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FACULTÉ DE MÉDECINE
Laboratoire de Chimie Pharmaceutique
Professeur Bernard Pirotte
DÉVELOPPEMENT DE NOUVELLES
CYANOBENZÈNESULFONYLURÉES DIVERSEMENT
SUBSTITUÉES EN TANT QU’ANTAGONISTES DES
RÉCEPTEURS AU THROMBOXANE A 2 .
Sylvie-Mireille BAMBI-NYANGUILE
Pharmacienne
Promoteurs: Professeurs Bernard Pirotte et Jean-Michel Dogné
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et
Pharmaceutiques.
Année académique 2013-2014.
REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, il m’est agréable de remercier vivement le Professeur Bernard
Pirotte. Je lui exprime toute ma gratitude pour m’avoir accueilli et permis de travailler au sein
du Laboratoire de Chimie Pharmaceutique (LCP). Je le remercie pour avoir supervisé mon
travail, m’avoir fait bénéficier de ses conseils, de sa grande curiosité et rigueur scientifique
ainsi que pour son implication et son suivi de mon travail. Ces années passées au sein du LCP
ont été jalonnées de bons et de moins bons moments qui m’ont permis d’évoluer et d’en
arriver là où j’en suis. En espérant avoir été à la hauteur de ses attentes.
Je voudrais exprimer mes vifs remerciements au professeur Jean-Michel Dogné de
l’Université Notre-Dame de la paix de Namur pour avoir accepté d’être le co-promoteur de
cette thèse.
Je souhaite également exprimer ma reconnaissance au Professeur André Gothot, chef
de service de l’unité Hématologie et Immunohématologie du Centre Hospitalier Universitaire
de Liège, pour m’avoir ouvert les portes de son service pour réaliser mes tests sur les
plaquettes humaines (agrégométrie, thromboxane synthase).
Pour la détermination des structures cristallographiques et les études in Silico, je tiens
à remercier respectivement le professeur Luc Van Meervelt de l’Université de Leuven et le Dr
Sébastien Dilly du Laboratoire de Chimie Pharmaceutique de l’Université de Liège pour leur
aide.
Un grand merci au Professeur Jean-François Liégeois du Laboratoire de Chimie
Pharmaceutique de l’Université de Liège pour ses conseils, sa disponibilité et pour son temps
passé à corriger mes multiples manuscrits relatifs à ce travail.
Que les Dr Julien Hanson, Jean-François Renard et Pierre Peters trouvent ici
l’expression de ma profonde reconnaissance pour leur expérience, conseils et aide dans
l’évaluation de l’activité de nos composés sur les récepteurs plaquettaires, la thromboxane
synthase et dans l’agrégation plaquettaire.
i
Je remercie le Dr Pascal de Tullio pour son appui scientifique et ses encouragements
qui ont été d’une aide précieuse.
Je voudrais aussi remercier Mr Kamel Harrouche de l’Université de Jijel, pour sa
collaboration lors des expérimentations réalisées sur l’aorte de rats.
Je remercie tout particulièrement Mr Philippe Neven, Eric Goffin et le Dr Pierre
Francotte, tous collaborateurs au Laboratoire de Chimie Pharmaceutique de l’Université de
Liège, pour leur grande disponibilité à mes multiples sollicitations et parfois pour leur bonne
humeur dont j’avais besoin pendant les moments difficiles. Eric a largement contribué à
l’avancement de ce travail par son don de sang à chaque fois que nous le désirions.
Je tiens à remercier aussi tous les volontaires qui ont participé aux différents
protocoles en donnant de leur sang. Sans eux, il n’y aurait pas eu d’expériences.
Je remercie Stéphane Counerotte pour la réalisation des analyses élémentaires.
J’ai le réel plaisir de saluer tous les membres du Laboratoire de Chimie
Pharmaceutique de l’Université de Liège pour des moments inoubliables passés ensemble et
qui m’ont permis de réaliser cette thèse dans des bonnes conditions.
Qu’il me soit permis de rendre hommage à tous les membres de mon comité de thèse
pour leurs conseils avisés et à tous les membres de mon jury qui me font l’honneur
d’examiner ce travail.
Cette thèse était difficile à réaliser sans la précieuse aide de la Pouponnière Sainte
Adeline qui s’est occupée valablement de mes trois filles en assurant leur accueil. Que tout le
personnel de la Pouponnière Sainte Adeline, et en particulier les puéricultrices du groupe des
petits loups (Murielle, Anne, Annie, Aurélie et Prescilla) et la directrice Madame Médard,
soient assurés de ma profonde gratitude et de ma plus grande considération. Dans mon cœur,
vous faites partie de mon projet et vous m’avez aidé à réaliser mon rêve d’être mère. Merci
pour tout.
Finalement, je tiens à remercier la Coopération Technique Belge (CTB), le service
social de l’Université de Liège, le Pacodel et le service d’aide aux étudiants et stagiaires
ii
étrangers (SESE) pour la confiance qu’ils nous ont accordée en nous octroyant un
financement pour la réalisation de ce travail. Qu’ils veuillent bien trouver dans le présent
mémoire la concrétisation des sentiments de gratitude que nous leur devons.
Je terminerai ces remerciements en ayant une attention particulière pour ma famille,
mes amis et mes proches pour leur réconfort, soutien, patience et encouragements.
Que mes enfants trouvent à travers ce travail, un exemple de courage, d’abnégation et
de volonté.
iii
Résumé
Développement de nouvelles cyanobenzènesulfonylurées diversement
substituées en tant qu’antagonistes des récepteurs au tromboxane A2
Médiateur lipidique, le thromboxane A2 dérive de l'acide arachidonique par la
thromboxane synthase dans la voie des cyclo-oxygénases, parallèlement aux prostaglandines.
Il est synthétisé principalement par les plaquettes et les macrophages où l’enzyme est
surexprimée et est dégradé très rapidement en thromboxane B2 inactif. Le TXA2 intervient
dans l’hémostase et dans la contraction des muscles lisses pour le maintien du tonus
vasculaire. C’est un bronchoconstricteur, un vasoconstricteur et un puissant inducteur de
l’agrégation plaquettaire.
Par ailleurs une surproduction révélée par des taux anormalement élevés de TXB2 a été
mise en évidence dans les pathologies cardiovasculaires, sanguines, rénales et pulmonaires.
L’action du thromboxane résulte de la stimulation du récepteur TP (dont il existe deux
isoformes, TPα et TPβ), un récepteur de la famille des récepteurs couplés aux protéines G.
La démonstration que l’usage des dérivés à action mixte (antagonistes vis-à-vis du
récepteur TP et inhibiteurs de la thromboxane synthase) est corrélé avec un meilleur profil
thérapeutique a ouvert des nouvelles perspectives dans la recherche des molécules plus
prometteuses. Des études de pharmacomodulation avaient permis au laboratoire de Chimie
Pharmaceutique de l’Université de Liège d’identifier les dérivés nitrobenzènesulfonylurées
présentant des propriétés intéressantes comme antagonistes vis-à-vis du récepteur TP et
antiagrégant plaquettaire. Certains de ces dérivés, dont le BM-573 et le BM-613, sont en plus
inhibiteurs de la thromboxane synthase.
Dans ce travail, nous avons développé des analogues originaux du BM-573
comportant un noyau cyanobenzènesulfonylurée. Le but de cette étude était de vérifier l’effet
sur le profil pharmacologique d’une part, du remplacement bioisostérique du groupement
nitro des dérivés nitrobenzènesulfonylurées précédemment synthétisés par un groupement
cyano, et d’autre part, le remplacement du pont NH intercycle par un pont O intercycle.
Ces modulations nous ont permis de générer plus d’une soixantaine des molécules originales.
iv
Nous nous sommes ensuite concentrés sur l’évaluation du potentiel antagoniste des
nouvelles molécules synthétisées vis-à-vis de TPα et TPβ. Le test pharmacologique a consisté
à mesurer la capacité des composés à inhiber la mobilisation du calcium intracellulaire induite
par la stimulation de ces deux isoformes séparément en présence du U-46619 (un agoniste
puissant du récepteur TP).
Des études agrégométriques (turbidimétrie) ont permis de confirmer le pouvoir
antagoniste vis-à-vis du récepteur TP et de révéler leur potentiel antiagrégant. Le pouvoir
antagoniste de certains dérivés (8h, 8e, 7h et 7e) vis-à-vis du récepteur TP, a également été
confirmé sur l’aorte de rat précontractée au moyen d’une solution de U-46619. Au cours de ce
test, les dérivés 7h et 7e se sont montrés plus actifs que le 8h. Par ailleurs, les dérivés 8h et 7h
se sont aussi caractérisés par un puissant effet inhibiteur de la thromboxane synthase,
supérieur à celui du BM-573. De plus la détermination de la toxicité cellulaire du BM-573, en
comparaison avec celle des dérivés 8h et 7h, a permis de mettre en évidence une toxicité
aigüe du BM-573 supérieure à celle observée avec les deux dérivés testés.
v
Summary
Development of new diversely substituted cyanobenzenesulfonylureas
as thromboxane A2 receptor antagonists
Thromboxane A2 is, like prostaglandins, a lipid mediator resulting from the action of
thromboxane synthase on arachidonic acid in the cyclooxygenase pathway. It is mainly
synthesized in platelets and macrophages where the enzyme is overexpressed, and is rapidely
degraded into inactive thromboxane B2. TXA2 is involved in hemostasis and in smooth
muscles contraction where it maintains vascular tone. It’s a bronchoconstrictor, a
vasoconstrictor and a powerful platelet aggregation inductor.
Moreover, an overproduction revealed by unusually high levels of TXB2 has been
highlighted in cardiovascular, renal and pulmonary pathologies. The action of thromboxane
results from the stimulation of the TP receptor (for which two isoforms, TPα and TPβ, have
been reported), a receptor belonging to the G protein-coupled receptor family.
Demonstration that the use of compounds with a mixed activity (TP receptor
antagonists and thromboxane synthase inhibitors) is correlated with a better therapeutic
profile
opens
new
perspectives
in
the
search
of
more
promising
molecules.
Pharmacomodulation studies at the Laboratory of Medicinal Chemistry of the University of
Liege let to the identification of nitrobenzenesulfonylurea derivatives exhibiting interesting
properties as TP receptor antagonists and antiplatelet agents. Some of these derivatives, such
as BM-573 and BM-613, were also found to be thromboxane synthase inhibitors.
In this work, we have developed original analogues of BM-573 comprising the
cyanobenzenesulfonylurea nucleus. The aim of this study was to verify the effect, on the
pharmacological profile, on one hand, of the bioisosteric replacement of the nitro group of
previously described nitrobenzenesulfonylurea derivatives by a cyano group, and on the other
hand, of the replacement of the intercyclic NH bridge by an intercyclic O bridge.
These modulations allowed us to generate more than sixty original molecules.
We then focused on the evaluation of the antagonistic activity of the newly
synthesized molecules on TPα and TPβ. The pharmacological test consisted in measuring the
vi
ability of the compounds to inhibit the mobilisation of intracellular calcium induced by
stimulation of the two isoforms separately in presence of U-46619 (a potent TP receptor
agonist).
Agregometric studies (turbidimetry) were able to confirm the agonistic potency of the
new compounds on the TP receptor and to reveal their antiplatelet activity. The antagonistic
potency of some compounds (8h, 8e, 7h and 7e) on TP receptors was also confirmed on rat
aorta precontracted with a solution of U-46619. During this test, 7h and 7e were found to be
more active than 8h. Moreover, 8h and 7h were also characterized by a potent inhibitory
effect on thromboxane synthase, greater than BM-573. Finally, the determination of cellular
toxicity of BM-573, compared to that of 8h and 7h, revealed an acute toxicity for BM-573
greater than the one observed with the two new compounds.
vii
LISTE DES ABREVIATIONS
AA: Acide arachidonique
GIRK: G protein-regulated inward rectifier
AC: Adénylate cyclase
potassium channel
ADP: Adénosine diphosphate
GP: Glycoprotéine
AINS: Anti-inflammatoire non stéroidien
GPIa/IIa: Complexe de glycoprotéines Ia et IIa
AMPC: Adénosine monophosphate cyclique.
GPIb/IX/V: Complexe de glycoprotéines Ib,
ASA: Acide acétylsalicylique
IX et V
ATP: Adénosine triphosphate
GPIIb/IIIa: Complexe de glycoprotéines IIb et
CCM: Chromatographie sur couche mince
IIIa
COX-1: Cyclooxygénase de type 1
GRK: G protein Receptor Kinase
COX-2: Cyclooxygénase de type 2
GPCR: Récepteur couplé aux protéines G
DAG: Diacylglycérol
GTP: Guanosine triphosphate
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi-
HB-EGF: Heparin binding epidermal growth
um
factor
DMF: Diméthylformamide
HEK 293 (Cellules): La lignée de cellules ré-
DMSO: Diméthylsulfoxide
nales embryonnaires humaines (Human
EDCF: Endothelium Derived Contracting Fac-
embryonic kidney cell line)
tors
HETEs: Acides hydroxyéicosatétraènoiques
EDRF: Endothelium Derived Relaxing factors
15-S-HETE:
EGF: Epidermal growth factor
Acide
15-S-
hydroxyeicosatétraénoïque
EGTA: Ethylèneglycol bis (2-aminoethyl)
HHT:
tetraacetate
acide
12-L-hydroxy-5,8,10-
heptadecatriénoique
EIA: Dosage immunoenzymatique (Enzyme
IP: Récepteur de prostaglandine I2
immunoassay)
IP3: Inositol-1,4,5-triphosphate
eL2: Second extracellular loop
IR: Infrarouge
EPA: Acide 5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentanoique
IV: Intraveineux
ERK: extracellular signal regulated kinase
LDH: Lactate déshydrogénase
ERK1/2: Extracellular signal-regulated kinase
LOX: Lipoxygénase
½
LTs: Leucotriènes
FAK: Focal adhesion kinase
MDA: Malondialdehyde;
FBS: Fetal Bovine Serum
MEK: mitogen-activated and extracellular
FvW: Facteur de Von Willebrand
regulated kinase
GDP: Guanosine diphosphate
MMP: Matrix metalloproteinase
NO: monoxide d’azote
viii
P44/42: MAPK, p44/42 mitogen-activated
RhoGEF: Guanine nucleotide exchange factor
protein kinase
of the small G protein Rho
PAF: Facteur d’activation plaquettaire ( Plate-
RMN: Résonance magnétique nucléaire
let activating factor)
RS: Réticulum sarcoplasmique
PBS: tampon phosphate salin (phosphate
RTK: Receptor tyrosine kinase
buffered saline)
SN1: substitution nucléophile monomoléculaire
PE: Point d’ébullition
SN2: substitution nucléophile bimoléculaire
PF: point de fusion
SNAr: substitution nucléophile aromatique
PGD2: Prostaglandine D2
TM: Domaine transmembranaire
PGE2: Prostaglandine E2
TP: Récepteur au thromboxane A2
PGF2α: Prostaglandine F2α
TRIS: Tris(hydroxyméthyl)aminométhane ou
PGG2: Prostaglandine G2
trométhamine
PGH2: Prostaglandine H2
TS: Temps de saignement
PGI2: Prostaglandine I2 ou prostacycline
TXA2: Thromboxane A2
PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase
TXB2: Thromboxane B2
PIP2: Phosphatidyl-inositol-4,5-diphosphate
TXS: Thromboxane synthase
PKA: Protéine kinase A
TXSis: Inhibiteurs de la thromboxane synthase
PKC: Protéine kinase C
U46619:
(Z)-7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1E,3S)-3-
PLA2: Phospholipase A2
hydroxy-1-octenyl]-2
PLC: Phospholipase C
oxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl]-5-heptenoic
PM: Poids moléculaire
acid
PPP: Plasma pauvre en plaquettes
SQ29548:
7-(3-((2-((phenylamino)carbonyl)
PRP: Plasma enrichi en plaquettes
hydrazino)methyl)-7-
Raf: sérine-thréonine kinases
oxabicyclo(2.2.1)hept-2-yl)-5-heptenoic
RE: Réticulum endoplasmique
acid
RGD: Arginine-Glycine-Asparagine
UV: Ultraviolet
RGS: Régulation de la signalisation des
VEGF: Vascular endothelial growth factor
protéines G (Regulation of G protein
signaling)
ix
-
Table des matières
I.
INTRODUCTION .............................................................................................................. 3
I. 1. Le thromboxane A2 ............................................................................................................. 3
I. 1. 1. Biosynthèse et métabolisme ............................................................................................ 3
I. 1. 2. Rôles physiologiques et physiopathologiques du TXA2 ................................................. 7
I. 1. 2. 1. L’hémostase ................................................................................................................ 7
I. 1. 2. 1. 1. L’adhérence et le changement de forme ................................................................. 8
I. 1. 2. 1. 2. L’agrégation .......................................................................................................... 10
I. 1. 2. 2. Contraction des muscles lisses .................................................................................. 11
I. 1. 2. 2. 1. Musculature lisse vasculaire ................................................................................. 12
I. 1. 2. 2. 3. L’athérosclérose .................................................................................................... 13
I. 1. 2. 2. 4. L’infarctus du myocarde, la thrombose, le diabète et le stress oxydatif ............... 14
I. 1. 2. 2. 5. Embolie pulmonaire .............................................................................................. 14
I. 1. 2. 2. 6. Choc septique ........................................................................................................ 15
I. 1. 2. 2. 7. Préeclampsie ......................................................................................................... 15
I. 1. 2. 2. 8. Asthme .................................................................................................................. 16
I. 1. 2. 2. 9. Cancer ................................................................................................................... 16
I. 1. 2. 2. 9. 1. La prolifération cellulaire et l’invasion ............................................................. 16
I. 1. 2. 2. 9. 2. Angiogenèse tumorale ...................................................................................... 17
I. 1. 2. 2. 9. 3. Métastase........................................................................................................... 17
I. 2. Les récepteurs au thromboxane A2 ................................................................................... 18
I. 2. 1. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) .......................................................... 19
I. 2. 1. 1. Structure des récepteurs couplés aux protéines G ..................................................... 20
I. 2. 1. 2. Exemples de stimuli capables d’activer un récepteur couplé aux protéines G ......... 21
I. 2. 1. 3. Mécanisme de transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G... 22
I. 2. 1. 3. 1. Activation des protéines G .................................................................................... 23
I. 2. 1. 3. 2. Variété des effecteurs cibles des protéines G et transduction du signal ............... 26
I. 2. 1. 3. 2. 1. L’adénylate cyclase (ou adénylyl-cyclase) ....................................................... 27
I. 2. 3. 3. 2. 2. La phospholipase C ........................................................................................... 27
I. 2. 1. 3. 2. 3. La cGMP phosphodiestérase : .......................................................................... 28
I. 2. 1. 3. 2. 4. Les canaux ioniques .......................................................................................... 29
I. 2. 1. 4. Mécanisme de transduction du signal par le récepteur au thromboxane A2 (TP) ..... 32
I. 2. 1. 5. Mécanisme d'atténuation du signal par le récepteur au thromboxane A2 (TP)
33
I. 2. 1. 6. Homodimérisation/hétérodimérisation du récepteur TP ........................................... 34
I. 3. Les modulateurs du thromboxane A2 ................................................................................ 35
I. 3. 1. Les inhibiteurs de la cyclooxygénase ........................................................................... 35
I. 3. 2. Les inhibiteurs de la thromboxane synthase (TXS) ...................................................... 36
I. 3. 3. Les antagonistes vis-à-vis du récepteur au TXA2 ......................................................... 37
I. 3. 4. Médicaments à double action ........................................................................................ 39
II. PRESENTATION DU TRAVAIL ...................................................................................... 43
III. STRATEGIE DE SYNTHESE .......................................................................................... 51
III. 1. Généralités ...................................................................................................................... 51
III. 2. Synthèse des différents dérivés ...................................................................................... 52
III. 2. 1. Première étape de synthèse. ....................................................................................... 55
III. 2. 2. Deuxième étape de synthèse ...................................................................................... 56
III. 2. 3. Troisième étape de synthèse ....................................................................................... 59
III. 2. 4. Quatrième étape de synthèse ...................................................................................... 63
IV. RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................................................... 71
IV. 1. Evaluation pharmacologique.......................................................................................... 71
IV. 1. 1. Introduction et choix du modèle ................................................................................ 71
IV. 1. 2. Estimation de la concentration en calcium intracellulaire induite par 1 µM de U46619. ....................................................................................................................................... 73
IV. 1. 2. 1. Introduction ............................................................................................................ 73
IV. 1. 2. 2. Résultats obtenus dans le test de mesure de la concentration en calcium
intracellulaire mobilisé en présence de l’agoniste stable des récepteurs TP (U-46619). ......... 75
IV.1. 3. Détermination de l’effet antiagrégant plaquettaire des molécules sélectionnées........ 83
IV.1. 3.1. Introduction et protocole .......................................................................................... 83
IV.1. 3. 2. Résultats et discussion ............................................................................................ 84
IV.1. 4. Mesure de la relaxation de l’aorte de rat précontractée par le U-46619 (20 nM) ....... 88
IV. 1. 4. 1. Introduction et protocole ........................................................................................ 88
IV. 1. 4. 2. Résultats ................................................................................................................ 89
IV. 1. 5. Evaluation du pouvoir inhibiteur de la thromboxanesynthase ................................... 91
IV.1. 5. 1. Introduction et protocole ......................................................................................... 91
IV. 1.5. 2. Résultats et discussion ............................................................................................ 92
IV. 1. 6. Mesure de la viabilité des hépatocytes humaines en présence des drogues ............... 93
IV. 1. 6. 1. Mesure de la concentration intracellulaire en ATP ................................................ 94
IV. 1. 6. 1. 1. Méthodes ............................................................................................................ 94
IV. 1. 6. 1. 2. Résultats ............................................................................................................. 95
IV. 1. 6. 2. Mesure de l'activité extracellulaire de la LDH
98
IV. 1. 6. 2. 1. Méthodes ............................................................................................................ 98
IV. 1. 3. 2. 2. Résultats
99
IV. 2. Etudes cristallographiques des benzènesulfonylurées ................................................. 103
V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES .............................................................................. 115
VI. MATERIEL ET METHODES. ........................................................................................ 121
VI. 1. Synthèse organique ...................................................................................................... 121
VI. 1. 1. Matériel .................................................................................................................... 121
VI. 1. 2. Description des modes opératoires........................................................................... 122
VI. 1. 2. 2. Méthode générale de synthèse des dérivés N-alkyl-N’-[2(arylamino/aryloxy/cycloalkylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]urées. ................................. 126
VI. 2. Étude pharmacologique................................................................................................ 135
VI. 2. 1. Test pharmacologique in vitro: test de stimulation du Calcium intracellulaire en
présence d’un agoniste stable (U-46619). .............................................................................. 135
VI. 2. 2. Test pharmacologique ex vivo .................................................................................. 138
VI. 2. 2. 1. Test d’agrégation plaquettaire .............................................................................. 138
VI. 2. 2. 2. Étude de la relaxation de l’aorte de rat précontractée au moyen du U-46619 ..... 140
VI. 2. 2. 3. Étude du pouvoir inhibiteur de la thromboxane synthase .................................... 141
VII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................ 145
VIII. PUBLICATIONS RELATIVES A LA DISSERTATION
189
I.
Introduction
Introduction
2
Introduction
I.
INTRODUCTION
Ce chapitre est consacré aux généralités sur le thromboxane A2, les récepteurs couplés
aux protéines G (et en particulier le récepteur au thromboxane A2) et des exemples de
quelques modulateurs de thromboxane A2.
I. 1. Le thromboxane A2
I. 1. 1. Biosynthèse et métabolisme
Médiateur lipidique, le thromboxane A2 (TXA2) (Figure I-2), dérive de l'acide
arachidonique (Figure I-1), par la thromboxane synthase dans la voie des cyclo-oxygénases,
parallèlement aux prostaglandines (Needleman et al., 1976). Il est synthétisé principalement
par les plaquettes et les macrophages où l’enzyme est surexprimée et est dégradé très
rapidement en thromboxane B2 ou TXB2, inactif (Ellis et al., 1976; Pawlowski et al., 1983;
Brock et al., 1999).
Figure I-1: Acide arachidonique (acide gras polyinsaturé à 4 doubles liaisons)
Figure I-2: Structure chimique du TXA2
3
Introduction
Il existe 3 voies de métabolisation de l’acide arachidonique (Figure I-3):
1.
sous l'action de la lipooxygénase, l’acide arachidonique est transformé
en leucotriènes B4, C4, D4, E4, en acide 15-S-hydroxyeicosatétraénoïque (15-S-HETE)
et en lipoxines A4 et B4 (Murphy et al., 1979; Serhan et al., 1984);
2.
une autre voie dite mineure, est celle des époxygénases (cytochrome P-
450) qui entraîne la formation d'acides époxyéicosatriénoïques (Falck et al., 1997;
Sacerdoti et al., 2003);
3.
et la voie des cyclooxygénases (Samuelsson et al., 1978).
Figure I- 3: différentes voies de métabolisation de l’acide arachidonique
La voie qui nous intéresse est celle de la cyclooxygénase qui conduira à la production
de divers prostanoïdes et thromboxanes (figure I-4). En effet, l’acide arachidonique est libéré
des membranes plasmiques sous l’action de la phospholipase A2 sur la phosphatidylcholine
(Vane et Botting, 1987; Tomlison et al, 1994). Ensuite, la cyclooxygénase transforme l’acide
arachidonique sur deux sites distincts et en deux étapes successives. La première étape est une
dioxygénation permettant la formation de PGG2, la seconde est une peroxydation qui
transforme la PGG2 en PGH2. La PGH2 est hautement instable, son isomérisation ou réduction
permet la production de divers métabolites.
4
Introduction
Sous l'action de la PGI2 synthétase, il se forme la PGI2 ou prostacycline; la TXA2
synthase conduit à la formation du thromboxane A2 (TXA2).
Le TXA2 est un composé instable dont la demi-vie est courte (30 s à 37°C). Il est
rapidement transformé de façon non enzymatique en un dérivé stable, le thromboxane B2
(TXB2) (Hamberg et al., 1975). Les traces de TXA2 se retrouvent au niveau urinaire sous
forme de 2,3-dinor-TXB2 (Robers et al., 1981). Ces deux métabolites peuvent être dosés,
notamment par des techniques immunoenzymatiques que nous décrivons dans le chapitre sur
les résultats et la discussion.
La PGH2 est également à l'origine de la formation de la PGD2 sous l'action de la PGD
synthétase, de la PGF2α par la PGF synthétase et de la PGE2 par la PGE isomérase (Hamberg
et al., 1975).
Figure I-4: biosynthèse du thromboxane A2 et des prostaglandines par la voie des
cyclooxygénases.
Il existe une interaction entre cellules sanguines et vasculaires dans la synthèse des
dérivés eicosanoïques. Ainsi, les prostaglandines G2 (PGG2) et H2 (PGH2) peuvent être
transférées des plaquettes aux cellules endothéliales qui les convertissent en prostacycline
(Furchgott et Zawadzki, 1980; Mcadam et al., 1999; Vane et Corin, 2003; Wong et al., 2005;
Fetalvero et al., 2006).
5
Introduction
Il existe également une voie de synthèse du TXA2 et PGI2 via la forme inductible de la
cyclooxygénase (COX-2) (Garcia-Cohen et al., 2000; Feletou et al., 2011; D'Abril Ruíz-Leyja
et al., 2013).
Par ailleurs, il apparaît que le TXA2 dérivé des plaquettes peut, par action paracrine,
entraîner une surexpression de la COX-2 endothéliale et stimuler la synthèse de PGI2
(Caughey et al., 2001a; Caughey et al., 2001b).
Pratiquement tous les tissus sont capables de synthétiser de la PGH2, mais son
métabolisme dépend de chaque tissu et est fonction des enzymes qui y sont présentes. Par
exemple, les plaquettes contiennent principalement de la thromboxane synthase (TXS) et
produisent le TXA2 qui contribue à l’agrégation plaquettaire et à la vasoconstriction
(Narumiya et al., 1999). Les cellules endothéliales, au contraire contiennent de la
prostacycline (PGI2) synthase qui métabolise le PGH2 en PGI2, puissant antiagrégant et
vasodilatateur (DeWitt, 1991; Jones et al., 1993; Smith et al., 1996).
Il est intéressant de noter que la synthèse de PGI2 par les cellules endothéliales est
augmentée chez des patients avec des pathologies associées à une activation plaquettaire
(FitzGerald et al., 1984), ce qui renforce la notion d’équilibre entre la production de PGI2 et
de TXA2 dans la régulation hémostatique circulatoire.
Les axes AA-PGH2-TXA2 de la plaquette et AA-PGH2-PGI2 de la cellule endothéliale
semblent interagir et se réguler mutuellement. En effet, Cheng et son équipe ont mis en
évidence l’effet modulateur de la PGI2 sur l’action cardio-vasculaire du TXA2 in vivo (Cheng
et Harris, 2004). Et certaines études in vitro ont montré que le TXA2 produit par les plaquettes
pouvaient stimuler l’expression de COX-2 par les cellules endothéliales et par conséquent
augmenter la production de PGI2 (Caughey et al., 2001b).
Etant donné l’importance de la COX-2 dans la production de PGI2 par la cellule
endothéliale, tant à l’état basal qu’en présence d’athérosclérose, on comprend que l’utilisation
d’inhibiteurs spécifiques de la COX-2 puisse contrecarrer le versant antithrombotique dont la
PGI2 est le principal acteur dans l’homéostasie plaquette/vaisseau (Mehta et Mehta, 1982;
Mcadam et al., 1999). Cette hypothèse pourrait expliquer les effets prothrombotiques
rapportés en clinique chez les patients à risque lors de l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de la
COX-2 (Funk et FitzGerald, 2007).
6
Introduction
I. 1. 2. Rôles physiologiques et physiopathologiques du TXA2
Du point de vue physiologique, le TXA2 intervient dans l’hémostase (dans les petits
vaisseaux, les plaquettes secrètent le TXA2 qui a des propriétés proagrégantes et
vasoconstrictrices) (Samuelsson et al., 1976; Charo et al., 1977) et dans la contraction des
muscles lisses pour le maintien du tonus vasculaire (Svenssen et Fredholm, 1977, Yamada et
al., 2003). C’est un bronchoconstricteur, un vasoconstricteur et un puissant inducteur de
l’agrégation plaquettaire.
La prostacycline est considérée comme son antagoniste physiologique par régulation
de l’hémostase (Fitzgerald, 1991).
Au niveau physiopathologique, des nombreux travaux ont mis en évidence le rôle du
TXA2. Une surproduction révélée par des taux anormalement élevés de TXB2 a été mise en
évidence dans les pathologies cardiovasculaires, sanguines, rénales et pulmonaires (Hamm et
al., 1987; Davis-Bruno et Halushka, 1994; Devillier et Bessard, 1997; Bing et al.,1999).
Nous décrivons brièvement ci-dessous, les différents phénomènes physiologiques et
physiopathologiques dans lesquels sont impliqués divers prostanoïdes dérivant de l’acide
arachidonique, dont le TXA2.
I. 1. 2. 1. L’hémostase
L’hémostase est le processus physiologique qui permet d’interrompre le saignement
pour éviter l’hémorragie (Bevers et al., 1991).
Lors d’une lésion de la paroi vasculaire, le sous-endothélium est mis à nu et les
plaquettes réagissent avec les constituants thrombogènes du sous-endothélium (collagène,
vWF, facteur tissulaire, le thromboxane A2, …) conduisant au déclenchement de l’activation
des plaquettes (Holmsen, 1991; Solum, 1999). L’activation plaquettaire est un phénomène
comprenant plusieurs étapes: l’adhérence, le changement de forme, l’agrégation, la sécrétion
et la microvésiculation (exposition des phospholipides procoagulants).
7
Introduction
I. 1. 2. 1. 1. L’adhérence et le changement de forme
L’adhérence des plaquettes à la surface sous-endothéliale est un mécanisme faisant
intervenir de nombreux facteurs dont le facteur de Von Willebrand (vWF) et la glycoprotéine
Ib (GpIb) sous forme d’un complexe GpIb-IX-V (Ruggeri, 2002; Nieswandt et Watson, 2003;
Jackson et al., 2003; Ruggeri, 2003; Offermanns, 2006).
Le vWF est une protéine synthétisée par les cellules endothéliales de la paroi
vasculaire et les mégacaryocytes (Sadler, 1991). Le vWF formé dans les cellules endothéliales
est soit sécrété de façon constitutive dans le plasma soit stocké dans les grains de WeibelPalade jusqu’à une sécrétion induite par un stimulus approprié comme la thrombine ou la
fibrine (Sporn et al., 1986).
Le vWF synthétisé dans les mégacaryocytes est, lui, stocké dans les granules
plaquettaires et est sécrété lors de l’activation des plaquettes (Ruggeri et Ware, 1993). Sous
forme libre dans le plasma, le vWF n'adhère pas aux plaquettes tant qu'elles n'ont pas été
activées (Nieswandt et Watson, 2003; Nieswandt et Offermanns, 2004).
Lors d’une brèche vasculaire, le vWF se fixe au collagène contenu dans le sousendothélium, ce qui se traduit par un changement conformationnel du vWF lui permettant
d’interagir avec le complexe GPIb-V-IX présent à la surface plaquettaire (Andrews et al.,
1997; 2004).
Le complexe GpIb-IX-V est un complexe de quatre glycoprotéines possédant des
domaines riches en leucine et contenues dans la membrane plaquettaire: GpIb et GpIb reliées
par un pont disulfure et associées de façon non covalente avec le complèxe GpIX et GpV
(Andrews et al., 1997).
La liaison du vWF au complexe GPIb-V-IX déclenche des signaux intracellulaires
conduisant à l’élévation du calcium cytosolique, à des réarrangements du cytosquelette et à la
dégranulation (Andrews et al., 2004).
La fixation du vWF au complexe GPIb-V-IX induit des signaux d’activation
aboutissant à l’activation de la phospholipase C2 qui va induire la génération de deux
messagers, l’inositol tri-phosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG) par hydrolyse du
phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (PIP2). L’IP3 formé mobilise le calcium cytoplasmique
et le DAG active la protéine kinase C (PKC) et induit le réarrangement du cytosquelette
d’actine. La résultante est une activation de la glycoprotéine GpIIbIIIa, par modification
8
Introduction
conformationnelle de la protéine, qui pourra alors lier le fibrinogène (Blockmans et al., 1995;
Andrews et al., 1997).
La forme discoïde des plaquettes au repos est maintenue par les réseaux de
microtubules et de filaments d'actine situés sous la membrane plaquettaire.
L’adhérence des plaquettes à la surface cellulaire induit des modifications
morphologiques importantes (Blockmans et al., 1995; Wurzinger, 1990). Ainsi, lors de
l’activation plaquettaire, les microtubules dépolymérisent, tandis que la polymérisation des
filaments d’actine débute (Hartwig, 1992). Ces phénomènes aboutissent à un changement de
forme de la plaquette qui devient sphérique et à la formation de pseudopodes (Figure I-5).
Figure I-5: Changement de la forme de plaquettes lors de l’activation.
Dans les plaquettes activées, les granules se regroupent et leurs membranes fusionnent
avec celle du système canaliculaire ouvert. Les molécules thrombogènes sécrétées tels l’ADP,
la sérotonine, la thrombospondine, le fibrinogène et le vWF vont participer au recrutement de
plaquettes non activées circulantes au niveau du site de la lésion et initier ainsi l’agrégation.
9
Introduction
I. 1. 2. 1. 2. L’agrégation
L’agrégation plaquettaire est médiée par le complexe GpIIb/IIIa (glycoprotéine
IIb/IIIa) (Offermanns, 2006). Ce complexe nommé également αIIbβ3 fait partie de la famille
des intégrines, qui se lient à des séquences d'acides aminés particulières: RGD (ArginineGlycine-Asparagine). Cette séquence se retrouve au niveau de protéines comme le
fibrinogène, le vWF, la prothrombine, la fibronectine ou la vitronectine (Shattil et Brass,
1987; Priddle et al., 1998; Critchley, 2000; Tadokoro et al., 2003; Shattil et al., 2004; Bennett,
2005; Ratnikov et al., 2005).
L’intégrine GpIIb/IIIa est composée d’une glycoprotéine GpIIb liant les ions calcium
divalents associée à une glycoprotéine GpIIIa riche en cystéines. Trois sites de liaison pour
des peptides du fibrinogène ont été localisés sur le complexe GpIIb/IIIa (Boneu et Cazenave,
1997).
Le nombre de complexes présents à la surface des plaquettes est d’environ 50 000 et
augmente lors de l’activation plaquettaire par libération de molécules contenues dans les
granules. Une fois activé par le collagène, l’ADP ou bien encore la thrombine, le complexe
peut lier les protéines adhésives (fibrinogène, vWF, fibronectine et vitronectine).
Cette activation est due à un changement de conformation de l'intégrine par un
mécanisme de signalisation «inside-out» permettant alors la liaison des ligands sur l’intégrine.
