rapport oraux
réceptifs avec lésions buccales [pour revue (Hladik and McElrath 2008; Boily et al.
2009; Tebit et al. 2012; Baggaley et al. 2013)]. La prévalence entre les différents
modes de transmission sexuelle diffère selon les régions du monde. Dans les pays
développés (USA, Canada, Europe, Australie, Nouvelle Zélande, certains pays
d’Asie et d’Amérique du sud) les homosexuels, exposés par voie rectale et par le
pénis, constituent la population la plus infectée. Au contraire, dans les pays en voie
de développement
(Afrique sub-saharienne, Caraïbe, Océanie, Chine), la
transmission hétérosexuelle est la plus fréquente (UNAIDS 2013). Ces données font
des muqueuses génitales et colorectales les deux portes d’entrée principales du VIH1 et du sperme son principal vecteur.
Bien que l’infection du pénis, via le prépuce et l’urètre [(Ganor et al. 2010); pour
revue (Ganor and Bomsel 2010)] par les sécrétions vaginales et colorectales
constituent une part importante des nouvelles contaminations [pour revue (Hladik
and McElrath 2008)], nous ne nous intéresserons dans les chapitres suivants qu’à la
muqueuse colorectale et aux muqueuses du tractus génital féminin dans le cadre
d’une contamination via le sperme.
18
Site d’invasion
Localisation
Type
Vecteur de
du VIH
anatomique
d’épithélium
transmission
Probabilité de
transmission
par exposition
Estimation de la
contribution au
nombre de cas VIH
dans le monde
Vagin
Tractus génital
féminin
Pluristratifié
Exocol
Endocol
Sperme
Pluristratifié
1/700 – 1/3000
10,2 millions
Sécrétion et
Tractus génital
desquamation
masculin
cervi-vaginales
intestinal
12,6 millions
Monostratifié
Prépuce interne
Tractus
1/200-1/2000
Urètre pénien
Monostratifié
et rectales
Rectum
Monostratifié
Sperme
1/20 – 1/300
3,9 millions
Sperme
1/2500
1,5 millions
1/5 – 1/10
960 000
1/10 – 1/20
480 000
95/100 – 1/150
2,6 millions
Tractus
gastrointestinal
Sang maternel,
Varié
haut
sécrétion
génitale
(intrapartum),
lait maternel
2 épithéliums
Placenta
Villosités
(cyto – et
Sang maternel
choriales
syncytio –
(intrautérin)
trophoblaste)
Produits
Sang
sanguins,
coupure
Tableau 1 : Contribution des sites d’invasion du VIH-1 à la pandémie
[d’après (Hladik and McElrath 2008)].
19
b. Le tractus génital féminin et la muqueuse colorectale :
principales voies d’entrée du VIH présent dans le sperme
Lors de la transmission sexuelle par voie anale ou vaginale réceptive, le VIH-1
contaminant le sperme sous la forme de virions et de cellules infectées entre en
contact avec la muqueuse génitale féminine ou celle du tissu colorectal. Différents
mécanismes de passage au niveau des muqueuses ont été avancés et sont
présentés ci-dessous.
1) La muqueuse : barrière physique contre l’infection
a. Les muqueuses du tractus génital féminin (TGF)
Le TGF est constitué de 3 parties (Figure 4) :
- le TGF inférieur qui correspond au vagin et à l’exocol et qui est exposé au
VIH-1,
- le TGF supérieur qui correspond à l’endocol, l’endomètre, les trompes de
Fallope et les ovaires, et qui est isolé de l’environnement externe et est peu exposé
au VIH-1
- et une 3ème partie qui correspond à la zone de transition entre l’endocol et
l’exocol [pour revue (Iwasaki 2010; Southern 2013; Xu et al. 2013; Nguyen et al.
2014)].
La muqueuse vaginale et celle de l’exocol sont constituées d’un épithélium
squameux pluristratifié, kératinisé (vagin) ou non (exocol), comportant plusieurs
dizaines de couches de cellules et d’une épaisseur de 200 à 300 µm. Une couche de
cellules basales génère de nouvelles cellules. Michellini et al. suggèrent que la
régénération de l’épithélium squameux favorise le recrutement de leucocytes via la
sécrétion de cytokines ou de facteurs de croissance favorisant la protection contre
les pathogènes (Michelini et al. 2004). De plus, au fur et à mesure que les cellules
migrent vers la partie extérieure de l’épithélium, elles se kératinisent constituant une
barrière efficace conte les pathogènes (Dinh et al. 2012). En outre, la desquamation
des couches supérieures de cellules confère à la muqueuse une protection contre
les pathogènes car il est plus difficile d’y établir une infection persistante [pour revue
(Kaushic et al. 2010; Southern 2013)].
20
La muqueuse de l’endocol et celle de l’utérus sont constituées d’un épithélium
monostratifié sous lequel des agrégats lymphoïdes sont observés. L’épithélium est
couvert de mucus sécrété par les cellules épithéliales qui peuvent former des
cryptes. Ce mucus immobilise les virions et diminue l’attachement du virus aux
cellules épithéliales [(Maher et al. 2005) ; pour revue (Merbah et al. 2011; Southern
2013)].
La zone de transition entre l’endocol et l’exocol est caractérisée par un
épithélium peu épais et une abondance de cellules immunitaires notamment des
LT CD4+. Des agrégats lymphoïdes peuvent également y être observés. La
muqueuse de la zone de transition est celle du TGF qui contient le plus de cellules
immunitaire, c’est pourquoi cette zone est considérée comme la plus sensible à
l’infection par le VIH-1 [(Maher et al. 2005); pour revue (Merbah et al. 2011; Southern
2013; Nguyen et al. 2014)].
b. La muqueuse colorectale
La muqueuse colorectale est formée d’un épithélium monostratifié. Juxtaposé à
la surface basolatérale de cet épithélium, on trouve de nombreuses cellules
immunitaires : LT, macrophages, DC, LB, CELLULES NK, cellules de Langerhans.
La muqueuse anale est formée d’un épithélium pluristratifié. Entre les deux, une
zone de transition ou de jonction anorectale est observée [pour revue (Hladik and
McElrath 2008; Iwasaki 2010; Keele and Estes 2011; Xu et al. 2013)] (Figure 4). Les
épithéliums monostratifiés sont plus fragiles que les épithéliums pluristratifiés et sont
de ce fait plus susceptibles à la formation de brèche lors de rapports sexuels et donc
plus vulnérables aux pathogènes (Chlamydia trachomatis, Neissaria gonorrhoeae,
VIH-1). Mais ils sont également caractérisés par la présence de jonctions serrées qui
leur confèrent une certaine protection contre les pathogènes. A l’inverse, des
jonctions plus lâches sont observées dans les épithéliums pluristratifiés [pour revue
(Keele and Estes 2011; Southern 2013; Nguyen et al. 2014)].
21
Lumière
Exocol
Junction
anorectale
Follicules
lymhoïdes
Vagin
Epithélium
monostratifié
Epithélium
monostratifié
Junction
anorectale
Zone de
transformation
Mucus
Epithélium
pluristratifié
Epithélium
pluristratifié
Figure 4 : Anatomie de la muqueuse Cervico-vaginale et de la muqueuse anorectale.
D’après (Iwasaki 2010).
22
2) Le mucus
Les cellules épithéliales des muqueuses sécrètent de nombreux facteurs
biologiques dont le mucus qui crée un environnement inhospitalier pour les
pathogènes et renforce la barrière épithéliale. Le mucus est composé d’eau et de
glycoprotéines hydrophiles contenant des domaines riches en sérine et thréonine et
des sites de liaison de glycane Ces glycoprotéines sont les mucines. A ce jour, 18
gènes codant pour la mucine (MUC) ont été identifiés. La composition du mucus peut
varier selon le type de muqueuse et sa localisation. De plus, 2 types de mucines ont
été identifiés : (i) les mucines liées à la membrane, exprimées à la surface apicale
des cellules épithéliales, elles forment le glycocalyx ; (ii) les mucines sécrétées sous
forme de monomères qui se lient les unes aux autres pour former un gel [pour revue
(Juge 2011)].
Dans le TGF, plusieurs mucines ont été identifiées en fonction du site
anatomique : (i) les mucines 1 et 6 sont sécrétées au niveau de l’utérus ; (ii) les
mucines 1, 4, 5 et 6 sont sécrétées au niveau de l’endocol ; (iii) et les mucines 1 et 4
sont sécrétées au niveau de l’exocol. La sécrétion des mucines dans le TGF et donc
la composition et la viscosité du mucus varient en fonction du cycle menstruel.
L’œstradiol favorise la sécrétion de la mucine 5B et sa glycosylation, ce qui a pour
effet d’augmenter la quantité d’eau dans le mucus et de le rendre plus abondant,
moins visqueux et moins acide. Ceci facilite la pénétration du sperme au moment de
l’ovulation. Le mucus contient également des composants antimicrobiens, des
immunoglobulines et des anticorps qui peuvent se lier aux pathogènes et former des
agrégats trop larges pour diffuser à travers le mucus [pour revue (Kaushic et al.
2010; Hickey et al. 2011; Juge 2011; Reis et al. 2014)].
Au niveau de la muqueuse anorectale, les cellules en gobelet de la muqueuse
anorectale produisent de grandes quantités de mucus (MUC 3, 4, 5, 11 et 19) qui
protègent l’épithélium d’un contact direct avec la microflore bactérienne. En cas
d’inflammation, des brèches peuvent survenir dans cette barrière chimique et
entraînent la colonisation bactérienne [pour revue (Juge 2011; Maldonado-Contreras
and McCormick 2011)].
23
3) La flore microbienne
La flore microbienne est présente à la surface de toutes les muqueuses et elle
joue un rôle important dans la régulation du pH du mucus, en particulier les bactéries
Lactobacillus. Ces bactéries produisent de l’acide lactique qui permet de maintenir le
pH acide du mucus, du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et des bactériocines. Ces
molécules permettent le maintien de la flore microbienne et elles présentent des
propriétés antivirales. Au niveau du TGF, l’altération de la flore microbienne liée au
cycle menstruel, ou liée à la prolifération d’autres microorganismes (Candida
albicans, Staphylococcus aureus) ou suite à des douches vaginales peut entraîner
une inflammation et favoriser l’infection par le VIH-1 (Aldunate et al. 2013; Nardis et
al. 2013; Vandepitte et al. 2014) ; [pour revue (Buvé 2014)]. La flore intestinale, dans
laquelle plus de 1 000 espèces de bactéries ont été identifiées, est indispensable au
maintien de l’intégrité de la muqueuse. Elle joue un rôle dans la réponse immunitaire
intestinale et le renouvellement des cellules de la muqueuse [pour revue
(Maldonado-Contreras and McCormick 2011)].
4) Les cellules cibles de la muqueuse
Le VIH a pour cible différentes cellules immunitaires et pénètre rapidement
dans les macrophages, les monocytes et les lymphocytes T4. Deux catégories de
cellules exprimant la molécule CD4 peuvent être infectées par le VIH au niveau des
muqueuses :
- Les lymphocytes CD4+, dits T helper, ayant pour fonction de coordonner
l’ensemble des réactions immunes humorales et cellulaires. Ils sont impliqués dans
un cycle hautement réplicatif du virus.
- Les cellules myéloïdes et/ou présentatrices d’antigènes : monocytes et
macrophages, cellules dendritiques, cellules de Langherans. Elles sont impliquées
dans un cycle peu réplicatif et participent à la diffusion et la dissémination du virus,
elles peuvent également constituer des réservoirs pour le VIH. La circulation de ces
cellules est assurée par les voies lymphatiques et sanguines et cette dynamique
assure une dissémination optimale du virus.
24
La fréquence et la densité des cellules cibles potentiel du VIH varie dans les
muqueuses en fonction du tissus étudiés et en fonction des facteurs de l’hôte et des
facteurs externes conduisant à une inflammation locale [pour revue (Keele and Estes
2011)].
a. Les lymphocytes T CD4+
De nombreux LT CD4+ (41 % des LT CD3+) ont été observés sous forme
d’infiltrats dans le stroma de la zone de transition et dans la lamina propria de
l’exocol et du vagin ainsi que dans la sous muqueuse de l’endocol [pour revue
(Rodriguez-Garcia et al. 2013)] ; (Trifonova et al. 2014). Les LT CD4+ sont
également retrouvé en abondance dans la muqueuse colorectale (Grivel et al. 2007;
McElrath et al. 2013). Plusieurs études ont montré qu’alors que les lymphocytes
TCD4 naïfs sont résistants à l’infection productive,
les lymphocytes T CD4+
mémoires sont permissifs à l’infection par le VIH-1, en particulier les LT CD4+
mémoires activés [pour revue (McKinnon and Kaul 2012) ; (Saba et al. 2013). Les LT
CD4+ sont également capables d’initier une transmission cellule-cellule efficace du
VIH via l’établissement d’une synapse virologique [pour revue (Costiniuk and
Jenabian 2014)]. La majorité des LT CD4+ des muqueuses sont des LT mémoires.
Ils sont caractérisés par une forte expression de CCR5 (15 fois plus que les LT CD4+
sanguins), et du marqueur d’activation CD69 (100 fois plus que les LT CD4+
sanguins). Dans la muqueuse colorectale 56% des cellules CCR5+ sont des
lymphocytes. Les LT CD4+ présents dans les muqueuses du TGF et de la muqueuse
colorectale expriment fortement l’intégrine α4β7 (Cicala et al. 2009; McKinnon et al.
2011; Martinelli et al. 2013; Goode et al. 2014). Celle-ci medie la migration des
lymphocytes dans les muqueuses via l’intégration avec les protéines MAdCAM-1, VCAM-1, et la fibronectine (Andrew et al. 1994). Les cellules α4β7+ définissent un
sous ensemble de LT qui sont métaboliquement actifs et hautement susceptibles à
l’infection par le VIH et caractérisés par une forte expression de CCR5 et une faible
expression de CXCR4 (Cicala et al. 2009; McKinnon et al. 2011). L’intégrine α4β7
pourraient donc être impliquée dans l’infection massive des LT CD4+ dans l’intestin,
leur déplétion ainsi que dans la perte d’intégrité de la muqueuse [pour revue (Wilen
et al. 2012)]. L’importance du rôle de l’intégrine α4β7 dans l’infection par le VIH a été
modulée par des études récentes. En effet, deux études ont montré que les LT CD4+
25
α4β7 négatives constituaient les cellules cibles préférentiels du VIH dans l’intestin
(Monteiro et al. 2011; McBride et al. 2013). D’autres part, l’études de nombreux
isolats de VIH indique que la capacité de liaison α4β7/Gp120 n’est pas commune à
toutes les souches de VIH (Parrish et al. 2012; Perez et al. 2014). Cependant une
sélection des souches transmises pourrait ainsi s’opérer.
b. Les monocytes/macrophages
Les macrophages constituent 10 % des leucocytes présents dans le TGF où ils
sont localisés au niveau de la lamina propria. Ils expriment peu le récepteur CD4 et
le corécepteur CXCR4 mais expriment largement CCR5. Leur phénotype est proche
de celui des monocytes puisqu’ils expriment fortement le récepteur CD14 (Saba et al.
2010); [pour revue (Rodriguez-Garcia et al. 2013)]. Une étude récente vient
contredire ces résultats et montre que les macrophages CD14+ CD11c- constituent
30% des cellules de l’exocol (Trifonova et al. 2014). Dans la muqueuse colorectale,
les macrophages expriment peu CCR5 et ne représentent que 1 à 3 % des cellules
CCR5+ (McElrath et al. 2013). Les macrophages des muqueuses peuvent exprimer
DC-SIGN, CD169 mais aussi des syndécans et ainsi capter le VIH-1. Ils sont
également capables de macro-pinocytose [pour revue (Hladik and McElrath 2008)];
(Soilleux et al. 2002; Hiemstra et al. 2014; Trifonova et al. 2014).
La permissivité des macrophages à l’infection diffère selon les sous populations
de macrophages et la muqueuse. Les M1 qui ont une activité pro-inflammatoire sont
peu permissifs au virus car ils produisent des chimiokines ligands de CCR5 et
diminuent l’expression de CD4 à leur surface. De plus, ils expriment le facteur de
restriction APOBEC 3A. Les macrophages M2 qui ont une activité anti inflammatoire
sont plus susceptibles à l’infection, ils expriment DC-SIGN (DC Specific ICAM-3Grabbing Non integrin) et sont capables de transmettre efficacement le virus aux LT
CD4+ [pour revue (Alfano et al. 2013)]. Les macrophages du TGF sont plus
susceptibles à l’infection que les macrophages de la muqueuse colorectale (Saba et
al. 2013); [pour revue (Shen et al. 2010a; Rodriguez-Garcia et al. 2013)]. Les
macrophages infectés sont plus résistants aux effets cytopathiques de l’infection
virale que les lymphocytes T et continuent à produire du virus et servent donc de
réservoir viral jusqu’à la mort de la cellule (demie-vie de 1 à 4 semaines). De plus,
l’infection par le VIH-1 des macrophages entraîne une dérégulation des fonctions de
26
phagocytose, de présentation antigénique, de signalisation via les TLR et de
production de cytokines [pour revue (Collini et al. 2010)].
c. Les cellules dendritiques et cellules de Langerhans
Les cellules dendritiques (DC) sont localisées au niveau de la sous muqueuse
cervico-vaginale, dans la lamina propria et dans l’épithélium pluristratifié du vagin et
de l’exocol ainsi qu’au niveau sub-épithélial dans la muqueuse colorectale. Dans
cette dernière, elles sont plus abondantes au niveau du colon (194 DC/mm2) qu’au
niveau du rectum (116 DC/mm2) [pour revue (Hladik and McElrath 2008; RodriguezGarcia et al. 2013) ; (McElrath et al. 2013). Dans l’endomètre, le nombre de DC
matures (CD83+) reste constant alors que le nombre de DC immatures (CD1a+)
varie en fonction du cycle menstruel [pour revue (Rodriguez-Garcia et al. 2013)].
Les DC expriment le CD4 et les corécepteurs CCR5 et CXCR4 mais également
plusieurs récepteurs alternatifs dont DC-SIGN et CD169 (dont l’expression,
contrairement à DC-SIGN, ne dépend pas du stade de maturation des cellues) qui
sont capables de fixer le VIH (souches X4 ou R5) via la Gp120 avec une affinité
supérieure à celle de l’interaction Gp120/CD4 [pour revue (Nisole and Saib 2004)].
La capture de la particule virale par endocytose est le mode d’entrée majeur du VIH1 dans les DC et via l’interaction entre DC-SIGN ou GalCer et le VIH-1 (Turville et al.
2004; Nobile et al. 2005). Les DC jouent alors le rôle de cellules réservoirs avant de
transmettre le virus en trans aux LT CD4+ [pour revue (Rodriguez-Garcia et al.
2013)]. D’autre part, il a récemment été montré que les DC présentes dans la
muqueuse colorectale étaient capables d’étendre leurs dendrites à travers
l’épithélium jusque dans la lumière du colon pour y capturer via leurs récepteurs
CCR5 les virus de souche R5 puis d’infecter des LT CD4+ par transfert (Cavarelli et
al. 2013).
Les cellules de Langerhans sont abondantes dans l’épithélium cervico-vaginal.
Elles n’expriment pas le récepteur DC-SIGN ni le corécepteur CXCR4 mais elles
expriment HLA-DR et CD1a, CD11c et la langérine ainsi que des MCLRs (Mannose
dépendant C type Lectine Receptors). Elles capturent les virions via leurs dendrites
qui s’étendent dans la lumière vaginale ou colorectale pour la capture d’antigène
[pour revue (Hladik and McElrath 2008; Rodriguez-Garcia et al. 2013)]. Au niveau de
27
la muqueuse vaginale, les cellules de Langerhans n’expriment pas CD4 ni CCR5
(pour revue (Xu et al. 2013)].
d. Les cellules épithéliales
Les cellules épithéliales sont les premières cellules au contact du virus contenu
dans les sécrétions contaminées. Elles constituent des cibles potentielles pour le
VIH, grâce à l’expression de récepteurs de surface alternatifs comme le GalCer, les
lactocéramides sulfatés ou les syndécans. D’autre part, l’existence des corécepteurs
CCR5 et CXCR4 du VIH-1 à la surface de lignées de cellules épithéliales
colorectales ou génitales a pu être mise en évidence par différentes études. Ces
observations suggérant que les cellules épithéliales pouvaient constituer des cibles
pour le VIH-1 ont été confortées par la détection du virus au sein de l’épithélium
intestinal de patients séropositifs (Heise and L'Age 1991; Kotler et al. 1991). Mais
des études menées ex vivo et in vivo ont montré soit une absence d’expression du
récepteur CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 par les cellules épithéliales
primaires soit une expression des co-récepteurs mais uniquement à la surface des
cellules sub-épithéliales (Patterson et al. 1998; Zhang et al. 1998). Les résultats de
nombreuses études in vitro ou ex vivo (Tan et al. 1993; Furuta et al. 1994; Howell et
al. 1997; Dezzutti et al. 2001; Asin et al. 2003; Wu et al. 2003; Asin et al. 2004;
Berlier et al. 2005; Saidi et al. 2007) sont contradictoires, certaines concluant à
l’absence d’entrée virale, d’autres à la séquestration du virus, et d’autres montrant
une production de novo de virions infectieux [pour revue (Rodriguez-Garcia et al.
2013)]; (Tan et al. 1993; Micsenyi et al. ). Malgré tout, les cellules épithéliales jouent
un rôle dans la transmission du VIH-1 via la transcytose, mécanisme de passage des
virions du pôle apical au pôle basolatéral des cellules épithéliales après la liaison de
virions aux certains récepteurs et corécepteurs CCR5 et CXCR4 ou via des
molécules d’adhésion telles que GalCer ou l’héparan sulfate (Bomsel and Alfsen
2003; Kinlock et al. 2014; Kohli et al.).
28
5) Les acteurs de l’immunité innée dans la muqueuse
a. Les cellules Natural Killer (NK)
Les cellules NK sont des cellules lymphoïdes granuleuses qui ont la capacité de
lyser les cellules tumorales et les cellules infectées par un virus sans stimulation
préalable par un antigène. Ce sont donc des acteurs de l’immunité innée. Elles sont
présentes en abondance dans la sous muqueuse cervico-vaginale ainsi que dans la
muqueuse rectale où elles résident soit dans l’espace intra épithélial soit dans la
lamina propria. Dans les muqueuses, les cellules NK, comme toutes les cellules NK,
n’expriment pas CD3 mais leur phénotype peut varier en fonction de la muqueuse.
Elles expriment CD9, CD56, CD94, CD69 et peu ou pas CD16 dans la muqueuse de
l’endocol, contrairement aux muqueuses de l’exocol, du vagin et à la muqueuse
colorectale qui exprime CD16 mais pas CD69 ni CD94. Dans le tractus gastrointestinal, il a été montré que les cellules NK de l’espace intra épithélial, qui se
multiplient de façon massive, pouvaient être impliquées dans le contrôle de la
réplication virale chez des patients traités et des patients élite contrôleurs [pour revue
(Ploquin et al. 2012) ; (Quillay 2014a)] ; (Sips et al. 2012).
Les cellules NK dans la muqueuse constituent la première ligne de défense et
vont contrôler l’infection par le VIH-1 avant l’initiation de la réponse immunitaire
adaptative. Leur exposition aux IFN de type 1 et leur contact avec des DC activées
entraînent la production d’IL-2 et d’IL-15. Ceci permet d’augmenter leur prolifération
ainsi que leur production d’IFNγ et leur activité cytotoxique contre les cellules
infectées. Les cellules NK activées par la diminution des signaux inhibiteurs ou
l’augmentation des signaux activateurs vont relarguer des granules cytoplasmiques
contenant de la perforine et de la granzyme. Les cellules NK peuvent également être
activées par liaison d’un anticorps au CD16, ce qui déclenchera les mécanismes
d’ADCC (cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps). Les cellules NK peuvent
également induire l’apoptose des cellules par le Fas ligand. Durant la phase aigüe de
l’infection, il y a une expansion des cellules NK CD56dim (faible expression de CD56
et exprime CD16) et une augmentation de l’expression des récepteurs inhibiteurs
(KIR et CD85j) et de l’expression des cytokines tels que l’IFNγ, impliqué dans la
réponse antivirale, TNFα, IL-10, GM-CSF qui vont permettre la mise en place d’un
environnement proinflammatoire et des ligands de CCR5 qui vont inhiber l’entrée du
29
virus MIP1α, MIP1β, RANTES. En parallèle, on observe une diminution des cellules
NK CD56bright (forte expression de CD56, pas d’expression de CD16). Durant la
phase chronique, on observe une altération de la distribution des cellules NK dans
les muqueuses avec une expansion des cellules NK anergiques CD56neg ainsi
qu’une diminution des cellules NK CD56+. Les cellules NK anergiques sont
caractérisées par une diminution de la production d’IFNγ et une diminution de
l’activation des DC. Le VIH-1 a développé la capacité d’échapper aux cellules NK, via
une adaptation au génotype des KIR, en particulier KIR2DK2, qui lui permet d’inhiber
la liaison des cellules NK aux LT CD4+ infectés par le récepteur KIR. De plus,
l’interaction entre les cellules NK et les DC augmente la réplication virale dans les
DC [pour revue (Ploquin et al.) ; (Quillay 2014a)] ; (Sips et al. 2012).
b. Les macrophages et les cellules dendritiques
Les macrophages et les cellules dendritiques sont des acteurs clés dans la
réponse immunitaire innée. Ce sont des cellules présentatrices d’antigènes (CPA)
qui vont permettre d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sécrètent des
cytokines qui vont orienter la réponse immunitaire. Les macrophages sont également
capables de produire des molécules du complément, des enzymes lytiques, des
microbicides, des radicaux libres oxygénés, des oxydes nitriques et ce sont des
cellules phaogocytaires.
Peu de choses ont été montrées sur le rôle des macrophages dans la réponse
immunitaire innée face au VIH-1 mais il semblerait que les DC et les cellules de
Langerhans puissent orienter la réponse immunitaire adaptative vers une réponse de
type Th2 alors que les macrophages orientent vers une réponse de type Th1 [pour
revue (Duluc et al. 2013)].
c. Les protéines et peptides antimicrobiens
Les cellules épithéliales et les cellules immunitaires des muqueuses produisent
dans leurs sécrétions de nombreuses protéines et peptides présentant une activité
antimicrobienne. Ils sont sécrétés de façon constitutive ou après induction par
l’inflammation ou par des pathogènes [pour revue (Maldonado-Contreras and
McCormick 2010; Wira et al. 2011; Southern 2013)]. Certains de ces peptides
30
présentent une activité anti-VIH tels que les défensines, le SLPI (Secretory
Leucocytes Protease Inhibitor), la lactoferrine et la trappine/élafine.
Les défensines sont de petits peptides cationiques qui possèdent une action
antibactérienne, antifongique et antivirale. Elles sont classées en deux groupes : les
α-défensines et les β-défensines. Elles sont sécrétées par les cellules immunitaires
et les cellules épithéliales. Les défensines exercent leur activité anti-VIH soit en se
liant directement aux virus, soit en inhibant sa réplication virale (α-défensine) (Furci
et al. 2012). Elles peuvent également inhiber l’entrée du virus dans la cellule cible via
la diminution de l’expression du co-récepteur d’entrée CXCR4 ou en modulant l’état
d’activation des cellules cibles (β-défensines). Deux défensines (HD5 et HD 6)
augmentent la réplication du VIH-1 en présence d’une infection à Gonorrheae
(Quinones-Mateu et al. 2003; Wira et al. 2011; Zhao and Lu 2013).
Les cathélicidines telles que LL-37 sont des peptides cationiques qui excercent
une action antibactérienne et inhibent la réplication du VIH-1 [pour revue (Wira et al.
2011; Southern 2013)].
Le lysozyme est un antibactérien qui agit par clivage des peptidoglycanes. C’est
une protéine cationique qui peut interagir avec les membranes et bloquer l’entrée du
VIH-1 et sa réplication [pour revue (Wira et al. 2011; Nguyen et al. 2014)].
La lactoferrine bloque la fusion et l’entrée du virus dans les LT CD4+ par son
interaction avec la Gp120 [pour revue (Wira et al. 2011; Nguyen et al. 2014)].
La trappine/élafine inhibe l’infection par le VIH en interagissant directement
avec le virus. Elle est surexprimée dans les sécrétions cervico-vaginales des femmes
hautement exposées au VIH-1 et non infectées (Shacklett and Greenblatt 2011;
Nguyen et al. 2014).
MIP3α/CCL20 est un chimioattractant qui possède une action inhibitrice directe
sur le VIH-1 (Ghosh et al. 2009b).
Les protéines SLPI (Secretory leukocyte protease inhibitor) sont des membres
de la famille des trappines. Elles sont sécrétées par les cellules épithéliales, les
neutrophiles et les macrophages activés. Elles sont retrouvées dans de nombreuses
sécrétions (cervico-vaginale, rectale, pénienne, salive). Elles inhibent l’infection par le
31
VIH-1 des macrophages et des LT CD4+ par compétition pour le site de liaison à
l’annexine à la surface des cellules. De nature cationique, la protéine peut interagir
avec l’enveloppe virale et déstabiliser le virion. Le SLPI peut aussi agir sur la
prolifération et l’activation des LT CD4 [pour revue (Guerrieri et al. 2011; Wira et al.
2011)].
Tous ces peptides antimicrobiens ont un effet synergique qui accroît l’immunité
innée des muqueuses. Malgré leur structure et leurs fonctions différentes, ils
possèdent un élément commun : ce sont des molécules cationiques qui peuvent
interagir directement avec la membrane cellulaire ou virale et former des pores qui
vont modifier les gradients de concentration ioniques et déstabiliser la cellule CD4
[pour revue (Wira et al. 2011)]. Ils sont également sensibles à des facteurs tels que le
pH, la concentration ionique, le sérum ou la présence de sperme qui affectent leurs
activités biologiques. D’autre part, leur activité biologique est également régulée par
des protéases telles que les cathepsines, l’élastase, les kallidreins, les MMPs et des
inhibiteurs de protéases telles que la serpine. La serpine est un inhibiteur de sérine
protéase qui régule l’activité des protéases et qui possède une activité anti-VIH-1 soit
en inhibant les protéases de la cellule hôte soit en interférant avec les molécules de
liaison et en inhibant l’entrée (Aboud et al. 2014).
Dans le tractus génital féminin, la concentration de ces peptides antimicrobiens
varie en fonction du cycle menstruel, elle diminue de 10 à 100 fois dans les
sécrétions cervico-vaginales au moment de l’ovulation [pour revue (Shacklett and
Greenblatt 2011; Wira et al. 2011)].
Les cellules épithéliales sécrètent également des molécules du complément
sous forme native dont le rôle sur l’infection par le VIH-1 sera développé chapitre IIIC.
d. Les immunoglobulines (Ig)
Des anticorps de sécrétion (IgA, IgG et IgM) sont présents dans les sécrétions
génitales et rectales. Les secrétions cervico-vaginales contiennent plus d’IgG que
d’IgA et que d’IgM contrairement aux sécrétions rectales qui contiennent plus d’IgA
que d’IgG. Ces immunoglobulines polyspécifiques reconnaissent différents épitopes
et bien que leur efficacité soit faible et qu’elles ne bloquent pas complètement les
32
pathogènes, elles permettent une réponse rapide face à l’infection. Les Ig se fixent
au virus dans la lumière muqueuse externe et forment un complexe immun. Le virus
se retrouve piégé et éliminé dans le mucus. Ce mécanisme appelé exclusion immune
empêche la pénétration des virus dans l’organisme en les éloignant de l’épithélium,
en favorisant leur agglutination, en inhibant les molécules d’adhésion et en bloquant
leur fixation sur leur récepteur cellulaire. Les anticorps muqueux peuvent bloquer
l’infection des cellules cibles en agissant sur une ou plusieurs étapes clés du cycle
de réplication virale. Ces anticorps neutralisants coexistent avec les anticorps
muqueux non neutralisants et participent à l’exclusion immune des particules virales.
Plusieurs études ont montré la présence d’IgA spécifiques du VIH-1 dans les
sécrétions cervico-vaginales des femmes hautement exposées et non infectées par
le VIH-1 [pour revue (Shacklett and Greenblatt 2011; Wira et al. 2011; Xu et al.
2013)].
e. Les cytokines et chimiokines
Lors d’une inflammation ou de l’exposition des cellules épithéliales et
immunitaires des muqueuses aux pathogènes, des chimiokines et cytokines
proinflammatoires sont produites et induisent le recrutement des cellules de
l’immunité innée à la surface des muqueuses.
Les cellules épithéliales des muqueuses produisent de façon constitutive et
suite à une stimulation, des ligands naturels de CCR5 (MIP-1α, MIP-1β et RANTES)
et de CXCR4 (SDF1). Ils entrent en compétition avec le VIH-1 pour la liaison au
récepteur, entraînent la régulation négative de leur expression à la surface cellulaire
et diminuent l’infection des cellules cibles. Le recrutement des DC plasmacytoïdes
(pDC) est régulé par la sécrétion de CCL20, chimiokine pouvant avoir une action
inhibitrice directe sur le VIH-1 (Ghosh et al. 2009a ; Nguyen et al. 2014)}.
Des cytokines pro-inflammatoires sont également sécrétées par les cellules
épithéliales : IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-7, IL-8, TNF-α, ainsi que PGE2, médiateur de
l’inflammation dont le rôle dans l’infection par le VIH-1 au niveau des muqueuses
sera développé dans le chapitre III-C. Les cellules cibles sont alors attirées au site
d’infection ce qui favorise la réplication virale et la propagation du virus (Rancez et
al.; Nguyen et al. 2014). De plus, les cellules épithéliales produisent des interférons
33
de type I (IFNβ) qui ont un effet antiviral soit par une action sur la réplication du VIH1 soit en stimulant la production de facteurs de restrictions (APOBEC-3G/3F,
SAMHD1, Tétherine, Mx2) ou de ligands de CCR5 ou via l’activation des celllules
NK, DC, macrophages. Un nouvel IFN présentant une activité anti-VIH-1 a été
récemment mis en évidence dans les muqueuses : l’IFNε. Ce dernier est surexprimé
dans la muqueuse cervicovaginale exposée au liquide séminal ((Nguyen et al. 2014).
Des études ont montré que les femmes hautement exposées et non infectées
présentaient des taux d’expression de RANTES et de l’IFN-α, au niveau du col de
l’utérus, plus élevés que les femmes non exposées et des taux de MIG et IP10
(molécules impliquée dans le recrutement de cellules NK et de LT CD4+ mémoires)
plus faibles ce qui pourrait diminuer le recrutement des cellules cibles au niveau des
muqueuses et leur liaison au VIH-1 et donc diminuer le risque de transmission (Iqbal
et al. 2005; Hirbod et al. 2010; Lajoie et al.).
f. Les TLR (Toll Like Receptor)
Les cellules épithéliales, les cellules NK et les DC expriment à leur surface des TLR.
Le VIH-1 est reconnu par les pDC via le TRL7 et le TRL9. La reconnaissance se fait
en intracellulaire et requière l’endocytose du virion via les endosomes. Après la
reconnaissance, les pDC ne sont pas complètement matures mais expriment IRF7 et
produisent de façon persistante l’IFN 1 qui inhibe la réplication virale (Ploquin et al.
2012).
g. Les facteurs de restriction
Les facteurs de restriction tels que des membres de la famille APOBEC-3 (APO
lipoprotein B mRNA-editing, enzyme-catalytic, polypeptide-like 3G), la tétherine,
SAMHD-1 (SAM domain-containing and HD domain-containing), et dernièrement mis
en évidence Mx2 inhibent la réplication virale à différents stades du cycle viral. Bien
qu’ils ne soient pas toujours considérés comme des molécules de l’immunité innée,
les facteurs de transcription présentent une activité anti-VIH. De plus, ils sont
souvent produits par des cellules du système immunitaire et/ou induits par les IFN de
type I, sécrétés principalement par les pDC dans le cas d’une infection (Strebel et al.
2009; Ploquin et al. 2012; Strebel 2013; Towers and Noursadeghi 2014).
34
Le VIH a cependant acquis la capacité de contourner ces facteurs de
restriction. Il a développé des protéines dites accessoires, Vif, Vpu qui contrecarrent
respectivement APOBEC-3 et la téthérine, Vpx du VIH-2 qui contrecarre SAMHD-1.
La neutralisation des facteurs de restriction par le VIH implique souvent le
détournement de la voie de dégradation des protéines cellulaires par le protéasome
en réponse à leur polyubiquitination (Strebel et al. 2009; Ploquin et al. 2012; Strebel
2013).
APOBEC-3
Les membres de la famille APOBEC-3 qui inhibent le VIH-1 sont APOBEC-3D,
3F, 3H et 3G. Ce sont des cytidines désaminases qui en l’absence de vif peuvent
être encapsidés dans les virions. La désamination des résidus cytidine en uraciles
entraîne la synthèse d’ADNc hypermutés au moment de la transcription inverse,
l’activation de la machinerie de réparation de l’ADN cellulaire et la dégradation de
l’ADNc viral. Si l’ADNc est malgré tout intégré au génome, celui-ci ne pourrait pas
permettre la production de virions infectieux. La protéine Vif inhibe l’encapsidation
d’APOBEC-3 en induisant sa dégradation par le protéasome (Strebel et al. 2009;
Ploquin et al. 2012; Strebel 2013; Towers and Noursadeghi 2014).
La téthérine
La téthérine est une glycoprotéine transmembranaire qui interagit par son
extrémité cytoplasmique avec la protéine Nef perturbant ainsi le bourgeonnement
des virions qui vont rester accrochés à la membrane. Ceux-ci peuvent alors être
internalisés et dégradés dans les lysosomes. La protéine Vpu (Vpx pour le VIH-2) se
lie à la tethérine, inhibe sa liaison à Nef et entraîne sa dégration par le protéasome,
facilitant ainsi la libération des particules virales (Mitchell et al. 2009; Strebel et al.
2009; Ploquin et al. 2012; Strebel 2013; Towers and Noursadeghi 2014).
TRIM5α
La protéine TRIM5α se lie à la capside virale et entraîne sa dégradation soit par
le protéasome après ubiquitination soit par une voie indépendante du protéasome
dont les mécanismes ne sont pas encore bien connus mais qui a été mise en
évidence par l’utilisation d’inhibiteur du protéasome (Nakayama and Shioda 2010;
35
Towers and Noursadeghi 2014). Cependant la protéine TRIM5α humaine n’est pas
active contre le VIH-1 contrairement à la protéine TRIM5α simienne.
SAMHD-1
SAMHD-1 est une dNTPase dépendant de dGTP qui permet de bloquer
l’infection virale dans les macrophages et les DC (Hrecka 2011) en réduisant le taux
de dNTP précurseurs essentiels à la synthèse d’ADN viral (Lahouassa 2012).
Cependant une étude récente a montré que SAMHD-1 possèdait une activité
ribonucléase et que c’est celle-ci plutôt que son activité dNTPase qui serait impliquée
dans sa capacité à inhiber le VIH-1 en entrainant une dégradation de l’ARN VIH-1
(Ryoo et al. 2014). SAMHD-1 est induite par les IFN de type 1. La protéine Vpx du
SIV contrecarre l’action de SAMHD-1 en induisant sa dégradation par le protéasome
(Strebel et al. 2009; Strebel 2013; Towers and Noursadeghi 2014).
Mx2
Le nouveau facteur de restriction contre le VIH-1 Mx2 possède une activité
GTPase et est exprimé en réponse aux IFN de type 1. Bien que son mécanisme
d’action ne soit pas encore complétement compris, il semble que Mx2 intervienne
après la transcription inverse et avant l’import nucléaire par une interaction directe
avec la capside (Towers and Noursadeghi 2014).
6) L’immunité adaptative
Les DC et les macrophages initient la réponse immunitaire adaptative dans les
muqueuses. Les connaissances à ce propos sont encore incomplètes. Bien que les
LB soient présents dans la muqueuse vaginale au niveau d’agrégats lymphoïdes et
qu’ils semblent agir en tant que CPA, la réponse humorale via la sécrétion d’IgA
spécifique du VIH-1 ne se met en place qu’environ 3 semaines après l’infection
(Ploquin et al. 2012). L’apparition des LT CD8+ VIH-1 spécifiques a lieu une à deux
semaines après l’infection qui correspond au pic de virémie. Une étude a montré la
présence de LT CD8+ spécifiques du VIH-1 dans les muqueuses des femmes
exposées non infectées mais ces cellules ne seraient pas impliquées dans le
contrôle de la réplication du VIH-1 (Gumbi et al. 2008; Xu et al. 2013). D’autre part,
l’existence de LT mémoires résidents dans les tissus (Tm, Tissu resident memory T
36
cells) et leur implication dans le déclenchement d’une réponse immunitaire rapide
pour lutter contre les réinfections a été récemment mise en évidence. Les Tm
expriment l’intégrine αE en hétérodimère avec l’intégrine β7. Cet hétérodimère
permet de lier les E-cadhérines exprimées par les cellules épithéliales du tissu.
L’expression de ces intégrines combinée au TGFβ serait impliquée dans le maintien
à long terme des Tm dans le tissu. Les Tm initient une réponse immunitaire antivirale
locale et rapide via la production de cytokines : (i) des IFN qui vont induire
l’expression de molécules d’adhésion V-CAM et le recrutement des LB, (ii) du TNFα
qui induit la maturation des DC, (iii) de l’IL-2 qui active les cellules NK (Slutter and
Harty 2014). Différents sous types de LT CD4+ helper coopèrent pour combattre
l’infection VIH-1 et la balance entre les LTh17, LTh1 et les LTreg est essentielle. Les
LTh1 et LTh17 sont capables d’induire une inflammation et d’activer une réponse
immunitaire systémique et agissent en synergie pour augmenter la résistance à la
transmission VIH. Les LTh17 et LTreg proviennent des mêmes cellules progénitrices
et leur différentiation dépend du milieu cytokinique dans lequel elles se trouvent.
Mais à l’inverse des LTh17, les LTreg réduisent la réponse LT spécifique du VIH-1 et
facilite l’établissement et la maintenance d’une infection chronique. Au cours de
l’infection, une augmentation progressive des LTreg et perte graduelle des Th17 et
Th1 ont pu être observées (Singh et al. 2014).
c. Les modes de transmission du VIH-1
Lors de la transmission sexuelle, les virus présents sous forme de virions libres
ou de cellules infectées dans les sécrétions génitales ou rectales du partenaire
infecté doivent entrer en contact avec les cellules cibles immunitaires des
muqueuses et sous muqueuses génitales et rectales pour que l’infection soit
possible. Différents mécanismes de transmission du VIH-1 via la muqueuse ont été
proposés, notamment sur la base d’expériences ex vivo et in vivo chez le macaque
[pour revue (Shattock and Moore 2003; Haase 2005; Hladik et al. 2007; Hladik and
McElrath 2008; Rodriguez-Garcia et al. 2013; Barreto-de-Souza et al. 2014; Shen et
al. 2014b)].
37
1) Le passage de la barrière épithéliale
a. Brèches dans la muqueuse
En cas d’infection microbienne (ex : vaginose bactérienne), d’IST (ex : HSV),
d’utilisation de microbicides tels que le nonoxynol 9 (Weir et al. 1995; Zalenskaya et
al. 2011; Fuchs et al. 2013) ou de spermicides ou suite à un rapport sexuel même
non violent, des abrasions et des brèches peuvent survenir dans l’épithélium vaginal
ou rectal (Norvell et al. 1984). L’infection par le VIH via une brèche est le mode de
passage du virus le plus simple, le plus rapide et le plus efficace. Les virions libres ou
les cellules infectées traversent directement la muqueuse pour aller au contact des
cellules cibles résidentes dans la lamina propria [pour revue (Miller and Shattock
2003; Shattock and Moore 2003; Hladik and McElrath 2008; Rodriguez-Garcia et al.
2013)] (Figure 5).
