discussion generale - Centre de Neurosciences Paris

Transcription

UNIVERSITE PARIS XI
UFR SCIENTIFIQUE D’ORSAY
THESE
Présentée
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI ORSAY
Spécialité : Neurosciences et Biochimie
par
Solenne CHARDONNET
Etude protéomique de la potentialisation à long terme
dans l’hippocampe chez le rongeur
Directeur de thèse : Serge LAROCHE
Soutenance prévue le 4 octobre 2007 devant le jury
M. Hervé DANIEL
Président
Mme Marie-Claude POTIER
Rapporteur
M. Patrick JOUIN
Rapporteur
M. Jean CHAMPAGNAT
Examinateur
M. Serge LAROCHE
Co-directeur
M. Pierre LE MARECHAL
Co-directeur
Les nuages parfois
Viennent reposer les gens
D’admirer la lune
Matsuo Bashô
REMERCIEMENTS
Tout d’abord, je souhaite remercier les membres du jury Hervé Daniel, Marie-Claude Potier,
Patrick Jouin et Jean Champagnat d’avoir accepté d’examiner ce travail et d’y apporter un regard neuf.
Je remercie mes deux directeurs de thèse Serge Laroche (NAMC) et Pierre Le Maréchal
(IBBMC) d’avoir participé à mon apprentissage du métier de chercheur. J’éprouve une sincère
admiration pour leurs qualités scientifiques. Chacun dans son domaine m’a fait partager ses
connaissances, son expérience et son regard. Je les remercie pour les discussions enrichissantes que
nous avons eues, pour leur disponibilité, pour leurs conseils et leurs encouragements. Je souhaite
également remercier Serge de s’être impliqué pour l’obtention d’une bourse Docteur Ingénieur
financée par le CNRS et le conseil général de l’Essonne qui m’a permis d’effectuer cette thèse. Enfin,
je remercie Pierre et l’Université Paris-Sud d’avoir assuré le financement de ma dernière année de
thèse. Merci d’avoir cru en moi et de m’encourager à poursuivre.
Je remercie Sabrina Davis qui a également participé à mon encadrement. Je la remercie
particulièrement pour toute la partie de ce travail qui concerne l’électrophysiologie. Restée fidèle à
elle-même pendant ces 4 années, elle a su maintenir un esprit critique sur mon travail. Grâce à elle,
j’ai mûri et j’ai appris l’autonomie.
Je tiens à remercier Paulette Decottignies qui m’a offert, sans compter, son temps et son
expérience. Avec une patience infinie, avec discrétion mais force et conviction, elle a suivi mon travail
et m’a conseillée, de la conception à la réalisation des expériences. Merci pour tout ce que nous avons
partagé aussi bien scientifiquement qu’humainement.
Je remercie l’équipe de Chimie des Protéines de l’IBBMC, où j’ai passé la majeure partie de
mon temps pendant ces 4 ans. Merci à Christophe Marchand pour son encadrement sur le MALDI,
pour nos discussions sur PDQuest et nos débats interminables sur la constitution Européenne ou le
sexe des figuiers. Je remercie Monique Magneney pour tout ce temps passé à m’aider, me conseiller
et m’apprendre ces petits trucs qui font la différence. Je pense également à toutes les personnes qui
ont fait partie de l’équipe pendant une période plus ou moins longue, Sylvie, Ludo, Blanche, Greg,
Vincent, Laure, Pia, Fanny, Christel et Emilie. Je pense notamment à tous ces moments partagés
autour d’un gâteau ou des biscuits de la Trinitaine (merci Pierre !).
Je n’oublie pas non plus l’institut dans son ensemble, avec cette effervescence stimulante qui
dépasse les étages et les couloirs. Que chacun trouve ici ma gratitude pour tous les moments riches
que j’ai passés dans l’institut. Merci à Lucienne Letellier de m’avoir accueillie à l’IBBMC et d’encourager
le dynamisme de la jeune génération. Bravo à Audrey, Emma et Karine pour l’animation des réunions
Doc-Postdoc et l’organisation des deux premiers congrès de l’IBBMC. J’ai une pensée particulière pour
Olivier et son aide si précieuse, Quentin, Hélène, Roland et tous les adeptes du ballon rond. Longue
vie aux matchs du vendredi !
Je remercie également tous les membres du NAMC. Merci à tous les chercheurs avec qui j’ai
eu l’occasion d’échanger et qui ont apporté un regard extérieur sur mon projet. Merci à Nathalie,
Calette et Gérard pour leurs qualités humaines et leur aide généreuse. Enfin, merci à tous les
doctorants et post-doctorants, notamment Hélène, Katia, Bénédicte, Aurélie, Nadège et Yesser pour
nos discussions animées autour d’un plateau au CESFO, d’une banquette de RER, d’un verre dans un
bar ou d’une piste de danse. De la science à la culture en passant par nos histoires de cœur, nous
avons partagé tous nos petits malheurs et bonheurs.
Je remercie Olivier Laprévote et Jean-Pierre Le Caer avec qui j’ai eu la chance de collaborer et
qui ont apporté des éléments essentiels à la progression de mon travail. Merci également à Laurence
Amar qui m’a si spontanément ouvert la porte de la collaboration scientifique et de l’amitié, puissentelles durer.
Je m’en voudrais d’oublier tous les chercheurs qui m’ont encadrée lors de précédents stages
et ont participé à ma formation et grâce à qui mon enthousiasme pour la recherche est toujours resté
vif. Je pense notamment à Claude Carnaud et Clara Ballerini en DEA, Tim Bliss, Neville Osborne, Hervé
Daniel et Gérard Rinaudo.
Last but not least, je tiens à remercier toute ma famille et mes amis qui ont été présents à
mes côtés tout au long des ces 4 années. Avec leurs marques d’affection, leurs encouragements et les
bons moments que nous avons passés ensemble à Paris ou à Lipari, ils ont participé à mon bien être
et à mon équilibre. Merci à mes parents et à mon frère de m’avoir encouragée tout au long de mes
études et d’avoir cru en moi quand je doutais. Leur confiance et leurs petits coups de pouce ont eu
raison de mes baisses de motivation. Merci également à mes parents d’adoption oserais-je dire,
Chantal pour ses petites touches d’affection et Jean-Pierre sans qui je ne serais probablement pas là…
Enfin, merci à mon JC d’avoir supporté le rythme qu’impose une fin de thèse et d’avoir participé à
mon épanouissement personnel en ensoleillant cette dernière année de rires et de musique.
Si la confrontation de deux domaines scientifiques et de deux modes de pensée n’a pas
toujours été facile à gérer, elle n’en reste pas moins extrêmement enrichissante et porteuse. Avant de
commencer ma thèse, je rêvais de devenir chercheur en Neurosciences et Biochimie, à l’issue de ma
thèse, je rêve de devenir chercheur en Neurosciences et Biochimie ! Si j’y arrive, ce sera aussi grâce à
vous tous. Merci.
RESUME
La potentialisation à long terme (LTP) est un mécanisme de plasticité synaptique qui joue un
rôle fondamental dans la formation de mémoires à long terme. Découverte il y a bientôt 35 ans dans
l’hippocampe, une structure du cerveau impliquée dans différentes formes de mémoire, la LTP a fait
l’objet de nombreux travaux à l’échelle moléculaire afin d’identifier les mécanismes qui sous-tendent
cette forme durable de plasticité. On sait qu’après activation de récepteurs membranaires lors de
l’induction, les phases précoces de la LTP reposent sur des modifications post-traductionnelles de
protéines synaptiques tandis que les phases plus tardives, au-delà de quelques heures, nécessitent la
transcription de gènes et la néo-synthèse de protéines. Dans le travail présenté ici, nous avons
entrepris plusieurs études à large échelle visant à mieux connaître les variations d’expression ou de
phosphorylation des protéines au cours de différentes phases temporelles de la LTP. Dans un modèle
d’induction de la LTP par stimulation à haute fréquence des afférences du gyrus denté de
l’hippocampe chez le rat in vivo, nous avons utilisé des approches protéomiques différentielles par
électrophorèse 2D et spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Dans le but d’identifier des protéines impliquées dans la phase tardive de la LTP, nous avons
étudié le protéome du gyrus denté à des délais tardifs suivant l’induction de la LTP (6 h et 24 h) par
rapport à des tissus contrôles. Le faible nombre de protéines exprimées de façon différentielle à ces
délais nous a amenés à discuter des différents choix méthodologiques qui seraient envisageables pour
compléter une telle approche. En parallèle, nous avons entrepris de rechercher des cibles de Zif268,
un facteur de transcription essentiel à la stabilisation de la LTP et à la consolidation de la mémoire à
long terme, par la comparaison du protéome de souris mutantes n’exprimant pas Zif268 à celui de
souris sauvages. Cette étude a mis en évidence des différences d’expression protéiques liées à la
construction génétique des souris mutantes, rappelant la part non contrôlée des modifications induites
chez les animaux génétiquement modifiés.
Tenant compte de l’importance des modifications post-traductionnelles dans la phase précoce
de la LTP, nous avons également étudié par une approche de phosphoprotéomique la régulation du
niveau de phosphorylation des protéines du gyrus denté à de courts délais après l’induction de la LTP
dans le gyrus denté (0, 15 et 90 min). Cette approche a permis d’identifier plusieurs protéines dont le
niveau de phosphorylation est modifié au cours de la LTP aussi bien dans le sens d’une réduction que
d’une augmentation de phosphorylation. Parmi les protéines identifiées, un tiers est directement
impliqué ou appartient à des familles de protéines connues pour être impliquées dans les mécanismes
de plasticité synaptique. Deux tiers correspondent à des protéines qui n’avaient pas jusque là été
associées à la LTP. Elles constituent autant de pistes pour l’étude de nouveaux mécanismes
moléculaires impliqués dans l’expression de la LTP. Ces travaux montrent que les outils protéomiques,
qui se développent de façon considérable depuis quelques années, permettent d’apporter des
informations nouvelles sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la plasticité neuronale et qui
pourraient être impliqués dans les processus de mémorisation.
Mots clés : Cerveau, Mémoire, Plasticité synaptique, Protéomique, Phosphorylation, Rat, Souris, Zif268
SOMMAIRE
Introduction Générale ................................................................................. 1
A.
B.
LA POTENTIALISATION A LONG TERME, MODELE DE PLASTICITE SYNAPTIQUE ........ 4
A.1.
L’hippocampe, haut lieu de la plasticité synaptique ......................................... 4
A.2.
La synapse glutamatergique ............................................................................. 6
A.3.
La potentialisation à long terme, un mécanisme impliqué dans la mémoire ?. 6
LES MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PHASE PRECOCE DE LA LTP........................ 9
B.1.
C.
Induction de la LTP dans l’hippocampe : rôle des récepteurs du glutamate .... 9
B.1.a
Les récepteurs NMDA ........................................................................................... 9
B.1.b
Les récepteurs AMPA.......................................................................................... 10
B.1.c
Les récepteurs métabotropiques.......................................................................... 11
B.2.
La vague calcique ............................................................................................ 12
B.3.
Rôle clé des kinases ........................................................................................ 14
B.3.a
CaMKII ............................................................................................................. 14
B.3.b
Les MAP kinases ERK1 et 2 ................................................................................. 16
B.3.c
La voie de l’AMPc............................................................................................... 17
B.3.d
La protéine kinase C .......................................................................................... 18
B.3.e
La voie de la PI3K.............................................................................................. 18
B.3.f
Tyrosines-kinases .............................................................................................. 19
B.4.
Rôle des phosphatases.................................................................................... 19
B.5.
Rôle des neurotrophines ................................................................................. 20
B.6.
Une synthèse protéique précoce locale........................................................... 20
LES MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PHASE TARDIVE DE LA LTP ...................... 22
C.1.
Mise en évidence de l’existence de la phase tardive de la LTP ....................... 22
C.2.
Induction de gènes précoces .......................................................................... 22
C.3.
Rôle particulier du facteur de transcription Zif268......................................... 23
C.4.
Expression de gènes effecteurs....................................................................... 25
C.5.
Néosynthèse de protéines............................................................................... 27
C.6.
Localisation de la traduction dans les dendrites activées spécifiquement :
Notion de « tag » synaptique ..................................................................................... 29
D.
E.
LA LTP RESULTE D’UNE COMBINAISON D’EFFETS PRE- ET POSTSYNAPTIQUES ....... 30
D.1.
Augmentation de la quantité de neurotransmetteurs libérés......................... 30
D.2.
Augmentation de la transmission au niveau postsynaptique ......................... 30
D.3.
Modifications morphologiques ........................................................................ 31
LA PROTEOMIQUE....................................................................................................... 33
E.1.
Principe ........................................................................................................... 33
E.2.
Principales méthodes utilisées en protéomique fonctionnelle ....................... 34
E.3.
Quantification en protéomique différentielle.................................................. 37
E.4.
Le développement de la phosphoprotéomique ............................................... 41
E.5.
L’apport de la protéomique en neurosciences ................................................ 44
OBJECTIFS .......................................................................................................................... 48
Partie I : Etude Protéomique de la Phase Tardive de la LTP dans le Gyrus
Denté chez le Rat, In Vivo.......................................................................... 49
INTRODUCTION.................................................................................................................. 50
A.
B.
C.
Choix des délais expérimentaux................................................................................. 50
A.1.
6 h après induction de la LTP .......................................................................... 50
A.2.
24 h après induction de la LTP ........................................................................ 51
Choix des échantillons biologiques............................................................................. 51
B.1.
Sélection du gyrus denté dorsal...................................................................... 51
B.2.
Choix des contrôles ......................................................................................... 52
Choix de l’approche méthodologique ......................................................................... 52
C.1.
L’électrophorèse bidimensionnelle ................................................................. 52
C.2.
Choix des colorants pour l’électrophorèse bidimensionnelle.......................... 52
C.3.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF .............................................................. 53
C.4.
Protocole expérimental ................................................................................... 55
SCHEMA EXPERIMENTAL.................................................................................................... 56
MATÉRIELS ET MÉTHODES ................................................................................................. 57
A.
Animaux ...................................................................................................................... 57
B.
Induction de la LTP dans le gyrus denté chez le rat................................................... 57
B.1.
Chirurgie.......................................................................................................... 57
B.2.
Electrophysiologie ........................................................................................... 58
B.2.a
Implantation des électrodes................................................................................ 58
B.2.b
Induction de la LTP............................................................................................ 59
B.3.
C.
Dissection des tissus ....................................................................................... 59
Electrophorèse bidimensionnelle................................................................................ 59
C.1.
Préparation des échantillons........................................................................... 60
C.1.a
Tampon de solubilisation .................................................................................... 60
C.1.b
Dosage des protéines avec le kit 2D Quant .......................................................... 61
C.2.
Première dimension ........................................................................................ 61
C.2.a
Réhydratation passive ........................................................................................ 62
C.2.b
Incorporation par cupule .................................................................................... 62
C.2.c
Isoélectrofocalisation ......................................................................................... 62
C.3.
Deuxième dimension ....................................................................................... 63
C.3.a
Réduction et alkylation des protéines................................................................... 63
C.3.b
Migration des protéines sur gel SDS-PAGE ........................................................... 63
C.4.
Coloration ........................................................................................................ 63
D.
C.4.a
Bleu de Coomassie............................................................................................. 63
C.4.b
Nitrate d’argent ................................................................................................. 64
Analyse d’image .......................................................................................................... 64
D.1.
Détection des spots ......................................................................................... 64
D.2.
Correspondance des spots entre les gels ........................................................ 65
D.3.
Normalisation .................................................................................................. 65
D.4.
Analyse ............................................................................................................ 66
E.
Digestion trypsique..................................................................................................... 67
F.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF.......................................................................... 67
G.
Identification des proteines par empreinte peptidique.............................................. 68
RÉSULTATS ......................................................................................................................... 70
A.
Préparation de l’échantillon........................................................................................ 70
B.
Mise au point des conditions de migration ................................................................. 70
C.
Mise au point des conditions de coloration ................................................................ 73
D.
Induction de la LTP dans le gyrus denté chez le rat................................................... 74
E.
Analyse de l’expression des protéines colorées au bleu de Coomassie 6h et 24h après
induction de la LTP dans le gyrus denté............................................................................. 74
F.
E.1.
Définition de critères pour l’analyse d’images avec le logiciel PDQuest......... 75
E.2.
Analyse du groupe LTP 6h ............................................................................... 75
E.3.
Analyse du groupe LTP 24h............................................................................. 77
Analyse de l’expression des protéines colorées au nitrate d’argent 6h après induction
de la LTP dans le gyrus denté............................................................................................. 80
DISCUSSION....................................................................................................................... 83
A.
Discussion sur les choix expérimentaux..................................................................... 84
B.
Discussion sur le choix des techniques utilisées ........................................................ 85
Partie II : Etude de la Régulation des Phosphoprotéines au Cours de la
Phase Précoce de la LTP dans le Gyrus Denté chez le Rat, In Vivo ............ 90
A.
Introduction................................................................................................................ 92
B.
Materials and methods ............................................................................................... 93
C.
B.1.
Electrophysiology ............................................................................................ 93
B.2.
Tissue preparation........................................................................................... 93
B.3.
Two-dimensional electrophoresis ................................................................... 94
B.4.
Gel staining ..................................................................................................... 94
B.5.
Image analysis ................................................................................................ 94
B.6.
In-gel digestion and MALDI-TOF Mass spectrometry ..................................... 95
B.7.
NanoLC-MS/MS and Data analysis.................................................................. 95
B.8.
Western blotting ............................................................................................. 96
Results ........................................................................................................................ 97
C.1.
LTP alters the phosphorylation state of a variety of proteins......................... 97
C.2.
Analysis of the regulation of specific phosphorylation sites by western
blotting ..................................................................................................................... 101
D.
Discussion ................................................................................................................. 105
D.1.
Proteins of energetic metabolism ................................................................. 105
D.2.
Protein synthesis and folding........................................................................ 106
D.3.
Proteins of the cytoskeleton ......................................................................... 107
D.4.
Proteins associated with the membrane....................................................... 107
D.5.
Proteins involved in vesicle processing......................................................... 109
D.6.
Signal transduction ....................................................................................... 111
Partie III : Etude Protéomique des Souris Mutantes Zif268................... 113
Conclusions et Perspectives..................................................................... 126
A.
Utilisation des outils protéomiques pour une étude homogène de la régulation des
protéines au cours de la LTP ............................................................................................ 127
B.
Analyse différentielle de l’expression des protéines au cours de la LTP : vers de
nouveaux choix méthodologiques.................................................................................... 128
C.
Elargissement de l’accès aux protéines par fractionnement subcellulaire .............. 130
D.
La part non contrôlée des variations induites chez les animaux génétiquement
modifiés ............................................................................................................................ 131
E.
Identification de nouvelles phosphoprotéines régulées au cours de la LTP ............ 132
Bibliographie............................................................................................ 135
Annexes ................................................................................................... 158
Annexe 1 : Protocole de coloration au nitrate d’argent ........................................... 159
Annexe 2 : Mise au Point de la Coloration au Pro-Q® Diamond ................................ 160
Annexe 3 : Cartographie du Phosphoprotéome du Gyrus Denté de Rat .................. 162
Annexe 4 : Liste des Illustrations ............................................................................. 164
Annexe 5 : Liste des Acronymes ............................................................................... 167
Introduction
Générale
1
Introduction Générale
INTRODUCTION
Les modifications fonctionnelles des cellules neuronales et des réseaux de neurones dans le
cerveau sont depuis longtemps considérées comme étant un mécanisme essentiel à la formation de
mémoires à long terme. En effet, de nombreux arguments expérimentaux suggèrent que le stockage
de l’information dans le cerveau repose sur une augmentation durable de l’efficacité de la
transmission synaptique dans les réseaux de neurones activés par l’expérience, grâce aux propriétés
de plasticité des synapses. Le modèle le plus couramment étudié de cette plasticité synaptique est la
potentialisation à long terme ou LTP, initialement décrite pas Bliss et Lomo en 1973. La
compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la LTP a fait l’objet de
nombreux travaux au cours des trente dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes
permettant la formation et la consolidation de traces mnésiques. Le modèle de la LTP a été découvert
dans l’hippocampe, une région cérébrale impliquée dans plusieurs types de mémoire à long terme
telles que la mémoire épisodique chez l’homme ou la mémoire spatiale chez le rongeur. A l’échelle
moléculaire, certaines des grandes étapes de la mise en place et du maintien de la LTP ont été
décrites à partir de travaux réalisés principalement dans l’hippocampe. Ces mécanismes font intervenir
différents récepteurs du glutamate, des cascades de signalisation intracellulaire ainsi que l’activation
de gènes conduisant à la synthèse de nouvelles protéines (Bliss and Collingridge 1993). De cette
succession d’évènements découle une réorganisation moléculaire et structurelle des synapses.
De la même façon que l’on distingue mémoire à court terme et mémoire à long terme, la LTP
est constituée de deux phases successives qui reposent sur des mécanismes moléculaires distincts. La
phase précoce est associée à des réorganisations rapides induites principalement par des cascades de
signalisation
cellulaire
et
des
modifications
post-traductionnelles
de
nombreuses
protéines
synaptiques. La phase tardive, quant à elle, dépend de la régulation génique. L’inhibition de la
synthèse protéique perturbe le maintien de la LTP sur le long terme (Krug et al. 1984; Otani and
Abraham 1989), de la même manière qu’elle entraîne des déficits dans la formation de mémoire à
long terme tandis que la mémoire à court terme reste intacte (Davis and Squire 1984). Bien que les
grandes étapes moléculaires de la LTP aient été étudiées, les mécanismes impliqués dans les
processus de plasticité synaptique n’ont pas été intégralement décrits.
Le projet de mon doctorat s’est inscrit dans le cadre de l’étude des mécanismes moléculaires
impliqués dans la phase précoce ainsi que dans la phase tardive de la LTP. Dans l’optique de découvrir
de nouvelles protéines impliquées dans la plasticité synaptique, nous avons choisi d’utiliser une
approche protéomique qui permet d’étudier une large gamme de protéines. Compte tenu de
l’importance des modifications post-traductionnelles dans la mise en place de la LTP, nous nous
sommes intéressés à la régulation de l’état de phosphorylation des protéines du gyrus denté, une
sous-région de l’hippocampe, à de courts délais après l’induction de la LTP. Dans la mesure où la
2
phase tardive est associée à des modifications de l’expression des protéines, nous avons envisagé
deux types d’approches pour rechercher des protéines dont l’expression serait modulée à plus long
terme au cours de la plasticité synaptique. Dans un premier temps, nous avons étudié la régulation du
niveau d’expression total des protéines du gyrus denté après l’induction de la LTP. La deuxième
approche avait pour objectif de rechercher les cibles potentielles d’un facteur de transcription dont
l’activation au cours de la LTP a déjà été démontrée : Zif268 (Wisden et al. 1990). Pour ce faire, nous
avons réalisé une analyse protéomique comparative entre des souris sauvages et des souris mutantes
n’exprimant pas ce facteur de transcription. Chez ces souris, la LTP tardive est altérée sans
modification de la phase précoce. Ce modèle permet donc de cibler spécifiquement les protéines
impliquées dans la phase tardive de la LTP.
3
A.
LA POTENTIALISATION A LONG TERME, MODELE DE PLASTICITE SYNAPTIQUE
La plasticité synaptique repose sur la capacité qu’ont les neurones de modifier de façon
durable l’efficacité de la transmission synaptique. Donald Hebb, en 1949, a proposé un modèle
physiologique de l’apprentissage basé sur un mécanisme de plasticité des synapses. Le principe de la
synapse de Hebb est basé sur l’idée selon laquelle deux neurones activés ensemble renforcent leur
connexion de sorte que l’activation de l’un par l’autre sera facilitée à l’avenir.
« When the axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently
takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such
that A’s efficiency, as one of the cells firing B, is increased. »
Plus de vingt ans après, Bliss et Lomo ont mis en évidence pour la première fois l’existence
d’une telle forme de plasticité synaptique : le phénomène de LTP dans le gyrus denté de l’hippocampe
chez des lapins anesthésiés (Bliss and Lomo 1973). Ils ont observé que la stimulation de la voie
perforante, qui innerve le gyrus denté, par un ou plusieurs courts épisodes de stimulation tétanique
engendrait une potentialisation de la réponse postsynaptique évoquée qui pouvait durer plusieurs
heures. Une étude équivalente réalisée chez des animaux non anesthésiés a montré que la LTP
pouvait être maintenue pendant plusieurs jours, voire jusqu’à 16 semaines, dans le gyrus denté (Bliss
and Gardner-Medwin 1973).
La LTP présente trois caractéristiques principales : la coopérativité, l’associativité et la
spécificité de l’entrée synaptique (Bliss and Collingridge 1993). La coopérativité correspond à la
nécessité de stimuler un nombre suffisant d’axones simultanément pour que l’induction ait lieu.
L’associativité signifie qu’un faible stimulus sur une voie nerveuse peut induire une potentialisation de
cette voie si une autre voie convergente vers les mêmes neurones reçoit un stimulus fort
simultanément. Enfin, la LTP est « input-specific » car la potentialisation est spécifique des synapses
qui ont reçu le tetanus. Les propriétés associatives de la LTP répondent au principe de la synapse de
Hebb. En effet, une synapse ne pourra être potentialisée que si elle est activée à un moment où la
région dendritique avec laquelle elle est en contact est dépolarisée.
A.1.
L’hippocampe, haut lieu de la plasticité synaptique
L’hippocampe est une structure sous-corticale enroulée sur elle-même, ce qui lui vaut son
nom. Il appartient au système limbique qui joue un rôle essentiel dans le comportement, en particulier
pour les émotions et la mémoire. La structure de l’hippocampe est représentée dans la figure 1. Il est
formé de deux structures en forme de U inversés, le gyrus denté et la corne d’Ammon (CA – en
référence à la forme des cornes de bélier du dieu Ammon dans la mythologie égyptienne). Les
principales connexions internes de l’hippocampe sont organisées en un circuit trisynaptique excitateur.
La première connexion synaptique se fait entre la voie perforante qui provient du cortex entorhinal et
les neurones granulaires du gyrus denté. Ces neurones projettent ensuite dans la région CA3 de la
corne d’Ammon via des fibres moussues. Les cellules pyramidales de la région CA3 contactent à leur
4
tour les neurones pyramidaux de la région CA1 par l’intermédiaire des collatérales de Schaffer. Ces
derniers neurones envoient leurs projections hors de l’hippocampe, vers le subiculum qui contacte en
retour le cortex entorhinal, formant ainsi une boucle anatomique, ainsi que certaines régions
néocorticales comme le cortex préfrontal. Il existe de nombreuses autres connexions intrahippocampiques ou afférences et efférences avec d’autres structures cérébrales (Braak et al. 1996).
Nous ne décrivons ici que le principal circuit excitateur dans lequel la LTP a été largement étudiée.
(A)
(B)
Figure 1 : (A) Localisation de l’hippocampe dans le cerveau du rat. (B) Coupe transversale
d’hippocampe, représentation de la boucle trisynaptique. (source : http://lecerveau.mcgill.ca/)
L’induction de la LTP n’est pas restreinte aux synapses du gyrus denté de l’hippocampe, elle
peut être induite dans les régions CA1 et CA3 mais également dans d’autres régions cérébrales telles
que le cortex visuel, le cortex préfrontal, le striatum, le noyau géniculé médian du système auditif, le
fimbria-fornix ou plusieurs régions du système limbique (l’amygdale, le cortex entorhinal et le septum)
(Bennett 2000). Toutefois, l’hippocampe représente un modèle particulièrement intéressant lorsqu’il
s’agit de comprendre les liens entre les mécanismes de plasticité de la LTP et ceux de l’apprentissage.
L’induction de la LTP dans l’hippocampe chez le rongeur peut se faire in vivo par implantation
d’électrodes chez l’animal anesthésié ou sur des coupes maintenues en vie pendant plusieurs heures
par immersion dans du liquide céphalorachidien artificiel. In vivo, la stimulation peut être induite chez
l’animal anesthésié ou chez l’animal éveillé. En règle générale, in vivo la LTP est principalement
5
étudiée dans la région du gyrus denté, tandis que sur tranche elle est principalement étudiée dans la
région CA1. En effet, sur tranche, les neurones du gyrus denté sont soumis à une forte inhibition et
l’induction de la LTP nécessite l’utilisation d’inhibiteurs GABAergiques. A l’inverse, in vivo, l’induction
de la LTP dans la région CA1 est plus délicate car les sites de stimulation (hippocampe controlatéral
ou voie commissurale) sont beaucoup plus épileptogènes. Dans ce travail, nous avons centré notre
recherche sur la LTP dans le gyrus denté in vivo chez le rat anesthésié.
A.2.
La synapse glutamatergique
Le neurotransmetteur caractéristique des synapses excitatrices de l’hippocampe est le
glutamate. Dans la fente synaptique, il agit de façon spécifique sur des récepteurs glutamatergiques
et le caractère transitoire de l’excitation est contrôlé par sa recapture rapide par les cellules gliales. Il
existe deux groupes de récepteurs glutamatergiques, classés en fonction de leur mode d’action : les
récepteurs ionotropiques et métabotropiques.
Les récepteurs ionotropiques sont des canaux ioniques dont l’ouverture dépend de la liaison
du glutamate. Ils comprennent les récepteurs AMPA (activés par le α–amino-3-hydroxy-5-méthyl-4isoxazolepropionate), kaïnate et NMDA (activés par le N-méthyl-D-aspartate). Les récepteurs kaïnate
ne sont pas exprimés dans les synapses excitatrices du gyrus denté et de la région CA1 (Jaskolski et
al. 2005). En revanche, les récepteurs AMPA et NMDA sont abondamment exprimés dans
l’hippocampe et sont impliqués dans la LTP (Bliss and Collingridge 1993). Ces deux types de
récepteurs se distinguent par la nature des ions qu’ils laissent entrer dans la cellule. Les récepteurs
AMPA permettent une entrée de Na+ couplée à une sortie de K+ et ne sont que faiblement perméables
au Ca2+, tandis que les récepteurs NMDA sont perméables aux ions Ca2+, ce qui leur confère un rôle
prépondérant dans l’induction de la LTP.
Les récepteurs métabotropiques sont couplés à des protéines G et à des cascades de
messagers secondaires. Ils peuvent être localisés au niveau pré- ou postsynaptique et participent
également à l’expression de la LTP (Bliss and Collingridge 1993).
A.3.
La potentialisation à long terme, un mécanisme impliqué dans la
mémoire ?
Le rôle majeur que joue l’hippocampe dans la formation de la mémoire a été révélé par
l’exérèse ou l’inactivation de la formation hippocampique (hippocampe associé au complexe
subiculaire et aux aires corticales entorhinale et perirhinale). Chez l’homme comme chez l’animal, elles
conduisent à une amnésie antérograde (incapacité à former de nouveaux souvenirs) ainsi qu’une
amnésie rétrograde partielle (perte des souvenirs acquis peu de temps avant l’opération). De
nombreuses études ont été réalisées chez l’animal afin de caractériser les fonctions de l’hippocampe
(Eichenbaum 2004, 2006). Il est généralement admis que l’hippocampe participe à la formation de la
mémoire tandis que le stockage à long terme des souvenirs a lieu dans le cortex (Frankland and
Bontempi 2005). Toutefois, un autre modèle (multitraces) propose l’implication de l’hippocampe, non
6
seulement dans l’acquisition mais également au moment du rappel d’un souvenir (Nadel and
Moscovitch 1997).
Chez le rat, l’hippocampe joue un rôle crucial dans l’apprentissage spatial, la capacité d’établir
une cartographie du contexte environnemental et l’association de ces données avec les données
temporelles (Sweatt 2004a). Le test le plus fréquemment utilisé pour étudier la mémoire spatiale chez
les rongeurs est le test de la piscine de Morris au cours duquel l’animal doit apprendre à retrouver une
plate-forme cachée sous l’eau en se basant sur des indices spatiaux. Chez des animaux ayant subi des
lésions hippocampiques, l’apprentissage des informations spatiales est altéré dans ce test (Morris et
al. 1982).
Un des enjeux des recherches portant sur la LTP consiste à savoir si ce mécanisme joue un
rôle crucial dans les processus d’apprentissage et de mémoire. S’il n’y a toujours pas de
démonstration définitive indiquant que la consolidation de la mémoire est basée sur l’induction de
modifications identiques à celles qui sont nécessaires à l’induction de la LTP, les arguments
expérimentaux suggérant que l’induction et le maintien de la LTP miment des mécanismes de
plasticité synaptique impliqués dans la mémorisation à court et à long terme respectivement sont de
plus en plus nombreux (Lynch 2004; Miyamoto 2006).
La durée de la LTP, qui a été observée jusqu’à un an chez le rat (Abraham et al. 2002), et ses
propriétés de coopérativité, d’associativité et de spécificité vis-à-vis des entrées synaptiques activées
sont des arguments en faveur de l’hypothèse selon laquelle la LTP pourrait constituer un mécanisme
de plasticité important pour certaines formes de mémoire. En outre, elle peut être induite par des
trains d’activité qui miment le rythme naturel thêta enregistré dans l’hippocampe au cours d’un
apprentissage (Larson et al. 1986). De la même façon que la mémoire évolue au cours du temps et
peut être altérée par l’environnement, les synapses potentialisées restent plastiques et la LTP peut
être annulée (Abraham et al. 2006). Historiquement, les premiers arguments directs sont venus de
l’utilisation
d’inhibiteurs
pharmacologiques
de
la
LTP
tels
que
l’AP5
(acide
2-amino
5-
phosphonopentanoïque), antagoniste des récepteurs NMDA. Les premières données ont montré que
l’injection de cet antagoniste bloque l’induction de la LTP et s’accompagne de déficits importants
d’apprentissages dépendants de l’hippocampe (Collingridge et al. 1983; Morris et al. 1986; Davis et al.
1992). En outre, il a été montré que la saturation des synapses hippocampiques par une stimulation
tétanique massive des afférences entorhinales pouvait entraîner des déficits d’apprentissage dans des
tâches dépendantes de l’hippocampe (McNaughton et al. 1986; Moser et al. 1998). Enfin, de
nombreuses modifications biochimiques se produisant au cours de la LTP ont également été
retrouvées lors de l’acquisition de mémoire (Lynch 2004).
Plus récemment, de nombreux travaux sont venus conforter ces premières observations. La
majorité de ces travaux visant à étudier les mécanismes moléculaires de la LTP et de la mémoire a été
réalisée par le blocage pharmacologique de certaines molécules cibles ou par l’analyse phénotypique
d’animaux génétiquement modifiés (Elgersma and Silva 1999). De nombreux animaux génétiquement
7
modifiés ont été produits dans les années 90, le plus souvent par élimination d’un gène cible
(knockout) permettant d’étudier à la fois la LTP et des tâches d’apprentissage dépendantes de
l’hippocampe (Lynch 2004). Chez ces animaux, des déficits d’induction ou de maintien de la LTP ont
pu être mis en parallèle avec une altération des capacités mnésiques. L’absence de la sous-unité
NR2A des récepteurs NMDA, par exemple, augmente le seuil d’intensité nécessaire à l’induction de la
LTP ainsi que le seuil d’apprentissage des animaux pour une tâche de conditionnement de peur au
contexte (Kiyama et al. 1998). De nombreuses molécules de signalisation ont été ciblées avec ce type
d’études. On citera l’exemple de l’isoforme alpha de la Ca2+/calmoduline kinase 2 (CaMKII), de la PKA
ou de la MAPK ERK2 dont l’activation participe aussi bien à l’induction de la LTP qu’à la mise en place
de la mémoire spatiale (Abel et al. 1997; Gooney et al. 2002; Lisman et al. 2002). Le facteur de
transcription CREB est également activé dans l’hippocampe au cours de la LTP comme au cours d’un
apprentissage (Davis et al. 2000a; Gooney et al. 2002). A l’inverse, la phosphatase PP1 régule
négativement l’efficacité de la transmission synaptique ainsi que l’apprentissage et la mémoire et
l’inhibition de la phosphatase facilite la potentialisation et l’apprentissage spatial (Munton et al. 2004).
Des protéines synaptiques comme les récepteurs NMDA-R1 (Tsien et al. 1996) et la protéine de la
densité postsynaptique PSD-95 (Migaud et al. 1998), ou encore les gènes précoces Arc ou c-fos
(Guzowski et al. 2000; Fleischmann et al. 2003) ont également donné lieu à la construction de souris
mutantes qui présentent toutes des déficits parallèles d’induction de la LTP et de mémoire spatiale.
Toutefois, dans certains cas, la corrélation entre la LTP et la mémoire n’a pas été retrouvée. C’est le
cas par exemple de souris qui n’expriment pas les récepteurs de type 2 de la somatostatine (Dutar et
al. 2002) ou les récepteurs ryanodine de type 3 (Balschun et al. 1999). D’autres modèles, qui ne sont
pas directement liés à la LTP, comme le vieillissement ou des modèles murins de la maladie
d’Alzheimer montrent des altérations de la LTP associés à des déficits d’apprentissage et de mémoire
(Manahan-Vaughan et al. 2003; Jacobsen et al. 2006) (Martin et al. 2000).
Si les phases précoces de la LTP présentent de nombreux parallèles avec la mémoire à court
terme, les modifications plus sélectives des phases tardives de la LTP sont associées à des déficits de
mémoire à long terme, mais pas de mémoire à court terme. C’est le cas, par exemple, de l’inhibition
de Arc ou Zif268 (Jones et al. 2001; Plath et al. 2006). Le blocage de la traduction ou de la
transcription par des outils pharmacologiques empêche le maintien à long terme de la LTP, de la
même façon qu’elle altère de nombreuses formes de mémoires à long terme (Daniels 1971; Mizumori
et al. 1985; Frey et al. 1988; Otani and Abraham 1989). Les processus de mémoire et la LTP peuvent
donc être perturbés de façon parallèle à des stades précoces ou plus tardifs selon les mécanismes
cellulaires ciblés. Ces observations démontrent un parallèle essentiel entre l’organisation temporelle et
moléculaire de la LTP et de la mémoire : elles présentent une première phase, pouvant durer
quelques heures, qui ne dépend pas de l’expression des protéines, suivie d’une deuxième phase
strictement dépendante de régulations transcriptionnelles et de la synthèse protéique. L’ensemble de
ces données renforce l’idée selon laquelle la phase précoce de la LTP serait un mécanisme synaptique
8
essentiel à la mémoire à court terme et sa phase tardive un mécanisme impliqué dans les processus
de consolidation en mémoire à long terme.
Deux données récentes renforcent considérablement les liens entre LTP et mémoire. D’une
part, des augmentations de l’efficacité synaptique ont pu être détectées dans la région CA1 de
l’hippocampe au cours d’un apprentissage (Gruart et al. 2006; Whitlock et al. 2006). D’autre part,
l’application d’un inhibiteur de la protéine kinase PKM ζ injecté après l’induction de la LTP ou après un
apprentissage, peut annuler la LTP et « effacer » un souvenir (Pastalkova et al. 2006). Ces données
sont discutées par Bliss, Collingridge et Laroche (Bliss et al. 2006). Elles satisfont deux critères
supplémentaires parmi ceux énoncés dans la revue de Martin, Grimwood et Morris, à savoir la
possibilité de détecter un changement de l’efficacité synaptique au cours d’un apprentissage et la
possibilité d’induire une altération rétrograde (l’altération de l’efficacité synaptique qui a été induite
par un apprentissage antérieur perturbe la mémoire qu’a l’animal de cet apprentissage) (Martin et al.
2000).
Compte tenu de la pertinence du modèle de la LTP pour comprendre les mécanismes
moléculaires qui sous-tendent la mise en place et la consolidation de la mémoire, nous nous sommes
intéressés aux mécanismes biochimiques des différentes phases de la LTP. Un aperçu des
connaissances actuelles sur les mécanismes moléculaires de la LTP dans l’hippocampe est présenté
dans les chapitres suivants. Sur la base de la dépendance vis-à-vis de la synthèse protéique, nous
distinguerons la phase précoce de la phase tardive de la LTP. Toutefois dans certains cas, nous
évoquerons 3 phases de la LTP correspondant à la phase précoce (LTP1), aux premières heures de la
phase tardive qui dépendent de la synthèse protéique mais pas de la transcription de gènes (LTP2) et
au maintien à long terme de la phase tardive qui dépend aussi bien de la traduction que de la
transcription (LTP3) (Bliss and Collingridge 1993).
B.
LES MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PHASE PRECOCE DE LA LTP
B.1.
Induction de la LTP dans l’hippocampe : rôle des récepteurs du glutamate
B.1.a
Les récepteurs NMDA
Les récepteurs NMDA sont essentiels à l’induction de la LTP. L’inhibition des récepteurs NMDA
par des antagonistes compétitifs, comme l’AP5, ou non compétitifs, comme le MK801, bloque la LTP
dans la région CA1 et le gyrus denté (Coan et al. 1987; Errington et al. 1987). En condition basale, les
canaux associés à ces récepteurs sont bloqués par des ions magnésium dont la libération nécessite
une forte dépolarisation membranaire au niveau postsynaptique (Collingridge et al. 1992). La liaison
du glutamate conjointement à une dépolarisation membranaire conduit à l’ouverture du canal et à une
9
entrée de calcium dans la synapse activée (Nowak et al. 1984). La nécessité de coordination de ces
deux évènements illustre au niveau moléculaire le caractère associatif de la LTP.
Les récepteurs NMDA sont constitués d’une sous-unité NR1 associée à au moins l’une des 4
sous-unités NR2A-D ou NR3. Les sous-unités NR2A et NR2B participent toutes les deux à l’expression
de la LTP dans l’hippocampe comme l’ont montré des études réalisées avec des souris mutantes
n’exprimant pas ces sous-unités (Kutsuwada et al. 1996; Kiyama et al. 1998). En plus de la région
intramembranaire qui forme le canal NMDA, la région C-terminale intracellulaire des sous-unités NR2
joue un rôle clé dans l’expression de la plasticité synaptique (Sprengel et al. 1998). Cette région peut
interagir avec des protéines d’ancrage telles que des protéines à domaine PDZ membres de la famille
PSD-95/SAP90 qui établissent un lien avec des voies de transduction (Niethammer et al. 1996; Kornau
et al. 1997).