Le fibrinogène, est une glycoprotéine de poids moléculaire 340000 Da synthétisée par
les hépatocytes. Il est constitué de 3 paires de chaînes polypeptidiques (α, β et γ) liées de
façon covalente par des ponts disulfures situés aux extrémités N-terminales des chaînes
polypeptidiques (Boneu et Cazenave, 1997).
Le fibrinogène possède trois paires de sites de liaison pour le complèxe GpIIb/IIIa:
une séquence de douze acides aminés à l’extrémité C-terminale de ses chaînes γ, une
séquence RGDS et une séquence RGDF situées sur ses chaînes α. Le fibrinogène se lie au
complexe GpIIb/IIIa au niveau d’un domaine RGDS situé sur la chaîne β, au niveau du
dodécapeptide situé sur la chaîne α ainsi qu’à un troisième site de liaison situé entre les
résidus 211 et 237.
Le fibrinogène établit ainsi des ponts entre les plaquettes par liaison au niveau de deux
GpIIb/IIIa situés sur deux plaquettes différentes entraînant ainsi leur agrégation.
Les
complexes
formés
sont
stabilisés
par
la
thrombospondine
(protéine
intraplaquettaire) qui se fixe sur son récepteur (GpIIIb) et au fibrinogène par trois sites
10
Introduction
d’interactions situés sur les chaînes α (région 113-126 et 241-476) et β (région 243-252) du
fibrinogène (Tuszynski et al., 1985; Bacon-Baguley et al., 1990; Bonnefoy et al., 2001).
Le vWF se lie également à la GpIIb/IIIa ce qui conduit à l’étalement des plaquettes, à
leur adhérence irréversible ainsi qu’à l’agrégation en établissant des ponts entre les
glycoprotéines GpIIb/IIIa de plaquettes voisines activées.
Le vWF intervient aussi dans le système de la coagulation en se liant au facteur VIII
(Dahlback et Villoutreix, 2003).
L’adhérence et la contraction des plaquettes lors de l’activation induit une
centralisation des granules ainsi que la sécrétion de leur contenu à l’extérieur de la plaquette
par deux mécanismes dépendant ou non de la voie de l’acide arachidonique selon l’intensité
de la stimulation. La sécrétion concerne les trois types de granules. Les substances libérées
sont biologiquement actives et peuvent renforcer l’agrégation et la sécrétion des plaquettes
(ADP, calcium, fibrinogène et sérotonine), influencer la coagulation (facteur V, fibrinogène,
vWF) et modifier la perméabilité vasculaire (VEGF) et le tonus vasculaire (sérotonine)
(Offermanns, 2003).
I. 1. 2. 2. Contraction des muscles lisses
Les éicosanoïdes vasoactifs sont générés principalement par la voie des
cyclooxygénases. Parmi ceux-ci, le TXA2 et la PGI2 possèdent les effets les plus marqués.
Dès lors, lorsque la cascade de l’acide arachidonique est impliquée, c’est essentiellement
l’équilibre TXA2/PGI2 qui régule le tonus vasculaire (Klockenbusch et al., 2000; Chavarria et
al., 2003;Wong et al., 2005; Fetalvero et al., 2006).
La perturbation de la balance physiologique existant entre les effets de la PGI2 et du
TXA2 au niveau vasculaire expliquerait la survenue d’accidents thromboemboliques, le
développement et la progression de lésions d’athérosclérose, de prolifération néo-intimale, et
l’apparition d’hypertension artérielle en particulier chez des patients qui présentent des
prédispositions génétiques pour les maladies cardiovasculaires (Wong et al., 2005). En effet,
le TXA2 est l’un des principaux prostanoïdes du système cardio-vasculaire susceptible
d’intervenir dans les modulations du tonus vasculaire et de l’interaction plaquettes-paroi
vasculaire. Comme cela a été signalé précédemment, il possède une action pro-agrégante
plaquettaire et se caractérise par de puissantes propriétés vaso- et broncho-constrictrices
(Hamberg et al., 1975; Svensson et al., 1977; Moncada et Vane, 1978; Fiddler et al., 1990).
11
Introduction
De nombreuses études ont démontré son rôle dans la stimulation de la prolifération des
cellules musculaires lisses de la paroi vasculaire et dans l’angiogenèse (Dorn et al., 1997;
Pakala et al., 1997; Pakala et Benedict, 1998; Nie et al., 2008). On note en outre, une
augmentation de la production de TXA2 chez les patients qui présentent diverses pathologies
impliquant un processus d’agrégation plaquettaire accru et une hyperstimulation des cellules
musculaires lisses (Dogné et al., 2000a).
Dans ce contexte, il nous semble utile de mieux évaluer le rôle du TXA2 dans
l’homéostasie de la musculature lisse.
I. 1. 2. 2. 1. Musculature lisse vasculaire
Les découvertes des vingt dernières années faites en biologie de la paroi vasculaire ont
fondamentalement
changé
les
hypothèses
physiopathologiques
des
principaux
dysfonctionnements vasculaires. Ainsi, il est acquis que l'endothélium, par la synthèse et la
libération de nombreuses substances vasoactives, participe au contrôle du tonus vasomoteur
(Lüscher et Barton, 1997; Francois et Coffman, 2004; Feletou et al., 2010).
Les cellules endothéliales répondent à l'action de nombreux médiateurs chimiques
circulants (ADP, ATP, acétylcholine, adrénaline, histamine, sérotonine, UTP...) ou à des
modifications physicochimiques (forces de cisaillements, hypoxie, ...), par une synthèse de
facteurs de relaxation (endothelium derived relaxing factors = EDRF), tels que le monoxyde
d’azote (NO) ou la prostacycline, et/ou de facteurs de vasoconstriction (endothelium derived
contracting factors = EDCF), tels que les endothélines, le thromboxane A2 (TXA2) ou les
radicaux libres (Furchgott et Zawadzki, 1980; Cryer, 1983; Palmer et al., 1988; Lüscher et
Vanhoutte, 1990; Nathan et Xie 1994; Lüscher et Barton, 1997).
La prostacycline (PGI2), synthétisée par une cyclooxygénase et une PGI2 synthétase,
agit sur les cellules musculaires lisses en stimulant ses récepteurs membranaires puis, par
couplage positif à l'adénylate cyclase, induit une augmentation de la concentration d'AMP
cyclique intracellulaire, d’où relaxation (Luscher et Vanhoutte, 1990; Shimokawa et al., 1996;
Shimokawa, 1999). L'EDRF (endothelium derived relaxing factor) ou NO, synthétisé à partir
de la L-arginine par la NO synthase, est apparu comme un puissant vasodilatateur induisant,
par activation de la guanylate cyclase soluble du muscle lisse, une augmentation de la
concentration de GMP cyclique intracellulaire, responsable de la relaxation (Furchgott et
Zawadzki, 1980; Furchgott, 1981; Holzmann,1982; Azuma et al., 1986; Palmer et al, 1988;
12
Introduction
Radomski et al., 1987; Stamler et al., 1992; Mombouli et Vanhoutte, 1999; Loscalzo, 2013).
Les radicaux libres, à faible concentration, stimulent la cyclooxygénase et la prostacycline
synthétase et, donc, induisent une vasodilatation. En revanche, à forte concentration, ils
inactivent le NO et inhibent la production de prostacycline (Harrison, 1997; Cai et Harrison,
2000). Cependant, la production de TXA2 n'est pas atteinte et ce dernier conserve son effet
vasoconstricteur (Endemann et Schiffrin, 2004; Siekmeier et al., 2008).
I. 1. 2. 2. 3. L’athérosclérose
L’athérosclérose se caractérise par un dysfonctionnement endothélial avec une
diminution de la libération de substances vasodilatatrices et une augmentation de la
production de prostanoïdes vasoconstricteurs tels que le TXA2 (Lüscher et al., 1992;
Kobayashi et al., 2004; Dogné et al., 2005).
L’acide acétylsalicylique (Aspirine®) est l’agent thérapeutique le plus utilisé dans la
prévention secondaire des complications cliniques aiguës de l’athérosclérose (Wu et al., 2006)
Son action thérapeutique découle de son effet antiplaquettaire. Cependant, bien que l’aspirine
inhibe la COX-1 et de ce fait la production de TXA2, elle ne bloque pas l’action des autres
eicosanoïdes tels que les acides hydroxyeicosatétranoïques (HETEs) (Pfister et al., 1988; Van
Diest et al., 1996) et les F2-isoprostanes (Pratico et al., 1998), dont la production est accrue
dans l’athérosclérose. Cayatte et son équipe ont étudié le rôle du TXA2 dans le développement
des lésions d’athérosclérose, en comparant les effets de l’aspirine® et ceux de l’antagoniste du
récepteur au thromboxane, le S-18886 (Cayatte et al., 2000). L’aspirine® plus que le S-18886
diminuait significativement le taux plasmatique de TXB2, indiquant ainsi une nette action de
cette dernière dans l’inhibition de la synthèse plaquettaire de TXA2. Le S-18886 exerçait
également une action sur la surexpression d’ICAM-1 par des cultures de cellules endothéliales
humaines stimulées par l’agoniste du récepteur TP, le U-46619 (Cayatte et al., 2000).
Bien que cette étude n’ait pas clairement identifié les dérivés eicosanoïques impliqués,
plusieurs substances potentielles pourraient être envisagées, toutes susceptibles de stimuler le
récepteur TP et dont la synthèse n’est pas inhibée par l’aspirine.
Les données de cette étude suggèrent donc que chez les patients souffrant
d’athérosclérose, des prostanoïdes vasoconstricteurs, autres que le TXA2 et agissant sur le
13
Introduction
récepteur TP, sont activement produits et libérés à la suite de la stimulation des cellules
endothéliales.
I. 1. 2. 2. 4. L’infarctus du myocarde, la thrombose, le diabète et le stress oxydatif
La synthèse du TXA2 est accrue dans les syndromes d’activation plaquettaire comme
l’infarctus myocardique et l’ischémie cardiaque (Xiao et al., 2001; Eikelboom et al., 2002)
l’angine instable (Hamm et al., 1987), et les phénomènes thrombotiques (Saldeen et al., 1993).
Il existe chez les patients diabétiques une altération de la synthèse des dérivés eicosanoïques
avec une production accrue de TXA2 et une réduction de celle de prostacycline (Hendra et al.,
1989; Yamagishi et al., 2001). Ces patients présentent divers troubles plaquettaires,
notamment une hyperagrégabilité et une réponse réduite à certains antiagrégants endogènes
(Cassar et al., 2003; Dogné et al., 2006). Ces troubles plaquettaires sont impliqués dans
l’évolution de la microangiopathie diabétique comprenant la rétinopathie et la néphropathie
(Colwell et al., 1990; Winocour, 1992). Certains travaux, chez le rat, ont démontré une
relation directe entre l’altération de la synthèse des dérivés eicosanoïques et le degré
d’anomalies au niveau des vaisseaux de la rétine dans la rétinopathie diabétique (Zang et al.,
2010).
I. 1. 2. 2. 5. Embolie pulmonaire
Il semble de plus en plus évident que le TXA2 joue un rôle important dans la
pathogénie précoce de l’embolie pulmonaire (Klotz et al., 1984; Oates et al., 1988; Smulders
et al., 2000; Ghuysen et al., 2004). En effet, la libération de TXA2 apparaît dans les premières
minutes qui suivent l’embolie et son degré de production est corrélé avec le risque de
mortalité dans les modèles expérimentaux d’embolie pulmonaire (Utsonomiya et al., 1982;
Reeves et al., 1983). Le TXA2 est le principal médiateur vasomoteur responsable des troubles
hémodynamiques de la première phase, tandis que la prostacycline est active plus tardivement
(Reeves et al., 1983; Smulders et al., 2000).
14
Introduction
I. 1. 2. 2. 6. Choc septique
Le TXA2 est également considéré comme partiellement responsable de l’augmentation
des résistances vasculaires pulmonaires observée après l’administration d’endotoxines et
participerait, avec d’autres médiateurs, à la cascade inflammatoire du choc septique (Wise et
al., 1981; Ogletree et al., 1982; Redl et al., 1991; Lambermont et al., 2004; Efimova et al.,
2007).
I. 1. 2. 2. 7. Préeclampsie
Le TXA2 joue un rôle central dans la prééclampsie, état clinique caractérisé par un
syndrome systémique associant hypertension artérielle, protéinurie, anomalies de l’hémostase,
des fonctions hépatique et rénale et, enfin, ischémie cérébrale (Sibai et al., 2005; Leeman et
Fontaine, 2008).
Cause majeure de morbidité et mortalité foetale et maternelle, son mécanisme exact
demeure peu clair (Sibai, 2003; Duley, 2009). Il est toutefois admis que la prééclampsie est
associée à un déficit de la production intravasculaire de prostacycline et à une libération
excessive de TXA2 (Ness et Roberts, 1996; Sibai, 2003; Vatten, 2004). Ce déséquilibre
explique la plupart des symptômes cliniques que nous venons de citer ci-hauts à savoir
l’hypertension, l’hyperagrégabilité plaquettaire et la chute du débit utéro-placentaire.
Au niveau de la circulation maternelle, ce déséquilibre se manifeste primitivement par
une diminution de la production endothéliale de prostacycline (Bowen et al., 2002; Hauguelde Mouzon et Guerre-Millo, 2006). La production plaquettaire de thromboxane est accrue
uniquement en cas de prééclampsie sévère (Baker et al., 1996; Mutter et Karumanchi, 2008).
Le déséquilibre entre thromboxane et prostacycline est probablement causé par le
stress oxydant qui se manifeste dans la prééclampsie par une augmentation de la peroxydation
lipidique, une diminution de la protection anti-oxydante et une élévation des taux de F2isoprostanes. Le stress oxydant induit ce déséquilibre car les peroxydes lipidiques activent la
cyclooxygénase, stimulant la synthèse de thromboxane tout en inhibant simultanément la
prostacycline synthase (Baker et al., 1996; Mills et al., 1999).
15
Introduction
I. 1. 2. 2. 8. Asthme
Les prostanoïdes, en général, et le TXA2, en particulier, jouent un rôle central dans la
pathogenèse de l’asthme qui est une maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires
(Devillier et al., 1997; Oates et al., 1988). Ainsi, le TXA2 et le PGD2 sont susceptibles
d’induire une bronchoconstriction, une augmentation de la perméabilité vasculaire au niveau
du tractus bronchique, une hyperréactivité bronchique par action sur les récepteurs du TXA2
(Devillier et al., 1997; Nagase et al., 1997; Shi et al., 1998; Hong et al., 2005.). La PGE2 et la
prostacycline sont à l’inverse, bronchoprotecteurs.
I. 1. 2. 2. 9. Cancer
Une surexpression de COX-2 a été démontrée dans plusieurs types de néoplasies telles
que celles de la tête et du cou (Slotman, 1988), du sein (Jiang et al., 2003; Wang et Dubois,
2004; Watkins et al., 2005), des poumons (Li et Tai, 2013), du colon (Honn et Sloane, 1983;
Pradono et al., 2002; Dovizio et al., 2013), du pancréas (Woutersen et al., 1999; Wang et
Dubois., 2010), et de la prostate (Nie et al., 2004; Nie et al., 2008). Des travaux récents ont
démontré que les prostanoïdes dérivés de l’activité accrue de COX-2 avaient un profil
différent en fonction de la progression néoplasique. Parmi ceux-ci, le TXA2 apparaît comme
un métabolite important impliqué dans différentes étapes de la progression tumorale, à savoir
la prolifération cellulaire, l’invasion, l’angiogenèse tumorale et la dissémination métastatique
(Cathcart et al., 2010; Li et Ta, 2013; Yang et al., 2013).
I. 1. 2. 2. 9. 1. La prolifération cellulaire et l’invasion
Des études effectuées sur tissus tumoraux humains, notamment dans le cancer du
poumon, le carcinome spino-cellulaire du larynx, le glioblastome ou le méningiome ont
montré des taux tissulaires élevés de TXB2 par rapport à ceux de tissus normaux (Pinto et al.,
1993; Kurzel et al., 2002; Ermert et al., 2003; Nie et al., 2004). Sous un autre angle, Nanji a
démontré que le potentiel métastatique était corrélé positivement aux taux de TXS
(thromboxane synthase) suggérant ainsi un rôle éventuel de cette enzyme dans le
développement tumoral (Nanji, 1993).
16
Introduction
Divers travaux in vitro ont également démontré le rôle du TXA2 dans la prolifération
tumorale (Kurzel et al., 2002; Ekambaram et al., 2011). Finalement, le gène de la
thromboxane synthase a été décrit comme un gène favorisant l’invasion tumorale et dont la
transcription est activée par le proto-oncogène ets-1 (Keehn et al., 2003; Alipov et al., 2005;
Callia et al., 2011).
I. 1. 2. 2. 9. 2. Angiogenèse tumorale
L’angiogenèse est une étape importante dans le développement du cancer. Diverses
données évoquent l’implication du TXA2 dans ce processus. En effet, le TXA2 est un
stimulateur de la migration des cellules endothéliales in vitro (Daniel et al., 1999; Nie et al.,
2000; Salvado et al., 2012). Un exemple démontrant l’implication in vivo du TXA2 dans
l’angiogenèse tumorale est fourni par Pradono et son équipe qui ont démontré que le transfert
du gène de la thromboxane synthase dans des cellules néoplasiques de rat augmentait le
développement tumoral et l’angiogenèse (Pradono et al., 2002).
I. 1. 2. 2. 9. 3. Métastase
Diverses lignées cellulaires sont susceptibles d’induire l’agrégation plaquettaire, étape
précoce de la dissémination métastatique hématogène (Honn et Sloane, 1983; Donati, 1994;
Pinedo et al., 1998; Rickles, 2006).
Divers mécanismes sont impliqués dans ce processus notamment la libération de
médiateurs tels que la thrombine ou l’ADP ou une interaction directe médiée par les
glycoprotéines membranaires (Li et Tai, 2013). Le résultat final de ces différents mécanismes
est une agrégation plaquettaire accompagnée d’une libération importante de TXA2 (Picker et
al., 2011; Lian et al., 2013). En effet, l’inhibition de la synthèse ou de l’action de TXA2
apparaît comme une approche suffisante dans la prévention de l’agrégation plaquettaire
induite par les cellules tumorales aussi bien in vitro qu’in vivo (Nie et al., 2000; de Leval et al.,
2003; Bambace et Holmes, 2011).
Notons que le TXA2 exerce les effets biologiques que nous venons de décrire, par
fixation sur le récepteur au TXA2 appelé récepteur TP (Hirata et al., 1991; Kinsella, 2001).
17
Introduction
Le récepteur au TXA2 joue un rôle primordial dans le processus physiologique et
physiopathologique mettant en jeu le TXA2. De ce fait, il s’avère indispensable pour nous,
dans cette partie introductive, d’expliquer sommairement ce concept. Viendront ensuite
quelques généralités sur les médicaments modulateurs de TXA2.
I. 2. Les récepteurs au thromboxane A2
L’organisme, sollicité en permanence par son environnement, est amené à analyser
simultanément des milliers d’informations de natures diverses allant de simples photons à des
molécules odorantes en passant par des hormones, des acides aminés et des nucléotides (Salon
et al., 2011).
La réception de ces informations et leur décodage par les cellules nécessitent la
présence de récepteurs spécifiques présents à l’interface entre le milieu extracellulaire et le
milieu intracellulaire (Salon et al., 2011).
L’action du TXA2 est pour sa part consécutive à la stimulation d’un récepteur
spécifique, le récepteur TP (Thromboxane Prostanoïde), comme dit au chapitre précédent. Il
s’agit d’un récepteur à sept domaines transmembranaires qui appartient à la grande famille
des récepteurs couplés aux protéines G (Kinsella, 2001).
Le récepteur TP est issu d'un seul gène mais existe sous deux isoformes, TPα et TPβ
(Coleman et al., 1994). Elles sont identiques pour leurs 328 résidus aminoterminaux (Hirata et
al., 1996; Narumiya et al., 1999; Halushka, 2000). En revanche, des divergences ont été
observées sur la partie C-terminale (cytosolique) pour laquelle une séquence de 41 acides
aminés remplace les 15 de la séquence placentaire TPα (Nusing et al., 1993; Raychowdhury et
al., 1994; Miggin et Kinsella, 1998). L'analyse par Southern blot n'a pas révélé la présence
d'un gène distinct et les auteurs ont retenu l'hypothèse d'un épissage alternatif de l’ARNm par
rétention d'un intron pour expliquer l'existence de TPβ (Habib et al., 1999; Raychowdhury et
al., 1994).
Le récepteur TP n'existe pas seulement à la surface des plaquettes mais a été mis en
évidence dans une quinzaine de tissus, notamment au niveau des systèmes cardio-vasculaire
(endothélium et cellules musculaires lisses), nerveux et respiratoire, aorte, les yeux (Stahl et
18
Introduction
al., 1986; Namba et al., 1992; Borg et al., 1994; Yamamoto et al., 1995; Miggin et Kinsella,
1998; Batshake et al., 1999; Walsh et al., 2000; Kinsella et al., 2001).
Bien que la forme α du TP prédomine dans les tissus étudiés, le rapport TPα/TPβ varie
considérablement d'un tissu à l'autre. En particulier, alors que l'ARNm des deux isoformes a
été détecté dans les plaquettes, seule la forme α semble être présente à la surface de ces
cellules (Habib et al., 1999).
I. 2. 1. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)
Ces récepteurs sont ainsi nommés car en réponse à un ligand, ils ont la capacité de
recruter et d'activer des protéines G intracellulaires. Les protéines G une fois activées,
transmettent le signal provenant du récepteur à différents effecteurs intracellulaires permettant
la génération d’une réponse cellulaire appropriée (Bockaert et Pin, 1998; Bockaert et al.,
2003; Dalrymple et al., 2008) (Figure I-6).
Figure I-6: Structure de récepteur couplé aux protéines G
L’isolement puis le clonage des RCPG a permis d’identifier plus de 1000 récepteurs
couplés aux protéines G (Bockaert et pin, 1999). Chez l’homme autour de 900 gènes dont
environ 500 correspondent aux récepteurs olfactifs et gustatifs, 400 à des récepteurs capables
19
Introduction
de lier des ligands endogènes et plus de 200 récepteurs sont orphelins (Takeda et al., 2002;
Fredriksson et al., 2003; Fredriksson et Schioth, 2005; Vassilatis et al., 2003).
L’hétérogénéité de ces récepteurs assure une reconnaissance très large de signaux tant
externes (molécules de goût, odeurs, lumière, …) qu’internes (neurotransmetteurs et
hormones). De ce fait, les récepteurs couplés aux protéines G constituent la plus grande
famille de récepteurs membranaires de mammifères puisqu’elle représente 3.4 % du génome
(Bockaert et Pin, 1999; Gershengorn et Osman, 2001).
Une large partie de la pharmacologie cardio-vasculaire et neurologique repose sur la
connaissance de ces récepteurs et sur la recherche de molécules d’intérêt thérapeutique
susceptibles d’interférer avec eux, de façon agoniste ou antagoniste (Callis et al., 2009;
Bernardo et al., 2010).
Cette famille de récepteur est très importante non seulement du point de vue du grand
nombre de récepteurs, mais aussi de la diversité des implications dans les divers processus
physiologiques (vision, olfaction, médiation de l’action des hormones et des neuropeptides)
(Pierce et al., 2002).
I. 2. 1. 1. Structure des récepteurs couplés aux protéines G
La famille de récepteurs couplés aux protéines G possède une architecture commune
basée sur le modèle de la rhodopsine dont la structure tridimensionnelle a été résolue en 2000
(Palczewski et al., 2000). La structure des RCPG est caractérisée par (Fredriksson et al., 2003;
Harikumar et al., 2007; Milligan, 2009; Fotiadis et al., 2010) (Figure I-7):
•
une extrémité N-terminale extracellulaire qui peut subir des
modifications post-traductionnelles de type N-glycosylation ou acylation,
•
7 hélices α trans-membranaires numérotées TM1 à TM7, reliées par 3
boucles intracellulaires numérotées I1, I2, I3 et 3 boucles extracellulaires El, E2, E3,
•
un pont disulfure entre les boucles E1 et E2,
•
une extrémité C-terminale intracellulaire qui possède parfois des sites
d'ancrage lipidique dans la membrane (création d'une 4ème boucle, I4).
20
Introduction
Ces sites d'ancrage résultent d'une modification réversible de la cystéine par
palmitoylation (Salon et al., 2011; Zheng et al., 2012). Cette extrémité peut être phosphorylée
sur différents résidus par la protéine kinase A, la protéine kinase C ou les GRK (G-proteincoupled receptor Kinases) (Palczewski et al., 1991; Ohguro et al., 1993; 1996; 1998).
Le domaine N-terminal orienté du côté extracellulaire est opposé au domaine Cterminal intracytoplasmique (Bockaert et Pin, 1999; Pierce et al., 2002; Rasmussen et al.,
2011).
Figure I-7: Structure de récepteur couplé aux protéines G selon Zheng et al., 2012.
I. 2. 1. 2. Exemples de stimuli capables d’activer un récepteur couplé aux protéines G
Les récepteurs couplés aux protéines G reconnaissent des ligands ayant des structures
extrêmement variées entre autres, les protéines, les peptides, les amines, les acides aminés, les
lipides (prostaglandines), les nucléotides, les nucléosides, les photons, les molécules
olfactives et gustatives, le Ca2+, les protéases (ex: thrombine, trypsine). On estime que 60%
des médicaments utilisés actuellement ont pour cible ce type de récepteurs (Kroeze et al.,
2003; Vassilatis et al., 2003; Bjenning et al., 2004; Doggrell, 2004; Dahl et Sylte, 2005;
Overington et al., 2006; Milligan, 2009).
21
Introduction
I. 2. 1. 3. Mécanisme de transduction du signal par les récepteurs couplés aux protéines G
La reconnaissance des molécules messages par les récepteurs membranaires constitue
la première étape de la communication cellulaire (Houslay et al., 1986; Nakahata et al., 1989;
Bhandawat et al., 2005). L'interaction d'un ligand avec son récepteur initie une cascade
d'événements moléculaires faisant intervenir les éléments suivants (Houslay et al., 1986;
Nakahata et al., 1989):
•
les protéines G,
•
les
effecteurs
des
protéines
G
(enzymes,
canaux
ioniques,
transporteurs,…),
•
les messagers intracellulaires (seconds messagers: AMPc, IP3, Ca2+, le
diacyl-glycérols ou DAG,…),
•
les protéines cibles des messagers.
Finalement l'ensemble de ces évènements conduit à des réponses cellulaires variées
localisées, selon les cas, au niveau de la membrane plasmique, cytosolique ou nucléaire (Gold
et al., 1997) (Figure I-8).
22
Introduction
Figure I-8: Schéma général de la transduction du signal par les RCPGs
I. 2. 1. 3. 1. Activation des protéines G
Les protéines G représentent les principaux effecteurs des RCPG et répondent toutes
au même mécanisme d’activation. Ce sont des hétérotrimères α, β et γ à l’état inactif
(Milligan et Kostenis, 2006; Oldham et Hamm, 2008; Rasmussen et al., 2011).
Les sous-unités βγ sont toujours associées. Compte tenu de la diversité des sous-unités,
les combinaisons hétérotrimériques sont nombreuses (Jastrzebska et al., 2010; 2011a; 2011).
23
Introduction
Les protéines G sont ancrées à la membrane plasmique par un groupement myristoyl
pour α et un groupement farnésyl ou géranyl-géranyl pour les dimères βγ (Jaspard, 2011)
(Figure I-9).
Figure I-9: structure de la protéine G selon Jaspard.
Les protéines G (αβγ) sont nommées selon le type de sous-unité α. Ainsi le complexe
hétérotrimérique nommé Gs contient αs, Gi contient αi et Gq contient αq, ....
La diversité des protéines G est moindre que celle des RCPG, mais permet de
nombreuses combinaisons entre les sous-unités Gα et Gβ, Gγ (Jastrzebska et al., 2010).
Il existe au moins:
•
17 gènes codant pour la sous-unité Gα
•
5 gènes codant pour la sous-unité Gβ
•
12 gènes codant pour la sous-unité Gγ
Les diverses classes de sous-unités α sont (Gao et al., 2001; Gallet et al., 2003; Honma
et al., 2006):
•
•
la classe Gs ("s" pour stimulateur de l'adénylate cyclase) contient :
•
quatre types de sous unités αs, issues d'un épissage alternatif
•
la sous unité Golf (olfacteur) spécifique des récepteurs olfactifs
la classe Gi/o ("i" pour inhibiteur de l'adénylate cyclase) contient :
24
Introduction
•
deux types de transducine (αt1, αt2 des cellules en bâtonnet et en
cône de la rétine) issues d'un épissage alternatif
•
•
trois sous unités Gi
•
trois sous unités Go ("o" pour "other")
•
la sous unité Gz
la classe Gq/11 (stimulateur de la phospholipase C) contient les sous unités Gq,
G11, G14, G15 et G16
•
la famille Gα12 (régulation du cytosquelette et de certains processus liés au
mouvement) contient les sous unités G12 et G13
Il a pu être mis en évidence que le dimère β/γ peut lui aussi activer ou inhiber l'activité
de certains effecteurs comme certaines adénylates cyclases, des canaux ioniques, ou encore la
voie de ras-MAP kinases (Luttrell et al., 1997).
Lors de l’activation de la protéine G, la sous-unité Gα lie une molécule de GDP
(guanosine diphosphate) au niveau de son domaine GTPase (De Vries et al., 1995; Siderovski
et Willard, 2005).
.
Figure I-10: cycle d’activation des protéines G hétérotrimériques selon Jaspard 2011.
Tant que le récepteur est activé par son ligand et que le système ne subit pas une
désensibilisation, le cycle d'échange du GDP par du GTP continue.
25
Introduction
I. 2. 1. 3. 2. Variété des effecteurs cibles des protéines G et transduction du signal
La liaison d’un ligand sur son récepteur et l’activation successive de la protéine G
représentent les deux premières étapes indispensables à la transmission d’un signal à
l’intérieur de la cellule (Cotton et Claing, 2009). Notons qu’un récepteur peut activer
plusieurs protéines G (Rosenbaum et al., 2009; Marty et Ye, 2010) (figure I-11). La protéine
Gα activée peut interagir avec différentes classes d’effecteurs dont l'adénylate cyclase et la
phospholipase C (Janetopoulos et al., 2001;Cabrera-Vera et al., 2003).
Des résultats de plus en plus nombreux montrent qu’en fonction du type de ligand
utilisé pour activer un récepteur, les voies de signalisation induites peuvent être différentes
(Roth et al., 2004; Strachan et al., 2006; Regard et al., 2008) (Figure I-11).
Figure I-11: les multiples voies de signalisation activées par le récepteur mGlu1a via
son couplage à différents types de protéines G selon Hermans et Challiss, 2001.
26
Introduction
Nous essayerons de décrire brièvement dans les lignes qui suivent les différents
effecteurs cibles des protéines G en insistant sur les éffecteurs impliqués dans la signalisation
à travers le récepteur TP.
I. 2. 1. 3. 2. 1. L’adénylate cyclase (ou adénylyl-cyclase)
L'adénylate cyclase (AC) est une enzyme membranaire, avec 12 régions
transmembranaires, qui est activée par les sous-unités de type Gαs et inhibée par celles de
type Gαi (Murray et al., 1990). L'AC catalyse la réaction de formation de l'AMPc, qui est le
second messager produit, à partir d'ATP (Murray et al., 1990). Cet AMPc est l'activateur de la
protéine kinase A (PKA) qui est capable de phosphoryler, et ainsi de moduler, l'activité de
nombreux substrats protéiques.
I. 2. 3. 3. 2. 2. La phospholipase C
En réponse à l'activation de la phospholipase C (PLC), deux molécules sont formées,
l'IP3 et le DAG (diacylglycérol). La PLC est activée par les sous-unités de la classe Gαq
(Nakahata, 2008). Il s’ensuit deux phénomènes (figure I-12):
A.
l'IP3 est libéré dans le cytoplasme. Il se lie à son récepteur IP3-R
(fonctionnant comme un récepteur canal) situé sur le réticulum endoplasmique (RE) et
sarcoplasmique (RS), ce qui a pour effet de libérer du Ca2+ de ses deux organites.
L’IP3 est un second messager et, selon le type cellulaire, l'augmentation transitoire du
Ca2+ intracellulaire (fréquence et durée) déclenche diverses réponses telles que:
dégradation du glycogène, libération de neurotransmetteurs, contraction musculaire,
prolifération cellulaire, transcription etc. (Offermanns et Simon, 1995; Kinsella et al.,
1997).
B.
le DAG reste ancré dans la membrane plasmique et active
spécifiquement la protéine kinase C (PKC ou Ca2+ /phospholipid-activated protein
kinase C). Son activité enzymatique (sérine thréonine kinase) est régulée par le Ca2+
et, selon le type cellulaire, elle phosporyle diverses protéines cytoplasmiques qui
27
Introduction
modulent la transcription de gènes, la production de médiateurs lipidiques (stimulation
de la phospholipase A2 responsable de la production d'acide arachidonique après
activation du RCPG des chimioattractants) (Berridge et Irvine, 1984; Nishizuka,
1984).
Figure I-12: Activation de la phospholipase C
I. 2. 1. 3. 2. 3. La cGMP phosphodiestérase :
C’est l'enzyme spécifique des cellules en bâtonnet et en cône de la rétine qui catalyse
la réaction de formation du GMPc à partir du GTP. Elle est activée par les transducines Gt1 et
Gt2 (Jaspard, 2011).
28
Introduction
I. 2. 1. 3. 2. 4. Les canaux ioniques
Certains canaux à conductance potassique ou calcique voient leur activité modulée par
certaines
sous-unités
de
la
classe
Gαi
(Bockaerthttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0764446998804551
‐
cor1 et
Pin, 1998).
Notons enfin que les sous-unités Gβγ peuvent également moduler l'activité d'effecteurs
différents, après l'activation et la dissociation des sous-unités d'un seul sous-type de protéine
G (Zhang et al., 1996; Maier et al., 2000). Les sous-unités β et γ n'ont pas de site catalytique:
elles agissent donc comme des modulateurs dans la signalisation liée aux protéines G via des
interactions protéine-protéine qu'elles régulent (Li et al. 1997). En conséquence, le complexe
[β - γ] agit aussi comme une molécule signal. C'est le cas par exemple du récepteur
[muscarinique/acétylcholine] impliqué dans l'ouverture des canaux à courant potassique
GIRK ("G protein-regulated inward rectifier potassium channel") (Wettschureck et
Offermanns, 2005) (figure I-13).
Figure I-13: Le récepteur [muscarinique/acétylcholine] impliqué dans l'ouverture des
canaux à courant potassique GIRK ("G protein-regulated inward rectifier potassium channel")
selon Wettschureck et Offermanns, 2005.
En définitive, les principales voies de signalisation à travers les protéines G peuvent
être groupées en deux (Figure I-14):
29
Introduction
A. Voie de signalisation AMPc dépendante qui fait intervenir entre autres:
(1) activation du récepteur par un signal externe,
(2) activation des protéines Gαs ou Gαi,
(3) activation via Gαs ou inhibition via Gαi de la production d’AMPc par l’adénylate
cyclase (AC),
(4) activation de la protéine kinase A (PKA) par l’adénosine monophosphate cyclique
(AMPc) suite à la dissociation de ses sous-unités régulatrices (R) et catalytiques (C).
B. Voie de signalisation d’inositol phosphate dépendante faisant intervenir:
(1) activation du récepteur par un signal externe,
(2) activation de la protéine Gαq,
(3) hydrolyse du phosphatidyl-inositol-4,5-diphosphate (PIP2) en inositol triphosphate
(IP3) et diacylglycérol (DAG),
(4) ouverture de canaux calciques du RE via l’IP3 et activation de la PKC via le DAG.
Cette dernière va induire l’ouverture de canaux calciques présents au niveau de la
membrane plasmique.
30
Introduction
Figure I-14: Voies de transduction du signal à travers les protéines G
31
Introduction
I. 2. 1. 4. Mécanisme de transduction du signal par le récepteur au thromboxane A2 (TP)
Le récepteur TP a la capacité de recruter et d'activer plusieurs protéines G
intracellulaires (Gq, G11, G14, G15, G16, G12, G13, Gs ) Ces protéines G une fois activées,
transmettent le signal provenant du récepteur à différents effecteurs intracellulaires permettant
la génération d’une réponse cellulaire (augmentation transitoire de la concentration en
calcium intracellulaire, activation de la phospholipase C, generation de l’IP3 et de DAG,
activation de la PKC, alcalinisation intracellulaire des plaquettes, exposition du complèxe
GPIIb/IIIa au site de fixation, regulation de l’actine, de la mobilité cellulaire, la prolifération
cellulaire, l’apoptose, l’échange Na+/H+, la contraction (Berridge et Irvine, 1984; Nishizuka,
1984; Houslay et al., 1986; Nakahata et al., 1989; Shenker et al., 1991; Voyno-Yasenetskaya
et al., 1994; Offermanns et Simon, 1995; Kinsella et al., 1997; Hall, 1998; Halushka, 2000;
Harenberg et al., 2005; Wilson et al., 2005; Nakahata et al., 2008).
