Primary Mouse Hippocampal Neurons and cortex Neurons

Bio 28 2007/2008
L3 biologie cellulaire/ Biochimie S6 UE BIO 28
My first scientific publication
Role of Semaphorin 3E/Plexin D1
in the nervous system
ENCADRANTS :
Frédérique Forquet, MCF, Philippe Kachidian, MCF, Sophie Chauvet, MCF
Emplois du temps:
- Mardi 15 janvier 14-16h, Analyse d’article en Anglais 1
- Mercredi 16 janvier 8-12h, Analyse d’article en Anglais 2 et 3
- Jeudi 17 janvier 8-10h, Analyse d’article en Anglais 4
- Jeudi 17 janvier 14-16h, Mise en place du projet de recherche
- Mardi 22 janvier, 14-18h, Préparation du TP, dosage de la Semaphorine3E: salle TP
4001-4009
- Mercredi 23 janvier 8-10h : Lecture des protocoles, établissement d’un emploi du
temps, préparation des différentes solutions, coating des boites de cultures. salle
TP 4001-4009
- Vendredi 25 janvier 8h-10h : suite de la préparation, salle TP 4001-4009
- Lundi 28 janvier 10-18h: salle TP 4001-4009
- Mardi 29 janvier 10-18h: salle TP 4001-4009
- Mercredi 30 janvier 8-12h: salle TP 4001-4009
- Jeudi 31 janvier 8-18h: salle TP 4001-4009
- Vendredi 1 février 14-18h: salle TP 4001-4009
- Mardi 5 février 14-18h : Analyse des Résultats, salle TP 4009
- Mercredi 6 février 8h-10h : Analyse des Résultats, salle TP 4009
- Vendredi 8 février 8-10h, Mise en forme des résultats, salle TP 4009
- Mercredi 13 février 10-12h, Mise en forme des résultats, salle TP 4009
Contact : [email protected]
1
Bio 28 2007/2008
Projet
Biobliography:
Nervous system functions depend on the correct connecting between
neurons of neural circuits. During development of the nervous system, axons are
guided to the correct targets to establish more than 100 trillion connections. The
guidance cues, in the extracellular environment, allow the establishment of this
important network (reviewed in Chilton et al. 2006). The integration of these
signals is complicated by some guidance cues which are bifunctional, acting as both
attractant and repellent (Bartoe et al. 2006, Falk et al. 2005). Semaphorins are one
family of the guidance cues for axonal/dendritic projections. Semaphorins are both
secreting and membrane-bound proteins sharing a Sema domain (Yazdani and
Terman 2006).
Some members of the class 3 semaphorins were almost well characterised,
especially, the first identified semaphorin3A (Sema3A) (Luo et al. 1993,
Pasterkamp and Klodkin 2003, De Winter et al.2006, Morita et al. 2006, Majed et
al. 2006), however the function of Semaphorin 3E (Sema3E) is poorly understood.
It was recently shown that during development, Sema3E control vascular
patterning in vivo. The sema3E and PlexinD1 mouse mutants studies reveal a highly
similar phenotype. Sema3E is expressed in a region of the somite directly adjacent
to the intersomitic vessels expressing PlexinD1, suggesting that PlexinD1 mediates
repulsive vessels guidance in respons to Sema3E stimulation (Gu et al. 2005).
Interestingly, for this effect, Sema3E binds directly PlexinD1 independently of
neuropilins (Nrp), unlike other class 3 semaphorins which receptors are composed
of a ligand-binding proteins consisting of neuropilins and a signal transduction
proteins consisting of plexinA (Kolodkin 1998, Winberg et al. 1998, Tamagnone et al.
1999). Sema3A, 3B, 3C and 3D need to bind Nrp1 or / and Nrp2 to signal, but
Sema3E was found unable to bind to Nrp1 (Gu et al. 2005). However roles for
PlexinD1-Sema3E complexes remain unknown in other tissues especially in the
nervous system.
Research Project :
To determine whether they also potentially contribute to CNS development, we
used a Sema3E-alkaline phosphatase (Sema3E-AP) fusion protein to visualize
Sema3E-binding cells and their projections on sections of E17 mouse brain.
