obtention par culture in vitro de clones d`absinthe, artemisia

25
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1996, 135, 25-43
OBTENTION PAR CULTURE IN VITRO DE
CLONES D'ABSINTHE, ARTEMISIA
ABSINTHIUM L., DENUÉS DE THUYONE (*)
A. LAMARTI (1) , I. SADKI (2) , A. BADOC
G. DEFFIEUX (3) , J.-P. CARDE (4)
(3)
,
La multiplication végétative par culture d’apex de
l’Absinthe a permis l’obtention de plusieurs clones, qui ont
été analysés pour leur huile essentielle. On observe une
importante variation des monoterpènes, en particulier de
l’acétate de sabinyle et de la β-thuyone, ce dernier composé
contribuant à la fois à la toxicité de l’Absinthe dans les
boissons du commerce et à ses propriétés médicinales.
INTRODUCTION
L’Absinthe ou Grande Absinthe, Artemisia absinthium L., de la
famille des Astéracées, est une plante vivace herbacée d’Europe, d’Asie
centrale et occidentale, d’Afrique du Nord, introduite en Amérique du Nord et
en Nouvelle-Zélande. Ses parties aériennes sont réputées médicinales depuis
la plus haute antiquité ; cette "Herbe sainte" entrait dans un grand nombre de
(*)
(1)
(2)
(3)
(4)
Manuscrit reçu le 1er décembre 1996.
Département de Biologie, Faculté des Sciences Mhanach II, BP 2121 Tetouan,
Maroc.
Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université Ibnou-Zohr, Agadir,
BP 28/5 Maroc.
Laboratoire de Mycologie et Biologie végétale, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 3, Place de la Victoire,
33076 Bordeaux Cedex.
Laboratoire de Physiologie cellulaire végétale, av. des Facultés,
Université Bordeaux 1, 33405 Talence Cedex.
26
remèdes au Moyen-Âge ; la plante est réputée vermifuge, antiseptique,
insectifuge, antimalarique, apéritive, eupeptique, diurétique, vulnéraire,
cholérétique, active contre les leucorrhées et les aménorrhées, etc. [1-2].
Plusieurs travaux font part d’une activité antimicrobienne [3-5], insecticide ou
insectifuge [6-10], antimalarique [11-15], antipyrétique [16-17], cholérétique
[18], antitumorale [19], contraceptive [20], hépatoprotectrice [21]. Bon nombre
de ces propriétés s’expliquent par la présence de composés terpéniques
(lactones sesquiterpéniques, homoditerpènes peroxydés, monoterpènes). Les
feuilles et les sommités fleuries ont été réintroduites en septembre 1974 à la
IXe édition de la Pharmacopée française et font partie depuis 1986 des plantes
permettant le dépôt d’un dossier allégé de demande d’autorisation de mise sur
le marché.
Des lactones sesquiterpéniques sont à l’origine du goût amer de
l’Absinthe et expliquent le succès de la boisson du même nom à la fin du
XIXe et au début du XXe siècle. D’autres plantes entraient dans la fabrication
de cet apéritif, notamment des espèces riches en (E)-anéthole (Anis, Fenouil,
Badiane de Chine) ou permettant l’obtention d’une coloration verte, comme la
Petite Absinthe, Artemisia pontica L. L’abus de cette liqueur fut décrit sous
le nom d’absinthisme et s’accompagnait d’un tableau clinique où dominent les
troubles nerveux. La toxicité fut surtout attribuée aux composés utilisés dans
les falsifications et à la thuyone, présente dans l’huile essentielle de la Grande
comme de la Petite Absinthe [22-24, etc.]. Il a été suggéré en 1975 [25] que la
thuyone sous une de ses formes énoliques et le tétrahydrocannabinol
pourraient réagir au niveau d’un même récepteur pharmacologique du système
nerveux central. Plus récemment, Bonkovsky et al. [26] ont montré que la
thuyone, tout comme l’α-pinène et le camphre, présents dans l’huile
essentielle d’Absinthe, peuvent être hépatotoxiques.