Le récepteur TP peut aussi activer la protéine Gh (protéine G dimerique à activité
transglutaminase) entrainant l’activation de la phospholipase C-δ (Feng et al., 1996; Vezza et
al., 1999). Le TP couple avec la Gi en dehors des plaquettes et dans des circonstances
particulières telles, la désensibilisation du récepteur TP dans les plaquettes (Murray et al.,
1990).
L’activation de la sous unité Gβγ par le récepteur TP joue un rôle dans la signalisation
par activation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), la phospholipase C-β2, la protéine
mitogène kinase p44/42 ein (p44/42 MAPK) et la kinase regulatrice du signal extracellulaire
ou extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) (Zhang et al., 1996; Maier et al., 2000).
Notons que, la réponse cellulaire résultant de l’activation de la protéine G par le
récepteur TP depend du tissu ou de la cellule concernée.
32
Introduction
I. 2. 1. 5. Mécanismes d'atténuation du signal initié par le récepteur TP (désensibilisation).
Les réponses cellulaires à de nombreuses hormones ou neurotransmetteurs sont en
général de courte durée (quelques secondes à quelques minutes) malgré une présence continue
du ligand dans l'environnement péricellulaire (Lefkowitz, 1998).
Afin d'éviter une réponse cellulaire exacerbée, il existe des mécanismes moléculaires
qui permettent d'atténuer la sensibilité d'un tissu en dépit d'une exposition chronique à un
ligand (Murray et al., 1990; Dorn, 1992; Sakai et al., 1996; Walsh et al., 2000; Reid et
Kinsella, 2003). Ces mécanismes concourent à la désactivation de la voie de signalisation,
c'est le phénomène de désensibilisation qui s'exerce aux niveaux du ligand, du récepteur et au
niveau post-récepteur. Nous parlerons ici de la désensibilisation au niveau du récepteur TP.
Elle survient quelques secondes ou quelques minutes après l'activation de ce dernier et
implique: une phosphorylation du récepteur et une diminution temporaire du nombre de
récepteurs présents au niveau de la membrane plasmique (Bouvier et al., 1988; Hausdorff et
al., 1989; Lohse et al., 1992).
Les protéines kinases C (PKC) sont susceptibles de réaliser cette phosphorylation par
activation de l’EP1 et de la FP entrainant la desensibilisation de TPα et TPβ (Kelley-Hickie et
Kinsella, 2004).
Les différences observées entre les deux isoformes (taille de la chaine carboxy terminale et
site de phosphorylation) entrainent une différence dans la désensibilisation homologue ou
héterologue entre le TPα et le TPβ. En effet, plusieurs études ont indiqués que le TPβ et non
le TPα est sujet à une désensibilisation GRK et arrestine dependant (Parent et al., 1999; Ahn
et al., 2003). La PGI2 desensibilise le récepteur TP par hydrolyse du phosphoinositide dans les
cellules HEK 293 surexprimant le TPα, et non pas le TPβ (Walsh et al., 2000). De plus, les
donneurs de NO et du 8-bromo-cGMP desensibilisent le TP par hydrolyse du
phosphoinositide dans les cellules HEK293 surexprimant le TPα, et non pas le TPβ (Reid
&Kinsella, 2003). En plus, le TPα est impliqué dans la desensibilisation médiée par la
protéine kinase G (cGMP/protein ou G (PKG).
L’extrémité C-terminale du TPα n’est pas phosphorylé par le GRK5 ou le GRK6 (Zhou et al.,
2001). La désensibilisation homologue de TPβ se fait selon deux mécanismes: l’un PKC
dependant et l’autre GRK2/3 dependant (Kelley-Hickie et Kinsella, 2006).
33
Introduction
I. 2. 1. 6. Homodimérisation/hétérodimérisation du récepteur TP
De nombreux RCPG peuvent former des homo ou des hétérodimères et chacun d'eux
peut former des oligomères (complexes très large de dimères) comme pour les récepteurs des
facteurs de croissance ou des cytokines (Terrillon et Bouvier, 2004; Maggio et al., 2005).
Dans un but de simplification de la nomenclature, on utilise plutôt les termes de dimères.
Il est à ce jour démontré que le TPα et le TPβ forment des homo et hetero-oligomères
(Laroche et al., 2005a; Sasaki et al.,2006). Laroche, Lepine et al. (2005a) ont démontré que le
TPα, peut être internaslisé dans un complèxe TPα/TPβ hetero-dimère. Des études récentes ont
démontré que la conformation de l’agoniste dans poche de fixation sur le récepteur peut
changer, suite à une héterodimérisation du récepteur TP (Sasaki et al., 2006; Wilson et al.,
2007b).
La formation d'hétéro-dimeres de TPα et TPß peut aboutir à la réduction de TP par une
diminution dans son expression cellulaire. Ainsi, l’heterodimerisation de TPα et TPß peut
changer la distribution du récepteur TP dans des cellules et par conséquent, affecter ainsi leur
signalisation (Wilson et al., 2007b).
Nous concluons ce chapitre sur les RCPG et en particulier le récepteur TP, en disant
qu’il est établi qu’un même RCPG peut moduler des voies distinctes de signalisation, et que la
réponse cellulaire induite par l’activation d’un récepteur peut varier en fonction du ligand
(DeWire et al., 2007; Kobilka et Deupi, 2007; Lebon et Tate 2012). Par ailleurs, l’existence
de plusieurs isoformes pour un même récepteur ainsi que la dimérisation de certains
récepteurs ajoutent un niveau de complexité lors d'une réponse biologique (Kobilka et Deupi,
2007; Katritch et al., 2012).
34
Introduction
I. 3. Les modulateurs du thromboxane A2
Le potentiel pathogène du TXA2 est à l’origine de nombreuses recherches ayant pour
but de développer de nouvelles molécules susceptibles de contrecarrer ses propriétés (Dogné,
2000). Plusieurs types de modulateurs de TXA2 ont été développés pendant ces 20 dernières
années. Nous avons classifié les modulateurs de TXA2 étudiés à ce jour dans quatre catégories
et nous montrons les structures chimiques de quelques médicaments représentatifs.
I. 3. 1. Les inhibiteurs de la cyclooxygénase
Le TXA2 est un métabolite qui dérive de l'acide arachidonique par la thromboxane
synthase dans la voie de la cyclooxygénase. Toute inhibition de la cyclooxygénase aboutit à la
réduction des prostanoïdes, y compris le TXA2.
Le représentant historique de cette classe de médicaments est l’acide acétylsalicylique
(Aspirine®) commercialisé par Bayer (figure I-15). On a montré qu’à faibles doses (50 à 160
mg/jour pour un adulte), l’aspirine inhibe préférentiellement la cyclooxygénase plaquettaire et
réduit ainsi la production des thromboxanes, tout en respectant, au moins partiellement, la
cyclooxygénase endothéliale responsable de la synthèse des PGE et PGI2 (ISIS-2, 1988;
Maier, et al., 1990; Vane et Botting, 2003). La plaquette étant une cellule anucléée, il n'y a
pas de synthèse de nouvelles enzymes, ce qui explique la longue durée de l'inhibition (ISIS-2,
1988; Maier, et al., 1990; Vane et Botting, 2003). L'effet antiagrégant plaquettaire et la
prolongation du temps de saignement induit par l'aspirine s'expliquent par l'inhibition
préférentielle de la cyclooxygénase plaquettaire. Cette propriété est exploitée dans la
prévention des certaines pathologies cardiovasculaires (Patrignani et al., 1982; Reilly et
FitzGerald, 1988; Hennekens, 2007; Zhang et al, 2010).
Il existe deux isoformes de la cyclooxygénase (COX-1 et COX-2). L’aspirine acétyle
de manière irréversible les deux isoformes de cyclooxygénases au niveau de la sérine 529
(Patrono, 1994; Baigent et Patrono, 2003). L’aspirine exerce une activité plus marquée sur la
COX-1 due à l’augmentation de la largeur du site catalytique de la COX-2 qui défavorise la
transacétylation de la sérine 529 (Roth et Majerus, 1975; Patrono, 1994; Patrono et al., 2004;
Michelson et al., 2005; Patrono, 2006).
35
Introduction
On distingue les inhibiteurs sélectifs et non sélectifs des cyclooxygénases.
L’indométacine est un exemple d’inhibiteur non sélectif des cyclooxygénases (figure I-15).
Figure I-15: Inhibiteurs des cyclooxygénases
I. 3. 2. Les inhibiteurs de la thromboxane synthase (TXS)
Les inhibiteurs de TXS empêchent la conversion de PGH2 en TXA2. Ces médicaments
réduisent la synthèse de TXA2, principalement dans des plaquettes, régulent la production de
TXA2 et, par conséquent, l’équilibre TXA2/PGI2 (Dogné et al. 2004). On observe avec ces
médicaments une augmentation de la synthèse de la prostacycline et des autres prostanoïdes
par l’accumulation de PGH2 (Patrignani et al., 1982; Reilly et Fitzgerald, 1987; Dogné et al.,
2006). L'accumulation de PGI2 induite par des inhibiteurs de TXS a comme avantage de
réduire le risque de thrombose. Il existe plusieurs inhibiteurs de TXS, tels le dazoxiben
(UK37248) (Vermylen et al., 1981), le dazmagrel (UK38485) (Coker, 1984), le pirmagrel
(CGS13080) (Ku et al., 1983), l’ozagrel (OKY046) (Uchida et Murao, 1981), le CS-518
(RS5186) (Toki et al., 1988), le OKY1581 (Feuerstein et Ramwell, 1981), l’isbogrel
(CV4151) (Shibouta et al., 1985) et le furegrelate (U63557A) (Wynalda et al., 1983).
Parmi eux, nous montrons les structures chimiques de l’ozagrel et du furegrelate à la
figure I-16.
36
Introduction
Figure I-16: Inhibiteurs de la TXS
I. 3. 3. Les antagonistes vis-à-vis du récepteur au TXA2
En général, les antagonistes vis-à-vis du récepteur au TXA2 (récepteur TP) n’affectent
pas la biosynthèse des prostanoïdes. Ils préviennent l’action du TXA2 par inhibition de sa
fixation sur le récepteur (Dogné et al., 2001; Rolin et al., 2001). Ils se caractérisent par un
profil thérapeutique supérieur à celui des inhibiteurs de la thromboxane synthase (Dogné et al.,
2001, 2004; Hanson et al., 2005). Le sulotroban mis au point en 1980 est à l’origine de
nombreuses recherches ayant pour but la découverte des nouveaux outils pharmacologiques
(Patscheke et Stegmeier, 1984). Le SQ29548 est une molécule antagoniste du récepteur TP
(Ogletree et al., 1985) qui a contribué à la compréhension des effets sur ce type de récepteur.
Le domitroban (S-1452/S-145) (figure I-17) a été utilisé pour purifier la protéine du récepteur
TP par la chromatographie d'affinité (Hanasaki et Arita, 1988; Ushikubi et al., 1989).
Nous citons aussi l’ifetroban (BMS180291) (Schumacher et al., 1992), le daltroban
(BM13505) (Bitterman et al., 1986), le GR32191 (Lumley et al., 1989), le Z-335 (Tanaka et
al., 1998), le LCB-2853 (CAS 141335-11-7), le linotroban (HN-11500) (Roald et al., 1994),
le ramatroban (BayU3405) (Rosentreter et al., 1989) et le seratrodast (AA-2414) (Ashida et
al., 1989).
Le seratrodast (figure I-17) est un antagoniste vis-à-vis du récepteur TP oralement
actif qui a été utilisé cliniquement pour le traitement de l'asthme au Japon depuis 1997 sous le
nom de Bromica® à la dose de 80 mg per os. Le ramatroban a des effets antagonistes vis-à-vis
du récepteur DP (PGD2) et du récepteur TP (Francis et Greenham, 1991). Il est aussi utilisé
cliniquement comme un médicament antiallergique au Japon.
37
Introduction
On a montré que la génistéine (figure I-17), une isoflavone, a une activité antagoniste
vis-à-vis du récepteur TP, bien que ce médicament soit plus connu comme un inhibiteur de
phosphorylation de la tyrosine (Nakashima et al., 1991). En plus de la génistéine, l’apignine,
la lutéoline, la quercétine et le flavonol ont montré aussi des activités antagonistes vis-à-vis du
récepteur TP (Guerrero et al., 2005).
La piperlongumine, un constituant de poivre, a montré une activité antagoniste vis-àvis du récepteur TP (Iwashita et al., 2007). Ces résultats suggèrent qu'il y a beaucoup de
produits chimiques d'origine naturelle qui ont une activité antagoniste vis-à-vis de ce
récepteur.
Figure I-17: Les antagonistes vis-à-vis du récepteur TP.
38
Introduction
I. 3. 4. Médicaments à double action
Bien que les antagonistes vis-à-vis du récepteur TP et les inhibiteurs de TXS soient
théoriquement de bons médicaments, ils montrent parfois certaines limites lors des essais
cliniques. Les drogues avec effet mixte, c’est-à-dire inhibiteurs de la thromboxane synthase et
antagonistes vis-à-vis du récepteur TP, présenteraient l’avantage d’une part d’inhiber la
synthèse de TXA2 avec augmentation simultanée de la synthèse de PGI2 et d’autre part,
d’antagoniser les récepteurs TP vis-à-vis de la PGH2 et des quantités résiduelles de TXA2
éventuellement formées (Dogné et al., 2001). Cette association a abouti à la synthèse des
composés mixtes, combinant les deux propriétés. Ceux-ci incluent le ridogrel (R68070) (Aoki
et al., 1989) (figure I-18), le picotamide (G137) (Gresele et al., 1989), le terbogrel le
samixogrel (DTTX30) (Guth et Muller, 1997), le BM-531 (Dogne et al., 2001), le BM-567
(Michaux et al., 2001) et le BM-573 (Rolin et al., 2001) (figure I-18).
Le YM158 (Arakida et al., 1998) a été rapporté pour être un autre type de médicament
à action double contrariant le récepteur TP et le récepteur LTD 4. Il est utilisé dans le
traitement de l'asthme (Arakida et al., 1999). De plus, le E3010 a été présenté comme un
médicament à action double montrant un effet antagoniste vis-à-vis du récepteur TP et
inhibiteur de 5-lipoxygenase (Oketani et al., 2001).
Finalement, le TRA-418 a été développé comme un antagoniste vis-à-vis du récepteur
TP avec une activité agoniste vis-à-vis du récepteur au prostaglandines I (IP) (Yamada et al.,
2003).
Ces composés à double action sont visés pour être des médicaments puissants dans le
traitement de pathologies liées à la surproduction de TXA2.
39
Introduction
Figure I-18: Composés à action mixte
En conclusion, les résultats des différentes études réalisées avec les composés à action
mixte montrent une meilleure activité par rapport aux antagonistes des récepteurs TP et aux
inhibiteurs de thromboxane synthase pris isolement.
40
II.
Présentation du travail
Présentation du travail
42
Présentation du travail
II. PRESENTATION DU TRAVAIL
Le Laboratoire de Chimie Pharmaceutique de l’Université de Liège, lors de
travaux antérieurs, avait développé le torasémide (Figure II-1), un diurétique de l’anse de
Henle (Delarge et Lapière, 1973; Delarge et Lapière, 1978).
Figure II-1: Structure chimique du Torasémide
Le torasémide agit principalement au niveau de la branche ascendante de l’anse de
Henlé. Dans cette dernière, il bloque la réabsorption du sodium et du chlorure pour induire
une diurèse rapide et marquée et une excrétion du potassium (Brater et al., 1987; Friedel et
Buckley, 1991; Kido et Ohtaki , 2001).
A cette action inhibitrice du segment du diluant médullaire et corticale rénale,
s’ajoute un effet sur l’hémodynamique intrarénale en induisant des changements locaux du
débit sanguin par modification dans le tonus des vaisseaux intrarénaux (Herchuelz et al.,
1988; Podszuz et al., 1994).
Le torasémide induit une vasodilatation de l’artériole rénale entraînant une
augmentation de la pression hydrostatique et, par conséquent, une diminution dans la
réabsorption tubulaire de sodium et d’eau. Ces modifications sont attribuées à une
stimulation de la synthèse des prostaglandines intrarénales d’action vasodilatatrice (Winer
43
Présentation du travail
et al., 1969; Weber et al., 1977; Pedrinelli et al., 1980; Van Ganse et al., 1986; Uchida et
al., 1994).
Cette molécule est commercialisée comme diurétique et antihypertenseur sous
plusieurs dénominations (Torasémide Sandoz®, Torrem®,…).
Plus tard, une action vasodilatatrice du torasémide sur les artères de chien
précontractées au moyen d’un agoniste des récepteurs TP plaquettaires, le thromboxane A2
carbocyclique (CTA2) avait été décrite (Uchida et al., 1992).
Dans le but d’amplifier l’activité antagoniste du TXA2 du torasémide, des
nombreux composés dérivés furent synthétisés et leurs propriétés pharmacologiques
évaluées (Dogné 2000; Masereel et al., 1999).
Au cours de ces études, l’équipe de Dogné a exploré, dans un premier temps
l’influence des substituants du noyau pyridinique du torasémide sur son affinité vis-à-vis
des récepteurs plaquettaires (TP). Les pharmacomodulations ont porté principalement sur
la nature et la position des substituants du noyau de base du torasémide (noyau
pyridinique) (Dogné et al., 2000; 2001). Le remplacement bioisostérique du noyau
pyridinique du torasémide par un noyau nitrobenzénique fut réalisé (Rolin et al., 2001,
2003; Dogné et al., 2000) (figure II-2).
Figure II-2: Analogues nitrobenzéniques résultant du remplacement bioisostérique
du noyau pyridinique du torasémide et modèle du pharmacophore.
Au terme de ces investigations, le noyau nitrobenzénique s’est révélé être l’un des
noyaux de base les plus intéressants pour l’activité antagoniste vis-à-vis du récepteur au
TXA2.
44
Présentation du travail
Ainsi, ces études ont démontré que le remplacement bioisostérique de la pyridine
du torasémide par un noyau nitrobenzène renforçait à la fois l’affinité des drogues et le
pouvoir antagoniste vis-à-vis du récepteur TP.
Les nouveaux composés synthétisés préviennent l’agrégation des plaquettes induite
par divers inducteurs tels l’acide arachidonique, le U-46619 et l’ADP. Certains d’entre eux
inhibent la thromboxane synthase (Dogné et al., 2004).
La vaste pharmacomodulation réalisée autour du pharmacophore (figure II-2) a
permis de sélectionner les substituants les plus intéressants en positions R1 et R2 pour un
meilleur potentiel antagoniste vis-à-vis du récepteur et une action antiagrégante
plaquettaire.
En série nitrobenzénique, les sulfonylurées qui présentent la meilleure affinité pour
les récepteurs plaquettaires et un bon potentiel antagoniste vis-à-vis du récepteur au TXA2
combinent des groupements lipophiles encombrants de type aryle ou cyclohexyle en
position R1 et n-pentyle ou tert-butyle en position R2.
Parmi les composés les plus actifs, le BM-573 et le BM-613 (figure II-3) ont
présenté des propriétés intéressantes (Dogné et al., 2004; Hanson et al., 2005; 2006; 2007).
Figure II-3: Structure chimique du BM-573 et du BM-613, deux puissants
antagonistes vis-à-vis du récepteur TP.
45
Présentation du travail
Outre le noyau nitrobenzénique, l’équipe de Dogné avait observé sur un nombre
restreint
d’exemples
que
les
noyaux
méthylsulfonylbenzénique,
trifluorométhylbenzénique et cyanobenzénique conduisaient à de puissants ligands des
récepteurs TP plaquettaires. En série cyanobenzénique, deux composés furent synthétisés
et testés et se sont révélés être des bons ligands du récepteur TP (figure II-4).
Figure II-4: Structure chimique de deux composés résultant du remplacement
bioisostérique du noyau pyridinique par un noyau cyanobenzénique.
Le travail que nous décrivons ici s’inscrit directement dans la continuité de
cette recherche et poursuit les objectifs suivants:

D’une part, réaliser la synthèse de nouveaux antagonistes des
récepteurs TP qui résultent du remplacement bioisostérique du noyau
nitrobenzénique
des
nombreux
composés
précurseurs
par
un
noyau
cyanobenzénique, méthylsulfonylbenzénique et trifluorométhylbenzénique, noyaux
peu étudiés (figure II-5), et :
1.
aromatiques
en
ou
(cyclohexylamine,
introduisant
en
alicycliques
position
R1
diversement
cycloheptylamine,
des
amines
substituées
cyclooctylamine,
halogénoanilines et toluidines, …), ou des phénols (crésols et
halogénophénols);
2.
en introduisant en position R2 des groupements tert-
butyle, isopropyle et n-pentyle;
46
Présentation du travail
3.
En remplaçant éventuellement le pont intercycle –
NH- par un pont –O-.
Figure II-5: Variations structurales envisagées autour du pharmacophore.
 D’autre part, examiner le pouvoir antagoniste in vitro des molécules
synthétisées au cours d’un test de mesure de la stimulation du calcium intracellulaire
mobilisé en présence d’un agoniste stable des récepteurs TP, sur les cellules HEK 293
surexprimant soit le récepteur TPα soit le récepteur TPβ et par la mesure de la
prévention de l’agrégation plaquettaire induite par différents inducteurs.
 De plus, examiner l’effet inhibiteur ou non d’une sélection de molécules
synthétisées sur la thromboxane synthase.
 Enfin, vérifier la toxicité cellulaire ou non du BM-573 en comparaison avec
quelques molécules les plus actives parmi les nouveaux produits synthétisés.
Par cette étude, nous cherchons à savoir si le changement de la nature du
substituant en Y (figure II-5), a une influence sur l’activité pharmacologique observée
avec les dérivés nitrobenzéniques.
Les pharmacomodulations envisagées doivent également nous permettre d’affiner
notre connaissance des relations structure-activité dans cette famille de molécules.
47
Présentation du travail
48
III. Stratégie de synthèse
Stratégie de Synthèse
50
Stratégie de Synthèse
III. STRATEGIE DE SYNTHESE
III. 1. Généralités
Cette section est consacrée à la synthèse des dérivés benzonitriles substitués en «3»
par une fonction de type sulfonylurée et en «4» par un groupement arylamino, aryloxy ou
cycloalkylamino. La numérotation de ce noyau ainsi que celle des dérivés qui en dérivent se
fait comme suit (Figure III-1):
Figure III-1: Numérotation du noyau benzonitrile substitué en 3 et en 4.
Cette numérotation est à la base de la nomenclature des différents produits que nous
présenterons dans la suite de l’exposé.
Au cours de ce chapitre, nous décrivons les différentes voies de synthèse suivies pour
obtenir nos molécules cibles.
Les deux premières étapes de synthèse permettent d’obtenir les intermédiaires
communs à toutes nos molécules, le 4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile (3) et le 4-fluoro-3sulfamoylbenzonitrile (3’) représentés sur la figure III-2.
Figure III-2: 4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile (3) et 4-fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile
(3’)
51
Stratégie de Synthèse
III. 2. Synthèse des différents dérivés
Pour obtenir les produits souhaités, nous nous sommes inspirés de la voie de synthèse
mise au point au cours de travaux antérieurs au sein de notre laboratoire (Dogné et al., 2004;
Hanson et al., 2006) (Figures III-3).
La synthèse commence par une réaction de réduction du 4-chloro-3-nitrobenzonitrile
(1) en 3-amino-4-chlorobenzonitrile (2) par le fer en poudre en présence de chlorure
d’ammonium dans le mélange eau/éthanol (figure III-3, étape i).
L’amine formée est engagée dans une réaction de diazotation avec le nitrite de sodium
en milieu acide acétique glacial et acide chlorhydrique pour former le sel de diazonium. La
réaction du sel de diazonium avec l’anhydride sulfureux en présence du chlorure de cuivre
donne le chlorure d’acide sulfonique correspondant selon la réaction de Sandmeyer modifiée
par Meerwein (Meerwein et al., 1957). La décomposition du chlorure d’acide sulfonique dans
l’ammoniaque conduit à la formation de la sulfonamide (3) (étape ii) (Dogné et al., 2004).
Une substitution nucléophile de l’atome de chlore en 4 par une amine ou un phénol
correctement substitués permet d’obtenir les intermédiaires arylamino, aryloxy et
cycloalkylaminosulfamoylbenzonitriles correspondants (4, 5 et 6) (étape iv).
Une déprotonation de la fonction sulfonamide dans une solution aqueuse d’hydroxyde
de sodium à 10% donne le sulfonamidate sodique correspondant (Hanson et al., 2006). La
dernière étape consiste en une réaction entre le sulfonamidate sodique de l’intermédiaire (4, 5
et 6) et l’isocyanate approprié dans l’acétone ou le diméthylformamide pour former les
sulfonylurées désirées (7, 8, 9 et 10) (figure III-3).
52
Stratégie de Synthèse
Figure III-3: Schéma général de synthèse des dérivés cyanobenzènesulfonylurées.
Les amines aromatiques ont présenté des difficultés lors de la substitution nucléophile
de l’atome de chlore en 4 (étape iv): pas de réaction après 24 heures et décomposition des
produits de départ au-delà de 30 heures. Afin de remédier à ce problème, nous nous sommes
proposés d’utiliser le dérivé fluoré à la place du dérivé chloré. La réduction du 4-fluoro-3nitrobenzonitrile (1’) et la formation de l’intermédiaire 4-fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile (3’)
sont obtenus selon la voie de synthèse décrite ci-dessous (Figure III-4). La réduction du 453
Stratégie de Synthèse
fluoro-3-nitrobenzonitrile en 3-amino-4-fluorobenzonitrile se fait par le chlorure stanneux en
présence du bicarbonate sodique dans l’acétate d’éthyle. Les autres étapes de synthèse restent
similaires.
Figure III-4: Schéma général de synthèse des dérivés arylamino et
aryloxycyanobenzènesulfonylurées.
Pour raison de clarté et d’uniformité, nous présenterons en détail un seul schéma de
synthèse, celui représenté sur la figure III-3.
54
Stratégie de Synthèse
III. 2. 1. Première étape de synthèse.
Synthèse du 3-amino-4-chlorobenzonitrile (2):
L’objectif de cette étape de synthèse est de réduire la fonction nitro en position 3 en
fonction amine primaire.
L’introduction directe d’un groupement amino sur un noyau aromatique, n’est en effet
possible que sur des cycles fortement appauvris en électrons ou en utilisant des bases très
fortes, en suivant un mécanisme de substitution nucléophile aromatique SNAr. Dans notre
contexte ici, le noyau benzénique est riche en électrons. Les dérivés nitrés aromatiques sont
en effet une voie d’accès intéressante aux amines aromatiques par réduction du groupement
nitro. La réduction du nitrobenzène par un métal en milieu acide par exemple, conduit à un sel
d’anilinium qui, après passage en milieu basique, conduit à l’aniline aromatique (Figure III5).
Figure III-5: Réduction du nitrobenzène en aniline
Les métaux les plus utilisés sont l’étain (Sn), le Fer (Fe) ou l’amalgame de Zn/Hg.
La réduction électrochimique des dérivés aromatiques (grâce à la cathode d'un électrolyseur)
et l’hydrogénation catalytique en présence de Nickel de Raney ou de palladium (Pd supporté
sur le charbon) ou le PtO2, constituent aussi des voies de réduction des nitrobenzènes.
Parmi les variantes de réduction envisagées, nous avons jeté notre dévolu sur le fer en
milieu éthanol/eau en présence de chlorure d’ammonium, bien que la méthode utilisant le fer
en milieu acide acétique ait fourni des résultats similaires.
55
Stratégie de Synthèse
Le 4-chloro-3-nitrobenzonitrile (1) réagit avec le chlorure d’ammonium en présence
du fer en poudre pour donner le composé (2) comme cela est illustré (Figure III-6) ci-dessous:
Figure III-6: Réduction du 4-chloro-3-nitrobenzonitrile (1) en 3-amino-4chlorobenzonitrile (2).
III. 2. 2. Deuxième étape de synthèse
Synthèse du 4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile (3):
Cet intermédiaire est obtenu en deux étapes: tout d’abord, la réaction de diazotation du
3-amino-4-chlorobenzonitrile (2) en milieu acide permet d’obtenir le sel de diazonium. Nous
avons effectué une réaction de nitrosation entre l’amine primaire obtenue à l’étape précédente
et l'acide nitreux HNO2. L’acide nitreux est un composé instable en raison de sa dismutation
rapide en NO3- et NO. Il est pour cela préparé in situ (dans le milieu réactionnel) en acidifiant
une solution de nitrite de sodium par l’ajout de HCl. La nature du produit de réaction entre le
cation NO+ ainsi formé et une amine dépend de la classe de l’amine. Les amines primaires
aromatiques sont transformées par nitrosation en un sel de diazonium.
La formation du sel de diazonium se fait selon le mécanisme repris à la figure III-7.
56
Stratégie de Synthèse
Figure III-7: Formation de l’ion diazonium et sa forme mésomère
Les sels de diazonium aromatiques sont stabilisés par résonance comme cela est
illustré à la figure III-8:
57
Stratégie de Synthèse
Figure III-8: Stabilisation du sel de diazonium par résonance
Dans notre cas, l’amine obtenue à la première étape est mise en solution dans un
mélange acide acétique glacial-acide chlorhydrique. La solution est maintenue à une
température de -5°C. L’obtention du sel de diazonium se fait par ajout progressif du nitrite
sodique (Figure III-9).
Figure III-9: Formation du sel de diazonium.
Cette étape de diazotation est ensuite directement suivie de la formation du chlorure de
sulfonyle par réaction de substitution du diazonium en utilisant une solution d’acide acétique
glacial saturée en anhydride sulfureux en présence du chlorure de cuivre (Cu2Cl2) (conditions
de la réaction de Sandmeyer) (Meerwein et al., 1957). La décomposition de ce sel en milieu
ammoniacal permet d’obtenir le 4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile (3) qui a servi
d’intermédiaire commun à la synthèse de la plupart des molécules finales. Le dérivé (3) a été
obtenu selon le schéma suivant (Figure III-10):
58
Stratégie de Synthèse
Figure III-10: Formation du chlorure d’acide sulfonique et sa décomposition dans
l’ammoniaque pour former la sulfonamide (3).
III. 2. 3. Troisième étape de synthèse
Formation
des
analogues
4-arylamino,
4-aryloxy
et
4-cycloalkylamino-3-
sulfamoylbenzonitriles (4, 5 et 6):
Cette étape de synthèse permet la formation du pont inter-cycle (aminé ou oxygéné)
commun à toutes les molécules synthétisées. Il s’agit d’une réaction de substitution
nucléophile du chlore ou du fluor en position 4 par des amines ou des phénols.
La substitution nucléophile est une réaction qui résulte de l’attaque nucléophile par un
élément riche en électrons et du départ nucléofuge d’un élément emportant un doublet
d’électrons. Il existe plusieurs types de substitutions nucléophiles:
A.
Substitution nucléophile sur un carbone hybridé sp3,
B.
Substitution nucléophile sur un carbone hybridé sp2,
C.
Substitution nucléophile aromatique.
Au niveau réactionnel, il existe trois mécanismes limites permettant d’effectuer une
substitution nucléophile (figure III-12):
A.
un mécanisme en deux étapes:
1.
la première est le départ du groupe partant, étape cinétiquement
limitante.
2.
La seconde est l'attaque du substituant sur le reste de la molécule. Ce
type de substitution sera qualifiée de «monomoléculaire» et notée en abrégé SN1;
59
Stratégie de Synthèse
B.
un mécanisme à une étape, dans laquelle l'attaque du substituant se fait
concomitamment avec le départ du groupe partant. Cette unique étape implique deux
molécules. Les substitutions fonctionnant selon ce mécanisme sont donc dites
«bimoléculaires» et notées en abrégé SN2.
A l’exception de dérivés halogénés aromatiques qui sont relativement inertes, les
autres dérivés halogénés subissent facilement des substitutions nucléophiles en série
aliphatique (mécanismes SN2 et SN1). Des réactions de substitution nucléophile sur des
substrats aromatiques sont cependant possibles sur des cycles fortement désactivés par des
groupes attracteurs situés en ortho ou en para du nucléofuge.
C.
La réaction de substitution nucléophile sur aromatique est caractérisée
par deux étapes successives, une addition suivie d’une élimination. Il s’agit d’un
mécanisme d’addition-élimination formant un intermédiaire anionique connu sous le
nom de complexe de Meisenheimer, représenté sur la figure III-11.
Figure III-11: Formation du complexe de Meisenheimer.
60
Stratégie de Synthèse
Figure III-12: Mécanismes de substitution nucléophile
La réaction de substitution nucléophile sur aromatique se prête bien à notre cas. En
effet, l’atome d’azote de l’amine ou l’atome d’oxygène du phénol, va d’abord réaliser une
addition nucléophile au niveau de l’atome de carbone portant le chlore ou le fluor du composé
(3) ou (3’). Ensuite, cet atome d’halogène va être éliminé pour donner lieu aux intermédiaires
4 (a-c), 5 (a-d) et 6 (a-o) (Figure III-13).
Le groupement nitrile en para et, dans une certaine mesure, le groupement
sulfonamide en ortho, par leurs effets attracteurs, permettent des formes de résonance qui
favorisent la réaction. Ainsi, l’halogène devient meilleur groupe partant car l’intensité du
dipôle C-Cl (ou C-F) est augmentée par la délocalisation des électrons due à ces deux
substituants du noyau.
61
Stratégie de Synthèse
Figure III-13: Formation de 4-arylamino, 4-aryloxy et de 4-cycloalkylamino-3sulfamoylbenzonitriles.
Les deux étapes de la substitution nucléophile sur aromatique possèdent une cinétique
différente. L’étape d’addition est plus lente et déterminante tandis que l’étape d’élimination
est rapide et sans effet sur la cinétique. L’addition nucléophile entraîne une perte
d’aromaticité alors que l’élimination de l’atome d’halogène la restaure (Clayden, 2001).
Dans une réaction de substitution nucléophile aliphatique, le choix du groupe partant
est déterminant et sa polarisabilité joue un rôle important pour le déroulement de la réaction.
C’est donc la force de la liaison qui est fréquemment le facteur dominant, si bien que l’ordre
de réactivité des halogènes est I > Br > Cl > F.
Dans le cas de la substitution nucléophile sur aromatique, l’atome d’halogène plus
électronégatif induit un incrément de charge positive plus grand sur le carbone, et facilite ainsi
62
Stratégie de Synthèse
l’attaque nucléophile. L’ordre de réactivité se retrouve donc inversé, car plus le dipôle associé
à la liaison carbone-halogène est important, plus l’addition est facilitée. Nous aurons donc de
cet fait l’ordre de réactivité suivant: F > Cl > Br > I.
De façon similaire à l'influence du nucléophile, un solvant polaire stabiliserait le
composé nucléophile; c'est pourquoi la SN2 sera favorisée dans un solvant peu polaire et
aprotique (acétone, DMSO,…), solvant ne créant pas de liaisons hydrogènes.
III. 2. 4. Quatrième étape de synthèse
Formation
de
N-alkyl-N’-[2-arylamino,
2-aryloxy
et
2-cycloalkylamino)-5-
cyanobenzenesulfonyl]urées (7, 8, 9 et 10):
Nous avons effectué une réaction d’addition nucléophile sur les isocyanates (Figure
III-14). Le carbone central des isocyanates est très électrophile. La préparation des produits
finaux a été réalisée en exacerbant le caractère nucléophile de l’azote de la fonction
sulfonamide, via un intermédiaire sulfonamidate sodique, un composé au caractère
nucléophile marqué.
Figure IIII-14: Schéma général de l‘addition nucléophile sur les isocyanates
Le mécanisme réactionnel consiste en une addition-élimination au cours de laquelle un
doublet d’électrons du nucléophile attaque le carbone du groupe carbonyle du substrat, créant
ainsi un lien sigma (σ) entre ce carbone et l’atome attaquant du nucléophile.
Concomitamment, la paire d’électrons formant un lien pi (π) entre les atomes de carbone et
d’oxygène du groupe carbonyle est absorbée par l’atome d’oxygène. La grande
électronégativité de l’azote lié au carbonyle tend à attirer fortement le nuage électronique
63
Stratégie de Synthèse
fragilisant ainsi la liaison sigma entre C et O. La conséquence est la reformation de la liaison
pi et l’expulsion du meilleur groupe partant entourant l’atome de carbone.
En résumé et de façon passablement simplifiée, le mécanisme général de l'addition
nucléophile se présente comme suit (figure III-15):
Figure III-15: Mécanisme général de l’addition nucléophile sur un isocyanate.
L’hydrolyse des isocyanates (liée à la présence d’eau dans le milieu réactionnel) donne
des amines. Il faut éviter que celles-ci ne réagissent sur l’isocyanate restant en donnant des
urées substituées. C’est la raison pour laquelle nous avons essayé de travailler en milieu
anhydre.
Les sulfonamides (4, 5 et 6) obtenues à l’étape précédente vont réagir avec
l’isocyanate approprié pour donner les sulfonylurées désirées (figure III-16).
Figure III-16: Formation de N-alkyl-N’-[2-(arylamino/aryloxy/cycloalkylamino)-5cyanobenzenesulfonyl]urées.
L’ensemble des produits obtenus est repris dans les tableaux III-1, III-2, III-3 et III-4.
