La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G
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La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G
Mémoire bibliographique La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G Marina Lavigne Claire Portugal Année 2007-2008 Résumé Les GPCRs ou récepteurs couplés aux protéines G permettent la communication intercellulaire de par leur diversité. En effet, ils sont capables de reconnaître différentes molécules transportant l’information extracellulaire ainsi que des stimuli sensoriels. Tous les GPCRs possèdent une structure commune constituée de 7 hélices transmembranaires, une extrémité N-terminale extracellulaire et une extrémité C-terminale intracellulaire permettant l’interaction avec les protéines G qui leur sont spécifiques. Malgré leur grande diversité, le mécanisme de transduction du signal est conservé. Le GPCR est activé par fixation de son agoniste, ce qui induit des changements conformationnels. Il peut alors interagir avec sa protéine G partenaire, qui une fois activée, pourra réguler l’activité de divers effecteurs. Il y a encore une vingtaine d’années, le modèle d’activation des protéines G décrivait un récepteur monomérique. Cependant, de nombreuses études ont depuis mis en évidence l’homo- et l’hétérodimérisation des GPCRs. En particulier, pour le récepteur au leukotriène B4 : BLT1, il a été montré qu’il homodimérise quand il est solubilisé dans du détergent après expression chez E. coli. En effet, il semblerait que ce récepteur interagisse avec sa protéine G associée sous forme d’un complexe pentamérique impliquant un dimère de BLT1 et une protéine G hétérotrimérique. Cependant, le récepteur monomérique est capable d’activer la protéine G, mais l’activation complète de cette dernière nécessite la dimérisation. Les études antérieures ont été menées uniquement in vitro, mais aucune preuve n’a été apportée sur le fait que BLT1 homodimériserait in vivo. Notre projet de recherche présente différentes expériences dont le but est de démontrer la validité du modèle de BLT1 dimérique in vitro puis in vivo. Pour cela, nous proposons de réaliser de l’immunoprécipitation sur des membranes de leucocytes humains ainsi que des expériences de BRET menées sur des cellules Cos-7 exprimant notre récepteur recombinant. 2 Sommaire Résumé Sommaire I. INTRODUCTION 1. Structure des GPCRs 2. Mécanisme général de la transduction du signal 3. Dimérisation des GPCRs 4. Importance des phénomènes de dimérisation a. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmique b. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteur c. Rôle de la dimérisation dans l’internalisation 5. Le récepteur BLT1 II. RESULTATS 1. Matériels et méthodes 2. Activation de la protéine G 3. Changements conformationnels de l’hétérodimère R : R0 induits par l’agoniste a. Changements conformationnels du récepteur R b. Changements conformationnels du récepteur R0 4. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 en présence de concentration saturante de LTB4 L L a. Hétérodimère R : R0 b. Homodimère RL : RL 5. Conclusion III. PROJET DE RECHERCHE 1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitro 2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivo a. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytes b. Expériences de BRET c. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT1 3. Perspectives Bibliographie 3 I. Introduction Les GPCRs (G-Protein-Coupled Receptors) forment la famille de protéines membranaires la plus vaste (30%) et les gènes codant pour ces récepteurs représentent entre 1 et 5 % du génome selon l’organisme. Les GPCRs se retrouvent chez les protozoaires, les métazoaires diploblastiques les plus anciens, les plantes, les levures, le nématode C. elegans, la drosophile et les vertébrés (Bockaert et Pin, 1999 ; Bockaert et al., 2002). Le rôle des GPCRs est de permettre une communication intercellulaire car leur diversité confère la reconnaissance de différentes molécules transportant l’information extracellulaire (hormones, neurotransmetteurs, facteurs de croissance et de développement) et des stimuli sensoriels (lumière, molécules olfactives et gustatives). La fixation de l’agoniste entraîne leur activation : ils sont alors capables d’activer les protéines G spécifiques auxquelles ils sont couplés. Ces dernières pourront alors stimuler ou inhiber différentes voies de signalisation (Bockaert et Pin, 1999 ; Gether, 2000 ; Kobilka, 2002). 