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THÈSE
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR de médecine et de pharmacie
Centre d investigation clinique - CIC (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)
Secteur de recherche : Recherche clinique, innovation technologique, santé publique
Présentée par :
Pierre-Jean Saulnier
Étude des déterminants génétiques et environnementaux
des complications du diabète de type 2
Directeur(s) de Thèse :
Samy Hadjadj
Soutenue le 20 décembre 2012 devant le jury
Jury :
Président
Alain Kitzis
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Rapporteur
Frédéric Fumeron
Maître de conférences, Université de Paris 7
Rapporteur
Jean-Michel Halimi
Professeur des Universités, Université de Tours
Membre
Samy Hadjadj
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Membre
Michel Marre
Professeur des Universités, Université de Paris 7
Membre
Lise Tarnow
Professor, Aarhus Universitet, Danmark
Membre
David-Alexandre Tregouet
Docteur, Université Pierre et Marie Curie, Paris 6
Membre
Ronan Roussel
Professeur des Universités, Université Paris Descartes
Pour citer cette thèse :
Pierre-Jean Saulnier. Étude des déterminants génétiques et environnementaux des complications du diabète de
type 2 [En ligne]. Thèse Recherche clinique, innovation technologique, santé publique. Poitiers : Université de
Poitiers, 2012. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE
pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté de Médecine et de Pharmacie)
(Diplôme National – arrêté du 7 août 2006)
Ecole doctorale : Biologie - Santé N°524
Champ disciplinaire : Biologie, Médecine, Santé
Secteur de Recherche : Recherche clinique, innovation technologique, santé publique
Présentée par :
Pierre-Jean SAULNIER
*************************
Etude des déterminants génétiques et environnementaux
des complications du diabète de type 2
************************
Directeur de Thèse : Pr Samy HADJADJ
************************
Soutenue le 20 Décembre 2012, à Poitiers
devant la Commission d’Examen
************************
JURY
M. Frédéric FUMERON
M. Jean-Michel HALIMI
Mme Lise TARNOW
M. David TREGOUET
M. Ronan ROUSSEL
M. Alain KITZIS
M. Samy HADJADJ
MCU
PU-PH
MD PhD
DR
PU-PH
PU-PH
PU-PH
Université Paris 7
Université de Tours
Aarhus University (DK)
Université Paris 6
Université de Paris 7
Université de Poitiers
Université de Poitiers
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
REMERCIEMENTS
A Monsieur Frédéric FUMERON, pour avoir accepté d’etre rapporteur de ce
travail.
A Monsieur Jean-Michel HALIMI, pour avoir accepté de juger ce travail et pour
l’intérêt qu’il y porte.
A Madame Lise TARNOW, pour avoir accepté d’examiner ce travail, mais
également de m’avoir soutenu lors de ma première présentation en congrès.
A Monsieur David TREGOUET, Monsieur Ronan ROUSSEL et Monsieur Alain
KITZIS pour l’intérêt qu’ils ont bien voulu porter à ce travai en acceptant d’être
membres du jury.
A Monsieur François GUILOT, PU-PH, coordonateur du Centre d’Investigation
Clinique Inserm CIC 802, pour m’avoir permis d’être accueilli comme doctorant
au sein du CIC.
A Monsieur Samy HADJADJ, que je tiens sincèrement et amicalement à
remercier pour m’avoir guidé à chacune des étapes, pour m’avoir donné le goût
de faire, pour avoir sans cesse valorisé mes travaux et m’avoir donné tout
simplement confiance.
REMERCIEMENTS
Je dédie également ce travail de Thèse à
Julie, Flore-Aël et Mélusine qui me donnent tous les jours un peu plus.
Mes parents, pour avoir toujours été là.
Mes frères pour m’avoir tiré et poussé et inversement.
Mes grands-parents pour m’avoir donné les repères de la vie de famille.
Monsieur Alain BOURGOIN pour m’avoir donné l’exemple.
Monsieur Nicolas
d’épidémiologie.
ROCHE,
pour
m’avoir
confié
mon
premier
travail
Madame Stéphanie RAGOT, pour m’avoir depuis longtemps écouté et
conseillé.
Mme Cécile DEMER pour son aide au quotidien et ses conseils avisés
Aux services d’Endocrinologie et de Pharmacologie Clinque pour m’avoir
incubé.
L’équipe du CIC0802 dans son ensemble.
Mes sparing partners et mes amis.
Felix qui potuit rerum cognoscere causas.
Virgile (Géorgiques)
RESUME
ETUDE DES DETERMINANTS GENETIQUES ET ENVIRONNEMENTAUX
DES COMPLICATIONS DU DIABETE DE TYPE 2
Le diabète de type 2 (DT2) représente un enjeu de santé publique au regard de
ses complications, qui sont des maladies complexes, où interagissent des
déterminants génétiques et environnementaux.
L'objectif de ce travail était d’étudier ces déterminants dans trois populations
indépendantes de patients DT2 en couplant études transversales
(DIAB2NEPHROGENE) et longitudinales (SURDIAGENE et DIABHYCAR)
totalisant 7767 sujets. Via une approche gène-candidat, nous avons focalisé
nos recherches sur le système des peptides natriurétiques, le gène NPR3
(codant le récepteur de clairance aux peptides natriurétiques) et les apports
sodés puis la voie métabolique des hormones sexuelles, le gène CYP19A1
(codant l’aromatase) et les concentrations de stéroïdes sexuels.
Nous avons montré que l’allèle G du rs2270915 du NPR3 est un allèle de
risque de pression artérielle (PA) plus élevée et de moindre sensibilité pressive
à la réduction sodée qui ne confère pas d’augmentation significative de risque
d’évènements cardiovasculaires (ECV) contrairement au rs6889608. Enfin, la
survie sans ECV est significativement modulée par les apports en sel avec un
risque de morbi-mortalité réduit chez les sujets diabétiques consommant le plus
de sel malgré un niveau de PA plus élevé.
Nous avons confirmé que le sexe masculin est un facteur de risque pour la
néphropathie diabétique (ND) mais également pour la survenue d'ECV. Nous
avons montré, chez les hommes, que des concentrations plus élevés
d’œstradiol s'associent à une prévalence plus importante de ND mais ne se
traduisent pas par une augmentation des événements rénaux ou
cardiovasculaires. CYP19A1 n’est associé ni avec les niveaux
d’œstradiol, ni avec la prévalence ou la sévérité de la ND. Deux SNP
s'associent toutefois significativement avec la survenue d'insuffisance rénale
chronique terminale.
Au total, nous avons identifié dans 2 voies métaboliques distinctes des
déterminants génétiques de complications du DT2 ainsi qu’une interaction
gène-environnement.
MOTS CLES:
diabète de type 2, épidémiologie génétique, peptides natriurétiques, stéroïdes
sexuels, NPR3, AROMATASE, pression artérielle, néphropathie diabétique
ABSTRACT
GENETIC AND ENVIRONMENTAL FACTORS STUDY OF TYPE 2 DIABETES
COMPLICATIONS
Type 2 diabetes (T2D) is a public health issue because of vascular and renal
complications, which are complex diseases with interaction between genetic
and environmental determinants.
The objective of this work was to study these determinants in three independent
populations of T2D patients by coupling cross-sectional (DIAB2NEPHROGENE)
and longitudinal studies (SURDIAGENE and DIABHYCAR). Through a
candidate-gene approach, we first focused on the natriuretic peptides system,
NPR3 gene and sodium intake and then on the metabolic pathway of sex
hormones, CYP19A1 gene (coding for aromatase) and sex steroid levels.
Our first results showed that NPR3 rs2270915 G Allele was associated with
high blood pressure (BP) and a reduced salt-sensitivity of BP. However, this
SNP was not associated with any significant risk of cardio-vascular events
(CVE) or death, at variance with rs6889608. Ultimately, CVE-free survival was
impacted by salt intake with a reduced risk of morbi-mortality in those patients
having the greatest intake, though a higher BP.
In our second study, we confirmed that male gender was a risk factor for
diabetic nephropathy (DN), but also for the occurrence of CVE. In men, we
showed higher levels of estradiol (E2) associated with a higher prevalence of
ND but without any significant increase in renal or CVE during follow-up.
CYP19A1 variants were not associated with either E2 levels or the prevalence of
ND. However, 2 SNPs tested, were significantly associated with the occurrence
of end stage renal failure.
Altogether, we have identified 2 different metabolic ways contributing to the
genetic determinants of complications associated with T2D including a geneenvironment interaction.
KEYWORDS :
type 2 diabetes, genetic epidemiology, natriuretic peptides, sex steroids, NPR3,
AROMATASE, blood pressure, diabetic nephropathy
Ce travail a été réalisé au sein du Centre d’Investigation Clinique de Poitiers
Inserm CIC0802
Entrée 5 cour Est Jean Bernard
CHU de Poitiers
86022 POITIERS Cedex
SOMMAIRE
ABBREVIATIONS ............................................................................................... 1
LISTES DES TABLEAUX .................................................................................... 7
LISTES DES FIGURES ...................................................................................... 9
I.
INTRODUCTION ........................................................................................ 15
1. Définition et type de diabète .................................................................... 17
1.1.
Définition et diagnostic ...................................................................... 17
1.2.
Types de diabète .............................................................................. 19
2. Epidémiologie du diabète ........................................................................ 21
2.1.
Incidence et prévalence .................................................................... 21
2.2.
Coût des dépenses de santé ............................................................ 23
3. Complications du diabète ........................................................................ 25
3.1.
Mortalité ............................................................................................ 25
3.2.
Complications vasculaires ................................................................ 26
3.3.
Qualité de vie .................................................................................... 34
4. Traitement du diabète de type 2 et de ses complications........................ 35
II. DETERMINANTS GENETIQUES DES COMPLICATIONS DU DIABETE.. 39
1. Arguments pour origine familiale des maladies ou agrégation familiale .. 42
2. Arguments pour une origine génétique des maladies ............................. 43
2.1.
Etudes de jumeaux ........................................................................... 44
2.2.
Analyses de ségrégation................................................................... 45
3. Identifier la région du génome impliquée................................................. 46
3.1.
Etudes de liaison (linkage analysis studies)...................................... 47
3.2.
Etudes d’association (ou association studies) .................................. 50
3.3. Etudes d’association pangénomique (GWAS pour genome wide
association studies) .................................................................................... 66
4. Interaction gène-environnement et épistasie ........................................... 69
5. Randomisation mendélienne ................................................................... 69
6. Epigénétique ........................................................................................... 72
7. Conclusion .............................................................................................. 76
III. OBJECTIFS DE LA THESE........................................................................ 79
IV. MATERIELS ET METHODES .................................................................... 83
1. Patients et cohortes................................................................................. 85
1.1.
L’étude DIAB-2-NEPHROGENE ....................................................... 86
1.2.
L’étude SURDIAGENE ..................................................................... 89
1.3.
L’étude DIABHYCAR........................................................................ 92
2. Phénotypages ......................................................................................... 94
2.1.
Données cliniques ............................................................................ 94
2.2.
Données biologiques ........................................................................ 94
3. Génotypages .......................................................................................... 95
3.1.
Choix des gènes .............................................................................. 96
3.2.
Choix des variants ............................................................................ 96
4. Statistiques ............................................................................................. 99
V. TRAVAUX PUBLIES OU EN COURS DE SOUMISSION ........................ 105
1. Impact des variants du gène du récepteur de clairance des peptides
natriurétiques (NPR3) sur les complications du DT2 ................................ 107
1.1.
Article publié dans Diabetes Care .................................................. 107
1.2. Données complémentaires sur gène du récepteur de clairance des
peptides natriurétiques ............................................................................. 125
2. Impact des polymorphismes du gène de l’AROMATASE sur le niveau
des hormones sexuelles et les complications du DT2 .............................. 146
2.1.
Article soumis à Diabetologia ......................................................... 146
2.2. Données complémentaires sur les stéroïdes sexuels et le gène
AROMATASE .......................................................................................... 172
3. Autres travaux realisés pendant la thèse .............................................. 181
3.1. Prognostic Value of Resting Heart Rate on Cardiovascular and
Renal Outcomes in Type 2 Diabetic Patients: A competing risk analysis
in a prospective cohort. ............................................................................ 181
3.2. Renal complications correlate with electrical atrial vulnerability
hallmarks in type 2 diabetic patients. ....................................................... 182
3.3. Association of ADIPOQ genetic variants and plasma adiponectin
isoforms with the risk of incident renal events in type 2 diabetes. ............ 183
VI. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ..................................................... 185
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................ 195
ANNEXES ...................................................................................................... 227
ABBREVIATIONS
3’UTR
AA
ACCORD
ACR
ADA
ADVANCE
AFD
AGE
ALD
ALFEDIAM
ANAES
ANOVA
ANP
APM
ApoE
ARIC
ASP
AT1R
AVC
BNP
CCPPRB
CKD-Epi
CEU
CNP
CNV
CpG
CPJ
CPP
CRP
D2NG
Région 3’ non traduite (3’ UnTranslated Region)
Acide Aminé
Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes study
Ratio albuminurie/créatininurie (Albumin Creatinine Ratio)
American Diabetes Association
Action in Diabetes and Vascular Disease : Preterax and
Diamicron Modified Release Controlled Evaluation study
Association Française des Diabétiques
Produits finaux de la glycation avancée (Advanced
Glycation End products)
Affection Longue Durée
Association de Langue Française pour l'Etude du Diabète et
des Maladies Métaboliques
Agence Nationale d'Accréditation et d'Evaluation en Santé
Analyse de la variance (ANalysis Of Variance)
Peptide natriurétique de type A (Atrial Natriuretic Peptide)
Affected Pedigree Member
Apolipoprotéine E
Atherosclerosis Risk In Communities study
Affected Sibling Pairs analysis
Recépteur de type 1 de l’angiotensine II (Angiotensin II
Type 1 Receptor)
Accident Vasculaire Cérébral
Peptide natriurétique de type B (Brain Natriuretic Peptide)
Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la
Recherche Biomédicale
Chronic Kidney Disease Epidemiology collaboration
Populations des résidents de l’Utah originaires de l’Europe
du Nord et de l’Ouest du projet Hapmap
Peptide natriurétique de type C (C-type Natriuretic Peptide)
Variabilité du nombre de copies d'un gène (Copy Number
Variation)
Dinucléotide Cytosine-Guanine
Critère Principal de Jugement
Comité de Protection des Personnes
Protéine C Réactive
DIABète de type 2, NEPHROpathie et GENEtique
(étude DIAB2NEPHROGENE)
1
DAG
DCCT
DECODE
DESIR
DFG
DNMT
DS
DT1
DT2
DZ
EASD
ECA
EDIC
eNOS
ENTRED
EUA
FDA
FO
GAJ
GEMMS
GENEDIAB
GLUT
GWAS
GxE
GxG
HAT
HbA1c
HDAC
HDACi
HGPIV
HGPO
HMT
HMTi
HPLC
HR
HTA
HWE
HZ
IBD
ICC
IC95%
2
Graphique dirigé acyclique (Directed Acyclic Graph)
Diabetes Control and Complications Trial
Diabetes Epidemiology : COllaborative analysis of
Diagnostic criteria in Europe study
Données Epidémiologiques sur le Syndrome d'InsulinoRésistance
Débit de Filtration Glomérulaire
ADN méthyltransférase (DNA methyltransferase)
Déviation standard
Diabète de Type 1
Diabète de Type 2
Dizygote
Association européenne pour l’étude du diabète (European
Association for the Study of Diabetes)
Enzyme de Conversion de l'Angiotensine
Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications
Endothelial Nitric Oxide Synthase
Échantillon National Témoin Représentatif des Personnes
Diabétiques
Excretion Urinaire d'Albumine
Food and Drug Administration
Fond d'Œil
Glycémie A Jeun
Groupe d'Etude des Maladies Métaboliques et Systémiques
Etude GEnétique de la NEphropathie DIABétique
Transporteur de glucose
Etude d'association génome entier
Interaction Gène-Environnement
Interaction Gène-Gène
Histone AcetylTransferase
Hémoglobine glyquée
Histone DeACetylase
Inhibiteur de HDAC
Hyperglycémie provoquée par voie intraveineuse
Hyperglycémie provoquée par voie orale
Histone Methyl Transférase
Inhibiteur de HMT
Chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance
Risque instantané d'évènement (Hazard Ratio)
HyperTension Artérielle
Equilibre de Hardy-Weinberg (Hardy-Weinberg equilibrium)
Hétérozygote
Identity By Descent
Insuffisance Cardiaque Congestive
Intervalle de Confiance à 95%
IDL
IDM
IMC
IQR
IRCT
LD
LDL
LOD score
MAF
MDRD
miRNA
MZ
ND
NHANES
NPR3
OCDE
OMS
OR
ORIGIN
PHRC
PPAR
PRMT
QdV
QTL
RAGE
RD
RENAAL
RFLP
RM
ROS
SCORE
SFD
SD
SDG
SHBG
SNP
SRA
Lipoprotéines de densité intermédiaire (Intermediate Density
Lipoprotein)
Infarctus Du Myocarde
Indice de Masse Corporelle
Ecart interquartile (Interquartile range)
Insuffisance Renale Chronique Terminale
Déséquilibre de liaison (Linkage Desequilibrium)
Lipoprotéines de densité basse (Low Density Lipoprotein)
Logarithm of the odds
Fréquence de l’allèle mineur (Minor Allele Frequency)
Modification of Diet in Renal Disease
Micro RNA
Monozygote
Néphropathie Diabétique
National Health and Nutrition Examination Survey
Récepteur de type C aux peptides natriurétiques
(Natriuretic Peptide Receptor type 3)
Organisation de Coopération et de Développement
Economique
Organisation Mondiale de la Santé
Rapport des cotes (Odds Ratio)
Outcome Reduction with an Initial Glargine Intervention
study
Programme Hospitalier de Recherche Clinique
Récepteur Activé par les Proliférateurs de Peroxysomes
Protéine Arginine MethylTransferase
Qualité De Vie
Locus de caractères quantitatifs (Quantitative Trait Locus)
Récepteur des AGE
Rétinopathie Diabétique
Reduction of Endpoints in NIDDM with the Angiotensin II
Antagonist Losartan study
Polymorphisme de longueur des fragments de restriction
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Randomisation Mendélienne
Espèces oxygénées réactives (Reactive Oxygen Species)
Systematic COronary Risk Evaluation project
Société Francophone du Diabète
Standard Deviation
SUivi Rénal, DIAbète de type 2 et GENEtique
(étude SURDIAGENE)
Sex Hormone Binding Globulin
Polymorphisme mono-nucléotidique (Single Nucleotide
Polymorphism)
Système Rénine-Angiotensine
3
STZ
T
TDT
TGF-β
UKPDS
UNa
USRDS
VADT
VEGF
4
STreptoZotocine
Testostérone
Transmission Disequilibrium Test
Transforming Growth Factor-Beta
United Kingdom Prospective Diabetes Study
Concentration urinaire de sodium
United States Renal Data System
Veterans Affairs Diabetes Trial
Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (Vascular
Endothelial Growth Factor)
5
6
LISTES DES TABLEAUX
Tableau 1 Classification étiologique des diabètes sucrés selon l’ADA
(source : The Expert Committee on the Diagnosis and
Classification of Diabetes, Mellitus Diabetes Care 2002) ................ 20
Tableau 2 Prévalence des complications du diabète de type 2 dans l'étude
ENTRED (Source : Fagot Campagna BEH 2009) ........................... 26
Tableau 3 Définition des stades d'excrétion urinaire d'albumine (d’après
Grimadi A Précis de diabétologie 2000 Ed Médecine SciencesFlammarion) .................................................................................... 28
Tableau 4 Définition des stades de néphropathie diabétique (D’après
Grimaldi A Précis de diabétologie 2000 Ed Médecine SciencesFlammarion) .................................................................................... 29
Tableau 5 Top Hit SNPs identifiés dans les GWAS pour la néphropathie
diabétique (d’après NHGRI GWAS Catalog) ................................... 67
Tableau 6 Top Hit SNPs identifiés dans les GWAS pour la rétinopathie
diabétique (d’après NHGRI GWAS Catalog) .................................. 68
Tableau 7 Récapitulatif des SNPs sélectionnés pour l'exploration du
NPR3............................................................................................... 97
Tableau 8 Récapitulatif des SNPs sélectionnés pour l'exploration du
CYP19A1. ....................................................................................... 98
Tableau 9 Caractéristiques des variables clinico-biologiques des patients
de l'étude DIAB2NEPHROGENE en fonction des tertiles de
concentration urinaire de sodium .................................................. 127
Tableau 10 Association des variables clinico-biologiques avec la
concentratio urinaire de sodium (mmol/l) dans la population des
patients de l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée) .. 128
Tableau 11 Association des variables clinico-biologiques avec la pression
artérielle systolique (mmHg) dans la population des patients de
l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée) ..................... 129
Tableau 12 Impact des variants du NPR3 sur la concentration urinaire
sodium (mmol/l) dans l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse
multivariée ajustée sur âge, sexe et DGF estimé) ......................... 130
Tableau 13 Impact des variants du NPR3 sur la pression artérielle
systolique (mmHg) dans l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse
multivariée ajustée sur le sexe, l’âge, l’EUA et DGF estimé) ........ 130
7
de l'étude SURDIAGENE en fonction de la survenue du critère
de jugement principal..................................................................... 133
Tableau 15 Association des variables clinico-biologiques avec le risque de
mortalité cardiovasculaire dans la population des patients de
l’étude SURDIAGENE (analyse de Cox univariée) ........................ 134
Tableau 16 Variables clinico-biologiques associées avec la survenue du
critère principal de jugement chez les patients de l’étude
SURDIAGENE (modèle de Cox).................................................... 135
Tableau 17 Risque proportionnel (hazard ratio) de décès cardiovasculaires
en fonction de variables clinico-biologiques dans la population
des patients de l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox
multivariée) .................................................................................... 137
Tableau 18 Association du rs6889608 avec le risque de survenue
d‘évènements chez les patients de l’étude SURDIAGENE
(modèle de Cox ajusté pour le sexe, l’âge, la PAS, l’EUA et
l‘UNa) ............................................................................................. 140
de l'étude SURDIAGENE à l’entrée dans l’étude........................... 173
Tableau 20 Variants du CYP19A1 chez les patients DT2 caucasiens
génotypés de l'étude SURDIAGENE ............................................. 174
Tableau 21 Association des rs1004984, rs28566535 et rs6493497 avec le
risque de survenue d’IRCT chez les hommes caucasiens de
l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox ajusté pour le sexe,
l’âge, la PAS, le log(DFGe) et log(EUA)) ....................................... 177
8
LISTES DES FIGURES
Figure 1 Prévalence de la rétinopathie par décile de la distribution de
glycémie à jeun (FPG), ], Glycémie 2h après une charge de
glucose (2hPG), et HbA1c dans 3 populations de référence : (A)
Indiens PIMA, (B) Egyptiens et (C) Américains de 40 à 74 ans
de l’étude NHANES (source : The Expert Committee on the
Diagnosis and Classification of Diabetes, Mellitus Diabetes
Care 2002) ...................................................................................... 17
Figure 2 Prévalence de la rétinopathie diabétique non proliférante en
fonction du taux d’hémoglobine glyquée (par des intervalles de
0,5%) chez plus de 28000 participants âgés de 20-79 ans.
(source ADA Diabetes Care 2009) .................................................. 19
Figure 3 Estimations de la prévalence du diabète parmi la population
âgée de 20 à 79 ans, 2010 (source : données OCDE 2011)........... 21
Figure 4 Taux standardisé de prévalence du diabète en fonction du
département en 2009 d’après les données du régime général
de l’Assurance Maladie (source : Ricci P BEH 2010) ...................... 22
Figure 5 Évolution de la prévalence du diabète traité entre 2000 et 2009
d’après les données du régime général de l’Assurance Maladie
(source : Ricci P BEH 2010) ............................................................ 23
Figure 6 Évolution de la part du diabète dans la mortalité générale et des
taux standardisés de mortalité liée au diabète en causes
multiples, France, de 2001 à 2006 (d’après Fagot-Campagna
INVS 2010)...................................................................................... 25
Figure 7 Causes d'insuffisance rénale terminale aux USA entre 1980 et
2008 : à gauche en nombre et à droite en taux par millions
(source : USRDS 2012 Annual Data Report ) ................................. 27
Figure 8 Répartition graphique d’une population de 301 patients DT2
australiens en fonction de leur excrétion urinaire d’albumine (en
colonne de gauche à droite : normo-, micro- et macro-) et leur
fonction rénale (en ligne conservée en haut [DFGe >60ml/min]
et altérée en bas [<60 ml/min]) (Source : Mac Isaac RJ
Diabetes 2004) ................................................................................ 30
Figure 9 Taux annuel de transition entre les stades de néphropathie
diabétique d'après les données d’UKPDS (source : Adler AI
Kidney Int 2003) .............................................................................. 30
Figure 10 Recommandations générales sur la stratégie des médicaments
anti-hyperglycémiants du diabète de type 2 (source : Société
Francophone du Diabète 2012) ....................................................... 35
9
Figure
11 Risque relatif d’évènements microvasculaires (A)
macrovasculaires (B) selon les déciles d’HbA1c (d’après
Zoungas S Diabetologia 2012) ........................................................ 37
Figure 12 Exemples d’hérédité mendélienne et non mendélienne. A.
Locus mendélien avec transmission dominante et fréquence de
l’allèle pathologique A : p=0,00275 B. Locus non mendélien
avec fréquence de l’allèle à risque A : p=0,40 La maladie
survient au-dessus du seuil de susceptibilité (source : Campion
D médecine/sciences 2001) ............................................................ 41
Figure 13 Prévalence de l’insuffisance rénale chronique terminale aux
USA selon l’ethnie d'appartenance du patient entre 1980 et
2008 (source : USRDS 2012 Annual Data Report) .......................... 44
Figure 14 Modèles génétiques de maladies complexes : A modèle
polygénique à seuil ; B modèle mixte (source : Feingold J
Médecine/Sciences 2005) ............................................................... 45
Figure 15 Possibilité d'identifier des variants génétiques en fonction de la
fréquence des allèles de risque et la force de génétique en
fonction du type de stratégie (d’après Mc Carthy MI Nat Rev
Genet 2008) ..................................................................................... 46
Figure 16 Résultats d’étude de liaison dans une population de sujets
diabétiques de type 2....................................................................... 49
Figure 17 Schéma des blocs en déséquilibre de liaison dans le gène
CYP19A1. ........................................................................................ 51
Figure 18 Représentation de SNPs taggants (indiqués au dessus des
colonnes de SNP par un triangle gris plein) à partir du logiciel
Haploview. ....................................................................................... 51
Figure
19 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de
l’hyperglycémie (source Brownlee M Nature 2001) ......................... 52
Figure
20 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de
l’hyperglycémie au travers de l’augmentation de PARP (source
Brownlee M Diabetes 2005) ............................................................ 53
Figure 21 Voie des polyols (source Brownlee M Nature 2001) ........................ 54
Figure 22 Conséquences de l'activation de la Protéine Kinase C (PKC)
induite par l'hyperglycémie (source : Brownlee M Nature 2001) ...... 55
Figure 23 Voie métabolique des produits avancés de la glycation (AGE)
(source Brownlee M Nature 2001) ................................................... 56
10
Figure 24 Shéma des acteurs du du système rénine-angiotensine (d’apres
KEGG [Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes] Kanehisa
Laboratories
web-database disponible
sur
www.genome.jp/kegg/) .................................................................... 57
Figure 25 Effet du système Rénine-Angiotensine sur les différents organes
cibles. .............................................................................................. 58
Figure 26 Localisation chromosomique des gènes des principaux acteurs
du système Rénine-Angiotensine-Aldostérone : REN : rénine,
RENBP :
N-acylglucosamine
2-epimerase
AGT :
angiotensinogène, AGTR1 : récepteur de type 1 à
l’angiotensine II, AGTR2 : récepteur de type 2 à l’angiotensine
II, ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine, ACE2 :
enzyme de conversion de l’angiotensine de type II, CYP11B2 :
aldostérone synthase, NR3C2 : récepteur des minéralocorticoïdes et de l’aldostérone (d’apres Ensembl release 69 (oct
2012) disponible sur http://www.ensembl.org/) ............................... 58
Figure 27 Représentation de l’affinité des ligands et des récepteurs du
système des peptides natriurétiques (source : Nakayama T
Endocr J. 2005) ............................................................................... 60
Figure
28 Représentation des effets du système des peptides
natriurétiques (source: Potter LR Endocr Rev 2006) ....................... 61
Figure 29 Localisation des gènes du système des peptides natriurétiques
(d’après Vassalle C Clin Chem 2009) ............................................. 62
Figure 30 Cartographie des loci associés à des maladies humaines
identifiées au cours d’études pangénomiques (GWAS). Chaque
couleur de point représente une pathologie pour lequel un ou
des loci ont été cartographiés grâce aux données publiées de
GWAS d’après NCBI. ...................................................................... 66
Figure 31 Comparaison du design des essais cliniques randomisés et de
la randomisation mendélienne (source : Davey Smith G BMJ
2005) ............................................................................................... 70
Figure 32 Structure d’une étude par randomisation mendélienne (d’après
Bochud M Int. J. Environ. Res. Public Health 2012) ........................ 70
Figure 33 Représentation des mécanismes épigénétiques de régulation de
la transcription (Source : Reddy MA Cardiovasc Res 2010) ........... 72
Figure 34 Variants génétiques associés à la néphropathie diabétique (ND)
et répliqués dans au moins une étude indépendante : (a)
Variants restant associés à la ND après méta-analyse (b)
Variants n’étant pas significativement associés à la ND après
méta-analyse. (source : Mooyaart AL Diabetologia 2011)............... 76
11
Figure 35 Représentation chronologique des populations de DIABHYCAR,
DIAB2NEPHROGENE et SURDIAGENE (en pointillé les
données qui seront collecté lors de la prochaine mise à jour du
suivi) ................................................................................................ 85
Figure 36 Résultats de génotypage pour une plaque d'échantillons pour le
SNP rs10046 du gène CYP19A1. En rouge les échantillons
homozygotes AA, en vert les hétérozygotes GA, en bleu les
homozygotes AA, en noir les deux puits vides de contrôle et en
roseunéchantillon indéterminé. ........................................................ 95
Figure 37 Représentation des 9 SNPs sélectionnés au sein du NPR3. ........... 96
Figure 38 Représentation des 21 SNPs sélectionnés au sein du gène
CYP19A1 (Haploview). Le code couleur des points est le
suivant blanc=(|D’|<1, LOD<2) rose/rouge ombré=(|D’|<1,
LOD#2), bleu=(|D’|=1, LOD<2), rouge vif=(|D’|=1, LOD#2). Le
nombre dans le carré représente le D’ (seulement les
décimales). Les D’=1 ne sont pas indiqués numériquement............ 98
Figure 39 Représentation de l'approche de randomisation mendélienne
envisagée dans l’étude cas-témoins DIAB2NEPHROGENE ......... 101
Figure 40 Stratégie d’exploration des associations entre sodium urinaire,
pression artérielle systolique, variants génétiques du NPR3 et
risque de complications cardiovasculaies et rénales dans les
populations (1) DIAB2NEPHROGENE, (2) SURDIAGENE et (3)
DIABHYCAR .................................................................................. 126
Figure 41 Représentation des apports sodés journaliers estimés (en
mmol/jour) en fonction de la concentration urinaire de sodium
(en mmol/l) chez les 1405 patients diabétiques de type 2 ayant
bénéficié du dosage de l’étude DIAB2NEPHROGENE (r²=0,27 ;
p<0,0001). ..................................................................................... 128
Figure 42 Estimation des apports quotidiens en sel (en g/j) en fonction du
sexe et de l’âge des patients DT2 de DIAB2NEPHROGENE. ....... 129
Figure 43 Représentation de la pression artérielle systolique (en mmHg)
en fonction des tertiles de UNa et selon les 3 génotypes du
NPR3
des
patients
caucasiens
de
l’étude
DIAB2NEPHROGENE (interaction : rs1173773 p=0,73 ;
rs6889609 p =0,93 et rs2270915, p=0,34) T1_UNa, T2_UNa et
T3_UNa représentent le tertile inférieur, intermédiaire et
supérieur de concentration urinaire de sodium, respectivement.. .. 131
Figure 44 Représentation du débit de filtration glomérulaire estimé (en
ml/min/1,73m²) en fonction de la concentration d’albumine
urinaire (en mg/l) chez les patients de DIAB2NEPHROGENE à
leur entrée dans l’étude (échelle semi logarithmique).................... 132
12
Figure 45 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans critère
principal de jugement en fonction des tertiles d’UNa
(logrank=46,2 ; p<0,0001) ............................................................. 135
Figure 46 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans décès
cardiovasculaire en fonction des tertiles d’UNa (logrank=25,0 ;
p<0,0001) ...................................................................................... 136
principal de jugement en fonction des génotypes du rs6889608
chez les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE
(logrank=9,3; p=0,0023) ................................................................ 138
toutes causes en fonction des génotypes du rs6889608 chez
les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE (p=0,013) ........ 139
Figure 49 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans accident
vasculaire cérébral en fonction des génotypes du rs6889608
chez les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE
(logrank=5,9; p=0,016) .................................................................. 139
Figure 50 Stratégie d’exploration de l’association entre stéroïdes sexuels,
variants génétiques du CYP19A1 et risque de survenue
d’événements cardiovasculaires et rénaux dans la population
SURDIAGENE............................................................................... 172
principal de jugement en fonction du sexe chez les patients de
l’étude SURDIAGENE (logrank=6,5 ; p=0,011) ............................. 175
toutes causes en fonction du sexe chez les patients de l’étude
SURDIAGENE (logrank=7,2 ;p=0,008) ......................................... 175
Figure 53 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans
insuffisance rénale chronique terminale en fonction du sexe
chez les patients de l’étude SURDIAGENE (p=0,0096) ................ 176
13
14
I.
INTRODUCTION
15
16
INTRODUCTION
1. Définition et type de diabète
1.1.
Définition et diagnostic
Le diabète est, selon l’Association Américaine du Diabète (ou ADA pour
American Diabetes Association), une affection métabolique caractérisée par
« une hyperglycémie résultant d’anomalies de la sécrétion d’insuline, de l’action
de l’insuline ou des deux ». L’hyperglycémie chronique du diabète est associée
au long terme à des complications, dysfonctions et insuffisances de différents
organes notamment les yeux, les reins, les nerfs, le cœur et les vaisseaux
sanguins1.
Les données d’études épidémiologiques transversales réalisées en Arizona
chez les indiens Pima2, en Egypte3 ou aux USA (Figure 1) ont permis
d’identifier l’association entre l’apparition des complications spécifiques du
diabète, dont notamment la rétinopathie diabétique (RD), avec les marqueurs
biologiques de l’équilibre glycémique (Glycémie à jeun [GAJ], Glycémie 2h
après une charge de glucose et hémoglobine glyquée [HbA1C]). Le seuil
diagnostique du diabète retenu est celui au dessus duquel l’apparition de la
rétinopathie augmente linéairement.
Figure 1 Prévalence de la rétinopathie par décile
de la distribution de glycémie à jeun (FPG), ],
Glycémie 2h après une charge de glucose
(2hPG), et HbA1c dans 3 populations de
référence : (A) Indiens PIMA, (B) Egyptiens et (C)
Américains de 40 à 74 ans de l’étude NHANES
(source : The Expert Committee on the
Diagnosis and Classification of Diabetes,
Mellitus Diabetes Care 2002)
17
INTRODUCTION
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a proposé de définir le diabète4
lorsque la glycémie plasmatique veineuse :
●
mesurée à jeun est > 1,26 g/l (7,0 mmol/l) à 2 reprises
ou
●
mesurée 2 heures après une charge orale de 75 g de glucose (test
d‘hyperglycémie provoquée orale [HGPO]) est > 2,00 g/l (11,1 mmol/l) à
2 reprises
ou
●
mesurée à n’importe quel moment de la journée est > 2,00 g/l (11,1
mmol/l) seulement si elle s’associe à des symptômes du diabète
(polyurie, polydipsie et perte de poids inexpliquée)
Les données historiques ayant permis d’établir ce seuil glycémique de 1.26 g/l,
accepté actuellement de tous les cliniciens, doivent toutefois être mises en
perspective avec des données plus récentes issues de travaux dans des
populations australiennes et nord américaines et qui n’ont pas permis de
retrouver cette relation de seuil entre GAJ et RD5.
D’autres études épidémiologiques sont venues par la suite confirmer cette
notion de seuil pour l’apparition des complications macrovasculaires même s’il
semble que ce seuil soit légèrement différent de celui des complications
microvasculaires comme nous le verrons plus loin6,7.
Le niveau de HbA1c est corrélé au niveau de glycémie veineuse moyenne des
2-3 derniers mois8.
La relation entre l'HbA1c et la rétinopathie est similaire à celle du glucose
plasmatique dans les études historiques (chez les indiens Pima2, en Egypte3 et
aux USA), mais également dans des populations japonaise9 et australienne10.
Des données de plus de 28 000 sujets, compilées par l’ADA, ont permis
d’explorer la relation entre HbA1c et RD dans le but de déterminer le seuil
d’apparition de RD non proliférative modérée (Figure 2). En 2012, l’ADA a
proposé à partir de ces résultats, le seuil de 6,5% d’HbA1c comme critère
diagnostique du diabète sous certaines conditions notamment celle de
l’utilisation d’une méthode de dosage de l’HbA1c certifiée et standardisée11.
18
INTRODUCTION
Figure 2 Prévalence de la rétinopathie diabétique non proliférante en fonction du taux
d’hémoglobine glyquée (par des intervalles de 0,5%) chez plus de 28000 participants âgés de 20-79
ans. (source ADA Diabetes Care 2009)
L’altération de la tolérance au glucose et de la glycémie à jeun sont des
affections intermédiaires (pré-diabète) qui font la transition entre normalité et
diabète. Les personnes qui en sont atteintes sont exposées à un risque élevé
d’évolution vers un diabète de type 2 (DT2), même si ce dernier ne semble pas
inévitable4.
1.2.
Types de diabète
Il existe plusieurs causes conduisant au diabète (Tableau 1) dont les 2
principales formes sont le diabète de type 1 (DT1) qui est d’origine autoimmune ou idiopathique, et le DT2 qui combine à différent degré une insulinorésistance et un déficit d’insulino-sécrétion. Le DT2 représente à lui seul
environ 90-95% des diabètes.
Nous nous attacherons à décrire dans ce manuscrit les éléments concernant
uniquement le DT2 qui reste un diagnostic d’élimination.
19
INTRODUCTION
Tableau 1 Classification étiologique des diabètes sucrés selon l’ADA (source : The Expert
Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes, Mellitus Diabetes Care 2002)
I. Type 1 diabetes* (β-cell destruction, usually leading to absolute insulin deficiency)
A. Immune mediated
B. Idiopathic
II. Type 2 diabetes* (may range from predominantly insulin resistance
with relative insulin deficiency to a predominantly secretory defect with insulin resistance)
III. Other specific types
A. Genetic defects of β-cell function
1. Chromosome 12, HNF-1α (MODY3)
2. Chromosome 7, glucokinase (MODY2)
3. Chromosome 20, HNF-4α (MODY1)
4. Mitochondrial DNA
5. Others
B. Genetic defects in insulin action
1. Type A insulin resistance
2. Leprechaunism
3. Rabson-Mendenhall syndrome
4. Lipoatrophic diabetes
5. Others
C. Diseases of the exocrine pancreas
1. Pancreatitis
2. Trauma/pancreatectomy
3. Neoplasia
4. Cystic fibrosis
5. Hemochromatosis
6. Fibrocalculous pancreatopathy
7. Others
D. Endocrinopathies
1. Acromegaly
2. Cushing’s syndrome
3. Glucagonoma
4. Pheochromocytoma
5. Hyperthyroidism
6. Somatostatinoma
7. Aldosteronoma
8. Others
E. Drug- or chemical-induced
1. Vacor
2. Pentamidine
3. Nicotinic acid
4. Glucocorticoids
5. Thyroid hormone
6. Diazoxide
7. β-adrenergic agonists
8. Thiazides
9. Dilantin
10. α-Interferon
11. Others
F. Infections
1. Congenital rubella
2. Cytomegalovirus
3. Others
G. Uncommon forms of immune-mediated diabetes
1. “Stiff-man” syndrome
2. Anti-insulin receptor antibodies
3. Others
H. Other genetic syndromes sometimes associated with diabetes
1. Down’s syndrome
2. Klinefelter’s syndrome
3. Turner’s syndrome
4. Wolfram’s syndrome
5. Friedreich’s ataxia
6. Huntington’s chorea
7. Laurence-Moon-Biedl syndrome
8. Myotonic dystrophy
9. Porphyria
10. Prader-Willi syndrome
11. Others
IV. Gestational diabetes mellitus (GDM)
20
INTRODUCTION
2. Epidé
démiologie du diabète
2.1.