Ces brèches apparaissent chez plus de 60% des femmes après un rapport
sexuel. La muqueuse rectale, de par son épithélium monostratifié, est la plus fragile
et de nombreux microtraumatismes apparaissent après un rapport anal (Southern et
al. 2011).
b. Infection directe des cellules cibles par les virions en l’absence
de brèche
Carrias et al. ont montré que les virions pourraient diffuser, jusqu’à 7 à 9µm
d’épaisseur en moyenne, de façon passive dans la muqueuse de l’endocol et de
l’exocol alors que la transmission par des cellules infectées résulterait d’un
mécanisme de migration active à travers l’épithélium (Carias et al. 2013). Les cellules
épithéliales des muqueuses du tractus génital féminin sont liées entre elles par des
jonctions serrées qui assurent l’intégrité de la barrière épithéliale. Celle-ci est altérée
lorsque le VIH-1 interagit via la Gp120 avec des cellules cibles en induisant la
production de TNFα. Le TNFα entraîne une diminution de l’expression des protéines
de jonctions serrées et une diminution de 60% de la résistance transépithéliale. Ce
phénomène est observé pour les souches R5 et X4 (Nazli et al. 2010). Cette
dégradation de l’épithélium facilite la translocation du VIH-1. Au niveau du TGF bas,
les cellules épithéliales apicales ne sont pas liées par des jonctions serrées et
l’épithélium présente des pores entre les cellules adjacentes permettant le passage
38
de molécules de hauts poids moléculaire. A l’inverse les cellules épithéliales basales
et para basales sont liées par des jonctions serrées. Le VIH-1 pourrait diffuser dans
la partie apicale de l’épithélium et rencontrer des cellules cibles telles que des
cellules de Langerhans et des lymphocytes T intraépithéliaux (Blaskewicz et al.
2011).
L’infection des cellules épithéliales par le VIH est controversée (voir paragraphe
IIb4d). Le VIH-1 peut pénétrer la muqueuse soit par l’infection productive de cellules
épithéliales soit en étant internalisé par ces cellules et séquestré dans des
compartiments d’endocytose et dans le cytosol, induisant la mise en place d’un
réservoir viral (Tan et al. 1993; Micsenyi et al.; Kinlock et al. 2014; Kohli et al. 2014 ) ;
pour revue (Rodriguez-Garcia et al. 2013) (Figure 5).
c. Passage par transcytose
La transcytose est le passage du virus à travers les cellules épithéliales, de la
face apicale vers la face basale, sans induire de fusion des membranes, ni d’infection
productive de ces cellules par internalisation dans des structures de type
endosomes. Après leur libération au niveau basal, les virions ont accès à de
nombreuses cellules cibles de la lamina propria (DC, LT CD4+, macrophages) qu’ils
sont capables d’infecter (Bomsel 1997) (Figure 5). Ce mécanisme de transmission a
été mis en évidence dans de nombreuses études in vitro
dans des modèles
d’épithélium monostratifié de cellules épithéliales polarisées vaginales (Kinlock et al.
2014), endométriale (Carreno et al. 2002), de col de l’utérus (Chancey 2002, Van
Herrewege 2007) et intestinale (Meng et al. 2002) mais n’a pas encore pu être mis
en évidence in vivo. Plus récemment, Kinlock et al. ont montré dans des cellules
épithéliales vaginales, que le mécanisme de transcytose impliquerait la voie de
l’endocytose (Kinlock et al. 2014). Ce mode de transmission montre une efficacité
très faible au niveau de la muqueuse génitale féminine – moins de 0,02% de
l’inoculum initial traverse l’épithélium formé par des cellules génitale primaire par
transcytose (Bobardt et al. 2007) - et se révèle plus efficace à travers l’épithélium
monostratifié de la muqueuse ano-rectale (Meng et al. 2002). L’entrée du VIH-1 dans
la cellule épithéliale implique l’interaction du virus avec des lectines, le GalCer et des
HSPG (Heparan Sulfate Proteoglycan) et les récepteurs au mannose ((Wu et al.
2003; Bobardt et al. 2007; Connell and Lortat-Jacob 2013) ou des intégrines
39
(Carreno et al. 2002). D’autre part, des récepteurs Fc néonatal (FcRn) identifié à la
surface des cellules épithéliales génitales favoriseraient l’infection par transcytose in
vitro dans des modèles d’épithélium monostratifié de cellules endométriales dans un
environnement acide et en présence d’anticorps spécifique du VIH-1 (Li et al.; Gupta
et al. 2013). En outre, la transcytose est plus efficace quand les particules virales
bourgeonnent directement dans une synapse virale après contact entre une cellule
infectée et une cellule épithéliale non infectée, plutôt que lors d’un contact entre des
virions libres et des cellules épithéliales.
d. Capture par les cellules immunitaires sous muqueuses ou
insérées dans la muqueuse
Les particules virales, libres ou associées aux cellules, qui sont piégées dans le
mucus peuvent être capturées par les cellules immunitaires, notamment les cellules
de Langerhans présentes dans la muqueuse et les DC (Ballweber et al. 2011). Elles
peuvent internaliser les virions dans les vésicules d’endocytose, établissant ainsi un
réservoir viral dans l’organisme, et transmettre le virus en cis ou en trans aux
macrophages et LT CD4+ au niveau du site d’exposition (lamina propria et sous
muqueuse) ou au niveau des ganglions lymphatiques après migration des DC dans
le système lymphatique et ce jusqu’à plusieurs jours après sa capture [pour revue
(Shattock and Moore 2003; Hladik and McElrath 2008)] (Figure 5). Plusieurs études
ex vivo se sont intéressées à la capture du VIH par les cellules immunitaires de la
muqueuse. Anderson et al. ont montré que les macrophages pourraient émettre des
prolongements cytoplasmiques à travers les espaces intraépithéliaux des explants
d’endocol et ainsi capturer des virions pour les transporter jusqu’aux cellules cibles
subépithéliales (Anderson 2010). Shen et al. ont mis en évidence un mécanisme
similaire dans la muqueuse intestinale via les DC présente dans la lamina propria
(Shen et al. 2010b). La liaison des DC survient 15 mn après l’inoculation alors que
les premiers macrophages et les premiers LT CD4+ infectés par le VIH-1 ne sont
détectables que 2h après inoculation (Shen et al. 2011). Une étude récente a
confirmé les résultats de Shen et al. et montré que l’exposition au VIH-1 R5 d’une
muqueuse colorectale reconstituée entraînait la migration rapide des DC sous
muqueuses à travers l’épithélium intestinal, puis le transfert du virus aux cellules
cibles par ces DC. En revanche, l’exposition au VIH-1 X4 n’entraînait pas cette
40
migration (Cavarelli et al. 2013). De plus selon Lawrence et al., la transmigration se
ferait préférentiellement avec des souches de VIH-1 R5 (Lawrence et al. 2012) et
constituerait un mécanisme pouvant expliquer la transmission préférentielle des
souches R5. Transmigration des leucocytes infectés.
Les LT et les macrophages infectés présents dans le sperme du donneur
peuvent s’infiltrer entre les cellules épithéliales dans la muqueuse en libérant des
particules virales de manière polarisées en direction de la sous muqueuse (pour
revue (Hladik and McElrath 2008). La migration apicale-basale des leucocytes
infectés est induite par un gradient de chimiokines relarguées par les cellules
épithéliales de la muqueuse [pour revue (Wira et al. 2005)]. Ce mécanisme de
transmission du VIH-1 a été mis en évidence à la fois dans des modèles ex vivo mais
aussi dans des modèles in vivo. Ainsi plusieurs études ont montré la transmigration
de cellules infectées à travers l’épithélium d’explants cervicaux, intestinaux ou
colorectaux et l’infection des cellules cibles subépithéliales (Collins et al. 2000; SotoRivera et al. 2012; Tugizov et al.; Kolodkin-Gal et al.). L’une d’entre elle indique que
la transmigration se ferait préférentiellement par les macrophages mais pas par les
LT dans l’épithélium intestinal fœtal mais pas dans l’épithélium intestinal adulte
(Tugizov et al.). Cette étude a été contredite par celle de Kolodkin et al. dans laquelle
la transmigration de LT CD4+ infectés à travers l’épithélium d’explants colorectaux et
l’infection des cellules cibles subépithéliales ont été mise en évidence (Kolodkin-Gal
et al.).
Des molécules spécifiques, telles que les intégrines LFA-1 et Mac-1 et leur
ligand ICAM ou JAM, présentes à la surface des cellules épithéliales et des cellules
immunitaires sont impliquées dans la transmigration. De plus, Carreno et al. ont
montré que l’infection de macrophages induisait l’augmentation de l’expression de
CD11a à leur surface et que celle-ci interagit avec ces ligands ICAM-2 et ICAM-3
exprimés à la surface des cellules épithéliales pour migrer à travers la muqueuse
(Carreno et al. 2002) (Figure 5).
41
Figure 5 : Mécanismes de transmission de l’infection par le VIH au niveau des
muqueuses [adapté de (Shattock and Moore 2003)].
Les mécanismes potentiels de la transmission du VIH via les muqueuses de l’organisme peuvent se
produire par : l’infection directe des cellules cibles immunitaires ou épithéliales via les brèches ou par
diffusion passive, un mécanisme de trancytose c'est-à-dire par la traversée du virus dans la cellule
épithéliale, délivré soit par une cellule infectée soit par des particules virales libres, un mécanisme de
transmigration des cellules infectées à travers l’épithélium ou par capture des virions ou cellules
infectées par les cellules immunitaires.
42
2) Infection locale et systémique
Les modèles de primates non humains ont permis d’étudier la cinétique
d’infection et de montrer que le SIV pénètre l’épithélium cervico-vaginal et infecte une
petite population de cellules, essentiellement des LT CD4+ résidents en une heure
(Hu et al. 2000, (Miller et al. 2005). Il s’ensuit pendant quelques jours une expansion
locale qui permet de générer une quantité de virus et de cellules infectées suffisantes
pour la dissémination aux ganglions lymphatiques où le virus va se répliquer. Cette
réplication virale intense a pour conséquence une augmentation forte de la charge
virale dans le sang de l’individu infecté (106 à 107 copies/ml) et est accompagnée par
une chute significative du taux de lymphocytes T CD4+ (jusqu’à moins de 200
cellules par µl de sang) (McMichael et al. 2010). Des cellules infectées ayant été
retrouvées précocement dans les ganglions dès 18h à 24h après exposition,
plusieurs vagues de dissémination du virus doivent avoir lieu avant l’établissement
de l’infection systémique (Salle et al. 2010). Ceci peut s’expliquer par le contrôle de
l’infection par la réponse immunitaire locale, innée ou adaptative, dans les temps
précoces de l’infection. Lorsque la réaction immunitaire antivirale est établie, la
numération des T CD4 + circulants retrouve un niveau modéré subnormal
(Grossman et al. 2006). La réponse immunitaire cellulaire (lymphocytes T CD8+) est
la première à se mettre en place et joue un rôle majeur dans l’initiation de la
diminution de la réplication virale dans le sang. Survient ensuite une réponse
humorale spécifique caractérisée notamment par l’apparition d’anticorps anti-gag p24
et anti-env qui permettent le diagnostic de séroconversion. Mais la réponse
immunitaire cellulaire contre le VIH-1 est trop faible et trop tardive pour prévenir la
dissémination dans le système lymphoïde où la réplication virale s’accélère. Ces
réactions immunitaires de l'hôte contrôlent en partie la réplication virale, jusqu'à ce
qu'elle atteigne un niveau stable inférieur appelé le « viral setpoint». Cependant, ces
réponses n’éliminent pas le virus, menant à une infection chronique. Les réservoirs
viraux sont établis très précocement dans les tissus lymphoïdes, l’intestin, le
cerveau, les tractus génitaux. Un réservoir cellulaire majeur du VIH est représenté
par l’intégration de provirus dans le génome de cellules infectées latentes (LT CD4+
mémoires non activés). Les macrophages infectés peuvent également constituer des
réservoirs. Une fois l’infection systémique et les réservoirs viraux établis, l’infection
VIH-1 est impossible à supprimer. La phase asymptomatique est caractérisée par un
43
équilibre entre la réplication virale et la réponse immunitaire qui peut contrôler le VIH1 jusqu’à plusieurs années après l’infection. On observe également durant cette
phase une augmentation du renouvellement des lymphocytes T, de leur niveau
d’activation ainsi que des niveaux de cytokines proinflammatoires et chimiokines
dans le sérum. Il semble que le degré d’activation du système immunitaire soit un
meilleur indicateur de la progression de la maladie que la charge virale. Cependant,
les causes de cette hyperactivation demeurent partiellement inconnues. La déplétion
suit son cours à raison de 60 cellules/mm3/année. La phase SIDA est déclarée
lorsque la numération sanguine de T CD4+ passe en-dessous de 200 cellules/mm3.
A ce stade, la charge virale plasmatique peut atteindre quelques millions de copies
par ml (Chomont et al. 2009 ; Haase 2010).
d. Les
souches
virales
transmises :
caractéristiques
et
mécanismes potentiellement impliqués dans la sélection
In vivo, les souches R5 sont préférentiellement transmises, indépendamment
de la voie de transmission, chez les adultes comme chez les enfants. Les souches
X4 sont rarement retrouvées chez les individus nouvellement infectés (Tebit et al.
2003) alors que des variants sont présents dans les sources de transmission. Ces
résultats suggèrent que l’usage du corécepteur CCR5 joue un rôle important dans la
transmission virale et dans la dissémination après infection et des restrictions envers
les souches X4 doivent exister. De plus, entre 70 et 90% des transmissions
hétérosexuelles se font via un unique variant viral sauf en cas d’inflammation ce qui
favoriserait les infections à variants multiples (Haaland et al. 2009; Keele and Estes
2011; Edo-Matas et al. 2012). L’infection par des variants de souche R5 suggère
l’implication des macrophages dans la transmission de l’infection mais des études in
vitro montrent que les souches transmises se répliquent mal ou pas du tout dans les
macrophages (Simmons et al. 1996; Peters et al. 2006; Cavarelli and Scarlatti 2009;
Keele and Derdeyn 2009; Salazar-Gonzalez et al. 2009). Les DC et les cellules de
Langerhans sont abondantes dans les muqueuses et peuvent aussi être impliquées.
Une étude conduite chez les singes Rhésus infectés avec du SIV par voie vaginale a
suggéré que les cellules de Langerhans étaient les premières cellules cibles (Miller
and Hu 1999). Elles capturent le virus et le transportent jusqu’aux organes
lymphoïdes pour le présenter au LT.
44
Une sélection visant à favoriser les variants R5 semblerait donc s’exercer au
sein du tractus génital du donneur et/ou au niveau du site d’infection (Haaland et al.
2009), pour revue (Grivel et al. 2011). Différentes hypothèses sont avancées pour
tenter d’expliquer la restriction de la transmission aux souches R5 (Fiser et al. 2010).
De manière générale, la Gp120 semble avoir une meilleure affinité avec CCR5
qu’avec CXCR4 (Pollakis and Paxton 2012). L’expression préférentielle de CCR5 à
la surface des DC pourrait expliquer que la majorité des transmissions concerne des
souches R5. Bien que l’infection des DC soit controversée, il a été montré que cellesci étaient capables de capturer le virus via DC-SIGN et d’être infectées selon un
mécanisme CCR5 dépendant. Et une étude récente a montré que bien que les
cellules de Langerhans pouvaient être infectées indépendamment par des souches
X4 ou R5, seules les souches R5 sont transmises aux LT CD4+ (Sarrami-Forooshani
et al. 2014).
Trois autres mécanismes de transmission préférentiels des souches R5 par les
DC ont été mis en évidence ces dernières années : - le passage sélectif des souches
R5 via les DC à travers l’épithélium intestinal (Cavarelli et al. 2013) ;
- la
transmigration préférentielle des monocytes infectés par des variants R5 par rapport
à des leucocytes infectés avec une souche X4 (Lawrence et al. 2012) ; - l’infection
préférentielle et rapide des LT CD4+ par les DC avec des souches R5 (Cavarelli and
Scarlatti 2009). Un autre mécanisme de restriction des souches R5 peut être associé
à la transcytose et relié au fait que les cellules épithéliales de l'intestin grêle
expriment de préférence CCR5 plutôt que CXCR4 (Poles et al. 2001). De plus, lors
d’expériences in vitro il a été rapporté que des cellules épithéliales intestinales
jéjunales primaires ont pu transférer les souches R5, mais pas X4 par transcytose
aux cellules cibles (Meng et al. 2002). En outre, une étude récente sur des mDC
vaginales primaires a montré que ces dernières pouvaient capturer et transporter des
souches transmises de VIH-1 et d’infecter en trans les LT CD4+ de façon efficace
suggèrant ainsi leur implication dans la sélection des souches R5 lors de la
transmission (Shen et al. 2014a).
Une explication alternative à la prédominance des variants R5 est l’existence de
différentes sous populations de lymphocytes. In vivo, CCR5 est principalement
exprimé par les LT mémoires activés alors que CXCR4 prédomine dans les LT naïfs.
45
Les DC présentes dans la muqueuse intestinale activent les LT CD4+ qui acquièrent
un phénotype de LT CD4+ mémoires. In vivo et in vitro des études ont confirmés que
des isolats R5 infectaient préférentiellement les LT mémoires CCR5+ alors que les
isolats X4 infectaient les LT naïfs et quiescents qui ne sont pas favorables à une
infection productive (Cavarelli and Scarlatti 2009).
Un mécanisme additionnel qui peut influencer la transmission au niveau des
muqueuses est l’expression de taux élevé de SDF1α, le ligand naturel de CXCR4 qui
induit une sous régulation de CXCR4. Le mucus cervical contient également des β
défensines qui peuvent inactiver le VIH-1 au niveau des épithéliums. Certaines de
ces défensines sont restrictives vis-à-vis des souches X4. Cependant d’autres ne
semblent pas avoir d’effet préférentiel sur l’une ou l’autre des souches virales
(Cavarelli and Scarlatti 2009; Seidel et al. 2010 ). D’autre part, les résultats de
Balandya et al. suggèrent que le liquide séminal favoriserait la transmission des
souches R5 par rapport aux souches X4.
La capacité des souches « dual tropic » X4R5 à se lier à l’un ou l’autre des
récepteurs est compromise par l’inhibition préférentielle de ces isolats par les βchimiokines en comparaison aux souches R5. De plus, l’infection par des souches
R5X4 est affectée par une substitution d’un amino-acide dans le domaine
extracellulaire de CCR5 (Cavarelli and Scarlatti 2009).
Une autre hypothèse est la séquestration et l’élimination sélective des souches
X4. Certaines études suggèrent que les virus X4 sont rapidement séquestrés et
éliminés en faveur des souches R5 par les mécanismes immunitaires bien que les
anticorps neutralisants supposés être impliqués n’aient pas montré de différence de
sensibilité face aux souches X4 et R5 (Cavarelli and Scarlatti 2009).
Enfin, les IFN de type 1 joueraient un rôle important dans le contrôle de la
réplication virale dans les étapes précoces de l’infection par le VIH-1, avant
l’établissement de l’infection systémique. La pression de sélection conduirait à la
transmission de variants moins sensibles aux interférons (Fenton-May et al. 2013).
La transmission des souches R5 du VIH-1 par voie sexuelle est donc
vraisemblablement due à une succession de filtres se situant à plusieurs niveaux et
non à un mécanisme unique sélectionnant la réplication des virus R5 et empêchant
le passage et la réplication des virus X4. Chaque barrière n’est pas efficace à 100%
dans la sélection mais l’addition de toutes les barrières existantes aboutit à une
46
sélection quasi-totale. Ainsi, même si une brèche est introduite dans l’une des
barrières, la sélection reste efficace (Grivel et al. 2011).
Les données de plusieurs études phylogénétiques suggèrent que les souches
transmises de VIH-1 présentent certaines caractéristiques génétiques. Ainsi Haaland
et al ont montré que les séquences d’Env de VIH-1 de sous types A et C, isolé chez
des patients en phase chronique, contenant des sites de N-glycosylation court et peu
nombreux dans les régions V1 et V4 étaient transmis de façon préférentiel (Haaland
et al 2009). Des résultats similaires ont été observés en comparant les séquences
d’Env de VIH-1 de sous-type A (Chohan et al 2005) et de VIH-1 de sous type A et D
(Sagar et al 2009) de patients en phase aigüe. Gnanakaran et al. ont mis en
évidence des signatures particulières pour le sous-type B (acide aminé conservé,
motifs de glycosylation) à proximité des site de liaison au récepteurs CD4, au
corécepteur CCR5 et dans le domaine cytoplasmique de la Gp41 (Gnanakaran et al
2011). Plus récemment, une étude a montré que l’infection par les souches de VIH
contenant un motif tripeptidique particulier (P/SDI/V) au niveau de la boucle V2 de la
Gp120 était fortement dépendante de l’intégrine α4β7. Ce motif est retrouvé dans
35% des variants du sous-type C (Simone I. Richardson 2014).
e. Les facteurs influençant l’efficacité de la transmission
De nombreuses différences inter-individuelles et de nombreux facteurs
d’infectivité du donneur et de la susceptibilité du receveur peuvent moduler la
transmission du VIH-1 [pour revue (Gupta and Klasse 2006)].
1) Les facteurs d’infectivité du donneur
a. Charge virale et stade d’infection
L’infectivité d’un donneur reflète la probabilité de ce donneur de transmettre le
VIH-1 au receveur. La charge virale dans les sécrétions génitales est généralement
corrélée à la charge virale dans le sang bien que la variabilité des charges virales
dans les sécrétions des muqueuses soit plus forte que dans le sang. De ce fait, la
probabilité de transmission par voie sexuelle est plus élevée lorsque la charge virale
sanguine est élevée. Ainsi, une personne avec une primo-infection ou un SIDA
déclaré a une charge virale sanguine et génitale plus élevée et présente 10 fois plus
de risque de transmettre le VIH qu’un individu en phase asymptomatique. Le taux
47
d’ARN viral dans les sécrétions génitales est généralement plus faible que dans le
plasma sanguin mais est plus fort dans les sécrétions rectales [pour revue (Gupta
and Klasse 2006; Le Tortorec and Neil 2009; Mounzer and DiNubile 2013)].
b. Les traitements
Chez la majorité des patients, les trithérapies réduisent la charge virale
sanguine sous la limite de détection ainsi que la charge virale génitale et donc le
risque de transmission du VIH (Swenson et al. 2014). Cependant de l’ARN viral peut
persister dans le sperme et les secrétions cervico-vaginales de certains patients
traités depuis plusieurs années alors que la charge virale sanguine est indétectable.
Ces patients pourraient donc encore présenter un risque de transmission sous
traitement (Attia et al. 2009; Politch et al. 2012; Houzet et al. 2014). De plus, la
charge virale des sécrétions rectales peut rester forte chez les patients traités
(Zuckerman et al. 2004).
c. Les ISTs
Les coinfections par des ISTs autres que le VIH-1 (Tableau 2) sont associées à
des charges virales élevées dans les sécrétions génitales et rectales. La réplication
de chaque agent infectieux augmente celle de l’autre par des mécanismes, directs
ou indirects, de synergie [pour revue (Garolla et al.)].
48
Tableau 2 : Principales maladies sexuellement transmissibles véhiculées par le sperme.
Abréviations : LS : liquide séminal, Spz : spermatozoïdes, HCMV : human cytomégalo virus, HSV : human
simplex virus, HCV : Hepatitis C virus, HBV : Hepatitis B virus, EBV : Epstein-Barr virus.
Pathologie
Agent
pathogène
SIDA
VIH
Sélection de
reférences
bibliographiques
(Le Tortorec and
Dejucq-Rainsford 2007)
Fraction du
sperme
LS,
leucocytes
LS,
Leucocytes
LS,
leucocytes
LS, autres
cellules
LS, autres
cellules
HCMV
(Pallier et al. 2002)
Herpes
HSV
(Pallier et al. 2002)
Condylome
HPV (WH)
(Garolla et al. 2012)
Virus
Inflammation de
l’uretre
Adenovirus
(Bradshaw et al. 2006)
(VST)
Oreillons
Myxovirus
parotidis
(Jalal et al. 2004)
Sperme total
HCV
(Davison et al. 1987;
Ghosn et al. 2005)
LS
HBV
(Le Tortorec and
Dejucq-Rainsford 2007)
LS, Spz,
leucocytes
Mononucléose
EBV
(Pallier et al. 2002)
LS,
leucocytes
Gonorrhoea
Neisseria
gonorrhoe
(Isbey et al. 1997;
Peeling and Embree
2005)
Hépatite virale
Lymphogranuloma
venereum
Chlamydia
trachomatis
Ureaplasma
urealyticum
Treponema
pallidum
Haemophilus
ducreyi
Streptococce
du groupe B
Chlamydia
trachomatis
Inflammation de
l’urètre
Mycoplasma
génitalium
Protozoaire
Inflammation
organes TGM
levure
Candidose
Trichomonas
vaginalis
Candida
albicans
Bactéries
Infection à
chlamydiiae
Inflammation de
l’urètre
Syphilis
Chancre mou
(Gdoura et al. 2008a)
(Reichart et al. 2000;
Gdoura et al. 2008b)
(Maw et al. 1985)
(Peeling and Embree
2005)
(Ochsendorf 2008)
(Svenstrup et al. 2003;
Peeling and Embree
2005)
(Sena et al. 2007)
(Mahadevan et al.
1996)
49
2) Les facteurs de susceptibilité du receveur
a. Les facteurs génétiques
Les facteurs génétiques de l’hôte peuvent influencer la transmission virale.
Ainsi, certains individus dont le corécepteur CCR5 est muté (homozygotie pour la
mutation CCR5Δ32 qui conduit à une absence d’expression du récepteur à la
surface de la cellule) sont résistants à l’infection par le VIH. Cette mutation est plus
fréquente dans les populations d’Europe du Nord où 1% des individus sont
homozygotes. Malgré cela, cette mutation ne procure qu’une protection incomplète,
et uniquement contre les souches R5, puisque des cas d’infection avec des souches
X4 ont été rapportés (Lama and Planelles 2007; Wilen et al. 2012).
Les gènes du HLA (Human Leukocyte Antigen) codent pour des protéines de
surfaces responsables de la présentation antigénique aux lymphocytes T. Certains
gènes du HLA de classe I, en particulier HLA-B ont été associés au contrôle du VIH.
En effet, les allèles HLA-B5701 (fréquents dans les populations d’Europe et
d’Amérique du Nord), HLA-B5703 (équivalent du précédent dans les populations
d’Afrique), et HLA-B2705 sont plus fortement représentés chez les contrôleurs du
VIH comparativement aux non contrôleurs. Les protéines de HLA sont également
reconnues par les cellules NK, et une série d’études a montré que les individus
exprimant à la fois le récepteur KIR3DS1 (un récepteur régulateur à la surface des
cellules NK) et le HLA-Bw4-081 (une famille d’allèle HLA se fixant au KIR3DS1) ont
une charge virale à l’équilibre plus faible et un moindre risque de progresser vers le
SIDA (Deeks and Walker 2007; Moir et al. 2011).
b. Les facteurs anatomiques
En cas d’ectopie cervicale, c’est-à-dire en cas d’extrusion de la muqueuse
endocervicale dans le vagin, la susceptibilité à l’infection s’accroît. Les ectopies
cervicales surviennent souvent chez les jeunes filles et durant la grossesse. La zone
de transformation et la muqueuse de l’endocol, caractérisées respectivement par une
abondance de cellules cibles et un épithélium monostratifié, se retrouvent exposées
aux pathogènes. Des ulcérations et/ou une inflammation peuvent survenir et
augmenter les risques d’infections (Kleppa et al. 2014).
50
c. Les facteurs hormonaux et la contraception
Le cycle menstruel influence la susceptibilité à l’infection. Les taux d’hormones
varient pendant le cycle menstruel et régulent les fonctions immunitaires et la
structure de l’épithélium. L’infection par le VIH-1 est plus efficace lorsque le taux de
progestérone est élevé c’est-à-dire pendant la phase sécrétrice (Saba et al. 2013).
Plusieurs modes d’action de la progestérone et des œstrogènes ont été mis en
évidence. La progestérone induit une diminution de l’épaisseur de l’épithélium alors
que les œstrogènes entraînent une prolifération de cellules épithéliales et donc un
épaississement de l’épithélium (Wood et al. 2008). La progestérone induit également
une augmentation du recrutement des cellules immunitaires cibles au niveau de la
muqueuse du TGF ainsi qu’une augmentation de leur activation et de l’expression de
CCR5 (Wira et al. 2011; Chandra et al. 2013). La progestérone inhibe la production
de cytokines pro-inflammatoires (Huijbregts et al. 2013), des peptides antimicrobiens
et des IgG et IgA. Wira et al. ont définis la notion de « fenêtre de vulnérabilité »
située 7 à 10 jours après l’ovulation lors du pic de progestérone et pendant laquelle
les risques d’infection par le VIH-1 seraient accrus (Wira and Fahey 2008). D’autre
part, plusieurs études ont montré que la contraception hormonale augmentait le
risque de transmission du VIH via une augmentation de l’inflammation, une
augmentation de l’expression de CCR5, une augmentation de la réplication et une
augmentation des risques d’IST (Blish and Baeten 2011 ; Heffron et al. 2012).
d. Perturbation de la flore endogène : IST et inflammation locale
La perturbation de la flore endogène augmente le risque d’infection par le VIH-1
Les IST altèrent l’environnement immun de la muqueuse et facilitent l’infection par le
VIH-1 en induisant soit une inflammation locale qui engendre une augmentation du
nombre de leucocytes activés - cibles préférentielles du VIH - dans les muqueuses
génitales comme dans le cas d’une infection à Chlamydia trachomatis soit une
ulcération de la muqueuse permettant au VIH d’accéder plus facilement à ces
cellules cibles comme lors d’une infection par le papillomavirus ou le chancre
(Trifonova et al. 2007; Shacklett and Greenblatt 2011).
51
Dans le cas d’une vaginose bactérienne, les bactéries anaérobies prolifèrent
plus que les bactéries Lactobacillus. Il en résulte une neutralisation du pH vaginal
acide, une diminution de la production de peroxyde d’hydrogène, et une activation de
la réplication virale par les sécrétions bactériennes via la voie des NFκB (Brotman
2011).
e. Les traumatismes physiques
L’utilisation de produit asséchant ou irritant [pour revue (Miller and Shattock
2003)] ou les pratiques provoquant des traumatismes génitaux (irritation de la
muqueuse, lésions inflammatoires, micro-ulcérations) augmentent la susceptibilité au
VIH par altération de la muqueuse génitale (Gupta and Klasse 2006; Myer et al.
2006).
f. La circoncision
La circoncision masculine est associée à une diminution du risque de
transmission de 60% (Auvert et al. 2005; Gray et al. 2007). L’OMS et l’ONUSIDA ont
recommandé en 2007 la circoncision de l’adulte comme stratégie de prévention
additionnelle contre le VIH dans les communautés à forte prévalence du virus et à
faible prévalence de la circoncision (UNAIDS/WHO, New data on male circumcision
and HIV prevention: policy and programme implications 2007). La circoncision
pourrait permettre de façon simple de réduire les chances d’être infecté pour chaque
exposition au virus. La muqueuse du prépuce contient dans sa partie interne, sous la
fine couche kératinisée présente à la surface, des cibles potentielles qui expriment
CD4 et CCR5 (LT CD4+, macrophages, cellules de Langerhans) d’où sa
susceptibilité à l’infection par le VIH (Ganor and Bomsel 2010; Ganor 2011). Le
nombre de ces cellules cibles du virus augmente avec d’autres infections génitales
ce qui pourrait être un possible effet synergique des co-infections. La circoncision a
aussi été associée à une plus faible prévalence du VIH dans un contexte de
transmission hétérosexuelle (Warner et al. 2009). Cependant, bien que très efficace
pour prévenir la transmission hétérosexuelle du virus, les résultats sont plus
contrastés parmi les homosexuels chez lesquels les effets bénéfiques de la
circoncision sont contrebalancés par l’accroissement des comportements à risque.
De même, l’efficacité de la circoncision pour prévenir la transmission du VIH de
52
l’homme à la femme est encore mal connue (Hirbod et al. 2010; Londish et al. 2010;
Rosario et al. 2013; Jayathunge et al. 2014).
III.
LE SPERME : PRINCIPAL VECTEUR DU VIH ET MODULATEUR
POTENTIEL DE SA TRANSMISSION
La principale fonction du sperme est la reproduction de l’espèce, via la
fécondation de l’ovocyte par un spermatozoïde. Mais le sperme est aussi le vecteur
d’un grand nombre de pathogènes (virus, bactéries, champignons) (Table 2) [pour
revue, (Dejucq and Jegou 2001)]. Le sperme est un fluide complexe, constitué d’une
fraction acellulaire, le liquide séminal (LS) (95-98% du volume total) et des cellules
spermatiques, principalement constituées de spermatozoïdes. Le liquide séminal est
classiquement défini comme le milieu de survie des spermatozoïdes pour lesquels il
assure une fonction nutritive, de protection et de transport dans le TGF. Il est
également impliqué dans la maturation des spermatozoïdes et dans la modulation de
la réponse immunitaire du TGF pour induire des conditions favorables à la
fécondation (Rolland et al. 2012), [pour revue (Rodriguez-Martinez et al. 2011)].
a. Elaboration et caractéristiques physiques et chimiques du
sperme
1) Origine et composition du sperme
La fraction cellulaire du sperme comprend les spermatozoïdes (20 à 250
millions de spermatozoïdes) ainsi que des cellules germinales testiculaires
immatures (40% de l’ensemble de la population des cellules non spermatozoïdes),
des corps cytoplasmiques (43%), des cellules épithéliales polygonales provenant de
la voie uréthrale (2%) et des leucocytes dont le nombre est normalement compris
entre 104 et 105/ml et ne doit pas excéder 1 million/ml (WHO 2010). Les leucocytes
du sperme sont essentiellement des polynucléaires neutrophiles (50-60% des
leucocytes séminaux), des macrophages (20-30%), et dans une moindre mesure des
lymphocytes T CD4+ et CD8+ (5%), ainsi que quelques lymphocytes B [Anderson,
2010 #5513;Bernard-Stoecklin, 2013 #5803] et comme montré dernièrement,
quelques cellules dendritiques [Duan, 2014 #5869].
53
Le volume de l’éjaculat est variable (entre 3 à 6 ml) et est constitué par le
mélange complexe des sécrétions provenant des testicules (1-2%), des épididymes
(2-4%), des vésicules séminales (65-75%), de la prostate (25-30%), ainsi que des
glandes bulbo-uréthrales (glandes de Cowper) et les glandes de Littré (<1%), au sein
desquelles baignent les spermatozoïdes et les autres cellules spermatiques (Figure
6) (Rolland et al. 2012).
L’éjaculat est fractionné en quatre phases. La première, nommée prééjaculatoire, provient des glandes de Cowper et de Littré qui jouent un rôle de
lubrification pour l'écoulement du sperme, c’est une petite fraction présentant très
peu
de
spermatozoïdes.
La
seconde,
la
fraction
préliminaire,
provient
essentiellement des épididymes et des canaux déférents, elle est riche en
spermatozoïdes et correspond à 30% du volume de l’éjaculat, elle contient des
enzymes qui permettront sa liquéfaction. La fraction principale est constituée par le
mélange des sécrétions de la prostate et des vésicules séminales. Ce mélange est
réalisé dans l'urètre, il est particulièrement impliqué dans la formation du coagulum
séminal, dans la modification de la mobilité des spermatozoïdes et dans
l'immunosuppression. La dernière fraction provenant principalement des vésicules
séminales est la plus volumineuse (65-75% de l’éjaculat), elle contient moins de
spermatozoïdes et est plus fluide.
2) pH et propriété tampon
Le sperme est le fluide biologique qui a les plus grandes propriétés de tampon.
Il maintient son pH entre 7,4 et 8,4 même dans l’environnement vaginal acide offrant
ainsi une protection aux spermatozoïdes. Des études ont montré que les propriétés
tampons du sperme étaient dues pour moitié aux composants de bas poids
moléculaires (citrate, pyruvate, phosphate inorganique), pour un quart aux protéines,
et pour un quart aux bicarbonates. La glycolyse et la production d’acide lactique
peuvent diminuer le pH du sperme [pour revue (Owen and Katz 2005)].
54
Vessie
Uretère
Vésicule séminale
Canaux déférents
Prostate
Glande de Cowper
Corps spongieux
Urètre
Corps caverneux
Epididyme
Canaux éfférents
Glande de Littré
Testicule
Gland
Fosse naviculaire
Figure 6 : Représentation schématique des différents constituants du
tractus génital mâle et de leur contribution à la composition du sperme.
55
3) L’osmolarité
Le sperme est caractérisé par une forte osmolarité, plus élevé que celle du
plasma sanguin. Son osmolarité dépend tout autant de sa concentration en glucide
et autres composants organique que de sa concentration en sels minéraux [pour
revue (Owen and Katz 2005)].
4) La viscosité
Les propriétés rhéologiques du sperme sont modifiées de façon drastique après
éjaculation. Très rapidement un coagulum gélatineux se forme puis se liquéfie. Les
facteurs de coagulation sont issus des vésicules séminales. Les composants
principaux du coagulum sont les séminogélines 1 et 2 (SEM1 et SEM2) très
abondantes dans le sperme (20mg/ml) et la fibronectine. Durant la liquéfaction, le
coagulum se transforme en un matériel fluide par le clivage protéolytique de sites
spécifiques des séminogélines. Les facteurs de la liquéfaction, PAP (Prostatic Acide
Phosphatase), PSA (Prostate Specific Antigen) sont issus de la prostate. La
liquéfaction intervient 5 minutes après éjaculation in vivo et 20 à 30 minutes après
éjaculation in vitro. Les changements de température dans le TGF lié au cycle
menstruel influencent le temps de liquéfaction, ainsi au moment de l’ovulation, la
température au sein du TGF augmente et la liquéfaction se fait plus rapidement [pour
revue (Owen and Katz 2005)] ; (Hunter et al.).
5) Les principaux composants du liquide séminal
Le fructose et le glucose, provenant des vésicules séminales, constituent des
sources énergiques importantes pour les spermatozoïdes. Leurs concentrations
(272mg/100ml en moyenne pour le fructose, 102mg/ml pour le glucose) varient de
façon importante en fonction de nombreux facteurs tels que l’âge du donneur. De
plus, elle n’est pas stable en raison de la glycolyse, source majeure d’acide lactique
dans le sperme. Le fructose est impliqué dans les complexes protéiques et la
formation du coagulum [pour revue (Owen and Katz 2005)]. Le citrate est l’un des
anions les plus importants présent dans le sperme humain (528mg/100ml). Il a une
forte affinité avec le calcium, dont il régule le taux dans le LS, le magnésium et le
zinc. Le calcium joue un rôle important dans la motilité des spermatozoïdes, leur
56
métabolisme, la réaction acrosomique et la fécondation. Les autres sels minéraux
importants sont le magnésium, le potassium, le sodium et le zinc. Les concentrations
de calcium, magnésium et zinc sont fortement corrélées. Le zinc et le magnésium
peuvent se lier à de nombreuses protéines du liquide séminal. Ces sels minéraux
peuvent former des complexes avec les autres composants du sperme et se lier à la
surface des spermatozoïdes [pour revue (Owen and Katz 2005)].
Plus de 2500 protéines ont été identifiées dans le sperme. Elles proviennent
majoritairement des vésicules séminales (séménogélines, lactoferrine, fibronectine,
protein C-inhibitor) et de la prostate (PSA, PAP, PSP-94). Leur concentration
moyenne est d’environ 50 mg/ml. D’autre part le sperme contient une forte
concentration d’acides aminés, plus élevée que dans le plasma sanguin. Celle-ci
s’accroit rapidement dans les heures suivant l’éjaculation en particulier la
concentration en acide glutamique (Rolland 2012, pour revue Owen 2005). Les
protéines présentes dans le LS sont des protéines de liaison ou bien elles sont
impliquées dans des activités catalytiques (hydrolases, glycosylases, glycosidases,
lipases), et dans de nombreux processus biologiques (métabolisme, régulation,
communication cellulaire, transport, etc.) (Figure 7). Le LS contient aussi de
l’albumine, composant majoritaire, des immunoglobulines, des molécules du
complément, des cytokines et chimiokines, qui sont impliquées dans la suppression
de la réponse immunitaire du TGF en plus des prostaglandines, des protéines à
activité antimicobiennes telles que les mucines produites par les glandes bulbouréthrales, etc. Les protéines basiques du sperme (putrescine, spermine, spermidine,
cadaverine) contrecarrent l’environnement acide vaginal acide [(Rolland et al. 2012),
pour revue (Owen and Katz 2005); (Rodriguez-Martinez et al. 2011)]. Deux autres
composants majeurs du liquide séminal sont l’acide lactique (62mg/100ml) et l’urée
(45mg/100ml) [pour revue (Owen and Katz 2005)]. Le sperme contient aussi des
prostasomes qui sont des vésicules lipidiques particulières sécrétées par la prostate
humaine. Les prostasomes semblent avoir un rôle bénéfique dans la mobilité des
spermatozoïdes et participerait à l'immunomodulation via leur fonction antioxydante
dans le sperme humain. Cette action s'exerce à la fois sur les polynucléaires
neutrophiles et sur les spermatozoïdes. Le mode d'action des prostasomes est
particulier puisqu'ils interviennent sur la production des dérivés actifs de l’oxygène,
57
Figure 7 : Distribution des protéines du liquide séminal en fonction de leur fonction
métabolique ou de processus biologiques dans lesquels elles sont impliquées.
D’après Batruch et al. 2011
58
en agissant notamment au niveau des membranes des polynucléaires
neutrophiles [pour revue (Aalberts et al.)].
b. Le sperme en tant que vecteur du VIH
Comme nous l’avons indiqué précédemment, le sperme est le principal vecteur
de dissémination du VIH dans le monde. Le VIH dans le sperme est présent sous la
forme de particules virales libres ou dans des leucocytes infectés, et il est excrété
selon les individus de façon continue ou intermittente [pour revue (Le Tortorec and
Dejucq-Rainsford 2010)]. La charge virale dans le sperme est en général inférieure à
celle du sang mais peut également ne pas être corrélée [pour revue (Le Tortorec and
Dejucq-Rainsford 2010)].
1) Origines du VIH dans le sperme
a. Différences sang/sperme
Plusieurs éléments indiquent que les souches virales et les cellules infectées
présentes dans le sperme ne proviennent pas uniquement du sang mais trouveraient
leur origine au moins en partie au sein du tractus génital mâle (TGM).
Bien qu’au cours de la phase aigüe d’infection, le sperme, très infectieux,
présente des taux élevés d’ARN viraux et d’ADN viraux dans les leucocytes infectés
dont les souches sont similaires à celles du sang, il n’en va pas de même durant la
phase chronique d’infection. En effet, des études phylogéniques réalisées pendant la
phase chronique, au cours de laquelle la charge virale et le taux de transmission sont
réduits, ont permis de mettre en évidence des différences génétiques entre les
souches de VIH dans le sang et dans le sperme indiquant une réplication virale
locale indépendante et des flux de virus restreints entre le sang et le sperme à la fois
en terme de virions et en terme de cellules infectées. De plus, les séquences d’ADN
et d’ARN dans les cellules infectées du sperme peuvent différer de celles des virions,
suggérant une origine différente des virions et des cellules infectées [pour revue
(Houzet et al. 2014)]. Suite à une analyse phylogénique du gène d’enveloppe dans le
sang et le sperme de patients, Anderson et al. ont proposé plusieurs mécanismes de
contamination du sperme par le VIH, non exclusifs et variables selon les individus et
au cours du temps: (i) un import direct de virus à partir du sang ; (ii) une amplification
clonale de souches virales sanguines au sein de cellules infectées infiltrant le tractus
59
génital mâle ; (iii) une réplication locale dans des cellules résidentes du tractus
génital mâle conduisant à une évolution virale distincte et caractérisant la
compartimentation (Anderson et al. 2010b).