64
Stratégie de Synthèse
Tableau III-1: Composés finaux obtenus en série aryloxycyanobenzènesulfonamide: série I
Composé
R1
X
7a
2-méthylphényle
isopropyle
O
7b
2-méthylphényle
tert-butyle
O
7c
2-méthylphényle
n-pentyle
O
7d
3-méthylphényle
isopropyle
O
7e
3-méthylphényle
tert-butyle
O
7f
3-méthylphényle
n-pentyle
O
7g
4-méthylphényle
isopropyle
O
7h
4-méthylphényle
tert-butyle
O
7i
4-méthylphényle
n-pentyle
O
7j
4-fluorophényle
isopropyle
O
7k
4-fluorophényle
tert-butyle
O
7l
4-fluorophényle
n-pentyle
O
7m
4-chlorophényle
isopropyle
O
7n
4-chlorophényle
tert-butyle
O
7o
4-chlorophényle
n-pentyle
O
7p
4-bromophényle
isopropyle
O
7q
4-bromophényle
tert-butyle
O
7r
4-bromophényle
n-pentyle
O
7s
4-iodophényle
isopropyle
O
7t
4-iodophényle
tert-butyle
O
7u
4-iodophényle
n-pentyle
O
7v
3-fluorophényle
isopropyle
O
7w
3-fluorophényle
tert-butyle
O
7x
3-fluorophényle
n-pentyle
O
7y
3-chlorophényle
isopropyle
O
7z
3-chlorophényle
tert-butyle
O
65
R2
Stratégie de Synthèse
Tableau III-2: Composés finaux obtenus en série arylaminocyanobenzènesulfonamide
Composé
R1
R2
X
8a
2-méthylphényle
isopropyle
NH
8b
2-méthylphényle
tert-butyle
NH
8c
2-méthylphényle
n-pentyle
NH
8d
3-méthylphényle
isopropyle
NH
8e
3-méthylphényl
tert-butyle
NH
8f
3-méthylphényle
n-pentyle
NH
8g
4-méthylphényle
isopropyle
NH
8h
4-méthylphényle
tert-butyle
NH
8i
4-méthylphényle
n-pentyle
NH
8j
4-fluorophényle
isopropyle
NH
8k
4-fluorophényle
tert-butyle
NH
8l
4-fluorophényle
n-pentyle
NH
66
Stratégie de Synthèse
Tableau III-3: Composés finaux obtenus en série cycloalkylaminocyanobenzènesulfonamide
Composé
R1
R2
X
9a
cyclohexyle
isopropyle
NH
9b
cyclohexyle
tert-butyle
NH
9c
cyclohexyle
n-pentyle
NH
9d
cycloheptyle
isopropyle
NH
9e
cycloheptyle
tert-butyle
NH
9f
cycloheptyle
n-pentyle
NH
9g
cyclooctyle
isopropyle
NH
9h
cyclooctyle
tert-butyle
NH
9i
cyclooctyle
n-pentyle
NH
67
Stratégie de Synthèse
Tableau III-4: Composés finaux obtenus en série aryloxycyanobenzènesulfonamide: série II
Composé
R1
R2
X
10a
3-chlorophényle
n-pentyle
O
10b
3-bromophényle
isopropyle
O
10c
3-bromophényle
tert-butyle
O
10d
3-bromophényle
n-pentyle
O
10e
3-iodophényle
isopropyle
O
10f
3-iodophényle
tert-butyle
O
10g
3-iodophényle
n-pentyle
O
10h
2-fluorophényle
isopropyle
O
10i
2-fluorophényle
tert-butyle
O
10j
2-fluorophényle
n-pentyle
O
10k
2-chlorophényle
isopropyle
O
10l
2-chlorophényle
tert-butyle
O
10m
2-chlorophényl
n-pentyle
O
10n
2-bromophényle
isopropyle
O
10o
2-bromophényle
tert-butyle
O
10p
2-bromophényle
n-pentyle
O
10q
2-iodophényle
isopropyle
O
10r
2-iodophényle
tert-butyle
O
10s
2-iodophényle
n-pentyle
O
68
IV. Résultats et discussion
Résultats et discussion
70
Résultats et discussion
IV. RESULTATS ET DISCUSSION
IV. 1. Evaluation pharmacologique
IV. 1. 1. Introduction et choix du modèle
L’évaluation du potentiel antagoniste vis-à-vis du récepteur au thromboxane A2 peut
être réalisée au moyen des différents modèles.
Parmi les modèles in vitro décrits dans la littérature, on rencontre fréquemment les
tests réalisés sur les plaquettes humaines, sur les organes isolés ou encore le test de la mesure
de la concentration en calcium intracellulaire mobilisé après stimulation par un agoniste stable
du récepteur TP (Dogné et al., 2004; Rolin et al., 2003; Hanson et al., 2006; Ballatore et al.,
2011; Bultas, 2013).
Le modèle qui consiste à déterminer l’affinité de la drogue vis-à-vis du récepteur,
appelé «radioligand binding assay» présente l’intérêt de donner une bonne idée de
l’interaction entre la drogue et le récepteur, mais l’efficacité du ligand sur le récepteur (effet
agoniste ou antagoniste) ne peut être directement extrapolée à partir de ce modèle (Hanson et
al., 2007).
Le choix des plaquettes humaines pour étudier les interactions entre les drogues et le
récepteur semble se justifier par le fait que le thromboxane A2 est principalement produit dans
les plaquettes et que ses récepteurs sont en grande majorité situés sur ces dernières (Lefer et
al., 1980; Le Duc et al., 1981; Nusing et al., 1993; Habib et al., 1999; Sasaki et al., 2007).
Etudier l’effet des drogues sur des organes isolés donne une idée de leur activité sur le
récepteur au thromboxane A2 exprimé sur un autre type de cellules que les plaquettes (Dogné
et al., 2001).
Des lignées cellulaires stables surexprimant soit le récepteur TPα soit le récepteur TPβ
sont utilisées dans la mesure de la stimulation de la concentration en calcium intracellulaire
induite par un agoniste stable des récepteurs TP, le U-46619, dans le but de déterminer
l’affinité et ou la sélectivité des ligands vis-à-vis de l’une ou l’autre isoforme du récepteur TP.
Malgré la diversité des protocoles utilisés, il est intéressant de noter que le profil
antagoniste ou agoniste des récepteurs TP est relativement bien conservé quel que soit le
71
Résultats et discussion
modèle utilisé, bien que pour un même composé la valeur de l’IC50 calculée puisse fortement
varier en fonction de l’inducteur utilisé.
Comme nous l’avons dit dans le chapitre II, ce travail s’inscrit dans la suite de l’étude
réalisée sur les dérivés nitrobenzènesulfonylurées. Cette étude avait permis de mettre en
évidence le BM-573 et le BM-613 en tant que dérivés intéressants pouvant être utilisés
comme ligands des récepteurs TP plaquettaires, antiagrégants plaquettaires et inhibiteurs de la
thromboxane synthase (Dogné et al., 2000; 2001; 2004; Hanson et al., 2005; 2006; 2007).
Le but de cette étude était de vérifier l’effet sur le profil pharmacologique d’une part,
du remplacement isostérique, par un groupement cyano, du groupement nitro des dérivés
nitrobenzènesulfonylurées synthétisés au cours des travaux antérieurs et d’autre part, le
remplacement du pont NH intercycle par un pont O intercycle.
Le développement de ces nouveaux ligands des récepteurs au thromboxane A2 nous a
aussi permis d’étudier la toxicité cellulaire du BM-573 par comparaison avec celle des deux
produits nouvellement synthétisés les plus actifs.
C’est dans ce contexte qu’il nous a paru logique de nous inspirer des modèles
pharmacologiques utilisés au cours des travaux antérieurs au sein de notre laboratoire (Dogné
et al., 2000; 2001; 2004; Hanson al., 2006).
Nous avons réalisé a priori le test de mesure de la stimulation de la concentration en
calcium intracellulaire mobilisé en présence du U-46619, un agoniste stable des récepteurs TP
plaquettaires. Ce test est réalisé sur les cellules HEK 293 surexprimant soit l’isoforme α ou
soit l’isoforme β des récepteurs au thromboxane A2, comme décrit précédemment (Hanson et
al., 2006).
Cette mesure nous a permis de mettre en évidence, la nature antagoniste ou non des
nouveaux ligands synthétisés.
Le pouvoir antagoniste des drogues sélectionnées au cours de ce test a été ensuite
confirmé par la mesure de la prévention de l’agrégation de plaquettes humaines induite par
différents inducteurs: le U-46619, l’acide arachidonique, l’ADP et le collagène. Cette mesure
est réalisée sur du plasma enrichi en plaquettes selon la méthode turbidimétrique décrite
précédemment (Born and Cross, 1963).
Le test sur l’aorte de rat précontractée au moyen d’une solution à 20 nM de U-46619
nous a permis de mettre en évidence le pouvoir relâchant ou non de nos molécules sur des
muscles lisses, selon la méthode décrite au cours des travaux antérieurs (Rolin et al., 2003;
Dogné et al., 2004).
72
Résultats et discussion
Ce test présente l’intérêt d’être réalisé sur un autre type cellulaire que les plaquettes et
de confirmer le potentiel antagoniste des récepteurs au thromboxane A2 des molécules
sélectionnées et testées.
Un profil mixte (antagoniste de récepteurs au thromboxane A2 et inhibiteur de la
thromboxane synthase) présente un intérêt évident du point de vue pharmacologique et
thérapeutique. La détermination du pouvoir inhibiteur de la thromboxane synthase par nos
molécules nous a donc paru utile.
Nous avons enfin évalué la toxicité cellulaire (sur les hépatocytes humains) du BM573 en comparaison avec celle des meilleurs produits de chacune des deux nouvelles séries
des produits synthétisés via une mesure de la concentration intracellulaire en ATP et celle de
l’activité extracellulaire de la LDH.
IV. 1. 2. Estimation de la concentration en calcium intracellulaire induite par 1 µM de U46619.
IV. 1. 2. 1. Introduction
Le TPα et le TPβ sont des récepteurs plaquettaires couplés aux protéines Gαq (Takuwa
et Rasmussen, 1987; Kinsella et al., 1997; Nakahata, 2008).
La liaison d’un ligand sur ses récepteurs et l’activation successive de la protéine G
représentent les deux premières étapes indispensables à la transmission d’un signal à
l’intérieur de la cellule.
La protéine Gαq activée peut interagir avec différentes classes d’effecteurs dont la
phospholipase C. La phospholipase C est une enzyme catalysant la réaction d'hydrolyse du
PIP2 (phosphatidyl inositol bis-phosphate) en IP3 (inositol-3-phosphate) et DAG
(diacylglycérol). L'IP3 est le second messager qui agit au niveau de récepteurs spécifiques
situés à la membrane de compartiments vésiculaires intracellulaires, entraînant un relargage, à
l'intérieur du cytosol, des ions Ca2+ contenus dans ces vésicules (Houslay et al., 1986;
Nakahata et al., 1989).
Le Ca2+ est un messager intracellulaire ubiquitaire qui contrôle diverses activités au niveau
cellulaire, notamment la contraction des muscles lisses (Raheja et Gill, 2002; Sharma et
O’Halloran, 2013; Wang et al., 2013).
73
Résultats et discussion
Par conséquent, l’estimation de la concentration en calcium intracellulaire [Ca2+]i
mobilisé en présence d’un agoniste stable du récepteur TP, représente un test fonctionnel
approprié pour l’évaluation du potentiel agoniste ou antagoniste des molécules synthétisées.
Le modèle pharmacologique utilisé consiste en une application de la méthode décrite
antérieurement (Lin et al., 1999). Cette méthode propose une mesure rapide et efficace de la
concentration en calcium intracellulaire [Ca2+]i mobilisé, dans une plaque à 96 puits, en
utilisant un spectrophotomètre.
L’adaptation de cette méthode par notre laboratoire a permis d’estimer la [Ca2+]i
mobilisé en utilisant des lignées cellulaires stables HEK 293 surexprimant soit le TPα soit le
TPβ (Hanson et al., 2006).
La mesure se fait par spectrophotométrie de fluorescence en utilisant une sonde
fluorescente, le Fluo-4/AM. Les cellules sont marquées au Fluo-4/AM et sont mises en
contact, dans une plaque à 96 puits, avec un agoniste (U-46619) agissant sur un récepteur
couplé à la régulation de la [Ca2+]i .
Le Fluo-4/AM présente les avantages suivants (Hanson et al., 2006):
1.
Sa longueur d’onde d’excitation est observée à 480 nm dans le spectre
du visible, ce qui évite des dommages aux cellules. Celles-ci sont endommagées en
UV entre 340 et 360 nm.
2.
Il est très sensible, facteur important dans les études sur les plaques
multipuits.
3.
Il permet de visualiser des cinétiques rapides et facilite le couplage avec
des techniques électrophysiologiques (patch-clamp).
4.
Il est adapté aux études de microscopie confocale et permet de montrer
la distribution spatiale du calcium dans les cellules.
5.
Sa liaison avec le Ca2+ entraine une augmentation de l’intensité de
fluorescence, ce qui permet de le quantifier.
Le principe de la méthode est basé sur la formation d’un complexe entre le
fluorophore et les ions calcium en présence d’un agent chélateur (EGTA).
74
Résultats et discussion
L’estimation de la concentration en calcium intracellulaire [Ca2+]i mobilisé peut être
faite sur base de la quantification de l’intensité du signal de fluorescence observé en présence
des différents ligands testés.
Les molécules sont testées à des concentrations variant entre 10-5 et 10-9 M. Les
produits sont d’abord dissous dans le DMSO (10-2 M), puis les différentes concentrations sont
obtenues par dilution avec du PBS.
Les résultats obtenus sont comparés à ceux d’un composé de référence, le BM-573
(figure IV-1) un antiagrégant plaquettaire, antagoniste du récepteur au thromboxane A2 et
inhibiteur de la thromboxane synthase (Hanson et al., 2005).
Figure IV-1: Structure du BM-573.
IV. 1. 2. 2. Résultats obtenus dans le test de mesure de la concentration en calcium
intracellulaire mobilisé en présence de l’agoniste stable des récepteurs TP (U-46619).
Dans cette étude, 68 produits originaux aryloxy/arylamino/cycloalkylamino-5cyanobenzenesulfonylurées (7(a-z), 8(a-l), 9(a-i) et 10(a-s)) ont été synthétisés selon la
stratégie rapportée au chapitre III.
Premièrement, nous avons caractérisé le potentiel antagoniste de ces nouveaux
produits en réalisant un screening pharmacologique à la concentration de 10-5 M, selon le
protocole décrit au point IV-1.2.1.
Tous les composés évalués ont montré une activité intéressante comme antagonistes
vis-à-vis des récepteurs TPα et TPβ à 10 µM. La nature du pont (O ou NH dans les deux
75
Résultats et discussion
séries synthétisées) entre le noyau cyanobenzène et le second noyau aromatique n’influence
pas l’activité observée avec les molécules vis-à-vis du récepteur TP.
Deuxièmement, nous avons voulu estimer la concentration qui inhibe de 50% (IC50) la
concentration de Ca2+ ([Ca2+]i) mobilisé en présence du U-46619 et d’établir des relations
structure-activité (SAR). Les produits sont testés cette fois à des concentrations allant de 10-5
à 10-9 M. Les résultats sont consignés dans les tableaux IV-1, IV-2, IV-3 et IV-4.
Nous avons dans un premier temps fait varier la position du groupement méthyle sur le
noyau aromatique en position X (positions 2-, 3- et 4-), et observé l’influence des substituants
sur l’atome d’azote terminal en position R (isopropyle, tert-butyle et n-pentyle) dans les deux
séries de molécules (arylamino et aryloxy).
Les composés caractérisés par un groupement 3-méthyle ou un groupement 4-méthyle
en position X et un radical tert-butyle ou n-pentyle en position R (7h, 7i, 8h et 8i) ont
montré une forte activité antagoniste pour les deux isoformes du récepteur TP dans les deux
séries de molécules comme présenté dans le tableau 1.
L’arrangement spatial du méthyle en méta ou en para sur le noyau aromatique
permettrait à la molécule d’adopter ainsi un meilleur positionnement au niveau du site actif du
récepteur (au niveau d’une éventuelle poche hydrophobe).
Tous les composés caractérisés par un groupement isopropyle en position R présentent
une faible activité comparée aux autres substitutions en position R.
La présence du groupement 2-méthyle en position X semble moins favorable à
l’activité antagoniste comparé à la présence des groupements 3- et 4-méthyles. Cette
diminution de l’activité résulterait de l’encombrement stérique dû à la substitution du
groupement méthyle en position ortho contraignant probablement le noyau aromatique à
adopter un autre arrangement spatial. Cette hypothèse doit être confirmée par des études
ultérieures.
En résumé, les résultats présentés dans le tableau IV-1 permettent de dégager la
tendance suivante dans le choix du groupement méthyle pour une meilleure activité sur les
deux isoformes du récepteur TP (TPα et TPβ): 4-méthyle > 3-méthyle >> 2-méthyle. Dans le
choix de groupements alkyles en position R, l’ordre est: tert-butyle > n-pentyle > isopropyle.
Il se dégage aussi que le remplacement du groupement nitro par le groupement cyano
sur la molécule ne change pas le profil pharmacologique. L’activité est cependant légèrement
diminuée mais n’est pas supprimée. Le groupement cyano semble de ce fait conférer à la
molécule une électronégativité comparable à celle du groupement nitro requise pour une
bonne interaction avec le récepteur.
76
Résultats et discussion
Du point de vue de la sélectivité des composés pour l’un ou l’autre isoforme du
récepteur TP, la différence n’est pas clairement établie pour l’un des isoformes avec les
composés issus de la série arylamino. Par contre, nous avons observé, avec plusieurs
composés issus de la série aryloxy, une bonne affinité pour le TPβ comparé au TPα. Cette
différence n’est cependant pas toujours significative (p<0.05), le plus grand ratio de
sélectivité (IC50 TPα/IC50 TPβ) calculé ici étant de 2.5.
Tableau IV-1: Estimation de la valeur de l’IC50 pour l’inhibition de la stimulation du calcium
intracellulaire induite par 1 µM de U-46619 sur le TPα ou le TPβ. Série I: Influence de la
nature et de la position du groupement méthyle en X et de la nature du groupement alkyle en
R.
X
Y
O
O
S
N
H
O
N
H
R
Z
Inhibition de la [Ca2+] i mobilisé après
Induction avec le U-46619 (1µM)
(IC50, µM)a
Composés
X
R
BM 573
4-méthyle
tert-butyle
7a
7b
7c
7d
7e
7f
7g
7h
7i
2-méthyle
2-méthyle
2-méthyle
3-méthyle
3-méthyle
3-méthyle
4-méthyle
4-méthyle
4-méthyle
8a
8b
8c
8d
8e
8f
8g
8h
8i
2-méthyle
2-méthyle
2-méthyle
3-méthyle
3-méthyle
3-méthyle
4-méthyle
4-méthyle
4-méthyle
a
Y
TPβ
ratiob
Z
TPα
NH
NO2
0.70 ± 0.08
0.62 ± 0.05
1.1
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
O
O
O
O
O
O
O
O
O
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
8.68 ± 0.20
3.69 ± 0.18
2.24 ± 0.12
2.38 ± 0.10
1.05 ± 0.09
1.33 ± 0.11
3.05 ± 0.10
0.75 ± 0.07
0.90 ± 0.08
6.13 ± 0.34
1.47 ± 0.10
1.78 ± 0.11
1.69 ± 0.15
0.69 ± 0.04
0.68 ± 0.07
1.35 ± 0.09
0.68 ± 0.03
0.63 ± 0.05
1.4
2.5
1.3
1.4
1.5
2.0
2.3
1.1
1.4
isopropyle
tertbutyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
7.24 ± 0.19
2.75 ± 0.21
3.19 ± 0.14
9.50 ± 0.71
1.59 ± 0.08
2.95 ± 0.16
4.11 ± 0.19
0.85 ± 0.07
1.04 ± 0.10
10.12 ± 0.24
4.78 ± 0.75
7.85 ± 0.95
9.11 ± 0.14
2.20 ± 0.09
2.33 ± 0.13
4.22 ± 0.23
1.04 ± 0.09
2.06 ± 0.15
0.7
0.6
0.4
1.0
0.7
1.3
0.9
0.8
0.5
Résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type de 3 expériences séparées. b IC50TPα/IC50TPβ.
77
Résultats et discussion
Les
résultats
obtenus
dans
cette
étude
avec
les
dérivés
aryloxycyanobenzènesulfonylurées ne correspondent pas totalement à ceux obtenus
précédemment avec les dérivés aryloxynitrobenzènesulfonylurées. Pour ces derniers, la
différence dans la sélectivité et dans l’affinité entre les deux isoformes étaient très marquée,
avec des ratios de sélectivité pouvant atteindre 16 ou 17, suggérant ainsi, une forte affinité
pour le TPβ par rapport au TPα (Hanson et al., 2006; 2007).
Nos résultats confirment cependant les résultats obtenus lors des travaux antérieurs
dans le choix de la position du méthyle X et celui des groupements alkyles en R (Dogné et al.,
2000; 2001; Hanson et al., 2006; 2007).
Nous nous sommes proposés dans un second temps de déterminer l’impact de
l’introduction d’un atome d’halogène sur le second noyau aromatique (X = F, Cl, Br, I) en
préparant les composés 7(j-z), 8(j-l) et 10(a-s). Ces composés ont montré un potentiel
antagoniste plus faible comparé à leurs analogues avec un groupement méthyle, avec des
valeurs des IC50 comprises entre 5 et 10 µM (Tableaux IV-2 et IV-3).
78
Résultats et discussion
Tableau IV-2: Estimation de la valeur de l’IC50 pour l’inhibition de la stimulation du calcium
intracellulaire induite par 1 µM de U-46619 sur le TPα ou le TPβ. Série II: Influence de la
nature et de la position de l’halogène en X sur le phényle et de la nature du groupement alkyle
en R.
X
Y
O
O
S
N
H
O
N
H
R
Z
Inhibition de la [Ca2+] i mobilisé après
Induction avec le U-46619 (1µM)
(IC50, µM)a
Composés
X
R
Y
Z
TPα
TPβ
ratiob
BM 573
4-méthyle
tert-butyle
NH
NO2
0.70 ± 0.08
0.62 ± 0.05
1.1
7j
7k
7l
7m
7n
7o
7p
7q
7r
7s
7t
7u
4-fluoro
4-fluoro
4-fluoro
4-chloro
4-chloro
4-chloro
4-bromo
4-bromo
4-bromo
4-iodo
4-iodo
4-iodo
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyl
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
9.62 ± 0.28
4.35 ± 0.20
9.43 ± 0.50
9.46 ± 0.17
5.64 ± 0.13
8.64 ± 0.17
9.47 ± 0.90
5.88 ± 0.10
8.52 ± 0.17
9.58 ± 0.12
5.52 ± 0.82
9.52 ± 0.01
9.30 ± 0.80
3.89 ± 0.12
9.53 ± 0.12
8.49 ± 0.50
5.27 ± 0.70
8.72 ± 0.30
9.13 ± 0.35
5.31 ± 0.14
9.54 ± 0.70
9.30 ± 0.33
5.34 ± 0.45
9.49 ± 0.05
1.0
1.2
0.9
1.1
1.1
0.9
1.0
1.1
0.9
1.0
1.0
1.0
8j
8k
8l
4-fluoro
4-fluoro
4-fluoro
isopropyle
tert-butyle
pentyle
NH
NH
NH
CN
CN
CN
8.17 ± 0.38
4.64 ± 0.07
6.78 ± 0.21
7.83 ± 0.44
4.91 ± 0.47
6.45 ± 0.81
1.04
0.95
1,05
a
Résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type de 3 expériences séparées. b IC50TPα/IC50TPβ.
79
Résultats et discussion
Tableau IV-3: Estimation de la valeur de l’IC50 pour l’inhibition de la stimulation du calcium
intracellulaire induite par 1 µM de U-46619 sur le TPα ou le TPβ. Série II: Influence de la
nature et de la position de l’halogène en X sur le phényle et de la nature du groupement alkyle
en R
X
Y
O
O
S
N
H
O
N
H
R
Z
Inhibition de la [Ca2+] i mobilisé après
Induction avec le U-46619 (1µM)
(IC50, µM)a
Composés
X
R
Y
Z
BM 573
4-méthyle
tert-butyle
NH
7v
7w
7x
7y
7z
10
10b
10c
10d
10e
10f
10g
10h
10i
10j
10k
10l
10m
10n
10o
10p
10q
10r
10s
3-fluoro
3-fluoro
3-fluoro
3-chloro
3-chloro
3-chloro
3-bromo
3-bromo
3-bromo
3-iodo
3-iodo
3-iodo
2-fluoro
2-fluoro
2-fluoro
2-chloro
2-chloro
2-chloro
2-bromo
2-bromo
2-bromo
2-iodo
2-iodo
2-iodo
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
TPα
TPβ
ratiob
NO2
0.70 ± 0.08
0.62 ± 0.05
1.1
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
9.75 ± 0.28
7.85 ± 0.75
8.10 ± 0.50
9.60 ± 0.17
7.64 ± 0.98
8.04 ± 0.17
9.77 ± 0.90
5.98 ± 0.10
8.72 ± 0.17
9.62 ± 0.12
5.12 ± 0.82
9.52 ± 0.01
9.35 ± 0.28
4.35 ± 0.20
9.43 ± 0.50
9.46 ± 0.17
5.64 ± 0.13
8.64 ± 0.17
9.47 ± 0.90
5.88 ± 0.10
8.52 ± 0.17
9.68 ± 0.12
5.57 ± 0.82
9.25 ± 0.01
9.30 ± 0.80
5.85 ± 0.98
7.53 ± 0.12
8.17 ± 0.50
5.17 ± 0.70
7.72 ± 0.30
9.13 ± 0.35
5.21 ± 0.14
9.54 ± 0.70
9.49 ± 0.33
5.54 ± 0.05
9.19 ± 0.05
9.00 ± 0.80
3.89 ± 0.12
9.53 ± 0.12
8.49 ± 0.50
5.27 ± 0.70
8.72 ± 0.30
9.13 ± 0.35
5.31 ± 0.14
9.54 ± 0.70
9.30 ± 0.33
5.24 ± 0.15
8.95 ± 0.05
1.0
1.3
1.0
1.2
1.5
1.0
1.0
1.2
0.9
1.0
0.9
1.0
1.0
1.1
0.9
1.1
1.1
0.9
1.0
1.1
0.9
1.0
0.9
1.0
a Résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type de trois expériences séparées. b IC50TPα/IC50TPβ.
80
Résultats et discussion
Des résultats repris dans les tableaux IV-2 et IV-3, on peut conclure qu’un potentiel
antagoniste vis-à-vis des récepteurs TP est plus marqué, dans cette série de composés, lorsque
le composé porte un groupement tert-butyle en R sur l’azote terminal. Les composés les plus
actifs de cette série sont 7k, 7n, 7q, 7t et 8k avec des valeurs des IC50 comprises entre 4.35
et 5.88 µM. Nous avons ainsi constaté que le remplacement du méthyle par un halogène en X
sur le second noyau phényle diminue le potentiel antagoniste vis-à-vis du récepteur TP. La
différence d’affinité et de sélectivité pour les deux isoformes du récepteur TP est non
significative (p<0.05), avec des ratios de sélectivité compris entre 0.9 et 1.5.
Lors des travaux antérieurs, Dogné avait constaté que la substitution du groupement
nitro des sulfonylurées nitrobenzéniques par un groupement cyano n’était pas défavorable à
l’activité antagoniste vis-à-vis du récepteur au thromboxane A2 (Dogné, 2000). Deux
composés portant un noyau cyclohexyle en plus du noyau cyanobenzénique avaient été
synthétisés et testés.
Nous nous sommes proposé, enfin, de réévaluer l’activité antagoniste vis-à-vis du
récepteur au thromboxane A2 de dérivés portant un groupement cyclohexyle en R1 synthétisés
précédemment, ainsi que celle de ses analogues cycloheptyles et cyclooctyles (tableau IV-4).
Nous avons constaté que les composés testés sont actifs mais que leur activité est
faible par rapport à celle de leurs analogues méthylphényles. Il apparait que le remplacement
du noyau phényle par un noyau cycloalkyle en R1 confère à la molécule un léger potentiel
antagoniste comparé à leurs analogues arylnitrobenzéniques et arylbenzonitriles. Les résultats
sont résumés dans le tableau IV-4.
La présence du groupement tert-butyle ou n-pentyle en R2
antagoniste vis-à-vis des récepteurs TP plaquettaires des molécules testées.
81
potentialise l’effet
Résultats et discussion
Tableau IV-4: Estimation de la valeur de l’IC50 pour l’inhibition de la stimulation du calcium
intracellulaire induite par 1 µM de U-46619 sur le TPα ou le TPβ. Série III: Influence de la
nature et de la position du groupement cycloalkyle en R1 et de la nature du groupement alkyle
en R2,
Inhibition de la [Ca2+] i mobilisé après
Induction avec le U-46619 (1µM)
(IC50, µM)a
Composés
R1
R2
BM 573
4-méthyle
tert-butyle
9a
9b
9c
9d
9e
9f
9g
9h
9i
cyclohexyle
cyclohexyle
cyclohexyle
cycloheptyle
cycloheptyle
cycloheptyle
cyclooctyle
cyclooctyle
cyclooctyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
isopropyle
tert-butyle
pentyle
a
Z
NO2
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
ratiob
TPα
TPβ
0.70 ± 0.08
0.62 ± 0.05
1.1
9.18 ± 0.90
6.69 ± 0.87
5.24 ± 0.92
9.38 ± 0.95
5.49 ± 0.69
5.33 ± 0.61
9.05 ± 0.90
6.75 ± 0.57
5.90 ± 0.78
8.82 ± 0.64
7.12 ± 0.90
6.78 ± 0.71
9.69 ± 0.78
6.69 ± 0.98
6.10 ± 0.87
9.57 ± 0.79
7.68 ± 0.93
7.63 ± 0.75
1.0
0.9
0.8
0.9
0.8
0.9
0.9
0.9
0.8
Résultats exprimés en moyenne ± écart-type de 3 expériences séparées. b IC50TPα/IC50TPβ.
Les résultats obtenus avec l’ensemble de ces molécules sont particulièrement
intéressants. Ce test nous a permis de vérifier le potentiel antagoniste de nos molécules et a
servi de criblage pharmacologique en vue de sélectionner les composés les plus actifs pour les
tests futurs. Nous nous sommes proposés ensuite de déterminer l’effet antiagrégant
plaquettaire des 20 molécules les plus actives.
82
Résultats et discussion
IV.1. 3. Détermination de l’effet antiagrégant plaquettaire des molécules sélectionnées.
IV.1. 3.1. Introduction et protocole
Le pouvoir antagoniste vis-à-vis du récepteur au thromboxane A2 des 20 molécules
sélectionnées à la suite du test de mesure de la stimulation de la concentration en calcium
intracellulaire mobilisé en présence du U-46619, a été confirmé par la mesure de la prévention
de l’agrégation plaquettaire induite par différents agents inducteurs.
Cette étude agrégométrique a été réalisée à l’aide du plasma enrichi en plaquettes
(PRP) provenant d’échantillons sanguins d’origine humaine.
Protocole
Le principe consiste à mesurer l’effet préventif des drogues vis-à-vis de l’agrégation
des plaquettes induite par les inducteurs de l’agrégation plaquettaire (l’acide arachidonique,
l’ADP, le collagène et le U-46619) à l’aide d’un agrégomètre selon la méthode
turbidimétrique classique de Born et Cross (Born et Cross, 1963).
Du point de vue pratique, les échantillons de sang sont prélevés dans des tubes citratés
par ponction veineuse au pli du coude chez des donneurs n’ayant absorbé aucun médicament
depuis au moins deux semaines.
Le plasma enrichi en plaquettes (PRP) est obtenu par centrifugation du sang à 1000g
pendant 10 minutes. Une deuxième centrifugation du sang restant à 3000g pendant 10 minutes
permet d’obtenir le plasma pauvre en plaquettes (PPP) qui servira à l’étalonnage de
l’agrégomètre et à la dilution du PRP pour ajuster la concentration à 250.000 plaquettes/µl
(Dogné et al., 2000). Les drogues sont testées à des concentrations finales allant de 10-5 à 10-8
M. En pratique, 900 µl de PRP dont la teneur en plaquettes est connue sont introduits dans la
cuvette de l’agrégomètre et ensuite additionnés de 10 µl de drogue (10-2 à 10-5 M dans le
DMSO ou le DMSO/PBS). Le mélange est maintenu à 37°C pendant 5 minutes sous agitation
dans l’agrégomètre. L’agrégation est induite par ajout de l’inducteur.
La transmission (T) de l’échantillon est mesurée après 6 minutes. La transmission
maximale (Tmax) est déterminée en présence d’un échantillon de PRP contenant l’inducteur,
et la transmission minimale (Tmin) est évaluée en absence d’inducteur.
Le pourcentage d’inhibition de l’agrégation plaquettaire est exprimé par la relation:
83
Résultats et discussion
L’expression des résultats varie en fonction de l’inducteur utilisé:
1.
Lorsque le U-46619 est utilisé comme inducteur, la concentration en
drogue requise pour inhiber de 50% l’agrégation (IC50) est calculée et les courbes
concentrations-réponses sont réalisées. Les résultats sont exprimés en moyenne ±
écart-type (n = 3).
2.
La concentration minimale en drogue requise pour inhiber 100% de
l’agrégation induite par l’acide arachidonique est exprimée en EC100. Les résultats sont
exprimés en moyenne ± écart-type (n = 3).
3.
Pour ce qui est de l’ADP, les résultats sont exprimés de façon
qualitative: NI signifie «pas d’inhibition», IR+D et IR-D signifient respectivement une
inhibition de «relargage» avec et sans désagrégation.
4.
Dans le cas du collagène, les résultats sont exprimés en pourcentage
d’inhibition moyen de l’agrégation ± écart-type (n = 3).
IV.1. 3. 2. Résultats et discussion
Tous les composés testés à la concentration de 10-5 M préviennent l’agrégation
plaquettaire induite par 1 µM de U-46619, comme observé lors du test de mesure de la
stimulation de la [Ca2+]i mobilisé. La perte d’activité est observée à 0.1 µM pour tous les
composés, y compris le BM-573. Les résultats obtenus avec une sélection de composés à la
concentration finale de 1 µM sont résumés dans la figure IV-2.
84
Résultats et discussion
% Agrégation plaquettaire
Agrégation optique en présence de 1µM de
U-46619
100
80
60
40
20
0
Composés testés à la concentration de 1 µM
% Agrégation plaquettaire
Agrégation optique en présence de 1µM de
U-46619
80
60
40
20
0
Composés testés à la concentration de 1 µM
Figure IV-2: Inhibition de l’agrégation plaquettaire induite par 1 µM de U-46619. Les
plaquettes sont incubées avec 1 µM de la drogue ou avec 0.1% de DMSO. Les résultats sont
exprimés en moyenne± écart-type de plus de 3 essais différents.
Des courbes concentrations-réponses sont réalisées pour les produits les plus actifs,
c'est-à-dire, ceux ayant montré une activité marquée à 1 µM (7b, 7e, 7h, 8b, 8e et 8h)
comme représenté dans le tableau IV-5.
Les valeurs des IC50 des composés 7h et 8h (0.649 et 0.504 µM respectivement) pour
l’inhibition de l’agrégation plaquettaire induite par le U-46619 sont proches de celle trouvée
pour la référence utilisée (BM-573) (0.509 µM). Dans ce test, le composé 8h est légèrement
plus actif que son analogue 7h.
85
Résultats et discussion
Tableau IV-5: Estimation de valeur de l’IC50 pour l’inhibition de l’agrégation plaquettaire
induite par U-46619 (1 µM)
Composé
Inhibition de l’agrégation
Induite par 1 µM U-46619
IC50 (µM) a
BM 573
a
0.509 ± 0.006
7b
0.966 ± 0.051
7e
0.705 ± 0.035
7h
0.649 ± 0.006
8b
0.971 ± 0.021
8e
0.726 ± 0.072
8h
0.504 ± 0.016
Resultats exprimés en moyenne ± écart-type, (n≥3).
Ce test nous a permis de sélectionner les composés 7e, 7h et 8h qui se sont révélés
être les plus actifs dans le présent modèle. L’activité du 8h est comparable à la référence
utilisée (BM-573).
Ces 3 composés sont sélectionnés pour une évaluation dans les autres modèles
pharmacologiques à savoir l’aorte isolée de rat et une mesure d’activité vis-à-vis de la
thromboxane synthase.
Quand l’acide arachidonique est utilisé comme inducteur (600 µM), l’effet
antiagrégant de tous les composés testés était très marqué par rapport à l’effet observé avec le
U-46619 et les autres inducteurs. Les produits restent actifs jusqu’à 0.1 µM. On n’observe pas
d’effet intermédiaire. Tous les produits sont inactifs à 0.01 µM. Le meilleur produit de cette
série est le 8h avec une valeur de EC100 de 230 nM en comparaison avec le SQ-29548 et le
BM-573 (45 et 210 nM, respectivement) utilisés comme référence. Le 7h et le 7e restent
relativement actifs avec des EC100 de 250 et 265 nM. Les résultats sont consignés dans le
tableau 6.