L’état de phosphorylation des récepteurs NMDA peut être régulé, ce qui modifie leur
probabilité d’ouverture mesurée par des méthodes de patch-clamp. La phosphorylation du récepteur
accroît la fréquence et la durée d’ouverture du canal et sa déphosphorylation les réduit (Lieberman
and Mody 1994; Wang et al. 1994; Wang and Salter 1994). La sous-unité NR2B peut être
phosphorylée par la CaMKII (sur la sérine 1303) (Omkumar et al. 1996) ou par la tyrosine kinase Fyn
(sur la tyrosine 1472) et son niveau de phosphorylation augmente au cours de la LTP (Nakazawa et
al. 2001), conduisant à une amplification de l’influx de calcium.
B.1.b
Les récepteurs AMPA
Les récepteurs AMPA interviennent dans la transmission rapide normale permettant à l’influx
nerveux de se propager de neurone en neurone. Au cours de la LTP, ils sont donc rapidement activés
lors de la stimulation tétanique par liaison du glutamate, entraînant une dépolarisation membranaire
importante et prolongée qui va permettre l’ouverture des canaux NMDA par éjection des ions
magnésium. En outre, les récepteurs AMPA sont fortement impliqués dans le maintien de la LTP.
Au cours de la LTP, la conductance ainsi que le nombre de ces récepteurs augmente à la
synapse. Comme pour les récepteurs NMDA, la conductance des récepteurs AMPA est contrôlée par
leur état de phosphorylation (Derkach et al. 1999). Il existe 4 sous-unités AMPA, nommées GluR1 à 4.
La sous-unité GluR1, en particulier, est la cible de plusieurs kinases telles que CaMKII (Barria et al.
1997), PKA (Boehm and Malinow 2005) et PKC (Boehm et al. 2006). Le nombre de récepteurs
présents à la synapse augmente au cours de la LTP grâce à l’insertion de nouveaux récepteurs. Dans
une étude réalisée par Shi et al., la distribution des récepteurs AMPA a pu être suivie grâce à
l’expression d’un récepteur couplé à une molécule fluorescente dans des neurones hippocampiques.
Suite à l’activation des récepteurs NMDA, les récepteurs AMPA sont largement exprimés au niveau
dendritique et notamment dans les épines (Shi et al. 1999). L’incorporation de la sous-unité GluR1 est
indispensable à l’induction de la LTP et nécessite l’interaction des récepteurs avec des protéines à
domaine PDZ (Hayashi et al. 2000). Elle se fait en deux étapes : l’insertion des récepteurs dans la
membrane extra-synaptique suivie d’une migration vers les synapses où ils sont stabilisés par les
protéines de la densité postsynaptique (Figure 2) (Derkach et al. 2007).
10
Figure 2 : Illustration de l’incorporation des récepteurs AMPA contenant la sous-unité GluR1 au cours
de la LTP. Source : (Derkach et al. 2007)
B.1.c
Les récepteurs métabotropiques
Il existe au moins 8 récepteurs métabotropiques différents, nommés mGluR1-8, qui sont tous
exprimés dans l’hippocampe à l’exception de mGluR6 (Shigemoto et al. 1997). Dans la région CA1, les
récepteurs mGluR2 et 3, qui sont couplés à l’adénylate cyclase, pourraient être impliqués dans les
mécanismes de feedback au niveau présynaptique. L’utilisation d’agonistes de ces récepteurs réduit
l’amplitude de la LTP tandis que des antagonistes l’amplifient (Behnisch et al. 1998). Ils ne sont
toutefois pas essentiels à l’expression de la LTP dans la région CA1.
Les récepteurs mGluR1 et mGluR5, quant à eux, sont couplés à la phospholipase C qui induit
la transformation de phospholipides membranaires en phosphatidyl inositol trisphosphate (IP3) et en
diacyl glycérol (DAG). Ils sont localisés au niveau postsynaptique et ont un effet positif sur l’induction
de la LTP. L’absence des récepteurs mGluR5 chez des souris mutantes réduit significativement
l’amplitude de la LTP dans la région CA1 (Lu et al. 1997) et l’inhibition spécifique des récepteurs
mGluR1 entraîne une altération de l’expression de la LTP dans le gyrus denté chez des animaux
éveillés (Naie and Manahan-Vaughan 2005). Ces récepteurs interagissent et coopèrent positivement
avec les récepteurs NMDA (Lu et al. 1999; Fujii et al. 2003).
Les trois types de récepteurs NMDA, AMPA et métabotropiques interviennent donc en parallèle
et interagissent entre eux afin d’amplifier les mécanismes d’induction de la potentialisation induite à la
synapse (Figure 3). Leur activation conjointe conduit à une forte augmentation de la concentration de
calcium intracellulaire ainsi qu’à l’activation de nombreuses voies de signalisation. Ces évènements
moléculaires sont décrits dans les paragraphes suivants.
11
(A)
(B)
Figure 3 : Schéma de l’activité des récepteurs NMDA, AMPA et métabotropiques du glutamate dans
des conditions de repos (A) ou après induction de la LTP (B). Source : (Kandel et al. 2000)
B.2.
La vague calcique
L’augmentation postsynaptique de calcium est nécessaire et suffisante pour l’expression de la
LTP (Bliss and Collingridge 1993). La LTP est bloquée par l’injection d’EGTA, un chélateur du calcium
(Lynch et al. 1983b) tandis que l’infusion de calcium au niveau postsynaptique grâce à l’utilisation d’un
chélateur de calcium photolabile sensible aux UV suffit à induire la LTP (Malenka et al. 1988).
L’augmentation de calcium intracellulaire se fait, au moins en partie, via les récepteurs NMDA qui sont
perméables aux ions calcium. Toutefois, si elle est généralement nécessaire à l’induction de la LTP
12
dans la région CA1 et le gyrus denté, l’activation des récepteurs NMDA n’est pas suffisante pour
induire la LTP (Bliss and Collingridge 1993). Cela suggère que le taux de calcium ne dépend pas
uniquement de l’influx de calcium extracellulaire. En effet, l’utilisation de thapsigargine, qui élimine les
réserves de calcium intracellulaire, inhibe la LTP (Bortolotto and Collingridge 1993). Les sources de
calcium intracellulaire peuvent être recrutées par l’intermédiaire des récepteurs métabotropiques du
glutamate (Bortolotto and Collingridge 1993). Les récepteurs mGluR1 et mGluR5 induisent la libération
de calcium stocké dans le réticulum endoplasmique (Rae and Irving 2004) via l’inositol trisphosphate
(IP3) (Nakamura et al. 2000) ou les récepteurs ryanodine (Mellentin et al. 2007). Les récepteurs
ryanodine peuvent aussi être activés par l’action des récepteurs NMDA. En effet, l’entrée de Ca2+ par
le canal NMDA peut activer la NO-synthase qui produit du monoxyde d’azote (NO). Le NO active la
voie du GMPc et induit la libération de calcium à partir des réserves intracellulaires sensibles à la
ryanodine (Lu and Hawkins 2002).
Une autre source possible d’augmentation du calcium intracellulaire correspond à l’ouverture
des canaux calciques voltage-dépendants. Les travaux réalisé par Raymond et Redman ont montré
que les sources de calcium étaient différentes selon l’intensité de la stimulation dans la région CA1 sur
des coupes d’hippocampe (Raymond and Redman 2002). L’augmentation de Ca2+ issue des réserves
intracellulaires dépend des récepteurs ryanodine dans le cas d’une faible stimulation et des récepteurs
de l’IP3 quand la stimulation est un peu plus forte (4 trains de stimulation théta au lieu d’un seul).
Enfin, suite à une stimulation encore plus forte (8 trains de stimulation théta), l’induction d’une forme
soutenue de la LTP nécessite l’activation de canaux calciques voltage-dépendants. Les auteurs ont
associé ces trois sources possibles du calcium aux différentes phases de la LTP dans un modèle où la
localisation de l’augmentation de calcium serait déterminante. L’activation des récepteurs ryanodine,
qui induit une libération de calcium dans les épines dendritiques, serait associée à la LTP1 ;
l’activation des récepteurs de l’IP3 produit un signal calcique dans les dendrites qui serait nécessaire à
la phase 2 de la LTP ; et l’activation des canaux calciques voltage-dépendants engendre une
augmentation de calcium dans le soma, correspondant à la LTP3 (Figure 4). La localisation du calcium
pourrait conditionner les voies de signalisation qui sont engagées et la forme de la LTP (Raymond and
Redman 2006).
Dans notre modèle, la stimulation utilisée pour induire la LTP étant de forte intensité, le
calcium est certainement recruté à la fois dans les dendrites et dans le soma, faisant intervenir une
combinaison de tous ces mécanismes.
13
Figure 4 : Modèle d’encodage spatial de l’induction des trois formes de LTP (LTP1, 2 et 3) régulé par
la localisation de la libération de Ca2+ dans les cellules neuronales. NMDAR : récepteur NMDA, RyR :
récepteur ryanodine, PSD proteins : protéines de la densité postsynaptiques, IP3R : récepteur de
l’inositol trisphosphate, L-VDCC : canaux calciques voltage-dépendants, mGluR : récepteur
métabotropique du glutamate. Source : (Raymond and Redman 2006)
B.3.
Rôle clé des kinases
La phase précoce de la LTP dépend de l’activation de nombreuses protéines kinases.
L’inhibition de l’ensemble des kinases, ou des tyrosines kinases en particulier, bloque l’induction de la
LTP (Malinow et al. 1988; Huang and Hsu 1999). En revanche, elle ne bloque pas son expression,
suggérant une implication transitoire de la phosphorylation dans l’expression de la LTP (Malinow et al.
1988). La facilitation de la transmission synaptique par la phosphorylation des récepteurs AMPA et
NMDA a déjà été évoquée mais les récepteurs ne sont pas les seules cibles des kinases au cours de la
LTP et les voies de signalisation engagées sont nombreuses et imbriquées de façon complexe. Les
principales kinases impliquées dans la LTP sont décrites ci-dessous.
B.3.a
CaMKII
La protéine kinase Ca2+/Calmoduline-dépendante II (CaMKII) est l’une des protéines les plus
abondantes dans les neurones. Elle représente 2 % des protéines de l’hippocampe (Erondu and
Kennedy 1985). Bien qu’elle soit exprimée aussi bien au niveau présynaptique que postsynaptique,
14
elle est préférentiellement localisée dans la densité postsynaptique où elle interagit avec plusieurs
protéines spécifiques (Fink and Meyer 2002). La CaMKII est organisée en homooligomères ou
hétérooligomères composés, dans l’hippocampe, des sous-unités α et/ou β. L’entrée de calcium
postsynaptique conduit à l’activation de la CaMKII qui peut s’autophosphoryler sur la thréonine 286
pour la sous-unité α et la thréonine 287 pour la sous-unité β (Giese et al. 1998).
L’autophosphorylation permet à la CaMKII de s’activer de façon indépendante du calcium et de la
calmoduline (Miller and Kennedy 1986). Cette propriété d’autophosphorylation confère à la CaMKII la
particularité de pouvoir maintenir un niveau de phosphorylation élevé pendant une période de temps
bien plus longue que celle de la vague calcique : après induction de la LTP, elle reste active pendant
au moins une heure (Fukunaga et al. 1993). La réduction de l’activité de la CaMKII est conditionnée
par sa déphosphorylation par des phosphatases. Elle peut être déphosphorylée par la protéine
phosphatase PP2A dans le cytosol ou par la protéine phosphatase 1 (PP1) au niveau synaptique
(Strack et al. 1997). Elle possède également un site d’autoinhibition (thréonine 305/306 pour la
CaMKIIα/β) dont la phosphorylation bloque son activité (Colbran and Soderling 1990).
Au cours de la LTP, une partie de la CaMKII est transférée au niveau de la densité
postsynaptique et se lie aux récepteurs NMDA (Otmakhov et al. 2004). Cette liaison avec les
récepteurs NMDA semble être essentielle pour l’induction de la LTP (Barria and Malinow 2005). Le
transfert de la CaMKII est dépendant de l’augmentation de calcium et de la calmoduline. Etant donné
que les influx de calcium par les récepteurs NMDA sont spécifiquement localisés dans les synapses
potentialisées et que l’adressage de la kinase est corrélé avec la présence du Ca2+, la CaMKII
contribue à la spécificité synaptique de la LTP (Merrill et al. 2005).
La CaMKII joue un rôle central dans l’induction et le maintien de la LTP car elle régule le
niveau de phosphorylation de nombreuses cibles cellulaires (Yoshimura et al. 2000; Yoshimura et al.
2002). Elle participe notamment à l’augmentation de la conductance des récepteurs AMPA et NMDA
en phosphorylant les sous-unités GluR1 et NR2B respectivement (Omkumar et al. 1996; Derkach et al.
1999). De même, elle participe à l’incorporation synaptique des récepteurs AMPA contenant la sousunité GluR1 (Shi et al. 2001). La CaMKII cible également des protéines d’ancrage (comme PSD-95,
SAP97, SAP90), des protéines du cytosquelette (telles que l’internexine α, les tubulines α et β,
l’actinine α et la MAP2), des protéines de trafic cellulaire, de l’endocytose, de l’exocytose (Figure 5),
ou encore d’autres protéines de signalisation (comme la calcineurine) (Fink and Meyer 2002).
Certaines de ces protéines se trouvent aussi bien au niveau présynaptique que postsynaptique, telles
que la synapsine I et la protéine MAP2 associée aux microtubules (Fukunaga et al. 1996). Les
fonctions de la CaMKII dans la LTP sont donc très variées et complexes.
De nombreuses études réalisées sur des coupes d’hippocampe ont montré que la CaMKIIα, et
en particulier sa capacité à s’autophosphoryler sur la thréonine 286, était indispensable à l’induction
de la LTP dans la région CA1 (Giese et al. 1998). Elle n’est pourtant pas toujours essentielle.
L’élimination du site de phosphorylation par la CaMKII sur les récepteurs AMPA, par exemple, n’induit
qu’une réduction partielle de la LTP (Lee et al. 2003). De plus, une étude récente a mis en évidence le
15
fait que son implication était différente entre la région CA1 de l’hippocampe et le gyrus denté où elle
n’est pas essentielle (Cooke et al. 2006). Ces observations ne mettent pas en doute l’implication de la
CaMKII dans l’induction ou le maintien de la LTP mais suggèrent qu’elle agit en synergie avec d’autres
voies de signalisation.
Figure 5 : Illustration de l’implication de la CaMKII dans le processus d’exocytose. Source : (Turner et
al. 1999)
B.3.b
Les MAP kinases ERK1 et 2
La principale voie d’activation des MAPK-ERK dépend de l’activation des petites protéines G
Ras qui activent à leur tour Raf-1, puis la MAPK kinase (MEK) qui contrôle finalement l’activation de
ERK1 et 2. La famille Ras des petites protéines G est spécifiquement requise pour l’incorporation des
récepteurs AMPA activité-dépendante et l’induction de la LTP (Zhu et al. 2002). ERK1 et 2 se trouvent
à la convergence de nombreuses voies de signalisation telles que la voie de la PKC, de la PKA
ou de la CaMKII via la Ras GTPase-activating protein SynGAP (Figure 6) (Sweatt 2004b). La cascade
de la CaMK kinase, qui n’est pas représentée dans la figure 6, agit également en amont de la voie
Ras/MEK/ERK et introduit un lien entre l’élévation de calcium et l’activation des MAPK (Schmitt et al.
2004).
L’induction de la LTP s’accompagne d’une augmentation rapide du niveau de phosphorylation
des MAPK-ERK (English and Sweatt 1997; Davis et al. 2000a). A l’inverse, l’inhibition de ERK supprime
la LTP dans la région CA1 ainsi que dans le gyrus denté (Impey et al. 1998; McGahon et al. 1999).
L’activation de ERK est impliquée aussi bien dans la phase précoce que tardive de la LTP, par
conséquent, les cibles des kinases ERK sont multiples, conférant à ces protéines des fonctions variées
dans l’expression de la LTP (Lynch 2004). Ces kinases sont particulièrement connues pour leur rôle
16
d’induction de gènes précoces par la régulation de facteurs de transcription tels que Elk-1 ou CREB
(Davis et al. 2000a). Elles induisent notamment l’expression des gènes zif286 ou arg3.1/arc qui sont
impliqués dans le maintien à long terme de la LTP (Waltereit et al. 2001; Davis et al. 2003). Elles
agissent également au niveau présynaptique où elles augmentent la libération de glutamate
(Greengard et al. 1993).
Trk
mGluR
NMDA
AMPA
mGluR
Tyrosine kinase
Gβγ
Ras/raf
PI-3K
PKA
PKC
CaMKII
ERK
Protéines de
signalisation
-
Protéines du
cytosquelette
PLA2
RSK2
-
MAP-2
Tau
Arc
Protéines des
synaptosomes
-
Synapsin
Kv4.2
Régulation de la libération de neurotransmetteurs
Transcription des gènes
Synthèse des Protéines
Changements morphologiques
Protéines
nucléaires
-
CREB
ATF
ELK1
cEBPβ
c-fos
c-jun
c-myc
Expression de la LTP
Apprentissage
Formation de la mémoire
Figure 6 : La voie des MAP kinases ERK1 et 2 se trouve à la convergence de nombreuses voies de
signalisation et agit à différents niveaux pour la régulation de la plasticité synaptique. (d’après Lynch,
2004)
B.3.c
La voie de l’AMPc
La LTP est associée à une augmentation de la concentration intracellulaire d’AMPc, qui induit
l’activation de la PKA et conduit à l’activation de facteurs de transcription tels que CREB (cAMP
response element-binding protein) ou c-fos (Waltereit et al. 2001; Nguyen and Woo 2003). La
17
stimulation de la PKA peut induire directement une potentialisation (Frey et al. 1993). La PKA
phosphoryle la sous-unité GluR1 des récepteurs AMPA, favorisant à la fois la probabilité d’ouverture du
canal (Banke et al. 2000) et le trafic de ces récepteurs à la membrane (Oh et al. 2006). Son inhibition
altère l’induction de la LTP dans la région CA1 de l’hippocampe par la réduction de la conductance des
récepteurs NMDA au calcium (Skeberdis et al. 2006). La PKA favorise la libération de BDNF qui
contribue à l’établissement de la LTP tardive (Patterson et al. 2001). Elle apparaît même indispensable
pour le maintien de la phase tardive de la LTP puisque son inhibition bloque la phase tardive de la LTP
dans le gyrus denté (Nguyen and Kandel 1996).
La voie de l’AMPc est reliée à l’activation d’autres kinases telles que les MAPK-ERK1 et 2 ou la
CaMKII (Vossler et al. 1997; Blitzer et al. 1998). Elle inhibe la PP1, probablement via la calcineurine,
et favorise la phosphorylation de la CaMKII. En agissant ainsi à l’interface entre plusieurs cascades de
signalisation et l’expression de gènes précoces nécessaires à l’expression des phases tardives de la
LTP, l’AMPc pourrait être le pont entre LTP précoce et tardive.
B.3.d
La protéine kinase C
L’inhibition de la PKC par un inhibiteur spécifique bloque l’induction de la LTP (Malinow et al.
1989). Elle agit sur des cibles exprimées aux niveaux pré- et postsynaptique et serait impliquée
notamment dans l’incorporation synaptique des récepteurs AMPA qui pourrait impliquer la
phosphorylation des récepteurs par la PKC (Ramakers et al. 2000; Boehm et al. 2006).
Il existe une forme constitutivement active de la PKC, appelée protéine kinase M ζ (PKM ζ)
dont l’expression est induite par la LTP (Hernandez et al. 2003). La PKM ζ correspond au fragment
catalytique de la PKC ζ, une forme atypique de la PKC qui ne nécessite pas de Ca2+ ou de
diacylglycérol pour être activée. La PKM ζ participe au maintien de la phase tardive de la LTP en
favorisant l’augmentation du nombre de récepteurs AMPA exprimés à la synapse (Ling et al. 2006).
L’inhibition de cette forme de la PKC annule la potentialisation induite dans le gyrus denté chez le rat
(Pastalkova et al. 2006). Ses substrats ne sont pas encore connus mais pourraient avoir un rôle
essentiel dans la LTP.
B.3.e
La voie de la PI3K
La PI3kinase phosphoryle le phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) en phosphatidylinositol
trisphosphate (PIP3). AKT (autrement appelée PKB) peut se lier au PIP3, ce qui induit son activation.
Enfin, AKT régule positivement la protéine kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) dont les
cibles appartiennent à différentes catégories fonctionnelles, telles que la régulation de la transcription,
de la traduction ou du cytosquelette. Au cours de la LTP, la PI3K régule les influx de calcium mais
également la libération du glutamate au niveau présynaptique (Kelly and Lynch 2000) et son inhibition
par des inhibiteurs pharmacologiques spécifiques bloque la LTP (Sanna et al. 2002). Comme cela est
représenté dans le figure 6, la PI3K converge vers ERK mais elle est également régulée par les MAPK
puisque l’inhibition de ERK bloque la phosphorylation de AKT induite par une stimulation à haute
fréquence (Tsokas et al. 2007).
18
B.3.f
Tyrosines-kinases
Les tyrosines-kinases dont fait partie la kinase Src sont également impliquées dans la LTP
puisque leur inhibition bloque son induction tandis que l’utilisation d’un activateur des kinases de la
famille Src induit une augmentation de la réponse synaptique qui occulte la LTP (Huang and Hsu
1999). L’induction de la LTP s’accompagne d’une activation rapide de la protéine kinase Src qui
semble être nécessaire pour son expression dans la région CA1 de l’hippocampe (Lu et al. 1998).
L’activation de cette kinase dépend des récepteurs métabotropiques du glutamate et a pour effet de
réguler l’efficacité des récepteurs NMDA (Lu et al. 1999). La protéine kinase Fyn, une autre tyrosinekinase, est également impliquée dans la phosphorylation de ces récepteurs au cours de la LTP
(Nakazawa et al. 2001).
Toutes ces voies de signalisation sont imbriquées ; elles peuvent interagir et se réguler
mutuellement. Par exemple, les voies de la PKA et de la CaMKII sont reliées par l’activation de l’AMPc
qui peut inhiber la PP1 et favoriser ainsi l’activation de la CaMKII (Brown et al. 2000). La CaMKII
interagit également avec la voie des MAPK-ERK : elle peut réguler négativement l’activité de Ras en
phosphorylant SynGAP (synaptic GTPase activating protein) qui induit une augmentation de l’activité
de RasGAP et inhibe l’activité de Ras (Oh et al. 2004). En retour, la CaMKII est elle-même une cible de
ERK, introduisant une boucle de contrôle entre ces deux voies (Giovannini et al. 2001). La position de
convergence de MAPK-ERK a également été évoquée, donnant un aperçu de la complexité de la
régulation des voies de signalisation au cours de la LTP. Enfin, ces voies agissent aussi bien au
niveau présynaptique que postsynaptique, et régulent l’efficacité de la transmission synaptique
dans ces deux compartiments.
B.4.
Rôle des phosphatases
Les protéines kinases, si elles sont très largement étudiées, ne sont pas les seules à contrôler
les voies de signalisation associées à la LTP. Si l’on s’en tient aux régulations du niveau de
phosphorylation des protéines, les protéines phosphatases ont également un rôle essentiel dans
l’équilibre fonctionnel de la transmission synaptique. Les principales phosphatases impliquées dans la
LTP sont la protéine phosphatase 1 (PP1), la PP2A et la PP2B plus couramment appelée
calcineurine. Ces trois phosphatases sont impliquées dans le phénomène de dépotentialisation
(Jouvenceau et al. 2003). Elles réduisent la probabilité d’ouverture des récepteurs NMDA (Lieberman
and Mody 1994; Wang et al. 1994). Elles peuvent désactiver également la CaMKII dont le rôle
essentiel dans la LTP a été décrit ci-dessus (Strack et al. 1997). La calcineurine est dépendante du
calcium et de la calmoduline et favorise l’activation de la PP1 en déphosphorylant l’inhibiteur I1. Elle
participe également au processus d’endocytose par la déphosphorylation des déphosphines qui
contrôlent ce processus (Cousin and Robinson 2001). La PP1 peut s’associer avec plusieurs protéines
d’ancrage et influencer la transmission synaptique, la stabilité du cytosquelette ou les interactions
cellulaires (Munton et al. 2004). Elle induit également la déphosphorylation des récepteurs AMPA
19
(Malenka and Nicoll 1999). L’inhibition partielle de la PP1 augmente l’amplitude de la LTP et abaisse le
seuil d’activation nécessaire à son induction (Jouvenceau et al. 2006). Cela illustre le rôle des
phosphatases dans l’organisation de l’équilibre moléculaire de la LTP.
B.5.
Rôle des neurotrophines
Plusieurs neurotrophines ont un effet facilitateur sur la LTP. L’application de BDNF (BrainDerived Neurotrophic Factor) ou de neurotrophine 3 (NT-3) dans la région CA1 de l’hippocampe
peut induire une augmentation durable de l’efficacité de la transmission synaptique équivalente à la
LTP (Kang and Schuman 1995). Toutefois, l’absence de la NT-3 chez des souris mutantes n’altère pas
l’induction de la LTP, suggérant qu’elle n’est pas indispensable à son expression (Ma et al. 1999). Le
NGF (Nerve Growth Factor), quant à lui, n’induit pas de potentialisation dans la région CA1 mais
participe à l’expression de la LTP dans le gyrus denté (Kang and Schuman 1995; Kelly et al. 1998). Le
BDNF est exprimé au cours de la LTP dans la région CA1 ainsi que dans le gyrus denté et son absence
chez des souris knockout inhibe de façon réversible l’induction de la LTP (Patterson et al. 1996;
Morimoto et al. 1998). L’absence de son récepteur TrkB empêche également l’induction de la LTP chez
des souris mutantes (Minichiello et al. 2002). Le BDNF a fait l’objet d’une plus grande attention dans
la mesure où une infusion intrahippocampique chez le rat in vivo conduit à une potentialisation dans le
gyrus denté (Messaoudi et al. 1998) qui fait intervenir les récepteurs NMDA, ERK et CREB et est
associée à une augmentation de l’expression de Arc, une cible de CREB (Messaoudi et al. 2002). En
outre, cette potentialisation est bloquée par l’inhibition de ERK (Ying et al. 2002). Le BDNF régule
également la phosphorylation des récepteurs NMDA (Wu et al. 2004; Xu et al. 2006) mais son effet ne
se limite pas au niveau postsynaptique puisque le blocage des voies de signalisation induites par le
BDNF (inhibition de la PLCγ) n’affecte la LTP que si elle est effective au niveau présynaptique et
postsynaptique simultanément (Gartner et al. 2006). L’ensemble de ces données met en évidence la
similitude entre la potentialisation induite par le BDNF et la LTP induite par une stimulation à haute
fréquence, faisant de la stimulation par le BDNF un bon modèle d’étude des mécanismes de la
plasticité synaptique.
B.6.
Une synthèse protéique précoce locale
La synthèse protéique n’est pas un processus réservé à la phase tardive de la LTP. Elle peut
aussi avoir lieu à des délais très courts suivant l’induction de la LTP. La CaMKIIα, par exemple, est
exprimée dans les 5 min qui suivent l’induction de la LTP, aussi bien dans la région CA1 (Ouyang et al.
1999; Giovannini et al. 2001) que dans le gyrus denté (Kanhema et al. 2006). Le facteur d’initiation de
la traduction eIF4E est également surexprimé de façon transitoire à 15 min (Kanhema et al. 2006).
L’étude à large échelle de McNair et al. a également montré une augmentation d’expression dès
10 min après induction de la LTP dans la région CA1 de l’énolase 2, de la Hnrpk (Heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein K) et de la protéine chaperonne Hsp60 (Heat shock protein 60) (McNair et
al. 2006). Enfin, la protéine Arc est synthétisée dans le gyrus denté 30 min après une stimulation à
haute fréquence (Steward et al. 1998).
20
La plupart de ces études ont montré que cette synthèse protéique précoce se produisait
spécifiquement au niveau synaptique, dans les synapses potentialisées (Figure 7). En effet, plusieurs
ARNm sont présents au niveau des dendrites dans l’hippocampe, tels que les ARNm de MAP2,
Arc/agr3.1, la CaMKIIα, la dendrine, la protéine G sous-unité γ, la calmoduline ou les récepteurs
NMDA NR1 (Steward and Schuman 2003). De plus, les synapses possèdent la machinerie nécessaire à
une traduction locale et la synthèse protéique locale participe à l’expression de la LTP précoce (Tang
et al. 2002; Fonseca et al. 2006a). La traduction, au niveau dendritique, est stimulée par l’activation
des récepteurs NMDA et métabotropiques du glutamate et met en jeu la voie de la PI3K (Gong et al.
2006). Les MAP kinases ERK sont également impliquées dans la régulation de cette synthèse
protéique locale, notamment via l’activation de la CaMKII (Giovannini et al. 2001; Sweatt 2004b). La
CaMKII pourrait avoir un rôle de « mémoire moléculaire » dans les synapses potentialisées. En effet,
une courte application d’inhibiteurs de la synthèse protéique peut être réversible et la mémoire peut
être récupérée suggérant que des marqueurs ont perduré pendant la période d’inhibition (Lisman et
al. 2002). La CaMKII pourrait donc être un marqueur permettant la localisation de la traduction
spécifiquement dans les synapses potentialisées.
Figure 7 : Traduction locale dans les dendrites. Source : (Derkach et al. 2007)
21
C.
LES MECANISMES MOLECULAIRES DE LA PHASE TARDIVE DE LA LTP
D’après le modèle décrit par Bliss et Collingridge, la phase tardive de la LTP peut se subdiviser
en deux phases : la phase LTP2, qui dure entre 3 et 6 h et nécessite la néosynthèse de protéines mais
ne dépend pas de la transcription génique et la phase LTP3, très durable, qui nécessite la transcription
de gènes ; la phase LTP1 correspond à la phase précoce de la LTP (Bliss and Collingridge 1993).
C.1.
Mise en évidence de l’existence de la phase tardive de la LTP
La phase tardive a d’abord été mise en évidence par sa dépendance vis-à-vis de la synthèse
protéique. En effet, l’application d’anisomycine, un inhibiteur de la traduction, bloque le maintien de la
LTP dans la région CA1 in vitro (Frey et al. 1988). L’anisomycine inhibe de la même façon le maintien
de la LTP au-delà de 3 h dans le gyrus denté (Otani and Abraham 1989). L’inhibition de la
transcription, quant à elle, bloque le maintien de la LTP à un délai plus tardif (à 6 h), mettant en
évidence des différences de fenêtres temporelles entre ces deux phénomènes (Otani and Abraham
1989). Le délai à partir duquel la LTP devient dépendante de la transcription de gènes n’est toutefois
pas toujours le même selon les modèles. En effet, l’application d’un inhibiteur de la transcription sur
des coupes d’hippocampe suite à une stimulation à haute fréquence empêche le maintien de la LTP
au-delà de 100 min dans la région CA1 (Nguyen et al. 1994). Quoiqu’il en soit, l’inhibition de la
transcription dans le gyrus denté in vivo bloque le maintien de la LTP mais n’affecte pas son
induction (Frey et al. 1996). La voie des MAPK semble jouer un rôle essentiel pour l’activation de la
transcription et de la traduction au cours de la LTP (Kelleher et al. 2004).
C.2.
Induction de gènes précoces
Comme nous l’avons évoqué dans le chapitre concernant la phase précoce de la LTP,
plusieurs voies de signalisation conduisent à l’activation des facteurs de transcription. La conséquence
directe de ces régulations est l’expression rapide de gènes dits précoces immédiats (Figure 8). Sur le
plan strictement temporel, leur expression se produit pendant la phase précoce de la LTP, toutefois
leur fonction s’est avérée être indispensable pour le maintien de la phase tardive. C’est la raison pour
laquelle nous les évoquons dans ce chapitre. Les gènes précoces (immediate early genes –IEG) sont
exprimés rapidement et de façon transitoire, indépendamment de la synthèse protéique en réponse à
des signaux extracellulaires. Parmi les gènes précoces exprimés au cours de la LTP, nous avons déjà
évoqué le gène arc dont l’ARNm est délivré au niveau des dendrites (Steward et al. 1998). La protéine
correspondante qui pourrait être impliquée dans la réorganisation structurale du cytosquelette à la
synapse est rapidement traduite et son expression est essentielle à la consolidation de la LTP
(Guzowski et al. 2000; Plath et al. 2006). La neurotrophine BDNF est également exprimée rapidement
après l’induction de la LTP (Lee et al. 2005). Comme Arc, le BDNF correspond à un gène effecteur,
tandis que les autres gènes précoces exprimés suite à l’induction de la LTP produisent majoritairement
des facteurs de transcription qui vont réguler l’expression d’autres gènes. Il s’agit des gènes zif268, cjun, junB, junD et les gènes c-fos-related (Wisden et al. 1990; Abraham et al. 1991; Demmer et al.
22
1993). L’activation de ces facteurs de transcription permet l’expression de gènes cibles en aval qui
seront des effecteurs de la modification de l’efficacité synaptique.
Figure 8 : L’induction de la LTP conduit à l’activation de gènes. Les gènes précoces sont les premiers
à être exprimés, leur expression est contrôlée par les voies de signalisation décrites dans le chapitre B
et ne dépend pas de la synthèse protéique. Source : (Kandel et al. 2000)
C.3.
Rôle particulier du facteur de transcription Zif268
Parmi les facteurs de transcription impliqués dans la consolidation de la LTP, nous mettrons
l’accent sur Zif268, autrement appelé Egr-1, NGFI-A, Krox24 ou TIS8. Zif268 appartient à la famille
des Egr (early growth response) qui sont des facteurs de transcription à doigt de zinc dont
l’expression est inductible, c'est-à-dire qu’elle nécessite un stimulus pour être induite (Lemaire et al.
1990). Les doigts de zinc sont des structures contenant des motifs Cys2-His2 qui peuvent chélater des
atomes de zinc. Ce motif permet la fixation du facteur de transcription sur l’ADN, au niveau du grand
sillon (Figure 9). La protéine Zif268 en contient 3 et reconnaît la séquence consensus
GCG(G/T)GGGGCG (Swirnoff and Milbrandt 1995).
23
Figure 9 : Schéma de l’interaction de Zif268 avec l’ADN. La
conformation des doigts de Zinc (en bleu) est stabilisée par les ions Zinc
(verts). Seule la partie de Zif268 qui interagit avec l’ADN est
réprésentée ici, la protéine entière ayant une masse de 88 kDa.
Zif268 est la cible de plusieurs facteurs de transcription tels que Elk-1, CREB ou l’héterodimère
Fos-Jun qui sont tous régulés au cours de la LTP (Davis et al. 2003). La traduction de la protéine se
fait dans le cytoplasme puis elle est de nouveau transférée dans le noyau où elle pourra induire
l’expression de gènes cibles. Zif268 est exprimé de façon constitutive dans le cortex, le noyau
accumbens, le striatum, l’amygdale et la région CA1 de l’hippocampe tandis qu’il est absent du gyrus
denté (Schlingensiepen et al. 1991). Toutefois, l’injection de glutamate augmente de façon dose
dépendante l’expression de zif268 dans les différentes régions de l’hippocampe, y compris le gyrus
denté (Beckmann et al. 1997). L’ARNm et la protéine Zif268 sont également exprimés suite à
l’induction de la LTP par une stimulation à haute fréquence (Cole et al. 1989; Wisden et al. 1990) et
son expression, qui a lieu entre 10 min et 2 h après l’induction de la LTP, est fortement corrélée avec
la durée de la LTP (Abraham et al. 1991; Richardson et al. 1992). Les données concernant la
régulation de l’expression de zif268 dans la région CA1 au cours de la LTP sont contradictoires. Si elle
a d’abord été décrite dans le sens d’une augmentation (Roberts et al. 1996), French et al. n’ont pu
observer aucune surexpression dans cette région sur des coupes d’hippocampe (French et al. 2001).
Dans le gyrus denté en revanche, zif268 est régulé après une stimulation à haute fréquence et
l’augmentation de son expression est corrélée avec l’activation de la voie des MAPK et des facteurs de
transcription CREB et Elk-1 (Davis et al. 2000a). En outre, des travaux réalisés chez des souris
génétiquement modifiées n’exprimant pas Zif268 ont montré que son expression était essentielle à la
consolidation de la LTP et de certaines formes de mémoires à long terme (Jones et al. 2001; Bozon et
al. 2002; Bozon et al. 2003b).
Compte tenu de l’implication de Zif268 dans le maintien de la LTP, les cibles de ce facteur de
transcription ont probablement des fonctions essentielles dans la mise en place des modifications
moléculaires et morphologiques qui sont associées à la LTP. Plusieurs cibles potentielles de Zif268 ont
été suggérées sur la base de la présence du site de liaison des Egr (Beckmann and Wilce 1997) et
certaines ont été caractérisées expérimentalement. Par exemple, l’expression des gènes de la
synapsine I et II, qui participent à la libération des neurotransmetteurs au niveau présynaptique, est
contrôlée par Zif268 (Thiel et al. 1994; Petersohn et al. 1995). Une étude à grande échelle des cibles
de Zif268 a été réalisée avec des puces à ADN, permettant d’avoir un aperçu de la diversité des cibles
de Zif268 dans des cellules neuronales. Elles appartiennent à des catégories fonctionnelles variées,
telles que la signalisation cellulaire, la formation des synapses, le trafic vésiculaire, des protéines
présentes au niveau présynaptique, le cytosquelette, le protéasome, le métabolisme, le complexe
24
majeur d’histocompatibilité ou la réponse immunitaire, ainsi que la régulation de la transcription et de
la traduction (James et al. 2005). Zif268 peut réguler l’expression de ses cibles dans le sens d’une
augmentation ou d’une réduction. Une étude récente par une approche bioinformatique a montré que
Zif268 et CREB avaient en commun un grand nombre de cibles, suggérant un recouvrement
fonctionnel partiel de ces deux facteurs de transcription (Pfenning et al. 2007). Dans la même optique
de rechercher des cibles de Zif268, nous avons effectué une étude comparative des protéines
exprimées chez des souris mutantes n’exprimant pas Zif268 et chez des souris sauvages (voir
Partie III).
C.4.
Expression de gènes effecteurs
Après la vague d’induction des gènes précoces, de nombreuses activations géniques se
produisent tout au long de la phase tardive de la LTP. L’organisation temporelle de l’activation du
facteur de transcription CREB, par exemple, est représentative de l’activation génique en deux temps
qui se produit au cours de la LTP. En effet, après un premier pic d’activation 30 min après l’induction
de la LTP, son activation est de nouveau élevée entre 2 h et 24 h après la stimulation (Schulz et al.
1999). La cinétique d’expression des gènes effecteurs de la phase tardive de la LTP s’étale sur au
moins 96 h (des délais plus tardifs n’ont pas été étudiés). En effet, outre les inductions rapides des
quelques gènes précoces effecteurs, des variations d’expression d’ARNm ont été observées à
différents délais entre 2 h et 96 h (Tableau 1). Parmi eux se trouvent des gènes impliqués dans la
signalisation (NCS-1 – Neuronal Calcium Sensor 1, CaMKIIα, PKCγ, AKAP, ERK2 et Raf-B), l’exocytose
et la libération de neurotransmetteurs (syntaxine 1B, synapsine I, synaptopodine) et des récepteurs
du glutamate (les récepteurs métabotropiques mGluR5, mGluR1c et les sous-unités NR1 et NR2B des
récepteurs NMDA). Certains de ces ARNm sont exprimés de façon locale au niveau synaptique
(CaMKIIα) ou dans les corps cellulaires (CaMKIIα et syntaxine 1B) (Thomas et al. 1994b; Davis et al.
2000b). Au niveau temporel, les molécules de signalisation sont exprimées aussi bien dans les
premières heures que plusieurs jours après l’induction de la LTP. Les délais intermédiaires n’ont pas
été étudiés, il n’est donc pas possible de savoir si leur expression est constante tout au long de la LTP
ou si elle s’organise en vagues successives comme c’est le cas pour CREB.
25
Nom de
l’ARNm
5’
30’
1h
2h
3h
4h
5h
6h
8h
12h
24h
48h
96h
Références
NCS-1
(Genin et al. 2001)
CaMKIIα
(Davis et al. 2000b), (Thomas et al. 1994b)
PKCγ
(Thomas et al. 1996)
Syntaxine 1B
(Hicks et al. 1997), (Davis et al. 2000b) , (Smirnova et
al. 1993)
Synapsine I
(Morimoto et al. 1998), (Hicks et al. 1997)
Synaptopodine
(Yamazaki et al. 2001)
AKAP
(Genin et al. 2003)
Raf-B
(Thomas et al. 1994b)
ERK-2
(Thomas et al. 1994b)
mGluR5
(Manahan-Vaughan et al. 2003)
NMDA-NR1
(Thomas et al. 1994a)
NMDA-NR2B
mGluR1c
Tableau 1 : Variations d’expression des ARNm au cours de la LTP observées à partir de l’étude de gènes candidats. Ce tableau rassemble des
données obtenues dans le gyrus denté et dans la région CA1 de l’hippocampe. Le niveau d’expression peut être supérieur (
), inférieur (
)
ou égal au niveau basal (
).
26
C.5.
Néosynthèse de protéines
Les données concernant la régulation de la synthèse protéique sont moins nombreuses que
celles concernant les ARNm (Tableau 2). Les protéines exprimées appartiennent aux mêmes
catégories fonctionnelles que celles des ARNm agrémentées d’une protéine impliquée dans la
traduction (eIF4E, facteur d’initiation de la traduction) et d’une protéine participant à la structure de la
synapse (neuroplastine 65). Toutes ces protéines ont fait l’objet d’études individuelles grâce à
l’utilisation d’anticorps spécifiques. Toutefois, une étude protéomique récente a identifié de
nombreuses protéines exprimées de façon différentielles 10 min et 4 h après l’induction de la LTP
dans la région CA1, sur des coupes d’hippocampes (McNair et al. 2006). Ces protéines sont régulées
aussi bien dans le sens d’une augmentation que d’une réduction du niveau d’expression. Elles
appartiennent à des catégories fonctionnelles variées, telles que la métabolisme, l’organisation du
cytoplasme, le transport des protéines, la neurogenèse, la transcription, la traduction, la transmission
synaptique, la production et la libération des neurotransmetteurs, la signalisation, l’adhésion cellulaire,
la contraction musculaire et le transport vésiculaire. Ils ont également identifié des canaux ioniques. A
10 min, la majorité des protéines régulées sont impliquées dans la régulation du métabolisme
énergétique tandis qu’à 4 h, l’organisation du cytosquelette est nettement majoritaire.
L’ensemble de ces données se situe dans les premières heures suivant l’induction de la LTP.