Un relargage intermittent de VIH dans le sperme a été observé chez 25% à
44% des hommes asymptomatiques et est associé à une compartimentation (Bujan
et al. 2002). D’autre part, il a également été observé chez certains patients traités
avec une charge virale indétectable dans le sang, la persistance du virus dans le
sperme (virions et cellules infectées) jusqu’à plusieurs années après l’initiation du
traitement et ceci en l’absence d’IST ou d’inflammation locale. Une étude a mis en
évidence des souches virales séminales différentes de celles du sang chez des
patients traités (Sheth et al. 2009). De plus, aucune corrélation n’est établie avec un
taux de médicaments suboptimal dans le sperme ou avec une combinaison
médicamenteuse spécifique. A l’inverse, une corrélation a été observée avec la
charge virale avant l’initiation du traitement. Lorsque la charge virale est élevée avant
l’initiation du traitement, il y a potentiellement plus de cellules cibles infectées dans le
tractus génital mâle et une inflammation locale. Après initiation du traitement, la
réplication virale pourrait persister en raison d’une pénétration incomplète des
médicaments dans le TGM et/ou en raison de l’infection de cellules du TGM avec
une demi-vie longue [pour revue (Houzet et al. 2014)]. Notre équipe a ainsi
dernièrement mis en évidence la persistance de macrophages infectés dans l’urètre
de macaques traités par une polychimiothérapie antivirale (HAART) efficace
conduisant notamment à l’absence de détection de cellules infectées dans les autres
organes du TGM (Matusali et al., 2014 soumis).
b. Infection des organes du TGM par le VIH
Notre équipe a décrit l’infection de plusieurs organes qui contribuent à
l’élaboration du sperme, à la fois chez l’homme et chez le macaque (Roulet et al.
2006b; Le Tortorec et al. 2008a; Le Tortorec et al. 2008b; Deleage et al. 2011). Ainsi
des leucocytes infectés sont retrouvés au niveau du testicule, de l’épididyme, de la
prostate, des vésicules séminales et de l’urètre. L’ensemble de ces organes est donc
susceptible de participer à la contamination du sperme [pour revue (Le Tortorec and
Dejucq-Rainsford 2010; Houzet et al. 2014)]. Des études phylogénétiques visant à
comparer les souches séminales avec celles isolées des organes du TGM chez le
60
macaque sont en cours au laboratoire afin de déterminer la contribution de ces
organes au virus présent dans le sperme. Une inflammation de la prostate, de la
vésicule séminale et de l’épididyme, se traduisant par des infiltrats de cellules
immunitaires activées et/ou par des taux de cytokines augmentés a été mise en
évidence chez l’homme en phase SIDA et chez le macaque en phase
asymptomatique [pour revue (Houzet et al. 2014)]. Cette inflammation combinée à
l’infection est fortement susceptible de modifier la composition du sperme
(notamment celle du liquide séminal) chez les individus infectés.
2) Les paramètres du sperme chez les patients séropositifs
Des études ont montré que une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ dans
le sperme des hommes séropositif en comparaison avec les hommes séronégatif,
phénomène qui peut être inversé lors de la mise sous traitement (Politch et al. 2009).
Ces résultats sont confirmés par l’étude de Gianella et al. (Gianella et al. 2012). Ces
deux études se sont également intéressées aux nombres de LT CD8+ et leur
conclusions divergent. Politch et al. constatent une diminution des LT CD8+ alors
que Gianella et al. constatent leur augmentation. Dans les deux études, le taux
d’activation des LT CD4+ et LT CD8+ est plus élevé dans le sperme d’hommes
infectés (Politch et al. 2009; Gianella et al. 2012). Le volume du sperme, le nombre
de spermatozoïdes, leur mobilité et leur morphologie sont positivement corrélés au
nombre de cellules CD4+ dans le sang (Dulioust et al. 2002). Des recherches
rapportent des modifications des paramètres du sperme chez les patients
séropositifs, pour la majorité recevant un traitement antirétroviral [pour revue (Le
Tortorec and Dejucq-Rainsford 2010; Houzet et al. 2014)]. Ainsi, il a été décrit une
diminution de la mobilité des spermatozoïdes et du volume de l’éjaculat ainsi qu’une
augmentation du pH (Muller et al. 1998; Dulioust et al. 2002; Nicopoullos et al. 2004;
Bujan et al. 2007; La Sala et al. 2007). Afin de distinguer l’effet du traitement de celui
de l’infection, Van Leeuwen et al. ont effectué une étude longitudinale sur 34 patients
avant, pendant et après traitement. Il ressort que le traitement antirétroviral
(thymidine, ténofovir ou autre) diminue la mobilité des spermatozoïdes, mais n’a pas
d’effet sur les autres paramètres du sperme (van Leeuwen et al. 2008). Il n’a pas été
observé d’effet différentiel des INTI (Inhibiteur nucléosidique de la transcriptase
inverse) par rapport aux inhibiteurs de protéases sur les paramètres du sperme
61
(Lambert-Niclot et al. 2011), alors qu’une variation de la mobilité des spermatozoïdes
a été notée entre les différents INNTI (Inhibiteur non nucléosidique de la
transcriptase inverse) sur une cohorte de 144 patients. Les ADN mitochondriaux
(ADNmt) des PBMC et des spermatozoïdes ont fait l’objet d’études comparatives lors
du suivi des charges virales plasmatiques et séminales chez des patients sous
HAART. Deux études ont rapporté une diminution significative du nombre de copie
d’ADNmt chez les patients traités (White et al. 2001; Pavili et al. 2010). Or un
génome mitochondrial intact est nécessaire à la mobilité du sperme. A l’inverse, une
autre étude a rapporté une augmentation de l’ADNmt dans les spermatozoïdes de
sujets sous HAART (La Sala et al. 2007). Au cours de la spermiogenèse, le contenu
en ADNmt est normalement drastiquement réduit. Ce phénomène est en partie
responsable de l’absence de transmission de l’ADNmt paternel. La cause de
l’augmentation de l’ADN mitochondrial chez ces patients n’est pas explicitée mais
une telle augmentation a été précédemment décrite chez des patients infertiles (MayPanloup et al., 2003).
3) Rôle des virions et des cellules infectées du sperme dans la
transmission
La plupart des expériences in vitro, ex vivo et in vivo sur la transmission du VIH
et du SIV ont été réalisées avec du virus libre. Cependant il existe un nombre
croissant d’études décrivant un rôle des cellules infectées présentes dans les
sécrétions génitales dans la transmission par voie sexuelle du virus (pour revues,
Anderson AIDS 2010, Barreto-de-souza Am J Reprod Immunol 2014). Ainsi,
l’inoculation intra-vaginale (Salle et al. 2010) ou intra-rectale ((Kolodkin-Gal et al.
2013) de leucocytes infectés chez le macaque conduit à l’infection des animaux. La
transmission par des cellules infectées pourrait contourner plusieurs des barrières
qui défendent le TGF contre des agents pathogènes, tels que le mucus, le pH acide,
ou les peptides antimicrobiens qui se fixent aux particules virales, en assurant au
virus une protection à l’intérieur des cellules et une durée de vie supérieure aux
particules virales libres. De plus contrairement à la diffusion passive des virions, les
cellules infectées pourraient être attirées par chimiotactisme à travers l’épithélium. Il
est connu que la transmission du virus à une cellule non-infectée est beaucoup plus
efficace par des contacts avec une cellule infectée que par du virus libre. L’infection
62
des cellules cibles sous-muqueuses par contact avec des cellules infectées du
sperme, voire la migration de ces dernières jusqu’aux ganglions locaux, pourrait donc
être un mode de transmission particulièrement efficace et sur lequel les stratégies de
prévention par l’exposition locale à des antirétroviraux aurait peu de prise. Par
ailleurs, s’il semble établi que les spermatozoïdes ne sont pas infectés de façon
productive par le VIH, un rôle de ces cellules en tant que transporteurs du virus au
sein du TGF a été suggéré dans plusieurs études. En effet il a été montré que le VIH
peut se fixer à la surface des spermatozoïdes via des récepteurs alternatifs,
notamment l’héparan sulfate et le récepteur au mannose (Ceballos et al. 2009; Le
Tortorec and Dejucq-Rainsford 2010). En conclusion, outre la transmission par du
virus libre, il est important de considérer également ces autres modes d’infection
dans les stratégies de prévention.
c. Le rôle du liquide séminal dans la transmission du VIH
Le liquide séminal contient de nombreux facteurs bioactifs qui contribuent à
assurer sa fonction de milieu de transport des spermatozoïdes dans le TGF. Mais le
LS n’est pas qu’un simple vecteur pour le VIH-1, il contient aussi de nombreux
facteurs tels que des peptides cationiques, des molécules du complément, des
cytokines et chimiokines qui stimulent ou inhibent l’infection par le VIH-1 in vitro et
pourraient jouer un rôle dans la transmission in vivo [pour revue (Doncel et al. 2010;
Doncel et al. 2014).
1) Effets directs du LS sur le virus ou sur son interaction avec les
cellules cibles
a. Les facteurs inhibiteurs de l’infection par le VIH-1
L’activité redox du liquide séminal
L’oxydation des polyamines du LS par les oxydases diamine augmente dans
l’environnement vaginal par la présence de peroxydases. Cette oxydation produit des
radicaux libres qui vont inactiver le virus. Le virus, en particulier l’enveloppe est
sensible aux radicaux oxygénés qui vont altérer son infectivité (Klebanoff and Kazazi
1995; Stief 2003).
63
L’activité antivirale des polypeptides cationiques et des exosomes du sperme
Les polypeptides cationiques antimicrobiens, dont les modes d’actions ont été
abordés dans le chapitre précédant (II-b-5-c), tels que le SLPI, les défensives, la
lactoferrine, possèdent des propriétés antibactériennes, antifongiques et anti-VIH-1
(Cole 2003; Venkataraman et al. 2005). O’Connor a démontré in vitro que le LS a
une activité anti-VIH-1 et que celle-ci est toujours active à des concentrations entre
35 et 50 fois plus faible que la concentration cytotoxique (O'Connor et al. 1995). Plus
récemment, Martellini et al. ont montré que 52 peptides cationiques du LS, parmi
lesquels les séménogélines, la fibronectine, la PAP, la PSA, etc. présentaient une
activité anti-VIH-1 (Martellini et al. 2009). Ces auteurs ont également décrit un effet
globalement inhibiteur du LS après 24h d’exposition de lignées cellulaires (TZM-bl et
PM-1) à ce fluide et au VIH. Tout dernièrement une activité anti-VIH a été décrite
pour les exosomes présents dans le sperme : ces nano-vésicules (communément
appelées prostasomes) peuvent être internalisées par des lymphocytes ou des
lignées de cellules leucocytaires et induisent un blocage post-entrée de la réplication
du VIH prévenant l’intégration du génome viral au génome de la cellule hôte
(Madison et al. 2014).
L’inhibition de l’attachement du VIH-1 au récepteur cellulaire DC-SIGN
Une étude a mis en évidence qu’une courte exposition au LS (90 min) inhibait
significativement l’attachement du VIH à la lectine DC-SIGN des DCdifférenciés à
partir de monocytes sanguins) et diminuait ainsi la capture, et la transmission aux LT
CD4+ de souches X4 et R5 du VIH-1. Cette inhibition sans aucun lien avec un effet
cytotoxique n’est pas observée sur des cellules cibles n’exprimant pas DC-SIGN
(monocytes, PBMC activés et lignée cellulaire de LT). Des analyses de structure ont
permis de déterminer que le facteur responsable de l’inhibition de la capture par DCSIGN est un composé de haut poids moléculaire (plus de 100kDa), stable à la
chaleur et résistant à l’action de la trypsine (Sabatte et al. 2007). Stax et al. ont
confirmé dans une étude indépendante, les résultats précédents et ils ont identifié
dans le LS un ligand de DC-SIGN qui pourrait être en partie responsable de l’effet
inhibiteur observé : la mucine-6 (Stax et al. 2009). Par la suite, Sabatté et al. ont
complété leur étude et ils ont pu identifier la clusterine, fortement concentrée dans le
LS (0,4-15mg/ml) comme principal ligand de DC-SIGN et probablement responsable
64
en partie de l’inhibition de la capture du VIH-1 par DC-SIGN (Sabatte et al. 2011).
Cependant, une étude récente a décrit une augmentation de CD169 (Siglec-1) à la
surface de cellules dendritiques exposées au TGFβ, une cytokine présente dans le
LS à des concentrations élevées (De Saint Jean et al. 2014). Cette sur-expression de
CD69 induit une augmentation de l’attachement du VIH à la surface des DC. Le
récepteur CD169 ayant été précedemment décrit comme jouant un rôle majeur dans
l’attachement du virus aux DC, le LS pourrait en fait avoir un rôle stimulateur de
l’infection à ce niveau. De plus, deux études ont montré que bien que CD169 soit
moins exprimé que DC-SIGN à la surface des DC, la capture du VIH par les DC
mature se ferait préférentiellement par CD169 (Izquierdo-Useros et al. 2012; Puryear
et al. 2013). En outre, la composition en glanglioside GM3 (variable en fonction du
type cellulaire dans lequel les virions ont été produits) de l’enveloppe virale est
corrélée à la capacité des virions à lier CD169 [pour revue (Gummuluru et al. 2014)].
L’opsonisation du VIH-1 par des anticorps neutralisants
Des anticorps neutralisants, majoritairement des IgG et des IgA, ont pu être mis
en évidence dans le sperme d’hommes infectés. L’opsonisation du VIH-1 par ces
anticorps a un rôle protecteur face à l’infection par le VIH-1 soit par exclusion
immune soit par ADCC mais l’opsonisation peut aussi faciliter l’infection en favorisant
le contact avec les cellules cibles exprimant les récepteurs Fc (macrophages, DC)
(Soderlund et al. 2004; Mestecky et al. 2011).
Sous régulation du récepteur CD4 à la surface des LT CD4+ par le LS
Les résultats obtenus par Balandya et al. ont indiquent un effet inhibiteur du LS
sur l’infection de lymphocytes T CD4+ in vitro dans le cas d’une exposition prolongée
supérieure à 24h. Ces auteurs montrent que le LS inhibe l’expression du récepteur
CD4 à la surface des LT ainsi que l’activation et la prolifération des LT CD4+.
Parallèlement, leurs résultats indiquent que le LS induit la surexpression de CCR5 à
la surface des LT, ce qui favorise l’infection in vitro des souches R5 par rapport aux
souches X4 (Balandya et al. 2010).
65
b. Les facteurs stimulateurs de l’infection par le VIH-1
La neutralisation du pH vaginal acide
L’infectivité du VIH-1 est stable à un pH compris entre 5 et 8 mais elle est
réduite de 25% à un pH de 4,5 (O'Connor et al. 1995). Le pH du LS est compris entre
7,4 et 8,4 et de par ses propriétés tampon, il permet de ramener le pH vaginal acide
à un pH neutre en 30 secondes et de maintenir ce pH neutre voire basique pendant
2 heures (Fox et al. 1973), (Wolters-Everhardt et al. 1986). Les particules de VIH-1
libre et les leucocytes infectés sont sensibles au pH acide et sont donc susceptibles
d’être inactivés par l’acidité vaginale. L’action tampon du LS peut protéger les virions
et les cellules infectées et favoriser l’infection par le VIH-1 (Bouvet et al. 1997).
Les fibrilles amyloïdes
Des composants du sperme formant des fibrilles amyloïdes capables de
stimuler l’infection par le VIH-1 sur différentes lignées cellulaires (TZM-bl, CEMx-M7)
ou des cultures de cellules primaires (PBMC), avec de faibles doses virales (dilution
au 1/100 du stock viral) et de faibles concentration de fibrilles ou de sperme (1%)
pour des temps d’infection court (3h) , ont été identifiés par Munch et al. et Roan et
al. (Munch et al. 2007; Roan et al. 2009; Kim et al. 2010; Roan et al. 2011; French et
al.). Ces fibrilles se forment à partir de fragments de la PAP qui génèrent le peptide
SEVI (Semen-derivated Enhancer of Viral Infection) ou de fragments des
séménogélines 1 et 2 (SEM 1 et SEM 2) qui génèrent plusieurs peptides stimulateurs
de l’infection in vitro. La PAP et les séménogélines sont des constituants majeurs du
coagulum présents dans le sperme à des concentrations de l’ordre de plusieurs
mg/ml. Les monomères de SEVI et les fragments de séménogélines (SEMs)
possèdent des propriétés biochimiques proches et s’assemblent spontanément en
fibrilles amyloïdes qui peuvent être révélées par un marquage à la Thioflavine T ou
au rouge congo ou par microscope électronique. Ils sont composés de nombreux
résidus basiques et sont donc chargés très positivement. Ces fibrilles favorisent
l’infection par le VIH-1 en diminuant la répulsion électrostatique entre les membranes
chargées négativement du virus et de la cellule cible (Munch et al. 2007; Roan et al.
2009; Kim et al. 2010; Roan et al. 2011; French et al.). Lorsque leurs charges sont
neutralisées par des polymères anioniques, SEVI et les fibrilles de SEM perdent leur
66
capacité à stimuler l’infection par le VIH des cellules cibles et le sperme traité avec
ces mêmes polymères anioniques perd également son activité stimulatrice sur
l’infection par le VIH-1 (Roan et al. 2009; Olsen et al.). De par leur mode d’action, les
fibrilles amyloïdes stimulent l’infection à la fois des souches de VIH-1 R5 mais aussi
des souches X4. D’autre part, la stimulation du pouvoir infectieux du VIH-1 conféré
par SEVI et les SEMs est plus marquée lorsque l’inoculum viral est limité, situation
qui est postulée survenir lors de la transmission du VIH-1. L’activité stimulatrice de
SEVI et des SEMs est donneur dépendante et l’abondance de SEVI et des SEMs
dans le sperme des donneurs séronégatifs corrèle avec la capacité relative des
échantillons de sperme à augmenter l’infection par le VIH (Munch et al. 2007; Kim et
al. 2010; Roan et al. 2011; Roan et al. 2014a; Roan et al. 2014b). De plus, les
échantillons de sperme provenant de patients présentant une obstruction du canal
éjaculateur sont moins riches en SEVI et en fibrilles de SEM et sont dépourvu de la
capacité à stimuler l’infection par le VIH in vitro (Roan et al. 2011). Récemment,
Roan et al. ont montré que bien que la fibronectine ne possède pas d’activité
stimulatrice sur l’infection par le VIH-1, elle participe à la formation des fibrilles
amyloïdes et favorise l’activité stimulatrice de ces dernières (Roan et al. 2014a).
Toutefois, il n’a pas pu être mis en évidence un rôle majeur de SEVI dans l’infection
in vivo de 18 macaques Rhesus répartis en 6 groupes exposés à des doses
croissante de virus en présence ou en absence de SEVI par la voie intravaginale
Néanmoins, l’exposition aux fibrilles amyloïdes SEVI semble favoriser l’infection par
de faibles doses de virus (Munch et al. 2013).
L’opsonisation par les molécules du complément
Le LS contient des molécules du complément qui peuvent être activées par les
souches du VIH-1 R5 et X4. Cette activation génère des fragments clivés C3 qui
peuvent opsoniser le VIH-1 et favoriser l’infection des cellules cibles (LT CD4+,
macrophages). En effet, des récepteurs des compléments sont exprimés à la surface
apicale des cellules épithéliales, des DC et des macrophages ce qui favorise le
contact entre les cellules cibles et le virus opsonisé (Bouhlal et al. 2002).
67
2) Effets indirects du LS sur les tissus portes d’entrée du VIH
a. Effet immunorégulateur du LS d’hommes non infectés
Chez les hommes non-infectés, le LS contient de nombreux facteurs
immunorégulateurs (Politch et al. 2007; Robertson et al. 2009; Anderson et al.
2010b; Lisco et al. 2012) importants pour la reproduction humaine, en particulier le
TGFβ
et
la
PGE2.
Ces
deux
facteurs
jouent
principalement
un
rôle
immunosuppresseur afin de préparer le TGF à la conception. Ils agissent sur les
neutrophiles, les cellules NK, les macrophages et les DC et sont en forte
concentration dans le sperme. Le LS contient plus de TGFβ que n’importe quel autre
fluide corporel. La majorité du TGFβ présent dans le LS est issu de la prostate et
synthétisé sous forme latente (80ng/ml). Il est activé (1ng/ml) par les plasmines et
autres enzymes des sécrétions vaginales (Robertson et al. 2002; Robertson et al.
2009). Le TGFβ va induire la différenciation et l’expansion des LT régulateurs (Treg)
et donc la tolérance du système immunitaire face aux antigènes (Robertson et al.
2002; Robertson et al. 2013). D’autre part, il semble que le TGFβ puisse induire une
altération de l’intégrité de l’épithélium pour favoriser l’implantation embryonnaire.
L’exposition de la muqueuse au TGFβ modifie la distribution de l’occludine et de la
claudin-7, protéines impliquées dans les jonctions serrées, ce qui pourrait faciliter le
passage de la barrière épithéliale par le VIH (Rametse et al. 2013).
Les prostaglandines, en particulier PGE2, constituent des composants
importants du LS capables de moduler la réponse immunitaire. La sécrétion de
PGE2 dans le LS, bien que variable d’un individu à l’autre, est élevée (100µg/ml)
(Harizi and Gualde 2005). PGE2 et plus globalement les prostaglandines exercent un
rôle immunorégulateur dans le TGF en inhibant l’expansion clonale des cellules NK
et des LT, en inhibant leur capacité cytotoxique et en polarisant les CD4+T vers le
phénotype Th2. De plus, les prostaglandines induisent la tolérance immune en
provoquant un changement de production de cytokine de l’IL-12 vers l’IL-10 par les
DC [(Kelly and Critchley 1997; Harizi and Gualde 2005), pour revue (Kalinski)]. Les
propriétés immunosuppressive des PGE et de l’IL-10 sont importantes pour la survie
des spermatozoïdes mais elles sont délétères dans le contexte des IST puisqu’elles
modifient
la
réponse
du
système
immunitaire
(Remes
Lenicov
et
al.).
Paradoxalement, des études suggèrent que les PGE2 contenu dans le LS induiraient
68
l’expression de COX-2 dans les cellules endocervicales et vaginales, ce qui
entrainerait une inflammation locale et le recrutement de cellules cibles sur le site de
l’inflammation (Sales et al. 2002; Muller et al. 2006).
En plus de ces deux facteurs immunomodulateurs, le LS d’hommes non
infectés contient de nombreuses cytokines. Les résultats de dosage des cytokines
dans les LS et dans le sang d’hommes non infectés réalisés par Olivier et al.
permettent de distinguer 5 cytokines dont les concentrations dans le LS sont 5 fois
plus élevées que dans le sang : MCP-1, IL-8, GM-CSF, IL-7, IL15 et la fractalkine.
Ces cytokines sont impliquées dans le recrutement, la maturation et la prolifération
des monocytes/macrophages, des LT, LB, DC et cellules NK (Olivier et al. 2013).
En utilisant des cellules épithéliales d’exocol in vitro et des biopsies prélevées
in vivo après exposition au LS, Sharkey et al. ont montré que le LS induisait la
production de nombreuses cytokines et chimiokines (IL-8, IL-6, CCL20, GM-CSF,
MCP-1, IL-1α, IL1β, Groα, MIP-2α, MIP-2β), vraisemblablement induites en partie par
le TGFβ. Il en résulte l’infiltration de neutrophiles, de macrophages et de LT au
niveau du col de l’utérus (Sharkey et al. 2007; Sharkey et al. 2012a; Sharkey et al.
2012b).
Berlier et al. ont également montré que le LS induisait la production de CCL20
un facteur chimioattractant majeur impliqué dans le recrutement et la maturation des
cellules de Langerhans et des DC ainsi que des LT intraépithéliaux considérés
comme les principales cibles dans les muqueuses (Berlier et al. 2006a; Cremel et al.
2006). Des études récentes ont montré que la sécrétion de CCL20 par les cellules de
l’épithélium endocervical pourrait être induite par la lactoferrine présente dans le LS
(Lourenco et al.).
Ces changements immuns dans la muqueuse exposée pourraient faciliter
l’infection VIH-1 soit en induisant une immunotolérance via PGE2 et TGFβ soit en
augmentant le nombre potentiel de cellules cibles dans la muqueuse en l’absence de
contexte inflammatoire. De plus, la sécrétion de molécules chimiotactiques en
réponse au LS favorise la transmigration des leucocytes infectés du sperme et donc
augmente le risque de transmission du VIH-1. Ainsi une étude ex vivo a montré que
l’IL-8 pouvait faciliter l’infection de tissus cervicaux par du VIH-1 (Narimatsu et al.
69
2005) et une autre que l’IL-7 facilitait la transmission et la dissémination du VIH-1
dans des tissus cervico-vaginaux en inhibant l’apoptose et en favorisant la
prolifération des LT CD4+ (Introini et al.).
b. Les facteurs immuno-modulateurs dans le LS d’hommes
infectés
Plusieurs études sur les cytokines et chimiokines du LS ont montré que le
sperme d’hommes non infectés et celui d’hommes infectés étaient enrichis en IL-1α,
IL-7, IL-8, MIP-3α, MCP-1, MIG, IP-10, SDFβ1 et TGFβ par rapport aux
concentrations sanguines (Maegawa et al. 2002; Politch et al. 2007; Anderson et al.
2010b; Lisco et al. 2012). La surexpression de facteurs proinflammatoires
spécifiques dans le LS d’hommes infectés par le VIH-1 par rapport au LS d’hommes
non-infectés a été montrée dans de nombreuses études (Anderson et al. 2010b;
Lisco et al. 2011; Lisco et al. 2012). En outre, il a été montré que cette surexpression
de cytokines/chimiokines proinflammatoires dans le LS d’hommes infectés modifie le
« réseau de cytokines » et peut altérer la capacité du système immunitaire à
répondre à l’infection par le VIH-1 (Lisco et al. 2012; Olivier et al. 2013). Lisco et al.
ont montré que cette modification du réseau cytokinique dans les LS d’hommes
séropositifs se traduisait par le renforcement des corrélations déjà existantes entre
les cytokines dans les LS d’hommes séronégatifs et par l’apparition de nouvelles
corrélations (Lisco et al. 2012). Au contraire, Olivier et al. ont mis en évidence une
diminution du nombre de corrélation entre cytokines dans les LS d’hommes infectés
en comparaison avec les LS d’hommes non infectés, suggérant ainsi une forte
perturbation de la régulation des cytokines en présence d’une infection par le VIH-1
(Olivier et al. 2013). De plus, il a été montré que les concentrations en cytokines et
chimiokines pro-inflammatoires des LS d’hommes infectés en phase aigüe étaient
plus élevés que ceux d’hommes infectés en stade chronique ou d’hommes non
infectés (Kafka et al. 2012). Une corrélation entre les taux de cytokines proinflammatoires et la charge virale dans le sperme a été rapportée dans plusieurs
études. Ainsi une corrélation positive avec la charge virale séminale a été décrite
pour le taux d’IL-1β par Berlier et al. (Berlier et al. 2006a), pour le taux de RANTES
par Storey et al. (Storey et al. 1999), pour le taux d’IL-6, d’IL-8, d’IL-12 et IFNγ par
Sheth et al. (Sheth et al. 2005), et avec l’IFNγ et l’IL-17 par Hoffman et al. Ces
70
derniers ont également mis en évidence une corrélation négative entre la charge
virale séminale et la concentration d’IL-5 (Hoffman et al. 2014).
Enfin, Kafka et al., ont montré que le taux de TGFβ1 dans le sperme dépend du
stade d’infection et conduit à des réponses différentes des cellules épithéliales du
TGF. La surexpression de TGFβ dans le sperme d’hommes en phase aigue de
l’infection par rapport au sperme d’hommes non infectés est modérée alors qu’elle
est forte en phase chronique. Ainsi en phase aigüe de l’infection, la concentration de
TGFβ ne serait pas suffisante pour contrecarrer les fortes concentrations de
cytokines proinflammatoires du LS. Il en résulterait une augmentation de la
production de la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules du TGF
(expérimentation sur lignée cellulaire). Au contraire chez les individus en phase
chronique d’infection, le taux de TGFβ, beaucoup plus élevé, induit la suppression de
la production des cytokines pro-inflammatoires (Kafka et al. 2012).
3) Effet du liquide séminal sur la transmission du virus in vivo
Le rôle du liquide séminal dans la transmission a été très peu étudié dans les
modèles expérimentaux de la transmission du VIH. Une tendance à favoriser la
transmission a été observée lorsque de faibles doses de virus libre ont été mixées
avec du liquide séminal avant l’inoculation intravaginale de macaques (Miller et al.
1989; Le Grand et al. 1995).
4) Rôle modulateur des cellules du sperme ?
D’autres composants du sperme que le LS, tels que les spermatozoïdes,
pourraient aussi jouer un rôle modulateur indirect de la transmission. Ainsi il a été
montré que les spermatozoïdes induisent la maturation des cellules dendritiques
(Ceballos et al. 2009) et que les PMN (leucocytes polymorphonucléaire) était associé
à des taux élevés de virions et de cellules infectées ainsi qu’à une augmentation de
cytokines proinflammatoires favorisant le recrutement des cellules cibles et la
réplication du VIH (Joseph 2014).
En conclusion, de nombreux éléments laissent à penser que le sperme est plus
qu’un simple vecteur pour le VIH et que son rôle, vraisemblablement très complexe,
71
variable au cours du temps et selon les types cellulaires, nécessite d’être intégré
pour une meilleure compréhension des évènements de transmission.
IV.
TRAITEMENT ET STRATEGIES DE PREVENTIONS CONTRE
LE VIH-1
a. Les traitements antirétroviraux (ARV)
Les molécules développées ont pour but d'agir sur les différentes étapes de
l'infection virale : l’attachement à la cellule hôte, le mécanisme de fusion, la
transcription inverse du génome viral d’ARN en ADN, son intégration dans le génome
de la cellule hôte, la maturation des protéines virales. Six groupes d’agents
antirétroviraux ont été développés : les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase
inverse (INTI), des inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI)
et des inhibiteurs de la protéase (IP), les inhibiteurs de fusion, les inhibiteurs du
récepteur CCR5 et les inhibiteurs d’intégrase.
Les INTI entre en compétition avec les nucléosides naturels et empêchent
l’élongation de la chaîne d’ADN. Ils constituent la 1ère classe d’ARV mis sur le
marché avec la commercialisation de la Zidovudine (AZT) dès 1987 (Dournon et al.
1988). Pendant les 20 dernières années, 7INTI ont été introduits comme traitement.
Trois INNTI ont été introduits comme traitement sur le marché (Nevirapine,
Delavirine, et Efavirenz). Ils agissent sur la Transcriptase Inverse comme antagoniste
non compétitifs en se liant à une région hydrophobe adjacente du site catalytique de
la transcriptase inverse (Spence et al. 1995).
Les IP (Indinavir, le Ritonavir, le Nelfinavir) inhibent l’activité protéolytique de la
protéase en s’attachant à son site actif de sorte que les virus nouvellement produits
sont défectueux et incapables d’infecter de nouvelles cellules (Boden and Markowitz
1998).
Les inhibiteurs d’intégrase (Raltégravir) bloquent l’intégration de l’ADN proviral
au génome des cellules infectées. Ils sont souvent utilisés lors de l’apparition de
résistance aux antirétroviraux cités précédemment (Steigbigel et al. 2008).
72
L’enfuvirtide (peptide T20) est un inhibiteur compétitif de l’intégration du
génome viral dans le cytoplasme de la cellule cible. Il se lie à la Gp41 du VIH-1 et
inhibe la fusion.
Deux molécules (Maraviroc et Vicriviroc) sont utilisées pour inhiber de manière
non compétitive la fixation du VIH via la Gp120 sur le co-récepteur CCR5. Les
patients ayant des souches de types X4 sont écartés de cette thérapeutique et
l’utilisation de ces molécules peut potentiellement bloquer les fonctions de CCR5.
De nos jours le traitement antirétroviral contre le VIH se fait en utilisant
plusieurs molécules ayant des spectres d’action différents afin de viser plus large et
d’éviter ainsi les phénomènes de résistance. La multithérapie antirétrovirale
hautement active (HAART en anglais) est le terme utilisé pour décrire le traitement
anti-VIH standard actuel. La
multithérapie
antirétrovirale
consiste
en
une
combinaison d'au moins trois médicaments antirétroviraux.
b. Développement de vaccins
Différentes approches sont utilisées dans le développement d’un vaccin pour
prévenir l’infection par le VIH-1. Ces approches incluent l’utilisation :
- de virus complètement inactivés,
- de virus atténués (délétion de Nef),
-
de vaccin de sous-unités : Gp120, Gp160,
- de protéines virales dans des vecteurs vivant (virus de la polio,
adénovirus, bactéries)
- de noyaux viraux avec des protéines de l’enveloppe : pseudovirions,
- de séquences dérivées de peptide du VIH (epitope V3)
- d’anticorps neutralisant anti-idiotypes
- de protéines dérivées de plantes.
Le vaccin idéal serait caractérisé par son innocuité et donnerait lieu à une
protection à long terme contre toutes les souches. Il devrait induire une immunité
locale avec des réponses immunitaires humorales et cellulaires de type inné et
adaptatif, comme produire des anticorps neutralisants (Levy et al. 2004).
73
Plusieurs vaccins sont en cours d’essai clinique de phase I (ex. : ADVAX,
MRkAd5, MVA) (Goepfert and Bansal 2014). Quelques vaccins sont en cours d’essai
clinique de phase II (ANRS VRI 01, ALVAC, Vacc-4x) (Frey et al. 2014; Pollard et al.
2014). Leur efficacité reste à déterminer et les recherches pour le développement
d’un vaccin continuent sans succès à ce jour.
c. Les stratégies de prévention
Deux nouvelles stratégies de prévention utilisant des anti-rétroviraux ont fait
l’objet de nombreuses études ces dernières années : le TasP (treatment as
prevention) et la PrEP (pre-exposure prophylaxie).
1) Le TasP
Le TasP consiste à proposer un traitement antirétroviral précoce aux personnes
séropositives pour réduire leur charge virale et ainsi la probabilité qu’elles
transmettent le virus. En effet, il a été montré que plus la charge virale est élevée et
plus le risque de transmission est fort (Quinn et al. 2000 ; Gray et al. 2001; Cohen et
al. 2011). Huit études ont comparé le risque de transmission du VIH au sein de
couples sérodifférents en fonction du statut ARV du partenaire séropositif [pour revue
(Gupta and Nutan 2013; Young and McDaid 2014). Une étude clinique (HPTN 052)
incluant 1763 couples sérodiscordants a montré que le traitement ARV précoce du
partenaire séropositif permettait la réduction de 96 % du risque de transmission du
VIH (Cohen et al. 2011). De plus, les premiers résultats de l’étude Partner présentés
à la CROI 2014 (Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections), montrent
que sur les 900 couples sérodifférents de l’étude (586 couples hétérosexuels et 308
couples homosexuels, suivis sur un an) le nombre d’infection estimé en l’absence de
traitement était de 15 pour les couples hétérosexuels et de 86 pour les couples
homosexuels. Or aucune transmission au sein des couples de la cohorte n’a été
observée tendant à confirmer que le traitement est un outil de prévention efficace.
L’effet du traitement sur la transmission chez les couples homosexuels est à
confirmer avec un effectif plus important et un suivi plus long.
74
2) La PreP
La stratégie PreP consiste en l’utilisation préventive d’ARV chez des individus
séronégatifs exposés fréquemment au VIH afin de réduire le risque de
contamination. Plusieurs essais cliniques récents ont confirmé l’intérêt de l’utilisation
des ARV comme outils préventifs permettant de réduire le risque d’infection lors de
rapports hétérosexuels ou homosexuels. En 2010, l’essai iPrEX a montré une
réduction de 44 % de l’incidence du VIH suite à la prise de Truvada (ténofovir +
emtricitabine) sous forme orale (Grant et al. 2010). Deux autres études ont renforcé
ces résultats en montrant que la prise quotidienne de Truvada ou de TDF sous forme
orale réduisait le risque de contracter le VIH chez les personnes hétérosexuelles : (i)
essai TDF-2 : réduction du risque d’infection de 62 % (Thigpen et al. 2012) ; (ii) essai
Partners PrEP (Baeten et al. 2012) : réduction de 67 % sous TDF et de 75% sous
Truvada). Deux essais ont été interrompu par manque d’efficacité, l’essai FEM-PrEP
Sterne 2009) et VOICE (Marrazzo) [pour revue (Gupta and Nutan 2013; Young and
McDaid 2014)].
Très récemment, les résultats intermédiaires de l’étude PROUD, menée au
Royaume-Uni chez des homosexuels, ont révélé que le prise quotidienne de Truvada
comme traitement prophylactique était « hautement protectrice contre le HIV ». En
réaction à cette annonce un bilan anticipé de l’essai ANRS IPERGAY a été réalisé.
Cet essai conduit chez les HSH (hommes ayant des rapports avec des hommes)
très exposés au VIH, ce distingue des autres essais par la prise d’un traitement
prophylactique occasionnellement au moment de l’exposition aux risques. Il a été
constaté une différence d’incidence significative entre le groupe traité et le groupe
placébo avec une réduction très importante du risque d’infection par le VIH, bien
supérieure à celle observées dans l’essai IPREX (communiqué de presse ANRS
octobre 2014).
3) Les microbicides
Les microbicides sont des agents biologiques ou chimiques formulés sous
différentes formes (gels, crèmes, films, suspension, suppositoires, tablettes) pouvant
être appliqués au niveau rectal ou vaginal dans l’intention de réduire la transmission
du VIH.
75
Le microbicide idéal doit être actif contre la transmission par du virus libre et
contre la transmission cellule-cellule. Il doit être non irritant, ne pas perturber
l’épithélium de la muqueuse, ni la flore microbienne, ni le pH du mucus. Il ne doit pas
être altéré par les enzymes protéolytiques présentes dans le mucus. Il doit avoir une
capacité à diffuser et une bioadhésion adéquate. Son temps de rétention doit être
suffisant pour agir contre les maladies sexuellement transmissibles pendant et après
la relation sexuelle. Il doit être bien accepté par les utilisateurs, être peu onéreux et
compatibles avec les préservatifs masculins (Maartens et al. 2014; McConville et al.).
Les microbicides sous forme de gel ou de crème présentent différents
mécanismes d’actions (McConville et al.) :
- Destruction du virus,
- Maintien de la flore vaginal et du pH : action protectrice,
- Inhibition de l’interaction Gp120-CD4,
- Inhibition de la réplication,
- Action de barrière physique et inhibition du contact entre le VIH et la
muqueuse,
- Action contre les autres IST qui augmentent les risques d’infection par
le VIH.
Plus de 30 microbicides vaginaux ont été développés dans des études in vitro
mais seul quelques-uns ont pu être testés en phase clinique. Pour les essais
cliniques, un gel placébo a été développé : l’HEC (HydroxyEthylCellulose pH4,5)
(Pozzetto et al.).
Les résultats de l’essai CAPRISA 004 ont montré pour la 1ère fois que les
femmes utilisant un gel vaginal à 1% de Ténofovir (appliqué 12h avant puis 12h
après le rapport) présentaient une réduction du risque d’infection par le VIH de 39%
par rapport au placebo, un chiffre qui monte à 54% chez les femmes adhérentes à
80% (Abdool Karim et al. 2010).
76
L’essai VOICE qui comportait 5 bras correspond à une prise quotidienne par
voie orale de Ténofovir, de Truvada ou d’un placébo ou d’un gel vaginal à 1% de
Ténofovir ou du placebo. Il a été mis fin au bras Ténofovir par voie orale et Ténofovir
en gel prématurément par manque d’efficacité.
Une étude clinique de phase III (FACTS 001) est en cours en Afrique du Sud et
reprend les conditions de l’étude CAPRISA 004 (1% ténofovir). Les résultats sont
attendus pour 2015. Deux autres études de phase III (CAPRISA 008 et CAPRISA
009) reprennent les participants de l’étude CAPRISA 004 et devraient permettre de
tester le développement de résistance au Ténofovir et de définir le traitement optimal
pour les femmes infectées malgré l’utilisation du microbicide (D'Cruz and Uckun
2014; McConville et al. 2014).
Concernant les microbicides rectaux, là encore de nombreuses études in vitro
ont été réalisés mais seuls 6 essais cliniques de phase I ont été réalisés ou sont en
cours. L’étude RMP-01 (Rectal Microbicide Program) incluant 36 personnes
séronégatives et comparant un gel avec 2 concentrations d’un INNTI extrêmement
hydrophobe, l’UC781, à un placébo, avait révélé une bonne acceptation du
traitement ainsi que son innocuité et sa capacité à inhiber l’infection VIH-1. Suite à
l’arrêt du programme par la FDA, l’étude clinique de phase II n’a pas été mise en
place. L’essai RMP-02/MTN-006 s’intéressait à un gel 1% Ténofovir dont la
formulation était issue d’un gel vaginal. Des effets secondaires ont été constatés et
une nouvelle formulation a été élaborée et testée dans l’essai MTN-007. Cet essai a
montré l’innocuité du traitement et une bonne tolérance du gel. Une étude clinique de
phase II est en cours (MTN-017). Deux autres études de phase I sont en cours
Project Gel (1% Ténofovir) et CHARM Program (1% Ténofovir + Maraviroc)
(McGowan 2014; Nunes et al. 2014).
Malgré les nombreuses études entreprises, et les effets inhibiteurs prometteurs
des tests in vitro, l’efficacité des microbicides lors d’essais de phase III reste à
démontrer. Une grande majorité de ces études se focalisent sur l’efficacité et
l’absence de toxicité des microbicides ainsi que l’adhérence aux traitements, mais
peu d’entre elles s’intéressent à l’impact d’autres facteurs tels que les co-infections,
la diversité des sous-types de virus, les protéines et peptides des fluides génitaux sur
l’efficacité des microbicides. Or une réduction de l’efficacité de certains microbicides
77
polyanioniques en présence de sperme a été mise en évidence in vitro (Neurath et
al. 2006; Patel et al. 2007; Buffa et al. 2009).
En dehors de ces stratégies de prévention, il a été montré que la circoncision
réduisait de façon efficace la transmission du VIH de la femme à l’homme de près de
60 % (Rosario et al. 2013; Jayathunge et al. 2014).
Dans ce contexte, il est primordial d’étudier l’ensemble des mécanismes
conduisant à la transmission sexuelle du virus et en particulier les facteurs du
sperme susceptibles de moduler cette transmission.
78
OBJECTIFS
Le sperme est le vecteur principal de dissémination du VIH. Des travaux
récents indiquent la présence de facteurs dans le liquide séminal des hommes non
infectés susceptibles de modifer la transmission du VIH, soit par un effet direct sur le
virus, soit par un effet sur les cellules cibles ou environnantes. Nous avons ici voulu
étudier le rôle modulateur du liquide séminal et de ses composants dans le cas d’une
transmission via des brèches dans la barrière épithéliale, mettant en contact direct le
sperme et le virus qu’il contient avec les cellules cibles présentes en sous-muqueux.
Pour cela, des modèles cellulaires et tissulaires ont été développés. Par ailleurs,
sachant que la composition du LS des hommes VIH+ est probablement modifée par
rapport à celle d’hommes non-infectés, nous avons comparé l’effet du LS d’hommes
infectés et non-infectés dans nos modèles cellulaires. Mes travaux de thèse se sont
ainsi articulés autour de 3 axes :
1- Effet du sperme d’hommes infectés par le VIH-1 sur l’infection des
cellules T CD4+ : differences avec le sperme d’hommes non infectés
Le liquide séminal humain contient des facteurs protéiques qui pourraient
influencer la transmission sexuelle du VIH-1. Plusieurs études ont montré un effet
global du liquide séminal sur l'infectivité du VIH-1 in vitro dans des lignées cellulaires,
des lymphoctytes T CD4+ ou des DC. Cependant, des effets contradictoires, tantôt
stimulateurs tantôt inhibiteurs, ont été décrits, notamment sur les lymphocytes T C4+.
De plus la vaste majorité des expériences décrites dans la littérature concernant le
rôle du LS dans la transmission sexuelle ont été réalisées à partir de spermes
d’hommes sains. Après la mise au point des conditions expérimentales, notre but a
donc été de vérifier l’hypothèse d’un effet différentiel du LS d’hommes infectés
versus non infectés sur l’infection par le VIH.