A faible dose (2 µM), l’ADP induit une agrégation biphasique avec une première
phase qui correspond à une agrégation réversible consécutive à un effet direct sur les
récepteurs plaquettaires. La deuxième phase est celle de l’agrégation irréversible résultant du
86
Résultats et discussion
«relargage» de l’ADP et de la production de thromboxane A2 des plaquettes stimulées qui
activent les plaquettes avoisinantes.
Lorsque l’ADP est utilisé comme inducteur, aucune inhibition primaire de l’agrégation
plaquettaire n’a été observée. Certains produits (à la concentration de 10 µM) préviennent
l’apparition de la seconde vague de l’agrégation induite par l’ADP et entraînent la
désagrégation des premiers agrégats. D’autres dérivés inhibent la seconde vague sans induire
de désagrégation comme indiqué dans le tableau IV-6.
Le collagène utilisé à 2 µg/mL a induit une agrégation monophasique impliquant
partiellement le thromboxane car le collagène se fixe sur les récepteurs plaquettaires GPIa/IIa,
comme nous l’avons expliqué dans l’introduction.
Le composé 8h inhibe l’agrégation plaquettaire induite par 2 µg/mL de collagène avec
une IC50 de 240 nM et s’est ainsi révélé être le composé le plus actif dans ce test. Les résultats
sont repris dans le tableau IV-6.
Tableau IV-6: Inhibition de l’agrégation plaquettaire induite par l’acide arachidonique (600
µM), le collagène (2 µg/mL) et l’ADP (2 µM). Les produits sont testés à des concentrations
comprises entre 10-5 et 10-8 M. IC50 représente l’estimation de la concentration de la drogue
qui inhibe 50% de l’agrégation plaquettaire induite par le collagène et l’EC100, la
concentration minimale en drogue requise pour inhiber 100% de l’agrégation induite par
l’acide arachidonique.
Drogue
600 µM acide
arachidonique
2 µM ADP
IC50 (µM) a
EC100 (µM)
SQ-29548
BM-573
7h
8h
7e
a
2 µg/ml Collagène
IR+D b
IR+D
IR+D
IR+D
IR-D
0.045 ± 0.009
0.210 ± 0.019
0.250 ± 0.014
0.230 ± 0.011
0.265 ± 0.006
n.d.
0.280 ± 0.044
0.295 ± 0.085
0.240 ± 0.064
0.325 ± 0.055
IC50 (µM). Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type, n≥3. b Aucun composé n’a réussi à inhiber la
première phase de l’agrégation plaquettaire induite par l’ADP. Nous avons observé uniquement l’inhibition de la
seconde phase d’agrégation (à 10 µM).
87
Résultats et discussion
Les résultats obtenus dans ces tests sur nos produits confirment leur potentiel
antagoniste du récepteur au thromboxane A2 observé dans le test de mesure de stimulation de
[Ca2+]i en présence du U-46619 et sont très encourageants pour les recherches ultérieures.
IV.1. 4. Mesure de la relaxation de l’aorte de rat précontractée par le U-46619 (20 nM)
IV. 1. 4. 1. Introduction et protocole
Nous avons envisagé ce test en vue d’étudier le comportement de nos molécules sur
les muscles lisses vasculaires, en l’occurrence le tissu aortique. Ce test nous permettra de
confirmer le potentiel antagoniste de nos molécules vis-à-vis des récepteurs exprimés sur un
autre type de cellules que les plaquettes. En effet, le thromboxane A2 intervient dans la
contraction des muscles lisses pour le maintien du tonus vasculaire (Svenssen et al., 1977;
Yamada et al., 2003); c’est un bronchoconstricteur et un vasoconstricteur. Au niveau
physiopathologique, de nombreux travaux ont mis en évidence le rôle du TXA2. Une
surproduction révélée indirectement par des taux anormalement élevés de thromboxane B2
(TXB2) a été mise en évidence dans les pathologies cardiovasculaires, sanguines, rénales et
pulmonaires (Hamm et al., 1987; Davis-Bruno et Halushka , 1994; Devillier et Bessard, 1997;
Bing et al.,1999).
Protocole
L’aorte prélevée sur des rats femelles de type Wistar est lavée et dépourvue
d’endothélium. Elle est ensuite coupée en anneaux de 5 mm de diamètre. Ceux-ci sont
suspendus dans des bains thermostatisés à 37°C et contenant une solution de tyrode. Ces bains
sont soumis au barbotage du mélange O2-CO2 dans un rapport 95/5. La tension de l’aorte est
équilibrée et stabilisée (Tmin). La contraction est déclenchée par ajout d’une solution de U46619 (20 nM concentration finale). La drogue est ajoutée après stabilisation de la tension
maximale (Tmax). Lorsqu’on observe la relaxation, on enregistre à nouveau la tension (T).
Les drogues sont ensuite ajoutées en concentrations croissantes afin de relâcher ou non
l’aorte.
Pour une concentration en drogue donnée, la relaxation de l’aorte est exprimée en
pourcentage de réponse contractile induite par le U-46619 selon la formule:
88
Résultats et discussion
Des courbes concentrations-réponses (1.10-5 - 1.10-11 M) sont réalisées et ont permis
de déterminer la concentration en drogue requise pour réduire de 50% la tension induite par le
U-46619 (EC50). Le DMSO est utilisé ici comme véhicule. Les EC50 moyennes sont calculées
à partir d’un minimum de trois courbes suivies de l’écart-type.
IV. 1. 4. 2. Résultats
Les résultats obtenus sont repris dans le tableau IV-7. Ces résultats confirment un
pouvoir antagoniste des molécules sélectionnées et testées (7h, 7e et 8h) vis-à-vis des
récepteurs de l’aorte de rat. Les EC50 sont égales à 0.125 µM, 0.135 et 0.185 µM,
respectivement.
Les composés 7h et 7e montrent une meilleure activité antagoniste par rapport au
composé 8h.
Le SQ-29548 avec un EC50 de 0.024 µM, semble être le meilleur produit dans ce
modèle, suivi du BM-573 avec 0.028 µM et du Sératrodast 0.045 µM. Ces EC50 rejoignent
celles trouvées dans la littérature pour le SQ-29548 et le BM-573 (Hanson et al., 2005).
Nos composés testés présentent une activité moindre que le BM-573 avec des valeurs
des EC50 plus importantes. Il semble dans notre cas que le dérivé 8h en particulier, composé
isostère cyané du BM-573, présente un pouvoir antagoniste moindre que le BM-573 sur les
récepteurs TP vasculaires de rat. Le remplacement du groupement nitro du BM-573 par un
groupement cyano (8h) conduit donc à un composé présentant une activité différente en
fonction du tissu.
89
Résultats et discussion
Tableau IV-7: Effet de la drogue sur l’aorte de rat précontractée avec 20 nM de U-46619. La
valeur de EC50 représente la concentration de la drogue qui réduit de 50% la tension de l’aorte
précontractée avec le U-46619 (solution à 20 nM).
Drogue
Inhibition de la contraction induite par le U-46619 (20 nM)
Aorte de Rat EC50 (µM)a
SQ-29548
0.024 ± 0.005
BM-573
0.028 ± 0.004
Sératrodast
0.045 ± 0.004
7h
0.125 ± 0.058
7e
0.135± 0.028
8h
0.185 ± 0.043
a
Les resultants sont exprimés en moyenne ± écart-type; n≥3.
Le récepteur TP n'existe pas seulement à la surface des plaquettes mais a été mis en
évidence dans une quinzaine de tissus, notamment au niveau des systèmes cardio-vasculaire
(endothélium et cellules musculaires lisses) et respiratoire (Kinsella, 2001). Selon ces études,
le TPα a une localisation essentiellement plaquettaire alors que le TPβ a une localisation
vasculaire.
Durant le test de stimulation de la concentration en calcium intracellulaire induite par
le U-46619, nous avons observé que la plupart des dérivés à pont oxygéné présentaient une
meilleure affinité pour l’isoforme β que pour l’isoforme α des récepteurs TP. Nos résultats sur
l’aorte isolée de rats montrent un pouvoir antagoniste légèrement plus important des
composés 7h et 7e (composés avec un pont oxygéné) par rapport au composé 8h (avec un
pont NH). Ce résultat est donc conforme aux résultats du test d’affinité sur les deux
isoformes.
90
Résultats et discussion
IV. 1. 5. Evaluation du pouvoir inhibiteur de la thromboxane synthase
IV.1. 5. 1. Introduction et protocole
L’évaluation de l’activité des composés sur la thromboxane synthase est réalisée par la
mesure de la teneur en TXB2, un métabolite stable du TXA2.
Nous avons réalisé ce test sur le plasma enrichi en plaquettes provenant des
échantillons sanguins d’origine humaine. L’acide arachidonique est utilisé pour servir de
substrat. Cette mesure est effectuée grâce à des kits EIA (enzyme immunoassay kit, enzo).
Protocole
Le plasma enrichi en plaquettes est préparé comme décrit au point IV. 2. Les drogues
sont testées à des concentrations finales allant de 10-5 à 10-8 M.
En pratique, 900 µL de PRP sont introduits dans la cuvette de l’agrégomètre et ensuite
additionnées de 10 µl de la solution de drogue (10-2 à 10-5 M). Le mélange est maintenu à
37°C sous agitation dans l’agrégomètre, pendant 6 minutes. La production de TXA2 qui
devient TXB2 est induite par ajout de 600 µM (concentration finale) d’acide arachidonique.
Après 4 minutes, la cascade de l’acide arachidonique est bloquée par ajout d’indométacine
(0.02 mM dans le méthanol). Le contenu de la cuvette est collecté et centrifugé, les
surnageants sont ensuite récoltés. La teneur en TXB2 de ces surnageants est déterminée (P) au
moyen des kits EIA selon le protocole établi par le fabricant.
Ces kits se composent d’une plaque de 96 puits préalablement recouverts avec des
immunoglobulines G (IgG). Les échantillons sont ajoutés dans les puits et ensuite une
solution de TXB2 lié à une acétylcholinestérase et une autre contenant un anticorps sélectif du
TXB2 est additionnée. Il s’en suit un phénomène de compétition entre le TXB2 présent dans
les échantillons et celui lié à une acétylcholinestérase pour les anticorps.
Au terme de l’incubation, la plaque est rincée et ensuite révélée grâce au réactif
d’Ellman qui est composé d’acétylthiocholine et d’acide 5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoïque. Il
apparaît une coloration jaune inversement proportionnelle à la quantité de TXB2 présent dans
l’échantillon.
91
Résultats et discussion
La production basale de TXB2 (Po) est estimée en remplaçant l’acide arachidonique
par une solution tampon. Sa production maximale (Pmax) est évaluée en l’absence de drogue.
Le pourcentage d’inhibition de TXA2 est ensuite calculé selon la relation:
Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen de production de TXB2 suivi de
l’écart-type (n = 3).
IV. 1.5. 2. Résultats et discussion
La thromboxane synthase est l’enzyme qui transforme le PGH2 en TXA2 (Needleman
et al., 1976). Le TXA2 a une durée de vie très courte dans les conditions physiologiques et est
vite dégradée en TXB2. La production de TXA2 dans les échantillons est suivie par le dosage
de TXB2 et de 2.3-dinor TXB2 qui sont des métabolites stables (Moncada et al., 1978). Les
composés 7h et 8h ont été évalués dans ce modèle et ont montré une importante activité
inhibitrice de la thromboxane synthase, avec des valeurs d’IC50 égales à 41.00 ± 0.33 nM et
69.00 ± 0.53 nM, respectivement comparé au BM-573 utilisé comme référence (IC50 = 187 ±
38 nM). Le composé 7h est le plus actif dans ce test. Nos deux produits sont donc des
puissants inhibiteurs de la thromboxane synthase.
Les résultats obtenus dans les différents modèles pharmacologiques utilisés dans ce
travail semblent caractériser nos molécules comme pourvues d’un potentiel mixte, c'est-à-dire
inhibiteur de la thromboxane synthase et antagonistes des récepteurs au thromboxane A2, en
plus de l’activité antiagrégante plaquettaire. On observe cependant, pour les composés testés
sur la thromboxane synthase, un meilleur potentiel inhibiteur de la thromboxane synthase par
rapport au potentiel antagoniste des récepteurs au thromboxane A2.
92
Résultats et discussion
IV. 1. 6. Mesure de la viabilité des hépatocytes humains en présence des drogues
Les stratégies de développement de nouveaux médicaments plus efficaces et
d’évaluation de l’impact d’une molécule chimique ou d’un métal sur le fonctionnement
cellulaire et tissulaire subissent aujourd’hui une véritable révolution rendue possible par
l’essor des biotechnologies.
Les connaissances acquises sur le génome humain et la mise au point de technologies
de plus en plus sophistiquées vont encore faire grandement évoluer la pharmacologie et la
toxicologie (Bus et Becker, 2009).
En effet, l’identification des cibles moléculaires (enzymes, récepteurs, canaux
ioniques), l’obtention de nouveaux modèles cellulaires (hépatocytes humains, tranches
d’organes,…), la mise au point de tests miniaturisés et automatisés (détection par
luminescence ou fluorescence, …), l’apport de la génomique et la bioinformatique offrent des
moyens d’investigation nouveaux. Les marqueurs de cytotoxicité les plus utilisés sont le bleu
d’Alamar dans des essais de viabilité cellulaire et la luciférase pour la mesure de la
concentration intracellulaire en ATP (Crouch et al., 1993; Pellegati et al., 2005).
On estime qu’environ un tiers des causes d’arrêt au cours du développement sont liés à
des problèmes de toxicité mis en évidence chez l’homme ou chez l’animal. Ceci signifie
qu’une détection plus précoce de la toxicité, dès la phase de recherche, réduirait
significativement de taux d’échec (Zanese et al., 2012).
L'objet de ce chapitre est d'évaluer in vitro la tolérance cellulaire (des hépatocytes
humains) vis-à-vis de trois composés, le BM-573, le 7h et le 8h essentiellement par la mesure
de la concentration intracellulaire en ATP et la mesure de l’activité extracellulaire de la LDH
comme décrit au cours de travaux antérieurs (Decker et Lohmann-Matthes, 1988; Masanet et
al., 1988; Crouch et al., 1993).
La mesure de la concentration intracellulaire en ATP, par la mesure de l'énergie émise
sous forme de bioluminescence, constitue une méthode rapide, simple et reproductible de
détermination de la viabilité des hépatocytes humains vis-à-vis des trois composés précités.
La mesure du dommage cellulaire se fera par dosage colorimétrique de l’activité
extracellulaire de la LDH.
93
Résultats et discussion
IV. 1. 6. 1. Mesure de la concentration intracellulaire en ATP
L’adénosine-5-triphosphate (ATP) est la molécule qui, dans la biochimie de tous les
organismes vivants, fournit par hydrolyse l’énergie nécessaire aux réactions chimiques du
métabolisme. Il est le précurseur d’un certain nombre de cofacteurs enzymatiques (la
coenzyme A), il intervient dans la phosphorylation et la régulation de l’activité de certaines
enzymes comme précurseur allostérique, il permet le transport et le stockage de l’énergie
(Salter et Konick, 1993; Seinoa et Miki, 2003).
Si l'ATP est trouvée à l'état libre dans les cellules, elle sert également de matériaux de
construction pour la synthèse des acides nucléiques, la classe de macromolécules
essentiellement en charge de l'information génétique (Crouch et al., 1993).
L'ATP est donc le donneur immédiat d'énergie libre de très loin le plus important dans
les systèmes biologiques. Ce rôle d'intermédiaire, couplé au fait que les stocks d'ATP ne sont
pas très importants, fait que cette molécule est soumise à un renouvellement intense, ce qui
nécessite une production permanente, rapide et importante. Tout processus qui bloque sa
production provoque en conséquence une mort rapide de l'organisme contaminé.
IV. 1. 6. 1. 1. Méthodes
La mesure de la concentration intracellulaire en ATP est faite par bioluminescence en
présence de la luciférase comme décrit précédemment au cours de travaux antérieurs.
L’intensité de lumière émise est proportionnelle à la concentration en ATP dans la cellule
selon la réaction (Higashi et al., 1985; Crouch et al., 1993):
Nous avons utilisé à cet effet, les trousses Sigma de dosage spectrophotométrique de
l’ATP en appliquant les instructions du fournisseur à une suspension d’hépatocytes humains
incubée à température ambiante (18-22°C) pendant quelques minutes. Les produits sont testés
à 8 concentrations différentes (0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 200 et 400 µM) en utilisant le triton X94
Résultats et discussion
100 comme témoin positif (composé exprimant une toxicité cellulaire aiguë), l’actinomycine
D et l’acétaminophène comme témoins négatifs.
IV. 1. 6. 1. 2. Résultats
La détermination de la concentration intracellulaire en ATP des hépatocytes montre
que celle-ci diminue progressivement en fonction de la concentration des produits utilisés. A
50 µM et après 2 heures d’incubation, on observe une diminution importante de la viabilité
cellulaire caractérisée par un faible taux de l’ATP intracellulaire, pour le BM-573 comparé au
7h et 8h comme indiqué dans les tableaux IV-8, IV-9 et dans les figures IV-3, IV-4 et IV-5.
Le composé 7h semble exercer moins d’impact sur la viabilité que le composé 8h
puisque la concentration intracellulaire en ATP reste élevée jusqu’à 400 µM pour 7h, tandis
qu’elle diminue fortement dès 100 µM pour 8h (Tableau IV-8).
Tableau IV-8: Mesure par bioluminescence de l’intensité de lumière émise reflétant la
concentration intracellulaire en ATP, valeur (luminescence) observée après 2 heures
d’incubation: Témoins (Actinomycine D, Acétaminophène et Triton X-100):
Conc.
µM
800
200
100
50
10
5
1
0,1
Actinomycine D
Moyenne
SD
0,00
0,00
0,62
0,11
0,68
0,09
0,56
0,07
0,67
0,10
0,68
0,12
0,59
0,12
0,67
0,04
Acétaminophène
Moyenne
SD
0,81
0,10
0,80
0,01
0,87
0,09
0,83
0,08
0,81
0,02
0,85
0,09
0,90
0,07
0,87
0,13
95
Conc.
%
0,10
0,01
0,05
0,01
0,00
0,00
0,00
0,00
Triton X-100
Moyenne
SD
0,07
0,01
0,07
0,00
0,07
0,01
0,06
0,01
0,07
0,01
0,07
0,00
0,12
0,00
0,83
0,03
Résultats et discussion
Tableau IV-9: Mesure par bioluminescence de l’intensité de lumière émise reflétant la
concentration intracellulaire en ATP, valeur (luminescence) observée après 2 heures
d’incubation: 7h, 8h et BM-573.
Conc.
µM
400
200
100
50
10
5
1
0,1
7h
Moyenne
0,71
0,82
0,93
1,00
0,89
0,90
1,00
0,97
SD
0,02
0,10
0,02
0,09
0,03
0,15
0,14
0,14
8h
Moyenne
0,14
0,15
0,32
0,61
0,69
0,82
0,97
1,03
SD
0,02
0,00
0,01
0,03
0,03
0,02
0,08
0,17
BM-573
Moyenne SD
0,11
0,12
0,14
0,14
0,66
0,82
0,96
1,03
0,01
0,01
0,02
0,01
0,02
0,08
0,09
0,07
1,000
0,800
0,600
0,400
Luminescence à 560 nm
1,200
0,200
0,000
0,001% 0,01%
0,05%
0,1%
0,5%
5%
1%
10%
Concentration en triton (m/V)
Triton
Figure IV-3: Evolution de la bioluminescence en fonction de la concentration en Triton X-100
96
Résultats et discussion
1,000
0,800
0,600
0,400
Luminescence à 560 nm
1,200
0,200
0,000
0,1
1
5
10
50
100
200
Concentration (µM)
Acti. D
Figure IV-4: Evolution de la bioluminescence en fonction de la concentration en
Actinomycine D ou en Acétaminophène.
1,000
0,800
0,600
0,400
Luminescence à 560 nm
1,200
0,200
0,000
0,1
1
5
10
50
7h
100
200
400
Concentration (µM)
8h BM-573
Figure IV-5: Evolution de la bioluminescence en fonction de la concentration en 7h, 8h ou en
BM-573.
97
Résultats et discussion
IV. 1. 6. 2. Mesure de l’activité extracellulaire de la LDH
Les lactates déshydrogénases (LDH) sont des enzymes présentes dans une grande
diversité d’organismes, aussi bien animaux que végétaux. Elles catalysent la conversion du
pyruvate en lactate. Plusieurs types de ces enzymes existent, qui diffèrent suivant la nature du
cofacteur de la réaction et le stéréoisomère du lactate formé.
Le cofacteur le plus fréquent des lactates déshydrogénases est le NADH qui est
converti en NAD+. Cette conversion est la réaction de base de la fermentation lactique qui
permet de régénérer le NAD+ à l’issue de la glycolyse. Elle intervient dans un grand nombre
de biotransformations par des microorganismes et des bactéries lactiques. Certains lactates
déshydrogénases peuvent aussi utiliser le NADPH, voire d’autres cofacteurs (le cytochrome
C).
En médecine, la LDH est souvent utilisée comme marqueur de dommage tissulaire.
Par exemple, elle peut servir de marqueur de l’hémolyse. D'autres applications du dosage de
l'activité de la LDH concernent la destruction des tissus en général. On l'utilise pour le suivi
des patients cancéreux (lymphome ou cancer de testicule), vu que les cellules cancéreuses se
renouvellent rapidement, ce qui fait que les cellules détruites entrainent un taux élevé de
LDH.
IV. 1. 6. 2. 1. Méthodes
L’activité de la LDH est déterminée par un test enzymatique qui se déroule en deux
étapes:
La première étape consiste en la conversion du lactate en pyruvate par réduction du
NAD+ en NADH/H+ en présence de la LDH.
1.
Dans la deuxième étape, le formazan (catalyseur fournit dans le kit
utilisé) transfère le couple H/H+ de NADH/H+ au sel de tétrazolium qui est réduit à
son tour en formazan selon la réaction: (Figure IV-6)
98
Résultats et discussion
Figure IV-6: Principe de dosage de l’activité extracellulaire de la LDH.
Une augmentation du nombre de cellules endommagées aboutit à une augmentation de
l’activité de la LDH dans le surnageant. Cette augmentation est directement proportionnelle à
la quantité de formazan formé. Donc, l’intensité de coloration formée dans l'essai est
proportionnelle au nombre de cellules mortes et la lecture se fait à 500nm.
IV. 1. 6. 2. 2. Résultats
La mesure de la LDH montre une augmentation de la concentration en LDH en
fonction de la concentration des produits utilisés. A 400 µM le BM-573 révèle un taux de 75
% d’activité extracellulaire en LDH comparé à ces analogues 7h (3.7%) et 8h (32.5 %)
(Tableau IV-10). Ce résultat suggère une diminution importante de la viabilité cellulaire à 400
µM pour le BM-573. Les résultats sont résumés dans les tableaux IV-10, IV-11 et les figures
IV-7, IV-8 et IV-9.
99
Résultats et discussion
Tableau IV-10: Estimation de la cytotoxicité par dosage de l’activité extracellulaire de la
LDH. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cytoxicité.
Conc
µM
800
200
100
50
10
5
1
0,1
Acti. D
Moyenne
38,446
14,855
7,126
1,892
1,208
0,000
1,167
Chlorpr.
Moyenne
16,828
13,205
11,312
6,200
0,201
0,604
0,604
0,845
Acetom.
Moyenne
0,161
0,926
1,570
1,087
0,966
1,530
1,932
1,288
Conc.
%
10%
5%
1%
0,5%
0,1%
0,05%
0,01%
0,001%
Triton .
Moyenne
100,000
80,797
42,230
49,074
36,634
36,151
18,035
5,636
Conc.
µM
400
200
100
50
10
5
1
0,1
7h
Moyenne
3,704
1,288
1,610
1,409
1,369
1,610
1,852
1,932
8h
Moyenne
32,528
16,345
11,111
5,113
0,845
1,530
1,731
2,536
BM-573
Moyenne
75,483
34,944
15,821
10,064
4,791
3,060
4,428
3,019
Tableau IV-11: Estimation de la viabilité cellulaire par dosage de l’activité extracellulaire de
la LDH, les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité.
µM
800
200
100
50
10
5
1
0,1
Acti. D
Moyenne
61,554
85,145
92,874
98,108
98,792
100,000
98,833
Chlorpr.
Moyenne
83,172
86,795
88,688
93,800
99,799
99,396
99,396
99,155
Acetom.
Moyenne
99,839
99,074
98,430
98,913
99,034
98,470
98,068
98,712
Conc.
%
10%
5%
1%
0,5%
0,1%
0,05%
0,01%
0,001%
100
Triton .
Moyenne
0,000
19,203
57,770
50,926
63,366
63,849
81,965
94,364
Conc.
µM
400
200
100
50
10
5
1
0,1
7h
Moyenne
96,296
98,712
98,390
98,591
98,631
98,390
98,148
98,068
8h
Moyenne
67,472
83,655
88,889
94,887
99,155
98,470
98,269
97,464
BM-573
Moyenne
24,517
65,056
84,179
89,936
95,209
96,940
95,572
96,981
Résultats et discussion
1,200
0,800
0,600
0,400
Absorbance à 500 nm
1,000
0,200
0,000
0,001% 0,01%
0,05%
0,1%
0,5%
1%
5%
10%
Concentration en triton (m/V)
Triton
Figure IV-7: Evolution des absorbances en fonction de la concentration en Triton X-100
1,000
0,800
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
Absorbance à 500nm
0,900
0,200
0,100
0,000
0,1
1
5
Acti. D
10
50
100
200
Concentration (µM)
Figure IV-8: Evolution des absorbances en fonction de la concentration en Actinomycine D
ou en Acétaminophène
101
1,000
0,900
0,800
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0,1
1
5
10
7h
50
100
200
Absorbance à 500 nm
Résultats et discussion
400
Concentration (µM)
8h BM-573
Figure IV-9: Evolution des absorbances en fonction de la concentration en 7h, 8h ou en BM573.
De l’ensemble des résultats que nous avons obtenus, nous pouvons conclure que le
BM-573 montre une toxicité aiguë plus importante que son analogue 8h à 400 µM. Le
composé 7h est celui qui présente la moindre toxicité aiguë.
102
Résultats et discussion
IV. 2. Etudes cristallographiques des benzènesulfonylurées
Il est important de pouvoir déterminer la conformation active d’une molécule, celle
qui interagira de façon optimale avec son récepteur. Dans le cas des nitro- et
cyanobenzènesulfonylurées, la fraction “urée” du groupe “sulfonylurée”, est en principe de
conformation plane (atomes de carbone et d’azote de géométrie plane sp2) pour pouvoir
assurer une distribution électronique optimale entre l’oxygène et les azotes (électrons π du
C=O et paire libre d’électrons de N). Pour les urées N,N’-disubstituées, ce qui est le cas de
nos composés, il existe théoriquement quatre formes conformères possibles (quatre
conformations planes privilégiées) qui assurent cette distribution électronique optimale (voir
figure IV-10).
Figure IV-10: Quatre conformères privilégiées adoptées par les urées N,N’disubstituées.
Dans le cas plus spécifique des “sulfonylurées” (R = R”-SO2-), on peut supposer qu’il
y a une certaine possibilité de rotation libre de la liaison S-N et donc un grand degré de liberté
conformationnelle. La conformation dépendra donc essentiellement de la forme conformère
adoptée par la fraction urée de la fonction sulfonylurée.
La question s’est posée de savoir si nous pouvions déterminer sous quelle(s) forme(s)
conformères privilégiée(s) nos molécules se présentaient en solution et/ou lors de leur
103
Résultats et discussion
interaction avec le récepteur TP. La nature du pont intercycle (-NH- ou –O-) et du substituant
en position 5 (NO2 ou CN), ainsi que la position des substituants sur le cycle benzènique
(ortho, meta, para) peuvent-ils influencer la conformation adoptée par la molécule?
La meilleure approche expérimentale pour ce faire est sans doute l’examen des
données cristallographiques qui donnent accès à la conformation des molécules adoptée à
l’état solide (dans le cristal). Même si cette conformation n’est pas nécessairement celle qui
sera privilégiée en solution ou lors de l’interaction drogue-récepteur, il s’agit tout de même
d’une conformation “de basse énergie” qui peut exister à l’état dissous puisqu’elle est à
l’origine de la formation du cristal.
Nous avons donc sélectionné les cinq molécules suivantes en vue d’un examen
cristallographique (figure IV-11):
1) le BM-573;
2) son analogue nitré strict avec un pont –O- (JHP);
3) l’analogue strict du JHP présentant le méthyle en meta (JHM);
4) l’analogue cyané strict du BM-573 (8h);
5) l’analogue cyané du BM-573 avec un pont –O- (7h).
104
Résultats et discussion
Figure IV-11: Nitro- et cyanobenzènesulfonylurées sélectionnées pour les études
cristallographiques
Des cristaux des cinq molécules ont été obtenus par évaporation lente d’une solution
méthanolique concentrée de chaque produit. Les cristaux ont été soumis à l’examen par
rayons X auprès du laboratoire de cristallographie du Prof. L. Van Meervelt (Chemistry
Department KU Leuven).
Les résultats de l’examen cristallographique des cinq composés peuvent être
brièvement résumés comme suit.
105
Résultats et discussion
BM-573
A l’état solide, le BM-573 apparaît sous la forme “conformère A” (cfr figure IV-10).
Cette conformation est sans doute favorisée par l’existence possible d’une liaison hydrogène
intramoléculaire forte entre le –NH- intercycle et l’un des deux S=O du groupe sulfonyle
(formation d’un pseudocycle à six pièces) (cfr figure IV-12). D’autre part, on note la
formation de liaisons hydrogènes intermoléculaires entre le groupe carbonyle (C=O) d’une
molécule et les deux NH urées ‘en parallèle’ d’une molécule voisine, ce qui tend à favoriser la
configuration qui place précisément ces deux groupes NH en parallèle.
On note également que les deux cycles benzènes occupent des plans perpendiculaires
l’un par rapport à l’autre, ce qui correspond à un état de moindre d’encombrement stérique
entre les substituants ‘orthos’ des deux noyaux.
Figure IV-12: BM-573 dans le cristal
106
Résultats et discussion
JHP
Dans le cristal, le JHP se présente également sous la forme “conformère A”, alors qu’il
n’y a pas de possibilité de formation d’une liaison hydrogène intramoléculaire entre le pont et
le groupement sulfonyle (figure IV-13).
Figure IV-13: JHP dans le cristal
Par contre, nous retrouvons la formation des deux liaisons hydrogènes
intermoléculaires entre le groupe carbonyle d’une molécule et les deux groupes NH d’une
molécule voisine (cfr figure IV-13 bas).
Les deux cycles benzènes occupent également des plans perpendiculaires ente eux.
107
Résultats et discussion
JHM
Le résultat cristallographique avec le JHM est étonnant. On trouve, dans le cristal, le
composé sous deux conformations différentes, à savoir “conf. A” et “conf. B”. Ces deux
conformères interagissent par au moins une liaison hydrogène intermoléculaire établie entre le
groupement NH du SO2NHCO du conformère B avec le carbonyle C=O du conformère A
voisin (cfr figure IV-14).
D’autre part, au sein du conformère B, on observe une liaison hydrogène
intramoléculaire entre le second NH porteur du radical tert-butyle et l’un des deux S=O du
groupe sulfonyle (formation d’un pseudocycle à six pièces) (cfr figure IV-14). L’existence de
cette liaison H intramoléculaire explique sans doute la formation d’une forme conformère
inhabituelle pour une urée N,N’-disubstituée, à savoir la forme “conf. B”.
Figure IV-14: JHM dans le cristal
108
Résultats et discussion
8h
Des cristaux du composé 8h ont pu être obtenus au départ d’un lot de produit non pur
contaminé par la N,N’-di-tert-butylurée.
Le composé cyané 8h co-cristallisé avec la N,N’-di-tert-butylurée apparaît sous la
forme conformère A à l’état solide, comme cela avait été observé avec son analogue strict
nitré, le BM-573. Cependant, il est intéressant d’observer que la liaison hydrogène
intramoléculaire favorisée dans ce cas-ci s’établit entre le –NH- intercycle et le carbonyle
C=O de la fraction urée au lieu du S=O du groupe sulfonyle. D’autre part, l’azote du groupe
cyano est engagé dans des liaisons hydrogènes avec les deux NH en parallèle de la N,N’-ditert-butylurée (cfr figure IV-15).
Enfin, les deux groupes NH de la fonction sulfonylurée, qui se trouvent en parallèle
dans la conformation A, établissent des liaisons hydrogènes intermoléculaires avec le
carbonyle urée de la N,N’-di-tert-butylurée (cfr figure IV-15).
Figure IV-15: 8h dans le cristal
109
Résultats et discussion
7h
Le composé 7h se retrouve exclusivement dans le cristal sous la forme “conformère
B”. Il semble que l’établissement d’une liaison hydrogène intramoléculaire entre le second
NH urée porteur du radical tert-butyle et l’un des deux S=O du groupe sulfonyle soit
privilégiée dans la mesure où l’absence de groupe NH intercycle rend impossible de liaisons
intramoléculaires impliquant ce groupe (cfr figure IV-16). Les données cristallographiques
obtenues avec ce composé ont fait l’objet d’une publication dans Acta Crystallogr. C (Bambi
et al., 2013).
Figure IV-16: 7h dans le cristal
En conclusion, cette étude cristallographique permet de mettre en lumière plusieurs
éléments de discussion.
Tout d’abord, il semble que la conformation (forme conformère) “conf. A” soit
généralement privilégiée. Elle est observée systématiquement avec les benzènesulfonylurées
porteuses d’un pont –NH- intercycle. Ce groupe –NH- tend à favoriser l’établissement d’une
liaison hydrogène intramoléculaire, soit avec l’un des deux S=O (BM-573), soit avec le
groupe C=O (composé 8h).
Lorsque ce pont –NH- n’est pas présent, ce qui est le cas des benzènesulfonylurées
avec le pont –O- intercycle, deux conformations semblent privilégiées, à savoir “conf. A” et
“conf. B”. La forme “conformère B” s’explique par la possibilité de formation d’une liaison
hydrogène intramoléculaire forte entre le NH porteur du radical tert-butyle et l’un des deux
S=O. Le composé JHM nous offre un résultat étonnant puisqu’il existe sous les deux
110
Résultats et discussion
conformations (conf. A et conf. B) dans le cristal, ce qui signifie clairement que les deux
formes conformères peuvent exister en solution (juste avant de se retrouver dans le réseau
cristallin) et que le passage d’une forme à l’autre semble possible sans qu’il soit nécessaire de
franchir une barrière énergétique trop importante.
La forme conformère prédominante reste la forme “conf. A” qui, probablement, est
celle qu’adoptent les molécules en solution et, hypothétiquement, lors de leur interaction avec
le site de liaison sur les récepteurs TP.
111
Résultats et discussion
112
V.
Conclusion et Perspectives
Conclusion et Perspectives
114
Conclusion et Perspectives
V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Dans le cadre de ce travail, nous avons entrepris le développement et l’évaluation
pharmacologique d’une nouvelle série d’agents thérapeutiques dérivés du BM-573 (figure V1), en tant qu’antagonistes du récepteur au thromboxane A2 et antiagrégant plaquettaire.
Le point de départ de ce travail se fonde sur le fait que parmi les
nitrobenzènesulfonylurées développés au sein de notre laboratoire, le BM-573 s’est révélé
être un puissant agent antagoniste vis-à-vis du récepteur TP, antiagrégant plaquettaire et
inhibiteur de la thromboxane synthase. Ces propriétés lui confèrent un intérêt en tant qu’agent
antiplaquettaire et antithrombotique potentiellement utilisé en thérapeutique dans les
pathologies associées à la surproduction de thromboxane A2 telles que l’infarctus du
myocarde, l’accident vasculaire cérébral, les thromboses,...
Figure V-1: Structure chimique du BM-573.
Sur base de la structure de ce composé, nous avons réalisé diverses
pharmacomodulations dans le but de vérifier l’effet sur le profil pharmacologique d’une part,
du remplacement isostérique par un groupement cyano du groupement nitro des dérivés
nitrobenzènesulfonylurées synthétisés au cours des travaux antérieurs et d’autre part, pour un
certain nombre de dérivés, le remplacement du pont NH intercycle par un pont O intercycle
(Figure V-2).
115
Conclusion et Perspectives
Figure V-2: Variations structurales réalisées autour du BM-573.
Plus d’une soixantaine des molécules originales ont été synthétisées et leur pouvoir
antagoniste vis-à-vis du récepteur TP (TPα et TPβ) a été déterminé.
Tous les composés testés ont montré une activité intéressante comme antagonistes visà-vis des récepteurs TPα et TPβ à 10 µM. La nature du pont (O ou NH dans les deux séries
synthétisées) entre le noyau cyanobenzène et le second noyau aromatique n’influence pas
l’activité observée avec les molécules vis-à-vis du récepteur TP.