Ainsi, les connaissances concernant la régulation des protéines au cours des délais plus tardifs de la
LTP sont rares. Il nous a donc paru intéressant d’étudier les régulations protéiques à des délais de 6 h
et 24 h suivant l’induction de la LTP afin d’obtenir des informations sur les protéines impliquées dans
le maintien à long terme de la LTP. Cette partie de mon travail de thèse sera décrite dans la Partie I.
27
Nom de l’ARNm
5’
15’
30’
45’
2h
3h
4h
5h
6h
8h
12h
24h
48h
Références
AMPA
(Nayak et al. 1998)
CaMKIIα
(Ouyang et al. 1999)
N-cadhérine
(Bozdagi et al. 2000)
eIF4E
(Kanhema et al. 2006)
Synapsine I
(Hicks et al. 1997), (Sato et al. 2000)
Synapsine II
(Helme-Guizon et al. 1998)
Syntaxine 1B
(Helme-Guizon et al. 1998)
Synaptotagmine
(Lynch et al. 1994)
Synaptophysine
(Lynch et al. 1994)
Neuroplastine 65 (np65)
(Smalla et al. 2000)
mGluR5
(Manahan-Vaughan et al. 2003)
Tableau 2 : Variations d’expression des protéines au cours de la LTP, observées à partir de l’étude de protéines candidates. Ce tableau rassemble des
données obtenues dans le gyrus denté et dans la région CA1 de l’hippocampe. Le niveau d’expression est soit supérieur (
), soit équivalent (
) au
niveau basal.
28
Introduction générale
Si les études ciblant une protéine d’intérêt ne montrent que des augmentations d’expression,
plusieurs données récentes ont montré que la LTP était aussi associée à une dégradation des
protéines. Elle met en jeu le système ubiquitine-protéasome (Bingol and Schuman 2005). L’étude à
large échelle de McNair et al. (2006) est un argument en faveur d’une intervention importante de la
dégradation des protéines au cours de la LTP puisque plus des deux tiers des protéines régulées le
sont dans le sens d’une réduction d’expression (McNair et al. 2006). De plus, plusieurs gènes du
protéasome dans le cerveau sont sous le contrôle de Zif268, apparemment dans le sens d’une
inhibition puisque chez des souris mutantes n’exprimant pas Zif268, ces gènes sont surexprimés et
l’activité du protéasome est augmentée dans le cortex (James et al. 2006). Enfin, l’inhibition
pharmacologique du protéasome réduit la durée de la LTP. Le protéasome apparaît indispensable à la
phase tardive de la LTP mais pourrait également être impliqué dans la phase précoce, au même titre
que la synthèse protéique (Karpova et al. 2006). L’inhibition conjointe de la synthèse et de la
dégradation des protéines peut rétablir la LTP suggérant que la phase tardive de la LTP nécessite une
activation combinée de la synthèse et de la dégradation des protéines (Fonseca et al. 2006b).
C.6.
Localisation de la traduction dans les dendrites activées spécifiquement :
Notion de « tag » synaptique
Comme nous l’avons évoqué précédemment, au moins une partie de la traduction a lieu
spécifiquement au niveau des synapses activées. L’ARNm de la CaMKIIα, par exemple, est présent au
niveau dendritique (Mayford et al. 1996). Il possède une région signal qui permet son transport vers
les synapses. L’élimination de ce signal chez des souris mutantes provoque une très forte réduction de
la présence de la protéine CaMKIIα dans la densité postsynaptique et une altération de la phase
tardive de la LTP, sans que la phase précoce ne soit perturbée (Miller et al. 2002). De nombreux
ARNm se trouvent dans les synapses et peuvent subir une traduction locale dépendante de l’activité
(Job and Eberwine 2001; Schuman et al. 2006). Des éléments de la machinerie de traduction y sont
également présents, tels que ERK, eIF4E, mTOR ou 4E-BP (Tang and Schuman 2002; Asaki et al.
2003) et l’induction de la LTP par stimulation à haute fréquence provoque le transfert de
polyribosomes de l’axe dendritique vers les épines (Ostroff et al. 2002).
Outre les ARNm, des protéines traduites dans le soma sont également transférées vers les
synapses. Comment expliquer qu’elles soient adressées spécifiquement dans les dendrites activées ?
En 1997, Frey et Morris ont proposé le concept d’étiquette synaptique qui consisterait en un marquage
spécifique des synapses activées dont la mise en place serait indépendante de la synthèse protéique
(Frey and Morris 1997). Cette étiquette serait présente de façon transitoire, jusqu’à 2-3 h suivant
l’induction de la LTP et permettrait de capturer les protéines synthétisées dans le corps cellulaire.
Cette notion d’étiquette synaptique a été confirmée ensuite par de nombreuses équipes (Reymann
and Frey 2007). La période d’expression de l’étiquette synaptique correspond à la fenêtre temporelle
au cours de laquelle la transition entre la phase précoce et la phase tardive de la LTP va se faire ou
29
non. Ellle pourrait donc avoir un rôle fondamental pour l’expression de la phase tardive de la LTP. La
nature de l’étiquette n’est pas encore clairement identifiée toutefois plusieurs kinases telles que la
CaMKII, la PKA ou la PKMζ mais pas les MAPK-ERK semblent participer au marquage spécifique des
synapses activées par une stimulation à haute fréquence dans la région CA1 (Young et al. 2006;
Sajikumar et al. 2007).
D.
LA LTP RESULTE D’UNE COMBINAISON D’EFFETS PRE- ET POSTSYNAPTIQUES
La question de savoir si la LTP était portée par des mécanismes pré- ou postsynaptiques a
longtemps fait débat. Certains groupes, forts de leurs observations expérimentales, soutenaient une
vision unilatérale des mécanismes de la LTP (Nicoll 2003; Voronin and Cherubini 2003) tandis que
d’autres prônent la combinaison des deux (Lisman 2003). Compte tenu de la diversité des protéines
qui sont impliquées dans l’expression de la LTP et de l’ensemble des travaux visant à identifier le lieu
de l’établissement de la LTP, la situation la plus probable consiste en un rôle associé des deux
compartiments synaptiques. Comme nous l’avons décrit ci-dessus, les kinases agissent aussi bien au
niveau pré- que postsynaptique et peuvent ainsi contrôler en parallèle l’ensemble des phénomènes.
D.1.
Augmentation de la quantité de neurotransmetteurs libérés
Au niveau présynaptique, la LTP se traduit par une augmentation de la libération de
glutamate. Cela a été observé notamment dans le gyrus denté après induction de la LTP chez le rat
anesthésié (Richter-Levin et al. 1998). Plusieurs voies de signalisation et des protéines impliquées
dans le transport et la fusion des vésicules synaptiques contrôlent le rythme de l’exocytose. Certaines
protéines du trafic vésiculaire, par exemple, sont phosphorylées par la PKA dont l’activation peut
augmenter la probabilité de libération au niveau des terminaisons présynaptiques (Kohara et al.
2001). Le renouvellement des vésicules synaptiques est également augmenté (Ryan et al. 1996).
Si la LTP est associée à des modifications de la libération des neurotransmetteurs cela signifie
qu’il existe des voies de signalisation rétrogrades de la région postsynaptique vers la région
présynaptique. Les principaux candidats de messagers rétrogrades sont le monoxyde d’azote (NO),
l’acide arachidonique (AA) et le platelet-activating factor (PAF) (Malenka and Nicoll 1999). Le blocage
de la synthèse du NO, par exemple, par l’inhibition pharmacologique de la NO-synthase bloque la LTP
dans la région CA1. La fenêtre temporelle de l’action du NO semble être relativement courte puisque
cette inhibition n’avait d’effet que dans les 15 premières minutes de la LTP (Bon and Garthwaite
2003).
D.2.
Augmentation de la transmission au niveau postsynaptique
Nous avons déjà largement évoqué les effets postsynaptiques de l’induction de la LTP, à
savoir l’augmentation de la conductance des récepteurs, l’augmentation de leur nombre à la synapse,
30
l’expression de gènes et la synthèse de protéines. La découverte des synapses dites « silencieuses » a
apporté un argument supplémentaire en faveur d’une insertion de récepteurs AMPA à la synapse au
cours de la LTP (Isaac et al. 1995; Liao et al. 1995). Une synapse est dite fonctionnellement
silencieuse lorsqu’elle exprime des récepteurs NMDA mais est dénuée de récepteurs de type AMPA. En
effet, dans les synapses glutamatergiques de l’hippocampe, la transmission synaptique dans des
conditions normales de potentiel de repos se fait grâce aux récepteurs AMPA tandis que les récepteurs
NMDA ne sont activés que si la membrane est dépolarisée. Puisque la LTP, par l’intermédiaire de
l’activation des récepteurs NMDA, provoque l’insertion de récepteurs AMPA à la synapse, elle modifie
les propriétés des synapses silencieuses qui deviennent fonctionnellement actives (Liao et al. 2001).
L’induction de la LTP se traduit donc, au niveau postsynaptique, par une augmentation de la
conductance des récepteurs AMPA et NMDA, une augmentation du nombre de récepteurs AMPA ainsi
qu’une augmentation du nombre de synapses fonctionnellement actives.
D.3.
Modifications morphologiques
La LTP s’accompagne d’une plasticité morphologique des épines dendritiques (Matsuzaki et al.
2004). La délétion du gène de l’adducine β, une protéine qui régule la dynamique du cytosquelette,
chez des souris entraîne une altération de la LTP (Rabenstein et al. 2005). Il existe une corrélation
entre la taille des épines et l’efficacité synaptique (Kasai et al. 2003). En effet, la LTP s’accompagne
d’une augmentation du nombre et de l’aire des épines dendritiques. Les éléments pré- et
postsynaptiques évoluent de façon parallèle au cours de la LTP, conduisant à une augmentation de la
surface totale de contact (Desmond and Levy 1988). L’augmentation de surface synaptique engage le
recyclage des endosomes dans les épines dendritiques (Park et al. 2006). Un rôle de la PKC et des
MAPK a été démontré dans les modifications structurelles des épines dendritiques associées à l’activité
neuronale (Goldin and Segal 2003). De plus, l’inhibition de la PKA ou du facteur de transcription CREB
bloque l’augmentation de la densité des épines dendritiques (Murphy and Segal 1997) tandis que des
activateurs de la PKA augmentent le nombre de sites présynaptiques fonctionnels (Kohara et al.
2001). Les travaux de Harris et al. montrent une prévalence de l’augmentation de la surface des
synapses plutôt que de leur nombre (Harris et al. 2003).
La figure 10 schématise les trois grands types de modifications synaptiques induites par la
LTP.
31
Figure 10 : Illustration schématique des trois types de régulations synaptiques associées à la LTP.
Source : (Sanes and Lichtman 1999)
Comme nous l’avons montré, l’implication et les mécanismes d’action des récepteurs du
glutamate, des voies de signalisation ou de certains facteurs de transcription comme Zif268 au cours
de la LTP ont été largement étudiés. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la LTP restent
malgré tout en grande partie méconnus. En particulier, les protéines qui sont les cibles des voies de
signalisation ou des facteurs de transcription sont moins connues. Elles sont, pourtant, les effectrices
de la régulation de l’efficacité de la transmission synaptique et des modifications morphologiques. Ces
protéines peuvent appartenir à différentes catégories fonctionnelles, telles que des protéines
d’adhésion, du cytosquelette, du trafic intracellulaire, des protéines chaperonnes, des protéines
associées aux vésicules synaptiques, ou impliquées dans le contrôle de la synthèse et de la
dégradation protéique. Dans le but d’étudier un grand nombre de protéines appartenant à ces
diverses catégories fonctionnelles et d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans les
mécanismes de la LTP, nous avons entrepris une étude protéomique à large échelle des différentes
étapes de la LTP. Ce type d’approche, contrairement aux outils pharmacologiques ou génétiques,
permet d’étudier la régulation des protéines dans les conditions physiologiques naturelles de la LTP,
sans perturbation artificielle externe qui pourrait modifier la réponse cellulaire des neurones. De plus,
elle permet d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans l’expression de la LTP sans idée
préconçue. Dans le chapitre qui suit, nous présenterons les principales stratégies mises en œuvre
dans les approches de type protéomique, sans toutefois chercher à être exhaustifs devant les
nombreux développements que suscite cette discipline.
32
E.
LA PROTEOMIQUE
E.1.
Principe
Par analogie avec la génomique qui consiste à étudier le génome des organismes, et la
transcriptomique celle des ARNm, la protéomique est un terme générique qui désigne un ensemble
d'approches méthodologiques consacrées à la caractérisation des protéomes, c'est-à-dire à l’ensemble
des protéines exprimées à partir du génome dans une cellule, un tissu, un organisme. On distingue
généralement la Protéomique structurale qui s'intéresse à la structure tridimensionnelle des
protéines, et la Protéomique fonctionnelle dont le but est de connaître soit les variations du niveau
d’expression des protéines sous l'effet de divers stress*, à un instant donné, soit les interactions des
protéines entre elles (recherche des partenaires, interactome ou complexome), soit leurs modifications
post-traductionnelles (phosphoprotéome par ex.).
À l’échelle cellulaire, les protéines sont soumises à une dynamique temporelle, spatiale et
fonctionnelle permanente. La protéomique permet d’obtenir un aperçu de l’état des protéines dans un
organisme, un tissu, une cellule ou un compartiment subcellulaire donné à un moment donné, dans
un contexte biologique qui doit être défini le plus précisément possible. La protéomique est une
science récente qui a pu se développer grâce à l’évolution conjointe des méthodes séparatives
comme l’électrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D) et la chromatographie liquide capillaire
(nanoLC), des méthodes d'ionisation douce en spectrométrie de masse et enfin de la bioinformatique,
à présent capable de gérer la quantité énorme d’informations qui provient du séquençage et de
l'annotation des génomes (Lane 2005).
La protéomique se positionne comme étant l’ère de la post-génomique. L’ampleur de son
développement se justifie principalement à deux niveaux. D’une part, le niveau d’expression des
protéines n’est pas toujours corrélé à celui des ARNm. D’autre part, en plus des étapes d’épissage des
ARNm, les protéines sont soumises à des modifications post-traductionnelles très variées et très
fréquentes, qui sont essentielles à leur(s) fonction(s) et qui sortent du cadre de la génomique. Ainsi,
un génome conduit à de nombreux protéomes qui varient en fonction du stade de développement,
des étapes du cycle cellulaire, de la différenciation, de la réponse à différents signaux biologiques ou
physiques et de l’état physiopathologique des cellules. L’analyse protéomique se situe donc à une
autre échelle de la biologie moléculaire.
En protéomique fonctionnelle, on distingue la protéomique descriptive et la protéomique
différentielle. La protéomique descriptive a pour objectif d’identifier un grand nombre de
protéines, souvent dans un tissu ou un type cellulaire donné, parfois dans une région subcellulaire (à
la suite d'un fractionnement cellulaire). Elle permet d’établir des cartographies (électrophorèses 2D)
ou des listes donnant une vision globale des protéines exprimées dans l’échantillon biologique étudié.
* Stress est utilisé ici comme un terme générique pour désigner tout effet biologique naturel ou non, ou toute
action physicochimique et/ou temporelle provoqué sur un organe, un tissu ou des cellules en culture.
33
C'est souvent une étape indispensable avant d'étudier des variations de niveau d'expression comme
nous l’évoquerons ci-après. La protéomique différentielle a pour vocation, quant à elle, de
comparer la quantité relative des protéines entre deux situations biologiques données. Elle s’intéresse
donc à des listes plus restreintes de protéines qui sont exprimées à des taux différents entre les deux
échantillons.
La protéomique fonctionnelle a de nombreuses applications dans le domaine biomédical. Elle
a, par exemple, pour objectif de rechercher des marqueurs diagnostiques (biomarqueurs précoces)
associés à des pathologies comme les cancers ou les maladies neurologiques. Elle cherche également
à identifier de nouvelles cibles pharmacologiques pour le développement de médicaments. Dans cette
optique, l’étude des voies de signalisation fait l’objet de nombreux travaux, notamment l’étude des
modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation. La protéomique met donc à profit sa
capacité à étudier les protéines dans toute leur complexité pour identifier de nouvelles molécules
d’intérêt dans différents domaines de la biologie.
E.2.
Principales méthodes utilisées en protéomique fonctionnelle
Les principales étapes d’une analyse protéomique sont la préparation d’un extrait protéique et
la séparation des protéines suivie de leur identification. Plusieurs méthodes peuvent être envisagées
et sont associées à des démarches expérimentales différentes. On distingue les approches par
électrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D), qui permettent la séparation des protéines
entières, des méthodes par spectrométrie de masse qui impliquent la digestion enzymatique du
mélange protéique suivi d’une séparation des peptides en solution (Figure 11).
Préparation de l’échantillon
Extraction des protéines
Séparation des protéines
Séparation des protéines
(Électrophorèse 2D)
(E1D, fractionnement)
Digestion enzymatique
Digestion enzymatique
(Trypsine)
(Trypsine)
Spectrométrie de masse
Séparation des peptides
(MALDI-TOF)
(nanoLC, 2D-LC)
Empreinte peptidique
massique
(Quadrupole, TOF, trappe, FT)
Recherche dans des
banques de données
Identification des protéines
Intensité relative
MS/MS
m/z
Figure 11 : Schéma général des stratégies utilisées en protéomique
34
La méthode la plus fréquemment utilisée pour séparer les protéines à partir d’un mélange
complexe est l’électrophorèse 2D. Cette technique de séparation des protéines a été décrite dès 1975
(O'Farrell 1975), mais elle a fait des progrès considérables au cours des 10 dernières années,
notamment en terme de facilité dans sa mise en œuvre et de reproductibilité. Elle consiste, dans un
premier temps, à séparer les protéines d’un mélange complexe en fonction de leur charge globale
nette (première dimension) puis, dans un second temps, en fonction de leur masse en milieu
dénaturant (deuxième dimension). Les protéines sont colorées dans les gels, ce qui permet de
visualiser des centaines, voire des milliers, de protéines qui se présentent sous forme de spots dans le
gel de polyacrylamide. La résolution est suffisante pour détecter différentes isoformes d’une même
protéine à condition qu’elles aient des points isoélectriques ou des masses apparentes différents. Les
patrons (patterns) d’expression des différents échantillons biologiques que l’on souhaite étudier sont
ensuite comparés au cours d’une analyse d’image à l’aide de logiciels spécialisés. Le nombre de
protéines qui peuvent être ainsi détectées dépend de la nature et de la sensibilité du colorant utilisé.
Les protéines d'intérêt sont ensuite identifiées. Initialement, elles l'étaient par microséquençage Nterminal selon Edman, mais cette méthode est assez peu sensible (une dizaine de pmoles) et reste
relativement coûteuse (réactifs). En revanche, l’association plus récente des méthodes de
spectrométrie de masse avec l’électrophorèse 2D a offert des outils très sensibles (au niveau de la
fmole) permettant, de plus, l’identification des protéines à haut débit. Les protéines séparées sur gel
2D sont soumises à une digestion enzymatique directement dans le gel. Les produits de digestion
constituent des ensembles de peptides qui sont caractéristiques de chaque protéine. À partir de ces
mélanges de peptides, les protéines peuvent être identifiées par spectrométrie de masse. Il existe
également des méthodes dites « hors-gel » basées principalement sur les possibilités qu’apporte la
spectrométrie de masse à elle-seule.
Un spectromètre de masse (MS) discrimine les ions à l’état gazeux et les caractérise par leur
rapport masse sur charge (m/z). Il est constitué d’une source dans laquelle l’analyte est ionisé, d’un
analyseur qui permet la séparation des ions en fonction de leur rapport m/z et d’un détecteur qui
mesure l’intensité des ions émergeant de l’analyseur. L’ensemble est associé à un ordinateur qui
permet de contrôler les paramètres du spectromètre et de numériser les données. En protéomique,
deux types de sources d’ions sont utilisées : MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation) et
ESI (Electrospray Ionisation). Elles produisent une ionisation douce des molécules, limitant ainsi le
nombre de fragmentations. Il existe également quatre types d’analyseurs à savoir les temps de vol,
les quadrupoles, les trappes à ion et les analyseurs à résonance cyclotronique. Le principe de ces
différents types d’appareillages et les combinaisons les plus fréquemment utilisées sont décrits dans la
revue de Lane (Lane 2005). Ces outils ne présentent pas les mêmes caractéristiques et diffèrent en
terme de précision, de résolution, de sensibilité ou de gamme dynamique (Domon and Aebersold
2006). Le choix de l’appareil à utiliser dépend donc de la question biologique qui est posée.
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) ajoute une autre dimension pour l’étude des
peptides et des protéines. En effet, en MS/MS, après une première séparation dans un analyseur, les
35
ions sont fragmentés dans une chambre de fragmentation puis de nouveau séparés en fonction de
leur rapport m/z dans un second analyseur (Figure 12). La fragmentation des peptides en MS/MS
permet l’identification de la protéine dont il provient par reconstitution de la séquence du peptide. La
MS/MS permet d’identifier la présence d’un peptide dans un mélange complexe, de rechercher
l’ensemble des peptides précurseurs d’un ion fils de masse donnée ou de cibler la perte d’un élément
neutre de masse définie au cours de la fragmentation (Domon and Aebersold 2006). Cette approche
est particulièrement utilisée pour l’étude de modifications post-traductionnelles comme les
phosphorylations.
Les approches protéomiques en phase liquide hors-gel utilisent des systèmes de séparation
des peptides par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur des colonnes capillaires
(nanoLC) adaptées à des analyses sur de très faibles quantités (phase inverse ou colonne échangeuse
d’ions). Cette séparation par HPLC qui se produit en amont de l’analyse par spectrométrie de masse
est généralement couplée à une source ESI.
Source d’ion
Chambre de
fragmentation
Analyseur 2
Détecteur
(séparation en
fonction de m/z)
(intensité du
signal)
Intensité
(phase gazeuse)
Analyseur 1
(séparation en
fonction de m/z)
m/z
Figure 12 : Schéma de principe d’un spectromètre de masse en tandem. L’ensemble des
compartiments de l’appareil est maintenu sous un vide poussé.
Que la spectrométrie de masse soit précédée d’une électrophorèse 2D ou d’une HPLC, les
études protéomiques nécessitent l’utilisation d’outils informatiques puissants. L’identification des
protéines est une étape critique au cours de laquelle les données expérimentales sont comparées avec
des banques de données provenant du séquençage des génomes. L’ampleur des données issues d’une
analyse protéomique rend souvent inenvisageable la validation manuelle des données. Si l’on n’est pas
à l’abri aujourd’hui d’une certaine part d’erreur, la qualité des outils informatiques continue de faire
l’objet de développements pour une optimisation maximale.
Dans l’optique de faciliter les analyses protéomiques et d’améliorer l’accès aux protéines les
moins abondantes, on observe une tendance vers une réduction de la complexité des échantillons à
analyser. Elle peut se faire par le fractionnement préalable des échantillons (en fonction de leur
localisation cellulaire, de leur hydrophobicité, ou de la présence de modifications post-traductionnelles
par exemple) ou en ciblant une liste de protéines d’intérêt (Malmstrom et al. 2007).
Les applications de ces approches varient de l’identification des protéines d’un mélange à des
études quantitatives absolues ou relatives, des études fonctionnelles par l’étude de la régulation des
protéines au cours d’un phénomène biologique donné ou l’étude d’interactions entre les protéines
(Aebersold and Mann 2003; Tyers and Mann 2003).
36
La méthode de l’électrophorèse 2D présente plusieurs limites expérimentales que n’ont pas les
approches hors-gel, ou dans une moindre mesure. L’incorporation des protéines dans une
électrophorèse 2D est limitée et rend difficile l’accès aux protéines faiblement exprimées par rapport à
celles qui sont naturellement très abondantes (protéines du cytosquelette pour les tissus du cerveau,
albumine ou immunoglobulines pour le plasma sanguin…). De plus, les protéines hydrophobes, ainsi
que celles qui sont de haut poids moléculaire pénètrent difficilement dans les gels et les protéines de
pH extrême sont souvent mal résolues. Certes, ces limites réduisent la gamme des protéines qui
peuvent être analysées, mais l’électrophorèse 2D reste cependant une méthode très largement utilisée
grâce à sa capacité de résolution unique sur des protéines entières et son coût relativement faible.
C’est encore aujourd’hui la méthode de choix lorsque l’on commence une étude protéomique sur un
phénomène biologique nouveau et/ou un tissu nouveau concernant des protéines solubles.
E.3.
Quantification en protéomique différentielle
Dans le cadre d’une approche différentielle, la quantification intervient après la séparation des
protéines ou des peptides afin de comparer les niveaux d’expression des protéines entre deux
échantillons biologiques différents. Il s’agit le plus souvent de comparer le protéome des cellules d’un
tissu (ou d’une culture de cellules) ayant subi un traitement à celui des cellules du même tissu témoin.
Les principales stratégies employées en protéomique quantitative sont présentées dans la figure 13.
La majorité de ces approches est semi-quantitative.
Protéomique quantitative
Échantillons traités séparément
Mesure
d’intensité
relative
en MS
Échantillons mélangés en amont
Marquage différentiel
par des cyanines
Électrophorèse 2D
Quantification relative
par analyse d’image
Électrophorèse 2D
(DIGE)
par analyse d’image
Marquage différentiel
par des isotopes stables
In vitro
(ICATTM, iTRAQTM,
16
O/18O…)
In vivo
(SILAC, 14N/15N)
Quantification absolue
(AQUA, iTRAQTM)
Figure 13 : Principales approche utilisées en protéomique quantitative.
Les étapes de séparation engendrent la perte de certaines protéines qui peuvent être, toutes
ou partie, celles d’intérêt. Il y a une sorte de « trou noir » entre le moment où l’on extrait un tissu
d’un organe, son broyage, sa solubilisation et la façon dont les protéines de l’extrait acellulaire vont
pénétrer dans les « strip » de la première dimension (séparation selon le pI), pour ce qui est de
37
l’électrophorèse 2D par exemple. Il en est de même pour les séparations en HPLC en amont de la
spectrométrie de masse MS/MS. Même en manipulant très proprement et de façon reproductible, il est
difficile d’obtenir exactement les mêmes résultats à chaque expérience pour un tissu donné.
Pour compliquer la situation, les protéines faiblement exprimées représentent une large part
des protéines contenues dans une cellule et se trouvent être souvent celles d’intérêt. Elles sont
généralement masquées par les protéines les plus abondantes et sont donc difficiles à détecter et à
identifier lorsqu’elles sont en mélange complexe. Il est possible d’améliorer l’accessibilité de ces
protéines minoritaires en fractionnant les échantillons avant la séparation. Soit en éliminant les
protéines abondantes (des anticorps fixés sur colonne sont maintenant commercialisés), soit en
effectuant un fractionnement cellulaire (isolement des mitochondries, du phagosome, des vésicules
synaptiques ou de la densité postsynaptique, par exemple). Quelques protéomes ont été décrits après
application de telles approches (Desjardins 2003; Yoshimura et al. 2004; Vo and Palsson 2007), mais
elles apportent évidemment un risque supplémentaire de pertes aléatoires des protéines d’intérêt,
rendant délicates toutes conclusions biologiques tirées à partir des résultats obtenus.
Pour pallier ces inconvénients, dans le cas des études protéomiques utilisant l’électrophorèse
2D, plusieurs expériences sont répétées sur les tissus à analyser, suivies de statistiques sur plusieurs
gels (Horgan 2007). Par exemple, et comme nous le verrons dans le cas de notre étude, plusieurs
cerveaux de rats subissent le même traitement et sont comparés à autant de cerveaux de rats non
traités. Après coloration spécifique, des logiciels (analyse d’image) permettent de numériser l’intensité
de coloration des spots dans les gels, de quantifier puis de sommer les spots d’intérêt, et finalement
de comparer les valeurs moyennes obtenues pour le tissu témoin et le tissu traité. Cette approche
statistique est plus délicate à réaliser avec des animaux (qui ont une variabilité propre) qu’avec des
cultures d’organismes unicellulaires par exemple, mais elle a longtemps été la seule fiable. Nous avons
utilisé une telle approche et nous discuterons dans les Partie I de ce manuscrit la validité des résultats
que nous avons obtenus.
Un autre type d’approche s’est développé récemment. Elle consiste à effectuer un marquage
différentiel des protéines du tissu témoin et du tissu traité puis à mélanger les deux échantillons avant
séparation par électrophorèse 2D ou HPLC couplée à la spectrométrie de masse. On peut ainsi espérer
que les pertes de protéines seront les mêmes dans les deux échantillons lors de la manipulation
puisqu’ils subissent exactement le même traitement.
Pour ce qui est de l’électrophorèse 2D, le marquage différentiel est effectué par des molécules
fluorescentes (des cyanines dans le cas de la méthode DIGE, Differential In Gel Electrophoresis). Cette
méthode permet de minimiser la variabilité inter-gels. Nous l'évoquerons dans la discussion de la
Partie I. Elle constitue, en effet, un prolongement prometteur à l’étude présentée dans ce mémoire.
En spectrométrie de masse (avec ou sans électrophorèse 2D préalable), outre quelques
méthodes basées sur la comparaison de l’intensité des signaux mesurés dans des analyses
38
séquentielles, les méthodes différentielles sont principalement basées sur des marquages isotopiques
qui introduisent une différence de masse (Yan and Chen 2005). Cela permet d’estimer la quantité
relative d’un peptide donné dans les différents échantillons biologiques. Ces marquages peuvent être
réalisés in vivo par incorporation métabolique d’isotopes stables dans les protéines. La méthode
SILAC, en particulier, est basée sur l’incorporation d’acides aminés marqués par des isotopes stables
comme le 2H, le
13
C ou le
15
N. Cette méthode, bien que performante, ne peut être adaptée à un
modèle comme celui de la LTP puisqu’elle nécessite de travailler avec des cultures cellulaires.
Les méthodes de marquage isotopique différentiel in vitro mettent en jeu des marquages
enzymatiques ou chimiques. Il est possible d’incorporer 2 atomes d’18O au niveau C-terminal des
peptides au moment de la digestion enzymatique des protéines par la trypsine (Schnolzer et al. 1996).
Ce type de marquage introduit une différence de masse de 4 Da entre les peptides des deux
échantillons. Cette méthode est limitée par les risques d’une incorporation incomplète des isotopes
ainsi que par le faible écart de masse qui est introduit. La mesure de l’intensité des ions peut être
biaisée par la répartition isotopique naturelle des peptides étudiés. L’ICATTM est la première méthode
de marquage isotopoque chimique mise au point par Gygi et al. (Gygi et al. 1999) et consiste à
dériver les peptides contenant des résidus cystéines par un « tag » d’affinité à la biotine. Le principe
de cette méthode, qui est à la base du développement des autres méthodes de marquage chimique
isotopique, est présenté dans la figure 14. La méthode ICATTM présente l’avantage de réduire la
complexité de l’échantillon étudié puisqu’elle restreint l’analyse aux peptides contenant des cystéines,
toutefois cette restriction exclut d’office les protéines qui ne contiennent pas cet acide aminé, soit
environ 4 % des protéines. En outre, elle peut introduire un biais à l’étape de séparation des peptides
du fait de la présence du tag et du remplacement de plusieurs atomes d’hydrogène par du deutérium.
Plus récemment cette méthode a fait l’objet d’améliorations, notamment par l’utilisation d’isotopes du
carbone (12C/13C) et par l’introduction d’un site de clivage dans le tag, permettant une meilleure coélution des isotopes correspondant à un même peptide (Shiio and Aebersold 2006).
Le développement de la méthode iTRAQTM a apporté une autre dimension avec la possibilité
de comparer dans une même analyse 4 échantillons différents ou d’effectuer une quantification
absolue avec l’utilisation de standards internes (Ross et al. 2004). Les tags utilisés dans cette méthode
comprennent diverses combinaisons isobariques entre un groupe reporter (de 114 à 117 Da) et un
groupe balance (de 31 à 28 Da). La quantification se fait sur les groupes reporters qui sont
fragmentés dans l’appareil de spectrométrie de masse. D’autre part, le tag est greffé sur le N-terminal
des peptides et non pas sur un acide aminé particulier, ce qui assure une meilleure couverture des
protéines contenues dans l’échantillon. Enfin, une quantification absolue peut être envisagée grâce à
l’utilisation de standards internes marqués (technologie AQUATM), toutefois cette approche n’est pas
adaptée à une étude prospective comme la nôtre.
Ces méthodes restent délicates à mettre en œuvre et, parce qu’elles sont basées sur la
séparation des peptides et non des protéines, elles nécessitent obligatoirement d’être couplées à la
39
spectrométrie de masse en tandem qui permet de valider l'identité du peptide à quantifier par sa
séquence en acides aminés.
Tag d’affinité
pour la biotine
Échantillon 1
Linker portant les isotopes
lourds ou légers
Marquage
isotopique
Mélange des
échantillons
Groupement réactif
avec les thiols
Digestion
trypsique
Chromatographie
d’affinité
Clivage éventuel
du tag biotine
LC MS/MS
2- Identification
des protéines en
MS/MS
Intensité
1- Mesure de
l’intensité relative
en MS
Intensité
Échantillon 2
Figure 14 : Principe de la méthode ICATTM. Les échantillons sont marqués respectivement avec un
tag isotopique lourd ou léger constitué d’un groupement réactif spécifique des groupements thiols,
d’un « linker » qui porte les différents isotopes (1H/2H ou 12C/13C) et d’un tag biotine qui permet la
purification des peptides marqués par chromatographie d’affinité. L’intensité relative de deux peptides
identiques portant des isotopes lourds et légers est estimée en MS tandis que les protéines
correspondantes sont ensuite identifiées par MS/MS.
Une étude publiée récemment a montré que les méthodes basées sur des marquages
isotopiques ou la comparaison d’intensité dans les spectres de masse étaient plus justes que les
méthodes par électrophorèse en terme de quantification. Toutefois la réplication des expériences
menées par électrophorèse améliore sensiblement leur performance (Turck et al. 2007).
Malgré de nombreuses avancées technologiques, il faut souligner qu’il n’existe actuellement
aucune approche ni méthode qui permette de visualiser l’ensemble du protéome d’une cellule et
encore moins de visualiser les variations de toutes les protéines impliquées dans un seul phénomène
biologique.
40
E.4.
Le développement de la phosphoprotéomique
Compte tenu de l’importance de l’état de phosphorylation des protéines dans l’induction de la
LTP, nous avons également réalisé une étude protéomique des phosphoprotéines au cours de la
phase précoce de la LTP. La phosphoprotéomique est une ère de la protéomique en pleine expansion
dont les derniers développements sont présentés dans quelques revues récentes (Zhou et al. 2001;
Jensen 2004; Mumby and Brekken 2005; Salih 2005; Delom and Chevet 2006; Morandell et al. 2006).
On estime à environ 30% le nombre de protéines phosphorylées dans les cellules des
mammifères et de 2 à 5% (selon les auteurs) le nombre de gènes qui codent des kinases ou des
phosphatases. Ce mécanisme de régulation des activités enzymatiques est le plus étudié dans le cadre
général de la transduction des signaux cellulaires. La phosphorylation des protéines par les kinases
implique la formation d’une fonction phosphoester qui est relativement stable en milieu acide et
beaucoup moins en milieu basique. De plus, seul l’ATP permet une telle phosphorylation. Chez les
eucaryotes, les résidus qui sont le plus souvent sujets à la phosphorylation sont les sérine, thréonine
et tyrosine, dans des proportions de 1800 : 200 : 1. D’autres acides aminés peuvent être phosphorylés
transitoirement chez les procaryotes. Si les kinases sont relativement spécifiques d’une protéine
substrat, voire d’un acide aminé (tyrosines kinases par exemple), souvent du fait de leur localisation
cellulaire, il n’en est pas de même pour les protéines phosphatases. C’est un point qui ne peut être
négligé lorsque l’on prépare un extrait acellulaire en vue d’une recherche de protéines phosphorylées
et on imagine sans mal l'impact que peuvent avoir ces phosphatases sur une étude de variations
d'état de phosphorylation. Il est possible d'inhiber leur activité grâce à des inhibiteurs de
phosphatases disponibles dans le commerce, tout en sachant que leur action n’est pas absolue.
Les protéines qui sont phosphorylées lors des phénomènes de transduction des signaux, de
différenciation cellulaire, de régulation de la transcription ou de la traduction etc, sont connues pour
être peu abondantes. De plus, la population d'une protéine donnée est phosphorylée de façon
hétérogène à un instant donné.
Plusieurs approches méthodologiques ont été mises au point depuis le début des années
1970. L'ouvrage édité par D. G. Hardie en 1999 (Protein Phosphorylation, a practical approach) fait le
point sur ce sujet. La signalisation médiée par les phosphorylations / déphosphorylations est un
phénomène dynamique et concerne des séries de protéines qui fonctionnent en cascades. Aussi, avec
l'avènement des outils de la protéomique, l’accès à une vision globale d’une chaîne de transduction
impliquant plusieurs kinases / phosphatases pour un signal donné est devenu envisageable. Lorsque
les voies de signalisation sont connues, la protéomique différentielle permet de se tourner vers leurs
cibles.
Au milieu des années 1990, les premières études de phosphoprotéomique par électrophorèse
2D utilisaient la radioactivité
32
P. L’incubation de bactéries avec du
32
P ou celle d’un extrait acellulaire
avec de l’ATP32P a permis de visualiser en autoradiographie le phosphoprotéome (tout au moins une
P
grande partie) de l’organisme en question. L’avantage de la radioactivité
32
P est sa très grande
sensiblité (niveau du femtog, peut-être moins ?), en revanche, l'identification des protéines
41
correspondant aux taches radioactives était particulièrement difficile en raison de leur faible niveau
d'expression par rapport aux contaminants (kératines) ou aux autres protéines migrant au même
endroit. De plus, il est nécessaire d’utiliser d’assez fortes radioactivités spécifiques ce qui pose des
problèmes de sécurité et de coût l’élimination des déchets. De telles approches en électrophorèse 2D
sont moins utilisées aujourd’hui, mais le marquage radioactif, compte-tenu de sa spécificité, reste
encore utile pour suivre la présence des phosphoprotéines lors de leur enrichissement (Delcourt et al.
2007), ou pour détecter des sites de phosphorylation (MacDonald et al. 2002).
Au début des années 2000, un réactif fluorescent relativement sensible (au niveau du ng de
protéine phosphorylée) a fait son apparition sur le marché : le Pro-Q® Diamond (Invitrogen, Molecular
ProbesTM) (Schulenberg et al. 2003). Par comparaison, ce Pro-Q® Diamond est aussi sensible que le
nitrate d’argent et 50 fois plus que le bleu de coomassie, deux réactifs traditionnels utilisés pour
révéler des protéines en gel 2D. Il est devenu ainsi possible, sans utiliser de radioactivité, de révéler
les protéines phosphorylées sur un gel 2D par ce réactif fluorescent, d’effectuer une lecture
numérique grâce à un lecteur et un logiciel appropriés pour en avoir une image complète, puis de
réaliser une coloration avec un réactif général des protéines (bleu de coomassie, SYPRO Ruby ou
nitrate d’argent) compatible avec des identifications ultérieures en spectrométrie de masse. Les deux
images ainsi obtenues peuvent être superposées et comparées. Nous avons utilisé cette méthode pour
l’étude des protéines phosphorylées au cours de la LTP (voir la Partie II). Dans la mesure où injecter
de fortes radioactivités spécifiques
32
P à des animaux vivants reste une opération très délicate, voire
dangereuse, le Pro-Q® Diamond est devenu l'outil le plus performant pour une première approche
expérimentale consistant à rechercher des protéines phosphorylées via l'électrophorèse 2D. Des
auteurs ont montré récemment que le
32
P et le Pro-Q® Diamond donnaient des résultats très proches
(Levine et al. 2006). Ce dernier réactif n'étant pas totalement spécifique des protéines phosphorylées,
nous discuterons ce biais expérimental dans la partie 2 de notre étude.
Là encore, il s’agit d’accéder aux protéines visibles en électrophorèse 2D, ce qui exclut celles
qui sont très hydrophobes, très acides ou très basiques. L’état de phosphorylation des protéines
individuelles peut être évalué avec une stratégie de gel monodimensionnel associée à l’utilisation
d’anticorps spécifiques. La panoplie d’anticorps disponibles dans le commerce est en pleine expansion,
notamment grâce au développement d’anticorps spécifiques des sites particuliers de phosphorylation.
Cette stratégie convient à l’étude des protéines hydrophobes et peut être utilisée en complément
d’une approche par électrophorèse 2D. Il est possible, en particulier, de corréler les résultats obtenus
en gel 2D avec ceux obtenus avec un anticorps spécifique pour une protéine donnée (Kaufmann et al.
2001; Rush et al. 2005). Nous avons également utilisé une telle stratégie au cours de notre étude.
Pour aller plus loin dans le cadre d’études phosphoprotéomiques, pour visualiser les protéines
phosphorylées les moins abondantes, pour identifier les sites de phosphorylation en spectrométrie de
masse etc, il est nécessaire d’enrichir l’extrait cellulaire en protéines phosphorylées. Cette
étape, comme on peut s’en douter, apporte obligatoirement un nouveau risque de pertes aléatoires
qu’il faudra pallier, notamment si l’on souhaite faire de la phosphoprotéomique différentielle.
42
Dans la mesure où nous n’avons pas développé de telles approches dans notre étude, nous
nous contenterons de résumer ici les différentes méthodes publiées récemment au sein d'une
abondante littérature. Nous évoquerons également ces approches dans les discussions et perspectives
de notre étude.
