ESSAIS INTERLABORATOIRES DE MICROBIOLOGIE

ESSAIS INTERLABORATOIRES DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
PROGRAMME 2014
ESSAIS INTERLABORATOIRES (EIL) PORTANT SUR DES PARAMÈTRES MICROBIOLOGIQUES DANS LES
DENRÉES ALIMENTAIRES
L’ASBL REQUASUD (www.requasud.be) organise des essais interlaboratoires (EIL) de microbiologie
alimentaire depuis 1991. En 2013, 18 laboratoires de Belgique et du Luxembourg ont pris part aux EIL
de microbiologie alimentaire de REQUASUD.
L’organisation des EIL est assurée par la Cellule de Coordination de REQUASUD :
Marie-Julie Goffaux
Rue de Liroux, 9 – 5030 Gembloux
+32 (0)81 62 65 90
[email protected]
L’organisation et l’expertise techniques (préparation des matériaux) sont confiées au Laboratoire de
Microbiologie Alimentaire de l’UCL (ELI-M) :
Marleen Abdelmassih
Place Croix du Sud 2 L7.05.12 – 1348 Louvain-la-Neuve
: +32 (0)10 47 85 98
[email protected]
L’analyse statistique des résultats est confiée au statisticien de la cellule de coordination de l’ASBL
REQUASUD :
Elena Pitchugina
Rue de Liroux, 9 – 5030 Gembloux
+32 (0)81 62 65 74
[email protected]
L’expertise statistique est confiée au CRA-W – Département Agriculture et milieu naturel (D3), Unité
Systèmes agraires, territoire et technologie de l’information (U11) :
Contact : V. Planchon
Rue de Liroux, 9 – 5030 Gembloux
+32 (0)81 62 65 74
Les EIL de REQUASUD répondent aux prescriptions de la norme ISO 17043 (demande d’accréditation
en cours auprès de BELAC). L’organisation et la conception des EIL sont décrites dans un Manuel
Qualité (disponible sur demande) et des procédures.
1. OBJECTIFS DES EIL DE MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE DE REQUASUD
L’objectif des EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD est d’évaluer et de démontrer la
performance des laboratoires participants et de suivre leur justesse dans le temps, conformément à la
norme ISO 17043. Les EIL de microbiologie de REQUASUD sont exploités par les laboratoires dans le
cadre de l’évaluation de leurs performances, de la validation de nouvelles méthodes d’analyse, de la
formation continue du personnel ainsi que de l’harmonisation des méthodes au sein de plusieurs
laboratoires.
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Ces EIL incluent la plupart des paramètres analysés en routine, avec des niveaux de contamination
proches de ceux rencontrés en routine :
- Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles
- Dénombrement des B. cereus
- Dénombrement des spores aérobies
- Dénombrement des bactéries lactiques mésophiles
- Dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
- Dénombrement des entérobactéries
- Dénombrement des coliformes totaux
- Dénombrement des E. coli
- Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs
- Dénombrement des C. perfingens
- Dénombrement des levures et moisissures osmophiles/non-osmophiles
- Dénombrement des L. monocytogenes
- Dénombrement des Campylobacter spp
-
Détection de L. monocytogenes
Détection de Salmonella spp
Détection de E. coli O157:H7
L’évaluation de la performance est réalisée pour chacun de ces paramètres analytiques, grâce à une
étude de la fidélité et de la justesse du laboratoire, basée sur les normes ISO 13528 et ISO 5725.
2. ORGANISATION DES EIL
L’ASBL REQUASUD organise annuellement deux EIL de microbiologie, dont le planning est
communiqué aux laboratoires participants l’année précédente.
Pour l’année 2014, le planning des EIL est le suivant :
EIL MIC 14-1 du 20/01/14 :
Matrices analysées : Saucisson de jambon, lait entier UHT
Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles, entérobactéries, coliformes,
E. coli, B. cereus, spores aérobies, bactéries lactiques, S. aureus, anaérobies sulfitoréducteurs, C. perfringens, Campylobacter spp et L. monocytogenes
Recherche de salmonelles et de E. coli O157:H7
EIL MIC 14-2 du 08/09/14 :
Matrices analysées : Saumon fumé, lait de soja, cake
Dénombrement des germes totaux aérobies mésophiles, entérobactéries, coliformes,
E. coli, B. cereus, bactéries lactiques, S. aureus, , anaérobies sulfito-réducteurs, C.
perfringens et des levures et moisissures (osmophiles et non-osmophiles)
Recherche de L. monocytogenes
Plusieurs semaines avant le début de l’EIL, des instructions claires sont envoyées aux laboratoires
(formulaire F MIC E07), par courrier électronique, pour l’analyse des objets soumis à l’essai. Ce
formulaire comprend les instructions spécifiques sur la réception (date, mesure de la température de
réception), la conservation (à 4°C) des échantillons, leur analyse et la manière d’enregistrer et de
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retourner les résultats d’essais (adresse mail, date limite). Les objets soumis à l’essai doivent être
analysés à la date imposée et traités de la même manière que les échantillons de routine.