Ce test nous nous a permis d’estimer la concentration en drogue qui inhibe de 50%
(IC50) la stimulation du ([Ca2+]i) mobilisé en présence du U-46619, d’établir des relations
structure-activité (SAR) dans cette famille des molécules et d’aboutir à une sélection de
quelques molécules plus actives. Les composés caractérisés par un groupement 3méthylphényle ou un groupement 4-méthylphényle en position R1 et un radical tert-butyle ou
n-pentyle en position R2 (7e, 7h, 7i, 8e, 8h, 8i) ont montré la meilleure activité antagoniste
pour les deux isoformes du récepteur TP dans les deux séries de molécules. L’arrangement
spatial du méthyle en méta ou en para sur le noyau aromatique permettrait à la molécule
d’adopter un meilleur positionnement au niveau du site actif du récepteur. Ce test nous a servi
de criblage pharmacologique de ces drogues.
L’étude agrégométrique sur les molécules les plus actives a permis de confirmer le
pouvoir antagoniste vis-à-vis du récepteur. De ce fait, les composés 7e, 7h, 8e et 8h se sont
avérés de puissants inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire induite par le U-46619, le
116
Conclusion et Perspectives
collagène et l’acide arachidonique. Par ailleurs, ces composés se sont montrés aptes à inhiber
partiellement l’agrégation induite par l’ADP.
De plus, les composés 7e, 7h et 8h ont révélé un puissant effet myorelaxant sur l’aorte
de rat précontractée au moyen du U-46619 (concentration finale de 20 nM). Le test sur l’aorte
isolée de rats montre un pouvoir antagoniste légèrement plus important des composés 7e et 7h
(composés avec un pont oxygéné) par rapport au composé 8h (avec un pont NH). Ce résultat
est conforme aux résultats du test d’affinité sur les deux isoformes du récepteur TP.
L’intérêt thérapeutique supérieur attribué aux composés à action mixte (antagoniste
vis-à-vis du récepteur et inhibiteur de la thromboxane synthase), nous a poussés à étudier le
comportement de quelques-unes des nouvelles molécules synthétisées vis-à-vis de cette
enzyme. Au cours de ce test, nos dérivés ont été caractérisés par un puissant effet inhibiteur
de la thromboxane synthase supérieur à celui du BM-573 utilisé comme référence. Les
composés 7h et 8h ont montré jusqu’à la concentration de 1.10-7 M, une prévention totale de
la production de TXB2 par les plaquettes humaines stimulées à l’acide arachidonique.
La détermination de la toxicité cellulaire du BM-573 en comparaison de celle de deux
composés de la série des nouvelles molécules synthétisées nous a permis de mettre en
évidence une toxicité aigüe plus marquée du BM-573 par rapport aux composés 7h et 8h.
En conclusion, nos travaux ont abouti à la synthèse de différents dérivés
cyanobenzéniques possédant des propriétés antagonistes vis-à-vis des deux isoformes du
récepteur TP (TPα et TPβ), avec des affinités différentes. La plupart des dérivés
arylaminocyanobenzènes
présentent
une
meilleure
affinité
pour
le
TPα
et
les
aryloxycyanobenzènes une affinité pour le TPβ. Ces molécules possèdent également des
propriétés antiagrégantes plaquettaires. Certaines molécules testées inhibent remarquablement
la thromboxane synthase. Le 7h et le 8h (figure V-3) présentent une toxicité cellulaire aiguë
plus faible par rapport à leur analogue nitrobenzénique, le BM-573.
117
Conclusion et Perspectives
Figure V-3: Structures chimiques des molécules ayant présenté des propriétés
intéressantes dans les différents modèles pharmacologiques testés.
Ce travail ouvre donc la voie vers de nouvelles perspectives. En effet, les résultats
obtenus
dans
différents
modèles
avec
plusieurs
exemples
de
dérivés
cyanobenzènesulfonylurées développés dans ce travail sont encourageants. Ils nous ont
permis de dégager deux composés en particulier, à savoir le 7h et 8h, qui semblent être très
prometteurs pour la suite des investigations.
Ainsi, nous préconisons pour les études ultérieures:

D’un point de vue pharmacologique, les études in vivo de l’effet de ces
drogues en prophylaxie ou en traitement des troubles hémodynamiques vasculaires et
ventriculaires observés chez le rat et le porc dans des différentes conditions
physiologiques et physiopathologiques induites impliquant une surproduction de
TXA2 (Rolin et al., 2003; Dogné et al., 2004; Hanson et al., 2005; Cyrus et al., 2007).

La determination de la toxicité aiguë et subaiguë du BM-573, en
comparaison avec le 7h et 8h, chez le rat et le porc.

Du point de vue chimique, la
synthèse des dérivés à noyaux
méthylsulfonylbenzénique et trifluorométhylbenzénique, noyaux peu étudiés jusque-là.
118
VI. Matériel et Méthodes
Matériel et Méthodes
120
Matériel et Méthodes
VI. MATERIEL ET METHODES.
VI. 1. Synthèse organique
Dans ce chapitre, nous décrivons les différents protocoles de synthèse ainsi que les
données physico-chimiques des composés synthétisés (points de fusion, spectres RMN,
spectres de masse, analyses élémentaires des composés (C, H, N, S).
VI. 1. 1. Matériel
Les points de fusion des produits ont été mesurés sur un appareil à tube capillaire
Stuart modèle SMP3 et n’ont pas été corrigés.
Les spectres infrarouges de quelques produits ont été enregistrés sur un
spectrophotomètre Perkin-elmer FT-IR Spectrum 1000. Les produits ont été mis en dispersion
dans des pastilles de KBr.
Les spectres 1H et 13C RMN ont été enregistrés sur un appareil Bruker Avance (500 et
125 MHz respectivement) dans du DMSO deutéré.
Les déplacements chimiques sont exprimés en unités (ppm) en utilisant le
tétraméthylsilane (TMS) comme référence interne.
Nous avons utilisé les abréviations suivantes pour l’interprétation des spectres: s=
singulet, d = doublet, t = triplet, q = quadruplet, m = multiplet et b = bande large.
Les spectres de masse ont été pris sur ToF MS.
Les analyses élémentaires des composés (C, H, N) ont été effectuées sur un appareil
Thermo Electron Corporation Flash EA 1112 (Logiciel Eager 300). Une différence maximale
de 0.4 % par rapport à la valeur théorique est tolérée.
L’avancement des réactions était suivi par chromatographie sur couche mince (CCM).
Les plaques employées sont des plaques Merck® en aluminium recouvertes d’une couche de
gel de silice 60F254. L’observation des plaques se faisait à une longueur d’onde de 254 ou
366 nm à l’aide d’une lampe ultra-violette.
121
Matériel et Méthodes
Les diverses synthèses ont été réalisées à l’aide de réactifs et solvants fournis par les
firmes Aldrich®, Acros
®
et Fluorochem®. Toutes les synthèses ont été effectuées avec un
équipement conventionnel pour la chimie organique de synthèse (ballons, réfrigérants, …).
Tous nos composés synthétisés sont séchés à l’étuve ventilée à 30°C sans précautions
particulières.
VI. 1. 2. Description des modes opératoires
VI. 1. 2. 1. Synthèse des intermédiaires.
3-Amino-4-chlorobenzonitrile (2)
4 g de 4-chloro-3-nitrobenzonitrile sont dissous dans un mélange éthanol/eau (50/50)
et portés à reflux. On y ajoute 2 g de chlorure d’ammonium et 8 g de fer en poudre. Le
mélange est maintenu à reflux et sous agitation constante durant 10 minutes. Après
refroidissement, les oxydes de fer sont filtrés sur porcelaine. Le filtrat est placé à + 4 °C pour
provoquer la cristallisation du produit. Il se forme un précipité qui est recueilli par filtration,
rincé à l’éthanol, puis séché.
Le produit est recristallisé par traitement au charbon en utilisant l’éthanol. Le solvant
est ensuite évaporé sous pression réduite. Le précipité est repris dans l’eau, filtré, lavé à l’eau
et séché.
Rendements: 40-65%.
Phase mobile: Acétate d’éthyle/ hexane (5/15) + acide formique (quelques gouttes).
4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile (3)
D’une part, 50 ml d’acide acétique glacial sont saturés en SO2 durant 1 heure (solution
A), d’autre part, 4 g de 4-chloro-3-aminobenzonitrile sont dissous dans 15 ml d’acide
chlorhydrique 12 N auquel nous avons ajouté 40 ml d’acide acétique glacial (Solution B).
Cette solution est refroidie et maintenue à une température comprise entre 0 et -5°C. Enfin,
2.5 g de nitrite sodique sont dissous dans 5 ml d’eau (solution C). La solution C est ajoutée
goutte à la solution B pour former le sel de diazonium. La réaction étant exothermique, la
température reste inférieure à 5°C. 1 g de CuCl2 sont dissous dans 5 ml d’eau (solution D). La
122
Matériel et Méthodes
solution D est ajoutée à la solution A et agitée pendant 2 minutes. Un précipité de chlorure
cuivreux (Cu2Cl2) apparaît.
La solution contenant le diazonium est ajoutée prudemment et sous agitation à cette
dernière suspension. 75 g de glace sont ensuite additionnés au milieu réactionnel. Le précipité
de chlorure de sulfonyle formé est recueilli rapidement sur frité, lavé à l’eau glacée et
additionné sous agitation à une solution constituée de 20 ml d’ammoniaque concentré et de 40
ml d’eau. Cette solution est préalablement refroidie avant l’usage. Le mélange obtenu est
laissé sous agitation continue pendant 30 minutes et son pH est ajusté à 5 par ajout d’acide
chlorhydrique 12 N, puis concentré sous pression réduite. L’insoluble en suspension est
recueilli par filtration et ensuite dissous dans un minimum de méthanol. A cette solution est
ajoutée deux volumes d’eau. Il se forme un précipité qui est recueilli par filtration, lavé à
l’eau et séché puis recristallisé dans l’éthanol bouillant.
Rendement: 40-67%.
Phase mobile: Chloroforme/méthanol (19/1) + acide formique (quelques gouttes)
4-cycloalkylamino-3-sulfamoylbenzonitriles (4)
1 g de 4-chloro-3-sulfamoylbenzonitrile est mis en solution dans 30 ml de dioxane.
Après l’addition de 5 équivalents d’amine appropriée, le mélange est porté à reflux pendant
30-72 heures. Au terme de la réaction, la solution est évaporée sous pression réduite et le
résidu est repris par 100 ml de NaOH 0.5 N. L’excès d’amine est extrait trois fois par 150 ml
d’éther diéthylique. La phase aqueuse est ensuite amenée à pH 7.5 par ajout d’acide
chlorhydrique 0.5 N. Le précipité est recueilli sur filtre, lavé à l’eau puis séché.
Rendements: 60-95%
Par ce procédé, nous avons obtenu trois intermédiaires:
4-cyclohexylamino-3-sulfamoylbenzonitrile (4a)
4-cycloheptylamino-3-sulfamoylbenzonitrile (4b)
4-cyclooctylamino-3-sulfamoylbenzonitrile (4c)
Phase mobile: chloroforme/méthanol (19/1) + acide formique (quelques gouttes)
123
Matériel et Méthodes
3-Amino-4-fluorobenzonitrile (2’)
2 g de 4-fluoro-3-nitrobenzonitrile sont dissous dans 50 ml d’acétate d’éthyle et porté
à reflux. On y ajoute 10 g de chlorure d’étain et on maintient le reflux sous agitation constante
durant 30 minutes. Après refroidissement, on ajoute à la solution 100 ml d’une solution
saturée de bicarbonate de sodium. L’amine formée est extraite trois fois par 100 ml d’acétate
d’éthyle. L’acétate d’éthyle récupéré est séché sur le sulfate de magnésium anhydre. Le
sulfate de magnésium est éliminé par filtration et le filtrat recueilli est évaporé sous pression
réduite. Le résidu est repris dans un minimum de méthanol. En y ajoutant de l’eau et sous
agitation, il apparaît un précipité qui est recueilli par filtration, lavé à l’eau et séché.
Rendement: 30-60%
Phase mobile: Chloroforme + acide formique (quelques gouttes)
4-Fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile (3’):
Même mode opératoire que pour la formation de l’intermédiaire 4-chloro-3sulfamoylbenzonitrile.
Rendement: 40-65%
4-Arylamino-3-sulfamoylbenzonitriles (5)
1 g de 4-fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile est dissous dans 10 ml de dioxane. Après
addition de 4 équivalents d’amine appropriée, le mélange est mis à la bombe et placé à l’étuve
à 110°C pendant 20 à 30 heures. Au terme de la réaction, la solution est évaporée sous
pression réduite et le résidu est repris par 100 ml de NaOH 0.5N. L’excès d’amine est extrait
trois fois par 150 ml d’éther diéthylique. La phase aqueuse est ensuite amenée à pH 7.5 par
ajout d’acide chlorhydrique 0.5N. Le précipité formé est recueilli sur filtre, lavé à l’eau puis
séché.
Rendements: 60-80%.
Phase mobile: Chloroforme/méthanol (19/1) + acide formique (quelques gouttes).
Par ce mode opératoire nous avons synthétisé les intermédiaires suivants:
124
Matériel et Méthodes
4-(4-Méthylphénylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile
(5a).
Mp:
159-161°C.
Analyse
élémentaire (C14H13N3O2S) théorique N2 : 14.62, C: 58.52, H2: 4.56, S: 11.16. Trouvé: N2:
14.85, C: 58.35, H2: 4.62, S: 10.95.
4-(3-Méthylphénylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile
(5b) :
Mp:
160-162°C.
Analyse
élémentaire (C14H13N3O2S) théorique N2: 14.62, C: 58.52, H2: 4.56, S: 11.16. Trouvé: N2:
14.26, C: 58.05, H2: 4.74, S: 10.99.
4-(2-Méthylphénylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile
(5c).
Mp:
145-147°C
Analyse
élémentaire (C14H13N3O2S) théorique N2: 14.62, C: 58.52, H2: 4.56, S: 11.16. Trouvé: N2:
14.48, C: 58.63, H2: 4.46, S: 10.99.
4-(4-Fluorophénylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile (5d). Mp: 208-210°C.
4-Aryloxy-3-sulfamoylbenzonitriles (6)
0.03 moles de phénol approprié sont déprotonés par un équivalent de NaOH dans un
mélange hydroalcoolique et le mélange est évaporé sous pression réduite. Le phénolate formé
est repris dans 10 ml d’acétonitrile et porté à reflux. On ajoute au mélange 0.01 moles de
sulfonamide (3). Le reflux est maintenu sous agitation durant 10 à 36 heures. A la fin de la
réaction, le mélange est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est dissous dans le
méthanol. Le précipité est formé par ajout au mélange d’un minimum d’eau; il est recueilli sur
filtre, lavé et séché.
Rendement: 60-95%
Phase mobile: cyclohexane/acétate d’éthyle (10/10).
Produits obtenus par cette réaction:
4-(4-Méthylphénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6a). Mp: 186-188°C. Analyse élémentaire
(C14H13N3O2S) théorique N2: 9.72, C: 58.32, H2: 4.20, S: 11.12. Trouvé: N2: 10.19, C: 58.55,
H2: 4.25, S: 10.97.
4-(3-Méthylphénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6b). Mp: 161-163°C. Analyse élémentaire
(C14H13N3O2S) théorique N2: 9.72, C: 58.32, H2: 4.20, S: 11.12. Trouvé: N2: 9.77, C: 58.30,
H2: 4.12, S: 11.10.
125
Matériel et Méthodes
4-(2-Méthylphénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6c). Mp: 176-178°C. Analyse élémentaire
(C14H13N3O2S) théorique N2: 9.72, C: 58.32, H2: 4.20, S: 11.12. Trouvé: N2: 9.85, C: 58.43,
H2: 4.23, S: 11.02.
4-(4-Fluorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6d). Mp: 189-191°C.
4-(3-Fluorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6h). Mp: 185-187°C
4-(2-Fluorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6l). Mp: 215-217°C
4-(4-Chlorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6f). Mp: 210-212°C.
4-(3-Chlorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6j). Mp: 213-215°C
4-(2-Chlorophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6n). Mp: 187-189°C
4-(4-Bromophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6e). Mp: 205-207°C.
4-(3-Bromophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6i). Mp: 199-201°C
4-(2-Bromophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6m). Mp: 201-203°C
4-(4-Iodophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6g). Mp: 212-214°C.
4-(3-Iodophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6k). Mp: 205-207°C
4-(2-Iodophénoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (6o). Mp: 217-219°C
VI.
1.
2.
2.
Méthode
générale
de
synthèse
des
dérivés
N-alkyl-N’-[2-
(arylamino/aryloxy/cycloalkylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]urées.
0.01 mole de sulfonamide appropriée sont dissoutes dans 10 ml d’une
solution hydroalcoolique et additionnées d’un équivalent de NaOH. Après dissolution
complète de la sulfonamide, la solution est évaporée sous pression réduite. Le résidu
est repris trois fois par l’acétone et la solution évaporée sous pression réduite. La
sulfonamidate formée est portée ensuite à reflux dans l’acétone, on y ajoute 0.02
moles d’isocyanate appropriée et le milieu est maintenu sous agitation durant 10
minutes à 36 heures. Au terme de la réaction, le milieu est évaporé sous pression
réduite. Le résidu est repris par le méthanol et additionné d’un peu d’eau. Le milieu
126
Matériel et Méthodes
est ajusté à pH 1. Il apparaît un précipité qui est recueilli sur filtre, lavé à l’eau et
séché.
Rendements: 40-95%
Phase mobile: cyclohexane/acétate d’éthyle (10/10).
Par ce procédé, nous avons synthétisé 72 produits finaux dont nous décrivons cidessous quelques-uns d’entre eux:
N-Isopropyl-N’-[2-(2-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée
(7a).
Mp:
191-
193°C.1H NMR (DMSO) δ: 0.99 (d, 6H, -CH(CH3)2); 2.11 (s, 3H, 2’CH3); 3.62 (m, 1H, CH(CH3)2); 6.31 (d, 1H, CO-NH-CH); 6.77 (d, 1H, J = 9 Hz, 3-H); 6.99-7.45 (m, 4H, Haro’);
8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.88 (s, 1H, SO2-NHCO-NH).
13
C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 15.26, 22.30, 41.35, 104.36, 116.12, 117.42,
121.29, 126.68, 128.17, 130.14, 132.07, 135.29, 139.28, 150.34, 151.07, 157.86. Anal
(C18H19N3O4S) théorique: N, 11.25; C, 57.89; H, 5.13; S, 8.59. Trouvé: N, 11.06; C, 57.85; H,
5.30; S, 8.56. EI/HRMS (m/z) [M+H] +: 374.1171. Calcd for [C18H20N3O4S] +: 374.1175.
N-Tert-butyl-N’-[2-(2-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7b). Mp: 136-138°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.19 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 2.14 (s, 3H, 2’CH3); 6.29 (s, 1H, CO-NH-C);
6.75 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.01-7.49 (m, 4H, Haro’); 8.39 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H);
8.63 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.51 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO)
δ: 15.33, 28.35, 50.11, 104.36, 116.07, 117.43, 121.28, 126.71, 128.20, 130.14, 132.09,
135.23, 139.31, 151.07, 157.87. Anal (C19H21N3O4S) théorique: N, 10.85; C, 58.90; H, 5.46;
S, 8.27. Trouvé: N, 10.58; C, 58.94; H, 5.83; S, 8.16. EI/HRMS (m/z) [M+H] + : 388.1369.
Calcd for [C19H22N3O4S] +: 388.1331.
N-Pentyl-N’-[2-(2-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7c). Mp: 115-117 °C.
1
H NMR (DMSO) δ: 0.82 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.0-1.31 (m, 6H,
NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.13 (s, 3H, 2’CH3); 2.98 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2CH2-CH3); 6.52 (sb, 1H, CO-NH-CH2); 6.79 (d, 1H, J = 9Hz, 6’H); 7.10 (d, 1H, J = 9Hz, 6H); 7.29 -7.49 (m, 3H, Haro’); 8.41 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.68 (d, 1H, J = 2.5 Hz,
6-H); 10.98 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal (C20H23N3O4S) théorique: N, 10.47; C, 59.83; H,
5.77; S, 7.99. Trouvé: N, 10.43; C, 59.92; H, 5.70; S, 7.73.
N-Isopropyl-N’-[2-(3-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7d). Mp: 186-188°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H, -CH(CH3)2); 2.35 (s, 3H, 3’CH3); 3.62 (m, 1H,-CH-
(CH)3)2); 6.30 (d, 1H, CO-NH-CH); 7.00 (m, 3Haro’); 7.17 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Haro’); 7.42 (t,
127
Matériel et Méthodes
1H, J = 7.8 Hz, Haro’); 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H);
10.69 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.79, 22.32, 41.39, 99.50,
104.93, 117.38, 117.66, 118.31, 121.00, 126.70, 130.28, 135.10, 139.04, 140.49, 150.42,
153.81, 158.05. Anal (C18H19N3O4S) théorique: N, 11.25; C, 57.89; H, 5.13; S, 8.59. Trouvé:
N, 11.35; C, 57.67; H, 5.19; S, 8.56. EI/HRMS (m/z) [M+H]
+
: 374.1204. Calcd for
[C18H20N3O4S] +: 374.1175.
N-Tert-butyl-N’-[2-(3-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7e). Mp: 135-137°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 2. 38 (s, 3H, 3’CH3); 6.29 (s, 1H, CO-NH-
C); 7.07 (m, 3H, Haro’); 7.22 (d, 1H, J = 7.5 Hz, Haro’); 7.48 (t, 1H, J = 7.8 Hz, Haro’); 8.39 (dd,
1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.63 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.89 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH).
13
C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.81, 28.40, 50.15, 104.95, 117.37, 117.66, 118.25, 121.00,
126.76, 130.32, 135.07, 140.52, 153.78, 158.06. Anal (C19H21N3O4S) théorique: N, 10.85; C,
58.90; H, 5.46; S, 8.27. Trouvé: N, 10.55; C, 59.79; H, 5.79; S, 8.25. EI/HRMS (m/z) [M+H]
+
: 388.1341. Calcd for [C19H22N3O4S] +: 388.1331.
N-Pentyl-N’-[2-(3-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7f). Mp: 171-173°C. 1H
NMR (DMSO) δ: 0.85 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.12-1.67 (m, 6H, NHCH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.38 (s, 3H, 3’-CH3); 2.94 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2- CH2-CH2CH2-CH3); 6.58 (sb, 1H, CO-NH-CH2); 6.98 -7.19 (m, 3H, Haro’); 7.25 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H);
7.45 (t, 1H, J = 8Hz, 5’H); 8.45 (dd, 1H, J = 9Hz, J= 2.5 Hz, 4-H); 8.80 (d, 1H, J = 2.5Hz, 6H); 11 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal (C20H23N3O4S) théorique: N, 10.47; C, 59.83; H, 5.77;
S, 7.99. Trouvé: N, 10.27; C, 59.67; H, 5.70; S, 7.90.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7g). Mp: 218-220°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H, -CH(CH3)2); 2.35 (s, 3H, 4’CH3); 3.62 (m, 1H,-CH-
(CH)3)2); 6.30 (d, 1H, CO-NH-CH); 6.98 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.05 (d, 2H, J = 9Hz, Haro’);
7.36 (d, 2H, J = 9 Hz, Haro’); 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz,
6-H); 10.79 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal (C18H19N3O4S) théorique: N, 11.25; C, 57.89; H,
5.13; S, 8.59. Trouvé: N, 11.14; C, 57.82; H, 5.12; S, 8.54.
N-Tert-butyl-N’-[2-(4-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7h). Mp: 175-177°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.19 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 2.37 (s, 3H, 4’CH3); 6.22 (s, 1H, CO-NH-C);
7-7.65 (m, 5H, Haro’, 3-H); 8.49 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.67 (d, 1H, J = 2.5 Hz,
6-H); 10.55 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.36, 28.40, 41.58,
104.79, 117.44, 118.01, 120.55, 130.86, 130.94, 135.07, 135.46, 151.58, 158.37. Anal
128
Matériel et Méthodes
(C19H21N3O4S) théorique: N, 10.85; C, 58.90; H, 5.46; S, 8.27. Trouvé: N, 11.21; C, 58.97; H,
5.47; S, 8.01. EI/HRMS (m/z) [M+H] + : 388.1350. Calcd for [C19H22N3O4S] +: 388.1331.
N-Pentyl-N’-[2-(4-méthylphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7i). Mp: 161-163°C. 1H
NMR (DMSO) δ: 0.89 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.10-1.32 (m, 6H, NHCH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.53 (s, 3H, 4’CH3); 3.10 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2- CH2-CH2CH2-CH3); 6.52 (sb, 1H, CO-NH-CH2) 6.99 -7.49 (m, 5H, Haro’, 3-H); 8.40 (dd, 1H, J = 9 Hz,
J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 11.01 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal
(C20H23N3O4S) théorique: N, 10.47; C, 59.83; H, 5.77; S, 7.99. Trouvé: N, 10.49; C, 59.75; H,
5.88; S, 8.01.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-fluorophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7j). Mp: 179-181°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.0 (d, 6H,-CH(CH3)2); 3.60 (m, 1H,-CH-(CH)3)2); 6.34 (d, 1H, CO-
NH-CH); 6.98 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.00-7.30 (m, 4H, Haro’); 8.47 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5
Hz, 4-H); 8.64 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.79 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal
(C17H16FN3O4S), théorique: N, 11.13; C, 54.10; H, 4.27; S, 8.50. Trouvé: N, 11.10; C, 54.21;
H, 4.24; S, 8.32.
N-Tert-butyl-N’-[2-(4-fluorophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7k). Mp: 152-154°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 6.23 (s, 1H, CO-NH-C); 7.13 (d, 1H, J = 9Hz,
3-H); 7.22-7.63 (m, 4H, Haro’); 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.62 (d, 1H, J = 2.5
Hz, 6-H); 10.70 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH).
13
C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 28.39, 50.18,
105.21, 117.20, 117.33, 117.39, 118.19, 122.18, 122.55, 122.62, 130.08, 135.07, 139.16,
149.93, 158.01, 158.62, 160.55. Anal (C18H18FN3O4S), théorique: N, 10.74; C, 55.23; H,
4.64; S, 8.19. Trouvé: N, 10.62; C, 55.42; H, 4.74; S, 8.31. EI/HRMS (m/z) [M+H]
+
:
392.1073. Calcd for [C18H19FN3O4S] +: 392.1080.
N-Pentyl-N’-[2-(4-fluorohénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7l). Mp: 186-188°C. 1H
NMR (DMSO) δ: 0.81 (t, 3H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.10-1.35 (m, 6H, NH-CH2CH2-CH2-CH2-CH3); 2.96 (q, 2H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 6.42 (sb, 1H, CO-NH-CH2)
7.10 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.20-7.65 (m, 4H, Haro’); 8.49 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H);
8.71 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 11.1 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal (C19H20FN3O4S) (405.456)
théorique: N, 10.36; C, 56.28; H, 4.97; S, 7.91. Trouvé: N, 10.42; C, 56.43; H, 4.77; S, 7.98.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-chlorophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7m). Mp: 168-170°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H, -CH(CH3)2); 3.62 (m, 1H,-CH-(CH)3)2); 6.30 (d, 1H, CO-
NH-CH); 6.96 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.05-7.34 (m, 4H, Haro’); 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5
129
Matériel et Méthodes
Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.78 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal
(C17H16ClN3O4S) (393.85) théorique: N, 10.67; C, 51.84; H, 4.09; S, 8.14. Trouvé: N, 10.45;
C, 51.72; H, 4.15; S, 8.24.
N-Tert-butyl-N’-[2-(4-chlorophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7n). Mp: 154-156°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 6.25 (s, 1H, CO-NH-C); 7.11 (d, 1H, J = 9Hz,
3-H); 7.20 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 7.65 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 8.45 (dd, 1H, J = 9 Hz, J =
2.5 Hz, 4-H); 8.68 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.55 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125
MHz, DMSO) δ: 28.40, 50.23, 105.25, 117.19, 117.34, 117.42, 118.23, 122.19, 122.52,
122.64, 130.10, 135.09, 139.16, 149.93, 158.00, 158.64, 160.52. Anal (C18H18ClN3O4S)
théorique: N, 10.30; C, 53.01; H, 4.45; S, 7.86. Trouvé: N, 9.99; C, 53.03; H, 4.42; S, 7.64.
N-Pentyl-N’-[2-(4-chloroxyphénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7o). Mp: 167-169°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 0.81 (t, 3H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.10-1.35 (m, 6H, NH-CH2-
CH2-CH2-CH2-CH3); 2.96 (q, 2H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 6.46 (sb, 1H, NH-CO-NHCH2) 7.13 (d, 1H, J = 9 Hz, 3-H); 7.20 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 7.61 (d, 2H, J = 8.5 Hz,
Haro’) ; 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.65 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.99 (s, 1H,
SO2-NH-CO-NH). Anal (C19H20ClN3O4S) théorique: N, 9.96; C, 54.09; H, 4.78; S, 7.60.
Trouvé: N, 10.05; C, 54.17; H, 4.55; S, 7.44.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-bromophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7p). Mp: 160-162°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H, -CH(CH3)2); 3.64 (m, 1H,-CH-(CH)3)2); 6.35 (d, 1H, CO-
NH-CH); 6.98 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.05-7.36 (m, 4H, Haro’); 8.45 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5
Hz, 4-H); 8.62 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.79 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal
(C17H16BrN3O4S) théorique: N, 9.59; C, 46.59; H, 3.68; S, 7.32. Trouvé: N, 9.40; C, 46.68; H,
3.75; S, 7.41.
N-Tert-butyl-N’-[2-(4-bromophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7q). Mp 179-180°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.19 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 6.35 (s, 1H, CO-NH-C); 6.95 (d, 1H, J = 9Hz,
3-H); 7.13 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 7.63 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 8.35 (dd, 1H, J = 9 Hz, J =
2.5 Hz, 4-H); 8.86 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.65 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125
MHz, DMSO) δ: 28.40, 50.20, 105.19, 117.15, 117.35, 117.45, 118.25, 122.22, 122.50,
122.65, 130.15, 135.09, 139.18, 149.93, 158.02, 158.63, 160.54. Anal (C18H18BrN3O4S)
théorique: N, 9.29; C, 47.80; H, 4.01; S, 7.09. Trouvé: N, 9.19; C, 47.89; H, 4.12; S, 7.13.
N-Pentyl-N’-[2-(4-bromophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7r) . Mp: 170-172°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 0.81 (t, 3H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.10-1.35 (m, 6H, NH-CH2130
Matériel et Méthodes
CH2-CH2-CH2-CH3); 2.96 (q, 2H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 6.46 (sb, 1H, CO-NH-CH2)
7.11 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.20 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 7.73 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’) ;
8.41 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.65 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 11.01 (s, 1H, SO2-NHCO-NH). Anal (C19H20BrN3O4S) théorique: N, 9.01; C, 48.93; H, 4.32; S, 6.88. Trouvé: N,
8.91; C, 48.97; H, 4.38; S, 6.91.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-iodophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7s) . Mp: 174-176°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.15 (d, 6H, -CH(CH3)2); 3.64 (m, 1H,-CH-(CH)3)2); 6.36 (d, 1H, CO-
NH-CH); 6.97 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 6.99-7.32 (m, 4H, Haro’); 8.40 (dd, 1H, J = 9 Hz, J= 2.5
Hz, 4-H); 8.59 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.92 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal
(C17H16IN3O4S), théorique: N, 8.66; C, 42.07; H, 3.32; S, 6.61. Trouvé: N, 8.57; C, 42.21; H,
3.35; S, 6.52.
N-Tert-butyl-N-[2-(4-iodophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7t) . Mp: 183-185°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 6.25 (s, 1H, CO-NH-C); 7.01 (d, 2H, J = 8.5
Hz, Haro’) ; 7.13 (d, 2H, J = 9Hz, 3-H); 7.90 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 8.45 (dd, 1H, J = 9 Hz,
J = 2.5 Hz, 4-H); 8.68 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.55 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH).
13
C NMR
(125 MHz, DMSO) δ: 28.39, 50.19, 105.27, 117.24, 117.37, 117.45, 118.22, 122.24, 122.55,
122.65, 130.08, 135.09, 139.18, 149.93, 158.02, 158.62, 160.59. Anal (C18H18IN3O4S)
théorique. N, 8.42; C, 43.30; H, 3.63; S, 6.42.Trouvé: N, 8.50; C, 43.29; H, 3.61; S, 6.50.
N-Pentyl-N’-[2-(4-iodophénoxy)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (7u) . Mp: 159-161°C. 1H
NMR (DMSO) δ: 0.81 (t, 3H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.10-1.35 (m, 6H, NH-CH2CH2-CH2-CH2-CH3); 2.96 (q, 2H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 6.46 (sb, 1H, NH-CO-NHCH2) 6.99 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 7.15 (d, 2H, J = 9Hz, 3-H); 7.84 (d, 2H, J = 8.5 Hz,
Haro’) ; 8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.65 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 10.99 (s, 1H,
SO2-NH-CO-NH). Anal (C19H20IN3O4S) théorique: N, 8.19; C, 44.45; H, 3.93; S, 6.25.
Trouvé: N, 8.01; C, 44.53; H, 3.95.55; S, 5.99.
N-Isopropyl-N’-[2-(2-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8a). Mp: 150152°C. 1H NMR (DMSO) δ: 0.99 (d, 6H,-CH(CH3)2); 2.11 (s, 3H, 2’CH3); 3.62 (m, 1H, CH(CH3)2); 6.31 (d, 1H, CO-NH-CH); 6.75 (d, 1H, J = 9 Hz, 3-H); 6.99-7.45 (m, 4H, Haro’);
8.43 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H);8.72 (s, 1H, Ph-NHPh ) 10.88 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH).13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 17.23, 22.26, 41.53,
97.75, 114.41, 118.56, 126.38, 126.99, 127.32, 131.39, 134.27, 135.62, 136.62, 137.31,
146.72. Anal (C18H20N4O3S) théorique: N, 15.04; C, 58.05; H, 5.41; S, 8.61. Trouvé: N,
131
Matériel et Méthodes
15.29; C, 57.94; H, 5.52; S, 8.53. EI/HRMS (m/z) [M+H] +: 373.1355. Calcd for
[C18H21N4O3S] +: 373.1334.
N-Tert-butyl-N’-[2-(2-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8b). Mp: 165167°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.19 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 2.14 (s, 3H, 2’CH3); 6.29 (s, 1H, CONH-C); 6.70 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.01-7.49 (m, 4H, Haro’); 8.39 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5
Hz, 4-H); 8.63 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.50 (s, 1H, Ph-NH-Ph ); 10.51 (s, 1H, SO2-NH-CONH). Anal (C19H22N4O3S) théorique: N, 14.50; C, 59.05; H, 5.74; S, 8.30. Trouvé: N, 14.55;
C, 59.07; H, 5.90; S, 8.33.
N-Pentyl-N’-[2-(2-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée
(8c).
Mp:
159-
1
161°C. H NMR (DMSO) δ: 0.8 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.1-1.36 (m,
6H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.12 (s, 3H, 2’CH3); 2.92 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2- CH2CH2-CH2-CH3); 6.63 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 6.9 (sb, 1H, CO-NH-CH2); 7.26 -7.45 (m, 4H,
Haro’); 8.19 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.48 (s, 1H, Ph-NH-Ph); 8.61 (d, 1H, J = 2.5
Hz, 6-H); 10.91 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). Anal (C20H24N4O3S) théorique: N, 13.99; C, 59.98;
H, 6.04; S, 8.00. Trouvé: N, 14.19; C, 60.14; H, 6.25; S, 8.26.
N-Isopropyl-N’-[2-(3-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8d). Mp: 136138°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H, -CH(CH3)2); 2.35 (s, 3H, 3’CH3); 3.62 (m, 1H,-CH(CH)3)2); 6.30 (d, 1H, CO-NH-CH); 7.00-7.17 (m, 4H, Haro’); 7.42 (t, 1H, J = 8, H-5’); 8.43
(dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.59 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.74 (s, 1H, Ph-NH-Ph );
10.69 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.88, 22.27, 41.62, 98.50,
115.12, 118.46, 120.50, 123.96, 126.12, 129.57, 135.62, 137.25, 138.44, 139.32, 146.11,
150.97. Anal (C18H20N4O3S) théorique: N, 15.04; C, 58.05; H, 5.41; S, 8.61. Trouvé: N,
15.12; C, 58.07; H, 5.66; S, 8.51. EI/HRMS (m/z) [M+H]
+
: 373.1338. Calcd for
[C18H21N4O3S] +: 373.1334.