Sema3E-AP binding to brain sections was completely abolished in plexinD1-/embryos confirming that, as in the vascular system, PlexinD1 is the predominant
binding partner for Sema3E in the brain. Prominent Sema3E-AP binding was
detected in the developing cortex and the subiculum, a region of the hippocampus
adjacent to CA1.
2
Bio 28 2007/2008
By using genetic and cellular approach, we will investigate the role of Sema3E, in
the establishment of neuronal network. We will study the sema3E null mutant mice.
We will provide insights into the molecular composition of the semaphorins
receptors. We will check if the activation of the Pi3K is implicated in the signalling
of Sema3E in the development of the central nervous system. Finally, given the
anatomical localization of Sema3E in circuits controlling behavior and memory
functions, in particular the hippocampal formation, we will further examined
whether Sema3E gene inactivity during the development might have consequences
in basic locomotor and anxiety-related behavior, and in hippocampus-dependent
memory, using adult male Sema3E null mice (Sema3E-/-) and their wild type
controls (WT).
3
Bio 28 2007/2008
Planning 2007
Mardi 22 janvier 14h-18h Préparation du TP: Dosage de la Sémaphorine3E-AP
(Alkaline Phosphatase) et du surnageant AP avec et sans serum
Préparation du TP:
- Préparer les solutions pour la culture cellulaire de lundi et voir le comptage
sur cellule de Malassez
- Préparer le tampon de lyse
- Préparation des gammes pour les dosages protéiques
Mercredi 23 janvier 8h-10h: finir et coating des boites pour la culture primaire
Vendredi 25 janvier 14-18h : finir
- Préparer les plaques pour couler les gels du western et les solutions
- Finir coating des boites pour la culture primaire
Lundi 28 janvier 10-18h
OBJECTIFS :
1) Effet de Sema3E sur la croissance des axones des neurones du subiculum et du
cortex
2) Liaison de Sema3E sur les molécules PlexinD1 et Npn1
3) Mise en évidence par Western blot de la phosphorylation d’Akt suite à la
stimulation par Sema3E sur des neurones du subiculum et du cortex
4) Analyse des résultats donnés sur polycopié
Trois manipulations vont tourner
A faire :
• Culture primaire de neurones du cortex (un des enseignants disséquera le
subiculum) :
- disséquer 4 cerveaux en prenant les cortex limbique (mettre l’ensemble des
tissus dans le même tube).
- préparer une boite 4 puits ensemencée avec 10 000 dans 2 puits et 20 000
cellules dans 2 autres puits et une boite de 3cm ensemencée avec 2 millions de
cellules
• Préparation de boites de cellules COS, à partir d’une boite de cellules COS
T75, préparer une boite 4 puits ensemencées avec 40 000 cellules par puits
et une boite de 6 puits ensemencée avec 2 105 cellules par puits
• Couler les gels pour le western à 12.5% et préparer l’ensemble des solutions
pour la migration et le western, préparer la manip du mardi
4
Bio 28 2007/2008
Mardi 29 janvier 10-18h
Î Ajouter un inhibiteur de la voie Pi3K (LY : 20µM, soit 4µl à 10mM), attendre
2h. Stimulation ou pas 10 min avec 10mM de Sema3E-AP des boites de
cultures de neurones de 3cm, Lyse, dosage protéique, Electrophorèse,
Transfert, Saturation et AC anti-phosphoAkt
Î Observer les cultures
Î Transfection des cellules COS avec rien, vecteur vide, PlexinD1, Npn1 ou les
deux pour lyse et révélation
Mercredi 7 février 8-12h
Î AC secondaire et révélation des Western
Î Observer les cultures
Î Immunohistochimie sur les cellules du Subiculum (jour 1)
Î Préparation des solutions pour la manipulation de liaison sur cellules COS
Jeudi 8 février 8-18h:
Î Immunohistochimie sur les cellules du Subiculum (jour 2), prendre des photos
Î Immunohistochimie sur les cellules du Cortex (jour 1)
Î Liaison sur cellules COS :
Î Lyse des cellules et mesure de l’activité AP
Î In situ staining AP
Vendredi 9 février 14-18h
Î Immunohistochimie sur les cellules du Cortex (jour 2), prendre des photos
5
Bio 28 2007/2008
Primary Mouse Hippocampal Neurons and cortex Neurons
Preparation of culture plate
1. Add 400 µl poly-D-lysine solution (1 mg/ml final, dissolve in water, 5OX initial) and incubate in a
humidified 37°C/5% CO2 incubator overnight.
