Fractionnement cellulaire protéomique

Protocole pour séparer la fraction nucléaire (pour les histones), la MLP, la
fraction cytosolique sur des larves de poissons (Heterandria formosa).
d’après Jonsson et al, Aquat Toxicol, 2006 (sur moules).
Frédéric Silvestre 7/2008
Tampons :
a) tampon d’homogénéisation isotonique :
Ø pour un Eriocheir acclimaté à l’eau douce (575 mOsm): sucrose 500mM –
Hepes-KOH 20 mM – EDTA 1 mM – pH 7.5
Ø pour un poisson d’eau douce (Heterandria) (290 mOsm) : sucrose 250 mM Hepes-KOH 20 mM – EDTA 1 mM – pH 7.5
Préparer deux solutions stocks et les conserver au frigo :
Hepes 500mM : 11.9 g dans 100 ml d’eau
EDTA 100mM (Na2 . 2H2O) : 3.72 g dans 100 ml d’eau
Pour préparer 100 ml de tampon (souvent, en faire 10 ml) :
- sucrose (sucre Tirlemont) (342 g/mol)
17.1 g (Eriocheir) ou 8.6 g (Heterandria)
- sol Hepes :
4 ml
- sol EDTA :
1 ml
Amener à pH 7.5 avec du KOH 0.1N.
Ajuster le volume à 100 ml.
(Vérifier l’osmolarité).
Le jour même, mettre des inhibiteurs de protéases (pastilles Roche) : diluer 1 pastille dans 2
ml d’eau et ensuite 400 µl dans 10 ml de tampon (dilution 1 :50).
b) tampon microsomes : Tris 20 mM – glycérol 20% - EDTA 0,1 mM pH 7.6
- Tris (121,1 g/mol)
- Glycérol 87%
- sol EDTA
- H2 0
0,048 g
4,6 ml
20 µl
=> 20 ml
c) tampon de lyse 2D : 7 M urea, 2 M thiourea, 1% DTT (ou 0,3% si DeStreak), 0.5%
amidosulfobetaine-14 (ASB-14) and 4% (CHAPS) ; ajouter les IPG (2%) le jour même en
fonction de la gamme de pH (20µl/ml). Aliquoter et congeler.
- urée (60,06 g/mol)
- thiourée (76,12 g/mol)
- DTT
- ASB14
- CHAPS
- H 2O
-
4,2 g
1,52 g
0,1 g (ou 0,3g)
0,05 g
0,4 g
=>10 ml
Protocole :
Généralités : pour Heterandria formosa, l’objectif est de séparer une fraction S enrichie en
cytosol afin de faire des gels 2D dessus. Aussi, récupérer une fraction MLP qui pourra passer
sur gradient afin de purifier le réticulum endoplasmique. La mise au point du gradient est
encore à faire (FUNDP ou UC). Enfin, la fraction N pourra être utilisée afin de récolter les
histones.
Deux centris sont effectuées : 1000 g 10’ et 100 000 g 45’. Aucun lavage n’est réalisé. Avec
cette technique, l’intégrité totale des mitos est de 84%. S est enrichie 2.4 X en LDH. Il n’y a
pratiquement pas de mitos dans S. Il y a par contre beaucoup de cyto réductase (2.0).
33% des protéines se retrouvent dans S, 14% dans MLP. Il y a 25 µg de prot par mg de tissu
dans S, et 12 µg/mg dans MLP (5 dans P). Donc, avec 50 mg de poisson, on peut espérer
obtenir : 1250 µg de prot dans S, 600 dans MLP, dont 250 dans P. Ok mais risque d’être
faible pour le réticulum endoplasmique.
Pour l’expérience 2 de Louisiane, prendre les groupes 0A2w vs 1A2w et 0C2w vs 1C2w.
Faire 4 groupes X 4 réplicats X 4 poissons par pool. Au total, 8 gels en DIGE.
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Rincer à l’eau le poisson ; mesurer et peser. Homogénéiser le tissu (organisme entier) dans
tampon d’homog. Peser 50 mg de tissu (ou plus – 4 poissons) dans 1000 µl de tampon et
rincer dans 500 µl. Découper les tissus en petits morceaux. Au potter (glace-glace 2 x 15
sec sur glace). Garder 200 µl d’Hg1. Peser toutes les fractions !!
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Centrifugation 1 10 min à 1000 g. Récupérer le Sg E. Resuspendre le culot contenant les
noyaux (N) dans 1000 µl Tp d’Hg. Garder 200 µl pour les enzymes. Congeler 800 µl pour
extraire les histones.
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Centrifugation 2 du Sg E 45 min à 100 000 g (39 000 rpm avec le Ti50). Ne pas ajouter
de tampon supplémentaire.
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Récupérer le Sg S (cytosol + prot solubles) sans décoller le culot. Garder 200 µl pour les
enzymes. Stocker le reste. Resuspendre Ct MLP avec 1000 µl de tampon Hg. Garder 200
µl pour les enzymes. Stocker le reste.
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Ensuite précipiter les protéines de S et laver le culot avec le kit de lavage Amersham avant
de resuspendre dans le tp de lyse protéomique.
Sonication ( ?) 2 X 10 sec sur glace pour la protéomique mais pas pour les enzymes !!!
Centrifuger 10 min à 12000 g
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Tester différents marqueurs de fractions : NADPH-cyt.c réductase (ER), cytochrome oxydase
(mito), lactate déshydrogénase (cytosol).
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Vol pour les enzymes : prot : 5µl ; cyto red : 50 µl ; cytox : 40 µl ; LDH : 20 µl. Soit : 115 µl.