N-Tert-butyl-N’-[2-(3-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8e). Mp: 138140°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C (CH3)3); 2. 38 (s, 3H, 3’CH3); 6.25 (s, 1H,
CO-NH-C); 7.07-7.21 (m, 4H, Haro’); 7.48 (t, 1H, J = 7.8 Hz, Haro’); 8.39 (dd, 1H, J = 9 Hz, J
= 2.5 Hz, 4-H); 8.63 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.76 (s, 1H, Ph-NH-Ph); 10.89 (s, 1H, SO2-NHCO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.89, 28.36, 29.33, 50.41, 98.56, 115.21, 118.46,
120.48, 123.95, 126.11, 129.58, 135.36, 137.27, 138.55, 139.31, 146.31. Anal (C19H22N4O3S)
théorique: N, 14.50; C, 59.05; H, 5.74; S, 8.30. Trouvé: N, 14.56; C, 58.98; H, 6.01; S, 8.12.
EI/HRMS (m/z) [M+H] +: 387.1485. Calcd for [C19H23N4O3S] +: 387.1491.
132
Matériel et Méthodes
N-Pentyl-N’-[2-(3-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée
(8f).
Mp:
125-
126°C. 1H NMR (DMSO) δ: 0.8 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.12-1.37 (m,
6H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.35 (s, 3H, 3’-CH3); 2.99 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2- CH2CH2-CH2-CH3); 6.9 (sb, 1H, CO-NH-CH2); 7.11 -7.19 (m, 4H, Haro’); 7.37 (t, 1H, J = 8, 5’H);
8.4 (dd, 1H, J1 = 2.5 Hz, J2 = 9 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5Hz, 6-H); 8.75 (s, 1H, Ph-NHPh); 11.02 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH).13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 13.85, 20.88, 21.72,
28.27, 28.81, 98.51, 115.07, 118.45, 120.51, 123.00, 123.97, 126.15, 129.55, 135.58, 137.28,
138.39, 139.31, 146.06, 151.60. Anal (C20H24N4O3S) théorique: N, 13.99; C, 59.98; H, 6.04;
S, 8.00. Trouvé: N, 13.87; C, 59.81; H, 6.21; S, 7.89. EI/HRMS (m/z) [M+H] +: 401.1643.
Calcd for [C20H25N4O3S] +: 401.1647.
N-Isopropyl-N’-[2-(4-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8g) Mp: 136138°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.01 (d, 6H,-CH(CH3)2); 2.35 (s, 3H, 4’CH3); 3.62 (m, 1H,-CH(CH)3)2); 6.30 (d, 1H, CO-NH-CH); 6.98 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.05-7.36 (m, 4H, Haro’); 8.43
(dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.78 (s, 1H, Ph-NH-Ph );
10.79 (s, 1H, SO2-NH-CO-NH). 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 20.53, 22.28, 23.27, 41.60,
98.11, 114.71, 118.51, 124.00, 130.23, 134.99, 135.60, 135.81, 137.19, 141.81, 146.54. Anal
(C18H20N4O3S) théorique: N, 15.04; C, 58.05; H, 5.41; S, 8.61. Trouvé: N, 15.26; C, 57.97; H,
5.56; S, 8.26. EI/HRMS (m/z) [M+H] + : 373.1338. Calcd for [C18 H21N4O3S] +: 373.1334.
N-Tert-butyl-N’-[2-(4-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8h). Mp: 139141°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.18 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 2.35 (s, 3H, 4’CH3); 6.53 (s, 1H, CONH-C); 6.99-7.38 (m, 5H, Haro’); 8.19 (dd, 1H, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, H-4); 8.57 (d, 1H, J = 2.5
Hz, 6-H); 8.79 (s, 1H, Ph-NH-Ph ),10.59 (s, 1H, SO2- NH-CO-NH). Anal (C19H22N4O3S)
théorique: N, 14.50; C, 59.05; H, 5.74; S, 8.30. Trouvé: N, 14.70; C, 59.08; H, 5.82; S, 8.21.
N-Pentyl-N’-[2-(4-méthylphénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée
(8i).
Mp:
134-
136°C. 1H NMR (DMSO) δ: 0.8 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.1-1.38 (m,
6H, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.40 (s, 3H, 4’CH3); 2.95 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2- CH2CH2-CH2-CH3); 6.89 (sb, 1H, CO-NH-CH2) 7.07 -7.33 (m, 4H, Haro’); 8.19 (dd, 1H, J = 9 Hz,
J = 2.5 Hz, 4-H); 8.57 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.79 (s, 1H, Ph-NH-Ph ), 10.99 (s, 1H, SO2NH-CO-NH).
13
C NMR (125 MHz, DMSO) δ: 13.85, 20.52, 21.73, 28.28, 28.81, 98.15,
114.71, 118.49, 124.02, 130.22, 135.04, 135.57, 135.77, 137.23, 146.50, 151.75. Anal
(C20H24N4O3S) théorique: N, 13.99; C, 59.98; H, 6.04; S, 8.00. Trouvé: N, 14.20; C, 59.96; H,
6.08; S, 8.16. EI/HRMS (m/z) [M+H] +: 401.1649. Calcd for [C20H25N4O3S] +: 401.1647.
133
Matériel et Méthodes
N-Isopropyl-N’-[2-(4-fluorophénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (8j). Mp: 190192°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.0 (d, 6H, -CH(CH3)2); 3.80 (m, 1H,-CH-(CH)3)2); 6.35 (d, 1H,
CO-NH-CH); 6.79 (d, 1H, J = 9Hz, 3-H); 7.15-7.93 (m, 4H, Haro’); 8.46 (dd, 1H, J = 9 Hz, J =
2.5 Hz, 4-H); 8.65 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.78 (s, 1H, Ph-NH-Ph ); 10.88 (s, 1H, SO2-NHCO-NH). Anal (C17H17FN4O3S) théorique: N, 14.88; C, 54.25; H, 4.55; S, 8.52. Trouvé: N,
15.01; C, 54.37; H, 4.38; S, 8.47.
N-Tert-Butyl-N’-[2-(4-fluorophénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (k). Mp: 182184°C. 1H NMR (DMSO) δ: 1.17 (s, 9H, NH-C(CH3)3); 6.28 (s, 1H, CO-NH-C); 7.02 (d, 2H,
J= 8.5 Hz, Haro’); 7.15 (d, 2 H, J = 9Hz, 3-H), 7.92 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Haro’); 8.35 (dd, 1H, J =
9 Hz, J = 2.5 Hz, 4-H); 8.55 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-6); 8.75 (s, 1H, Ph-NH-Ph ),10.59 (s, 1H,
SO2- NH-CO-NH). Anal (C18H19FN4O3S) théorique: N, 14.35; C, 55.37; H, 4.91; S, 8.21.
Trouvé: N, 14.46; C, 55.49; H, 4.69; S, 8.25.
N-Pentyl-N’-[2-(4-fluorophénylamino)-5-cyanobenzènesulfonyl]urée (l). Mp: 163-165°C.
1
H NMR (DMSO) δ: 0.81 (t, 3H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 1.1-1.35 (m, 6H,
NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 2.93 (q, 2H, J = 7Hz, NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3); 6.69 (sb,
1H, CO-NH-CH2) 7.17 (d, 1H, J = 9HZ, H-3) 7.27 -7.49 (m, 4H, Haro’); 8.19 (dd, 1H, J = 9 Hz,
J = 2.5 Hz, 4-H); 8.57 (d, 1H, J = 2.5 Hz, 6-H); 8.80 (s, 1H, Ph-NH-Ph), 11.00 (s, 1H, SO2NH-CO-NH). Anal (C19H21FN4O3S) théorique: N, 13.85; C, 56.42; H, 5.23; S, 7.93. Trouvé:
N, 13.81; C, 56.51; H, 5.18; S, 7.84.
134
Matériel et Méthodes
VI. 2. Étude pharmacologique
VI. 2. 1. Test pharmacologique in vitro: test de stimulation du Calcium intracellulaire en
présence d’un agoniste stable (U-46619).
Culture cellulaire.
Les cellules clonales HEK 293 surexprimant soit le TP α ou le TP β et décrites
antérieurement (Walsh et al., 2000) ont été maintenues dans le milieu de culture DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) additionné de 10% (v/v) de FBS (Fetal Bovine
Serum). Elles ont été cultivées dans les boîtes de cultures («Tflask – T-75», Nune, Costar). La
boîte a été conservée dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère humide comprenant
5 % de CO2 et 95 % d’oxygène.
Les réactifs de culture ont été fournis par Invitrogen life technologies.
Préparation de la suspension cellulaire HEK 293
Les cellules HEK 293 ont été récoltées à partir de cultures présentant un degré de
confluence de 70-80 %. Après un traitement avec de la trypsine-EDTA, les cellules ont été
collectées et lavées deux fois avec 10 ml de tampon Krebs-HEPES buffer (118 mM de NaCl,
4.7 mM de KCl, 1.2 mM de MgSO4, 1.2mM de KH2PO4, 4.2mM de NaHCO3, 11.7 mM de DGlucose, 1.3mM de CaCl2, 10 mM de HEPES, pH, 7.4). Elles sont ensuite placées dans
l’incubateur pendant 60 minutes dans une atmosphère humide à 37 °C et 5 % de CO2 sous
agitation constante, en présence du fluorophore (le Fluo-4/AM (5 µg/ml, venant de chez
Invitrogen Belgique). Ce dernier, permet une forte émission de fluorescence une fois que les
cellules marquées sont mises en contact avec les antagonistes potentiels. Il est sensible et
permet de déterminer la variation de la concentration en Ca2+ intracellulaire.
Les cellules ont été ensuite rincées trois fois avec le tampon Krebs HEPES-glucose. .
Le rinçage permet d’élimer le reste de Fluo-4. 150 µl de la suspension cellulaire contenue
dans ce tampon ont été chargées dans chacun des 96 puits (Figure VI-1).
135
Matériel et Méthodes
Figure VI-1: plaque 96 puits
Les cellules ont été ensuite incubées durant 10 minutes avec 10 µl de la solution de
drogues à tester (concentrations finales variant de 10-5 à 10-9 M) avant leur stimulation avec
50 µl d’une solution de U-46619 (1 µM en concentration finale), l’agoniste stable des
récepteurs TP. Tous les composés à tester sont dissous dans du DMSO puis dilués à l’aide du
PBS.
Mesure de la concentration en calcium intracellulaire induite par l’agoniste en présence des
drogues
La mesure de la concentration en calcium intracellulaire a été inspirée de la méthode
modifiée de Lin et al., 1999 (Lin, Sadee et al., 1999). Le calcium intracellulaire ([Ca2+]i) est
mobilisé lorsque des cellules HEK 293.TP α et HEK293.TP β sont mises en contact avec 1
µM d’un agoniste (U-46619) agissant sur un récepteur couplé à la régulation du [Ca2+]i. Cela
facilite la mesure de la concentration par fluorimétrie à l’aide du Fluoroskan Ascent FL
équipé de deux dispensateurs (Thermo electron corporation, Finland). La fluorescence émise
était lue à 538 nanomètres (nm).
À la fin de l’expérience, des intensités de fluorescence ont été calibrées par la
libération de tous les noyaux des cellules en ajoutant au milieu 50 µl de Triton X-100 (un
détergent qui permet de digérer la membrane cytoplasmique afin d'avoir accès au noyau)
(Figure VI-2). Ceci nous permet de trouver (Fmax) de (Ca2+)i. En chélatant le calcium par la
suite avec 50 µl d’EGTA (Figure VI-3), nous trouvons (Fmin).
136
Matériel et Méthodes
Figure VI-2: Structure chimique du Triton X-100
Figure VI-3 : Structure Chimique de l’EGTA
L’estimation de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules est
obtenue par la formule:
[Ca2+]i = Kd. (F-Fmin)/(Fmax-F)
où le Kd est la constante de dissociation du Fluo-4 /AM, elle est de 345 nM.
Les concentrations requises pour inhiber de 50 % le calcium intracellulaire libéré
(IC50) par 1µM de U-46619 sont déterminées. Ces IC50 étaient calculées par régression non
linéaire en utilisant le logiciel GraphPad Prism software.
137
Matériel et Méthodes
VI. 2. 2. Test pharmacologique ex vivo
VI. 2. 2. 1. Test d’agrégation plaquettaire
Préparation de la suspension de plaquettes.
Le sang total est prélevé par ponction veineuse au pli du coude chez des donneurs
n’ayant absorbé aucun médicament depuis au moins deux semaines puis conservé dans des
tubes citratés. Le plasma enrichi en plaquettes est obtenu par centrifugation du sang à 1000 g
pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant (PRP) est conservé dans des tubes en polystyrène à
température ambiante pour être utilisé endéans les deux heures. Une centrifugation
supplémentaire du culot à 3000 g pendant 10 minutes à 4° C permet d’obtenir le plasma
pauvre en plaquettes (PPP) qui servira à l’étalonnage de l’agrégomètre. Le nombre de
plaquettes dans le PRP est compté et éventuellement ajusté à 250.103/µL par dilution avec du
PPP.
Préparation des drogues
Chaque molécule à tester est mise en solution dans le DMSO. Les différentes
concentrations souhaitées sont obtenues par dilution de la solution mère par du PBS. Les
molécules sont testées à des concentrations finales allant de 10-5 à 10-8 M.
Préparation des inducteurs d’agrégation
L’acide arachidonique (acheté chez sysmex®) est mis en solution dans du NaCl 0.9%.
On prépare une solution mère à une concentration de 0.015 M. L’acide arachidonique est
utilisée dans le test à la concentration finale de 600 µM. Le U-46619 (acheté chez Cayman
Chemical®) est préparé à une concentration de 1.10-4 M avec du NaCl 0.9%. Le U-46619 est
utilisé à la concentration finale de 1 µM. Le collagène (1 mg/mL) provient d’une dilution
d’une solution obtenue chez Horm®. L’ADP est dilué pour obtenir une solution de
concentration égale à 100 µM.
Essai
L’agrégation plaquettaire est mesurée à l’aide d’un agrégomètre (Chronolog
Corporation®), selon la méthode turbidimétrique de Born et Cross (Born et Cross, 1963). 900
µL de PRP, 10 µL de drogue et du sérum physiologique (q.s pour obtenir un volume final
138
Matériel et Méthodes
après ajout de l’inducteur de 1000 µl) sont introduits dans les cuvettes de mesure. Le mélange
est maintenu à 37°C pendant 3 minutes dans l’agrégomètre, sous agitation. La transmission
(T) de l’échantillon est mesurée 6 minutes après avoir ajouté la solution contenant l’agent
inducteur de l’agrégation (acide arachidonique: 40 µL; U-46619: 10 µL; collagène: 1 µL;
ADP: 20 µL). La transmission maximale (Tmax) est déterminée en présence d’un échantillon
de PRP contenant l’inducteur utilisé, tandis que la transmission minimale (Tmin) est évaluée
en l’absence d’inducteur.
Expression des résultats
Le pourcentage d’inhibition de l’agrégation est exprimé par la relation suivante:
Les résultats sont exprimés différemment suivant l’inducteur utilisé. La concentration
minimale en drogue pour inhiber 100% de l’agrégation induite par l’acide arachidonique a été
évaluée (EC100). Les résultats sont exprimés en valeur moyenne plus ou moins de son écart
type (n = 3).
Pour le U-46619, des courbes doses-réponses ont été réalisées et des IC50 ont été
déterminées. Elles représentent la concentration en drogue requise pour inhiber de 50%
l’agrégation des plaquettes. Les valeurs obtenues représentent les IC50 moyennes calculées à
partir de trois courbes plus ou moins l’écart-type (n = 3).
Lorsque le collagène est utilisé comme inducteur, les résultats sont exprimés en
pourcentage d’inhibition moyen de l’agrégation suivi de l’écart-type (n = 3). Dans ce cas, les
drogues sont utilisées à une concentration unique de 1.10-5 M.
Dans le cas de l’ADP, les résultats sont exprimés de façon qualitative: NI signifie «pas
d’inhibition», IR+D et IR-D traduisent respectivement une inhibition du« relargage» avec et
sans désagrégation.
139
Matériel et Méthodes
VI. 2. 2. 2. Étude de la relaxation de l’aorte de rat précontractée au moyen du U-46619
Préparation de l’aorte de Rat
Après thoracotomie, l’aorte est prélevée sur des rats (de type Wistar, 200-300 g)
anesthésiés au pentobarbital sodique (80 mg/kg, injection intrapéritonéale). L’aorte est
nettoyée de tout tissu adhérent et de l’endothélium (éliminé délicatement après curetage). Des
segments ou anneaux (5 mm) sont ensuite suspendus dans un bain contenant 20 mL de
tampon Krebs (118 mM de NaCl, 5.4 mM de KCl, 1.5 mM de 6H2O.MgCl2, 1.2 mM de
NaHCO3, 25 mM de NaHCO3, 10 mM de D-Glucose, 2.5 mM de CaCl2, pH 7.4). Ce bain est
thermostatisé à 37°C et soumis au barbotage d’un mélange gazeux O2-CO2 (95: 5). L’aorte est
équilibrée à 1 g de tension durant une heure avant de recevoir l’agent contractant qui est le U46619 (20 nM). Durant cette période, le milieu d’incubation est renouvelé toutes les quinze
minutes.
Préparation des drogues
Chaque drogue est mise en solution dans du DMSO (1.10-2 M). Cette solution est
éventuellement diluée par du PBS pour obtenir la concentration souhaitée (1.10-5-1.10-11 M).
Aux concentrations utilisées, le DMSO n’a pas d’impact sur les mesures.
Préparation du U-46619
10 mg de U-46619 (Cayman Chemical®) sont mis en solution dans 951 µL de DMSO
pour obtenir une concentration de 30 mM. Cette solution est ensuite diluée 10.000 fois avec le
tampon Krebs. La contraction de l’aorte est déclenchée par ajout de 132 µL de la solution de
U-46619 dans le bain d’incubation, soit une concentration finale de 20 Nm.
Essai
Après l’équilibrage et la stabilisation de la tension de l’aorte (Tmin), une contraction
est provoquée par ajout de 20 nM de U-46619 (en concentration finale). Lorsque la tension
maximale est stabilisée (Tmax), la drogue est ajoutée. Une fois la relaxation observée, la
nouvelle tension stabilisée est enregistrée (T). Des concentrations croissantes en drogue sont
ajoutées afin de relâcher l’aorte par paliers.
140
Matériel et Méthodes
Expression de résultats
Pour une concentration donnée en drogue, la relaxation de l’aorte est exprimée en
pourcentage de réponse contractile induite par le U-46619 selon la formule représentée cidessous:
Des courbes concentrations-réponses (1.10-5 M à 1.10-11 M) ont été réalisées et ont
permis de déterminer la concentration en drogue requise pour réduire de 50% la tension
induite par le U-46619 (EC50). Les valeurs obtenues représentent les EC50 moyennes calculées
à partir d’un minimum de trois courbes (± écart-type, n ≥ 3).
VI. 2. 2. 3. Étude du pouvoir inhibiteur de la thromboxane synthase
Préparation de la suspension de plaquettes
La préparation du PRP est identique à celle décrite pour le test d’agrégation de
plaquettes.
Préparation des drogues et préparation de l’inducteur d’agrégation
Les préparations des drogues et de l’acide arachidonique sont identiques à celles
décrites respectivement pour le test d’agrégation de plaquettes.
Essai
La production de TXA2 est évaluée par le dosage du TXB2 libéré après ajout
d’arachidonate sodique à du PRP.
On introduit 900 µL de PRP, 10 µL de dogue et 50 µL de sérum physiologique dans
les cuvettes de l’agrégomètre décrit précédemment (chronolog corporation®). Après 6 minutes
d’incubation à 37°C sous agitation, l’agrégation est induite par ajout de 40 µL d’arachidonate
141
Matériel et Méthodes
sodique en solution (0.015 M). Après 4 minutes, la cascade de l’acide arachidonique est
stoppée par ajout de 50 µL d’une solution d’indométacine (0.02 M dans le méthanol). Le
contenu de la cuvette est ensuite centrifugé immédiatement à 17500 g durant 10 secondes. Le
surnageant prélevé est congelé (-20°C). Le dosage du TXB2 (P) présent dans le surnageant
s’effectue au moyen d’un kit immunoenzymatique (EIA, TXB2 Enzo Chemical®). La
production basale de TXB2 (Po) est estimée en remplaçant l’arachidonique sodique et la
drogue par du tampon. La production maximale (Pmax) de TXB2 est quantifiée en remplaçant
la drogue par du tampon.
Expression des résultats
Les résultats sont exprimés en pourcentage moyen de production de TXB2 (± écarttype; n = 3), calculé selon la formule représentée ci-dessous:
142
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VIII. Annexes
Publications relatives à la dissertation
188
Publications relatives à la dissertation
VIII. PUBLICATIONS RELATIVES A LA DISSERTATION.
189
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Original article
Synthesis and pharmacological evaluation of 2-aryloxy/arylamino5-cyanobenzenesulfonylureas as novel thromboxane A2 receptor
antagonists
Sylvie-Mireille Bambi-Nyanguile a, Julien Hanson a, d, Annie Ooms b, Lutfiye Alpan c,
Philippe Kolh b, Jean-Michel Dogné c, Bernard Pirotte a, *
a
Laboratory of Medicinal Chemistry, Drug Research Center, University of Liege, 1, Avenue de l’Hôpital, Sart-Tilman, B-4000 Liege, Belgium
Department of Cardiovascular Research, University of Liege, Belgium
Department of Pharmacy, Namur Thrombosis and Hemostasis Center e Narilis, University of Namur, FUNDP, 61 rue de Bruxelles, B-5000 Namur, Belgium
d
Molecular Pharmacology, GIGA-Signal Transduction, University of Liege, Belgium
b
c
a r t i c l e i n f o
a b s t r a c t
Article history:
Received 12 December 2012
Received in revised form
10 April 2013
Accepted 13 April 2013
Available online 23 April 2013
New series of original 2-aryloxy/arylamino-5-cyanobenzenesulfonylureas were synthesized and evaluated as thromboxane A2 receptor (TP receptor) antagonists. A functional pharmacological test was used,
which consisted of measuring the inhibition of intracellular calcium mobilization in a model of
mammalian cell line that specifically over-expressed the individual TPa or TPb isoforms. 2-Arylamino-5cyanobenzenesulfonylureas exhibited virtually identical affinity and/or functional activity than 2aryloxy-5-cyanobenzenesulfonylureas for both TPa and TPb, but some 2-aryloxy-substituted compounds showed increased selectivity for TPb relative to TPa. Several compounds were found to be as
potent as the 2-arylamino-5-nitrobenzenesulfonylurea reference compound BM-573, supporting the
view that the bioisosteric replacement of the nitro group by a cyano group was tolerated.
TP receptor antagonist activity of the most promising molecules was confirmed in a platelet aggregation assay using the TP receptor agonist U-46619 as a proaggregant.
Three compounds (7e, 7h and 8h) were identified as leads for further non-clinical pharmacological
and toxicological studies.
Ó 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Keywords:
Thromboxane receptor antagonists
Antiplatelet agents
2-Aryloxy/arylamino-5cyanobenzenesulfonylureas
1. Introduction
Thromboxane A2 (TXA2) is a lipid mediator belonging to a group
of bioactive compounds called prostanoids and results from
arachidonic acid metabolism by the cyclooxygenase pathway [1e3].
This metabolite is formed by the action of thromboxane synthase
on prostaglandin endoperoxide H2 (PGH2) and causes vasoconstriction, bronchoconstriction, and platelet aggregation [4e8]. This
short-live lipid mediator is mainly produced by platelets, macrophages, and lung parenchyma [9]. It has been reported that high
plasma levels of this metabolite is implicated in the pathogenesis of
thrombotic diseases, including myocardial infarction, unstable
angina, pulmonary embolism, atherosclerosis, thrombosis [10e14];
preeclampsia [15], septic shock, asthma and pulmonary hypertension [16]. Furthermore, several studies pointed out a significant
Abbreviations: TXA2, thromboxane A2; TXS, thromboxane synthase; GPCR,
G-protein coupled receptor; TP receptor, thromboxane A2 receptor; PLC,
phospholipase C; IP3, inositol 1,4,5-triphosphate.
* Corresponding author. Tel.: þ32 43664365; fax: þ32 43664362.
E-mail address: [email protected] (B. Pirotte).
0223-5234/$ e see front matter Ó 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.04.033
stimulatory role of TXA2 in the proliferation of vascular smooth
muscle cells and mitogenesis [17,18]. TXA2 exerts its action through
the specific G-protein-coupled prostanoid receptors called TP receptors [2,19]. These human TP receptors exist in two isoforms, TPa
and TPb [20,21], which are identical for their first 328 amino
acids and differ exclusively in their carboxyl-terminal cytoplasmic
tail (C-tail) regions, due to alternative splicing in exon 3 of the TP
gene [21,22].
They exhibit identical ligand binding and couple similarly to Gq/G11
[23,24], G16 and G12 [25], but oppositely regulate adenylyl cyclise [26].
TPb is an alternative mRNA splicing variant with an extended carboxyl
terminus. The differences in intracellular termini may influence
desensitization, internalization, and G protein coupling [2,27,28].
However, only the TPa isoform is translated in platelets [29]. It is
noteworthy that the TPb isoform, but not TPa, promoted cell proliferation and migration and invasion by bladder cancer cells.
Moreover, TPb receptor expression was increased in tissue obtained
from bladder cancer patients [30].
The design and synthesis of selective isoform-specific TP receptor antagonists is of great interest not only in therapeutics but also as
pharmacological tools to decipher TP isoform specific roles [7,31].
Author's personal copy
S.-M. Bambi-Nyanguile et al. / European Journal of Medicinal Chemistry 65 (2013) 32e40
33
The cyano-substituted compounds evaluated in this work were
synthesized according to a synthetic process inspired from the one
previously described for nitro-substituted analogues [32]. The
starting compound was the commercially available 4-fluoro-3nitrobenzonitrile (1), which was reduced with stannous chloride
in the presence of sodium hydrogenocarbonate in ethyl acetate to
give 3-amino-4-fluorobenzonitrile (2). This latter reacted with sodium nitrite in acidic medium, and the resulting diazonium salt
solution was mixed with a solution of sulphur dioxide in acetic acid
in the presence of cuprous ions to generate 2-fluoro-5cyanobenzenesulfonyl chloride (3) according to the Meerwein
variation of the Sandmeyer reaction [32,33]. The decomposition of
compound 3 into a solution of ammonia gave 2-fluoro-5cyanobenzenesulfonamide (4), which was the common intermediate giving access to the target compounds (Scheme 1).
The nucleophilic substitution of the fluorine atom of 4 by
various phenols and amines gave access to intermediates 5 and 6.
The last step consisted of sulfonamide group deprotonation of intermediates 5 or 6 followed by their reaction with the appropriate
isocyanate in DMF, providing the target compounds 7 and 8
(Schemes 2 and 3).
The structures of the compounds prepared were confirmed by
elemental and spectral analyses.
test, which consisted of measuring the inhibition of intracellular
calcium ([Ca2þ]i) mobilization in a model of mammalian cell line
that specifically over-expressed the individual TPa or TPb isoforms
(HEK 293), in presence of the TXA2-mimetic compound U-46619
(7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1E,3S)-3-hydroxy-1-octenyl]-2-oxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl]-5-heptenoic acid) [7]. Calcium is the adequate
second messenger to evaluate since TPa or TPb each couples to Gq/
phospholipase (PL) C activation, leading to inositol 1,4,5trisphosphate (IP3) -mediated intracellular calcium mobilization
from intracellular stores [23,24]. The intracellular calcium mobilization was measured with cells preloaded with fluorescent dye
Fluo-4, whose fluorescence increases upon binding with calcium
ion released in response to the TXA2 mimetic U-46619 (1 mM).
Briefly, cells preloaded in Fluo-4/AM were stimulated with 1 mM
ligand (U-46619) for dose response studies, using concentrations of
the target compounds ranging from 109 M to 105 M. Representative data from at least three independent experiments are plotted
as changes in intracellular Ca2þ concentration mobilized (D[Ca2þ]i
(mM)) as a function of time (s) upon ligand stimulation. Concentrationeresponse curves were determined, and the IC50, defined as
the concentration of compound required to inhibit 50% of U-46619
induced [Ca2þ]i mobilization, were calculated. A selectivity index
ratio, defined as the IC50 TPa/IC50 TPb, was also calculated.
Results were compared to those observed with the reference
compound, BM-573 (Fig. 1), a well-known nitrobenzenesulfonylurea
previously reported to be a potent thromboxane A2 receptor antagonist and a thromboxane synthase inhibitor, and to prevent human
platelet aggregation induced by arachidonic acid or the TXA2-mimetic
compound U-46619 [36].
Secondly, the ability of the most interesting tested compounds
to prevent human platelet aggregation in response to U-46619 was
also evaluated. In this test, briefly, anticoagulated blood was
immediately centrifuged at 100g for 10 min at room temperature
and platelet rich plasma collected. The remaining fraction was
centrifuged at 2000g to obtain platelet poor plasma. Platelet aggregation was determined by light absorbance using a platelet
aggregometer with constant magnetic stirring. U-46619 (1 mM), the
stable analogue of TXA2, was used as an agent to induce an irreversible aggregation.
3. Pharmacological evaluation
4. Results and discussion
The aim of this study is to investigate if the replacement of the
nitro group by a cyano group has an impact on the in vitro pharmacological activity observed with nitrobenzenesulfonylureas as
TPa and TPb antagonists. Antagonistic activity and platelet aggregation were studied as previously described [7,24,34,35].
First, we have characterized the potency of the new synthetic
cyanobenzenesulfonylureas by using a functional pharmacological
In this study, a series of 33 original 2-aryloxy/arylamino-5cyanobenzenesulfonylureas (7aeu and 8ael) was synthesized according to Schemes 1e3.
First, we have characterized the antagonistic potency of these
new synthetic cyanobenzenesulfonylureas on the TPa and TPb isoforms of the human TXA2 receptors (see Table 1). All compounds
evaluated (7aeu) and (8aej) exhibited high activity as TPa and TPb
In this study, we describe the synthesis of a series of novel 5cyanobenzenesulfonylureas structurally related to previously
described 5-nitrobenzenesulfonylureas [32] and outline their
pharmacological evaluation as TP receptor antagonists. We also
describe the antiplatelet activity of the most interesting compounds.
The aim of this study is to investigate if the replacement of the
nitro group by a cyano group has an impact on the in vitro pharmacological activity observed with nitrobenzenesulfonylureas as
TPa and TPb antagonists. Due to potential toxicity with nitrobenzenic derivatives, a further investigation will be the assessment,
by means of appropriate in vitro and in vivo tests, of the acute and/
or chronic toxicity of the cyanobenzenic compounds compared to
the nitrobenzenic compounds.
2. Chemistry
F
F
NH2
NO2
CN
F
CN
O
O
S
F
Scheme 1. Synthesis of 4-fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile (4).
O
S
Cl
CN
O
CN
NH2
Author's personal copy
34
S.-M. Bambi-Nyanguile et al. / European Journal of Medicinal Chemistry 65 (2013) 32e40
X
F
O
O
S
CN
X
O
O
O
S
NH2
CN
O
O
O
S
NH2
N
H
O
N
H
R
CN
Scheme 2. General procedure for the preparation of N-alkyl-N’-[2-(aryloxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]ureas (7aeu).
receptor antagonists. The bridging atom (O or NH in series 7aeu or
8aej, respectively) between the cyanobenzene nucleus and the
second ring did not affect the affinity of the molecules for the TP
receptors.
In order to establish structureeactivity relationships (SAR) and
to evaluate selectivity for TP receptor isoforms within this family of
compounds, we first varied the position of the methyl group on the
aromatic ring (2-, 3- or 4-position), and we addressed the influence
of various alkyl (isopropyl, tert-butyl and n-pentyl) side chains R for
each position in the two series of molecules (arylamino- and
aryloxy-substituted compounds). Compounds characterized by a 3methylphenyl or a 4-methylphenyl group and a tert-butyl or a npentyl hydrocarbon chain in R (7e, 7f, 7h, 7i, 8h and 8i) were
characterized by potent antagonistic activity in the two series as
shown in Table 1. One possible explanation for this is that the
spatial arrangement of meta or para methyl position on the aromatic ring allows a better positioning in the active site of the receptor (at the level of a hydrophobic pocket). Most compounds
characterized by an isopropyl moiety in R exerted a weak activity
compared with the other substituents.
The presence of a 2-methylphenyl group appeared to be less
favourable for the antagonistic potency compared to the presence
of the 3- and 4-methyl-substituted phenyl group. This decrease of
activity probably resulted from the steric hindrance due to the
substituent in the ortho position of the aromatic ring forcing the
phenyl ring to adopt another spatial orientation. Further studies
will be needed to confirm this hypothesis.
Collectively, results from Table 1 highlighted the following general
trend in the choice of the R substituent for optimal activity on both
isoforms TPa and TPb: tert-butyl > n-pentyl > isopropyl. For compounds with a tert-butyl or an n-pentyl chain, the best positions for a
methyl group on the phenyl ring were positions 3 and 4.
The presence of a cyano group allows the molecule to exhibit a
similar profile compared to the previously described nitrobenzenesulfonylureas [7,32] because this group confers a similar
electron withdrawing impact on the molecule for a better interaction with the receptors. Regarding the difference of affinity for one
of the two isoforms, there was no clear difference with the compounds from the arylamino series. However, with compounds from
the aryloxy series, we found a better affinity for TPb with several
compounds. Nevertheless this difference was not significant
(p < 0.05), the higher isoform selectivity ratio (IC50 TPa/IC50 TPb)
being 2.5.
The results obtained from this study with cyanobenzenesulfonylureas do not fully correlate with those obtained with aryloxysubstituted nitrobenzenesulfonylureas for which a difference of
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S.-M. Bambi-Nyanguile et al. / European Journal of Medicinal Chemistry 65 (2013) 32e40
X
F
O
O
S
X
NH O
NH O
O
S
NH2
CN
35
NH2
CN
O
O
S
N
H
R
N
H
CN
Scheme 3. General procedure for the preparation of N-alkyl-N’-[2-(arylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]ureas (8ael).
activity between the two isoforms was observed. Some compounds
were characterized by an isoform selectivity ratio of 16 or 17 suggesting an increased selectivity for TPb relative to TPa [7].
We next investigated the effect of introducing a halogen atom
on the aromatic ring (X ¼ F, Cl, Br, I) by preparing compounds 7jeu
and 8jel. These compounds exhibited a weaker antagonistic potency, with IC50 values comprised between 4 and 10 mM in our
assays (Table 2). From the data summarized in Table 2, it can be
concluded that the best antagonistic potency on TP receptors by
these series of compounds was observed with compounds bearing
a tert-butyl moiety at R. The most interesting compounds of
this series were 7k, 7n, 7q, 7t and 8k with IC50 values between 4
and 6 mM.
Regarding the selectivity for one of the two isoforms of TP receptors, no difference was observed in affinity for one of them
(p < 0.05). The selectivity ratio varied between 0.9 and 1.2. We then
confirmed the activity of selected compounds on human platelets
by assessment of their ability to inhibit platelet aggregation in
response to the TXA2 mimetic U-46619. The results obtained at
1 mM with compounds 7aei and 8aei are summarized in Fig. 2. All
H3C
NH O O O
S
N
N
H
H
NO2
Fig. 1. Structure of the previously described nitrobenzenic sulfonylurea as thromboxane A2 receptor antagonist (BM-573).
Table 1
Estimated IC50 values for the inhibition of [Ca2þ]i mobilization mediated by either
TPa or TPb upon stimulation by U-46619 (1 mM). First series: Influence of the position of the methyl substituent in R1 and of the R2 alkyl side chain (18 compounds).
X
Y
O
O
O
S
N
H
N
H
R
Z
Compound X
R
Y
Z
Inhibition of U-46619-mediated
[Ca2þ]i mobilization (IC50, mM)a
TPa
BM-573
7a
7b
7c
7d
7e
7f
7g
7h
7i
8a
8b
8c
8d
8e
8f
8g
8h
8i
a
b
4-Methyl
2-Methyl
2-Methyl
2-Methyl
3-Methyl
3-Methyl
3-Methyl
4-Methyl
4-Methyl
4-Methyl
2-Methyl
2-Methyl
2-Methyl
3-Methyl
3-Methyl
3-Methyl
4-Methyl
4-Methyl
4-Methyl
tert-Butyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
NH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NO2
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
0.70
8.68
3.69
2.24
2.38
1.05
1.33
3.05
0.75
0.90
7.24
2.75
3.19
9.50
1.59
2.95
4.11
0.85
1.04
TPb
Ratiob
0.08 0.62 0.05 1.1
0.20 6.13 0.34 1.4
0.18 1.47 0.10 2.5
0.12 1.78 0.11 1.3
0.10 1.69 0.15 1.4
0.09 0.69 0.04 1.5
0.11 0.68 0.07 2.0
0.10 1.35 0.09 2.3
0.07 0.68 0.03 1.1
0.08 0.63 0.05 1.4
0.19 10.12 0.24 0.7
0.21 4.78 0.75 0.6
0.14 7.85 0.95 0.4
0.71 9.11 0.14 1.0
0.08 2.20 0.09 0.7
0.16 2.33 0.13 1.3
0.19 4.22 0.23 0.9
0.07 1.04 0.09 0.8
0.10 2.06 0.15 0.5
Results are expressed as mean standard deviation of three separate experiments.
IC50TPa/IC50TPb.