La méthode la plus simple à mettre en œuvre reste la plus ancienne. Elle est appellée IMAC
pour Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography. Son principe date des années 1970. Elle
fonctionne sur le principe d’une chromatographie d’affinité qui consiste à immobiliser un métal sur un
support synthétique, lui-même greffé chimiquement par des molécules qui portent des groupements
carboxyles. Ce sont ces groupements carboxyles qui complexent le métal. Ce dernier est choisi pour
sa capacité à disposer de plusieurs orbitales libres qui fixeront à leur tour toute molécule très acide et
notamment celles qui portent des phosphates. Ces métaux sont essentiellement : Fe3+, Ga3+, Zn2+ ou
Al3+. Pour simplifier la procédure, après un lavage qui élimine les protéines ou les peptides non
phosphorylés, ceux qui sont restés accrochés sont élués par un gradient de sel ou de pH. Des billes
magnétiques portant du Fe3+ ont même été mises au point pour faciliter la manipulation. Parce qu’elle
retient aussi les peptides ou protéines acides, la méthode IMAC ne doit pas être considérée comme
une méthode de purification des phosphoprotéines / phosphopeptides mais bien comme un
enrichissement. Plus récemment des oxydes de métaux (Sugiyama et al. 2007) ont été proposés,
dioxyde de titane ou de zirconium, par exemple. TiO2 donne des résultats très prometteurs
notamment pour une rétention plus spécifique des Phosphoprotéines/Phosphopeptides. De nombreux
travaux ont récemment été publiés selon cette approche (Larsen et al. 2005; Delcourt et al. 2007;
Pocsfalvi et al. 2007), avec la possibilité de couplage à une colonne C18 en amont de la MS/MS
(Pinkse et al. 2004). Un tel enrichissement en phosphoprotéines / phosphopeptides par la méthode
IMAC Fe3+ a été l’objet de quelques essais préliminaires au laboratoire. Ils ne seront pas évoqués dans
ce mémoire, mais ils feront partie des prolongements de notre étude, notamment pour la recherche
de sites de phosphorylation en spectrométrie de masse MS/MS, que nous évoquerons dans la partie
perspectives.
Une seconde méthode consiste à éliminer en milieu basique le phosphate des peptides
obtenus après protéolyse. A la place du résidu phosphoséryle, il y aura un résidu déshydroalanyle, ou
déshydrobutyryle s’il s’agissait d’une phosphothréonine. Cette β-élimination ne fonctionne pas avec la
phosphotyrosine. Il est possible de détecter en spectrométrie de masse une telle disparition de
phosphate. Oda et al. (2001) ont proposé de compléter cette approche en fixant un « tag » biotine
sur les déshydroséryle / déshydrothréonyle permettant ainsi de purifier sur colonne d'avidine les
peptides qui étaient phosphorylés (Oda et al. 2001). Cette approche a fait l'objet de plusieurs
variantes (Knight et al. 2003). Aussi élégante soit elle, la méthode d’Oda nécessite une longue mise
au point et présente de nombreuses difficultés expérimentales. Elle a cependant permis l'élaboration
de la première approche de phosphoprotéomique différentielle calquée sur celles qui ont été décrites
plus haut (Goshe et al. 2001; Qian et al. 2003). D'autres approches de la phosphoprotéomique
différentielle ont été menées comme celle qui consiste à comparer des échantillons traités soit au
32
P
43
soit au
33
P, en jouant sur la différence d'énergie d'émission de ces 2 isotopes (Wyttenbach and
Tolkovsky 2006).
Enfin, la spectrométrie de masse en tandem joue un rôle fondamental dans la recherche des
peptides phosphorylés au sein d’un mélange pas trop complexe (Steen et al. 2006). La perte du
phosphate sous forme d’ion PO3– (–79 Da) ou PO2– (–63 Da) (balayage d'ions parents en mode ions
négatifs) ou sous forme de neutre H3PO4 (–98 Da) (balayage en mode perte de neutre en mode
positif) dans l’analyseur du spectromètre de masse est un indice précieux qui permet de détecter la
présence d’un peptide phosphorylé. Cette perte peut même être obtenue « manuellement » en
utilisant une phosphatase sur la cible d’un MALDI-TOF (Torres et al. 2005). Avec les spectromètres de
masse qui possèdent un analyseur à résonance cyclotronique (FTICR), il est possible de provoquer la
capture d’un électron de faible énergie (ECD) par le peptide analysé. Cette opération entraîne des
cassures plus spécifiques de la chaîne polypeptidique (ions c et z en majorité) tout en gardant stables
des modifications post-traductionnelles comme les phosphorylations. La technologie ECD ouvre de
réelles perspectives pour des analyses de phosphorylations de protéines sur de très faibles quantités
dans les prochaines années.
Enfin, plusieurs sites WEB spécialisés dans la recherche ou la prédiction des sites de
phosphorylation ont été créés ces dernières années. Couplés aux analyses de spectrométrie de masse,
ces sites WEB sont des outils particulièrement utiles aux phosphoprotéomistes.
E.5.
L’apport de la protéomique en neurosciences
L’application des méthodes de protéomique à des problématiques de neurosciences est en
plein essor depuis quelques années. Que ce soit dans des modèles cellulaires ou plus intégrés, la
protéomique fonctionnelle, aussi bien descriptive que différentielle, ouvre de nouveaux champs de
connaissance sur le fonctionnement et l’organisation des cellules neuronales ou gliales et du cerveau.
Dans ce chapitre, nous allons nous concentrer sur les aspects qui touchent à la mémoire et à la
plasticité synaptique mais l’on se doit d’évoquer les efforts qui sont mis en œuvre dans le domaine des
maladies neurodégénératives et les pathologies du cerveau. Dans ce domaine, la protéomique clinique
s’est largement développée dans l’optique d’établir des diagnostics ou de développer de nouveaux
médicaments par la recherche de marqueurs spécifiquement associés à une pathologie. Beaucoup de
travaux se sont intéressés en particulier à la maladie d’Alzheimer ou au syndrome de Down
(Fountoulakis 2004; Lovestone et al. 2007).
Dans le domaine de la mémoire et de la plasticité, une attention particulière s’est portée sur la
description des protéines synaptiques. En se basant sur des méthodes de fractionnement
subcellulaire, plusieurs équipes se sont intéressées à l’identification des protéines de la densité
postsynaptique (Walikonis et al. 2000; Li et al. 2004a; Peng et al. 2004; Yoshimura et al. 2004; Cheng
et al. 2006),
des vésicules synaptiques (Coughenour et al. 2004), de la membrane plasmique
synaptique (Stevens et al. 2003) ou encore de complexes protéiques associés aux récepteurs AMPA ou
NMDA (Husi et al. 2000; Fountoulakis et al. 2005). Ce type d’approche a permis d’identifier de
44
nouvelles protéines par séparation des protéines de la PSD sur gel 1D, digestion trypsique et
identification par nanoLC MS/MS (Murata et al. 2005) et de commencer à dresser un tableau des
grands complexes protéiques qui régissent l’activité synaptique (Grant and Husi 2001).
L’étude des complexes dans différents états physiologiques pourrait apporter de nombreuses
informations sur les cascades de signalisation impliquées, les interactions protéiques et la nature des
complexes fonctionnels. La nature de ces complexes, leur nombre ainsi que leur localisation font
partie intégrante de l’équilibre fonctionnel du cerveau. Cependant, comme nous l’avons déjà évoqué,
une des limites du fractionnement tient à la difficulté d’obtenir une bonne reproductibilité. En outre,
cette approche nécessite en règle générale une quantité importante de protéines ce qui rend difficile
l’étude de petites régions du cerveau. En conséquence, la plupart des études différentielles se sont
basées sur des homogénats de tissu entier, notamment l’hippocampe. Le protéome des protéines
solubles de l’hippocampe de rat séparées par électrophorèse 2D a été décrit et contient une large
majorité d’enzymes mais également des protéines chaperonnes, ou impliquées dans le cycle cellulaire,
la transduction du signal, la structure cellulaire, la transcription, la traduction et le transport cellulaire
(Fountoulakis et al. 2005). Une étude récente a pourtant réalisé une quantification relative des
protéines membranaires du cortex, de l’hippocampe et du cervelet (Olsen et al. 2007). Les auteurs ont
développé une méthode d’enrichissement des protéines membranaires sur des petites quantités de
tissu ainsi qu’une méthode de marquage isotopique par HysTag (Olsen et al. 2004; Nielsen et al.
2005). La combinaison des deux ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude quantitative des
protéines membranaires sur de petites quantités de tissu cérébral.
Les travaux portant sur des problématiques liées à la mémoire ou à la plasticité synaptique
sont encore peu nombreux. La première étude à grande échelle visant à étudier la régulation des
protéines dans un modèle de plasticité synaptique a été réalisée par électrophorèse bidimensionnelle
sur le modèle de l’Aplysie (Castellucci et al. 1988). La LTP a également fait l’objet d’une étude
similaire en 1993, montrant des modifications bidirectionnelles de l’expression des protéines 1 h et 3 h
après son induction dans le gyrus denté chez le rat anesthésié (Fazeli et al. 1993). Ces deux études se
sont basées sur une séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle. Toutefois, à cette
époque, la grande majorité des protéines observées n’a pas pu être identifiée.
Depuis, plusieurs études protéomiques différentielles se sont intéressées aux régulations
protéiques associées à la mémoire. Certains travaux se sont basés sur l’étude du protéome de
l’hippocampe ou du cerveau de souris mutantes qui présentent des déficits mnésiques. Ils ont montré,
d’une part, que le métabolisme et le niveau d’oxydation des protéines étaient altérés chez des souris
dont le vieillissement est accéléré (Poon et al. 2004). D’autre part, ils ont mis en évidence des
modifications de l’expression de protéines de signalisation, du métabolisme, du cytosquelette, de la
transcription ou de protéines chaperonnes chez des souris qui n’expriment pas la NO-synthase
(Kirchner et al. 2004). Deux études récentes ont étudié directement la régulation de l’expression des
protéines suite à un séjour en milieu enrichi ou à un apprentissage spatial. Les principales altérations
45
protéiques associées à un séjour en milieu enrichi sont impliquées dans la structure du cytoplasme, le
métabolisme et la signalisation cellulaire (McNair et al. 2007). Dans cette étude, les auteurs ont
dissocié la couche somatique et la couche dendritique de la région CA1 de l’hippocampe, montrant
une prévalence des protéines de signalisation cellulaire au niveau dendritique. Enfin, Henninger et al.
(2007) ont montré une forte tendance à une réduction du niveau d’expression des protéines de
l’hippocampe après un apprentissage spatial en piscine de Morris (Henninger et al. 2007). Les
protéines concernées sont, là encore, impliquées dans le métabolisme ou l’architecture du
cytosquelette mais également dans le transport vésiculaire ou la neurogenèse.
Concernant la plasticité synaptique, Liao et al. (2007) ont observé la surexpression de
nombreuses protéines dans des synaptosomes suite à un traitement par le BDNF (Liao et al. 2007).
Les protéines des synaptosomes ont été digérées par la trypsine et les peptides séparés puis identifiés
par 2D LC-MS/MS (MudPIT). Les protéines surexprimées sont des protéines de structure ou des
protéines impliquées dans la transcription et le traitement des ARNm mais surtout dans les
mécanismes de traduction. Ces observations sont en accord avec l’induction de la traduction par le
BDNF ainsi que l’existence d’une synthèse protéique localisée au niveau synaptique au cours de la
plasticité synaptique. Finalement, une étude réalisée par McNair et al. (2006) a montré des variations
d’expression des protéines dans l’hippocampe après induction de la LTP par stimulation à haute
fréquence dans la région CA1 (McNair et al. 2006). Dans cette étude, les catégories de protéines qui
sont le plus sujettes à des variations sont le métabolisme, la régulation du cytosquelette et le
transport et métabolisme des protéines. Selon le délai étudié (10 min, LTP précoce, ou 4 h, LTP
tardive), les catégories principales ne sont pas les mêmes. Il semble que le métabolisme énergétique
soit impliqué de façon rapide et transitoire au cours de la LTP.
Le rôle prépondérant des phosphorylations dans l’induction de la LTP a également donné lieu
à plusieurs études de phosphoprotéomique. Les phosphoprotéines sont particulièrement importantes
dans la régulation fonctionnelle de la densité postsynaptique (Yamauchi 2002). Collins et al. (2005)
ont donc entrepris une étude poussée des phosphoprotéines dans des synaptosomes en utilisant en
parallèle la séparation de phosphoprotéines et de phosphopeptides sur colonne IMAC (Collins et al.
2005). Ils ont pu identifier de nombreuses protéines mais également de nombreux sites de
phosphorylation dont une large part n’avaient pas été décrits sur des récepteurs, des protéines
d’ancrage, des kinases, phosphatases, petites protéines G, protéines du cytosquelette, des protéines
impliquées dans la traduction et d’autres enzymes et protéines de signalisation. Les travaux de
Trinidad et al., qui sont également basés sur un enrichissement des peptides phosphorylés par
colonne IMAC, sont venus compléter ces données en décrivant de nouvelles phosphoprotéines et leurs
sites de phosphorylation dans la densité postsynaptique (identification des peptides phosphorylés par
nano-LC-ESI-Q-TOF MS/MS suivie d’une fragmentation par CID) (Trinidad et al. 2005; Trinidad et al.
2006). Enfin, une publication récente décrit la première étude de quantification relative et absolue du
niveau de phosphorylation des protéines dans un modèle d’activation synaptique (Munton et al. 2007).
46
Les auteurs ont travaillé sur des extraits de terminaisons synaptiques ou de densité postsynaptique
stimulés avec du KCl qu’ils ont comparés. Ils ont pu estimer le niveau de phosphorylation des
protéines dans les différents compartiments suite à la stimulation par le KCl. Ils ont observé
notamment une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la CaMKIIα et β dans les
synaptosomes activés. Leurs travaux ont également permis l’identification de nouveaux sites de
phosphorylation sur certaines protéines connues de la synapse telles que la CaMKII, la sous-unité NR2
des récepteurs NMDA, la PKC, la PSD-95 et la DAP (Disk large-associated protein). L’étude des
protéines phosphorylées au cours de la LTP n’a encore fait l’objet d’aucune publication et a constitué
la majeure partie de mon travail de thèse.
Au vu de l’ensemble de ces données, la régulation des protéines de signalisation, du
métabolisme et du cytosquelette apparaît de façon récurrente au cours de la mémoire et de la
plasticité synaptique. Les travaux de protéomique permettent de pointer des protéines ou des
catégories de protéines que l’on n’imaginait pas être particulièrement impliquées dans les
phénomènes de plasticité synaptique. Ils ouvrent ainsi des perspectives vers de nouvelles hypothèses
et de nouvelles voies d’études.
47
OBJECTIFS
L’objectif général de ce travail qui m’a été proposé en Septembre 2003 a été d’identifier des
protéines impliquées dans les différentes phases de la LTP afin de mieux connaître les mécanismes
moléculaires qui contrôlent la plasticité synaptique. La plupart des études visant à comprendre les
mécanismes moléculaires de la LTP se basent sur des données pharmacologiques ou génétiques,
c'est-à-dire sur la modification des conditions physiologiques normales par l’ajout d’un agent
pharmacologique et la mutation ou la délétion d’un gène. Nous avons choisi d’utiliser une démarche
différente puisque nous cherchons à observer les variations qui se produisent naturellement au cours
de la LTP.
Notre modèle d’étude est la LTP induite par une stimulation à haute fréquence dans le gyrus
denté chez le rat anesthésié. Le protocole que nous utilisons induit une LTP stable pendant plusieurs
jours (Laroche et al. 1989).
Nous avons choisi d’aborder la question posée avec trois approches différentes qui sont toutes
basées sur une séparation des protéines par électrophorèse 2D suivie d’une analyse différentielle et de
l’identification des protéines par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux variations d’expression totale des
protéines au cours de la phase tardive de la LTP. Deux délais ont été étudiés correspondant à des
périodes encore peu connues de la LTP : 6 h et 24 h. Après avoir mis au point les conditions de
séparations des protéines par gel 2D et optimisé la méthodologie d’analyse différentielle, nous avons
comparé le niveau d’expression des protéines du gyrus denté dorsal ayant subi ou non une stimulation
à haute fréquence. Ce travail est décrit dans la Partie I de ce manuscrit.
En parallèle, et avec une approche similaire, nous avons cherché à identifier des cibles
potentielles du facteur de transcription Zif268 par la comparaison du protéome de souris sauvages et
de souris mutantes n’exprimant pas Zif268. Ces travaux nous ont conduits à montrer la présence de
faux positifs provenant de la construction génétique des souris mutantes. Ceci a abouti à une
publication qui est présentée dans la Partie III.
Enfin, nous nous sommes intéressés à la phase précoce de la LTP avec une approche
légèrement différente. Compte tenu de l’importance des protéines phosphorylées dans les premières
étapes de l’induction de la LTP, nous avons étudié spécifiquement la régulation des phosphoprotéines
à trois délais suivant son induction : 0 min, 15 min et 90 min. La démarche utilisée pour ce travail a
bénéficié des enseignements que nous avons tirés des deux autres parties et nous a permis
d’identifier une quinzaine de protéines dont le niveau de phosphorylation était altéré au cours de la
LTP (Partie II).
48
Partie I :
Etude Protéomique de la Phase Tardive de la LTP dans
le Gyrus Denté chez le Rat, In Vivo
49
Partie I : Introduction
INTRODUCTION
La première partie de ce travail a consisté à mettre au point une approche méthodologique
pour l’étude des variations d’expression des protéines au cours de la phase tardive de la LTP. Plusieurs
points essentiels ont dû être définis, tels que le choix des délais expérimentaux, le choix des
échantillons biologiques et le choix de l’approche méthodologique. Chacun de ces points sera
développé et discuté afin de présenter notre démarche expérimentale.
A.
Choix des délais expérimentaux
La plasticité est par définition un phénomène dynamique. Capturer un état statique de la
région stimulée ne peut donc fournir qu’une information très restreinte sur la réalité du phénomène.
C’est pourquoi, nous avons choisi d’étudier deux délais différents après l’induction de la LTP. Dans la
mesure où la plupart des études portant sur des protéines individuelles se sont placées dans des
délais assez courts après induction de la LTP (entre 5 min et 3 h), nous avons choisi de nous
concentrer sur des délais plus tardifs afin de comprendre les modifications moléculaires qui
permettent le maintien de la LTP sur le long terme : 6 h et 24 h après induction de la LTP.
A.1.
6 h après induction de la LTP
Le délai de 6 h nous a paru intéressant car l’application d’inhibiteurs de la transcription
provoque le déclin de la LTP entre 3 h et 6 h. A 6 h, la phase tardive est donc engagée, probablement
accompagnée d’une activité de transcription et traduction conséquente. Plusieurs protéines sont déjà
connues pour être exprimées à ce délai. La protéine synapsine 1, par exemple, est surexprimée entre
5 h (Hicks et al. 1997) et 8 h (Sato et al. 2000) après induction de la LTP dans le gyrus denté in vivo
chez le rat. L’expression de la syntaxine 1B est également accrue par l’induction de la LTP dans le
gyrus denté à 5 h (Hicks et al. 1997).
En outre, l’ARNm de la protéine d’ancrage A-kinase 5 (AKAP 150) est exprimé 3 h, 6 h et 12 h
après induction de la LTP dans le gyrus denté in vivo chez des rats éveillés (Genin et al. 2003). Bien
que l’expression des ARNm et des protéines ne soient pas systématiquement corrélés (Ross et al.
2004), on peut supposer que le niveau d’expression de la protéine AKAP 150 est régulé pendant cette
fenêtre temporelle.
Les trois protéines évoquées ci-dessus sont impliquées dans la plasticité synaptique. La
synapsine 1 et la syntaxine 1B sont des protéines neuronales impliquées dans l’exocytose et la
libération des neurotransmetteurs (Sudhof 1995; Hilfiker et al. 1999). La protéine AKAP 150 est une
protéine d’ancrage qui établit un lien entre les voies de signalisation des protéines kinases PKA et PKC,
la calmoduline et la phosphatase calcineurine (Dodge and Scott 2000). En dehors de la synapsine 1
50
dont le pI est très basique, ces protéines devraient être détectées par électrophorèse 2D car elles sont
peu hydrophobes et leurs masses et pI se trouvent dans des gammes adaptées, à condition qu’elles
soient suffisamment exprimées :
-
syntaxine 1B : 30918 Da, pI 5,25
-
AKAP 150 : 75962 Da, pI 4,70
A.2.
24 h après induction de la LTP
Le protocole que nous utilisons au laboratoire pour induire la LTP dans le gyrus denté chez le
rat anesthésié produit une LTP qui peut durer plusieurs jours (Laroche et al. 1989). Or très peu
d’études portant sur les protéines se situent à des délais de l’ordre d’une journée. Pour cette raison,
nous avons choisi ce second délai de 24 h afin de cibler les mécanismes moléculaires impliqués dans
les phases très tardives de la LTP.
Une augmentation du niveau d’expression du récepteur métabotropique du glutamate mGluR5
a déjà été observée à ce délai après induction de la LTP dans le gyrus denté in vivo (ManahanVaughan et al. 2003). Mais les autres études réalisées à 24 h se sont focalisées sur l’étude de la
régulation des ARNm et non des protéines. Elles ont montré la surexpression des ARNm de trois
protéines kinases : la CaMKIIα (Thomas et al. 1994b), la MAPK ERK2 (Thomas et al. 1994b) et la PKCγ
(Thomas et al. 1996).
Il est peu probable que l’on puisse détecter le récepteur mGluR5 dans les gels 2D compte
tenu de son hydrophobicité. La protéine CaMKIIα est fortement exprimée dans l’hippocampe où elle
représente 2 % des protéines totales (Erondu and Kennedy 1985). Elle devrait donc être détectée
dans les gels 2D (masse : 54 115 Da, pI 6,61). Les deux autres kinases se trouvent également dans
des gammes de masse et de point isoélectrique accessibles (ERK2 : 41 144 Da, pI 6,53 ; PKCγ :
78 358 Da, pI 7,27) cependant leurs niveaux d’expression risquent d’être faibles comme c’est le cas
généralement pour les protéines de signalisation cellulaire.
B.
Choix des échantillons biologiques
B.1.
Sélection du gyrus denté dorsal
Dans notre modèle d’étude, la LTP est induite dans la voie perforante médiane qui provient du
cortex entorhinal médian et innerve majoritairement le gyrus denté dorsal de l’hippocampe (van Groen
et al. 2002). Les variations d’expression protéiques pourraient donc être localisées préférentiellement
dans la partie dorsale du gyrus denté. Une étude récente a également montré que les récepteurs
AMPA étaient exprimés en plus grand nombre dans l’hippocampe dorsal par rapport au ventral (Pandis
et al. 2006). Ces observations suggèrent que l’induction de la LTP devrait être plus détectable dans la
région dorsale de l’hippocampe. En outre, nous enregistrons la réponse électrique induite par la
stimulation avec une électrode d’enregistrement placée dans le gyrus denté dorsal, ce qui permet de
51
contrôler l’induction de la LTP dans cette zone. Nous avons donc choisi de travailler spécifiquement
sur la région du gyrus denté dorsal.
B.2.
Choix des contrôles
Deux types de contrôles sont envisageables dans le cadre de notre étude. La LTP est induite
dans un seul hémisphère chez les animaux. Le gyrus denté de l’hémisphère controlatéral, non stimulé,
peut donc servir de contrôle interne pour chaque animal. Dans ce cas, la variabilité entre les
échantillons est réduite puisque le facteur de variabilité individuelle est éliminé. Le deuxième type de
contrôle consiste à soumettre d’autres animaux aux mêmes conditions expérimentales que les
animaux induits (anesthésie, implantation des électrodes, stimulation à basse fréquence), en
remplaçant le tetanus de stimulation par un pseudo-tetanus.
Dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que la variabilité individuelle, nous
avons choisi, dans un premier temps, d’utiliser le gyrus denté controlatéral de chaque animal stimulé.
C.
Choix de l’approche méthodologique
C.1.
L’électrophorèse bidimensionnelle
Dans l’optique d’effectuer une étude exploratoire et d’étudier à large échelle les variations
d’expression des protéines intervenant au cours de la phase tardive de la LTP, nous avons choisi
d’utiliser l’électrophorèse 2D. Cette méthode bénéficie, en effet, de nombreuses années d’expériences,
notamment dans l’équipe de Chimie des protéines de l’Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire
et Cellulaire (IBBMC). Compte tenu des limites intrinsèques à l’électrophorèse 2D, nous avons
délibérément fait le choix de travailler sur les protéines solubles ou semi solubles, tout en bénéficiant
des qualités de reproductibilité et de résolution de cette technique. En outre, elle ne nécessite pas
d’être couplée à la spectrométrie de masse en tandem, ce qui la rend plus accessible, et elle offre le
confort de pouvoir visualiser les protéines. Couplée à une coloration spécifique des protéines, elle
permet de réaliser des études quantitatives relatives, ce qui répond à notre projet expérimental. Enfin,
le travail de Fazeli et al. a démontré que l’on pouvait observer des variations d’expression protéiques
dans le gyrus denté après induction de la LTP avec cette technique, ce qui renforce clairement ce
choix méthodologique (Fazeli et al. 1993).
C.2.
Choix des colorants pour l’électrophorèse bidimensionnelle
Les colorants disponibles à l’époque de la mise en place de ce projet étaient le Bleu de
Coomassie, le nitrate d’argent et le Sypro Ruby.
Le Sypro Ruby est un colorant fluorescent. Sa gamme de linéarité recouvre 3 ordres de
grandeur et il permet de détecter jusqu’à 2 ng de protéines (Berggren et al. 2002). La combinaison
52
d’une bonne sensibilité et d’une gamme de linéarité satisfaisante en faisait un bon candidat dans le
cadre de notre étude. Cependant, la détection de la fluorescence dans les gels nécessite l’utilisation
d’un scanner spécifique auquel nous n’avions pas accès en routine.
Le Bleu de Coomassie et le nitrate d’argent sont les colorants les plus couramment utilisés. Le
Bleu de Coomassie réagit, en milieu acide, avec les acides aminés basiques et les groupes non
polaires des protéines. Il se lie de façon non covalente par des liaisons électrostatiques et des forces
de Van der Waals. Sa limite de détection est de l’ordre de 100 ng quoiqu’elle puisse descendre jusqu’à
25 ng selon le protocole utilisé. Le nitrate d’argent quant à lui est plus sensible puisqu’il peut détecter
des quantités inférieures à 1 ng, toutefois il est peu reproductible et sa gamme dynamique est étroite.
Du fait de la complémentarité de leurs gammes dynamiques, nous avons utilisé en parallèle le Bleu de
Coomassie et le nitrate d’argent.
C.3.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
La spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption-Ionisation Time of
Flight) est basée sur une méthode d’ionisation par désorption-ionisation laser assistée par matrice
suivie d’une séparation des molécules ionisées en fonction de leur temps de vol dans un tube
maintenu sous vide. L’échantillon à analyser est co-cristallisé avec une matrice sur une cible
métallique et soumis à un rayon Laser par pulses. Les molécules de matrice, excitées par le Laser,
transfèrent de l’énergie à l’analyte qui va s’ioniser et passer en phase gazeuse. Les molécules ionisées
sont généralement monochargées par le transfert d’un proton de la matrice vers l’échantillon.
Les molécules protonées sont soumises à un champ électrique qui leur confère une énergie
cinétique. Elles sont séparées dans le tube de vol dans lequel le temps de parcours jusqu’au détecteur
sera proportionnel à leur rapport masse/charge. Dans la mesure où les ions des peptides sont
monochargés, le temps de vol est directement proportionnel à la masse de la molécule. L’analyseur
temps de vol (TOF) peut être utilisé en mode linéaire ou en mode réflectron selon l’utilisation que l’on
souhaite en faire. Le mode linéaire permet de mesurer des masses élevées (à l’échelle d’une protéine
entière) avec une faible résolution tandis que le mode réflectron permet de mesurer avec une
meilleure résolution des masses allant de 700 à 4500 Da. Le mode réflectron est un miroir
électrostatique qui impose un changement de trajectoire aux ions, accentuant ainsi les écarts de
temps de vol entre des peptides de masse proche. La Figure I-1 représente l’organisation de l’appareil
et la figure I-2 est une photo du Voyager-DETM STR disponible à l’IBBMC.
Les protéines que l’on souhaite identifier sont digérées par une protéase, souvent la trypsine,
qui donne naissance à un mélange de peptides propre à chaque protéine. Le spectre de masse
obtenu, appelé l’empreinte peptidique (PMF), est caractéristique de la protéine digérée et permet de
retrouver son identité.
53
Figure I-1 : Schéma de la structure d’un spectromètre de masse MALDI-TOF.
Figure I-11 : Photo du MALDI-TOF Voyager-DETM STR.
54
C.4.
Protocole expérimental
Compte tenu de la variabilité inhérente à la technique de l’électrophorèse 2D et de la quantité
limitée de protéines contenues dans un gyrus denté dorsal, nous avons choisi de réaliser des
réplications techniques à partir d’un mélange d’échantillons biologiques. De toute évidence, les
résultats qui découlent d’une telle expérience ne peuvent être considérés comme définitifs dans la
mesure où il est nécessaire de multiplier les échantillons biologiques. Toutefois, à travers cette
expérience préliminaire, nous avons effectué un certain nombre de mises au point permettant
d’acquérir une meilleure expérience ainsi qu’un regard critique sur la méthode afin d’optimiser les
choix expérimentaux qui en découleront.
55
SCHEMA EXPERIMENTAL
1) Stimulation à haute fréquence de la
voie perforante : induction de la LTP
2) Dissection puis homogénéisation des
gyrus dentés gauche (LTP) et droit
(contrôle interne) de l’hippocampe
pH 5
pI
pH 8
3) Séparation des protéines en fonction de
leur point isoélectrique puis de leur masse
Masse
-
réhydratation passive
coloration au Bleu de Coomassie
(1 mg / gel) ou au nitrate
d’argent (150 µg / gel)
3 réplicats techniques par groupe
4) Analyse des images de gels avec le logiciel
PDQuestTM (Bio-Rad)
-
Détection des spots
Correspondance entre les gels
Normalisation
Analyse statistique
5) Découpe et digestion trypsique
des spots d’intérêt
6) Acquisition et analyse de spectres de
masse
-
Acquisition de spectres par
spectrométrie de masse MALDITOF
Extraction d’une liste de masses
Interrogation de banques de
données
Identification des protéines par
empreinte peptidique
56
Partie I : Matériels et Méthodes
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Cette partie présente le principe des différentes techniques utilisées ainsi que les choix
méthodologiques que nous avons faits.
A.
Animaux
Conformément aux règles d’éthique, les conditions d’élevage et de manipulation des animaux
répondent aux normes françaises (87/848) et européennes (86/609/EEC) en vigueur. Tous les
efforts ont été mis en oeuvre afin de minimiser les souffrances des animaux et de limiter leur nombre
dans les expériences.
Des rats mâles Sprague-Dawley (Iffa Credo, France) pesant 250-350 g ont été utilisés. Ils ont
été élevés par deux dans l’animalerie du laboratoire NAMC à température et luminosité contrôlées
(alternance éclairage / obscurité toutes les 12h) avec un accès libre à l’eau et la nourriture. Un délai
minimum de 10 jours entre l’arrivée des animaux dans l’animalerie du laboratoire et les
expérimentations a systématiquement été respecté afin de laisser aux animaux le temps de s’adapter
à ce nouvel environnement.
B.
Induction de la LTP dans le gyrus denté chez le rat
La LTP est induite dans le gyrus denté chez le rat anesthésié par l’application d’une
stimulation à haute fréquence dans la voie perforante qui innerve le gyrus denté. Elle nécessite
l’implantation unilatérale d’une électrode de stimulation dans la voie perforante et d’une électrode
d’enregistrement dans le gyrus denté. L’induction de la LTP est contrôlée grâce à l’enregistrement du
potentiel post-synaptique excitateur (PPSE) des neurones du gyrus denté en réponse à la stimulation
du faisceau perforant.
B.1.
Chirurgie
Les animaux sont anesthésiés par injection intra péritonéale de pentobarbital (60 mg/kg) puis
placés dans un appareil stéréotaxique. Leur température corporelle est contrôlée tout au long de
l’expérimentation et maintenue grâce à un matelas thermostaté. Le haut du crâne est mis à nu par
une légère incision de la peau de façon à observer les sutures coronale, sagittale et lambdoïde du
crâne. Les intersection de ces sutures, Bregma (fontanelle antérieure) et Lambda (fontanelle
postérieure), servent de repère pour le positionnement des électrodes de stimulation et
d’enregistrement :
-
électrode de stimulation : Bregma – 4,2 mm ; suture sagitale – 2,5 mm.
-
électrode d’enregistrement : Lambda 0 mm ; suture sagitale – 4,4 mm. L’électrode de
stimulation doit se trouver au niveau de la bandelette angulaire de la voie perforante.
57
Deux ouvertures de 2 mm de diamètre environ sont creusées suivant ces coordonnées à
travers l’os pariétal gauche à l’aide d’une petite perceuse électrique.
B.2.
Electrophysiologie
B.2.a
Implantation des électrodes
L’électrode de stimulation, bipolaire concentrique, est constituée d’un tube d’acier inoxydable
(150 µm de diamètre) placé dans un microtube (300 µm). L’électrode d’enregistrement est composée
de deux fils de nichrome de 62 µm de diamètre (alliage de 65% de nickel, 20% de fer et 15% de
chrome) décalés de 300 µm à leur extrémité, entourés d’un tube d’acier inoxydable. Les deux
électrodes sont implantées simultanément, de façon progressive. Elles sont descendues par paliers de
quelques µm toutes les 5 min jusqu’à se trouver respectivement au niveau de la voie perforante
médiane et du gyrus denté dorsal (Figure I-3). La descente de l’électrode d’enregistrement est
contrôlée grâce au suivi de l’activité électrique spontanée des neurones (activité multi unitaire). En
effet, les neurones de la région CA1 de l’hippocampe située au dessus du gyrus denté, déchargent
avec une fréquence plus élevée que ceux des autres régions traversées. Ils servent donc de repère
pour estimer la profondeur du gyrus denté. L’ajustement de la position des deux électrodes se fait
ensuite conjointement jusqu’à l’obtention de la réponse maximale.
(A)
(B)
Hippocampe
Electrode d’enregistrement
Electrode de stimulation
CA1
CA3
DG
Voie Perforante
Figure I-3 : (A) Localisation de l’hippocampe dans le cerveau de rat. (B) Coupe transversale
d’hippocampe. L’électrode de stimulation est implantée dans la voie perforante médiane et l’électrode
d’enregistrement sous la couche granulaire du gyrus denté.
L’intensité de la réponse des neurones peut être évaluée selon différentes composantes des
PPSE évoqués (Figure I-4) :
-
La pente des PPSE traduit la sommation des PPSE unitaires générés par les neurones activés.
Elle donne un indice de l’efficacité de la transmission synaptique.
-
le « population spike » traduit la sommation de tous les potentiels d’action unitaires émis par
les neurones activés ; il donne un indice de l’excitabilité de la population des cellules granulaires du
gyrus denté.
58
population
spike
pente
Figure I-4 : Potentiel post-synaptique évoqué.
B.2.b
Induction de la LTP
Des stimulations à basse fréquence (100 µs, 0,033 Hz) sont délivrées dans la voie perforante
afin d’obtenir une ligne de base des PPSE stable pendant au moins 30 min. Pour chaque rat, l’intensité
de stimulation basale est choisie de façon à induire un PPSE dont l’amplitude est égale au tiers de
l’amplitude maximale. Les signaux sont amplifiés et filtrés (passe bande de 0,1 Hz à 3 kHz),
numérisés, visualisés sur un ordinateur et stockés. Les paramètres de stimulation sont contrôlés par le
logiciel Advance.
Le tetanus consiste en 6 répétitions à 2 min d’intervalle de 6 trains de pulses de 20 msec à
400 Hz, séparés de 10 sec (Davis et al. 2000a). L’intensité de stimulation est augmentée pendant le
tetanus de façon à recruter un maximum de fibres nerveuses. Les réponses évoquées par des
stimulations tests sont de nouveau enregistrées pendant une heure après le tetanus. Les données
enregistrées sont analysées par ANOVA.
A l’issue de l’enregistrement, les animaux sont recousus avec des agrafes puis replacés dans
l’animalerie dans une cage d’habitation.
B.3.
Dissection des tissus
Les animaux sont assommés et sacrifiés par décapitation 6 h ou 24 h après induction de la
LTP. L’hippocampe de chaque hémisphère est disséqué sur glace et les gyrus dentés dorsaux sont
isolés. Les tissus sont immédiatement congelés dans l’azote liquide. Pour chaque animal, le gyrus
denté de l’hémisphère droit sert de contrôle interne. Les tissus sont conservés à -80°C jusqu’à
utilisation pour l’électrophorèse bidimensionnelle.
C.
Electrophorèse bidimensionnelle
La technique d’électrophorèse 2D adaptée à la séparation de protéines a été développée par
O’Farrell (O'Farrell 1975). Les protéines sont séparées dans une première dimension en fonction de
leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique puis dans une deuxième dimension en fonction de
leur masse moléculaire par électrophorèse SDS-PAGE. Dans la mesure où la charge et la masse des
59
protéines ne sont pas corrélées, cette approche permet de séparer les protéines issues d’un mélange
biologique complexe avec une bonne résolution.
C.1.
Préparation des échantillons
La préparation de l’échantillon est une étape essentielle dans la mesure où elle conditionne la
bonne résolution du gel. Elle doit rompre les interactions covalentes et non covalentes entre les
protéines et/ou les autres constituants cellulaires (lipides, acides nucléiques), limiter le nombre de
molécules interférentes avec l’électrophorèse (sels, lipides, acides nucléiques) et protéger les
protéines de la dégradation par les protéases et ainsi conserver l’intégrité des protéines dans leur état
natif.
Les tampons classiquement utilisés pour solubiliser un mélange complexe de protéines ne
sont donc pas adaptés dans la mesure où ils introduisent des sels et des charges qui interfèrent avec
les protéines. Afin d’éviter l’introduction d’un trop grand nombre de charges extérieures à l’échantillon,
des agents dénaturants et des détergents non ioniques ou zwitterioniques (dont la charge globale est
nulle) peuvent être utilisés. Ils facilitent la solubilisation des protéines, inhibent leur agrégation et
limitent les interactions hydrophobes. Cependant, les protéines membranaires sont généralement trop
hydrophobes pour être solubilisées dans ces conditions. Il y a donc un compromis à trouver entre le
fait de solubiliser une très large gamme de protéines et le fait d’obtenir une bonne focalisation et donc
une bonne séparation des protéines. Il apparaît tout de même plus important de bien séparer un
nombre limité de protéines plutôt que de mal séparer un plus grand nombre de protéines.
Une option que nous n’avons pas évoquée ici consiste à extraire les protéines dans un premier
tampon qui ne répond pas aux contraintes liées à l’IEF puis à l’éliminer en faisant précipiter les
protéines avant de les reprendre dans le tampon de solubilisation adapté. Selon les contextes, ce type
d’étape préliminaire peut s’avérer incontournable. Il permet à la fois de purifier un échantillon dont la
composition originelle ne serait pas suffisamment compatible avec l’électrophorèse bidimensionnelle
ou de traiter les échantillons en amont de l’électrophorèse. Il est possible, par exemple, de fractionner
les protéines en fonction de leurs propriétés biologiques, physico-chimiques ou de leur compartiment
cellulaire. Cependant, en terme de qualité de séparation des protéines et de reproductibilité, il est
préférable d’éviter d’introduire des étapes supplémentaires dans la préparation de l’échantillon. Nous
avons donc choisi de solubiliser directement les protéines dans le tampon adapté à l’IEF.
C.1.a
Tampon de solubilisation
Le tampon de solubilisation contient 5 éléments essentiels :
Des agents chaotropes qui dénaturent et solubilisent les protéines : Urée, Thiourée (l’utilisation de
la thiourée augmente la solubilité des protéines)
Un détergent zwitterionique pour empêcher l’agrégation des protéines : CHAPS
Un agent réducteur qui réduit les ponts disulfures : DTT (dithiothreitol)
Des
inhibiteurs
de
protéases
couvrant
un large
panel
de
protéases :
AEBSF
(4-(2-
AminoEthyl)BenzeneSulfonyl Fluoride Hydrochloride), Antipaïne, Leupeptine, E-64
60
Des ampholytes qui améliorent la solubilité des protéines puis leur focalisation au cours de la
première dimension : biolytes couvrant la même gamme de pH que le strip utilisé pour la première
dimension.
La composition finale du tampon est la suivante : 7 M Urée, 2 M Thiourée, 20 mM DTT, 4 %
CHAPS, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL AEBSF, 50 µg/mL Antipaïne, 5 µg/mL Leupeptine, 5 µg/mL E-64,
0.2 % Biolytes.
L’échantillon est homogénéisé directement dans le tampon de solubilisation, sur la glace à
l’aide d’un potter électrique adapté spécifiquement aux tubes eppendorfs de 1,5 mL (MOTOR,
Cordless, SIGMA, Saint Louis, MO). Chaque gyrus denté de rat a été repris séparément. L’ensemble
des homogénats d’un même groupe a ensuite été rassemblé en mélange unique. Chaque mélange a
fait l’objet d’un dosage protéique avant d’être séparé par électrophorèse bidimensionnelle.
Il faut noter que dans la partie II de ce travail, pour l’étude des protéines phosphorylées au
cours de la phase précoce de la LTP, les échantillons n’ont pas été rassemblés comme c’est le cas ici.
Les protéines de chaque animal ont été séparées individuellement.
C.1.b
Dosage des protéines avec le kit 2D Quant
En raison des concentrations en urée, thiourée, biolytes et DTT, le tampon de solubilisation
décrit ci-dessus n’est pas compatible avec les dosages de protéines classiques, notamment avec le
dosage de Bradford. Le PlusOneTM 2-D Quant kit a été spécialement conçu par Amersham Biosciences
(GE Healthcare) pour pallier ce problème. Le principe de cette méthode de dosage consiste à
précipiter les protéines tout en maintenant les substances interférentes en solution. Les protéines sont
ensuite re-solubilisées dans une solution contenant du cuivre. Le dosage est basé sur l’interaction
spécifique des ions cuivre avec les protéines. Ce sont les ions cuivre libres qui sont mesurés par
colorimétrie. Le dosage est linéaire et permet de mesurer des concentrations de protéines comprises
entre 0 et 50 μg. Chaque échantillon a été dosé 3 fois, suivant le protocole conseillé par le fabriquant.
C.2.
Première dimension
La première dimension de l’électrophorèse 2D est basée sur la migration des protéines en
réponse à un champ électrique. Le support de la migration est un gel de polyacrylamide contenant un
gradient de pH. Le gradient est établi par un ensemble de petites molécules amphotères : les
ampholytes. L’ensemble des charges d’une protéine, qui constitue sa charge globale, va conditionner
la migration de la protéine à travers ce gradient de pH. Tant que la protéine est chargée positivement,
elle migre vers la cathode, tant que sa charge globale est négative, elle se rapproche de l’anode, et
quand elle se trouve dans la zone de pH correspondant à son point isoélectrique (pH auquel sa charge
globale est nulle) elle n’est plus soumise au champ électrique et se stabilise.