Les nombreux problèmes de santé publique conduisirent le
gouvernement français à confier en 1872 la vente de l’essence composée
d’Absinthe aux seuls pharmaciens, à imposer en 1912 une baisse des
concentrations en alcool et en huile essentielle des liqueurs d’Absinthe, et
finalement à interdire la fabrication et la vente de cet apéritif par la loi du 16
mars 1915 [23-24]. Depuis, le décret du 31 juillet 1959 et l’article L641 du
Code de la Santé Publique réglementent la fabrication, le transport et la vente
de l’huile essentielle d’Absinthe, de même que celles d’Anis, de Badiane, de
Fenouil et d’Hysope.
Néanmoins, l’utilisation de l’Absinthe est autorisée dans certains Pays
en alimentation avec des limitations de la teneur en thuyone [27-28].
L’Absinthe rentre en particulier dans la formulation de diverses liqueurs et
boissons alcoolisées comme les vermouths ou dans des eaux minérales
toniques. Plusieurs dizaines de brevets ont été déposés, la plupart émanant
27
d’Europe centrale. L’Absinthe et son huile essentielle sont aussi utilisées pour
la fabrication de savons, détergents, lotions, parfums, avec des teneurs
limites en thuyone à respecter [27].
La distillation à la vapeur d’eau favorise la transformation des lactones
sesquiterpéniques comme l’artabsine en absinthine, dimère plus amer, et en
dihydrochamazulènes de couleur jaune à rouge, qui donnent un peu de
chamazulène bleu [29]. Ce dernier composé se forme en plus grande quantité
quand la distillation a lieu en milieu acide ou en milieu basique puis acide
[30-31]. La distillation extrait plus facilement la thuyone toxique que la
percolation ou la digestion [32]. L’extraction à l’eau chaude de l’artabsine
n’est pas complète [33] et les solvants organiques qui pourraient dissoudre la
thuyone extraient une partie des lactones sesquiterpéniques et doivent être peu
toxiques et facilement éliminables. Ajoutons qu’une macération prolongée en
solution éthanolique modifie considérablement le profil essentiel [34]. Avec le
gaz carbonique à l’état liquide ou supercritique, Stahl et Gerard obtiennent
une élimination complète de la thuyone pour une perte faible d’artabsine [35]
ou encore la totalité des lactones sesquiterpéniques en mélange avec une partie
des monoterpènes de haut poids moléculaire, comme les esters de thuyyle et
de sabinyle [29]. On notera que ces derniers, comme l’acétate de sabinyle,
peuvent ne pas être dénués de toxicité [36-37]. L’élimination de la thuyone
s’accompagne généralement d’une diminution de concentration d’autres
terpènes pouvant contribuer à la note aromatique finale recherchée, ce qui peut
être corrigé en ajoutant un mélange terpénique approprié [38]. Ajoutons
qu’une technique de photolyse par laser a été récemment mise au point pour
éliminer des molécules indésirables de solutions complexes, comme la
thuyone présente dans les extraits de Sauge [39].
Face aux difficultés et au coût de la détoxification des extraits, divers
auteurs ont cherché à cultiver des Absinthes pauvres en thuyone ; celle-ci
existe sous 2 formes isomères, α- et β-. La β-thuyone est souvent le
principal constituant [40-46] ou un composé important de l’huile essentielle
[46-49]. L’α-thuyone peut aussi être le principal composé volatil [51] ou
atteindre des proportions non négligeables [42,49]. Inversement, quelques
profils essentiels totalement dénués de thuyones ont été décrits [45-46,52] entre
différentes origines ou au sein d’une même provenance. Parmi les autres
composés majoritaires, on peut citer le myrcène [29,42,45,53], le (Z)-époxyocimène [52,54-56], le terpinène-4-ol [46], le sabinène [29,45], le trans- ou le
cis-acétate de sabinyle [43,45,47-48,50,52], le cis-chrysanthénol [57] et l’acétate
de chrysanthényle [52,56].
La micropropagation apparaît comme une technique de choix pour
profiter de la variabilité inter et intrapopulationnelle de l’Absinthe.
28
La micropropagation des Armoises a généralement lieu sur milieu
solide. Elle peut se faire à partir de segments foliaires [58], mais on a surtout
eu recours à la culture d’apex ou de noeuds de tige, réalisée pour les espèces
suivantes : A. umbelliformis Lam. et A. genepi Weber [59-60], A.
absinthium L. [61-63], A. alba Turra [64-65], A. scoparia Waldst. et Kit.