2- Effet du liquide séminal sur l’infection d’explants cervicaux et colorectaux
Les effets du LS d’hommes séronégatifs ont été décrits exclusivement dans des
modèles de cellules isolées (TZM, PBMC ou lignées de cellules T CD4+, cellules
épithéliales, cellules dendritiques). A notre connaissance, l’effet du LS n’a jamais été
79
étudié dans un modèle plus intégré de la muqueuse du receveur, c'est-à-dire
comprenant l’ensemble des types cellulaires et permettant leurs interactions, tels que
les modèles d’explants tissulaires. Or un effet du LS a été décrit sur différents types
cellulaires, cibles du virus comme les lymphocytes T CD4+ et les DC,ou non, comme
les cellules épithéliales. Dans ce contexte, il nous a paru important d’étudier l’effet du
LS sur les tissus qui sont en contact avec le sperme in vivo, à savoir les tissus
cervico-vaginaux et colo-rectaux.
3- Fractionnement du liquide séminal et identification des facteurs à
activité biologique sur l’infection par le VIH-1
Les études réalisées à ce jour indiquent que le liquide séminal, qui est un fluide
extrêmement riche en protéines, a des actions multiples, qui peuvent selon les
modèles cellulaires et les protocoles, soit favoriser soit inhiber l’infection par le VIH.
Nos propres résultats suggèrent que que l’effet global du LS dans des modèles
complexes (tissus, PBMC) correspond à la somme d’effets inhibiteurs et stimulateurs
de différents facteurs. Afin d’identifier les protéines/peptides avec une activité
biologique, nous avons fractionné par HPLC successives le LS permettant ainsi de le
décomplexifier et d’identifier des facteurs biologiquement actifs en spectrométrie de
masse.
80
Matériels et Méthodes
81
MATERIELS ET METHODES
PROVENANCE DU MATERIEL BIOLOGIQUE :
SPERME
Les échantillons de sperme utilisés dans les expériences du chapitre I sont
obtenus auprès du CECOS de Toulouse (collaboration avec le Pr L. Bujan) dans le
cadre de notre protocole de recherche et avec l’autorisation de l’AFSSAPS (n°
B90850-30). 36 donneurs volontaires ont été recrutés pour cette étude, 16 témoins
non infectés et 20 donneurs infectés par le VIH, non traités, avec une charge
séminale et sanguine positive. Les échantillons de sperme ont été obtenus après un
examen clinique et une recherche par questionnaire des facteurs de risques
d’infections uro-génitales et d’infertilité. Le sperme a été obtenu par masturbation
sans lubrification après un délai de 3 jours d’abstinence. L’éjaculat a été liquéfié 30
minutes à 37°C puis centrifugé 10 mn à 1 000 g à température ambiante pour
séparer les spermatozoïdes du liquide séminal. Le surnageant a été aliquoté et
conservé à -80°C.
Le sperme de donneurs sains non infectés par le VIH, utilisés dans les
expériences des chapitres II et III de ce manuscrit, ont été récolté dans le cadre
d’une collaboration avec le CECOS de Rennes (Prs D. Le Lannou et C. Ravel), après
acceptation du protocole de recherche par le Ministère de la Recherche (déclaration
DC-2010-1155). Des pools de liquide séminaux (LS) de donneurs sains (20 à 50
donneurs) sont constitués à partir des spermes récoltés, liquéfiés 30 minutes à 37°C
puis congelés à -80°C. Après obtention d’un nombre suffisant de LS, ceux-ci sont
décongelés, centrifugés 10 mn à 1 000 g, regroupés et aliquotés puis congelés à 80°C. En vue du fractionnement HPLC, un pool de LS de 21 donneurs VIH- a été
constitué de la même façon à l’exception qu’une partie a été ultracentrifugée à 105
000 g pendant 1 h.
82
TISSUS CERVICAUX ET COLORECTAUX
Les tissus cervicaux et colorectaux sont recueillis auprès du service
d’anatomopathologie du CHU de Rennes en accord avec le CPP Grand Ouest
(déclaration Ministère DC-2009-1028) dans le cadre d’une collaboration avec le Pr N.
Rioux-Leclercq. Les tissus cervicaux proviennent d’hystérectomie pour prolapsus et
les tissus colorectaux de colectomie pour cancer colorectal ou diverticulose. Seuls
les tissus sains, déterminés comme normaux par l’examen anatomopathologique,
sont utilisés. Le tissu prélevé est conservé à 4°C dans du milieu de transport (RPMI,
100 U/ml de pénicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine, 100 µg/ml gentamycine) avant
d’être acheminé au laboratoire dans l’heure qui suit le prélèvement.
I.
TECHNIQUES DE BIOLOGIE CELLULAIRE
a. Entretien des lignées cellulaires
Nous avons utilisé deux lignées cellulaires de mammifères au cours de notre
étude : les lignées TZM-bl et 8E5.
La lignée TZM-bl :
La lignée TZM-b1 est une lignée stable de cellules HeLa. Ces cellules
expriment fortement et de façon stable les molécules CD4, CXCR4 et CCR5. Elles
contiennent également dans leur génome des gènes rapporteurs (luciférase et βgalactosidase) dont les promoteurs sont sous le contrôle de la protéine virale Tat.
Elles sont cultivées à 37°C, en atmosphère humide enrichie en CO2 à 5 %, dans du
milieu DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium) complété avec 2mM de Lglutamine, 100 U/ml de pénicilline, 0,1mg/ml de streptomycine et 10% (v/v) de sérum
de veau fœtal (SVF) décomplémenté. Ces cellules étant adhérentes, elles sont
maintenues en culture après un traitement de 5 min à la trypsine (0,25%), laquelle
sera ensuite inactivée en présence de milieu complet supplémenté (cf ci-dessus).
83
La lignée 8E5 :
La lignée 8E5 est une lignée lymphocytaire contenant une copie de provirus
VIH défectif par cellule (Folks et al., 1987). Elle est cultivée à 37°C, en atmosphère
humide enrichie en CO2 à 5 %, en milieu RPMI supplémenté par 10 % SVF
décomplémenté, 100 U/ml pénicilline et 0,1 mg/ml streptomycine.
b. Isolement et culture des cellules primaires
Les cellules mononuclées du sang (PBMC : Peripheral Blood Mononuclear
Cells) sont obtenues à partir du sang de donneurs sains recueilli à l’Etablissement du
Sang Français dans le cadre d’une convention avec notre laboratoire. Les cellules
sont obtenues après séparation sur un gradient de densité de Ficoll. Elles sont
cultivées à 37°C, en atmosphère humide enrichie en CO2 à 5 %, dans du milieu
RPMI contenant 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 0,1 mg/ml de
streptomycine et 10 % (v/v) de SVF. En début de culture et ce pendant 72h, les
cellules sont cultivées en présence de 3µg/ml de l’agent mitogène PHA
(phytohémagglutinine), puis lavées et remise en culture en présence de 5ng/ml d’IL-2
(Interleukine 2), l’ensemble favorisant l’activation et la prolifération des lymphocytes
T.
c. Culture organotypique de tissus colorectaux et cervicaux
humains
Les tissus (muqueuses et sous muqueuses) sont délicatement découpés au
scalpel en explants de 3 mm3 (explants cervicaux) ou en lamelle de 3x6 mm
(explants colorectaux). Un fragment de tissu colorectal ou 2 fragments de tissus
cervicaux sont transférés sur des inserts constitués d’une membrane poreuse en
PET (polyéthylène téréphtalate, diamètre des pores : 3 µm, diamètre insert 10.5mm)
(Falcon Labware) eux-mêmes disposés dans des plaques de culture 12 puits
contenant 1 ml de milieu de culture par puits. Les explants cervicaux sont cultivés
dans du milieu RPMI sans rouge de phénol et sans glutamine, supplémenté en SVF
(10 %), 1 % (v/v) d’acides aminés non essentiels, 0,1 mM de sodium pyruvate, 100
U/ml de pénicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine et 100 µg/ml gentamycine. Les
explants colorectaux sont cultivés dans du milieu RPMI sans rouge de phénol et sans
L-glutamine, supplémenté en SVF (15 %), 1 % d’acides aminés non essentiels,
0,1 mM de sodium pyruvate, 100 U/ml de pénicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine, L-
84
glutamine (1 mM), 100 µg/ml gentamycine et 2,5 µg/ml fungizone. Les cultures sont
maintenues pendant 11 jours pour les tissus colorectaux et 13 jours pour les tissus
cervicaux, à 37°C, en atmosphère humide à 5 % de CO2 et 95 % d’air. Le milieu de
culture est entièrement renouvelé tous les 2 jours jusqu’au 5 ème de culture. A partir
du 7ème jour de culture, seuls 400 µl de milieu de culture sont renouvelés tous les
2 jours. Les surnageants de culture prélevés sont conservés à -80°C. Avant la mise
en culture, ainsi qu’au 7ème, 11ème/13ème jours de culture, des explants sont prélevés
et congelés afin d’extraire l’ADN et de réaliser par la suite une PCR quantitative,
d’autres sont fixés au paraformaldéhyde (PBS-PAF 4%, 2 heures à 4°C) puis
déshydratés et inclus en paraffine pour l’analyse immunohistologique.
d. Test enzymatique de viabilité pour les modèles cellulaires
La viabilité des cellules en culture est évaluée par un test enzymatique à l’aide
du kit CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (PROMEGA). Ce test permet de
mesurer l’ATP dans les cellules viables, sachant qu’une perte d’intégrité de la
membrane conduit à une diminution rapide du taux d’ATP dans la cellule. Après avoir
décongelé les réactifs à température ambiante, le substrat lyophilisé (CellTiter-Glo®
Substrate) est repris dans 10 ml de tampon (CellTiter-Glo® Buffer) afin de
reconstituer le mélange enzymes/susbtrat. Après agitation douce, le mélange
enzyme substrat ainsi reconstitué (CellTiter-Glo® Reagent) est ajouté volume à
volume au milieu de culture. Après 2 minutes d’agitation pour induire la lyse des
cellules, la plaque est incubée à température ambiante pendant 10 minutes afin de
stabiliser le signal luminescent. Ce dernier est enregistré avec un luminomètre
(FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) avec un temps d’intégration de 1 seconde.
e. Test enzymatique de cytotoxicité sur les cultures de tissus
colorectaux et cervicaux
La cytotoxicité sur les tissus en culture est évaluée grâce à un test enzymatique
à
l’aide
du
kit CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay
(PROMEGA). Ce test permet de mesurer, dans le milieu de culture, le relargage de
la lactate deshydrogenase (LDH) par les cellules dont la membrane plasmique a
perdu de son intégrité. Après avoir décongelé les réactifs à température ambiante, le
substrat lyophilisé (Substrate Mix) est repris dans 11 ml de tampon (Assay Buffer)
afin de reconstituer le mélange enzyme/susbtrat. Après agitation douce, le réactif
85
enzyme substrat reconstitué (CytoTox-ONE™ Reagent) est ajouté volume à volume
au surnageant de culture prélevé. Après 30 secondes d’agitation, la plaque est
incubée à température ambiante pendant 10 minutes. La réaction est stoppée par
l’ajout de Stop Solution (50 µl pour 100 µl de CytoTox-ONE™ Reagent). Le signal de
fluorescence émis à la longueur d’onde 590nm est enregistré avec un fluorimètre
(FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) après excitation à une longueur d’onde
d’excitation de 560 nm.
f. Cytométrie en flux (ou FACS)

Marquage des récepteurs et des molécules de l’activation des
lymphocytes T (LT)
Les antigènes étudiés se trouvant exprimés soit à la membrane soit de manière
intracellulaire (vésicules cytoplasmiques), le traitement des cellules sera différent
selon la localisation de l’antigène recherché. Pour la recherche d’une localisation
membranaire, les cellules sont lavées une fois en PBS-1% SVF puis incubées 20
mn à + 4°C en présence de l'anticorps primaire ou de l’anticorps contrôle
correspondant dilué dans du PBS-1% SVF à raison de 50µl final pour 0,5 million de
cellules. Les volumes ou concentrations d’anticorps utilisés sont indiqués dans le
tableau 3. Les cellules sont lavées 2 fois en PBS-1% SVF puis fixées au PFA 1,5%.
Dans le cas d’une localisation intracellulaire des antigènes, 1 million de cellules sont
centrifugées par condition à tester. Elles sont fixées et perméabilisées avec la
solution de fixation/perméabilisation du kit
Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)
pendant 20 min à +4°C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec la solution de
lavage (Permwash) fournie dans le kit puis incubées 20 min à RT avec l’anticorps
primaire (Tableau 3) dilué dans la solution de lavage. Puis les cellules sont lavées
une fois avec cette solution puis avec du PBS- avant d’être fixées au PFA 1,5%.

Mesure de la prolifération
La prolifération des cellules est mesurée avec le kit Click-iT EdU Flow
Cytometry Assay kit (Life Technologies). Ce kit permet d’évaluer la synthèse d’ADN
par l’incorporation d’un nucléoside analogue de la thymidine : EdU (5-ethynyl-2´deoxyuridine). La détection est basée sur une réaction de catalyse entre un alkyle
86
contenu dans l’EdU et un azoture conjugué au fluorochrome Alexa Fluor® 488.
Après infection et traitement au LS des cellules pendant 3h, 10 µM d’EdU est ajouté
au milieu de culture pendant 6h, puis les cellules sont concentrées par centrifugation
à raison de 1 million de cellules par condition à tester. Les cellules sont lavées en
PBS-1% BSA puis fixées avec la solution « Click-iT fixative » (106 cellules/100 µl)
pendant 15 minutes à température ambiante. Après un lavage en PBS-1 % BSA, les
cellules sont resuspendues dans un tampon perméabilisant « Click-iT saponin-based
permeabilization and wash reagent » pendant 15 minutes. Elles sont ensuite
marquées à l’aide du tampon « Click-iT reaction » contenant le fluorochrome Alexa
Fluor® 488 conjugué à l’azoture. Après 30 minutes d’incubation à température
ambiante, les cellules sont lavées dans le tampon perméabilisant puis dans du
tampon PBS-1% SVF.
Elles sont ensuite
marquées à
l’aide
d’anticorps
membranaires comme précédemment décrit.

Mesure de la viabilité
La viabilité des cellules est évaluée via le kit « LIVE/DEAD® Fixable Red Dead
Cell Stain » (Life Technologies). Le marquage fluorescent mesuré est basé sur une
réaction entre un réactif fluorescent et les amines cellulaires. Ce réactif fluorescent a
la propriété de réagir avec les amines à la surface de l’ensemble des cellules mais
traverse également la membrane devenue perméable des cellules engagées dans
un processus de mort cellulaire et va ainsi réagir avec les amines libres dans le
cytoplasme des cellules. Il en résulte un marquage de fluorescence intense dans les
cellules mortes et d’un marquage d’intensité plus faible dans les cellules vivantes. Ce
système de détection des cellules viables présente l’avantage d’utiliser un réactif
fluorescent résistant à la fixation au PFA. Les cellules sont centrifugées à raison de 1
million de cellules par condition à tester. Après marquage par
des anticorps
membranaires comme décrits précédemment, les cellules sont reprises dans 500 µl
de PBS auquel on ajoute 0,5 µl de « LiveDead Reagent » et incubées 30 minutes à
température ambiante. Après un lavage en PBS, les cellules sont fixées au PFA
1,5%. L’acquisition du signal de fluorescence puis les analyses sont réalisées sur un
cytomètre Facscalibur (BD Biosciences), équipé d’un laser d’excitation à 488nm.
L’émission des FITC et de l’Alexa488 est récupérée via un filtre laissant passer les
longueurs d’ondes comprises entre 515 et 545 nm, le marquage PE via un filtre qui
87
récupère les longueurs d’ondes entre 561 et 603 nm et le PerCP via un filtre qui
récupère les longueurs d’ondes supérieures à 670 mn (LP 670). Le signal émis par le
réactif Live Dead Red fluorescent utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire présente
un spectre d’émission très large et est récupéré à la fois dans le filtre 515-603nm ou
dans le filtre LP 670 sans pouvoir être compensé. Les analyses sont réalisées à
l’aide du logiciel CellQuestPro.
Tableau 3 : Liste des anticorps utilisés pour la cytométrie en flux
Anticorps
primaire
Isotype
Mouse IgG1k
CD3
(BD Biosciences)
Mouse IgG1k
CD4
(BD Biosciences)
Mouse IgG2a, k
CCR5
(BD Biosciences)
Mouse IgG2a, k
CXCR4
(BD Biosciences)
Mouse IgG1k
CD69
(BD Biosciences)
Clone
(Fournisseur)
Conditions
d’utilisation/essai
clone SP34-2 (BD
Biosciences)
10µl
clone RPA-T4 (BD
Biosciences)
10µl
clone 3A9 (BD
Biosciences)
10µl
Clone 12G5 (BD
Biosciences)
10µg/ml
clone FN50 (BD
Biosciences)
10µl
88
II.
TECHNIQUES DE VIROLOGIE
a. Production des virus
Plusieurs souches virales présentant des tropismes cellulaires différents ont été
utilisées pour infecter les modèles cellulaires et/ou tissulaires. Ces souches de VIH-1
sous type B sont soit de tropisme R5 (clone moléculaire SF162 (Cheng-Mayer et al.
1989) et isolat primaire HIV-1 ES P-2149-3 isolé d’un patient en phase aigüe de
l’infection) soit de tropisme X4 (clone moléculaire IIIB). Ces différentes souches ont
toutes été fournies par le NIBSC (Centralized Facility for AIDS Reagent, Potters Barr,
Royaume Uni). Ces virus sont produits par amplification après infection de PBMC
purifiés provenant de sang frais de donneurs sains et préalablement activés à la
PHA. Un culot de 10 x 106 PBMC est mis en contact pendant 2 heures à 37°C avec
200 µl de stock viral. Les cellules sont ensuite resuspendues dans 10 ml de RPMI
5% IL-2 (5 ng/ml), puis mises en culture à 37°C, en atmosphère humide, 5 % de CO2
et 95 % d’air. Le lendemain, le milieu de culture est entièrement changé. Puis à 4
jours post-infection, 2/3 du surnageant de culture est prélevé, et remplacé par du
milieu frais. 2 x 106 de PBMCs sont rajoutés à 7 jours post-infection. Les surnageants
des jours 7, 8, 9 et 10 après infection sont réunis et conservés à – 80°C jusqu’au
dosage de la protéine P24 et à la titration de la TCID 50.
b. Infection des modèles cellulaires
Après passage à la trypsine, les cellules TZM-bl sont ensemencées sur une
plaque 96 puits à 9 000 cellules/puits dans 150 µl de milieu. Les PBMC stimulés à la
PHA et à l’IL-2 sont ensemencés à 2.106 cellules/ml dans 100 µl de milieu (plaques
96 puits) ou dans 500 µl de milieu (plaques 24 puits). Le lendemain, les échantillons
de sperme, de LS et des aliquots de virus sont décongelés et dilués. Le virus est
amené à une MOI de 0,01 ce qui correspond pour les virus utilisés à une
concentration de 2ng p24/ml pour la souche SF162 et 5ng de p24/ml pour la souche
IIIB. L’infection est réalisée en absence ou en présence de sperme ou de LS dont la
concentration finale sur les cellules est de 1 %, 0,2 % ou 0,04 %. Chaque condition
est testée en triplicat. Après 3 h d’infection à 37°C, l’inoculum est retiré et remplacé
par du milieu frais. Pour les TZM-bl, après 2 jours de culture, l’infection est évaluée
par mesure de l’activité β-galactosidase via le kit « Gal-Screen System » (Applied
Biosystem). Pour les PBMC, après 3 jours de culture, les surnageants sont collectés
89
et congelés pour un dosage ultérieur de la protéine virale p24 (kit Innotest HIV
Antigen mAb - Innogenetics).
c. Infection des cultures organotypiques de tissus colorectaux
et cervicaux humains
Suite à la dissection, les explants sont infectés en présence ou non de liquide
séminal à 20 % final (pool de LS issu d’au moins 20 patients) pendant 3 h à 37°C par
la souche de VIH-1 R5 SF 162 (100 ng de p24 dans 150µl) puis lavés en PBS avant
d’être mis en culture selon le protocole décrit en I-c. Les explants ne sont pas
polarisés, permettant l’accès direct du virus aux cellules épithéliales et subépithéliales comme dans le cadre des micro-lésions de l’épithélium dues aux
rapports sexuels ou à une inflammation. Les surnageants de culture prélevés et
renouvelés tous les 2 jours sont conservés à –80°C jusqu’au dosage de la protéine
virale p24 pour le suivi de l’infection et du dosage de la LDH pour le suivi de la
viabilité. Au terme de la culture, les explants sont fixés au paraformaldéhyde et
enrobés en paraffine pour l’analyse immunohistologique ou congelés à sec à -80°C
pour la détection d’ADN proviral.
d. Dosage de la protéine virale P24
Le VIH est constitué d’une enveloppe renfermant notamment une capside
protéique formée des protéines P24. La détection et la quantification de cette
protéine témoignent de la présence du virus. Pour doser la protéine virale p24, nous
avons utilisé le kit Innotest HIV Antigen mAb (Innogenetics®) qui repose sur le
principe de la technique ELISA. Les réactifs amenés à température ambiante, les
échantillons, les contrôles et la gamme étalon sont préparés par dilution en cascade
dans du PBS. Des plaques au format 96 puits tapissées d’anticorps anti-P24 sont
fournies dans le kit. Après avoir déposé dans chaque puits 100 µL de conjugué 1,
contenant un anticorps monoclonal anti-P24 biotinylé, les échantillons à doser ou
90
points de gamme étalon dilués en PBS (100 µL) sont déposés dans ces puits et la
solution homogénéisée. Après une incubation de 1 heure à 37°C, la plaque est lavée
4 fois par un tampon de lavage fourni dans le kit. Puis, 200 µL du conjugué 2
(streptavidine reconnaissant la biotine, couplée à la péroxydase) sont ajoutés, la
plaque est mise à incuber 30 minutes à 37°C et de nouveau lavée 4 fois. Ensuite, le
substrat de la péroxydase (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) est ajouté (200 µL) et la
plaque est à nouveau incubée à température ambiante pendant 30 minutes. A l’issue
de cette incubation, 50 µL d’acide sulfurique (H2SO4 à 1 - 2 mol/L) sont ajoutés pour
arrêter la réaction enzymatique. Enfin, la densité optique est lue à 450 nm et 620 nm
grâce à un lecteur de plaque ((FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH). La mesure à
620 nm permet de mettre en exergue le bruit de fond de cette expérience et la
densité optique est obtenue par la soustraction de la valeur obtenue à 450 nm et la
valeur à 620 nm. La concentration en P24 est déterminée à partir de l’équation de la
droite de régression de la gamme.
e. Dosage de l’activité β-galactosidase
Le taux d’infection des cellules TZM-b1 est mesuré à l’aide du kit Gal screen
(Tropix, Applied Biosystem). Le test Gal screen combine une lyse directe des cellules
et un test rapide et sensible de l’activité β – galactosidase des cellules TZM-b1. Un
substrat chimioluminescent est dilué au 1/25 dans un tampon de lyse, et 90 µl de ce
mélange réactionnel sont ajoutés au milieu de culture des cellules. Après une
incubation de 30 mn à température ambiante, 140 µl de lysat par puits sont
transférés dans une plaque blanche pour la lecture au luminomètre (FLUOstar
OPTIMA, BMG LABTECH).
III.
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
a. Lyse des PBMC congelées à sec
Un culot d’1 million de cellules est suspendu avec un tampon de lyse contenant
de la protéinase K. Elles sont ensuite incubées à 56°C pendant 16 h, puis la
protéinase K est inactivée par un traitement à la chaleur (100°C pendant 10mn).
91
b. Extraction d’ARN totaux à partir de PBMC congelées à sec
L’extraction des ARN totaux à partir d’échantillons congelés est effectuée à
l’aide du kit RNeasy plus (Qiagen). Les culots de 1 million de cellules sont
resuspendus dans du tampon de lyse (RLT lysis buffer) contenant de l’isocyanate de
guanidium et du β mercaptoéthanol. Les ARN sont retenus sur une colonne de silice,
après une série de lavages, ils sont traités à la DNase selon les indications du
fournisseur puis les ARN sont élués dans de l’eau distillée stérile. Les ARN isolés
sont dosés par mesure de l’absorbance à 260 nm (1 unité DO = 40 g d’ARN/ml).
c. Transcription inverse des ARN
La synthèse des ADNc se fait selon la technique du « random-priming » (Taylor
et al. 1976). Des hexanucléotides s’hybrident au hasard de leur complémentarité sur
les ARN et permettent l’action de la transcriptase inverse (High-Capacity RNA-tocDNA™ Kit, Applied Biosystems®). La synthèse d’ADNc s’effectue à partir de 100 ng
d’ARN. Cette réaction de transcription inverse se déroule dans un volume final de
20µl pendant 1 h à 37°C puis 5 mn à 95°C. La même réaction en l’absence de
transcriptase inverse permet de tester l’efficacité du traitement à la DNAse.
d. Extraction d’ADN totaux à partir de tissus humains congelés
à sec
L’extraction d’ADN génomique des tissus est effectuée à l’aide du kit QIAamp
DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) à partir de fragments de tissus de 30
mg et grâce à des minicolonnes de silice. L’estimation de la concentration d’ADN et
de sa pureté est obtenue par mesure de l’absorbance à 260 nm (1 unité DO = 50 g
d’ADN /ml).
e. La PCR en temps réel
i. Quantification des ARNm cellulaires et proviraux
Les réactions d’amplification ont été réalisées à partir de 5µl d’ADNc dilué au
demi avec l’appareil ABI 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA) dans un mélange réactionnel (TaqMan Universal PCR MasterMix,
Applied Biosystems pour les ARNm cellulaires et iQ SYBR Green Supermix,
92
BIORAD pour les ARNm proviraux) en utilisant des sondes et amorces commerciales
spécifiques du gène d’intérêt (Tableau 4). Le mélange réactionnel final (20 µl) pour
les ARNm cellulaires est constitué de 10 µl de TaqMan Universal MasterMix, 1 µl de
sonde TaqMan MGBprobe (10 pmole/réaction), 1µl de chaque amorce (25
pmole/réaction), 8 µl d’ADNc. Le mélange réactionnel final (20 µl) pour les ARNm
proviraux est constitué de 10 µl de iQ SYBR Green Supermix, 0.4 µl de chaque
amorce à 25 µM (500nM) , 0.4 µl de ROX Passive Reference Dye, 5 µl d’ADNc ,
H2O q.s.p 20µl. L’amplification est effectuée comme suit : 95°C 10 mn (dénaturation
de l’ADN, activation de l’enzyme Taq Gold), (40 cycles) 95°C 15 s (dénaturation),
60°C 1 mn (élongation). La quantification relative de l’expression des gènes d’intérêt
est normalisée par rapport à l’expression du gène ubiquitaire en utilisant la méthode
de la courbe standard décrite par Applied Biosystems. Les valeurs de Ct de chaque
gène sont donc calculées par le logiciel : ABI sequence detection system 1.9
(Applied Biosystems, USA). Une fois normalisées respectivement
d’expression du gène ACTINE
au taux
ou au taux d’expression des gènes GAPDH,
l’expression du gène d’intérêt CCR5 et celle du gène proviral gag peuvent être
quantifiées par la méthode des 2
ΔΔct
qui repose sur la formule suivante : ΔΔCt= ((Ct
x – Ctref) condition A – (Ct x – Ct ref) condition B)(Livak and Schmittgen 2001). Cette
méthode ne peut être utilisée que dans le cas d’une efficacité de PCR équivalente et
proche de 100% entre le gène de référence et le gène d’intérêt.
ii. Quantification de l’ADN proviral
La quantification de l’ADN proviral par PCR en temps réel est réalisée selon le
protocole de M. Burgard (Laboratoire de virologie du Pr Rouzioux, Hopital Necker,
Paris) (Rouet et al. 2004). Les réactions d’amplification sont réalisées sur 250 ng
d’ADN d’explant infectés, avec l’appareil ABI PRISM 7000 Real-Time PCR system
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un mélange réactionnel (TaqMan
Universal PCR MasterMix, Applied Biosystems) en utilisant des sondes et amorces
spécifiques soit pour la région promotrice LTR du génome viral, (Rouet et al. 2004)
soit pour la region Strong Stop soit du gène de l’albumine sérique humaine (Desire et
al. 2001) (Tableau 4). Mélange réactionnel final (20 µl) pour la région promotrice LTR
du génome viral :
10 µl de TaqMan Universal PCR MasterMix, 0.4 µl de chaque
amorce à 25µM (500 nM ), 0.4 µl de sonde à 10µM (200 nM), 8,8 µl d’ADN
Le
93
nombre de copies d’ADN proviral contenues dans un échantillon est calculé à l’aide
d’une gamme réalisée à partir de cellules 8E5 et rapporté au nombre de copies
d’albumine (le gène de l’albumine sérique humaine est ubiquitaire et présent en deux
exemplaires par cellule). La lignée 8E5 est une lignée lymphocytaire contenant une
copie de provirus VIH incomplète par cellule (Folks et al. 1987). Le nombre de copies
d’ADN proviral peut donc être déduit du nombre total de cellules utilisées ou de la
quantité d’ADN génomique sachant que 1 µg d’ADN correspond à l’ADN génomique
de 150 000 cellules.
Tableau 4 : Liste des amorces
94
IV.
TECHNIQUES DE BIOCHIMIE
a. Dosage des cytokines par LUMINEX
La concentration de 45 cytokines a été analysée sur 50 µl d’échantillon via les
kits Bio-Plex Pro assay (Bio-Plex Pro Human Cytokine Group I [27-plex] and Group II
[21-plex] panels; Bio-Rad) selon les recommandations du fournisseur. La
Technologie Luminex™ est une technologie basée sur le même principe que l’ELISA
sandwich mais repose sur l’utilisation de microsphères fluorescentes, renfermant un
ratio différent et spécifique de 2 fluorochromes.
Ces billes sont couplées à des
anticorps spécifiques de cytokines. La reconnaissance des cytokines avec deuxième
anticorps spécifique biotinylé est détectée grâce à l’ajout d’un complexe steptavidine
couplé à un troisième fluorochrome dont la longueur d’onde diffère de celle émise
par les microbilles. La lecture a été effectuée grâce au système Luminex (Bioplex
array reader BIORAD). Cette technologie utilise les principes de la cytométrie de flux
adaptée à la lecture
de microsphères.
Chaque microsphère
est excitée
individuellement par 2 lasers. La première information recueillie correspond à
l’émission de fluorescence permettant de classifier la couleur de la bille et donc
d'identifier la cytokine. La seconde information correspond à la quantification de
l'intensité de fluorescence émise en surface par le troisième fluorochrome. Ce
principe permet donc l'analyse simultanée, rapide et très sensible de nombreuses
molécules d’intérêts différentes dans un très petit volume d'échantillon.
b. Dosage de la prostaglandine E2
Le dosage de la prostaglandine E2 est réalisé à l’aide d’un kit de dosage
immunoenzymatique (EIA, Enzyme ImmunoAssay) commerciale (Prostaglandin E2
EIA kit – Cayman) et selon les modalités préconisées par le fabriquant. Ce dosage
est basé sur la compétition entre la PGE2 libre et un conjugué PGE-2
acétylcholinestérase (AChE) (PGE2 tracer) pour un nombre limité de sites de liaison
PGE2-spécifiques. La présence du traceur est révélée grâce au réactif d’Ellman,
substrat de l’AChE, et la concentration en PGE2 déduite par lecture d’absorbance.
Au jour 1, la gamme de standards est préparée à partir d’une solution mère à 10
ng/ml de PGE2. Elle couvre une gamme de concentrations comprises entre 7,8 et 1
000 pg/ml. Dans une plaque 96 puits, 50 µl de standards ou d’échantillons sont
ensuite distribués et exposés à 50 µl de traceur AChE et 50 µl d’anticorps anti-PGE2
95
(produits chez la souris), sans oublier les puits contrôles adéquats (B : Blank, TA :
Total Activity, NSB : Non Specific Bonding, B0, respectivement destinés à mesurer
l’absorbance résiduelle causée par le réactif d’Ellman, l’activité totale du traceur
AChE, la liaison non spécifique du traceur au puits et la quantité maximale de traceur
que l’anticorps peut lier en l’absence de PGE2 libre). L’ensemble est couvert et
incubé une nuit à +4°C. Au jour 2, la PGE2 libre est liée aux anticorps anti-PGE2
compétitivement au traceur. Ces derniers se sont eux-mêmes liés aux anticorps antisouris fixés au fond des puits. Ceux-ci sont vidés et lavés à 5 reprises dans un
tampon de lavage, 200 µl de réactif d’Ellman y sont ajoutés, ainsi que 5 µl de traceur
dans les puits TA. L’ensemble est couvert et placé sur un agitateur orbital pendant
60 à 90 minutes à température ambiante. La plaque est lue entre 405 et 420 nm et la
concentration en PGE2 est calculée grâce à une courbe étalon.
c. Dosage du TGF-β actif et total
Le dosage du TGF-β actif et total est réalisé à l’aide du kit de dosage
Quantikine human TGF-β kits (R&D Systems) et selon les modalités préconisées par
le fabriquant. Il repose sur le principe de la technique ELISA Sandwich. Des plaques
96 puits ont été recouvertes au préalable avec des anticorps monoclonaux
spécifiques dirigés contre TGF-β. 50 µl de « Assay Diluent RD1-73 » à utiliser pour
les échantillons de plasma et de sérum sont distribués dans chaque puits ainsi que
50 µl d’échantillon, de gamme ou de contrôle. Après homogénéisation douce, la
plaque est scellée et incubée 2 heures à température ambiante. Après 4 lavages
avec 400µl de tampon de lavage, 100µl de conjugué TGF-β contenant des anticorps
polyclonaux anti- TGF-β couplés à la HRP sont ajoutés. Après une incubation de 2
heures à température ambiante, les anticorps anti-TGF-β non liés sont éliminés par
une série de 4 lavages avec 400µl de tampon de lavage. Puis 100µl de solution
substrat sont ajouté dans chaque puits. La plaque est incubée 30 minutes à
température ambiante à l’abri de la lumière. La réaction est arrêtée avec l’ajout
d’acide chlorhydrique avec 100 µl de « Stop solution ». La plaque est lue à 450 nm et
la concentration en TGF-β est calculée grâce à une courbe étalon. Le dosage du
TGF-β total nécessite l’activation du TGF-β latent par un traitement acide. 40 µl
d’échantillon sont mélangés à 20 µl d’HCL 1N et incubés pendant 10 minutes à
température ambiante. L’acidité est neutralisée par ajout de 20 µl de 1,2 N
NaOH/0,5M HEPES afin d’obtenir un pH après neutralisation compris entre 7,2 – 7,6.
96
d. Dosage de SEVI
Le dosage de SEVI a été réalisé par le Pr Jan Munch (Ulm University,
Allemagne). Des plaques EIA/RIA 96 puits (Corning Incorporated) sont recouvertes
pendant 16 h à 4°C avec 100 µl d’antigène dilués ou avec du liquide séminal dilué
100 fois dans du PBS. Le jour suivant, les plaques sont lavées 2 fois avec un tampon
de lavage (imidazole buffer Saline with Tween 20; KPL) puis incubées 2 heures avec
100 µl de solution « Roti®-Block solution » (Roth). Elles sont ensuite lavées 5 fois.
Par la suite, 100 µl de serum pré-immun ou d’antiserum dilués 50 fois et obtenus
chez le lapin (d28; Pocono Rabbit Farms) ou le cobaye (S3; IPF-Pharmaceuticals)
immunisés contre SEVI sont ajoutés dans les puits. Les plaques sont incubées
pendant une heure puis rincées 5 fois avec du tampon de lavage. 100 µl anticorps
anti-lapin (PerkinElmer) ou anti-cobaye (Abcam) couplés à l’HRP et dilués au 1/10
000ème sont ajoutés. La plaque est incubée 30 minutes puis rincés 5 fois avant
d’être incubés avec 100 µl de substrat HRP (SureBlue™, KPL). L’ajout de 100 µl de
HCL 1N stoppe la réaction. L’absorbance est lu à 450 nm et 650 nm.
e. Dosage des fragments de séménogéline SEM1 et SEM2
Le dosage des fragments de séménogéline SEM1 et SEM2 a été réalisé par le
Dr Nadia Roan (Gladstone Institute, University of California, USA). Des plaques
Immunolon II (Fisher, Waltham, MA) sont incubées pendant 12 à 18 heures à 4°C
avec du liquide séminal 1 % ou avec un antigène dilué dans du PBS. Puis les
plaques sont incubées pendant 2 heures à température ambiante avec du PBS-1%
BSA. Les puits sont ensuite incubés avec des sera dilués dans du PBS-1% BSA
pendant une heure à température ambiante. Après lavage, les plaques sont incubées
avec un anticorps secondaire couplé à l’HRP (GE Healthcare, South San Francisco,
CA) dilué dans du PBS-1% BSA. Après lavage, le susbtrat TMB (Sigma-Aldrich, St.
Louis MO) est ajouté et la réaction est arrêtée par 2M d’H2SO4. L’absorbance est lue
à 450 nm et 650 nm. Les anticorps dirigés contre SEM1(86-107) et SEM2(49-107)
sont produits par Pocono Rabbit Farms (Canadensis, PA).
97
V.
TECHNIQUES D’HISTOLOGIE
a. Traitement des échantillons
Les tissus fixés au paraformaldéhyde 4 % sont déshydratés par une succession de
bains d’alcool de titre croissant (de 70 à 100 %) puis enrobés en blocs de paraffine
chaude et entreposés au moins 6 heures à 4°C. Des coupes de 5 µm ou 7 µm
d’épaisseur sont réalisées au microtome puis déposées sur des lames traitées
TESPA (3 aminopropyltriethoxy-Silane) puis incubées sur la nuit à 37°C. Les coupes
sont déparaffinées par trois bains de toluène 100% et réhydratées par des bains
d’alcool de titre décroissant dans un automate Varistain (Shandon) dont les
différentes étapes sont : toluène 100% 3x10 minutes, éthanol 100° 2x5 min, éthanol
95° 2x2 minutes, éthanol 90° 2 minutes, éthanol 70° 2 minutes, éthanol 60° 2
minutes, éthanol 50° 2 minutes, eau. Afin d’apprécier la morphologie du tissu, les
coupes sont colorées dans un bain d’hémalun de Masson (1 minute), rincées à l’eau
saturée en lithium, puis déshydratées dans des bains d’alcool successifs de titre
croissant (de 50 à 100 %), plongées dans deux bains de toluène et enfin montées
entre lame et lamelle dans du milieu de montage (Eukitt, Labonord). Les coupes sont
ensuite observées au microscope photonique.
b. Immunohistochimie
Les différents anticorps utilisés ainsi que leurs conditions spécifiques d’utilisation
sont décrits dans le Tableau 5. L’utilisation de certains d’entre eux nécessite un
traitement afin de démasquer les antigènes. Ce traitement consiste soit à incuber les
lames au bain marie à 80°C pendant 20 minutes soit au micro-ondes (3 fois 10
secondes à 1 000 W) dans un bain de tampon citrate 10 mM pH6 dans H 2O, ou dans
un bain de tampon Tris (10 mM)-EDTA (1 mM) pH9 (Tableau 5). Les étapes
suivantes sont réalisées en chambre humide à température ambiante. D’une manière
générale, après un rinçage au PBS, les sites aspécifiques sont saturés avec du
sérum humain 4 % (Tableau 5). Les coupes sont incubées une nuit à 4°C ou 1 h à
température ambiante en présence de l’anticorps primaire ou de l’IgG contrôle dilué
dans le tampon saturant (Tableau 5). Après 3 lavages dans du PBS (+/- triton 0.5%)
les coupes sont ensuite recouvertes d’une solution H2O2 3 % pendant 5 minutes afin
d’inhiber les peroxydases endogènes puisque le marquage immunologique est
révélé grâce à un système « biotine-avidine-horseradish peroxydase biotinylée».
98
Après lavage au PBS, les coupes sont incubées 45 mn à température ambiante avec
l’anticorps secondaire biotinylé dirigé contre l’anticorps primaire (Tableau 5). Après
lavage au PBS, les tissus sont ensuite incubés 20 minutes avec un précomplexe
moléculaire d’avidine couplée à la HorseRadish Peroxydase (HRP) biotinylée
(Vectastain, ABC kit, Vector laboratories). .La révélation de la fixation se fait en
présence des substrats chromogènes de la peroxydase (H2O2 et AEC (3-amino-9ethylcarbazole) ou DAB (3,3 diaminobenzidine). Les coupes sont contre-colorées à
l’hémalun de Masson (1 minute), puis montées entre lame et lamelle en milieu
aqueux (Aqueous Mount, Scytek) dans le cas de l’AEC, ou déshydratées (bains
d’alcool de titre croissant puis toluène) et montées à l’Eukitt (CML) dans le cas d’une
révélation à la DAB. Pour les expériences de co-localisation utilisant une révélation
par fluorochrome, le protocole utilisé ne varie que sur quelques points : Après le
démasquage, une incubation dans la glycine 0,1M est effectuée pendant 5min pour
minimiser les phénomènes d'autofluorescence, les lavages sont fait avec du PBS 1%
triton, l’anticorps primaire est dilué dans du Dako real 2% sérum humain, l’inhibition
des peroxydases endogènes par l’H2O2 n’est pas nécessaire, les anticorps
secondaires sont directement couplés au fluorochrome désiré et les lames sont
montées en milieu aqueux contenant du DAPI (Tableau 5). Les coupes sont
observées à l’aide d’un microscope AxioImager M1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH,
Göttingen, Allemagne).
99
Tableau 5 : Liste des anticorps utilisés pour les techniques
d'immunohistochimie et d’hybridation in situ.
Anticorps
Primaire
Clone et
fournisseur
CD4
4B12
Citrate
(Novocastra)
CD163
K20T
(Novus)
CD3
Démasquage [C]
Isotype
Cible
2.5
μg/mL
IgG1
Lymphocytes T4
20
μg/mL
IgG rabbit
Citrate
7.3
μg/mL
IgG1
Lymphocytes T
Citrate
2 μg/mL
IgG1 k
Protéine virale P24
(CA) HIV-1
Citrate
F7.2.38
(Dako)
P24
VI.
Kal-1 (Dako)
monocytes
macrophages
TECHNIQUES DE PROTEOMIQUE (en collaboration avec la
plateforme de protéomique Biogenouest)
a. Fractionnement du liquide séminal par HPLC échangeuse
d’anions
1 ml de liquide séminal du pool D à 32,75 mg/ml de protéines est fractionné sur
une colonne échangeuse d’anion (Mono Q 5/50 GL, Taille des particules = 10 µm,
Dimensions = 5 x 50 mm, GE Healthcare) montée sur une HPLC Waters équipée
d’une pompe 1525. Les tampons utilisés sont A (Tris 20mM pH 8) et B (20mM Tris
pH8, 1M NaCl). La séparation a lieu à un débit de 1ml/min selon un gradient par
palier et les fractions de 1ml sont collectées de façon individuelle. Les protéines sont
tout d’abord éluées dans le tampon A et 2% de tampon B pendant 40 min. La
proportion de tampon B est augmentée progressivement de 2 à 40 % durant 85 min
amenant à une concentration saline de 0.4 M NaCl. Puis la proportion de tampon B
est augmentée à 100% en 5 minutes. Une élution finale dans 100% de tampon B est
100
effectuée durant 5 min. Enfin, la proportion de tampon B est ramenée à 2% en 30 s.
Les absorbances à 280nm, 214nm et 254 nm sont mesurées simultanément
permettant de suivre la présence des protéines, des liaisons peptidiques et celle de
contaminants (acides nucléiques).
b. Fractionnement du liquide séminal par HPLC gel filtration
Les fractions inhibitrices ou activatrices sélectionnées après les tests d’activité
biologique ayant fait suite à la 1ère HPLC échangeuse d’anions ont été regroupées
pour constituer les pools suivant : FA 46-49, FA 55- 61, FA 64-69, FA 91- 94, FA
115- 119, FA 123-125 et FA 73- 77.