2. Wash 3x with sterile water
3. Incubate coverslips in 400 µl laminin solution 1000X diluted
in L15 medium bicarbonate in an incubator over nigh until one week.
(L15 medium bicarbonate: Na bicarbonate 7,5% , 1/40: 12,5ml for 500ml of L15 medium)
Isolation / preparation of cells
1. Separate heads from mouse embryos (E17.5)
2. Dissect brains from the skull and transfer them into a Petri dish
with pre-cooled HBSS (Hanks Balanced Sodium Salt Buffer).
HBSS for dissection:
11.25 ml 20% glucose dissolved in HBSS
3.5ml Hepes; In 500ml of HBSS; Filtered
3. Cut brains along midline and extract subiculum and cortex.
4. Store subiculum and cortex in HBSS in Falcon tubes.
5. Remove HBSS (after this step avoid any bubble in your preparation)
6. Add 1 ml Trypsin/EDTA and incubate for 15 min at 37°C.
7. Add 9ml of Ham F12 medium, 10% Horse serum, let sediment, remove
supernatant
8. 2 Washes with Neuro Basal medium (NB)
9. let 1.5 ml of NB
10.Triturate 10x with 3 different fire-polished Pasteur pipette until the
suspension is homogenous.
13. Count cell numbers.
14. Put cells in four well plates 12 000 in 2 wells 25 000 in 2 others wells in 500μl
of complete NB to measure the axon growth in 500μl of complete NB
15. Put the rest of cells in culture 3cm well plate in 2 ml of completeNB
complete NB :
1mlB27 (neuronal nutriment)
250μl glutamine 200mM
0.5ml P/S (Penicillin/ Streptomycin)
NB qsp 50ml
6
Bio 28 2007/2008
Dosage des surnageants AP
Chaque étudiant fait un unique dosage, soit le surnageant AP soit le surnageant
Sema3E-AP
1. Prendre stérilement 50μl du surnageant AP ou Sema3E-AP dans 450μl
d’optiMEM medium ou dans 450μl de milieu complet.
2. Inactiver le mélange 10 min à 65°C.
3. Préparer la solution de révélation (substrat de l’enzyme):
Sigma fast TM p-Nitrophenyl Phosphate (pNpp) Tablets kit
1 tablette tris buffer
1 tablette pNPP
2.5ml d’H2O
4. Préparer 500μl d’optiMEM medium ou 500μl de milieu complet pour le blanc
5. Régler le spectrophotomètre à 405 nm.
6. Mélanger le surnageant et la solution de révélation 1/1 en étant prêt à
mesurer la DO, suivre l’évolution de la DO pendant 15 à 20 min.
7. Faire une courbe DO= f(temps)
8. Calculer la pente de la droiteDO/min
9. Mesurer la concentration
7
Bio 28 2007/2008
Préparation des cellules COS
1. Prendre une boite de cellules COS,
2. laver les cellules 2 fois avec 5ml de PBS
3. Trypsiniser les cellules avec 2ml laisser à 37°C ou jusqu’à décollement
complet
4. Ajouter 5ml de milieu complet
5. Compter le nombre de cellules
6. Centrifuger les cellules 4 min à 1500g
7. Enlever le surnageant
8. Reprendre les cellules dans un volume de milieu adéquat en fonction de la
dilution voulue
9. Préparer une boite 4 puits ensemencée avec 40 000 cellules dans un volume
de 500 μl par puits et une boite de 6 puits ensemencée avec 2.105 cellules
dans un volume de 2,5ml par puits.