Les gels d’acrylamide contenant les ampholytes existent sous différentes formes.
Originellement, ils étaient coulés dans des tubes et soumis à une première étape de migration visant à
former le gradient de pH par la migration des ampholytes (O'Farrell 1975). Mais il existe maintenant
61
des gels précoulés commercialisés présentant un gradient de pH déjà fixé : les strips IPG (gradient de
pH immobilisé). Ils contiennent des molécules ampholytes capables de copolymériser avec
l’acrylamide, les immobilines. Les strips IPG présentent l’avantage d’être très reproductibles et simples
d’utilisation. La longueur des strips ainsi que la zone de pH couverte sont variables et permettent
d’étudier différents patterns de protéines à partir d’un même échantillon. Les gammes de pH peuvent
être larges (pH 3-10 par exemple) permettant de visualiser un très grand nombre de protéines ou plus
restreintes, jusqu’à une seule unité de pH afin d’optimiser la résolution dans une zone d’intérêt.
C.2.a
Réhydratation passive
Les strips IPG se présentent sous forme déshydratée et doivent être réhydratés avec le
tampon de solubilisation décrit ci-dessus. Les protéines peuvent être incorporées dans le gel dès cette
étape si le strip est réhydraté directement avec le mélange protéique solubilisé dans le tampon. Cette
méthode de réhydratation passive présente l’avantage d’être simple à réaliser et de permettre
l’incorporation d’un grand nombre de protéines dans le gel. La réhydratation est réalisée sur la nuit
afin de favoriser l’incorporation d’un maximum de protéines dans le strip, en particulier les protéines
de haut poids moléculaires qui ne pénètrent pas facilement dans le gel.
Un faible courant électrique peut être appliqué au strip pendant la phase de réhydratation afin
de favoriser encore la pénétration des protéines. Toutefois, nous n’avons pas utilisé ce protocole dans
le cadre de ce travail.
C.2.b
Incorporation par cupule
Le « cup-loading » est une méthode alternative d’incorporation des protéines dans les strips
IPG. Les strips sont préalablement réhydratés avec du tampon de solubilisation brut puis l’échantillon
est déposé dans une cupule placée en contact direct avec le gel d’acrylamide au moment de l’étape de
focalisation. Les protéines pénètrent dans le gel sous l’influence du courant électrique. Cette méthode
est souvent utilisée dans les zones de pH extrêmes dans la mesure où elle semble favoriser la
focalisation des protéines basiques en particulier (Barry et al. 2003).
C.2.c
Isoélectrofocalisation
L’isoélectrofocalisation, de même que la réhydratation, ont été effectuées avec le Protean IEF
Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Les paramètres de migration ont été choisis suivant les
recommandations du fabriquant. Nous utilisons des strips IPG de 17 cm de long, ce qui conditionne la
durée de la migration. L’appareil est thermostaté à 20°C tout au long de la focalisation qui consiste en
3 étapes successives :
- le voltage augmente progressivement jusqu’à 250 V pendant 15 min
- le plafond est déplacé à 10 000 V pendant 3 h
- la migration se poursuit à 10 000 V jusqu’à atteindre 60 000 VH
L’intensité du courant est limitée à 50 µA par gel afin d’éviter l’échauffement du gel et de
l’échantillon. Au cours de la focalisation, l’intensité diminue pour approcher généralement 30 µA par
62
gel en fin de migration. La baisse de l’intensité traduit une réduction du nombre de molécules ionisées
dans le gel et donc la progression de la focalisation.
L’appareil Protean IEF Cell peut accueillir jusqu’à 12 strips en parallèle mais l’expérience
acquise au laboratoire a montré une meilleure reproductibilité des gels lorsque les strips étaient
focalisés deux par deux. Nous avons donc réalisé les gels par 2 dans toutes les parties de ce travail.
C.3.
Deuxième dimension
Entre les deux étapes de migration, l’échantillon doit être soumis à un traitement. En effet, si
au cours de la première dimension les charges doivent être conservées, la deuxième dimension est
basée sur l’uniformisation des charges pour restreindre la séparation des protéines au critère de leur
masse. Toutes les protéines sont chargées négativement par un excès de SDS.
C.3.a
Réduction et alkylation des protéines
Deux étapes sont effectuées successivement, visant à réduire puis alkyler les ponts disulfures
des protéines tout en équilibrant les protéines dans le SDS. L’étape de réduction favorise la
dénaturation des protéines. Elle est rendue irréversible par l’alkylation des cystéines avec de
l’iodoacétamide qui bloque les thiols libres. Ces deux étapes sont réalisées par incubation du strip
pendant 15 min dans une solution de réduction (Urée 6 M ; SDS 2 % ; Tris (pH8,8) 375 mM ; Glycérol
20 % ; DTT 65 mM) suivi de 20 min dans une solution d’alkylation (Urée 6 M ; SDS 2 % ; Tris
(pH8,8) 375 mM ; Glycérol 20 % ; Iodoacetamide 135 mM ; Bleu de Bromophénol 0.004 %).
C.3.b
Migration des protéines sur gel SDS-PAGE
Les protéines sont transférées du strip vers un gel d’acrylamide à 12 %. Pour cela, le strip est
déposé au sommet du gel et scellé grâce à une fine couche d’agarose. La migration se déroule en
deux phases dans un tampon Tris-Glycine. La première phase, à faible voltage constant permet le
transfert progressif des protéines du strip dans l’autre gel. La migration se poursuit ensuite à courant
constant (30 mA par gel) jusqu’à ce que le front de migration ait atteint le bas du gel.
A l’issue de cette deuxième migration, les protéines sont séparées avec une très bonne
résolution sur une surface de 340 cm².
C.4.
Coloration
Les gels sont rapidement rincés dans de l’eau ultra pure avant d’être colorés. Deux types de
colorations ont été utilisés dans cette partie de la thèse. Elles ont chacune été réalisées manuellement
dans des boîtes individuelles.
C.4.a
Bleu de Coomassie
Ce colorant existe sous la forme de deux produits : le G250, autrement appelé colloïdal, et le
R250. Le Bleu Colloïdal est connu pour présenter une meilleure sensibilité que le R250 (Tannu and
Hemby 2006). Toutefois, l’expérience du laboratoire a permis de constater qu’une longue décoloration
63
du R250 dans l’eau ultra pure améliore également sa sensibilité. Pour cette raison et parce que son
utilisation est plus simple, toutes les expériences présentées dans cette partie ont été réalisées avec
du R250. Ce dernier se lie aux protéines par des liaisons électrostatiques et hydrophobes en milieu
acide. Il est donc utilisé directement dans une solution Ethanol/acide acétique qui fixe les protéines en
même temps que la coloration a lieu. L’excès de colorant est éliminé par des étapes successives de
décoloration dans une solution éthanol/acide acétique puis dans l’eau ultra pure.
C.4.b
Nitrate d’argent
Il existe de nombreuses variantes de protocoles pour cette coloration qui reste basée sur la
précipitation d’argent sous forme de métal. Nous avons utilisé un protocole décrit par Mortz et al. dont
les détails sont donnés en Annexe 1 (Mortz et al. 2001).
Après coloration, tous les gels sont scannés puis ils sont conservés sous forme déshydratée.
Analyse d’image
D.
Chaque gel a été scanné à l’aide d’un densitomètre GS800 (Bio-Rad, Hercules, CA) avec une
résolution de 63.5 µm et importé dans le logiciel PDQuest (version 7.2, Bio-Rad, Hercules, CA).
L’analyse et la comparaison de deux groupes de gels expérimentaux s’effectuent en plusieurs étapes
dont les grandes lignes sont les suivantes :
1- Définition de paramètres de détection des spots
2- Détection automatique des spots dans chaque gel
3- Regroupement des différents gels dans un fichier commun appelé MatchSet
4- Correspondance (Matching) automatique des spots dans les différents gels
5- Normalisation de la quantification basée sur l’ensemble des spots matchés.
6- Comparaison des groupes expérimentaux et analyse.
Les étapes de détection et de correspondance automatiques nécessitent un long travail de
vérification manuelle dans la mesure où elles introduisent des erreurs.
D.1.
Détection des spots
Les paramètres de détection (taille minimale et maximale des spots, sensibilité de détection,
nature du bruit de fond) sont ajustés pour chaque expérience mais tous les gels d’une série sont
systématiquement analysés selon des paramètres identiques. Sur la base de ces paramètres, les gels
sont filtrés afin de réduire le bruit de fond et les spots sont détectés automatiquement.
À l’issue de cette étape, les gels peuvent se présenter sous trois formes :
•
L’image scannée brute
•
Une image « filtrée » dans laquelle le bruit de fond est déduit de l’image d’origine
•
Une image « gaussienne », image fictive qui ne représente que les spots détectés sur le gel,
64
lissés sous forme de gaussienne.
Afin d’éviter d’éventuels biais de détection liés à l’élimination du bruit de fond, j’ai
systématiquement travaillé sur les images brutes. La détection automatique des spots introduit un
certain nombre d’erreurs : des taches ne correspondant pas à des spots peuvent être détectées, à
l’inverse certains spots existants ne le sont pas, ou la surface attribuée au spot peut ne pas
correspondre à sa forme réelle. En effet, à chaque spot détecté automatiquement est attribuée une
ellipse. Dans la mesure où l’intensité du spot est estimée sur la surface de l’ellipse, celle-ci doit être
représentative de la forme du spot. Or certains spots présentent des formes irrégulières qui
nécessitent une délimitation manuelle. Il est donc indispensable de contrôler dans les moindres détails
la détection des spots dans tous les gels.
D.2.
Correspondance des spots entre les gels
L’objectif de cette étape consiste à établir des liens entre les spots dans l’ensemble des gels.
Pour cela, il faut créer un fichier « MatchSet » qui rassemble tous les gels que l’on souhaite comparer.
Le MatchSet contient également un gel fictif supplémentaire, le gel « Master », correspondant à
l’image gaussienne d’un gel de la série considéré comme représentatif. Ce gel Master doit contenir
tous les spots détectés dans tous les gels. Il sert de référence pour établir la correspondance entre les
spots dans les différents gels. La correspondance des spots se fait automatiquement sur la base de
quelques spots désignés manuellement (Figure I-5). Elle doit cependant être validée et complétée afin
d’éliminer toutes les erreurs d’association possibles.
Spot reconnu
automatiquement par
rapport au gel Master
Spot de
référence
Spot non reconnu
automatiquement par
rapport au gel Master
Figure I-5 : Illustration de la correspondance automatique des spots par rapport au gel « Master ».
D.3.
Normalisation
A ce stade, le logiciel attribue à chaque spot une valeur quantitative absolue correspondant à
une densité optique. Dans le but de comparer l’intensité des spots dans les différents gels, il est
essentiel de procéder à une étape de normalisation qui attribue à chaque spot une valeur relative, ici
en partie par million (ppm). Deux méthodes de normalisation sont envisageables :
65

se baser sur l’intensité totale comprise dans les gels

ou considérer uniquement l’intensité cumulée dans les spots détectés.
Dans la mesure où les patterns de protéines sont très similaires dans tous les gels, la
normalisation a été effectuée par rapport à l’ensemble des spots détectés dans les gels. La présence
de taches très imposantes correspondant à l’actine et à la tubuline pourrait introduire un biais dans la
quantification si la normalisation était basée sur l’intensité totale du signal dans les gels (Figure I-6).
Toutefois, la méthode de normalisation basée sur les spots détectés peut également être biaisée si le
nombre de spots détectés dans tous les gels n’est pas le même. Il convient donc de s’assurer que tous
les gels présents dans un MatchSet contiennent le même nombre – ou un nombre très proche – de
spots détectés.
pI 3
pI 10
100 kDa
Tubuline
Actine
40 kDa
20 kDa
Figure I-6 : Electrophorèse bidimensionnelle de gyrus denté : les spots correspondant à l’actine et à
la tubuline sont très largement majoritaires.
D.4.
Analyse
Les groupes de gels contrôles ou traités sont définis. Le logiciel permet ensuite de comparer
les groupes entre eux par des analyses qualitatives (détecte les spots présents dans un seul des deux
groupes), quantitatives (comparaison de la moyenne des spots) ou statistiques. Nous avons utilisé les
analyses qualitatives et statistiques avec le test t de Student (p < 0,05). Le logiciel rapporte alors une
liste de protéines dont le niveau d’expression diffère entre les groupes.
66
E.
Digestion trypsique
Les spots d’intérêt sont découpés dans les gels puis réhydratés dans du bicarbonate
d’ammonium. Lorsqu’un spot est faiblement exprimé, il est découpé dans 2, 3 voire 4 gels et les
morceaux de gels sont traités ensemble afin d’augmenter la quantité de protéine disponible. Le
colorant est éliminé par bains successifs de bicarbonate d’ammonium et d’acétonitrile. Lorsque le spot
est totalement décoloré, il est incubé une dernière fois dans de l’acétonitrile avant d’être lyophilisé
sous vide pendant une vingtaine de minutes.
Les spots sont à nouveau réhydratés avec une solution de trypsine, à raison de 0,25 µg de
trypsine par spot ou groupe de spots. La quantité de trypsine est adaptée en fonction de l’intensité du
spot, notamment divisée par 2 dans le cas de protéines très faiblement exprimées. Cela permet de
conserver un rapport protéine / trypsine relativement constant. La digestion se fait sur la nuit à 37°C
sous agitation après ajout de bicarbonate d’ammonium. La trypsine clive les protéines au niveau des
résidus lysines et arginines. Le surnageant, qui contient les peptides, est récupéré puis additionné des
surnageants issus d’un bain d’acide trifluoroacétique (TFA, 1 %) et d’un bain d’acétonitrile/TFA
(60 %/1 %). Le volume des surnageants collectés est réduit à quelques microlitres au speed-vac puis
éventuellement complété de façon à obtenir un volume final de 5 µL.
Tout au long des étapes de découpage, décoloration et digestion des spots, il est nécessaire
de travailler avec du matériel très propre et d’éviter toute contamination avec de la kératine.
F.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
L’appareil que nous utilisons est un Voyager-DETM STR (Applied Biosystems), acquis en 1998 à
l’IBBMC. Il existe plusieurs types de matrices compatibles avec la méthode de désorption-ionisation
Laser. Ce sont de petites molécules qui doivent répondre à certains critères essentiels. Elles doivent
être capables de former des cristaux avec l’analyte ; elles ne doivent pas sublimer dans les conditions
de vide poussé qui règnent dans la source de l’appareil ; enfin elles doivent absorber fortement à la
longueur d’onde du laser, en l’occurrence, ici, un laser à azote qui émet dans l’ultraviolet à 337 nm.
Nous avons utilisé la matrice α-cyano-4-hydroxycinnamique qui est classiquement utilisée pour l’étude
de peptides. Pour chaque échantillon, 1 µL du mélange de peptide a été mélangé avec 1 µL d’une
solution saturée d’ α-cyano-4-hydroxycinnamique et 1 µL de ce mélange a été déposé sur la plaque.
L’analyseur peut également être réglé en mode positif ou négatif selon que l’on souhaite
accélérer des ions positifs ou négatifs respectivement. Compte tenu du fait que l’analyte est protoné
par la matrice, le mode positif est utilisé par défaut. Nous avons travaillé en mode positif avec le
réflectron. Chaque acquisition d’échantillon est calibrée en externe par rapport à un mélange de
peptides
de
masse
connue
(des-arg1-bradykinin :
904 Da ;
tyr8-susbtance
P:
1363 Da ;
neurotensine : 1672 Da ; ACTH (1-17) : 2093 Da ; ACTH (18-39) : 2465 Da ; ACTH (7-38) : 3659 Da).
67
G.
Identification des proteines par empreinte peptidique
L’identification de protéines à partir de spectres obtenus avec le MALDI-TOF se fait par
empreinte peptidique massique (PMF = peptide mass fingerprint). Cette méthode est basée sur la
comparaison de la liste des masses monoisotopiques obtenues expérimentalement avec des banques
de données de masses correspondant à la digestion théorique de protéines dont la séquence est
connue. En effet, dans la mesure où la trypsine clive spécifiquement les protéines après les résidus
arginines et lysines, il est possible de prédire in silico la liste de masses théoriques que donnerait la
digestion d’une protéine donnée par la trypsine. Cette méthode ne peut être utilisée qu’avec des
organismes dont le génome est séquencé et annoté. Ce n’est pas totalement le cas pour le rat,
toutefois la proximité du génome de la souris permet parfois d’identifier une protéine homologue chez
la souris à défaut de le faire chez le rat.
Plusieurs logiciels sont disponibles en ligne pour effectuer les recherches d’empreinte
peptidique. MASCOT (http://www.matrixscience.com/) et (feu) PeptIdent (http://us.expasy.org/tools/
peptident.html) ont été utilisés dans cette partie, en restreignant les banques de données
respectivement à NCBI et Swiss-Prot et TrEMBL chez le rat. La liste de masses soumise à la recherche
est épurée par l’élimination des masses correspondant à la matrice ou à l’autodigestion de la trypsine.
La carbamidométhylation des cystéines et la possible oxydation des méthionines sont spécifiées en
tant que modifications respectivement fixes et variables à prendre en compte. En outre, parce que la
digestion par la trypsine n’a pas un taux d’efficacité de 100 %, certains sites de coupure peuvent être
manqués. Nous tolérons donc une voire deux coupures manquantes lors de la recherche. Enfin, le
niveau de l’erreur maximale tolérée doit être précisé. Plus l’erreur tolérée est petite, plus la validité de
l’identification sera importante. Afin de définir le niveau de tolérance le plus bas possible, l’erreur
(donnée en ppm) est estimée dans chaque spectre sur la base des peptides correspondant à
l’autodigestion de la trypsine. Si elle est supérieure à 50 ppm, le spectre est calibré en interne avec les
peptides de la matrice et de la trypsine et l’erreur est estimée de nouveau (Figure I-7).
La recherche dans la banque aboutit à l’obtention d’une liste de protéines susceptibles de
correspondre à la protéine d’intérêt. Elles sont classées par ordre de probabilité. Lorsque la probabilité
(présentée sous la forme d’un score) est importante et que certains critères sont respectés,
l’identification est validée. Il s’agit, d’une part, que la masse et le pI du spot étudié soient proches des
masses et pI théoriques de la protéine proposée. D’autre part, les écarts de masse calculés pour
l’ensemble des pics attribués doivent être homogènes. Enfin, parmi les pics attribués doivent se
trouver les pics les plus abondants du spectre de masse. Il arrive que deux protéines voire trois soient
identifiées dans un même spot. Ceci reflète les limites de résolution des électrophorèses
bidimensionnelles qui ne permettent pas de séparer toutes les protéines en des spots distincts, même
dans des zones de pH retreintes comme la gamme 5-8 que nous avons utilisée.
68
Trypsine
Matrice
Figure I-7 : Spectre de masse MALDI-TOF acquis en mode positif avec réflectron, avec un voltage
d’accélération de 20 000 V. Plusieurs pics correspondant à la matrice ou à la trypsine peuvent servir
de référence interne pour calibrer le spectre.
Un autre critère permettant de donner de la valeur à une identification de protéine est le
nombre de peptides qui ont pu être attribués à cette protéine par rapport à l’ensemble des peptides
présents dans le spectre. La couverture de séquence est également un bon indice de validation.
Toutefois, le pourcentage de couverture de séquence peut être relativement faible en particulier
lorsqu’il s’agit de protéines de haut poids moléculaire (approchant les 100 kDa). Indépendamment du
fait que la trypsine peut ne pas digérer l’ensemble de la protéine, tous les peptides ne sont pas égaux
devant l’étape de désorption. Certains désorbent mal ou sont occultés par des peptides plus
abondants et n’apparaissent pas dans le spectre. Par exemple, les peptides se terminant par une
lysine désorbent moins bien que ceux qui se terminent par une arginine et sont en général de moins
grande intensité. Ceci explique que les spectres ne contiennent qu’une partie des pics attendus et que
la couverture de séquence de la protéine ne soit pas totale.
69
Partie I : Résultats
RÉSULTATS
A.
Préparation de l’échantillon
La première étape consiste à établir les conditions d’homogénéisation des tissus. La
composition du tampon de solubilisation des protéines est essentielle dans la mesure où elle
conditionne la qualité de l’extraction des protéines ainsi que la qualité de la migration au cours de
l’électrophorèse bidimensionnelle. Les différents constituants de ce tampon sont décrits dans la
Partie I – Matériels et Méthodes. Sa composition résulte d’un compromis entre le souhait de solubiliser
un maximum de protéines, y compris des protéines à caractère hydrophobe, et les contraintes liées à
l’utilisation de détergents non chargés.
Les premiers tests ont été effectués avec des tissus de cortex ou gyrus denté provenant de
rats naïfs. Afin d’éviter l’introduction de tout biais qualitatif ou quantitatif dans les échantillons, les
protéines ont été extraites à partir des tissus broyés directement dans le tampon de solubilisation,
sans traitement préalable.
B.
Mise au point des conditions de migration
Pour la mise au point des paramètres d’électrophorèse bidimensionnelle, tous les gels ont été
colorés au Bleu de Coomassie, coloration rapide, reproductible et facile à réaliser. En moyenne, nous
avons mesuré, grâce au dosage 2-D Quant (voir Partie I – Matériels et Méthodes), que la quantité de
protéines contenues dans un gyrus denté était de l’ordre de 1,5 mg. Nous avons donc utilisé le
contenu protéique d’un gyrus denté entier ou d’une quantité équivalente de cortex pour les premiers
essais.
Afin de déterminer la zone de pH la plus pertinente dans le cadre de notre étude, nous avons
comparé les patterns de protéines obtenus dans différentes gammes de pH par incorporation passive
des protéines d’un gyrus denté de rat dans les strips. En premier lieu, nous avons réalisé des gels 2D
couvrant la zone de pH 3-10. Pour cela, nous avons utilisé des strips dans lesquels la répartition des
ampholytes n’est pas linéaire car ils offrent une meilleure répartition des protéines. Comme le montre
la figure I-8, la grande majorité des protéines se trouve dans la partie centrale du gel, c'est-à-dire
entre pH 5 et 8 approximativement. Les protéines acides et basiques sont moins représentées et leur
focalisation est moins résolue. Dans l’optique d’une analyse d’image quantitative, qui nécessite une
délimitation précise des spots et une bonne reproductibilité entre les gels, les zones extrêmes de ces
gels risquent de ne pas être exploitables.
70
pH
3
4
5
6
7
8
9
10
100 kDa
60 kDa
40 kDa
20 kDa
Figure I-8 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au Bleu de Coomassie réalisée à partir de tissu
de cortex sur une gamme de pH 3-10 non linéaire.
Les protéines de pH extrême focalisent en règle générale moins bien que celles dont le pI se
rapproche du pH neutre. C’est effectivement ce que nous pouvons constater sur les gels couvrant la
gamme de pH 3-10 (Figure I-8) : les protéines basiques en particulier ont tendance à s’étirer, ce qui
entraîne des recouvrements entre protéines voisines. Il existe une méthode alternative d’incorporation
des protéines dans les gels 2D qui permet d’améliorer, au moins partiellement, la focalisation des
protéines de pH extrême, en particulier les protéines basiques. Cette méthode consiste à incorporer
directement les protéines dans le strip au moment de l’électrofocalisation en les déposant dans une
cupule qui se trouve en contact direct avec le gel d’acrylamide. Au préalable, le strip doit être
réhydraté avec du tampon vierge. La cupule ne peut contenir qu’un volume restreint d’échantillon et
nécessite souvent l’utilisation d’un échantillon plus concentré que dans le cas de la réhydratation
passive. Ainsi, il peut arriver qu’une partie des protéines précipitent au niveau de la zone de contact
avec le gel, toutefois, une très large majorité des protéines qui sont déposées dans la cupule sont
71
incorporées dans le gel, contrairement à la méthode de réhydratation passive. La quantité de
protéines déposée peut donc être moins importante que celle utilisée pour la réhydratation passive.
Nous avons testé deux quantités de protéines : 600 et 800 µg. Conformément à la méthode classique,
la cupule a été déposée du côté de l’anode (figure I-9).
(A)
pH 3
pH 10
(B)
pH 3
pH 10
100
40
20
kDa
(C)
pH 7
pH 10
(D)
pH 7
pH 10
100
40
20
kDa
Figure I-9 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au Bleu de Coomassie : dépôt d’un échantillon
de cortex dans une cupule déposée du côté de l’anode avec 600 µg (A) ou 800 µg (B) de protéines
déposées. Les strips utilisés couvrent la gamme de pH 3-10 non linéaire. Les gels (C) et (D) couvrent
la gamme de pH 7-10. Dans le premier, les protéines ont été incorporées par réhydratation passive,
tandis que dans le deuxième, elles l’ont été par l’intermédiaire d’une cupule.
72
(A) pH 4
(B) pH 5
pH 7
pH 8
100
40
20
kDa
Figure I-10 : Electrophorèse bidimensionnelle réalisée à partir de gyrus denté couvrant la gamme de
pH 4-7 (A) ou 5-8 (B) (coloration au Bleu de Coomassie).
(A)
pH 5
(B)
pH 8
pH 5
pH 8
100
40
20
kDa
Figure I-11 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au nitrate d’argent réalisée à partir de
150 µg (A) ou 300 µg (B) de protéines de gyrus denté.
73
Partie I :Résultats
Comme le montre la figure I-9 C et D, la méthode d’incorporation des protéines par cupule
améliore la focalisation des protéines basiques. Dans la gamme de pH 3-10, les meilleurs résultats
sont obtenus avec un dépôt de 800 µg. Cependant, malgré l’utilisation de cupules, la focalisation des
protéines de pH extrêmes est restée insatisfaisante en vue d’une analyse quantitative qui nécessite
une délimitation claire des spots. Devant ce constat et compte tenu du fait que la majorité des
protéines contenues dans les gels se trouvent dans la zone centrale, nous avons décidé d’utiliser la
réhydratation passive sur une gamme de pH plus étroite.
Le fait de réduire la zone de pH permet d’étirer la zone où se trouve la majorité des protéines,
offrant ainsi une meilleure résolution pour ces protéines. Parmi les gammes de pH proposées par BioRad, nous avons testé les gammes de pH 4-7 et 5-8. Comme en témoigne la figure I-10, la gamme de
pH 5-8 semble être la mieux adaptée. En effet, les spots d’actine et de tubuline perturbent clairement
la migration des protéines se trouvant dans la zone de pH 4-5 tandis que, du côté basique, les spots
focalisent très bien jusqu’au pH 8. La zone de pH 5-8 est donc la plus pertinente dans le cadre de
l’étude des protéines du gyrus denté de l’hippocampe.
C.
Mise au point des conditions de coloration
Deux types de coloration ont été réalisés : Bleu de Coomassie (protocole classique avec du
R250) et nitrate d’argent (protocole de Vorum). Pour chacun, la quantité optimale de protéines à
utiliser pour la réhydratation des strips a été évaluée. Pour le Bleu de Coomassie, les patterns obtenus
avec 1.5, 1.0 et 0.8 mg ont été comparés. Ils nous ont amenés à opter pour 1 mg de protéines par
strip. Dans le cas du nitrate d’argent, nous avons testé des quantités de 300 et 150 µg (Figure I-11),
faisant état d’une meilleure résolution avec 150 µg de protéines.
Comme nous l’avons déjà évoqué, toutes les protéines ne sont pas incorporées dans le strip.
La quantité de protéines restante a donc été évaluée par dosage 2D-Quant afin d’estimer la quantité
de protéines qui a réellement pénétré dans les strips. Le tableau I-1 montre les résultats obtenus sur
un groupe de 12 gels. Le taux d’incorporation des protéines s’échelonne entre 54 % et 72 %. Cela
signifie qu’une part importante des protéines n’a pas pénétré dans le gel. Elle représente
probablement majoritairement des protéines de haut poids moléculaire qui pénètrent moins facilement
dans le strip que les petites protéines.
73
(A)
Pré tetanus
% de variation de la pente
des PPSE / ligne de base
(B)
Post tetanus
100
80
60
40
20
0
-20
-45
-30
-15
0
15
30
45
60
Temps (min)
Figure I-12 : (A) Représentation de la forme des réponses post-synaptiques avant et après tetanus.
(B) Pourcentage d’augmentation de la pente des PPSE après induction de la LTP dans le gyrus denté.
Les cercles représentent la moyenne de la pente des PPSE et les barres l’erreur standard pour
l’ensemble des animaux du groupe expérimental. Une ligne de base de 30 min est enregistrée avant
l’induction du tetanus (triangle noir) puis la réponse postsynaptique est suivie pendant 1 h.
69
Vol restant (µL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
95
100
85
60
60
125
90
100
80
50
50
50
Dosage
(µg pour 5 µL)
24,1
23,0
22,5
35,8
31,0
16,7
22,9
23,1
26,6
32,3
31,1
27,7
Concentration
(µg/µL)
4,8
4,6
4,5
7,2
6,2
3,3
4,6
4,6
5,3
6,5
6,2
5,5
Qté protéines
restantes (µg)
457
460
382
429
372
417
412
461
426
323
311
277
Qté protéines
incorporées (µg)
543
540
618
571
628
583
588
539
574
677
689
723
Taux (%)
d'incorporation
54
54
62
57
63
58
59
54
57
68
69
72
Tableau I-1 : Taux d’incorporation des protéines dans les strips par réhydratation passive pour 1 mg
de protéines.
Le taux d’incorporation moyen est de 61 %, avec un écart type de 6.2. Il ne faut donc pas
négliger la variabilité inhérente à cette méthode. C’est pourquoi il sera nécessaire de réaliser une
étape de normalisation de la quantification des spots au cours de l’analyse d’images.
D.
Induction de la LTP dans le gyrus denté chez le rat
La LTP est induite in vivo, chez le rat anesthésié, dans le gyrus denté gauche par stimulation
de la voie perforante (voir Partie I - Matériels et Méthodes). Sur la figure I-12, on observe une
augmentation durable de l’efficacité de la transmission synaptique (représentée par une augmentation
stable de la pente des EPSP), traduisant bien l’induction de la LTP dans les neurones granulaires du
gyrus denté. L’augmentation moyenne de la pente est de 53.21 % ± 7.93 (n=12) par rapport à la
ligne de base. Les données précédentes du laboratoire ont montré que le tetanus utilisé ici induit une
potentialisation durable permettant à la phase tardive de la LTP d’être induite.
E.
Analyse de l’expression des protéines colorées au bleu de Coomassie 6h et
24h après induction de la LTP dans le gyrus denté
Les expériences présentées ici ont été réalisées dans le but de déterminer si la démarche
expérimentale choisie était adaptée à une analyse différentielle des protéines du gyrus denté après
induction de la LTP. Les gyrus dentés dorsaux droit et gauche de chaque animal ont été
homogénéisés puis rassemblés par groupe biologique de façon à obtenir respectivement un
échantillon contrôle et un échantillon LTP pour chaque délai. Compte tenu de la quantité de protéines
contenue dans un mélange de 6 gyrus dentés dorsaux, un maximum de trois gels 2D colorés au Bleu
74
de Coomassie a pu être réalisé pour chaque échantillon biologique. Les images scannées de ces gels
ont ensuite été analysées avec le logiciel PDQuest.
E.1.
Définition de critères pour l’analyse d’images avec le logiciel PDQuest
Après les étapes automatiques de filtrage du bruit de fond et d’identification des spots, les
gels contrôles et LTP correspondant à un même délai ont été regroupés dans un unique fichier
« Matchset ». De cette façon, ils ont pu être retravaillés en parallèle, dans un souci d’homogénéité.
Chaque spot détecté a été contrôlé individuellement afin de vérifier sa bonne délimitation ainsi que sa
régularité dans les différents gels. Il arrive que des points denses de coloration se trouvent au milieu
d’un spot et biaisent la quantification du signal. Dans ce cas, le spot est exclu de l’analyse
quantitative. Les spots dont les contours ont dû être redéfinis manuellement ont également été l’objet
d’une attention particulière. Dans la mesure où un spot donné se présente généralement dans la
même disposition dans tous les gels, les contours définis manuellement ont été copiés à l’identique
pour les spots concernés dans tous les autres gels. De cette façon, la surface utilisée pour la
quantification d’un spot donné est la même dans tous les gels, évitant ainsi l’introduction d’un biais lié
au manipulateur.
A l’issue de ces validation manuelles, seuls les spots présents et bien identifiés dans tous les
gels d’un même groupe biologique ont été considérés pour l’analyse quantitative. Dans la mesure où
les patterns d’expression sont identiques à l’œil nu entre les deux groupes expérimentaux, le même
nombre de spots a pu été détecté dans tous les gels, à savoir 204 dans le cas de cette analyse. Afin
de pallier les écarts de quantités totales de protéines incorporées dans les différents gels, l’intensité
totale du signal des 204 spots a été utilisée pour la normalisation. Ainsi, la quantité attribuée à chaque
spot est exprimée en partie par million par rapport à l’intensité totale contenue dans les spots
détectés. Enfin, les groupes expérimentaux sont définis et comparés par une analyse statistique
réalisée directement par l’intermédiaire du logiciel PDQuest utilisant le test t de Student (p < 0,05).
E.2.
Analyse du groupe LTP 6h
La comparaison des groupes contrôle et LTP 6h a porté sur 326 spots présents dans tous les
gels 2D. Elle n’a révélé qu’un seul spot dont le niveau d’expression variait de façon significative entre
les deux groupes selon un test t de Student (p < 0,05). Son expression est augmentée d’un facteur 2
dans les gels du groupe LTP (Figure I-13).
75
Gel Master
1- Contrôle
2- Contrôle
4- LTP 6 h
5- LTP 6 h
6- LTP 6 h
3- Contrôle
1 2 3 4 5 6
Figure I-13 : Expression différentielle du spot 5706 entre les groupes contrôles (3 gels du haut) et
LTP 6h (3 gels du bas). L’intensité du spot est plus abondante dans les gels du groupe LTP, comme le
montre le graphe présenté à droite. Le gel se trouvant en haut à gauche de la fenêtre correspond au
gel de référence sous forme gaussienne. Il faut noter que les numéros qui sont attribués aux spots
par le logiciel PDQuest ne sont pas corrélés avec le nombre de spots présents dans le gel mais
dépendent de leurs positions dans l’image.
Le spot 5706 a été découpé puis digéré par la trypsine afin d’identifier la protéine
correspondante par empreinte peptidique (voir Partie I - Matériels et Méthodes). La protéine a été
identifiée comme étant de l’albumine. L’albumine est une protéine du sang, elle est abondante dans le
cerveau compte tenu de la densité du réseau d’irrigation. La quantité de sang prélevée au moment de
la dissection des tissus biologiques ne peut pas être contrôlée. Il est donc possible qu’un ou plusieurs
échantillons contiennent une quantité plus importante de protéines du sang, introduisant ainsi un
biais. Nous ne sommes donc pas en mesure d’interpréter la variation de quantité d’albumine entre
gels contrôles et LTP 6 h.
76
E.3.
Analyse du groupe LTP 24h
L’analyse des images de gels pour les groupes contrôles et LTP 24 h a donné une liste de 4
protéines dont le niveau d’expression est significativement différent après induction de la LTP dans le
gyrus denté (test t de Student, p < 0.05). La figure I-14 indique leur position dans les gels ainsi que
les graphiques correspondant à leur niveau d’expression dans tous les gels. Leur taux d’expression est
également indiqué dans le Tableau I-2. Chacun de ces spots a été découpé et les protéines digérées
par la trypsine. Les spectres acquis par MALDI-TOF sont présentés dans la figure I-15.
Figure I-14 : Résultats de l’analyse statistique des gels contrôles et LTP 24 h. Pour chaque spot
exprimé de façon différentielle, un graphique est représenté dans lequel les trois premières barres
correspondent à l’intensité du spot dans les 3 gels contrôles et les trois suivantes son intensité dans
les gels LTP.
77
Spot 4713
Spot 8302
Spot 2308
Spot 8187
Figure I-15 : Spectres de masse MALDI-TOF correspondant aux spots dont l’intensité est altérée
24 h après induction de la LTP dans le gyrus denté de l’hippocampe de rat.
78
Contrôle
SSP
LTP 24h
Sens de
variation
Taux de
variation
Moyenne
CV
Moyenne
CV
2308
1149,6
16,1%
528,3
23,1%
2,18
4713
1212,7
8,1%
1933,5
9,4%
1,59
8147
45802,4
7,5%
35099,1
9,5%
1,30
8302
1691,6
5,4%
1240,8
16,5%
1,36
Tableau I-2 : Taux de variation des 4 spots exprimés de façon différentielle entre les groupes
contrôles et LTP 24 h.
Les 4 spots ont été identifiés par empreinte peptidique, sur le même principe que la protéine
identifiée pour le délai de 6 h. Les identifications ont été validées par les deux logiciels MASCOT et
PeptIdent, en utilisant la banque du rat dans NCBI ou SwissProt et TrEMBL. Les résultats sont
présentés dans le tableau I-3.
SSP
Nom de la Protéine
N°
d'accession
Masse
pI
Score Mascot
2308
Tubuline alpha
P68370
49937
4,96
77
10/21
31%
4713
Albumine
P02770
65904
5,8
257
24/31
49%
8147
Phosphoglycérate mutase,
type B
P25113
28942
7,07
131
12/21
48%
8302
Erk2
P27703
41275
6,5
262
19/21
40%
Nonmbre de Couverture
peptides
de séquence
Tableau I-3 : Identification des protéines dont le niveau d’expression varie 24 h après induction de
la LTP dans le gyrus denté.
Comme cela a été dit dans le paragraphe précédent, nous ne pouvons pas conclure au sujet
de l’augmentation d’albumine dans le groupe LTP. La tubuline alpha est le constituant majeur des
microtubules, constituants très dynamiques du cytosquelette qui participent notamment au transport
des vésicules d’endocytose et d’exocytose. Toutefois, la localisation du spot 2308 dans les gels 2D
n’est pas cohérente avec la masse théorique de la tubuline alpha, ce qui suggère que la protéine a été
protéolysée. Nous ne pouvons donc pas conclure sur ce résultat. La phosphoglycérate mutase est
impliquée dans la glycolyse et donc le métabolisme énergétique du glucose. ERK2 (Extracellular
signal-regulated kinase 2) est une protéine kinase dont l’implication dans la LTP a déjà été montrée
(McGahon et al. 1999; Davis et al. 2000a). L’implication potentielle de ces deux dernières protéines au
cours de la LTP sera discutée dans la Partie I – Discussion.
Sur l’ensemble des deux délais étudiés, le nombre de variations observées est très faible. Cela
pourrait être dû à la faible sensibilité du colorant utilisé. En effet, les protéines que l’on cherche à
observer ne sont certainement pas les plus abondantes et sont peut-être trop faiblement exprimées
79
pour être détectées au Bleu de Coomassie. Afin de pallier ce problème de sensibilité, nous avons
entrepris de refaire une analyse différentielle en colorant les gels au nitrate d’argent.
F.
Analyse de l’expression des protéines colorées au nitrate d’argent 6h après
induction de la LTP dans le gyrus denté
Les électrophorèses ont été réalisées à partir des mêmes échantillons biologiques, à raison de
150 µg de protéines par gel. Bien que plus sensible que le Bleu de Commassie (< 1 ng au lieu de 50100 ng), la coloration au nitrate d’argent est moins linéaire et sature rapidement. Grâce à la possibilité
qu’offre le logiciel PDQuest de visualiser les spots en 3 dimensions, les spots dont la coloration était
saturée ont pu être détectés et éliminés de l’analyse (Figure I-16).
Figure I-16 : Visualisation en 3 dimensions des spots situés dans l’encart rouge. Les 3 spots les plus
abondants apparaissent comme tronqués à partir d’un certain seuil d’intensité, illustrant la saturation
de la coloration des protéines abondantes au nitrate d’argent.
Après élimination des spots saturés et de ceux qui étaient contaminés par des points denses,
378 spots ont été considérés pour l’analyse comparative entre les deux groupes. L’analyse statistique
80
(test t, p < 0,05) a révélé l’expression différentielle de 6 spots (Figure I-17) dont le taux de variation
est présenté dans le tableau I-4.
Figure I-17 : Résultats de l’analyse statistique des gels contrôles et LTP 6 h colorés au nitrate
d’argent. Dans les graphiques, les trois premières barres correspondent à l’intensité du spot dans les 3
gels contrôles et les trois suivantes son intensité dans les gels LTP.
SSP
Contrôle
LTP 6h
Sens de
variation
Taux de
variation
Moyenne
CV
Moyenne
CV
4426
2190,0
3,6%
1754,6
6,5%
1,25
4630
3701,8
3,1%
3333,5
0,7%
1,11
5021
4860,2
10,2%
6827,2
6,9%
1,40
7739
3534,4
5,6%
4062,0
4,2%
1,15
8115
189,5
71,7%
728,5
20,3%
3,84
8402
4230,5
6,6%
5615,0
7,2%
1,33
Tableau I-4 : Résultats de l’analyse statistique par test t des groupes de gels contrôles et LTP 6h
colorés au nitrate d’argent.
81
(A)
(B)
Figure I-18 : Niveau d’expression du spot 8115 dans les gels contrôles (A) et LTP 24 h (B).
Compte tenu de la mauvaise linéarité de la coloration à l’Argent, les variations inférieures à un
facteur de 1,5 n’ont pas été prises en compte. Un seul spot varie avec un taux de variation supérieur à
1,5. Il s’agit du spot 8115 représenté dans la figure I-18. Nous l’avons identifié en tant que sous-unité
alpha de l’ATP synthase (P15999). L’ATP synthase est une enzyme mitochondriale qui utilise le
gradient de protons maintenu de part et d’autre de la membrane interne des mitochondries pour
former des molécules d’ATP. Toutefois, la masse et le pI théoriques de cette protéine (55 kDa, 8,28)
ne correspondent pas à sa localisation dans les gels. En outre, sur l’ensemble des peptides attribués,
tous sauf un se trouvent dans la moitié C-terminale de la séquence. Il est dont probable qu’il s’agisse
d’un produit de protéolyse. Nous ne pouvons de nouveau pas conclure sur ce résultat.