[66], Artemisia dracunculus L. [67-70, etc.], A. balchanorum Krash. [71-72],
A. pallens Wall. ex DC. [73-75], A. granatensis Boiss. [76] et surtout A.
annua L. [77-88, etc.], en raison de l’activité antimalarique de l’artémisinine et
de ses dérivés. Les auteurs partent d’apex ou de noeuds de tige de plante
adulte ou de plantule issue de germination de graines. Le milieu le plus
fréquemment utilisé est celui de Murashige et Skoog [89] parfois dilué au
demi ou modifié, avec le saccharose comme source énergétique habituelle
(2-3%). Le taux de multiplication dépend de nombreux facteurs :
concentrations en phytohormones, rapport auxines / cytokinines, type de
support, positionnement de l’explant, conditions lumineuses, etc. Des
problèmes d’hyperhydrie sont souvent rencontrés et la teneur en cytokinines
est alors généralement diminuée. L’enracinement a lieu sans problème par
suppression des cytokinines, avec ou sans auxines.
Nous exposons dans ce travail les profils essentiels de 7 clones
obtenus par micropropagation de l’Absinthe.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Germination des akènes
Des semences d’Absinthe du commerce (Clause Semences
Professionnelles, 24, bd P. Brossolette, 91221 Brétigny-sur-Orge Cedex) ont
été stérilisées (alcool 95° 1-2 min, puis solution 9% d’hypochlorite de calcium
à 120° chlorométriques français 30 min) puis mises à germer par 90-100 dans
des boîtes de Petri en plastique (90 x 12 mm) contenant 30 ml d’eau gélosée
stérile (6 g/l). La germination est maximale au bout de 16 jours.
Conditions de culture
Des tubes à essais en verre (22 x 160 mm) contenant 15 ml de milieu
gélosé, bouchés par du coton hydrophile, flambés, puis recouverts d’une
feuille d’étain ont été utilisés. Afin de réduire le taux d’hyperhydrie, les
bouchons en coton hydrophile ont été remplacés par des capuchons en
plastique.
29
Les cultures sont placées dans une salle climatisée à 22±1°C.
L’éclairage de 2000 à 2500 lux (8 à 10 W.m-2) est obtenu par des tubes
fluorescents de type blanc de luxe (General Electric, 40 W). La photopériode
est de 18 heures de lumière.
Les milieux sont ajustés à pH 5.5-5.8 et autoclavés 25 min à 120°C.
Micropropagation
Après germination, les apex de 2 mm sont prélevés et placés sur la
solution minérale KNOP 1/2 [90] additionnée de saccharose (5g/l) et d’agar
bactériologique type E (6 g/l). Après quelques jours de culture, on obtient des
plantules enracinées d’1 cm.
Ces plantules sont repiquées sur un milieu plus riche de
multiplication : macroéléments (x 1/2), microéléments et Fe - EDTA de
Murashige et Skoog [89], saccharose (20 g/l), agar (6 g/l), acide
-8
3-indolylacétique (AIA 10 g/ml) et vitamines de Leddet et al. [60] :
pantothénate de calcium 500, chlorhydrate de thiamine 500, acide nicotinique
250, pyridoxine 250, acide folique 50, biotine 25 µg/l ; le bourgeonnement
-8
-9
axillaire est favorisé par la 6-benzylaminopurine (BAP 10 , voire 10 g/ml).
Après 3 semaines de culture, les plantules ont atteint 3 à 4 cm. L’hyperhydrie
est importante au premier passage. 7 clones ont été isolés au cours de 4
repiquages.
La suppression de la BAP entraîne l’apparition de racines après une
semaine.
Passage en serre
Les clones enracinés sont placés en mini-serres sur de la vermiculite.
Ils sont arrosés par la solution nutritive précédente sans BAP dans les mêmes
conditions de température et de photopériode. Après 10 jours d’acclimatation,
les plants sont alors transférés en pots sur du terreau.
Extraction
Les analyses sont effectuées sur des feuilles (pétiole et limbe) de
plants cultivés 20 jours en pots.
