docAnnexe I. Matériel et Méthodes
download 
Plainte Transcription
Annexe I. Matériel et Méthodes
Matériel et Méthodes Annexe I. Matériel et Méthodes 1. Manipulations d’ADN 1.1. Préparation, Purification et analyse des ADN plasmidiques Les expériences de restriction ainsi que de ligation d’ADN, d’extraction phénol/chloroforme, de précipitation, d’électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide, de transformation de bactéries par choc électrique et de PCR (Polymerase Chain Reaction) ont été réalisées selon les méthodes décrites précédemment (Sambrook et al., 1989). Les extractions d’ADN à partir de gels d’agarose et les minipréparations d’ADN plasmidiques ont été réalisés en utilisant le kit DNA extraction from Agarose et le kit DNA minipreperation (QIAGEN & SIGMA), respectivement. Les séquençages ont été réalisés et analysés par la firme Genome Express. Toutes les constructions plasmidiques ont été générées en sous-clonant des fragments d’ADN obtenus par restriction de plasmides ou par amplification PCR à partir de plasmides contenant la séquence d’intérêt. 1.2. Plasmides utilisés Différents plasmides ont été utilisés afin de transcrire, in vitro, des sondes ARN antisens. Ces plasmides «sondes» sont repris dans le tableau 1 présenté en pages I-II. Afin de transcrire des ARNm destinés à être injectés dans les embryons de xénope, nous avons utilisé plusieurs constructions préexistantes qui nous ont été gracieusement fournies par les laboratoires qui les ont générées. De plus, nous avons généré différentes constructions destinées à servir de modèles lors de la transcription in vitro d’ARNm. Ces plasmides d’expression sont repris dans le tableau 2 présenté en pages II-IV. Plasmide sonde Espèce Vecteur Linéarisation ARN polymérase Rangement Origine BMP4 X.laevis pSPRT PstI T7 ish n° 17 Bang et al., 1997 Delta1 X.laevis XhoI T7 ish n° 82 Chitnis et al., 1995 Delta2 X.laevis pGEM T ApaI SP6 ish n° 4 Jen et al., 1997 Epi. Keratin X.laevis pGEM 81 EcoRI SP6 ish n° 36 Bellefroid et al., 1998 FoxD3 X.laevis pCS2 BamHI T7 ish n° 311 Sasai et al., 2001 Hairy2 X.laevis pBKS SalI T7 ish n° 112 Taelman et al., 2003 HoxB9 X.laevis pBKS BamHI T7 ish n° 270 Sharpe, 1991 Id3 X.laevis pCS2 HinDIII T7 ish n° 339 Liu et al., 2003 Msx1 X.laevis pCTS XhoI T7 ish n° 39 Suzuki et al., 1997 MyoD X.laevis BamHI SP6 ish n° 78 Rupp et al., 1991 I Matériel et Méthodes Myt1 X.laevis pBKS BamHI T7 ish n° 79 Bellefroid et al., 1998 NeuroD X.laevis pBKS XbaI T7 ish n° 69 Bellefroid et al., 1998 Notch1 X.laevis ClaI SP6 ish n° 85 Chitnis et al., 1995 Nrp1 X.laevis BamHI T3 ish n° 367 Bellefroid et al., 1998 N-Tubulin X.laevis BamHI T3 ish n° 40 Chitnis et al., 1995 Otx2 X.laevis NotI T7 ish n° 126 Blitz et al., 1995 Pax3 X.laevis pBKS SalI T7 ish n° 60 Bang et al., 1997 Pax8 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 98 Carroll and Vize, 1999 Serrate1 X.laevis pBKS HinDIII T7 ish n° 278 Sato et al., 2000 Six1 X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 303 Pandur et al., 2000 Six3 X.laevis pCS2 ClaI T7 ish n° 404 Zhou et al., 2000 Snail2 X.laevis pSP72 BglII SP6 ish n° 82 Mayor et al., 1995 Sox10 X.laevis pBKS EcoRI T3 ish n° 308 Aoki et al., 2003 Sox2 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 50 Bellefroid et al., 1998 Sox3 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 276 Penzel et al., 1996 Sox9 X.laevis pGEM T NcoI SP6 ish n° 304 Spokoni et al., 2002 SoxD X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 47 Mizuseki et al., 1998 Trp2 X.laevis pGEM T NcoI SP6 ish n° 353 Aoki et al., 2003 Xag1 X.laevis pBKS NotI T7 ish n° 377 Wardle et al., 2002 Xbra X.laevis pSP73 BglII T7 ish n° 152 Smith et al., 1991 Zic1 X.laevis pBKS EcoRI T7 ish n° 49 Sato et al., 2005 pBKS Tableau 1. Plasmides utilisés comme modèles pour la transcription in vitro de sondes ARN Plasmide injection Espèce Vecteur Linéarisation ARN polymérase Rangement Origine dnBMPR (tBr) X.laevis p64T EcoRI SP6 inj n° 4 Graff et al., 1994 BMP4 X.laevis XbaI SP6 inj n° 6 Schmidt et al., 1995 Noggin X.laevis EcoRI SP6 inj n° 15 Wettstein et al., 1997 pCS2 NotI SP6 inj n° 44 Turner D Lac Z ICD X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 50 Wettstein et al., 1997 Delta1 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 53 Chitnis et al., 1995 Wnt8 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 58 Christian et al., 1991 Su(H)ank X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 75 Chitnis et al., 1995 Delta X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 123 Chitnis et al., 1995 Su(H) X.laevis pCS2-Flag ApaI SP6 inj n° 124 Wettstein et al., 1997 Hairy1 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 131 Taelman et al., 2004 Hairy2b X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 132 Taelman et al., 2004 Hes6 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 154 Koyano-Nakagawa et al., 2000 ESR10 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 155 Li et al., 2003 ICD X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 170 Lahaye et al., 2002 dnGSK3β X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 179 Dominguez et al., 1995 GSK3β X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 180 Dominguez et al., 1995 stu GFP pCS2 NotI SP6 inj n° 190 Bronchain et al., 1999 Hes2 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 225 Sölter et al., 2006 HRT1 X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 270 Taelman et al., 2004 ESR10 X.laevis pCS2-Flag-GR NotI SP6 inj n° 278 Sölter et al., 2006 II Matériel et Méthodes Hairy2b X.laevis pCS2-Myc-GR NotI SP6 inj n° 282 Taelman et al., 2004 Nrarp X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 296 Lahaye et al., 2002 Hes2 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 300 Sölter et al., 2006 eFGF X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 302 Slack et al., 1989 caBMPR (Ca-Alk3) X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 306 Graff et al., 1994 Su(H)dbm X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 314 Chitnis et al., 1995 dnFGFR1 (XFD1) X.laevis pCS2 EcoRI SP6 inj n° 345 Amaya et al., 2001 dnFGFR4 (ΔR4) X.laevis pSP64T SalI SP6 inj n° 346 Hongo et al., 1999 FGFR4 X.laevis pSP64T AvaI SP6 inj n° 348 Delaune et al., 2005 Hairy2ΔWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 411 Nichane et al., 2008b Hairy2dbm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 412 Nichane et al., 2008b Id3 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 427 Nichane et al., 2008a Bax X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 437 Finkielstein et al., 2001 Bcl2 X.laevis pCS2-Myc NotI SP6 inj n° 438 Finkielstein et al., 2001 Hairy2b-GFP X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 439 Nichane et al., 2008a Hairy2a-GFP X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 440 Nichane et al., 2008a Hairy2a X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 441 Nichane et al., 2008a Hairy2a X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 442 Nichane et al., 2008a FGF8a X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 463 Fletcher et al., 2006 Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 471 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔOIWRPW X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 472 Nichane et al., 2008b Hairy2-I X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 473 Nichane et al., 2008b Hairy2-O X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 474 Nichane et al., 2008b Hairy2-OI X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 475 Nichane et al., 2008b Hairy2-HLHO X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 476 Nichane et al., 2008b Hairy2-HLH X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 477 Nichane et al., 2008b Stat3 X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 485 Nichane et al., 2009 Stat3 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 489 Nichane et al., 2008b Id3 X.laevis pCS2-Flag-GR NotI SP6 inj n° 492 Nichane et al., 2008a Hairy2-Nterm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 497 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 498 Nichane et al., 2008a Hairy2dbm X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 499 Nichane et al., 2008a Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 500 Nichane et al., 2008a Hairy2ΔOIWRPW X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 501 Nichane et al., 2008a Hairy2-I X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 502 Nichane et al., 2008a Hairy2-OI X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 504 Nichane et al., 2008a Id3-Nterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 508 Nichane et al., 2008a Id3-Cterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 509 Nichane et al., 2008a Id3-HLH X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 511 Nichane et al., 2008a Stat3CTC X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 527 Nichane et al., 2009 Stat3YF X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 529 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-NLS-GR NotI SP6 inj n° 533 Nichane et al., 2008b Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 534 Nichane et al., 2008b HRT1-NtermHairy2 X.laevis pCS2-GR NotI SP6 inj n° 537 Nichane et al., 2008b Hes1 Mouse pCS2-GR NotI SP6 inj n° 538 Nichane et al., 2008a pCS2 NotI SP6 inj n° 540 Luyten et al., 2008 p64T EcoRI SP6 inj n° 557 Slack et al., 1989 mRFP bFGF X.laevis III Matériel et Méthodes FGF3 X.laevis pCS2 NotI SP6 inj n° 558 Slack et al., 1989 caFGFR1 (torsoR1) X.laevis pSP64T-Myc SacI SP6 inj n° 564 Umbhauer et al., 2000 Wnt7b X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 565 Monsoro-Burq et al., 2005 caFGFR4 (torsoR4) X.laevis pSP64T-Myc XbaI SP6 inj n° 566 Umbhauer et al., 2000 Hairy2 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 570 Nichane et al., 2009 Stat3 X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 571 Nichane et al., 2009 FGFR1-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 613 Nichane et al., 2009 FGFR2-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 614 Nichane et al., 2009 FGFR3-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 615 Nichane et al., 2009 FGFR4-IC X.laevis pCS2-Flag NotI SP6 inj n° 616 Nichane et al., 2009 Stat3 X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 629 Nichane et al., 2009 Hairy2 X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 630 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔNterm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 643 Nichane et al., 2009 Hairy2dbm X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 644 Nichane et al., 2009 Hairy2ΔIWRPW X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 645 Nichane et al., 2009 Hairy2-I X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 646 Nichane et al., 2009 Hairy2-OI X.laevis pCS2-HA NotI SP6 inj n° 647 Nichane et al., 2009 Id3 X.laevis pCS2-Flag-GFP NotI SP6 inj n° 648 Nichane et al., 2009 Pax3 X.laevis pCS107 AscI SP6 inj n° 655 Monsoro-Burq et al., 2005 Zic1 X.laevis pCS2 KpnI SP6 inj n° 656 Sato et al., 2005 Msx1 X.laevis pSP64T EcoRI SP6 inj n° 657 Monsoro-Burq et al., 2005 Stat3CTC X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 687 Nichane et al., 2009 Stat3YF X.laevis pCS2-GFP NotI SP6 inj n° 689 Nichane et al., 2009 Tableau 2. Plasmides utilisés comme modèles pour la transcription in vitro d’ARNm 2. Transcription et traduction in vitro Les plasmides servant de modèles pour la transcription in vitro sont préalablement digérés par une enzyme de restriction reconnaissant un site unique en aval de la séquence à transcrire. Le produit de digestion est analysé sur gel et l’ADN linéarisé est ensuite purifié par une extraction au phénol/chloroforme, une extraction au chloroforme et est précipité à l’éthanol. Il est ensuite resuspendu dans de l’H2O traitée au DEPC (diéthyl pyrocarbonate, Sigma) à une concentration d’environ 1µg/µl. 2.1. Transcription des sondes ARN antisens marquées non radioactivement La réaction de transcription des sondes ARN antisens est réalisée à l’aide du kit MEGAscript® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6) en présence de digoxigénine11-UTP (Roche) ou de fluoréscéine-11-UTP (Roche). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 4 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré par l’ajout de DNAse I et incubation de IV Matériel et Méthodes 15 minutes à 37°C. La sonde ribonucléotidique antisens est ensuite purifiée par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution de Tris10mM-EDTA 1mM et 0,1% SDS. La sonde ribonucléotidique antisens est précipitée à l’éthanol et le culot est resupendu dans 20µl d’H2O traitée au DEPC. La qualité de l’ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. La sonde est ensuite diluée dans du tampon d’hybridation à 1µg/µl et conservée à -20°C. 2.2. Transcription d’ARNm synthétiques La réaction de transcription d’ARNm synthétique est réalisée à l’aide du kit mMESSAGE mMACHINE® (Ambion) en utilisant l’ARN polymérase adaptée (T3, T7 ou SP6). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 2 heures. L’ADN plasmidique est ensuite digéré et éliminé par l’ajout de DNAse I et incubation de 15 minutes à 37°C. L’ARNm synthétique est extrait au phénol/chloroforme et est purifié par chromatographie d’exclusion sur billes Sephadex G50 Medium (Amersham Biosciences) équilibrées dans une solution aqueuse de TE (10mM Tris, 1mM EDTA) et 0,1% SDS. L’ARNm synthétique est ensuite précipité à l’éthanol. Le culot est resupendu dans 20µl d’H2O traitée au DEPC et conservé à -80°C. La qualité de l’ARNm est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. 2.3. Transcription – traduction couplées in vitro Les réactions de transcription et traduction couplées in vitro sont réalisées en présence de méthionine [35S] (15µCi/mmol ; Amersham Life Science) à l’aide du kit "TNT SP6 Coupled Transcription-Translation System®" (Promega) en suivant les instructions de la firme. Les produits de réaction sont analysés par électrophorèse sur gel 10% SDS – PAGE. Après migration, le gel est fixé 20 minutes dans une solution aqueuse contenant 10% d’acide acétique et 10% de méthanol. Le gel est séché 1 heure et placé dans une cassette au contact d’un film autoradiographique. Le film est développé après une nuit à température ambiante. 