1. Structure des GPCRs La caractéristique structurale commune à tous les GPCRs est la présence de 7 hélices transmembranaires connectées par trois boucles extracellulaires (E1 à E3) et trois boucles intracellulaires (I1 à I3). L’extrémité N-terminale est positionnée du côté extracellulaire, tandis que la queue C-terminale est positionnée du côté intracellulaire et permet, entre autres, l’interaction avec les protéines G intracellulaires (figure 1) (Bockaert et al., 2002). En fonction de leur topologie, il a été établi un classement des GPCRs : ils se divisent en trois classes principales qui possèdent toutes un pont disulfure entre les boucles E1 et E2. La classe A est la famille la plus vaste et la plus étudiée qui regroupe notamment la rhodopsine, les récepteurs olfactifs et les récepteurs adrénergiques. Elle est caractérisée par une faible homologie de séquence avec uniquement quelques résidus clés conservés : le domaine DRY localisé au niveau de la boucle I2. Cette région est particulièrement importante lors de la transduction du signal via la protéine G associée. Pour la majorité de ces récepteurs, le site actif est localisé au niveau du domaine transmembranaire. La classe B regroupe quant à elle 4 une vingtaine de GPCRs sensibles aux hormones, dont les récepteurs au glucagon, à la calcitonine, et à la GnRH (Gonadrotopin-Releasing Hormone). Elle ne présente pas de caractéristique commune avec la classe A et se distingue par un domaine Nterminal important (environ 100 résidus). C’est d’ailleurs au niveau de ce domaine que se fixent les ligands. Enfin, la classe C regroupe les récepteurs métabotropiques au glutamate et au GABAB (γ-Amino-Butyric Acid), le récepteur au calcium et les récepteurs aux goûts sucré et unami (Kolakowski, 1994 ; Bockaert et al., 2002). Ici, c’est le domaine N-terminal, appelé Venus flytrap, qui est caractéristique de par son importance (entre 500 et 600 résidus) et sa structure bilobée au niveau de laquelle vient se fixer le ligand. Figure 1 : Topologie des GPCRs L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils présentent trois boucles extracellulaires (E1 à 3) et trois boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4. 2. Mécanisme général de la transduction du signal Malgré la grande diversité des GPCRs, le mécanisme fondamental de transduction du signal est conservé (figure 2.A) (Bockaert et Pin, 1999 ; Gether, 2000 ; Kobilka, 2002). 5 Le GPCR au repos est activé après interaction avec son agoniste au niveau du domaine extracellulaire ou du domaine transmembranaire. Cette fixation entraîne des changements de conformation du GPCR : on observe une rotation de TM6 dans le sens des aiguilles d’une montre, ainsi qu’un mouvement relatif des TMs 3 et 6 (ce qui résulte en leur éloignement) (figure 2.B) (Kobilka, 2002). Le récepteur ainsi activé peut interagir, grâce à sa partie intracellulaire, avec les sous-unités α et βγ de la protéine G. Au niveau de la sous-unité α de la protéine G ainsi activée, on observe un échange GDP-GTP, et les sous-unités α et βγ sont dissociées. Les 2 sous-unités vont alors pouvoir réguler l’activité de divers effecteurs membranaires ou cytosoliques. Ces effecteurs sont, en général, des canaux ioniques ou des enzymes productrices d’un second messager assurant une amplification considérable du signal. Enfin, de par l’activité GTPase intrinsèque de la sous-unité α, la protéine G est alors réassociée, ce qui stoppe l’interaction avec les effecteurs. Il est à noter que tant que le récepteur est activé par son ligand, le cycle d’échange GDP-GTP peut continuer. A Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels relatifs du domaine transmembranaire A. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Le changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cette liaison, permet l'activation de l'échange du GDP par du GTP et donc l'activation de la protéine G hétérotrimérique : les sous-unités Gα et Gβγ intracellulaires (3) vont aller réguler l'activité de divers effecteurs membranaires ou cytosoliques (4). Le déclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité Gα entraîne la réassociation des sous-untités Gα et Gβγ (5) et le retour à l'état initial (1). B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne des changements conformationnels. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre de TM6 et un éloignement des TMs 3 et 6. 6 Il existe trois grands mécanismes permettant de mettre fin au signal induit par le stimulus extracellulaire : c’est la désensibilisation (Perron et al., 2003 ; Perez et Karnik, 2005). Le premier est la régulation de la concentration en agoniste. Lorsque le ligand est relargué dans une fente synaptique, très souvent, deux processus entraînent une diminution de la concentration synaptique en agoniste : il s‘agit de la recapture pré-synaptique et de la dégradation de l’agoniste par des enzymes spécifiques. Le deuxième mécanisme est le découplage fonctionnel par phosphorylation et l’internalisation du complexe ligand-récepteur (figure 3). ↓ Figure 3 : Internalisation d’un GPCR Le récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par une GRK (G-protein Receptor Kinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine qui induit son endocytose clathrinedépendante. Il sera alors, soit recyclé à la membrane après déphosphorylation et élimination de l’agoniste, soit dégradé après fusion de la vésicule d’endocytose avec le lysosome. Le couplage GPCR-protéine G est peu à peu inhibé grâce à une phosphorylation par les GRK (G-protein Receptor Kinases), la PKA (Protein Kinase A) ou la PKC (Protein Kinase C) de la région intracellulaire du récepteur responsable de l’activation des protéines G. Le récepteur phosphorylé est alors reconnu par des protéines arrestines qui se lient au récepteur, et empêchent donc l’échange GDP-GTP au niveau de la 7 protéine G. Après liaison des arrestines, le complexe ligand-récepteur est internalisé dans des vésicules recouvertes de clathrine. Les récepteurs endocytés peuvent ainsi subir un recyclage à la membrane plasmique (ce qui nécessite une déphosphorylation du récepteur et une élimination du ligand), ou une dégradation avec la fusion des vésicules d’endocytose avec les lysosomes. Enfin, la désensibilisation peut faire intervenir la régulation du nombre total de récepteurs à la surface cellulaire lors d’une exposition longue à l’agoniste. Deux phénomènes sont impliqués : une diminution de la synthèse des récepteurs et une augmentation de leur dégradation. 3. Dimérisation des GPCRs Jusqu’à il y a peu de temps, on estimait que les GPCRs existaient et fonctionnaient en tant que monomères. Cependant, de nombreuses études biochimiques et biophysiques ont permis de mettre en évidence des homo- et hétérodimères de GPCRs (Milligan, 2004 ; Bulenger et al., 2005). Il semblerait que, pour la plupart (en particulier ceux de la classe C), la dimérisation soit constitutive et se produise tôt lors de la biosynthèse, à savoir au niveau du réticulum endoplasmique (Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005). Dans un dimère, la zone de contact des GPCRs est située au niveau de leur domaine membranaire, en particulier au niveau de TM6. Un modèle de dimérisation a été proposé, dans lequel les hélices transmembranaires des GPCRs participent à la formation d’un « swapping domain » (figure 4) (Goudson et al., 2000). Ce modèle illustre des résultats expérimentaux obtenus sur des mutants incapables de fixer l’agoniste quand ils sont exprimés seuls et qui recouvrent cette capacité quand d'autres récepteurs fonctionnels sont coexprimés (Monnot et al., 1996). Dans ce modèle proposé, modèle "swapping", la dimérisation des récepteurs fait apparaître deux sites actifs similaires à celui du monomère, mais constitué des domaines transmembranaires provenant des deux monomères (Goudson et al., 2000). Cependant, cette hypothèse est largement controversée. Dans le cas des récepteurs à la dopamine D2 (D2DR), des expériences réalisées par coexpression d’un mutant ponctuel (muté en TM3) avec un mutant tronqué (ne possédant que les TMs 1 à 5) ne permettent pas de restaurer des propriétés de liaison avec leur ligand. Ceci démontre, qu’au moins dans le cas des D2DRs, les TMs 1 à 5 ne peuvent pas 8 réaliser de « swapping » avec les TMs 6 et 7 (Lee et al., 2000). Cette étude, ainsi que d’autres, remettent en cause ce mécanisme de dimérisation pour tous les autres GPCRs. B Figure 4 : Modèle de dimérisation : le « swapping-domain » A. Les deux protomères sont caractérisés par un site de fixation. Ces deux sites de fixation sont reformés après dimérisation par « swapping ». Le « swapping » consiste en l’interaction entre différents TMs des deux protomères afin de constituer un dimère fonctionnel. B. Dans le cas de protomères mutés incapables de fixer leur agoniste, on s’attend à ce que la dimérisation par « swapping » restaure la capacité de liaison à l’agoniste. 