15 feuilles sont broyées dans un petit mortier avec de petites quantités
de pentane bidistillé. Les surnageants prélevés avec une pipette Pasteur sont
réunis, additionnés de 5 ml d’une solution à 0,012g/l d’oenanthate d’éthyle
utilisé comme étalon interne et concentrés sous hotte dans un appareil de
Kuderna avec un bain-marie de 60°C (Figure 1).
30
Fig. 1 : L’appareil de Kuderna est
constitué d’un petit tube gradué qui
s’emboîte dans un ballon dans lequel on
verse la solution à concentrer, lui même
surmonté d’une colonne de rectification. Le
petit tube est plongé dans un bain-marie
thermostaté à 60°C. La colonne de
rectification verticale permet l’élimination
du seul solvant jusqu’à obtention d’un
volume final de 1 à 1,5 ml.
Chromatographie en phase gazeuse
Les conditions opératoires sont les suivantes : chromatographe Girdel
série 30, colonne Girdel ST 102 (en acier, de 2 m de long, 1,9 mm de
diamètre interne, carbowax 20M 10% sur chromosorb WAW 80-100 mesh),
H2 (2,2 bars), air synthétique (O 2 : N 2 20 : 80, 1,0 bar), N2 (0,5 bar à
60°C), programmation de température (2°C / min de 60 jusqu'à 200°C,
maintenus constants 30 min), température de l'injecteur et du détecteur à
ionisation de flamme (250°C), volume d’extrait concentré injecté (6 µl),
enregistreur Sefram Servotrace (5 mm / min), intégrateur ICAP 50 Delsi.
Identification des pics
Par comparaison avec les chromatogrammes de substances témoins, la
plupart des principaux pics ont été identifiés (Figures 2 et 3). Les coefficients
de réponse vis-à-vis du détecteur à ionisation de flamme ont été calculés
(Tableau I). On admet que l’α- et la β-thuyone fournissent un même
coefficient de réponse par rapport à l’étalon interne [51].
31
Fig. 2 : Formules développées de quelques monoterpènes rencontrés dans
l’huile essentielle d’Absinthe
Fig. 3 : Chromatogramme du clone b riche en β-thuyone et présentant des
teneurs non négligeables de myrcène et d’acétate de sabinyle. L’étalon
interne est l’oenanthate d’éthyle. Les pics déterminés correspondent à
81,2 % de la surface totale des pics.
32
Tableau I
Coefficients de réponse au détecteur à ionisation de flamme de
terpènes rencontrés dans l’essence des feuilles d’Absinthe, avec
indications sur l’origine, la pureté et la température de sortie
des témoins
L’étalon interne est l’oenanthate d’éthyle ou heptanoate d’éthyle.
Témoins
Origine
α-pinène
Fluka
camphène
Pernod-Ricard
β-pinène
Pernod-Ricard
β-myrcène
Pernod-Ricard
limonène
Pernod-Ricard
β-phellandrène
Pernod-Ricard
γ-terpinène
Fluka
p-cymène
K&K Laboratories Inc.
oenanthate d'éthyle
Fluka
β-thuyone
Pernod-Ricard
camphre
Fluka
linalol
Fluka
acétate de chrysanthényle
Pernod-Ricard
acétate de sabinyle
Interchim
Pureté Coefficient Température
Ki
de sortie
en °C
98,9
85,7
83,1
87,3
96,3
85,2
95,6
94,5
99,2
89,2
99,6
99,6
81,5
92,4
0,67
0,67
0,67
0,77
0,68
0,79
0,71
0,65
1,00
0,76
0,83
0,84
0,82
0,86
75,0
78,5
81,1
86,8
90,4
91,2
97,3
99,8
106,7
117,1
127,9
130,4
137,6
141,8
RÉSULTATS
L’analyse par CPG de 7 clones d’A. absinthium cultivés in vitro
montre des différences de profil marquées. On observe une importante
variation des teneurs en ß-thuyone et en acétate de sabinyle (Tableau II).
Les clones a, b, c et d sont riches en β-thuyone, le clone b en
contenant jusqu’à 58,2 mg / 100g de matière fraîche (Figure 3). Le clone e
est dépourvu de thuyones et les clones f et i en contiennent une quantité
négligeable.
L’acétate de sabinyle n’est en faible quantité que dans le clone a. Sa
teneur est comprise entre 27 et 38 mg pour les clones b, c, d, e et f et atteint
70,7 mg / 100 g de matière fraîche pour le clone i.