Incid
idence et prévalence
D’après les données de
d l’OMS en 2011, environ 356 millions de
d personnes sont
12
diabétiques dans le monde . Il existe des différencess importantes de
prévalence entre les différentes
d
nations et la Figure 3 présente
te des données de
l’Organisation de Coo
oopération et de Développement Econom
mique (OCDE) qui
permettent de visualis
liser cette hétérogénéité de prévalence cchez les patients
âgés de 20 à 79 ans13.
Figure 3 Estimations de la prévalence du diabète parmi la population âgée
e de 20 à 79 ans, 2010
(source : données OCDE 2011)
20
Cette disparité a égal
alement été mise en évidence sur le cont
ntinent européen à
partir des données du
u projet collaboratif EURODIAB pour ce qui
qu est du DT114,15.
En France, il existe
e également une forte disparité géograp
raphique avec une
prévalence plus élevé
vée dans la région nord-est et les DOM TOM
TO (en rouge sur
la Figure 4).
21
INTRODUCTION
Figure 4 Taux standardisé de prévalence du diabète en fonction du département en 2009 d’après
les données du régime général de l’Assurance Maladie (source : Ricci P BEH 2010)
En 2007 en France, la population diabétique avait un âge moyen de 65 ans et
26% avait 75 ans ou plus. Un peu plus de la moitié des personnes diabétiques
(54%) sont des hommes, lesquels sont un peu plus jeunes que les femmes
diabétiques16.
L’incidence du diabète, en France, est approchée au travers des données de
l’Assurance Maladie et des admissions en Affection de Longue Durée (ALD)
pour diabète, qui donnent droit au remboursement à 100%du coût des soins
liés à la maladie. En 2006, le taux brut d’incidence des ALD pour diabète
atteignait 289 pour 100 000 habitants correspondant à environ 178 000
nouvelles admissions17.
La population diabétique est en augmentation constante dans le monde et en
France (
Figure 5). La prévalence en France est passée de 2,5 millions de patients
traités soit 3,95% de la population (dont 92%pour le type 2, soit 2,2 millions de
patients) en 200718 à 2,9 millions soit 4,39% de la population en 200917.
22
INTRODUCTION
Figure 5 Évolution de la prévalence du diabète traité entre 2000 et 2009 d’après les données du
régime général de l’Assurance Maladie (source : Ricci P BEH 2010)
SLM, sections locales mutualistes (mutuelles des fonctionnaires et des étudiants) ; INSEE, Institut
national de la statistique et des études économiques
Aux USA en 2010, d’après les données du Center for Disease Control and
Prevention (CDC) d’Atlanta, le nombre de patients atteints par le diabète est
estimé à 28,5 millions soit 8,3% de l’ensemble de la population parmi lesquels
18,8 millions sont diagnostiqués et 7 millions sont des diabétiques méconnus19.
Il existe une grande disparité ethnique et les données NHANES 2007-2009
montraient que le diabète avait été diagnostiqué parmi les personnes de plus
de 20 ans chez 7.1% des américains d’origine européenne, 8,4% d’origine
asiatique, 11,8% d’origine hispanique et 12,6% d’origine afro-américaine19.
Les projections de la Fédération Internationale du Diabète prévoient pour 2030
environ 440 millions de patients diabétiques dans le monde dont 5,2 millions en
France20.
2.2.
Coût des dépenses de santé
Le diabète et ses complications ont des répercussions économiques
importantes sur les patients et leurs familles mais également les systèmes de
santé des pays. L’OMS estime qu’entre 2006 et 2015, la Chine va perdre 558
milliards de $ de revenu national à cause des complications cérébrales et
cardiaques du diabète12.
23
INTRODUCTION
Les dépenses de santé engagées pour traiter et prévenir le diabète ainsi que
ses complications ont été évaluées à 345 milliards de $ dans les pays de
l’OCDE en 201020.
En France, le coût des soins remboursés aux patients en ALD pour diabète
était d’environ 9 milliards d’euros en 2004 et 12,5 milliards d’euros en 2006.
Le remboursement annuel par l’Assurance Maladie des frais de santé liés au
diabète est passé d’une estimation de 4300 €/personne/an en 200421 à celle de
5300 €/personne/an en 200722.
En comparaison, l’estimation du coût annuel des frais de santé lié au diabète
était aux USA en 2007 de 174 milliard $, ce qui représentait un coût individuel
de 6446 $/ personne/an19,23.
Environ un quart des dépenses médicales, liées au diabète, est consacré à la
prise en charge de l’hyperglycémie, un autre quart au traitement des
complications chroniques du diabète, et le reste aux soins médicaux généraux
supplémentaires20.
En France, les données de l’assurance maladie montrent que ces frais étaient
liés majoritairement à la prescription de médicaments et aux hospitalisations
(26,8% et 37,2% respectivement) mais également aux soins infirmiers (8,4%) et
aux dispositifs médicaux dont les matériels d’autosurveillance glycémique
(7,7%)22.
24
INTRODUCTION
3. Complications du diabète
3.1.
Mortalité
D’après l’OMS, le diabète a tué environ 3,4 millions de personnes en 2005 dans
le monde, en lien avec une complication cardiovasculaire dans 50 à 80% des
cas. D’après les projections, le nombre total de décès par diabète devrait
augmenter de plus de 50% au cours des dix prochaines années et le diabète
pourrait devenir la 7e cause de décès dans le monde d’ici 2030.12.
La mortalité générale chez les sujets diabétiques est au minimum deux fois plus
importante que chez les personnes indemnes de diabète24.
En France, l’analyse des causes de décès se fait grâce aux données des
certificats de décès collectés par le Centre d’épidémiologie sur les causes
médicales de décès (CépiDc). En 2006, le diabète était noté sur les certificats
de décès comme cause associée dans environ 6% de l’ensemble des décès en
France17 (Figure 6).
Figure 6 Évolution de la part du diabète dans la mortalité générale et des taux standardisés de
mortalité liée au diabète en causes multiples, France, de 2001 à 2006 (d’après Fagot-Campagna
INVS 2010)
En 2008 le diabète était, en France, la 6e cause de décès (en considérant la
cause initiale ayant conduit au décès) avec 11 713 décès soit 2,2%de
l’ensemble des décès25.
L’étude ENTRED (pour Échantillon National Témoin REprésentatif des
personnes Diabétiques) avait pour objectifs de réaliser un état des lieux de
l’état de santé de la population diabétique et de sa prise en charge médicale en
France sur un échantillon de plus de 10 000 diabétiques français. Dans l’étude
ENTRED 2001-2003, le taux de mortalité annuel était de 32 ‰ personnesannées et ce taux était 1,6 fois plus élevé chez les hommes que chez les
femmes26.
Aux USA, le diabète était, en 2007, la 7e cause de décès. Il était notifié sur les
certificats de décès comme cause initiale dans 30%des cas (soit 71 382 décès)
et comme cause associée dans 69% (soit 160 022 décès) de l’ensemble des
231 404 décès survenus aux USA en 200719.
25
INTRODUCTION
3.2.
Complications vasculaires
Le diabète est une des principales causes de cécité, d’amputation,
d’insuffisance rénale et de maladie cardiaque.
Il est à noter que le patient diabétique peut présenter également des
complications métaboliques (coma hyperosmolaire ou acido-cétosique,
hypoglycémie et acidose lactique), cutanéo-muqueux ou ostéo-articulaires mais
seules les complications cardiovasculaires et rénales seront développées ici.
Le Tableau 2 montre la prévalence des complications du DT2 de l’étude
française ENTRED en 200716.
Tableau 2 Prévalence des complications du diabète de type 2 dans l'étude ENTRED (Source : Fagot
Campagna BEH 2009)
Les complications vasculaires sont habituellement dichotomisées en
complications microvasculaires (microvaisseaux de la rétine, des reins et des
nerfs) d’une part et macrovasculaires (aorte et coronaires, carotides et artères
de membres) d’autre part.
26
INTRODUCTION
A. Microangiopathies
Reins et Néphropathie
EPIDEMIOLOGIE
Le diabète est la 1ère cause d’Insuffisance rénale chronique terminale (IRCT)
nécessitant une suppléance rénale (dialyse ou greffe rénale). D’après l’OMS,
10 à 20% des sujets diabétiques meurent d’une insuffisance rénale.
En France, dans l’étude ENTRED 2007-2010, 19% des patients présentaient un
débit de filtration glomérulaire estimé (DFGe) <60 ml/min16.
D’après le registre REIN (pour Réseau Epidémiologie et Information en
Néphrologie), qui a pour objectif de collecter l’information des patients
bénéficiant d’un traitement de suppléance de leur IRCT, les patients
diabétiques représentent 22,8% des nouveaux patients pris en charge dialyse
en 2006, c'est-à-dire autant que ceux arrivant en dialyse à cause d’une
patholgie hypertensive ou vasculaire27.
Aux USA, l’enquête nationale NHANES (pour National Health and Nutrition
Examination Survey) réalisée entre 2005-2008 rapporte que 14,9% des sujets
diabétiques présentaient une microalbuminurie (EUA >30mg/l) et que 23,7%
avaient une fonction rénale altérée avec un DFGe < 60 ml/min28.
Dans le registre américain des IRCT (dont le nom est USRDS pour United
States Renal Data System), il avait été dénombré, en 2010, 224 000 patients
diabétiques traités par dialyse29. Cela représentait une incidence annuelle de
+50 000 nouveaux cas de dialyse dans la population des patients diabétiques
(Figure 7).
Figure 7 Causes d'insuffisance rénale terminale aux USA entre 1980 et 2008 : à gauche en nombre
et à droite en taux par millions (source : USRDS 2012 Annual Data Report )
27
INTRODUCTION
PHYSIOPATHOLOGIE
La néphropathie diabétique (ND) est caractérisée par des altérations
hémodynamiques avec hyperfiltration glomérulaire et hypertension artérielle
(HTA) qui se traduisent d’un point de vue fonctionnel par une augmentation de
l’excrétion urinaire d’albumine (EUA).
La microalbuminurie correspond à une EUA entre 30 et 300 mg/24h mais elle
peut être également définie en fonction de la concentration d’albumine urinaire
sur échantillon voire du rapport de la concentration d’albumine urinaire sur la
concentration de créatinine urinaire (où ACR pour albumin/creatinin ratio). Le
Tableau 3 présente les stades d’albuminurie en fonction de l’ACR ou de l’EUA.
Tableau 3 Définition des stades d'excrétion urinaire d'albumine
diabétologie 2000 Ed Médecine Sciences-Flammarion)
Ratio albumine/créatinine
(d’après Grimadi A Précis de
Excrétion urinaire d’albumine
Spot
(mg/l)
Récolte
nocturne
minutée
(µg/min)
Recueil
sur 24 h
(mg/24h)
Homme < 20
Femme < 30
<20
<20
< 30
Homme 2,5-25
Femme 3,5-35
Homme 20-200
Femme 30-300
20-200
20-200
30-300
Homme >25
Femme >35
Homme >200
Femme >300
>200
>200
> 300
Stade
Spot
(mg/mmol
créatinine)
Spot
créatinine)
Normoalbuminurie
Homme <2,5
Femme < 3,5
Microalbuminurie
Macroalbuminurie
(protéinurie)
(mg/g
La microalbuminurie est présente chez un quart des patients DT2 après 10 ans
d’évolution de diabète30.
La microalbuminurie est, dans le DT2, un facteur de risque d’évolution vers la
ND31 mais également un facteur de risque de complications cardiovasculaires32
et de mortalité cardiovasculaire33 ou toutes causes34.
Il a également été montré, dans le DT1, que les patients qui ne développaient
pas de ND avait un risque de mortalité similaire à celui de la population
générale tandis que ceux qui devenaient microalbuminuriques présentaient un
taux de mortalité 2,8 à 6 fois plus élevé35,36.
Au niveau histologique, les lésions retrouvées sont situées :
o au niveau glomérulaire avec un épaississement de la membrane
basale, une expansion de la matrice mésangiale et des anomalies
des podocytes (réduction de l’expression de la néphrine),
o au niveau artériolaire avec un infiltrat sous-endothélial des
artérioles afférentes et efférentes,
o au niveau tubulo-interstitielle où une fibrose est présente.
28
INTRODUCTION
DIAGNOSTIC
Le diagnostic de ND est suspecté chez un diabétique de longue date
(ancienneté > 10 ans ou présence concomittante de RD qui traduit l’exposition
prolongée à l’hyperglycémie) en cas de macroalbuminurie persistante ou de
DFGe <60ml/min/1.73m².
Une classification en 5 stades de la ND a été proposée à partir des travaux
menés par Mogensen et al. dès les années 1980 dans le DT137 en s’appuyant
sur des données anatomiques, histologiques et fonctionnelles (Tableau 4).
Tableau 4 Définition des stades de néphropathie diabétique (D’après Grimaldi A Précis de
diabétologie 2000 Ed Médecine Sciences-Flammarion)
Stade de néphropathie dabétique
Albuminurie
Pression
artérielle
Débit de Filtration
Glomérulaire
Stade 1
Hypertrophie rénale
normale
normale
Elevée (+ 20%)
Stade 2
Phase silencieuse
normale
normale
Elevée à normale
Stade 3
Néphropathie incipiens
Microalbuminurie
discrètement
augmentée
normale ou
discrètement
augmentée
Stade 4
Néphropathie
Macroalbuminurie
(protéinurie)
Souvent élevée
Baisse de -10 ml/an
(sans traitement)
Stade 5
Insuffisance rénale
Protéinurie
massive
Souvent élevée
< 30 ml/min
L’évolution naturelle de la ND décrite par Mogensen et al. fait se succéder
inexorablement les différents stades de ND par ordre de sévérité croissante
jusqu'à l’IRCT et la mort. Néanmoins l’évolution spontanée de certains patients
DT2 ne suit pas toujours cette linéarité car :
• au moment de leur diagnostic, 3% des DT2 présentent déjà une
microalbuminurie,
• des données de l’étude UKPDS (pour United Kingdom Prospective
Diabetes Study) ont montré que l’état de certains patients peut
s’aggraver en « sautant » un stade30,
• des résultats de l’étude du Steno Diabetes Center ont montré après 8
ans de suivi des patients micro-albuminuriques DT2 qu’environ 1/3
restait microalbuminurique, 1/3 a régressé vers la normoalbuminurie et
1/3 tiers a progressé38,
• 20% des DT2 présentant un DFG< 60 ml/min ont une albuminurie
normale39-41.
Cette notion de patients insuffisants rénaux normalbuminuriques est imagée par
le résultat d’une cohorte de patients australiens en Figure 840.
29
INTRODUCTION
Figure 8 Répartition graphique d’une population de 301 patients DT2 australiens en fonction de
leur excrétion urinaire d’albumine (en colonne de gauche à droite : normo-, micro- et macro-) et
leur fonction rénale (en ligne conservée en haut [DFGe >60ml/min] et altérée en bas [<60 ml/min])
(Source : Mac Isaac RJ Diabetes 2004)
L'histoire naturelle de l’atteinte rénale au cours du diabète est donc très
hétérogène et non linéaire au regard de ces éléments. Il semble néanmoins,
que l’incidence annuelle de l’évolution d’un stade de ND vers un stade
supérieur se situe autour de 2-3%, tandis que le risque de décès augmente
fortement avec la gravité de l’atteinte rénale. La Figure 9 propose un schéma
de l’histoire naturelle de la ND chez des sujets DT2 à partir des données de
l’étude UKPDS30.
Figure 9 Taux annuel de transition entre les stades de néphropathie diabétique d'après les
données d’UKPDS (source : Adler AI Kidney Int 2003)
Le risque d’évolution vers l’IRCT a pu être modélisé et des scores de risque,
issus des données d’études comme RENAAL (pour Reduction of Endpoints in
NIDDM with the Angiotensin II Antagonist Losartan), sont disponibles pour une
évaluation individuelle. Ils prennent en considération en plus de l’EUA, l’ACR, la
créatininémie et le taux d’hémoglobine42.
30
INTRODUCTION
Œil et rétinopathie diabétique
EPIDEMIOLOGIE
L’atteinte ophtalmologique du diabète est représentée par la rétinopathie même
s’il existe également des atteintes de la cornée, du cristallin (anomalies de la
réfraction et de l’accommodation, glaucome), des nerfs optiques et
oculomoteurs.
L’OMS a estimé qu’en 2002, la RD était la cause de 5% des individus atteints
de cécité soit 5 millions de personnes.
En 2005-2008 aux USA, 4,2 millions des personnes atteintes de diabète, âgées
de 40 ans ou plus, avaient une RD dont 700 000 avaient une forme avancée qui
aurait pu mener à la perte de vision sévère19.
En 2007 en France, 16,6% des patients de l’étude ENTRED avaient déjà
bénéficié d’un traitement par photocoagulation par laser16 (ce qui représentait
une projection de 110 000 patients DT2 atteints en France cette même année).
PHYSIOPATHOLOGIE
Les conséquences de l’hyperglycémie chronique (activation de la voie des
polyols et de la PKCβ, production d’AGE et de radicaux libres) entraînent, au
niveau des capillaires rétiniens, une augmentation de leur perméabilité
(hémorragies et exsudats [nodule cotonneux]), des dilatations et la formation de
microanévrysmes. Ces anomalies entraînent également une occlusion des
capillaires puis des artérioles qui aboutit à une ischémie rétinienne. La sécrétion
de facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF pour Vascular
Endothelial Growth Factor), en réponse à cette ischémie entraîne, à son tour, la
formation d’une néo-vascularisation anormale et peu fonctionnelle.
Les phénomènes œdémateux prédominent dans la région centrale de la rétine,
la macula, et les phénomènes occlusifs affectent surtout la rétine périphérique,
du moins initialement.
La maculopathie diabétique peut se développer à tous les stades de la
rétinopathie mais est d’autant plus fréquente que la RD ischémique est sévère.
DIAGNOSTIC
La RD est composée de plusieurs lésions typiques identifiées au fond d’œil
(FO) qui s’associent pour définir plusieurs stades d’atteinte (ALFEDIAM 1999) :
1. RD NON PROLIFERANTE
a. Minime (microanévrysmes isolés, hémorragies rétiniennes
punctiformes peu nombreuses).
b. Modérée
(nombreux
microanévrysmes,
hémorragies
rétiniennes punctiformes, nodules cotonneux, signes
d'ischémie rétinienne peu nombreux)
31
INTRODUCTION
c. Sévère ou RD préproliférante
(plus de 20 hémorragies rétiniennes dans chaque quadrant
et/ou anomalie veineuse en chapelet dans au moins 2
quadrants
et/ou
anomalies
microvasculaires
intrarétiniennes [AMIR] dans un quadrant)
2. RD PROLIFERANTE (présence de néovaisseaux prérétiniens et/ou
prépapillaires)
a. Minime (néovaisseaux prérétiniens < ½ de la surface
papillaire
b. Modérée (néovaisseaux prérétiniens ≥ ½ de la surface
papillaire et/ou néovaisseaux prépapillaires < ¼ à ⅓ de la
surface papillaire)
c. Sévère (néovaisseaux prépapillaires ≥¼ à ⅓ de la surface
papillaire)
d. Compliquée (avec hémorragie du vitré, décollement de rétine
par traction, glaucome néovasculaire)
Neuropathie
Les neuropathies diabétiques font partie des complications spécifiques du
diabète et recouvrent plusieurs entités cliniques en fonction du types de fibres
nerveuses atteintes : poly/mononévrite sensitive et/ou motrice, neuropathie
autonome (pupillaire, cardiovasculaire, sudoripare, gastro-intestinale, génitourinaire…).
La prévalence de la neuropathie diabétique est très difficile à appréhender mais
il est vraisemblable qu’environ 20% des sujets diabétiques en aient une
présentation clinique.
Des convergences d’opinion de différentes associations mondiales de lutte
contre le diabète ont permis d’établir des critères de diagnostic de classification
des polynévrites sensitivo-motrices43,44 .
La définition de la polyneuropathie sensitivomotrice diabétique est basée sur
l’existence de signes cliniques de polyneuropathie (comme la baisse de la
sensibilité, l’apparition de dysesthésies, de sensations de brûlures ou de
douleurs lancinantes) prédominant au niveau des pieds ou des jambes de
manière symétrique et en association avec une hypo/aréflexie ostéotendineuse.
Le diagnostic est confirmé par la présence d’une anomalie des tests de la
conduction nerveuse. La définition actuelle propose quatre niveaux de
neuropathie diabétique : possible, probable, confirmé ou infraclinique.
Les patients diabétiques peuvent présenter également des neuropathies
autonomes au niveau cardiovasculaire, gastro-intestinal, uro-génital mais
également au niveau de la fonction sudorale.
32
INTRODUCTION
B. Macroangiopathies
L’hyperglycémie chronique induit des anomalies physiopathologies favorables
au développement de l’athérosclérose chez le diabétique. Ces anomalies, qui
associent une dysfonction endothéliale, des anomalies des fonctions
plaquettaires couplées à un état pro-coagulant et des anomalies vasomotrices
des cellules musculaires lisses vasculaires, jouent un rôle important de
facilitateurs dans le développement à long terme de la maladie vasculaire chez
les patients DT2.
Cœur et cardiopathie
EPIDEMIOLOGIE
Depuis l’étude de Framingham, qui avait suivi prospectivement une cohorte de
5345 hommes et femmes de 30 à 74 ans dans le Massachusetts (USA)
pendant 12 ans dans les années 1970, il a été mis en évidence un risque
augmenté de 2 à 3 fois de maladies cardiovasculaires chez les patients
diabétiques. Il a également été mis en évidence que le risque d’insuffisance
cardiaque congestive (ICC) chez les sujets diabétiques était multiplié par 2 chez
les hommes et par 5 chez les femmes45.
En 2007 en France, dans l’étude ENTRED la prévalence de la cardiopathie
ischémique (angor ou infarctus du myocarde [IDM]) et l’ICC étaient de 16,7% et
6,3%respectivement ce qui représentait une projection respectivement de
367 000 et 139 000 patients DT2 atteints en France cette même année par
chacune de ces deux complications.
En 2004 aux USA, 68% des décès liés au diabète étaient dûs, selon les
certificats de décès, à une maladie cardiaque chez les plus de 65 ans19.
La maladie coronaire du diabétique présente des spécificités qui la distingue de
l’athérosclérose chez les sujets non diabétiques notamment parce qu’elle est
plus diffuse et plus sévère mais aussi parce les plaques sont plus instables et
plus distales. Par ailleurs, la présentation clinique est différente de celle des
sujets non diabétiques avec des formes d’ischémie silencieuse plus fréquentes
et une incidence de complications à type d’insuffisance cardiaque ou de
récidive à la phase aiguë plus importante.
Il a d’ailleurs été récemment montré dans une population japonaise de patients
DT2 que les coronaropathies asymptomatiques avec anomalies perfusionnelles
myocardiques étaient présentes chez la moitié des patients présentant déjà
d’autres complications micro ou macrovasculaires46.
La méta-analyse de Sarwar et al.24 a permis de montrer à partir des données de
plus d’une centaine d’études prospectives (698 782 patients) qu’après
ajustement sur les facteurs de risque cardiovasculaire connus (âge, tabagisme,
indice de masse corporel [IMC] et pression artérielle systolique [PAS]) le risque
de survenue de maladie coronarienne (fatale ou non) et le risque d’accident
vasculaire cérébral étaient doublés chez les patients diabétiques (Hazard ratio
[HR] 2,0 et 2,27 respectivement).
Le risque de maladie cardiovasculaire a pu être modélisé grâce à des scores de
risque issus d’études en population générale comme Framingham47-50, ARIC
33
INTRODUCTION
(pour Atherosclerosis Risk in Communities Study)51, DECODE (pour Diabetes
Epidemiology: Collaborative analysis of Diagnostic criteria in Europe)52 ou
SCORE (pour Systematic COronary Risk Evaluation project)53 ou plus
spécifiquement de populations diabétiques comme UKPDS54,55 ou ADVANCE56.
Ces outils proposent une évaluation précise du risque cardiovasculaire (global
ou décomposé) individuel chez le sujet diabétique.
Cerveau et Accident Vasculaire Cérébral
En 2007 en France, dans l’étude ENTRED la prévalence de l’AVC était de 5%
des patients suivis ce qui représentait une projection de 110 000 patients DT2
atteints en France cette même année16.
En 2004 aux USA, 16% des décès liés au diabète étaient dûs, selon les
certificats de décès, à un AVC chez les plus de 65 ans19.
Artériopathie des membres
En 2007 en France, dans l’étude ENTRED, la prévalence de l’amputation était
de 15% des patients suivis ce qui représentait une projection de 33 000 patients
DT2 amputés en France cette même année16.
Les complications artérielles du diabète sont la 1ére cause d’amputation non
traumatique de membres inférieurs.
En 2006 aux USA, environ 65 700 amputations non traumatiques des membres
inférieurs ont été réalisées chez des personnes atteintes de diabète.
Il est à noter que l’artériopathie des membres inférieurs aboutit d’autant plus
fréquemment à des lésions nécessitant une amputation qu’elle est associée
avec une neuropathie.
3.3.
Qualité de vie
Les conséquences de la maladie, plus que le diabète lui-même, altèrent la
qualité de vie (QdV) des patients. Il a été montré dans 2007 que les
complications macrovasculaires (plus que les complications microvasculaires),
les hypoglycémies sévères, les revenus et le soutien social perçus comme
insuffisants déterminaient fortement le niveau de qualité de vie. En limitant
progressivement les activités, le diabète a également un effet de vieillissement
prématuré. Par ailleurs, l’obésité, qui est fortement associée au diabète, avait
un effet négatif sur la QdV physique par la limitation de la mobilité.
Les données issues des études d’intervention comme UKPDS57 mais
également d’observation comme ENTRED ont montré que la qualité de vie des
patients atteints de diabète était altérée par la survenue de complications58-60
qu’elles soient micro ou macrovasculaires. La fréquence de survenue
d’épisodes d’hypoglycémie impacte également la qualité de vie en perturbant
l’humeur et altérant la satisfaction au travail57. Les stratégies d’intensification
thérapeutique pour le contrôle glycémique ne semblent pas, quant à elles,
modifier la qualité de vie des patients57,61.
34
INTRODUCTION
4. Traitement du diabète de type 2 et de ses
complications
Il a été montré que des mesures hygiéno-diététiques simples modifiant le mode
de vie représentent la base du traitement non pharmacologique du diabète :
•
•
•
favoriser la réduction de poids (modeste de 5 à 10%) ou au moins
stabiliser le poids,
promouvoir l’activité physique (au moins 30 min/jour d’un exercice
régulier d’intensité modérée ou équivalent à 150 min/semaine),
promouvoir un régime alimentaire sain composé de trois à cinq fruits et
légumes par jour et réduire l’apport en sucre et en graisses saturées tout
en personnalisant les conseils diététiques.
Néanmoins, environ 40% des diabétiques ont besoin de médicaments par voie
orale pour contrôler la glycémie et 40% doivent avoir recours aux injections
d'insuline12.
Les thérapeutiques pharmacologiques anti-hyperglycémiantes sont introduites
et adaptées en fonction des objectifs glycémiques personnalisés du patient. La
Figure 10 montre les recommandations générales sur les médicaments antihyperglycémiants du DT2 issues de la prise de position émise par l’ADA et
l’Association Européenne pour l’Étude du Diabète (EASD)62 et reprise par la
Société Francophone du Diabète (SFD)63.
Figure 10 Recommandations générales sur la stratégie des médicaments anti-hyperglycémiants du
diabète de type 2 (source : Société Francophone du Diabète 2012)
35
INTRODUCTION
L’effet du traitement pharmacologique a été exploré dans les essais cliniques
interventionnels avec comme critères de jugement l’efficacité sur les
complications principalement macrovasculaires.
Dans le DT1, la cohorte EDIC (pour Epidemiology of Diabetes Interventions and
Complications) qui est le prolongement du suivi de l’essai clinique DCCT
(Diabetes Control and Complications Trial) a montré clairement le bénéfice au
long terme du traitement intensif (optimisation du traitement avec pour cible une
HbA1c moyenne <7%) dans le DT1 sur la microangiopathie (ND
[microalbuminurie et baisse du DFGe64], neuropathie et RD)65 comme sur les
évènements macrovasculaires66 en dépit de contrôle glycémique identique
entre les 2 groupes.
Dans le DT2, le suivi 10 ans après l’étude UKPDS a corroboré l’effet durable du
traitement glycémique intensifié précoce sur les complications microvasculaires
et macrovasculaires67.
Chacune des études d’intervention chez des patients DT2 que sont ACCORD
(pour Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes Study68), ADVANCE
(pour Action in Diabetes and Vascular Disease: Preterax and Diamicron
Modified Release Controlled Evaluation study69) et VADT (pour Veterans Affairs
Diabetes Trial70) n’a pas permis de montrer un bénéfice du traitement intensif
sur des événements macrovasculaires.
Toutefois la méta-analyse réalisée en 2012 par Turnbull et al. a montré, en
reprenant les données issues de ces 4 populations étudiées (soit plus de
27 000 sujets), que le traitement intensif diminuait significativement le risque de
survenue d’IDM (odds ratio [OR] 0,85 ; intervalle de confiance à 95% [IC95%]
0,76–0,94) mais n’avait pas d’impact sur la survenue des autres complications
cardiovasculaires71.
Les résultats de l’étude ORIGIN (pour Outcome Reduction with an Initial
Glargine Intervention study) à 6 ans de suivi n’ont également pas permis de
montrer un bénéfice du traitement par insuline glargine sur les événements
cardiovasculaires majeurs (le critère de jugement principal est un critère
composite incluant AVC non fatal et IDM non fatal et mort cardiovasculaire). Il
est cependant intéressant de noter que pour ce qui concerne le critère IDM non
fatal (qui n’est qu’un critère secondaire de jugement dans ORIGIN), le risque
est significativement diminué dans le groupe traité intensivement (OR 0,76 ;
IC95% 0,62–0,92).
L’étude Steno-2 a montré un bénéfice du traitement intensif sur la survenue de
la RD, de ND, de neuropathie et la mortalité toutes causes72,73, les études
ACCORD68, et ADVANCE69 sur la survenue de la RD et la ND tandis que
l’étude VADT70 a confirmé le bénéfice, sur des effectifs moindres, uniquement
sur le risque de microalbuminurie.
Une ré-analyse des données de l’étude ADVANCE a permis d’identifier une
relation non linéaire entre le taux d’HbA1c et les risques micro- et
macrovasculaires (Figure 11). Il est apparu un seuil optimal différent pour les
complications macrovasculaires et microvasculaires de 7% et 6.5% d’HbA1c
respectivement7.
36
INTRODUCTION
A
B
Figure 11 Risque relatif d’évènements microvasculaires (A) macrovasculaires (B) selon les déciles
d’HbA1c (d’après Zoungas S Diabetologia 2012)
Pour ce qui concerne spécifiquement la RD, outre l’équilibre de la glycémie, des
chiffres de pression artérielle et la prise en charge des facteurs de risque
cardiovasculaires, il a été montré que la photocoagulation panrétinienne était le
traitement de la forme proliférante et pouvait permettre d’en limiter la
progression et de réduire le risque de cécité associée74,75. De manière
complémentaire, certaines données issues d’essais randomisés concernant des
agents anti-VEGF ont montré un bénéficie sur la rétinopathie proliférative et
l’œdème maculaire76. Enfin, des résultats sur l’utilisation des fibrates ont
également montré un bénéfice sur la progression de la RD77,78.
37
38
II.
DETERMINANTS
GENETIQUES DES
COMPLICATIONS
DU DIABETE
39
40
DETERMINANTS GENETIQUES DES COMPLICATIONS DU DIABETE
Les complications du DT2 sont des maladies complexes dans lesquelles
interagissent des facteurs de susceptibilité (ou de protection) liés à
l’environnement (dans le sens large de ce qui environne ou a environné le
patient) mais également des facteurs liés au patrimoine génétique de l’individu.
Au sein des maladies génétiques, coexistent les maladies héréditaires (à
transmission mendélienne), les maladies mitochondriales (hérédité maternelle),
les maladies par aberration chromosomique et les maladies multifactorielles.
Ces dernières, appelées également maladies à hérédité complexe s’opposent
par définition aux maladies « simples » comme les maladies monogéniques et
aux maladies purement environnementales par le fait d’interaction entre une
composante "environnementale" (plus ou moins identifiable ou connue) et une
composante génétique (multiples déterminants génétiques suspectés). La
Figure 12 propose une représentation graphique d’hérédité mendélienne et
d’hérédité complexe.
Figure 12 Exemples d’hérédité mendélienne et non mendélienne. A. Locus mendélien avec
transmission dominante et fréquence de l’allèle pathologique A : p=0,00275 B. Locus non
mendélien avec fréquence de l’allèle à risque A : p=0,40 La maladie survient au-dessus du seuil de
susceptibilité (source : Campion D médecine/sciences 2001)
On constate pour le diabète et ses complications une forte agrégation familiale
mais la transmission ne correspond à aucun grand mode de transmission
mendélien (autosomique dominant, autosomique récessif, récessif lié au
chromosome X) ni à une transmission mitochondriale.
Le DT2 et ses différentes complications correspondent à cette définition de
maladie complexe. Chaque variant génétique n’est ni indispensable ni suffisant
mais confère une susceptibilité supplémentaire qui fait apparaitre la maladie
lorsqu’un certain seuil est dépassé.
41
Différentes stratégies se sont succédé et combinées pour l’étude de la
composante génétique des maladies complexes. La stratégie globale
d’exploration comporte généralement trois étapes :
1) Montrer que la maladie est familiale,
2) Montrer que la tendance familiale est d’origine génétique,
3) Identifier les gènes impliqués.
Nous allons développer chacune de ces trois étapes en illustrant nos propos à
partir d’illustrations concernant les complications rénales du diabète, néanmoins
il faut considérer que le raisonnement est également identique pour les
complications d’ordre cardiovasculaire.
1.
Arguments pour origine familiale des
maladies ou agrégation familiale
Le rôle de facteurs génétiques dans la survenue des complications a été
initialement suspecté à partir d’études d’agrégation familiale où la prédisposition
familiale est approchée par le « risque relatif familial », appelé λs ou λr qui est
la mesure de l’agrégation familiale d’un trait. Il correspond au rapport entre la
prévalence de la maladie chez les apparentés du cas (habituellement du 1er
degré : parents, enfants, frères et sœurs) et celle de la population générale (ou
chez les apparentés des témoins).
Cette prédisposition familiale a été mise en évidence dans des études « paires
de germains » ou des études « familiales » pour certaines complications ou
traits quantitatifs liés au diabète.
Ainsi le risque de développer une complication rénale était 2,5 à 5 fois
supérieur si le germain index du patient DT1 était lui-même atteint de ND.
Une des premières équipes à avoir identifié ce risque familial pour la
néphropathie était celle de Seaquist et al. qui, en 1989, ont montré aux USA
dans des familles caucasiennes de patients DT1 que 83% des germains des
cas index avec néphropathie étaient atteints de ND contre seulement 17%des
germains de cas index non néphropathes79.
En 1989 Quinn et al. ont montré, dans des familles de patients caucasiens,
qu’après 30 ans d’évolution de DT1, le risque de développer une néphropathie
était 3 fois plus élevé lorsque le germain du cas index était lui-même atteint de
néphropathie. Des résultats concordants ont été rapportés par d’autres équipes
par la suite dans le DT1 dans des populations caucasiennes au Danemark en
199280 et aux USA en 199681 mais également dans le DT2 en Italie en 199782
et au Brésil en 199983.
En 1999, l’équipe de Fioretto et Mauer a rapporté des arguments pour
l’agrégation familiale des lésions histologiques glomérulaires dans le DT184. Ils
ont en effet montré qu’en complément de l’héritabilité de l’EUA85, il existait une
héritabilité des lésions des cellules et de la matrice mésangiale au sein du
glomérule.
42
Dans une étude de ségrégation familiale publiée en 2000, Fogarty et al. ont pu
estimer la variabilité de certains traits quantitatifs liés à la ND dans le DT2. Ils
ont montré que 30% de la variabilité interindividuelle de l’albuminurie était liée à
des facteurs familiaux85.
Il a été également montré dans des populations DT2 que l’héritabilité du DFGe
était de 60% et celle de l’ACR de 46%86.
Cette agrégation familiale de la ND a également été démontrée dans d’autres
groupes ethniques en complément des travaux sur les caucasiens notamment
chez indiens Pima (tribu du sud de l’Arizona)87,88 ou les Afro-americains aux
USA89.
Certains traits de l’athérosclérose liée au diabète ont également une héritabilité
forte dans le DT2 comme cela a été montré pour l’épaisseur intima-media de la
carotide (41% d’héritabilité90) ou les calcifications des artères coronaires (50%
d’héritabilité91). Par comparaison, des travaux menés en population générale
ont retrouvé une héritabilité des lésions d’athérosclérose au niveau des
carotides de 20 à 60%92,93 et au niveau des les coronaires de l’ordre de
46%94,95.
L’héritabilité de traits métaboliques liés au DT2 a été démontrée pour ce qui
concerne la pression artérielle, l’IMC, les marqueurs lipidiques (HDL
cholestérol, cholestérol total, triglycérides) mais également l’insulinorésistance/sécrétion insulinique96-98.
Des données issues de l’étude DCCT99 mais également des données d’études
plus récentes (FIND-eye100 et FinnDiane101), ont permis de montrer que dans le
DT1 la sévérité de la rétinopathie diabétique était influencée, elle aussi, par des
facteurs familiaux. Des travaux menés dans des populations indiennes ou
chinoises sont venues consolider ces résultats sur la rétinopathie
diabétique102,103.
2.
Arguments pour une origine génétique
des maladies
La tendance à l’agrégation familiale d’une maladie n’est pas synonyme de
prédisposition génétique d’autant que les facteurs sociaux et culturels peuvent
en compliquer l’interprétation.
Contrairement aux études d’adoption et de jumeaux, les études familiales ne
permettent pas de déterminer si l’agrégation familiale est d’origine génétique ou
environnementale.
43
2.1.
Etudes de jumeaux
Les études de jumeaux comparent le taux de concordance phénotypique entre
des jumeaux monozygotes (MZ) et des jumeaux dizygotes (DZ) pour estimer la
contribution relative de la génétique et des facteurs environnementaux. Les
jumeaux MZ ont le même patrimoine génétique alors que les jumeaux DZ en
ont la moitié en commun. Les discordances, c’est à dire les différences entre un
jumeau malade et l’autre, sont d’origine génétique lorsqu’elles apparaissent
entre MZ et génétique ou environnementale chez les DZ
Certaines études de jumeaux rapportent des arguments forts pour suspecter
une composante génétique de la maladie notamment pour le diabète lui-même
mais également la RD104,105. Il n’existe pas à notre connaissance d’étude de
jumeaux sur les autres complications vasculaires du diabète.
Les études d’enfants adoptés pourraient également permettre de dissocier la
composante génétique de la composante familiale post natale mais elles n’ont
été que très peu rapportées dans le champ des complications du diabète.
Une prévalence très élevée de maladies complexes dans certains groupes
ethniques peut être un argument pour une origine génétique de la maladie
surtout s’il s’agit d’un isolat (culturel ou géographique). Cette situation peut en
effet expliquer le peu d'apport génétique extérieur à même de "diluer" cette
susceptibilité génétique comme c’est le cas dans les populations d’Arizona
(Indiens Pimas) ou de Micronésie (Nauuru)106-108.