Un volume de 50µl est mis de côté et
correspond à un témoin d’activité qui représente à l’échantillon avant son deuxième
fractionnement. Chaque pool est lyophilisé et repris dans 60µl de tampon phosphate
de sodium (NaH2PO4/Na2HPO4) 10mM pH 6,8. Les pools de fraction ainsi
resuspendus sont chargés sur une colonne de filtration sur gel (BioBasic sec 300,
5µm, 300 Å, 7.8 mm x 30 mm) montée sur une UHPLC Ultimate 3000 (Thermo
Scientific ; Dionex). La séparation se déroule pendant 40 min avec un débit de
0,5ml/min. La phase mobile de l’HPLC gel filtration est le tampon phosphate de
sodium 10mM pH 6.8. L’élution des protéines est suivie par mesure des absorbances
à 280nm, 214nm. L’absorbance à
254 nm permet de vérifier l’absence de
contaminants (acides nucléiques).
c. Fractionnement du liquide séminal par HPLC en phase
inverse
Comme précédemment, les fractions inhibitrices ou activatrices sélectionnées
après les tests d’activité biologique faisant suite à l’HPLC gel filtration ont été
regroupées pour constituer les pools : FA 46-49/FG14-15, FA 46-49/FG20-24, FA 4649/FG28-30, FA 46-49/FG34-37, FA 55-61/FG13-19, FA 55- 61/FG23-24, FA 5561/FG27-32, FA 55- 61/FG34-37, FA 64-69/FG24-27, FA 91- 94/FG15-16, FA 9194/FG18-21, FA 115- 119/FG27. La moitié de chacun des pools est lyophilisée et
reprise dans 100µl de solution aqueuse 5% acétonitrile (ACN) – 0,1% acide
trifluoroacétique (solvant A). Les pools de fraction ainsi resuspendus sont chargés
sur une colonne de phase inverse (C18 Acclaim 300, 3µm, 300 Å, 2.1 mm i.d. x
150mm) montée sur une UHPLC Ultimate 3000 (Thermo Scientific ; Dionex). Les
solvants utilisés sont A (eau, 0,1% acide trifluoroacétique) et B (100% ACN, 0,1%
101
acide trifluoroacétique). La séparation a lieu à un débit de 0,5ml/min selon un
gradient par palier et les fractions de 0,5 ml sont collectées de façon individuelle.
Les protéines sont tout d’abord éluées dans le solvant A et 5% de solvant B pendant
5 min. La proportion de solvant B est augmentée de 5 à 80 % durant 35 min. Puis la
proportion de solvant B est augmentée à 100% en 10 secondes. Enfin, l’élution finale
dans 100% de solvant B est effectuée durant 5 min. Puis la proportion de solvant B
est ramenée à 2% en 10 secondes pour finir par 5 min à 2% de solvant B. De la
même façon que pour les précédentes chromatographies, l’élution des protéines est
suivie par absorbance à 280nm, 214nm et l’absorbance à 254 nm permet de vérifier
l’absence de contaminants (acides nucléiques).
d. Gel d’électrophorèse avec coloration au nitrate d’argent
Les protéines des fractions d’intérêts sont séparées sur un gel d’électrophorèse
dénaturant 4-12% ou 12 % (NuPage Novex Bis Tris Mini Gel ; Invitrogen) en tampon
de migration MES (50mM acide 2-(N-morpholino) éthane sulfonique, 50mM Tris,
0,1% SDS, 1mM EDTA, pH7.3, Invitrogen) afin de connaître leur complexité relative.
Healthcare) sont préparés dans le tampon LDS NuPAGE en présence de 50mM
DTT. Echantillons et marqueurs sont dénaturés par chauffage à 80°C pendant 10
min avant leur dépôt sur le gel. La migration a lieu pendant 1h à 200V. Après
migration les gels sont colorés au nitrate d’argent dans un protocole compatible avec
une caractérisation ultérieure par spectrométrie de masse. Ils sont rincés à l’eau
sous agitation 2 fois puis incubés 15 min avec une solution de fixation (éthanol 30%,
acide acétique glacial 10%, qsp H2O). Après 2 lavages sous agitation de 10 min avec
de l’éthanol 20%, les gels sont lavés une 3 ème et une 4ème fois avec de l’eau milliQ
sous agitation pendant 10 min. Ils sont ensuite incubés avec la solution de
sensibilisation (0,02% Na2S2O3) pendant une minute et rincés 2 fois une minute à
l’eau milliQ. Ils sont ensuite incubés 30 min avec la solution de coloration (0,1%
AgNO3). Après 2 rinçages de 1 min à l’eau milliQ, les gels sont incubés avec la
solution de développement (0,04% formaldéhyde, 2% NaCO2) pendant 30 secondes.
L’excédent de solution est éliminé. Lorsque le contraste souhaité est obtenu, les gels
sont incubés pendant 30 min dans une solution stop (5% d’acide acétique). Enfin ils
sont rincés 2 x 30 min à l’eau milliQ. Ils sont conservés dans l’eau milliQ pour une
analyse immédiate et dans 1% d’acide acétique pour stockage et analyse ultérieure.
102
e. Analyse par nano-LC-MS/MS OrbiTrap
i.
Digestion protéique
Après coloration au nitrate d’argent, les gels sont excisés autours des bandes
d’intérêt et sont coupés en morceaux de 1mm3. Les morceaux sont lavés deux fois 5
min par 40µl d'eau milliQ puis deux fois 5 min par 40µl d’ACN 100 %. Les morceaux
de gel sont séchés à l’incubateur à 37°C pendant 20min. Les protéines contenues
dans le gel sont ensuite réduites par une incubation de 15 minutes à 37°C en
présence de 40µl de DTT 65mM puis alkylées par incubation de 15 min à l’obscurité
en présence de 40µl d’iodoacétamide 135mM. Les morceaux de gel sont ensuite
lavés par 40 µl de solution de bicarbonate NH4HCO3 0.05 M, ACN 50 % pendant
5min puis 40 µl d’ACN 100 % jusqu’à déshydratation du gel. Le surnageant est
alors remplacé par 40 µl de NH4HCO3 0.1M pendant 5 min puis par 120 µl d’ACN
100 % pendant 10 min. Les morceaux de gel sont à nouveau déshydratés à 37 °C et
10 µl d’une solution de trypsine porcine (Proméga) à 7.1 ng/µl préparée dans le
NH4HCO3 0.05 M sont ajoutés. Après 15 min sur la glace, l’excédent de trypsine est
retiré et 30µl de NH4HCO3 50mM sont ajoutés; la digestion est poursuivie à 37 °C
pendant la nuit puis le digestat trypsique est mis de côté. Les peptides de digestion
sont ensuite extraits du gel après une incubation de 20 min à température ambiante
en présence de 40 µl d’une solution d’ACN 70 %, acide formique 0.1 %. Ce volume
est ajouté au surnageant précédent. Les bouts de gel sont ensuite recouverts de
20µl d'ACN 100 % et après 5 min on ajoute 40µl d’ACN 70 %, acide formique 0.1 %.
L'incubation est poursuivie 15 min à température ambiante. L'ensemble des
surnageants est réuni puis les échantillons sont ensuite amenés à un volume de 40
µl par évaporation au speed vac. Les fractions issues de l’HPLC2 sont lyophilisées
et reprises dans 50 µl de NH4HCO3 50mM pH8. Les protéines sont réduites en
présence de 7.2mM DTT 15 minutes à 37°C dans le même tampon puis sont ensuite
alkylées par une incubation de 15 min dans le noir en présence de 13,5 mM
d’iodoacétamide. Les protéines sont ensuite digérées la nuit en présence de 4ng/µl
de trypsine (Proméga).
103
ii.
Séparation par nano-HPLC
Les échantillons peptidiques, 10 µl de chaque digestat trypsique, sont
directement séparés par une nanoHPLC (nanoLC Ultimate 3000, Thermo-Scientific,
Dionex) couplée à un spectromètre de masse hybride LTQ-Orbitrap-XL (Thermo
Scientific). Les peptides sont préalablement concentrés sur une pré-colonne de type
C18 (C18 PepMap300, 5µm, 300 Å / 300µm i.d. x 5mm, Thermo Scientific-Dionex)
puis séparés sur une colonne de chromatographie liquide (C18 PepMap100, 3µm,
100 Å / 75µm i.d. x 150mm, Thermo Scientific-Dionex), avec un débit constant de
250 nL/min, et sont élués par un gradient d’ACN. Le gradient est composé d’un
solvant A correspondant à un mélange eau/acide formique (100/0,1 ; v/v) et d’un
solvant B correspondant à un mélange acétonitrile/acide formique (100/0,1 ; v/v) et
est constitué des étapes suivantes : Etape 1 : 0 – 60 min : 2% - 35% de B / Etape 2 :
60 – 85 min : 35% - 60% de B / Etape 3 : 85 – 105 min : 60% - 90% de B / Etape 4 :
105 – 120 min : 90% de B / Etape 5 : 120 – 125 min : 90% - 2% de B / Etape 6 : 125
– 140 min : 2% de B. Les peptides atteignent la source chacun leur tour et suivant un
ordre croissant d’hydrophobicité. Le voltage au niveau de la source d’ionisation est
suffisant pour induire le chargement des peptides et l’évaporation du solvant les
entourant. Ainsi seuls les peptides chargés pénètrent dans le spectromètre de
masse.
iii.
Méthode d'analyse MS/MS
L'acquisition des spectres de masse (scan MS) avec le système Orbitrap TM est
effectué avec une résolution de 60000 (à la masse 400 m/z). Les dix peptides les
plus intenses sont automatiquement sélectionnés (mode data dependant ou DDA)
pour une analyse en parallèle par CID (MS/MS, Collision-Induced Dissociation) dans
la trappe d'ions linéaire (LTQ). L'ionisation de type Electrospray (ESI) est réalisée
avec une tension de 1,5 kV dans la source nanoelectrospray (couplage direct
nanoLC/trappe d'ion). La température du tube de transfert d'ions est réglée à 200°C.
Un scan MS dans l'Orbitrap TM nécessite l'accumulation de 106 ions tandis que les
scans MS et MS/MS dans la trappe LTQ nécessite l'accumulation de 10000 ions. Le
seuil de déclenchement de la fragmentation MS/MS (LTQ) est fixé à 2000 (délai
d'activation de 30 ms), afin d'éviter une fragmentation trop précoce au cours de
104
l'élution des peptides. Les peptides sélectionnés sont exclus de manière dynamique
durant 60 s avec une tolérance de masse de ± 10 ppm. Les précurseurs
monochargés sont rejetés. Le temps d'analyse maximal est fixé à 500 ms et 300 ms
pour respectivement les scans MS et MS/MS. La chromatographie liquide ainsi que
le LTQ-OrbitrapTM sont paramétrables via l’ordinateur grâce aux logiciels Chromeleon
et Tune plus ed’ XCaliburTM (Thermo Scientific).
iv.
Méthode de traitement des données
A l’issu de l’analyse, un fichier par fraction ou par bande est généré sous
format de fichier (.raw) qui représente les données brutes, ou les spectres MS et
MS/MS obtenus, visualisable via le logiciel d’XCaliburTM. L'analyse des données a
été réalisée avec le logiciel Proteome Discoverer
TM
(version 1.2, Thermo Scientific)
supporté par le moteur de recherche Mascot (Matrixscience) et qui va permettre
d’interroger les bases de données et d’identifier les protéines à partir des données
brutes. Les spectres MS/MS sélectionnés sont donc confrontés aux spectres MS/MS
théoriques contenus dans la base de donnée SwissProt (version 2014_07, nombre
de résidus = 193948795, nombre de séquences = 545388) restreinte à la taxonomie
ou genre Homo Sapiens (nombre de séquences = 20265). Les tolérances de masse
en MS et MS/MS ont été fixées à 10 ppm et 0,5 Dalton respectivement, et le
traitement appliqué aux échantillons doit impérativement être renseigné, c’est-à-dire
une digestion à la trypsine, et l’existence de possibles modifications fixes
(Carbamidométhylation des cystéines) et variables (oxidation des méthionines et
acétylation des lysines). En outre, pour améliorer les résultats obtenus, Mascot
effectuera les recherches dans SwissProt et dans la base de données inversée
correspondante (Base de données « Decoy »). L’utilisation de cette base de données
inversée permet de déterminer le taux de faux positifs (FDR), qui a été ici fixé à 1%
maximum. Les peptides identifiés ont donc été filtrés en fonction de leur score
Mascot pour obtenir un taux de faux positifs inférieur à 1%. De plus, il n’est conservé
que les peptides de rang 1 ; ce qui signifie qu’un peptide unique ne peut être attribué
qu’à une seule protéine ; et les requêtes ont été réalisée avec la fonction « protein
grouping » qui signifie que l’on garde uniquement la protéine ayant le score le plus
élevé et le pourcentage de couverture de séquence le plus important parmi les
différents isoformes possibles pour une famille de protéines. Ainsi un tableau de
105
données d’identification est obtenu contenant plusieurs informations telles que le
numéro d’accession de la protéine, le nombre de peptides identifiés par protéine, le
pourcentage de couverture de la séquence, la masse, le pI, le score global de la
protéine...
f. Test d’activité biologique des fractions
Après passage à la trypsine, les cellules TZM-bl sont ensemencées sur une
plaque 96 puits à 9 000 cellules/puits dans 150 µl de milieu. Les PBMC stimulés à la
PHA et IL-2 sont ensemencés 2.106 cellules/ml dans des plaques 96 puits dans 100
µl de milieu ou des plaques 24 puits dans 500 µl de milieu. Le lendemain, les
fractions obtenues par HPLC sont décongelées. Le virus à une MOI de 0,01 est
mélangé ou non, volume à volume, avec les fractions pour une concentration finale
des fractions sur les cellules de 10 % et une concentration finale de virus de 2ng
p24/ml pour la souche SF162. Chaque condition est testée en triplicat. Après 3 h
d’infection à 37°C, l’inoculum est retiré et remplacé par du milieu frais. Pour les TZMbl, après 2 jours de culture, l’infection est évaluée par l’activité
β-galactosidase
mesurée grâce au kit « Gal-Screen System » (Applied Biosystem). Pour les PBMC,
après 3 jours de culture, les surnageants sont collectés et congelés pour un dosage
indirect de l’infection ultérieure des PBMC, évaluée via l’infection de TZM-bl par les
surnageants de PBMC. Les TZM-bl sont incubés pendant 3h en présence de
surnageant de PBMC (dilué au 10ème). Après 2 jours de culture, l’infection est
évaluée par mesure de l’activité β-galactosidase (kit « Gal-Screen System », Applied
Biosystem).
106
RESULTATS
107
Chapitre I
Effet du sperme d’hommes infectés par le
VIH-1 sur l’infection des cellules T
CD4+ : différences avec le sperme
d’hommes non infectés
108
Chapitre I : Effet du sperme d’hommes infectés par le VIH-1 sur
l’infection des cellules T CD4+ : différences avec le sperme
d’hommes non infectés Synthèse de l’article
Synthèse de l’article
OBJECTIFS ET METHODOLOGIE
Dans cette étude, nous avons comparé, pour la première fois à notre
connaissance, l’effet du LS d’hommes infectés versus celui d’hommes sains sur
l’infectivité par le VIH-1 dans des modèles cellulaires.
Les LS ont été obtenus auprès du CECOS de Rennes (collaboration avec le Pr
D Le Lannou) pour la mise au point à partir de LS de donneurs VIH-, et du CECOS
de Toulouse (collaboration avec le Pr L Bujan) (16 témoins VIH- et 20 patients VIH+
non traités avec une charge séminale et sanguine positive).
Les LS ont été testés, individuellement ou proviennent d’un pool de plusieurs
donneurs, dans la préparation de l’inoculum pour l’infection par le VIH-1 de PBMC et
d’une lignée de cellules CD4+ (TZM-bl).
L’infection et la production virale ont été évaluées par plusieurs techniques
complémentaires : dosage de la protéine virale p24 dans les surnageants de culture
des cellules infectées et quantification de l’ADN et de l’ARN viral par qPCR et
RTqPCR. La cytotoxicité a été évaluée par des tests métaboliques et cytométrie de
flux. Parallèlement, le taux de 46 cytokines, chimiokines, facteurs de croissance,
PGE2 et d’autres facteurs déjà connus pour faciliter l’infection (SEVI, fragments de
séménogélines SEM1 et SEM2), a été estimé par dosage Luminex ou ELISA. De
plus, une analyse en cytométrie de flux des PBMC infectés en présence de LS
d’hommes VIH+ (n=10) versus sains (n=5 à 10) a été effectuée. Nous nous sommes
intéressés plus particulièrement à l’expression des récepteurs CD4, CXCR4 et CCR5
à la surface des lymphocytes T CD4+ ainsi qu’à l’activation et la prolifération des
lymphocytes T CD4+.
109
RESULTATS ET DISCUSSION
Nos résultats montrent que dans des conditions non cytotoxiques, le LS
d’hommes non infectés (LS VIH-) a un effet stimulateur dose-dépendant modéré sur
l’infection des cellules TZM-bl et sur les LT CD4+ par le VIH-1 de souche R5. Un
effet stimulateur significativement moins important sur l’infection des LT CD4+ est
observé pour le LS d’hommes infectés
(LS VIH+),
alors qu’il n’est pas
significativement différent en ce qui concerne l’infection des cellules TZM-bl.
L’activité stimulatrice sur l’infection des TZM-bl en présence du LS VIH- corrèle
avec la concentration des peptides SEVI, SEM1 et SEM2 connus pour former des
fibrilles amyloïdes capables de promouvoir la capture du virion et son attachement
aux cellules cibles sans interaction avec les récepteurs et corécepteurs du VIH
(Munch et al. 2007; Roan et al. 2009; Roan et al. 2011). Au contraire, aucune
corrélation n’est observée pour le LS VIH+.
L’effet différentiel observé entre les LS VIH- et VIH+ sur l’infection des LT CD4+
par une souche R5 de VIH-1 suggère l’implication de facteurs immunorégulateurs.
Nous avons donc évalué les concentrations des 46 cytokines et d’une
prostaglandine, PGE2 et nous avons observé une augmentation significative de 5
cytokines (RANTES, TNFα, IL-1β, IL-1ra et IL-15) dans les LS VIH+ en comparaison
avec les LS VIH-. L’augmentation la plus marquée est celle de RANTES, ligand de
CCR5, ce qui vient conforter les résultats de deux études précédentes (Storey et al.
1999; Lisco et al. 2011). De plus, la concentration de RANTES est négativement
corrélée avec le niveau d’infection par le VIH-1 des LT CD4+.
Suite à l’analyse de l’expression de récepteurs CD4, CXCR4 et CCR5, la seule
différence d’effet entre les LS VIH- et les LS VIH+ se situe au niveau de l’expression
du corécepteur CCR5. On observe une diminution rapide et significative de
l’expression de CCR5 6h après exposition au LS d’homme VIH+ en comparaison au
LS d’hommes VIH-. L’absence de modification des taux d’ARNm de CCR5 après
exposition au LS suggère que cette modification d’expression est liée à des
mécanismes de transport cellulaire. De plus, l’expression du corécepteur CCR5 est
positivement corrélée à l’infection par le VIH-1 des LT CD4+ et négativement
corrélée aux concentrations des ligands de CCR5 dans le sperme (RANTES, MIP1α, MIP-1β). Les résultats d’infection des PBMC par une souche X4 de VIH-1 ne
110
montrant pas de différence d’effet entre les LS VIH- et les LS VIH+, renforcent notre
hypothèse selon laquelle la diminution de l’expression de CCR5 à la surface des LT
CD4+, probablement liée au concentration de ligand de CCR5 dans les LS, est le
principal facteur responsable de l’effet différentiel des LS VIH+ vs LS VIH-.
Ces résultats amènent à discussion sur le rôle potentiel du LS dans la
transmission du VIH-1. En comparant nos résultats à ceux d’autres études, il
apparaît que la durée d’exposition au LS peut conduire à des résultats opposés : un
effet stimulateur du LS étant observé après un temps d’exposition au LS court
(Munch et al. 2007; Roan et al. 2009) et un effet inhibiteur étant lié à un temps
d’exposition long (O'Connor et al. 1995; Martellini et al. 2009). De plus, d’autres
études ont cherché à caractériser le rôle du LS dans la transmission par le VIH-1.
Sabatté et al. ont montré que le LS inhibait la capture des virions par les cellules
dendritiques (Sabatte et al. 2007; Sabatte et al. 2011) via la liaison de DC-SIGN à
certains de ces ligands : la mucine-6 et/ou la clusterine (Stax et al. 2009; Sabatte et
al. 2011). Une augmentation de l’attachement des virions aux cellules épithéliales et
la modification des sécrétions de ces dernières conduisant au recrutement des
cellules cibles après exposition au LS a également été montrée (Doncel et al. 2010).
In vivo, le LS n’aurait que peu d’impact sur la transmission du SIV bien qu’il
augmenterait le taux de transmission en présence de faible dose de virus (Miller et
al. 1994; Neildez et al. 1998; Munch et al. 2013).
CONCLUSION
Ces résultats soulignent la complexité de l’effet du LS dans la transmission par
le VIH-1 et l’importance de définir des conditions expérimentales au plus proche de la
situation physiologique (cellules cibles, statut virologique des donneurs de sperme,
temps d’exposition). Nous avons pu montrer un effet différentiel du LS VIH+ sur
l’infection des LT CD4+ par rapport au LS VIH- pouvant résulter d’une surexpression
de certaines cytokines dont RANTES et d’une sous expression à la membrane du
corécepteur CCR5.
111
Effect of semen from HIV-infected and uninfected men on CD4+T cell
infection
Céline Camus1, Olivier Bourry1, Dominique Mahé1, Louis Bujan2, Christophe
Pasquier3, Célia Ravel4, Onofrio Zirafi5, Jan Munch5, Nadia R. Roan6, Charles
Pineau1, Nathalie Dejucq-Rainsford1
1
INSERM U1085-IRSET, Rennes University, France; 2CECOS Midi-Pyrénées,
Universitary Hospital of Toulouse and University of Toulouse; UPS; Groupe de
recherche en Fertilité Humaine (EA 3694, Human Fertility Research Group)
Toulouse, France; 3Virology laboratory Universitary Hospital of Toulouse; 4Service de
biologie de la reproduction, Hôpital Sud, Rennes, France; 5Institute of Molecular
Virology, Ulm University, Germany; 6Gladstone Institute of Virology and Immunology,
San Francisco, USA.
Introduction
Semen represents the main vector of HIV transmission worldwide (Hladik and
McElrath 2008). Indeed, most of the over 2 million of new infections per year are due
to genital or rectal exposure to semen of HIV-positive men during unprotected sexual
intercourse (ONUSIDA 2013). The development of effective strategies to prevent the
dissemination of HIV by unprotected sexual intercourse requires a better
understanding in the earliest events of HIV transmission, especially the role of
semen. Semen is composed of cells in a complex biological fluid called the seminal
fluid (SF), which is produced mainly by the seminal vesicles and the prostate, and to
a lesser extent, by the epididymides, the testes and the bulbourethral glands. This
fluid comprises many proteins (>2500 identified to date) (Rolland et al. 2012)
(Rodriguez-Martinez et al. 2011) as well as lipids, carbohydrates and inorganic
constituents. SF plays important immunomodulatory and antimicrobial roles
(Southern). Several studies have recently shown that, in addition of being a carrier of
HIV particles and infected cells, SF could modulate the efficiency of HIV infection of
target cells through its intrinsic properties (Munch et al. 2007; Sabatte et al. 2007;
Martellini et al. 2009; Balandya et al. 2010; Kim et al. 2010; Roan et al. 2011; Sabatte
et al. 2011). However, contradictory effects of SF were described (either inhibitory or
stimulatory), depending not only on the target cell type studied (e.g. dendritic cells,
cell lines or PBMC), but also on the authors for the same target cell type (Munch et
al. 2007; Sabatte et al. 2007; Martellini et al. 2009; Balandya et al. 2010; Kim et al.
112
2010; Roan et al. 2011; Sabatte et al. 2011). Of note is that primary CD4+ T cells,
which are considered the main gate for HIV infection of the new host, have received
little attention. In addition, a major drawback of these studies is that they were all
performed with SF from uninfected donors. The composition of SF from HIV-infected
men significantly differs from that of HIV-infected men, as demonstrated by studies
on SF cytokines content (Anderson et al. 1998; Anderson et al. 2010; Lisco et al.
2011; Kafka et al. 2012; Liu et al. 2014), and microbiome (Liu et al. 2014). In
addition, we showed that semen-producing organs (e.g. seminal vesicles and
prostate) are infected by HIV/ SIV and display inflammatory infiltrates (Roulet et al.
2006b; Le Tortorec et al. 2008a; Le Tortorec et al. 2008b; Deleage et al. 2011),
which most probably influences their seminal secretions. As a matter of fact, the
volume of the ejaculate of HIV+ donors is generally less than that of uninfected men
(Bujan et al. 2007). All these elements indicate that HIV infection triggers significant
modifications of SF.
CD4+T cells have been pointed as the predominant target cell type for HIV infection
at the mucosal invasion sites (Hladik et al. 2007; Saba et al. 2010). These cells are
present both underneath the epithelial cell barriers and within stratified squamous
epithelia (e.g. vagina and exocervix) (Shen et al. 2010; Haase). Breaches in
epithelium monolayers, such as that of the rectum, are frequent, bringing HIV target
cells located beyond the epithelium barrier in direct contact with semen (Haase
2011).
In this context, we sought to compare the effect of SF from HIV-infected men
(HIV+SF) versus SF from uninfected donors (SF) on HIV infectivity of CD4+ T cells.
We observed a significantly reduced infection of CD4+T cells by HIV-1 R5 in
presence of HIV+SF as compared with SF, the latter displaying enhancing activity.
This differential effect was not observed on the infectivity of the CD4+ cell line TZMbl, or on PBMC infection by HIV-1 X4. We compared the composition of HIV+SF
versus SF in terms of enhancing peptides, cytokines and prostaglandins, and
investigated the impact of SF from both HIV-infected and uninfected men on CD4+T
cell HIV receptors expression, activation and proliferation. HIV+SF vs HIV-SF was
found to induce a significantly higher downmodulation of CCR5 expression shortly
after exposure, which correlated with the concentrations of CCR5 ligands in semen.
113
Methods
Semen collection and seminal plasma preparation
Semen was collected from 16 HIV-uninfected and 20 HIV-infected men who gave
voluntary consent for semen donation within the frame of the research protocol
authorized by the AFSSAPS (n°B90850-30). Individual semen samples were
collected after a clinical examination and a research questionnaire for infertility and
uro-genital infections risk factors performed by CECOS (Center for study and
conservation of human eggs and sperm, Toulouse and Rennes, France). Patients
were asked to refrain from ejaculation for 3 days and semen was obtained using
masturbation without lubricants. Ejaculates were liquefied for 30 min at 37°C. They
were centrifuged 10mn at 1 000g at room temperature (unless otherwise specified)
and the supernatant (SF) stored at -80°C.
HIV-1 variants and virus stocks
HIV-1 clade B R5 SF162, X4 IIIB strain and primary isolate (HIV-1 ES P2149-3 (B),
ARP113) were obtained from the NIBSC Centralised Facility for AIDS Reagents.
Viruses were grown in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated by
phytohemagglutinin (PHA, 3µg/ml – Sigma Aldrich, Saint-Louis, USa) and human
recombinant interleukin-2 (IL-2, 5ng/ml - Roche Applied Science, Bale, Swiss) to
provide viral stocks. The culture supernatants were ultracentrifuged for one hour at
100 000g on a 20% sucrose pillow.
The resulting virus stocks were titrated on
PBMCs by using the 50% infectivity end-point method (TCID50) of Reed and Muench
(Brown 1964) and by measuring p24 concentrations. Virus stocks were stored in
aliquot at -80°C.
114
Cell culture
TZM-bl cells are a stable line of Hela-derived epithelia which express HIV Tatregulated reporter genes b-gal and luciferase and neutralize virus after single round
infections. TZM-bl cells were grown in DMEM medium supplemented with 100U/ml
penicillin, 100µg/ml streptomycin, 2mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine
serum. Human PBMCs were obtained by ficoll density centrifugation. PBMCs were
cultured in RPMI medium supplemented with 100U/ml penicillin, 100µg/ml
streptomycin, 2mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum. PBMCs were
activated with PHA (3µg/ml) for 72h and subsequently with IL-2 (5ng/ml) for 24h
before infection. Within the PBMC population, CD4+ cells were essentially CD3+ T
lymphocytes (>98%), as determined by flow cytometry analysis. About 70% of
PBMCs were CD3+ T cells, of which about half were CD4+. CD4+ T cells were
purified from PHA-stimulated PBMC by negative selection (Dynabeads Untouched
Human CD4, Life technologie, Carlsbad, USA). 97% of the resulting cell population
was CD3+CD4+ T lymphocytes, which undergo IL-2 stimulation for 24h before
infection.
Effect of semen and SF on HIV-1 infection of TZM-bl cells
9.103 cells were seeded in 96-well plates in 150µl of medium. The following days,
sample of semen or SF and aliquot of virus stock were defrosted and diluted. R5 HIV1 was mixed or not with serial dilutions of semen or SF to obtain semen or SF
concentration of 10%, 2% or 0.4% (final concentrations on the cells of 1%, 0.2% and
0.04%) and final virus concentration of 2ng p24/ml. Each condition was tested in
triplicate. Inoculums were removed after 3h of exposure (or 24h, see supplementary
data). After two days, infection was evaluated by measuring β-galactosidase activitiy
as per the manufacturer’s instruction using the Gal-Screen System (Applied
Biosystem, Foster City, CA). For SF from infected men, the highest SF dilution (1%
final) was incubated on the cells for 3h in the absence of added HIV-1 R5 strain to
check for infection of TZM-bl by the semen sample. Infection of TZM-bl was never
detected for any of the infected semen samples in the absence of added virus.
115
Effect of semen or SF on HIV infection of PBMCs
PBMCs previously stimulated with PHA and IL-2 were seeded at 2.106/ml of medium
in 96 or 24-well plates. HIV-1 SF162 or IIIB strains at a MOI of 0.01 (corresponding to
respectively 2 ng/ml or 5 ng/ml p24) were mixed or not with serial dilutions of semen
or SF to obtain final semen or SF concentration on the cells of 1%, 0.2% or 0.04%.
Each condition was tested in triplicate. Inoculums were removed after 3h of exposure
(or 24h, see supplementary data). After three days of culture, supernatants were
collected and frozen for p24 viral protein assay which was performed using the
Innotest HIV Antigen mAb (Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium). For semen from
infected men, the highest semen dilution (1% final) was incubated on the cells for 3h
in the absence of added HIV-1 R5 strain to check for PBMC infection by the semen
sample. Infection of PBMCs was never detected for any of the infected semen
samples in the absence of added virus.
Cell Viability
The number of viable TZM-bl and PBMCs in culture was evaluated as per the
manufacturer's instruction using the highly sensitive CellTiter-Glo Luminescent Cell
Viability Assay (Promega, Madison, USA), which measures the amount of ATP within
viable cells. Loss of membrane integrity triggers a precipitously fall of ATP levels
within minutes. Viability was also assessed using the amine-reactive red dye
(Live/dead Fixable dead cell stain kit, Life Technologies, Carlsbad, USA). Acquisition
was performed with a FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes,
USA) and CELLQuestPro Software was used for analysis. The cell surface
expression levels in the flow cytometry profiles are expressed as percent of stained
cells.
Measurement of cytokines in SF
The concentrations of 46 cytokines were analyzed in SF from 10 healthy donors and
18 HIV-infected men using the Bio-Plex Pro assay (Bio-Plex Pro Human Cytokine
Group I [27-plex] and Group II [21-plex] panels; Bio-Rad, Hercules, USA). Total and
active TGF-β levels in SF were determined using the Quantikine human TGF-β kits
(R&D Systems, Minneapolis, USA).
116
Measurement of PGE2 in SF
PGE2 levels in SP were determined using the Prostaglandin E2 EIA kits (Cayman
Chemical Company, Ann Arbor, USA).
Assessment of CD4+T cell HIV receptor expression, activation and proliferation
For surface marker analysis, PBMCs were cultured and treated as previously above.
Cells were stained at 6 hours, 24 hours and 48 hours post-infection using
fluorescently conjugated monoclonal antibodies to CD3-PerCP (clone SP34-2), CD4FITC (clone RPA-T4) or CD8-FITC (clone RPA-T8), in combination with either CCR5PE (clone 3A9), CXCR4-PE (clone 12G5), or the activation marker CD69-PE (clone
FN50), all from BD Biosciences (Franklin Lakes, USA). Corresponding fluorescent
isotype controls were used at the same concentrations as the reference antibody.
Cells were stained with antibodies by incubation for 30min at 4°C, washed in PBS1% FCS and fixed in 1.5% paraformaldehyde.. Proliferation assays were performed
using the Click-iT EdU Flow Cytometry Assay kit (Life Technologies, Carlsbad, USA).
Briefly, PBMCs were infected and treated with SF as described above in the
presence of 10µM of 5-ethyl-2’ –deoxyuridine (EdU). Cells were fixed, permeabilized
in 1x Click-iT saponin-based permeabilization reagent, and stained for EdU content
using alexa-488 conjugated azide before membrane staining with fluorescently
conjugated CD3-PerCP and CD4-FITC. Acquisition was performed with a
FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) and
CELLQuestPro Software was used for analysis. The cell surface expression levels in
the flow cytometry profiles are expressed as percent of stained cells or as the mean
fluorescence intensity (MFI) indices.
117
SEVI ELISA
96 well EIA/RIA plates (Corning Incorporated, Corning, USA) were coated with 100 μl
dilutions of antigen or 100-fold dilutions of SF in PBS over night at 4°C. The next day,
plates were rinsed twice in wash buffer (imidazolebuffered Saline with Tween 20;
KPL), blocked for 2 hrs with 100 μl 1 × Roti®-Block solution (Roth) and rinsed again
5 times. Thereafter, 100 μl of 50-fold dilutions of pre-immune sera or antisera derived
from SEVI amyloid immunized New Zealand White female rabbits (d28; Pocono
Rabbit Farms) or guinea pigs (S3; IPF-Pharmaceuticals) were added, and then plates
were incubated for 1 hr and rinsed 5 times. Finally, 100μl of 10,000 fold dilutions of
HRP-coupled anti-rabbit (PerkinElmer, Waltham, USA) or antiguinea- pig antibodies
(Abcam, Cambridge, United Kingdom) were added, samples were incubated for 30
min, washed 5 times, and incubated with 100 μl HRP substrate (SureBlue™, KPL).
Reactions were stopped by adding 100 μl 1 N HCl and OD was read at 450/650 nm.
Semenogelin ELISA
Immunolon II plates (Fisher, Waltham, MA) were coated for 12–18 hours at 4°C with
1% semen or the indicated concentration of antigen diluted in PBS. Next, wells were
blocked for 2 hours at room temperature with 1% BSA diluted in PBS. Wells were
then incubated with sera (diluted in 1% BSA / PBS) for 1 hour at room temperature.
After washing, wells were incubated with HRP-conjugated secondary antibody (GE
Healthcare, South San Francisco, CA) diluted in PBS / 1% BSA. After a second
wash, TMB substrate (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) was added and the reaction was
stopped
with
2M
H2SO4.
OD
at
450/650nm
was
monitored
using
a
spectrophotometer. Antibodies against SEM 1(49–107), and SEM 2(49–107) were
custom-produced by Pocono Rabbit Farms (Canadensis, PA).
118
Measurement of HIV-1 DNA using TaqMan Real-Time PCR
PBMCs were infected with HIV-1 R5 SF162 in presence of 1% SF (final
concentration on cells) and cultured as described above. PBMCs infected in
presence of Nevirapine (37.5µM) were used as negative control. PBMCs were
washed and centrifuged at different time points post-infection. Cell pellets were lysed
with a proteinase K lysis buffer overnight at 55°C. Proteinase K
was then heat
inactivated at 100°C for 10 mn. Quantitative real- time PCR for HIV-1 LTR DNA and
albumin gene used as a reference was performed as we previously described (Roulet
et al. 2006a).
Real-Time Quantitative RT-PCR
PBMCs were infected with HIV-1 R5 SF162 in presence of 1% SF (final
concentration on cells) and cultured as described above. At different time points postinfection, total RNA was extracted using the RNeasy isolation kit (Quiagen SA,
Courteboeuf, France) and depleted of contaminating DNA via DNase treatment
(Quiagen SA, Courteboeuf, France). cDNA was generated from total RNA using MMLV reverse transcriptase (SuperScript II, Life technologies, Carlsbad, USA). PCR
was performed on 100 ng equivalent RNA with the ABI 7500 Fast Real-Time PCR
system (Applied Biosystems, inc, Foster City, CA) using commercially available
master mix and target probes (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA):
Hs00152917_m1 (CCR5) and the following primers for gag RNA: sHIV-1306 (5'TCAGCATTATCAGAAGGAGCCACC-3’),
aHIV-1541
(5'-
TCATCCATCCTATTTGTTCCTGAAG-3’) (Houzet et al. 2007). The relative gene
expression was normalized to GAPDH expression and calculated using the
comparative Ct method, as previously described (Livak and Schmittgen 2001).
119
Statistical analyses
All data were analyzed with the non-parametric Wilcoxon-Mann-Withney test.
Significant differences are indicated as follows : * p< 0,05 ; ** p< 0,01 ; *** p< 0,001
compared with virus alone ; ° p< 0,05 ; °° p< 0,01 ; °°° p < 0,001 compared between
HIV- and HIV+ donors.
Correlations were calculated using Spearman test. Statistical analyses were
performed using commercially available software (GraphPadPrism 6, GraphPad
Software, Inc).
120
Results
Determination of the experimental conditions for analyzing the effect of SF on
HIV infection in vitro
We first aimed at understanding the divergent results reported in the literature on the
effect of SF from uninfected men on CD4+T cell infection. Thus, depending on the
authors, SF was shown to display either enhancing (Munch et al. 2007; Kim et al.
2010; Roan et al. 2011) or inhibitory effects (Martellini et al. 2009; Balandya et al.
2010) on HIV infection of CD4+ T lymphocytes and TZM-bl. There may be two main
reasons for these discrepancies: (i) the design of the infectivity assay; (ii) the
treatment of semen after collection, which both differed amongst those studies.
We found that in presence of low dose of HIV-1 R5 (2 ng/ml of p24 in the inoculum,
MOI of 0.01 on PBMCs), short exposure (3h) of target cells to SF at a final dilution of
1% or less have a dose dependent enhancing effect on HIV-1 infection of both
CD4+T cells and TZM-bl (Fig. S1 A and B), in agreement with the findings from
(Munch et al. 2007; Kim et al. 2010; Roan et al. 2011). This enhancing effect was
reproducibly observed for up to three different pools of SF obtained from healthy
donors (20 to 50 donors in each pool), as well as for SF from up to 16 healthy donors
tested individually. Although as previously described (Kim et al. 2010), there were
some variations in the intensity of the enhancing effect depending on the donors,
there was no significant difference in the median fold infectivity increase on either
CD4+T cells or TZM-bl exposed to SF from 16 uninfected individuals tested
individually as compared to different pools of SF (Fig. S1 A and B). Therefore the
median modulating effect of the semen samples from the 16 uninfected donors
further tested in this study appeared representative of that of larger cohorts of
uninfected semen donors (Fig. S1 A & B). Using the same assay, the enhancing
effect of seminal fluid was lost when higher doses of virus were used (≥10 ng/ml
p24), in agreement with Munch et al (data not shown). Our experiments showed that
a longer incubation time (24h) of a low virus dose (2ng/ml) together with seminal fluid
at the same dilutions as above (maximum 1% final) induced an inhibitory effect on
CD4+ T cells infectivity, whereas a significant enhancing effect was maintained on
TZM-bl infectivity (Fig. S2 A). The inhibitory effect observed on CD4+ T cells was
positively correlated with a decrease in cell viability, as measured using a sensitive
121
ATP assay (Fig. S2 B). These results are in agreement with the previously reported
cytotoxic effect on PBMCs of prolonged exposure (>3h) of SF, even when highly
diluted (Allen and Roberts 1986; Fiore et al. 1997; Okamoto et al. 2002; Munch et al.
2007; Kim et al. 2010).
As a second step, we studied the impact of different semen treatments as various
protocols had been described amongst studies with divergent results (Munch et al.
2007). We analyzed the impact of: (i) the duration of the liquefaction step of semen
after collection (0, 30 min, 5h); (ii) the speed and duration of semen centrifugation to
obtain SF (1000g for 10 min or 20 000g for 30 min) and the absence of this
centrifugation step (whole semen instead of SF); (iii) the use of fresh semen versus 80°C frozen semen. Whereas a stronger enhancing effect on TZM-bl HIV R5
infection was observed when semen was left to liquefy for 5h as compared with 30
min of liquefaction or absence of liquefaction step (Fig. S3), the centrifugation
conditions and use of fresh or -80°C frozen whole semen had no impact on the
enhancing effect of semen on TZM-bl or PBMCs (Fig. S4).
In view of these results and based on physiological considerations, we chose for our
subsequent experiments to: - perform a liquefaction step of 30 min after semen
collection, which reflects the duration for semen coagulum disruption by prostaticspecific antigen (PSA) after semen is released into the recipient (Southern 2013); perform a minimal centrifugation of semen at 1000g for 10 min to eliminate cellular
components; - perform HIV infectivity assays of both TZM-bl and PBMCs in presence
of a maximal final concentration of LS of 1% to avoid toxic effect and for a short
duration (3h). Indeed, cell-free virus was shown in macaques to infect cervicovaginal
and rectal target cells within 1 to 4h post- exposure (Hu et al. 2000; Ribeiro Dos
Santos et al. 2011) and SF is rapidly drained from the recipient (Fox et al. 1973;
Louissaint et al. 2012a). Thus the most relevant time window for the study of SF
impact on HIV transmission appears to be during the few hours following the
intercourse.
122
Effect of HIV+SF on PBMC, purified CD4+ T cell and TZM-bl infection by HIV-1
R5
We tested the impact of SF from uninfected versus seropositive donors on the
infection of PBMC and CD4+ T cell by an HIV-1 R5 strain, R5 strains being
preferentially sexually transmitted over X4 strains. SFs collected from 20 therapynaive HIV-infected donors and SFs from up to 16 uninfected men were analyzed
individually in a minimum of three independent experiments.
The clinical characteristics of the HIV-infected donors are indicated in Table 1. The
median CD4+ T cell count of this cohort was 522 cells/mm 3 (range 227 – 975). HIV-1
RNA was detected in the blood plasma from all patients with a median load of 4,78
log10 copies/ml (range 2,58 –6,31). A positive seminal viral load was detected at the
time of collection in 17/20 patients, with a median load of 4,37 log10 copies/ml (range
2,61 –6,54). Within the HIV-infected group, a positive correlation was observed
between blood and seminal viral loads (Spearman test, r=0.657, p=0.003).
HIV+ SF displayed a significantly reduced enhancing effect on PBMC infection by
HIV-1 R5, as measured by p24 assay 72h post-infection, when compared with SF
(median in three independent experiments of 1.7 to 2.9 fold for 1% SF, donor range
0.98 to 6.92 fold vs median 1.5 to 1.54 fold for 1% HIV+SF, donor range 0.4 to 2.8
fold), with a subset of HIV+SF samples exhibiting a slight inhibitory activity (Fig. 1A).
In agreement with p24 assay, the level of HIV gag RNA within PBMCs exposed to SF
was significantly higher than that in PBMCs exposed to HIV+SF or to virus alone
(Fig. 1B). Quantification of HIV DNA revealed a lower number of HIV DNA copies in
PBMCs exposed to HIV+SF versus SF from 24h post-exposure onwards (Fig. 1C).
No correlation was found between semen or blood VL of the donors and the level of
PBMC infection following HIV+SF exposure measured either by p24 assay, vRNA or
vDNA levels (Spearman test). To assess whether SF had a direct effect on HIV target
cells within PBMC (i.e. CD4+T cells), we infected purified CD4+ T cells with or
without HIV+SF and SF. Similarly to what was observed in PBMCs, HIV+SF had a
significantly reduced enhancing effect on CD4+T cell infection by HIV-1 R5 (Fig. S5).
Interestingly, the recurrent significant differential effect of SF vs HIV+SF on HIV
infection of PBMC or purified CD4+ T cells was not observed when using TZM-bl as
123
target cells (Fig. 1D): SF from both HIV-infected and non-infected men consistently
triggered a dose-dependent enhancing effect of TZM-bl infection (Fig. 1D) with no
significant differences between semen donor status, although a slightly lower level of
infection was observed for (median enhancement in three independent experiments
3.3 to 7.1 fold for 1% SF, donor range 1.9 to 10 fold versus median 3.3 to 4.8 fold for
1% HIV+SF, donor range 0.6 to to 11.3 fold).