milieu complet :
DMEM 500 ml
Sérum de veau fœtal 50 ml
Glutamine 1X
Sodium Pyruvate 5 ml
Pénicilline/ Strétomycine 5 ml
8
Bio 28 2007/2008
Protocole de Lipotransfection des cellules COS
1/ OPTIMEM
Quantity per well Quantity per well
for 4 wells plate
for 6 wells plate
Preparation of DNA prep in one specific tube: tube 1
25µl
100 µl
2/ add DNA 0.4 µg
0.4 µg
1 µg
4µl
6µl
3/ Mix
4/ Add REAGENT PLUS
5/ Mix
6/ let 15 minutes RT
7/ In the last minutes of step 6 : Prepare
transfection media in a new tube (tube 2)
25µl OPTIMEM + 100µl OPTIMEM +
4 µl
1 µl
LIPOFECTAMINE LIPOFECTAMINE
8/ MIX tube 1 to tube 2 and mix slowly
9/ let 15 min RT
10/ In the last minutes of 9, retrieve the medium of cells
11/ Add OPTIMEM
200 µl
800 µl
12/ Add the mix of step 8 and gently agitate the plates
13/ Put the cells 3 H at 37°C
14/ Replace with complete medium 500µl
500 µl
2 ml
9
Bio 28 2007/2008
Lysat SDS
Attention ne jamais mettre dans la glace, le SDS précipiterait
Préparation de 200ml de tampon de lyse
125 ml H2O
50ml SDS 10%
25ml Tris 1M pH6,8
Préchauffer le tampon de lyse à 95°C dans des tubes en verre, prévoir 400 µl pour
une boite de 3 cm
Lyse des cellules :
- Aspirer le milieu de culture
- 1 lavage PBS 1X à RT
- Aspirer le PBS totalement
- Ajouter 200 μl de tampon de lyse préchauffé à 95°C pour une boite de 3cm.
- Frotter la surface de la boite avec l’extrémité plate du cône pour décoller les
cellules et les transférer dans un eppendorf
- Chauffer 10 min à 95°C,
- Centrifuger à vitesse maximum 15 min à RT
- Récupérer le surnageant
- Quantifier les protéines
10
Bio 28 2007/2008
Gamme Etalon en triplicats :
-
Préparer le mix A+S : pour 1 ml de tampon A, ajouter 20 μl de tampon S
Pour chaque échantillon à doser préparer une cuve de spectrophotomètre et
mettre à partir du stock de BSA 10mg/ml :
Pour 20 μg prendre 2μl du stock
+20μl H2O +3μl de tampon de lyse
15 μg
1,5μl
+20,5μl H2O +3μl de tampon de lyse
10μg
1μl
+21μl H2O +3μl de tampon de lyse
5 μg
prendre 1μl dilution ½ +21μl H2O +3μl de tampon de lyse
2,5 μg
1μl
dilution ¼
+21μl H2O +3μl de tampon de lyse
1 μg
1μl
dilution 1/10 :
+21μl H2O +3μl de tampon de lyse
0,5 μg
1μl
dilution 1/20:
+21μl H2O +3μl de tampon de lyse
0 μg
+22μl H2O +3μl de tampon de lyse
-
125 μl de mix A+S
1 ml de tampon B
Mélanger et laisser 10 min
Mesurer la DO à 750 nm
Tracer le courbe DO=f (quantité de BSA)
Quantification des protéines à partir d’un lysat SDS en utilisant le kit Bio-Rad
-
Estimer le nombre de tubes à doser
Préparer le mix A+S : pour 1 ml de tampon A ajouter 20 μl de tampon S
Pour chaque échantillon à doser préparer une cuve de spectrophotomètre et
mettre
22 μl d’H2O
3 μl de l’échantillon à doser
125 μl de mix A+S
1 ml de tampon B
Mélanger et laisser 10 min
Mesurer la DO à 750 nm
Estimer la quantité de protéine de l’échantillon à partir de la gamme de BSA
11
Bio 28 2007/2008
Gel de protéines
Dépôt 40 à 50 μg de protéine par puits à reprendre dans du tampon de charge
Dépôt du marqueur de taille
Pour tester la phosphorylation de Akt gel 12.5%
Composition du tampon de charge 6X:
30 ml SDS 20%, 24ml Tris pH 6,8 (1M), 30 ml glycérol, 8,5 ml H2O, plus un peu de
bleu de bromophénol
RUNNING GEL MIX (ANDERSON)
40% Acrylamide
2% Bis-acrylamide
1.5M Tris-HCl pH8.8
H2O
APS
TEMED
12.5%
9.6ml
1.56ml
7.5ml
11.17ml
150μl
15μl
30ml
STACKING GEL MIX (ANDERSON)
40% Acrylamide
2% Bis-acrylamide
1M Tris-HCl pH6.8
H2O
APS
TEMED
0.64ml
0.33ml
0.63ml
3.4ml
50μl
5μl
5ml
5X ANDERSON RUNNING BUFFER
For 5 liters:
• 150g
Tris Base
• 720g
Glycine
• 250ml
SDS protein quality 10% stock
• Qsp H2O 5 liter
Migration
Dans du running buffer 1X
A 90V pour la migration dans le stacking
Puis à 20mA par gel, pour le running
12
Bio 28 2007/2008
WESTERN BLOT
1. Leave the gel for 10 min. in transfer buffer.
10X Wet TRANSFER BUFFER
For 2 liters:
• 58g
Tris Base
• 290g
Glycine
• H2O to 2 litres
1X Wet TRANSFER BUFFER for 500 ml
350ml H2O
+ 50 ml 10X Wet TRANSFER BUFFER
Mix
+ 100ml EtOH
2.
3. Blotting:
3x paper 3MM
gel
nitrocellulose
3x paper 3MM
everything in transfer buffer (nitrocellulose first in water (depends of
membrane type), then in transfer buffer).
4. Transfer at 400mA for 1h, at 4°C
5. Wash with H2O
6. Ponceau staining. Then, wash with H2O until there is no more background.
7. Make photocopy.
8. Wash with PBST (PBS 1X+ 0.1% Tween) until no coloration .
9. Incubate in blocking solution (5% milk in PBST) 1h at RT.
10. Rinse with PBST and incubate with the primary antibody (diluted in PBST with
5% milk) for O/N at 4°C.
13
Bio 28 2007/2008
11. Wash 4x 15min with PBST at RT.
12. Incubate with secondary antibody (dilution in PBST+1% milk) for 1h.
13. Wash 4x 15min with PBST at RT.
14. ECL (without letting the membrane dry).
Mix the two buffers of the kit volume to volume, take the wet membrane and
recover with the mixture during 1min, then go to expose the membrane with a film,
between 1s to 5min.
Primary antibodies:
rabbit antiP-Akt (1/500)
mouse antitubuline (1/7000)
Secondary antibodies:
Anti-rabbit HRP conjugated (1/4000)
Anti-mouse HRP conjugated (1/4000)
HRP: Horse Radish Peroxidase
14
Bio 28 2007/2008
IMMUNOFLUORESCENCE ON CULTURED CELLS
Use 500µl for each washing step
-
Choose one well without and one well with Sema3E (neurons should
separated)
Add gently 5OO μl of 4% PFA in PBS, 30 min at 4°C (important se mettre
sous une hotte à produit chimique),
wash the cells 3 x 5 min with 500µl of PBS 1X at RT
incubate with 50 mM NH4Cl (0.66 g in 250 ml PBS 1X), 15 min at RT
wash 2 x 5 min with PBS 1X at RT
permeabilise with 0.1% triton in PBS 1X, 15 min at RT
block 1 hr at RT with 500µl of blocking solution
incubate O/N at 4°C with 250µl of anti-phosphoneurofilament SMI31
(neuronal marker) 1:500 in blocking solution
wash 3 x 5 min in PBS 1X at RT
incubate 50 min at RT with 250µl of Cy3-conjugated Goat anti-Mouse IgG
(Jackson, cat# 115-165-003) 1:500 in blocking solution in the dark
wash 4 x 5 min with PBS 1X at RT in the dark
Observation
Blocking solution:
10 ml: 1 ml BSA 20% in PBS
0.2 ml goat serum
0.2 ml donkey serum
qsp 0.1% triton in PBS
15
Bio 28 2007/2008
LIAISON (BINDING) SUR CELLULES
1. Laver les cellules avec du tampon HBHA
2. Incuber avec différentes concentrations de Sema3E-AP ou de l’AP avec
sérum pendant 90min à température ambiante
3. Rincer 7 fois avec du HBHA sur la glace sur une période de 10min
Pour mesurer la liaison, utiliser les boites de 6cm:
1. Enlever complètement le milieu
2. Lyser les cellules dans 200ul de tampon de lyse (10mM Tris HCl pH 8, 1%
triton).