33
On constate que le β-pinène se trouve en quantité notable dans les
clones a et b, le myrcène dans le clone b. Les autres terpènes sont en très
faibles proportions.
Tableau II
Teneurs de divers constituants de l’huile essentielle des feuilles
de 7 clones d’Absinthe
Les teneurs, exprimées en mg par 100 g de matière fraîche, ont été corrigées en
tenant compte des coefficients Ki de réponse vis-à-vis du détecteur à ionisation de
flamme et sont la moyenne d’au moins 2 injections.
Clones
a
b
c
d
e
f
i
T
T
8,7
3,4
0,7
T
0,1
0,1
0,4
39,2
T
0,3
0,1
0,3
0,3
0,1
4,6
20,7
T
0,2
0,1
0,5
0,7
58,2
0,1
1,2
0,6
27,2
T
0,1
1,3
8,9
T
0,1
0,1
0,5
0,2
29,8
T
0,9
0,3
30,5
T
T
2,0
6,3
T
0,1
0,1
0,3
0,3
34,1
T
0,3
0,3
27,0
T
T
0,8
0,2
T
T
0,8
0,3
0,1
27,2
T
T
0,3
3,4
T
0,4
T
0,2
0,1
0,1
T
0,3
0,3
38,0
T
T
0,8
9,5
0,1
0,8
0,1
0,7
0,1
0,1
0,2
0,5
0,1
70,7
Constituants
α-pinène
camphène
β-pinène
myrcène
limonène
β-phellandrène
γ-terpinène
p-cymène
α-thuyone
β-thuyone
camphre
linalol
ac. de chrysanthényle
acétate de sabinyle
T : traces
- : non détecté
DISCUSSION
Nos résultats concordent avec ceux de la littérature : à partir de
semences du même fournisseur (Clause), Karp et Croteau [47] ont analysé
l’huile essentielle des feuilles immatures et matures et montré également que
les principaux composés sont la β-thuyone et l’acétate de sabinyle.
Les profils essentiels des feuilles des 7 clones d’Absinthe permettent
de penser que la population d’origine présente une grande hétérogénéité
34
chimique : le clone a est riche en β-thuyone, les clones e, f et i en acétate de
sabinyle et les clones b, c et d contiennent des quantités importantes de ces 2
terpènes.
La micropropagation par culture d’apex paraît donc être une voie
d’avenir pour obtenir à partir de populations d’Absinthe ou au sein de ces
populations des profils chimiques divers, dont on pourra tirer profit.
En alimentation, on cherchera à diminuer la teneur des composés les
plus toxiques (pinènes, thuyones, camphre, acétate de sabinyle). Le clone b
sera éliminé d’office alors que le clone e semble mieux approprié. La
recommercialisation de la liqueur d’absinthe n’est pas impensable dans
l’avenir.
Pour l’usage pharmaceutique, on ne cherchera pas forcément à
diminuer trop la thuyone, qui participe aux propriétés médicinales, ce qui a été
prouvé pour les activités antibactérienne, antifongique, insecticide et
insectifuge [91-94, etc.].
Certains constituants pourront être recherchés. Ainsi, l’acétate de
chrysanthényle, qui présente des propriétés antimicrobiennes [95], a aussi un
intérêt en parfumerie [96]. De même, le sabinène et la thuyone peuvent servir
d’intermédiaires en chimie de synthèse [97-98, etc.].
Enfin, le clonage in vitro permettrait de disposer d’un matériel végétal
mieux défini dans les études sur les voies de biosynthèse des nombreux
terpènes constituant l’huile essentielle d’Absinthe.
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ABSTRACT
Obtention by in vitro culture of clones of wormwood,
Artemisia absinthium L., lacking thujone
The vegetative multiplication by apex culture of wormwood allowed the
obtention of several clones, that have been analysed for their essential oil. A
major variation of monoterpenes is observed, principally as regards sabinyl
acetate and β-thujone. This last compound contributes not only to the toxicity
of wormwood in commercial beverages but also to its medicinal properties.
Key-words : wormwood, A rt e m i s i a abs i nt hi um , micropropagation,
essential oil composition, thujone, sabinyl acetate.
__________