To assess whether HIV+SF had a negative impact on PBMC viability, a sensitive
assay measuring the ATP level of the cells was used. No differences in cell viability
were observed between PBMCs or purified CD4+ T cells exposed or not to HIV+SF
or SF at the end of the 72h culture (Fig. 1A and S5). In addition, the viability of CD4+
T cells was assessed at different time points (24, 48 and 72h) using flow cytometry.
No differences in cell viability were observed between cells exposed to virus alone
and cells exposed to virus together with HIV+SF or SF at any time point (Fig. 2).
Levels of seminal enhancing peptides (SEVI, SEM1 and SEM2) in HIV+SF
The enhancing properties of semen on HIV infectivity have been attributed to seminal
amyloid fibrils resulting from the natural proteolytic cleavage in ejaculated semen of
the prostatic acidic phosphatase PAP (leading to a peptide called SEVI for Semenderived Enhancer of Virus Infection) (Munch et al. 2007) and of seminogelins 1
(SEM1) and 2 (SEM2) (Roan et al. 2011). These amyloid fibrils have been shown to
promote the attachment of HIV to target cells. The median level of SEVI was not
significantly different between HIV+SF and SF (Fig. 3A), whereas a slightly higher
level of SEM1 and SEM2 fragments was observed in HIV+SF compared with SF (Fig.
3 B, C). These results indicate that the lower level of PBMC infection observed with
HIV+SF compared to SF was not associated with lower concentrations of either
SEVI, SEM1 or SEM2 in semen. Positive correlations were observed between SEVI,
SEM1 or SEM2 levels and the magnitude of infection of TZM-bl exposed to SF but
not to HIV+SF (Table 2). In contrast, there were no consistent correlations between
PBMC or purified CD4+T cells infection levels post exposure to SF or HIV+SF and
the seminal concentrations of those enhancing peptides.
124
Levels of cytokines, chemokines, growth factors and prostaglandin in HIV+SF
and SF
We investigated whether differences in expression levels of immunomodulatory
cytokines between HIV+SF and SF may explain their specific differential effect on
PBMC infection. Using Luminex and ELISAs, the concentrations of 46 cytokines,
chemokines and growth factors were measured, together with that of the main
immunosuppressive seminal prostaglandin, PGE2 (Table S1).
We found a moderate but significant increase in the median concentrations of 5
cytokines in the SF from HIV-infected men: RANTES (1.9 fold), TNFα (1.3 fold), IL-1β
(1.3 fold), IL-1ra (1.2 fold) and IL-15 (1.2 fold) (Table S1 and Fig. 4). A positive
correlation was observed between the levels of those cytokines (apart from IL-1ra)
and the seminal viral loads (Table 2), as similarly reported for IL-1b in two cohorts
(Berlier et al. 2006b; Liu et al. 2014) and for TNFα in another cohort (Olivier et al.
2014).
Statistically significant correlations were found between different cytokines in SF from
HIV- men (Fig. S6). In contrast, much fewer of these correlations were observed in
SF from infected men. This confirms previous findings (Lisco et al. 2011; Olivier et al.
2014) indicating that HIV infection deregulates cytokines network in semen.
RANTES was the only cytokine for which a consistent (negative) correlation was
observed between its concentrations in semen and the magnitude of PBMC or
purified CD4+T cell infection (Spearman test, r= -0.564, p= 0.031) (Fig.4).
Effect of HIV+SF vs SF on CD4+T cell HIV receptor expression, activation and
proliferation
We next analyzed the effect of HIV+SF versus SF on CD4+T cell receptor
expression, proliferation and activation. Compared with cells not exposed to SF, CD4
expression on CD3+T cell surface was slightly but significantly decreased at 6, 24
and 48h post exposure to either SF or HIV+SF, as reflected by lower MFI (Fig. 5A)
and percentage of positive cells (data not show). No differential effect of HIV+ SF
versus SF on CD4 membrane expression was ever observed at any time point. In
125
contrast, the number of CD4+ T cells expressing detectable levels of CCR5 at their
surface was significantly and systematically reduced 6h post-exposure to HIV+SF
compared with virus alone, and significantly further reduced when compared with SF
(Fig. 5B). CCR5 membrane expression was on the opposite similarly elevated at 24
and 48h post exposure to SF or HIV+SF (Fig. 5B and D). No significant changes in
CCR5 mRNA copy number were observed at anytime points tested, indicating posttranscriptional modulation of CCR5 surface expression by SF (Fig. 5C). No
correlations were found between CCR5 expression level and the individual
concentrations in semen of CCR5 ligands RANTES, MIP1α and MIP1β. However,
when adding the concentrations of these three CCR5 ligands, a negative correlation
was observed (Spearman test, r=-0,596 p=0,0115). CXCR4 expression on CD4+T
cells was unchanged at 6h and significantly increased at 24 and 48h following SF
exposure (Fig. 5E). A positive correlation with PGE2, known to upregulate CXCR4
(Obermajer et al.; Salcedo et al. 2003) was observed (p<0.001, r=0.68).
Exposure of PBMCs to HIV+SF or SF decreased the expression of the activation
marker CD69 on CD4+ T cells as early as 6h post exposure (Fig. 6A), and decreased
CD4+ T cell proliferation at 24h (Fig. 6B). No differential effect of HIV+SF vs SF was
observed on either T cell activation or proliferation.
In summary, the only difference found on CD4+T cells exposed to HIV+SF versus SF
was the percentage of CCR5+ cells at 6h. The percentage of CCR5+ cells at 6h
positively correlated with the magnitude of PBMC or purified CD4+ T cell infection
following 1% SF of HIV+SF exposure (Spearman test, r=0,622 ; p=0,0167) and
negatively correlated with the seminal concentrations of CCR5 ligands (Spearman
test, r=-0,596 p=0,0115) (Fig. S7).
Effect of HIV+ SF on PBMC and TZM-bl infection by HIV-1 X4
To assess whether the lower percentage of CCR5+ cells observed at 6h post
exposure to HIV+SF as compared with SF or virus alone may be responsible for the
lower level of PBMC infection, we analyzed the impact of HIV+SF on HIV-1 X4
infection. As shown Fig.7, SF and HIV+SF had similar enhancing effect on both
PBMC and TZM-bl infection by HIV-1 X4 (Fig. 7).
126
Discussion
Understanding the role played by the intrinsic properties of semen in HIV
transmission is crucial to the design of effective prevention strategies. There have
been several conflicting reports on the modulating role of seminal fluid on HIV
infection of CD4+ T cells alone, with either stimulatory or inhibitory effects being
described depending on the authors. Moreover and importantly, the effect of seminal
fluid from HIV-infected men has never been studied. In this context, we aimed at : (i)
understanding the basis for the reported discrepancies; (ii) defining experimental
conditions as relevant as possible to HIV transmission in vivo.; (iii) comparing the
impact of seminal fluid from HIV-infected versus uninfected men on CD4+ T cell
infection by HIV-1 strains.
Our results show that in non-cytotoxic conditions mimicking rapid infection of the
recipient’s target cells through contaminated semen, seminal fluid from uninfected
men displayed a moderate (3 fold) enhancing effect on CD4+T lymphocytes’ infection
by HIV-1 R5 strain. We chose to focus on the effect of short term exposure of target
cells to virus and seminal fluid (rather than on the effect of over 24h exposure, this
latter duration being chosen by authors describing inhibitory activity of SF (Martellini
et al. 2009; Balandya et al. 2010) for the following reasons: (i) mucosal target cells,
including T cells, were shown to get infected within one to four hours postintravaginal or intrarectal inoculation of SIV in macaques (Miller et al. 1994) ; (ii)
conversely, simulated intercourse in humans with HIV surrogate in the presence of
artificial or autologous seminal fluid indicated maximal virus distribution in the vagina
and rectum within the first hour, with significant decrease after 3 to 8h (Louissaint et
al. 2012a; Louissaint et al. 2012b); (iii) Semen raises the naturally acidic vaginal pH
for a couple of hours following ejaculation. This transient buffering capacity is thought
to contribute to create favorable conditions conducive to HIV infection; (iv) prolonged
exposure (24h) of PBMCs to seminal fluid and virus, even at low doses, led to an
inhibition of the infection strongly associated with reduced cellular metabolic activity.
Of note is that SF enhancing activity of HIV infection after short term incubation with
target cells was lost when a higher dose of virus (10 ng/ml p24) was used.
127
We next compared the modulating effect of SF from infected versus uninfected men
on CD4+ T cells and TZM-bl infection by HIV-1 R5. CD4+ T cells were significantly
less infected in the presence of HIV+SF compared with SF as early as 24h postexposure, whereas similar enhancing activities were observed for both groups of SF
on TZM-bl infection, although a tendency for lower enhancing effect was noted for
HIV+SF. The enhancing activity of semen on TZM-bl infection was shown to depend
upon positively charged amyloid fibrils such as SEVI, SEM1 and SEM2 which capture
virions and promote their attachment to cells (Roan et al. 2009; Roan et al. 2011),
without bypassing the need for HIV interactions with the cell receptors CD4, CCR5
and CXCR4. The level of infection of TZM-bl in presence of SF indeed correlated
with the seminal concentrations of those enhancing peptides. In contrast, such
correlations were not observed for HIV+SF which displayed similar or slightly higher
concentrations of enhancing peptides than SF. Thus the lower level of PBMC
infection post HIV+SF exposure could not be explained by a decreased level of those
enhancing peptides, indicating that other factors were at play.
The specific differential effect of HIV+SF vs SF on CD4+T cell infection by HIV-1 R5
suggested the involvement of immunomodulatory factors and prompted us to
compare cytokine and prostaglandins content between the two groups of SF.
Prostaglandins (of which the E series are predominant in semen) have
immunosuppressive actions on leukocytes (Kelly 1999; Sreeramkumar et al. 2012),
while cytokines can potently influence HIV replication, either directly (e.g. the antiviral
activity of type IFN) or through secondary effects on their target cells (e.g. shut off of
cell activation by IL-10 or induction of pro-inflammatry cytokines by IL-15) (Alfano and
Poli 2005). Considerable heterogeneity in semen cytokine levels exists between
cohorts of uninfected individuals (Anderson et al. 1998; Berlier et al. 2006a; Politch et
al. 2007; Balandya et al. 2010) as well as between cohorts of HIV- infected men
(Storey et al. 1999; Berlier et al. 2006a; Lisco et al. 2011; Kafka et al. 2012; Hoffman
et al. 2014), which likely reflects both inter-cohorts differences (e.g. number of
individual tested, geographical origins, detection kits used…) and the wide range of
concentrations found for most cytokines in between individuals, which may be linked
to semen microbiome, HIV load or genital infections (Anderson et al. 1998; Berlier et
al. 2006a; Politch et al. 2007; Balandya et al. 2010; Lisco et al. 2011; Kafka et al.
2012). In our study, of the five cytokines with significantly elevated levels in HIV+SF
128
vs SF, the CCR5 ligand RANTES showed the highest increase (about 2 fold versus
1.2-1.3 fold for TNFα, IL-1β, IL-15 and IL-1ra). Elevated concentrations of RANTES
in the semen of HIV-infected men were similarly previously reported in two
independent studies (Storey et al. 1999; Lisco et al. 2011). IL-1β was also found to
be upregulated in one study (Berlier et al. 2006b), and another study reported
increased TNFa concentrations (Kafka et al. 2012). RANTES (CCL5) inhibits HIV R5
entry through competitive binding to CCR5, while IL-1β, TNFα and IL-15 increase
HIV infection (Alfano and Poli 2005). Among those elevated cytokines, a negative
correlation was consistently found between seminal RANTES concentrations and the
level of CD4+ T cell infection by HIV-1 R5 post SF exposure in all the experiments
performed. The levels of the antiproliferative and immunosuppressive molecules
PGE2 and TGF-β (both in high concentrations in semen, as expected (Robertson et
al. 2002; Politch et al. 2007) were not significantly different between the two groups.
Their high seminal concentrations were likely involved in the decreased proliferation
of CD4+T cells and expression of the activation marker CD69 following exposure to
SF or HIV+SF. When examining HIV receptor expression at different time points, the
only difference found between the effects of SF vs HIV+ SF was a significantly more
pronounced initial decrease of CCR5 surface expression. The percentage of cells
expressing CCR5 positively correlated the magnitude of CD4+T cell infection and
negatively correlated the concentrations of CCR5 ligands in semen. In addition to this
and to CCR5 ligand RANTES elevated concentrations in HIV+SF, our finding that
HIV+SF and SF similarly enhanced HIV-1 IIIB infection of PBMC further points at
decreased CCR5 surface expression by HIV+SF as the main factor responsible for
the lower level of HIV-1 R5 infection of CD4+ T cells post exposure to HIV+SF vs SF.
The unchanged CCR5 mRNA levels post SF exposure at all-time points indicated
modifications of the intracellular trafficking of the receptor (e.g. enhanced
internalization) compatible with ligand binding.
Overall, we showed an enhancing effect of both HIV+SF and SF on HIV-1 infection of
primary CD4+T cells, with varying intensity depending upon donor status and virus
tropism. Differences were also observed when comparing the effect of semen on
primary CD4+T cells and the TZM-bl cell line. Our results indicate that HIV infection
significantly modifies SF composition, and that a mix of stimulatory (e.g. HIV
replication enhancing cytokines such as IL-1β, TNFα, enhancing peptides, …) and
129
inhibitory molecules (such as cytokines decreasing HIV-1 infection like RANTES) are
likely at play, to which target cells and viral strains will be differently susceptible. For
instance the TZM-bl cell line was not sensitive to the inhibitory action of HIV+SF on
HIV-1 R5, since similar enhancing effects were observed for both HIV+SF and SF.
TZM-bl cells stably express large amounts of CCR5 and CD4 and only support single
round of infection. These cells represent a simplified model, likely less sensitive as
primary cells to HIV receptor downmodulation by SF, as well as to complex regulation
of HIV infection by SF, including secondary effect on target cells through modification
of their own cytokine production. In CD4+T cells interestingly, although SF induced
an initial downregulation of CCR5, a decrease in CD4 expression and diminished
CD4+ T cell proliferation and activation, SF enhancing effect predominated. Seminal
factors favoring HIV infection in CD4+ T cells likely involve the previously described
enhancing peptides SEVI, SEM1 or SEM2 as well as other factors such as proinflammatory cytokines.
When comparing our results and those of others, it appears that the duration of
exposure to semen may trigger opposite effects: thus while in our experimental
setting, short term incubation of T cells with SF triggered an enhancing effect on HIV
infection (as observed by (Munch et al. 2007; Roan et al. 2011) for similar short term
incubation), longer incubation period of T cells with highly diluted SF (O'Connor et al.
1995) or with seminal cationic peptides (Martellini et al. 2009) were described to lead
to an inhibitory effect. In addition, SF has been previously reported to have various
effects on different cell types. Thus, SF from uninfected men was shown to inhibit
the capture of HIV by dendritic cells, preventing virus transfer to target cells (Sabatte
et al. 2007; Sabatte et al. 2011). Two seminal molecules were reported to mediate
this effect, mucin 6 and clusterin (Stax et al. 2009; Sabatte et al. 2011). SF was also
described to increase HIV attachment to epithelial cells and modify their secretions,
which in turn led to recruitment and promotion of target cell infection (Doncel et al.
2010). Finally, SF was reported to modify the epithelial cell barrier and modulate the
transmigration of infected cells through this barrier (Lawrence et al. 2012). The
impact of SF on HIV transmission in vivo has been very little studied. Although
semen did not have any drastic impact on SIV transmission in experimentally
inoculated macaques, there was a tendency for an increase rate of transmission for
130
low virus dose in the inocula (Miller et al. 1994; Neildez et al. 1998; Munch et al.
2013).
In conclusion, our results highlight the complex effects of semen on HIV infection and
point at the need for carefully selecting an experimental setting as close as possible
to “real life” (e.g. primary target cell types, status of semen donor, duration of
exposure to semen) when assessing semen modulating effect. Integrated ex vivo
models such as tissue explants and in vivo experiments in animal models are
urgently needed to better understand the role of this complex fluid in HIV
transmission.
131
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137
Figure legends
Table 1. Clinical data from antiretroviral therapy-naive HIV-infected men
Figure 1. Effect of HIV+SF versus HIV-SF on PBMC and TZM-bl infection
by HIV1 R5 strain. PBMCs (A, B) or TZM-bl cell line (C) were exposed to the
indicated dilutions of SF for 3h in presence of HIV-1 R5 strain. Infectivity was
measured in PBMCs after 72h of culture by p24 assay in the supernatants (A), by
real-time RT-PCR quantification of HIV-1 gag transcripts (B) and by quantification of
HIV-1 DNA in one millions PBMCs 24H after exposure to HIV- and HIV+ SF, as
assayed for LTR DNA using quantitative real-time PCR (C). Infectivity was measured
in TZM-bl after 48h of culture by measuring Tat-inducible β-galactosidase activities
(D). A significantly lower level of PBMC infection was observed in presence of
HIV+SF compared with HIV-SF. In contrast, no significant differences of HIV+SF vs
HIV-SF were found on the infection of TZM-bl. Results are expressed as fold change
compared with virus alone for infectivity (A, C) and as relative copy number of HIV
gag cDNA standardized to the copy number of GAPDH cDNA and expressed relative
to control (PBMCs exposed to virus alone). Results shown are representative of two
(B, C) or three (A, D) independent experiments for each donor (n=10 to 20). * p<
0,05 ; ** p< 0,01 ; *** p< 0,001 compared with virus alone ; ° p< 0,05 ; °° p< 0,01 ; °°°
p < 0,001 compared between HIV- and HIV+ SF. Statistical analysis with nonparametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test.
Figure 2. Effect of HIV+SF and HIV-SF on the viability of infected PBMCs
and CD4+ T cells. (A) The viability of PBMCs exposed to HIV-1 R5 SF162 in
presence of SF from uninfected or infected donors was evaluated by measuring
cellular metabolic activity. Results are expressed as percentage of control (PBMCs
exposed to HIV-1 R5 SF162 in absence of SF). Results shown are representative of
three independent experiments for each donor (n=16 to 20). (B) The viability of
CD4+T cells was evaluated at various time points using flow cytometry (LIVE/DEAD).
Results are expressed as percentage of control (CD4+ T cells exposed to HIV-1 R5
SF162 in the absence of SF). No significant effect of either HIV-SF or HIV+SF was
observed. Results shown are the mean of 5 to 10 donors +/- SEM. Statistical analysis
with non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test
Figure 3. Levels of enhancing peptides in SF from HIV-infected versus
uninfected men. Relative SEVI (A), SEM 1 (B) and SEM 2 fragments (C) levels in
SF from HIV-infected or uninfected donors (n=9 to 19), as determined by ELISA.
Similar levels of SEVI were observed in the two groups, whereas slightly but
significantly elevated levels of SEM1 and SEM2 were measured in HIV+SF.
Statistical analysis with non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test
138
Table 2. Correlations between enhancing peptides’ levels in SF and the
magnitude of TZM-bl infection. SEVI relative levels positively correlated with the
magnitude of TZM-bl infection in the presence of different dilutions of HIV-SF only.
SEM1 and SEM2 levels positively correlated with TZM-bl infection levels, but only for
HIV-SF. Statistical analysis with non-parametric test: Spearman test.
Figure 4. (A) Elevated cytokines in HIV+SF vs HIV-SF. Dot plots of RANTES,
TNFα , IL-1β, IL-ra and IL-15 concentrations in SF from infected and uninfected
donors. Statistical analysis with non-parametric Wilcoxon-Mann-Withney test.
(B) RANTES concentrations in SF negatively correlate purified CD4+T cells
infection levels. Statistical analysis with non-parametric test: Spearman test.
Statistical analysis with non-parametric test: Spearman test.
Figure 5. Effect of SF from HIV+SF versus HIV-SF on HIV receptor
expression by CD4+T cells. (A) The measure of CD4 mean fluorescence intensity
(MFI) on CD3+ T cell membrane at different time points following exposure to either
HIV+SF or HIV-SF and HIV-1 R5 SF162 showed a significant decrease of CD4
expression as compared with control (CD3+ T cells exposed to virus alone). (B) The
percentage of CD4+ T cells expressing CCR5 was significantly decreased 6h postexposure to HIV+SF, as compared with control (CD3+ CD4+ T cells exposed to virus
alone) and HIV-SF. In contrast, an increase in the percentage of CD4+T lymphocytes
expressing CCR5 was observed at 24h for both HIV+SF and HIV-SF as compared
with control. By real-time RT-PCR, no differences in CCR5 mRNA was seen (C). (D)
CCR5 MFI on CD3+CD4+ T cells exposed to HIV+SF or HIV-SF and HIV-1 R5
SF162 showed a significant increase in CCR5 expression from 24h onwards, as
compared with control (CD3+ CD4+ T cells exposed to virus alone). CXCR4
expression at 6h post SF exposure was similar to that in the absence of SF. In
contrast, CXCR4 MFI was increased 24h post SF exposure (E) (n=5 to 10). Control
represents PBMC CD4+ T cells exposed to virus (HIV-1 R5, 2ng/ml p24) for 3h in
absence of SF (n=10). SF was used at a final dilution of 1%. * p< 0,05 ; ** p< 0,01 ;
*** p< 0,001 compared between HIV- SF and virus alone ; ° p< 0,05 ; °° p< 0,01 ; °°°
p < 0,001 compared between HIV+ SF and virus alone. + p< 0,05 ; ++p< 0,01 ; +++ p
< 0,001 compared between HIV- SF and HIV+ SF. Statistical analysis with nonparametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test
139
Figure 6. Effect of SF from HIV-infected versus uninfected men on CD4+T
cells activation. Exposure (3h) to either HIV+SF or HIV-SF (n=10 in each group)
and HIV-1 R5 SF162 showed a significant decrease of the percentage of CD4+T
cells expressing the activation marker CD 69 after 6h, 24h and 48h of culture (A).
The measure of percentage of CD4+T cell EDU+ at 24h (B) following exposure to
either HIV+SF and HIV-1 R5 SF162 didn’t showed a significant different as compared
with HIV-SF and HIV-1 R5 SF162. In contrast, there is a significant difference at 48h
(B). Control represents PBMC CD4+ T cells exposed to virus (HIV-1 R5, 2ng/ml p24)
for 3h in the absence of SF. SF was used at a final dilution of 1%. * p< 0,05 ; ** p<
0,01 ; *** p< 0,001 compared between HIV- SF and virus alone ; ° p< 0,05 ; °° p<
0,01 ; °°° p < 0,001 compared between HIV+ SF and virus alone. + p< 0,05 ; ++p<
0,01 ; +++ p < 0,001 compared between HIV- SF and HIV+ SF. Statistical analysis
with non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test.
Figure 7. Effect of HIV+SF versus HIV-SF on PBMC by HIV1 X4 strain.
PBMCs (A) or TZM-bl cell line (B) were exposed to the indicated dilutions of SF for
3h in presence of HIV-1 X4 strain. Infectivity was measured after 72h of culture by
p24 assay in the supernatants of PBMCs (A) or after 48h by measuring Tat-inducible
β-galactosidase activities in TZM-bl (B). Results are expressed in fold change
compared with virus alone. Results shown are representative of three independent
experiments for each donor. * p< 0,05 ; ** p< 0,01 ; *** p< 0,001 compared with virus
alone. Statistical analysis with non-parametric test : Wilcoxon-Mann-Withney test.
140
Supplemental data
Figure S1. Effect of short term exposure of SF from healthy donors on
PBMCs and TZM-bl infection. PBMCs (A) and TZM-bl (B) were exposed for 3h to
the indicated dilutions of SF (obtained by centrifugation at 1000g for 10 min) in
presence of low dose HIV-1 R5 strain (2ng p24/ml). Infectivity was measured after
72h of culture by p24 assay in the supernatants of PBMCs (A) or after 48h by
measuring Tat-inducible β-galactosidase activities in TZM-bl (B). SF from healthy
donors consistently triggered an enhancing effect on both PBMCs and TZM-bl
infection. Results are expressed in fold change compared with virus alone and
represent the average of three experiments for either 2 to 3 pools of SF (n=30 to 52
donors in each pool) or 10 to 16 uninfected donors tested individually. ** < 0,01 ; ***
< 0,001 compared with virus alone. Statistical analysis with non-parametric test:
Wilcoxon-Mann-Withney test
Figure S2. Effect of prolonged exposure of SF from healthy donors on
PBMCs and TZM-bl infection. PBMCs and TZM-bl were exposed for 24h to the
indicated dilutions of SF (obtained by centrifugation at 1000g for 10 min) in presence
of low dose HIV-1 R5 strain (2ng p24/ml). Infectivity was measured after 72h of
culture by p24 assay in the supernatants of PBMCs or after 48h by measuring Tatinducible β-galactosidase activities in TZM-bl. Whereas an enhancing effect of SF
was observed on TZM-bl infection, an inhibitory effect was observed on PBMCs. (B)
The inhibitory effect of SF on PBMCs infection was positively correlated with a
reduction in cell viability. Results are expressed in fold change compared with virus
alone and represent the average of three experiments for 2 pools of SF (n=30 to 52
donors each). * < 0,05 ; ** < 0,01 compared with virus alone. Statistical analysis with
non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test.
Figure S3. Impact of liquefaction on the SF mediated changes of HIV-1
infection. Semen was left to liquefy after ejaculation at 37°C for the indicated
duration and then centrifuged at 1000g for 10 min to evaluate the effect of
liquefaction on TZM-bl HIV-1 R5 infection. TZM-bl were exposed for 3h to the
indicated dilutions of SF in presence of low dose HIV-1 R5 strain (2ng p24/ml).
Infectivity was measured after 48h by measuring Tat-inducible β-galactosidase
activities. Enhancement of TZM-bl infection was similar following exposure to SF
obtained from semen liquefied for 30 min or centrifuged immediately after collection,
whereas a 5h liquefaction step led to a significantly higher enhancement of infection.
Results are expressed in fold change compared with virus alone and represent the
average of two experiments for two independent donors. ** < 0,01 compared with
virus alone; °< 0,05 compared between different SF liquefaction duration. Statistical
analysis with non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test
141
Figure S4. Impact of freezing on the SF mediated changes of HIV-1
infection. Semen was left to liquefy after ejaculation at 37°C for 30 minutes. Fresh
semen or seminal fluid frozen before or after centrifuged at 1000g for 10 min were
used to evaluate the effect of freezing on TZM-bl HIV-1 R5 infection. TZM-bl were
exposed for 3h to the indicated dilutions of SF in presence of low dose HIV-1 R5
strain (2ng p24/ml). Infectivity was measured after 48h by measuring Tat-inducible βgalactosidase activities. Results are expressed in fold change compared with virus
alone and represent the average of two experiments for two independent donors. ** <
0,01 compared with virus alone; °< 0,05 compared between different SF liquefaction
duration. Statistical analysis with non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test
Figure S5. Effect of HIV+SF versus HIV-SF on CD4+ T cells. CD4+T cells
were purified and exposed to the indicated dilutions of SF for 3h in presence of HIV-1
R5 strain. Infectivity was measured in CD4+T cells after 72h of culture by p24 assay
in the supernatants (A). A significantly lower level of CD4+T infection was observed
in presence of HIV+SF compared with HIV-SF. The viability of CD4+T cells was
evaluated by measuring cellular metabolic activity (B). Results are expressed as fold
change compared with virus alone for infectivity (A) and as percentage of control
(CD4+T cells exposed to HIV-1 R5 SF162 in absence of SF). Results shown are
representative of three independent experiments for each donor (n=16 to 20).
Results shown are one experiment for each donor (n=10 to 20). * p< 0,05 ; ** p<
0,01 ; *** p< 0,001 compared with virus alone ; ° p< 0,05 ; °° p< 0,01 ; °°° p < 0,001
compared between HIV- and HIV+ SF. Statistical analysis with non-parametric test:
Wilcoxon-Mann-Withney test.
Figure S6. Correlations between cytokine concentrations in HIV-1uninfected (down) and HIV-1-infected (up) seminal plasmas. Statistically
significant correlations (spearman test) are presented as a heat map: different
shades of blue represent positive correlations of various strengths and different
shades of red represent negative correlations of various strengths. White cells in the
matrix denote the absence of a statistically significant correlation between cytokines.
Note that HIV-1 infection resulted in a dramatic increase of the number of correlations
between different cytokines, thus making the cytokine network more interconnected.
Statistical analysis with non-parametric test: Spearman test
Figure S7. Correlation between the levels of % CCR5 expression and the
SF 1% mediated enhancement of purified CD4+T cells infection The magnitude of
purified CD4+ T cells following exposure to SF is correlated with the percentage of
CCR5 expression at 6h post exposition to SF 1%. Statistical analysis with nonparametric test: Spearman test.
142
Table S1. Comparison of immunomodulatory factor concentrations in SF
from HIV- infected versus uninfected men. Shown are the median concentrations
and interquartile range (IQR) of 46 cytokines, chemokines and growth factors, as well
as prostaglandin PGE2, measured in SF from infected and uninfected donors.
Immunomodulatory factors with significantly elevated concentrations in HIV+SF
compared to HIV-SF are highlighted in red, while factors with a trend for differences
but that did not reach significance are highlighted in yellow. Statistical analysis with
non-parametric test: Wilcoxon-Mann-Withney test.
Table S2. Correlations between the levels of cytokines and the seminal
viral loads. IL-1β, IL-15, RANTES and TNFα levels positively correlated with the
blood viral load (BVL) and the semen viral load (SVL). Statistically significant
correlations are indicated in bold. Statistical analysis with non-parametric test:
Spearman test.
143
144
145
146
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160
161
Chapitre II
Effet du liquide séminal sur l’infection
d’explants cervicaux et colo-rectaux
162
Chapitre II : Effet du liquide séminal sur l’infection d’explants
cervicaux et colo-rectaux
INTRODUCTION
A ce jour, l’effet du LS sur l’infection par le VIH n’a jamais été testé: 1)
directement sur les cellules cibles du VIH issues des tissus (qui peuvent donc avoir
des caractéristiques sensiblement différentes des lignées et des cellules primaires
isolées du sang) ; 2) dans des modèles permettant l’exposition au LS des différents
types cellulaires présents dans les muqueuses (e.g. cellules épithéliales et cellules
immunes cibles du virus), mimant ainsi les interactions entre les cellules survenant in
vivo.
L’étude de l’effet du LS sur l’infection par le VIH-1 de muqueuses cervicovaginales et colo-rectales est donc une étude complémentaire à celle que nous
avons réalisée sur les modèles cellulaires afin de prendre en compte non seulement
un effet direct du LS sur les cellules cibles du VIH dans ces tissus mais aussi un effet
indirect du LS sur l’environnement de ces cellules cibles.
OBJECTIFS ET STRATÉGIES EXPÉRIMENTALES
Les études publiées à ce jour qui se sont intéressées à l’effet du LS sur
l’infectivité du VIH-1 ont été réalisées sur des modèles cellulaires. Nous avons voulu
étudier l’effet d’un pool de LS d’hommes sains sur l’infection par le VIH-1 R5 sur les
tissus qui sont les portes d’entrée du VIH dans l’organisme à savoir le col de l’utérus
et le tissu colorectal.
Nous avons également étudié la cytotoxicité du LS sur les explants provenant
de ces tissus. En effet, les études publiées (Okamoto et al. 2002; Munch et al. 2007;
Roan et al. 2009; Kim et al. 2010) et celles que nous avons réalisées (cf. Chapitre 1)
ont montré une action cytotoxique du LS sur les cellules cibles du VIH-1 telles que
les PBMC.
D’autre part, des études ayant montré l’influence du LS sur la production de
cytokines par les cellules épithéliales (Denison et al. 1999; Sales et al. 2002; Berlier
et al. 2006b; Robertson et al. 2006; Battersby et al. 2007; Sharkey et al. 2007; Kafka
et al. 2012; Sharkey et al. 2012a; Joseph et al. 2013), nous avons ensuite souhaité
163
étudier l’effet, sur l’infection de modèles cellulaires, des sécrétions des cellules du
tissu (cellules stromales et épithéliales) en réponse au LS dans les explants.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Les matériels et les méthodes relatifs à cette étude ont été décrits en détail
dans la partie « Matériels et Méthodes » de ce manuscrit. Nous en résumons ici
simplement les grandes lignes.
Les prélèvements tissulaires
Les
tissus
cervicaux
et
colorectaux
sont
fournis
par
le
service
d’anatomopathologie du CHU de Rennes (Pr N. Rioux-Leclercq) en accord avec le
CPP Grand Ouest (déclaration Ministère DC-2009-1028). Les tissus cervicaux
proviennent d’hystérectomie pour prolapsus et les tissus colorectaux de colectomie
pour cancer colorectal ou diverticulose. Seuls les tissus sains, déterminés comme
normaux par l’examen anatomopathologique, sont utilisés. Les tissus (muqueuses et
sous muqueuses) sont découpés en explants de 3 mm 3 (explants cervicaux) ou en
lamelles de 3x6 mm (explants colorectaux). Les explants ne sont pas polarisés,
permettant l’accès direct du virus aux cellules épithéliales et sub-épithéliales comme
dans le cas d’un épithélium avec des micro-lésions dues aux rapports sexuels.
Concernant les tissus cervicaux, nous nous sommes intéressés exclusivement
à la partie exocol car il a été montré que celle-ci était plus susceptible à l’infection et
plus permissive à la réplication virale que l’endocol ou l’endomètre (Gupta et al.
2002; Asin et al. 2009).
Le liquide séminal
Le sperme d’hommes sains a été recueilli au CECOS de Rennes en
collaboration avec le Pr C. Ravel et avec l’accord du CPP Grand Ouest (déclaration
DC-2010-1155). Trois pools de LS de donneurs sains (20 à 50 donneurs) sont
constitués à partir de sperme récolté puis liquéfié 30 minutes à 37°C avant d’être
congelé à -80°C. Après obtention d’un nombre suffisant de LS, ceux-ci sont
décongelés, centrifugés 10 mn à 1 000 g, réunis et aliquotés puis congelés à -80°C.
164
Infection et culture des explants
Les explants sont infectés en présence ou non de liquide séminal à 20% final
pendant 3h à 37°C par la souche de VIH-1 R5 SF 162 (100ng de p24/ml final). Cette
souche a été choisie car les souches R5 sont préférentiellement transmises par voie
sexuelle. Par ailleurs, la souche SF 162 permet, comme la souche BaL, une
réplication dans des explants non stimulés par la PHA et l’IL-2, contrairement à
d’autres souches R5 (Greenhead et al. 2000). Le LS d’hommes VIH+ étant
disponible en quantité limitée, nous avons effectué nos expériences avec du LS
d’homme sains. Afin de minimiser l’effet des variations individuelles et en raison du
nombre restreint de conditions testables dans une même expérience sur explants,
seuls trois pools de LS d’au moins 20 patients ont été testés. Les explants sont
ensuite lavés et cultivés sur des inserts (2 explants/insert pour les explants cervicaux
et un explant/insert pour les explants colorectaux) dans des plaques 12 puits. Les
tissus sont cultivés dans du milieu RPMI sans rouge de phénol (pour éviter les
interférences avec les tests enzymatiques conduits sur les surnageants de culture) et
sans glutamine, supplémenté en sérum (10% SVF ou 10% sérum humain AB-),
acides aminés non essentiels, sodium pyruvate, pénicilline, streptomycine,
gentamycine, fungizone et L-glutamine (uniquement pour les tissus colorectaux).
L’infection des explants est suivie par quantification de la protéine virale p24 par
dosage ELISA dans le surnageant de culture tous les 2 jours et est comparée à la
condition témoin en absence de liquide séminal pour mesurer une activité
stimulatrice ou inhibitrice (2 ou 3 puits/conditions). La viabilité des explants est
évaluée par un test enzymatique (MTT ou LDH). L’ADN viral est quantifié dans les
explants au cours du temps par PCR en temps réel (Taqman, amplification du gène
LTR du VIH) comme précédemment décrit (Roulet et al. 2006a).
Effets des sécrétions issues des tissus exposés au LS sur l’infection par
le VIH
Les explants sont incubés en présence ou non de LS 20% final pendant 3h à
37°C mais en absence de virus. Comme lors de l’infection, ils sont ensuite lavés et
cultivés sur inserts. Le surnageant est récolté à J1 et J4. Les surnageants récoltés
sont centrifugés à 2 000 rpm pendant 10 min, aliquotés et congelés à -80°C. Ils sont
165
ensuite utilisés, à une dilution finale de 1/20, pour préparer un inoculum avec la
souche de VIH-1 R5 SF 162 (2ng de p24/ml finale) pour l’infection du modèle
cellulaire TZM-bl. Chaque condition est testée en triplica. Après 3h d’infection à
37°C, l’inoculum est retiré et remplacé par du milieu frais. Après 2 jours de culture,
l’infection est évaluée par mesure de l’activité β-galactosidase via le kit « Gal-Screen
System » (Applied Biosystem). La viabilité des cellules en culture est évaluée par un
test enzymatique à l’aide du kit CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
(PROMEGA).
RÉSULTATS
Validation des cultures d’explants colorectaux et cervicaux et mise en
évidence des cellules cibles du VIH-1
L’examen histologique des tissus à J0 montre que les explants ont une
structure morphologique typique. L’architecture du tissu n’a pas subi d’altération
notable lors de la dissection du tissu. Concernant les explants colorectaux, la surface
de l’épithélium monostratifié contient les entérocytes et les cellules caliciformes et
forment des cryptes de Lieberkühn. Des cellules immunitaires sont distribuées dans
la lamina propria et la sous muqueuse (Figure 1A et 1B). Les explants cervicaux sont
formés d’un épithélium pluristratifié et du chorion (Figure 1A). Au cours de la culture,
la structure de l’épithélium et de la lamina propria est progressivement perdue, dans
les explants colorectaux et dans les explants cervicaux, comme précédemment décrit
(Abner et al. 2005; Fletcher et al. 2005; Wallace et al. 2009). Dans ces derniers, on
observe également une migration des cellules de l’épithélium stratifié (Figure 1A). En
nous basant sur les protocoles décrits dans la littérature (Abner et al. 2005; Fletcher
et al. 2005; Grivel and Margolis 2009; Wallace et al. 2009) et des colorations HES
(hématéine-éosine-safran)
réalisées
en
collaboration
avec
le
service
d’anatomopathologie, nous avons déterminé un temps de culture de 13 jours pour
les tissus exocervicaux et de 11 jours pour les tissus colorectaux dont la structure est
moins bien conservée au cours de la culture.
L’analyse immunohistologique montre des cellules marquées positivement par
l’anticorps
anti-CD3
(lymphocytes
T),
l’anticorps
anti-CD163
(monocytes/macrophages) et l’anticorps anti-CD4 (lymphocytes T CD4+) sur les
coupes de tissus colorectaux et cervicaux prélevés au cours de la culture à J0 et J7
166
(Figure 1B). Ces résultats confirment la présence et la persistance au cours de la
culture des cellules cibles du VIH-1. Dans les tissus colorectaux, les cellules
CD163+, CD3 + et CD4+ sont observées à la fois au niveau de la muqueuse et de la
sous-muqueuse. Dans les tissus exocervicaux, les cellules positives ne sont
observées qu’au niveau du chorion, aucun marquage n’a été constaté dans
l’épithélium.
Le co-marquage de la protéine virale p24 en immunofluorescence avec les
marqueurs CD163 et CD3 a permis de montrer que les lymphocytes T et les
macrophages sont infectés dans les explants colorectaux et cervicaux (Figure 1C,
1D, 1E, 1F). La proportion respective de cellules infectées/type cellulaire n’a pu être
déterminée en raison du faible nombre de cellules double positives.
Effet du LS sur l’infection par le VIH-1 R5 SF162 et la viabilité des explants
colorectaux et cervicaux
Les tissus cervicaux de 17 donneurs au total et les tissus colorectaux de 18
donneurs au total ont été infectés pendant 3h à 37°C par des inocula contenant du
virus seul ou du virus et du liquide séminal utilisé à une concentration de 20%. Cette
concentration maximale de LS est celle pour laquelle nos premiers essais effectués
avec des tests MTT ont montré une absence de toxicité dans les deux modèles
tissulaires.
En ce qui concerne les explants colo-rectaux, malgré une variabilité interdonneurs importante, déjà mise en évidence dans des études précédentes (Grivel et
al. 2000; Rollenhagen and Asin 2010), une augmentation du relarguage de la p24 au
cours du temps a été observée pour 12 des 18 explants exposés au VIH-1 R5
SF162. Il n’a pas été observé d’effet significatif du LS sur le relarguage de la p24
pendant la culture (n=12 explants) ou sur la quantité d’ADN viral mesurée en fin de
culture (n=10) dans les explants infectés (Figure 2 A, B). Toutefois, la mesure de la
viabilité par dosage de la LDH, un test plus sensible que le MTT, dans les
surnageants des explants colorectaux cultivés en présence de veau fœtal a montré
un effet cytotoxique du LS chez les 4 explants testés (Figure 2 C). Les profils de
relarguage de p24 et de LDH des explants de deux donneurs représentatifs sont
présentés en Figure 2E, F. Le sérum de veau fœtal ayant été décrit comme pouvant
167
induire un effet cytotoxique du LS sur les lymphocytes T, via l’oxydation de la
spermine séminale (Vallely and Rees 1986; Allen and Roberts 1987; Quan et al.
1990), nous avons remplacé le sérum de veau fœtal dans les cultures d’explants
colo-rectaux par du sérum humain, lequel aurait un effet protecteur (Quan et al.
1991). Nos résultats montrent une viabilité similaire pour les explants exposés ou
non au LS lorsqu’ils sont cultivés en présence de sérum humain. Cependant, aucun
des trois explants colo-rectaux cultivés en présence de sérum humain n’a été infecté
par le VIH. Nous avons observé que la viabilité des explants cultivés en présence de
sérum humain, avec ou sans LS, est plus faible que celle des explants cultivés en
présence de sérum de veau fœtal sans LS (Figure 3).
Nous avons observé une augmentation du relarguage de la p24 en présence ou
en absence de LS pour 13 explants exocervicaux sur 17. Le taux de protéine virale
p24 est modestement mais globalement significativement plus faible dans les
surnageants d’explants infectés exposés au LS par rapport à la condition témoin
avec du virus seul (n=13) (Figure 4 A). Une diminution significative de la quantité
d’ADN viral est également mesurée en fin de culture dans les explants cervicaux
exposés au LS par rapport aux explants non exposés (n=11) (Figure 4B). Cette
différence, bien que modérée, s’observe chez 11 sur 13 donneurs (Figure 4A),
comme représenté Figure 4E pour la mesure de p24 dans les explants de deux
donneurs représentatifs. Elle est retrouvée pour des explants cultivés dans du milieu
avec du sérum de veau fœtal (n=10) ou avec du sérum humain (n=3) (Figure 4E) et
n’est pas liée à un effet cytotoxique du LS, comme le montrent les mesures de
viabilité cellulaire par le test LDH (Figure 4C, 4D, 4F).
Effet des sécrétions des explants cervicaux en réponse au LS sur
l’infection par le VIH de TZM-bl
Afin de déterminer si l’effet inhibiteur du LS au niveau des explants cervicaux
pourrait être médié par les sécrétions des cellules du tissu exposées au LS, plutôt
qu’à un effet directement inhibiteur du LS sur l’infection des cellules cibles, nous
avons testé les propriétés de ces sécrétions sur la lignée de cellules TZM-bl. Pour
cela, le surnageant de culture des explants a été prélevé 24h ou 84h après
l’exposition au LS de 3h, sans changement de milieu suite à l’élimination et lavage
du LS. Les TZM-bl ont été exposées à un inoculum contenant le virus et le
168
surnageant de culture des explants vol/vol conduisant à une dilution finale des
surnageants d’explant de 1/20ème (soit 5% final).
Les résultats d’infection des TZM-bl ne montrent pas de différences entre les
cellules infectées en présence des sécrétions des explants cervicaux exposés ou
non au LS, et les cellules infectées par du virus seul (Figure 5).