Par ailleurs, dès 1989 des données sur le risque de développer une IRCT au
Michigan (USA) montraient un risque 2,6 plus élevé chez les afro-américains
que chez les caucasiens109, un risque 40 fois plus élevé aux Pays-Bas chez les
indo-asiatiques que pour les caucasiens110.
Le risque d’IDM et de mort cardiovasculaire sont 3.8 et 1,8 fois plus élevés chez
les patients diabétiques originaires d’Asie du Sud-Est que chez les caucasiens
vivant à Londres (UK)111.
La Figure 13 présente les données des registres américains (registre USDRS)
concernant l’incidence et la prévalence annuelle (1981 à 2008) de l’IRCT (dont
le diabète est la 1ère cause) en fonction du groupe ethnique des patients. On
peut y constater les taux plus élevés chez les afro-américains et les «native»
américains comparativement aux autres ethnies.
Figure 13 Prévalence de l’insuffisance rénale chronique terminale aux USA selon l’ethnie
d'appartenance du patient entre 1980 et 2008 (source : USRDS 2012 Annual Data Report)
44
Pour ce qui concerne la DR, il a été montré une prévalence différente selon les
groupes ethniques d’appartenance au niveau mondial112. Il apparaît néanmoins
évident que le poids des facteurs socio-économiques, des habitudes de vie et
de l’environnement social est extrêmement important, compte tenu de leur
disparité, au regard des facteurs de risque spécifiquement liés à l’ethnie et à la
génétique dans les comparaisons de ces communautés distinctes
géographiquement.
2.2.
Analyses de ségrégation
Les analyses de ségrégation visent à déterminer le modèle génétique (mode
héréditaire) qui explique le mieux les distributions familiales d'une maladie. Les
modèles génétiques classiques pour ce qui concerne les maladies complexes
(Figure 14) sont :
• le modèle POLYGENIQUE (ou multifactoriel) : la susceptibilité à la
maladie est sous l’effet de nombreux gènes et facteurs du milieu dont
l’effet individuel est petit mais additif,
• le modèle MIXTE : la susceptibilité à la maladie est sous l’effet d’un
«gène majeur» modulé par un ensemble de gènes mineurs et des
facteurs du milieu.
Figure 14 Modèles génétiques de maladies complexes : A modèle polygénique à seuil ; B modèle
mixte (source : Feingold J Médecine/Sciences 2005)
La question du modèle de transmission héréditaire du diabète et de certaines
de ses complications a été traitée dans des études de ségrégation par de
nombreux auteurs88,113,114. Des arguments pour un modèle mixte (un gène
majeur et des gènes mineurs) ont été avancés par certains même si les
données des études d’association sont venues allonger la liste des gènes
mineurs impliqués.
45
3.
Identifier la région du génome impliquée
Le concept sous-jacent aux études d’association notamment pan-génomique
est que les maladies complexes sont dues à des variants fréquents ou théorie
du « common disease, common variant »115. Les travaux d’exploration menés
jusqu’alors ont montré que l’héritabilité du DT2 était estimée selon les auteurs
de 3 à 6%en impliquant 18 à 25 variants116. Les variants fréquents (fréquence
de l’allèle mineur [MAF] > 5%) pourraient n’expliquer que moins de 20%de cette
variabilité phénotypique ce qui est très faible au regard de l’importance du
nombre de variants supposés impliqués117.
La Figure 15 présente les méthodes d’exploration du génome en fonction de la
fréquence des variants impliqués ainsi que de la taille de leur effet sur le trait ou
la maladie considérée.
Taille de l’effet
Étude
de liaison
Fine
mapping
Fort
Maladies
mendéliennes
Étude
d’association
Variant peu
fréquent avec
effet
intermédiaire
Intermédiaire
Faible
Variant très
inhabituel pour
les maladies
complexes
Maladies
complexes
Variant dur à
identifier
génétiquement
Très rare
0.1%
rare
peu
1% fréquent 5%
commun
Fréquence
de l’allèle mineur
Figure 15 Possibilité d'identifier des variants génétiques en fonction de la fréquence des allèles de
risque et la force de génétique en fonction du type de stratégie (d’après Mc Carthy MI Nat Rev
Genet 2008)
46
3.1.
Etudes de liaison (linkage analysis studies)
Les études de liaison visent à identifier, grâce à un criblage du génome, une
liaison entre une large région de celui-ci (région chromosomique jusqu’à 50 cM)
et la maladie ou le trait d’intérêt.
Elles s’appuient sur le fait que 2 loci sont liés et dits en déséquilibre de liaison
(LD pour linkage desequilibrium) si pendant la méiose, une recombinaison
génétique intervient avec une probabilité de moins de 50%. Deux allèles situés
à 2 loci sont donc en LD lorsqu’ils ne sont pas transmis de manière
indépendante.
Des recombinaisons génétiques ont lieu naturellement en début de méiose et
déterminent des blocs de taille variable coségrégés. Plus les loci sont éloignés,
plus le risque de recombinaison méiotique diminue.
Les polymorphismes utilisés pour marquer le génome peuvent être :
•
•
•
•
•
SNP : pour single nucleotide polymorphism ou polymorphisme mononucléotidique,
CNV : pour copy number variant ou variation du nombre de copies d'un
même gène ou d'un segment chromosomique dans le génome,
Satellite ou VNTR pour variable number tandem repeats :
- Micro satellite : de 10 à 50 répétitions de 1 à 6 paires de bases
- Mini satellite : motif unitaire entre 10 à 100 nucléotides
Ins/Del en cas d’insertion ou de délétion d’une séquence de n
nucléotides au sein du gène,
RFLP : variations individuelles de la séquence d’ADN révélées par des
modifications de la carte de restriction. Les polymorphismes de longueur
des fragments de restriction (RFLP pour Restriction Fragment Lenght
Polymorphism) sont générés après traitement par une enzyme de
restriction.
Deux types d’analyses de liaison peuvent être utilisés selon que le mode
héréditaire de transmission est :
• connu et fixé a priori : modèle PARAMETRIQUE
Le niveau de liaison est alors évalué par le LOD score (LOD pour logarithm of
odds) qui est la probabilité de partage d’allèles entre germains discordants ou
concordants pour le phénotype, les germains étant les frères et sœurs du
propositus (ou proband)).
On considère un score de LOD ≥3 (correspondant à p≤0,0001) comme
significatif pour une liaison/coségrégation entre 2 zones.
• inconnu ou n’est pas clairement établi : modèle NON PARAMETRIQUE
Son principe repose sur l'analyse, pour un marqueur génétique donné, du
nombre d'allèles d'origine parentale partagés entre germains atteints, comparé
au nombre théorique attendu lorsque la ségrégation se fait au hasard. Pour
définir le nombre d'allèles partagés pour un marqueur donné, un score d'identité
par descendance (IBD pour identity by descent) est attribué pour chaque paire
de germains. Les fréquences attendues pour 0, 1 et 2 allèles IBD (marqueurs
47
biallèliques) sont 25%, 50% et 25% respectivement. Cette méthode d'analyse
implique l'étude d'un grand nombre de paires de germains présentant le
phénotype.
Ce principe peut être appliqué sur les paires de germains atteints de la même
maladie (analyse de paires de germains concordantes ou méthode ASP pour
Affected Sibling Pairs analysis) ou sur des paires de germains discordantes
(DSP pou discordant sib-pair analysis).
Les méthodes non paramétriques ont également été développées118-120 pour
des analyses de liaison pour un trait quantitatif (QTL pour Quantitative Trait
Loci) comme par exemple dans la ND avec l’ACR ou l’EUA85,121.
Il a également été développé une méthode basée sur le statut IBS (pour
identical by state) qui permet d'étudier tous les sujets atteints appartenant à des
généalogies, y compris de parents éloignés (méthode APM pour affected
pedigree member122).
Des travaux ont permis de démontrer, en fonction des cas de figure, la
supériorité d’une de ces méthodes d’exploration de liaison sur les autres. Ainsi
Rogus et al. ont montré que la méthode des paires de germains discordantes
pouvaient donner de meilleur résultats en ce qui concerne la ND123.
Le Système Rénine-Angiotensine (SRA) a été, quant à lui, largement exploré et
sert ici d’exemple.
Moczulski et al. ont montré en 1998 chez des patients caucasiens diabétiques
de type 1 avec la méthode des paires de germains discordants le lien entre ND
et une région proche en 3q (20cM) du gène AGTR1 du récepteur de type II de
l’angiotensine (AT1R). Dans cette étude il n’avait pas été possible de mettre en
évidence de lien avec les régions chromosomiques d’autres effecteurs du SRA
et pas de la région 1q proche des gènes AGT de l’angiotensinogène (AGT) ni
de la région 17q qui contient le gène ACE de l’enzyme de conversion de
l’angiotensinogène (ACE)124.
Des données contradictoires avaient cependant été produites par cette même
équipe en 1996 qui n’avait pas pu mettre en évidence, dans une étude de
germains concordant pour l’IRCT et menée chez des afro-américains, le lien
entre les marqueurs (microsatellites) génétiques de l’ACE, l’AGT, l’AT1R (mais
également REN et KLK1 qui codent pour les gènes de la rénine et la
kalikréine 1) et l’IRCT125.
Imperatore et al. ont mis en évidence que des loci pouvaient influencer la
susceptibilité aux complications microvasculaires (sur les chromosomes 3, 7 et
20 pour la ND et sur les chromosomes 3 et 9 pour la RD [Figure 16]). Les
gènes suspectés par les auteurs au niveau de la région chromosomique la plus
fortement en liaison sont TCRBC (T cell receptor beta locus) en position 7q34,
NOS3 (nitric oxide synthase 3) en position 7q36 et ALDR1 (aldo-keto reductase
family 1) en position 7q35126.
48
Figure 16 Résultats d’étude de liaison dans une population de sujets diabétiques de type 2.
Les pics des graphes identifient les régions des chromosomes 3, 7, 9 et 20 associées en haut avec
la néphropathie diabétique et bas avec la rétinopathie diabétique (source : Imperatore G. Diabetes
1998)
Des études de liaison (non paramétriques) de trait quantitatif sur la
susceptibilité de l’IRCT et l’HTA, dans des modèles murins, ont mis en évidence
un signal de liaison proche du gène Rf-1127. Les travaux complémentaires dans
des populations humaines afro-américaine et caucasienne128,129 ont confirmé ce
signal de liaison entre IRCT et une région du chromosome 10, tout
particulièrement une zone adjacente au gène RF1 (analogue humain du gène
Rf-1 qui avait déjà été mis en évidence chez la souris).
Le métabolisme des lipides a été exploré notamment par Elbein et al. dans une
étude de liaison génome entier dans des familles caucasiennes de patients
DT2. Il a été mis en évidence une association entre les concentrations de
triglycérides et la région chromosomique 19q13, elle-même très proche d’un
groupe de gènes impliqués dans la lipidogénèse et appartenant à la famille des
apolipoprotéines (dont APOC2, APOE, APOC1 et APOC4)130.
Le développement et l’amélioration des techniques et des méthodes de
séquençage et de génotypage ont permis aux études de liaison d’explorer
simultanément plusieurs milliers de variants. Ainsi l’étude FIND (pour Family
Investigation of Nephropathy and Diabetes) qui correspond à une étude de
liaison « génome entier » a exploré, aux USA dans plus de 2600 patients de 4
ethnies distinctes différentes (caucasiens, afro-américains, américains d’origine
mexicaine et indiens natifs), plus de 5 500 marqueurs sur les complications
rénales du diabète et particulièrement l’albuminurie131. Des régions
chromosomiques déjà décrites n’ont pas été retrouvées (notamment en 18q
autour du CNDP1), d’autres ont été confirmées comme 7p22, chez les
américains d’origine mexicaine, qui est proche des gènes MYH9 et APOL1
(codant pour la non muscle myosin heavy chain 9 et l’apolipoprotéine L1,
respectivement) tandis que de nouvelles régions ont été identifiées en 3p chez
les afro-américains (proche du gène de la ghréline (GHRL) et en 6p chez les
caucasiens.
49
3.2.
Etudes d’association (ou association studies)
Les études d’association ont pour but de détecter une association d’un ou
plusieurs polymorphismes génétiques et des marqueurs de la maladie qui
peuvent être quantitatifs ou qualitatifs (comme la présence ou la survenue
d’une maladie en étudiant la prévalence dans les études transversales ou
l’incidence dans les études prospectives).
Il s’agit donc de comparer des fréquences (génotypique, allélique ou
haplotypique) de marqueurs génétiques choisis au préalable entre des malades
et des témoins (qui n’ont pas de lien familial a contrario des études de liaison).
L’approche de type « gène-candidat » définit a priori les gènes à tester. Ces
gènes codent pour des protéines connues pour être impliquées a priori dans la
physiopathologie de la maladie.
Ces études peuvent identifier des marqueurs liés avec la maladie et/ou le
phénotype. Certaines associations identifient un marqueur non causal
(marqueur intermédiaire ou surrogate marker) qui est soit lié à un locus causal
pas encore découvert soit un authentique faux positif dû à des facteurs
confondants.
Les études d’association ont fait suite aux études de liaison en proposant une
exploration plus fine des régions du génome, avec une puissance de détection
supérieure sur des populations plus importantes d’individus indépendants entre
eux. Elles s’appuient notamment sur les loci précédemment détectés et
permettent de tester jusqu’à plusieurs centaines de milliers de variants.
L’intensité du LD est mesurée pour 2 loci avec le coefficient D. Certains auteurs
utilisent le coefficient D’ qui correspond à une standardisation de D.
D’ varie entre -1 et 1 (D’=1 : déséquilibre complet ; D’=0 : équilibre de liaison).
Le coefficient de corrélation r² est également utilisé et le seuil de 0,8 est en
pratique considéré pour définir 2 loci en LD.
Il existe au sein du génome des zones en fort LD (blocs en LD ou blocs
haplotypiques) qui peuvent s’étendre jusqu'à plusieurs centaines de kb et au
sein desquels il n’existe qu’une faible diversité haplotypique. Par ailleurs,
certains allèles dont les loci espacés de plusieurs kb et séparés par des loci en
équilibre de liaison peuvent être eux-mêmes en LD.
Des outils comme Haploview permettent d’obtenir une représentation graphique
de ces notions de bloc de LD en proposant un code couleur informatif (Figure
17).
50
Figure 17 Schéma des blocs en déséquilibre de liaison dans le gène CYP19A1.
Données issues des populations CEU du site HapMap (http://www.hapmap.org). Les triangles noirs
représentent les blocs en LD. Les points sont créés en utilisant Haploview et le code couleur des
points est le suivant : blanc=(|D’|<1, LOD<2), rose/rouge ombré=(|D’|<1, LOD#2), bleu=(|D’|=1,
LOD<2), rouge vif=(|D’|=1, LOD#2).
Des SNPs marqueurs (ou tag SNPs), au sein d'un haplotype ou d’un bloc en
LD, sont choisis pour constituer un identificateur de cet haplotype.
Cette sélection peut être menée grâce au logiciel Haploview132 (Figure 18) mais
d’autres outils existent comme le serveur web « Tagger » du Broad Institue
ou
le
Genome
(http://www.broadinstitute.org/mpg/tagger/server.html133)
variation server (http://gvs.gs.washington.edu/GVS134/index.jsp)
Figure 18 Représentation de SNPs taggants (indiqués au dessus des colonnes de SNP par un
triangle gris plein) à partir du logiciel Haploview.
Les mêmes données que la figure 17 ont été, ici , utilisées. Les nombres en gris représentent la
er
fréquence de l’haplotype considéré (lecture en ligne). Dans le 1 bloc, 6 SNPs sont taggant (#1, #3,
e
e
#4, #6, #7 et #9), 2 dans le 2 bloc (#11 et #12) et 4 dans le 3 bloc (#16, #17, #18 et #20).
Il existe des tests d’association basés sur des études familiales qui proposent
d’explorer dans le même temps la liaison génétique comme le test du
51
déséquilibre de transmission (TDT pour transmission disequilibrium test)134 en
choisissant des témoins au sein des familles des cas. Ce test est réalisé dans
des triades de deux parents et d’un enfant. La distribution des allèles transmis
par des parents hétérozygotes (en effet les parents homozygotes ne sont pas
considérés car cela représente une situation non informative) aux descendants
atteints est comparée avec la distribution attendue des allèles parmi les
descendants. Il a ainsi été possible d’explorer l’association entre la ND et
plusieurs centaines de gènes d’intérêt135,136.
Le test du déséquilibre de transmission entre germains (S-TDT pour Sib
transmission disequilibrium test)137 utilise l’information provenant d’un seul
enfant malade et d’un enfant sain avec des génotypes différents dans un
ensemble de familles non-apparentées.
Nous proposons de présenter les études d’association génétique réalisées
dans le champ des complications du diabète en fonction des voies
métaboliques explorées. Nous allons dans un premier temps écrire les travaux
menés dans les voies liées à la glucotoxicité ainsi qu’aux voies impliquant la
glycorégulation. Dans un second temps, nous regarderons les voies
métaboliques impliquées dans les pathologies cardiovasculaires et la régulation
de la pression artérielle.
A.
Gènes candidats de la glucotoxicité
La glucotoxicité liée à l’hyperglycémie chronique exerce son effet toxique par
différentes voies (Figure 19) :
- la voie des polyols,
- la voie des héxosamines,
- le stress oxydatif et la production de produits avancés de la glycation,
- la voie de la protéine kinase C.
Chacune de ces voies métaboliques ont été également largement ciblées par
des études d’association.
Figure 19 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de l’hyperglycémie (source Brownlee M
Nature 2001)
52
Variants génétiques de la voie de la poly (ADP-ribose) polymérase
L’hyperglycémie entraîne une augmentation de la production d’espèces
oxygénées réactives qui, à leur tour, activent la poly (ADP-ribose) polymérase
(PARP). Le schéma de la Figure 20, emprunté à Brown et al., décrit un
mécanisme unifié de lésions cellulaires induites par l’hyperglycémie pour lequel
PARP joue un rôle central. Pour autant, les variants génétiques du gène PARP
semblent avoir été assez peu investigués jusqu’à maintenant sauf dans une
population de sujets DT1 russes, dans laquelle a été mise en évidence
l’association avec les polynévrites138.
Figure 20 Voies métaboliques impliquées dans la toxicité de l’hyperglycémie au travers de
l’augmentation de PARP (source Brownlee M Diabetes 2005)
La gluco-toxicité est également responsable de production d’espèces
oxygénées réactives ou ROS (pour Reactive Oxygen Species) dont la famille
des superoxides dismutases (SOD) assure la détoxification. Il a été mis en
évidence l’implication de certains variants de SOD1 qui code pour la SOD
mitochondriale et la survenue de ND dans le DT1139 et dans le DT2140-142.
Le gène SOD2, qui code pour la SOD cytoplasmique, a été associé, pour
certains de ces variants, avec la ND dont le V16A143 et le C47T144 mais
également pour ce qui est de la RD et le V16A145,146.
Variants génétiques de la voie des polyols
En présence d'une hyperglycémie chronique, le glucose intra cellulaire est
réduit en sorbitol sous l’action de l’aldose réductase en présence de NADPH.
La sorbitol-déshydrogénase (SDH) catalyse ensuite la transformation du
sorbitol en fructose en réduisant NAD+ en NADH (Figure 21).
53
DETERMINANTS GENETIQUES DES
ES COMPLICATIONS DU DIABETE
Figure 21 Voie des polyols (source
ce Brownlee M Nature 2001)
Les polyols provoquent :
• des dégâts osmotiqu
ques,
• une diminution de l’activité
l’a
Na+/K+ ATPase,
• une augmentation du rapport cytosolique NADH/NAD+ qui a
aboutit à une
activation de PKC,
• une diminution de la
l concentration de NAD+ qui est con
onsommé par
PARP activé ce quii e
entraine in fine une majoration du stresss o
oxydant.
L’Aldose réductase, l’enzym
yme clé de la voie est codée par le gè
ène AKR1B1
(également nommé ADR,, ALDR1, ALR2, AR) localisé en 7q35.
5. Ce dernier
présente des variants d’inté
térêt dans la région promotrice 5’ (microsa
satellite (CA)n
et -106(C/T)) mais égaleme
ent des variants intra géniques.
Certaines données de la litttérature font état d’une association entre
e des variants
147-149
de AKR1B1 et la rétinopath
thie diabétique dans le DT1
et le DT
T2150-154 et la
neuropathie155.
Pour ce qui concerne la ND
D, des données contradictoires ont été pu
publiées124,156158
. Néanmoins l’ensemble
le de ces données d’association montre l’intérêt
l
et le
potentiel thérapeutique théo
éorique de molécules ciblant la voie des polyols.
po
Variants génétiques de la voie protéine Kinase C
La voie d’activation de la protéine
p
Kinase C (PKC), présenté en Figure
F
22, a
bénéficié d’exploration atten
tentive tant au niveau de la superfamille PKC
PK 159,160 que
pour ses voies d’aval iimpliquant eNOS (pour endothelial nitric oxide
synthase)161-175, le VEGF et le Transforming Growth Factor-Beta (TG
TGF-β)176-184.
54
Figure 22 Conséquences de l'activation de la Protéine Kinase C (PKC) induite par l'hyperglycémie
(source : Brownlee M Nature 2001)
Variants génétiques de la voie RAGE et produits de la glycation avancée
L’hyperglycémie chronique induit une glycation non enzymatique des protéines
de l’organisme et ces produits avancés de la glycation (ou AGE pour advanced
glycation end product) vont avoir des conséquences, représentées
schématiquement en Figure 23, en agissant sur :
les protéines intracellulaires en altérant leurs fonctions,
les protéines de la matrice extracellulaire en provoquant une altération
des interactions cellule-cellule et cellule-matrice,
• les protéines plasmatiques qui peuvent alors se lier au récepteur des
AGE (RAGE) et activer via les ROS (pour reactive oxygen species) et
NF-κB la production de facteurs de croissance et cytokines proinflammatoires.
La protéine RAGE est codée par le gène RAGE (également appelé AGER) qui
est situé en 6p21.3
•
•
55
Figure 23 Voie métabolique des produits avancés de la glycation (AGE) (source Brownlee M Nature
2001)
Encore une fois une littérature profuse, parfois contradictoire, a exploré dans
plusieurs groupes ethniques l’association entre de nombreux variants du RAGE
et
les
complications
rénales185-188,
rétiniennes174,189-193
ou
194,195
cardiovasculaires
du diabète.
Une récente méta-analyse n’a cependant pas confirmé l’association entre les 3
variants Gly82Ser, 1704G/T et 429T/C de RAGE et le risque de ND et de
RD196.
B.
Gènes candidats de la régulation de la pression
artérielle et des complications cardiovasculaires
Le présent travail n’a pas vocation à proposer une revue exhaustive des
travaux menés sur les déterminants génétiques des complications
cardiovasculaires du diabète. Néanmoins, nous approcherons ces gènescandidats grâce à deux exemples détaillés de systèmes impactant la survenue
de complications cardiovasculaires au travers de la régulation de la pression
artérielle que sont le système rénine-angiotensine et le système des peptides
natriurétiques. Nous avons fait le choix de ne pas détailler d’autres systèmes
impliqués comme celui du système nerveux sympathique, celui de la
dysfonction endothéliale, celui des médiateurs de l’inflammation mais
également celui des échangeurs/transporteurs/canaux ioniques ou celui des
messagers intracellulaires, pour ne citer que ceux-là.
56
Variants génétiques du système Rénine-Angiotensine
Le SRA joue un rôle clé dans la régulation de la pression artérielle et
l'homéostasie hydrosodée.
L'angiotensinogène (AGT), synthétisé principalement par le foie, est clivé par la
rénine (REN), produite par l’apparel juxta-glomérulaire en angiotensine I. Cette
dernière est à son tour clivée par l'enzyme de conversion de l’angiotensine
(ACE) pour former l'angiotensine II, la molécule majeure de l'effecteur RAS. Les
effets biologiques de l'angiotensine II sont médiés par des récepteurs de
surface cellulaire qui sont pharmacologiquement définis comme de type 1
(AT1R) et de type 2 (AT2R) qui ont une homologie de 30%. Ces récepteurs,
situés dans les tissus tels que les glandes surrénales, les reins, le cœur, le
cerveau et les muscles lisses vasculaires, appartiennent à la grande famille des
récepteurs couplés aux protéines G. Les composants majeurs du SRA sont
présentés dans la Figure 24.
Figure 24 Shéma des acteurs du du système rénine-angiotensine (d’apres KEGG [Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes] Kanehisa Laboratories web-database disponible sur
www.genome.jp/kegg/)
Les fonctions physiologiques de de l'angiotensine II (via les AT1R) ne se
limitent pour autant pas à la régulation pressive et hydrosodée puis qu’elle a
également un effet procoagulant/pro-inflammatoire, sur l’hypertrophie et la
fibrose et un effet cardiqueinotrope et chronotrope (Figure 25).
57
Figure 25 Effet du système Rénine-Angiotensine sur les différents organes cibles.
ACE : enzyme de convertion de l’angiotensine (angiotensin-converting enzyme);CNS : système
nerveux central (central nervous system); NO : nitric oxide; RAS : système rénine-angiotensine
(renin–angiotensin system); ROS : espèces réactives oxygénée (reactive oxygen species); SNS :
systeme nerveux sympathique (sympathetic nervous system) ; VSMC : cellule vacsculaire
musculaire lisse (vascular smooth muscle cells).
(Source McFarlan Am J Cardiol 2003)
Les gènes codants pour les principaux composants du SRA sont représentés
sur la Figure 26.
Figure 26 Localisation chromosomique des gènes des principaux acteurs du système RénineAngiotensine-Aldostérone : REN : rénine, RENBP : N-acylglucosamine 2-epimerase AGT :
angiotensinogène, AGTR1 : récepteur de type 1 à l’angiotensine II, AGTR2 : récepteur de type 2 à
l’angiotensine II, ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine, ACE2 : enzyme de conversion de
l’angiotensine de type II, CYP11B2 : aldostérone synthase, NR3C2 : récepteur des minéralocorticoïdes et de l’aldostérone (d’apres Ensembl release 69 (oct 2012) disponible sur
http://www.ensembl.org/)
58
Une littérature abondante a cherché à identifier l’impact des gènes des acteurs
du SRA et nous détaillerons ici, par choix, uniquement les résultats concernant
les trois principaux acteurs que sont ACE, AGT et AGT1R.
ACE
Pour l’ACE, le variant d’insertion/délétion situé dans l’intron16 (rs4344) a été
clairement associé dans le DT1 et le DT2 avec la ND, ce qu’a encore confirmé
une récente méta-analyse de plus de 26 000 sujets197. Ce variant a également
été associé avec le déclin du DFGe198,199 et l’apparition de l’IRCT200. Enfin, il a
été montré des interactions gène-gène entre le variant d’insertion/délétion
d’ACE et d’autres variants de gènes du système RAA198,201 ou des variants de
gènes de la voie de signalisation de l’insuline199.
AGT
La littérature est également abondante concernant le gène de
l’angiotensinogène pour lequel un variant plus que les autres a été exploré
(M235T ou rs699). Les résultats pour ce variant sont néanmoins contradictoires
puisque nombre de travaux dans le DT1 et le DT2 identifient une association
positive avec le risque de ND147,197,198,202-206 tandis que l’on peut souligner les
papiers négatifs en miroir201,207-214.
AGT1R
Pour le gène du récepteur de type 1 de l’angiotensine 2, un variant a retenu
l’attention de nombreux auteurs (A1166C ou rs5186). Il semble que ce SNP soit
associé dans le DT2 avec la néphropathie diabétique215-219 tandis que dans le
DT1 les résultats sont plus contrastés201,220.
Variants génétiques du système des peptides natriurétiques
Le système des peptides natriurétiques est composé de 3 ligands principaux :
ANP (pour Atrial Natriuretic Peptide), BNP (pour Brain Natriuretic Peptide) et
CNP (pour C-type Natriuretic Peptide). Les peptides natriurétiques ont une
structure commune annulaire de 17 acides aminés (AA). ANP et BNP sont
essentiellement produits par les cardiomyocytes tandis que le CNP est
principalement sécrété au niveau du système nerveux central et de
l’endothélium vasculaire.
Ces ligands agissent par couplage à 3 récepteurs membranaires NPRA, NPRB,
NPRC dont l’affinité pour les ligands est différentes : NPRA : ANP≥BNP>>CNP;
NPRB : CNP>>ANP≥BNP et NPRC : ANP≥CNP> BNP (Figure 27).
59
Figure 27 Représentation de l’affinité des ligands et des récepteurs du système des peptides
natriurétiques (source : Nakayama T Endocr J. 2005)
Leurs fonctions physiologiques (Figure 28) ne se limitent pourtant pas à la
régulation pressive puis qu’ils ont également un impact au niveau :
•
•
•
•
•
•
•
60
de l’endothélium vasculaire en augmentant sa perméabilité et sa
vasodilatation,
du cœur en inhibant l’hypertrophie des cardiomyocytes ainsi que le
remodelage et la fibrose cardiaque,
du rein en diminuant la réabsorption hydrosodée tubulaire, en
augmentant la filtration glomérulaire et en diminuant la production de
rénine par l’appareil juxta-glomérulaire,
des surrénales en inhibition de la production d’aldostérone,
du tissu adipeux en stimulant la lipolyse,
du système immunitaire en participant à sa modulation,
des chondrocytes et des ostéoblastes/clastes en favorisant la
croissance.
Figure 28 Représentation des effets du système des peptides natriurétiques (source: Potter LR
Endocr Rev 2006)
Le rôle des peptides natriurétiques et notamment de l’ANP a été mis en avant
dans la physiopathologie de l’HTA. Il a été montré chez des volontaires sains
que la perfusion d’AMP diminuait significativement la pression artérielle et
augmentait de manière marquée l’excrétion urinaire de sodium221. Dans des
modèles murins, il a été montré que des modèles d’inactivation des gènes
NPPA ou NPRA induisaient des hausses de pression d’environ 20 à 40 mmHg
et une sensibilité pressive au sel plus importante222,223. Des modèles
transgéniques murin avec une augmentation des concentrations circulant
d’ANP entraînaient une diminution des pressions artérielles dans les mêmes
proportions224.
NPRA et NPRB sont des récepteurs transmembranaires avec un domaine
intracellulaire d’environ 570 AA avec une activité guanilyl cyclase et une activité
tyrosine kinase. Ils ont 63%d’homologie entre eux.
Le NPRC présente un domaine raccourci (seulement 37 AA) et seulement 30%
d’analogie. Il a une action d’internalisation des NPs en favorisant leur
dégradation lysosomale. Il présente néanmoins une activité physiologique
intracellulaire par son couplage aux protéines G inhibitrices ce qui entraîne via
leur sous-unité α une inhibition de l’adenyl cyclase et via leurs sous-unités βγ
une activation de la Phospholipase C (PLC).
Le potentiel thérapeutique a été transformé pour 2 médicaments que sont
l’anaritide (CARPERITIDE®) qui est un analogue de l’ANP et le nesiritide
(NATRECOR®) qui est du BNP recombinant approuvé par la FDA dans
l’insuffisance cardiaque décompensée.
Les gènes des 3 ligands sont situés sur 2 chromosomes différents. NPPA et
NPPB, qui codent pour ANP et BNP respectivement, sont en 1p36.2 et NPPC,
qui code, pour CNP en 2q24 (Figure 29).
61
Les gènes des récepteurs sont situés à différents loci NPR1 en 1q21-22, NPR2
en 9p21-p12 et NPR3 en 5p14-p1. Les 2 premiers ont des structures très
proches avec un gène d’environ 16 kb et 22 exons. NPR3 ne contient que 8
exons.
Figure 29 Localisation des gènes du système des peptides natriurétiques (d’après Vassalle C Clin
Chem 2009)
Un certain nombre de variants génétiques du système ont été associés avec
des marqueurs de maladies cardiovasculaires ou métaboliques.
NPPA (ANP)
Plusieurs variants sont associés au risque de ND dans le DT1225,226, tandis
qu’un RFLP de l’intron 1 ne l’est pas227. Dans une population générale de
mexicains, 2 RFLP sont associés à l’albuminurie228.
L’allèle C du rs5065 semble protecteur vis-à-vis du risque coronarien chez des
patients Afro antillais DT2229.
Le polymorphisme TC2238 semble associé avec un risque augmenté d’AVC
ischémique dans des populations japonaises230,231 tandis que le variant G664A
ne semble pas conférer ce risque232.
Il a été montré qu’un variant situé dans le promoteur du NPPA (-A2843G) était
associé aux concentrations plasmatiques d’ANP d’une part, mais également à
l’hypertrophie ventriculaire gauche chez les patients hypertendus dans des
populations italiennes233 et chinoises234.
62
NPPB (BNP)
Le variant T381C du NPPB est associé avec la concentration de NT-proBNP
chez des DT1 sans être associé ni avec la ND ni avec la mortalité235. Ce variant
a également été associé avec la concentration de BNP et le risque de DT2 chez
des caucasiens236. Ce risque de survenue de diabète a été confirmé dans la
méta-analyse de 49 279 sujets réalisée par Choquet et al.237.
Trois variants ont été associés avec les concentrations plasmatiques d’ANP et
de BNP ainsi que la pression artérielle chez 17 773 patients caucasiens238 ce
qui a été confirmé pour la pression artérielle dans la cohorte DESIR (pour Data
from an Epidemiological Study on the Insulin Resistance Syndrome cohort)239.
Ces travaux n’ont cependant pas permis de conclure à un effet sur la survenue
de microalbuminurie ou la dégradation du DFGe.
NPR1
Les variants du gène NPRA ont été associés avec les concentrations
plasmatiques de BNP et l’HTA d’une part240, le risque d’IDM241 mais également
de remodelage ventriculaire myocardique chez les patients hypertendus233.
NPR2
Chez des japonais, le variant G2628A situé dans la région 3’ non traduite (ou
3’UTR pour 3’ untranslated region) est associé au risque d’HTA242. Des
données de Rahmutual et al. ont montré que le polymorphisme d’I/D de l’intron
18 n’était pas en faveur d’une association avec le risque d’HTA ou d’AVC243,244.
NPR3
Dans les DT1, il a été montré par Roussel et al. qu’un variant de l’exon 8 était
associé à la progression de la ND245.
L’allèle C du variant -55AC, situé dans le promoteur de NPR3, prédispose à des
concentrations plus basses d’ANP, des chiffres tensionnels plus élevés246,247.
Ce même allèle a également été associé à la prédisposition familiale d’HTA248
tandis que l’allèle A était associé au risque d’obésité abdominale249.
Dans le GWAS mené par Estrada et al., il a été montré un signal fort
d’association entre des variants proches du gène NPR3 (rs10472828) et la
mesure de la taille250.
Il a par ailleurs été montré par Lanfear et al. qu’un variant situé dans l’exon 2 du
NPR3 était associé à la fonction ventriculaire gauche et interférait sur la relation
entre concentrations de BNP circulant et pression télédiastolique qui traduisent
le niveau d’étirement myocardique251.
63
C.
Gènes
candidats
l’insulinorésistance
de
l’obésité
et
de
Variants génétiques des Voies des lipides et des apolipoprotéines
L’adiponectine est une cytokine produite par les adipocytes qui a des effets
d’insulino-sensibilisation et des effets anti-athérogènes. Il a été montré que ses
concentrations plasmatiques s’associaient inversement au risque de survenue
de DT2252. Les risques de mortalité toutes causes, de complications rénales et
de microangioanpathie diabétique sont plus importants chez les patients ayant
des concentrations plasmatiques plus élevés253,254.
Le gène de l’adiponectine (ADIPOQ) est situé en 3q27.
Des travaux menés dans la population de l’étude DIABHYCAR ont permis de
montrer que certains variants étaient associés d’une part aux concentrations
variables d’adiponectine plasmatique255 et, d’autre part, au risque de survenue
de néphropathie256.
Des données de l’étude d’association (cas témoins et TDT) paneuropéenne
EURAGEDIC, Danemark, Finlande et France, dont la population regroupe plus
de 2000 duos cas-témoin et plus de 500 trios DT1, ont mis en avant l’impact
d’un variant situé dans le promoteur de ADIPOQ sur la survenue de ND257.
D’autres travaux sont venus par la suite nuancer ces données en apportant des
résultats négatifs d’association pour les variants +45G15G(T/G),+276(G/T)258 et
94G/T259.
La fonction des peroxysomes est la β-oxydation des acides gras à longues
chaînes mais ils sont également impliqués dans le métabolisme du cholestérol
et des AA.
Les proliférateurs de peroxysomes ont une action via les Récepteur Activés par
les Proliférateurs de Peroxysomes (PPAR) dont il existe 3 classes (α, β/δ et γ).
Les ligands de PPARγ exercent un effet sur le métabolisme glucidique au
niveau des tissus cibles de l’insuline :
-
augmentation de l’expression du transporteur de glucose (GLUT) de
type 4,
au niveau du tissu adipeux : différentiation adipocytaire, augmentation
de l’adiponectine et diminution de la leptine,
au niveau hépatique : diminution de la néo-glucogenèse,
inhibition de l’angiogénèse induite par le VEGF.
Le variant de PPAR Pro12Ala a été associé avec une réduction du risque de
ND et notamment d’apparition d’albuminurie dans le DT2 dans des populations
caucasiennes (la méta-analyse de De Cosmo et al.260) mais pas dans des
populations indiennes. Les données sur le risque de RD vis à vis de ce
polymorphisme semblent contradictoires261,262.
Le variant Gly482Ser du gène PPARGC1 (peroxisome proliferator-activated
receptor-gamma coactivator-1) est associé dans des populations indiennes au
risque de ND263 et dans des populations caucasiennes.
La modulation de la voie PPARγ qui impacte la production d’AGE et le stress
oxydatif représente toujours un potentiel thérapeutique en particulier pour la RD
et malgré le retrait des thiazolidinediones264.
64
APOLIPOPROTEINE
L'apolipoprotéine E (ApoE) est une glycoprotéine de 299 AA qui appartient à la
famille des apolipoprotéines et joue un rôle central dans le métabolisme des
lipides. Présente dans les chylomicrons et les lipoprotéines de densité
intermédiaire et basse (IDL et LDL), elle en facilite l’endocytose.
Le gène APOE est situé en 19q13.2 dans un cluster avec les gènes des
apolipoprotéines C1, C2 et C4. Il comprend 3597 pb et 4 exons pour 3 introns.
Un polymorphisme de l’exon 4 définit trois variants communs dans le gène
APOE, ε2, ε3 et ε4 codant pour E2, E3 (forme commune) et E4. Ces isoformes
diffèrent par la substitution d'un seul acide aminé qui influe sur leurs structures
et leurs fonctions. Alors que ε3, la forme la plus commune, a une cystéine en
position 112 et une arginine en position 158, ε2 a une cystéine aux deux
positions et ε4 deux arginines.
ApoE4 est un facteur de risque important pour la maladie d'Alzheimer et un
facteur de risque modéré de la maladie coronarienne. D'autre part, la liaison
des récepteurs des lipoprotéines de ApoE2 est défectueux par rapport à celle
de ApoE3.
Les porteurs de l’ApoE4 ont des niveaux plasmatiques plus élevés de
cholestérol total et cholestérol LDL que les porteurs de ApoE2 ou ApoE3
homozygotes265.
Des données dans le DT2 ont montré des arguments pour un effet protecteur
de ε3266 et délétère de ε4267 sur le risque de ND (notamment vis-à-vis de
l’albuminurie mais également des lésions histologiques glomérulaires268) et de
neuropathie périphérique269. Une étude australienne est également en faveur
d’un risque majeur de surmortalité cardiovasculaire (+60% après ajustement
sur les facteurs de risque cardiovasculaire) chez les patients porteurs de la
forme ApoE4270. L’existence de données contradictoires271,272 rend cependant
difficile des conclusions définitives.
Une étude dans la RD ne mettait pas en évidence d’effet du génotype de
l’APOE dans des populations Africaine-américaine ou caucasienne aux USA273.
Dans le DT1, aucune association n’a été retrouvée dans les études impliquant
des caucasiens comme GENEDIAB (pour étude GEnetique de la NEphropathie
DIABétique)274 ou des études de la Steno Clinic275, la St. Petersburg State
Medical University276 ou la Joslin Clinic277 même si une étude plus récente
issue de cette dernière population rapporte une augmentation du risque de ND
pour l’allèle ε2278.