Les échantillons sont distribués par des transporteurs professionnels, en conditions de réfrigération et
le jour de leur conception. Chaque laboratoire reçoit ainsi un lot de matériaux pour essai réfrigérés,
dans un sachet nominatif. L’analyse est effectuée par tous les laboratoires le jour suivant la réception
des échantillons. A partir de la date de réception des échantillons, les laboratoires participants
disposent de 9 jours pour envoyer leurs résultats d’analyses à la cellule de coordination, en
complétant le formulaire F MIC E07 transmis.
Les méthodes d’analyse utilisées par les différents laboratoires doivent être des méthodes de
référence ou des méthodes alternatives validées suivant l’ISO 16140 appartenant à la liste des
méthodes reconnues par l’AFSCA; ceci afin d’éviter la production de résultats trop différents devant
subir un traitement statistique séparément. Si une autre méthode est utilisée par un laboratoire,
l’organisateur évaluera la méthode en question et décidera d’accepter ou non la demande de
participation du laboratoire concerné. En cas de doute, l’organisateur vérifie statistiquement si les
méthodes différentes donnent des résultats significativement différents, c’est-à-dire si la différence
entre les niveaux de contamination moyens obtenus est supérieure à 0,3 log (limite de productivité
généralement admise pour les milieux gélosés, selon l’ISO 11133-2). Si la différence est bien
supérieure à 0,3 log, les résultats des méthodes concernées seront analysés en clusters séparés (sauf
si le plus petit cluster contient moins de 6 résultats, auquel cas il sera exclu de l’analyse statistique).
Un rapport d’essai est transmis à chaque laboratoire participant dans les 2 mois suivant le retour des
valeurs observées à la cellule de coordination. Ce rapport fait état de leur performance individuelle et
permet aux laboratoires de se situer par rapport à l’ensemble des participants.
En cas de contestation des résultats, les laboratoires ont la possibilité d’introduire une réclamation
auprès de la cellule de coordination de REQUASUD.
3. MATÉRIAUX D’ESSAI
Deux catégories de matériaux pour essai sont intégrées dans les EIL de microbiologie alimentaire de
REQUASUD :
• Matrices alimentaires naturellement contaminées et artificiellement inoculées : La moitié des
matériaux pour essai est constituée de matrices alimentaires naturellement contaminées et
artificiellement inoculées, représentatives des échantillons analysés par les laboratoires en routine.
Les matrices naturellement contaminées sont généralement de type saumon fumé, saucisson de
jambon, cake ou lait cru.
• Matrices alimentaires stériles inoculées : L’autre moitié des matrices alimentaires utilisées est
stérile (généralement du lait entier ou du lait de soja) et artificiellement contaminée, afin de garder un
contrôle sur les valeurs cibles en cas de forte contamination naturelle des autres matrices.
Les matériaux d’essai sont préparés par le laboratoire expert technique (laboratoire ELIM de l’UCL),
suivant une procédure validée incluant une étape d'homogénéisation. L’homogénéité des lots
distribués lors de chaque campagne d’EIL est validée par l’organisateur suivant une procédure
statistique. La stabilité des objets soumis à l’essai fait également l’objet d’une validation sur la durée
de l’EIL. Les conclusions des tests d’homogénéité et de stabilité des objets soumis à l’essai sont
présentées dans le rapport d’EIL.
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Les valeurs assignées des matériaux d’essai sont déterminées a posteriori comme étant la moyenne
consensuelle des participants. Les objets sont introduits en double pour permettre une évaluation de
la répétabilité de chaque laboratoire (ISO 13528 et ISO 5725).
4. ANALYSE STATISTIQUE
L’analyse statistique des résultats d’EIL est réalisée suivant les prescriptions des normes ISO 13528 et
ISO 5725, comme décrit brièvement ci-dessous.