3. Oligos morpholinos antisens Les morpholinos (Gene Tools) sont des oligomères analogues synthétiques de l’ADN capable de bloquer spécifiquement l’épissage ou la traduction d’un ARNm cible. Afin d’inhiber la traduction, les séquences des morpholinos sont choisies au niveau du site d’initiation de la V Matériel et Méthodes traduction ou dans la région 5’ non traduite située immédiatement en amont du site d’initiation de la traduction de l’ARNm. Les morpholinos, d’une longueur de 25 résidus, sont resupendus dans de l’H2O à une concentration d’environ 1mM. L’absorbance de 5µl de la solution de morpholinos est lue à 265nm dans 995µl d’une solution 0,1M d’HCl. La concentration de la solution de morpholinos est calculée selon la formule suivante : A265 x 200/ε. Où ε est l’absorbance d’une mole de morpholinos. Les stocks de morpholinos dilués sont aliquotés et conservés à -80°C. Juste avant l’injection, les morpholinos sont dégelés et incubés 5 minutes à 65°C afin de permettre leur complète mise en solution. Après décongélation, les morpholinos peuvent être gardés à 4°C durant 2 semaines. Les séquences des différents morpholinos utilisés sont reprises dans le tableau 3 présenté en page VI. Morpholino Espèce Séquence Rangement Origine Hairy2a MO X.Laevis 5’-ATGGTATCTGCGGGCATGTTCAGTT-3’ MO n°5 Nichane et al., 2008a Hairy2b MO X.Laevis 5'-GGCATGTTCAGATGTTGTATCCGGA-3’ MO n°6 Nichane et al., 2008a Hairy2b MO5mis X.Laevis 5’-GGCTCGTTCATAGTCGTATCCTGA-3’ MO n°7 Nichane et al., 2008a Id3 MO X.Laevis 5'-ACCGCACTGGGCTGATGGCTTTCAT-3' MO n°29 Light et al., 2005 FGF8 MO X.Laevis 5'-GGAGGTGATGTAGTTCATGTTGCTC-3' - Pax3 MO X.Laevis 5'-TCTCAGTTCCCTTGCCAAGTATTAA-3' MO n°69 Monsoro-Burq et al., 2005 Msx1 MO X.Laevis 5'-GCCATACAGAGAGATCCGAGCTGAG-3' MO n°68 Monsoro-Burq et al., 2005 Zic1 MO X.Laevis 5'-AAGTCTTCCAACAATGGGCAGCGAA-3' Delta1 MO X.Laevis 5'-CGCTGCTGTCCCATGTTGTCTGATA-3’ MO n°30 Nichane et al., 2008b Stat3 MO X.Laevis 5'-GGTTCCACTGCGCCATTGTGTGGGC-3' MO n°28 Ohkawara et al., 2004 Stat3 MO7mis X.Laevis 5'-GACTCCAATGGGCCTTTGTGTCCGA-3' MO n°49 Nichane et al., 2008b FGFR1a MO X.Laevis 5’-AGGGACCTTCCGGAGAACATCCCAA-3’ MO n°74 Nichane et al., 2009 FGFR1b MO X.Laevis 5’-AGGGACATTCCGGAGAACATCCCAA-3’ MO n°75 Nichane et al., 2009 FGFR4a MO X.Laevis 5'-GATCCAGACATGACTGGTGCGTATG-3’ MO n°72 Nichane et al., 2009 FGFR4b MO X.Laevis 5’-GATCCAGACATGGCTGGCGCGTATG-3’ MO n°73 Nichane et al., 2009 Control MO - 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3' MO n°17 Gene Tools - Fletcher et al., 2006 Sato et al., 2005 Tableau 3. Morpholinos oligonucléotides utlisés pour les expériences de perte de fonction 4. Obtention et manipulation d’embryons 4.1. Obtention des embryons de Xenopus laevis 4.1.1. Induction de la ponte Les xénopes de l’espèce X. laevis adultes (Nasco) sont élevés dans des aquariums dont l’eau, à une température de 16°C, est renouvelée une fois par jour. L’ovulation est induite par l’injection, VI Matériel et Méthodes dans le sac lymphatique dorsal d’une femelle pigmentée ou albinos d’hCG (hormone gonadotropine chorionique humaine; Sigma). Les femelles X. laevis reçoivent 500U d’hCG la veille du jour désiré de la ponte. La ponte dure de 8 à 16 heures. Au début de la ponte, les femelles X. laevis sont transférées dans la solution de ponte (120mM NaCl, 1mM KCl, 4mM NaHCO3, 1,7mM MgSO4, 30mM Tris, 0,3mM Ca(NO3)2.4H2O, 0,06mM CaCl2.2H2O, pH 7,8 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca). Cette solution à concentration élevée en sels, permet aux oeufs de rester fécondables durant plusieurs heures. 4.1.2. Dissection des testicules Les mâles sont anesthésiés dans une solution de 0,1% de 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS 222; Sigma) avant d’être décapité. Afin d’isoler les testicules, une incision est pratiquée au niveau de l’abdomen à travers la peau et les muscles de façon à exposer les viscères. Les testicules sont débarrassés des corps adipeux. Les testicules de X. laevis sont récupérés dans 5ml d’une solution de stockage (125mM NaCl, 3,75mM KCl, 1,5mM NaH2PO4, 7,5mM HEPES, 1,5mM MgCl2.6H2O, 1,5mM CaCl2, 5,7mM NaOH, pH 7,8 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca). Dans cette solution, les spermatozoïdes restent en vie plusieurs jours à 4°C. 4.1.3. Fécondation in vitro et culture des embryons Les oeufs de X. laevis sont récoltés dans la solution de ponte à l’aide d’une pipette et transférés dans une boîte de Pétri. La solution de ponte est éliminée et les oeufs sont fécondés en les incubant 3 minutes dans quelques gouttes de solution de stockage dans laquelle un morceau de testicule a été broyé. Les spermatozoïdes sont activés par la dilution de la solution de stockage de testicule, diminuant ainsi la concentration en sels dans la solution. Pour ce faire, la boîte de Pétri contenant les oeufs est remplie de milieu de 0,1X MBS (Modified Barth Saline ; MBS 10X 88mM NaCl, 1mM KCl, 2,4mM NaHCO3, 0,82mM MgSO4.7H2O, 0,33mM Ca(NO3)2.4H2O, 0,41mM CaCl2.6H2O, pH 7,5 à ajuster avant d’ajouter les sels de Ca et de Mg). La première division cellulaire apparaît 1 heure après la fécondation lorsque les embryons sont maintenus à température ambiante. Les embryons sont cultivés dans du milieu 0,1X MBS et s’y développeront plus ou moins rapidement suivant la température d’incubation (14°C, 18°C ou température ambiante). Les embryons sont récoltés au stade désiré défini selon les tables de Nieuwkoop and Faber (Nieuwkoop and Faber, 1967). VII Matériel et Méthodes 4.2. Micro-injection Afin de les débarrasser de leur gangue, les embryons de X. laevis sont traités 8-10 minutes dans une solution 2% de cystéine (Sigma; 2% cystéine dans du MBS 0,1X, pH 8,0). Ils sont ensuite rincés dans du milieu 0,1X MBS et sont placés dans la solution d’injection contenant du Ficoll (Sigma; 1% Ficoll dans du 0,5X MBS). Les micro-injections sont réalisées sous une loupe binoculaire à l’aide d’un micromanipulateur MM3 (Märhauser Wetzlar) et d’un microinjecteur (PicoSpritzer II). Les aiguilles en verre sont obtenues en étirant des capillaires en verre (Harvard Apparatus) à l’aide d’une étireuse P87 (Sutter Instrument). Un volume de 5nl de solutions d’ARNm synthétiques ou de morpholinos est injecté dans les embryons. Les concentrations des ARNm synthétiques utilisées varient de 0,2ng/µl à 200ng/µl, permettant d’injecter respectivement de 1pg à 1ng dans un volume de 5nl. Les stocks de morpholinos à une concentration de 40ng/5nl (environ 1mM) sont dilués de manière à injecter 20 à 5ng de morpholinos dans un volume de 5nl. Les volumes injectés sont calibrés sous la loupe binoculaire, à l’aide d’un réticule, en ajustant le diamètre de la goutte injectée par variation du temps d’injection. Environ deux heures après l’injection, les embryons de X. laevis sont transférés dans du milieu 0,1X MBS afin qu’ils puissent continuer leur développement. 4.3. Manipulation des embryons et dissection de calottes animales Afin de sélectionner les embryons albinos vivants de X. laevis et de déterminer leur stade de développement, ceux-ci sont colorés dans une solution contenant un colorant vital bleu : le Nile blue (0,01% Nile blue, 45mM K2HPO4, 5mM KH2PO4, pH 7,8). Dans le cas d’injections d’ARNm codant pour des protéines de fusion inductibles aux glucocorticoïdes, de la dexaméthasone (Sigma), un analogue de glucocorticoïde a été ajoutée au milieu de croissance des embryons (0,1X MBS) au stade désiré à une concentration finale de 10µM. Un stock de dexaméthasone est préparé dans de l’éthanol à une concentration de 10mM et est conservé à -20°C. Les explants de calottes animales sont disséqués au stade blastula tardive (stade 9) et sont cultivés dans du milieu 1x Steinberg (58mM NaCl, 0,67mM KCl, 0,34mM Ca(NO3)2, 0,83 MgSO4, 3mM HEPES, 100mg/l de sulfate de kanamycine, pH 7,8) contenant 0,1% de BSA. Les embryons sont débarrassés de leurs membranes vitellines à l’aide de forceps et les calottes animales sont disséquées avec un cil collé sur une pipette Pasteur. VIII Matériel et Méthodes 4.4. Fixation et révélation de l’activité enzymatique de la β-galactosidase Les embryons sont placés dans des tubes en verre de 5ml et sont fixés une heure dans du MEMFA (0,1M MOPS, 2mM EGTA, 1mM MgSO4, 3,7% formaldéhyde, pH 7,4). Ils sont ensuite transférés dans de l’éthanol et conservés à -20°C. Les embryons injectés avec de l’ARNm codant pour la β-galactosidase sont fixés 40 minutes dans du MEMFA et lavés dans du tampon phosphate (23mM K2HPO4, 77mM KH2PO4, pH 6,3) pendant 15 minutes. Ils ont ensuite incubés à température ambiante dans du tampon de coloration (23mM K2HPO4, 77mM K2HPO4, 10mM K3Fe(CN)6, 10mM K4Fe(CN)6) contenant 0,15% de X-Gal (5-bromo 4-chloro-3indolyl-βgalactopyranoside ; Bioline) ou 0,15% de Red-Gal (6-chloro 3-indolyl-β-D-galactoside ; Research Organics) faisant apparaître un marquage respectivement bleu ou rouge. Les embryons sont ensuite fixés de nouveau 20 minutes dans du MEMFA et transférés dans de l’éthanol, dans lequel ils sont conservés à -20°C. 5. Hybridations in situ sur embryons entiers Les expériences d’hybridation in situ sont réalisées sur des embryons entiers selon une méthode de détection non radioactive. Les embryons de xénope, conservés dans de l’éthanol à -20°C, sont progressivement réhydratés à température ambiante. Pour ce faire, ils sont successivement lavés pendant 5 minutes dans des solutions contenant 75% 50% puis 25% d’éthanol dans du PTw et finalement dans du PTw 100% (0,1% Tween-20 dans du 1x PBS). Les embryons sont lavés 3 x 5 minutes dans la solution de PTw. Un traitement de 5-10 minutes dans 2ml de PTw contenant 10mg/ml de protéinase K (Roche) permet de perméabiliser les embryons. Ils sont ensuite incubés 2 x 5 minutes dans une solution de triéthanolamine (0,1M Triéthanolamine, pH 7,5). Après la fin du 2 ème lavage dans la solution de triéthanolamine, la solution est additionnée de 12,5µl d’acide acétique anhydre et les embryons sont incubés 5 minutes dans cette solution sous agitation. Le même volume d’acide acétique anhydre est à nouveau ajouté pour le même temps d’incubation. Les embryons sont refixés pendant 20 minutes dans une solution contenant 4% de formaldéhyde dans du PTw et sont rincés par 5 lavages de 5 minutes dans du PTw. Ils sont ensuite préhybridés 4 heures à 65°C dans du tampon d’hybridation pour embryons de xénope (SSC 5x pH 7,0, 50% formamide, 100µg/ml héparine, 1mg/ml torula RNA, 1x Denhart’s, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10mM EDTA). Après la préhybridation, les embryons sont incubés dans 1ml de tampon d’hybridation contenant la sonde ARN antisens marquée à la digoxigénine (1µg/ml) pendant une IX Matériel et Méthodes nuit à 65°C. La sonde non hybridée est éliminée par 3 lavages de 20 minutes dans du SSC 2x à 65°C puis par traitement à la RNase A (Sigma; 20µg/ml) et RNase T1 (Sigma; 10u/ml) pendant 30 minutes à 37°C. Les embryons sont ensuite lavés 2 x 30 minutes dans du SSC 0,2x. La sonde est détectée à l’aide d’un anticorps dirigé contre la digoxigénine. Pour cela, les embryons sont lavés 2 x 15 minutes à température ambiante dans du tampon MAB (100mM acide maléique, 0,8% NaOH, 150mM NaCl, pH 7,5). Les embryons sont incubés 1 heure à température ambiante dans une solution de MAB contenant 2% de BMB (Boeringher Mannheim Blocking; Roche) et 20% de sérum d’agneau (Invitrogen) et ensuite 4 heures dans la même solution additionnée de l’anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline (Roche) dilué à 1/2000. Les embryons sont lavés dans du tampon MAB 4 x 10 minutes, sous agitation, à température ambiante, ainsi qu’un lavage supplémentaire durant la nuit à 4°C, de manière à éliminer l’excès d’anticorps. Les embryons sont lavés 2 x 5 minutes à température ambiante dans du tampon AP (Alkaline Phosphatase buffer; 100mM Tris-HCl pH 9,5, 50mM MgCl2, 100mM NaCl, 0,1% Tween-20). La réaction chromogénique est réalisée en présence de 4,5 µl de NBT (Roche; Nitro Blue Tetrazolium, 75mg/ml dans une solution aqueuse de diméthylformamide 70% concentrée) et de 3,5µl de BCIP (Roche; 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate, 50mg/ml dans du diméthylformamide 100%) pour 1ml de tampon AP. Ces réactifs génèrent un précipité de couleur bleue foncée, après réaction avec la phosphatase alcaline. La réaction est arrêtée par incubation des embryons dans une solution de MEMFA. Le marquage non spécifique est éliminé par plusieurs lavages dans l’éthanol. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA. Pour les doubles hybridations in situ, les deux sondes, l’une marquée à la digoxigénine et l’autre à la fluorescéine sont hybridées simultanément et visualisées séquentiellement à l’aide des anticorps correspondants couplés à la phosphatase alcaline (Roche). La première sonde marquée à la fluorescéine est révélée par une réaction chromogénique à l’aide de BCIP, générant un précipité de couleur turquoise. La réaction est arrêtée par deux lavages de 30 minutes dans du méthanol 100%. Les embryons sont ensuite lavés 5 x 10 minutes dans du tampon MAB et incubés en présence de l’anticorps dirigé contre la digoxigénine comme décrit précédemment. Après lavage des embryons dans du tampon MAB, la seconde sonde est révélée au NBT et BCIP comme décrit plus haut. Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur une loupe binoculaire Leica MZFLIII. X Matériel et Méthodes 6. Immunohistochimie et test TUNEL sur embryons entiers 6.1. Analyse de la prolifération : Immunohistochimie sur embryons entiers Afin de visualiser les cellules en cours de prolifération dans des embryons entiers, des expériences d’immunohistochimie ont été réalisées à partir d’embryons injectés avec différents ARNm et/ou morpholinos. La rhodamine dextran (RLDx, Invitrogen), qui est un composé fluorescent émettant dans le rouge (lumière visible), a été utilisée comme traceur au lieu de l’activité de la β-galactosidase, afin de ne pas confondre la coloration X-gal et le marquage de l’immunohistochimie. Après injection, les embryons sont divisés en 2 groupes selon que la partie gauche ou droite de l’embryon est injectée, ils sont ensuite fixés 1 heure dans du MEMFA et sont stockés dans l’ethanol à -20°C. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25% d’éthanol dans du 1x PBS. Un traitement de 3 minutes dans du 1x PBS contenant 10mg/ml de protéinase K (Roche) permet de perméabiliser les embryons, suivi de 3 lavages de 5 minutes dans du 1x PBS. Ils sont ensuite lavés 2 x 10 minutes dans du PBT (0,5% Triton-X100, 2mg/ml BSA dans du 1x PBS). Afin d’éviter les liaisons aspécifiques d’anticorps, les embryons sont incubés 4 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de PBT contenant 20% de sérum de chèvre. Les embryons sont ensuite incubés en présence de l’anticorps primaire anti-phosphoHistone 3 (Rabbit anti-pH3, UPSTATE) qui permet de détecter les cellules en phase M (mitose) dilué 1/250, dans du PBT contenant 20% de sérum de chèvre, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du PBT. L’anticorps primaire est ensuite détecté par un anticorps secondaire antiIgG de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti-rabbit IgG-AP, CHEMICON) dilué 1/500, dans du PBT contenant 20% de sérum de chèvre, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps secondaire est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du PBT. Les embryons sont ensuite lavés 2 x 10 minutes dans du tampon AP. La réaction chromogénique est réalisée en présence de 4,5µl de NBT et de 3,5µl de BCIP pour 1ml de tampon AP. La réaction est arrêtée par incubation des embryons dans une solution de MEMFA durant 20 minutes. Le marquage non spécifique est éliminé par plusieurs lavages dans l’éthanol. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA. XI Matériel et Méthodes 6.2. Analyse de l’apoptose : test TUNEL sur embryons entiers Afin de visualiser les cellules apoptotiques dans des embryons entiers, des expériences de test TUNEL ont été réalisées à partir d’embryons injectés avec différents ARNm et/ou morpholinos. La rhodamine dextran a été utilisée comme décrit précédemment et les embryons ont été stockés à -20°C dans de l’éthanol après fixation. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25% d’éthanol dans du 1x PBS. Ils sont lavés 2 x 10 minutes dans du 1x PBS. Ensuite, les embryons sont successivement lavés 3 x 5 minutes dans une solution de PTw (0,1% Tween-20 dans du PBS 1x), 1x 15 minutes dans une solution de PTw 0,2% Tween-20 et 1x 30 minutes dans une solution de PTw 0,5% Tween-20 pour perméabiliser les embryons. Après, les embryons sont rincés 3x 10 minutes dans du 1x PBS afin d’éliminer les détergents (Tween-20) qui pourraient inhiber la réaction enzymatique. Ils sont préincubés 1 heure à température ambiante dans du tampon TDT (200µl de 1x PBS + 50µl de tampon 5x TDT, Invitrogen). Après préincubation, les embryons sont soumis à une réaction enzymatique à température ambiante durant la nuit et sous agitation. Pour ce faire, de la digoxigénine-11-dUTP est ajoutée par une terminal désoxynucléotide transférase (TDT, Invitrogen) aux extrémités terminales de l’ADN génomique (2,5µl de TDT + 2µl de dig-11-dUTP + 50µl de tampon 5x TDT + 200µl de 1x PBS par réaction). Les cellules en apoptose ou en nécrose incorporeront une quantité plus importante de dig-11-dUTP en raison de la fragmentation de leur ADN génomique. La réaction enzymatique est bloquée par 2 lavages de 30 minutes dans une solution de 1x PBS + 2mM EDTA à 65°C, suivi de 3x 10 minutes dans du 1x PBS à température ambiante. Les fragments d’ADN génomique marqués avec la digoxigénine-11-dUTP sont détectés à l’aide d’un anticorps dirigé contre la digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline. La suite de la procédure est identique au protocole d’hybridation in situ sur embryons entiers. 6.3. Détection de protéines phosphorylées endogènes : Immunohistochimie sur embryons entiers Afin de visualiser les cellules exprimant de manière endogène la protéine Stat3 phosphorylée dans des embryons entiers, des expériences d’immunohistochimie ont été réalisées à partir d’embryons de stades différents. Les embryons ont d’abord été coupés en deux parties égales pour permettre une meilleure pénétration de l’anticorps. Les embryons sont progressivement XII Matériel et Méthodes déshydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 25%, 50% et 75% de DENT’s fix (80% méthanol, 20% DMSO) dans du 1x PBS et sont stockés dans le DENT’s fix à -20°C durant une nuit minimum. Ensuite, les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante par des incubations de 5 minutes dans des solutions contenant 75%, 50% et 25% de DENT’s fix. Ils sont ensuite lavés 3 x 10 minutes dans du TBST (0,1% Tween-20, 50mM Tris pH7,5, 150mM NaCl). Afin d’éviter les liaisons aspécifiques d’anticorps, les embryons sont incubés 4 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de TBST contenant 5% de BSA. Les embryons sont ensuite incubés en présence de l’anticorps primaire anti-phospho-Tyrosine705-Stat3 (Rabbit anti-pTyr705-Stat3, Cell Signaling) dilué 1/300, dans du TBST contenant 5% de BSA, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et sous agitation dans du TBST contenant 0,2% de BSA. Les embryons sont incubés 2 heures à température ambiante, sous agitation, dans une solution de TBST contenant 5% de BSA. L’anticorps primaire est ensuite détecté par un anticorps secondaire anti-IgG lapin couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti-rabbit IgG-AP, CHEMICON) dilué 1/500, dans du TBST contenant 5% de BSA, une nuit à 4°C sous agitation. L’excès d’anticorps secondaire est éliminé par 5 lavages d’une heure à température ambiante et 1 lavage durant la nuit à 4°C et sous agitation dans du TBST contenant 0,2% de BSA. La réaction chromogénique est réalisée comme pour le protocole d’immunohistochimie décrit ci-dessus. Les embryons sont ensuite conservés dans du MEMFA. 7. Sections d’embryons Une première couche de gélatine-albumine est coulée dans un moule à partir de 2 ml de solution de gélatine - albumine (4mg/ml gélatine, 0,27g/ml de BSA, 0,18mg/ml sucrose dans du 1x PBS) et de 140 µl de glutaraldéhyde 25%. Le mélange se fait sur glace pour diminuer la vitesse de polymérisation provoquée par la glutaraldéhyde. Ensuite, l'embryon analysé en hybridation in situ et préalablement équilibré dans la solution de gélatine - albumine est déposé sur la couche solidifiée. Une seconde couche est coulée au-dessus de la première. Une fois la solution solidifiée, un cube est découpé dans la gélatine autour de l’embryon et collé sur le support du vibratome (752/M vibroslice tissue cutter, Campden Instruments Limited) selon l’orientation désirée. Les sections réalisées présentent une épaisseur comprise entre 30 et 45µm. Elles sont XIII Matériel et Méthodes montées entre lames et lamelles dans une solution de 90% glycérol dans du 1x PBS et sont conservées à 4°C. Les images ont été obtenues à l’aide d’une caméra vidéo Sony DXC9100P adaptée sur un microscope Zeiss Axioskop 2. 8. Coloration du cartilage au Bleu d’Alcian Les embryons contrôles ou injectés avec des ARNm ou morpholinos expérimentaux sont récoltés aux stades têtard (42-45) et sont fixés 1 heure dans du MEMFA à température ambiante. Ils sont ensuite déshydratés dans de l’éthanol 100% 5 x 5 minutes avant d’être incubés dans une solution de Bleu d’Alcian (15ml d’acide acétique, 35ml d’éthanol 100%, 20mg de Bleu d’Alcian, Sigma) durant 3 jours sous agitation et à température ambiante. Après, la solution de Bleu d’Alcian est enlevée par 3 lavages de 15 minutes dans de l’éthanol 95%. Les embryons sont progressivement réhydratés à température ambiante dans une solution contenant 2% de KOH. Pour ce faire, ils sont successivement lavés pendant 10 minutes dans des solutions contenant 75% 50% puis 25% d’éthanol dans la solution de 2% KOH et 3 x dans la solution de 2% KOH. Ensuite, les embryons sont lavés successivement avec des solutions contenant 20%, 40% puis 60% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant 1 heure sous agitation. Finalement, les embryons sont lavés avec une solution contenant 80% de glycérol dans la solution de 2% KOH durant une nuit sous agitation. Les embryons sont ensuite conservés dans du 80% de glycérol/2% KOH à 4°C. 9. Analyse de protéines 9.1. Extraction des protéines totales Les explants de calottes animales (30 par échantillon analysé) sont lysés 10 minutes sur glace dans 150µl de tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,5% NP40, 20µM PMSF). Une pastille d’inhibiteurs de protéases (Complete Mini EDTA-free, Roche) est ajoutée pour 10ml de tampon de lyse. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C et les surnageants sont récupérés. Un volume de 100µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 25µl de tampon Laemmli 5x (tampon Laemmli 5x : 0.5M Tris-HCl pH 6.8, 5% β-Mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol Blue, 20% Glycerol). Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. XIV Matériel et Méthodes 9.2. Immunoprécipitations Afin d’étudier les interactions biochimiques entre protéines, celles-ci ont été produites par surexpression dans des embryons injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec leur ARNm correspondant. Les embryons injectés sont récoltés aux stades gastrula et stockés à -70°C. D’abord, des billes de sépharose couplées à la protéine A (ProteinA Sepharose Fast flow, GE Healthcare) 50% sont préparées. 500µl de ces billes sont prélevées du stock auquel 10ml de tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,2% NP40, 20µM PMSF) est ajouté afin de laver les billes. Les billes sont centrifugées 2 minutes à 2000rpm et le surnageant est enlevé. L’opération est répétée 2 x et les billes sont ensuite incubées dans du tampon de lyse plus 0,1% BSA durant 1 heure sous agitation à 4°C. Les billes sont de nouveau lavées et centrifugées 3x. Le surnageant est enlevé et 500µl de tampon de lyse est ajouté aux billes de manière à obtenir des billes 50%. 50 embryons par échantillon analysé sont lysés 10 minutes sur glace dans 400µl de tampon de lyse froid plus inhibiteurs de protéases. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C, les surnageants sont récupérés et un volume égal (400µl) de 1,1,2-Trichloro-Trifluoroethan (Merck) est ajouté. Les échantillons sont vortexés 1 minute et une nouvelle centrifugation est effectuée à 14000rpm pendant 5 minutes de manière à éliminer les lipides et les débris cellulaires. Les surnageants sont de nouveau récupérés et sont préadsorbés avec 25µl de billes de sépharose couplées à la protéine A durant 1 heure, sous agitation à 4°C. Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 2 minutes à 4°C, les surnageants sont récupérés et un volume de 30µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 6µl de tampon Laemmli 5x. Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. 1 à 2µl d’anticorps primaire (Anti-Flag, M2, Sigma ; anti-Myc, clone 9E10, Sigma ; anti-HA, clone HA-7, Sigma) sont ajoutés au reste du surnageant. Les échantillons sont mis sous agitation durant 1 heure à 4°C. Après, 30µl de billes sont ajoutées et les échantillons sont de nouveau mis sous agitation, 1 heure à 4°C. Ensuite, les échantillons sont centrifugés 2 minutes à 2000rpm, le surnageant est éliminé et 1ml de tampon de lyse est ajouté pour laver les billes auxquelles l’anticorps et les protéines d’intérêts sont fixés. L’opération est répétée 2 x. Le surnageant est éliminé et 15µl de tampon Laemmli 2x est ajouté. Les échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. XV Matériel et Méthodes 9.3. Western blot Les échantillons sont bouillis 5 minutes afin de dénaturer les protéines. Les échantillons sont séparés et analysés par électrophorèse sur gel SDS-PAGE dans du tampon de migration (12g de Tris, 57,6g de Glycine, 40ml de SDS 10% , 4 litres d’eau milli Q). Ils sont ensuite transférés sur une membrane PVDF (PolyVinylidine DiFluoride, Biorad), préalablement incubée 2 minutes dans du méthanol 100%, dans du tampon de transfert (23,24g de Tris, 11,6g de Glycine, 20ml de SDS 10%, 3 litres d’eau milli Q, 1 litre de méthanol 100%) 2 heures à 100V à 4°C. Les membranes sont rincées dans du TBST (50mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween-20) et sont incubées, 1 heure à température ambiante sous agitation, dans une solution de saturation (3-5% lait en poudre écrémé dans du TBST). Elles sont ensuite incubées en présence de l’anticorps primaire à la concentration appropriée (Anti-Myc, à 1/10000; Anti-Flag, à 1/1000; Anti-HA, à 1/1000; Anti-Stat3, clone C-20, Santa Cruz, à 1/1000; Anti-GAPDH, Abcam, à 1/5000; Anti-GFAP, DAKO, à 1/1000) dilué dans du TBST + 3-5% de lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est ensuite lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante et incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Anti-souris, Jackson immunosource, à 1/30000; Anti-lapin (Protéine A-peroxydase), Sigma, à 1/10000) dilué dans du TBST + 3-5% lait en poudre, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est lavée 5 x 5 minutes dans du TBST à température ambiante. Les protéines sont détectées par chémiluminescence à l’aide du kit ECL™ Western Blotting ou ECL plus™ Western Blotting (GE Healthcare) sur film autoradiographique (Super Rx, Fujimedical). Après révélation des protéines, les membranes PVDF peuvent être réutilisées 1 à 2 x afin de détecter d’autres protéines sur la même membrane. Pour ce faire, les anticorps primaires et secondaires utilisés lors de la première détection sont éliminés de la membrane sans pour autant affecter les protéines transférées préalablement sur la membrane. La membrane est d’abord lavée 10 minutes dans du TBST et incubée 30 minutes à 55°C dans une solution de stripping (3,8g de Tris, 10g de SDS, 500ml d’eau milli Q, pH 6,7) à laquelle 750µl de β-Mercaptoethanol est ajouté par 50ml de solution de stripping. Ensuite, la membrane est lavée 3 x 10 minutes dans du TBST. La suite de la procédure est identique à celle décrite ci-dessus à partir de l’étape de saturation (1 heure dans du TBST + 3-5% de lait en poudre) jusqu’à la détection chemiluminescente des protéines. XVI Matériel et Méthodes 9.4. Western blot sur des échantillons contenant des phospho-protéines Pour la détection de la protéine Stat3 phosphorylée (pTyr705-Stat3), les explants de calottes animales (30 par échantillon analysé) sont lysés 15 minutes sur glace dans 90µl de solution phospho ready (tampon RIPA (0,1% NP40, 20mM Tris-HCl, pH 8, 10% glycérol, 1mM EDTA) plus une pastille d’inhibiteurs de protéases par ml de tampon RIPA auquel on ajoute 900µl de phospho stay solution (Novagen) pour 100µl de tampon RIPA). Les échantillons sont centrifugés à 14000rpm pendant 5 minutes à 4°C et les surnageants sont récupérés. Un volume de 60µl est prélevé à partir de chaque échantillon, auquel est ajouté 15µl de tampon Laemmli 5x. Ces échantillons sont conservés à -70°C en prévision de l’analyse par western blot. La détection des phospho-protéines est identique à la procédure décrite ci-dessus à l’exception que du TBST contenant 3% de BSA au lieu de 3-5% de lait en poudre est utilisé lors des étapes de saturation et d’incubation avec les anticorps primaires et secondaires. L’incubation en présence de l’anticorps primaire (Anti-pTyr705-Stat3, Cell Signaling, à 1/1000) dilué dans du TBST + 3% BSA est réalisée durant la nuit à 4°C sous agitation. Après lavages, la membrane est incubée avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Protéine A-peroxydase, à 1/10000) dilué dans du TBST + 3% BSA, pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. La membrane est de nouveau lavée et les protéines sont détectées à l’aide du kit ECL plus™ Western Blotting. 10. PCR quantitatives (qPCR) Les embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec différents ARNm ou morpholinos expérimentaux. Les explants de calottes animales (20 par échantillon analysé) sont disséqués au stade blastula et sont récoltés à l’équivalent des stades neurula ou bourgeon caudal. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit RNeasy mini (Qiagen). La qualité des ARN totaux est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. Ensuite, une PCR est réalisée avec les amorces Histone 4 (H4) afin de vérifier que les ARN totaux ne contiennent pas d’ADN génomique. Après vérification, l’ADN complémentaire (ADNc) est synthétisé avec le kit iScript cDNA synthesis (Biorad). 