D’autres membres de cette voie métabolique ont également été associés avec
une néphropathie diabétique comme des variants de APOC3266,279 ou certains
SNP de LPL qui code pour la lipoprotéine lipase266,280.
Le signal de liaison identifié dans l’étude génome entier FIND entre ND (ACR
ou EUA) et la région 22q13.1131 n’a pas permis, dans des études d’association,
de confirmer l’importance des variants du gène APOL1 sur le risque de ND ou
d’IRCT chez des afro-américains DT2281,282.
65
3.3.
Etudes d’association pangénomique (GWAS pour
genome wide association studies)
L’étude systématique à travers tout le génome des associations entre des
polymorphismes communs et des pathologies complexes est le concept sousjacent aux études d’association pan-génomique (ou GWAS pour Genome wide
Associaton studies). Ces études ont été rendues posibles grâce aux avancées
technologiques en matière de génotypage.
Le catalogue des études d’association génome entier (Figure 30) est disponible
et mis à jour sur le site http://www.genome.gov/gwastudies283.
Figure 30 Cartographie des loci associés à des maladies humaines identifiées au cours d’études
pangénomiques (GWAS). Chaque couleur de point représente une pathologie pour lequel un ou
des loci ont été cartographiés grâce aux données publiées de GWAS d’après NCBI.
A ce jour, 6 études GWAS ont été rapportées pour la ND281,284,285 et 3 pour la
RD286-288. Les meilleurs signaux de ces études sont présentés dans le
Tableau 5.
66
Tableau 5 Top Hit SNPs identifiés dans les GWAS pour la néphropathie diabétique (d’après NHGRI GWAS Catalog)
ND, néphopathie diabétique, IRCT, Insuffisance rénale chronique terminale.
SNP ID
Gene
Région
chromosomique
Trait
285
ELMO1
7p14.2
ND
Maeda
rs2648875
PVT1
8q24.21
IRCT
Hanson
null
NR
NR
ND
Pezzolesi
null
NR
NR
IRCT
Craig
rs2358944
MSRB3,
HMGA2
12q14.3
ND
rs2106294
LIMK2
22q12.2
ND
AUH
9q22.31
ND
rs6930576
SASH1
6q24.3
ND
rs7769051
RPS12
6q23.2
ND
289
284
McDonough
281
null(NR)
NR
NR
IRCT
Freedman
OR/Beta
[95% CI]
p-Value
platforme
témoins]
94 cas, 94 témoins
/NR
rs741301-?[NR]
2,67[[1,71-4,16]]
8x10-6
NR
[~80,000]
105 cas, 102 témoins
/NR
rs2648875-A[0,53]
2,97[[1,90-4,65]]
2x10-6
Affymetrix
[115,352]
820
cases,
controls/1,304
individuals
NR[NR]
NR[NR]
null
Affymetrix
[359,193]
NR[NR]
NR[NR]
null
Illumina
[474,050]
(pooled)
rs2358944-G[0,77]
1,33[[1,18-1,49]]
4x10-6
rs2106294-T[0,94]
1,75[[1,39-2,22]]
4x10-6
rs773506-G[0,77]
1,32[[1,18-1,49]]
6x10-6
rs6930576-A[0,28]
1,31[[1,18-1,45]]
7x10-7
rs7769051-A[0,29]
1,28[[1,16-1,42]]
2x10-6
NR[NR]
NR[NR]
null
885
547 cas caucasiens,
549
témoins
caucasiens/NR
290
282
Allèle
à
risque
[Prevalence chez les
965 cas africainsamericains,
1,029
témoins
africainsamericains /709 cas
africains-americains,
690
témoins
africains-americains
952 cas africainsamericains,
988
témoins
africainsamericains /640 cas
africains-americains,
683
témoins
africains-americains
Affymetrix
[832,357]
Affymetrix
[832,357]
67
rs741301
rs773506
Taille d’échantillon
(Initial/Repliqué)
Auteur
SNP ID
Gene
Région
chromosomique
rs476141
rs10927101
rs6702784
rs1970671
rs11765845
rs3007729
rs2115386
rs4787008
rs10403021
rs2696835
rs10910200
rs9866141
rs13064954
rs11867934
rs1073203
rs17404956
rs7772697
rs10199521
rs1342038
AKT3, ZNF238
AKT3, ZNF238
OSCP1, LSCM10, MRPS15
CCDC68, TCF4
CREB5, tcag7.873, LOC401317
IGSF21, KLHDC7A
INSR,LOC100131165, LOC100128567
RBFOX1,LOC100131413,LOC100131080
VSTM2B
IRF8, LOC732275
KIAA1804, KCNK1
KRT18P34, VEPH1
LEKR1, CCNL1
LOC100128283, TNFRSF13B, MPRIP
LOC100130551, GRAMD3
LOC441114, ODZ2
LOC729200, MAP3K7IP2
MYT1L, LOC7029897
TNFSF4, LOC730070
1q44
1q44
1p34.3
18q21.2
7p15.1
1p36.13
19p13.2
16p13.3
19q12
16q24.1
1q42.2
3q25.31
3q25.31
17p11.2
5q23.2
5q34
6q25.1
2p25.3
1q25.1
null(NR)
NR
NR
rs12219125
rs2038823
rs2811893
rs4462262
rs4470583
rs1571942
rs4838605
rs17376456
Intergenic
HS6ST3
MYSM1
Intergenic
Intergenic
PLXDC2
ARHGAP22
Intergenic
10p12.31
13q32.1
1p32.1
10q21.1
4q32.2
10p12.31
10q11.22
5q15
Auteur
Grassi
286
Fu
288
Huang
287
Taille
d’échantillon
(Initial/Repliqué)
973 cas europeéns,
1,856
témoins
européens /NR
Allele à risque
[Prevalence chez les
témoins]
rs476141-A[0,51]
rs10927101-A[0,38]
rs6702784-C[0,07]
rs1970671-G[0,29]
rs11765845-A[0,29]
rs3007729-T[0,65]
rs2115386-C[0,55]
rs4787008-G[0,17]
rs10403021-C[0,66]
rs2696835-C[0,03]
rs10910200-G[0,25]
rs9866141-T[0,04]
rs13064954-G[0,04]
rs11867934-C[0,79]
rs1073203-G[0,13]
rs17404956-A[0,9]
rs7772697-T[0,58]
rs10199521-T[0,22]
rs1342038-G[0,64]
286 diabetiques mexicains
NR[NR]
americans /NR
174 chinois Han DT2
avec RD, 575 chinois
Han DT2 sans RD, 100
témoins chinois Han
/NR
rs12219125-T[NR]
rs2038823-C[NR]
rs2811893-T[NR]
rs4462262-C[NR]
rs4470583-A[NR]
rs1571942-C[NR]
rs4838605-C[NR]
rs17376456-A[NR]
OR/Beta
[95% CI]
p-Value
1,37[[NR]]
1,33[[NR]]
1,08[[NR]]
1,37[[NR]]
1,02[[NR]]
1,35[[NR]]
1,12[[NR]]
1,47[[NR]]
1,01[[NR]]
2,27[[NR]]
1,35[[NR]]
1,02[[NR]]
1,02[[NR]]
1,43[[NR]]
1,54[[NR]]
1,16[[NR]]
1,35[[NR]]
1,46[[NR]]
1,49[[NR]]
1x10
-6
2x10
-6
4x10
-6
3x10
-6
7x10
-6
5x10
-6
3x10
-7
6x10
-6
2x10
-6
3x10
-6
6x10
-7
9x10
-7
7x10
-6
7x10
-6
9x10
-6
1x10
-6
3x10
-6
3x10
-6
4x10
NR[NR]
-
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
NR[NR]
9x10
-11
5x10
-7
3x10
-8
9x10
-7
4x10
-7
3x10
-9
2x10
-15
3x10
platforme
-7
Affymetrix
& Illumina
[2 543 887]
(imputé)
Affymetrix
-9
[421 010]
(imputé)
Illumina
[~550 000]
68
Tableau 6 Top Hit SNPs identifiés dans les GWAS pour la rétinopathie diabétique (d’après NHGRI GWAS Catalog)
4.
Interaction
gène-environnement
et
épistasie
L’interaction entre le génotype et l’environnement (GxE) d’un sujet peut
conduire à moduler le phénotype. Il a été mis en évidence par certains auteurs
que des variants de la région 9p21 pouvaient moduler le niveau de risque de
complications cardiovasculaires en fonction du niveau de contrôle
glycémique291 ou du type de régime alimentaire292. D’autres types d’interaction
ont été mis en évidence dans des populations non diabétiques. Le variant
Pro12Ala de PPAR modulait l’amélioration de la glycémie en fonction d’un
programme d’entraînement chez les patients nord-américains293. Il a également
été montré que ce variant interagissait sur la relation entre l’indice de masse
corporelle et le niveau d’insulino-sécrétion294. Le polymorphisme d’insertion
délétion de l’ACE a également été associé avec une modulation du niveau
d’insulino-sécrétion chez les patients âgés en fonction de leur poids de
naissance, ce qui est un reflet de l’exposition à l’environnement intra-utérin295.
La prise en compte de ces interactions GxE devrait donc permettre d’améliorer
notre compréhension de l’héritabilité des complications du DT2, même si
certains auteurs pensent que la contribution de ces interactions GxE ou gènegène (GxG ou effet épistatique) sera faible296.
5.
Randomisation mendélienne
La randomisation mendélienne (RM) est une méthode utilisée en épidémiologie
pour évaluer grâce à un variant génétique (variable instrumentale Z) le lien de
causalité entre une variable d’exposition (exposure X) et la survenue d’un
événement clinique (outcome Y). L’idée qui sous-tend la RM est que si un
facteur de risque (représenté, par exemple, par le niveau d’un biomarqueur X)
est responsable d’une maladie (Y), alors un variant génétique (Z), qui serait
associé au facteur de risque, devrait être associé dans une relation similaire
avec la maladie297.
L’utilisation d’un variant génétique comme variable instrumentale pour évaluer
la causalité est directement liée à la 2e loi de Mendel (ou loi de disjonction des
allèles ou loi d’indépendance) qui prédit que les gènes sont distribués dans les
gamètes au moment de la méiose de manière indépendante (aléatoire) les uns
des autres. Cette 2e loi de Mendel est certes mise en défaut pour des loci en LD
mais, compte tenu de la taille très importante du génome, la loi est convenable
pour l’approche épidémiologique298,299.
Dans une population, le génotype n’est a priori pas lié à un facteur de confusion
environnemental.
69
Un parallèle a été fait par Davey Smith et al.300 entre RM et essai clinique
interventionnel sur leur capacité à tester la causalité d’un facteur sur la
survenue d’une maladie ou d’une complication (Figure 31).
Figure 31 Comparaison du design des essais cliniques randomisés et de la randomisation
mendélienne (source : Davey Smith G BMJ 2005)
La représentation classique pour la RM des relations entre les facteurs et la
maladie utilise des graphiques dirigés dits acycliques (ou DAG pour directed
acyclic graph) (Figure 32). Une boîte représente une variable et la flèche un
effet causal direct. Chaque cause précède un effet et les représentations en
boucle/cycle ne sont pas autorisées.
Figure 32 Structure d’une étude par randomisation mendélienne (d’après Bochud M Int. J. Environ.
Res. Public Health 2012)
Il existe plusieurs conditions que doit remplir un variant génétique pour être
utilisé comme variable instrumentale dans la RM299,301 :
1) Le variant génétique Z doit être associé au facteur de risque X,
70
2) Le variant génétique Z doit être indépendant de facteurs de confusion U
qui pourraient expliquer l’association entre le facteur de risque X et la
maladie Y,
3) Le variant génétique Z est indépendant de la maladie Y et n’a pas d’effet
direct sur celle-ci mais par l’intermédiaire du facteur de risque
d’exposition X.
Par ailleurs, l’approche de randomisation mendélienne présente également des
limitations qui sont communes aux études d’association génétique302. La
première difficulté pour la RM est d’identifier un variant génétique utilisable pour
cette approche. La stratification de populations, qui met en présence différents
sous-groupes dans lesquels la prévalence de la maladie est différente ainsi que
les fréquences des allèles d’intérêt, représente un des biais à anticiper.
La présence d’un LD du variant génétique d’intérêt avec un second variant qui
lui-même est en association avec la maladie représente une autre mutation.
La pléiotropie d’un gène qui est associé avec plusieurs phénotypes ou qui code
pour plusieurs protéines (à cause d’épissages alternatifs), peut être également
un facteur de confusion. Toutefois, il a été proposé pour dépasser ces
limitations d’utiliser à la fois plusieurs variables instrumentales génétiques ou la
combinaison de celles-ci.
La randomisation mendélienne a été appliquée à la recherche de facteurs
impliqués dans l’étiologie du DT2. Des données plaident pour un rôle causal du
BNP303, du MIF304 de la Sex Hormone Binding Globulin (SHBG)305,306 et de la
bilirubine307 ce qui n’a pas pu être mis en évidence pour d’autre marqueurs
comme les triglycérides308, l’acide urique309 ou le Beta Carotène310 entre autres.
Pour l’AVC, Casas et al. ont montré la causalité de la concentration
d’homocystéine en utilisant un variant du gène MTHFR (qui code pour la
méthylène-tétrahydrofolate réductase)311 même si les essais cliniques
randomisés avec des stratégies de réduction de l’homocystéine n’ont pas été
considérés comme concluants312.
Pour l’IDM ou la maladie coronarienne, les études de RM n’ont mis en évidence
de valeur causale ni pour des marqueurs métaboliques comme le BMI313 ni
pour des marqueurs de l’inflammation comme le fibrinogène314,315 ou la
CRP298,316,317. Le lien entre bilirubine et IDM a été attentivement regardé mais
malgré de nombreux résultats parfois contradictoires, la méta-analyse de
Stender et al. n’a pas permis d’identifier de lien causal307 entre IDM et allèles
impactant la bilirubine.
71
6.
Epigénétique
L’épigénétique est un système de régulation de l’expression des gènes qui agit
sans en affecter leur séquence. Il comprend des modifications posttranscriptionnelles et post-traductionnelles du nucléosome par 3 mécanismes
principaux (Figure 33) :
•
•
•
la méthylation de l’ADN,
les modifications post-transcriptionnelles des histones,
les ARN non codants.
Figure 33 Représentation des mécanismes épigénétiques de régulation de la transcription
(Source : Reddy MA Cardiovasc Res 2010)
Méthylation de l’ADN
Des îlots de dinucléotides (CpG) tout au long du DNA sont positionnés au
niveau du promoteur et/ou du premier exon de plus de 60% des gènes
humains.
La méthylation est catalysée par des ADN méthyl-transférases (DNMT pour
DNA méthyl-transférase) et entraîne le transfert d’un groupement méthyle sur la
cytosine précédant la guanine.
72
La plupart des îlots CpG du génome sont méthylés par défaut tandis que les
CpG des îlots des régions promotrices sont déméthylés. La méthylation des
CpG est généralement corrélée avec une répression transcriptionnelle des
promoteurs.
Une étude menée sur des cellules d’îlots de pancréas d’origine humaine a
montré qu’une hyperméthylation du gène PPARGC1A (pour peroxisome
proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha) avait pour
conséquence de diminuer la production d’insuline318.
Le profil de méthylation de l’ADN a été exploré dans des modèles cellulaires
humains de ND (cellule mésangiale et tubulaire proximale soumis à stimulation
par des périodes d’hyperglycémie ou mis en présence de TGFβ-1). Environ
20% des gènes explorés présentaient une méthylation différentielle319.
Un GWAS récent320 a permis d’identifier chez des DT1, 19 sites CpG associés
au risque de ND dont notamment un site hyperméthylé situé dans la région
régulatrice de UNC13B déjà mis en évidence dans des études d’association160.
Sapienza et al. ont regardé le profil de méthylation de plus de 27 000 sites CpG
(>14 000 gènes) dans une étude cas contrôle sur l’IRCT chez des patients
diabétiques. Ils ont montré que 10% des sites avaient une méthylation
différentielle. Des signaux concernant des gènes déjà identifiés au cours
d’étude de liaison ou d’association ont été retrouvés comme des gènes
impliqués dans la matrice extracellulaire (MMP10) ou le métabolisme de
l’homocystéine (MTHFR)321.
Dans un modèle d’exposition in utero à des hyperglycémies modérées (fœtus
de mère présentant un DT1), il a été montré l’existence d’altérations du profil de
méthylation pangénomique (dont une hypométhylation du gène de la DNMT1)
qui s’associaient à des anomalies de fonction rénale, à l’âge adulte, chez les
descendants de mères diabétiques322.
Modifications post-transcriptionnelles des histones
Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine et rassemble environ
200 pb d’ADN enroulées autour de huit protéines histones (deux exemplaires
de chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4) accompagnées de l’histone H1.
Il existe par ailleurs plusieurs formes protéiques des histones qui présentent
des homologies de séquence variable et sont codées par différents gènes. Ces
variants d’histone sont appelés « histones majeures » selon qu’ils interviennent
pendant la phase S pour répondre aux besoins massifs d’histones de la
réplication ou « histone de remplacement » lorsqu’ils interviennent en dehors de
la phase S (action en dehors de la période de synthèse de l’ADN).
Des enzymes viennent moduler l’action du nucléosome :
• Histone acétyltransférase (HAT) qui a une action d’acétylation sur des
lysines provoquant une ouverture de la chromatine et une activation de la
transcription des gènes,
73
• Histone dé-acétylase (HDAC) qui a une action de dé-acétylation des
lysines et une répression de la transcription des gènes,
• Protéine arginine transférase (PRMT) qui a une action de
mono/diméthylation de résidu arginine et une activation de la transcription
des gènes,
• Histone méthyltransférase (HMT) qui a une action de méthylation sur des
lysines spécifiques mais également sur les arginines ou certaines familles
de protéines à domaine SET (pour Su(var)3-9, Enhancer of Zeste,
Trithorax).
Cette méthylation présente un impact fonctionnel direct : l’histone 3
méthylée sur la lysine 4 (H3K4me) entraîne une configuration active de la
chromatine (euchromatine) et une activation des gènes, tandis que,
lorsqu’elle est méthylée sur la lysine 9 ou 27 (H4K9me, H4K27me) elle
entraîne aussi une configuration inactive de la chromatine
(hétérochromatine) et une répression des gènes.
• Histone déméthylase comme la Lysine specific demethylase (ou LSD ou
KDM) a une action de déméthylation sur la lysine 4 de l’histone H3 mais
également sur la peptidyl-arginine deiminase 4 (PADI4) et les proteines Fbox protein 10 et 11 (FBXL10/11).
D’autres mécanismes peuvent également participer aux modifications post
transcriptionnelles des histones comme la phosphorylation (sur des sérines ou
thréonines par des kinases) l’ubiquitination (fixation d'une ou de plusieurs
protéines d'ubiquitine), l’ADP ribosylation (transfert d’un groupement ADPribose par la poly-ADP-ribose polymérase) ou la sumoylation (liaison covalente
avec une ou plusieurs protéines de la famille SUMO).
Ces modifications ont un impact sur l’accessibilité de la machinerie
transcriptionnelle à l’ADN. Il a été montré que l’hyperglycémie provoquait dans
les cellules endothéliales de l’aorte de souris une monométhylation de H3K4
dans la région promotrice d’une sous-unité de NF-κB323.
Les HDAC et particulièrement les sous-familles de classe I et II ont été
impliquées dans la genèse de l’hypertrophie musculaire cardiaque324,325.
Une étude sur le génome entier menée sur des cellules mononuclées du sang
périphérique soumises à des conditions hyperglycémiques a montré des
variations des profils de méthylation de H3K4me2 et H3K9me2326.
La notion de « mémoire métabolique » est issue des résultats du suivi long
terme des essais cliniques DCCT-EDIC327-329 et UKPDS (ou metabolic memory
DCCT-EDIC ou legacy effect UKPDS) où les effets bénéfiques vasculaires long
terme persistaient au delà des périodes de bon contrôle glycémique. Certaines
données sont venues conforter l'hypothèse selon laquelle des modifications
épigénétiques et notamment post-transcriptionnelles des histones pourraient
jouer le rôle de support pour cette mémoire hyperglycémique ou
métabolique330.
En effet, dans des modèles murin de DT1 induit par la streptozotocine (STZ)331
mais également dans des modèles cellulaires323,332, il a été mis en évidence
que l’activation de voies de l’inflammation et du stress oxydant persistait après
le retour à l’euglycémie.
74
Les ARN non codants
Le transcriptome est composé d’ARN codants mais également d’ARN non
codants qui peuvent interférer avec la traduction de l’ARN messager ainsi que
le contrôle de l’épissage ou l’inactivation spécifique de certains gènes. On
définit ces ARN non codants en fonction de leur taille. Les longs ARN non
codants ont une taille de plus de 200 nucléotides et leur rôle ainsi que leur
localisation sont partiellement connus. Les micro ARN (ou miRNA), mieux
connus, sont des ARN non codants constitués d’environ 20 nucléotides qui
ciblent les régions 3’UTR de certains ARNm dans le but de les dégrader ou
d’en inhiber la traduction333.
De nombreux miRNA ont été associés à la régulation de gènes de voies
métaboliques impliquées dans les complications du diabète333.
Ainsi, dans des modèles murins de ND (modèle DT1 de type STZ et modèle
DT2 de type db/db), le TGF-β1 augmente l’expression de miR-192 et miR-216a
dans les cellules mésangiales184. Le miR-192 réprime la transcription de ZEB2
qui est lui même un répresseur transcriptionnel du gène du collagène col1a2.
Le miR-216a, quant à lui, réprime YB-1 qui augmente l’expression de col1a2
d’une part et l’expression de TGF-β1 par les cellules tubulaires proximales
d’autre part, créant une boucle favorable à la fibrogénèse. Il a été montré
également l’implication de mir-21 qui cible PTEN334 et miR-377 qui cible
MnSOD335.
Concernant la cardiopathie diabétique, dans un contexte d‘hyperglycémie la
régulation de miR-1/miR-206 sur le gène Pim-1 entraîne une hypertrophie des
cardiomyocites dans un modele de souris STZ336 tandis que celle de miR-133
sur les gènes SRF et ERG entraîne des troubles de la conductivité cardiaque
dans un modèle de lapin337.
Le VEGF est impliqué dans les complications microvasculaires du diabète et,
en particulier, la RD où il est augmenté338. L’hyperglycémie réduit, chez la
souris, l’expression de miR-93 qui cible VEGF-A, ce qui a pour impact
d’augmenter l’expression de VEGF-A339 qui est également la cible de miR200340.
Les effecteurs des mécanismes épigénétiques sont autant de cibles
thérapeutiques potentielles. Les HDAC et les DNMT peuvent être ciblés par des
inhibiteurs (HDACi et DNMTi ou DNi). A ce jour plusieurs molécules ont été
approuvées par les agences réglementaires essentiellement dans le champ du
cancer :
vorinostat (ZOLINZA®) est un HDACi utilisé dans la le lymphome T
cutané réfractaire,
• 5-azacytidine (VIDAZA®) and decitabine (DACGEN®) sont des DNMTi
utilisés dans les myélodysplasies.
D’autres représentants de ces familles sont actuellement en cours d’évaluation
comme le HDACi multicible panobinostat dans la leucémie myéloïde chronique,
le myélome multiple ou les myélodysplasies.
•
75
De manière intéressante, le gène du transporteur de glucose GLUT4 est régulé
par HDAC5 qui pourrait bénéficier à l’avenir d’une thérapeutique ciblée341.
Certaines données suggèrent également que les inhibiteurs sélectifs de HDAC3
pourraient être efficaces dans la prévention de l’apoptose des cellules bêta
induite par les cytokines342,343.
7. Conclusion
Comme nous venons de le décrire le champ des déterminants génétiques des
complications du DT2 a été largement investigué ces dernieres années. Une
méta-analyse publiée en 2011 a repris les données de plus de 670 études
d’association concernant la ND344. Parmi les 34 polymorphismes génétiques
décrits comme associés à la ND et répliqués dans au moins une étude
indépendante, 21 sont restés significativement associés dans un modèle à
effets aléatoires méta-analyse. Les OR conférés par les variants variaient de
0,48 à 1,70 (Figure 34).
Figure 34 Variants génétiques associés à la néphropathie diabétique (ND) et répliqués dans au
moins une étude indépendante : (a) Variants restant associés à la ND après méta-analyse (b)
Variants n’étant pas significativement associés à la ND après méta-analyse. (source : Mooyaart AL
Diabetologia 2011).
L’épidémiologie génétique couvre un champ d’investigation qui va des études
de liaison345 aux études d’association346,347 et passe désormais par les
approches épigénomiques348. Les succès, comme les échecs, des travaux
précédents ont permis d’établir des recommandations pour la méthodologie et
la conduite de telles études349-351.
76
Nous constatons cependant que malgré les efforts déployés par la communauté
scientifque, seule une part modeste de l’héritabilté des complications du DT2 a
pu etre identifiée jusqu’à maintenant.
Certaines situations peuvent, en effet, conduire à des résultats d’études
d’association faussement positifs ou faussement négatifs346,352.
Parmi les éléments limitants le succès des études d’association, l’insuffisance
de précision des phénotypes (des cas et/ou des contrôles) est un élément clé
qui peut moduler fortement la puissance de l’étude et donc son succès.
D’autres explications peuvent être trouvées dans le fait que, pour les maladies
complexes qui impliquent une multitude de variants, ceux qui ont un petit effet
sont difficiles à détecter identifier ce d’autant qui peuvent présenter des
fréquences alléliques plus rares (MAF< 1 à 5%).
L’existence d’interactions GxG (effet épistatique) et ou GxE peut également
masquer statistiquement d’authentiques associations en modulant l’expression
des génotypes dans différentes situations et peuvent être particulièrement
importantes pour l’apparition de phénotypes à effet seuil.
La stratification représente une situation dans laquelle plusieurs sous-groupes
d’une même population d’étude diffèrent à la fois par la fréquence des variants
alléliques et par la prévalence du phénotype. La stratification apparait donc
comme un bais qui limite le succès des études génétiques.
L’hétérogénéité génétique, qui traduit le fait que différents loci soient
responsables d’un même phénotype, mais également la pléiotropie d’un gène,
dont la protéine qu’il code a une action dans de multiples voies métaboliques,
peuvent induire des biais de confusion dans les analyses d’association. La
pénétrance, qui est le pourcentage d’individus présentant un trait intermédiaire
et exprimant le phénotype, et l’expressivité, qui est la gravité du phénotype,
sont des éléments qui peuvent dépendre fortement d’autre facteurs comme
l’âge du patient et peuvent conduire encore une fois à des conclusions
erronées.
Enfin la notion de taille d’échantillon est critique pour les études d’association
génétiques et tout particulièrement pour les études pangénomiques. La taille de
la population conditionne, en effet, la puissance statistique de détection des
associations génotype-phénotype et constitue l’une des clés de la réussite.
77
78
III.
OBJECTIFS DE LA
THESE
79
80
OBJECTIFS DE LA THESE
L’objectif de ce travail était de rechercher des déterminants, génétiques ou
environnementaux, liés aux complications du DT2 et plus spécifiquement à la
néphropathie diabétique et aux complications cardiovasculaires.
Au travers d’une approche basée sur des hypothèses physiopathologiques
établies a priori, nous avons mis en place une exploration de deux systèmes
métaboliques qui semblaient intervenir dans la survenue de complications du
diabète : le système des peptides natriurétiques et celui des stéroïdes sexuels.
Les outils utilisés ont été ceux de l’épidémiologie génétique.
Nous avons recherché, dans un premier temps, les associations entre
environnement (apports en sodium), phénotypes intermédiaire (pression
artérielle) et final (complications rénales ou cardiovasculaires) mais également
variants du gène NPR3 qui code pour le récepteur de clairance des peptides
natriurétiques.
Nous nous sommes ensuite intéressés, en nous positionnant dans une
deuxième voie métabolique d’intérêt, à l’interrelation entre la concentration de
stéroïdes sexuels, la morbi-mortalité cardiovasculaire et rénale et le
polymorphisme du gène CYP19A1 qui code pour l’aromatase.
La recherche de ces associations et interactions a été menée successivement
dans trois populations de patients diabétiques de type 2 indépendantes et
complémentaires : une étude transversale (DIAB2NEPHROGENE) combinée à
deux populations suivies prospectivement (cohorte initiale SURDIAGENE et
cohorte de réplication DIABHYCAR).
Ce travail a également cherché, dans le même temps, à structurer
qualitativement et quantitativement les bases de données liées aux études
D2NG et SDG.
81
82
MATERIELS ET METHODES
IV.
MATERIELS ET
METHODES
83
84
1. Patients et cohortes
Les populations de trois études (Figure 35) viennent se compléter et vont être
détaillées ci-après :
DIAB2NEPHROGENE est une enquête transversale nationale multicentrique de
2287 patients DT2 dont l’inclusion a été réalisée entre 2001 et 2012.
SURDIAGENE est une cohorte d’inception prospective monocentrique de 1467
patients DT2. Les patients on été inclus entre 2003 et 2012. Les patients sont
suivis prospectivement avec une date de mise à jour tous les 2 ans depuis
2007. Les patients de SURDIAGENE ont été inclus, avec leur accord, dans
DIAB2NEPHROGENE. Les données d’évaluation à l’entrée du suivi prospectif
(données « baseline ») correpondent donc, pour ces patients, à leurs données
issues de DIAB2NEPHROGENE.
DIABHYCAR est un essai clinique international qui a évalué l’effet de faible
dose d’IEC chez des sujets DT2. Les patients ont été inclus entre 1995 et 1998
et suivis pendant 3 ans. Seules les données des 3341 patients français ayant
donné leur accord pour l’exploitation de leurs données génétiques seront
présentées.
DIABHYCAR
n=3341
DIAB2NEPHROGENE
n=2287
SURDIAGENE
n=1467
1995
1997
1999
2001
2003
Mise à jour des évènements SURDIAGENE
2005
2007
2009
2011
2013
Figure 35 Représentation chronologique des populations de DIABHYCAR, DIAB2NEPHROGENE et
SURDIAGENE (en pointillé les données qui seront collecté lors de la prochaine mise à jour du
suivi)
85
1.1.
L’étude DIAB-2-NEPHROGENE
Design de l’étude
L’étude du polymorphisme génétique chez des
néphropathie diabétique (DIAB2NEPHROGENE
NEPHROpathie et GENEtique ou D2NG) est
multicentrique de type cas-témoins, de sujets DT2
d'atteinte rénale.
sujets DT2 avec ou sans
pour DIABète de type 2,
une enquête étiologique,
présentant différents stades
Cette étude épidémiologie transversale dont le promoteur est le CHU de
Poitiers a reçu le soutien financier de différents partenaires académiques :
Programme Hospitalier de Recherche Clinique (PHRC) interrégional,
Association Française des Diabétiques (AFD) (2003), Association de Langue
Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM)
(2009) et Association du Groupe d'Etude des Maladies Métaboliques et
Systémiques (GEMMS) Poitiers (2001-2012).
D2NG a démarré en décembre 2001 après l’accord du CCPPRB de la région
Poitou-Charentes.
Au total, les services hospitaliers de Diabétologie et Néphrologie de 15 hôpitaux
en France métropolitaine et à Tahiti ont participé au recrutement des patients
(liste en Annexe).
Sélection des Patients
Les éléments phénotypiques communs aux cas et aux témoins de D2NG sont
la présence d’un diabète de type 2 et la rétinopathie diabétique, phénotypes
définis comme suit :
• Définition du diabète de type 2 ([1a ou1b]et 2 et 3):
La distinction entre DT1 et DT2 est parfois délicate mais les critères de
diagnostic de DT2 sont les éléments suivants :
1a) âge au diagnostic ≥ à 40 ans ET insulino-requérance apparue plus de
2 ans après le diagnostic de diabète
1b) âge au diagnostic ≥ à 30 ans ET insulino-requérance apparue plus de
5 ans après le diagnostic de diabète
2) absence de diabète secondaire (pancréatopathie, hépatopathie...)
3) absence de cétonurie (supérieure ou égale à ++) au diagnostic
86
• Définition de la RD :
La présence d'une rétinopathie est appréciée par un examen ophtalmologique
(fond d’œil réalisé après dilatation pupillaire éventuellement associé à une
angiographie fluorescéinique). La rétinopathie sera classée en 4 classes
(absente, simple, pré-proliférative, proliférative). L'œdème maculaire, fréquent
dans le diabète de type 2, a été codé absent/présent.
Les critères de sélection des patients propres aux cas et aux témoins sont les
suivants :
Sujets CAS - atteints de ND ( a ou b) :
a) sujet présentant une glomérulopathie diabétique affirmée par la biopsie
rénale (même en l'absence de rétinopathie)
b) sujet présentant les 5 caractéristiques suivantes (1 et 2 et 3 et 4 et 5) :
1. DT2 connu depuis plus de 5 ans
2. EUA élevée ≥ 20mg/l ou 30 mg/24h, 2 fois sur 3 prélèvements
consécutifs, au cours des 5 dernières années
3. avec ou sans altération de la fonction rénale (définie par DFGe
< 60 ml/min ou un recours à une méthode de suppléance rénale
[épuration extra-rénale ou à une transplantation rénale]).
4. absence de maladie rénale autre que la néphropathie diabétique
5. rétinopathie diabétique quel qu'en soit le stade.
Sujets TEMOINS - indemnes de ND (a et b et c) :
a) normoalbuminurie
avec EUA normale (définie comme une
concentration d'albumine urinaire < 20 mg/l ou 30 mg/24h), 2 fois sur
3 prélèvements consécutifs, au cours des 5 dernières années sans
traitement par IEC/ARA2 (ou si ttraitement par IEC/ARA2, EUA
normale avant et apres la mise en route du traitement)
b) présentant l’un ou l’autre des critères suivants (1 ou 2)
1. rétinopathie diabétique quel qu'en soit le stade.
2. OU DT2 connu depuis plus de 20 ans.
c) fonction rénale conservée avec DFGe ≥ 60 ml/min
Population complémentaire :
Une population complémentaire de patients a été définie en utilisant des
critères moins étroits :
•
CAS COMPLEMENTAIRES (a et b et c)
a) EUA élevée ≥ 20mg/l ou 30 mg/24h, 2 fois sur 3 prélèvements
consécutifs, au cours des 5 dernières années
b) Absence de rétinopathie diabétique
c) DT2 connu depuis plus de 5 ans
87
•
TEMOINS COMPLEMENTAIRES (a et b et c)
a) NORMOALBUMINURIE avec EUA normale (définie comme une
concentration d'albumine urinaire < 20 mg/l ou 30 mg/24h), 2 fois sur
3 prélèvements consécutifs, au cours des 5 dernières années avec ou
sans traitement par IEC/ARA2
b) DT2 connu depuis plus de 15 ans.
c) DFGe > 45ml/min
Les patients ne devaient par ailleurs présenter aucun des critères de non
inclusion suivants :
- mineurs
- majeurs protégés par la loi
- privation des libertés
- état de mort cérébrale
- absence de consentement de participation écrit,
information
- femmes enceintes, parturientes ou qui allaitantes.
signé
après
Objectifs
L’objectif PRINCIPAL de l’étude DIAB2NEPHROGENE, grâce à son approche
transversale cas-témoins, était d’étudier les déterminants génétiques associés
aux complications rénales du diabète de type 2.
Les objectifs SECONDAIRES étaient :
1- d’étudier des phénotypes spécifiques de la néphropathie diabétique
(critères anatomo-pathologiques)
2- de compléter l’analyse cas témoin par une étude de suivi longitudinal
(projet SURDIAGENE)
Nombre de sujets nécessaires
Le calcul du nombre de sujets nécessaires a été réalisé en se basant sur la
répartition du polymorphisme I/D de l'ACE chez les sujets avec et sans ND.
Nous avons pris en compte un effet dominant de l'allèle D sur le risque de ND.
La répartition du polymorphisme I/D de l'ACE a été estimée à partir des
données de la littérature ; la prévalence de l'allèle D de 83% chez les patients
atteints de ND et de 79% chez les sujets indemnes de ND.
L’OR minimum à détecter était de 1,30 (+30%de risque pour les patients
porteurs de l’allèle D de développer une ND).
88
En utilisant un risque α de 5% (test bilatéral) et un risque β de 10%, le nombre
total de sujets à inclure au total est de 3600 majoré à 4000, soit 2000 cas et
2000 témoins.
Au total, 2887 patients DT2 ont été inclus dans D2NG, dont 1786 ont pu être
classés cas ou témoins pour ce qui concerne leur statut de ND. A partir de ces
effectifs, le risque relatif minimum détectable lié à un polymorphisme génétique
variait de 1,45 à 1,19 pour des MAF entre 5 et 45%.
1.2.
L’étude SURDIAGENE
L’Étude du Polymorphisme génétique chez des sujets diabétiques de type 2 et
l’analyse longitudinale de la fonction rénale (Etude SURDIAGENE pour SUivi
Rénal, DIAbète de type 2 et GENEtique ou SDG) est une étude de cohorte
prospective.
Le promoteur est le CHU de Poitiers et l’étude a également reçu le soutien
financier de différents partenaires académiques : PHRC interrégional, AFD
Recherche (2003) ALFEDIAM (2009) et Association GEMMS Poitiers (20012012).
SDG a démarré en décembre 2003 après l’accord du CCPPRB de la région
Poitou-Charentes.
Sélection des patients
Les sujets de l’étude SURDIAGENE présentent un diabète de type 2. La
distinction entre diabète de type 1 et diabète de type 2 est parfois délicate.
Nous retenons comme critère de diagnostic de diabète de type 2 les mêmes
éléments que pour D2NG. Par ailleurs, les patients incluables devait avoir un
suivi de leur diabète depuis au moins 1 an comprenant un recueil de données
cliniques (pression artérielle, poids) et biologiques (hémoglobine glyquée,
créatininémie, excrétion urinaire d’albumine) permettant d’analyser l’évolution
de la néphropathie (critère principal d’évaluation) et des autres complications
dégénératives (rétiniennes et cardiovasculaires : critère secondaire
d’évaluation).
Les patients ne devaient présenter aucun des critères de non inclusion
suivants :
•
•
absence de diabète ou présence d’un DT1 ou d’un diabète secondaire,
présence d’une néphropathie évoquant une atteinte rénale non diabétique
(l’hypertension artérielle n’est pas considérée comme un critère
89
•
•
•
•
•
•
•
•
d’exclusion sauf si la néphropathie hypertensive précédait la découverte
du diabète) :
- protéinurie au moment du diagnostic de diabète (la microalbuminurie,
fréquente, au diagnostic de diabète, n’est pas un argument pour une
atteinte rénale non liée au diabète)
- néphropathie glomérulaire non diabétique prouvée par biopsie rénale
- néphropathie vasculaire pure
- hématurie glomérulaire confirmée ou uropathie malformative
- néphrite interstitielle chronique dont antécédents de pyélonéphrite ou
d’infection urinaire persistante
suivi médical estimé inférieur àunan,
âge<18 ans,
âge >18 ans et protection par la loi,
privation des libertés,
état de mort cérébrale,
absence de consentement de participation écrit, signé après information,
grossesse en cours ou allaitement
absence d’affiliation à la Sécurité Sociale.
Objectifs
L’objectif de l’étude SURDIAGENE, grâce à son approche longitudinale de type
cohorte, est d’analyser l’influence de la génétique sur les complications
dégénératives du diabète de type 2.
L’objectif PRINCIPAL initial est d’étudier les déterminants génétiques associés
à la modification de la fonction rénale (modification de la clairance de la
créatinine et aggravation de la fonction rénale estimée par le passage d’un
stade de néphropathie à un stade de néphropathie de gravité supérieure).
Les objectifs SECONDAIRES sont :
1. d’étudier les déterminants génétiques associés à la modification de
l’excrétion urinaire d’albumine,
2. d’étudier les déterminants génétiques associés aux autres complications
dégénératives du diabète (rétinopathie, événement cardiovasculaire),
3. de compléter l’analyse cas témoin de l’étude DIAB2 NEPHRO-GENE.