3. Récupérer ce mélange le mettre dans un tube de 1,5ml
4. Vortexer fortement
5. Centrifuger le surnageant 5 min à 12000g
6. Récupérer le surnageant dans un tube propre
7. Chauffer le surnageant 10 min à 65°C
8. prendre 100μl afin de mesurer l’activité phosphatase alkaline
9. pour chaque boite mesurer la quantité de Sema3E fixée, en mesurant la
pente
Pour révéler la liaison in situ de la sema3E-AP, utiliser les boites 4 puits :
1. Enlever complètement le milieu
2. Fixer les cellules pendant 30s dans le tampon de fixation (important se
mettre sous une hotte à produit chimique), enlever le milieu de fixation
3. Laver les cellules avec le tampon de lavage 5 min à température
ambiante, enlever le milieu
4. Remettre du tampon de lavage et chauffer les cellules pendant 15 min
à 65°C
5. enlever le milieu
6. rincer 2 fois avec du milieu de révélation
7. Lancer la révélation en diluant mille fois la solution de NBT et de BCIP
(substrat de l’enzyme)
8. arrêter les réactions en même temps, avec du PBS
9. laver 15min avec de la PFA 4% (se mettre sous une hotte de produit
chimique), attention à évacuer correctement les déchets
10. Rincer 3 fois avec du PBS 1X
11. Prendre des photos et interpréter
16
Bio 28 2007/2008
Tampon HBHA
HBSS
BSA 0,5 mg/ml
Mg Cl2, 4mM
Hepes pH7, 20mM
Tampon de fixation :
100% acétone
10% PFA
1M HEPES pH7.5
pour 10ml
6 ml
4 ml
0,2 ml
Tampon de lavage :
150mM NaCl
20mM HEPES pH7.5
Tampon de révélation :
100mM Tris HCl (pH 9,5)
100mM NaCl
5 mM MgCl2
17
Bio 28 2007/2008
MESURE DE LA CROISSANCE AXONAL
• Prendre une vingtaine de photo des neurones immunomarqués par smi31 pour
chaque condition, à l’aide du microscope inversé, objectif X 20.
• Télécharger vos photos sur les ordinateurs.
• A l’aide du logiciel de dessin passer l’ensemble des images en noir et blanc,
faite une macro si possible, sauvegarder les images dans un fichier bien
identifié.
• Ouvrir le programme ImageJ
• Dans Plugins cliquer sur NeuronJ
1 2
3
4
Les cases utiles sont numérotées par 1, 2, 3 et 4.
1 : Erase tracings
2 : Load image/tracings
3 : Add tracings
4 : Measure tracings
Il va falloir mesurer séparément les axones correspondant aux différentes
conditions
Pour mesurer la longueur d’un axone il faut :
• Cliquer sur la case Load image/tracings et ouvrir l’image de l’axone à mesurer.
Identifier l’axone, il ne faut pas mesurer les denrites.(il peut y avoir
plusieurs neurones sur une même image, les faire les uns après les autres)
• Cliquer sur la case Add tracings, il apparait une croix, à l’aide de cette crois
suivre le trajet d’un axone. Cliquer pour marquer le début, laisser cliqué en
suivant le trajet, appuyer sur la barre espace pour marquer la fin du trajet.
S’il y a plusieurs ramifications pour un même axone, suivre le traceé de
l’ensemble des ramifications.
• Cliquer sur la case Measure tracings, il apparaît alors la fenêtre suivante
18
Bio 28 2007/2008
Seule la case Display tracing length statistic doit être cochée.
• Cliquer sur Run, la fenêtre NeuronJ: Statistics apparait, la case image donne
le nom de la photo qui a été utilisé pour la mesure et la case sum, la longueur
de l’axone mesuré.
• S’il y a un autre axone à mesurer sur la même image, cliqué sur la case Erase
tracings et recommencer la procédure de mesure.