4. Importance des phénomènes de dimérisation a. Rôle de la dimérisation dans l’adressage à la membrane plasmique L’export du réticulum endoplasmique est l’étape limitante de la maturation des GPCRs puisque les récepteurs mal "foldés" ou possédant un signal de rétention sont retenus dans le réticulum endoplasmique. La dimérisation intervient alors en permettant de masquer ces signaux de rétention ou des patchs hydrophobes de ces récepteurs, ce qui permet le transport du récepteur dimérique au niveau de la Supprimé : Supprimé : : le récepteur dimérique pourra ainsi être transporté jusqu’à la membrane plasmique membrane plasmique via la voie de la sécrétion. 9 Dans l’exemple du récepteur GABAB, une hétérodimérisation précoce dans le réticulum endoplasmique est obligatoire. Le récepteur GABAB1 possède un signal de Supprimé : e Supprimé : Ainsi, la sous-unité rétention au réticulum endoplasmique dans sa partie C-terminale et ne peut être exprimé à la membrane plasmique que s'il est associé au récepteur GABAB2. Mis en forme : Indice L’hétérodimérisation de ces récepteurs est assurée par une interaction coiled-coil de leurs extrémités C-terminales, interaction qui masque le signal de rétention du Supprimé : peut être exprimée à la surface cellulaire Mis en forme : Indice récepteur GABAB1 (Jones et al., 1998 ; Robbins et al., 2001). b. Rôle de la dimérisation dans l’activation du récepteur Pour le récepteur GABAB, l’hétérodimérisation de GABAB1 et GABAB2 est nécessaire pour l’obtention d’un récepteur fonctionnel (Galvez et Pin, 2003 ; Pin et Supprimé : En effet, son association, notamment via une interaction de type coiled-coil en C-terminal, masque le signal de rétention et permet l’adressage à la membrane plasmique d’un récepteur fonctionnel al., 2005). Dans le dimère, GABAB1 fixe l’agoniste tandis que GABAB2 en est incapable. En revanche, GABAB1 ne peut pas activer les protéines G. La formation de l’hétérodimère est donc indispensable pour permettre une transactivation où GABAB1 fixe l’agoniste et GABAB2 active la protéine G (figure 5). Figure 5 : Rôle de la dimérisation dans l’activation des GPCRs : le récepteur au GABAB Le récepteur au GABAB est un hétérodimère constitué de 2 protomères : GABAB1, seul capable de fixer l’agoniste et GABAB2, seul capable d’activer la protéine G. La dimérisation se fait par interaction de type coiled-coil entre les extrémités C-terminales des 2 protomères. Elle permet de former le récepteur fonctionnel par transactivation des 2 protomères. Un protomère est constitué de 2 lobes (LB) formant le domaine Venus-flytrap et d’une partie transmembranaire. Les flèches + jaunes représentent la transactivation entre les 2 protomères. La flèche + bleue représente l’activation de la protéine G par le dimère. 10 Supprimé : ed c. Rôle de la dimérisation dans l’internalisation Pour beaucoup d’hétérodimères, la stimulation d’un seul des protomères est suffisante pour entraîner la co-internalisation des deux protomères (Perron et al., 2003). Dans d’autres cas, certains récepteurs qui ne subissent pas d'internalisation après leur interaction avec leur ligand, empêchent l'internalisation des récepteurs auxquels ils sont associés. C’est le cas en particulier du récepteur aux opioïdes κ qui inhibe l’endocytose du récepteur aux opioïdes δ (Terrillon et Bouvier, 2004). Supprimé : ne peuvent pas subir d’endocytose induite par le ligand agissent comme des dominants négatifs après hétérodimérisation avec un récepteur capable d’endocyter : Supprimé : c 5. Le récepteur BLT1 Le récepteur BLT1 au LTB4 (LeukoTriène B4) est un GPCR de classe A, le Supprimé : seul GPCR à avoir été exprimé dans E. coli puis correctement "foldé". D’une part, BLT1 isolé est essentiellement sous forme dimérique (l’interaction entre les deux protomères se fait au niveau de leur TM6), en présence ou en Supprimé : s absence d’agoniste. D’autre part, quand le ligand LTB4 se fixe sur son récepteur, la Supprimé : conformation dimérique forme dimérique de ce