Principe, intérêts et limites

Spectrométrie de masse et
Mycobactéries
MycoMed 15 Octobre 2015
Dr Laurent Raskine
Principe
Spectrométrie de masse de type
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization –
Time Of Flight
sur le postulat qu’une
espèce bactérienne possède
une empreinte protéique
unique
Quantité
 Basée
Temps de vol
Dépôt + matrice + laser : ionisation des protéines
Accélération, séparation des ions en fonction de leur masse/charge
Détection des ions: obtention d’un spectre protéique
Comparaison de l’empreinte spectral de l’échantillon avec les
spectres de la base de données
 Microorganismes « entiers »
 Dépôt sur la plaque
 Bases de données disponibles
Optimiser le résultat
Etape d’extraction nécessaire
Optimiser le résultat
Etape d’extraction nécessaire
Protocole d’extraction / inactivation
pour test de mycobactérie sur VITEK MS®
Utilisation d’un PSM, port de blouses /
gants / manchettes
Milieu liquide
Prélever un aliquote
MGIT : 1,8 ml
Bouteille MP : 3 ml
Milieu solide
Centrifugation
10 min
Lowenstein-Jensen,
Coletsos
2&3
Suspendre une oese de 1µl
dans 500µl d ’éthanol à 70%
Elimination du surnageant
Remise en suspension du culot dans
500µl d’éthanol 70%
Remise en suspension du culot
dans 10 µl d’acide formique 70%
Vortex
Inactivation du
contenu validée
Ajouter 10µl acetonitrile
Manipulation hors PSM
Vortex
Centrifugation 2 min
Déposer 1µl surnageant
Laisser sécher
Ajouter 1µl de matrice HCCA
Transfert de la suspension
dans un tube contenant
des billes en verre 0.5mm
Elimination du
surnageant
Vortex ou Bead beatter
15 min
In 40 µL FA [70%]
5 min
Centrifugation 2 min
Vortex et transfert de la
suspension dans un tube
Eppendorf vide
3
Incubation à température
ambiante 10 min
(temps d’inactivation)
Intérêt de la méthode
Outils de diagnostic pour
 Identification
 Temps technique
 Cout
 Délai de rendu du résultat
 Constitution de bases de données
(Fournisseurs ou base propre)
 Algorithme d’analyse des empreintes spectrales
 Scores
Intérêt de la méthode
Outils de diagnostic pour
 Comparaison de souches
 Détection de la résistance (?)
Limites de la méthode
 Nécessité de culture bactérienne
milieu liquide ou milieu solide
 Etape d’extraction quasi indispensable
(expertise)
 Pas de détection possible directement a partir
de l’échantillon clinique
Limites de la méthode
 (Trop ?) Grande
diversité des espèces de
Mycobactéries
établies sur la base de
séquences d’ADN
Mise à jour et /ou construction
de Bases de référence
A la place ou en complément?
Outil de screening simplement
méthodes conventionnelles
méthodes génotypiques