4.1 COMPILATION DES DONNÉES
Avant tout calcul statistique, l’ensemble des données est compilé et transformé en log afin que ces
dernières suivent une distribution normale. A ce stade, les valeurs de type « inférieur à » sont
remplacées par la moitié de la valeur indiquée (par exemple, un résultat « < 100 CFU/g » sera
remplacé par « 50 CFU/g ») afin de permettre l’analyse statistique. Les valeurs de types « supérieur à »
seront remplacées par le même résultat sans le signe « > » (par exemple, un résultat « > 100 CFU/g »
sera remplacé par « 100 CFU/g ») pour permettre l’analyse statistique, et le z-score obtenu se verra
ajouter le signe « > ».
4.2 DÉTECTION DES VALEURS ABERRANTES POUR LA VARIANCE OU LA MOYENNE
Les valeurs suspectes et aberrantes pour la variance ou la moyenne sont détectées respectivement
grâce aux tests de Cochran et de Grubbs (suivant la norme ISO 5725). Les valeurs suspectes sont
signalées par un symbole « # » dans les tableaux de résultats. Les valeurs aberrantes sont signalées
par un symbole « ## » et éliminées de la suite de l’analyse statistique.
4.3 DÉTERMINATION DE LA VALEUR ASSIGNÉE DES MATÉRIAUX D’ESSAI
Dans les EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD, la valeur assignée des matériaux d’essai est
la moyenne des résultats obtenus par tous les participants, après suppression des valeurs aberrantes.
4.4 ECART-TYPE POUR L’ÉVALUATION DES PERFORMANCES
L’écart-type robuste (s*) est utilisé dans le calcul des z-scores, et sert donc à l’évaluation de la justesse
des laboratoires. Il est également utilisé pour établir les limites de tolérance (ou incertitude élargie
« U ») autour de la valeur cible, suivant la formule U95% = 2 s*. Sur les graphiques de résultats d’EIL, ces
limites de tolérance apparaissent comme des pointillés autour de la valeur assignée.
Dans les EIL de de microbiologie alimentaire de REQUASUD, s* est calculé comme étant la moyenne
robuste de tous les résultats obtenus durant les EIL REQUASUD depuis 2002. Cette moyenne robuste
est calculée au moyen de l’ “Algorithme A” de l’ISO 13528.
Cet écart-type robuste est calculé pour chaque paramètre analysé lors des EIL. Il est re-calculé
annuellement jusqu’à ce qu’un minimum de 10 résultats aient été accumulés ; il peut ensuite être fixé.
Le tableau ci-dessous récapitule les écart-types robustes de la chaine Microbiologie de REQUASUD
pour chaque paramètre analytique (données 2002 – 2012).
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Paramètre
Germes totaux
Lactiques
S. aureus
B. cereus
Spores aérobies
Entérobactéries
Coliformes
E. coli
Anaérobies sulfito-réducteurs
Clostridium perfringens
L. monocytogenes
Levures
Moisissures
Campylobacter spp
Germes totaux anaérobies
s* REQUASUD
0,25
0,25
0,25
0,25
0,35
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
(non figé)
0,25
0,25
(non figé)
(non figé)
Note : L’utilisation de s* robustes basés sur une accumulation de données est un choix de
REQUASUD afin d’augmenter la fiabilité de l’analyse statistique. Toutefois, lorsque le nombre de
participants est supérieur à 10, il est tout aussi correct d’utiliser le sR du seul EIL considéré. Chaque
laboratoire a donc la possibilité de recalculer ses z-scores en utilisant les sR propres à l’EIL, qui sont
donnés dans le rapport d’EIL.
4.5 JUSTESSE
L’évaluation de la justesse est basée sur le calcul des z-scores : les résultats de chaque participant sont
comparés à la valeur assignée, avec une zone de tolérance (proportionnelle à s*) autour de cette
valeur. Les z-scores reflètent donc la cohérence entre le résultat analytique et la valeur assignée :
z=
où
mi − M
s*
mi est la moyenne des résultats du ième laboratoire ;
M est la valeur assignée ;
s* est l’écart-type pour l’évaluation des performances.
Pour l’interprétation de la justesse, la norme ISO 13528 préconise les limites suivantes sur base de la
valeur absolue du z-score :
[0
2 ] : résultat satisfaisant
]2
3 ] : signe de surveillance
]3
...[ : signe d’action
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4.6 FIDÉLITÉ
L’évaluation de la fidélité des participants est basée sur leur répétabilité, qui est calculée grâce à la
duplication en aveugle de certains échantillons de l’EIL. Chaque laboratoire peut ainsi analyser deux
échantillons identiques, en conditions de répétabilité, ce qui donne des résultats m1 et m2. Le calcul de
la répétabilité limite (r) du laboratoire est alors réalisé comme suit :
sr = STDEV(m1,m2)
r = 2,772 . sr
L’interprétation du r est laissée aux laboratoires ; des limites indicatives peuvent être issues des
normes (par exemple dans les normes ISO 4833, ISO 7932 et ISO 7937).