82
Partie I : Discussion
DISCUSSION
Nous avons présenté, ici, une approche expérimentale possible pour étudier les variations
d’expression des protéines 6 h et 24 h après induction de la LTP dans le gyrus denté. Les variations
que nous avons observées dans les différentes analyses vont à la fois dans le sens d’une
augmentation et d’une réduction. Cette bipolarité est cohérente, d’une part, avec le fait que le niveau
d’expression d’une protéine est le résultat d’un équilibre permanent entre synthèse et dégradation, et
d’autre part, avec les observations de Fazeli et al qui ont également étudié, par électrophorèse
bidimensionnelle, les variations d’expression des protéines induites par la LTP dans le gyrus denté in
vivo (Fazeli et al. 1993). A l’époque, ils n’ont pas pu identifier les protéines responsables des
variations qu’ils observaient. Avec notre approche expérimentale, l’identification des protéines
régulées par la LTP a été rendue possible par l’utilisation de la spectrométrie de masse.
Parmi les protéines identifiées, la phosphoglycérate mutase catalyse l’interconversion
entre le 3-phosphoglycérate et le 2-phosphoglycérate au cours de la glycolyse. La réduction de son
expression 24 h après l’induction de la LTP pourrait signifier une diminution de la dégradation du
glucose à cette étape de la LTP. Celle-ci pourrait intervenir en compensation après une période
d’augmentation de la production énergétique (Wieraszko 1982).
Une réduction de l’expression de la protéine kinase ERK2 a également été observée à 24 h.
Le niveau d’expression de la protéine n’a pas été étudié à ce délai d’après la littérature. En revanche,
une augmentation de son ARN messager a été observée à ce même délai après induction de la LTP
dans le gyrus denté chez le rat éveillé (Thomas et al. 1994b). Ces deux données apparaissent
contradictoires ; toutefois il est admis aujourd’hui que l’expression des ARNm n’est pas toujours
corrélée à celle des protéines. En outre, ERK2 est impliquée dans le maintien de la LTP (Davis et al.
2000a). Si la protéine kinase est connue pour être activée dans les premières heures de la LTP (Ying
et al. 2002), elle pourrait l’être aussi à des délais plus tardifs. ERK1 et 2 sont effectivement activés par
vagues dans la région CA1 suite à un apprentissage (premier pic à 15 min, retour au niveau basal à
3 h, suivi d’une nouvelle augmentation significative d’activité à 9 h) (Trifilieff et al. 2007). Il est
possible qu’après plusieurs vagues d’activation la kinase soit dégradée et qu’une néosynthèse soit
induite afin de rétablir le niveau d’expression de la protéine.
Parmi les protéines dont l’expression a déjà été étudiée à ces délais, seule la syntaxine 1B
aurait pu être identifiée dans les gels compte tenu de la gamme de pH que nous avons utilisée. Les
protéines kinases CaMKIIα et PKCγ, dont les ARNm sont régulés à 24 h (Thomas et al. 1994b; Thomas
et al. 1996) se trouvent également dans la gamme de notre étude. Le fait que l’on n’ait pas retrouvé
la PKCγ n’est pas surprenant car, en dehors de la CaMKIIα dont le niveau d’expression est
particulièrement élevé dans l’hippocampe, les protéines de signalisation sont souvent très faiblement
exprimées. En revanche, la syntaxine 1B et la CaMKIIα auraient pu être détectées dans notre analyse.
83
Il est possible que les spots correspondant à ces protéines n’aient pas été pris en compte dans
l’analyse parce que leur focalisation ou leur détection dans les gels était mauvaise. Cependant, comme
nous l’avons évoqué précédemment, l’ensemble des résultats présentés ici doit être considéré avec
beaucoup de précaution compte tenu du fait que les gyrus dentés ont été regroupés en un unique
échantillon biologique pour chaque condition. Le fait que nous ne retrouvions pas les variations
attendues nous engage à être d’autant plus prudents sur leur interprétation. Une réplication
biologique serait indispensable pour les valider. Ainsi, devant le faible nombre de variations observées
dans ces conditions expérimentales, nous avons préféré tirer les enseignements de ces premières
expériences afin de redéfinir une nouvelle méthodologie plutôt que de répliquer les expériences dans
les mêmes conditions. Plusieurs choix expérimentaux peuvent expliquer ce manque de résultats et
méritent d’être discutés.
A.
Discussion sur les choix expérimentaux
Le fait d’avoir mélangé les échantillons biologiques au départ est une cause possible de
nivellement des protéines. En effet, compte tenu des variabilités individuelles, tous les animaux
n’expriment pas les mêmes protéines dans les mêmes proportions. En outre, leur niveau de régulation
est probablement au moins autant sujet à des variabilités entre les individus. Il suffit donc qu’un ou
deux animaux dans un groupe (6 animaux par groupe) se soient distingués des autres pour que les
variations soient diluées dans le mélange. Dans l’optique de renouveler ces expériences, il sera
préférable de comparer des réplications biologiques plutôt que techniques. Si des réplications
techniques doivent être faites, mieux vaut les faire à partir des extraits protéiques d’un même animal,
quand cela est possible. En outre, il serait préférable de travailler sur un plus grand nombre de gels
pour donner plus de poids à l’analyse statistique des données. Puisque la quantité de protéines
contenues dans un gyrus denté dorsal n’est pas suffisante pour réaliser un gel 2D coloré au Bleu de
Coomassie par animal, nous avons travaillé sur le gyrus denté entier dans les autres parties de ce
projet.
Le choix du gyrus denté controlatéral comme contrôle pour chaque animal peut également
expliquer une réduction des différences entre les échantillons contrôles et LTP. Si le fait de choisir des
contrôles internes pour chaque animal peut avoir un intérêt justement pour pallier les problèmes de
variabilité individuelle, dans le cas présent, cela peut introduire un biais. En effet, quelques travaux
ont montré qu’après induction de la LTP dans l’un des deux gyrus dentés par stimulation de la voie
perforante ipsilatérale, des modifications d’expression géniques ou protéiques pouvaient avoir lieu
dans le gyrus denté controlatéral, celui même qui n’a pas reçu de stimulation. Une augmentation de
l’ARN messager de la synapsine 1 à 5 h et de la syntaxine 1B à 2 h et 5 h ont été observées (Hicks et
al. 1997) et la sous-unité mGlu5 des récepteurs métabotropiques du glutamate est surexprimée dans
84
le gyrus denté controlatéral à 24 h (Manahan-Vaughan et al. 2003). Bien que les modifications ne
soient pas de la même ampleur dans les deux hémisphères, elles peuvent réduire la perception
relative des modifications protéiques induites par la LTP. Toutefois, ce phénomène reste marginal
dans la mesure où plusieurs travaux ont montré des variations d’expression génique spécifiquement
localisées dans le gyrus denté ipsilatéral, sans qu’aucune variation ne soit détectée dans le gyrus
controlatéral (Cole et al. 1989; Salin et al. 2002). Afin d’éviter tout risque de biais, le choix d’animaux
ayant subi un pseudotetanus est donc probablement un meilleur contrôle.
La question du choix des délais est difficile à évaluer. En effet, si les données sont limitées en
terme d’expressions protéiques aux délais de 6 h et 24 h, c’est parce qu’ils ont été très peu étudiés.
Compte tenu du caractère transitoire de la régulation de l’expression des protéines, il est difficile
d’évaluer le nombre de protéines dont le niveau pourrait être régulé à ces délais. Au niveau génique, il
existe différentes vagues temporelles qui ne présentent pas de synchronisation apparente. Les
variations protéiques sont certainement soumises aux mêmes règles.
Les variations d’expressions géniques induites par la LTP dans le gyrus denté ne sont pas
homogènes dans toutes les régions du gyrus denté. Selon les transcrits étudiés (Zif286, Homer ou
syntaxin1B), l’expression peut être majoritaire dans les extrémités, rostrales ou caudales, ou dans la
région centrale du gyrus (Salin et al. 2002). Cette hétérogénéité spatiale observée pour quelques
ARNm suggère que l’expression des protéines dans le gyrus denté après induction de la LTP pourrait
également être distribuée de façon hétérogène. Dans ce cas, le fait de travailler sur un homogénat de
gyrus denté, même s’il est restreint au gyrus denté dorsal, amoindrit certainement l’intensité des
variations que l’on peut observer. Si, comme c’est le cas pour les transcrits, toutes les protéines ne
sont pas régulées à un même délai dans les mêmes zones, ce qui parait plus que probable, il sera
difficile de définir des zones pertinentes pour une étude de type protéomique. Puisque dans un
homogénat les variations sont nivelées, des variations de faible amplitude pourraient correspondre à
des régulations locales plus conséquentes. Des variations de faible niveau peuvent donc être
considérées avec intérêt.
B.
Discussion sur le choix des techniques utilisées
Nous avons précédemment évoqué les limites de l’électrophorèse 2D. Les protéines
membranaires ou de hautes masses moléculaires notamment ne pénètrent pas dans les gels et les
protéines de pH extrêmes ont été exclues. Cependant, nous n’avons pas exploité toutes les ressources
de cette technique. Le fait d’avoir utilisé les colorations au Bleu de Coomassie et au nitrate d’argent a
probablement réduit nos chances de détecter beaucoup de variations. Bien que ces deux colorations
présentent des gammes dynamiques complémentaires, elles ne sont pas les plus appropriées pour
85
réaliser une étude quantitative fine du fait de leur faible linéarité (Tannu and Hemby 2006). Elles sont
toujours largement utilisées dans ce type d’études mais elles le sont généralement dans des contextes
biologiques qui génèrent des variations d’expression d’une plus grande amplitude que celles
auxquelles on peut s’attendre avec un phénomène fin comme la LTP, en particulier dans sa phase
tardive. Depuis quelques années, plusieurs types de colorations fluorescentes se sont développées,
telles que le Sypro Ruby®, le Deep PurpleTM et la méthode DIGE (Differential In Gel Electrphoresis).
Toutes ces méthodes sont basées sur un marquage fluorescent des protéines. Elles offrent
ainsi à la fois une bonne sensibilité (de l’ordre du ng) et des gammes de linéarité de 3 à 4 ordres de
grandeurs. En outre, elles sont compatibles avec la spectrométrie de masse, notamment MALDI-TOF,
permettant l’identification des protéines. Par rapport au Sypro Ruby®, le Deep PurpleTM présente
plusieurs avantages : sa gamme de linéarité couvre 4 ordres de grandeur au lieu de 3, il produit très
peu de points de précipitation qui sont des obstacles pour l’analyse quantitative et il offre un meilleur
recouvrement de séquence par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Mackintosh et al. 2003).
Quant à la DIGE, et plus spécifiquement la méthode limitante (Unlu et al. 1997), elle paraît
être la plus intéressante dans le cadre de notre étude. Cette méthode est basée sur le marquage
différentiel par des molécules fluorescentes (cyanines Cy3 et Cy5) des échantillons à comparer en
amont de la séparation par électrophorèse bidimensionnelle (Figure I-19).
Figure I-19 : Représentation schématique du principe de la DIGE
Outre une bonne sensibilité (1 ng) et une gamme de linéarité qui s’étend sur 3 ordres de
grandeur, la DIGE permet de s’affranchir de la variabilité inter-gels. Les échantillons à comparer
migrent dans le même gel en parallèle. La méthode limitante permet une quantification fiable grâce à
la présence d’un standard interne constitué d’un mélange équimolaire des deux échantillons à
86
comparer marqué avec une troisième cyanine (Cy2). La mesure séquentielle de la fluorescence des
trois cyanines dans chaque gel nécessite l’utilisation d’un scanner adapté, comme le Typhoon®
(Amersham Biosciences, GE Healthcare). L’analyse des données se fait grâce à un logiciel spécialisé,
DeCyderTM, en deux étapes principales : 1- la normalisation des échantillons biologiques dans chaque
gel par rapport au standard interne ; 2- l’analyse des variations biologiques par comparaison des
différents gels entre eux.
Depuis qu’elles ont commencé à se développer, les méthodes utilisant la fluorescence ont
connu un essor remarquable. La DIGE, en particulier, est l’outil le plus rigoureux pour des analyses
quantitatives par électrophorèse bidimensionnelle puisqu’elle permet de s’affranchir de la variabilité
technique et que l’analyse se base sur la comparaison des échantillons par rapport à un standard
interne. A titre indicatif, le nombre de publications utilisant cette technique au cours des 10 dernières
années est représenté dans le graphique ci-dessous (Figure I-20). Si elle n’avait quasiment pas été
utilisée au moment de la mise en place de notre projet (2002-2003), elle connaît depuis une
croissance exponentielle.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Figure I-20 : Evolution du nombre de citations annuelles de la méthode DIGE depuis son
développement en 1997.
Des méthodes hors-gel permettent également de réaliser des analyses quantitatives
différentielles. Pour certaines d’entre elles comme l’AQUA (pour Absolute QUAntification) (Kirkpatrick
et al. 2005) ou les puces à protéines (Petricoin et al. 2002), il est nécessaire de se poser une question
précise, voire de se limiter à l’étude d’une protéine d’intérêt dans le cas de l’AQUA. Elles ne peuvent
donc pas être utilisées dans une recherche à large échelle sans protéines candidates a priori. Dans
notre cas, des méthodes comme l’ICATTM, l’H218O ou l’iTRAQTM sont plus adaptées (Schnolzer et al.
1996; Gygi et al. 1999; Ross et al. 2004).
La méthode de l’H218O est basée sur le marquage isotopique différentiel des peptides des
deux échantillons à comparer. L’échantillon contrôle et l’échantillon traité sont digérés séparément par
87
la trypsine, en présence d’H216O et d’H218O respectivement. Les isotopes d’oxygène sont incorporés au
niveau du groupement carboxyle en C-terminal des peptides, introduisant une différence de masse de
4 Da, à raison de 2 atomes d’oxygène incorporé par peptide. Les échantillons sont ensuite rassemblés
et leur quantité relative est évaluée par LC-MS. Enfin, les peptides sont identifiés par spectrométrie de
masse en tandem.
Les méthode ICATTM et iTRAQTM quant à elles sont basées sur l’ajout d’un « tag » isotopique
sur les cystéines des protéines dans le cas de l’ICATTM ou en N-terminal sur les peptides trypsiques
pour l’iTRAQTM. Différents états isotopiques stables de ces « tags » sont utilisés pour marquer
spécifiquement les échantillons à comparer. La quantification relative de ces « tags » permet de
comparer l’abondance de chacune des protéines marquées dans les différents échantillons (4 au
maximum).
Parmi toutes ces méthodes, l’iTRAQTM est celle qui serait la mieux adaptée pour une étude
comme la nôtre. En effet, la méthode de l’H218O n’est pas bien appropriée pour l’étude des peptides
de grande masse dans la mesure où elle n’introduit qu’une différence de masse de 4 Da. Le massif
isotopique des peptides dont la masse est supérieure à 3000 Da est susceptible de chevaucher celui
de leurs homologues porteurs d’18O. La méthode ICATTM quant à elle restreint aussi le nombre de
peptides analysables parce qu’elle cible les cystéines. L’iTRAQTM a une portée bien plus large puisque
les réactifs se lient sur les lysines et le N-terminal de chaque peptide. Wu et al. ont également montré
que cette technique était plus sensible que l’ICATTM (Wu et al. 2006b).
Aussi performantes que soient l’iTRAQTM ou la DIGE, aucune méthode de protéomique ne
peut prétendre à l’exhaustivité compte tenu de la trop grande diversité des protéines en terme de
taille, d’hydrophobicité, de charge et de niveau d’expression. A l’heure actuelle, les méthodes les plus
performantes ont une gamme dynamique de 4 ordres de grandeur. Pour pouvoir étudier l’ensemble
des protéines d’un génome, il faudrait pouvoir atteindre des gammes de 6 ordres de grandeur. Le
principal défi des méthodes de séparation et d’identification des protéines consiste à repousser
toujours plus loin les limites de sensibilité et de débit tout en conservant une bonne résolution.
Si toutes les protéines ne peuvent pas être étudiées de façon exhaustive simultanément, la
possibilité de fractionner les échantillons peut repousser les limites de détection. Le fractionnement
cellulaire permet d’une part de réduire le nombre de protéines à étudier, ce qui facilite leur séparation
et leur identification, et d’autre part d’enrichir en protéines peu abondantes.
Dans le cadre de l’étude de la plasticité synaptique, le fractionnement des régions synaptiques
pourrait apporter des informations très précieuses sur les mécanismes moléculaires qui régissent les
modifications synaptiques. Cependant, la reproductibilité du fractionnement d’un échantillon à l’autre
est difficile à contrôler. En outre, ce type d’approche peut aboutir à des quantités très faibles de
protéines, en particulier si l’on souhaite travailler sur une petite région du cerveau comme c’est le cas
du gyrus denté. La grande majorité des études réalisées sur des extraits protéiques synaptiques sont
effectuées à partir de cerveaux entiers. Toutefois, le développement de la DIGE, et notamment de la
88
méthode de saturation (liaison des cyanines sur les cystéines au lieu des lysines), permet de comparer
de très faibles quantités de protéines. Une étude récente a utilisé cette démarche pour étudier les
régulations protéiques spécifiques des régions somatiques et dendritiques dans la région CA1 suite à
un séjour en milieu enrichi : les régions somatiques et dendritiques de la région CA1 ont été
microdisséquées à partir de coupes d’hippocampe puis analysées par la DIGE (McNair et al. 2007).
Cette étude a montré que les protéines n’étaient pas régulées de la même façon dans ces deux
compartiments cellulaires. Cette observation suggère une explication supplémentaire du faible nombre
de variations que nous avons observées. Certaines régulations d’expression protéiques peuvent être
très localisées dans les cellules. La régionalisation peut se trouver aussi bien à l’échelle cellulaire en
fonction des types cellulaires dans lesquels sont exprimées les protéines (cellule neuronale, cellule
gliale, cellule endothéliale) qu’à l’échelle des compartiments intracellulaires. Compte tenu de cette
variabilité, le fait de travailler sur un extrait total des protéines du gyrus denté dilue certainement les
variations d’expression locales.
La combinaison d’une étape de fractionnement cellulaire et de la DIGE apparaît attrayante. Il
ne faut cependant pas perdre de vue que si l’on travaille sur des extraits de protéines synaptiques, un
grand nombre des protéines d’intérêt risque d’être très hydrophobe. Une méthode de séparation par
électrophorèse bidimensionnelle ne serait donc pas la mieux adaptée. Dans ce cas, la technique de
l’iTRAQTM pourrait être un meilleur choix.
En conclusion, si cette approche expérimentale est réitérée, il faudra
•
séparer les protéines de chaque individu indépendamment
•
réaliser des groupes expérimentaux d’au moins 6 animaux
•
utiliser une coloration fluorescente afin d’assurer une bonne sensibilité ainsi qu’une bonne
gamme de linéarité pour la quantification
•
une approche par MS/MS telle que l’iTRAQTM serait intéressante aussi. D’autant plus que les
méthodes de la DIGE et iTRAQTM sont complémentaires. Il y a peu de recouvrement des
protéines caractérisées par chacune des deux méthodes (Wu et al. 2006b).
Ces méthodes n’ont pas pu être envisagées pendant la période de ma thèse faute de temps.
En effet, d’autres approches ont été développées en parallèle selon les objectifs que nous avions fixés.
Ces approches, qui ont également nécessité de longues périodes de mise en œuvre, ont apporté des
résultats intéressants que nous avons exploités au maximum. Dans l’intervalle, la méthode de la DIGE
a été mise au point au laboratoire de Chimie des Protéines sur d’autres projets, offrant la possibilité
d’entreprendre au jour d’aujourd’hui une analyse protéomique quantitative de la LTP par la DIGE.
89
Partie II :
Etude de la Régulation des Phosphoprotéines au Cours
de la Phase Précoce de la LTP dans le Gyrus Denté chez
le Rat, In Vivo
90
Partie II : Introduction
Dans
cette
partie,
nous
avons
concentré
notre
attention
sur
la
régulation
des
phosphoprotéines au cours de la LTP par l’étude des variations du niveau de phosphorylation des
protéines suite à l’induction de la LTP. Dans la mesure où nous travaillons chez le rat in vivo,
l’utilisation du
32
P n’est pas envisageable dans notre cas. Le développement récent par Molecular
Probes Inc. du colorant fluorescent Pro-Q® Diamond (Schulenberg et al. 2003), spécifique des
phosphoprotéines a rendu possible cette étude.
Après avoir adapté au laboratoire le protocole d’utilisation du Pro-Q® Diamond (voir
Annexe 2), nous avons effectué une cartographie partielle du phosphoprotéome du gyrus denté de rat
(Annexe 3) afin de situer globalement les catégories de phosphoprotéines auxquelles nous avions
accès avec cette approche. Ensuite, la régulation des phosphoprotéines a été étudiée par analyse
différentielle à différents délais suivant l’induction de la LTP : 0 min, 15 min et 90 min. Sachant que le
protocole d’induction de la LTP dure une dizaine de minutes, le délai de 0 min n’est pas ce que l’on
pourrait classiquement appeler un Temps 0. A ce délai, l’expression de la LTP a déjà commencé.
Plusieurs protéines phosphorylées ont été étudiées à 0 ou 15 min comme la CaMKIIα et sa cible le
récepteur AMPA (Barria et al. 1997), les facteurs d’initiation ou d’élongation de la traduction eIF4E et
eEF2 (Kanhema et al. 2006) ou les MAPK-ERK (Davis et al. 2000a). En revanche, le délai de 90 min
n’a fait l’objet d’aucune étude encore.
Par rapport à la méthodologie présentée dans la partie précédente, deux éléments importants
ont été modifiés. D’une part, nous avons travaillé sur le gyrus denté entier, ce qui nous a permis de
réaliser un gel 2D par animal. Nous n’avons donc pas mélangé les échantillons biologiques. D’autre
part, nous avons utilisé comme contrôle le gyrus denté d’animaux ayant subi un pseudotetanus (les
trains de stimulation sont remplacés par des pulses simples) qui n’induit pas de LTP. Le traitement de
ces animaux est strictement identique à celui des animaux LTP (anesthésie, chirurgie, implantation
des électrodes, stimulation à basse fréquence), à l’exception du tetanus. Ils constituent donc de
meilleurs contrôles que le gyrus denté controlatéral des animaux LTP. Comme dans la partie
précédente, nous avons travaillé sur la zone de pH 5-8, ce qui limite les risques éventuels d’un
marquage aspécifique des protéines acides par le Pro-Q® Diamond.
Compte tenu des trois délais que nous avons étudiés et du grand nombre de protéines
solubles phosphorylées auxquelles nous avons accès, notre approche nous a permis d’identifier une
quinzaine de protéines dont le niveau de phosphorylation variait suite à l’induction de la LTP, dont les
deux tiers n’avaient pas encore été associés avec la LTP. Les résultats sont présentés sous forme
d’article dans les pages qui suivent. Les perspectives de ce travail, quant à elles, seront discutées dans
le chapitre Conclusion et Perspectives.
91
Partie II : Introduction
Large scale study of phosphoproteins involved in long-term potentiation in
the dentate gyrus in vivo
Solenne CHARDONNET1, 2, Pierre LE MARECHAL2, Hélène CHEVAL1, Jean-Pierre LE CAER3, Paulette
DECOTTIGNIES2, Serge LAROCHE1, Sabrina DAVIS1
1
NAMC, UMR 8620, CNRS, Univ Paris-Sud, 91405 Orsay, France
2
IBBMC, UMR 8619, CNRS Univ Paris-Sud, 91405 Orsay, France
3
A.
ICSN, UPR2301, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette, France
Introduction
Long term potentiation (LTP) is an activity-dependent, persistent form of synaptic plasticity
believed to play a central role in the laying down of memory (Bliss and Collingridge 1993). The
molecular mechanisms underlying the establishment and maintenance of LTP are the subject of
intense investigation. Key mechanisms involve the activation of membrane receptors and of several
signalling cascades leading to post-translational modifications and genomic responses implicated in
the stabilisation of long-term changes in synaptic function. Phosphorylation events are critical for LTP
induction and the transition from short-term to long-term potentiation (Soderling and Derkach 2000;
Ying et al. 2002). Many proteins such as membrane receptor subunits and channels, proteins involved
in synaptic endocytosis/exocytosis, signalling proteins or certain trancription factors undergo
phosphorylation or dephosphorylation following LTP induction (Nayak et al. 1996; Barria et al. 1997;
Blitzer et al. 1998; Fukunaga et al. 2000; Bozon et al. 2003b). To date, in search for post-translational
modifications of proteins that could be involved in LTP, studies generally have focused on LTP induced
in the CA1 area of the hippocampus and have used a protein candidate strategy to investigate
changes in the phosphorylation of specific protein members belonging to canonical signalling
cascades. Here, we used a large-scale phosphoproteomic strategy to examine a large number of
phosphoproteins following the induction of LTP in the rat dentate gyrus in vivo. A proteomic study was
thus conducted using 2D-gel electrophoresis stained with Pro-Q® Diamond, a fluorescent stain specific
for phosphoproteins, and mass spectrometry was used for protein identification. With these methods,
quantitative analysis of protein phosphorylation state was performed in the rat dentate gyrus
immediately, 15 and 90 minutes after the induction of LTP by high-frequency stimulation of the
perforant path in vivo. This first temporal and large scale analysis of phosphoproteins associated with
dentate gyrus LTP allowed us to identify new sets of proteins with increased or reduced
phosphorylation state at different delays following LTP induction and that are likely to be involved in
the molecular mechanisms underlying LTP. These proteins belong to different functional categories,
including proteins involved in exo- and endocytosis, metabolism, cell signalling, protein synthesis, and
chaperone, anchoring and cytoskeletal proteins.
92
Partie II : Materials and Methods
B.
Materials and methods
B.1.
Electrophysiology
Male Sprague Dawley rats (Iffa Credo, France) weighting 250-300 g were used (n=64). They
were housed in a temperature and light-controlled colony room (12 hours light/dark cycle) and had ad
libitum access to food and water. Rats were anesthetized with urethane (1.5 mg/kg), placed in a
stereotaxic frame, and maintained at a constant body temperature of 37°C. Unilateral implantation of
electrodes were performed using standard stereotaxic procedures (Laroche et al. 1989) in order to
induce LTP in the dendate gyrus by stimulating the perforant path. Recording electrodes were lowered
into the dentate gyrus (bregma -4.2 mm, 2.5 mm from midline) under electrophysiological control.
Stimulating electrodes were implanted in the angular bundle of the perforant path (bregma -8.0 mm,
4.4 mm from midline) to evoke a positive-going response in the hilus of the dentate gyrus. Low
frequency test pulses (100 µs, 0.033 Hz) were delivered to the perforant path throughout the entire
experiment except when a tetanus or a pseudotetanus was delivered. After the response in the
dentate gyrus had stabilised, a 30-min baseline period was recorded, followed by delivery of a tetanus
or a pseudotetanus. Tetanic stimulation consisted of six trains of pulses (400 Hz, 20 ms) delivered
every 10 s and repeated six times at 2-min intervals. Pseudotetanus followed the same pattern with
single pulses instead of trains of pulses. The stimulation intensity was increased during tetanus or
pseudotetanus to ensure maximal recruitment of fibres. The slope of the excitatory post-synaptic
potential (EPSP) and amplitude of the population spike were measured as described previously
(Laroche et al. 1989). Independent groups of animals were stimulated at the different time points for
2D gel electrophoresis and western blotting experiments. Experimental procedures were conducted in
accordance with the recommendations of the EU directive (86/609/EEC) and the French National
Committee (87/848). All efforts were made to minimise animal suffering and to use only the number
of animals necessary to produce reliable scientific data.
B.2.
Tissue preparation
Rats were killed by decapitation at specified times after receiving a tetanus or a
pseudotetanus. The dentate gyrus of the hippocampus from the hemisphere that received stimulation
was dissected, immediately frozen in liquid nitrogen and kept at -80°C or later use. For 2D gel
electrophoresis, tissues were homogenised in rehydration buffer: Urea (7 M), Thiourea (2 M), DTT
(20 mM), CHAPS (4 %), EDTA (1 mM), AEBSF (0.5 mg/mL), Antipain (50 µg/mL), Leupeptin
(5 µg/mL), E-64 (5 µg/mL), Na3VO4 (1 mM), Biolytes pH 3-10 (0.2 %, Bio-Rad, Hercules, CA). The
homogenates were incubated at 30°C for 30 min then centrifugated at 14 000 g for 15 min. Protein
contents of homogenates were quantified using Amersham 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences - GE
Healthcare). For western blot experiments, tissues were homogenised in lysis buffer: Tris/HCl pH 7.4
(10 mM), NaCl (150 mM), Triton X-100 (1 %), EDTA (1 mM), Na3VO4 (1 mM), NaF (10 mM), DTT
(20 mM), and 1 tablet of complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim,
93
Germany) for 10 mL. Samples were incubated on ice for 20 min and centrifugated at 14 000 g for
another 20 min. Protein contents were quantified using the Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules,
CA).
B.3.
Two-dimensional electrophoresis
IPG strips (17 cm, pH 3-10 non linear or pH 5-8, Bio-Rad) were passively rehydrated with
1 mg of proteins solubilised in 500 µL of rehydration buffer for 15h at 20°C. Isoelectric focusing was
carried out in a Protean Bio-Rad IEF cell at 250 V for 15 min, followed by a rapid increase to 10 000 V
for 3h and 10 000 V for 60 000 VH at 20°C with a maximum current setting at 50 µA/strip. The IPG
strips were kept at – 20°C overnight. Before running the second dimension, the strips were
equilibrated with a reduction solution (375 mM Tris pH 8.8, 6 M urea, 2 % w/v SDS, 20 % v/v
glycerol, 65 mM DTT) for 15 min, then with an alkylation solution (identical to the reduction solution
except DTT was replaced with 135 mM iodoacetamide) for 20 min. The strips were sealed with 1 %
agarose in running buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1 % w/v SDS) on top of an SDS
polyacrylamide gel (12 % acrylamide). The second dimension was run in Bio-Rad 2-D PAGE tanks at
25 V for 1 h, then 30 mA/gel for 5 h to 5 h 30.
B.4.
Gel staining
Phosphoproteins were stained with Pro-Q® Diamond (Invitrogen, Molecular Probes) prior to
Coomassie blue staining. At the end of the second dimension, gels were incubated in a fixation
solution (50 % methanol, 10 % acetic acid) for 30 min and overnight. The gels were washed three
times for 10 min in water and stained with Pro-Q® Diamond for 90 min in the dark. All following steps
were performed in the dark. Gels were then destained for 30 min three times in 50 mM sodium
acetate pH 4.0, 20 % acetonitrile and washed in water twice for 5 min. The fluorescent image was
scanned using a FXTM Pro Plus multi-imaging system with the green Laser (332 nm) and a 605DF50
emission filter (Bio-Rad, Hercules, CA). For Coomassie blue staining, gels were stained with 0.2 % w/v
Coomassie blue in 45 % ethanol and 9.5 % acetic acid for 45 min and destained with 40 % ethanol,
10 % acetic acid or water. Images were scanned on a GS800 densitometer, Bio-Rad.
B.5.
Image analysis
®
Pro-Q
Diamond images were analysed using the software PDQuest 7.2 (Bio-Rad, Hercules,
CA). Gels from a same group of experiment were pooled in a MatchSet file. The numbers of 2D gels
included in the image analysis are the following: n=6 for control 0 min, n=5 for LTP 0 min, n=5 for
control 15 min, n=5 for LTP 15 min, n=4 for control 90 min and n=4 for LTP 90 min. Spot detection
was performed in each gel and all patterns from the same group of experiment were matched
together. Statistical analyses were run using the PDQuest software (p < 0.05, using the Student ttest).
94
B.6.
In-gel digestion and MALDI-TOF Mass spectrometry
Spots of interest were excised manually, destained and vacuum dried as described
(Shevchenko et al. 1996). Tryptic digestion was performed overnight at 37°C in 50 mM NH4HCO3 with
250 ng of trypsin. Supernatants were removed and peptides were extracted with 1 % TFA then with
60 % acetonitrile containing 1 % v/v TFA. The combined extracts were dried under vacuum and resuspended in 5 µL of acetonitrile/TFA (60/1 v/v). One µL of tryptic samples was mixed with 1 µL of
saturated solution of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 50 % acetonitrile, 0.3 % trifluoroacetic acid,
and 1.5 µL of this premix was then deposited onto the sample plate and allowed to dry at room
temperature. Spectra were acquired on a Voyager DE-STR MALDI-TOF mass spectrometer (Perseptive
Biosystem) equipped with a 337 nm nitrogen laser. All spectra were acquired in positive-ion reflector
mode with delayed extraction, using six peptides with known mass as close external calibration
standards.
Proteins
were
(http://www.matrixscience.com/)
identified
and
Aldente
using
the
search
programs
(http://www.expasy.org/tools/aldente/)
Mascot
reducing
respectively the NCBI and UniProtKB/Swiss-Prot databases to the ratus species. Two missed cleavage
sites, oxidation of methionine and modification of cysteines by iodoacetamide were considered in
searches and the mass accuracy was limited to 50 ppm.
B.7.
NanoLC-MS/MS and Data analysis
The digested peptide mixtures were characterized by online nanoLC and electrospray tandem
mass spectrometry. The analyses of peptides were performed on a U3000 Dionex nanoflow system
connected to a LTQ Orbitrap mass spectrometer equipped with a nanoelectrospray source (ThermoFischer, Bremen, Germany).
Chromatographic separation took place in a C18 pepmap 100 column (75 µm ID 15 cm
length, 5 µm,100 Α Dionex). The peptides mixtures were injected on pre-concentration column with a
flow rate of 20µl/min of water TFA 0.1 %. After three minutes of wash with the same solvent, the
peptides were eluted and separated on the analytical column with a flow of 200 nl/min and a gradient
from 2 % to 60 % MeCN in 0.1 % formic acid in 30 min. The mass spectrometer was operated in the
data dependent mode to automatically switch between orbitrap MS and MS2 in the linear trap. Survey
full scan MS spectra from 500 to 2000 Da were acquired in the orbitrap with resolution R=60,000 at
m/z 400, after accumulation of 500,000 charges on the linear ion trap. The most intense ions (up to
six, depending on signal intensity) were sequentially isolated for fragmentation, in the linear ion trap
using CID at a target value of 100,000 charges. The resulting fragments were recorded in the linear
trap.
Proteins identifications were performed using high accuracy MS data and MSMS Data using
Sequest (Thermo-Fischer). The mass accuracy for MS Data was set to 5ppm and 1uma for MSMS
Data. Data mining was done in human Uniprot database.
95
Partie II : Results
B.8.
Western blotting
Protein homogenates were run on 10 % acrylamide 1D SDS-PAGE. Gels were run in
Tris/glycine buffer at 120 V for 20 min then 180 V until the migration “front” reached the bottom of
the gel. The proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane (Hybond-C Extra, Amersham
Biosciences, Piscataway NJ) at 100 V for 1 h. Odyssey blocking buffer diluted in TBS (50/50 v/v) was
used to block the membranes either for 1 h RT or 1 night at 8°C. Primary antibodies were applied for
1 h RT or 1 night at 8°C followed by secondary antibodies for 1 h RT. The primary antibodies for
dynamin1 (1/2000), dynamin1 phospho-Ser774 (1/200), dynamin1 phospho-Ser778 (1/100), CaMKIIα
(1/8000), CaMKIIα phosphor-Thr285 (1/200) and CaMKIIα phosphor-Thr305 (1/250) were purchased
from Abcam (Cambridge, UK) while ERK1-2 (1/1000) and phosphoERK1-2 (1/100) were purchased
from Cell Signaling (Danvers, MA). Secondary antibodies consisted of anti-mouse Alexa Fluor® 680
conjugated, anti-rabbit IRDye® 680 conjugated, anti-rabbit IRDye® 800 conjugated and anti-sheep
IRDye® 800 conjugated purchased from Rockland (Gilbertsville, PA). The fluorescent signal was
scanned using the Odyssey infrared imaging system (Li-Cor, Lincoln, NE) at 685 and 785 nm
excitation wavelengths simultaneously. The emission wavelengths are 710 nm for IRDye® 680 and
806 nm for IRDye® 800. Image analysis was performed with the Odyssey software. Each sample was
loaded 4 times on different blots and the mean value of these 4 replicates was calculated for each
animal. The statistic analysis was conducted with a Student t test on the individual animal’s averaged
values: LTP 0 min (n=6) compared with pseudotetanus 0 min (n=5); LTP 15 min (n=6) compared
with pseudotetanus 15 min (n=6); LTP 90 min (n=6) compared with pseudotetanus 90 min (n=6).
96
Partie II : Results
C.
Results
C.1.
LTP alters the phosphorylation state of a variety of proteins
LTP was induced in vivo in the dentate gyrus of anaesthetised rats using a protocol of
repeated high frequency stimulation (HFS) of the perforant path that was previously shown to induce
LTP lasting several days in awake animals (Laroche et al. 1989). Because LTP is known to rely on
phosphorylation events (Malenka et al. 1989; Klann et al. 1991; Kelly and Lynch 2000), some of which
can be extremely rapid (Roberson and Sweatt 1996; Davis et al. 2000a), we examined modifications
of the phosphorylation state of proteins immediately after the 10-min long tetanus (LTP 0 min) and at
later time points : 15 min and 90 min after LTP induction. As expected, animals receiving HFS
exhibited LTP (Fig. II-1). The animals receiving HFS for 2D gels experiments exhibited an increase in
EPSP slope of 40.5 % at 15 min and 42.3 % at 90 min. No potentiation at any time point was
observed in animals that received a pseudotetanus.
% change in EPSP
slope from baseline
80
60
LTP
40
20
0
Pseudotetanus
-20
-60
-30
0
30
60
90
Time (min)
Figure II-1: Induction of LTP in the dentate gyrus. High frequency stimulation (black triangle) of the
perforant path induced stable LTP (filled circles) whereas pseudotetanus (empty circles) had no effect.
Proteins from the dentate gyrus of each individual animal in the control and LTP groups were
separated on 2D gel eletrophoresis and stained with Pro-Q® Diamond, a fluorescent dye specific for
phosphoproteins (Fig. II-2). Pro-Q® Diamond stains all serine, threonin and tyrosine phosphorylated
proteins with a high sensitivity and a large linear range (Steinberg et al. 2003). Comparison of the
group of gels corresponding to LTP 0 min with the corresponding pseudotetanus control group
revealed 18 variations in phosphoproteins associated with LTP. Five of them showed an increased
phosphorylation while 13 spots were indicative of dephosphorylation. At 15 min, 8 spots exhibited an
altered phosphorylation state, 4 showing an increase in phosphorylation and 4 showing a reduction in
phosphorylation. At 90 min, 9 spots were differentially expressed, 8 of which towards a higher level of
phosphorylation. A majority of these proteins could be identified by mass spectrometry; they are
referenced in Table II-1.
97
(A)
pH5
pH8
(B)
pH5
pH8
100
40
20
kDa
Figure II-2: 2-D gel electrophoresis from rat dentate gyrus stained with (A) Pro-Q® Diamond and (B) Coomassie Blue. The spots which phosphorylation
state is altered with LTP are numbered from 1 to 33.
98
Table II-1: Summary of mass spectrometry analysis of proteins which phosphorylation state differs after LTP.
1
2
3
4
5
Phosphorylation
Variation
- 36%
- 68%
- 49%
- 48%
- 23%
Delay
(min)
0
0
0
0
0
6
+ 84%
0
8
9
10
11
12
13
14
15
16
- 39%
+ 57%
- 56%
+ 35%
- 48%
- 39%
+ 82%
- 55%
- 42%
- 52%
- 54%
0
90
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
appears
0
18
+ 21%
0
19
+ 48%
15
20
+ 172%
15
21
22
23
25
+ 107%
- 29%
- 52%
- 37%
+ 59%
- 20%
15
15
15
15
90
15
26
+ 41%
15
27
28
29
30
31
32
33
+ 40%
- 37%
+ 35%
+ 32%
+ 75%
+ 49%
+ 63%
90
90
90
90
90
90
90
Nb
7
24
Mascot
Peptide Nb Coverage
score
Protein Identification
Functional Category
Accession Nb
pI
MW
non identified
Dynamin1
Dynamin1
Dynamin1
DRP-2 / CRMP-2 / TOAD64
Predicted (Pr): Nischarin(N-term)
+ MAGUK p55 sub family 6
Endocytosis
Endocytosis
Endocytosis
Axonal growth
Cytoskeleton regulat
Scaffold
P21575
P21575
P21575
P47942
gi 109503020
gi 109473490
6.32
6.32
6.32
5.96
5.22
5.91
96 209
96 209
96 209
62 277
167 938
64 545
138
197
232
276
81
75
17/23
24/31
29/40
26/32
19/32
14/32
25%
31%
39%
41%
12%
21%
Protein disulfide isomerase A3
Chaperone
P11598
5.80
54 239
89
12/26
29%
Synapsin II
DEAD box protein 19A
Synapsin II
Pyruvate dehydrogenase E1 α
MAP1 light chain LC2
Pr: Armadillo repeat containing 6
Creatine kinase
+ CNPase
α Enolase (non neural)
+ GFAP δ
DRP-2 / CRMP-2 / TOAD64
Glutaminase
+ Coatomer subunit
+ DRP-2 / CRMP-2 / TOAD64
Exocytosis
Protein synthesis
Exocytosis
Metabolism
Cytoskeleton
Metabolism
Metabolism
Metabolism
unknown
Metabolism
Cytoskeleton
Metabolism
Cytoskeleton
Axonal growth
Metabolism
Protein transport
Axonal growth
Q63537
Q9NUU7
Q63537
P26284
P43926
P26284
P26284
P26284
gi 109503178
P07335
P13233
P04764
P47819
P47942
P13264
Q66H80
P47942
7.62
6.20
7.62
6.82
5.46
6.82
6.82
6.82
5.81
5.23
9.18
6.16
5.36
5.96
6.04
5.89
5.96
52 822
53 975
52 822
40 191
30 023
40 191
40 191
40 191
51 528
42 686
47 239
46 996
49 956
62 277
66 576
57 199
62 277
124
12/34
7 (MS/MS)
14/32
9/12
3 (MS/MS)
24/46
23/40
24/41
14/29
6 (MS/MS)
3 (MS/MS)
19/52
13/52
35%
11%
37%
18%
7%
49%
37%
50%
37%
17%
8%
55%
33%
122
21/59
11/59
11/59
50%
32%
31%
non identified
Dynamin-like protein 1
6-Phosphofructokinase type C
Mitochondria division
Metabolism
O35303
P47860
6.63
6.95
80 103
85 719
121
98
20/49
21/56
36%
35%
CaMKII α chain
Signalling
P11275
6.60
54 114
104
14/39
40%
Synapsin II
Protein disulfide isomerase A3
+ Synapsin IIb
Pr: MAGUK p55 sub family 2
Coronin: actin binding protein 1A
non identified
non identified
Tu translation EF (mitochondrial)
Aldolase C fructose bisphosphate
CaMKII α chain
Exocytosis
Redox regulation
Exocytosis
Scaffold
Cytoskeleton
Q63537
P11598
Q63537
Q3TT52
Q91ZN1
7.62
5.80
7.62
6.04
6.05
52
54
52
61
51
822
239
822
554
065
80
76
52
120
76
9/23
10/25
7/25
14/28
7/17
27%
24%
27%
34%
27%
Protein synthesis
Metabolism
Signalling
Q497E7
P63164
P11275
5.23
6.79
6.60
49508
39152
54114
140
237
84
16/44
25/48
13/27
51%
76%
30%
112
112
201
201
224
124
153
61
99
Partie II : Résultats
Some proteins were identified from several distinct spots. The separate spots are likely to
correspond to different phosphorylation states of these proteins, although other post-translational
modifications may also be responsible for this dispersion. Spots 2, 3 and 4 corresponding to
dynamin 1 share the same mass with different pIs, suggesting the identification of a train of different
phosphorylation states (Fig. II-3). When a mixture of two or more proteins was identified, no
conclusion could be reached, as there are no reliable ways to attribute the variation to any given
protein of the pool. In addition, because we observed that abundant proteins could give a slight non
specific signal with the Pro-Q® Diamond stain, these proteins were excluded from the analysis. In the
end, 15 proteins were identified, some of which showed altered phosphorylation at several time points
following induction of LTP.