Le critère de jugement de SDG pour évaluer la morbi-mortalité cardio-rénale est
un critère composite combinant :
•
•
•
•
•
décès de cause cardiovasculaire,
IDM non fatal,
AVC non fatal,
ICC nécessitant une hospitalisation,
épuration extra-rénale pour IRCT (hémodialyse, dialyse péritonéale ou
greffe rénale).
Ce critère a été choisi pour sa pertinence clinique et pour assuer la compatibilté
avec les données de l’étude DIABHYCAR353.
90
Les critères de jugement secondaires sont chacun des événements du critère
de jugement principal analysés séparément mais également les événements
suivants :
• décès toutes causes,
• procédure
de
revascularisation
artérielle
(coronarienne,
carotidienne ou artère des membres inférieurs,
• doublement tenu de la créatinine plasmatique (≥ 1mois) afin de
distinguer les épisodes d’insuffisance rénale aigue,
• amputation de membre inférieur au dessus de l’articulation métatarso-phalangienne.
Ces mêmes critères de jugement combinés ont déjà été explorés dans d’autres
études portant sur les complications du diabète (HOPE study354 et DIABHYCAR
study355).
Le décès est considéré comme d’origine cardiovasculaire s’il correspond à l’une
des situations suivantes :
IDM : survenue jusqu’à 7 jours après le début de la symptomatologie
initiale,
•
Mort subite,
•
AVC : survenue jusqu’à 7 jours après le début de la symptomatologie
initiale,
•
ICC sans argument clinique ou post mortem pour un événement
ischémique aigu,
•
arythmie cardiaque (bradyarythmie ou tachyarythmie),
•
rupture d’un anévrisme de l’aorte abdominale,
•
embolie pulmonaire,
•
survenue en période après intervention cardiaque ou vasculaire :
•
en post opératoire (dans les 30 jours) après chirurgie cardiaque;
•
en post interventionnelle dans les 7 jours après cathétérisation cardiaque,
ou angioplastie, ou stent ou toute autre méthode invasive coronaire ou
artérielle,
•
cause non connue avec certitude et sans argument pour une cause non
cardiovasculaire.
•
Un comité de validation a été mis en place pour organiser une revue critique
des informations médicales et des critères de sélection à l’entrée des patients
dans la cohorte. Ce comité est organisé en différents groupes de travail
considérant :
•
•
•
•
les caractéristiques du diabète,
la revue des données initiales sur la RD,
la revue des données initiales sur la ND,
la revue des données initiales sur l’atteinte cardiovasculaire.
Un comité d’adjudication indépendant des investigateurs de l’étude a été mis en
place pour la revue des événements de santé survenant pendant le suivi et
correspondant aux critères de jugement combinés de morbi-mortalité.
91
Le nombre n de sujets nécessaire par groupe est de n=M* σ2/ ∆2.
Dans la littérature, la variabilité (σ) de la modification du débit de filtration
glomérulaire sur une période de 9 ans est estimée à 27 ml/min/1,73 m2.
Pour un risque alpha de 5% et un risque bêta de 20%, en situation bilatérale, M
vaut 15,7.
Le calcul a été réalisé pour mettre en évidence une différence minimum (∆) de
0,8 ml/min/1,73 m²/an, entre les sujets de génotypes II ou de génotypes ID/DD,
en appliquant une hypothèse de dominance de l’allèle D, vérifiée dans des
études antérieures.
Il fallait donc considérer n=235 sujets par groupe. Le nombre total de sujets à
inclure était de 470. Initialement d’autres gènes d’intérêt avaient été ciblés et
afin de prendre en compte la recherche de l’effet de plusieurs gènes, le nombre
de sujets total devant être inclus était de 1500.
Au total 1467 patients DT2 ont été inclus dans SDG.
1.3.
L’étude DIABHYCAR
L’étude DIABHYCAR (non insulin-dependent DIABetes, HYpertension,
microalbuminuria or proteinuria, CArdiovascular events, and Ramipril) est une
étude randomisée, contrôlée contre placebo, en double aveugle et en groupes
parallèles prévue avec un suivi de 3 ans355.
L’étude DIABHYCAR (DBH) a démarré en 1995 après l’accord du CCPPRB n°1
de la région Pays de Loire.
Sélection des Patients
Les critères d’inclusion sont :
• DT2 défini par un traitement en cours avec au moins un antidiabétique
oral,
• l'âge ≥ 50 ans,
• albuminurie < 20 mg/l (dosage centralisé sur 2 prélevements),
• la créatinine sérique ≤ 150 µmol/l,
• le consentement éclairé signé et l'accord des patients afin de fournir aux
enquêteurs leur adresse actuelle et les adresses de deux proches
parents.
Les critères d'exclusion sont :
• traitement en cours par l'insuline, par un IEC ou par un ARA2,
92
• ICC documentée,
• IDM au cours des 3 derniers mois,
• infection des voies urinaires,
• intolérance antérieure à un IEC (toux, œdème de Quincke, ou autres
réactions allergiques),
• alcoolisme chronique ou toxicomanie et incapacité à comprendre les
méthodes et les objectifs de l'essai,
• espérance de vie limitée.
Objectifs
Le critère de jugement PRINCIPAL était un critère composite comprenant :
1. décès dû à une origine cardiovasculaire ou inconnue (y compris la mort
subite)
2. IDM
3. AVC
4. IRCT avec dialyse ou transplantation rénale.
Les critères de jugement SECONDAIRES étaient :
• Le décès toutes causes,
• une hospitalisation pour une angioplastie coronaire,
• une ICC,
• un accident ischémique transitoire,
• le doublement de la créatinine sérique
• la perte de fonction d'un œil,
• l'amputation au-dessus de l'articulation métatarso-phalangienne.
A partir des données de la littérature, il avait été estimé dans la population de
l’étude un taux de mortalité cardiovasculaire de 6-7% et une incidence de 20%
du critère de jugement combiné pendant les 3 ans de suivi. Pour un risque α de
5% (bilatéral) et une puissance de 90%, un recrutement de 2000 sujets était
nécessaire dans chacun des 2 groupes pour pouvoir détecter une réduction de
20% du risque d’évènements.
93
2. Phénotypages
2.1.
Données cliniques
Les variables cliniques sont les variables recueillies à l’entrée dans l’étude.
Elles concernent des données sur:
• l’anthropométrie (âge, poids, taille) et le sexe
• le diagnostic de DT2 (année de diagnostic du diabète, année de mise à
l’insuline)
• le fond d’œil : présence ou l’absence de RD et son stade de gravité
• l’histoire médicale notamment cardiovasculaire : antécédent de
complications à type d’IDM, AVC, RD, suppléance rénale, angor,
revascularisation coronarienne, carotidienne ou d’une artère de membre
inférieur, amputation de cause vasculaire,
• le statut tabagique
• les antécédents familiaux avec le cas échéant, date et cause de décès
des 2 parents (information recueillie uniquement dans D2NG et SDG)
• l’ethnie des 2 parents du patient (recueillie uniquement dans D2NG et
SDG)
• les thérapeutiques en cours (antidiabétiques oraux ou injectables,
médicaments ayant un impact sur la pression artérielle)
2.2.
Données biologiques
Les examens biologiques suivants étaient réalisés dans SDG et D2NG de
manière centralisée au CHU de Poitiers et dans DBH au CHU d’Angers :
-
-
HbA1c (méthode Chromatographie en phase liquide à haute
performance [HPLC]- DIAMAT BioRad)
créatinine plasmatique et urinaire (méthode de Jaffé), albumine
urinaire (méthode néphélémétrique)
La fonction rénale a été calculée par une estimation selon la formule
de Cockcroft et Gault356 et l’équation MDRD (pour Modification of Diet
in Renal Disease357)
cholestérol total (méthode enzymatique)
Pour certains patients de SDG et D2NG, les dosages suivants ont également
été réalisés:
-
94
stéroïdes sexuels (centralisation laboratoire de Biochimie Angers)
méthode immunologique d’électrochimiluminescence (ECLIA) pour la
Testostérone (T), l’Œstradiol (E2) et la SHBG.
Les fractions libres de T et d’E2 ont été calculées par la formule de
Sodergard et al.358 en considérant une concentration fixe d’albumine
plasmatique à 40 g/l.
-
NT-proBNP (pour N-terminal fragment of the prohormone brain-type
natriuretic peptide) (par méthode ECLIA)
sodium urinaire (UNa) sur un échantillon d’urine du matin (méthode de
potentiométrie indirecte sur un système MODULAR P [Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany]).
3. Génotypages
Pour D2NG et SDG, la technique de KASPAR (pour Kompetitive Allele Specific
PCR) du laboratoire LGC Genomics-KBioscience (London, UK) a été retenue
pour des raisons de fiabilité et de coût. La Figure 36 montre les résultats de
génotypage du variant rs10046 du gène CYP19A1 pour 82 patients de l’étude
D2NG.
Figure 36 Résultats de génotypage pour une plaque d'échantillons pour le SNP rs10046 du gène
CYP19A1. En rouge les échantillons homozygotes AA, en vert les hétérozygotes GA, en bleu les
homozygotes AA, en noir les deux puits vides de contrôle et en roseunéchantillon indéterminé.
Pour DBH, la technique de sondes fluorescentes de TaqMan a été utilisée pour
les génotypages du NPR3.
95
3.1.
Choix des gènes
Le choix des gènes s’est porté sur le NPR3 qui code pour le récepteur de type
3 des peptides natriurétiques. Des données de Roussel et al. avaient montré
qu’un SNP situé dans l’exon 8 était associé à la progression de la ND dans une
étude prospective de patients présentant un DT1245.
Le 2e gène exploré est celui codant pour le cytochromeP45019A1 (CYP19A1).
Les variants de ce gène ont été associés, via le niveau d’activité enzymatique
de l’aromatase359, à une modulation des concentrations de stéroïdes
sexuels360,361. Il a, par ailleurs, été montré que, chez des sujets DT1 atteints de
ND présentateint des concentrations plus élevées d’estradiol par rapport à des
DT1 indemnes de complications rénales362
3.2.
Choix des variants
Pour le NPR3
Le gène NPR3 est situé en 5p14, il a une taille de 2650 pb et comporte 8
exons. Ses transcrits sont au nombre de 7 correspondant à 6 protéines de 88 à
541 AA. A ce jour, 9 127 variants ont été recensés dans la base de données
Ensembl. Les 9 SNPs sélectionnés au sein du NPR3 sont listés dans le
Tableau 7 et représentés dans la Figure 37 en fonction des blocs de LD
identifiés dans la population caucasienne de HapMap (résidents de l’Utah
originaires de l’Europe du Nord et de l’Ouest [CEU]).
1 23
4
5
6
7
8
9
Figure 37 Représentation des 9 SNPs sélectionnés au sein du NPR3.
L’analyse de LD a été menée à partir des données disponibles dans HapMap pour la population
caucasienne d’ascendance européenne (CEU). Le LD est affiché par des couleurs standard :
couleur rouge pour un très fort LD (LD = 2 D '= 1), de couleur blanche sans LD (LD <2, D '<1),
rose/rouge (LOD = 2 D' <1) et bleu (LD <2 D '= 1) pour LD intermédiaire. Les chiffres encerclés
représentent ls SNPs génotypés : 1, rs9716700, 2, rs1421811, 3, rs12522446, 4, rs6889608, 5,
96
rs700923, 6, rs16890196, 7, rs1173773, 8, rs1173743, 9, rs2270915. Les blocs de LD ont été définis à
l'aide Haploview et apparaissent en triangle de trait fin noir
Tableau 7 Récapitulatif des SNPs sélectionnés pour l'exploration du NPR3.
#
génotype
position sur le Chromosome 5
position
rs9716700
A/C
32711633
3' UTR
2
rs1421811
C/G
32704270
INTRON
1
3
rs12522446
C/T
32705135
INTRON
1
4
rs6889608
C/T
32709693
INTRON
1
1
SNP ID
# Bloc LD
5
rs700923
A/G
32724868
INTRON
2
6
rs16890196
A/G
32729661
INTRON
2
7
rs1173773
A/G
32740983
INTRON
3
8
rs1173743
G/T
32765047
INTRON
4
9
rs2270915
A/G
32776389
EXON 8
4
Pour le CYP19A1
Le gène CYP19A1 est situé en 15q21.2, il a une taille de 132 kb et comporte 8
exons. Ses transcrits sont au nombre de 20 correspondant à 15 protéines de
138 à 503 AA. A ce jour, plus de 30 000 variants ont été recensés dans la base
de données Ensembl (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/).
Nous avons en premier lieu mené une analyse de la littérature via PUBMED
des variants associés aux concentrations de stéroïdes sexuels ou à des traits
phénotypiques réliés. Cela nous a permis de retenir 25 variants363-367.
Six variants n’ont pas pu être intégrés aux analyses :
• 2 étaient faussement localisés dans le CYP19A1 (en fait dans le gène de
la gliomedine),
• 1 SNP était exprimé uniquement dans le tissu cancéreux,
• 1 SNP n’était pas retrouvé dans les bases de données HapMap et
dbSNP,
• 1 SNP était un tandem repeat et n’a pas pu être recherché par la
méthode Kaspar,
• 1 SNP était monomorphique dans notre population,
• 1 SNP n’a pas pu être déterminé.
De manière à couvrir l’ensemble de l’information génétique du NPR3, nous
avons complété notre sélection dans le but de couvrir l’ensemble des 9 blocs
haplotypiques. Les 3 derniers SNPs ont été sélectionnés grâce aux outils de
tagging (tagger server [algorithme implémenté dans le logiciel Haploview] et
GVS [http://gvs.gs.washington.edu/GVS134/index.jsp]) en priorisant les variants
exoniques et non synonymes puis en sélectionnant ceux qui captaient le plus
d’information. Au total, 21 SNPs ont été analysés pour CYP19A1. Ils sont listés
dans le Tableau 8 et représentés dans la Figure 38 en fonction des blocs de LD
identifiés dans la population des caucasiens de DIAB2NEPHROGENE.
97
Tableau 8 Récapitulatif des SNPs sélectionnés pour l'exploration du CYP19A1.
#
SNP ID
Géno-type
position
sur le
Chromosome 15
Position
#
Bloc
LD
publication
Marqueurs
associés
1
rs10046
G/A
49290278
3' UTR
1
Huhtaniemi366
E2, HOMA-IR
2
rs700519
G/A
49295260
EXON 7
1
3
rs11575899
-/TCT
49307241
INTRON 4
2
4
rs700518
T/C
49316404
EXON 3
1
Gennari
365
Huhtaniemi366
Gennari
E2, T libre
365
5
rs727479
A/C
49321839
INTRON 2
2
Huhtaniemi366
6
rs12911554
T/C
49330049
INTRON 9
3
not published
7
rs7172156
G/A
49333590
INTRON 9
4
not published
8
rs10519299
C/G
49338638
INTRON 9
5
Huhtaniemi366
E2
366
E2
E2
9
rs12050767
T/C
49344549
INTRON 9
5
Huhtaniemi
10
rs749292
G/A
49346023
INTRON 9
5
Huhtaniemi366
11
rs1902586
G/A
49358145
INTRON 9
6
Cai
363
12
rs936306
C/T
49366890
INTRON 9
6
Cai
363
13
rs730154
T/C
49378496
INTRON 9
6
Cai
363
14
rs2470152
A/G
49382264
INTRON 9
NO
15
rs28566535
A/C
49388433
INTRON 9
NO
Eriksonn364
E2, T libre
E2
Estrone
Estrone
E2, Estrone
Cai
363
E2
NS
16
rs1902584
A/T
49398946
INTRON 9
7
Cai
363
17
rs1004984
G/A
49400821
INTRON 9
7
Cai
363
18
rs2445762
T/C
49405000
INTRON 10
8
19
rs2470144
C/T
49409017
INTRON 10
9
Estrone
not published
Cai
363
367
NS
20
rs6493497
G/A
49418127
5’upstream
NO
Wang L
E2, activité CYP19A1
21
rs7176005
C/T
49418571
5’upstream
NO
Wang L367
E2, activité CYP19A1
Figure 38 Représentation des 21 SNPs sélectionnés au sein du gène CYP19A1 (Haploview). Le
code couleur des points est le suivant blanc=(|D’|<1, LOD<2) rose/rouge ombré=(|D’|<1, LOD#2),
bleu=(|D’|=1, LOD<2), rouge vif=(|D’|=1, LOD#2). Le nombre dans le carré représente le D’
(seulement les décimales). Les D’=1 ne sont pas indiqués numériquement.
98
4. Statistiques
Les statistiques descriptives ont été réalisées avec les logiciels Statview 5.0,
PLINK et THESIAS. La représentation graphique des LD a été réalisée grâce a
Haploview. La magnitude de l'association détectable dans un échantillon a été
calculée grâce à PGA et les méta-analyses ont été conduites avec METAL.
○
STATVIEW
Les variables quantitatives sont décrites par la moyenne et l'écart type (DS pour
déviation standard) pour les variables continues gaussiennes et par la médiane
et l’intervalle interquartile (IQR pour interquartile range) pour les variables non
gaussiennes.
L’évaluation de la normalité des variables a été testée avec le test de
Kolmogorov Smirnov. Les variables non gaussiennes peuvent être, le cas
échéant, normalisées pour permettre d’être utilisées dans les tests
paramétriques ou la régression linéaire.
Analyse univariée
Les comparaisons inter-groupes ont été réalisées pour :
•
•
les variables continues :
- distribuées normalement par test t de Student ou par analyse de
variance (ANOVA) en cas de plus de 2 groupes,
- non gaussiennes par test de Mann-Whithney (groupes indépendants)
ou test des rangs de Wilcoxon (groupes appariés), ou le test de
Kruskall-Wallis (plus de 2 groupes)
les variables qualitatives par test du chi-carré (χ²) ou test de Fisher (en
cas d’effectif attendu <5).
Le test de l’association entre 2 variables continues était réalisé pour les
variables :
•
•
distribuées normalement grâce au coefficient de corrélation de Pearson,
non gaussiennes grâce au coefficient de corrélation Rho de Spearman.
Analyse multivariée
Pour l’analyse multivariée la stratégie utilisée consistait en une procédure
d’élimination pas à pas descendante appliquée sur un modèle maximal
contenant les variables asociées à la variable dépendante avec un p<0,10 ainsi
que les variables d’intérêt. L’absence d’interactions a été vérifiée sur les
modèles finaux.
99
Une régression linéaire multiple a été conduite pour explorer les relations entre
une variable continue dépendante Y et plusieurs variables explicatives X.
Les génotypes ont été utilisés dans les modèles sous 2 formes :
• variable continue discrète à 3 modalités : 0, 1, 2 en fonction du nombre
d’allèle mineur dans l’hypothèse d’un effet additif de celui-ci,
• variable continue discrète à 2 modalités : 0 pour porteur A1 ou porteur A2
et 1 pour homozygote A2/A1 dans l’hypothèse d’un effet dominant.
L’association entre une variable catégorielle dépendante et une ou plusieurs
variables indépendantes (catégorielles ou continues) a été recherchée par
régression logistique. La force de l’association entre la variable indépendante X
et la variable dépendante Y est quantifiée par l’OR (ou rapport de cotes) et son
IC95%. Les génotypes ont été utilisés dans les modèles sous 2 formes 2 ou 3
classes.
Seuil de significativité
Nous avons considéré le seuil de significativité des tests à 0,05.
Pour tenir compte de la répétition des tests d’association (ou multiple testing)
pour les n génotypes explorés, une correction de Bonferroni368 a été appliquée
pour lutter contre l’inflation du risque α ainsi le degré de signification pour
chacun des tests était p’≈p/n.
Randomisation méndélienne
Pour l’exploration de la causalité des hormones sexuelles et notamment de la
concentration d’œstradiol sur la survenue de complications rénales, nous avons
réalisé une randomisation mendelienne297 en évaluant dans une approche
triangulaire (Figure 39) de manière séquencielle:
a) l’association observée entre les variants du CYP19A1 et le risque de ND,
b) l’association entre l’œstradiolémie et le risque de ND,
c) l’association entre les variants du CYP19A1 et l’œstradiolémie,
d) l’association attendue entre les variants du CYP19A1 et le risque de ND.
La comparaison entre OR observé (a) et OR attendu (d) est ensuite réalisée
pour évaluer l’association causale entre l’œstradiolémie et risque de ND.
100
b
Taux
d’œstradiol (E2)
c
Association observée
du taux d’E2
avec les variants
du CYP19A1
chez les caucasiens
Risque observé de ND
lié au taux d’E2
Néphropathie
diabétique
a
risque observé de ND lié
aux variants de CYP19A1
chez les caucasiens
d
risque attendu de ND lié
aux variants du CYP19A1
à partir de b et c
Variants du
CYPA19A1
DIAB2NEPHROGENE
Figure 39 Représentation de l'approche de randomisation mendélienne envisagée dans l’étude
cas-témoins DIAB2NEPHROGENE
Analyses de survie
La construction des courbes de survie a été menée selon la méthode de
Kaplan-Meier. La comparaison des données de survie a été réalisée par le test
de logrank ou par modèle de risque proportionnel de Cox.
○
THESIAS
THESIAS (pour Testing haplotype effects in association studies) est un logiciel
d'analyse haplotypique développé par Tregouet et al.369.
Il bénéficie d’une interface Java qui en facilite utilisation. Il permet, en outre,
l’exploration de l’association haplotype-phénotype pour des variables
quantitatives et binaires (cas témoin) en présence ou non de covariables par
régression linéaire ou logistique.
Les fréquences alléliques de chaque variant mais également l’estimation des
fréquences haplotypiques peuvent être obtenues.
L’effet de l’haplotype sur le phénotype peut être apprécié pour les variables
binaires par un OR et pour les variables continues par le coefficient
« Estimate » en comparaison à l’haplotype de référence qui est celui qui
présente la fréquence la plus élevée.
Le pourcentage de la variance du phénotype expliquée par les haplotypes est
également donné.
101
Nous avons pris le parti de prendre en compte uniquement l’effet des
haplotypes les plus fréquents, c'est-à-dire avec une fréquence ≥ 5%.
○
PLINK
Le logiciel PLINK370 a été utilisé pour tester l’équilibre de Hardy-Weinberg
(HWE) pour chacun des variants explorés et réaliser simplement les analyses
d’association entre les génotypes et les variables binaires (cas-témoins) ou
continues (concentrations plasmatiques d’œstradiol par exemple).
La loi de Hardy-Weinberg (HW) correspond au modèle théorique central de la
génétique des populations. Elle postule, qu'au sein d'une population (idéale), il
y a équilibre des fréquences alléliques et génotypiques d'une génération à
l'autre.
La loi de HW permet le calcul de fréquences génotypiques théoriques à partir
de fréquences alléliques.
Soient A et a deux allèles d’un même locus avec fréquence allélique f(A)=p et
f(a)=q=1- p. Les fréquences génotypiques en HWE sont :
f(AA)=p² f(Aa)=2pq
f(aa)=q²
L’absence de différence entre les fréquences génotypiques observées et
théoriques (selon l’équilibre prédit par la loi de HW) est vérifiée par un test de
χ².
○
HAPLOVIEW
Le logiciel Haploview version 4.2 (http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview ) a
été utilisé pour rechercher les déséquilibres de liaison entre les variants et
identifier les SNP représentatifs (tag SNP) d’un un bloc haplotypique132. Les
données de populations caucasiennes sont issues des données de la
population CEU du projet Hapmap371-373.
○
PGA
Nous avons utilisé le logiciel PGA (pour Power for Genetic Association
Analyses ; http://dceg.cancer.gov/bb/tools/pga) pour le calcul de puissance a
posteriori pour nos études d’association génétique374. Il permet également de
calculer le risque relatif minimum détectable pour les marqueurs génétiques de
choix en fonction de leur fréquence allélique et la taille des populations mais
également la prévalence de la maladie en population et le mode transmission
génétique supposé et les risques de 1ère (α) et 2e espèces (β).
102
○
METAL
Pour ce qui concerne les méta-analyses des données provenant des différentes
populations étudiées (D2NG, SDG et DBH), nous avons utilisé le logiciel
METAL375 (http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/metal/).
Le logiciel intègre pour chaque population les données d’association (OR et p
value) en les pondérant par la taille de la population pour fournir un score Z et
un seuil de significativité.
○
POLYPHEN2
Nous avons utilisé le logiciel Polyphen2
(Polymorphism Phenotyping
version 2 ; http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) qui est un outil informatique
développé par l’Harvard University376 et permet de prédire l'impact d'une
substitution d'acide aminé (mutation faux sens induite par le polymorphisme)
sur la structure et la fonction d'une protéine humaine à l'aide de simples
considérations physiques et comparatives.
103
104
V.
TRAVAUX PUBLIES
OU EN COURS DE
SOUMISSION
105
106
TRAVAUX PUBLIES OU EN COURS DE SOUMISSION
1. Impact des variants du gène du récepteur de
clairance des peptides natriurétiques (NPR3) sur
les complications du DT2
Nous avons dans un premier temps étudié l’effet de variants du NPR3 sur la
PAS et la prévalence de la ND dans DIABHYCAR et DIAB2NEPHROGENE.
Puis nous avons mis en place une étude fonctionnelle pour estimer l’impact de
ces SNP sur la régulation de la PAS en fonction de la charge sodée.
Ce travail a été publié dans le Journal Diabetes Care.
Nous avons ensuite complété nos travaux évaluant l’influence de ces SNP sur
la relation entre PAS, excrétion urinaire de sodium et survenue de
complications dans le suivi.
1.1.
Article publié dans Diabetes Care
ABSTRACT
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
Supplementary Table 4. Association between NPR3 variants and SBP according to
presence or absence of obesity in the DIABHYCAR study
SBP (mmHg)
Obesity status
(n*/n†/n‡)
A1A1
A1A2
A2A2
AA
AC
CC
Obese (49/384/809)
147.8±16.6
145.7±14.7
145.6±13.2
0,561
Non obese (71/565/1,213)
145.5±14.0
142.9±12.8
143.3±12.2
0,280
CC
CG
GG
Obese (200/575/468)
145.2±14.3
145.9±13.6
145.6±13.7
0,815
Non obese (296/861/689)
142.6±12.6
143.3±12.7
143.6±12.8
0,547
TT
CT
CC
148.5±12.0
145.2±12.7
145.9±14.2
0,684
145.1±11.9
143.2±12.0
143.2±12.9
0,757
CC
CT
TT
Obese (97/471/675)
145.1±12.4
146.4±13.9
145.3±14.0
0,389
Non obese (132/681/1,036)
145.3±12.4
143.7±12.3
142.7±12.9
0,054
GG
AG
AA
Obese (62/434/715)
142.7±12.2
146.3±15.3
145.5±13.1
0,147
Non obese (102/624/1,070)
142.3±11.2
143.5±12.8
143.1±12.8
0,630
GG
AG
AA
144.0±12.3
146.4±15.7
145.3±13.0
0,374
142.6±11.4
143.4±12.2
143.2±13.0
0,872
GG
GA
AA
Obese (120/578/546)
141.8±14.0
145.9±14.5
146.4±12.9
0,004
Non obese (210/810/828)
142.7±12.9
143.2±12.7
143.4±12.7
0,780
GG
GT
TT
Obese (278/593/373)
147.1±13.5
145.0±13.5
145.8±14.6
0,118
Non obese (431/899/519)
142.4±12.6
143.5±12.8
143.6±12.6
0,299
GG
GA
AA
149.0±16.3
145.7±14.3
145.6±13.4
0,226
Non obese (88/581/1,168)
144.9±12.1
144.3±12.9
Data are means ± SD.
*/†/‡ / number of patient for A1A1/A1A2/A2A2 respectively.
§ P value from one-way ANOVA.
142.8±12.7
0,068
SNP
rs9716700
rs1421811
rs12522446 Obese (8/286/950)
Non obese (27/394/1,428)
rs6889608
rs700923
rs16890196 Obese (34/375/800)
Non obese (62/526/1,215)
rs1173773
rs1173743
rs2270915
Obese (51/403/785)
P value§
117
Supplementary Table 5. Association between NPR3 variants and SBP according to
presence or absence of obesity in Europid-only participants of the
DIAB2NEPHROGENE/SURDIAGENE studies
SBP (mmHg)
SNP
rs6889608
rs1173773
rs2270915
Obesity status
(n*/n†/n‡)
A1A1
A1A2
A2A2
CC
CT
TT
Obese (55/351/565)
139.6±21.6
140.9±20.3
139.6±10.1
0.649
Non obese (60/334/591)
131.7±18.1
137.0±17.7
137.3±19.2
0.082
GG
AG
AA
Obese (105/409/456)
143.0±19.7
140.7±21.4
138.5±19.0
0.077
Non obese (127/403/453)
137.9±18.3
136.5±18.8
137.2±18.7
0.729
GG
AG
AA
Obese (42/331/629)
139.2±20.0
142.0±20.6
138.8±19.9
0.066
Non obese (48/327/639)
135.7±19.2
138.9±19.8
136.0±18.2
0.075
Data are means ± SD.
*/†/‡ / number of patient for A1A1/A1A2/A2A2 respectively.
§ P value from one-way ANOVA.
118
P value§
Supplementary Table 6-NPR3 gene haplotype analysis of rs6889608, rs1173773
and rs2270915 in the conjunct population : DIABHYCAR and Europid
DIAB2NEPHROGENE-SURDIAGENE participants
Haplotype
C/T*
G/A†
Haplotype
frequency
SBP (mmHg)
P value
G/A‡
T
A
A
0.395
141.3(140.3-142.3)
Reference
T
G
A
0.200
142.6(140.9-144.4)
0.235
C
A
A
0.133
143.2(141.2-145.2)
0.129
T
A
G
0.102
145.4(142.5-148.3)
0.016
C
G
A
0.067
142.2(138.7-145.8)
0.612
T
G
G
0.052
143.5(140.9-146.1)
0.129
*rs6889608, †rs1173773, ‡ rs2270915.
Comparisons were made using TAA as reference in THESIAS software and haplotype
frequencies above 0.05 were considered taking more than 95% of chromosomes into account..
119
Supplementary Table 7 - Clinical and biological response to salt reduction in the
sodium restriction functional study (additional data)
Variable
Weight (kg)
Salt
diet
Usual
Low
Treatment effect (P value)
Global treatment effect (P
value)
HR (min-1)
Usual
Low
Usual
Low
value)
(n = 7)
(P value)
87.5 ± 11.5
86.2 ± 10.8
0.063
89.7 ± 15.7
88.5 ± 14.9
0.1148
0.848
0.848
65 ± 9
65 ± 5
0.999
64 ± 22
64 ± 18
0.8658
79.3 ± 6.7
70.4 ± 8.0
0.018
Usual
Low
0.848
0.949
0.0409
0.4062
1777 (404)
1642 (387)
0.3980
89 (24)
87 (28)
0.4990
0.3952
0.4057
0.2774
0.8182
0.3706*
94 (37)
105(14)
0.4990
0.3305
0. 8542
0.0845*
0.9721
Usual
Low
0. 8182
0.8480*
73.3 ± 6.2
73.3 ± 7.7
0.999
2200 (1883)
3183 (1836)
0.6002
Global
genotype
effect
(P
value)
0.7491*
0.048
value)
Serum creatinine (µmol/l)
(n = 7)
0.925
value)
Diuresis (ml/24h)
G carriers
0.0131
value)
DBP (mmHg)
AA
Genotype
effect
0.4057
0.3056
0.8182
0.6540*
Data are mean +/- SD or median (interquartile). HR, heart rate ; DBP, diastolic blood pressure. P values
within each genotype are treatment effect (Wilcoxon rank test). P values within each salt diet are
genotype effect (Mann-Whitney U test) *P values for estimated genotype-treatment interaction (MannWhitney U test). Treatment effect means effect of diet sodium intervention.
120
Supplementary Figure 1- Organisation of the functional study of sodium intake
restriction
Usual Sodium Intake
Low-Sodium intake (10 days)
Time
(days)
Day -3
Day 0
urine collection
Day +7
Day +10
urine collection
Arrows represent BP measure.
121
Supplementary Figure 2- Linkage disequilibrium (LD) analysis of NPR3 genetic
polymorphism
1 23
4
5
6
7
8
9
LD for western European ancestry population (from Centre d’Etude du Polymorphisme Humain [CEU])
is displayed by standard color schemes: red color for very strong LD (LOD = 2 D' = 1), white color for no
LD (LOD<2, D'<1), pink, red (LOD = 2 D'<1), and blue (LOD<2 D' = 1) for intermediate LD.
Numbers circled represent genotyped SNPs: 1, rs9716700; 2, rs1421811; 3, rs12522446; 4, rs6889608; 5,
rs700923; 6, rs16890196; 7, rs1173773;8, rs1173743; 9, rs2270915. LD blocks were defined using
Haploview.
122
Supplementary Figure 3 - Change in systolic blood pressure (mmHg) induced by
salt reduction according to rs2207915 NPR3 polymorphism
Data are presented individually and mean is in bold font; * Salt reduction effect (Wilcoxon signed-rank
test); †, genotype effect (Mann-Whitney U test); ‡ estimated salt reduction-genotype interaction (MannWhitney U test).
A: all patients (*P=0.006; † P=0.51; ‡ P =0.006); B: AA homozygote; * P=0.0117; C: G carriers
*P=0.3980.
A
B
C
123
Supplementary Figure 4 - Local plot of the height association test results (log10(P))
along the NPR3 gene.
Imputed genotypes using HapMap CEU data in the DIABHYCAR population
rs1173773
2.0
rs6889608
rs2270915
1.0
10
-log (P value)
1.5
0,5
0,0
rs700923
rs1689096
rs12522446
rs1421811
rs9716700
32750000
rs1173743
32800000
Chromosome 5 Position (bp)
124
32850000
3290000
1.2.
Données complémentaires sur gène du récepteur de
clairance des peptides natriurétiques
INTRODUCTION
Au vu des résultats de notre étude fonctionnelle publiée dans Diabetes Care,
nous avons cherché à savoir dans une population de plus grande taille,
comment les apports sodés estimés par la concentration urinaire de sodium
(UNa) sur échantillon influençaient les paramètres hémodynamiques et
notamment la PAS.
Nous avons également cherché à savoir comment les variants du NPR3
pouvaient moduler la relation entre le sodium urinaire et la PAS et impacter la
survenue de complications au long cours. Pour cela, nous avons mené une
exploration de triangulation entre ces facteurs dans la population de l’étude
transversale DIAB2NEPHROGENE et longitudinale de SURDIAGENE puis à
visée de réplication dans la population indépendante suivie prospectivement de
DIABHYCAR.
Les dosages de sodium urinaire ont été réalisés sur un échantillon d’urines du
matin par méthode de potentiométrie indirecte sur un système MODULAR P
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Les patients sélectionnés
pour cette analyse d’UNa sont les patients qui ont participé à la fois à
DIAB2NEPHROGENE et à SURDIAGENE. Ces patients commun aux deux
approches, pour lesquels les données « baseline » du suivi prospectif SDG sont
représentées par les données de D2NG, ont bénéficié d’une seule et même
mesure d’UNa. La triangulation sur des variables uniquement évaluées
transversalement (variants génétiques, UNa et PAS) sera menée dans la
population de D2NG. La triangulation qui inclue, outre UNa et variants
génétiques, des données de suivi sera menée dans la population de SDG.
Les génotypages ont été réalisés sur les échantillons par méthode KASPar
basée sur une PCR spécifique d’allèle (KBiosciences, Hoddesdon, UK).
Les apports quotidiens en sodium ont été extrapolés à partir des dosages
urinaires de sodium sur échantillon, grâce aux formules de conversion de
Tanaka et al.377.
Les analyses statistiques ont été menées conformémént à celles décrites dans
le chapitre IV.
La Figure 40 propose une représentation des différentes analyses réalisées
dans les études DIAB2NEPHROGENE, SURDIAGENE et DIABHYCAR.
125
a
Association de UNa
avec la PAS
(n= 1398)
Sodium
urinaire (UNa)
d
b
1
Pression artérielle
systolique (PAS)
Interaction
des variants du NPR3
sur la relation
UNa-PAS
de UNa avec les
variants du NPR3
chez les caucasiens
(n=1021)
c
de la PAS avec les variants du NPR3
chez les caucasiens
(n= 2276)
DIAB2NEPHROGENE
Variants du
NPR3
(n=2887)
a
Sodium
urinaire (UNa )
Association du taux d’ UN a avec
la survenue d’ événeme nts cardiovasculaires
et rénaux (n= 1446)
Evénements
Cardiovasculaires
et rénaux
c
Interaction
des variants du NPR3
sur la relation
UNa -Evènements
2
Variants du
NPR3
b
Im pact des variants du NPR3
sur la survenue
d’événements cardiovasculaires
et rénaux (n˜101 0)
SURDIAGENE
(n= 1467)
Evénements
Cardiovasculaires
et rénaux
3
a
Impact des variants du NPR3
sur la survenue
d’événements cardiovasculaires
et rénaux (n≈3120)
Variants du
NPR3
DIABHYCAR
(n=3413)
Figure 40 Stratégie d’exploration des associations entre sodium urinaire, pression artérielle
systolique, variants génétiques du NPR3 et risque de complications cardiovasculaies et rénales
dans les populations (1) DIAB2NEPHROGENE, (2) SURDIAGENE et (3) DIABHYCAR
126
RESULTATS
A. étude DIAB2NEPHROGENE
Les caractéristiques des patients de la population d’étude D2NG pour lesquels
les résultats du dosage du UNa étaient disponibles (n=1405) sont présentées
dans le Tableau 9.
DIAB2NEPHROGENE en fonction des tertiles de concentration urinaire de sodium
Variables
de
l'étude
Tertiles de UNa
Inférieur
≤69 mmol/l
475
n
Homme : n (%)
Intermédiaire
70-104 mmol/l
467
Supérieir
≥105 mmol/l
463
P
value
251 (53)
274(59)
293 (63)
Age (ans)
66±11
66±11
64±11
0,0063
Durée du diabète (ans)
16±10
15±10
12±9
<0,0001
31,2±6,3
30,6±6,0
31,9 ±6,3
0,012
49(10)
44(10)
56(12)
0,42
IMC (kg/m²)
Fumeur: n (%)
0,006
PAS (mmHg)
130,8±18,2
133,8±18,4
132,8±14,1
0,015
PAD (mmHg)
71,1±10,8
73,1±10,5
73,4±11,7
0,003
73,2±12,8
73,4±13,9
73,9±13,2
-1
Fréquence cardiaque (min )
0,75
Antécédent d’IDM: n (%)
87(18)
66(14)
54(12)
0,015
Antécédent d’AVC: n (%)
32(7)
24(5)
24(5)
0,49
HbA1C (%)
DFGe (ml/min/1,73m²)
EUA (mg/l)
UNa (mmol/l)
Traitement antihypertenseur (%)
dont IEC (%)
7,7±1,6
7,0±1,6
7,7±1,5
84,9 (30,4)
0,35
67,7 (39,1)
77,4 (36,4)
<0,001
26(133)
26(104)
22 (60)
0,12
46±16
87±10
136±26
<0,0001
423(89)
387(83)
359(78)
<0,0001
189(4)
172(37)
162(35)
0,31
dont ARA2 (%)
135(28)
133(29)
122(26)
0,71
dont Inhibiteurs calciques (%)
163(34)
147(32)
131(28)
0,14
dont Béta-bloquants (%)
179(38)
161(35)
128(28)
0,0034
dont Diuretiques (%)
266(56)
205(44)
170(37)
<0,0001
La moyenne de concentration urinaire de sodium chez nos patients était de 89
± 41 mmol/l. La moyenne de l’UNa était significativement plus élevée chez les
hommes (92 ± 41vs 85 ± 41 mmol/l chez les femmes, p=0,0027).
En complément, l’UNa (comme variable continue) était indépendamment
associée, dans une analyse mulitvariée, avec la durée du diabète, le sexe, le
débit de filtration glomérulaire estimé (DFGe); l’EUA et les traitements par
diurétiques (Tableau 10).