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
La transmission sexuelle lors de rapports non protégés dépend de la capacité
du VIH-1 à infecter les cellules cibles des muqueuses colorectales et du tractus
génital.
Les études sur cultures organotypiques permettent de conserver les différents
types cellulaires interagissant in vivo (Michelini et al. 2005) et constituent donc des
modèles plus physiologiques que les modèles de cellules isolées. Bien que nous
ayons observé une perte de l’intégrité des muqueuses au cours de la culture des
explants colorectaux et exocervicaux, confirmant les résultats d’études précédentes
(Abner et al. 2005; Michelini et al. 2005; Fletcher et al. 2006b; Southern et al. 2011),
nous montrons la présence et le maintien de cellules cibles du VIH-1 dans les
explants colorectaux et cervicaux au cours de la culture et leur susceptibilité à
l’infection.
A travers nos résultats sur les cultures organotypiques, nous avons montré que
le LS induit une diminution de l’infection ex vivo des tissus exocervicaux alors
qu’aucun effet n’est observé sur l’infection des tissus colo-rectaux. Toutefois, l’effet
cytotoxique du LS sur les explants colo-rectaux cultivés dans du milieu contenant du
SVF pourrait masquer un effet stimulateur du LS et ne permet donc pas de conclure.
Pour remédier à ce problème, nous avons cultivé les explants colo-rectaux dans du
milieu avec du sérum humain. Nos résultats montrent la disparition de l’effet
cytotoxique lié au LS mais suggère que la viabilité des explants est globalement
moins bonne en sérum humain qu’avec du sérum de veau fœtal, ce qui pourrait
expliquer le fait que les 3 explants cultivés en sérum humain n’ont pas été infectés.
Ces expériences nécessitent d’être répétées avec une concentration moins forte en
sérum humain afin de tester si la viabilité et l’infectivité des explants colorectaux
peuvent être améliorées. Bien que des études aient montré l’intérêt du sérum humain
pour la culture de tissus (cartilage articulaire, cartilage nasal) (Badrul et al. 2004;
169
Alexander et al. 2006) et que l’on trouve indifféremment des protocoles de culture de
tissus colorectaux en présence de 5% (Abner et al. 2005) ou 10% (Fletcher et al.
2006a) de sérum humain, à notre connaissance, aucune étude n’a comparé l’effet du
SVF et du sérum humain sur les cultures de tissus colorectaux ou de tissus
cervicaux. Si la culture des explants colorectaux dans du milieu contenant 5% de
sérum humain ne permet pas d’améliorer leur viabilité, nous pourrions alors tester un
milieu de culture sans sérum mis au point par Dame et al.. et qui permet un meilleur
maintien de l’architecture des tissus colorectaux au cours de la culture (Dame et al.
2010).
L’effet cytotoxique du LS a été observé uniquement sur les explants
colorectaux, il n’affecte pas les explants cervicaux, en tout cas pas de façon
détectable dans notre dosage LDH. Il y a plusieurs hypothèses pour expliquer cette
différence : 1) dans le cas où l’effet cytotoxique du LS est spécifique des
lymphocytes, la proportion moindre de lymphocytes dans les muqueuses
exocervicales par rapport à la population cellulaire totale comparée aux muqueuses
colorectales (Hussain et al. 1995; Grivel et al. 2007; Trifonova et al. 2014) pourrait
conduire à un manque de détection d’une mortalité accrue des lymphocytes dans les
explants cervicaux par le dosage de la LDH. Ce dosage étant global sur l’ensemble
des populations cellulaires, il n’est donc potentiellement pas assez sensible pour une
population faiblement représentée. Dans ce cas, on ne peut pas exclure que l’effet
inhibiteur du LS sur l’infection des explants exocervicaux soit dû à un possible effet
cytotoxique sur les lymphocytes. Cependant, les explants exocervicaux cultivés en
présence de sérum humain montrent également un effet inhibiteur du LS, et des
lymphocytes infectés ont pu être observés dans des explants colorectaux et
cervicaux cultivés dans du milieu contenant 10% de SVF à J7. Ces deux éléments
tendraient à prouver que l’effet cytotoxique n’est pas spécifique des lymphocytes.
Une analyse de la viabilité par type cellulaire en FACS sur cellules isolées ou par
TUNEL in situ devra être réalisée. D’autre part, pour nous assurer que la cytotoxicité
en sérum humain, globalement plus élevée qu’en SVF, ne masque pas un effet
cytotoxique sur les lymphocytes, les expériences d’infection et de viabilité devront
être répétées avec une concentration en sérum humain plus faible (5%). Dans
l’hypothèse où l’effet cytotoxique du LS combiné au SVF n’est pas spécifique des
170
lymphocytes, celui-ci pourrait s’expliquer par un moins bon maintien de l’architecture
et de la viabilité des tissus colorectaux par rapport aux tissus exocervicaux.
Nos résultats sur les explants cervicaux montrent une inhibition de l’infection
virale productive par le VIH-1 en présence de LS sans que l’on puisse observer un
effet cytotoxique. Cette inhibition est relativement faible mais constante. Ceci va à
l’encontre des résultats que nous avons obtenus précédemment (cf chapitre 1) sur
des lymphocytes T CD4+ sanguins, à savoir un effet stimulateur du LS. L’inhibition
observée dans les explants cervicaux pourrait être liée à une sensibilité au LS
différente entre les cellules cibles du VIH présentes dans les tissus cervicaux et les
cellules sanguines, et/ou refléter un effet inhibiteur (ou non stimulateur) d’autres
cellules du tissu sur l’infection. Ainsi, Kafka et al. (Kafka et al. 2012) ont montré que
la forte concentration de TGFβ dans le LS d’hommes en phase chronique de
l’infection par le VIH entraîne une diminution de la concentration de la cytokine proinflammatoire TNFα produite par les cellules épithéliales non exposées au LS,
laquelle stimule normalement l’infection de cellules cibles. Par ailleurs, les cellules
épithéliales secrètent des facteurs anti-microbiens ayant une activité anti-VIH tels
que les défensines dont HBD2 (Duits et al. 2003; Ganz 2003; Quinones-Mateu et al.
2003; Porter et al. 2005), MIP 3a/CCL20 (Ghosh et al. 2009b), Trapin/Elafin (Ghosh
et al. 2009a) et SLPI (Tomee et al. 1997; Wahl et al. 1997; Hocini et al. 2000; Fahey
and Wira 2002; King et al. 2002). Elles produisent également des facteurs inhibant le
VIH tels que les ligands de CCR5, MIP1α, MIP1β, RANTES et le ligand de CXCR4,
SDF1a. Wira et al., ont ainsi montré que les sécrétions des cellules épithéliales du
tractus génital féminin supérieur, dont les cellules épithéliales de l’exocol, inhibent la
réplication du VIH (Wira et al. 2011). L’effet du LS sur les sécrétions antimicrobiennes des cellules épithéliales n’est pas connu. Outre la barrière épithéliale,
d’autres cellules des muqueuses sont impliquées dans la défense contre les
pathogènes et pourraient être stimulées par le LS. Outre les lymphocytes T qui
représentent environ 40 % des cellules immunitaires au niveau de l’exocol, il s’agit
des cellules NK (environ 10 % des leucocytes), des macrophages (environ 10%), des
granulocytes (10-30%), des lymphocytes B (10%) et des cellules dendritiques
(Quillay 2014b). Il a été montré que des facteurs solubles produits par les cellules NK
de l’endomètre gestant inhibent la réplication du VIH dans les macrophages (Quillay
2014b). Un rôle des cellules immunitaires présentes dans les explants cervicaux
171
dans l’inhibition de l’infection par le LS n’est donc pas à exclure. Par ailleurs, il a été
décrit tout dernièrement une activité antivirale contre le VIH des fibroblastes du
tractus génital femelle (secrétion de RANTES, SDF1a, CCL20) (Mickey V. Patel
2014).
Nous avons cherché à mettre en évidence un effet inhibiteur des sécrétions
issues des tissus cervicaux exposés au LS. Nos expériences sur TZM-bl n’ont pas
permis de mettre en évidence un tel effet. Cependant, ces résultats sont à prendre
avec précaution pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il est possible que la
concentration finale (5%) des sécrétions exocervicales sur les TZM-bl soit trop faible
pour mesurer un effet. Ainsi, nous n’avons pas reproduit les résultats de Wira et al.
(Wira et al. 2011) montrant un effet inhibiteur des sécrétions exocervicales en
absence de LS sur l’infection des TZM-bl. Ceci pourrait s’expliquer par des
différences de protocole : ces auteurs ont utilisé les sécrétions de cellules
épithéliales polarisées sur 48h, diluées ensuite au 1/10ème et pré-incubées une heure
avec le virus avant d’infecter les TZM-bl avec leur inoculum. Or pour nous placer
dans les conditions les plus physiologiques possibles, nous avons décidé de ne pas
pré-incuber le virus. Par ailleurs, il est vraisemblable que les sécrétions épithéliales
obtenues dans ces conditions soient plus concentrées. Le manque de polarisation
des cellules épithéliales dans notre système a également pu influer sur leurs
sécrétions. Des expériences complémentaires avec une concentration finale sur
TZM-bl plus élevée des sécrétions des explants devront être réalisées dans un
premier temps. De plus, il est possible comme nous l’avons montré dans le chapitre
I, que les TZM-bl soient moins sensibles à un effet inhibiteur, médié par exemple par
des cytokines, que les PBMC. Nous testerons donc dans un second temps l’effet de
ces sécrétions sur l’infection de PBMC. D’autre part, les cellules épithéliales
dégénèrent rapidement au cours de la culture (Michelini et al. 2005), nous pourrions
donc envisager de récolter les surnageants seulement quelques heures après
l’exposition au LS.
Afin de continuer à explorer le rôle des sécrétions exocervicales dans l’effet
inhibiteur du LS sur l’infection par le VIH-1 des explants exocervicaux, nous pourrons
comparer la concentration de certaines cytokines dans les surnageants par une
analyse multiplex (Luminex, Biorad) et par des ELISA spécifiques commerciaux
172
(R&D system, antibodiesonline…). En effet, plusieurs cytokines (IL-10, TGFβ1, IL-8,
MIP1α, MIP1β, RANTES, CCL20, IFNα…) et protéines (SLPI, LL-37 cathélicidine, β
défensines, élafine, lactoferrine) pourraient être impliquées dans un effet inhibiteur
(Borrow et al. 2010; Firoz Mian and Ashkar 2011; Pollakis and Paxton 2012).
Si nos résultats sur l’influence des sécrétions sur l’infection se confirmaient,
cela pourrait signifier que le LS inhibe l’infection des explants cervicaux non pas en
agissant directement sur le virus ou
les cellules cibles mais sur les cellules
environnantes.
Il est également important de nous intéresser aux différences au niveau des
cellules cibles entre les explants et les PBMC qui pourraient expliquer les différences
entre les résultats obtenus sur nos modèles cellulaires et tissulaires. En effet, il existe
une plus grande proportion de macrophages dans les explants cervicaux par rapport
aux PBMC (Palacio et al. 1994) et il a été montré que la souche R5 BaL, qui est très
similaire à la souche SF162 pour son tropisme pour les macrophages, infecte
préférentiellement les macrophages cervicaux par rapport aux lymphocytes T
(Greenhead et al. 2000). A l’inverse, les cellules cibles du VIH dans les PBMC sont
principalement des lymphocytes T CD4+. Par ailleurs, il est possible que le LS agisse
différemment sur les lymphocytes T de la muqueuse par rapport aux PBMC, en
raison de caractéristiques propres ou de différences de niveau d’activation, les
PBMC ayant été stimulées par la PHA et l’IL-2. Afin de vérifier cette hypothèse, les
cellules immunitaires CD45+ seront isolées des explants par séparation sur billes
magnétiques (MidiMACS, Miltenyibiotech), comme décrit par Willey et al. (Willey et
al. 2003), après dissociation enzymatique du tissu à la collagénase II (Shacklett et al.
2003; Fletcher et al. 2006a). Des tests d’infection seront réalisés en présence ou
absence de LS sur les cellules CD45+ isolées, cultivées en plaque 96 puits dans le
milieu de culture des explants (RPMI+ 10% SVF) afin d’explorer un effet direct du LS
sur l’infection de ces cellules.
173
Figure 1 : Mise en évidence des cellules cibles du VIH-1 et de leur
infection au cours de la culture. Des explants cervicaux et colorectaux ont été
prélevés à J0 et J7 de la culture puis fixés au paraformaldéhyde, déshydratés et
inclus en paraffine. Des coupes sériées sont ensuite réalisées. A : Histologie des
explants cervicaux et colorectaux. Coloration à l’hémalun de Masson. B :
Immunohistochimies réalisées avec les anticorps anti-CD163 (macrophages), antiCD3 (lymphocytes T), anti-CD4. Un anticorps isotypique a été utilisé comme contrôle
négatif et ne montre aucun marquage (résultats non présentés). C - F : Mise en
évidence de cellules infectées par le VIH dans les explants cervicaux (C, D) et
colorectaux (E, F). Les marquages ont été réalisés avec des anticorps anti-p24 (vert)
et anti-CD3 (C, E) (rouge) ou anti-CD163 (D, F) (rouge) . Les noyaux ont été
marqués au DAPI (bleu). La photo principale présente l’image superposée des trois
marquages. Les photos latérales correspondent aux images individualisées des 2
marquages.
174
175
Figure 2 : Effet du LS sur l’infection par le VIH-1 et la viabilité des explants
colorectaux. Les explants sont incubés 3h à 37°C avec de l’inoculum (virus seul ou
virus + LS 20%) puis lavés avec du PBS et mis en culture pendant 11 jours. Le milieu
de culture, contenant 10% de SVF ou de sérum humain AB- (SH) est renouvelé
entièrement jusqu’à J5 puis en partie seulement (400µl sur 1ml). Les conditions sont
testées en duplica ou triplica selon les donneurs. A : L’infection est évaluée par
dosage de la quantité de protéine virale p24 (en pg/ml) mesurée dans les
surnageants de chaque puits lors d’expériences indépendantes effectuées sur des
explants colorectaux de 12 donneurs différents. Les résultats représentent les
quantités de protéines virales p24 dans les surnageants, en cumulé, à J11 et sont
exprimés en moyenne des duplicatas/triplicatas par conditions +/- SEM (A). B :
Mesure en qPCR de l’ADN viral (LTR) dans les explants à J11 et exprimée en copie
d’ADN viral par million de cellules. Chaque point représente une expérience
indépendante et exprime la moyenne des duplicatas/triplicatas par conditions. C,D :
Les mêmes explants on été cultivés soit dans 10% de SVF (C) soit dans 10% de SH
(D). La cytotoxicité est évaluée par mesure de la LDH dans les surnageants
d’explants. Les résultats représentent la moyenne +/- SEM de 4 expériences
indépendantes. E, F : Deux expériences indépendantes représentatives sont
présentés en E. Les résultats représentent la quantité cumulée de protéines virales
p24 (E) ou la quantité de LDH relarguée (F) dans le surnageant au cours de la
culture et sont exprimés en moyenne des duplicatas/triplicatas par conditions +/SEM.
176
177
Figure 3 : Comparaison de la viabilité des explants colo-rectaux cultivés
avec du SVF ou du sérum humain. La cytotoxicité après infection par du virus seul
dans les explants mis en culture dans du milieu contenant 10% de SVF a été
comparée à celle des explants mis en culture dans du milieu contenant 10% de SH.
Les résultats représentent la moyenne +/- SEM de 4 expériences indépendantes.
178
Figure 4 : Effet du LS sur l’infection par le VIH-1 et la viabilité des explants
cervicaux. Les explants sont incubés 3h à 37°C avec de l’inoculum (virus seul ou
virus plus LS 20%) puis lavés avec du PBS et mis en culture pendant 11 jours. Le
milieu de culture, contenant 10% de SVF ou de sérum humain AB- (SH) est
renouvelé entièrement jusqu’à J5 puis en partie seulement (400µl sur 1ml). Les
conditions sont testées en duplicata ou triplicata selon les donneurs. A : L’infection
est évaluée par dosage de la quantité de protéine virale p24 (en pg/ml) mesurée
dans les surnageants de chaque puits lors d’expérience indépendantes effectuées
sur des explants cervicaux de 13 donneurs différents. Les résultats représentent les
quantités de protéines virales p24 dans les surnageants, en cumulé, à J11 et sont
exprimés en moyenne des duplicata/triplicata par conditions +/- SEM (A). B : Mesure
en qPCR de l’ADN viral (LTR) dans les explants à J11 et exprimée en copie d’ADN
viral par million de cellules. Chaque point représente une expérience indépendante
et exprime la moyenne des duplicatas/triplicatas par conditions. C,D : Les mêmes
explants ont été cultivés soit dans 10% de SVF (C) soit dans 10% de SH (D). La
cytotoxicité est évaluée par mesure de la LDH dans les surnageants d’explants. Les
résultats représentent la moyenne +/- SEM de 4 expériences indépendantes. E, F :
Deux expériences indépendantes représentatives (l’une en SVF, explant 191113,
l’autre en SH, explant 51011) sont présentées en E. Les résultats représentent la
quantité cumulée de protéines virales p24 (E) ou la quantité de LDH relarguée (F)
dans le surnageant au cours de la culture et sont exprimés en moyenne des
duplicatas/triplicatas par conditions +/- SEM.
179
180
Figure 5 : Effet des sécrétions des cellules de l’environnement en réponse
au LS dans les explants sur l’infection des TZM-bl. Les explants sont incubés 3h
à 37°C avec de l’inoculum (RPMI ou RPMI plus LS 20%) puis lavés avec du PBS et
mis en culture pendant 3 jours. Le milieu de culture est renouvelé entièrement et
prélevé à J1 et J4. Les conditions sont testées en duplicata ou triplicata selon les
donneurs. Des TZM-bl sont infectées 3h avec un inoculum contenant du VIH-1 R5
SF 162 (2ng de p24/ml final) mélangé volume à volume avec du RPMI ou avec les
surnageants de culture précédemment récoltés. A : L’infection des cellules est
quantifiée par dosage de l’expression des gènes rapporteurs des TZM-bl et exprimé
en fold change par rapport à l’infection par du virus seul. B : L’activité métabolique
est évaluée par mesure de l’ATP produit par les cellules. Chaque point représente
une expérience indépendante effectuée sur des explants cervicaux de 5 donneurs
différents et exprime la moyenne des triplicatas par conditions.
181
182
Chapitre III
Fractionnement du liquide séminal et
identification des facteurs à activité
biologique sur l’infection par le VIH-1
183
Chapitre III : Fractionnement du liquide séminal et identification des
facteurs à activité biologique sur l’infection par le VIH-1
OBJECTIFS ET STRATÉGIES EXPÉRIMENTALES
Les études réalisées à ce jour indiquent que le LS est un fluide extrêmement
riche en protéines et qui possède des actions multiples qui peuvent, selon les
modèles cellulaires et les protocoles, soit favoriser, soit inhiber l’infection par le VIH.
Nos résultats (chapitres I et II) suggèrent fortement que l’effet global du LS dans des
modèles complexes (PBMC, tissus) correspond à la somme d’effets inhibiteurs et
stimulateurs de différents facteurs. Afin d’identifier les différents protéines/peptides
du LS avec une activité biologique sur l’infection par le VIH, nous avons choisi de
fractionner ce fluide par HPLC successives afin de le décomplexifier et d’identifier les
facteurs actifs par spectrométrie de masse.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Comme pour les chapitres précédents, les matériels et les méthodes relatifs à
cette étude ont été décrits plus en détail dans la partie « Matériels et Méthodes » de
ce manuscrit. Nous en résumons ici simplement les grandes lignes.
Le LS est fractionné par HPLC successives (échange d’anions, gel filtration
puis phase inverse). A chaque cycle chromatographique, l’activité des fractions est
testée en triplicat sur nos modèles cellulaires. Les fractions sont mélangées volume à
volume avec la souche de VIH-1 R5 SF162, pour former l’inoculum. Les TZM-bl ou
les PBMC sont incubés 3h à 37°C avec celui-ci (concentration finale de virus 2ng
p24/ml, concentration finale des fractions 10%). Après avoir remplacé l’inoculum par
du milieu, les cellules sont mises en culture. Après 2 jours de culture, pour les TZMbl, l’infection est évaluée par mesure de l’activité
System,
β-galactosidase (Gal-Screen
Applied Biosystem). Pour les PBMC, après 3 jours de culture, les
surnageants sont collectés et congelés pour un dosage indirect de l’infection,
évaluée via l’infection de TZM-bl par les surnageants de PBMC. Les TZM-bl sont
incubés pendant 3h en présence de surnageant de PBMC (dilué au 10 ème). Après 2
jours de culture, l’infection est évaluée par mesure de l’activité β-galactosidase (GalScreen System, Applied Biosystem).
184
Compte-tenu du grand nombre de fractions générées par la succession
d’étapes de chromatographie, les fractions voisines les plus actives sont réunies pour
être re-fractionnées pour la purification des facteurs impliqués. Le cycle
fractionnement/tests d’activité est répété jusqu’à l’obtention d’une fraction fortement
enrichie. Les protéines/peptides isolés sont alors caractérisés sur un spectromètre de
masse LTQ-Orbitrap XL ETD (ThermoFischer Scientific), utilisé sur la plate-forme
Protéomique Biogenouest. Les spectres de masse obtenus sont traités par deux
moteurs de recherche (Mascot et Proteome Discoverer). Ces moteurs de recherche
criblent à très haut-débit l’ensemble des bases de données biologiques
internationales non redondantes pour permettre l’identification des facteurs
biologiquement actifs.
RÉSULTATS
Détermination de la nature protéique des facteurs modulateurs de
l’infection
Afin de nous assurer que les effets du LS observés sur les modèles cellulaires
et tissulaires (cf chapitre I et chapitre II) sont liés à des facteurs protéiques, un aliquot
d’un pool de LS de 52 donneurs sains a été chauffé au bain marie à 95°C pendant
30 mn. Nous avons ensuite infecté des TZM-bl avec de faibles doses de virus de
souche R5 de VIH-1 (concentration finale de 2 ng de p24/ml) en présence de
différentes concentrations (1 %, 0.2 %, 0.04 %) du pool de LS chauffé ou non
pendant un temps d’exposition court (3 h).
Nos résultats montrent un effet stimulateur dose dépendant significatif sur
l’infection du LS non traité à la chaleur en comparaison à l’infection par du virus seul,
comme observé dans nos expérimentations précédentes. Au contraire, aucun effet
du LS traité à la chaleur n’est constaté sur l’infection par le VIH-1 R5 SF 162, et une
différence significative entre l’effet du LS non traité à la chaleur et celui du LS traité à
la chaleur est observée (p=0,0118). Ces résultats suggèrent donc que l’effet
modulateur du LS observé précédemment est dû à des facteurs protéiques
(Figure 1).
185
Effet stimulateur du pool de LS ultracentrifugé
En vue du fractionnement du liquide séminal et de l’identification des facteurs à
activité biologique sur l’infection par le VIH-1, un nouveau pool de liquide séminal
(pool D) de 21 donneurs VIH- a été constitué. Dans un 1er temps, nous avons voulu
nous assurer que ce nouveau pool de LS avait le même effet sur l’infection que ceux
précédemment testés en le comparant à notre pool A de LS de 52 donneurs VIH-. En
parallèle, nous avons ultracentrifugé à 105 000 g pendant 1 heure une partie du pool
D afin de le fractionner par HPLC dans un second temps. Nous avons donc
également évalué l’effet du pool D de LS ultracentrifugé sur l’infection par le VIH-1
sur nos modèles cellulaires. Pour cela, les PBMC et les TZM-bl ont été incubés
pendant 3 h en présence de VIH-1 R5 SF162 (2ng/ml) et de liquide séminal à
différentes concentrations. Le pool A ainsi que le pool D et son correspondant
ultracentrifugé, présentent tous les trois un effet stimulateur dose dépendant sur
l’infection qui est significatif par rapport à l’infection par du virus seul, aussi bien sur
TZM-bl que sur PBMC. Aucune différence significative n’est observée entre l’effet
des différents LS testés (Figure 2).
Fractionnement par chromatographie par échange d’anions des protéines
et peptides du liquide séminal
Le pool D de LS ultracentrifugé a subi un premier cycle de fractionnement par
HPLC échangeuse d’anions. Les protéines exclues présentes dans les 10 premières
fractions sont réunies. Tout comme les 32 tubes suivants elles ne montrent pas
d’absorbance. Les fractions 43 à 129 sont collectées séparément. Après avoir vérifié
que la concentration en sel des solvants utilisés pour l’HPLC échangeuse d’anions
était compatible avec nos tests d’activité biologique sur TZM-bl et PBMC par des
tests de cytotoxicité et d’infectivité (résultats non présentés), nous avons infecté des
TZM-bl et des PBMC avec des inocula contenant du virus VIH-1 de souche R5
SF162 (2ng/ml) mélangé ou non aux fractions (dilution finale 10%).
Les résultats d’infection sur PBMC montrent que plusieurs fractions
consécutives présentent un effet soit inhibiteur, soit stimulateur de l’infection par le
VIH-1. Ainsi les fractions 73-77 montrent un effet stimulateur sur l’infection alors que
les fractions 46-49, 55-61, 91-94, 115-119 et 123-125 ont un effet inhibiteur sur
186
l’infection par le VIH-1 des PBMC (Figure 3B). La viabilité des cellules a été évaluée
en parallèle par un test métabolique et n’a pas montré d’effet cytotoxique pouvant
être responsable de l’effet inhibiteur (résultats non présentés). Il n’a pas été tenu
compte des fractions ayant un effet différent des fractions consécutives ou
présentant un SEM trop important telles que les fractions 81 à 83.
L’effet des fractions sur l’infection des TZM-bl est moins prononcé que sur
l’infection des PBMC et seules les fractions 46-49 et 64-69 montrent un effet
inhibiteur sur l’infection par le VIH-1 (Figure 3 C).
Les fractions consécutives présentant un effet semblable sur l’infection par le
VIH-1 sont regroupées dans des pools nommés de la façon suivante : FA pour
désigner un pool de fraction anionique, suivi des numéros des premières et dernières
fractions réunies (FA46-49, FA55-61, FA64-69, FA73-77, FA91-94, FA115-119,
FA123-127).
Fractionnement par gel filtration des protéines et peptides des fractions
anioniques du liquide séminal
Les pools de fractions (FA46-49, FA55-61, FA64-69, FA73-77, FA91-94,
FA115-119, FA123-125) constitués après les tests biologiques consécutifs au
premier cycle d’HPLC ont été lyophilisés puis repris dans un tampon adéquat avant
de subir un deuxième cycle de fractionnement par HPLC sur colonne de gel filtration.
Pour chaque pool de fractions, 28 nouvelles fractions de gel filtration (FG) sont
obtenues et annotées FA X-Y/FGn (n : numéro de la fraction récupérée). L’effet sur
l’infection par le VIH-1 de chacune d’elle est testé sur PBMC, en même temps que
l’effet du pool de fractions anioniques correspondant.
Les résultats d’infection sur PBMC montrent que les fractions obtenues par gel
filtration présentent à nouveau un effet soit inhibiteur soit stimulateur de l’infection par
le VIH-1.
Parmi les fractions obtenues suite à l’HPLC par gel filtration des pools FA46-49,
FA55-61, FA64-69, FA91-94, FA115-119, FA123-127, nous avons choisi de nous
intéresser dans un premier temps aux fractions présentant un effet inhibiteur sur
l’infection (en rouge, Figure 4B). En effet, les fractions regroupées pour le deuxième
187
cycle de fractionnement révélaient une activité inhibitrice sur l’infection par le VIH-1,
activité qui est confirmée par l’effet du pool de fractions anioniques sur l’infection par
le VIH-1 (Figure 4 B) à l’exception du pool 64-69.
A l’inverse, pour les fractions obtenues suite à l’HPLC par gel filtration du pool
FA73-77, nous avons choisi de nous intéresser dans un premier temps aux fractions
présentant un effet stimulateur sur l’infection (en bleu, Figure 4B). En effet, les
fractions réunies pour le 2ème cycle de fractionnement révélaient une activité
stimulatrice sur l’infection par le VIH-1, activité qui est confirmée par l’effet du pool de
fractions anioniques sur l’infection par le VIH-1 (Figure 4 B).
Des gels d’électrophorèse avec coloration au nitrate d’argent ont été réalisés
afin de visualiser en partie la complexité des fractions FG obtenues (Figure 4C). La
faible coloration voire l’absence de coloration obtenue pour certaines fractions
suggère une concentration protéique extrêmement faible. A l’inverse, pour certaines
fractions FG la coloration de plusieurs bandes protéiques indique la présence de
plusieurs protéines/peptides différents et suggère que la complexité protéique de la
fraction nécessite un 3ème cycle de fractionnement (HPLC en phase inverse).
Les chromatogrammes des fractionnements par HPLC gel filtration présentent
les valeurs d’absorbance à 210 nm et 280 nm sous la forme de pics plus ou moins
individualisés (Figure 4A) et reflètent la concentration protéique et la complexité de la
fraction. Leur analyse et celle des gels d’électrophorèse (Figure 4C), ont permis de
sélectionner les fractions FG d’intérêt qui devront subir un 3 ème cycle de
fractionnement (FA46-49/FG14-15 ; FA46-49/FG20-24 ; FA46-49/FG28-30 ; FA4649/FG34-37 ; FA55-61/FG13-19 ; FA55-61/FG23-24 ; FA55-61/FG27-32 ; FA5561/FG34-37 ; FA64-69/FG24-27 ; FA73-77/FG31-39 ; FA91-94/FG15-16, /FG1821 et FA115-119/FG27) et celles pour lesquelles une identification des peptides et
protéines par spectrométrie de masse pouvaient être d’ores et déjà envisagée.
Identification des facteurs biologiques par spectrométrie de masse
Une identification par spectrométrie de masse après le 2 ème cycle de
fractionnement a été réalisée sur les fractions montrant une faible complexité
protéique – pics d’absorbance bien individualisés – et/ou une faible concentration
protéique (Figures 4A et 4C) : fractions FA91-94/FG12, /FG24, /FG33-34, /FG36-37 ;
188
FA115-119/FG15-16, /FG19-20, /FG29, /FG33-35 ; FA123-125/FG12-14, /FG19,
/FG21, /FG24, /FG27, /FG33-35.
L’identification par spectrométrie de masse sur LC-MS/MS des peptides et
protéines de la fraction FA91-94/FG12, a permis d’identifier plusieurs fragments issus
des protéines suivantes : la PIP (prolactin-inducible protein), la séménogéline 1, la
séménogéline 2, la PAP (prostatic acid phosphatase), la clusterine, la mucine 6, la
carboxypeptidase, la molécule du complément C3, l’actine, la glutamine γ
glutamyltransférase 4, la lipoprotéine lipase et l’albumine sérique (Table 1). La liaison
de certaines de ses protéines aux protéines virales ou aux récepteurs du VIH-1 et
donc leur rôle dans l’infection par le VIH-1 a déjà été décrit (Bouhlal et al. 2002;
Munch et al. 2007; Martellini et al. 2009; Stax et al. 2009; Kim et al. 2010; Roan et al.
2011; Sabatte et al. 2011; Roan et al. 2014b).
L’identification par spectrométrie de masse sur Orbitrap des peptides et
protéines de la fraction FA115-119/FG15-16 n’a permis de mettre en évidence que
de la Kératine, protéine majoritaire dans l’échantillon et pouvant masquer
l’identification des protéines d’intérêt. Pour les autres fractions, aucune protéine n’a
pu être identifiée et ce probablement à cause d’une concentration protéique trop
faible ne permettant pas la détection par le spectromètre.
Par ailleurs, après coloration au nitrate d’argent, les gels sont excisés autour
des bandes d’intérêt qui sont ensuite digérées à l
a trypsine. Une identification
par spectrométrie de masse a été réalisée sur les peptides de digestion afin d’en
évaluer la complexité. Cela a permis de générer plusieurs listes de peptides
identifiés. Parmi ces nombreux peptides, correspondant à une cinquantaine de
protéines, des fragments de la PIP et de la fibronectine sont identifiés dans plusieurs
bandes.
Comparaison de certains peptides identifiés dans la littérature par
alignement de séquence
Afin de comparer les séquences des fragments protéiques identifiés par
spectrométrie de masse à celles des peptides connus pour interagir avec les VIH-1
tels que SEVI, et les fragments de SEM1 et SEM2 (Munch et al. 2007; Kim et al.
189
2010; Roan et al. 2011) ou avec le récepteur CD4 telle que la PIP, nous avons
réalisé un alignement de séquence.
L’alignement de séquence de nos deux peptides de digestion de la PIP
présente dans la fraction FA91-94/FG12 avec ceux mis en évidence par
Basmaciogullari et al. (peptide 4 et peptide 81) montre que l’un d’eux correspond à
une partie de la région en C-terminal impliquée dans la liaison au récepteur CD4
(peptide 81) (Basmaciogullari et al. 2000) (Figure 5).
L’alignement de nos deux peptides de digestion de la PAP montre qu’il s’agit
des fragments PAP48-59 et PAP164-179 alors que le fragment de PAP qui permet la
formation de SEVI est le fragment PAP248-286 (Munch et al. 2007). De la même
façon,
les fragments de
séménogéline que
nous avons caractérisés ne
correspondent pas à ceux mis en évidence par Roan et al. (Roan et al. 2011; Roan
et al. 2014b).
La fibronectine a été identifiée dans notre fraction grâce à la présence de 12
peptides de digestion différents. Nous n’avons pas trouvé parmi eux le pentapeptide
GRGDS, site de liaison de la fibronectine au VIH-1 (Pugliese et al. 1996). En
revanche deux d’entre eux se retrouvent dans la région C-terminale contenant le
domaine de liaison à l’héparine (aa1720-aa1988) (Skorstengaard et al. 1986; Bozzini
et al. 1998). Cette région est impliquée dans la liaison aux protéines gp120 et gp160
et l’inhibition de l’infection par le VIH-1 et pourrait participer à l’effet inhibiteur de
notre fraction (Figure 5B).
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Alors que la présence de molécules antimicrobiennes dans le LS a été mise en
évidence depuis plus de 50 ans (Gurevitch et al. 1951) et qu’il a été montré que ces
molécules ( défensines, cathélicidines et autres peptides) étaient produites par le
tractus génital mâle (Grandjean et al. 1997; Malm et al. 2000; Com et al. 2003),
seules quelques études se sont intéressées au rôle direct du LS sur l’infectivité du
VIH-1 (Bouhlal et al. 2002; Munch et al. 2007; Sabatte et al. 2007; Martellini et al.
2009; Balandya et al. 2010; Kim et al. 2011; Roan et al. 2011).
Nos résultats montrent que le LS exercerait une activité globalement
stimulatrice sur l’infection de PBMC et de TZM-bl par le VIH-1 et que cet effet serait
190
lié aux facteurs protéiques du LS. Cependant, nous avons mis en évidence (Chapitre
I) que l’effet du LS sur l’infection des cellules cibles du VIH est complexe et résulte
très vraisemblablement de la somme d’effets inhibiteurs et stimulateurs. Les tests
d’activité biologique réalisés sur les fractions après la 1 ère HPLC confirment cette
hypothèse : ainsi certaines fractions du LS inhibent l’infection par le VIH-1 tandis que
d’autres la stimulent.
La comparaison des profils de l’effet des fractions sur l’infection par le VIH-1
des TZM-bl ou des PBMC, modèle cellulaire plus complexe, suggère que le ou les
facteurs biologiques actifs dans les fractions 46-49 et 64-69 qui ont un effet à la fois
sur l’infection des TZM-bl et sur les PBMC pourraient agir soit directement sur le
virus, soit en modulant l’attachement et l’entrée du virus dans les cellules, les TZM-bl
constituant un modèle cellulaire à cycle viral unique. Les mécanismes d’action pour
les facteurs biologiques présents dans les autres fractions actives uniquement sur
PBMC pourraient soit agir
par ces mêmes mécanismes, soit en inhibant la
réplication du virus, en modifiant par exemple l’état d’activation des cellules cibles du
virus et la réponse des autres cellules immunitaires (lymphocytes T CD8+, cellules
NK…), ces derniers effets ne pouvant être observés sur la lignée TZM-bl.
A l’issue du 2ème fractionnement, nous avons cherché à identifier des protéines
dans certaines des fractions d’intérêt. Pour une partie d’entre elles, la concentration
protéique était trop faible pour permettre une identification malgré la mise en
évidence d’une activité biologique. Ce résultat, bien que surprenant, suggère que
certains composants du sperme pourraient moduler l’infection à de très faibles
concentrations. Si on prend pour exemple la fraction FA123-125/FG27, celle-ci
présente une activité inhibitrice sur l’infection et l’absorbance observée sur le
chromatogramme de la 2ème HPLC laissait supposer une forte concentration
protéique. Pourtant l’électrophorèse avec coloration au nitrate d’argent n’a révélée
aucune bande et la spectrométrie de masse n’a pas permis de mettre en évidence et
d’identifier de protéine. On peut donc supposer que cette fraction contient de
nombreuses protéines en très faible concentration et que celles-ci exercent
éventuellement une action synergique pour inhiber l’infection par le VIH-1. Ceci
confirmerait les résultats de Martellini et al. (Martellini et al. 2009) qui avaient montré
191
que le LS avait une action inhibitrice sur l’infection par le VIH-1 même à de très faible
concentration (dilution au 3200ème).
L’analyse par spectrométrie de masse sur les bandes de gel d’électrophorèse,
bien qu’informative, présente l’inconvénient de ne fournir qu’une information partielle.
En effet, seules les bandes colorées au nitrate d’argent et visibles ont été
découpées. Or les plus petites protéines ont pu migrer en dehors du gel et ne
pourront donc pas être visualisées et identifiées par spectrométrie de masse. D’autre
part, des protéines peuvent être présentes en faible concentration et ne pas être
visibles sur le gel après coloration. Malgré tout la liste des peptides obtenus confirme
la complexité des fractions correspondantes et la nécessité de procéder à une
nouvelle étape de fractionnement par HPLC.
La spectrométrie de masse sur la fraction inhibitrice FA91-94/FG12 digérée par
la trypsine a permis d’identifier des peptides issus de 13 protéines. Parmi celles-ci,
on retrouve la PIP, la séménogéline 1, la séménogéline 2, la PAP et la clusterine
déjà présentes dans la liste de polypeptides inhibiteurs de l’infection par le VIH-1 de
Martellini et al. (Martellini et al. 2009).
La PIP, aussi appelé gp17/SABP/EP-GP, est exprimée par les glandes
salivaires et lacrymales et, ce qui nous intéresse plus particulièrement, par les
vésicules séminales, et elle se retrouve en abondance dans les fluides corporels
(sang, lait, fluide amniotique, sperme) (0,5-1mg/ml dans le LS) (Basmaciogullari et al.
2000; Umadat et al. 2013).
Elle est également retrouvée dans la région post-
acrosomale des spermatozoïdes et reste liée à leur surface après capacitation jouant
probablement un rôle dans la fertilité (Bergamo et al. 1997). La PIP possède la
capacité à se lier au récepteur CD4. Cette interaction forte induit un changement de
conformation du CD4 ce qui empêche sa liaison à la gp120 et donc inhibe l’infection
par le VIH-1 (Autiero et al. 1991; Autiero et al. 1997).
Basmaciogullari et al. (Basmaciogullari et al. 2000) ont démontré que deux
régions en N-terminal et C-terminal de la protéine sont importantes pour la liaison au
CD4. Les acides aminés D115--R118E119, D125D126 (Figure 5) semblent se lier au
CD4 alors que les autres acides aminés jouent un rôle dans la conformation du site
de liaison au CD4 (Basmaciogullari et al. 2000). Or un des fragments de la PIP que
192
nous avons identifié par spectrométrie de masse contient les acides aminés E119 et
D125D126 précédemment cités. Ce même fragment est retrouvé parmi les peptides
identifiés à partir de certaines bandes d’électrophorèse. On peut donc émettre
l’hypothèse que le fragment de la PIP présent dans notre fraction avant digestion
trypsique préalable à l’analyse par spectrométrie de masse, correspond à la région
C-terminale qui lie le récepteur CD4.
D’autres activités de la PIP ont été également mises en évidence, une liaison
potentielle aux fragments de séménogéline 1 (Tomar et al. 2013) et une activité
aspartyl-protéase qui lui permet de dégrader la fibronectine par clivage (Caputo et al.
2000; Naderi and Meyer 2012).
Dans ce contexte, il faut noter que la fibronectine fait partie des 13 protéines
que nous avons identifié dans notre fraction inhibitrice. La fibronectine peut se lier au
VIH-1 par ses séquences pentapeptidiques GRGDS (Pugliese et al. 1996) mais
aucune de ces séquences n’a été trouvée dans nos peptides de digestion. La
fibronectine peut également se lier aux protéines gp120 et gp 160 du VIH-1 par son
domaine de liaison héparine entraînant une diminution de l’infection par le VIH-1
(Bozzini et al. 1998). Deux des peptides de digestion identifiés sont issus de cette
région, celle-ci pourrait être impliquée dans l’effet inhibiteur de la fraction. Une autre
étude a montré que la fibronectine peut également être liée de façon covalente à des
protéines inhibitrices du VIH-1 telles que l’élafine et la trappine 2, via l’action de
transglutaminase (Moreau et al. 2008). Or une protéine de cette famille a été
identifiée dans notre fraction inhibitrice. Il s’agit de la protéine glutamine γ
glutamyltransférase 4. Cette enzyme catalyse la formation de liaison covalente entre
les protéines. Elle est sécrétée de façon spécifique par la prostate (Grant et al.
1994).
Ces activités de la fibronectine vont dans le sens d’une modulation inhibitrice de
l’infection par le VIH-1 comme montrée dans notre fraction, mais la fibronectine peut
aussi se lier à la surface des cellules épithéliales via son interaction avec la β1intégrine, ce qui favorise la liaison du virus aux muqueuses et facilite l’infection par le
VIH-1 (Maher et al. 2005).
193
Enfin la fibronectine participe également à la formation du coagulum séminal et
interagit avec la séménogéline 1 et la séménogéline 2 (Roan et al. 2014a). Si
Martellini et al. (Martellini et al. 2009) ont émis l’hypothèse que les séménogélines 1
et 2 étaient impliquées dans l’effet inhibiteur de LS qu’ils ont mis en évidence, Roan
et al, ont montré, en revanche, que des fragments de séménogéline 1 et 2 après
clivage par la PSA s’agrégeaient pour former des fibrilles amyloïdes qui stimulent
l’infection in vitro par le VIH-1 (Roan et al. 2011). De la même façon, la PAP,
présente parmi les protéines identifiées, est clivée en fragments spécifiques,
nommés SEVI, qui s’agrègent en fibrilles amyloïdes et stimulent l’infection par le
VIH-1 (Munch et al. 2007; Kim et al. 2010). Il faut noter que nos peptides de
digestion identifiés de la séménogéline 1 et 2 et de la PAP ne sont pas les mêmes
que les fragments spécifiques stimulateurs de l’infection décrits par Munch et al. et
Roan et al. dans leur publication (Munch et al. 2007; Roan et al. 2014b).
Deux autres protéines, pour lesquelles une action sur l’infection par le VIH-1 a
été montrée dans des études précédentes, ont été identifiées. Il s’agit de la
clusterine et de la mucine-6. Ces deux protéines en fortes concentrations dans le
sperme, sont des ligands de DC-SIGN qui inhibent la capture du VIH-1 par les DC et
la transmission au LT CD4+ et donc l’infection par le VIH-1 (Sabatte et al. 2007; Stax
et al. 2009; Sabatte et al. 2011). Les études ayant mis en évidence l’action de ces 2
protéines sur les DC ont également montré que la clusterine et la mucin-6 n’avaient
pas d’effet sur l’infection des PBMC (Sabatte et al. 2007; Stax et al. 2009; Sabatte et
al. 2011). Celles-ci ne semblent donc pas être impliquées dans l’activité inhibitrice de
notre fraction.
Nous avons également identifié la molécule de complément C3. L’étude menée
par Bouhlal et al (Bouhlal et al. 2002) a montré in vitro que les molécules du
complément C3 contenues dans le sperme sont activées par le VIH-1. Les fragments
C3 clivés générés stimuleraient l’infection des LT et macrophages.