5. RAPPORT
Dans un délai de 2 mois après le début de la campagne, un rapport (F MIC E03) est envoyé à chaque
laboratoire ayant participé à l’EIL. Ce rapport se compose des parties suivantes :
-
un rappel des objectifs des EIL de microbiologie alimentaire de REQUASUD ;
une description des modalités pratiques de l’EIL (conditions de transport, niveaux
d’inoculation, méthodes d’analyses, …) ;
les résultats de l’EIL et les commentaires de l’organisateur.
5.1 PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE DÉNOMBREMENTS
Pour les analyses quantitatives, la performance des laboratoires est présentée en termes de justesse
(z-score) et de fidélité (répétabilité) de leurs résultats.
Le rapport présente la valeur assignée de chaque matériau d’essai. Celle-ci est calculée comme étant
la moyenne de l’ensemble des résultats, après élimination des valeurs aberrantes. Le niveau
d’inoculation des échantillons n’est donné qu’à titre indicatif.
Pour chaque paramètre quantitatif l’écart-type et le z-score du laboratoire sont donnés.
5.2 PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE DÉTECTIONS
La performance des laboratoires pour les recherches de pathogènes est évaluée sur la sensibilité
(absence de faux-négatifs) et la sélectivité (absence de faux-positifs). Le rapport présente, dans un
tableau, les résultats attendus et les résultats obtenus par les laboratoires.
6. CONFIDENTIALITÉ
Une politique de confidentialité est suivie pour l’organisation des EIL. Un numéro est attribué à
chaque laboratoire participant. Le lien entre l’identité des laboratoires participants et le numéro
attribué n’apparait sur aucun document diffusé, ni en interne, ni en externe dans le réseau à
l’exception du document D RQ E01 (protégé informatiquement) qui est conservé et consultable
uniquement par le coordinateur. Le coordinateur et le responsable techniqueRT de la chaine
microbiologiee sont les seuls à connaitre la correspondance des numéros des différents participants
aux EIL MIC. Chaque laboratoire participant connait uniquement son propre numéro.
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Dans le cadre de législations particulières, l’ASBL REQUASUD pourrait être amenée à transmettre les
résultats des EIL à une autorité particulière. Dans ce cas, les participants seront avertis préalablement
par écrit. Pour l’année 2014, les résultats aux EIL de microbiologie de REQUASUD des laboratoires
agréés seront encodés automatiquement dans le module PT-Scheme de l’AFSCA.
Des mesures sont prises pour garantir la confidentialité des données tout au long du processus. Des
déclarations de confidentialité sont signées par tous les intervenants dans l’organisation des EIL.
7. COLLUSION, FALSIFICATION
En cas de suspicion de falsification ou de collusion entre participants, REQUASUD se réserve le droit de
demander aux laboratoires participants des preuves de la bonne réalisation de l’essai (feuilles de
paillasse, cartes de contrôle, …).
8. PARTICIPATION AUX EIL DE REQUASUD
8.1. CRITÈRES DE PARTICIPATION
Les demandes de participation et les reconductions sont traitées suivant la procédure P RQ C01. Les
critères de participation spécifiques à la chaine MIC sont évalués grâce au formulaire F RQ C25, qui
comprend notamment les points suivants :
-
Etre un laboratoire de microbiologie alimentaire
Utiliser des méthodes d’analyse de référence ou alternatives validées suivant l’ISO 16140
Etre localisé dans une zone géographique compatible avec les tournées de livraison
Etre en mesure de comprendre les instructions dans les langues officielles de l’ASBL (français
et anglais)
8.2. FRAIS D’INSCRIPTION
Pour les laboratoires externes au réseau REQUASUD, le coût de participation annuelle est fixé à
500,00 euros hors TVA. La procédure P RQ C01 définit la gestion des demandes de participation aux
EIL REQUASUD.
8.3. MODALITÉS PRATIQUES
Les laboratoires déjà inscrits aux EIL REQUASUD reçoivent automatiquement une offre pour l’année
suivante. Pour toute nouvelle demande de participation, prendre contact avec :
M-J. Goffaux
Rue de Liroux, 9 – 5030 Gembloux
081 62 65 90
[email protected]
La procédure d’inscription est détaillée dans la P RQ C01 disponible sur demande. L’inscription est
validée après réception du payement.
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