récepteur est stabilisée (Banères et Parello, 2003). Le récepteur dimérique interagit avec la protéine G sous forme d’un complexe pentamérique (LTB4-BLT1)2-Gαβγ. Dans le pentamère, il est possible que chaque Supprimé : serait protomère interagisse avec des loci différents de la protéine G. De plus, dans le récepteur BLT1 homodimérique, un phénomène coopératif a été mis en évidence puisque la fixation de l’agoniste sur un seul des protomères induit des changements conformationnels du protomère associé libre de tout ligand Supprimé : non-chargé (Mesnier et Banères, 2004). Enfin, lors de la formation du complexe pentamérique, on observe une augmentation de l’affinité du récepteur pour l’agoniste. Ce changement d’affinité est probablement lié à des changements conformationnels du récepteur quand il interagit avec la protéine G (Banères et Parello, 2003). Il apparaît donc que la protéine G contrôlerait les changements conformationnels du récepteur BLT1 dimérique. Dans la publication « Asymmetric Conformational Changes in a GPCR Dimer Controlled by G-Proteins » parue en 2006 dans « The EMBO Journal », Damian et al. ont étudié cette hypothèse sur le récepteur BLT1. Supprimé : en Supprimé : travaillant Supprimé : dimérique 11 II. Résultats Dans cette publication, les auteurs ont choisi d’étudier les changements conformationnels de chaque monomère de récepteur BLT1 lors de la formation du dimère. Les auteurs ont analysé à la fois les changements conformationnels résultant Supprimé : O Supprimé : été de la fixation de l’agoniste LTB4 sur un ou deux des protomères, et l’influence du couplage avec la protéine G sur ces changements conformationnels. 1. Matériels et méthodes Les auteurs ont travaillé majoritairement sur l’hétérodimère de BLT1 R : R0 (reconstitué dans un environnement de micelles lipidiques) composé du récepteur sauvage R et du récepteur mutant R0. Ce mutant de BLT1 est caractérisé par une mutation de sa cystéine97 (localisée au niveau de l’hélice transmembranaire TM3) en alanine. Cette mutation ponctuelle n’affecte pas la structure du récepteur R0. En revanche, son affinité pour l’agoniste LTB4 est réduite de 100 fois (la constante de dissociation de BLT1 passe ainsi de 1,8.10-9 M pour le récepteur sauvage R à 2,4.10-7 M pour le récepteur mutant R0) (Mesnier et Banères, 2004). Du fait de cette différence d’affinité pour LTB4 entre les protomères de l’hétérodimère, il est possible de charger l’agoniste de façon séquentielle. Ainsi, à faible concentration, LTB4 se fixe sur le site de haute affinité du protomère R, tandis qu’en concentration saturante, Supprimé : sur le site de plus faible affinité LTB4 sera fixé à la fois sur les sites des récepteurs sauvage et du mutant. Afin de suivre l’activation du dimère de BLT1, et donc ses changements conformationnels, on fait appel à la fluorescence intrinsèque du tryptophane (Trp). Afin de simplifier l’analyse en faisant abstraction de possibles interférences dans les spectres d’émission de fluorescence, tous les résidus Trp (excepté le résidu Trp234 du protomère d’intérêt) ont été mutés en leucines dans les protomères du dimère d’étude. Le choix de suivre l’émission de fluorescence du Trp234 a été fait en prenant en compte les caractéristiques de ce résidu. D’une part, le Trp234 est localisé dans TM6 qui est connu comme étant le principal domaine impliqué lors de la dimérisation. 12 Supprimé : dans la D’autre part, le Trp234 est le seul résidu de BLT1 dont les propriétés de fluorescence Supprimé : ie sont sensibles à l’activation du récepteur. Dans le but d’analyser uniquement les changements du protomère d’intérêt (R ou R0 selon l’expérience), le Trp234 de ce protomère a été marqué par l’ajout d’un groupement hydroxy en position 5 (5-OH-Trp234) lors de la biosynthèse dans une souche d’E. coli auxotrophe pour le Trp. Ainsi, il a été aisé de suivre les changements de conformation du récepteur en excitant sélectivement le 5-OH-Trp à 315 nm et en suivant la fluorescence spécifique à 337 nm. En complément de l’analyse des changements conformationnels du dimère de BLT1 induits par la fixation de l’agoniste, les auteurs ont étudié le couplage du récepteur à la protéine G en observant sa capacité à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α de la protéine G. Pour cela, ils ont utilisé l’analogue non-hydrolysable du GTP marqué au soufre 35 ([35S]GTPγS), et ils ont suivi sa fixation en fonction du temps. En comparant la catalyse de l’échange GDP-GTP par le récepteur BLT1 recombinant produit dans E.coli et le récepteur natif dans des fractions membranaires de cellules Chem-1 (lignée adhérente de rat, Chemicon) stablement transfectées avec la séquence du BLT1 humain, il apparaît que le récepteur recombinant est un bon modèle car il active les protéines G de la même manière que le récepteur in vivo (figure 6). 