500ng d’ARN total sont utilisés pour la transcription inverse par reaction. Chaque réaction est diluée 2,5 x pour être utilisée dans la reaction de PCR quantitative (qPCR). La réaction de qPCR a été réalisée en utilisant le kit qPCR core kit for SYBR Green I (Eurogentec) suivant le protocole recommandé par la firme. Brièvement, une courbe d’étalonnage a été réalisée en diluant 4 x un plasmide contenant la séquence d’intérêt (de 107 à 10 4 copies) XVII Matériel et Méthodes pour chaque paire d’amorce utilisée. La quantité de fragments PCR amplifiés à partir des ADNc synthétisés provenant des ARNm des gènes d’intérêts produits par la réaction de qPCR a été détectée grâce à un lecteur Gene Amp TM PCR system 9600 (Perkin Elmer Biosystem) et analysés avec le programme Gene Amp 5700 SDS. La valeur obtenue de chaque échantillon a été normalisée avec la valeur de GAPDH, un gène ubiquitaire. Les paires d’amorces utilisées sont reprises dans le tableau 4 présenté en pages XVIII-XIX. Gène Espèce Séquence des amorces BMP4 X.Laevis Fw: 5’-AAGAGGATGAGCTGCACGAT-3’ Rangement Origine n°18 Nichane et al., 2008a n°40 Nichane et al., 2008a n°16 Nichane et al., 2008a n°27 Nichane et al., 2008a n°17 Nichane et al., 2008a n°33 Nichane et al., 2008a Rev: 5’-GCTGCTGAGGTTGAACACAA-3’ Epi. Keratin X.Laevis Fw: 5’-CTCACTTTGCCAGCACTCTG-3’ Rev: 5’-GTGATAGCAATGGCCTTCGT-3’ ESR6e X.Laevis GAPDH X.Laevis Fw: 5’-CTGCTTCCAGAAAATGCACA-3’ Rev: 5'-CAGGGAGGCAAGAATCAGTC-3’ Fw: 5’-TAGTTGGCGTGAACCATGAG-3’ Rev : 5’-GCCAAAGTTGTCGTTGATGA-3’ Hairy2 X.Laevis Fw : 5’-TGACAGTCAAGCACCTACGG-3’ Rev : 5’-CTGGTCCTCACTTCGGTGTT-3’ Id3 X.Laevis N-Tubulin X.Laevis Fw: 5’-AAAGCCATCAGCCCAGTG-3’ Rev: 5’-AGTGGCAGACGCTGGTGT-3’ Fw: 5’-CAATACCGAGCCCTGACAGT-3’ Nichane et al., 2008a Rev: 5’-CTGTGAGGTAGCGTCCATGA-3’ Six1 X.Laevis Fw: 5’-GCGATCACCTCCACAAGAAT-3’ n°64 Nichane et al., 2008a n°15 Nichane et al., 2008a n°39 Nichane et al., 2008a n°29 Nichane et al., 2008a n°28 Nichane et al., 2008a n°19 Nichane et al., 2008b n°35 Nichane et al., 2008b n°68 Nichane et al., 2009 n°73 Nichane et al., 2009 n°74 Nichane et al., 2009 n°69 Nichane et al., 2009 Rev: 5’-AGTGGTCTCCCCCTCAGTTT-3’ Snail2 X.Laevis Sox3 X.Laevis Fw: 5’-CACACGTTACCCTGCGTATG-3’ Rev: 5'-TCTGTCTGCGAATGCTCTGT-3’ Fw: 5’-TACCTGTGCTGGATCTGCTG-3’ Rev: 5’-AGACACTTACGCGCACATGA-3' Sox9 X.Laevis Fw: 5’-GCAATTTTCAAGGCCCTACA-3’ Rev: 5’-GCTGCCTACCATTCTCTTGC-3’ Sox10 X.Laevis Delta1 X.Laevis Fw: 5’-TGCTCACTCCAGTCCAGATG-3’ Rev: 5’-ACCAATGTCCAGTCGTAGCC-3’ Fw: 5’-CAATGTGCACGAGGTTATGG-3’ Rev: 5’-AGCAATCCATGGGAACTGTC-3’ SoxD X.Laevis Fw: 5’-TATGGGTACCTCCCCTACCC-3’ Rev: 5’-TCCAGGGTTTGGTACTGGAC-3’ CDK4 X.Laevis CyclinD1 X.Laevis Fw: 5’-TGAACCTGTCGCAGAGATTG-3’ Rev: 5’-GACCGTAGAGAGGGGGAGTC-3’ Fw: 5’-ACCGCAGAGAAACTTTGCAT-3’ Rev: 5’-GCGGATGATCTGCTTGGTAT-3’ HoxB9 X.Laevis Fw: 5’-CTGGGACCCCAACATTACAC-3’ Rev: 5’-TGTTTTGATGAGTCCGGTCA-3’ p27XIC1 X.Laevis Fw: 5’-AAGAAATGATCGCATCC-3’ Rev: 5’-CTCTTCAGCTCCGACCTCAG-3’ XVIII Matériel et Méthodes Pax8 X.Laevis Fw: 5’-CTCTCGACCCACCAAGGATA-3’ n°23 Nichane et al., 2009 n°21 Nichane et al., 2009 Rev: 5’-CAGGAAGGTGGGGCTACATA-3’ Sox2 X.Laevis Fw: 5’-TGCGTCCAACAACCAGAATA-3’ Rev: 5’-TTGCTGATCTCCGAGTTGTG-3’ Tableau 4. Amorces utilisées pour les expériences de PCR quantitatives 11. Mesure et mise en évidence de l’activité rapportrice luciférase Des embryons ont été injectés dans chaque blastomère au stade 4 cellules avec 100pg de plasmide rapporteur pTATA-TK-Luc-4xM67 (Adgene; Besser et al., 1999) contenant 4 sites de liaison au facteur de transcription Stat3 et la séquence codant pour la luciférase firefly ainsi que divers ARNm ou morpholinos expérimentaux. 2pg de plasmide phRL contenant un promoteur ubiquitaire et la séquence codant pour la luciférase rénilla a également été co-injecté pour servir de contrôle de normalisation. Les explants de calottes animales (20 par échantillon analysé) sont disséqués au stade blastula et sont récoltés à l’équivalent du stade gastrula. L’activité des luciférases rénilla et firefly est mesurée en utilisant le kit Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega) avec un luminomètre TD-20/20 (Programme DLR, temps d’intégration 10s, temps de délai 2s). Les échantillons sont lysés dans 100µl de tampon PLB (Passive Lysis Buffer) et 20µl du lysat sont prélevés et ajoutés à 100µl de LAR II (Luciférase Assay Reagent II). Les échantillons sont vortexés et l’activité rapportrice de la luciférase firefly est d’abord mesurée. Ensuite, 100µl de solution Stop & Glo est ajoutée, les échantillons sont vortexés et l’activité rapportrice de la luciférase rénilla est mesurée. Le rapport entre les valeurs obtenues pour la luciférase firefly et la luciférase rénilla (contrôle interne) est calculé par le luminomètre. 12. Microscopie fluo ou confocale Des explants de calottes animales provenant d’embryons injectés dans chaque blastomere au stade 4 cellules avec des ARNm codant pour des protéines fusions GFP seuls ou avec un ARNm codant pour une RFP membranaire (mRFP) ont été récoltés et fixés 1 heure dans du MEMFA. Les explants ont ensuite été brièvement lavés dans du PBS 1x et sont incubés 5 minutes dans du PBS 1x contenant du DAPI (1µg/ml, Sigma) avant d’être de nouveau lavé 2 x 5 minutes dans du PBS 1x. Les explants sont montés entre lames et lamelles dans du milieu de montage Vectashield XIX Matériel et Méthodes (Vectorlabs). La fluorescence a été observée à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Zeiss Axioplan II) ou un microscope confocal (Leica DM IRE2). 13. Bioinformatique Les analyses de séquences nucléiques et protéiques sont effectuées par le programme Blast sur le site de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) et par le programme Vector NTI (Invitrogen). XX Références Annexe II. Références Abu-Elmagd,M., Garcia-Morales,C., and Wheeler,G.N. (2006). Frizzled7 mediates canonical Wnt signaling in neural crest induction. Dev. Biol. 298, 285-298. Acloque,H., Adams,M.S., Fishwick,K., Bronner-Fraser,M., and Nieto,M.A. (2009). Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119, 1438-1449. Agius,E., Oelgeschläger,M., Wessely,O., Kemp,C., and De Robertis,E.M. (2000). Endodermal Nodal-related signals and mesoderm induction in Xenopus. Development 127, 1173-1183. Ahrens,K., and Schlosser,G. (2005). Tissues and signals involved in the induction of placodal Six1 expression in Xenopus laevis. Dev. Biol. 288, 40-59. Akira,S., Nishio,Y., Inoue,M., Wang,X.J., Wei,S., Matsusaka,T., Yoshida,K., Sudo,T., Naruto,M., and Kishimoto,T. (1994). Molecular cloning of APRF, a novel IFN-stimulated gene factor 3 p91-related transcription factor involved in the gp130-mediated signaling pathway. Cell 77, 63-71. Alfandari,D., Cousin,H., Gaultier,A., Smith,K., White,J.M., Darribère,T., and DeSimone,D.W. (2001). Xenopus ADAM 13 is a metalloprotease required for cranial neural crest-cell migration. Curr. Biol. 11, 918-930. Alonzi,T., Maritano,D., Gorgoni,B., Rizzuto,G., Libert,C., and Poli,V. (2001). Essential role of STAT3 in the control of the acute-phase response as revealed by inducible gene inactivation [correction of activation] in the liver. Mol. Cell Biol. 21, 1621-1632. Aoki,Y., Saint-Germain,N., Gyda,M., Magner-Fink,E., Lee,Y.H., Credidio,C., and Saint-Jeannet,J.P. (2003). Sox10 regulates the development of neural crest-derived melanocytes in Xenopus. Dev. Biol. 259, 19-33. Arbouzova,N.I., and Zeidler,M.P. (2006). JAK/STAT signalling in Drosophila: insights into conserved regulatory and cellular functions. Development 133, 2605-2616. Artavanis-Tsakonas,S., Rand,M.D., and Lake,R.J. (1999). Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science 284, 770-776. Axelson,H. (2004). The Notch signaling cascade in neuroblastoma: role of the basic helix-loop-helix proteins HASH-1 and HES-1. Cancer Lett. 204, 171-178. Aybar,M.J., and Mayor R. (2002). Early induction of neural crest cells: lessons learned from frog, fish and chick. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 452-458. Aybar,M.J., Nieto,M.A., and Mayor,R. (2003). Snail precedes slug in the genetic cascade required for the specification and migration of the Xenopus neural crest. Development 130, 483-494. Bae,Y.K., Shimizu,T., and Hibi,M. (2005). Patterning of proneuronal and inter-proneuronal domains by hairyand enhancer of split-related genes in zebrafish neuroectoderm. Development 132, 1375-1385. Baek,J.H., Hatakeyama,J., Sakamoto,S., Ohtsuka,T., and Kageyama,R. (2006). Persistent and high levels of Hes1 expression regulate boundary formation in the developing central nervous system. Development 133, 24672476. Bai,G., Sheng,N., Xie,Z., Bian,W., Yokota,Y., Benezra,R., Kageyama,R., Guillemot,F., and Jing,N. (2007). Id sustains Hes1 expression to inhibit precocious neurogenesis by releasing negative autoregulation of Hes1. Dev. Cell 13, 283-297. Bange,J., Prechtl,D., Cheburkin,Y., Specht,K., Harbeck,N., Schmitt,M., Knyazeva,T., Müller,S., Gärtner,S., Sures,I., Wang,H., Imyanitov,E., Häring,H.U., Knayzev,P., Iacobelli,S., Höfler,H., and Ullrich,A. (2002). Cancer progression and tumor cell motility are associated with the FGFR4 Arg(388) allele. Cancer Res. 62, 840-847. Basch,M.L., Bronner-Fraser,M., and Garcia-Castro,M.I. (2006). Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature 441, 218-222. i Références Battle,T.E., and Frank,D.A. (2002). The role of STATs in apoptosis. Curr. Mol. Med. 2, 381-392. Becker,S., Groner,B., and Müller,C.W. (1998). Three-dimensional structure of the Stat3beta homodimer bound to DNA. Nature 394, 145-151. Bellmeyer ,A., Krase,J., Lindgren,J., and LaBonne,C. (2003). The protooncogene c-myc is an essential regulator of neural crest formation in xenopus. Dev. Cell 4, 827-839. Besser,D., Bromberg,J.F., Darnell,J.E., and Hanafusa,H. (1999). A single amino acid substitution in the vEyk intracellular domain results in activation of Stat3 and enhances cellular transformation. Moll. Cell Biol. 19, 1401-09. Betschinger,J., Mechtler,K., and Knoblich,J.A. (2006). Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell 124, 1241-1253. Betz,A., Lampen,N., Martinek,S., Young,M.W., and Darnell,J.E. Jr. (2001). A Drosophila PIAS homologue negatively regulates stat92E. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98, 9563-9568. Bhat,K.M., Maddodi,N., Shashikant,C., and Setaluri,V. (2006). Transcriptional regulation of human MAP2 gene in melanoma: role of neuronal bHLH factors and Notch1 signaling. Nucleic Acids Res. 34, 3819-3832. Bolós,V., Grego-Bessa,J., and de la Pompa,J.L. (2007). Notch signaling in development and cancer. Endocr. Rev. 28, 339-363. Bong,Y.S., Lee,H.S., Carim-Todd,L., Mood,K., Nishanian,T.G., Tessarollo,L., and Daar,I.O. (2007). ephrinB1 signals from the cell surface to the nucleus by recruitment of STAT3. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 17305-17310. Bonni,A., Sun,Y., Nadal-Vicens,M., Bhatt,A., Frank,D.A., Rozovsky,I., Stahl,N., Yancopoulos,G.D., and Greenberg,M.E. (1997). Regulation of gliogenesis in the central nervous system by the JAK-STAT signaling pathway. Science 278, 477-483. Böttcher,R.T., and Niehrs,C. (2005). Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development. Endocr. Rev. 26, 63-77. Bowman,T., Broome,M.A., Sinibaldi,D., Wharton,W., Pledger,W.J., Sedivy,J.M., Irby,R., Yeatman,T., Courtneidge,S.A., and Jove,R. (2001). Stat3-mediated Myc expression is required for Src transformation and PDGF-induced mitogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98, 7319-7324. Brault,V., Moore,R., Kutsch,S., Ishibashi,M., Rowitch,D.H., McMahon,A.P., Sommer,L., Boussadia,O., and Kemler,R. (2001). Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development 128, 1253-1264. Bromberg,J., and Darnell,J.E. (2000). The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene 19, 2468-2473. Bromberg,J.F. (2001). Activation of STAT proteins and growth control. Bioessays 23, 161-169. Bromberg,J.F., Wrzeszczynska,M.H., Devgan,G., Zhao,Y., Pestell,R.G., Albanese,C., and Darnell,J.E. Jr. (1999). Stat3 as an oncogene. Cell 98, 295-303. Bronchain,O.J., Hartley,K.O., and Amaya,E. (1999). A gene trap approach in Xenopus. Curr. Biol. 9, 11951198. Caldenhoven,E., van Dijk,T.B., Solari,R., Armstrong,J., Raaijmakers,J.A., Lammers,J.W., Koenderman,L., and de Groot,R.P. (1996). STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J. Biol. Chem. 271, 13221-13227. Calò,V., Migliavacca,M., Bazan,V., Macaluso,M., Buscemi,M., Gebbia,N., and Russo,A. (2003). STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis. J. Cell Physiol. 197, 157-168. Campbell,K. (2005). Cortical neuron specification: it has its time and place. Neuron 46, 373-376. ii Références Cano,A., Pérez-Moreno,M.A., Rodrigo,I., Locascio,A., Blanco,M.J., del Barrio,M.G., Portillo,F., and Nieto,M.A. (2000). The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing Ecadherin expression. Nat. Cell Biol. 2, 76-83. Cao,F., Hata,R., Zhu,P., Ma,Y.J., Tanaka,J., Hanakawa,Y., Hashimoto,K., Niinobe,M., Yoshikawa,K., and Sakanaka,M. (2006). Overexpression of SOCS3 inhibits astrogliogenesis and promotes maintenance of neural stem cells. J. Neurochem. 98, 459-470. Cao,X., Tay,A., Guy,G.R., and Tan,Y.H. (1996). Activation and association of Stat3 with Src in v-Srctransformed cell lines. Mol. Cell Biol. 16, 1595-1603. Carmona-Fontaine,C., Acuña,G., Ellwanger,K., Niehrs,C., and Mayor,R. (2007). Neural crests are actively precluded from the anterior neural fold by a novel inhibitory mechanism dependent on Dickkopf1 secreted by the prechordal mesoderm. Dev. Biol. 309, 208-221. Carmona-Fontaine,C., Matthews,H.K., Kuriyama,S., Moreno,M., Dunn,G.A., Parsons,M., Stern,C.D., and Mayor,R. (2008). Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature 456, 957-961. Catlett-Falcone,R., Landowski,T.H., Oshiro,M.M., Turkson,J., Levitzki,A., Savino,R., Ciliberto,G., Moscinski,L., Fernández-Luna,J.L., Nuñez,G., Dalton,W.S., and Jove,R. (1999). Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immunity 10, 105-115. Cayouette,M., and Raff,M. (2002). Asymmetric segregation of Numb: a mechanism for neural specification from Drosophila to mammals. Nat. Neurosci. 5, 1265-1269. Ceresa,B.P., and Pessin,J.E. (1996). Insulin stimulates the serine phosphorylation of the signal transducer and activator of transcription (STAT3) isoform. J. Biol. Chem. 271, 12121-12124. Chakraborty,A., White,S.M., Schaefer,T.S., Ball,E.D., Dyer,K.F., and Tweardy,D.J. (1996). Granulocyte colony-stimulating factor activation of Stat3 alpha and Stat3 beta in immature normal and leukemic human myeloid cells. Blood 88, 2442-2449. Chapman,R.S., Lourenco,P.C., Tonner,E., Flint,D.J., Selbert,S., Takeda,K., Akira,S., Clarke,A.R., and Watson,C.J. (1999). Suppression of epithelial apoptosis and delayed mammary gland involution in mice with a conditional knockout of Stat3. Genes Dev. 13, 2604-2616. Chen,G., and Courey,A.J. (2000). Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression. Gene 249, 116. Chen,H., Thiagalingam,A., Chopra,H., Borges,M.W., Feder,J.N., Nelkin,B.D., Baylin,S.B., and Ball,D.W. (1997). Conservation of the Drosophila lateral inhibition pathway in human lung cancer: a hairy-related protein (HES-1) directly represses achaete-scute homolog-1 expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94, 5355-5360. Cheng,H.Y., Li,P., David,M., Smithgall,T.E., Feng,L., and Lieberman,M.W. (2004). Arsenic inhibition of the JAK-STAT pathway. Oncogene 23, 3603-3612. Chenn,A., and McConnell,S.K. (1995). Cleavage orientation and the asymmetric inheritance of Notch1 immunoreactivity in mammalian neurogenesis. Cell 82, 631-641. Chitnis,A.B. (1995). The role of Notch in lateral inhibition and cell fate specification. Mol. Cell Neurosci. 6, 311-321. Choksi,S.P., Southall,T.D., Bossing,T., Edoff,K., de Wit,E., Fischer,B.E., van Steensel,B., Micklem,G., and Brand,A.H. (2006). Prospero acts as a binary switch between self-renewal and differentiation in Drosophila neural stem cells. Dev. Cell 11, 775-789. Christiansen,J.H., Coles,E.G., and Wilkinson,D.G. (2000). Molecular control of neural crest formation, migration and differentiation. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 719-724. Chung,J., Uchida,E., Grammer,T.C., and Blenis,J. (1997a). STAT3 serine phosphorylation by ERKdependent and -independent pathways negatively modulates its tyrosine phosphorylation. Mol. Cell Biol. 17, 6508-6516. iii Références Chung,C.D., Liao,J., Liu,B., Rao,X., Jay,P., Berta,P., and Shuai,K. (1997b). Specific inhibition of Stat3 signal transduction by PIAS3. Science 278, 1803-1805. Colomiere,M., Ward,A.C., Riley,C., Trenerry,M.K., Cameron-Smith,D., Findlay,J., Ackland,L., and Ahmed,N. (2009). Cross talk of signals between EGFR and IL-6R through JAK2/STAT3 mediate epithelialmesenchymal transition in ovarian carcinomas. Br. J. Cancer 100, 134-144. Conway,G. (2006). STAT3-dependent pathfinding and control of axonal branching and target selection. Dev. Biol. 296, 119-136. Cornell,R.A., and Eisen,J.S. (2000). Delta signaling mediates segregation of neural crest and spinal sensory neurons from zebrafish lateral neural plate. Development 127, 2873-2882. Cornell,R.A., and Eisen,J.S. (2005). Notch in the pathway: The roles of Notch signaling in neural crest development. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 663-672. Coumailleau,F., Fürthauer,M., Knoblich,J.A., and González-Gaitán,M. (2009). Directional Delta andNotch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature 458, 1051-1055. Cremisi,F., Philpott,A., and Ohnuma,S. (2003). Cell cycle and cell fate interactions in neural development. Curr Opin Neurobiol 13, 26-33. Cuevas,P., Díaz-González,D., Sánchez,I., Lozano,R.M., Giménez-Gallego,G., and Dujovny,M. (2006). Dobesilate inhibits the activation of signal transducer and activator of transcription 3, and the expression of cyclin D1 and bcl-XL in glioma cells. Neurol. Res. 28, 127-130. Davis,R.L., and Turner,D.L. (2001). Vertebrate hairy and Enhancer of split related proteins: transcriptional repressors regulating cellular differentiation and embryonic patterning. Oncogene 20, 8342-8357. Davis,R.L., Cheng,P.F., Lassar,A.B., and Weintraub,H. (1990). The MyoD DNA binding domain contains a recognition code for muscle-specific gene activation. Cell 60, 733-746. Dawson,S.R., Turner,D.L., Weintraub,H., and Parkhurst,S.M. (1995). Specificity for the hairy/enhancer of split basic helix-loop-helix (bHLH) proteins maps outside the bHLH domain and suggests two separable modes of transcriptional repression. Mol. Cell Biol. 15, 6923-6931. De Calisto,J., Araya,C., Marchant,L., Riaz,C.F., and Mayor,R. (2005). Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development 132, 2587-2597. De la Pompa,J.L., Wakeham,A., Correia,K.M., Samper,E., Brown,S., Aguilera,R.J., Nakano,T., Honjo,T., Mak,T.W., Rossant,J. and Conlon,R.A. (1997). Conservation of the Notch signalling pathway in mammalian neurogenesis. Development 124, 1139-1148. De Robertis,E.M., and Kuroda,H. (2004). Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 285-308. Deadorff,M.A., Tan,C., Saint-Jeannet,J.P., and Klein,P.S. (2001). A role for frizzled 3 in neural crest development. Development 128, 3655-3663. Deblandre,G.A., Wettstein,D.A., Koyano-Nakagawa,N. and Kintner,C. (1999). A two-step mechanism generates the spacing pattern of the ciliated cells in the skin of Xenopus embryos. Development 126, 4715-4728. Decker,T., and Kovarik,P. (2000). Serine phosphorylation of STATs. Oncogene 19, 2628-2637. Del Barrio,M.G., and Nieto,M.A. (2002). Overexpression of Snail family members highlights their ability to promote chick neural crest formation. Development 129, 1583-1593. Delaune,E., Lemaire,P., and Kodjabachian,L. (2005). Neural induction in Xenopus requires early FGF signalling in addition to BMP inhibition. Development 132, 299-310. Dorsky,R.I., Moon,R.T., and Raible,D.W. (1998). Control of neural crest cell fate by the Wnt signalling pathway. Nature 396, 370-373. iv Références Duncan,S.A., Zhong,Z., Wen,Z., and Darnell,J.E. Jr. (1997). STAT signaling is active during early mammalian development. Dev. Dyn. 208, 190-198. Dupont,S., Zacchigna,L., Cordenonsi,M., Soligo,S., Adorno,M., Rugge,M., and Piccolo,S. (2005). Germlayer specification and control of cell growth by Ectodermin, a Smad4 ubiquitin ligase. Cell 121, 87-99. Eiselleova,L., Matulka,K., Kriz,V., Kunova,M., Schmidtova,Z., Neradil,J., Tichy,B., Dvorakova,D., Pospisilova,S., Hampl,A., and Dvorak,P. (2009). A complex role for FGF-2 in self-renewal, survival, and adhesion of human embryonic stem cells. Stem Cells 27, 1847-1857. Ellenberger,T., Fass,D., Arnaud,M., and Harrison,S.C. (1994). Crystal structure of transcription factor E47: E-box recognition by a basic region helix-loop-helix dimer. Genes Dev. 8, 970-980. Elms,P., Siggers,P., Napper,D., Greenfield,A., and Arkell,R. (2003). Zic2 is required for neural crest formation and hindbrain patterning during mouse development. Dev. Biol. 264, 391-406. Endo,Y., Osumi,N., and Wakamatsu,Y. (2002). Bimodal functions of Notch-mediated signaling are involved in neural crest formation during avian ectoderm development. Development 129, 863-873. Engin,F., Bertin,T., Ma,O., Jiang,M.M., Wang,L., Sutton,R.E., Donehower,L.A., and Lee,B. (2009). Notch signaling contributes to the pathogenesis of human osteosarcomas. Hum. Mol. Genet. 18, 1464-1470. Eswarakumar,V.P., Lax,I., and Schlessinger,J. (2005). Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 139-149. Falvella,F.S., Frullanti,E., Galvan,A., Spinola,M., Noci,S., De Cecco,L., Nosotti,M., Santambrogio,L., Incarbone,M., Alloisio,M., Calabrò,E., Pastorino,U., Skaug,V., Haugen,A., Taioli,E., and Dragani,T.A. (2009). FGFR4 Gly388Arg polymorphism may affect the clinical stage of patients with lung cancer by modulating the transcriptional profile of normal lung. Int. J. Cancer. 124, 2880-2885. Foshay,K.M., and Gallicano,G.I. (2008). Regulation of Sox2 by STAT3 initiates commitment to the neural precursor cell fate. Stem Cells Dev. 17, 269-278. Frederick,T.J., and Wood,T.L. (2004). IGF-I and FGF-2 coordinately enhance cyclin D1 and cyclin E-cdk2 association and activity to promote G1 progression in oligodendrocyte progenitor cells. Mol. Cell Neurosci. 25, 480-492. Fuentealba,L.C., Eivers,E., Ikeda,A., Hurtado,C., Kuroda,H., Pera,E.M., and De Robertis,E.M. (2007). Integrating patterning signals: Wnt/GSK3 regulates the duration of the BMP/Smad1 signal. Cell 131, 980-993. Fujimi,T.J., Mikoshiba,K., and Aruga,J. (2006). Xenopus Zic4: conservation and diversification of expression profiles and protein function among the Xenopus Zic family. Dev. Dyn. 235, 3379-3386. Fujimoto,M., and Naka,T. (2003). Regulation of cytokine signaling by SOCS family molecules. Trends Immunol. 24, 659-666. Fukada,T., Ohtani,T., Yoshida,Y., Shirogane,T., Nishida,K., Nakajima,K., Hibi,M., and Hirano,T. (1998). STAT3 orchestrates contradictory signals in cytokine-induced G1 to S cell-cycle transition. EMBO J. 17, 66706677. Fukuda,A., Kawaguchi,Y., Furuyama,K., Kodama,S., Horiguchi,M., Kuhara,T., Koizumi,M., Boyer,D.F., Fujimoto,K., Doi,R., Kageyama,R., Wright,C.V., and Chiba,T. (2006). Ectopic pancreas formation in Hes1 knockout mice reveals plasticity of endodermal progenitors of the gut, bile duct, and pancreas. J. Clin. Invest. 116, 1484-1493. Garcia,R., and Jove,R. (1998). Activation of STAT transcription factors in oncogenic tyrosine kinase signaling. J. Biomed. Sci. 5, 79-85. Garcia-Castro,M.I., Marcelle,C., and Bronner-Fraser,M. (2002). Ectodermal Wnt function as a neural crest inducer. Science 297, 848-851. Georgia,S., Soliz,R., Li,M., Zhang,P., and Bhushan,A. (2006). p57 and Hes1 coordinate cell cycle exit with self-renewal of pancreatic progenitors. Dev. Biol. 298, 22-31. v Références Giraud,S., Bienvenu,F., Avril,S., Gascan,H., Heery,D.M., and Coqueret,O. (2002). Functional interaction of STAT3 transcription factor with the coactivator NcoA/SRC1a. J. Biol. Chem. 277, 8004-8011. Glavic,A., Silva,F., Aybar,M., Bastidas,F., and Mayor,R. (2004). Interplay between Notch signaling and the homeoprotein Xiro1 is required for neural crest induction in Xenopus embryos. Development 131, 347-359. Golub,R., Adelman,Z., Clementi,J., Weiss,R., Bonasera,J., and Servetnick,M. (2000). Evolutionarily conserved and divergent expression of members of the FGF receptor family among vertebrate embryos, as revealed by FGFR expression patterns in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 345-357. Gotoh,A., Takahira,H., Mantel,C., Litz-Jackson,S., Boswell,H.S., and Broxmeyer,H.E. (1996). Steel factor induces serine phosphorylation of Stat3 in human growth factor-dependent myeloid cell lines. Blood 88, 138145. Gotoh,N. (2009). Control of stemness by fibroblast growth factor signaling in stem cells and cancer stem cells. Curr. Stem Cell Res. Ther. 4, 9-15. Gowardhan,B., Douglas,D.A., Mathers,M.E., McKie,A.B., McCracken,S.R., Robson,C.N., and Leung,H.Y. (2005). Evaluation of the fibroblast growth factor system as a potential target for therapy in human prostate cancer. Br. J. Cancer 92, 320-327. Gu,F., Hata,R., Ma,Y.J., Tanaka,J., Mitsuda,N., Kumon,Y., Hanakawa,Y., Hashimoto,K., Nakajima,K., and Sakanaka,M. (2005). Suppression of Stat3 promotes neurogenesis in cultured neural stem cells. J. Neurosci. Res. 81, 163-171. Guentchev,M., and McKay,R.D. (2006). Notch controls proliferation and differentiation of stem cells in a dose-dependent manner. Eur. J. Neurosci. 23, 2289-2296. Han,J., Ishii,M., Bringas,P. Jr., Maas,R.L., Maxson,R.E. Jr, and Chai,Y. (2007). Concerted action of Msx1 and Msx2 in regulating cranial neural crest cell differentiation during frontal bone development. Mech. Dev. 124, 729-745. Harris,M.L., and Erickson,C.A. (2007). Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Dev. Dyn. 236, 1-19. Hart,K.C., Robertson,S.C., Kanemitsu,M.Y., Meyer,A.N., Tynan,J.A., and Donoghue,D.J. (2000). Transformation and Stat activation by derivatives of FGFR1, FGFR3, and FGFR4. Oncogene 19, 3309-3320. Hatakeyama,J., Sakamoto,S., and Kageyama,R. (2006). Hes1 and Hes5 regulate the development of the cranial and spinal nerve systems. Dev. Neurosci. 28, 92-101. Heasman,J. (2006). Patterning the early Xenopus embryo. Development 133, 1205-1217. Heeg-Truesdell,E., and LaBonne,C. (2004). A slug, a fox, a pair of sox: transcriptional responses to neural crest inducing signals. Birth Defects Res. C. Embryo Today 72, 124-139. Henion,P.D., and Weston,J.A. (1997). Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development 124, 4351-4359. Hirano,T., Ishihara,K., and Hibi,M. (2000). Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene 19, 2548-2556. Hirsch,N., Zimmerman,L.B., and Grainger,R.M. (2002). Xenopus, the next generation: X. tropicalis genetics and genomics. Dev. Dyn. 225, 422-433. Hitoshi,S., Alexson,T., Tropepe,V., Donoviel,D., Elia,A.J., Nye,J.S., Conlon,R.A., Mak,T.W., Bernstein,A., and van der KooY,D. (2002). Notch pathway molecules are essential for the maintenance, but not the generation, of mammalian neural stem cells. Genes Dev. 16, 846-858. Hitoshi,S., Seaberg,R.M., Koscik,C., Alexson,T., Kusunoki,S., Kanazawa,I., Tsuji,S., and van der Kooy,D. (2004). Primitive neural stem cells from the mammalian epiblast differentiate to definitive neural stem cells under the control of Notch signaling. Genes Dev. 18, 1806-1811. vi Références Hong,C.S., and Saint-Jeannet,J.P. (2005). Sox proteins and neural crest development. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 694-703. Hong,C.S., and Saint-Jeannet,J.P. (2007). The activity of Pax3 and Zic1 regulates three distinct cell fates at the neural plate border. Mol. Biol. Cell 18, 2192-2202. Hong,C.S., Park,B.Y., and Saint-Jeannet,J.P. (2008). Fgf8a induces neural crest indirectly through the activation of Wnt8 in the paraxial mesoderm. Development 135, 3903-3910. Hongo,I., Kengaku,M., and Okamoto,H. (1999). FGF signaling and the anterior neural induction in Xenopus. Dev. Biol. 216, 561-81. Hornyak,T.J., Hayes,D.J., Chiu,L.Y., and Ziff,E.B. (2001). Transcription factors in melanocyte development: distinct roles for Pax-3 and Mitf. Mech. Dev. 101, 47-59. Houston,D.W., and Wylie,C. (2005). Maternal Xenopus Zic2 negatively regulates Nodal-related gene expression during anteroposterior patterning. Development 132, 4845-4855. Huang,X., and Saint-Jeannet,J.P. (2004). Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev. Biol. 275, 1-11. Inoue,T., Hatayama,M., Tohmonda,T., Itohara,S., Aruga,J., and Mikoshiba,K. (2004). Mouse Zic5 deficiency results in neural tube defects and hypoplasia of cephalic neural crest derivatives. Dev. Biol. 270, 146162. Ishibashi,M., Ang,S.L., Shiota,K., Nakanishi,S., Kageyama,R., and Guillemot,F. (1995). Targeted disruption of mammalian hairy and Enhancer of split homolog-1 (HES-1) leads to up-regulation of neural helix-loop-helix factors, premature neurogenesis, and severe neural tube defects. Genes Dev. 9, 3136-3148. Itoh,N. (2007). The Fgf families in humans, mice, and zebrafish: their evolutional processes and roles in development, metabolism, and disease. Biol. Pharm. Bull. 30, 1819-1825. Jain,N., Zhang,T., Fong,S.L., Lim,C.P., and Cao,X. (1998). Repression of Stat3 activity by activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK). Oncogene 17, 3157-3167. Jain,N., Zhang,T., Kee,W.H., Li,W., and Cao,X. (1999). Protein kinase C delta associates with and phosphorylates Stat3 in an interleukin-6-dependent manner. J. Biol. Chem. 274, 24392-24400. Jiang,H., Patel,P.H., Kohlmaier,A., Grenley,M.O., McEwen,D.G., and Edgar,B.A. (2009). Cytokine/Jak/Stat signaling mediates regeneration and homeostasis in the Drosophila midgut. Cell 137, 13431355. Jögi,A., Persson,P., Grynfeld,A., Påhlman,S., and Axelson,H. (2002). Modulation of basic helix-loop-helix transcription complex formation by Id proteins during neuronal differentiation. J. Biol. Chem. 277, 9118-9126. Jordà,M., Olmeda,D., Vinyals,A., Valero,E., Cubillo,E., Llorens,A., Cano,A., and Fabra,A. (2005). Upregulation of MMP-9 in MDCK epithelial cell line in response to expression of the Snail transcription factor. J. Cell Sci. 118, 3371-3385. Joshi,I., Minter,L.M., Telfer,J., Demarest,R.M., Capobianco,A.J., Aster,J.C., Sicinski,P., Fauq,A., Golde,T.E., and Osborne,B.A. (2009). Notch signaling mediates G1/S cell-cycle progression in T cells via cyclin D3 and its dependent kinases. Blood 113, 1689-1698. Jouve,C., Palmeirim,I., Henrique,D., Beckers,J., Gossler,A., Ish-Horowicz,D., and Pourquié,O. (2000). Notch signalling is required for cyclic expression of the hairy-like gene HES1 in the presomitic mesoderm. Development 127, 1421-1429. Kageyama,R., Ohtsuka,T., and Tomita,K. (2000). The bHLH gene Hes1 regulates differentiation of multiple cell types. Mol. Cells 10, 1-7. Kageyama,R., Ohtsuka,T., Hatakeyama,J., and Ohsawa,R. (2005). Roles of bHLH genes in neural stem cell differentiation. Exp. Cell Res. 306, 343-348. vii Références Kageyama,R., Ohtsuka,T., and Kobayashi,T. (2007a). The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development 134, 1243-1251. Kageyama,R., Yoshiura,S., Masamizu,Y., and Niwa,Y. (2007b). Ultradian oscillators in somite segmentation and other biological events. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 72, 451-457. Kageyama,R., Ohtsuka,T., and Kobayashi,T. (2008). Roles of Hes genes in neural development. Dev. Growth Differ. 