Enfin, l’actine a également été identifiée. Bien que le rôle central du
cytosquelette d’actine dans l’infection par le VIH-1 (Rocha-Perugini et al. 2014), dans
l’établissement de synapse immunologique et dans l’activation des LT (Roumier et al.
2001) (Lasserre and Alcover 2010) ait été mis en évidence, le rôle de l’actine
présente dans le sperme n’a pas encore été montré.
194
Concernant les autres protéines identifiées, la carboxypeptidase, la lipoprotéine
lipase et l’albumine sérique, aucun lien direct ou indirect n’a pu être trouvé dans la
littérature.
A ce stade de nos travaux, deux protéines candidates semblent donc se
dégager pour expliquer l’action inhibitrice de la fraction FA91-94/FG12, la
fibronectine et la PIP.
Pour la suite de cette étude, l’activité biologique des fractions issues d’un 3ème
cycle de fractionnement par phase inverse sera testée. Les tests d’activité biologique
seront réalisés après vérification que la quantité de peptides/protéines présente dans
ces fractions est suffisante pour une identification par spectrométrie de masse. Puis
comme précédemment, les protéines/peptides isolés dans les fractions actives
seront caractérisés par spectrométrie de masse.
Parallèlement, nous tenterons de confirmer l’implication de la fibronectine et/ou
de PIP dans l’effet inhibiteur de la fraction FA91-94/FG12 sur l’infection. Pour cela,
nous pourrons envisager de tester l’effet de la fraction sur l’infection par le VIH-1 en
présence d’anticorps soit anti-fibronectine soit anti-PIP. Si cette expérience s’avère
concluante, elle pourra être appliquée pour les protéines d’intérêts qui seront mises
en évidence après la 3ème HPLC. Nous pouvons également prévoir l’utilisation de
peptides synthétiques ou de protéines recombinantes pour tester leurs effets en
concentration physiologique sur l’infection par le VIH-1 dans nos modèles cellulaires
et tissulaires.
Enfin, il pourrait être intéressant de quantifier dans le liquide séminal d’hommes
séropositifs et séronégatifs, les différents peptides/protéines pour lesquels un effet
sur l’infection par le VIH-1 aura été confirmé. Cette quantification pourrait se faire par
SRM (Single Reaction Monitoring, Isotope coded Protein Label) si aucun outil de
dosage n’existe.
195
Figure 1 : Effet d’un traitement à la chaleur sur l’effet du LS d’hommes noninfectés sur l’infection par le VIH-1 (souche R5 SF162) dans le modèles TZM-bl.
Les cellules ont été incubées pendant 3h en présence de virus (2ng de p24/ml ; MOI
: 0,1 sur TZM) et de liquide séminal. Le liquide séminal a été ou non chauffé au bainmarie à 95°C pendant 30mn. Il a été utilisé à la dilution indiquée sur le graphique,
correspondant à la dilution dans l’inoculum. Des tests d’infectivité ont été réalisés par
dosage de l’expression des gènes rapporteurs des TZM-bl. Les résultats des tests
d’infectivité sont exprimés en fold change par rapport au virus seul. Ils représentent
la moyenne +/- SEM entre 3 expériences réalisées avec 1 pool de liquide séminal,
chaque condition étant testée en triplicata. Le pool (n=52 donneurs) a été préparé
par centrifugation à 1 000 g pendant 10 min et a été utilisé dans les expériences
précédentes (cf. chapitre 1). (Test statistique : test non paramétrique de WilcoxonMann-Withney * p<0.05, ** p<0.01, valeurs significatives par rapport au virus seul).
196
Figure 2 : Effets du LS d’hommes non-infectés sur l’infection par le VIH-1
(souche R5 SF162) dans deux modèles cellulaires. Les PBMC (A) et les TZM (B)
ont été incubées pendant 3h en présence de virus (2ng de p24/ml ; MOI : 0,01 sur
PBMC et 0,1 sur TZM) et de liquide séminal. Le liquide séminal a été utilisé à la
dilution indiquée sur le graphe, correspondant à la dilution dans l’inoculum. Des tests
d’infectivité ont été réalisés par dosage de la protéine virale p24 dans le surnageant
des PBMC (A) ou par dosage de l’expression des gènes rapporteurs des TZM (B).
Les résultats des tests d’infectivité sont exprimés en fold change par rapport au virus
seul. Ils représentent la moyenne +/- SEM entre 3 expériences réalisées pour
chaque pool de liquide séminal, chaque condition étant testée en triplicata. Le pool A
(n=52 donneurs) a été préparé par centrifugation à 1 000 g pendant 10 min et a été
utilisé dans les expériences précédentes (cf. chapitre 1), et le pool D (n=21
donneurs) a été constitué pour le fractionnement par HPLC. Un partie du pool D a
été préparée par centrifugation à 1 000 g pendant 10 min, l’autre partie a été
centrifugée à 105 000g pendant 1h (Ultra Pool D). (Test statistique : test non
paramétrique de Wilcoxon-Mann-Withney * p<0.05, ** p<0.01, valeurs significatives
par rapport au virus seul).
197
Figure 3 : Fractionnement des protéines et peptides du liquide séminal par
HPLC échangeuse d’anions et test d’activité biologique des fractions. (A) Le
chromatogramme présenté est représentatif de 2 fractionnements indépendants
réalisés sur un pool de 21 liquides séminaux. (B, C) Un aliquote de chaque fraction
est utilisé pour des tests d’activité biologique sur l’infection par le VIH-1 (souche R5
SF162). Les PBMC (B) et les TZM (C) ont été incubés pendant 3h en présence de
virus (2ng de p24/ml ; MOI : 0,01 sur PBMC et 0,1 sur TZM) et de fractions
mélangées volume à volume avec le virus pour une dilution finale au 1/10. Des tests
d’infectivité ont été réalisés par infection de TZM-bl avec les surnageants des PBMC
(dilution finale 10%) (B) et par dosage de l’expression des gènes rapporteurs des
TZM-bl (C). Les résultats des tests d’infectivité sont exprimés en fold change par
rapport au virus seul. Ils représentent la moyenne +/- SEM entre 2 expériences,
chaque condition étant testée en triplicata.
198
199
Figure 4 : Fractionnement des protéines et peptides des pools de fractions de
l’HPLC échangeuse d’anions par HPLC
gel filtration et test d’activité
biologique des fractions. (A) Le chromatogramme présente la valeur d’absorbance
à 210 nm et 280 nm au cours du temps d’élution.
(B) Un aliquote de chaque fraction est utilisé pour des tests d’activité biologique sur
l’infection par le VIH-1 (souche R5 SF162). Les PBMC ont été incubées pendant 3h
en présence de virus (2ng de p24/ml ; MOI : 0,01) et de fractions mélangées volume
à volume avec le virus. Des TZM-bl sont ensuite incubées en présence des
surnageants des PBMC (dilution finale 10%) pendant 3h. L’infection des TZM-bl,
reflet de l’infection des PBMC, est mesurée par dosage de l’expression des gènes
rapporteurs des TZM-bl. Les résultats des tests d’infectivité sont exprimés en « fold
change » par rapport au virus seul. Ils représentent la moyenne +/- SEM des
triplicatas.
(C) Electrophorèse des fractions protéiques d’intérêts. M : standard de poids
moléculaires en kDa. Les protéines ont été colorées au nitrate d’argent.
200
201
202
203
204
205
206
207
208
Figure 5 : Alignement des séquences d’acides aminés.
A : de la PIP, du peptide 81 (P81) impliqué dans la liaison de la PIP au récepteur
CD4 et du fragment identifié par spectrométrie de masse (MSMS1)
B : d’une partie de la fibronectine avec deux fragments identifiés par spectrométrie
de masse MSMS2 et MSMS3. Le domaine de liaison à l’héparine, de la fibronectine,
impliqué dans la liaison à la Gp120 et la Gp160 se situe entre les acides aminés
1720 et 1988 (Bozzini 1998, Skorstengaard 1986).
209
210
DISCUSSION
GENERALE
211
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
L’objectif de ma thèse a été de répondre à la question suivante : quel est l’effet
du liquide séminal sur l’infection par le VIH-1 ? Pour tenter de répondre à cette
question nous avons développé trois approches distinctes mais complémentaires.
D’une part, l’analyse in vitro dans des modèles cellulaires de l’effet du liquide séminal
d’hommes infectés par le VIH-1 comparé à celui de donneurs sains sur l’infectivité.
D’autre part, l’analyse ex vivo sur des modèles tissulaires de l’effet du liquide séminal
d’hommes sains sur l’infectivité. Et enfin, la recherche d’identification de facteurs
stimulateurs ou inhibiteurs de l’infection présents dans le liquide séminal d’hommes
sains via une approche protéomique.
Les travaux réalisés au cours de ma thèse nous ont permis de :
- Mettre en évidence pour la première fois à notre connaissance un effet
différentiel du LS d’hommes séropositifs par rapport au LS d’hommes séronégatifs.
L’effet stimulateur observé du LS d’hommes non-infectés sur l’infection par le VIH-1
des cellules T CD4+ est significativement diminué pour les LS d’hommes VIH+ et
ceci semble au moins en partie lié à des différences d’expression du corécepteur
CCR5.
- Montrer sur des cultures organotypiques que le LS induit une diminution de
l’infection ex vivo des tissus exocervicaux alors qu’aucun effet n’est observé sur
l’infection des tissus colo-rectaux ;
- Décomplexifier le LS par fractionnement grâce à des HPLC successives, de
sélectionner des fractions biologiques actives et d’identifier deux protéines
candidates, par spectrométrie de masse, potentiellement responsables d’un effet
inhibiteur.
Dans cette dernière partie, nous discuterons de l’effet du LS sur la transmission
du VIH-1, des avantages mais aussi des limites de chacune des approches et
stratégies
expérimentales
choisies.
Nous
proposerons
alors
de
nouvelles
expériences qui pourront être mises en place pour approfondir et/ou poursuivre ce
travail.
212
I.
AVANTAGES ET LIMITES DE NOS MODELES D’ETUDES
Dans ces trois chapitres, nous avons utilisé des modèles d’étude (culture
organotypique et isolement de cellules) qui tentent au mieux de répondre aux
questions posées mais également de se rapprocher au maximum d’une réalité
physiologique. Cependant nos modèles ont bien sûr des limites et nous essayerons
ici de les détailler et d’explorer d’autres moyens d’études.
a. Les modèles d’étude pour l’analyse de la transmission par voie
sexuelle du VIH : avantages et inconvénients
Afin de pallier notamment aux difficultés d’accès aux organes ou cellules de la
muqueuse chez l’humain, les chercheurs ont développé des modèles permettant
d’étudier l’effet du sperme sur la transmission du VIH.
Les modèles cellulaires in vitro constituent des outils essentiels à la
compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de la transmission du
VIH. Les modèles cellulaires qui ont été utilisés sont majoritairement des lignées
cellulaires immortalisées et très souvent des cellules épithéliales génitales
immortalisées : TZM-bl, HEC-1, End-1, SiHa, Ect 1 pour la muqueuse cervicovaginale (Berlier et al. 2005; Berlier et al. 2006b; Munch et al. 2007; Saidi et al. 2007;
Sharkey et al. 2007), CaCo2 pour la muqueuse colorectale (Rohan et al. 2010); ou
bien des lignées de lymphocytes T immortalisés : CEM, PM-1, Jurkat, Molt-4,
MT4…(Munch et al. 2007; Sabatte et al. 2007; Stax et al. 2009). Les lignées
cellulaires sont faciles d’accès, facilement à long terme, en grande quantité et à
faible coût. Elles permettent une bonne reproductibilité des expériences en limitant
les variations inter-individuelles liées aux cellules primaires directement isolées de
patients et présentent des caractéristiques proches de celles des cellules ex vivo,
notamment en termes d’expression de récepteurs membranaires et de différenciation
cellulaire. Les cellules primaires isolées ou non, différenciées ou non (PBMCs, LT,
DC, macrophages, kératinocytes primaires du col de l’utérus (Michelini et al. 2004),
ou cellules primaires provenant de la muqueuse vaginale (Bobardt et al. 2007)
constituent des modèles cellulaires qui présentent des caractéristiques plus
physiologiques que les lignées cellulaires mais elles sont plus difficiles à préparer et
à maintenir en culture [pour revue (Arien et al. 2012)]. Des modèles d’épithéliums
polarisés reconstitués avec des lignées cellulaires et/ou des cellules isolées
213
(muqueuse cervico-vaginale, prépuce) cultivés sur des filtres peuvent également être
utilisés. Ces modèles permettent de mimer la polarisation des cellules dans la
muqueuse avec une face apicale (lumière) et une face basale (sous-muqueuse)
(Bomsel 1997; Cremel et al. 2005; Bobardt et al. 2007; Saidi et al. 2007; Van
Herrewege et al. 2007; Mesquita et al. 2009; Gali et al. 2010; Nazli et al. 2010), pour
revue (Arien et al. 2012) et de polariser l’infection. Ces modèles permettent d’évaluer
la capacité du VIH-1 à traverser la muqueuse par transcytose en dosant le virus
retrouvé dans le milieu basal (Bomsel 1997; Bobardt et al. 2007) ou d’étudier la
transmigration de cellules immunitaires telles que les cellules de Langerhans (Cremel
et al. 2005) ou les MDM infectés (Carreno et al. 2002; Lawrence et al. 2012). Ces
modèles in vitro reproductibles et modulables permettent d’étudier les premières
étapes de la transmission sexuelle du VIH-1 mais ne permettent pas de tenir compte
de l’ensemble des interactions cellulaires et de l’ensemble des facteurs présents in
vivo.
Dans le cas de notre étude sur l’effet du LS sur les lymphocytes T CD4+, nous
avons utilisé des lymphocytes sanguins qui peuvent présenter des caractéristiques
sensiblement différentes des lymphocytes muqueux (Slutter and Harty 2014) et qui
ont été fortement activés par la PHA et l’IL-2 pour faciliter leur infection in vitro. En ce
qui concerne les interactions cellulaires, nous avons initialement testé l’infection
d’une population de PBMC qui comprend d’autres cellules immunitaires que les
lymphocytes T CD4+ (lymphocytes T CD8+, cellules NK…). Nous n’avons pas
observé de différence d’effet du LS sur les PBMC par rapport aux lymphocytes T
CD4+ purifiés, suggérant que le LS n’impacte pas ces cellules. Toutefois, les
proportions de cellules immunitaires et leurs caractéristiques sont bien différentes
entre le sang et les muqueuses.
Les modèles de muqueuse ex vivo constituent une alternative en principe
encore plus physiologique que la culture primaire de cellules isolées : en effet, les
interactions entre les différents types cellulaires présents dans les tissus sont ici
préservées. Par ailleurs, les cellules primaires immunitaires sont souvent isolées du
sang. En revanche, les modèles tissulaires permettent l’étude des cellules cibles
dans un milieu et un environnement cellulaire conditionné, l’étude des mécanismes
d’interaction entre les cellules de la muqueuse et le virus lors de la transmission du
214
VIH-1, l’étude des modifications structurales (Michelini et al. 2005) et physiologiques
de la muqueuse suite à l’exposition à du virus, à du LS ou à des microbicides, etc.
Les cultures organotypiques (explants cervicaux, colorectaux présentés dans cette
thèse, et les explants de prépuce, urètre etc…) (Grivel and Margolis 2009; Ganor and
Bomsel 2010; Cavarelli et al. 2013) permettent de partiellement préserver
l’architecture de la muqueuse in vivo
ainsi que l’environnement cellulaire et
cytokinique local.
L’une des limites majeures des cultures organotypiques est l’hétérogénéité
inter-explant qui rend difficile l’interprétation des résultats ((Merbah et al. 2011) 2011;
Arien, 2012 #12402; Grivel, 2000 #12400}. Cette variabilité est liée d’une part aux
donneurs et d’autre part à la composition variable en différents types cellulaires d’un
explant à l’autre. L’autre limite majeure est la perte de l’étanchéité et de l’intégrité de
la muqueuse au cours de la culture. Ainsi dans les cultures d’exocol, une perte des
couches supérieures de l’épithélium est observée avec le temps (Michelini et al.
2004; Southern et al. 2011). D’autre part, la dédifférenciation des cellules épithéliales
induite par l’utilisation de sérum dans le milieu de culture n’est pas optimale pour
mettre en évidence une infection potentielle des cellules épithéliales ou un effet de
leurs sécrétions. De plus, les explants sont généralement cultivés ex vivo dans du
milieu contenant des antibiotiques et des antifongiques susceptibles d’altérer la flore
microbienne locale qui joue un rôle dans l’infection par le VIH-1. Cette altération de
l’organe durant la culture pourrait donc influencer les résultats obtenus lors des
études sur modèles ex vivo.
Par ailleurs, l’absence de polarisation dans nos modèles d’explant ne permet
d’étudier que la capacité de l’organe à s’infecter en présence ou non de LS et ne
permet pas d’étudier les mécanismes de transcytose et/ou transmigration impliqués
dans la transmission du VIH-1 et qui pourraient être influencés par le LS. D’autre
part, les explants sont obtenus à partir d’hystérectomies pour prolapsus pour les
tissus cervicaux et de colectomies pour cancer colorectal ou diverticulose pour les
tissus colorectaux. Bien que seuls les tissus sains, déterminés comme normaux par
l’examen anatomopathologique, soient utilisés, aucune donnée en dehors de l’âge
n’est fournie, que ce soit le statut hormonal de la patiente, l’existence ou non
d’éventuelles coinfections, les traitements antibiotiques reçus, etc. Certains patients
215
ne sont donc peut-être pas représentatifs de la situation dans la population
séronégative.
Les modèles animaux pour l’étude de la transmission du VIH, bien
qu’indispensables, présentent eux aussi des limites. Ainsi le modèle de primates non
humains, bien qu’il soit le plus proche de l’homme, ne permet pas une extrapolation
totale : d’une part, les souches virales utilisées pour infecter ces animaux (SIV ou
SHIV) présentent des différences notables par rapport au VIH (génotype,
phénotype, tropisme, virulence…) ; d’autre part, l’environnement muqueux présente
des différences importantes en comparaison avec la muqueuse humaine : (i) la flore
microbienne dans le TGF des macaques est différente de la flore microbienne
humaine, en particulier dans le cas des macaques Rhésus ; (ii) le pH des sécrétions
vaginales dans les modèles primates non humain est compris entre 6 et 8 alors que
dans le tractus génital féminin humain il permet la mise en place d’un environnement
acide délétère pour les virions, tamponné de façon transitoire par le sperme. Les
effets du sperme dans ce modèle pourraient donc être différents de ceux chez
l’homme.
b. Les souches virales utilisées
Dans l’ensemble de nos études nous avons utilisé des souches dites de
laboratoire à tropisme R5 pour la souche SF162 et à tropisme X4 pour la souche IIIB.
L’utilisation de telles souches peut être discutable au vu des isolats primaires
disponibles et des techniques de génétique inverse permettant la génération de virus
présentant une enveloppe déterminée. Les souches utilisées ici présentent le confort
d’une réplication abondante ce qui permet l’obtention de stocks viraux conséquents.
De plus la souche SF162 présente le même tropisme pour les macrophages que
certains isolats primaires (Simmons et al. 1996). Toutefois, des études indiquent que
les souches transmises sont généralement peu macrophage tropiques (SalazarGonzalez et al. 2009). Ces souches pourraient présenter des caractéristiques
différentes de la souche R5 utilisée dans notre étude en termes d’utilisation des
récepteurs cellulaires pour l’entrée (niveaux d’expression, nature) et de sensibilité à
des facteurs anti-microbiens. Ainsi, il a été récemment mis en évidence une
résistance accrue de certaines souches transmises à l’effet antiviral des interférons
216
de type I (Fenton-May et al. 2013). Il sera donc important de tester de telles souches
dans nos modèles.
D’autre part, dans nos études nous nous sommes focalisés sur l’infection par
des virions libres, or plusieurs études ont montré que l’infection par le VIH-1 est
beaucoup plus efficace par des contacts avec une cellule infectée que par du virus
libre. Les mécanismes de transmission par des cellules infectées, le rôle des
barrières physiques et chimiques des muqueuses et la réponse immunitaire de l’hôte
ainsi que l’effet du LS sur l’infection pourraient être sensiblement différents de ceux
impliqués dans la transmission par du virus libre (Anderson et al. 2010a; Barreto-deSouza et al. 2014).
c. Le statut des donneurs de LS
Dans le chapitre I, nous avons testé de façon individuelle l’effet du LS de 20
donneurs infectés par le VIH. Alors que nous avons analysé de manière extensive
l’effet du LS d’hommes sains en étudiant plusieurs pools de LS d’un nombre
important de donneurs, ainsi que l’effet individuel du LS de 16 donneurs non-infectés
pour lesquels un effet stimulateur a été systématiquement retrouvé, nous n’avons
pas pu faire cette même comparaison pour les hommes infectés en raison d’un
accès plus difficile à ces patients. Ainsi il reste à déterminer si la réduction de l’effet
stimulateur que nous avons observé pour les LS issus d’hommes infectés est
retrouvée
dans
d’autres
cohortes,
sachant
qu’il
existe
des
variabilités
interindividuelles importantes dans la composition du sperme et l’effet du LS sur
l’infection. Par ailleurs, la charge virale dans le sang et le sperme des patients et le
stade de la maladie (primo-infection, asymptomatique, SIDA) pourrait influer sur la
composition du LS et modifier son effet. Ainsi, Kafka et al. ont observé des
différences d’effet du LS d’hommes infectés sur la sécrétion de cytokines par les
cellules épithéliales en fonction du stade de la maladie et de la charge virale (Kafka
et al. 2012). Bien que nous n’ayons pas observé de corrélation entre la charge virale
sanguine et séminale et le niveau d’infection des lymphocytes T CD4+ exposés au
LS, il faut noter que les charges virales du sang et du sperme étaient relativement
homogènes parmi les donneurs, rendant difficile la mise en évidence d’une telle
corrélation. Il n’est donc pas exclu que le LS d’hommes infectés à un stade différent
217
de la maladie ou avec des charges virales plus faibles ou plus fortes ait un effet
sensiblement différent de celui que nous avons observé.
Dans notre étude sur l’effet du LS dans l’infection des modèles tissulaires et
celle visant à identifier les facteurs du LS modulant l’infection, nous avons utilisé du
LS d’homme séronégatif. Le LS d’hommes non-infectés offre la possibilité de
travailler avec un nombre de prélèvements plus important et ils ne constituent pas, à
l’inverse des LS d’hommes VIH+, un facteur limitant pour les expérimentations. Au
vu des études, dont la nôtre, ayant montré une différence de profils cytokiniques
(Lisco et al. 2012; Olivier et al. 2013) et des différences d’effet des LS d’hommes
non-infectés et VIH+ virale (Kafka et al. 2012), ce choix pourrait être discutable.
Ainsi, ces études ont montré que des cytokines et chimiokines étaient surexprimées
dans le LS d’hommes infectés par rapport au LS d’hommes non infectés et
pourraient jouer un rôle important dans la transmission du VIH-1 (Politch et al. 2007;
Anderson et al. 2010b; Lisco et al. 2011; Lisco et al. 2012; Olivier et al. 2013).
II.
PERSPECTIVES ET AUTRES STRATEGIES D’ETUDE
Les résultats que nous avons obtenus permettent d’envisager d’autres travaux,
afin d’approfondir l’étude du LS sur l’infection par le VIH-1.
a. Effet du LS d’hommes infectés et non infectés sur l’infection
des LT CD4+
1) Effet du LS sur l’infection des modèles cellulaires par différentes
souches R5 et X4 de VIH-1
Les résultats du chapitre 1 nous ont permis de montrer un effet stimulateur du
LS d’hommes sains sur l’infection par le VIH-1 des LT CD4+. Cet effet est
significativement diminué pour les LS d’hommes VIH+ et ceci semble en partie lié à
des différences d’expression du corécepteur CCR5 à la surface des LT CD4+. Nous
envisageons donc de tester des souches primaires de VIH-1 transmises, qui ne sont
donc pas à tropisme pour les macrophages, isolées de patients en phase aigüe de
l’infection. Ces souches, présentant des affinités pour les récepteurs cellulaires et
des sensibilités aux facteurs antimicrobiens différents des souches de laboratoire
(Salazar-Gonzalez et al. 2009), pourraient ne pas être influencées comme les
souches de laboratoire par le LS.
218
2) Analyse Exploration du rôle de l’expression de CCR5 à la surface
des LT CD4+ dans l’effet différentiel observé entre les LS d’hommes
sains et VIH+
Les résultats du chapitre 1 nous ont permis de montrer un effet stimulateur du
LS d’hommes sains sur l’infection par le VIH-1 des LT CD4+. Cet effet est
significativement diminué pour les LS d’hommes VIH+ et ceci semble en partie lié à
des différences d’expression du corécepteur CCR5 à la surface des LT CD4+.
L’existence de corrélation entre l’infection des LT CD4+, l’expression du corécepteur
CCR5 et le taux de ligand de CCR5 dans les LS d’hommes VIH+ et VIH- suggèrent
l’implication des ligands de CCR5 dans la diminution de l’expression du corécepteur
et la diminution de l’effet stimulateur du LS. Afin de vérifier cette hypothèse, nous
envisageons d’appauvrir, par séparation sur billes magnétiques couplées à des
anticorps anti-RANTES, anti-MIP-1α, anti-MIP-1β, les LS d’hommes VIH- et VIH+ en
ligands de CCR5, ceux-ci étant probablement responsables de l’internalisation du
corécepteur (Pollakis and Paxton 2012; Wilen et al. 2012).
3) Analyse du rôle éventuel des anticorps du sperme (neutralisants ou
médiant l’ADCC ou Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity)
Des anticorps anti-VIH (principalement IgG mais aussi IgA et IgM) dirigés
contre différents antigènes incluant la gp160 sont présents dans le sperme des
hommes séropositifs [pour revue (Shacklett and Greenblatt 2011; Wira et al. 2011;
Xu et al. 2013)]. L’hypothèse d’un rôle des anticorps présents dans le sperme des
hommes infectés, soit par ADCC soit par neutralisation du virus, ne peut donc être
exclue, bien qu’elle ne soit pas la plus probable. En effet, le liquide séminal contient
des niveaux élevés d’enzymes protéolytiques qui digèrent les Ig lors de la collecte du
LS (Mestecky et al. 2011). Or aucun inhibiteur de protéase n’a été utilisé lors du
recueil de sperme, lequel a subit une étape de liquéfaction impliquant l’action des
protéases d’origine prostatique. Par ailleurs, l’absence de diminution de l’effet
stimulateur sur TZM, la forte dilution du LS (1% final) et l’absence d’effet cytotoxique
sur PBMC ne vont pas dans le sens d’une inhibition par les anticorps. Il pourrait
toutefois s’avérer utile de vérifier le rôle potentiel des anticorps du LS soit par
traitement des LS d’hommes infectés à la protéase sulfhyfril papaine, qui digère les
Ig en fragments Fc, Fab et F(ab’)2, comme précédemment décrit (Raju and Scallon
219
2006) soit par déplétion via des billes magnétiques couplés à des anticorps dirigés
contre le fragment Fc.
4) Effets du LS sur l’infection de cellule à cellule des LT CD4+
Il est aujourd’hui clairement établi que la transmission du VIH-1 via des cellules
infectées est plus efficace que par du virus libre. D’autre part, un nombre croissant
d’’études montrent que les cellules infectées présentes dans le sperme,
essentiellement des lymphocytes et macrophages, ont un rôle dans la transmission
du virus par voie sexuelle [pour revues, (Anderson et al. 2010a; Barreto-de-Souza et
al. 2014)]. Cependant, l’impact du liquide séminal sur la transmission cellule-cellule
du VIH-1 n’a jamais été étudié. Celui-ci pourrait moduler l’expression des molécules
d’adhésion ou des récepteurs présents à la surface des cellules et perturber ainsi la
mise en place de la synapse virologique. L’un des projets récent de notre équipe est
d’étudier l’effet du LS sur l’infection de cellules cibles par des cellules infectées.
b. Effet du LS sur l’infection des muqueuses
A ce jour, aucune étude, hormis la nôtre, n’a été effectuée sur l’effet du LS sur
l’infection ex vivo des muqueuses cervicales et colo-rectales par le VIH. Plusieurs
études ont en revanche mis en évidence un effet du LS sur l’infection de cellules
immunitaires sanguines isolées ou sur la sécrétion par les cellules épithéliales du
TGF de facteurs pouvant moduler l’infection (cf introduction), tandis que seules deux
études ont analysé l’effet du LS sur le passage de virions ou de cellules infectées à
travers la barrière épithéliale du TGF (Maher et al. 2005; Lawrence et al. 2012). Nos
résultats montrent, pour la première fois et de façon assez surprenante au vu du
chapitre I, un effet légèrement inhibiteur du LS sur l’infection par le VIH-1 R5
d’explants cervicaux. Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour expliquer ces
résultats contradictoires :
-
l’effet stimulateur du LS sur l’infection par le VIH est lié au moins en partie à la
présence de fibrilles amyloïdes (SEVI, SEM) dans le LS (Munch et al. 2007;
Roan et al. 2011). Or l’effet des fibrilles amyloïdes de SEVI ou de SEM n’a
encore pas pu être confirmé sur des modèles de muqueuses ex vivo ou dans
des modèles in vivo (Munch et al. 2013);
220
-
l’environnement des cellules cibles dans la muqueuse exocervicale pourrait
contrecarrer l’effet stimulateur du LS observé sur cellules immunitaires isolées
via la production de facteurs inhibiteurs induits par le LS ;
-
certaines études ont mis en évidence un effet directement inhibiteur du LS sur
l’infection de modèles cellulaires (Martellini et al. 2009; Balandya et al. 2010).
Bien que leurs conditions d’infection soient discutables compte tenu du temps
d’exposition des cellules au LS et du risque d’effet cytotoxique qu’il en
découle, les résultats de Martellini et al. suggèrent que les peptides
cationiques présents en grande quantité dans le LS pourraient avoir un effet
inhibiteur sur l’infection par le VIH-1 (Martellini et al. 2009). Ces résultats
viennent renforcer de nombreuses études réalisées sur le rôle antimicrobien
du LS et celui des peptides cationiques présents dans les sécrétions des
muqueuses. Ces peptides cationiques peuvent inhiber l’infection par le VIH
soit au niveau de l’entrée du virus, soit au niveau de sa réplication, soit en
modulant l’expression des récepteurs à la surface des cellules cibles et leur
état d’activation (Cole 2003; Cole and Lehrer 2003; Venkataraman et al. 2005;
Martellini et al. 2009).
Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’effet inhibiteur du
LS sur les explants exocervicaux et de confirmer ou d’infirmer nos hypothèses, des
expérimentations complémentaires sont envisagées.
1) Caractérisation de l’effet inhibiteur du LS observé sur l’infection des
explants cervicaux
Afin de déterminer si les sécrétions exocervicales sont impliquées, dans un
premier temps, nous testerons leur effet à de plus fortes concentrations sur l’infection
des cellules TZM-bl et des PBMC puis nous mesurerons la concentration de
certaines cytokines et de certains facteurs antiviraux dans les surnageants par une
analyse multiplex (Luminex, Biorad) et par des ELISA spécifiques commerciaux
(R&D system, antibodiesonline…). Par ailleurs, nous étudierons l’effet du LS sur
l’infection des cellules immunitaires isolées de la muqueuse, des différences de
phénotypes comparés aux PBMC pouvant expliquer les différences de résultats
obtenus sur nos modèles cellulaires et tissulaires. En parallèle, nous étudierons
l’effet du LS sur des cellules épithéliales cervicales purifiées et polarisées et
221
analyserons les surnageants de ces cultures en terme de concentrations
cytokiniques, de concentrations en protéines antimicrobiennes et en terme d’effet sur
l’infection par le VIH-1. Si aucun facteur connu ne peut être lié à l’effet inhibiteur
observé, nous envisagerons la recherche de facteurs modulateurs de l’infection dans
ces surnageants via une approche protéomique.
2) Etude de l’effet du LS sur l’infection des explants cervicaux par des
isolats primaires de VIH-1
Afin de nous rapprocher le plus possible des conditions de transmission in vivo,
nous envisageons d’analyser l’effet d’un pool de LS d’hommes VIH+ en phase
chronique (n=20) sur l’infection d’explants cervicaux par une souche de VIH-1
primaire (sous type B, R5 NSI) isolée d’un patient en phase aiguë de l’infection
(souche ES P-2149-3, référence ARP1113, obtenue auprès du NIBSC-AIDS reagent,
UK). D’après la littérature (Greenhead et al. 2000), nous envisageons de devoir
stimuler les explants cervicaux à la PHA et à l’IL-2 dans le cas d’une souche primaire
non-M tropic pour obtenir une réplication dans ce modèle.
3) Effet du liquide séminal sur la transmission du virus au niveau colorectal
Nous n’avons pu analyser l’effet du LS sur l’infection des explants colo-rectaux
en raison de la perte rapide d’intégrité de ce tissu en culture et de sa grande
sensibilité à l’effet cytotoxique du LS dans nos conditions de culture. A notre
connaissance, l’effet du LS sur la muqueuse colo-rectale n’a jamais été étudié. Or le
LS renferme de nombreux facteurs susceptibles de perturber directement ou
indirectement la perméabilité de la barrière épithéliale. Parmi ces facteurs, de
nombreuses cytokines présentes dans le LS, telles que le TGFβ, l’IFNγ, l’IL-4 ou l’IL6 ont été décrites comme capables de moduler l’intégrité d’une barrière épithéliale de
cellules intestinales (Schmitz et al. 2002; Al-Sadi et al. 2009). De plus, une étude a
montré que la perméabilité de la barrière épithéliale cervico-vaginale était
directement altérée par l’exposition à des particules virales de VIH-1, via la
production de TNFα (Nazli et al. 2010). Il serait intéressant dans un premier temps
de comparer l’effet du LS sur des cellules épithéliales colo-rectales et cervicales.
Pour cela, des cultures de cellules épithéliales primaires isolées polarisées
pourraient être effectuées. Il pourrait aussi être envisagé d’isoler les lymphocytes T
222
CD4+ de la muqueuse colo-rectale et de comparer l’effet du LS sur l’infection de ces
cellules par rapport aux lymphocytes T CD4+ sanguins. Par ailleurs, un des projets
de l’équipe est de tester l’effet du LS sur l’adhésion et la migration des particules
virales et des cellules infectées à travers la muqueuse colo-rectale polarisée.
c. Identification des facteurs à activité biologique sur l’infection
par le VIH-1
Le test d’activité sur l’infection par le VIH des fractions de LS d’hommes non
infectés, obtenues par des HPLC successives, a abouti à la sélection de fractions
biologiquement actives et à l’identification par spectrométrie de masse de plusieurs
protéines dans les fractions. Bien que ces résultats nécessitent d’être confirmés,
l’étude bibliographique des protéines identifiées nous a permis de dégager deux
protéines candidates potentielles : la fibronectine qui favoriserait la liaison du VIH
avec des peptides cationiques inhibiteur, l’élafine et la trappine ; et la PIP, ligand du
récepteur CD4 qui inhiberait la liaison de ce dernier avec la Gp120 et donc inhiberait
l’infection par le VIH. Ces deux protéines pourraient être impliquées dans l’effet
inhibiteur du LS observé dans les explants exocervicaux. En revanche leur action sur
les modèles cellulaires pourrait être masquée sur les TZM-bl en raison de la
surexpression des récepteurs et corécepteurs et sur les PBMC en raison de leur état
d’activation favorisant l’infection. Il est également possible que les fibrilles amyloïdes
stimulatrices de l’infection aient une action prédominante dans le cas de cellules
cibles isolées en raison d’un meilleur accès à la membrane par rapport à des cellules
intriquées au sein d’un tissu. Ainsi il n’a pas été observé d’effet majeur de SEVI
après inoculation en intra-vaginal chez le macaque.
Dans
un
premier
temps,
nous
allons
continuer
l’identification
des
protéines/peptides des fractions biologiquement actives et confirmer leur implication
dans la modulation de l’infection par le VIH-1 via l’utilisation de peptides synthétiques
ou
de
protéines
recombinantes
pour
tester
leur
effet
en
concentrations
physiologiques sur l’infection par le VIH-1 dans nos modèles cellulaires et tissulaires.
A long terme, les peptides d’intérêts isolés du sperme ou des sécrétions
cervicales pourront être testés sur la transmission sexuelle chez le macaque en
collaboration avec le groupe du Dr Roger Le Grand (CEA), afin de disposer d’un
modèle d’étude in vivo. Dans le cas de molécules stimulatrices, l’effet d’inhibiteur
223
spécifique des molécules identifiées sur l’infection en présence de sperme pourra
être testé. Par ailleurs nous espérons identifier dans le sperme de nouvelles
molécules inhibitrices de l’infection par le VIH qui pourraient être utilisées dans les
stratégies de prévention de la transmission impliquant les microbicides.
Conclusion
L’étude de l’effet du sperme sur l’infection par le VIH-1 et l’identification des
facteurs impliqués dans la modulation de l’infection par le sperme est indispensable à
la compréhension des mécanismes de transmission du VIH-1 dans les muqueuses.
Sur la base de la littérature et de nos résultats, il apparaît que le sperme est un fluide
biologique complexe dont l’effet global sur l’infection résulte de la somme des
activités biologiques des facteurs stimulateurs et des facteurs inhibiteurs de
l’infection qu’il contient. En outre, l’effet du sperme sur l’infection est dépendant du
modèle d’étude, cellulaire ou tissulaire, et du statut sérologique du donneur. En effet,
les différences de composition (cytokines, chimiokines, peptides antimicrobiens…)
entre les spermes d’hommes infectés ou non aboutissent à des modifications dans la
modulation de l’infection VIH-1 par le sperme via des mécanismes directs ou
indirects qui nécessitent d’être approfondis.
224
ANNEXE
LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS
Melle Céline CAMUS
PUBLICATIONS


Carrier JL, Javadi P, Bourrier E, Camus C, Ségal-Bendirdjian E, Karniguian A.
cFos mediates cAMP-dependent generation of ROS and rescue of maturation
program in retinoid-resistant acute promyelocytic leukemia cell line NB4-LR1.
PLoS One. 2012; 7(11):e50408.
Céline Camus, Olivier Bourry, Dominique Mahé, Louis Bujan, Christophe
Pasquier, Onofrio Zirafi, Jan Munch, Nadia R. Roan, Warner C. Greene, Charles
Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effect of semen from HIV-infected men on
CD4+T cell infection: differences with semen from uninfected donors. In
preparation
ORAL COMMUNICATIONS


Céline Camus, Olivier Bourry, Louis Bujan, Nathalie Rioux-Leclercq, Florence
Burtin, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effet du liquide séminal sur
l’infection par le VIH et identification des facteurs actifs. 3ème journée
Recherche Campus Santé, Rennes, 14 January 2013.
Céline Camus, Olivier Bourry, Louis Bujan, Christophe Pasquier, Dominique Le
Lannou, Onofrio Zirafi, Jan Munch, Nadia R. Roan, Warner C. Greene, Charles
Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effet de facteurs du liquide séminal sur
l'infectivité du VIH. 1ère journée des jeunes chercheurs de l’IRSET, Rennes,
27 November 2012.
225
COMMUNICATIONS ECRITES






Céline Camus, Olivier Bourry, Dominique Mahé, Louis Bujan, Christophe
Pasquier, Dominique Le Lannou, Onofrio Zirafi, Jan Munch, Nadia R. Roan,
Warner C. Greene, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effect of seminal
fluid from infected and uninfected men on HIV infectivity in vitro. 30 years of HIV
Science, Paris, 22 may 2013.
Céline Camus, Olivier Bourry, Louis Bujan, Nathalie Rioux-Leclercq, Florence
Burtin, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effet du liquide séminal sur
l’infection par le VIH et identification des facteurs actifs. 3ème journée
Recherche Campus Santé, Rennes, 14 january 2013.
Céline Camus, Olivier Bourry, Louis Bujan, Christophe Pasquier, Dominique Le
Lannou, Onofrio Zirafi, Jan Munch, Nadia R. Roan, Warner C. Greene, Charles
Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Effect of seminal fluid from infected and
uninfected men on HIV infectivity in vitro. XIX International AIDS Conference,
Washington DC (USA), 25 july 2012.
Céline Camus, Olivier Bourry, Louis Bujan, Nathalie Rioux-Leclercq, Florence
Burtin, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Identification de facteurs du
liquide séminal modulant la transmission sexuelle du VIH. XIVèmes Journées
Francophones de Virologie, Paris, 29 march 2012.
Céline Camus, Olivier Bourry, Florence Aubry, Florence Burtin, Nathalie RiouxLeclercq, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Identification de facteurs du
liquide séminal modulant la transmission sexuelle du VIH. 2ème Rencontres
Rennaises autour de la Reproduction, Rennes, 18 november 2011.
Céline Camus, Olivier Bourry, Florence Aubry, Florence Burtin, Nathalie RiouxLeclercq, Charles Pineau, Nathalie Dejucq-Rainsford. Identification de facteurs du
liquide séminal modulant la transmission sexuelle du VIH. Université des
Jeunes Chercheurs « Approche multidisciplinaire de la recherche sur le
VIH » - Sidaction and AIDS in Carry-le-Rouet, october 2011.
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Le sperme est le vecteur principal de dissémination du VIH. Des travaux
récents indiquent la présence de facteurs dans le liquide séminal (LS) des hommes
non infectés qui modulent l’infectivité par le VIH. Nous avons préalablement montré
que les principaux organes génitaux mâles qui contribuent à l’élaboration du sperme
sont infectés par le VIH, ce qui modifie probablement la composition du LS des
hommes VIH+. Pour preuve, des différences significatives dans les profils
cytokiniques ont été mises en évidence dans le LS d’hommes VIH+ par rapport à
celui d’hommes sains. Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont articulés
autour de 3 axes :
- Effet du sperme d’hommes infectés par le VIH-1 sur l’infection des cellules T
CD4+ : différences avec le sperme d’hommes non infectés : nous avons comparé,
pour la première fois à notre connaissance, l’effet du LS d’hommes infectés versus
celui d’hommes sains sur l’infectivité par le VIH dans des modèles cellulaires. Nous
avons mis en évidence un effet différentiel du LS d’hommes séropositifs par rapport
au LS d’hommes séronégatifs. L’effet stimulateur observé du LS d’hommes VIHnon-infectés sur l’infection par le VIH-1 des cellules T CD4+ est significativement
diminué pour les LS d’hommes VIH+. Cet effet différentiel résulte au moins en partie
ceci semble au moins en partie d’une surexpression de certaines cytokines dont
RANTES et d’une sous expression à la membrane du corécepteur CCR5.
- Effet du liquide séminal sur l’infection d’explants cervicaux et colo-rectaux : les
explants exocervicaux et colorectaux représentent des portes d’entrée du virus dans
l’organisme et sont donc des modèles particulièrement physiologiques. Nous avons
montré que le LS induit une diminution de l’infection ex vivo des tissus exocervicaux
alors qu’aucun effet n’est observé sur l’infection des tissus colorectaux.
- Fractionnement du liquide séminal et identification des facteurs à activité
biologique sur l’infection par le VIH-1 : nous avons débuté une approche
protéomique qui nous a permis de décomplexifier le LS par fractionnement grâce à
des HPLC successives, de sélectionner des fractions biologiques actives et
d’identifier deux protéines candidates, par spectrométrie de masse, potentiellement
responsable d’un effet inhibiteur sur l’infection par le VIH-1.
Sur la base de la littérature et de nos résultats, il apparait clairement que le LS
est un fluide biologique complexe dont l’effet global sur l’infection résulte de la
somme des activités biologiques des facteurs stimulateurs et des facteurs inhibiteurs
de l’infection qu’il contient. En outre, l’effet du sperme sur l’infection est dépendant
du modèle d’étude, cellulaire ou tissulaire, et du statut sérologique du donneur. En
effet, les différences de composition (cytokines, chimiokines, peptides
antimicrobiens…) entre les spermes d’hommes infectés ou non aboutissent à des
modifications dans la modulation de l’infection VIH-1 par le sperme via des
mécanismes directs ou indirects qui ouvrent de nombreuses perspectives d’études.
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