127
Tableau 10 Association des variables clinico-biologiques avec la concentratio urinaire de sodium
(mmol/l) dans la population des patients de l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée)
Variables explicatrices
Coefficient ± SE
P value
Durée du diabète (pour un incrément de 1 an)
-0,3±0,1
0,019
Sexe (référence=Homme)
-4,6±2,2
0,033
DFGe *
5,5±0,6
< 0,0001
Diurétiques (oui/non)
-6,9±2,2
0,002
* transformation
pour normalisation
√
L’excrétion urinaire de sodium des 24 heures a été estimée à partir des
dosages des natriurèses sur échantillon (en mmol/l) selon les formules de
conversion de Tanaka et al.377. Les apports quotidiens en sodium et sel (en g/j)
ont été calculés à partir de l’estimation de l’excrétion urinaire de sodium des 24
heures. La Figure 41 représente les apports sodés journaliers en fonction de la
natriurèse chez les 1405 patients diabétiques de type 2 ayant bénéficié du
dosage. Il existe une corrélation significative entre ces deux variables (r2=0,27,
p < 0,0001).
Natriurèse estimée des 24h (mmol/j)
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
Concentration urnaire de sodium (mmol/l)
Figure 41 Représentation des apports sodés journaliers estimés (en mmol/jour) en fonction de la
concentration urinaire de sodium (en mmol/l) chez les 1405 patients diabétiques de type 2 ayant
bénéficié du dosage de l’étude DIAB2NEPHROGENE (r²=0,27 ; p<0,0001).
Les apports quotidiens en sel des patients de la cohorte étaient en moyenne de
9,5 ± 2,8 g/jour. La majorité des patients (91,2%) présentaient des apports en
sel quotiens supérieurs aux apports quotidiens recommandés de 6g/j. Seuls 3
patients avaient des apports quotidiens estimés en sel < 3g/j.
128
Après ajustement sur l’âge, le DFGe et l’EUA, les hommes consommaient plus
de sel que les femmes (9,6±2,8 vs 9,3±2,7 ; p=0,02). Chez les hommes,
l’augmentation de l’âge s’associait significativement celle de la consommation
de sel (p=0,02) ce qui n’était pas retrouvé chez les femmes (Figure 42)
Figure 42 Estimation des apports quotidiens en sel (en g/j) en fonction du sexe et de l’âge des
patients DT2 de DIAB2NEPHROGENE.
Les apports quotidiens en sel ont été calculés à partir de l’estimation de l’excrétion urinaire de
sodium des 24h. La ligne pointillée représente la limite supérieure des apports recommandés de
6g/j.
a) Association de l’excrétion urinaire de sodium avec la pression
artérielle systolique
En analyse univariée, la PAS n’était pas significativement associée avec la
concentration de sodium urinaire (p=0,19). Néanmoins, après ajustement sur
l’âge, le sexe et le DFGe, l’association entre UNa et PAS devenait significative
(p=0,0014) (Tableau 11).
Tableau 11 Association des variables clinico-biologiques avec la pression artérielle systolique
(mmHg) dans la population des patients de l’étude DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée)
Coefficient ± SE
P value
Sodium urinaire (pour un incrément de 1 mmol/l)
0,04±0,01
0,0014
-0,29±0,93
0,75
Age (pour un incrément de1 an)
0,19±0,04
0,0002
DFGe*
-0,46±0,30
< 0,0001
6,42±0,59
< 0,0001
EUA†
Transformation par *
√
et et par † log-transformation pour normalisation
129
b) Association de la concentration urinaire sodium avec les variants
du NPR3
Les analyses génétiques ont été conduites uniquement chez les 2680 patients
caucasiens. Les distributions des génotypes étaient en HWE sauf pour
rs6889608 (p non corrigé pour tests multiples = 0,041). Les MAF étaient en
accord avec nos précédentes explorations (allèle mineure, MAF : C, 23.36% ;
G, 33,29% et G, 20,38% pour rs6889608, rs1173773 et rs2270915
respectivement).
Chez les caucasiens pour lesquels étaient à la fois disponibles les données de
génotypage de NPR3 et le dosage du UNa, les apports sodés n’étaient pas
différents selon les génotypes (p=0,21, p=0,95 et p=0,73 pour rs6889608,
rs1173773 et rs2270915, respectivement). L’ajustement sur l’âge, le sexe, le
DFGe et l’EUA ne modifiait pas les résultats [Tableau 12]).
Tableau 12 Impact des variants du NPR3 sur la concentration urinaire sodium (mmol/l) dans l’étude
DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée ajustée sur âge, sexe et DGF estimé)
Coefficient ± SE
P value
-4,9±2,6
0,07
Age (pour +1 an)
0,1±0,1
0,43
DFGe*
6,34±0,8
<0,0001
EUA†
-1,0±1,7
0,56
rs6889608‡
3,1±2,1
0,15
rs1173773‡
1,0±1,9
0,62
rs2270915‡
1,4±2,2
0,53
√
‡pour l’addition d’un allèle mineur allèle (par exemple C, G et G pour rs6889608, rs1173773,
rs2270915, respectivement).
c) Association de la pression artérielle systolique avec les variants du
NPR3
Parmi les 3 variants testés, seuls rs2270915 étaient significativement associés
avec la PAS en analyse univariée (p=0,024). Après ajustement l’âge, le sexe, le
DFGe et l’EUA, l’association devenait significative pour rs1173773 et
rs2270915 (Tableau 13).
Tableau 13 Impact des variants du NPR3 sur la pression artérielle systolique (mmHg) dans l’étude
DIAB2NEPHROGENE (analyse multivariée ajustée sur le sexe, l’âge, l’EUA et DGF estimé)
Coefficient ± ES
P
Sexe (par rapport aux hommes)
-0,3±0,8
0,68
Age (pour +1 an)
0,2±0,05
< 0,0001
DFGe*
-1,3±0,2
0,72
EUA†
6,2±0,5
<0,0001
rs6889608‡
-0,3±0,6
0,66
rs1173773‡
1,2±0,6
0,042
rs2270915‡
1,6±0,7
0,025
√
‡ Pour l’addition d’un allele mineur allele (par exemple C, G et G pour rs6889608, rs1173773,
rs2270915, respectivement).
130
Les sujets porteurs de l’allèle G pour rs1173773 avaient des PAS plus élevées
que les homozygotes AA (138,8 ± 19,7 vs 136,9 ± 18,6 mmHg, p ajusté
=0,021). Les sujets porteurs de l’allèle G pour rs1173773 avaient des PAS plus
élevées que les homozygotes AA (139,7 ± 20,1 vs 137,4 ± 18,6 mmHg, p
ajusté =0,021).
d) Interaction des variants du NPR3 sur la relation UNa-PAS
Nous n’avons pas mis en évidence d’interaction des variants du NPR3 sur la
relation entre UNa et la PAS (p=0,93, p=0,73 et p=0,34 pour rs6889608,
rs1173773 et rs2270915 respectivement). La Figure suivante propose une
représentation de la PAS en mmHg en fonction des tertiles d’UNa et des
génotypes de chacun des trois SNP.
170
160
rs1173773
PAS (mmHg)
150
140
Homozygotes AA
Porteurs allèle G
130
120
110
100
T1_UNa
T2_UNa
T3_UNa
170
160
rs6889608
PAS (mmHg)
150
140
Homozygotes TT
Porteurs allèle C
130
120
110
100
T1_UNa
T2_UNa
T3_UNa
170
160
rs2270915
PAS (mmHg)
150
140
Homozygotes AA
Porteurs allèle G
130
120
110
100
T1_UNa
T2_UNa
T3_UNa
Tertiles de concentration urinaire de sodium
Figure 43 Représentation de la pression artérielle systolique (en mmHg) en fonction des tertiles de
UNa et selon les 3 génotypes du NPR3 des patients caucasiens de l’étude DIAB2NEPHROGENE
(interaction : rs1173773 p=0,73 ; rs6889609 p =0,93 et rs2270915, p=0,34) T1_UNa, T2_UNa et T3_UNa
représentent le tertile inférieur, intermédiaire et supérieur de concentration urinaire de sodium,
respectivement..
131
e) Association de l’excrétion urinaire de sodium avec la pression
artérielle systolique
La moyenne des apports estimés en sel est significativement associée aux
tertiles de UNa (7,7±2,4 vs 9,9±2,4 vs 10,9±2,5 g/j; p<0,0001 pour les 1er, 2e et
3e tertiles de UNa respectivement).
Parmi les 2833 patients DT2 pour lesquels étaient à la fois disponibles la
concentration d’albumine urinaire et le DFGe, 755 (26,7%) présentaient une
IRCT avec un DFGe inférieur à 60 ml/min/1,73m². Dans la population de
DIAB2NEPHROGENE, 1293 patients (45,6%) étaient normo-albuminuriques,
1010 (35,4%) étaient microalbuminuriques et 530 (18,7%) étaient
protéinuriques.
Nous avons montré que plus de 25,8%(n=195) des patients en IRCT étaient
normo-albuminuriques (Figure 44)
Figure 44 Représentation du débit de filtration glomérulaire estimé (en ml/min/1,73m²) en fonction
de la concentration d’albumine urinaire (en mg/l) chez les patients de DIAB2NEPHROGENE à leur
entrée dans l’étude (échelle semi logarithmique)
Les barres verticales correspondent au seuil de 20 et 200 mg/l (à gauche : patients normoalbuminuriques ; au milieu, patients microalbuminuriques ; à droite, patients protéinuriques). La
barre horizontale correspond au seuil de 60 ml/min/1,73m².
132
B. cohorte SURDIAGENE
La cohorte SURDIAGENE est composée de 1467 patients dont 1446 ont
bénéficié d’une évaluation de la UNa. Parmi les 1421 patients caucasiens de la
cohorte, les données de génotypage concernant les rs1173773, rs6889608 et
rs2270915 étaient disponibles pour 1027, 1020 et 963 patients respectivement.
La durée médiane de suivi pour les analyses de survie était de 57 mois
(interquartile 63 mois) pendant lesquels 322 (21,9%) décès sont survenus, dont
193 (13,2%) étaient d’origine cardiovasculaire. Pendant cette période
également, un total de 386 patients (26,3%) a présenté un événement
constituant le critère principal de jugement (CPJ). Considérant individuellement
chacun des évènements composant ce critère, 84 patients (5,7%) ont présenté
un IDM, 67 (4,6%) un AVC, 168 (11,5%) une hospitalisation pour ICC et 41
(2,8%) ont bénéficié d’une prise en charge pour IRCT. Par ailleurs 64 patients
(4,6%) ont présenté un doublement de la créatinine.
Les caractéristiques des patients en fonction de la survenue du CPJ sont
résumées dans le Tableau 14.
Tableau 14 Caractéristiques des variables clinico-biologiques des
SURDIAGENE en fonction de la survenue du critère de jugement principal
patients
de
l'étude
critère principal de jugement
Variables
n
Hommes n(%)
Age (ans)
IMC (kg/m²)
Fumeurs actif n(%)
Survenue pendant
le suivi
Pas de survenue
386
1081
236 (61)
610(56)
0,11
70±10
64±11
<0,0001
19±10
13±10
<0,0001
30,4±6,3
31,5±6,2
26 (7)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
-1
Antécédent d’IDM n(%)
Antécédent d’AVC n(%)
HbA1C (%)
P
127(12)
0,004
0,0005
137,1±19,6
130,7±16,6
<0,0001
72,6±11,4
72,2±10,9
0,54
73,4±12,7
73,5±13,6
98 (26)
123 (11)
<0,0001
31 (8)
50 (5)
0,013
7,9±1,5
7,0±1,6
0,027
0,84
61,2 (43,0)
80,5 (32,0)
<0,0001
77 (539)
19(54)
<0,0001
77,6±38,1
92,3±41,8
<0,0001
332 (86)
741 (69)
<0,0001
dont IEC n(%)
176 (46)
369 (34)
<0,0001
dont ARA2 n(%)
102 (26)
295 (27)
0,69
dont Inhibiteurs calciques n(%)
166 (43)
294 (27)
<0,0001
dont Bétabloquants n(%)
141 (49)
355 (33)
0,22
dont Diurétiques n(%)
223 (58)
442 (41)
<0,0001
EUA (mg/l)
UNa (mmol/l)
Traitement par antihypertenseur n(%)
133
L’association des variables clinico-biologiques avec avec la survenue de CPJ
ou de décès cardiovasculaire est présentée dans le Tableau 15.
Tableau 15 Association des variables clinico-biologiques avec le risque de mortalité
cardiovasculaire dans la population des patients de l’étude SURDIAGENE (analyse de Cox
univariée)
Mortalité
cardiovasculaire
Critère principal
de jugement
Variables prédictrices
HR (IC95%)
P value
HR (IC95%)
P value
Sexe masculin
1,30 (1,06-1,60)
0,012
1,17 (0,87-1,55)
0,30
Age (ans)
1,06 (1,05-1,07)
<0,0001
1,08 (1,06-1,09
<0,0001
1,04 (1,03-1,05)
<0,0001
1,04 (1,03-1,06)
<0,0001
IMC (kg/m²)
0,98 (0,96-0,99)
0,024
0,99 (0,93-1,01)
0,32
Fumeur:
0,58 (0,39-0,87)
0,008
0,66 (0,39-1,14)
0,14
PAS (mmHg)
1,01 (1,01-1,02)
<0,0001
1,01 (1,00-1,02)
0,002
PAD (mmHg)
1,00 (0,99-1,01)
0,84
1,00 (0,98-1,01)
0,69
1,00 (0,99-1,01)
0,85
1,00 (0,98-1,01)
0,52
Antécédent d’IDM (oui/non)
1,88 (1,30-2,71)
<0,0001
2,29 (1,67-3,15)
<0,0001
Antécédent d’AVC (oui/non)
1,88 (0,96-1,09)
0,0008
1,72 (1,02-2,91)
0,044
-1
HbA1C (%)
1,02 (0,96-1,09)
0,55
0,96 (0,87-1,05)
0,38
0,07 (0,05-0,10)
<0,0001
0,11 (0,07-0,17)
<0,0001
EUA (mg/l)
2,13 (1,90-2,39)
<0,0001
2,06 (1,76-2,42)
<0,0001
0,990 (0,987-0,993)
<0,0001
0,989 (0,985-0,993)
<0,0001
2,08 (1,70-2,54)
<0,0001
3,30 (2,08-5,24)
<0,0001
dont IEC
1,55 (1,27-1,90)
<0,0001
1,56 (1,18-2,08)
0,002
dont ARA2
1,10 (0,88-1,38
0,41
1,16 (0,84-1,59)
0,37
dont Inhibiteurs calciques
1,80 (1,47-2,21)
<0,0001
1,85 (1,40-2,46)
<0,0001
dont Bétabloquants
1,29 (1,05-1,59)
0,017
1,13 (0,84-1,52)
0,44
dont Diurétiques
2,08 (1,70-2,55)
<0,0001
2,37 (1,77-3,18)
<0,0001
UNa (mmol/l)
Traitement par antihypertenseur
a) Association de l’UNa avec les événements cardiovasculaires et
rénaux
La concentration urinaire de sodium était associée à la survenue du CPJ
composite ainsi qu’aux décès cardiovasculaires et aux décès toutes causes
(p<0,0001 pour chaque). Ces résultats n’étaient pas modifiés après ajustement
sur l’âge, le sexe, la fonction rénale (DFGe) dans un modèle de Cox.
Comme le montre la Figure 45, la concentration urinaire de sodium était
significativement et négativement associée avec la survenue de CPJ
(logrank=46,2 ; p <0,0001).
134
Survie Cumulée sans
évènements cardiovasculaires majeurs
1
,8
,6
tertile inférieur UNa
tertile intermédiaire UNa
,4
tertile supérieur UNa
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 45 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans critère principal de jugement en
fonction des tertiles d’UNa (logrank=46,2 ; p<0,0001)
Après ajustement sur l’âge à l’inclusion, le sexe et le DFGe et le niveau d’EUA,
l’UNa restait significativement associée avec l’incidence cumulée du CPJ
(Tableau 16).
Tableau 16 Variables clinico-biologiques associées avec la survenue du critère principal de
jugement chez les patients de l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox)
Hazard Ratio
IC95%
P value
0,77
0,62-0,95
0,015
Age à l’inclusion (pour un incrément de 1an)
1,05
1,04-1,07
< 0,0001
DFGe *
0,34
0,21-0,54
< 0,0001
EUA *
1,77
1,55-2,01
< 0,0001
0,990-0996
< 0,0001
UNa (pour un incrément de 1mmol/l)
0,993
* log-transformation par la fonction pour normalisation
L’intégration des variables PAS, antécédent d’IDM et traitement par un
médicament antihypertenseur dans le modèle de Cox précédent ne modifiait
pas la significativité de l’association de UNa avec la survenue de CPJ
(HR=0,993 ; IC95%=0,991-0,997 ; p<0,0001).
En prenant en considération comme variable d’ajustement le traitement par
diurétiques comme le reflet d’une insuffisance cardiaque chronique(qui peut
être associée à une réduction des apports sodés) dans l’analyse de survie en
modèle de Cox, l’association du sodium urinaire n’est pas modifiée en ce qui
concerne le CPJ (p< 0,0001) ou les décès cardiovasculaires (p=0,0002).
Il n’y avait d’interaction significative ni du traitement par bloqueur du SRA ni du
traitement antihypertenseur (quelle que soit sa classe) sur la relation entre UNa
et mortalité cardiovasculaire (interaction p=0,52 et p=0,08 respectivement). Il
n’y avait pas non plus d’interaction significative du traitement par bloqueur du
SRA sur la relation UNa et CPJ (interaction p=0,99).
135
Toutefois, il existait une interaction significative du traitement antihypertenseur
(quelle que soit sa classe) sur la relation UNa et CPJ (interaction p=0,0496).
Dans le sous groupe des patients traités par antihypertenseur (n= 1056 patients
/322 CPJ [30,5%]) une concentration plus élevée d’UNa était significativement
associée avec un risque de survenue du CPJ significativement plus bas
(HR=0,989 ; IC95%=0,986-0,992 ; p<0,0001). Dans le sous groupe des patients
sans traitement antihypertenseur (n=378 patients/75 CPJ [19,8%]) cette
association disparaissait (p=0,38).
Nous nous sommes intéressés plus spécifiquement aux évènements
composant le CPJ les plus dépendants de la PAS (l’hospitalisation pour ICC et
l’AVC, par rapport à l’IDM ou le décès cardiovasculaire).
Nous avons montré également dans les analyses de survie par méthode de
Cox ajustée sur l’âge, le sexe, le DFG et l’EUA, que la survenue
d’hospitalisation pour ICC et la survenue d’IRCT étaient significativement moins
fréquentes chez les patients ayant des concentrations d’UNa plus élevés
(p<0,0001 et p=0,012 respectivement). Toutefois, nous n’avons pu montrer
d’association ni de la survenue d’IDM ni celle d’AVC avec UNa (p=0,13 et
p=0,42 respectivement).
Survie Cumulée
sans décès cardiovasculaire
Les patients du tertile inférieur d’UNa (< 69 mmol/l) avaient les incidences
cumulées de décès cardiovasculaires (Figure 46) et de décès toutes causes les
plus élevées.
1
,8
tertile inférieur UNa
,6
tertile intermédiaire UNa
tertile supérieur UNa
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 46 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans décès cardiovasculaire en fonction
des tertiles d’UNa (logrank=25,0 ; p<0,0001)
La concentration urinaire de sodium plus basse restait significativement
associée avec la mortalité cardiovasculaire dans un modèle de Cox multivarié
avec ajustement sur l’âge, le sexe, le DFGe et l’EUA (HR=0,992 ;
IC95% =0,988-0,996 ; p=0,0001). Les données de cette analyse sont
présentées dans le Tableau 17.
136
Tableau 17 Risque proportionnel (hazard ratio) de décès cardiovasculaires en fonction de variables
clinico-biologiques dans la population des patients de l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox
multivariée)
Hazard Ratio
IC95%
P value
0,822
0,607-0,113
0,21
Age (pour un incrément de 1 an)
1,074
1,056-1,093
<0,0001
DFGe *
0,520
0,276-0,981
0,044
EUA *
1,790
1,487-2,156
< 0,0001
UNa (pour un incrément de 1 mmol/l)
0,993
* log-transformation des données pour normalisation
0,989-0,997
0,0008
L’intégration des variables PAS, antécédent d’IDM et traitement par un
médicament antihypertenseur dans le modèle de Cox précédent ne modifiait
pas la significativité de l’association de UNa avec la mortalité cardiovasculaire
(HR ajusté=0,993 ; IC95% =0,989-0,998 ; p=0,0021).
Concernant le risque de mortalité toutes causes, les sujets avec des
concentrations d’UNa plus élevées présentaient un risque diminué (y compris
après ajustement sur l’âge, le sexe, le DFGe et l’EUA, la PAS, antécédent
d’IDM et traitement par un médicament antihypertenseur) : HR ajusté pour un
incrément de 1 mmol/l : 0,994 (IC95% : 0,991-0,997; p=0,0001) mais pas pour
le CPJ (p=0,13).
137
b) Impact des variants du NPR3 sur la survenue d’événements
cardiovasculaires et rénaux
Dans le sous-groupe des patients caucasiens caucasiens qui représentaient la
majorité de la population étudiée (n=1419/1467), les données de génotype
étaient disponibles pour les rs1673773, rs6889608 et rs2270915, chez 1013,
1006 et 949 patients respectivement. Les distributions des génotypes étaient en
HWE pour tous les SNP sauf pour le rs6889608 (p=0,023). Les allèles mineurs
et leur fréquences étaient C, 21,96%, G, 32,72%et G 21,50%pour rs6889608,
rs1673473 et rs2270915 respectivement
Dans le sous-groupe des caucasiens, 375 patients (26,4%) ont présenté un
CPJ, 188 (13,2%) ont présenté un décès de cause cardiovasculaire, 83 (5,8%)
ont présenté un IDM, 64 (4,5%) un AVC, 164 (11,5%) une hospitalisation pour
ICC et 39 patients (2,7%) ont été pris en charge pour IRCT. Par ailleurs, 61
patients (4,3%) ont présenté un doublement de la créatinine.
Parmi les patients caucasiens, seul rs6889608 était associé avec la survenue
de complications. On rappelera que les sujets CC avaient des valeurs de PAS
plus basses.
Survie cumulée
sans évènement cardiovasulaire majeur
Les patients porteurs de l’allèle T pour rs6889608 présentait une incidence
cumulée significativement plus basse que les patients homozygotes CC pour la
survenue du CPJ (logrank=9,3; p=0,0023 [Figure 47]).
1
,8
,6
Homozygotes CC
Porteurs de l'allèle T
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
fonction des génotypes du rs6889608 chez les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE
(logrank=9,3; p=0,0023)
Les patients porteurs de l’allèle T présentaient également moins de décès
toutes causes que les patients homozygotes CC (logrank=6,3; p=0,013) (Figure
48) et moins de décès cardiovasculaires même si pour ce dernier la différence
n’atteignait pas le seuil de significativité (logrank=3,7; p=0,055).
138
Survie Cumulée
sans décès toutes causes
1
,8
,6
Homozygotes CC
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 48 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans décès toutes causes en fonction
des génotypes du rs6889608 chez les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE (p=0,013)
Le groupe de patients porteurs de l’allèle T pour rs6889608 présentait
également une incidence cumulée significativement plus basse que les patients
homozygotes CC pour la survenue d’AVC (logrank=5,9; p=0,016 [Figure 49]) et
celle d’hospitalisation pour ICC (logrank=4,2; p=0,040).
Survie Cumulée sans AVC
1
,8
,6
Homozygotes CC
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 49 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans accident vasculaire cérébral en
fonction des génotypes du rs6889608 chez les patients caucasiens de l’étude SURDIAGENE
(logrank=5,9; p=0,016)
Il n’y avait pas de différence entre les porteurs de l’allèle T et les homozygotes
CC pour ce qui concerne la survenue d’IDM (logrank=0,2; p=0,63) ou d’IRCT
(logrank=9,3; p=0,42) avec cependant une puissance plus faible liée au plu
faible nombre d’évènements.
Après ajustement dans un modèle de Cox multivarié (sur l’âge, le sexe, la PAS,
l’UNa, et l’EUA) et en utilisant la méthode de Bonferroni pour tests multiples, les
patients homozygotes CC pour rs6889608 présentaient un risque
significativement plus élevé de décès toutes causes, du CPJ et d’AVC que les
sujets porteurs de l’allèle T (Tableau 18).
139
Tableau 18 Association du rs6889608 avec le risque de survenue d‘évènements chez les patients
de l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox ajusté pour le sexe, l’âge, la PAS, l’EUA et l‘UNa)
Risque*
Hazard Ratio
IC95%
P value
Critère principal de jugement
1,78
1,20-2,62
0,0037
Décès toutes causes
1,71
1,11-2,62
0,0037
1,10-6,13
0,0030
Accident vasculaire cérébral
2,60
*modèle additif : pour l’addition d’un allèle mineur allèle C
L’ajout forcé du DFGe dans le modèle en complément des 5 covariables
précédentes faisait cependant perdre la significativité des associations avec le
rs6889608.
c) Interaction des variants du NPR3 sur la relation entre UNa et les
événements cardiovasculaires et rénaux
Nous n’avons pas mis en évidence d’interaction des variants du NPR3 sur la
relation entre UNa et le CPJ.
Toutefois, il existait une interaction du variant rs6889608 sur la relation entre
UNa et la mortalité toutes causes (p interactions=0,013). Il existait une relation
inverse entre UNa et mortalité toutes causes chez les 946 porteurs de l’allèle T,
y compris après ajustement sur l’âge, le sexe, la PAS, l’EUA et le DFGe,
(HR=0,993 ; IC95%=0,989-0,996 p<0,0001) alors que cette association n’était
pas significative chez les 60 patients homozygotes CC (HR=1,00; IC95%=0,981,01 p=0,49).
140
C. cohorte DIABHYCAR
La population de l’étude DIABHYCAR, dans laquelle les données génétique
sont disponibles, est composée de 3413 patients. Les caractéristiques des
patients à l’inclusion ont déjà été décrites par Hadjadj et al.378. La médiane de
suivi était de 56 mois, pendant lesquels 541 patients ont présentés un CPJ
(15,9%) et 228 patients ont présenté un décès de cause cardiovasculaire
(6,7%). Par ailleurs, 104 patients (3,0%) ont présenté un IDM, 174 (5,1%) un
AVC, 150 (4,4%) une hospitalisation pour ICC et 31 (0,6%) ont bénéficié d’une
prise en charge pour IRCT.
Les données des génotypages étaient disponibles de 3122 patients pour les
rs1373773 et rs6889608 ainsi que chez 3105 patients pour le rs2270915. Les
fréquences des génotypes étaient en HWE pour l’ensemble des trois SNP. Les
allèles mineurs et leurs fréquences étaient C, 26,2%; G, 33.18%et G,
20,47%pour rs6889608, rs1673473 et rs2270915 respectivement.
Impact des variants du
NPR3
sur
la
survenue
d’événements
Dans le suivi de l’étude DIABHYCAR, nous n’avons pas mis en évidence
d’association significative entre les variants NPR3 (modèle additif) et le risque
de survenue du CPJ (p=0,29, p=0,91 et p=0,95 pour rs6889608, rs1173473 et
rs2270915 respectivement) ni le risque de décès cardiovasculaire (p=0,22,
p=0,20 et p=0,82 respectivement). Considérant un modèle dominant pour les
génotypes, l’association entre les variants et le CPJ n’était pas modifiée. Les
évènements qui composent le CPJ (IDM, AVC, hospitalisation pour ICC, prise
en charge pour IRCT) n’étaient pas non plus individuellement associés
significativement avec aucun des SNP (modèle additif ou modèle dominant).
Il n’y a donc pas de réplication de l’association mise en évidence dans SDG
dans la cohorte DBH, même si nous ne disposons pas des données de
concentration urinaire de sodium qui pourraient moduler ce résultat.
141
DISCUSSION
Nous avons montré dans une analyse transversale de plus de 1390 patients
DT2, que les apports sodés (estimés par la concentration urinaire de sodium)
étaient associés positivement à la PAS. Nous avons également confirmé, sur
un nombre plus réduit de sujets, nos résultats précédemment publiés379
montrant que les patients caucasiens porteurs de l’allèle mineur G des variants
rs1173773 ou rs2270915 présentaient des PAS significativement plus élevées
après ajustement sur l’âge, le sexe et l’IMC (p=0,037 et p=0,021
respectivement).
Nous n’avons pas mis en évidence d’interaction de type GxE des variants du
NPR3 sur la relation entre UNa et PAS.
Dans notre 1ère cohorte, les patients porteurs de l’allèle G du rs22709115
(identifié comme allèle à risque de PAS plus élevée et de moindre sensibilité
pressive à la réduction sodée) ou du rs1173773 ne présentent pas, après
ajustement sur les facteurs de risque vasculaire, d’augmentation de morbimortalité cardiovasculaire et rénale dans le suivi. A contrario, les patients
homozygotes CC pour le rs6889608 présentaient un risque significativement
plus élevé de complications à type de décès toutes causes, du CPJ et d’AVC.
Nous n’avons pas mis en évidence d’interaction de type GxE du rs6889608 sur
la relation UNa et mortalité toutes causes qui sont significativement associés
chez les porteurs de l’allèle T et pas chez les homozygotes CC.
Nous n’avons, toutefois, pas pu répliquer ces résultats dans une 2e cohorte de
plus de 3100 patients DT2 suivis prospectivement dans laquelle nous ne
disposons pas d’information quant au niveau d’UNa.
Les patients de SURDIAGENE et DIAB2NEPHROGENE présentaient un
niveau d’exposition au sel élevé puisque plus de 90% des patients avaient des
apports quotidiens supérieurs aux recommandations de 6g/j380. Cela confirme la
nécessité d’application des politiques de santé publique sur l’adaptation des
apports nutritionnels, notamment chez les populations à risque381.
Chez ces patients, nous avons montré que les apports sodés les plus
importants étaient associés à une moindre survenue de décès cardiovasculaire
ou du CPJ malgré des PAS plus élevés.
Nous avons mis en évidence une interaction GxE du rs6889608 sur le risque de
décès toutes causes. Les patients porteurs de l’allèle T avaient un risque
significativement augmenté de mortalité en cas de sodium urinaire plus bas
Chez les homozygotes CC, UNa n’était pas associée à la mortalité toutes
causes.
Un des points forts de nos études observationnelles réside dans le couplage
des approches transversales et prospectives. Le recul de 6 811 patients.années
dans SURDIAGENE offre une puissance suffisante pour détecter des facteurs
de risque associés de façon modérée aux complications. Par ailleurs, un comité
d’adjudication indépendant a évalué les évènements du suivi pendant lequel
322 patients sont décédés et 386 ont présenté un CPJ non fatal.
L’évaluation de l’exposition sodée a été mesurée sur un échantillon urinaire ce
qui permet d’avoir une estimation plus précise que par des enquêtes
142
nutritionnelles. Par ailleurs, les données sur les habitudes alimentaires de nos
patients ne sont, actuellement, pas exploitables ce qui limite notre
compréhension des apports sodés au regard des apports énergétiques et
nutritionnels des patients DT2.
Il est à noter, toutefois, certaines limites pour ce qui concerne notre approche
méthodologique qui n’intègre pas la notion de risques compétitifs pour des
évènements qui peuvent s’exclure mutuellement.
Nos résultats sont en cohérence avec des travaux montrant une élévation de la
morbi-mortalité chez des patients à apport sodé plus faible en population
générale382 et chez des sujets DT2383 ou hypertendus384. Ils ne s’accordent
toutefois pas avec des résultats récents385, y compris dans le DT1386, qui
proposent une relation séduisante de type « courbe en J » entre les apports
sodés et les maladies cardiovasculaires. Les hypothèses physiopathologiques
avancées pour soutenir nos résultats mettent en jeu l’insulinorésistance387 et le
système nerveux autonome388. Nous n’avons, toutefois, pas les outils pour
tester la 1ère hypothèse dans nos populations d’études. La 2e hypothèse n’est
pas satisfaisante compte tenu du fort niveau d’exposition au sel de nos
populations qui ne permet pas l’activation du système nerveux autonome.
Par ailleurs, les résultats génétiques confirment l’importance des variants
NPR3, aux côtés des autres acteurs du système des peptides natriurétiques,
dans l’héritabilité de la pression artérielle et de ses complications associées qui
ont déjà été identifiées dans des GWAS389,390. Un score de risque génétique
(basé sur 29 variants génétiques dont un dans le NPR3) issu de ces études
pangénomiques, a été utilisé pour confirmer que la prédisposition génétique de
l’augmentation de la pression artérielle était associée à une augmentation du
risque cardiovasculaire dans deux populations indépendantes de sujets DT2391.
Dans nos résultats, l’augmentation de 70-80% du risque de survenue de CPJ
ou de mort toutes causes conférée par le rs6889608 correspond bien à la force
de l’association attendue entre un variant génétique et les complications du
DT2.
La causalité du niveau d’exposition sodée sur le risque de complications ne
faisait pas partie des objectifs de notre étude. Elle n’a pas été évaluée, à notre
connaissance, par des essais cliniques randomisés chez des sujets
diabétiques, même si des données sont disponibles dans des populations de
patients hypertendus392 ou insuffisants cardiaques393,394. Il serait intéressant de
tester nos hypothèses génétiques dans ces populations.
En résumé, nous avons montré que le variant rs2270915 du NPR3 est un allèle
de risque de pression artérielle plus élevée et de moindre sensibilité pressive à
la réduction sodée mais qu’il ne conférait pas d’augmentation significative de
risque d’évènements cardiovasculaires (ECV) contrairement au rs6889608. En
complément, la survie sans CPJ est significativement modulée par les apports
en sel. Le risque de morbi-mortalité est réduit chez les sujets DT2 consommant
le plus de sel malgré un niveau de PA plus élevé.
Une partie des résultats présentés ici a été soumise en résumé au congrès
2013 de la SFD.
143
RESUME soumis au congrès de la Société Francophone du Diabète 2013
Apports sodés, gène du récepteur de clairance des peptides
natriurétiques (NPR3) et complications cardiovasculaires chez
des sujets diabétiques de type 2
Pierre-Jean SAULNIER1,2, Ronan ROUSSEL3,4,5, Jean Michel HALIMI6, Dured
DARDARI7, Bruno GUERCI8,9,10, Pierre GOURDY11 Olivier DUPUY 12, Odile
VERIER-MINE 13, Frédérique RACHEDI 14, Anne SECHET15, Gérard
GUILLOTEAU16, Richard MARECHAUD2,17, Philippe SOSNER2,18, Stephanie
RAGOT1,2, Michel MARRE3,4,5, Samy HADJADJ1,2,10,11, pour les groupes
d’études SURDIAGENE, DIAB2NEPHROGENE & DIABHYCAR
1
Centre d’investigation clinique, Inserm CIC0802, CHU de Poitiers, Poitiers, France.
Université de Poitiers, Poitiers, France.
3
Inserm U695, Paris, France.
4
Universite Paris 7 Denis Diderot, Paris, France.
5
Service d’Endocrinologie, diabétologie, nutrition, Groupe Hospitalier Bichat Claude Bernard, Assistance
Public-Hopitaux de Paris (AP-HP), Paris, France.
6
Centre d’investigation clinique, Inserm CIC0202, Service de Néphrologie, CHU de Tours, Tours, France.
7
Service d’Endocrinologie, CH Sud Francilien, Corbeil Essonnes, France.
8
CHU de Nancy, Service de Diabétologie, maladies métaboliques et nutrition, Vandoeuvre-Les-Nancy,
France
9
Inserm, CIC9501 I, Vandoeuvre-Les-Nancy, France
10
Université Nancy, Centre d’investigation Clinique, Vandoeuvre-Les-Nancy, France
11
CHU de Toulouse, Service de Diabétologie, Maladies Métaboliques et Nutrition, Pôle Cardio Vasculaire
et Métabolique, Toulouse, France
2
144
12
Hôpital d’Instruction des Armées Bégin, Service d’endocrinologie, diabétologie et maladies
métaboliques, F- 94160 Saint-Mandé, France
13
CH Valenciennes, Service d’Endocrinologie, Valenciennes, France
14
Centre Hospitalier de Polynésie française, Service d’Endocrinologie, Pirae, Tahiti. France
15
CH de Niort, Service de Néphrologie, Niort, France
16
CHU d’Angers, Service d’Endocrinologie Diabétologie Nutrition, Angers, France
17
Service de Médecine interne, endocrinologie et maladies métaboliques, CHU de Poitiers, Poitiers,
France.
18
Centre de prévention des maladies cardiovasculaire, Service de Cardiologie, CHU de Poitiers, Poitiers,
France.
19
Inserm U1082, Poitiers, France.
OBJECTIF – Le système des peptides natriurétiques intervient dans le
métabolisme du sodium et la régulation de la pression artérielle. Nous avons
cherché, si en fonction de l’excrétion sodée, des polymorphismes du gène
NPR3 (récepteur de clairances des peptides natriurétiques), influençaient la
pression artérielle systolique (PAS) et le risque de survenue de complications
cardiovasculaires et rénales chez des patients diabétiques de type 2 (DT2).
MATERIELS ET METHODES –Trois polymorphismes du NPR3 ont été
génotypés chez des sujets DT2 issus d’une étude transversale
(DIAB2NEPHROGENE n=2887) et de deux cohortes indépendantes
(SURDIAGENE n=1467 et DIABHYCAR n=3413). Nous avons évalué
l’influence de ces SNP sur la relation entre PAS, sodium urinaire et survenue de
complications (critère principal de jugement combiné : mort cardiovasculaire,
infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral, hospitalisation pour
insuffisance cardiaque ou épuration extrarénale).
RESULTATS –Dans DIAB2NEPHROGENE, nous avons confirmé que la
concentration urinaire de sodium était associée avec des valeurs de PAS
significativement plus élevées. Dans SURDIAGENE, la concentration de
sodium urinaire était inversement associée avec la survenue du critère principal
de jugement (RR ajusté pour un incrément de 10 mmol/l : 0.93 [IC95% : 0.900.96 ; p<0.0001]) .Le SNP rs6889608 interagissait sur cette relation (p
interaction= 0.013). Par ailleurs, les patients homozygotes CC pour ce SNP
présentaient plus souvent le critère principal de jugement (RR ajusté 1,78
[IC95% : 1,20-2,62; p=0.0037]) indépendamment de la PAS et l’excrétion
sodée. Dans DIABHYCAR, le rs6889608 ne s’associe pas avec le critère
principal de jugement mais l’information sur l’excrétion urinaire de sodium n’est
pas disponible.
CONCLUSION – La survie sans événement cardiovasculaire était
significativement modulée par l’excrétion urinaire de sodium avec un risque
réduit chez les sujets DT2 excrétant plus de sel malgré un niveau de pression
artérielle plus élevé. Le rs6889608 du NPR3 interagit sur cette relation.
145
2. Impact des polymorphismes du gène de
l’AROMATASE sur le niveau des hormones
sexuelles et les complications du DT2
Nous avons dans un premier temps étudié l’effet de variants du CYP19A1 sur
les concentrations de stéroïdes sexuels et la prévalence de la ND dans la
population masculine de DIAB2NEPHROGENE.
Ce travail a été soumis pour publication dans le journal Diabetologia.
Nous avons ensuite compléter nos travaux évaluant l’influence de ces SNP sur
la relation entre de stéroïdes sexuels et survenue de complications
cardiovasculaires et rénales dans le suivi des sujets masculins de l’étude
SURDIAGENE.
2.1.
146
Article soumis à Diabetologia
ABSTRACT
AIMS - The sexual dimorphism of the risk for nephropathy in diabetes is wellestablished. Although poorly understood, it is suspected to be related to sex
steroids. We studied whether serum sex steroid concentrations were related to
diabetic nephropathy in male type 2 diabetic patients, and then applied a
targeted candidate-gene approach to the aromatase gene.
RESEARCH DESIGN AND METHODS - Sex Hormone Binding Globulin
(SHBG), testosterone (T) and estradiol (E2) were assayed and free T and free
E2 concentrations calculated in male patients with type 2 diabetes and
nephropathy (cases, n=578) and diabetic long-term normoalbuminuric controls
with normal renal function (controls, n=238). A case-control approach was used
to study 21 SNPs in the aromatase gene (CYP19A1).
RESULTS- SHBG, T and free T did not differ between cases and controls. E2
values were higher in cases than controls (100.9 vs. 92.8 pmol/L, P = 0.001).