• Si vous voulez changer d’image, fermer votre image, le programme vous
demande do you want to save the tracings, vous cliquez No.. Puis vous
recommencez la procédure avec une nouvelle image
• Quand vous avez fini de mesurer l’ensemble des axones d’une condition
donnée, vous copiez l’enseble des mesures effectuées. Dans la fenêtre
NeuronJ statistics, aller dans Edit, faire select all puis copy.
• Ouvrir le programme de calcul, type excel, et coller votre tableau de valeur
• Garder uniquement les colonnes Image et Sum.
• Remplacer les points par des virgules, utiliser la fonction rechercher
remplacer du logiciel
• Au niveau de la colonne Sum, calculer la taille moyenne des axones
• Au niveau de la colonne Sum, l’écart type de la taille des axones
• Faire la racine carrée du nombre de vos valeurs
• Puis calculer l’écart moyen en divisant l’écart type par la racine carré du
nombre de vos valeurs.
• Plus vous avez de mesures par condition plus la valeur sera fiable. Il est donc
conseillé que vous mettiez en commun les valeurs de chacun pour les mêmes
conditions.
19
Bio 28 2007/2008
Mesure de l’intensité de Binding
• Prendre une vingtaine de photo des cellules COS après le binding AP pour
chaque condition, à l’aide du microscope inversé, objectif X 20. Attention à
ne pas modifier l’intensité de l’éclairage entre chaque condition.
• Télécharger vos photos sur les ordinateurs.
• A l’aide du logiciel de dessin passer l’ensemble des images en noir et blanc,
faite une macro si possible, sauvegarder les images dans un fichier bien
identifié.
• Pour l’ensemble des images, réaliser le négatif
• Pour mesurer l’intensité, Ouvrir le programme ImageJ
• Aller dans File, Open pour choisir l’image à ouvrir
• Choisir la sélection la mieux adaptée à la forme dont vous voulez mesurer
l’intensité, l’idéale sera de conserver le même forme pour l’ensemble des
mesures. Pour cela faites Edit, Copy, Edit, Paste, CtrlZ. Attention pour
pouvoir déplacer la forme que vous avez ainsi conservée vous devez voir une
flèche, si vous voyez une croix ou une main vous allez déformer votre
sélection.
• Aller dans Analyse, puis Measure. La fenêtre Results apparaît, avec la colonne
Area, qui correspond à l’aire dont vous avez mesurée l’intensité (elle restera
identique si vous utilisez toujours la même forme). Il y a la colone Mean qui
donne l’intensité moyenne par surface.
• CHAQUE PHOTO AYANT UN FOND QUI PEUT VARIER, IL FAUT FAIRE
UNE MESURE DU BRUIT DE FOND QU’IL FAUDRA RETRANCHER DE
L’ENSEMBLE DE VOS MESURES, D’UNE MÊME PHOTO. IDENTIFIER LA
MESURE CORRESPONDANT A CE TEMOIN.
• Après chaque photo sauvegardez vos valeurs dans un fichier de type Excel.
Vous pouvez éliminer les colonnes min et max.
• Remplacer les points par des virgules, utiliser la fonction rechercher
remplacer du logiciel
• Une fois les mesures faites, il faut vérifier que vous avez trailler toujours
avec la même surface.
• Retrancher pour chaque photo la valeur mean du bruit de fond à votre valeur
mean mesure ce qui vous donne une valeur mean corrigée.
• Mettre ensemble les valeurs mean corrigées
• Calculer la valeur moyenne de l’intensité
• l’écart type de vos valeurs
• Faire la racine carrée du nombre de vos valeurs
20
Bio 28 2007/2008
• Puis calculer l’écart moyen en divisant l’écart type par la racine carré du
nombre de vos valeurs.
• Plus vous avez de mesures par condition plus la valeur sera fiable. Il est donc
conseillé que vous mettiez en commun les valeurs de chacun pour les mêmes
conditions.
Mesure de l’intensité des bandes de western
• Scanner les autoradiographies
• Télécharger vos photos sur les ordinateurs.
• A l’aide du logiciel de dessin passer l’ensemble des images en noir et blanc,
faite une macro si possible, sauvegarder les images dans un fichier bien
identifié.
• Pour l’ensemble des images, réaliser le négatif
• Suivre le protocole mesure d’intensité de binding dans ImageJ pour mesurer
l’intensité des différentes bandes.
21