Three of these proteins have already been shown to be involved in synaptic plasticity: the
endocytotic protein dynamin 1 (Montgomery et al. 2005) showed a decreased phosphorylation at 3
different spots at 0 min (−68 %, −49 % and −48 % on spots 2, 3 and 4 respectively), phosphorylation
of the mitochondrial protein dynamin-like protein 1 (Li et al. 2004b) also decreased by 29 % (spot 22)
at 15 min and phosphorylation of the kinase CaMKII (Giese et al. 1998; Chen et al. 2001) decreased
by 37 % at 15 min on spot 24 and increased at two different spots (24 and 33) by +59 % and +63 %
at 90 min. Two other proteins belong to families that are implicated in LTP: the exocytotic protein
synapsin II decreased at three different spots (−56 % and −48 % corresponding to spots 8 and 10 at
0 min, then −20 % at spot 25 at 15 min) (Helme-Guizon et al. 1998; Sato et al. 2000), and the
membrane palmitoylated protein MPP2 (spot 27, +40 % at 90 min) which belongs to the MAGUK
family of scaffold proteins like PSD-95, chapsyn-110 and SAP97 (Migaud et al. 1998; Ehrlich and
Malinow 2004).
The other proteins, which had not been previously associated with synaptic plasticity, belong
to various functional categories. The chaperone protein disulfide isomerase A3 (PDI A3) first exhibited
a reduced phosphorylation at 0 min (−39 %) and then an increase of 57 % at 90 min. Metabolic
proteins involved in the glucose catabolism showed differential phosphorylation states at the three
time points: pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit is dephosphorylated immediately after LTP
induction (spots 11, 13, 14 and 15; change in phosphorylation: −39 %, −55 %, −52 % and −42 %
respectively), phosphofructokinase C at 15 min (spot 23, −52 %) and aldolase C fructose
bisphosphate is hyperphosphorylated at 90 min (spot 32, +49 %). Proteins associated with the
cytoskeleton also showed regulated phosphorylation. For example, coronin was dephosphorylated at
90 min (spot 28, -37 %), the MAP1 light chain LC2 was hyperphosphorylated at 0 min (spot 12,
+82 %) and the dihydropyrimidinase related protein 2 (DRP2 / CRMP2 / TOAD-64), involved in axonal
growth, was dephosphorylated at spot 5 (−23 %) at 0 min then hyperphosphorylated on spot 19
(+48 %) at 15 min. Phosphorylation of the translation initiation factor DEAD box protein 19A was
100
increased immediately after LTP induction (+35 %, spot 9) and that of the mitochondrial translation
elongation factor Tu was up-regulated at 90 min by +75 % (spot 31). Finally, phosphorylation of an
Armadillo repeat containing 6 protein, which function is unknown, was down-regulated at 0 min
(−54 %, spot 16).
2
3
4
2
3
4
(A)
(B)
Figure II-3: Zoom on spots 2, 3 and 4 corresponding to dynamin 1, stained with (A) Pro-Q®
Diamond and (B) Coomassie Blue.
Thus, using a large-scale proteomic approach, our results show that a large number of
phosphoprotein spots are differentially expressed after the induction of LTP in the dentate gyrus. The
majority of these phophoproteins are regulated immediately after HFS, suggesting a rapid and
complex reorganisation of neuronal and glial phosphoproteins after the stimulation. Using MALDI-TOF
MS and ESI-Orbitrap MS/MS, we identified 15 proteins which phosphorylation state is altered at
different time points after LTP. This suggests a role for these proteins in LTP induction or
maintenance. Most of them had not been previously associated with LTP and thus constitute new
candidates for the comprehension of the molecular mechanisms underlying synaptic plasticity.
C.2.
Analysis of the regulation of specific phosphorylation sites by western
blotting
Protein identification by MALDI-TOF MS following 2D gel separation does not routinely allow
the localisation of the phosphorylation sites within the identified proteins. Moreover, 2D gel
electrophoresis separates with a high resolution all protein isoforms and the analysis of specific
phosphorylation sites is complicated by the fact that proteins may be phosphorylated in several
distinct spots. Thus, a complementary method based on separation by 1D SDS-PAGE and detection by
western blotting was used to investigate regulation of specific phosphorylation sites for several of the
identified proteins. Davis et al. have previously shown a rapid but transient increase in the
phosphorylation states of ERK1 and ERK2 after LTP induction in the dentate gyrus in vivo, using a
similar induction paradigm (Davis et al. 2000a). The ERK proteins were thus used as controls to
validate our approach. Commercial antibodies raised against specific phosphorylation sites are
available for two of the proteins that were identified on 2D gels: CaMKIIα on Thr286 and Thr305 and
101
Dynamin1 on Ser774 and Ser778. We investigated the regulation of these specific sites at the same
time points as for the 2D gels analysis. To this end, we chose again a fluorescent technology because
of its high sensitivity and linear range. Secondary antibodies coupled to IRDye® 680 or 800 were used
and the blotted membranes were scanned on the Odyssey infrared imaging system.
As shown in figure II-4, both ERK1 and ERK2 were found to be significantly hyperphosphorylated immediately after the 10-min long induction phase of LTP. The level of phosphoERK1/2 was still above the basal level at 15 min, but this did not reach statistical significance due to a
much larger variation between animals in the decaying phase of LTP-induced ERK1/2 phosphorylation.
These results are consistent with those from Davis et al. (2000) using the same LTP induction
protocol. In addition, we observed that ERK1 and ERK2 phosphorylation was again significantly
increased 90 min after LTP induction, a time point that has not been previously examined. This was
accompanied by a slight increase in total ERK1 at 15 and 90 min (10.1 ± 2.8% at 15 min, p<0.01;
14.9 ± 5.0% at 90 min, p<0.05, data not shown). No significant variation was found for total ERK2 at
any time point. These results suggest that LTP in the dentate gyrus is associated with two distinct
temporal waves of ERK1/2 hyperphosphorylation.
Level of phosphorylation
% of control
p-Erk1
250
p-Erk2
250
***
200
200
*
150
*
100
100
50
50
0
0
0 min
15 min
*
150
90 min
0 min
15 min
90 min
p-Erk1
p-Erk2
CT 0
LTP 0
CT 15 LTP 15
CT 90 LTP 90
Figure II-4: Western blotting of phospho-ERK1 and phospho-ERK2 at 0, 15 and 90 min following LTP
induction in the dentate gyrus (control: light bars, LTP: dark bars).
The Odyssey imager is able to scan simultaneously at 680 and 800 nm. Thus, the total protein
content and the phosphorylation rate on one specific phospho-site could be quantified simultaneously
on the same blot, providing the primary antibodies for the total and phosphorylated forms come from
different species, which was the case for CaMKIIα and dynamin1. In this way, the ratio between the
phosphorylated form and the total protein could be quantified precisely for each animal. For CaMKIIα,
both the autophosphorylation site Thr286 and the autoinhibitory site Thr305 were investigated
102
(Fig. II-5-A). The inhibitory site Thr305 exhibited no alteration at the three time points investigated,
suggesting that phosphorylation of Thr305 may not be implicated during the early phase of LTP in the
dentate gyrus in vivo. In contrast, phospho-Thr286 was significantly increased immediately after LTP
induction. This activation was not persistent, suggesting a rapid and transient increase in the rate of
CaMKIIα autophosphorylation following LTP induction in the rat dentate gyrus in vivo. No significant
variation was observed for total CaMKIIα (data not shown). Interestingly, the kinetics we describe
here for the autophosphorylation and the autoinhibitory sites of CaMKIIα are not similar to the
variations we observed in the 2D gels (i.e decreased phosphorylation at 15 min and increased
phosphorylation at 90 min).This suggests that Thr286 and Thr305 are not responsible for these
variations. Considering the fact that the rat CaMKIIα possesses at least 4 other potential
phosphorylation sites (Colbran and Soderling 1990; Patton et al. 1990; Lengyel et al. 2000; Migues et
al. 2006), our 2D gel results suggest that at least one of these other phospho-sites is regulated after
LTP. The development of specific antibodies should help characterising the kinetics of regulation of
each of these potential phospho-sites.
The phosphorylation sites Ser774 and Ser778 of dynamin1 were investigated using the same
approach. We found that the rates of phosphorylation on Ser774 and Ser778 did not vary significantly
at any time point examined after LTP (Fig. II-5-B) and the total amount of protein remained stable
(data not shown). However, it should be noted that there was quite high heterogeneity between
individual animals, including in the controls. Interestingly, these variations in phosphorylation states at
Ser774 and Ser778 among animals were highly correlated for each individual, varying systematically in
the same direction (Fig. II-6). This is consistent with the fact that these two sites seem to be
regulated together, as shown during the endocytotic process (Graham et al. 2007). Finally, the
dephosphorylation of dynamin 1 that we observed in the 2D gels cannot be explained by variations in
the phosphorylation state of Ser774 or Ser778. Dynamin1 possesses at least 5 other phosphorylation
sites (Graham et al. 2007). Thus, as in the case for CaMKIIα, other phospho-sites must be regulated
after LTP.
103
% of control
(A)
Ratio p-CaMKIIα / total CaMKIIα
T 305
T 286
140
140
*
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
0 min
90 min
0 min
15 min
90 min
Ratio p-Dynamin1 / total Dynamin1
(B)
% of control
15 min
S 774
S 778
140
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
0 min
15 min
0 min
90 min
15 min
90 min
Figure II-5: Ratio of phosphorylated over total CaMKIIα (A) and dynamin1 (B) quantity measured by
western blotting at 0, 15 and 90 min following LTP induction in the dentate gyrus (control: light bars,
LTP: dark bars).
Ratio p-Dynamin1 / total Dynamin1: Individual animals’ averages
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
CT1
CT2
CT3
CT4
Pseudotetanus 0 min
CT5
LTP1
LTP2
LTP3
LTP4
LTP5
LTP6
LTP 0 min
Figure II-6: Ratio of phosphorylated dynamin1 on Ser774 (light bars) and Ser778 (dark bars) over
total dynamin1 quantity measured by western blotting at the time point 0 min. Individual animals
show a high correlation of phosphorylation state on the two sites.
104
Partie II : Discussion
D.
Discussion
This study is the first attempt to analyse a large number of phosphoproteins regulated by LTP
in the rat dentate gyrus in vivo. To obtain a large and homogenous account of changes in protein
phosphorylation state, we used a proteomic approach and studied 3 different time points following
LTP induction in order to get relevant kinetic information that could provide new insights into the
mechanisms involved in early LTP. Considering the inherent limits of the 2D gel electrophoresis
method in terms of protein pI, molecular weight and solubility, this study cannot be regarded as
exhaustive. However, it provides access to a large panel of proteins with a reliable quantification
range, especially when using Pro-Q® Diamond fluorescent staining. To strengthen the validity of our
analysis, only proteins highly stained with Pro-Q® Diamond and weakly stained with Coomassie Blue
were taken into account. We found a total of 33 spots significantly altered between the control and
the LTP groups, equally distributed between up and down-regulation of the phosphorylation level. Out
of these 33 spots, 22 were identified by mass spectrometry corresponding to 13 proteins. Five spots
corresponded to protein mixtures, preventing us from any conclusion in these spots. Apart from the
Armadillo repeat containing 6 protein which function is unknown, the proteins identified here could be
attributed to various functional groups. They include proteins involved in cell function such as
metabolism, signalling, cytoskeleton, proteins involved in protein synthesis and folding, proteins
associated with the membrane (axonal growth, anchor protein) and proteins involved in vesicles
processing (exo- and endocytosis). The possible implication of all these proteins in LTP induction will
be discussed hereafter.
D.1.
Proteins of energetic metabolism
The metabolic proteins we identified in this study are all involved in energy metabolism based
on glucose catabolism via pyruvate degradation. The pyruvate dehydrogenase E1 (PDH) is one of the
3 subunits which constitute the pyruvate dehydrogenase complex transforming pyruvate in acetylCoA. PDH is activated by dephosphorylation (Patel and Korotchkina 2001); thus the rapid
dephosphorylation we observed after LTP corresponds to an increase in the activity of the enzyme.
This is consistent with the fact that glucose can be used as an energy source for LTP induction (Izumi
et al. 1997). During LTP, the concentration of intracellular calcium is widely increased and this
increase could take part in PDH activation since the PDH-phosphatase is stimulated by Ca2+ (Rutter et
al. 1989). Moreover, the phosphorylation state of PDH is correlated with calcium sequestration by
mitochondria during LTP in hippocampal slices (Lynch et al. 1983a). Thus, LTP induction may resort to
rapid glucose degradation as a source of energy and may also provide calcium buffering by
mitochondria through the regulation of PDH phosphorylation state. Pyruvate can also be generated by
several amino acids catabolisms (alanine, serine, threonine or cysteine), thus PDH activity could also
be linked with protein degradation leading to free amino acids.
105
Phosphofructokinase, a limiting enzyme in the glycolysis pathway, is stimulated by
phosphorylation (Marsin et al. 2000). Here, we observed a decrease in the phosphorylation state of
the phosphofructokinase 15 min after LTP induction, suggesting a transient inhibition of glycolysis at
this time point. This reduction in glucose catabolism may counteract the rapid increase we observed
through PDH dephosphorylation at 0 min, bringing the energetic glucose metabolism back to a basal
level.
The aldolase C fructose bisphosphate, which is also involved in glucose catabolism, is
hyperphosphorylated 90 min after LTP induction. The effect of phosphorylation on aldolase C, the
brain isoform, has not been previously investigated and it is therefore difficult to make any hypothesis
on the possible function of this protein in LTP. The present result, however, points to the possibility of
a delayed regulation of glucose metabolism after LTP.
D.2.
Protein synthesis and folding
The DEAD box protein 19A exhibited hyperphosphorylation immediately after LTP induction.
This protein is involved in mRNA export from the nucleus (Schmitt et al. 1999) and is expressed in the
cytosol and at the nuclear rim interacting with the nuclear pore complex (Rollenhagen et al. 2004). It
was recently shown to take part also in translation termination through stop-codon recognition (Gross
et al. 2007). Activity regulation by phosphorylation has not been described for this protein thus we
cannot interpret the regulation we observed.
Protein disulfide isomerase A3, also known as the glucose related protein 58 (GRP58), is a
molecular chaperone expressed in the endoplasmic reticulum. It catalyses the formation of disulfide
bonds. In our experiments, GRP58 exhibited reduced phosphorylation immediately after LTP induction,
then returned to basal levels and finally showed hyperphosphorylation at 90 min. Thus its regulation
seems to follow rigorous time scales. Protein disulfide isomerases are known to be phosphoproteins
and GRP58 exhibits at least 5 potential phosphorylation sites (Donella-Deana et al. 1996; Sakai et al.
2003; Kita et al. 2006), however, the relevance of these post-translational modifications remains
unknown.
The Tu translation elongation factor (EF-Tu) was found to be hyperphosphorylated at 90 min.
EF-Tu promotes protein synthesis in mitochondria by delivering aminoacyl-tRNA to the acceptor site of
the ribosome. EF-Tu is a phosphoprotein containing at least 2 phosphorylation sites, the
phosphorylation state of which are believed to control directly mitochondrial protein synthesis (He et
al. 2001). In prokaryotes, EF-Tu phosphorylation inhibits protein translation (Alexander et al. 1995).
Thus, it is attractive to speculate that mitochondrial EF-Tu phosphorylation also leads to inactivation of
protein synthesis although this has not yet been proven. A reduction in mitochondrial protein
106
synthesis might be a way to spare energy for other cellular mechanisms taking part in early LTP such
as expression of nuclear immediately early genes.
D.3.
Proteins of the cytoskeleton
Coronin 1A, a cytoskeleton protein also known as tryptophan aspartate-containing coat
protein (TACO), was found to be dephosphorylated 90 min after LTP induction. This protein
participates in plasma membrane invagination and in the formation of protrusions for cell locomotion.
Recently, coronin A1 has been shown to be a specific marker for microglial cells, absent from neurons,
astrocytes or oligodendrocytes (Ahmed et al. 2007). In addition, microglia may interact with LTP in
the hippocampus as shown by Griffin et al in aged rats (Griffin et al. 2006). Thus our finding suggests
that the dynamic of microglia is altered during LTP and constitutes an additional argument in support
of the hypothesis that glial cells take part in synaptic plasticity (Sastry et al. 1990; Sykova and Chvatal
2000).
The light chain LC2 is a derivative product from MAP1A protein (microtubule associated
protein 1A) which is mainly expressed in neuronal cells (Langkopf et al. 1992). It is able to bind and
stabilise microtubules by itself and its function is at least partly regulated by MAPkinases (Halpain and
Dehmelt 2006). LC2 can be phosphorylated in vitro by casein kinase Iδ and this would regulate
microtubules dynamics. Moreover, this protein has been found to be phosphorylated in the
postsynaptic density (PSD) isolated from mice brain tissue (Trinidad et al. 2005). The increase in
phosphorylation state we observed at 0 min after LTP may thus reflect a critical role for this protein in
PSD dynamics.
D.4.
Proteins associated with the membrane
We identified the membrane palmitoylated protein 2, a MAGUK protein (MAGUK p55 subfamily
member 2, mpp2), as being hyperphosphorylated 90 min following LTP induction. This protein has
already been shown to be phosphorylated in the PSD (Trinidad et al. 2006). Indeed, like other MAGUK
proteins, mpp2 is located at the post-synaptic site and participates in protein complex assembly (JingPing et al. 2005). Among the MAGUK proteins, PSD-95 has been the most extensively studied during
synaptic plasticity. Mutant mice lacking PSD-95 were shown to exhibit altered LTP and deficient spatial
learning (Migaud et al. 1998). PSD-95 was also shown to regulate AMPA receptors insertion at the
synapse during LTP (Ehrlich and Malinow 2004). The role of mpp2 in synaptic plasticity has not been
yet characterised, but according to its location and binding properties, it may be involved in synaptic
adhesion and post-synaptic signalling.
The dihydropyrimidinase-related protein 2 (DRP-2/CRMP-2/TOAD-64) was found to be
dephosphorylated immediately after LTP induction and hyperphosphorylated at a different spot at
15 min. The 2 spots identified here differ in molecular weight and pI. This has been observed
previously and interpreted as fragmentation isoforms of CRMP-2 (Franzen et al. 2003). However, in
107
our 2D gels we identified CRMP-2 at 5 other spots sharing the same molecular weight as spot 19 with
different pIs (data not shown). These most likely correspond to different phosphorylation states of the
protein, knowing that CRMP-2 contains at least 5 phosphorylation sites (Cole et al. 2004; Mimura et al.
2006). CRMP-2 is a cytosolic protein tightly associated with the membrane and has been implicated in
axonal growth and guidance and thus in the regulation of neurites differentiation into dendrites or
axons (Brown et al. 2004; Yoshimura et al. 2005). In this context, the dephosphorylation of CRMP-2
through NT-3 and BDNF supports axon elongation (Yoshimura et al. 2005), while phosphorylation by
GSK-3 (Cole et al. 2004), Cdk5 (Brown et al. 2004) or the Rho kinase (Arimura et al. 2005) inhibit its
interaction with tubulin and supports growth cone collapse. Moreover, phosphorylation of CRMP-2 may
promote the formation of degenerating neurites in Alzheimer’s brains (Gu et al. 2000). In contrast,
CRMP-1 is thought to be implicated in neurites formation in pyramidal cells in the hippocampal CA1
region. Mutant mice deprived of CRMP-1 exhibit deficits in CA1 LTP as well as impaired spatial
learning and memory (Su et al. 2007). According to Su et al, CRMP-1 is not expressed in the dentate
gyrus, but we demonstrate here that CRMP-2 is expressed in this brain region. In mature neurons
CRMP-2 is no more located in terminals but at the somatodendritic level (Veyrac et al. 2005). Thus,
we can hypothesise that CRMP-2 could interfere with LTP establishment in the dentate gyrus through
neurites formation. Furthermore, CRMP-2 has been suggested to play a role in neurogenesis in the
adult brain and in neuroprotective mechanisms activated during cerebral ischemia (Chen et al. 2006).
Neurogenesis is known to occur in the dentate gyrus in adults and recent evidence has shown that
LTP increases adult neurogenesis in the dentate gyrus (Bruel-Jungerman et al. 2006). Thus, regulation
of CMPR-2 phosphorylation during LTP is of particular interest and may illustrate a first step of
morphological reorganisation of connectivity in the dentate gryus after LTP.
Dynamin-like protein 1 (DLP1) belongs to the dynamin family of large GTPases and induces
mitochondrial and peroxisomal division (Koch et al. 2003; Yoon et al. 2003). The fission of
mitochondria is promoted by phosphorylation of DLP1 (Taguchi et al. 2007). Here we report a
reduction in its phosphorylation state 15 min following LTP induction, and effect which may
correspond to an inhibition of mitochondrial division. To date, only one phosphorylation site has been
described for DLP, but it may not be exclusive. Taguchi et al (2007) described only one
phosphorylation site for DLP1 but the authors did not undertake a systematic study (Taguchi et al.
2007). Thus we cannot exclude the presence of other phosphorylation sites which may be involved in
different functional regulations. DLP-1 has been shown to support the ability of neurons to form new
excitatory synapses in response to stimulation via mitochondria distribution at the dendritic spines (Li
et al. 2004b). Thus, DLP1 may be involved in the regulation of synaptic morphology through the
control of mitochondria dynamics during LTP.
DLP1, together with pyruvate dehydrogenase and the Tu translation elongation factor, is the
third protein associated with the mitochondria that we identified in this study. Mitochondrial activity is
related to LTP through an increased uptake of calcium (Stanton and Schanne 1986) and the
expression of mitochondrial genes (Williams et al. 1998). In pathological conditions like
108
hyperammonemia, the improvement of mitochondrial function by a taurine treatment can restore
impaired synaptic plasticity (Chepkova et al. 2006). In the same way, cyclosporin A which stabilises
mitochondrial function, significantly ameliorates LTP following traumatic brain injury (Albensi et al.
2000). The 3 proteins we report here are associated with 3 essential characteristics of mitochondria:
dynamic distribution through fission/fusion, energetic activity through aerobic respiration, and their
ability to synthesise proteins. Thus our results confirm the multi facets involvement of mitochondria in
LTP.
D.5.
Proteins involved in vesicle processing
Synapin II was found to be dephosphorylated at 0 and 15 min following LTP induction. The
three spots we identified as synapsin II probably correspond to isoform b although this hypothesis is
based on the presence of a single peptide (2849.45 Da, corresponding to the amino acids 449-474) in
the MALDI-TOF spectra. Synapsins are located exclusively in synapses where they cover synaptic
vesicles and ensure synapse maintenance by tethering a reserve pool of vesicles to the cytoskeleton
(Greengard et al. 1993). Several studies established a link between these proteins and LTP. Synapsins
I and II are overexpressed during LTP in the rat dentate gyrus (Hicks et al. 1997; Helme-Guizon et al.
1998) and mice deprived of synapsin I and/or II exhibit synaptic plasticity deficits (Hilfiker et al.
1999). Synapsin I has been most extensively studied and has been shown to be the target of several
kinases such as CaMKII, PKA and MAPK at different sites. Phosphorylation of synapsin I promotes
dissociation from synaptic vesicles and allows vesicles to mobilise and fuse with the plasma
membrane, thus increasing neurotransmitter release (Leenders and Sheng 2005). Synapsins share a
common N-terminal domain A binding phospholipids which contains one phosphorylation site (site 1).
Phosphorylation of synapsin II on this site also seems to inhibit interactions between vesicles and
actin (Nielander et al. 1997), suggesting a role in vesicle mobilisation and neurotransmitter release. In
contrast, synapsin IIb is expressed in adipocytes where inhibition of phosphorylation on site 1
increased Glut4 exocytosis. In addition to regulating neurotransmitter release, the synapsins may also
regulate the formation of new nerve terminals. For example, synapsin IIb expressed in a
neuroblastoma-glioma cell line was shown to result in the formation of more nerve terminals and
more synaptic vesicles in each nerve terminal (Han et al. 1991). To date, apart from the
phosphorylation of site 1 by PKA, no other phosphorylation event has been described in synapsin II.
However, in our 2D gels, synapsin II was identified at several distinct spots stained with Pro-Q®
Diamond, suggesting that site 1 is not the only site undergoing change in phosphorylation in LTP. The
reduction in phosphorylation of synapsin II that we observed here is thus likely to be involved in the
regulation of neurotransmitter release but may also participate in longer lasting events such as the
regulation of synapse and vesicle formation. Furthermore, our results strongly suggest that yet
unidentified phosphorylation sites could take part in these regulatory events.
Dynamin1 was found to be dephosphorylated on three different spots immediately after LTP
induction. The 3 spots differ only in pIs suggesting different phosphorylation states. Dynamin1
109
belongs to the dephosphins which are constitutively phosphorylated neuronal proteins involved in
synaptic vesicle endocytosis (SVE). They undergo rapid and coordinated dephosphorylation in
neuronal terminals following calcium entry and the regulation of their phosphorylation state is
essential for SVE (Robinson et al. 1994). Dynamin1 induces the fission of the vesicles probably via a
conformational
change
involving
GTP
hydrolysis
(Cousin
and
Robinson
2001).
Following
depolarisation, calcium influx leads to the dephosphorylation of dynamin1 by calcineurin while PP1
and PP2A seem to be less efficient (Liu et al. 1994). SVE is an essential process that takes place both
at the pre- and post-synaptic levels. In axon terminals, SVE takes part in the recycling of synaptic
vesicles: following exocytosis and neurotransmitter release, vesicles are recycled by endocytosis for a
forthcoming release. This implies the successive dephosphorylation and rephosphorylation of
dynamin1 (Nguyen and Bibb 2003). In dendrites, dynamin1 is involved in receptor endocytosis, in
particular of AMPA receptors as shown in the CA1 region of the hippocampus (Alberi et al. 2005).
Dynamin1 can also participate in NMDA receptors internalisation as shown following the induction of
LTD where NMDA receptors are internalised in a dynamin1-dependent manner (Montgomery et al.
2005). Thus, dynamin1 is already known to be involved in LTD and the rapid dephosphorylation we
found here after LTP suggests a rapid activation of dynamin1 in LTP mechanisms, which could control
both the regulation of receptor expression at the synapse and the rate of neurotransmitter release,
illustrating the dual function of certain proteins at pre- and post-synaptic sites during synaptic
plasticity.
Using western blotting, we found no evidence for a significant regulation on the phosphoSer774 and Ser778 of dynamin1 at 0, 15 or 90 min after LTP induction, suggesting that these sites are
not responsible for the clear dephosphorylation we observed in the 2D gels. However, when
considering individual animals, a rather large variability could be observed at both sites, with a clear
parallel regulation at S774 and S778 which is consistent with previous observations (Ahn et al. 2002;
Graham et al. 2007). The fact that the mean phosphorylation state remained unchanged may reflect
the rapid turnover described on these sites where dephosphorylation is directly associated with
dynamin1 activation (Anggono et al. 2006) and phosphorylation ensures the recycling of the protein
(Cousin and Robinson 2001). Because the regulation of these phosphorylation sites is extremely rapid,
lack of synchronisation between animals or between neurons may have made it difficult to observe an
acceleration or reduction in the turnover on these sites using a global in vivo approach. Thus, the
regulation of S774 and S778 may not be stable enough to be detectable in our experimental
conditions. However, dynamin1 possesses at least 7 phosphorylation sites (Ahn et al. 2002; Graham et
al. 2007) and it is most probable that at least one of these, different from S774 and S778, exhibits a
stable decreased in phosphorylation following LTP induction. While S774 and S778 are involved in
basal activity of dynamin1, this (or these) other site(s) could be more specifically associated with
synaptic plasticity.
110
D.6.
Signal transduction
Several kinases belonging to canonical cell-signalling cascades are known to be involved in
LTP and it may seem surprising that a significant change in the phosphorylation state of only one of
these kinases, CaMKIIα was detected in this study. A likely explanation is that the expression level of
most of these kinases may be too weak to be detected with the proteomic method used, while
CaMKII, as one of the most abundant protein kinase in neurons, was more likely to be identified in our
experimental conditions. Two different spots corresponding to CaMKIIα were found to be altered after
LTP induction: spot 24 was down-regulated at 15 min and then upregulated at 90 min, and spot 33
exhibited hyperphosphorylation at 90 min. A large majority of studies investigating CaMKII in LTP
have been performed on CA1 LTP in the in vitro hippocampal slice preparation. CaMKII has been
shown to be essential for LTP induction in this area, in particular via its autophosphorylation on
Thr286 which supports the kinase activity in a Ca2+-independent manner (Giese et al. 1998). CaMKII
participates in both LTP induction and maintenance (Fukunaga et al. 1996). Regulation of the
autoinhibitory site Thr305 also seems to be critical for synaptic plasticity and learning (Elgersma et al.
2002). In the dentate gyrus, CaMKIIα is also regulated during LTP although is does not seem to be
essential (Cooke et al. 2006; Wu et al. 2006a). In the same way, inhibition of MEK or PKA alone is not
sufficient to block LTP induction, suggesting redundancy and parallel implication of these different
signalling cascades (Wu et al., 2006). These observations also point out to differences in the
molecular mechanisms underlying LTP in CA1 and in the dentate gyrus. Moreover, the time scales for
CaMKII activation differ in the two hippocampal regions: CaMKII inhibitors do not block LTP when
applied after LTP induction in the CA1 region while CaMKII/PKA or CaMKII/MAPK inhibitors have a
prolonged effect and can still block LTP 30 min after induction in the dentate gyrus (Wu et al. 2006a).
This is consistent with our finding of an increased phosphorylation state of CaMKIIα at a late (90 min)
time point after LTP.
Two phosphosite-specific antibodies for CaMKII were then used in western blotting
experiments, anti-Thr286, an autophosphorylation site of CaMKIIα associated with Ca2+-independent
activity of the kinase (Fukunaga et al. 1995) and anti-Thr305, an autoinhibitory site which seems to
weaken LTP induction and alter spatial learning (Elgersma et al. 2002). As expected, we found a rapid
increase in Thr286 phosphorylation after LTP. This regulation was transient, suggesting a relay with
other signalling pathways for later events. In addition, we found no evidence for regulation at the
inhibitory site at any of the time points examined. The fact that these results are not similar to those
obtained with the 2D gels approach and that at least four other phosphorylation sites have been
described in rat CaMKIIα (Colbran and Soderling 1990; Patton et al. 1990; Lengyel et al. 2000; Migues
et al. 2006) strongly suggest that some of these other sites are responsible for the variations we
observed in the 2D gels rather. Indeed, several studies have highlighted the fact that Thr286 cannot
by itself explain total CaMKII activity regulation (Fukunaga et al. 1993; Barria et al. 1997). Thus, as
previously suggested (Fukunaga et al., 1996), other sites are likely to be regulated during LTP, which
111
function could be unique to LTP induction and maintenance mechanisms. In terms of kinetics,
consistent with our observations, Barria et al. (1997) pointed out that phosphorylation of Thr286
cannot by itself explain total CaMKII phosphorylation 15 and 60 min after LTP induction. Thus,
following a rapid and transient phosphorylation at Thr286, other CaMKIIα phosphorylation sites seem
to take over during the more longer-lasting phases of LTP. Identification of these sites and their
functional relevance in LTP will be of great interest.
Finally, we also examined ERK phosphorylation in western blotting experiments as ERK has
been shown to be essential for LTP maintenance in the dentate gyrus in vivo and for LTP-dependent
gene transcription (McGahon et al. 1999; Davis et al. 2000a). Activation of ERK1-2 by phosphorylation
is increased in the dentate gryus after LTP induced by HFS (Davis et al. 2000a; Gooney et al. 2002;
Yang et al. 2003) or by BDNF (Ying et al. 2002). When assayed immediately or 5 min after LTP
induction, ERK1-2 phosphorylation was found to be strongly increased, with a rapid decay at later
time points. In accordance with these findings, we observed a rapid increase in both ERK1 and ERK2
phosphorylation, which decayed back to basal levels by 15 min. However, we found a second wave of
ERK phosphorylation detected at 90 min after LTP which has not been previously reported in the
dentate gyrus in vivo. Our results thus suggest the occurrence of two distinct waves of ERK activation
after LTP in the dentate gryus, in a similar manner as what was observed in cultured cortical neurons
stimulated by BDNF (Rosenblum et al. 2002). These results suggest the involvement of ERK1-2
activation in several phases of LTP induction and maintenance mechanisms.
In all, with a large scale proteomic approach, we describe here the regulation of various
classes of proteins at three different time points after the induction of LTP in the dentate gyrus. Our
results highlight new proteins the phosphorylation or dephosphorylation of which is associated with
LTP induction or maintenance. Lower scale protein studies with a particular focus on the regulation of
specific phosphorylation sites are now needed to further understand the individual implications of
these proteins in LTP as well as their molecular interactions.
Acknowledgments
This work was supported by a CNRS grant (Protéomique et Génie des Protéines program) to S.L. and
P.L.M., an HFSP grant to S.L (RGP0040/2002) and EU grant RTN-CT-2003-504231 to S.L. S.C. was
supported by a BDI fellowship from CNRS and Conseil Régional de l’Essonne. We would like to thank
P. Veyrac and N. Samson (UMR 8620, Orsay) for animal care.
112
Partie III :
Etude Protéomique des Souris Mutantes
Zif268
113
Partie III
Dans cette partie, nous nous sommes de nouveau intéressés aux mécanismes moléculaires de
la phase tardive de la LTP. Par une approche indirecte, nous avons cherché à identifier des cibles du
facteur de transcription Zif268 qui est induit dans le gyrus denté au cours de la LTP et joue un rôle
essentiel dans la consolidation de la LTP et de la mémoire à long terme (French et al. 2001; Davis et
al. 2003). Nous avons comparé le protéome de souris sauvages et de souris mutantes n’exprimant pas
Zif268. L’étude a porté sur le cortex et les régions CA de l’hippocampe car Zif268 est exprimé de façon
basale dans ces deux régions. A l’inverse, il n’est pas exprimé de façon constitutive dans le gyrus
denté. Nous avons donc également étudié cette région afin de détecter d’éventuels faux positifs. En
effet, l’absence de Zif268 chez les souris mutantes pourrait entraîner des phénomènes de
compensation impliquant d’autres facteurs de transcription, tels que les autres membres de la famille
Egr ou CREB qui semble partager de nombreuses cibles avec Zif268 (Pfenning et al. 2007). Ainsi
certaines différences d’expression de protéines observées chez les souris mutantes pourraient être
dues à une activation altérée de l’un ou de plusieurs de ces facteurs de transcription.
Les protéines, séparées par électrophorèse bidimensionnelle, ont été colorées au Bleu de
Coomassie et les images analysées avec le logiciel PDQuest suivant le même schéma expérimental
que dans la Partie I. Pour le cortex, un gel différent a été réalisé pour chaque animal, cependant, cela
n’a pas pu être mis en œuvre pour le gyrus denté et les régions CA de l’hippocampe qui, chez la
souris, contiennent une quantité trop faible de protéines. Contrairement à nos attentes, nous n’avons
observé aucune variation commune au cortex et aux régions CA qui soit absente dans le gyrus denté.
En revanche, nous avons observé deux variations très reproductibles dans les 3 régions.
L’identification des protéines correspondantes (la mortaline et la synthétase de l’ARNt-histidyl) et le
séquençage de leurs ARNm ou de leurs gènes a permis de montrer que ces variations n’étaient pas
liées à l’absence de Zif268 en tant que facteur de transcription mais à la façon dont les souris
mutantes avaient été conçues. La description et l’explication de ces résultats ont fait l’objet d’une
publication qui est insérée à la suite de ces quelques pages (Chardonnet et al. 2007).
L’étude du protéome des souris mutantes a été réalisée en parallèle avec le travail présenté
dans la Partie I. L’absence de résultat conforme à nos attentes nous amène, comme dans la première
partie, à réfléchir à la pertinence de la démarche expérimentale. Le fait d’avoir mélangé les
échantillons provenant des régions CA ou du gyrus denté, d’une part, a pu introduire un biais lié à la
variabilité individuelle des animaux. D’autre part, le fait d’avoir utilisé la coloration au Bleu de
Coomassie et un faible nombre de gels pour les régions de l’hippocampe réduit la fiabilité de l’analyse
quantitative. Nous ne reviendrons pas sur ces points en détail dans la mesure où ils ont déjà été
discutés (voir Partie I-Discussion). Pour cette partie du travail, comme pour la première, l’utilisation de
la DIGE ou de méthodes de quantification par spectrométrie de masse en tandem permettrait
d’accéder à un plus grand nombre de protéines avec une plus grande sensibilité et dans des
conditions mieux adaptées à une étude quantitative.
114
Partie III
Dans l’optique de reproduire ces expériences avec la méthode de la DIGE, un élément
supplémentaire pourrait être ajouté dans la démarche expérimentale afin de favoriser l’observation
des cibles de Zif268. Il s’agirait d’induire un électrochoc chez les souris de façon à induire l’expression
de Zif268 et à potentialiser son activation. En effet, l’application d’un électrochoc induit l’expression
rapide (dès 15 min, retour au niveau basal à 4 h) de zif268 dans le cerveau du rat, en particulier dans
le gyrus denté (Cole et al. 1990). Comme nous l’avons vu dans l’introduction générale, la LTP induit
également l’expression de zif268 dans le gyrus denté mais l’électrochoc est un modèle de plasticité
plus simple à mettre en œuvre, en particulier chez la souris, et qui est susceptible d’induire des
modifications d’expression de plus grande amplitude. Une telle étude permettrait de faire plusieurs
comparaisons croisées afin d’obtenir un maximum d’informations.
La comparaison du protéome du gyrus denté des souris sauvages contrôles ou ayant subi un
électrochoc devrait mettre en évidence des protéines dont l’expression est altérée par l’électrochoc.
Une partie d’entre elles est susceptible de correspondre à des cibles directes de Zif268. Toutefois,
Zif268 n’a pas l’exclusivité des mécanismes moléculaires induits au cours d’un électrochoc : d’autres
facteurs de transcription sont induits dans l’hippocampe suite à un électrochoc, tels que c-fos, c-jun,
jun-B, delta FosB ou CREB (Cole et al. 1990; Chen et al. 1995; Nibuya et al. 1996). Ainsi seule une
partie des protéines régulées constitueraient des cibles potentielles de Zif268.
La comparaison du protéome du gyrus denté des souris sauvages et mutantes contrôles
devrait, comme nous l’avons déjà évoqué, renseigner sur les phénomènes de compensation induits
par l’absence de Zif268. Les variations qui seraient communes à cette comparaison et à la précédente
doivent correspondre à des cibles d’autres facteurs de transcription, ce qui ne signifie pas qu’elles ne
peuvent pas être aussi sous le contrôle de Zif268 chez les souris sauvages. Les cibles des autres
facteurs de transcription devraient également être visibles dans le protéome du gyrus denté des souris
mutantes après électrochoc.
Enfin, la comparaison des souris sauvages et mutantes ayant subi un électrochoc doit faire
apparaître les régulations protéiques spécifiquement induites par Zif268. Il est probable que la liste de
protéines obtenue soit minorée à cause de phénomènes de compensation mais les différences
observées devraient être spécifiques de Zif268.
Le choix du délai devrait faire l’objet d’une attention particulière puisque l’activation de zif268
a lieu rapidement et de façon transitoire après l’électrochoc. Il faut que le délai soit suffisamment long
pour permettre la traduction des protéines mais suffisamment court pour éviter leur dégradation qui
masquerait le phénomène. Un délai d’1 h ou 2 h après le choc pourrait être un compromis intéressant.
Quels que soient les résultats observés, les cibles potentielles identifiées devront faire l’objet
de deux validations systématiques : 1) vérifier que le gène correspondant porte bien au moins un site
de reconnaissance de Zif268 dans son promoteur ; 2) compte tenu de l’enseignement que nous avons
tiré de nos résultats, il apparaît nécessaire de s’assurer que les gènes codant les protéines identifiées
ne se trouvent pas à proximité du gène de zif268 sur le chromosome 18. Le meilleur moyen de
s’affranchir du problème de la non-conformité des animaux contrôles serait de travailler avec des
animaux mutants conditionnels (Gerlai 1996).
115
Conclusions
et
Perspectives
126
Conclusion et Perspectives
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les trois parties de mon projet de doctorat avaient pour objectif commun d’identifier des
protéines qui pourraient participer à l’expression de la LTP dans l’hippocampe chez le rongeur, in vivo.
A l’exception d’une étude récente réalisée dans la région CA1 de l’hippocampe in vitro (McNair et al.
2006), l’étude des variations d’expression des protéines au cours de la LTP se fait généralement pour
une protéine donnée. Les approches classiquement utilisées sont basées sur des analyses
biochimiques, sur l’inhibition (ou plus rarement l’activation) pharmacologique de la protéine d’intérêt
ou sur l’étude phénotypique d’animaux génétiquement modifiés. Avec ce type d’approches, il est
nécessaire d’avoir une idée précise des protéines qui pourraient être impliquées dans l’expression de
la LTP. Les protéines qui sont sujettes à ce type d’études appartiennent donc souvent aux mêmes
familles (récepteurs du glutamate, protéines impliquées dans la libération des neurotransmetteurs) ou
aux mêmes voies de signalisation (kinases et phosphatases décrites dans l’introduction). Une
approche protéomique, parce qu’elle n’est pas basée sur une hypothèse préconçue sur les protéines
potentiellement impliquées, peut mettre en évidence des protéines régulées au cours de la LTP qui
n’auraient peut-être jamais fait l’objet d’une étude individuelle.