This difference persisted in multivariate analysis after adjustment for BMI, age,
estimated glomerular filtration rate and systolic blood pressure.
As suggested by this hormonal profile, we explored CYP19A1 SNPs for their
relationship with E2 and diabetic nephropathy. In Caucasian patients, none of
the SNPs was associated with either nephropathy or E2 concentration, as
assessed by studying either genotype or haplotype.
CONCLUSIONS - E2 was independently associated with diabetic nephropathy
whereas SNPs in CYP19A1 did not correlate with renal disease.
147
IMPACT OF SEX HORMONES AND OF AROMATASE GENE
POLYMORPHISMS ON DIABETIC NEPHROPATHY IN TYPE 2 DIABETES.
Pierre-Jean Saulnier1,2,3, Pierre Gourdy4, Yves Gallois5, Stéphanie Ragot1,2,3,
Guillaume Charpentier6, Gérard Guilloteau7, Bruno Guerci8,9,10, Ronan
Roussel11,12,13, Pierre Lecomte 14, Olivier Dupuy 15, Odile Verier-Mine 16,
Frédérique Rachedi 17, Anne Sechet18, Richard Marechaud 19, Michel
Marre13,20,21, Samy Hadjadj1,2,3,19,22 for the DIAB2NEPHROGENE study group.
INSERM, CIC0802, F-86021 Poitiers, France
CHU de Poitiers, Centre d’investigation Clinique, F-86021 Poitiers, France
3
Université de Poitiers, Centre d’investigation Clinique CIC0802, F-86021 Poitiers,
France.
4
CHU de Toulouse, Service de Diabétologie, Maladies Métaboliques et Nutrition, Pôle
Cardio Vasculaire et Métabolique, F-31059 Toulouse, France
5
CHU d’Angers, Service de Biochimie et biologie moléculaire, F-49933 Angers, France
6
CH Sud Francilien, Service d’Endocrinologie Diabétologie, F-91106 CorbeilEssonnes, France
7
CHU d’Angers, Service d’Endocrinologie Diabétologie Nutrition, F-49933 Angers,
France
8
CHU de Nancy, Service de Diabétologie, maladies métaboliques et nutrition, F-54511
Vandoeuvre-Les-Nancy, France
9
INSERM, CIC9501 I, F-54511 Vandoeuvre-Les-Nancy, France
10
Université Nancy, Centre d’investigation Clinique F-54511 Vandoeuvre-Les-Nancy,
France
11
Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMR 738, F-75018 Paris, France
12
INSERM, UMR872, Equipe 2, Centre de Recherche des Cordeliers, F-75006 Paris,
France
13
AP-HP, Hôpital Bichat, Service de Diabetologie Endocrinologie Nutrition, F75018Paris, France
14
CHRU de Tours, Unité d’Endocrinologie, Nutrition, Diabétologie, F-37000 Tours
France
15
Hôpital d’Instruction des Armées Bégin, Service d’endocrinologie, diabétologie et
maladies métaboliques, F- 94160 Saint-Mandé, France
16
CH Valenciennes, Service d’Endocrinologie, F-59300 Valenciennes, France
17
Centre Hospitalier de Polynésie française, Service d’Endocrinologie, Pirae, Tahiti.
France
18
CH de Niort, Service de Néphrologie, F79000 Niort, France
19
CHU de Poitiers, Service de Médecine interne, endocrinologie et maladies
métaboliques, F-86000Poitiers, France
20
INSERM, U695, F-75018 Paris, France;
21
Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMRS 695, UFR de Médecine Site
Bichat, F-75018 Paris, France;
22
INSERM U1082 , Poitiers, F-86000, France
1
2
Abbreviated title: sex steroids, CYP19A1 and diabetic nephropathy
Keywords: diabetes, nephropathy, sex steroid, aromatase, polymorphism
Word count: 3012 words (abstract, 214); 3 Tables 1 Figure
(Supplementary material: 5 Tables and 3 figures).
148
INTRODUCTION
Diabetic nephropathy (DN) is a complex disease which is now frequent in
westernized countries (1; 2). Its prevalence has consistently increased due to
the “epidemic” of type 2 diabetes, with a large proportion of patients reaching
end stage renal disease (40%) affected by the condition. Several risk factors
have been identified, including glucose control and blood pressure, but also
gender: the risk for DN in type 1 and in type 2 diabetes is approximately 50%
higher for men than women (3-5). How gender affects DN is still poorly
understood; the higher prevalence of smokers among men and the overall a
greater risk of macrovascular disease in men than in women may be involved.
However, it is widely suggested that the gender effect may be related to sex
steroids.
In atherosclerosis, which is epidemiologically related to glomerulosclerosis,
there is an unexpected relationship between sex steroids and clinical outcome.
Although high testosterone (and low estradiol) concentrations were expected to
be related to a pro-atherosclerotic profile, it has been shown that the lower the
serum testosterone concentration, the worse the clinical outcomes (6-9)
Several key effectors in the sex steroid pathway are good candidates for
involvement in DN. In addition to sex steroids per se, estradiol receptor genetic
polymorphisms are associated with DN risk in type 2 diabetes (10). Aromatase
is a key enzyme in the regulation of sex steroids; the activity of the enzyme
directly affects estradiol and testosterone levels (11; 12), as it catalyses the
conversion of androgens (androstenedione and testosterone [T]) to estrogens
(estrone and 17-estradiol [E2], respectively)(13). Aromatase is encoded by the
CYP19A1 gene, and aromatase activity differs according to the genetic variant
of CYP19A1 present (14).
Although putative targets in DN, few studies have studied the relationship
between sex steroids and DN in humans. The available data suggest that
plasma estradiol concentrations are higher in type 1 diabetes patients with DN
than in type 1 patients without long-term renal complications (15). However, no
such data have been reported to date for type 2 diabetes patients. In addition, it
is unknown whether genetic polymorphisms affecting sex steroids are involved
in the pathogenesis of renal complications in type 2 diabetes patients.
We therefore aimed to assess the relationship between sex steroid
concentrations and DN in type 2 diabetes. We first used a large case-control
cohort to analyze the association between circulating sex steroid concentrations
and DN in male type 2 diabetes. We then applied a candidate-gene approach to
study the association between genetic polymorphisms of CYP19A1 and sex
steroid levels in this population. Finally, we tested whether these genotypes
were associated with DN.
149
RESEARCH DESIGN AND METHODS
Study protocols and subjects
DIAB-2-NEPHRO-GENE study
Briefly, the DIAB2-NEPHRO-GENE (D2NG) study is a French multicenter casecontrol study of type 2 diabetes patients, designed to assess the genetic
determinants of DN in type 2 diabetes (16). Its design was approved by Poitiers
University Hospital Ethics Committee. All participants in the study gave their
written informed consent.
Classification of patients
Type 2 diabetes was defined as an age at diagnosis > 40 and no need for
insulin treatment at least 2 years after diagnosis, or age > 30 at diagnosis and
no need for insulin treatment for at least 5 years.
The following stages of renal involvement were used to define our primary
population:
Cases were type 2 diabetic patients with high urinary albumin ([UAE]≥20 mg/l or
30 mg/24 h in at least two of three independent sterile urine samples) and
diabetic retinopathy. Forty patients with kidney biopsy evidencing diabetic
nephropathy were classified as cases regardless their retinopathy status.
Control subjects were type 2 diabetic patients with urinary albumin <20 mg/l or
30 mg/24h in at least two of three sterile urine samples, who were not receiving
ACE inhibitors and/or angiotensin receptor blockers, and who had diabetic
retinopathy and/or known diabetes duration ≥20 years and estimated glomerular
filtration rate (eGFR)> 60 ml/min.
Polymorphism determination and SNP selection
We searched the Pubmed database using the search terms aromatase,
CYP19A1, association and polymorphism. We selected and analyzed articles
addressing associations between CYP19A1 variants and sex hormone levels,
enzymatic activity or sex steroid-related markers. Of the 24 variants identified in
five articles (17-21), we discarded 4 variants: one was only present in tumoral
tissue, one was a tandem repeat and two were not located in CYP19A1 but in
the gliomedin gene. We genotyped the full set of SNPs with the allele-specific
PCR-based KASPar SNP genotyping system (KBioscience, Hoddesdon, UK):
one SNP (rs12900137) was found to be monomorphic and one failed
(rs2414096); these SNPs were not studied further.
We then identified CYP19A1 linkage disequilibrium (LD) blocks with Haploview
software (22) and available European (CEU and TSI) population data from the
HapMap version 3 release R2 (http://www.hapmap.org) (Supplementary Figure
1). Using the 18 genotyped SNPs we were able to cover all but three LD blocks,
which led us to include in the study one additional SNP for each of these
uncovered blocks (Supplementary Table 1).
Laboratory methods
Blood samples were obtained from patients after an overnight fast, between
7:30 and 10:00 am. In sample from men, serum T, E2 and SHBG levels were
measured by electro-chemiluminescence immunoassay (ECLIA) on a Roche
Modular E170 instrument (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany).
The sensitivity of the assay (limit of quantification) was 0,42 nmol/L, 18.4 pmol/L
and 0,35 nmol/L for T, E2 and SHBG, respectively. Reference ranges were 9.9-
150
27.8 nmol/l, 28-156 pmol/l and 14.5-48.4 nmol/l for total T, total E2 and SHBG,
respectively.
Calculated free T (cfT) and calculated free E2 (cfE2) concentrations in the
serum were computed with Södergdård’s formula (23) from T, E2, SHBG on the
basis of a fixed plasma albumin concentration of 40 g/L.
Serum creatinine and urinary albumin were measured by nephelometry with a
Modular System P (Roche Diagnostics GmbH). Renal function was estimated
by GFR using the Modification of Diet in Renal disease (MDRD-4) formula (24).
Glycated hemoglobin (A1C) was assayed by a high performance liquid
chromatography method with an ADAMS A1C HA-8160 analyzer (normal
values 4.0-6.0%; Menarini, Florence, Italy).
Statistical analysis
Statistical analyses were performed with Statview 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Patient characteristics are expressed as means ± standard deviation (SD) or
medians (interquartile range [IQR]) for skewed distributions. Groups were
compared using the χ² test for categorical variables, or parametric (ANOVA) or
nonparametric (Kruskal-Wallis or Mann-Whitney U tests if not normally
distributed) tests for continuous variables.
Allele frequencies were estimated by the gene-counting method and the HardyWeinberg equilibrium (HWE) was tested with the χ² test.
We used Haploview software to study pairwise LD between CYP19A1
polymorphisms (expressed in terms of the D’ and r² statistics) (22) and selected
tagging SNPs for the haplotype analysis with Thesias software (25). Linear
regression analysis and ANOVA were used to asses linear associations, and
variables presenting skewed distributions were logarithmically transformed.
Case-control associations were tested using PLINK (version 1,07
http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/(26)).
P values <0,05 were considered to be statistically significant.
RESULTS
The study population included 1,652 patients with validated diabetic
nephropathy status (see Figure 1 for the flowchart, and supplementary Table 1
for clinical and biological characteristics). Male gender was a significant risk
factor for DN (χ2: 15.70; p<0,0001), with an OR of 1,51 (95%CI: 1,23-1,85) in
the overall population and 1,43 (95%CI: 1,17-1,79) in the Caucasian
subpopulation. In a backward stepwise multiple regression model, factors found
to be significantly associated with DN were male gender, BMI, SBP, heart rate
and ln-transformed eGFR (P ≤ 0,001).
Sex steroid determinations in male patients
Univariate analysis
The characteristics of the 794 (715 Caucasian and 79 non Caucasian) male
patients with available sex steroid results are presented in Table 1.
SHBG, T, cfT, E2 and cfE2 were significantly correlated with BMI (rho=-0,225,
P<0,0001; rho = -0,240, P < 0,0001; rho = -0,169, P<0,0001; rho=0,141, P =
0,0001; rho = 0,199, P < 0,0001, respectively). We found a significant
correlation between age and T, cfT and SHBG (rho = -0,110, P = 0,0033, rho =
151
-0,26; P < 0,0001 and rho = 0,225, P < 0,0001 respectively) but not with E2 or
cfE2 (P = 0,47 and P = 0,17).
No difference was found between cases and controls for T or SHBG, whereas
total and free E2 values were significantly higher in cases than in controls. The
results were similar for the male Caucasian subpopulation (n=715; data not
shown).
In the 794 male patients with available sex steroid determinations, E2 and cfE2
were associated with diabetic nephropathy stage (P = 0,0046 and P = 0,0018)
whereas T, cfT and SHBG were not (P = 0,21, 0,27 and 0,74, respectively;
Suppl Figure 2).
Sex steroid levels were significantly associated with the severity of renal
impairment (CKD being classified into three groups: eGFR less than 30 ml/min,
30 to 60 ml/min and more than 60 ml/min; Suppl Fig 3).
Multivariate analysis
In male subjects, the association between circulating levels of E2 and DN
persisted in a descending multiple linear regression model after adjusting for
BMI, SBP and ln(eGFR) (Table 2).
Contribution of aromatase genetic polymorphism to E2 levels and DN risk.
SNP selection and genotyping
We restricted our genetic analyses to the 1,447 Caucasian patients of both
sexes. Genotyping success ranged from 97.22% to 99.11%. Allelic frequencies
for all SNPs were very similar to those for the CEU population reported in
HapMap. Genotypic and allelic frequencies did not differ between men and
women. The genotype distribution (supplementary Table 2) was in HWE for all
SNPs except for rs700519 (unadjusted P= 0,02). Pairwise linkage
disequilibrium analysis of CYP19A1 SNPs is available in supplementary Figure
4. In Haploview, focusing on male patients with sex hormones determination,
we identified three LD blocks made of total/tagging SNPs: 10/6, 4/3 and 6/5
SNPs/tags in blocks 1, 2 and 3, respectively.
Aromatase gene, sex steroids and DN
Using a linear regression model under an additive model adjusted for BMI,
ln(eGFR) and DN status, no CYP19A1 polymorphism was associated with E2
concentrations in the male Caucasian population (data not shown). There was
no significant association between any haplotype and E2 levels (supplementary
Table 3, 4 and 5). Adjustment for BMI, eGFR and DN status did not modify this
findings (data not shown).
There was no significant association between any CYP19A1 SNP and DN
status (Table 3). No association was found between DN and CYP19A1
haplotype (data not shown). We found no interaction of any CYP19A1 SNP with
the association between E2 and DN (data not shown).
DISCUSSION
In this cross-sectional study of type 2 diabetes patients, we evidenced that in
male patients there was a significant association between DN and E2 levels, but
not other sex steroids; higher blood E2 titers were associated with more severe
152
status of DN, suggesting a dose-dependent effect. This association between
DN and E2 concentration remained significant after multiple adjustments.
Our data confirm previous reports that male sex is a DN risk factor (3; 27-29).
The magnitude of the association (OR:1.5 ;95% CI: 1.2-1.9) is very close to
what was previously reported both in type 1 (4) and in type 2 diabetes patients
(5). Male patients are a good model for studying sex steroids and diabetic renal
disease because the serum levels of sex hormones show less variability than in
women in both the short and long term.
In male patients with type 2 diabetes, E2 concentrations differed significantly
according to DN status. This has not previously been reported in type 2
diabetes patients, to our knowledge. A recent study in type 1 diabetes patients
examined the relationship between DN and sex steroids: in 300 male type 1
diabetes patients, levels of E2 and cfE2 were associated with DN status and
progression (15), similar to our findings. However, unlike our findings for type 2
diabetes, this previous study also showed that total T was significantly
associated with DN when comparing normo-, micro- and macroalbuminuric
patients. However, no linear “dose-effect” was evidenced: only microalbuminuric
patients had lower T concentrations than normo- and/or macroalbuminuric
patients.
A case-control study revealed an association between estrogen therapy and
increased risk for microalbuminuria in non diabetic women (30). Other authors
identified oral contraceptives as a risk factor for the development of
macroalbuminuria in type 1 diabetes women (31). The association between
estradiol and the modulation of the renin angiotensin system (RAS), a key factor
in DN, as suggested by experimental findings in non diabetic (32) and diabetic
subjects (31) is a possible mechanistic link between estradiol and DN. However,
the possible causality of the E2 level on DN risk has not been studied in a
randomized clinical trial. Hadjadj et al in a randomized controlled trial of type 2
diabetes post-menopausal women demonstrated that a selective estrogen
receptor modulator (SERM) may limit the progression of albuminuria (33).
However, whether raloxifene stimulates or blocks ER in the kidney is completely
unknown. Very little is known about the effects of anti-androgenic drugs on DN
in type 2 diabetes patients.
There are some relevant experimental data from work with male rodents. These
reports suggest that diabetes is associated with an imbalance of sex steroids,
with low T and high E2 concentrations possibly contributing to kidney
involvement (34). Castration of diabetic rats, leading to a small decrease in E2
but a large decrease of the T/E2 ratio, leads to an exacerbation of renal
complications in male rats with streptozotocin-induced diabetes (STZ) (34). The
modulation of sex steroids in males through aromatase inhibition by anastrazole
leads to lower E2 (associated with higher T) titers and less UAE,
glomerulosclerosis (GSI) and tubulointerstitial fibrosis (TIFI) in STZ male rats
than untreated counterparts (35). Whether this beneficial effect is due to a
reduction in E2 or an increase in T is unclear, but the absence of effect of
dihydroT supplementation on DN suggests a specific deleterious effect of E2
rather than a beneficial effect of androgen supplementation (36). SERMs are
also renoprotective and act by suppressing collagen I and IV, and inhibiting
TGF beta expression in murine mesangial cells (37).
153
The hormonal profile revealed in our study led us to study the aromatase gene,
through a Mendelian Randomization approach, as aromatase activity is causally
associated with the plasma E2 concentration (11; 12). We used the ‘Power for
Genetic Association analyses’ program to calculate the power to detect
associations with DN in our sample (38) (http://dceg.cancer.gov/bb/tools/pga):
we could detect an OR from 1.49 to 1.23 for the SNPs (MAF: 5.8 to 49.5%) with
a power of 80% using a co-dominant model, and an OR from 1.55 to 1.25 for
haplotype frequencies from 5.8% to 48.2%.
The definition of cases and controls is critical to this type of cross-sectional
study. Here, cases were defined by the association of persistent elevated UAE
associated with the presence of DR, because DR substantially increases the
probability of diabetic renal disease in albuminuric patients (39; 40).
Additionally, the subjects used as controls were type 2 diabetes patient with
persistent normoalbuminuria (without ACEIs or ARBs) together with either the
presence of DR or diabetes of long duration (over 20 years). The concomitant
presence of DR suggests long exposure to hyperglycemia leading to
microvascular defects (40). However, the threshold of diabetes duration used is
questionable. It is generally accepted that the risk of DN reaches a plateau after
20 years of diabetes (41). In type 2 diabetes, a threshold at 20 years duration
leads to a cumulative incidence of DN that is 10% to 50% higher than that for a
threshold at 10 years (42). Thus, all the controls having a diabetes duration at
20 years or more is one of the strengths of our study.
However, our study also has some limitations. Neither aromatase enzyme
activity nor CYP19A1 expression were studied directly. The enzymatic activity
of CYP19A1 is tissue-dependent. Extraglandular sites for aromatization of T to
E2 include adipose tissue and probably renal tissue as suggested by preclinical
data (43). However, we did not have access to tissues for assaying aromatase
activity and obtaining patient tissue for such studies is unjustifiably high risk.
Blood samples for sex steroid determinations were collected between 7:3010:00 am, to limit the influence of circadian variations. Circannual variations
may potentially have affected our conclusions, but we did not detect any
significantly different in sex steroid levels according to the month or season of
sampling.
In our study, liver function was not quantified as it is believed to decrease
hepatic CYP activity (44). However, as DN does not segregate with liver
dysfunction, it is unlikely that our findings have been substantially affected by a
selection bias
Our experimental design did not include a non-diabetic control group. It is
already known that men with type 2 diabetes exhibit hypogonadism (9; 45)
whereas the relationship with E2 level is much less clear.
Finally, these results must be interpreted with caution because the design of our
study was cross-sectional. Whether or not circulating E2 concentrations are
indeed a major risk factor for DN required further confirmation by studies
involving longitudinal follow-up.
In conclusion, we report that the circulating concentration of E2, but not of T or
SHBG, is independently associated with DN in male type 2 diabetes patients.
We also show that polymorphisms or haplotypes of the CYP19A1 gene coding
154
for the aromatase enzyme did not correlate with diabetic renal disease. The
mechanism underlying the E2-DN association is not clearly established and
requires further investigation.
ACKNOWLEDGEMENTS
The DIAB2NEPHROGENE study was supported by grants from the Ministry of
Health (PHRC-Poitiers 2004), the Association Française des Diabétiques (AFD
Research Grant 2003) and the Groupe d’Etude des Maladies Métaboliques et
Systémiques (GEMMS, Poitiers, France).
We thank all of the patients and physicians who took part in the
DIAB2NEPHROGENE study (see list in Supplementary material).
We thank Cecile Demer (Diabetology Department, CHU de Poitiers, Poitiers,
France) for secretarial help, the staff of the Diabetes Department at Poitiers and
Elodie Rogeon (Inserm CIC0802, Poitiers, France) for their help with data
collection and monitoring, and Sonia Brishoual (Inserm CIC0802, Poitiers,
France) for biological determinations. We are also grateful to Alex Edelman and
Associates (Malakoff, France) for reviewing the manuscript. We thank Frédéric
Fumeron (Inserm U695 and University of Paris 7, Paris France) for his
assistance to this work.
Address all correspondence and requests for reprints to: Pierre-Jean
SAULNIER, Centre d’investigation clinique, Inserm CIC0802, 2 rue de la
Milétrie, CHU de Poitiers ; F-86021 Poitiers Cedex – France, Tel: +33 5 49 44
46 89, Fax: +33 5 49 44 46 91. Email: [email protected]
Authors’ contributions
PJS, SH and PG wrote the manuscript. PJS, SH, PG, FB, GC, OD, BG, GG,
PL, FR, RR, AS, OVM, MM, RM and SH contributed to data collection and
genotyping. YG performed sex steroids assessments. PJS, SH and SR
contributed to data analysis. PJS, SH, MM, PG and RR contributed to the
discussion. All authors reviewed the manuscript.
Disclosure Summary: The authors have no potential conflicts of interest to
disclose.
155
TABLE 1 Clinical and biological characteristics of male type 2 diabetic patients with
available sex hormone data (n=794) according to their diabetic nephropathy status
n
Diabetic
nephropathy
578
controls
*
*
P
P
216
Age (years)
65.1±9.6
64.3±8.8
0.30
0,30
Ethnicity: Caucasian/other (n/n)
520†/58
199‡/17
0.27
0,27
30,1±4.7
18.2±9.7
28.7±4.8
19.2±9.5
0.0003
0,0003
0.19
0,19
SBP (mmHg)
143.5±20,7
134.1±18.4
<0.0001
<0,0001
DBP (mmHg)
75.4±9.9
76.9±11.0
0.08
0,08
Heart rate (bpm)
74±13
70±12
0.002
0,002
A1C (%)
8.0±1.5
7.8±1.2
0.11
0,11
66 (42)
85(21)
<0.0001§
<0,0001§
9 (10)
14.07±6.0
<0.0001§
<0,0001§
Total testosterone (nmol/l)
155 (428)
13.43±6.13
0.19
0,19
Calculated free testosterone (nmol/l)
0,28±0,10
0,29±0,10
0.24
0,24
SHBG (nmol/l)
43.8±22.5
45.3±23.1
0.43
0,43
100.94±38.79
92.77±35.49
0.008
0,008
BMI (kg/m²)
Duration of diabetes (years)
eGFR (ml/min/1.73m²)
UAE (mg/l)
Total estradiol (pmol/l)
2.59±0,98
2.38±0,92
0.005
0,005
Calculated free estradiol (pmol/l)
Data are means ± SD or medians (interquartile range).
*P values as determined with the T-test except for §Mann Whitney U test
DNA unavailable for † n=3 and ‡ n=1 patient
SBP, systolic blood pressure; DBP, diastolic blood pressure; A1C, glycated hemoglobin; eGFR,
estimated glomerular filtration rate according to the MDRD formula; UAE, urinary albumin
excretion.
156
TABLE 2 Risk of DN according to clinical and biological variables (multiple analysis) in
the 794 patients with available sex hormone data.
Adjusted OR
(95% CI)
P
BMI (per 1 kg/m²)
1.056
(1.015-1.094)
0.0046
SBP (per 1 mmHg)
1.022
(1.013-1.032)
<0.0001
eGFR (per 1 ml/min/1.73m²)*
0.100
(0.057-0.174)
<0.0001
1.005
(1.001-1.010) 0.0367
Total estradiol (per 1 pmol/l)
SBP, systolic blood pressure; eGFR, estimated glomerular filtration rate according to the MDRD
formula.
*natural log transformed
157
TABLE 3 Allelic frequency distribution of CYP19A1 gene polymorphisms in male
Caucasian (n=739) patients according to DN status.
minor allele
SNP
rs10046
G
rs700519
A
Del
rs11575899
rs700518
C
rs727479
C
rs12911554
C
rs717256
A
rs10519299
G
C
rs12050767
rs749292
A
rs1902586
A
rs936306
T
rs730154
C
rs2470152
G
C
rs28566535
rs1902584
T
rs1004984
A
rs2445762
C
rs2470144
T
rs6493497
A
rs7176005
T
*Test for difference in allele
(1df)
MAF, Minor allele frequency
158
MAF
case
(n=532)
0.477
0.021
0.370
0.495
0.379
0.464
0.424
0.434
0.435
0.432
0.048
0.141
0.141
0.484
0.049
0.091
0.404
0.285
0.486
0.140
0.145
frequencies
control
(n=207)
0.493
0.017
0.367
0.481
0.370
0.488
0.446
0.431
0.430
0.430
0.047
0.128
0.124
0.485
0.050
0.076
0.379
0.288
0.490
0.139
0.140
between cases
P*
OR (95%CI)
0.60
0.94 (0.75-1.18)
0.62
1.24 (0.53-2.93)
0.93
1.01 (0.80-1.28)
0.62
1.06 (0.84-1.33)
0.77
1.04 (0.82-1.32)
0.41
0.91 (0.72-1.14)
0.45
0.91 (0.73-1.15)
0.93
1.01 (0.80-1.28)
0.85
1.02 (0.81-1.29)
0.95
1.01 (0.80-1.27)
0.88
1.04 (0.61-1.79)
0.51
1.12 (0.80-1.57)
0.40
1.16 (0.82-1.63)
0.98
1.00 (0.79-1.25)
0.95
0.98 (0.58-1.67)
0.35
1.23 (0.80-1.87)
0.39
1.11 (0.88-1.41)
0.89
0.98 (0.76-1.27)
0.88
0;98 (0.78-1.24)
0.98
1.01 (0.72-1.40)
0.79
1.05 (0.75-1.46)
and controls using an allelic chi² test
TRAVAUX PUBLIES OU EN COU
OURS DE SOUMISSION
FIG. 1. Diagrammatic re
representation of the studied patients, with special
sp
emphasis on
Caucasian patients.
cases
controls
cases
controls
male
532
207
739
female
284
142
426
816
349
1165
517
198
* sex steroid assay data were
re available for 79 non Caucasian patients
159
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162
Supplementary Table 1. Clinical and biological characteristics of type 2 diabetes patients
(n=1,652) according to DN status.
cases
controls
n
1,037
615
Age (years)
65.9±9.9
64.8±8.9
0.020
Male sex: n (%)
677 (65.3)
341 (55.4)
<0.0001
Ethnicity (Caucasian/other) : n/n
947/90
580/35
0.027
BMI (kg/m²)
30.9±5.6
30.1±5.8
0.006
Current smoker: n (%)
115 (11.0)
69 (11.3)
0.89
SBP (mmHg)
143.0±20.8
134.2±17.5
<0.0001
DBP (mmHg)
75.7±11.4
73.9±10.8
0.0016
Heart rate (bpm)
74±13
72±12
0.0002
Duration of diabetes (years)
18.4±9.5
19.2±9.0
0.08
Personal history of MI: n (%)
166 (16.0)
65 (10.6)
0.0021
Personal history of stroke: n (%)
81 (7.8)
18 (2.9)
<0.0001
A1C (%)
8.0±1.5
7.9±1.3
0.15
eGFR (ml/min/1.73m²)
61 (44)
80 (28)
<0.0001*
P
7 (9)
<0.0001*
169 (535)
Data are means ± SD or medians (interquartile range).
SBP, systolic blood pressure ; DBP, diastolic blood pressure; personal history of MI, personal
history of myocardial infarction; A1C, glycated hemoglobin; eGFR, estimated glomerular
filtration rate according to the MDRD formula; UAC, urinary albumin concentration.
*Mann Whitney U Test
UAC (mg/l)
163
Supplementary Table 2.CYP19A1 polymorphism in the genotyped Caucasian D2NG
patients (n=1,447)
Location
on
Chromosome 15
Type
Allele*
AA change
(position)
pHWE
MAF
rs10046
49290278
3' UTR
A/G
-
0.46
0.486
rs700519
49295260
exonic
G/A
R/C (264)
0.02
0.026
rs11575899
49307241
intronic
TCT/-
-
0.96
0.360
rs700518
49316404
exonic
T/C
V/V (80)
0.96
0.480
rs727479
49321839
intronic
A/C
-
0.61
0.367
rs12911554
49330049
intronic
T/C
-
0.96
0.472
rs7172156
49333590
intronic
G/A
-
0.48
0.417
rs10519299
49338638
intronic
C/G
-
0.45
0.435
rs12050767
49344549
intronic
T/C
-
0.26
0.434
rs749292
49346023
intronic
G/A
-
0.22
0.433
rs1902586
49358145
intronic
G/A
-
0.06
0.058
rs936306
49366890
intronic
C/T
-
0.37
0.156
rs730154
49378496
intronic
T/C
-
0.32
0.156
rs2470152
49382264
intronic
A/G
-
0.88
0.495
rs28566535
49388433
intronic
A/C
-
0.10
0.060
rs1902584
49398946
intronic
A/T
-
0.21
0.092
rs1004984
49400821
intronic
G/A
-
0.14
0.415
rs2445762
49405000
intronic
T/C
-
0.14
0.288
rs2470144
49409017
intronic
C/T
-
0.76
0.478
rs6493497
49418127
upstream
G/A
-
0.13
0.143
SNPs
49418771
upstream
C/T
0.17
rs7176005
pHWE, P value for Hardy Weinberg equilibrium test ; MAF, Minor allele frequency
* major allele/minor allele
164
0.147
Supplementary Table 3. CYP19A1 gene haplotype analysis of rs10046, rs11575899,
rs700518, rs12911554, rs7172156, and rs12050767 (block 1) according to estradiol levels in
Caucasian male type 2 diabetic patients. (n=715).
Haplotype
A/G Ins/Del T/C
T/C
G/A
T/C
Haplotype
frequency
Estradiol (pmol/l)*
P
A
I
C
T
G
C
0.392
98.4 (93.2-103.5)
Reference
G
D
T
C
A
T
0.263
94.1 (86.4-101.8)
0.42
G
D
T
C
G
T
0.087
104.0 (90.3-117.6)
0.48
G
I
T
C
A
T
0.079
99.7 (84.7-114.71)
0.87
0.051
111.3 (93.2-129.4)
0.19
A
I
C
T
A
T
*Mean (95% CI)
Comparisons were made using AICTGC as the reference with THESIAS software, and
haplotype frequencies above 0.05 were considered taking more than 95% of chromosomes into
account.
Supplementary Table 4. CYP19A1 gene haplotype analysis of rs11902590 and rs936306
(block 2) according to estradiol levels among Caucasian male type 2 diabetic patients. (n=715).
Haplotype
Haplotype
frequency
Estradiol (pmol/l)*
P
A/G
T/C
G
C
0.863
97.8 (94.6-101.1)
Reference
G
T
0.091
99.8 (86.7-112.8)
0.79
A
T
0.045
106.1 (85.3-126.8)
0.45
*Mean (95% CI)
Comparisons were made using GC as the reference with THESIAS software, and haplotype
frequencies above 0.05 were considered taking more than 95% of chromosomes into account.
165
Supplementary Table 5. CYP19A1 gene haplotype analysis of rs1902584, rs1004984,
rs2445762, rs2470144 and rs6493497 (block 3) according to estradiol levels among Caucasian
male type 2 diabetic patients (n=715).
Haplotype
frequency
Haplotype
Estradiol (ng/l)*
P
A/T
A
G/A
G
T/C
T
C/T
T
C/T
G
0.485
98.0 (93.6-102.4)
Reference
A
A
C
C
G
0.213
98.4 (89.3-107.6)
0.93
T
A
T
C
A
0.083
106.1 (91.7-120.5)
0.30
A
G
C
C
G
0.072
92.2 (78.2-106.3)
0.47
A
A
T
C
A
0.051
100.69 (84.7-116.7)
0.76
*Mean (95% CI)
Comparisons were made using AGTTC as the reference with THESIAS software, and haplotype
frequencies above 0.05 were considered taking more than 95% of chromosomes into account.
166
Supplementary Figure 1. Schematic representation of the CYP19A1 gene
167
Schematic diagram of linkage disequilibrium blocks within the CYP19A1 gene. Black triangles represent linkage disequilibrium (LD) blocks. The LD plots were
created using Haploview and the color code on the plot follows the standard color scheme for Haploview: white=(|D’|<1, LOD<2) shades of pink/red=(|D’|<1,
LOD#2), blue=(|D’|=1, LOD<2), bright red=(|D’|=1, LOD#2).
Supplementary Figure 2. Relationship between urinary albumin excretion status and sex
hormone concentrations (n=794).
A : Total testosterone (P=0.21) B : Calculated free testosterone. (P=0.27) C : SHBG (P=0.74)
D : Estradiol(P=0.0035), E : calculated Free Estradiol (P=0.0015).
Data were analyzed using a one-way ANOVA. (white : normo-albuminuria, n=218 ; grey : microalbuminuria, n=253 ; black :proteinuria, n=323). Error bars indicate standard deviations
B
A
0.5
calculated free
Testosterone (nmol/L)
Testosterone (nmol/L)
25
20
15
10
5
0
0.2
0.1
D
150
Estradiol (pmol/L)
80
SHBG (nmol/l)
0.3
0.0
C
60
40
20
E
5
calculated free
Estradiol (pmol/L)
100
50
0
0
4
3
2
1
0
168
0.4
Supplementary Figure 3. Relationship between eGFR and sex hormone concentrations
(n=794).
A : Total testosterone (P=0.0002). B : Calculated free testosterone (P=0.001). C : SHBG
(P=0.0157) D : Estradiol (P=0.0009), E : calculated Free Estradiol (P<0.001).
Data were analyzed using a one-way ANOVA. (white : eGFR ≥ 60 ml/min group, n=549; gray :
eGFR from 30 to 60 ml/min group, n=172 ; black : eGFR < 30 ml/min group, n=73). Error bars
indicate standard deviation
B
A
free Testosterone (pmol/L)
Testosterone (pmol/L)
25
20
15
10
5
0
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
C
150
p=0.019
Estradiol (pmol/L)
SHBG (nmol/L)
80
D
60
40
20
0
100
50
0
E
calculated free
Estradiol (pmol/L)
5
4
3
2
1
0
169
SUPPLEMENTARY FIGURE 4. Pairwise Linkage Disequilibrium between selected CYP19A1
SNPs in male Caucasian type 2 diabetes patients with available sex hormone level
assessments (n=715)
Linkage disequilibrium (LD) in CYP19A1. The LD plots were created using Haploview and the
color code on plot follows the standard color scheme for Haploview: white=(|D’|<1, LOD<2)
shades of pink/red=(|D’|<1, LOD#2), blue=(|D’|=1, LOD<2), bright red=(|D’|=1, LOD#2).
170
List of D2NG participating centers and investigators:
Poitiers – Diabetology clinic (coordinating center) & CIC 0802: F Duengler, R
Maréchaud, D Gendre, F Torremocha, L Labbe, X Piguel, A Miot, PJ Saulnier,
S Hadjadj (Principal Investigator) ; Poitiers – Nephrology clinic: G Touchard, F
Bridoux, A Thierry, R Abou-Ayache, S Belmouaz ; Poitiers – Cardiovascular
disease prevention center : D Herpin, Ph Sosner, Angers - Diabetology clinic :
G Guilloteau, B, Bouhanick; PH Ducluzeau, P Ritz ; Angoulême - Diabetology
clinic : A-M Chameau-Lagarde, M. Bonnefoy ; Corbeil-Essonnes - Diabetology
clinic : G Charpentier, JP Riveline, D Dardari, C. Petit ; Limoges - Diabetology
clinic : F. Archambeaux-Mouveroux, S. Gallina ; Nancy - Diabetology clinic : Ph
Bohme, B Guerci, I. Glatz, H. Hallage ; Narbonne -Diabetology clinic : N. Vigier,
JP Courrèges ; Niort - Nephrology clinic: A Séchet, M Baron ; Paris Bichat Diabetology clinic : A Ankotche, R Roussel, M Marre ; Rennes - Diabetology
clinic: C Faure-Gérard, JY Poirier, D Maugendre ; St Mandé – HIA Begin Diabetology clinic : B. Bauduceau, O. Dupuy, H. Mayaudon, J. Margery, R.
Poyet ; Toulouse - Diabetology clinic: P Gourdy, M Matta, H Hanaire ; Tours –
CIC 0202 , Diabetology clinic and Nephrology clinic : JM Halimi, P Lecomte, M
François ; Valenciennes - Diabetology clinic : O. Verier-Mine ; Valenciennes Nephrology clinic : P Vanhille
171
2.2.
Données complémentaires sur
sexuels et le gène AROMATASE
les
stéroïdes
INTRODUCTION
Nous avons complété notre approche transversale de l’impact des stéroïdes
sexuels et des variants du gène du CYP19A1 sur la complication rénale du DT2
par une approche longitudinale du risque de morbi-mortalité cardiovasculaire et
rénale dans la cohorte SURDIAGENE.
MATERIELS ET MEHODES
Les hommes inclus dans SURDIAGENE ont bénéficié d’un dosage des
hormones sexuelles (Testostérone [T], œstradiol [E2] et SHBG) dans les
mêmes conditions que celles de l’étude DIABNEPHROGENE.
Les analyses statistiques ont été menées conformément à celles décrites dans
le chapitre IV.
La Figure 50 propose une représentation des différentes analyses réalisées
dans la population d’étude SURDIAGENE.
a
Taux
d’œstradiol (E2)
c
du taux d’E2
avec les variants
du CYP19A1 chez les
caucasiens
(♂ n=275)
Variants du
CYPA19A1
Risque observé de survenue d’évènements
Evénements
liés au taux d’E2(♂ n=288 )
cardiovasculaires et
rénaux
b
risque observé d’évènements
liés aux variants de CYP19A1
(n≈ 600)
SURDIAGENE
(n=1467 )
Figure 50 Stratégie d’exploration de l’association entre stéroïdes sexuels, variants génétiques du
CYP19A1 et risque de survenue d’événements cardiovasculaires et rénaux dans la population
SURDIAGENE
172
RESULTATS
Parmi les 1467 patients, 297 hommes ont bénéficié d’un dosage de leurs
hormones sexuelles. Ces patients étaient des sujets cas ou témoins de l’étude
DIAB2NEPHROGENE. Quatorze patients qui présentaient un traitement
médicamenteux interférant avec les hormones sexuelles (inhibiteur de la 5alpha testostérone réductase, œstrogène, anti-androgène, analogue GnRH et
Testostérone) au moment de l’inclusion dans SURDIAGENE ont été exclus des
analyses sur les stéroïdes sexuels. Les caractéristiques de la population de
SURDIAGENE sont présentées dans le Tableau 19.