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Table 2
Estimated IC50 values for the inhibition of [Ca2þ]i mobilization mediated by either
TPa or TPb upon stimulation by U-46619 (1 mM). Second series: Influence of the
position of the halogen atom on the phenyl ring at R1 and of the hydrocarbon side
chain R2 (15 compounds).
X
Y
O
O
O
S
N
H
N
H
R
Z
Compound X
R
Y
Z
Inhibition of U-46619-mediated,
[Ca2þ]i mobilization (IC50, mM)a
TPa
BM-573
7j
7k
7l
7m
7n
7o
7p
7q
7r
7s
7t
7u
8j
8k
8l
a
b
4-Methyl
4-Fluoro
4-Fluoro
4-Fluoro
4-Chloro
4-Chloro
4-Chloro
4-Bromo
4-Bromo
4-Bromo
4-Iodo
4-Iodo
4-Iodo
4-Fluoro
4-Fluoro
4-Fluoro
tert-Butyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
Isopropyl
tert-Butyl
Pentyl
NH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
NH
NH
NH
NO2
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
CN
0.70
9.62
4.35
9.43
9.46
5.64
8.64
9.47
5.88
8.52
9.52
5.52
9.52
8.17
4.64
6.78
Ratiob
TPb
0.08
0.28
0.20
0.50
0.17
0.13
0.17
0.90
0.10
0.17
0.12
0.82
0.01
0.38
0.07
0.21
0.62
9.30
3.89
9.53
8.49
5.27
8.72
9.13
5.31
9.54
9.49
5.54
9.49
7.83
4.91
6.45
0.05
0.80
0.12
0.12
0.50
0.70
0.30
0.35
0.14
0.70
0.33
0.05
0.05
0.44
0.47
0.81
1.1
1.0
1.2
0.9
1.1
1.1
0.9
1.0
1.1
0.9
1.0
0.9
1.0
1.04
0.95
1,05
Results are expressed as mean standard deviation of three separate experiments.
IC50TPa/IC50TPb.
compounds tested inhibited platelet aggregation at 10 mM (results
not shown), which was in line with their antagonistic potency
showed on TP receptors. The concentrationeresponses curves were
obtained for the most interesting compounds giving a significant
activity at 1 mM (7b, 7e, 7h, 8b, 8e and 8h) and the IC50 values for
inhibition of U-46619 induced platelet aggregation were reported
in Table 3. For the 4-methylphenyl/tert-butyl compounds 7h and
8h, the IC50 value was found to be approximately the same as that
of BM-573, the reference compound.
It should be highlighted that all the compounds evaluated in the
pharmacological assessment models exhibited promising results in
terms of measurement of inhibition of [Ca2þ]i mobilization, and
inhibition of U-46619 induced platelet aggregation. Compounds 7e,
7h and 8h were the most potent antagonists for U-46619 induced
platelet aggregation since their IC50 value was respectively 0.705,
0.649 and 0.504 mM. Finally, it is noteworthy that these three
compounds were also found to be among the most potent TP receptor antagonists.
In conclusion, we have demonstrated that 2-aryloxy/arylamino-5cyanobenzenesulfonylureas are TXA2 receptor antagonists and that
their activity is closely related to the presence of both the 4methylphenyl group and a tert-butyl or a n-pentyl hydrocarbon
chain on the terminal nitrogen atom of the urea function. We didn’t
observe a difference of activity on the two isoforms in the arylamino
series. The aryloxy compounds were characterized by an isoform
selectivity ratio comprised between 0.9 and 2.5. Thus, no marked
difference in selectivity between the two isoforms was observed.
Selected 2-aryloxy/arylamino-5-cyanobenzenesulfonylureas prevented human platelet aggregation induced by the TXA2-mimetic
compound U-46619. Three lead compounds (7e, 7h and 8h) were
selected for further in vitro and in vivo pharmacological and toxicological studies.
5. Experimental section
5.1. Chemistry
All commercial chemicals (SigmaeAldrich, Belgium) and solvents
are reagent grade and were used without further purification unless
otherwise stated. Melting points were determined with a Büchie
Tottoli capillary apparatus and are uncorrected. The 1H and 13C NMR
spectra were recorded on a Bruker Avance (500 and 125 MHz
respectively) instrument using d6-DMSO as the solvent with TMS
(tetramethylsilane) as an internal standard; chemical shifts were
reported in d values (ppm) relative to that of internal TMS. The abbreviations s ¼ singlet, d ¼ doublet, t ¼ triplet, q ¼ quadruplet,
m ¼ multiplet, and b ¼ broad were used throughout. Elemental
analyses (C, H, N, and S) were realized on a Thermo Scientific Flash EA
1112-elemental analyzer and were within 0.4% of the theoretical
values. High-resolution mass spectra (positive electrospray
Table 3
Estimated IC50 values for the inhibition of platelet Aggregation induced, by U-46619
(1 mM).
Fig. 2. Inhibition of ex vivo platelet aggregation induced by U-46619. Platelets were
incubated with 1 mM of tested sample or 0.1% DMSO at 37 C for 1 min, then U-46619
(1 mM) was added to trigger the aggregation. Values are presented as means SD, n 2.
Compound
Inhibition of platelet aggregation induced
by 1 mM U-46619 IC50 values (mM)a
BM-573
7b
7e
7h
8b
8e
8h
0.509
0.966
0.705
0.649
0.971
0.726
0.504
0.006
0.051
0.035
0.006
0.021
0.072
0.016
a
Results expressed as mean (standard deviation of at least three determinations
(n 3).
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ionization) were obtained using ToF MS and ToF MS/MS scan modes
with MS-TOF equipment. All reactions were routinely checked by
thin layer chromatography on silica gel 60F254 Merck and visualization was accomplished with UV light (254 nm).
5.1.1. 3-Amino-4-fluorobenzonitrile (2)
4-Fluoro-3-nitrobenzonitrile (1) (2 g, 0.012 mol) in ethyl acetate
(50 mL) was supplemented with stannous chloride (11.4 g,
0.06 mol). The reaction mixture was stirred for 30 min and then a
saturated solution of sodium hydrogenocarbonate (100 mL) was
added. This mixture was treated with ethyl acetate (300 mL) and
the aqueous layer was separated. The ethyl acetate layer was
evaporated under reduced pressure. The crude product was dissolved in methanol, and ice was added; the resulting precipitate
was collected by filtration (Yield: 30e60%).
5.1.2. 4-Fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile (4)
3-Amino-4-fluorobenzonitrile (2) (2 g, 0.015 mol) in acidic
medium (28 mL HCl 6 N) reacted with sodium nitrite (1.4 g in
2 mL of water). The resulting solution of diazonium salt was
mixed with a solution of sulphur dioxide in acetic acid in the
presence of CuCl2 (0.8 g in 2 mL of water) to generate 3chlorosulfonyl-4-fluorobenzonitrile (3) according to the Meerwein variation of Sandmeyer reaction. Compound 3 was poured
into a solution of ammonium hydroxide and gently heated,
resulting in the synthesis of intermediate 4-fluoro-3sulfamoylbenzonitrile (4) (Yield: 40e65%).
5.1.3. General procedure for the preparation of 4-aryloxy-3sulfamoylbenzonitriles (5aeg)
The appropriate methylphenol (0.05 mol) or halophenol
(0.05 mol) was deprotonated in presence of 1.1 equivalent of
NaOH (in aqueous solution). Crystals of methyl/halophenolates
were provided after evaporation under reduced pressure. 4Fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile (4) (0.01 mol), and potassium
carbonate (7 equivalents) in acetonitrile (10 mL) were added and
the mixture was refluxed for 16e30 h. At the end of the reaction
and after cooling, the mixture was acidified with hydrochloric
acid (12 N) and filtered. The filtrate was evaporated under
reduced pressure. The crude product was dissolved in methanol,
and ice was added; the resulting precipitate was collected by
filtration (Yield: 60e85%).
The following compounds were obtained according to this
procedure.
5.1.4. 4-(4-Methylphenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5a)
Mp: 186e188 C.
5.1.5. 4-(3-Methylphenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5b)
Mp: 161e163 C.
5.1.6. 4-(2-Methylphenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5c)
Mp: 176e178 C.
5.1.7. 4-(4-Fluorophenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5d)
Mp: 189e191 C.
5.1.8. 4-(4-Chlorophenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5e)
Mp: 210e212 C.
5.1.9. 4-(4-Bromophenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5f)
Mp: 205e207 C.
5.1.10. 4-(4-Iodophenoxy)-3-sulfamoylbenzonitrile (5g)
Mp: 212e214 C.
37
5.1.11. General procedure for the preparation of 4-arylamino-3sulfamoylbenzonitriles (6aed)
4-Fluoro-3-sulfamoylbenzonitrile 4 (2 g, 0.01 mol) and the
appropriate amine (4 equivalents; 0.04 mol) were dissolved in
dioxane (10 mL) and the mixture was refluxed for 20e36 h. When
the reaction was finished, the mixture was evaporated under
reduced pressure. The residue was dissolved in an aqueous 0.5 N
NaOH solution. This mixture was treated with diethyl ether
(30 mL) and the aqueous layer was separated and adjusted to pH 1
with 12 N hydrochloric acid. The precipitate, which appeared,
was collected by filtration, washed with water and dried (Yield:
60e80%).
The following compounds were obtained according to this
procedure.
5.1.12. 4-(4-Methylphenylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile (6a)
Mp: 159e161 C.
5.1.13. 4-(3-Methylphenylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile (6b)
Mp: 160e162 C.
5.1.14. 4-(2-Methylphenylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile (6c)
Mp: 145e147 C.
5.1.15. 4-(4-Fluorophenylamino)-3-sulfamoylbenzonitrile (6d)
Mp: 208e210 C.
5.1.16. General procedure for the preparation of N-alkyl-N’-[2(arylamino/aryloxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]ureas (7aeu and 8ael)
The appropriate 4-arylamino/aryloxy-3-sulfamoylbenzonitrile 5
or 6 (0.01 mol) and 1.1 equivalent of NaOH were dissolved in a
mixture of methanol and water (70/30) (10 mL). The reaction
mixture was gently stirred during 10 min and then evaporated
under reduced pressure. The resulting solid was suspended in
acetone (10 mL) and evaporated under reduced pressure. The crude
product was dissolved in dimethylformamide (5 mL) and gently
refluxed. The appropriate isocyanate (2 equivalents; 0.02 mol) was
added to the mixture. At the end of the reaction monitored by tlc
(0.1e1 h), the reaction mixture was evaporated under reduced
pressure and acidified with hydrochloric acid (2 N). The resulting
precipitate was collected by filtration, washed with distilled water
and dried. The crude product was then crystallized in methanol/
water (50/50) (Yields: 75e90%).
The 1H and 13C NMR spectral data of compounds 7aeu and 8ael
are reported in the Supplementary material available online.
5.1.17. N-Isopropyl-N0 -[2-(2-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7a)
Mp: 191e193 C. Anal (C18H19N3O4S) theoretical: N, 11.25; C,
57.89; H, 5.13; S, 8.59. Found: N, 11.06; C, 57.85; H, 5.30; S, 8.56.
EI/HRMS (m/z) [M þ H]þ: 374.1171. Calcd for [C18H20N3O4S]þ:
374.1175.
5.1.18. N-tert-Butyl-N0 -[2-(2-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7b)
Mp: 136e138 C. Anal (C19H21N3O4S) theoretical: N, 10.85; C,
58.90; H, 5.46; S, 8.27. Found: N, 10.58; C, 58.94; H, 5.83; S, 8.16. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 388.1369. Calcd for [C19H22N3O4S]þ:
388.1331.
5.1.19. N-Pentyl-N0 -[2-(2-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7c)
Mp: 115e117 C. Anal (C20H23N3O4S) theoretical: N, 10.47;
C, 59.83; H, 5.77; S, 7.99. Found: N, 10.43; C, 59.92; H, 5.70;
S, 7.73.
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38
S.-M. Bambi-Nyanguile et al. / European Journal of Medicinal Chemistry 65 (2013) 32e40
5.1.20. N-Isopropyl-N0 -[2-(3-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7d)
Mp: 186e188 C. Anal (C18H19N3O4S) theoretical: N, 11.25; C,
57.89; H, 5.13; S, 8.59. Found: N, 11.35; C, 57.67; H, 5.19; S, 8.56. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 374.1204. Calcd for [C18H20N3O4S]þ: 374.1175.
5.1.21. N-tert-Butyl-N0 -[2-(3-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7e)
Mp: 135e137 C. Anal (C19H21N3O4S) theoretical: N, 10.85; C,
58.90; H, 5.46; S, 8.27. Found: N, 10.55; C, 59.79; H, 5.79; S, 8.25. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 388.1341. Calcd for [C19H22N3O4S]þ: 388.1331.
5.1.22. N-Pentyl-N0 -[2-(3-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7f)
Mp: 171e173 C. Anal (C20H23N3O4S) theoretical: N, 10.47; C,
59.83; H, 5.77; S, 7.99. Found: N, 10.27; C, 59.67; H, 5.70; S, 7.90.
5.1.23. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7g)
Mp: 218e220 C. Anal (C18H19N3O4S) theoretical: N, 11.25; C,
57.89; H, 5.13; S, 8.59. Found: N, 11.14; C, 57.82; H, 5.12; S, 8.54.
5.1.24. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7h)
Mp: 175e177 C. Anal (C19H21N3O4S) theoretical: N, 10.85; C,
58.90; H, 5.46; S, 8.27. Found: N, 11.21; C, 58.97; H, 5.47; S, 8.01. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 388.1350. Calcd for [C19H22N3O4S]þ:
388.1331.
5.1.25. N-Pentyl-N0 -[2-(4-methylphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7i)
Mp: 161e163 C. Anal (C20H23N3O4S) theoretical: N, 10.47; C,
59.83; H, 5.77; S, 7.99. Found: N, 10.49; C, 59.75; H, 5.88; S, 8.01.
5.1.26. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-fluorophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7j)
Mp: 179e181 C. Anal (C17H16FN3O4S), theoretical: N, 11.13; C,
54.10; H, 4.27; S, 8.50. Found: N, 11.10; C, 54.21; H, 4.24; S, 8.32.
5.1.27. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-fluorophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7k)
Mp: 152e154 C. Anal (C18H18FN3O4S), theoretical: N, 10.74; C,
55.23; H, 4.64; S, 8.19. Found: N, 10.62; C, 55.42; H, 4.74; S, 8.31. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 392.1073. Calcd for [C18H19FN3O4S]þ:
392.1080.
5.1.28. N-Pentyl-N0 -[2-(4-fluorohenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]urea
(7l)
Mp: 186e188 C. Anal (C19H20FN3O4S) theoretical: N, 10.36; C,
56.28; H, 4.97; S, 7.91. Found: N, 10.42; C, 56.43; H, 4.77; S, 7.98.
5.1.29. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-chlorophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7m)
Mp: 168e170 C. Anal (C17H16ClN3O4S) theoretical: N, 10.67; C,
51.84; H, 4.09; S, 8.14. Found: N, 10.45; C, 51.72; H, 4.15; S, 8.24.
5.1.32. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-bromophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7p)
Mp: 160e162 C. Anal (C17H16BrN3O4S) theoretical: N, 9.59; C,
46.59; H, 3.68; S, 7.32. Found: N, 9.40; C, 46.68; H, 3.75; S, 7.41.
5.1.33. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-bromophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7q)
Mp 179e180 C. Anal (C18H18BrN3O4S) theoretical: N, 9.29; C,
47.80; H, 4.01; S, 7.09. Found: N, 9.19; C, 47.89; H, 4.12; S, 7.13.
5.1.34. N-Pentyl-N0 -[2-(4-bromophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7r)
Mp: 170e172 C. Anal (C19H20BrN3O4S) theoretical: N, 9.01; C,
48.93; H, 4.32; S, 6.88. Found: N, 8.91; C, 48.97; H, 4.38; S, 6.91.
5.1.35. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-iodophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7s)
Mp: 174e176 C. Anal (C17H16IN3O4S), theoretical: N, 8.66; C,
42.07; H, 3.32; S, 6.61. Found: N, 8.57; C, 42.21; H, 3.35; S, 6.52.
5.1.36. N-tert-Butyl-N-[2-(4-iodophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7t)
Mp: 183e185 C. Anal (C18H18IN3O4S) theoretical: N, 8.42; C,
43.30; H, 3.63; S, 6.42. Found: N, 8.50; C, 43.29; H, 3.61; S, 6.50.
5.1.37. N-Pentyl-N0 -[2-(4-iodophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7u)
Mp: 159e161 C. Anal (C19H20IN3O4S) theoretical: N, 8.19; C,
44.45; H, 3.93; S, 6.25. Found: N, 8.01; C, 44.53; H, 3.95.55; S, 5.99.
5.1.38. N-Isopropyl-N0 -[2-(2-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8a)
Mp: 150e152 C. Anal (C18H20N4O3S) theoretical: N, 15.04; C,
58.05; H, 5.41; S, 8.61. Found: N, 15.29; C, 57.94; H, 5.52; S, 8.53. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 373.1355. Calcd for [C18H21N4O3S]þ:
373.1334.
5.1.39. N-tert-Butyl-N0 -[2-(2-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8b)
Mp: 165e167 C. Anal (C19H22N4O3S) theoretical: N, 14.50; C,
59.05; H, 5.74; S, 8.30. Found: N, 14.55; C, 59.07; H, 5.90; S, 8.33.
5.1.40. N-Pentyl-N0 -[2-(2-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (8c)
Mp: 159e161 C. Anal (C20H24N4O3S) theoretical: N, 13.99; C,
59.98; H, 6.04; S, 8.00. Found: N, 14.19; C, 60.14; H, 6.25; S, 8.26.
5.1.41. N-Isopropyl-N0 -[2-(3-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8d)
Mp: 136e138 C. Anal (C18H20N4O3S) theoretical: N, 15.04; C,
58.05; H, 5.41; S, 8.61. Found: N, 15.12; C, 58.07; H, 5.66; S, 8.51. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 373.1338. Calcd for [C18H21N4O3S]þ:
373.1334.
5.1.30. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-chlorophenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7n)
Mp: 154e156 C. Anal (C18H18ClN3O4S) theoretical: N, 10.30; C,
53.01; H, 4.45; S, 7.86. Found: N, 9.99; C, 53.03; H, 4.42; S, 7.64.
5.1.42. N-tert-Butyl-N0 -[2-(3-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8e)
Mp: 138e140 C. Anal (C19H22N4O3S) theoretical: N, 14.50; C,
59.05; H, 5.74; S, 8.30. Found: N, 14.56; C, 58.98; H, 6.01; S, 8.12. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 387.1485. Calcd for [C19H23N4O3S]þ:
387.1491.
5.1.31. N-Pentyl-N0 -[2-(4-chloroxyphenoxy)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (7o)
Mp: 167e169 C. Anal (C19H20ClN3O4S) theoretical: N, 9.96; C,
54.09; H, 4.78; S, 7.60. Found: N, 10.05; C, 54.17; H, 4.55; S, 7.44.
5.1.43. N-Pentyl-N0 -[2-(3-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (8f)
Mp: 125e126 C. Anal (C20H24N4O3S) theoretical: N, 13.99; C,
59.98; H, 6.04; S, 8.00. Found: N, 13.87; C, 59.81; H, 6.21; S, 7.89. EI/
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HRMS (m/z) [M þ H]þ: 401.1643. Calcd for [C20H25N4O3S]þ:
401.1647.
5.1.44. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-methylphenylamino)-5-cyanobenzene
sulfonyl]urea (8g)
Mp: 136e138 C. Anal (C18H20N4O3S) theoretical: N, 15.04; C,
58.05; H, 5.41; S, 8.61. Found: N, 15.26; C, 57.97; H, 5.56; S, 8.26. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 373.1338. Calcd for [C18H21N4O3S]þ:
373.1334.
5.1.45. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8h)
Mp: 139e141 C. Anal (C19H22N4O3S) theoretical: N, 14.50; C,
59.05; H, 5.74; S, 8.30. Found: N, 14.70; C, 59.08; H, 5.82; S, 8.21.
5.1.46. N-Pentyl-N0 -[2-(4-methylphenylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (8i)
Mp: 134e136 C. Anal (C20H24N4O3S) theoretical: N, 13.99; C,
59.98; H, 6.04; S, 8.00. Found: N, 14.20; C, 59.96; H, 6.08; S, 8.16. EI/
HRMS (m/z) [M þ H]þ: 401.1649. Calcd for [C20H25N4O3S]þ:
401.1647.
5.1.47. N-Isopropyl-N0 -[2-(4-fluorophenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8j)
Mp: 190e192 C. Anal (C17H17FN4O3S) theoretical: N, 14.88; C,
54.25; H, 4.55; S, 8.52. Found: N, 15.01; C, 54.37; H, 4.38; S, 8.47.
5.1.48. N-tert-Butyl-N0 -[2-(4-fluorophenylamino)-5-cyanobenzenesul
fonyl]urea (8k)
Mp: 182e184 C. Anal (C18H19FN4O3S) theoretical: N, 14.35; C,
55.37; H, 4.91; S, 8.21. Found: N, 14.46; C, 55.49; H, 4.69; S, 8.25.
5.1.49. N-Pentyl-N0 -[2-(4-fluorophenylamino)-5-cyanobenzenesulfonyl]
urea (8l)
Mp: 163e165 C. Anal (C19H21FN4O3S) theoretical: N, 13.85; C,
56.42; H, 5.23; S, 7.93. Found: N, 13.81; C, 56.51; H, 5.18; S, 7.84.
5.2. Calcium measurements
HEK.293TPa and HEK.293TPb cell lines, stably overexpressing
HA-tagged forms of TPa and TPb in human embryonic kidney (HEK)
293 cells have been previously described [37]. Cells were routinely
grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing
10% foetal bovine serum (FBS). Measurement of [Ca2þ]i mobilization either in HEK.293TPa or HEK.293TPb cells was carried out
using fluorescent microplate reader Fluoroskan Ascent FL equipped
with two dispensers (thermo electron corporation, Finland) according to modified method of Lin et al. [38].
Briefly, cells were trypsinized, washed twice with Krebs-HEPES
buffer (118 mM, NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4,
4.2 mM NaHCO3, 11.7 mM D-glucose, 1.3 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH
7.4), and incubated for 1 h with fluorescent dye Fluo-4/AM (5 mg/mL;
Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke Belgium). Cells were then
rinsed three times with Krebs-HEPES buffer and 150 mL of a suspension of cells in that buffer was loaded into each well of a 96-well
plate at a density of 150,000 cells/well. Cells were incubated 10 min
with various concentrations of the test compound (105 to 109 M
final). In all cases, compound (1 mM) was diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO)/PBS (30/70) prior to further dilution in PBS.
Fluorescence emission was read at 538 nm. At the end of each
experiment, fluorescence intensities were calibrated for determination of intracellular calcium concentration ([Ca2þ]i) values by
permeabilizing cells with 1% Triton X-100 to release all the dye
(Fmax) and subsequently chelating with 10 mM EGTA (Fmin). Calcium concentrations were calculated using equation [Ca2þ]i) Kd
39
(F Fmin)/(Fmax F), assuming a Kd of 385 nM for Fluo-4. The results (IC50) presented are the concentration required to inhibit 50%
of the normal rise of [Ca2þ]i upon stimulation with 1 mM U-46619,
determined in the absence of any compounds. The IC50s were
calculated by nonlinear regression analysis (GraphPad Prism software) from at least three concentrationeresponse curves.
5.3. Human in vitro platelet aggregation
The antiaggregant potency has been determined according to
the turbidimetric Born’s method [39]. The blood was drawn from 10
healthy donors of both genders. The subjects were free from
medication for at least 14 days. No significant differences in the
results were observed between the donors in our experiments.
Platelet-rich plasma (PRP) and platelet-poor plasma (PPP) were
prepared as previously described [32,40,41]. Platelet concentration
of PRP was adjusted to 250,000 cells/mL by dilution with PPP.
Platelet aggregation of PRP was studied using a double channel
aggregometer (Chronolog Corporation, Chicago, IL) connected to a
linear recorder as previously described [42]. PRP (290 mL) was
added in a silanised cuvette and stirred (1000 rpm). Each compound was diluted (1 mM) in a mixture of dimethyl sulfoxide-PBS
(DMSO/PBS) (30/70), and preincubated in PRP for 3 min at 37 C
before the aggregating agent was added. Compounds were tested at
various concentrations 105 M to 107 M. Platelet aggregation was
initiated by addition of a fresh solution of U-46619 (1 mM final). To
evaluate platelet aggregation, the maximum increase in light
transmission was determined from the aggregation curve 6 min
after addition of the inducer. The substance concentration preventing 50% of platelet aggregation (IC50) induced by U-46619 was
calculated by nonlinear regression analysis (GraphPad Prism software) from at least three concentrationeresponse curves.
5.4. Statistical analysis
Results are expressed as the mean standard deviation from at
least three determinations (n ¼ 3). Statistical differences between TP
isoforms have been determined using unpaired t-test between IC50s
values. p values of less than 0.05 were considered to be significant.
Acknowledgements
This work was supported by The Coopération Technique Belge (CTB,
from Belgium). The authors gratefully acknowledge the technical
assistance of E. Goffin, J.C. Van Heugen, S. Counerotte and P. Neven. We
also thank Dr. P. de Tullio (Liege University) for his scientific advice.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data related to this article can be found at http://
dx.doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.04.033.
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Acta Crystallographica Section C
Crystal Structure
Communications
ISSN 0108-2701
N -tert -Butyl-N -[5-cyano-2-(4-methylphenoxy)phenylsulfonyl]urea, a new TXA2 receptor
antagonist
Sylvie-Mireille Bambi-Nyanguile, Peter Mangwala Kimpende, Bernard
Pirotte and Luc Van Meervelt
Acta Cryst. (2013). C69, 901–903
c International Union of Crystallography
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Acta Cryst. (2013). C69, 901–903
Bambi-Nyanguile et al. · C19 H21 N3 O4 S
organic compounds
Acta Crystallographica Section C
Crystal Structure
Communications
ISSN 0108-2701
N-tert-Butyl-N0 -[5-cyano-2-(4-methylphenoxy)phenylsulfonyl]urea, a new
TXA2 receptor antagonist
Sylvie-Mireille Bambi-Nyanguile,a Peter Mangwala
Kimpende,b Bernard Pirottea and Luc Van Meerveltb*
a
Department of Medicinal Chemistry, Drug Research Center, University of Liège,
Avenue de l’Hôpital 1, B-4000 Liège, Belgium, and bChemistry Department, KU
Leuven, Celestijnenlaan 200F, B-3001 Leuven (Heverlee), Belgium
Correspondence e-mail: [email protected]
Received 22 May 2013
Accepted 27 June 2013
The title compound, C19H21N3O4S, crystallizes in the space
group P2/c with two molecules in the asymmetric unit. The
conformation of both molecules is very similar and is mainly
determined by an intramolecular N—H O hydrogen bond
between a urea N atom and a sulfonyl O atom. The O and
second N atom of the urea groups are involved in dimer
formation via N—H O hydrogen bonds. The intramolecular
hydrogen-bonding motif and conformation of the C—SO2—
NH(C O)—NH—C fragment are explored and compared
using the Cambridge Structural Database and theoretical
calculations. The crystal packing is characterized by –
stacking between the 5-cyanobenzene rings.
Keywords: crystal structure; urea derivatives; pharmaceutical
compounds; TXA2 receptor antagonist.
1. Introduction
Recently, we have described a novel reference compound, N-tertbutyl-N0 -[2-(4-methylphenylamino)-5-nitrobenzenesulfonyl]urea
(BM-573), a 5-nitrobenzenesulfonylurea derivative known to be
-
a TXA2 receptor antagonist and a thromboxane synthase inhibitor (Dogné et al., 2004). Such a compound is expected to
become the prototype of a new class of antiplatelet agents.
Acta Cryst. (2013). C69, 901–903
In our study of new TXA2 receptor antagonists and
thromboxane synthase inhibitors, we synthesized and crystallized the title compound, (I). This compound may be considered as a structural analogue of BM-573 resulting from the
isosteric replacement of its nitro group by a cyano group, and
of its –NH– bridge by an –O– bridge. Compound (I) was found
to be as potent as the reference compound as a TXA2 receptor
antagonist, supporting the view that such structural modifications are tolerated without alteration of the pharmacological profile (Bambi-Nyanguile et al., 2013).
2. Experimental
2.1. Synthesis and crystallization
Compound (I) was synthesized using a five-step procedure
starting from 4-fluoro-3-nitrobenzonitrile, as previously
described by Bambi-Nyanguile et al. (2013). Crystals suitable
for X-ray crystallography were grown from a methanol–water
mixture (50:50 v/v).
2.2. Refinement
Crystal data, data collection and structure refinement
details are summarized in Table 1. All C-bound H atoms were
placed in geometrically idealized positions and contrained to
ride on their parent atoms, with C—H = 0.93 (aromatic) or
0.96 Å (methyl) and Uiso(H) = kUeq(C), where k = 1.2 for
aromatic and 1.5 for methyl H atoms. N-bound H atoms were
refined with Uiso(H) = 1.2Ueq(N).
3. Results and discussion
A view of the molecular structures of the two molecules in the
asymmetric unit of (I) is shown in Fig. 1. Both molecules show
an intramolecular N—H O hydrogen bond between an N
atom of the urea moiety (N13 and N43) and an O atom of the
sulfonyl group (O9 and O39), influencing their conformation
(Table 2). The angle between the least-squares planes through
the C1–C6 and C19–C24 rings is 78.9 (2) , and it is 80.1 (2)
between the C31–C36 and C49–C54 rings. The similar
conformation of both molecules is further reflected by the
r.m.s. deviation of 0.054 Å obtained for a least-squares fit of all
27 non-H atoms. Neighbouring molecules form dimers
through hydrogen-bond interactions between the remaining N
atom (N10 and N40) and the O atom (O12 and O42) of the
urea groups (Fig. 2 and Table 2). The crystal packing shows
chains of dimers in the b direction, formed by C—H O
interactions between aromatic ring atoms C5, C6, C35 and C36
and O atoms O42, O38, O12 and O8 (Fig. 3 and Table 2).
The occurrence of an intramolecular hydrogen bond in the
C—SO2—NH—C( O)—NH—C fragment was further
explored in the Cambridge Structural Database (CSD, Version
5.34; Allen, 2002). A search for this fragment resulted in 79
hits. Only four structures show an intramolecular N—H O
hydrogen bond [CSD refcodes QERXUG (Yagupolskii et al.,
2001), TOHBUN (Iwata et al., 1997), TOHBUN01 (Grell et
al., 1998) and USOCOV (Gelbrich et al., 2011)]. The C—S—
doi:10.1107/S010827011301771X
electronic reprint
# 2013 International Union of Crystallography
901
organic compounds
Table 1
Experimental details.
Crystal data
Chemical formula
Mr
Crystal system, space group
Temperature (K)
a, b, c (Å)
( )
V (Å3)
Z
Radiation type
(mm1)
Crystal size (mm)
C19H21N3O4S
387.45
Monoclinic, P2/c
289
10.6408 (5), 15.8571 (4), 24.8678 (9)
93.534 (4)
4188.0 (3)
8
Mo K
0.18
0.45 0.25 0.05
Data collection
Diffractometer
Agilent SuperNova diffractometer
(single source at offset, Eos detector)
Multi-scan (CrysAlis PRO; Agilent, 2012)
0.738, 1.000
8550, 8550, 5931
Absorption correction
Tmin, Tmax
No. of measured, independent and
observed [I > 2(I)]
reflections
Rint
(sin /)max (Å1)
0.031
0.625
Refinement
R[F 2 > 2(F 2)], wR(F 2), S
No. of reflections
No. of parameters
No. of restraints
H-atom treatment
0.073, 0.174, 1.06
8548
507
0
H atoms treated by a mixture of
independent and constrained refinement
0.24, 0.26
3
max, min (e Å )
Computer programs: CrysAlis PRO (Agilent, 2012), SHELXS97 (Sheldrick, 2008),
SHELXL97 (Sheldrick, 2008) and OLEX2 (Dolomanov et al., 2009).
Figure 2
The formation of dimers in (I) through N—H O hydrogen-bond
interactions (dotted lines). [Symmetry codes: (i) x + 1, y, z + 32; (ii) x,
y, z + 32.]
Table 2
N—C torsion angle has two equally populated preferred
regions, +sc and sc, and has no influence on hydrogen-bond
formation (three of the four structures are in the +sc region).
The S—N—C—N torsion angle indicates a ap conformation,
except for the four structures where a sp conformation
occurs. The N—C—N—C torsion angle has preferred regions
sp and ap (minor and major populations, respectively), and
the four structures are all in the +ap region. The equivalent
torsion angles for (I) are also given in Table 3 and show ac,
Hydrogen-bond geometry (Å, ).
D—H A
N10—H10 O12
N13—H13 O9
N40—H40 O42ii
N43—H43 O39
C5—H5 O42ii
C6—H6 O38
C35—H35 O12iii
C36—H36 O8iv
C20—H20 N27ii
C50—H50 N57i
i
D—H
H A
D A
D—H A
0.86 (3)
0.87 (4)
0.82 (4)
0.87 (4)
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
1.93 (3)
2.04 (4)
1.96 (4)
2.07 (4)
2.60
2.52
2.57
2.55
2.56
2.55
2.784 (4)
2.801 (4)
2.774 (4)
2.794 (5)
3.484 (4)
3.266 (4)
3.452 (4)
3.343 (4)
3.425 (7)
3.439 (6)
171 (3)
145 (3)
177.0 (15)
141 (4)
160
138
159
144
155
161
Symmetry codes: (i) x þ 1; y; z þ 32; (ii) x; y; z þ 32; (iii) x þ 1; y þ 1; z þ 32; (iv)
x; y þ 1; z.
Figure 1
The molecular structure of (I), showing the atomic numbering scheme.
Displacement ellipsoids are drawn at the 50% probability level. Dotted
lines indicate intramolecular hydrogen bonds.
902
Bambi-Nyanguile et al.
C19H21N3O4S
sp and ap conformations. These observations are in
agreement with quantum chemical calculations on the model
system PhSO2NHC( O)NHMe (Kasetti et al., 2010), showing
that, in the gas phase, the conformation with an intramolecular
hydrogen bond is about 4.12 kcal mol1 (1 kcal mol1 =
4.184 kJ mol1) more stable than the alternative rotamer not
showing the intramolecular interaction. In a chloroform
medium, the energy difference is reduced to 0.37 kcal mol1
and in a water medium is even reversed.
In the crystal packing of (I), – interactions between the
5-cyanobenzene rings link pairs of molecules into dimers
(Fig. 3), with a Cg1 Cg1ii distance of 3.978 (2) Å and a
Cg2 Cg2i distance of 3.887 (2) Å [Cg1 and Cg2 are the
centroids of the C1–C6 and C31–C36 rings, respectively;
symmetry codes: (i) x + 1, y, z + 32; (ii) x, y, z + 32].
Furthermore, the packing shows a number of weaker contacts
electronic reprint
Acta Cryst. (2013). C69, 901–903
organic compounds
Figure 3
Interactions in the crystal packing of (I); lighter dashed lines (red in the electronic version of the paper) are N—H O interactions and darker dashed
lines (blue) are C—H O interactions. The 5-cyanobenzene rings involved in – interactions are shaded, with the C1–C6 ring in lighter shading (green)
and the C31–C36 ring in darker shading (red).
Table 3
Overview of the torsion angles ( ) and O H distances (Å) in the C—
SO2—NH—C( O)—NH—C fragment of various compounds showing
the N—H O S interaction.
C—S—N—C
QERXUG
TOHBUN
TOHBUN1
USOCOV
(I), molecule A
(I), molecule B
S—N—C—N
85.4
11.8
94.7 (2)
6.2 (4)
94.6
6.1
64.33 (14) 33.0 (2)
102.7 (3)
5.2 (5)
103.0 (3)
4.5 (5)
N—C—N—C
178.3
170.8 (2)
170.9
170.54 (13)
178.9 (4)
178.8 (4)
S O H—N
2.19
2.01
2.01
2.151 (17)
2.04 (4)
2.07 (4)
CSD refcodes: QERXUG (Yagupolskii et al., 2001), TOHBUN (Iwata et al., 1997),
TOHBUN01 (Grell et al., 1998) and USOCOV (Gelbrich et al., 2011)
of C—H N type [C20—H20 N27ii = 3.425 (7) Å and
C50—H50 N57i = 3.439 (6) Å].
Despite the fact that methanol was essential as crystallization solvent for obtaining good-quality crystals of (I), no
methanol molecules are present in the crystal packing. Also,
no voids larger than 18 Å3 are observed in the crystal packing.
For the compound TOHBUN, a second polymorph has been
found which does not show the intramolecular N—H O S
interaction (Endo et al., 2003). To date, no second polymorph
has been observed for (I).
The authors acknowledge the Coopération Technique
Belge (CTB) for financial support. The authors also thank the
Acta Cryst. (2013). C69, 901–903
Hercules Foundation for supporting the purchase of the
diffractometer through project No. AKUL/09/0035.
Supplementary data for this paper are available from the IUCr electronic
archives (Reference: UK3071). Services for accessing these data are
described at the back of the journal.
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C19H21N3O4S
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