A.
Utilisation des outils protéomiques pour une étude homogène de la
régulation des protéines au cours de la LTP
L’approche globale d’une étude protéomique permet d’étudier en parallèle un très grand
nombre de protéines dans un contexte biologique donné. Les études génétiques ou pharmacologiques
visant à décortiquer les mécanismes moléculaires de la LTP n’ont pas toutes été réalisées sur le même
modèle. En effet, il existe une très grande variété dans les approches utilisées en termes de délais, de
mode d’induction de la LTP (stimulation à haute fréquence, rythme thêta, infusion de BDNF), de
modèle animal (souris ou rat, in vivo ou in vitro, anesthésié ou non), ou de localisation de l’induction
(gyrus denté ou région CA1, autres régions corticales ou sous-corticales). La diversité des délais
étudiés se justifie par l’existence de phases de nature différentes au cours de la LTP et la mise en
évidence de vagues d’expression temporelles pour certains gènes ou protéines (Thomas et al. 1994b;
Davis and Laroche 1998). Les autres choix expérimentaux, quant à eux, peuvent influencer les
résultats observés en raison des différences inhérentes aux divers modèles utilisés. Nous avons déjà
évoqué des différences de mécanismes moléculaires entre le gyrus denté et la région CA1, par
exemple concernant l’expression basale de Zif268 (Schlingensiepen et al. 1991) ou l’implication de la
CaMKII dans l’induction de la LTP chez des souris, in vivo (Cooke et al. 2006). Il existe également des
différences entre souris et rats. On peut citer l’exemple des MAPK-ERK qui, dans le CA1, sont
nécessaires à l’induction de la LTP induite par une stimulation à haute fréquence chez le rat mais pas
127
chez la souris (Selcher et al. 2003). La même étude a mis en évidence des différences liées au mode
d’induction de la LTP puisque, chez les souris, ERK n’est pas nécessaire à la LTP induite par une
stimulation à 100 Hz mais l’est pour une LTP induite par une stimulation qui mime le rythme thêta. Le
fait de travailler chez l’animal anesthésié ou éveillé peut également influencer l’amplitude de la LTP
(Riedel et al. 1994). Enfin, le fait de travailler in vivo sur l’hippocampe entier ou in vitro sur des
coupes modifie l’induction de plusieurs facteurs de transcription (French et al. 2001; Taubenfeld et al.
2002).
Le fait d’étudier un grand nombre de protéines simultanément grâce aux techniques de
protéomique permet de comparer l’expression de protéines variées dans un contexte biologique
strictement identique. En utilisant une telle approche, nous avons donc étudié l’expression des
protéines ou leur niveau de phosphorylation à différents délais dans un modèle unique : l’induction de
la LTP par une stimulation à haute fréquence des afférences du gyrus denté, in vivo, chez le rat
anesthésié. Seule la troisième partie de mon projet a été réalisée avec un modèle différent parce
qu’elle visait à accéder spécifiquement aux cibles du facteur de transcription Zif268 et nécessitait
l’utilisation de souris mutantes. Dans les paragraphes suivants, nous reviendrons rapidement sur les
différentes parties de ce travail afin de présenter les perspectives qui pourront être mises en places
pour la poursuite de ce projet.
B.
Analyse différentielle de l’expression des protéines au cours de la LTP : vers
de nouveaux choix méthodologiques
Dans la première partie, nous nous sommes intéressés aux variations d’expression des
protéines du gyrus denté au cours de la phase tardive de la LTP (à 6 h et 24 h). Utilisant une
approche classique par électrophorèse 2D colorée au Bleu de Coomassie ou au nitrate d’argent, nous
n’avons pu identifier qu’un nombre restreint de protéines dont le niveau d’expression était altéré par
la LTP. Compte tenu des données de la littérature, on aurait pu s’attendre à observer un plus grand
nombre de variations aux deux délais étudiés bien qu’il soit possible qu’après l’induction les variations
soient de plus en plus faible amplitude et tendent vers un nivellement avec le temps. Toutefois, les
contraintes inhérentes aux choix méthodologiques que nous avons faits n’étaient peut-être pas les
plus favorables pour la mise en évidence de nombreuses variations. Au vu des résultats de notre
approche, nous sommes arrivés à plusieurs conclusions qui nous ont guidés lors de l’étude des
phosphoprotéines qui a suivi. D’une part, l’utilisation du gyrus denté controlatéral de chaque animal
comme contrôle peut introduire des faux négatifs dans la mesure où il peut être sujet, lui aussi, à des
modifications moléculaires. L’utilisation d’animaux qui subissent les mêmes traitements mis à part
l’induction d’un tetanus, remplacé par un pseudotetanus, parait mieux adaptée. D’autre part, le fait de
mélanger des échantillons biologiques provenant d’animaux différents peut introduire des biais dans le
128
niveau d’expression des protéines compte tenu des variabilités individuelles. Il est donc préférable de
travailler séparément sur les protéines de chaque individu. Enfin, les colorants que nous avons utilisés
pour quantifier les protéines dans les gels 2D n’étaient pas les mieux adaptés à une étude quantitative
différentielle fine par manque de sensibilité et/ou de linéarité. Ce constat nous a orientés vers
l’utilisation de colorants fluorescents, plus sensibles et qui présentent une large gamme de linéarité.
La méthodologie de la DIGE apparaît comme une perspective prometteuse pour la poursuite
de ce projet. Elle permet de s’affranchir de la variabilité inter-gels tout en disposant d’une bonne
sensibilité, d’une large gamme de linéarité et d’une méthode de quantification fiable. Parce qu’elle ne
nécessite qu’une quantité relativement faible de protéines, la DIGE serait également appropriée à
l’étude d’échantillons protéiques plus restreints. Il serait, par exemple, possible de travailler
séparément sur les régions dorsales ou ventrales du gyrus denté. Les travaux de McNair et al., qui
utilisent cette méthode, ont donné des résultats intéressants concernant l’induction de la LTP dans la
région CA1 (McNair et al. 2006). Il est donc probable qu’une étude équivalente menée dans le gyrus
denté apporte de nouvelles informations sur les protéines impliquées dans le maintien de la LTP dans
cette région. En outre, il serait intéressant de comparer les résultats obtenus dans les deux régions de
l’hippocampe, à condition de travailler aux mêmes délais. Cela permettrait d’avoir une idée plus
précise de la part des mécanismes de la LTP qui sont communs aux deux régions cérébrales ou, au
contraire, divergents.
Les méthodes basées sur l’utilisation de l’électrophorèse 2D se trouvent confrontées aux
limites inhérentes à cette technique. En effet, seule une quantité limitée de protéines peut être
incorporée dans les gels 2D. Les protéines de haut poids moléculaire, de pH extrême ou les protéines
hydrophobes sont particulièrement peu accessibles avec cette méthode. En outre, plusieurs protéines
peuvent se superposer dans un spot, rendant délicate l’interprétation des résultats d’une analyse
différentielle. Il existe d’autres façons d’aborder une étude différentielle, utilisant des méthodes horsgel, basées sur des marquages isotopiques différentiels. Nous avons eu l’occasion de citer la méthode
de l’H218O ou de l’ICAT mais la méthode iTRAQ serait probablement la mieux adaptée à notre
problématique parce qu’elle est particulièrement sensible et parce qu’elle donne accès à un très grand
nombre de protéines (Ross et al. 2004). Ces méthodes peuvent offrir un très bon niveau de séparation
des protéines grâce à l’utilisation successive de plusieurs étapes de chromatographie, même si elles
ne restent pas à l’abri de l’occlusion de protéines faiblement exprimées au profit des plus abondantes.
Elles permettent également de donner accès aux protéines membranaires qui sont d’un intérêt
particulier dans les phénomènes de plasticité synaptique.
129
C.
Elargissement de l’accès aux protéines par fractionnement subcellulaire
Malgré la qualité de ces différents outils, qui permettent d’accéder à un nombre toujours plus
grand de protéines avec une bonne résolution, le fait de travailler sur un tissu biologique entier risque
toujours de rendre certaines variations invisibles à l’œil de l’expérimentateur. En effet, différentes
échelles de variabilité introduisent des niveaux de complexité dans l’analyse d’extraits protéiques issus
d’un tissu. A l’échelle de la structure cérébrale, il peut y avoir des différences d’expression comme ça
peut être le cas entre le gyrus denté dorsal et ventral (Pandis et al. 2006). Au niveau du tissu,
plusieurs types cellulaires sont présents, qui peuvent participer de manière différentielle aux processus
biologiques étudiés (cellules neuronales principales ou interneurones, gliales ou endothéliales). Enfin,
au niveau cellulaire, les protéines ne sont pas exprimées de façon équivalente dans les différents
compartiments. Comme nous l’avons évoqué dans l’introduction, certaines protéines sont exprimées
spécifiquement dans les synapses, d’autres sont soumises à des transferts d’un compartiment à l’autre
au cours de la LTP. La composition protéique du soma n’est pas équivalente à celle des terminaisons
synaptiques. Ainsi, le fait de travailler sur un homogénat de tissu entier peut diluer les informations et
occulter certaines régulations locales.
Un moyen de pallier, au moins en partie, ces difficultés consiste à travailler sur une fraction
subcellulaire de l’échantillon biologique. Les méthodes de fractionnement permettent de travailler
spécifiquement sur des synaptosomes, sur la densité postsynaptique, voire sur des complexes
protéiques associés, par exemple, aux récepteurs du glutamate (Husi et al. 2000). De cette façon,
l’accès aux protéines faiblement exprimées est largement amélioré et certaines protéines spécifiques
de la fraction étudiée sont plus accessibles. Ainsi, le fractionnement subcellulaire permet, dans un
échantillon restreint, d’accéder à un plus grand nombre de protéines. Il est évident que la
multiplication des études basées sur le fractionnement donnera accès à un nombre bien plus large de
protéines que la simple étude des homogénats de tissus entiers.
Enfin, le fait de pouvoir accéder à des compartiments synaptiques et à des protéines
membranaires est particulièrement intéressant dans le domaine des neurosciences. Le travail récent
de Olsen et al. (2007) sur des études quantitatives de différentes régions cérébrales ouvre notamment
des perspectives pour l’étude différentielle des protéines membranaires à partir d’une quantité limitée
de tissu cérébral et il est envisageable de l’adapter à l’étude des protéines membranaires du gyrus
denté de l’hippocampe de rat (Olsen et al. 2007). La DIGE peut également offrir les moyens d’une
étude quantitative à partir d’une faible quantité de protéines, à condition des travailler sur des
protéines solubles. Toutefois, le fait d’effectuer des étapes de fractionnement, parce qu’elles sont
difficilement reproductibles, peut introduire un biais dans la quantification. Il faut donc rester vigilant
devant des études quantitatives différentielles basées sur des fractions subcellulaires.
130
D.
La part non contrôlée
génétiquement modifiés
des
variations
induites
chez
les
animaux
Pour l’étude du protéome des souris mutantes n’exprimant pas Zif268, nous avons également
utilisé une approche par électrophorèse 2D colorée au Bleu de Coomassie. Dans la mesure du
possible, nous avons travaillé sur des échantillons biologiques individuels (c’était le cas pour le cortex),
toutefois, pour le gyrus denté et les régions CA de l’hippocampe, nous avons été contraints de
rassembler les échantillons en raison de la faible quantité de protéines contenue dans ces deux
structures cérébrales chez la souris. A défaut d’identifier des cibles du facteur de transcription Zif268,
nous avons mis en évidence deux variations extrêmement reproductibles présentes dans toutes les
régions cérébrales étudiées chez les souris mutantes par rapport aux souris sauvages C57Bl/6. Le
séquençage des gènes correspondant aux protéines exprimées de façon différentielle nous a permis
de démontrer que ces variations étaient dues à la construction génétique des souris mutantes. En
effet, la région du chromosome qui se trouve à proximité du gène de zif268 a conservé l’haplotype
129/Sv de la souche utilisée pour générer les souris mutantes. Ces observations, nous ont permis
d’identifier de nouvelles isoformes des protéines mortaline et Histidyl-ARNt synthétase.
Les souris génétiquement modifiées dérivant de chimères entre 129 et C57Bl/6 sont
fréquemment utilisées en neurobiologie. En fonction du nombre de croisements en retour qui sont
effectués avec des souris sauvages C57Bl/6, la part de l’haplotype 129 peut varier, sans toutefois
devenir nulle. Le risque d’introduction d’un polymorphisme non contrôlé est donc non négligeable.
Gerlai a mis en garde contre les risques de biais comportementaux liés à ce polymorphisme (Gerlai
1996). De la même façon, notre étude a mis en évidence les risques de faux positifs dans des études
protéomiques différentielles basées sur la comparaison de ces animaux avec des souris sauvages. Ce
biais peut être dépassé par la vérification systématique de la localisation des gènes codant les
protéines identifiées. Toutefois, il interroge sur le choix des animaux contrôles dans le contexte de
l’étude des animaux génétiquement modifiés. Les animaux mutants conditionnels semblent prendre le
pas sur les modèles knockout conventionnels depuis plusieurs années et permettraient de réduire les
risques de modifications phénotypiques non spécifiques.
Indépendamment des différences évoquées ci-dessus, nous n’avons pas pu observer de
variation reproductible qui soit attribuable à l’absence de Zif268 chez les souris mutantes. Même si des
phénomènes de compensation par des facteurs de transcription proches peuvent atténuer les effets
de l’absence de Zif268, le fait de ne pas observer de variation reproductible est surprenant dans la
mesure où les souris mutantes présentent des déficits mnésiques et de plasticité synaptique (Jones et
al. 2001; Bozon et al. 2003a). De même que dans la partie précédente, les choix méthodologiques
peuvent expliquer en partie ces résultats. Il est possible également qu’une large part des protéines
cibles de Zif268 ne soient pas détectables dans des gels 2D parce qu’elles ont des pH trop basiques,
131
qu’elles sont hydrophobes ou tout simplement qu’elles sont trop faiblement exprimées à l’état basal.
Parmi les cibles de Zif268, on compte notamment de nombreux facteurs de transcription, qui sont
généralement exprimés en faible quantité (Pfenning et al. 2007). Le fait d’appliquer un électrochoc
aux animaux sauvages pourrait favoriser l’expression des cibles de Zif268. Cependant, pour cette
étude, une approche par une méthode hors-gel serait peut-être plus adaptée.
E.
Identification de nouvelles phosphoprotéines régulées au cours de la LTP
Dans cette partie du travail, nous avons identifié une quinzaine de protéines dont le niveau de
phosphorylation était modulé par la LTP. Parmi elles, plusieurs sont associées pour la première fois au
phénomène de LTP. Elles participent à différentes fonctions cellulaires telles que le métabolisme,
l’organisation du cytosquelette, la synthèse ou la conformation des protéines. Plusieurs protéines
appartenant aux mitochondries ont également été identifiées suggérant un rôle de régulation des
mitochondries au cours de la LTP.
Sur une quinzaine de protéines, il semble qu’il n’y ait pas de tendance majoritaire dans les
catégories de protéines régulées à chaque délai. Toutefois, des différences semblent se dégager en
fonction du temps. En effet, les protéines impliquées dans les mécanismes d’exocytose et
d’endocytose sont régulées de façon très précoce après l’induction de la LTP et reviennent à un état
stable à 90 min. A l’inverse, la protéine chaperonne n’est altérée qu’au délai le plus tardif. Cela
pourrait traduire des tendances générales dans la cinétique des mécanismes moléculaires de la LTP
avec une régulation très rapide des phénomènes de libération de neuromédiateurs ou d’insertion de
récepteurs à la membrane suivie d’une phase de néosynthèse et de repliement des protéines. Les
protéines impliquées dans le métabolisme, la synthèse protéique, la signalisation cellulaire ou
associées à la membrane semblent être impliquées à toutes les étapes de la phase précoce de la LTP
dans la mesure où elles sont régulées à plusieurs délais. Ceci est cohérent avec les données de la
littérature concernant notamment les protéines de signalisation et de la synthèse protéique. Enfin, en
dehors des protéines impliquées dans l’endocytose et l’exocytose, toutes les catégories de protéines
semblent être modifiées à 90 min, suggérant que l’impact de l’état de phosphorylation des protéines
dans l’expression de la LTP dépasse largement les premières phases temporelles, jusque là les plus
souvent étudiées. Le rôle des régulations de l’état de phosphorylation des protéines est probablement
fondamental jusqu’à la mise en place de mécanismes spécifiques du maintien de la phase tardive de la
LTP. Bien que les phosphorylations soient des modifications post-traductionnelles labiles, la succession
de plusieurs phases de régulations leur permet probablement de participer aux mécanismes durables
qui sous-tendent la phase tardive de la LTP.
Certaines des protéines que nous avons identifiées ont également été observées dans des
fractions membranaires ou des complexes protéiques synaptiques (Walikonis et al. 2000; Stevens et
132
al. 2003; Coughenour et al. 2004; Li et al. 2004a). Exprimées au niveau de la densité postsynaptique,
de la membrane plasmique ou des vésicules synaptiques, elles sont donc probablement impliquées
dans le contrôle de l’efficacité de la transmission synaptique via la régulation de leur état de
phosphorylation. Le fait d’avoir accès à des protéines qui sont exprimées dans les régions synaptiques
est un argument positif en faveur de la pertinence de la démarche utilisée. En outre, sur les 15
protéines identifiées, 12 sont déjà connues pour être phosphorylées dans des conditions
physiologiques. Ceci valide également la méthode utilisée et renforce nos résultats. Toutefois, le fait
de savoir que ces protéines sont phosphorylées et que leur niveau de phosphorylation est altéré au
cours de la LTP ne renseigne pas sur leurs modes de fonctionnement ni sur les conséquences
fonctionnelles de ces altérations. Afin de mieux comprendre les rôles et les interactions des protéines
que nous avons identifiées, d’autres types d’études devront être mises en œuvre.
Dans un premier temps, la recherche des sites de phosphorylation de toutes les protéines
identifiées par spectrométrie de masse en tandem sera le prolongement direct de notre étude. Elle
nécessitera la mise au point, au préalable, d’une étape de purification des peptides phosphorylés par
des colonnes d’affinité de type IMAC ou TiO2 afin d’améliorer l’accessibilité de ces peptides. Ces
données apporteraient des pistes pour comprendre comment les phosphoprotéines que nous avons
identifiées sont régulées et quelles conséquences la régulation de l’état de phosphorylation de ces
sites particuliers peut avoir sur leur activité. Ces informations seraient particulièrement intéressantes
pour les protéines dont le rôle a déjà été montré dans la LTP et dont plusieurs sites de
phosphorylation sont connus. Pour la CaMKIIα et la dynamine 1, en particulier, nous avons montré
que les sites qui variaient au cours de la LTP dans notre étude n’étaient pas les sites les plus étudiés.
Il est donc probable que d’autres sites participent à la régulation fonctionnelle de ces protéines au
cours de la LTP et leur identification permettrait d’aller plus loin dans la compréhension de ces
mécanismes.
Dans un second temps, quelques protéines d’intérêt, au moins, devront faire l’objet d’études
individuelles plus ciblées utilisant les méthodes classiques. En effet, le fait d’observer une modification
sur une protéine donnée avec une approche de protéomique différentielle ne constitue pas en soi une
preuve qu’elle joue un rôle dans la plasticité synaptique. Il faudra donc compléter ces données avec
des études pharmacologiques ou génétiques permettant d’étudier spécifiquement le rôle d’une
protéine au cours des différentes phases de la LTP. En outre, il serait intéressant de réaliser des
études similaires dans le contexte d’un apprentissage afin d’étudier le rôle de ces protéines dans
l’acquisition de la mémoire.
Pour conclure, l’ensemble de nos résultats a apporté des enseignements importants sur les
mécanismes de la LTP mais également sur la façon d’aborder des études biochimiques à large échelle
des protéines au cours de la plasticité synaptique. En effet, sur le plan méthodologique, nos travaux
133
rappellent la nécessité de bien définir les objectifs et le cadre d’une étude protéomique et de bien
connaître les avantages et les limites des différents outils utilisés pour en tirer des conclusions
biologiques fiables. Ils mettent particulièrement l’accent sur le choix et la bonne connaissance des
contrôles que l’on choisit d’utiliser. Sur le plan fonctionnel, les résultats que nous avons obtenus sur
les phosphoprotéines suggèrent que le phénomène de la LTP met en jeu des protéines très variées,
dans des mécanismes de régulation fins et complexes. Si dans un premier temps, les théoriciens de la
LTP ont voulu y voir un mécanisme basé sur un nombre limité de protéines clés, depuis plusieurs
années, la multitude d’informations sur les mécanismes moléculaires de la LTP tend à montrer qu’il
s’agit plutôt d’un phénomène très complet et complexe, mettant en jeu toutes les grandes fonctions
des cellules neuronales comme le métabolisme, la signalisation cellulaire, la régulation de la libération
des neurotransmetteurs, la régulation de l’efficacité de la transmission synaptique, la croissance des
neurites, la synthèse et la dégradation des protéines, la réorganisation du cytosquelette et de la
morphologie des synapses et, dans certaines régions, la neurogenèse. Malgré toutes ces données, les
mécanismes moléculaires de la LTP restent largement méconnus et la compréhension de l’intégralité
du phénomène nécessitera encore de nombreuses études. Dans cette optique, nos résultats ouvrent
de nouvelles pistes pour l’étude de protéines qui n’avaient pas encore été associées à la LTP.
134
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157
Annexes
158
Annexes
Annexe 1 : Protocole de coloration au nitrate d’argent
•
Fixation du gel 1 nuit dans 50 % MeOH, 12 % acide acétique, 0,05 % formaline
•
3 lavages de 20 min dans 35 % EtOH
•
Sensibilisation du gel dans 0,02 % Na2S2O3 pendant 2 min
•
3 lavages de 5 min dans de l’eau ultrapure
•
Coloration du gel dans 0,2 % AgNO3, 0,076 % formaline pendant 20 min
•
2 lavages de 1 min dans de l’eau ultrapure
•
Développement dans 6 % Na2CO3, 0,05 % formaline, 0,0004 % Na2S2O3 jusqu’à ce que la
coloration soit suffisante
•
Arrêt de la coloration avec 50 % MeOH, 12 % acide acétique pendant 5 min
•
Le gel est conservé dans 1 % d’acide acétique à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit scanné puis séché
159
Annexes
Annexe 2 : Mise au Point de la Coloration au Pro-Q® Diamond
Molecular Probes Inc., fabriquant du Pro-Q® Diamond annonce une sensibilité de l’ordre de 1
à 2 ng dans le cas de la β-caséine, qui possède 5 sites de phosphorylation, et de 8 ng dans le cas de
la pepsine, protéine monophosphorylée. En outre, la linéarité de la coloration peut aller d’un facteur
500 à 1000. N’ayant pas d’expérience avec ce nouveau colorant, nous avons d’abord vérifié ces
données. Par la même occasion, la spécificité du colorant pour les protéines phosphorylées a pu être
contrôlée.
Un mélange en solution d’ovalbumine (2 sites de phosphorylation), d’α et β-caséine
(respectivement 9 et 5 sites de phosphorylation) et de BSA (protéine non phosphorylée) a été préparé
à différentes concentrations. Chaque dilution a été séparée par électrophorèse SDS-PAGE 1D et
colorée au Pro-Q® Diamond puis au Bleu de Coomassie. Les bandes détectées sur l’image du gel
coloré au Pro-Q® Diamond ont pu être quantifiées grâce au logiciel Quantity One (Bio-Rad, Hercules,
CA) (Figure A-1).
BSA (66 kDa)
Ovalbumine (43 kDa)
β-caséine (24 kDa)
α-caséine (23 kDa)
Quantité de protéines déposées (ng)
280 140
70
35
17.5 8.8 4.4
0.7
Figure A-1 : Dilutions d’un mélange d’ovalbumine, α et β-caséine et BSA séparées par électrophorèse
1D et colorées au Pro-Q® Diamond.
Sur cette image, nous pouvons constater que la BSA donne un léger signal au Pro-Q®
Diamond à de fortes concentrations. Il faut donc être vigilant quant à la détection de faux positifs. On
conviendra donc de l’intérêt de la double coloration au Pro-Q® Diamond et Bleu de Coomassie qui
permet d’estimer l’abondance relative de la forme phosphorylée et de la forme totale de la protéine.
Concernant la sensibilité du colorant Pro-Q® Diamond, nous avons effectivement pu détecter
l’ovalbumine ainsi que la β-caséine jusqu’à 4 ng voire moins du ng. L’estimation de la linéarité est
représentée dans le graphique de la Figure A-2. Nous ne l’avons testée que sur 2 ordres de grandeur,
mais dans cette gamme, la coloration apparaît bien linéaire, avec un coefficient de régression de
0,9989.
160
Quantification Pro-Q Diamond
Annexes
60
50
40
30
20
10
0
0
100
200
300
Quantité de protéines (ng)
Figure A-2 : Courbe de linéarité de la
coloration au Pro-Q Diamond. La
quantification du signal est donnée en
pourcentage de la quantité totale de
signal détectée dans l’image. Le
coefficient de régression de la courbe est
de 0,9984.
La qualité de la détection par le Pro-Q® Diamond est donc tout à fait satisfaisante et adaptée
à une étude quantitative différentielle. Il subsiste cependant une limite à une bonne quantification du
signal : la présence de nombreux points très intenses contaminant le bruit de fond. Ces points
intenses, appelés « speckles », correspondent probablement à des points de précipitation du colorant,
comme c’est le cas pour le colorant fluorescent Sypro Ruby. Lorsqu’un speckle se trouve dans un spot
de protéine, il fausse la quantification de ce spot par le logiciel PDQuest. La visualisation systématique
des spots en 3D permet de vérifier la présence éventuelle de speckles. Chaque spot ainsi contaminé a
été exclu des analyses. Afin de limiter ce problème de bruit de fond, et encouragés par l’article de
Agrawal et Thelen (Agrawal and Thelen 2005), nous avons envisagé de diluer le colorant Pro-Q®
Diamond pour l’étape de coloration des gels. Une dilution au tiers du colorant dans de l’eau ultra pure
a permis de réduire sensiblement le bruit de fond lié aux speckles sans pour autant diminuer la
sensibilité. Agrawal et Thelen ont également montré que la linéarité n’était pas altérée par la dilution
du produit. En outre, cette réduction de la quantité de produit utilisé représente une économie non
négligeable compte tenu du coût de ce réactif fluorescent.
161
Annexes
Annexe 3 : Cartographie du Phosphoprotéome du Gyrus Denté de Rat
12
34
56
10
2
1
7 8
16
17
9
11
13
15
14
18
29
25 26
20 21
22
19
27
28
23 24
32
30
31
33
35
34
38
39
37
36
40
41
47
42
43
49
46
51
48
45
50
44
52
53
54
12
34
56
10
1
2
7 8
16
17
9
11
13
15
14
18
29
25 26
20 21
22
19
27
28
23 24
32
30
31
33
35
34
38
39
37
36
40
41
42
43
47
46
45
49
51
48
50
44
52
53
54
Figure A-3 : Cartographie partielle du phosphoprotéome de gyrus denté de rat. Les deux images
correspondent au même gel coloré au Bleu de Coomassie (A) ou au Pro-Q® Diamond.
162
Annexes
Nom de la protéine
N° Accès SwissProt
N° Acces
Mascot
Score
Mascot
Nombre de
peptides
Couverture
Séquence
MW
pI
5,42
1
Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A
gi/109493234
146
19/33
39%
68564
2
Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A
gi/109493234
179
25/47
44%
68564
5,42
3
Dihydropyrimidinase-related protein 2 (DRP-2)
P47942
gi/109501680
61
19/28
41%
62277
5,96
4
HSP70.1
Q07439
gi/47059179
145
17/31
29%
70184
5.61
P47942
gi/40254595
78
10/31
25%
62277
5,96
5
P47942
gi/40254595
191
23/32
48%
62277
5,96
6
P47942
gi/40254595
196
18/34
36%
62277
5,96
7
P47942
gi/40254595
183
21/24
45%
62277
5,96
8
P47942
gi/40254595
111
9/10
25%
62277
5,96
9
Seryl tRNA synthetase
Q6P799
gi/56090265
162
20/28
44%
58456
5,86
10
P47942
gi/40254595
271
26/35
56%
62277
5,96
11
Phosphoglucomutase-1 (PGM 1)
P38652
gi/730311
228
19/22
37
61271
6,33
12
Glycogen phosphrylase, brain form
P53534
gi/3485895
257
30/36
37%
96042
6,24
13
Adenylate cyclase-associated protein 2
P52481
gi/16758742
88
12/24
29%
52912
6,7
14
Splice isoform II b of synapsin 2
Q63537-2
gi/112350
110
14/30
35%
52454
8,05
15
Splice isoform II b of synapsin 2
Q63537-2
gi/112350
134
16/32
40%
52454
8,05
16
Guanine deaminase
Q9WTT6
gi/9910706
256
21/29
55%
51015
5,56
P04764
gi/56757324
109
11/26
32%
49956
5,36
P47819-2
gi/5030428
101
12/26
35%
48781
5,72
5,36
17
Enolase 1 alpha, non neural
GFAP
18
Enolase 1 alpha, non neural
P04764
14/28
38%
49956
19
Guanine nucleotide binding protein, alpha subunit 2
P30033
gi/232135
152
14/19
42%
39949
5,69
20
Transcriptional activator protein PUR-alpha (purine rich
element binding protein A isoform 1)
P42669
gi/6679573
145
13/22
38%
34976
6,07
21
MAPKK1 (MEK1)
Q01986
gi/13928886
224
22/40
48%
43333
6,21
22
MAPKK1 (MEK1)
Q01986
gi/13928886
243
19/24
39%
43333
6,21
23
Septin 5, isoform 2
Q9JJM9-2
9/35
35%
43920
6,33
24
Septin 5, isoform 3
Q9JJM9-3
25
Septin 2
26
Poly(rC)-binding protein 1; Alpha-CP1; hnRNP-E1
27
Aldolase C fructose biphosphate
P09117
28
Aldolase C fructose biphosphate
29
Pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit
30
Adaptin ear-binding coat associated protein 1 (NECAP1)
31
7/25
25%
40988
6,21
gi/16924010
135
13/28
46%
41592
6,15
gi/149036630
111
10/18
39%
36003
7,03
gi/6978489
156
12/19
36%
39152
6,79
P09117
gi/6978489
137
10/15
43%
39152
6,79
P26284
gi/109503594
111
9/12
21%
40191
6,82
P69682
gi|71361625
11/17
51%
29792
5,97
Isocitrate dehydrogenase subunit alpha
Q99NA5
gi/149041704
7/19
21%
36682
5,72
Transaldolase
Q9EQS0
6/19
16%
37460
6,57
Transaldolase
Q9EQS0
gi/149061610
14/19
35%
37460
6,57
33
NAD-dependent deacetylase sirtuin-2
Q5RJQ4
gi/149056443
117
14/25
42%
39319
6,66
34
3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase
P29266
gi/83977457
127
10/17
37%
31634
6,22
32
Q91Y81
68
155
35
similar to Esterase D/formylgluthatione hydrolase (prédit)
gi/109501878
146
16/41
74%
31971
6,44
36
Voltage-dependent anion-selective channel protein 2
P81155
gi/13786202
57
8/23
30%
31745
7,44
37
Ribose-phosphate pyrophosphokinase I
P60892
gi/4506127
223
21/36
61%
34703
6,57
38
Proteasome subunit alpha type 2
P17220
gi/8394063
150
13/17
56%
25795
7,13
39
Potassium channel tetramerisation domain containing
protein 4
Q9D7X1
gi/50980305
67
7/13
29%
29978
6,62
40
Eukaryotic translation initiation factor 4H
Q5X172
gi/55741853
108
11/23
47%
27192
6,92
41
Hypoxanthine guanine phosphorybosyl transferase
P27605
gi/51092266
77
15/35
54%
24477
6,07
42
Proteasome subunit alpha type 6
P60901
gi/8394076
109
12/20
41%
27399
6,35
43
Triosephosphatase isomérase
P48500
gi/117935064
150
18/37
76%
26717
7,06
44
Lactoylglutathione lyase
Q6P7Q4
gi/46485429
60
5/16
39%
20688
5,12
45
Phosphatidylethanolamine-binding protein
P31044
gi/8393910
78
5/17
32%
20670
5,47
Peroxiredoxin 2
P35704
gi/149037813
61
5/17
19%
21652
5,34
46
Proteasome subunit beta type 4
P34067
gi/149030731
100
8/18
38%
24366
5,96
47
Peroxiredoxin 3
Q9Z0V6
gi/149040547
102
10/28
71%
21649
5,8
48
DJ-1 protein
O88767
gi/16924002
122
14/32
79%
19974
6,33
15/32
60%
26497
6,33
gi/9790285
51
6/12
34%
20495
6,29
5/8
21%
41605
5,3
49
Gluthatione s-transférase Mu 5
Q9Z1B2
50
Similar to vacuolar protein sorting 29
Q9QZ88
51
Fragment d'actine
P60711
52
transgelin-3 (synonyme "neuronal protein NP25")
53
Sorcin
54
Glia maturation factor beta
P37805
gi/78214333
248
18/34
78%
22500
6,84
Q6P069-2
gi/12843188
141
11/22
52%
20296
5,11
Q63228
gi/13624295
142
12/24
56%
16605
5,31
Tableau A-1: Liste des protéines identifiées à partir d’un gel 2D de gyrus denté de rat coloré au ProQ® Diamond. Les étoiles marquent les protéines qui ont été identifiées avec les banques de souris.
163
*
*
*
*
Annexes
Annexe 4 : Liste des Illustrations
TABLEAUX
Tableau 1 : Variations d’expression des ARNm au cours de la LTP observées à partir de l’étude de
gènes candidats.
Tableau 2 : Variations d’expression des protéines au cours de la LTP, observées à partir de l’étude de
protéines candidates.
Tableau I-1 : Taux d’incorporation des protéines dans les strips par réhydratation passive pour 1 mg
de protéines.
Tableau I-2 : Taux de variation des 4 spots exprimés de façon différentielle entre les groupes
contrôles et LTP 24 h.
Tableau I-3 : Identification des protéines dont le niveau d’expression varie 24 h après induction de
la LTP dans le gyrus denté.
Tableau I-4 : Résultats de l’analyse statistique par test t des groupes de gels contrôles et LTP 6h
colorés au nitrate d’argent.
Table II-1: Summary of mass spectrometry analysis of proteins which phosphorylation state differs
after LTP.
Tableau A-1: Liste des protéines identifiées à partir d’un gel 2D de gyrus denté de rat coloré au ProQ® Diamond.
FIGURES
Figure 1 : (A) Localisation de l’hippocampe dans le cerveau du rat. (B) Coupe transversale
d’hippocampe, représentation de la boucle trisynaptique.
Figure 2 : Illustration de l’incorporation des récepteurs AMPA contenant la sous-unité GluR1 au cours
de la LTP.
Figure 3 : Schéma de l’activité des récepteurs NMDA, AMPA et métabotropiques du glutamate dans
des conditions de repos (A) ou après induction de la LTP (B).
Figure 4 : Modèle d’encodage spatial de l’induction des trois formes de LTP (LTP1, 2 et 3) régulé par
la localisation de la libération de Ca2+ dans les cellules neuronales.
Figure 5 : Illustration de l’implication de la CaMKII dans le processus d’exocytose.
Figure 6 : La voie des MAP kinases ERK1 et 2 se trouve à la convergence de nombreuses voies de
signalisation et agit à différents niveaux pour la régulation de la plasticité synaptique.
Figure 7 : Traduction locale dans les dendrites.
Figure 8 : L’induction de la LTP conduit à l’activation de gènes.
Figure 9 : Schéma de l’interaction de Zif268 avec l’ADN.
Figure 10 : Illustration schématique des trois types de régulations synaptiques associées à la LTP.
Figure 11 : Schéma général des stratégies utilisées en protéomique
Figure 12 : Schéma de principe d’un spectromètre de masse en tandem.
Figure 13 : Principales approche utilisées en protéomique quantitative.
Figure 14 : Principe de la méthode ICATTM.
Figure I-1 : Schéma de la structure d’un spectromètre de masse MALDI-TOF.
Figure I-11 : Photo du MALDI-TOF Voyager-DETM STR.
164
Annexes
Figure I-3 : (A) Localisation de l’hippocampe dans le cerveau de rat. (B) Coupe transversale
d’hippocampe.
Figure I-4 : Potentiel post-synaptique évoqué.
Figure I-5 : Illustration de la correspondance automatique des spots par rapport au gel « Master ».
Figure I-6 : Electrophorèse bidimensionnelle de gyrus denté : les spots correspondant à l’actine et à
la tubuline sont très largement majoritaires.
Figure I-7 : Spectre de masse MALDI-TOF acquis en mode positif avec réflectron, avec un voltage
d’accélération de 20 000 V. Plusieurs pics correspondant à la matrice ou à la trypsine peuvent servir
de référence interne pour calibrer le spectre.
Figure I-8 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au Bleu de Coomassie réalisée à partir de tissu
de cortex sur une gamme de pH 3-10 non linéaire.
Figure I-9 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au Bleu de Coomassie : dépôt d’un échantillon
de cortex dans une cupule
Figure I-10 : Electrophorèse bidimensionnelle réalisée à partir de gyrus denté couvrant la gamme de
pH 4-7 (A) ou 5-8 (B) (coloration au Bleu de Coomassie).
Figure I-11 : Electrophorèse bidimensionnelle colorée au nitrate d’argent réalisée à partir de
150 µg (A) ou 300 µg (B) de protéines de gyrus denté.
Figure I-12 : (A) Représentation de la forme des réponses post-synaptique avant et après tetanus.
(B) Pourcentage d’augmentation de la pente des PPSE après induction de la LTP dans le gyrus denté.
Figure I-13 : Expression différentielle du spot 5706 entre les groupes contrôles (3 gels du haut) et
LTP 6h (3 gels du bas).
Figure I-14 : Résultats de l’analyse statistique des gels contrôles et LTP 24 h.
Figure I-15 : Spectres de masse MALDI-TOF correspondant aux spots dont l’intensité est altérée
24 h après induction de la LTP dans le gyrus denté de l’hippocampe de rat.
Figure I-16 : Visualisation en 3 dimensions des spots situés dans l’encart rouge.
Figure I-17 : Résultats de l’analyse statistique des gels contrôles et LTP 6 h colorés au nitrate
d’argent.
Figure I-18 : Niveau d’expression du spot 8115 dans les gels contrôles (A) et LTP 24 h (B).
Figure I-19 : Représentation schématique du principe de la DIGE
Figure I-20 : Evolution du nombre de citations annuelles de la méthode DIGE depuis son
développement en 1997.
Figure II-1: Induction of LTP in the dentate gyrus. High frequency stimulation (black triangle) of the
perforant path induced stable LTP (filled circles) whereas pseudotetanus (empty circles) had no effect.
Figure II-2: 2-D gel electrophoresis from rat dentate gyrus stained with (A) Pro-Q® Diamond and
(B) Coomassie Blue. The spots which phosphorylation state is altered with LTP are numbered from 1
to 33.
Figure II-3: Zoom on spots 2, 3 and 4 corresponding to dynamin 1, stained with (A) Pro-Q®
Diamond and (B) Coomassie Blue.
Figure II-4: Western blotting of phospho-ERK1 and phospho-ERK2 at 0, 15 and 90 min following LTP
induction in the dentate gyrus (control: light bars, LTP: dark bars).
Figure II-5: Ratio of phosphorylated over total CaMKIIα (A) and dynamin1 (B) quantity measured by
western blotting at 0, 15 and 90 min following LTP induction in the dentate gyrus (control: light bars,
LTP: dark bars).
Figure II-6: Ratio of phosphorylated dynamin1 on Ser774 (light bars) and Ser778 (dark bars) over
total dynamin1 quantity measured by western blotting at the time point 0 min. Individual animals
show a high correlation of phosphorylation state on the two sites.
165
Annexes
Figure A-1 : Dilutions d’un mélange d’ovalbumine, α et β-caséine et BSA séparées par électrophorèse
1D et colorées au Pro-Q® Diamond.
Figure A-2 : Courbe de linéarité de la coloration au Pro-Q Diamond.
Figure A-3 : Cartographie partielle du phosphoprotéome de gyrus denté de rat.
166
Annexes
Annexe 5 : Liste des Acronymes
AEBSF
4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride
AKAP
A-Kinase Anchoring Protein
AKT
Protéine Kinase B
AMPA
α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionate
AP5
Acide 2-amino 5-phosphonopentanoïque
Arc
Activity regulated cytoskeletal-associated protein
BDNF
Brain Derived Neurotrophic Factor
CA
Corne d’Ammon
CaMKII
Ca2+/Calmoduline kinase II
CHAPS
3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propanesulfonate
CID
Collision-Induced Dissociation
CREB
cAMP Response Element-Binding
DIGE
Differential in Gel Electrophoresis
ECD
Electron Capture Dissociation
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
eEF2
eukaryotic Elongation Factor 2
Egr
Early Growth Response
eIF4E
eukaryotic Initiation Factor 4E
ESI-MS
Electrospray Ionisation Mass Spectrometry
FTICR
Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance
GABA
Gamma-Aminobutyric Acid
ICAT
Isotope-Coded Affinity Tags
IMAC
Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography
IPG
Immobilized pH Gradient
iTRAQ
isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification
LTD
Long Term Depression
LTP
Long Term Potentiation
MALDI-TOF
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation – Time of Flight
MAP-2
Microtubule Associated Protein 2
MAPK-ERK
Mitogen-Activated Protein Kinase – Extracellular signal-Regulated Kinase
MEK
MAPK-ERK Kinase
MS/MS
Spectrométrie de Masse en tandem
NMDA
N-méthyl-D-aspartate
pI
point Isoélectrique
PI3K
Phosphoinositide 3 Kinase
167
Annexes
PKA
Protéine Kinase A
PKC
Protéine Kinase C
PMF
Peptide Mass Fingerprint
PPSE
Potentiel Postsynaptique Excitateur
PSD
Postsynaptic Density
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
168