Tableau 19 Caractéristiques des variables clinico-biologiques des patients de l'étude SURDIAGENE
à l’entrée dans l’étude
Ensemble
de la
cohorte
Variables
1467
n
Hommes : n (%)
846 (58)
Age (ans)
65±11
15±10
IMC (kg/m²)
31,2±6,3
Fumeurs actifs : n (%)
153(11)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
Hommes
avec dosage
de stéroïdes*
Hommes
sans dosage
de stéroïdes
288
558
-
-
66±10
18±11
65±11
12±9
29,8
30,6
38(13)
75(14)
P†
0,17
<0,0001
0,03
0,14
132,4±17,7
136,8±20,9
131,5±16,3
<0,0001
72,3±11,0
74,3±11,2
73,0±10,9
0,11
74±13
74±14
72±14
0,13
Antécédent d’IDM: n (%)
221(15)
60(21)
112(20)
0,88
Antécédent d’AVC: n (%)
81(6)
17(6)
32(6)
0,97
-1
HbA1C (%)
EUA (mg/l)
8,0±1,5
7,5±1,6
76,8 (36,4)
7,7±1,6
75,6(40)
80,7(34,9)
0,0016
0,13
25(93)
70(371)
26(70)
<0,0001
Testostérone (µg/l)*
-
4,1±1,7
-
-
SHBG (nmol/l)*
-
42,0 (25,9)
-
-
Œstradiol (ng/l)*
-
28,4±13,9
-
-
*chez les 288 hommes ne prenant pas de traitement interférant avec les stéroïdes sexuels
†comparaison entres les groupes d’hommes constitués en fonction de la disponibilté des
résultats des concentrations d’hormones sexuelles.
Les données de variants génétiques du CYP19A1 étaient disponibles selon les
SNPs pour 580 à 592 patients caucasiens. Les distributions des génotypes
(Tableau 20) étaient en HWE pour tous les SNP sauf pour le rs700519
(p=0,038). La médiane de suivi pour les analyses de survie était de 57 mois
pendant lesquels 386 patients ont présenté un CPJ (26,3%) et 193 patients un
décès de cause cardiovasculaire (43,2%).
173
Tableau 20 Variants du CYP19A1 chez les patients DT2 caucasiens génotypés de l'étude
SURDIAGENE
SNP
Allèle
majeur (A2)
Allèle mineur
(A1)
MAF
Effectifs
A1A1/A1A2/A2A2
pHWE
rs10046
G
A
47,88%
134/298/159
0,87
rs700519
A
G
2,37%
2/24/564
0,037
rs1157899
-
TCT
35,09%
65/277/238
0,28
rs700518
C
T
48,89%
138/295/151
0,87
rs727479
C
A
36,54%
71/287/229
0,22
rs12911554
C
T
47,38%
132/296/163
0,94
rs717256
A
G
42,25%
107/282/198
0,74
rs10519299
G
C
43,52%
111/288/187
1
rs12050767
C
T
43,32%
112/288/191
0,87
rs749292
A
G
43,02%
111/283/193
0,68
rs1902586
A
G
5,15%
3/55/534
0,20
rs936306
T
C
14,93%
14/150/432
0,75
rs730154
C
T
15,02%
14/151/431
0,88
rs2470152
A
G
49,39%
141/288/148
1
rs28566535
C
A
5,36%
3/57/528
0,23
rs1902584
8,78%
5/94/493
0,80
T
A
rs1004984
A
G
39,69%
96/270/216
0,49
rs2445762
C
T
28,03%
44/240/301
0,76
rs2470144
C
T
49,49%
142/299/148
0,78
rs6493497
A
G
12,82%
8/134/443
0,72
rs7176005
T
C
13,23%
9/137/440
0,86
MAF, fréquence de l’allèle mineur (A1) ; pHWE, valeur de p du test d’équilibre de Hardy
Weinberg
a) Risque de survenue de complications cardiovasculaires et rénales
en fonction du sexe et des concentrations de stéroïdes sexuels
Dans l’ensemble de la cohorte SURDIAGENE, le sexe était un facteur de risque
de survenue de complications cardiovasculaires et rénale. Le risque du CPJ est
significativement plus élevé chez les hommes dans un modele de cox ajusté
sur l’âge, la PAS, le DFGe et l’EUA (HR ajusté: 1,27, IC95% : 1,03-1,58 ;
p=0,026 [Figure 51]).
174
Survie Cumulées des
évènements cardiovasculaires majeurs.
1
,8
,6
Hommes
Femmes
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
fonction du sexe chez les patients de l’étude SURDIAGENE (logrank=6,5 ; p=0,011)
Survie Cumulée sans décès toutes causes.
La mortalité toutes causes est également plus élevée chez les hommes dans
un modele de cox ajusté sur l’âge, la PAS, le DFGe et l’EUA (HR ajusté: 1,38 ;
IC95% 1,09-1,75 ; p=0,0078 [Figure 52]), tandis que le risque de décès
cardiovasculaire n’était pas significativement différent après ajustement
(p=0,22).
1
,8
,6
Hommes
Femmes
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 52 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans décès toutes causes en fonction du
sexe chez les patients de l’étude SURDIAGENE (logrank=7,2 ;p=0,008)
Les risques de survenue d’IDM et d’IRCT [Figure 53] étaient 1,97 et 3,77 fois
plus élevés chez les hommes dans un modele de Cox ajusté (IC95% 1,213,20 ; p=0,007 et IC95%=1,75-8,13 p=0,0007 respectivement). Les risques
d’AVC et d’hospitalisation pour ICC n’étaient pas significativement différents
entre les hommes et les femmes (p ajusté =0,49 et p=0,29 respectivement).
175
Survie Cumulée sans IRCT
1
,8
,6
Hommes
Femmes
,4
,2
0
0
12
24
36
48
60
72
Temps (mois)
84
96
108
Figure 53 Courbe de Kaplan-Meier pour la survie cumulée sans insuffisance rénale chronique
terminale en fonction du sexe chez les patients de l’étude SURDIAGENE (p=0,0096)
Lorsqu’on reprend l’analyse chez les 288 hommes, pour lesquels les données
de stéroïdes sexuels sont disponibles, 135 (46,9%) ont présenté un CPJ et 113
sont décédés dont 71 (24,7%) d’une cause cardiovasculaire. Par ailleurs, 30
hommes (10,4%) ont présenté un IDM, 23 un AVC (8%), 51 une hospitalisation
pour ICC (17,7%) et 24 une IRCT (8,3%).
Dans un des modèles de Cox ajusté sur l’âge, la PAS, le DFGe et l’EUA, la
concentration d’E2 était un facteur de risque associé au décès toutes causes
(HR ajusté pour un incrément de 1 ng/l =1,02 ; IC95% = 1,00-1,04; p=0,012).
Cependant, la concentration d’E2 n’était significativement associée ni avec la
survenue des décès d’origine cardiovasculaire (p ajusté=0,35), ni avec celle du
CPJ (p ajusté = 0,13).
Les concentrations de T et de SHBG n’étaient significativement associées ni
avec la survenue du CPJ, ni avec celle d’événements cardio-rénaux fatals ou
non.
b) Association du risque de survenue de complications en fonction
des variants du CYP19A1
Chez les 1421 sujets caucasiens hommes et femmes, aucun des SNP du
CYP19A1 n’était associé significativement avec la survenue de CPJ ou de mort
toutes causes.
En analysant individuellement chacun des cinq critères qui compose le CPJ, en
appliquant la correction de Bonferroni et en ajustant dans un modèle de Cox sur
l’âge, le sexe, la PAS, le DFG et l’EUA, seule la survenue d’IRCT (n=39
événements) est associée significativement avec les rs1004984 et rs6493497
(p=0,0023 et p=0,0018 respectivement [Tableau 21]).
176
Tableau 21 Association des rs1004984, rs28566535 et rs6493497 avec le risque de survenue d’IRCT
chez les hommes caucasiens de l’étude SURDIAGENE (modèle de Cox ajusté pour le sexe, l’âge,
la PAS, le log(DFGe) et log(EUA))
rs1004984*
rs6493497*
*pour l’addition d’un allèle mineur *
Hazard Ratio
ajusté
IC95%
P value
0,42
0,2-0,7
0,0023
0,17
0,06-0,52
0,0018
Aucun des SNP du CYP19A1 n’était associé avec le doublement persistant de
la créatinine considéré comme événement rénal complémentaire (n=61 soit
4,3% pendant le suivi chez les sujets caucasiens), celui-ci n’était pas associé
avec les SNP du CYP19A1.
Ce résultat bien que statistiquement significatif suggère donc un faux positif.
c) Association de la concentration d’œstradiol avec les variants du
CYP19A1
En utilisant un modèle de régression linéaire sous un modèle génétique additif
ajusté pour l'IMC, le DFGe et le statut DN, aucun polymorphisme du CYP19A1
n’était associé aux concentrations d’E2 dans la population caucasienne
masculine (données non présentées).
177
DISCUSSION
Nous avons confirmé que le sexe masculin était un facteur de risque de
survenue du CPJ, d’IRCT et de décès toutes causes chez des patients
présentant un DT2.
Chez les hommes, nous avons montré que des concentrations plus élevés d’E2
étaient associés avec un risque plus élevé de mortalité toutes causes.
Les variants du gène AROMATASE n’interféraient pas sur cette relation. Par
ailleurs, deux variants étaient associés significativement chez les caucasiens
avec la survenue dans le suivi d’IRCT sans signal concordant sur d’autres
phénotypes reliés tel que le doublement de la créatinine.
Ces données ont été soumises en résumé pour le congrès 2013 de la SFD.
178
RESUME soumis au congrès de la Société Francofone du Diabète 2013
CONCENTRATIONS SERIQUES DE STEROÏDES SEXUELS,
GENE
DE
L’AROMATASE
(CYP19A1)
ET
RISQUES
CARDIOVASCULAIRE ET RENAL CHEZ DES SUJETS DT2.
Pierre-Jean Saulnier1,2,3, Pierre Gourdy4, Yves Gallois5, Stéphanie Ragot1,2,3,
Guillaume Charpentier6, Gérard Guilloteau7, Bruno Guerci8,9,10, Ronan
Roussel11,12,13, Jean-Michel Halimi 14, Olivier Dupuy 15, Odile Verier-Mine 16,
Frédérique Rachedi 17, Anne Sechet18, Richard Marechaud 19, Michel
Samy
Hadjadj1,2,3,19,22
pour
le
groupe
d’étude
Marre13,20,21,
DIAB2NEPHROGENE
1
INSERM, CIC0802, F-86021 Poitiers, France
CHU de Poitiers, Centre d’investigation Clinique, F-86021 Poitiers, France
3
Université de Poitiers, Centre d’investigation Clinique CIC0802, F-86021 Poitiers, France.
4
CHU de Toulouse, Service de Diabétologie, Maladies Métaboliques et Nutrition, Pôle Cardio Vasculaire
et Métabolique, F-31059 Toulouse, France
5
CHU d’Angers, Service de Biochimie et biologie moléculaire, F-49933 Angers, France
6
CH Sud Francilien, Service d’Endocrinologie Diabétologie, F-91106 Corbeil-Essonnes, France
7
CHU d’Angers, Service d’Endocrinologie Diabétologie Nutrition, F-49933 Angers, France
8
CHU de Nancy, Service de Diabétologie, maladies métaboliques et nutrition, F-54511 Vandoeuvre-LesNancy, France
9
INSERM, CIC9501 I, F-54511 Vandoeuvre-Les-Nancy, France
10
Université Nancy, Centre d’investigation Clinique F-54511 Vandoeuvre-Les-Nancy, France
11
Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMR 738, F-75018 Paris, France
12
INSERM, UMR872, Equipe 2, Centre de Recherche des Cordeliers, F-75006 Paris, France
13
AP-HP, Hôpital Bichat, Service de Diabetologie Endocrinologie Nutrition, F-75018Paris, France
2
179
14
CHRU de Tours, Centre d’investigation clinique, Inserm CIC0202, Service de Néphrologie, F-37000
Tours France
15
Hôpital d’Instruction des Armées Bégin, Service d’endocrinologie, diabétologie et maladies
métaboliques, F- 94160 Saint-Mandé, France
16
CH Valenciennes, Service d’Endocrinologie, F-59300 Valenciennes, France
17
Centre Hospitalier de Polynésie française, Service d’Endocrinologie, Pirae, Tahiti. France
18
CH de Niort, Service de Néphrologie, F79000 Niort, France
19
CHU de Poitiers, Service de Médecine interne, endocrinologie et maladies métaboliques, F86000Poitiers, France
20
INSERM, U695, F-75018 Paris, France;
21
Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMRS 695, UFR de Médecine Site Bichat, F-75018 Paris,
France;
22
INSERM U1082 , Poitiers, F-86000, France
RATIONNEL et OBJECTIFS – Le dimorphisme sexuel pour le risque de
survenue de complications cardiovasculaires et rénales chez des patients
diabétiques de type 2 (DT2) suggère un effet des stéroïdes sexuels. Nous
avons évalué si les concentrations de stéroïdes sexuels et/ou les
polymorphismes du gène CYP19A1 (codant pour l’aromatase) s’associaient au
risque de complications.
MATERIELS ET METHODES – Les concentrations de SHBG, testostérone (T)
et œstradiol (E2) ont été mesurées chez 288 hommes DT2 issus de la cohorte
prospective
SURDIAGENE
(n=1467).
Nous
avons
génotypé
21
polymorphismes dans le gène CYP19A1 et analysé la survenue de
complications (critère principal de jugement [CPJ] combiné : mort
cardiovasculaire, infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral,
hospitalisation pour insuffisance cardiaque ou épuration extra-rénale).
RESULTATS – La médiane de suivi était de 57 mois avec 386 patients ayant
présenté un CPJ. Le sexe masculin est un facteur de risque de survenue du
critère principal de jugement : RR ajusté : 1,78 (IC95% : 1,20-2.62 ; p=0.0037).
Chez les hommes, après ajustement sur âge, pression artérielle, DFGe et
albuminurie, les sujets avec des concentrations d’E2 plus élevées présentaient
un risque augmenté de décès toutes causes: RR ajusté pour un incrément de 1
ng/l: 1,02 (IC95% : 1,00-1,04; p=0.0012) mais pas pour le critère principal de
jugement (p=0.13).
Les variants de CYP19A1 ne s’associaient pas aux concentrations d’E2 et
n’interféraient pas sur la relation E2/mortalité. Toutefois, en modèle additif, les
rs1004984 et rs6493497 s’associaient significativement avec la survenue
d’insuffisance rénale chronique terminale, RR ajusté : 0 .42 et 0.17, (95%IC :
0.24-0.73 et 0.06-0.52; p=0.0023 et p=0.0018, respectivement), mais sans
signal concordant sur d’autres phénotypes reliés tel que le doublement de la
créatinine.
CONCLUSIONS – La concentration d’E2 était indépendamment associée avec
la mortalité toutes causes, sans interaction des SNPs du CYP19A1
180
3. Autres travaux realisés pendant la thèse
D’autres travaux utilisant les cohortes SURDIAGENE et DIAB2NEPHROGENE
ont été publiés mais ils ne concernent pas directement le sujet du présent
travail et sont rappelés à titre d’information.
3.1.
Prognostic Value of Resting Heart Rate on
Cardiovascular and Renal Outcomes in Type 2 Diabetic
Patients: A competing risk analysis in a prospective
cohort.
Miot A, Ragot S, Hammi W, Saulnier PJ, Sosner P, Piguel X, Torremocha F,
Marechaud R, Hadjadj S.
Diabetes Care. 2012 Oct;35(10):2069-75. Epub 2012 Jul 18.
OBJECTIVE Epidemiological studies and randomized clinical trials have
demonstrated in various populations that resting heart rate (RHR) was an
independent predictor of cardiovascular (CV) risk and all-cause mortality.
However, few data specifically evaluated the relationship between RHR and
long-term CV and renal complications in a large population of type 2 diabetic
(T2D) patients.
RESEARCH DESIGN AND METHODS We performed a single-center,
prospective analysis in 1,088 T2D patients. RHR was determined at baseline by
electrocardiogram. The primary outcome was a composite criterion of CV and
renal morbi-mortality (CV death, nonfatal myocardial infarction and/or stroke,
hospitalization for heart failure, renal replacement therapy), which was adjusted
for death from non-CV cause as a competing event. The secondary outcome
was a renal composite criterion (renal replacement therapy or doubling of
baseline serum creatinine) adjusted for all-cause death as a competing event.
RESULTS During median follow-up of 4.2 years, 253 patients (23%) and 62
patients (6%) experienced the primary and secondary outcomes, respectively.
In the subgroup of patients with CV disease history at baseline (n = 336), RHR
was found to be associated with the incidence of primary outcome (P = 0,0002)
but also with renal risk alone, adjusted for all-cause death as a competing event
(secondary outcome; P < 0,0001). In patients without history of CV disease, no
relation was found between RHR and the incidence of CV and/or renal events.
CONCLUSIONS In the real-life setting, RHR constitutes an easy and less timeconsuming factor that would permit identification of CV disease diabetic patients
with an increased risk for long-term CV and renal complications.
PMID: 22815300 [PubMed - as supplied by publisher]
181
3.2.
Renal complications correlate with electrical atrial
vulnerability hallmarks in type 2 diabetic patients.
Montaigne D, Bailloeuil O, Hulin-Delmotte C, Edme JL, Sosner P, Miot A, Ragot
S, Saulnier PJ, Dupuy O, Gourdy P, Lecomte P, Guerci B, Dardari D, Roussel
R,Neviere R, Lacroix D, Hadjadj S; on behalf of the DIAB2NEPHROGENE and
SURDIAGENE study groups.
Int J Cardiol. 2012 Aug 9;159(1):63-66. Epub 2012 Jun 18.
PMID: 22713678 [PubMed - as supplied by publisher]
182
3.3.
Association of ADIPOQ genetic variants and plasma
adiponectin isoforms with the risk of incident renal
events in type 2 diabetes.
Jaziri R, Aubert R, Roussel R, Emery N, Maimaitiming S, Bellili N, Miot A,
Saulnier PJ, Travert F, Hadjadj S, Marre M, Fumeron F; DIABHYCAR and
SURDIAGENE Study Groups.
Nephrol Dial Transplant. 2010 Jul;25(7):2231-7. Epub 2010 Jan 18
BACKGROUND: Adiponectin levels are high in cases of diabetic nephropathy,
but it remains unclear whether these high levels are a cause or a consequence
of the disease. We investigated the possible association of polymorphisms in
the adiponectin gene and baseline adiponectin levels with the incidence of renal
events in subjects with type 2 diabetes.
METHODS: We studied three adiponectin polymorphisms (-11391G>A,
+45T>G and +276G>T) in 3086 subjects with type 2 diabetes and high levels of
albumin excretion from the diabetes, hypertension, microalbuminuria or
proteinuria, cardiovascular events and ramipril (DIABHYCAR) trial. Baseline
concentrations of
total adiponectin and of adiponectin isoforms were
determined in cases with incident renal events and in controls matched for sex,
age, body mass index (BMI) and adiponectin genotype. We used another cohort
of type 2 diabetes patients-the survie, diabète de type 2 et
génétique(SURDIAGENE) study (n = 1004)-for the replication of genetic data.
RESULTS: In DIABHYCAR, the -11391A and +45G alleles were associated
with a higher incidence of renal events [hazard ratio (HR) = 1.73; 95%
confidence interval (CI), 1.10-2.71; and HR = 1.68; 95% CI, 1.14-2.47,
respectively].
The
haplotype
containing
susceptibility
alleles,
11391A/+45G/+276G, was more frequent in cases with renal events (5.1% vs.
1.9% in those without, P = 0,005). In SURDIAGENE, the -11391A/+45G/+276G
haplotype was also associated with renal events (5.6% vs. 1.9% in those
without, P = 0,03). In DIABHYCAR, all isoforms were more abundant in subjects
carrying the -11391A or +45G alleles. Medium- (MMW) and low-molecular
weight (LMW) isoforms were more abundant in cases with renal events.
CONCLUSIONS: In subjects with type 2 diabetes and early renal dysfunction,
adiponectin gene variants are determinants of the renal risk. The -11391A and
+45G alleles may affect renal risk by leading to high circulating adiponectin
concentrations, at least those of MMW and LMW isoforms.
PMID: 20083470 [PubMed - indexed for MEDLINE]
183
184
VI.
CONCLUSIONS ET
PERSPECTIVES
185
186
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
RAPPELS DES RESULTATS
Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse s’appuie sur une approche gènecandidat. Il a permis de mettre en évidence certains des déterminants
génétiques et environnementaux de la régulation de la pression artérielle, mais
également de la survenue de complications cardiovasculaires et rénales dans
trois populations indépendantes de patients DT2, en couplant une étude
transversale (DIAB2NEPHROGENE) et deux études longitudinales
(SURDIAGENE et DIABHYCAR).
Dans un premier temps, nous avons pu montrer que le rs2270915 du NPR3 est
associé avec la PAS (l’allèle G conférant un risque de pression artérielle plus
élevée). Les patients homozygotes CC pour le rs6889608 ont un risque 1,8 et
2,6 fois plus élevé de survenue du critère principal de jugement et d’accident
vasculaire cérébral. Par ailleurs, notre étude fonctionnelle de restriction sodée
suggère la présence une interaction gène-environnement pour le variant
rs2270915 qui interfère avec la sensibilité au sel de la pression artérielle (l’allèle
G confère une moindre sensibilité pressive au sel). Enfin, la survie sans critère
principal de jugement est significativement modulée par les apports en sel avec
un risque de morbi-mortalité réduit chez les sujets DT2 consommant le plus de
sel malgré un niveau de pression artérielle plus élevé.
Dans un deuxième temps, nous avons confirmé que le sexe masculin est un
facteur de risque pour la ND mais également pour la survenue du critère
principal de jugement. Nous avons également montré que dans le cadre du
dimorphisme sexuel des complications du DT2, des concentrations d’Œstradiol
plus élevées (mais pas de Testostérone et de SHBG), sont associées
significativement chez les hommes à une augmentation de la mortalité toutes
causes. Dans le système des stéroïdes sexuels, nous n’avons pas mis en
évidence d’interaction des variants testés du CYP19A1 sur cette relation.
Néanmoins, deux SNP s'associent significativement avec la survenue
d'insuffisance rénbale terminale dans le suivi de nos patients, sans signal
concordant avec d’autres phénotypes reliés comme le doublement de la
créatinine.
LIMITES ET POINTS FORTS
Méthodologie
Notre démarche a cosisté à confirmer et reproduire systématiquement nos
résultats d’association génétique dans une deuxième population. Les forces de
cette population de réplication résident dans son indépendance, dans sa taille
(qui garantit une puissance de détection équivalente) et dans l’identité des
phénotypes et des génotypes testés (mêmes méthodes de génotypage et
mêmes variants référencés).
Le concept d’analyse en plusieurs étapes (multi-stage design) a permis, dans
une approche transversale, d’identifier un premier signal qui a été répliqué sur
des échantillons indépendants avec un nombre réduit de SNP. Nous avons
ensuite conduit une méta-analyse pour améliorer la puissance et coupler cette
187
approche à une étude fonctionnelle. Cela a permis de renforcer l’évidence
d’une association avec nos variants de prédilection.
Notre échec à répliquer nos résultats génétiques pour la survenue de
complications dans le suivi prospectif pourrait être dû, non pas à des résultats,
faussement positifs, mais plutôt à de possibles différences entre une population
sélectionnée par un essai clinique international et une population sélectionnée
par un recrutement hospitalier régional. Par ailleurs, la temporalité de ces
cohortes est décalée d’une décennie, ce qui peut induire des différences sur le
mode de vie et la prise en charge des patients et ainsi modifier les résultats
entre cesdeuxcohortes395.
Puissance de détection
Nos travaux rassemblent des données de trois populations indépendantes
comprenant plus de 7700 patients. La puissance de nos études pouvait, compte
tenu de leurs effectifs et des MAP des polymorphismes testés (entre 45 et 2%),
prétendre à détecter une augmentation minimum du risque relatif lié aux
variants génétiques de l’ordre de 20 à 90. Nous n’étions donc pas en capacité
de détecter un effet plus modeste (<20% pour les variants les plus fréquents).
Le niveau de risque, que nous avons identifié, correspond néanmoins à la
magnitude de celui détecté dans la littérature basée sur des populations de
consortia ou de méta-analyses, dans le champ des complications
cardiovasculaires396 ou rénales344.
Randomisation mendélienne et causalité : perspectives
Même si notre démarche de randomisation mendélienne n’a pas abouti, elle
reste d’intérêt pour étudier, en épidémiologie, la causalité d’un facteur de risque
sur un évènement clinique. Il nous faudra donc identifier, pour cela, une
variable instrumentale génétique appropriée. Nous disposons actuellement d’un
panel de plus d’une cinquantaine de variants génétiques (en dehors des voies
métaboliques testées) dans lequel nous espérons pouvoir trouver le ou les
variants adaptés.
Dosage urinaire de sodium
Nous avons choisi une stratégie de dosage urinaire du sodium pour mesurer
précisément l’exposition sodée. Nous avons ainsi pu éviter les biais d’une
estimation liée à la réalisation d’une enquête alimentaire. Cela nous a toutefois
éloignés du contexte nutritionnel global des patients.
Nous avons réalisé des dosages d’UNa chez 98%des patients de la cohorte
prospective SURDIAGENE, mais seulement 47%des patients de l’étude
transversale DIAB2NEPHROGENE. Nous considérons qu’élargir l’information
sur le phénotype de l’exposition sodée, à un nombre plus important de patients
de DIAB2NEPHROGENE (pour lesquels des échantillons urinaires sont
disponibles) nous permettra de confirmer le sens de l’association entre sel et
risque de complications chez les sujets DT2.
Génétique du système des peptides natriurétiques
188
Nous avons pu explorer la modulation de la pression artérielle en lien avec les
apports sodés et son interaction vis-à-vis des gènes du NPR3 dans une
population de taille très modeste pour notre étude fonctionnelle (n=14).
Nous envisageons de compléter cette approche fonctionnelle par une étude des
composants génétiques de la sensibilité au sel, dans une population d’étude
déjà constituée, pour tester l’intervention pragmatique non pharmacologique de
baisse des apports sodés pour lutter contre l’HTA. Nous avons proposé une
collaboration au groupe de l’étude DASH (pour Dietary Approaches to Stop
Hypertension, NCT00000608) et notamment son investigateur principal L.
Svetkey (Duke University Medical Center, Durham, NC, USA). Nous
souhaitons, à moyen terme, tester nos hypothèses d’interaction génétique sur
la modulation pressive et la survenue d’événements cardiovasculaires chez les
459 sujets de cette étude397,398.
De manière complémentaire, nous avons déjà mis en place une étude chez le
volontaire sain pour évaluer l’impact de la charge en sel sur la réponse de la
pression artérielle en évaluant la modulation du système nerveux autonome en
fonction de l’obésité (étude PLADSEL, NCT01532401, investigateur principal :
S. Hadjadj). L’étude est actuellement en cours, les premiers résultats sont
attendus à la fin du premier semestre 2013. Une approche génétique sur les
gènes du système des peptides natriurétiques sera ainsi conduite dans une
population d’environ 40 sujets sains.
Les autres gènes du système (ligands et récepteurs) sont autant de cibles
génétiques d’intérêt qui pourront être investiguées dans un deuxième temps.
Dosage des stéroïdes sexuels
Nous avons réalisé le dosage des stéroïdes sexuels chez 82%des hommes de
D2NG, phénotypés cas ou témoins pour la néphropathie diabétique, mais
seulement chez 34%chez les hommes de la cohorte d’inception SDG. La
disponibilité des dosages dans SDG a introduit un biais de sélection puisque le
groupe d’hommes pour lequel les dosages ont été réalisés ont des
caractéristiques différentes notamment sur les facteurs de risque
cardiovasculaire comme l’âge, la pression artérielle et la fonction rénale. Il nous
semble indispensable de corriger ce biais et améliorer notre puissance
statistique, en réalisant un maximum de dosage sur les échantillons encore
disponibles des hommes de SDG.
Génétique du système des stéroïdes sexuels
Nous poursuivrons également nos investigations dans la voie métabolique des
stéroïdes sexuelles en évaluant l’impact des polymorphismes d’autres gènes
d’intérêt comme les récepteurs aux œstrogènes (ESR1 et ESR2) dont certains
variants ont été associés avec le risque de ND399,400.
189
Phénotype
En complément des critères d'évaluation « durs » correspondant aux
complications du diabète elles-mêmes, nous avons étudié des phénotypes
clinico-biologiques reliés, en se basant sur une relation entre le génotype et le
phénotype intermédiaire plus facilement démontrable qu’avec le critère « dur ».
Ces phénotypes intermédiaires permettent un éclatement/décomposition du
trait complexe « complications du diabète ». Nous avons exploré des
phénotypes intermédiaires très usités comme la PAS ou moins communs
comme les concentrations d’E2 et de sodium urinaire ou la sensibilité pressive
au sel.
Nos populations d’études ont été phénotypées avec soin tant pour l’approche
cas-témoin que pour l’approche prospective. L’homogénéité phénotypique de
nos populations conditionne la puissance de détection de nos études
d’association. Nos efforts pour l’approche cas-témoin ont eu comme effet positif
d’en limiter l’hétérogénéité, au prix d’une exclusion de certains patients
notamment ceux qui présentaient une concentration urinaire d’albumine
normale (EUA<20mg/l) mais une fonction rénale dégradée (DFGe<60ml/min).
Ceux-ci n’ont pu être assimilés ni aux cas (au regard de leur EUA) ni aux
témoins (au regard de leur détérioration de leur DFGe). Pourtant, ces patients
représentent une sous-population importante des sujets DT2, au regard de
l’histoire naturelle de la ND, ce qui rend pertinent l’étude de leurs trajectoires
clinico-biologiques et de leurs déterminants génétiques
Pour ce qui est de l’approche prospective, a été mis en place pour
SURDIAGENE, à l’instar de DIABHYCAR, un comité d’adjudication
indépendant pour garantir fiabilité et véracité des événements survenus dans le
suivi. Nous souhaitons poursuivre le suivi de SURDIAGENE en maintenant ce
processus d’évaluation indépendante à chacune de ces évaluations
biannuelles.
Par ailleurs, nous allons à très court terme pouvoir bénéficier des données sur
les causes de décès enregistrées par l’Institut National de la Statistique et des
Etudes Economiques et accessibles par le Centre d’Epidémiologie des causes
du décès de l’INSERM. Nous venons, en effet, d’obtenir les autorisations
règlementaires pour cette démarche. L’intégration de ce renseignement aura
pour conséquence de consolider l’information sur la mortalité de nos patients.
Nous nous attendons, néanmoins, à avoir sur certains dossiers une
discordance partielle sur la cause de décès enregistrée par le médecin au
moment du décès et l’information notifiée dans le dossier médical, par le
médecin traitant ou la famille.
Biais de stratification
L’information sur l’origine ethnique des patients a été recueillie par un autoquestionnaire. Cela nous a permis d’identifier au sein de nos populations
d’études SURDIAGENE et DIAB2NEPHROGENE des patients d’origine
caucasienne à partir de l’ethnie des pères et mères. Pour un certain nombre de
sujets, cette information n’a pas pu être validée et ils ont donc été exclus de
l’analyse. Cette information n’était pas disponible dans la population de
DIABHYCAR.
190
Il est désormais envisageable de confirmer l’origine ethnique des patients à
partir d’un nombre relativement limité de loci par des techniques d’analyses en
composante principale. Le nombre de ces ensembles de marqueurs informatifs
sur l’origine ethnique et géographique est estimé selon les auteurs entre
quelques dizaines et plusieurs centaines401,402. Nous ne possédons
actuellement pas le nombre suffisants de marqueurs pour cette approche.
Néanmoins, compte tenu de l’évolution des technologies et de nos perspectives
de génotypage à court terme, il semble raisonnable et réaliste d’envisager dans
les 36 prochains mois ce type d’analyses pour corriger d’éventuels biais de
stratification dans nos populations d’études.
DEFIS A VENIR
Technique et technologie
Nous avons actuellement identifié deux défis techniques que nous devrons
relever à très court terme.
Le premier d’entre eux concerne l’exploitabilité des ressources biologiques de
populations constituées au cours des études SURDIAGENE et
DIAB2NEHROGENE. Ces ressources représentent plus de 80 000 échantillons
d’urines, de plasma et d’ADN mais pour des quantités limitées. Même si
techniquement il existe des solutions d’amplification d’ADN, cela n’est pas
possible pour le plasma et les urines. Il convient donc de prioriser l’utilisation
de ces échantillons au regard d’objectifs scientifiques et de la valorisation
potentielle des programmes de recherche adossés mais également de limiter
les séquences de décongélation/recongélation. Cette priorisation est effective,
depuis la fin l’année 2012, grâce à la mise en place d’un comité scientifique qui
analyse les demandes de collaboration pour chacune des études
SURDIAGENE et DIAB2NEPHROGENE.
Méthodologie
Le deuxième défi réside dans la masse de données générée par les techniques
de génotypage à grande échelle que nous envisageons à court terme. Nous
avons actuellement les ressources humaines et techniques, à l’intérieur de
notre groupe de recherche, pour analyser nos bases de données. Toutefois, le
passage à la production de masse devra nous conduire à nous former à des
outils d’analyses spécifiques ou alors à collaborer avec des équipes reconnues
pour leur savoir-faire dans ce domaine. Dans ce contexte, l’utilisation de
méthodes dites de «data mining » vont être également intégrées au regard de
nos objectifs d’épidémiologie génétique de populations.
Dans notre recherche des déterminants génétiques, le choix des variants à
examiner s’est fait selon l’hypothèse «common disease-common variant ». Il est
envisageable de s’en détourner, au profit d’une hypothèse « rare variantcommon disease », selon laquelle l’ensemble des variants rares pourraient
expliquer une part plus importante encore de l’héritabilité des maladies
complexes. Une approche alternative et plus pragmatique viserait à considérer
uniquement les variants présents dans l’exome humain (qui est estimé pour les
18 000 exons des environ 23 000 gènes codants pour des protéines à 1%du
191
génome soit 3 Mpb). Cette approche de séquençage de l’exome entier (ou
whole-exome sequencing) se focalise uniquement sur les variants présents
dans les séquences codantes du génome. Ces variations sont susceptibles
d’impacter de manière fonctionnelle les protéines. Cette stratégie d’analyses
del’exome ne met donc pas de côté les variants en fonction de leur MAF mais
mais pose la question des effectifs limites dans nos cohortes pour des variants
à MAF tres basse.
Enfin les marqueurs génétiques sélectionnés pour les approches classiques
d’association, y compris celles que nous venons de mener, sont
essentiellement les SNP, mais il est envisageable de considérer d’autres
variations structurelles impliquées dans l’héritabilité des maladies complexes
comme les CNV, dont la cartographie ne semble actuellement pas complète ou
les microsatellites.
Concrètement, début 2013, nous avons l’opportunité de pouvoir utiliser sur les
ADN de nos populations d’étude en partenariat avec d’autres équipes
françaises, une puce à ADN MetaboChip qui avait été dessinée pour étudier
l’effet de plus de 200 000 SNP choisis dans des voies métaboliques d’intérêt
(European Genomic Institute for Diabetes, Lille ; Responsable P Froguel). Dans
ce contexte de « production données génétiques de masse », nous ne pourrons
pas nous cantonner à tester l’effet d’un SNP unique mais à intégrer les
interactions épistatiques et GxE en complément des approches multiSNP et
haplotypiques. La tâche devient relativement ardue compte tenu du nombre
élevé de variants. Aussi la priorisation des variants ou des haplotypes et l’étude
de leurs interactions seront-elles menées en collaboration avec une équipe
experte dans le domaine (UMRS 937 : Génétique épidémiologique et
moléculaire des pathologies cardiovasculaires, Paris ; Responsable F Cambien/
DA Tregouet)
Recherche d’Interaction Gène-Médicament
Nous ne disposons actuellement pas de données consolidées (durée
d’exposition, posologie, type de molécule) concernant l’exposition
pharmacologique de nos patients dans le suivi comme SDG. Même si l’étude
des interactions pharmacogénomiques ne représente pas notre objectif
principal, elles doivent permettre d’aider à la compréhension et l’interprétation
des résultats de nos données issues d’études non interventionnelles
spécifiquement dessinées pour les approches d’épidémiologie clinique en
complément des interactions GxG et GxE.
Les données d’exposition aux médicaments sont partiellement enregistrées
dans le dossier médical et les données concernant les traitements prescrits à
nos patients sont connues et disponible pour D2NG et pour l’évaluation
baseline de SDG. Nous rechercherons un partenariat avec la Caisse Nationale
de l'Assurance Maladie pour pouvoir évaluer l’impact de la prise en charge
pharmacologique au travers des données de remboursement des frais de
prescription médicamenteuse, comme facteur additionnel aux déterminants
génétiques et environnementaux, dans la survenue des complications du DT2.
Il a été montré une intrication du système des peptides natriurétiques
notamment de l’ANP vis-à-vis de la famille des transporteurs du glucose (SGLT
192
pour Sodium-dependent glucose cotransporters) pour lequel des inhibiteurs
sont actuellement en phase d’évaluation dans des essais cliniques randomisés.
Nous envisageons, à terme, d’explorer dans le cadre d’un partenariat industriel,
les aspects pharmaco-génomiques d’un représentant de cette classe
d’inhibiteur vis-à-vis de la régulation pressive et hydrosodée en complément
d'effet sur l’équilibre glycémique.
EN CONCLUSION
La plus value des recherches génomiques comme celles que nous venons de
mener, est double. Tout d’abord, elle réside en une meilleure compréhension
des mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue des
complications du DT2 et pourrait déboucher sur l’identification de cibles
thérapeutiques à l’instar de la cancérologie, domaine d’application dans lequel
ce concept a été initié et largement développé403,404.
Cette plus value semble également au moins aussi importante sur l’amélioration
des outils de profilage des patients. Cette démarche qui vise à mieux identifier
les patients à risque et optimiser leur prise en charge passe dans un premier
temps par le raffinement des scores de risque génomiques, puis leur
l’intégration aux scores de risque clinico-biologiques puis leur évaluation par les
outils de la recherche clinique interventionnelle.
Nous sommes persuadés de l’effet bénéfique du transfert des découvertes de
l’épidémiologie génétique vers le management clinique du patient. Les outils,
notamment génomiques, de la médecine personnalisée telle qu’elle a été
conceptualisée jusque là, sont autant de leviers supplémentaires pour modifier
les comportements et améliorer la santé de manière pragmatique, à l’échelle
individuelle et sociétale.
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ANNEXES
227
228
ANNEXES
Les centres participants à l’étude DIAB 2 NEPHRO GENE sont remerciés ici :
Poitiers – Service de Diabétologie (centre de coordination) & CIC 0802: F
Duengler, R Maréchaud, D Gendre, F Torremocha, L Labbe, X Piguel, A Miot,
PJ Saulnier, S Hadjadj (Investigateur Principal) ; Poitiers – Service de
Nephrologie : G Touchard, F Bridoux, A Thierry, R Abou-Ayache, S Belmouaz ;
Poitiers – Centre de prévention des maladies cardiovasculaires: D Herpin, Ph
Sosner, Angers - Service de Diabétologie: G Guilloteau, B, Bouhanick; PH
Ducluzeau, P Ritz ; Angoulême - Service de Diabetologie: A-M ChameauLagarde, M. Bonnefoy ; Corbeil-Essonnes - Service de Diabetologie: G
Charpentier, JP Riveline, D Dardari, C. Petit ; Limoges - Service de
Diabétologie: F. Archambeaux-Mouveroux, S. Gallina ; Nancy - Service de
Diabétologie : Ph Bohme, B Guerci, I. Glatz, H. Hallage ; Narbonne -Service de
Diabétologie : N. Vigier, JP Courrèges ; Niort - Service de Nephrologie: A
Séchet, M Baron ; Paris Bichat - Service de Diabétologie : A Ankotche, R
Roussel, M Marre ; Rennes - Service de Diabétologie : C Faure-Gérard, JY
Poirier, D Maugendre ; St Mandé – HIA Begin - Service de Diabétologie : B.
Bauduceau, O. Dupuy, H. Mayaudon, J. Margery, R. Poyet ; Toulouse - Service
de Diabétologie : P Gourdy, M Matta, H Hanaire ; Tours – CIC 0202 , Service
de Diabétologie et Service de Nephrologie : JM Halimi, P Lecomte, M
François ; Valenciennes - Service de Diabétologie
: O. Verier-Mine ;
Valenciennes - Service de Nephrologie: P Vanhile
229

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