50, Suppl 1 97-103. Kalcheim,C., and Burstyn-Cohen,T. (2005). Early stages of neural crest ontogeny: formation and regulation of cell delamination. Int. J. Dev. Biol. 49, 105-116. Kamakura,S., Oishi,K., Yoshimatsu,T., Nakafuku,M., Masuyama,N., and Gotoh,Y. (2004). Hes binding to Stat3 mediates crosstalk between Notch and JAK-STAT signalling. Nat. Cell Biol. 6, 547-554. Kassen,S.C., Thummel,R., Campochiaro,L.A., Harding,M.J., Bennett,N.A., and Hyde,D.R. (2009). CNTF induces photoreceptor neuroprotection and Müller glial cell proliferation through two different signaling pathways in the adult zebrafish retina. Exp. Eye Res. 88, 1051-1064. Kaur,N., Wohlhueter,A.L., and Halvorsen,S.W. (2002). Activation and inactivation of signal transducers and activators of transcription by ciliary neurotrophic factor in neuroblastoma cells. Cell Signal. 14, 419-429. Kawamura,A., Koshida,S., Hijikata,H., Sakaguchi,T., Kondoh.,H., and Takada,S. (2005). Zebrafish hairy/enhancer of split protein links FGF signaling to cyclic gene expression in the periodic segmentation of somites. Genes Dev. 19, 1156-1161. Kee,Y., and Bronner-Fraser,M. (2005). To proliferate or to die: role of Id3 in cell cycle progression and survival of neural crest progenitors. Genes Dev. 19, 744-755. Kengaku,M., and Okamoto,H. (1993). Basic fibroblast growth factor induces differentiation of neural tube and neural crest lineages of cultured ectoderm cells from Xenopus gastrula. Development 119, 1067-1078. Kengaku,M., and Okamoto,H. (1995). bFGF as a possible morphogen for the anteroposterior axis of the central nervous system in Xenopus. Development 121, 3121-3130. Kim,T.Y., Kim,W.I., Smith,R.E., and Kay,E.P. (2001). Differential activity of TGF-beta2 on the expression of p27Kip1 and Cdk4 in actively cycling and contact inhibited rabbit corneal endothelial cells. Mol. Vis. 7, 261270. Kiryu-Seo,S., Kato,R., Ogawa,T., Nakagomi,S., Nagata,K., and Kiyama,H. (2008). Neuronal injuryinducible gene is synergistically regulated by ATF3, c-Jun, and STAT3 through the interaction with Sp1 in damaged neurons. J. Biol. Chem. 283, 6988-6996. Knight,R.D., Nair,S., Nelson,S.S., Afshar,A., Javidan,Y., Geisler,R., Rauch,G.J., and Schilling,T.F. (2003). Lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development 130, 5755-5768. Kos,R., Reedy,M.V., Johnson,R.L., and Erickson,C.A. (2001). The winged-helix transcription factor FoxD3 is important for establishing the neural crest lineage and repressing melanogenesis in avian embryos. Development 128, 1467-1479. Kotaja,N., Karvonen,U., Jänne,O.A., and Palvimo,J.J. (2002). PIAS proteins modulate transcription factors by functioning as SUMO-1 ligases. Mol. Cell Biol. 22, 5222-5234. Koyano-Nakagawa,N., Kim,J., Anderson,D., and Kintner,C. (2000). Hes6 acts in a positive feedback loop with the neurogenins to promote neuronal differentiation. Development 127, 4203-4216. Koziczak,M., and Hynes,N.E. (2004). Cooperation between fibroblast growth factor receptor-4 and ErbB2 in regulation of cyclin D1 translation. J. Biol. Chem. 279, 50004-50011. Krebs,D.L., and Hilton,D.J. (2001). SOCS proteins: negative regulators of cytokine signaling. Stem Cells 19, 378-387. viii Références Kroll,K.L., and Amaya,E. (1996). Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development 122, 3173-3183. Kunnimalaiyaan,M., Yan,S., Wong,F., Zhang,Y.W., and Chen,H. (2005). Hairy Enhancer of Split-1 (HES1), a Notch1 effector, inhibits the growth of carcinoid tumor cells. Surgery 138, 1137-1142. Kuo,J.S., Patel,M., Gamse,J., Merzdorf,C., Liu,X., Apekin,V., and Sive,H. (1998). Opl: a zinc finger protein that regulates neural determination and patterning in Xenopus. Development 125, 2867-2882. Kuphal,S., Palm,H.G., Poser,I., and Bosserhoff,A.K. (2005). Snail-regulated genes in malignant melanoma. Melanoma Res. 15, 305-313. Kuriyama,S., and Mayor,R. (2008). Molecular analysis of neural crest migration. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363, 1349-1362. Kuroda,H., Fuentealba,L., Ikeda,A., Reversade,B., and De Robertis,E.M. (2005). Default neural induction: neuralization of dissociated Xenopus cells is mediated by Ras/MAPK activation. Genes Dev. 19, 1022-1027. LaBonne,C., and Bronner-Fraser,M. (1998). Neural crest induction in Xenopus: evidence for a two-signal model. Development 125, 2403-2414. LaBonne,C., and Bronner-Fraser,M. (2000). Snail-related transcriptional repressors are required in Xenopus for both the induction of the neural crest and its subsequent migration. Dev. Biol. 221, 195-205. Lamar,E., and Kintner,C. (2005). The Notch targets Esr1 and Esr10 are differentially regulated in Xenopus neural precursors. Development 132, 3619-3630. Lang,D., Chen,F., Milewski,R., Li,J., Lu,M.M., and Epstein,J.A. (2000). Pax3 is required for enteric ganglia formation and functions with Sox10 to modulate expression of c-ret. J. Clin. Invest. 106, 963-971. Langer,E.M., Feng,Y., Zhaoyuan,H., Rauscher,F.J., Kroll,K.L., and Longmore,G.D. (2008). Ajuba LIM proteins are snail/slug corepressors required for neural crest development in Xenopus. Dev. Cell 14, 424-436. Latimer,A.J., Shin,J., and Appel,B. (2005). Her9 promotes floor plate development in zebrafish. Dev. Dyn. 232, 1098-1104. Lea,R., Papalopulu,N., Amaya,E., Dorey,K. (2009). Temporal and spatial expression of FGF ligands and receptors during Xenopus development. Dev. Dyn. 238, 1467-1479. Leaman,D.W., Pisharody,S., Flickinger,T.W., Commane,M.A., Schlessinger,J., Kerr,I.M., Levy,D.E., Stark,G.R. (1996). Roles of JAKs in activation of STATs and stimulation of c-fos gene expression by epidermal growth factor. Mol. Cell Biol. 16, 369-375. Lee,H.Y., Wroblewski,E., Philips,G.T., Stair,C.N., Conley,K., Reedy,M., Mastick,G.S., and Brown,N.L. (2005). Multiple requirements for Hes 1 during early eye formation. Dev. Biol. 284, 464-478. Lee,J.C., Smith,S.B., Watada,H., Lin,J., Scheel,D., Wang,J., Mirmira,R.G., and German,M.S. (2001). Regulation of the pancreatic pro-endocrine gene neurogenin3. Diabetes 50, 928-936. Lee,Y.H., Aoki,Y., Hong,C.S., Saint-Germain,N., Credidio,C., and Saint-Jeannet,J.P. (2004). Early requirement of the transcriptional activator Sox9 for neural crest specification in Xenopus. Dev. Biol. 275, 93103. Leslie,K., Lang,C., Devgan,G., Azare,J., Berishaj,M., Gerald,W., Kim,Y.B., Paz,K., Darnell,J.E., Albanese,C., Sakamaki,T., Pestell,R., and Bromberg,J. (2006). CyclinD1 is transcriptionally regulated by and required for transformation by activated signal transducer and activator of transcription 3. Cancer Res. 66, 25442552. Leu,J.I., Crissey,M.A., Leu,J.P., Ciliberto,G., and Taub,R. (2001). Interleukin-6-induced STAT3 and AP-1 amplify hepatocyte nuclear factor 1-mediated transactivation of hepatic genes, an adaptive response to liver injury. Mol. Cell Biol. 21, 414-424. ix Références Leve,C., Gajewski,M., Rohr,K.B., and Tautz,D. (2001). Homologues of c-hairy1 (her9) and lunatic fringe in zebrafish are expressed in the developing central nervous system, but not in the presomitic mesoderm. Dev. Genes Evol. 211, 493-500. Levy,D.E., and Darnell,J.E. (2002). Stats : transcriptional control and Biological impact. Nat. Rev. Cell Biol. 3, 651-662. Levy,D.E., and Lee,C.K. (2002). What does Stat3 do? J. Clin. Invest. 109, 1143-1148. Lewis,J.L., Bonner,J., Modrell,M., Ragland,J.W., Moon,R.T., Dorsky,R.I., and Raible,D.W. (2004). Reiterated Wnt signaling during zebrafish neural crest development. Development 131, 1299-1308. Lewis,R.S., and Ward,A.C. (2004). Conservation, duplication and divergence of the zebrafish stat5 genes. Gene 338, 65-74. Li,B., and DiCicco-Bloom,E. (2004). Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev. Neurosci. 26, 197-207. Li,J., Xia,F., and Li,W.X. (2003). Coactivation of STAT and Ras is required for germ cell proliferation and invasive migration in Drosophila. Dev. Cell 5, 787-798. Liem,K.F. Jr., Tremml,G., Roelink,H., and Jessell,T.M. (1995). Dorsal differentiation of neural plate cells induced by BMP-mediated signals from epidermal ectoderm. Cell 82, 969-979. Light,W., Vernon,A.E., Lasorella,A., Iavarone,A., and LaBonne,C. (2005). Xenopus Id3 is required downstream of Myc for the formation of multipotent neural crest progenitor cells. Development 132, 1831-1841. Lim,C.P., and Cao,X. (2006). Structure, function, and regulation of STAT proteins. Mol. Biosyst. 2, 536-550. Liu,K.J., and Harland,R.M. (2003). Cloning and characterization of Xenopus Id4 reveals differing roles for Id genes. Dev. Biol. 264, 339-351. Liu,L., McBride,K.M., and Reich,N.C. (2005). STAT3 nuclear import is independent of tyrosine phosphorylation and mediated by importin-alpha3. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 8150-8155. López,S.L., Rosato-Siri,M.V., Franco,P.G., Paganelli,A.R., and Carrasco,A.E. (2005). The Notch-target gene hairy2a impedes the involution of notochordal cells by promoting floor plate fates in Xenopus embryos. Development 132, 1035-1046. Low,S.H., Vasanth,S., Larson,C.H., Mukherjee,S., Sharma,N., Kinter,M.T., Kane,M.E., Obara,T., and Weimbs,T. (2006). Polycystin-1, STAT6, and P100 function in a pathway that transduces ciliary mechanosensation and is activated in polycystic kidney disease. Dev. Cell 10, 57-69. Lu,Y., Fukuyama,S., Yoshida,R., Kobayashi,T., Saeki,K., Shiraishi,H., Yoshimura,A., and Takaesu,G. (2006). Loss of SOCS3 gene expression converts STAT3 function from anti-apoptotic to pro-apoptotic. J. Biol. Chem. 281, 36683-36690. Luchtefeld,M., Drexler,H., and Schieffer,B. (2001). Role of G beta-subunit in angiotensin II-type 1 receptor signaling. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280, 756-760. Lufei,C., Ma,J., Huang,G., Zhang,T., Novotny-Diermayr,V., Ong,C.T., and Cao,X. (2003). GRIM-19, a death-regulatory gene product, suppresses Stat3 activity via functional interaction. EMBO J. 22, 1325-1335. Luo,T., Lee,Y.H., Saint-Jeannet,J.P., and Sargent,T.D. (2003). Induction of neural crest in Xenopus by transcription factor AP2alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 532-537. Luo,T., Matsuo-Takasaki,M., Thomas,M.L., Weeks,D.L., and Sargent,T.D. (2002). Transcription factor AP2 is an essential and direct regulator of epidermal development in Xenopus. Dev. Biol. 245, 136-144. Lyden,D., Young,A.Z., Zagzag,D., Yan,W., Gerald,W., O'Reilly,R., Bader,B.L., Hynes,R.O., Zhuang,Y., Manova,K., and Benezra,R. (1999). Id1 and Id3 are required for neurogenesis, angiogenesis and vascularization of tumour xenografts. Nature 401, 670-677. x Références Mancilla,A., and Mayor,R. (1996). Neural crest formation in Xenopus laevis: mechanisms of Xslug induction. Dev. Biol. 177, 580-589. Marquardt,T., and Gruss, P. (2002). Generating neuronal diversity in the retina: one for nearly all. Trends in Neurosciences 25, 32-38. Matsuda,T., Nakamura,T., Nakao,K., Arai,T., Katsuki,M., Heike,T., and Yokota,T. (1999). STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J. 18, 42614269. Matthews,H.K., Marchant,L., Carmona-Fontaine,C., Kuriyama,S., Larraín,J., Holt,M.R., Parsons,M., and Mayor,R. (2008). Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development 135, 1771-1780. Mayor,R., Guerrero,N., and Martinez,C. (1997). Role of FGF and noggin in neural crest induction. Dev. Biol. 189, 1-12. Mayor,R., Morgan,R., and Sargent,M.G. (1995). Induction of the prospective neural crest of Xenopus. Development 121, 767-777. McBride,K.M., McDonald,C., and Reich,N.C. (2000). Nuclear export signal located within theDNA-binding domain of the STAT1transcription factor. EMBO J. 19, 6196-6206. McCusker,C., Cousin,H., Neuner,R., and Alfandari,D. (2009). Extracellular cleavage of cadherin-11 by ADAM metalloproteases is essential for Xenopus cranial neural crest cell migration. Mol. Biol. Cell 20, 78-89. Meulemans,D., and Bronner-Fraser,M. (2004). Gene-regulatory interactions in neural crest evolution and development. Dev. Cell 7, 291-299. Miller,J.P., Yeh,N., Vidal,A., and Koff,A. (2007). Interweaving the cell cyle machinery with cell differentiation. Cell cycle 6, 2932-2938. Miyagi,C., Yamashita,S., Ohba,Y., Yoshizaki,H., Matsuda,M., and Hirano,T. (2004). STAT3 noncellautonomously controls planar cell polarity during zebrafish convergence and extension. J. Cell Biol. 166, 975981. Mizuseki,K., Kishi,M., Shiota,K., Nakanishi,S., and Sasai,Y. (1998). SoxD: an essential mediator of induction of anterior neural tissues in Xenopus embryos. Neuron 21, 77-85. Monsoro-Burq,A.H., Fletcher,R.B., and Harland,R.M. (2003). Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development 130, 3111-3124. Monsoro-Burq,A.H., Wang,E., and Harland,R.M. (2005). Msx1 and Pax3 cooperate to mediate FGF8 and WNT signals during Xenopus neural crest induction. Dev. Cell 8, 167-178. Mori-Akiyama,Y., Akiyama,H., Rowitch,D.H, and de Crombrugghe,B. (2003). Sox9 is required for determination of the chondrogenic cell lineage in the cranial neural crest. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100, 93609365. Mukherjee,T., Hombría,J.C., and Zeidler,M.P. (2005). Opposing roles for Drosophila JAK/STAT signalling during cellular proliferation. Oncogene 24, 2503-2511. Murata,K., Hattori,M., Hirai,N., Shinozuka,Y., Hirata,H., Kageyama,R., Sakai,T., and Minato,N. (2005). Hes1 directly controls cell proliferation through the transcriptional repression of p27Kip1. Mol. Cell Biol. 25, 4262-4271. Murato,Y., and Hashimoto,C. (2009). Xhairy2 functions in Xenopus lens development by regulating p27(xic1) expression. Dev. Dyn. 238, 2179-2192. Murato,Y., Yamaguti,M., Katamura,M., Cho,K.W., and Hashimoto,C. (2006). Two modes of action by which Xenopus hairy2b establishes tissue demarcation in the Spemann-Mangold organizer. Int. J. Dev. Biol. 50, 463-471. xi Références Murphy,M.J., Wilson,A., and Trumpp,A. (2005). More than just proliferation: Myc function in stem cells. Trends Cell Biol. 15, 128-137. Nagatomo,K., and Hashimoto,C. (2007). Xenopus hairy2 functions in neural crest formation by maintaining cells in a mitotic and undifferentiated state. Dev. Dyn. 236, 1475-1483. Nakajima,K., Yamanaka,Y., Nakae,K., Kojima,H., Ichiba,M., Kiuchi,N., Kitaoka,T., Fukada,T., Hibi,M., and Hirano,T. (1996). A central role for Stat3 in IL-6-induced regulation of growth and differentiation in M1 leukemia cells. EMBO J. 15, 3651-3658. Nakamura,Y., Sakakibara,S., Miyata,T., Ogawa,M., Shimazaki,T., Weiss,S., Kageyama,R., and Okano,H. (2000). The bHLH gene hes1 as a repressor of the neuronal commitment of CNS stem cells. J. Neurosci. 20, 283-293. Nakashima,K., Yanagisawa,M., Arakawa,H., Kimura,N., Hisatsune,T., Kawabata,M., Miyazono,K., and Taga,T. (1999). Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science 284, 479-482. Nakata,K., Koyabu,Y., Aruga,J., and Mikoshiba,K. (2000). A novel member of the Xenopus Zic family, Zic5, mediates neural crest development. Mech. Dev. 99, 83-91. Nakata,K., Nagai,T., Aruga,J., and Mikoshiba,K. (1997). Xenopus Zic3, a primary regulator both in neural and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11980-11985. Nakata,K., Nagai,T., Aruga,J., and Mikoshiba,K. (1998). Xenopus Zic family and its role in neural and neural crest development. Mech. Dev. 75, 43-51. Nakaya,Y., Sukowati,E.W., Wu,Y., and Sheng,G. (2008). RhoA and microtubule dynamics control cellbasement membrane interaction in EMT during gastrulation. Nat. Cell Biol. 10, 765-775. Nakayama,K., Satoh,T., Igari,A., Kageyama,R., and Nishida,E. (2008). FGF induces oscillations of Hes1 expression and Ras/ERK activation. Curr. Biol. 18, 332-334. Nguyen,V.H., Schmid,B., Trout,J., Connors,S.A., Ekker,M., and Mullins,M.C. (1998). Ventral and lateral regions of the zebrafish gastrula, including the neural crest progenitors, are established by a bmp2b/swirl pathway of genes. Dev. Biol. 199, 93-110. Nieuwkoop,P.D., and Faber,J. (1967). Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland Publishing Inc, New York. Nishinakamura,R., Matsumoto,Y., Matsuda,T., Ariizumi,T., Heike,T., Asashima,M., and Yokota,T. (1999). Activation of Stat3 by cytokine receptor gp130 ventralizes Xenopus embryos independent of BMP-4. Dev. Biol. 216, 481-490. Niu,G., Bowman,T., Huang,M., Shivers,S., Reintgen,D., Daud,A., Chang,A., Kraker,A., Jove,R., and Yu,H. (2002). Roles of activated Src and Stat3 signaling in melanoma tumor cell growth. Oncogene 21, 70017010. Niwa,H., Burdon,T., Chambers,I., and Smith,A. (1998). Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060. Niwa,Y., Masamizu,Y., Liu,T., Nakayama,R., Deng,C.X., and Kageyama,R. (2007). The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and notch signaling in the somite segmentation clock. Dev. Cell 13, 298-304. Norton,D. (2000). ID helix-loop-helix protein in cell growth, differentiation and tumorogenesis. J. Cell Sci. 113, 3897-3905. Nusse,R. (2008). Wnt signaling and stem cell control. Cell Res. 18, 523-527. Oates,A.C., Wollberg,P., Pratt,S.J., Paw,B.H., Johnson,S.L., Ho,R.K., Postlethwait,J.H., Zon,L.I., and Wilks,A.F. (1999). Zebrafish stat3 is expressed in restricted tissues during embryogenesis and stat1 rescues cytokine signaling in a STAT1-deficient human cell line. Dev. Dyn. 215, 352-370. xii Références O'Connell,M.J., and Nurse,P. (1994). How cells know they are in G1 or G2. Curr. Opin. Cell Biol. 6, 867-871. O'Donnell,M., Hong,C.S., Huang,X., Delnicki,R.J., and Saint-Jeannet,J.P. (2006). Functional analysis of Sox8 during neural crest development in Xenopus. Development 133, 3817-3826. Ohkawara,B., Shirakabe,K., Hyodo-Miura,J., Matsuo,R., Ueno,N., Matsumoto,K., and Shibuya,H. (2004). Role of the TAK1-NLK-STAT3 pathway in TGF-beta-mediated mesoderm induction. Genes Dev. 18, 381-386. Ohtsuka,T., Ishibashi,M., Gradwohl,G., Nakanishi,S., Guillemot,F.,and Kageyama,R. (1999). Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. EMBO J. 18, 2196-2207. Ohtsuka,T., Sakamoto,M., Guillemeot,F., and Kageyama,R. (2001). Roles of the basic helix-loop-helix genes Hes1 and Hes5 in expansion of neural stem cells of the developing brain. J. Biol. Chem. 276, 30467-30474. Påhlman,S., Stockhausen,M.T., Fredlund,E., Axelson,H. (2004). Notch signaling in neuroblastoma. Semin. Cancer Biol. 14, 365-373. Palmeirim,I., Henrique,D., Ish-Horowicz,D., and Pourquié,O. (1997). Avian hairy gene expression identifies a molecular clock linked to vertebrate segmentation and somitogenesis. Cell 91, 639-648. Pan,F.C., Chen,Y., Loeber,J., Henningfeld,K., and Pieler,T. (2006). I-SceI meganuclease-mediated transgenesis in Xenopus. Dev. Dyn. 235, 247-252. Parisi,M.A., and Kapur,R.P. (2000). Genetics of Hirschsprung disease. Curr. Opin. Pediatr. 12, 610-617. Park,E.S., Kim,H., Suh,J.M., Park,S.J., You,S.H., Chung,H.K., Lee,K.W., Kwon,O.Y., Cho,B.Y., Kim,Y.K., Ro,H.K., Chung,J., and Shong,M. (2000). Involvement of JAK/STAT (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription) in the thyrotropin signaling pathway. Mol. Endocrinol. 14, 662-670. Park,O.K., Schaefer,T.S., and Nathans,D. (1996). In vitro activation of Stat3 by epidermal growth factor receptor kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93, 13704-13708. Paroush,Z., Finley,R.L. Jr., Kidd,T., Wainwright,S.M., Ingham,P.W., Brent,R., and Ish-Horowicz,D. (1994). Groucho is required for Drosophila neurogenesis, segmentation, and sex determination and interacts directly with hairy-related bHLH proteins. Cell 79, 805-815. Pascal,A., Riou,J.F., Carron,C., Boucaut,J.C., and Umbhauer,M. (2001). Cloning and developmental expression of STAT5 in Xenopus laevis. Mech. Dev. 106, 171-174. Pasini,A., Henrique,D., and Wilkinson,D.G. (2001). The zebrafish Hairy/Enhancer-of-split-related gene her6 is segmentally expressed during the early development of hindbrain and somites. Mech. Dev. 100, 317-321. Paulson,M., Pisharody,S., Pan,L., Guadagno,S., Mui,A.L., and Levy,D.E. (1999). Stat protein transactivation domains recruit p300/CBP through widely divergent sequences. J. Biol. Chem. 274, 25343-25349. Pera,E.M., Ikeda,A., Eivers,E., and De Robertis,E.M. (2003). Integration of IGF, FGF, and anti-BMP signals via Smad1 phosphorylation in neural induction. Genes Dev. 17, 3023-3028. Perron,M., and Harris,W.A. (2000). Determination of vertebrate retinal progenitor cell fate by the Notch pathway and basic helix-loop-helix transcription factors. Cell Mol. Life Sci. 57, 215-223. Pichon,B., Taelman,V., Kricha,S., Christophe,D., and Bellefroid,E.J. (2002). XHRT-1, a hairy and Enhancer of split related gene with expression in floor plate and hypochord during early Xenopus embryogenesis. Dev. Genes Evol. 212, 491-495. Pourquié,O. (2003). The segmentation clock: converting embryonic time into spatial pattern. Science 301, 328330. Raible,D.W., and Ragland,J.W. (2005). Reiterated Wnt and BMP signals in neural crest development. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 673-682. Raz,R., Lee,C.K., Cannizzaro,L.A., d'Eustachio,P., and Levy,D.E. (1999). Essential role of STAT3 for embryonic stem cell pluripotency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 2846-2851. xiii Références Read,A.P. (2000). Hereditary deafness: lessons for developmental studies and genetic diagnosis. Eur. J. Pediatr. 159 Suppl. 232-235. Reich,N.C., and Liu,L. (2006). Tracking STAT nuclear traffic. Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612. Reimers,D., López-Toledano,M.A., Mason,I., Cuevas,P., Redondo,C., Herranz,A.S., Lobo,M.V., and Bazán,E. (2001). Developmental expression of fibroblast growth factor (FGF) receptors in neural stem cell progeny. Modulation of neuronal and glial lineages by basic FGF treatment. Neurol. Res. 23, 612-621. Reissmann,E., Ernsberger,U., Francis-West,P.H., Rueger,D., Brickell,P.M., and Rohrer,H. (1996). Involvement of bone morphogenetic protein-4 and bone morphogenetic protein-7 in the differentiation of the adrenergic phenotype in developing sympathetic neurons. Development 122, 2079-2088. Reynaud-Deonauth,S., Zhang,H., Afouda,A., Taillefert,S., Beatus,P., Etkin,L.D., Fisher-Lougheed,J., Spohr,G. (2002). Notch signaling is involved in the regulation of Id3 gene transcription during Xenopus embryogenesis. Differentiation 69, 198-208. Ribisi,S. Jr., Mariani,F.V., Aamar,E., Lamb,T.M., Frank,D., and Harland,R.M. (2000). Rasmediated FGF signaling is required for the formation of posterior but not anterior neural tissue in Xenopus laevis. Dev. Biol. 227, 183-96. Romond,P.C., Rustici,M., Gonze,D., and Goldbeter,A. (1999). Alternating oscillations and chaos in a model of two coupled biochemical oscillators driving successive phases of the cell cycle. Ann. N Y Acad. Sci. 879, 180193. Ronchini,C., and Capobianco,A.J. (2001). Induction of cyclin D1 transcription and CDK2 activity by Notch(ic): implication for cell cycle disruption in transformation by Notch(ic). Mol. Cell Biol. 21, 5925-5934. Saint-Jeannet,J.P., He,X., Varmus,H.E., and Dawid,I.B. (1997). Regulation of dorsal fate in the neuraxis by Wnt-1 and Wnt-3a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13713-13718. Sambrook,J., Fritsch,E.F., and Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Sánchez,I., and Dynlacht,B.D. (2005). New insights into cyclins, CDKs, and cell cycle control. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 311-321. Sano,S., Itami,S., Takeda,K., Tarutani,M., Yamaguchi,Y., Miura,H., Yoshikawa,K., Akira,S., and Takeda,J. (1999). Keratinocyte-specific ablation of Stat3 exhibits impaired skin remodeling, but does not affect skin morphogenesis. EMBO J. 18, 4657-4668. Sasai,N., Mizuseki,K., and Sasai,Y. (2001). Requirement of FoxD3-class signaling for neural crest determination in Xenopus. Development 128, 2525-2536. Sato,T., Sasai,N., and Sasai,Y. (2005). Neural crest determination by co-activation of Pax3 and Zic1 genes in Xenopus ectoderm. Development 132, 2355-2363. Schlosser,G. (2006). Induction and specification of cranial placodes. Dev. Biol. 294, 303-351. Selleck,M.A., and Bronner-Fraser,M. (1995). Origins of the avian neural crest: the role of neural plateepidermal interactions. Development 121, 525-538. Shao,H., Cheng,H.Y., Cook,R.G., and Tweardy,D.J. (2003). Identification and characterization of signal transducer and activator of transcription 3 recruitment sites within the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 63, 3923-3930. Shen,Q., Zhong,W., Jan,Y.N., and Temple,S. (2002). Asymmetric Numb distribution is critical for asymmetric cell division of mouse cerebral cortical stem cells and neuroblasts. Development 129, 4843-4853. Shen,Y., Schlessinger,K., Zhu,X., Meffre,E., Quimby,F., Levy,D.E., and Darnell,J.E. Jr. (2004). Essential role of STAT3 in postnatal survival and growth revealed by mice lacking STAT3 serine 727 phosphorylation. Mol. Cell Biol. 24, 407-419. xiv Références Shiau,C.E., Lwigale,P.Y., Das,R.M., Wilson,S.A., and Bronner-Fraser,M. (2008). Robo2-Slit1 dependent cell-cell interactions mediate assembly of the trigeminal ganglion. Nat. Neurosci. 11, 269-276. Shinga,J., Itoh,M., Shiokawa,K., Taira,S., and Taira,M. (2001). Early patterning of the prospective midbrainhindbrain boundary by the HES-related gene XHR1 in Xenopus embryos. Mech. Dev. 109, 225-239. Shojaei,F., Trowbridge,J., Gallacher,L., Yuefei,L., Goodale,D., Karanu,F., Levac,K., and Bhatia,M. (2005). Hierarchical and ontogenic positions serve to define the molecular basis of human hematopoietic stem cell behavior. Dev. Cell 8, 651-663. Shuai,K. (2000). Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. Oncogene 19, 2638-2644. Shuai,K., and Liu,B. (2003). Regulation of JAK-STAT signalling in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 3, 900-911. Singh,S.R., Liu,W., and Hou,S.X. (2007). The adult Drosophila malpighian tubules are maintained by multipotent stem cells. Cell Stem Cell 1, 191-203. Sölter,M., Locker,M., Boy,S., Taelman,V., Bellefroid,E.J., Perron,M., and Pieler,T. (2006). Characterization and function of the bHLH-O protein XHes2: insight into the mechanisms controlling retinal cell fate decision. Development 133, 4097-4108. Soo,K., O'Rourke,M.P., Khoo,P.L., Steiner,K.A., Wong,N., Behringer,R.R., and Tam,P.P. (2002). Twist function is required for the morphogenesis of the cephalic neural tube and the differentiation of the cranial neural crest cells in the mouse embryo. Dev. Biol. 247, 251-270. Spokoni,R.F., Aoki,Y., Saint-Germain,N., Magner-Fink,E., and Saint-Jeannet,J.P. (2002). The transcription factor Sox9 is required for cranial neural crest development in Xenopus. Development 129, 421-432. Stark,G.R., Kerr,I.M., Williams,B.R., Silverman,R.H., and Schreiber,R.D. (1998). How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem. 67, 227-264. Steventon,B., Araya,C., Linker,C., Kuriyama,S., and Mayor,R. (2009). Differential requirements of BMP and Wnt signalling during gastrulation and neurulation define two steps in neural crest induction. Development 136, 771-779. Steventon,B., Carmona-Fontaine,C., and Mayor,R. (2005). Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 647-54. Stewart,R.A., Arduini,B.L., Berghmans,S., George,R.E., Kanki,J.P., Henion,P.D., and Look,A.T. (2006). Zebrafish foxd3 is selectively required for neural crest specification, migration and survival. Dev. Biol. 292, 174188. Stockhausen,M.-T., Sjölund,J., and Axelson,H. (2005). Regulation of the Notch target gene Hes-1 by TGFa induced Ras/MAPK signaling in human neuroblastoma cells. Exp. Cell Res. 310, 218-228. Stoick-Cooper,C.L., Moon,R.T., and Weidinger,G. (2007). Advances in signaling in vertebrate regeneration as a prelude to regenerative medicine. Genes Dev. 21, 1292-1315. Suzuki,A., Ueno,N., and Hemmati-Brivanlou,A. (1997). Xenopus msx1 mediates epidermal induction and neural inhibition by BMP4. Development 124, 3037-3044. Taelman,V., Van Wayenbergh,R., Sölter,M., Pichon,B., Pieler,T., Christophe,D., and Bellefroid,E.J. (2004). Sequences downstream of the bHLH domain of the Xenopus hairy-related transcription factor-1 act as an extended dimerization domain that contributes to the selection of the partners. Dev. Biol. 276, 47-63. Takebayashi,K., Sasai,Y., Sakai,Y., Watanabe,T., Nakanishi,S., and Kageyama,R. (1994). Structure, chromosomal locus, and promoter analysis of the gene encoding the mouse helix-loop-helix factor HES-1. Negative autoregulation through the multiple N box elements. J. Biol. Chem. 269, 5150-5156. Takeda,K., Noguchi,K., Shi,W., Tanaka,T., Matsumoto,M., Yoshida,N., Kishimoto,T., and Akira,S. (1997). Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3801-3804. xv Références Takizawa,T., Nakashima,K., Namihira,M., Ochiai,W., Uemura,A., Yanagisawa,M., Fujita,N., Nakao,M., and Taga,T. (2001). DNA methylation is a critical cell-intrinsic determinant of astrocyte differentiation in the fetal brain. Dev. Cell 1, 749-758. Takke,C., Dornseifer,P., v Weizsäcker,E., and Campos-Ortega,J.A. (1999). her4, a zebrafish homologue of the Drosophila neurogenic gene E(spl), is a target of NOTCH signalling. Development 126, 1811-1821. Tanaka,T., Soriano,M.A., and Grusby,M.J. (2005). SLIM is a nuclear ubiquitin E3 ligase that negatively regulates STAT signaling. Immunity 22, 729-736. Taneyhill,L.A., Coles,E.G., and Bronner-Fraser,M. (2007). Snail2 directly represses cadherin6B during epithelial-to-mesenchymal transitions of the neural crest. Development 134, 1481-1490. Ten Hoeve,J., de Jesus Ibarra-Sanchez,M., Fu,Y., Zhu,W., Tremblay,M., David,M., and Shuai,K. (2002). Identification of a nuclear Stat1 protein tyrosine phosphatase. Mol. Cell Biol. 22, 5662-5668. Teng,L., Mundell,N.A., Frist,A.Y., Wang,Q., and Labosky,P.A. (2008). Requirement for Foxd3 in the maintenance of neural crest progenitors. Development 135, 1615-1624. Thomas,A.J., and Erickson,C.A. (2009). FOXD3 regulates the lineage switch between neural crest-derived glial cells and pigment cells by repressing MITF through a non-canonical mechanism. Development 136, 18491858. Tomita,K., Hattori,M., Nakamura,E., Nakanishi,S., Minato,N., and Kageyama,R. (1999). The bHLH gene Hes1 is essential for expansion of early T cell precursors. Genes Dev. 13, 1203-1210. Torres,J., and Watt,F.M. (2008). Nanog maintains pluripotency of mouse embryonic stem cells by inhibiting NFkappaB and cooperating with Stat3. Nat. Cell Biol. 10, 194-201. Trainor,P.A. (2005). Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 683-693. Tribulo,C., Aybar,M.J., Nguyen,V.H., Mullins,M.C., Mayor,R. (2003). Regulation of Msx genes by a Bmp gradient is essential for neural crest specification. Development 130, 6441-6452. Tríbulo,C., Aybar,M.J., Sánchez,S.S., and Mayor,R. (2004). A balance between the anti-apoptotic activity of Slug and the apoptotic activity of msx1 is required for the proper development of the neural crest. Dev. Biol. 275, 325-342. Tropepe,V., Li,S., Dickinson,A., Gamse,J.T., and Sive,H.L. (2006). Identification of a BMP inhibitorresponsive promoter module required for expression of the early neural gene zic1. Dev. Biol. 289, 517-529. Tsai,R.Y., and Kim,S. (2005). Fibroblast growth factor 2 negatively regulates the induction of neuronal progenitors from neural stem cells. J. Neurosci. Res. 82, 149-159. Tsai,Y.C., and Sun,Y.H. (2004). Long-range effect of upd, a ligand for Jak/STAT pathway, on cell cycle in Drosophila eye development. Genesis 39, 141-153. Tsuji,S., Cho,K.W., and Hashimoto,C. (2003). Expression pattern of a basic helix-loop-helix transcription factor Xhairy2b during Xenopus laevis development. Dev. Genes Evol. 213, 407-411. Tulina,N., and Matunis,E. (2001). Control of stem cell self-renewal in Drosophila spermatogenesis by JAKSTAT signaling. Science 294, 2546-2549. Turkson,J., Bowman,T., Adnane,J., Zhang,Y., Djeu,J.Y., Sekharam,M., Frank,D.A., Holzman,L.B., Wu,J., Sebti,S., and Jove,R. (1999). Requirement for Ras/Rac1-mediated p38 and c-Jun N-terminal kinase signaling in Stat3 transcriptional activity induced by the Src oncoprotein. Mol. Cell Biol. 19, 7519-7528. Turkson,J., Bowman,T., Garcia,R., Caldenhoven,E., De Groot,R.P., and Jove,R. (1998). Stat3 activation by Src induces specific gene regulation and is required for cell transformation. Mol. Cell Biol. 18, 2545-2552. Turpen,J.B., Carlson,D.L., and Huang,C. (2001). Cloning and developmental expression of Xenopus Stat1. Dev. Comp. Immunol. 25, 219-229. xvi Références Ungureanu,D., Vanhatupa,S., Grönholm,J., Palvimo,J.J., and Silvennoinen,O. (2005). SUMO-1 conjugation selectively modulates STAT1-mediated gene responses. Blood 106, 224-226. Vallin,J., Thuret,R., Giacomello,E., Faraldo,M.M., Thiery,J.P., Broders F. (2001). Cloning and characterization of three Xenopus slug promoters reveal direct regulation by Lef/beta-catenin signaling. J. Biol. Chem. 276, 30350-30358. Van de Wetering,M., Sancho,E., Verweij,C., de Lau,W., Oving,I., Hurlstone,A., van der Horn,K., Batlle,E., Coudreuse,D., Haramis,A.P., Tjon-Pon-Fong,M., Moerer,P., van den Born,M., Soete,G., Pals,S., Eilers,M., Medema,R., and Clevers,H. (2002). The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell 111, 241-250. Van Wayenbergh,R., Taelman,V., Pichon,B., Fischer,A., Kricha,S., Gessler,M., Christophe,D., and Bellefroid,E.J. (2003). Identification of BOIP, a novel cDNA highly expressed during spermatogenesis that encodes a protein interacting with the orange domain of the hairy-related transcription factor HRT1/Hey1 in Xenopus and mouse. Dev. Dyn. 228, 716-725. Vignais,M.L., Sadowski,H.B., Watling,D., Rogers,N.C., and Gilman,M. (1996). Platelet-derived growth factor induces phosphorylation of multiple JAK family kinases and STAT proteins. Mol. Cell Biol. 16, 17591769. Vinkemeier,U., Moarefi,I., Darnell,J.E. Jr., and Kuriyan,J. (1998). Structure of the amino-terminal protein interaction domain of STAT-4. Science 279, 1048-1052. Von Bubnoff,A., Peiffer,D.A., Blitz,I.L., Hayata,T., Ogata,S., Zeng,Q., Trunnell,M., Cho,K.W.Y. (2005). Phylogenetic footrprinting and genome scanning identify vertebrate BMP response elements and new target genes. Dev. Biol. 281, 210-226. Wahl,M.B., Deng,C., Lewandoski,M., and Pourquié,O. (2007). FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development 134, 4033-4041. Wakamatsu,Y., Maynard,T.M., and Weston,J.A. (2000). Fate determination of neural crest cells by NOTCHmediated lateral inhibition and asymmetrical cell division during gangliogenesis. Development 127, 2811-2821. Wang,R., Cherukuri,P., and Luo,J. (2005). Activation of Stat3 sequence-specific DNA binding and transcription by p300/CREB-binding protein-mediated acetylation. J. Biol. Chem. 280, 11528-11534. Wawersik,M., Milutinovich,A., Casper,A.L., Matunis,E., Williams,B., and Van Doren,M. (2005). Somatic control of germline sexual development is mediated by the JAK/STAT pathway. Nature 436, 563-567. Wegenka,U.M., Buschmann,J., Lütticken,C., Heinrich,P.C., and Horn,F. (1993). Acute-phase response factor, a nuclear factor binding to acute-phase response elements, is rapidly activated by interleukin-6 at the posttranslational level. Mol. Cell Biol. 13, 276-288. Wen,Z., and Darnell,J.E. Jr. (1997). Mapping of Stat3 serine phosphorylation to a single residue (727) and evidence that serine phosphorylation has no influence on DNA binding of Stat1 and Stat3. Nucleic Acids Res. 25, 2062-2067. Wilson,A., Murphy,M.J., Oskarsson,T., Kaloulis,K., Bettess,M.D., Oser,G.M., Pasche,A.C., Knabenhans,C., Macdonald,H.R., and Trumpp,A. (2004). c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Genes Dev 18, 2747-2763. Wishingra,M.A., Koshlukova,S., and Halvorsen,S.W. (1997). Ciliary neurotrophic factor stimulates the phosphorylation of two forms of STAT3 in chick ciliary ganglion neurons. J. Biol. Chem. 272, 19752-19757. Wu,J., Yang,J., and Klein,P.S. (2005). Neural crest induction by the canonical Wnt pathway can be dissociated from anterior-posterior neural patterning in Xenopus. Dev. Biol. 279, 220-232. Wu,Y., Liu,Y., Levine,E.M., and Rao,M.S. (2003). Hes1 but not Hes5 regulates an astrocyte versus oligodendrocyte fate choice in glial restricted precursors. Dev. Dyn. 226, 675-689. xvii Références Xie,T.X., Wei,D., Liu,M., Gao,A.C., Ali-Osman,F., Sawaya,R., and Huang,S. (2004). Stat3 activation regulates the expression of matrix metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis. Oncogene 23, 35503560. Yamaguti,M., Cho,K.W., and Hashimoto,C. (2005). Xenopus hairy2b specifies anterior prechordal mesoderm identity within Spemann’s organizer. Dev. Dyn. 234, 102-113. Yamashita,S., Miyagi,C., Carmany-Rampey,A., Shimizu,T., Fujii,R., Schier,A.F., and Hirano,T. (2002). Stat3 Controls Cell Movements during Zebrafish Gastrulation. Dev. Cell 2, 363-375. Yamashita,S., Miyagi,C., Fukada,T., Kagara,N., Che,Y.S., and Hirano,T. (2004). Zinc transporter LIVI controls epithelial-mesenchymal transition in zebrafish gastrula organizer. Nature 429, 298-302. Yan,R., Small,S., Desplan,C., Dearolf,C.R., and Darnell,J.E. Jr. (1996a). Identification of a Stat gene that functions in Drosophila development. Cell 84, 421-430. Yan,R., Luo,H., Darnell,J.E. Jr., and Dearolf,C.R. (1996b). A JAK-STAT pathway regulates wing vein formation in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93, 5842-5847. Yan,Y.L., Willoughby,J., Liu,D., Crump,J.G., Wilson,C., Miller,C.T., Singer,A., Kimmel,C., Westerfield,M., and Postlethwait,J.H. (2005). A pair of Sox: distinct and overlapping functions of zebrafish sox9 co-orthologs in craniofacial and pectoral fin development. Development 132, 1069-1083. Yang,E., Henriksen,M.A., Schaefer,O., Zakharova,N., and Darnell, J.E. Jr. (2002). Dissociation time from DNA determines transcriptional function in a STAT1 linker mutant. J. Biol. Chem. 277, 13455-13462. Yang,E., Wen,Z., Haspel,R.L., Zhang,J.J., and Darnell,J.E. Jr. (1999). The linker domain of Stat1 is required for gamma interferon-driven transcription. Mol. Cell Biol. 19, 5106-5112. Yang,J., Mani,S.A., Donaher,J.L., Ramaswamy,S., Itzykson,R.A., Come,C., Savagner,P., Gitelman,I., Richardson,A., and Weinberg,R.A. (2004). Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell 117, 927-939. Yin,D.D., Fan,F.Y., Hu,X.B., Hou,L.H., Zhang,X.P., Liu,L., Liang,Y.M., and Han,H. (2009). Notch signaling inhibits the growth of the human chronic myeloid leukemia cell line K562. Leuk. Res. 33, 109-114. Ying,Q.L., Nichols,J., Chambers,I., and Smith,A. (2003). BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115, 281-292. Yoo,J.Y., Huso,D.L., Nathans,D., and Desiderio,S. (2002). Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell 108, 331-344. Yoshimatsu,T., Kawaguchi,D., Oishi,K., Takeda,K., Akira,S., Masuyama,N., and Gotoh,Y. (2006). Noncell-autonomous action of STAT3 in maintenance of neural precursor cells in the mouse neocortex. Development 133, 2553-2563. Yoshiura,S., Ohtsuka,T., Takenaka,Y., Nagahara,H., Yoshikawa,K., and Kageyama,R. (2007). Ultradian oscillations of Stat, Smad, and Hes1 expression in response to serum. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 1129211297. You,M., Yu,D.H., and Feng,G.S. (1999). Shp-2 tyrosine phosphatase functions as a negative regulator of the interferon-stimulated Jak/STAT pathway. Mol. Cell Biol. 19, 2416-2424. Yu,C.L., Meyer,D.J., Campbell,G.S., Larner,A.C., Carter-Su,C., Schwartz,J., and Jove, R. (1995). Enhanced DNA-binding activity of a Stat3-related protein in cells transformed by the Src oncoprotein. Science 269, 81-83. Yu,X., Alder,J.K., Chun,J.H., Friedman,A.D., Heimfeld,S., Cheng,L., and Civin,C.I. (2006a). HES1 inhibits cycling of hematopoietic progenitor cells via DNA binding. Stem Cells 24, 876-888. Yu,F., Kuo,C.T., and Jan,Y.N. (2006b). Drosophila neuroblast asymmetric cell division: recent advances and implications for stem cell biology. Neuron 51, 13-20. xviii Références Yuan,Z.L., Guan,Y.J., Chatterjee,D., and Chin,Y.E. (2005). Stat3 dimerization regulated by reversible acetylation of a single lysine residue. Science 307, 269-273. Zabolotny,J.M., Bence-Hanulec,K.K., Stricker-Krongrad,A., Haj,F., Wang,Y., Minokoshi,Y., Kim,Y.B., Elmquist,J.K., Tartaglia,L.A., Kahn,B.B., and Neel,B.G. (2002). PTP1B regulates leptin signal transduction in vivo. Dev. Cell 2, 489-495. Zauberman,A., Zipori,D., Krupsky,M., and Ben-Levy,R. (1999). Stress activated protein kinase p38 is involved in IL-6 induced transcriptional activation of STAT3. Oncogene 18, 3886-3893. Zhang,C., Basta,T., Hernandez-Lagunas,L., Simpson,P., Stemple,D.L., Artinger,K.B., and Klymkowsky,M.W. (2004). Repression of nodal expression by maternal B1-type SOXs regulates germ layer formation in Xenopus and zebrafish. Dev. Biol. 273, 23-37. Zhang,J., Houston,D.W., King,M.L., Payne,C., Wylie,C., and Heasman,J. (1998). The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell 94, 515-524. Zhang,P., Yang,Y., Zweidler-McKay,P.A., and Hughes,D.P. (2008). Critical role of notch signaling in osteosarcoma invasion and metastasis. Clin. Cancer Res. 14, 2962-2969. Zhang,S.S., Liu,M.G., Kano,A., Zhang,C., Fu,X.Y., and Barnstable,C.J. (2005). STAT3 activation in response to growth factors or cytokines participates in retina precursor proliferation. Exp. Eye Res. 81, 103-115. Zhang,T., Kee,W.H., Seow,K.T., Fung,W., and Cao,X. (2000). The coiled-coil domain of Stat3 is essential for its SH2 domain-mediated receptor binding and subsequent activation induced by epidermal growth factor and interleukin-6. Mol. Cell Biol. 20, 7132-7139. Zhang,X., Wrzeszczynska,M.H., Horvath,C.M., and Darnell,J.E. Jr. (1999). Interacting regions in Stat3 and c-Jun that participate in cooperative transcriptional activation. Mol. Cell Biol. 19, 7138-7146. Zhu,W., Mustelin,T., and David,M. (2002). Arginine methylation of STAT1 regulates its dephosphorylation by T cell protein tyrosine phosphatase. J. Biol. Chem. 277, 35787-35790. Zhu,X., Zhang,J., Tollkuhn,J., Ohsawa,R., Bresnick,E.H., Guillemot,F., Kageyama,R., and Rosenfeld,M.G. (2006). Sustained Notch signaling in progenitors is required for sequential emergence of distinct cell lineages during organogenesis. Genes Dev. 20, 2739-2753. xix Annexe III. Publications En parallèle à mon travail sur les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération des cellules de la crête neurale, j’ai participé et contribué à plusieurs autres travaux du laboratoire. Ces travaux ont été intégrés dans des articles qui sont publiés. Durant mes deux premières années de thèse, j’ai participé à l’étude des mécanismes moléculaires régulant le développement du rein embryonnaire de xénope, le pronéphros. Dans un premier temps, j’ai contribué à l’étude du rôle du facteur de transcription Evi-1 dans la régionalisation du pronéphros. Ensuite, j’ai comparé les profils de gènes codant notamment pour des protéines spécialisées dans le transport de solutés dans les reins embryonnaires de xénope et de poisson zèbre. Nos résultats ont montré que le pronéphros du poisson zèbre peut être subdivisé en quatre segments et que les reins embryonnaires du xénope et du poisson zèbre présentent des organisations similaires. Enfin, j’ai étudié le rôle de l’acide rétinoïque (AR) durant la spécification du pronéphros. J’ai montré par des expériences de gain et de perte de fonction l’importance de la voie de signalisation AR dans le développement du rein embryonnaire chez le xénope. Des expériences de traitement à l’AR au cours du temps ont montré qu’il est requis précocement durant la gastrulation pour l’expression de Pax8 et Lim1 dans les précurseurs du pronéphros. Nos résultats ont aussi montré que l’AR pourrait directement réguler l’expression de Lim1. Les résultats obtenus sont repris dans les articles suivants : Van Campenhout,C., Nichane,M., Antoniou,A., Pendeville,H., Bronchain,O.J., Marine,J.C., Mazabraud,A., Voz,M.L., and Bellefroid,E.J. (2006). Evi1 is specifically expressed in the distal tubule and duct of the Xenopus pronephros and plays a role in its formation. Dev. Biol. 294, 203-219. Nichane,M.*, Van Campenhout,C.*, Pendeville,H., Voz,M.L., and Bellefroid,E.J. (2006). The Na+/PO4 cotransporter SLC20A1 gene labels distinct restricted subdomains of the developing pronephros in Xenopus and zebrafish embryos. Gene Expr. Patterns. 6, 667-672. Cartry,J.*, Nichane,M.*, Ribes,V., Colas,A., Riou,J.F., Pieler,T., Dollé,P., and Bellefroid,E.J., and Umbhauer,M. (2006). Retinoic acid signalling is required for specification of pronephric cell fate. Dev. Biol. 299, 35-51. * Ces deux auteurs ont contribué de manière égale à ces travaux. J’ai également participé à l’étude de la fonction de Nucleostemin, une GTPase présente dans le nucléole des cellules souches embryonnaires et de nombreuses lignées cancéreuses. Par des expériences de pertes de fonction, nos résultats ont mis en évidence un rôle de Nucleostemin dans le contrôle de la prolifération des neurones et de la crête neurale chez le xénope. Les résultats obtenus sont repris dans l’article suivant : Beekman,C., Nichane,M., De Clercq,S., Maetens,M., Floss,T., Wurst,W., Bellefroid,E., and Marine,J.C. (2006). Evolutionarily conserved role of nucleostemin: controlling proliferation of stem/progenitor cells during early vertebrate development. Mol. Cell Biol. 26, 9291-9301. Enfin, j’ai contribué à l’étude du mode d’action du facteur de transcription à doigts à zinc SIP1 jouant un rôle important dans la formation du tissu neural. Nos résultats ont montré que SIP1 neuralise l’ectoderme en réprimant directement la transcription de BMP4 et que le co-répresseur CtBP est nécessaire à son activité de répresseur. Les résultats obtenus sont repris dans l’article suivant : van Grunsven,L.A., Taelman,V., Michiels,C., Verstappen,G., Souopgui,J., Nichane,M., Moens,E., Opdecamp,K., Vanhomwegen,J., Kricha,S., Huylebroeck,D., and Bellefroid E.J. (2007). XSip1 neuralizing activity involves the co-repressor CtBP and occurs through BMP dependent and independent mechanisms. Dev. Biol. 306, 34-49.