13 Supprimé : Figure 6 : Comparaison de la capacité des récepteurs recombinant et natif à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α On observe la fixation de [35S]GTPγS au niveau de la sous-unité α de la protéine G couplée avec le récepteur BLT1 recombinant exprimé chez E. coli (A), ou le récepteur BLT1 natif exprimé dans des 35 fractions membranaires (B). Les profils de fixation de [ S]GTPγS étant similaires pour les deux types de récepteurs, on considère que le récepteur exprimé chez E. coli est un bon modèle pour l’étude de l’activation de la protéine G. 2. Activation de la protéine G L’hétérodimère R : R0 peut se présenter sous trois formes : ¾ L’état R : R0 dans lequel les deux protomères du dimère sont libres, ¾ L’état RL : R0 dans lequel seul le protomère R possédant le site de fixation de haute affinité est chargé par LTB4 présent en faible concentration, ¾ L’état RL : R0L dans lequel les deux sites de haute et faible affinités sont chargés par LTB4 présent en concentration saturante. Supprimé : Pour les états RL : R0 et RL : R0L, les mêmes profils de fixation du GTP ont été observés (figure 7.A), ces profils étant caractérisés par une augmentation de la fixation de [35S]GTPγS en fonction du temps. Ce résultat a permis de conclure que la 14 Supprimé : ’amener à la Supprimé : sion fixation de l’agoniste LTB4 sur un seul des protomères du dimère de BLT1 suffit à l’activation complète de la protéine G associée. Etant donnés ces résultats, les auteurs se sont interrogés sur la nécessité de la dimérisation pour l’activation de la protéine G. Afin de répondre à cette question, le complexe pentamérique formé par la protéine G hétérotrimérique et le dimère de BLT1 chargé par deux molécules de LTB4 a été mis en présence du peptide isolé TM6 (Banères et Parello, 2003). Ce peptide permet de dissocier le dimère, et ainsi d’observer la capacité du monomère à catalyser l’échange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α de la protéine G, c’est-à-dire à activer la protéine G (figure 7.B). Pour le monomère sauvage, de même que pour le monomère mutant, sa capacité à activer la protéine G a été mise en évidence. Cependant, l’échange GDP-GTP qui a pu être observé est plus lent que pour la forme dimérique du récepteur. Ceci indique que, bien que la protéine G puisse être activée par la forme monomérique de BLT1, son activation complète nécessite la dimérisation du récepteur. 35 Figure 7 : Fixation de [ S]GTPγS à la protéine G, en Supprimé : présence du dimère R : R0 à demi-chargé ou complètement chargé ou en présence du monomère BLT1 chargé par LTB4 A. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α catalysé par le dimère en absence d’agoniste (cercles), après fixation de l’agoniste sur le site de haute affinité de R (carrés), et en concentration saturante en LTB4 (triangles). B. Echange GDP-GTP au niveau de la sous-unité α catalysé par le récepteur BLT1 sauvage en présence de concentration saturante en LTB4, et en absence (cercles vides) ou en présence (cercles remplis) du peptide TM6. 15 3. Changements conformationnels de l’hétérodimère R : R0 induits par l’agoniste Supprimé : e R a. Changements conformationnels du récepteur R Afin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomère sauvage au niveau de l’hétérodimère R : R0, celui-ci a été marqué par le 5-OH-Trp Supprimé : Supprimé : celui-ci a été marqué avec le en position 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB4 en présence ou non de protéine G. Il est apparu qu’en absence ou en présence de protéine G, les changements conformationnels subits par R après fixation de LTB4 séquentiellement sur R et R0 sont identiques. A faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe au niveau du site de L haute affinité de R (état R : R0), R se retrouve alors dans son état complètement actif. De plus, R ne subit pas de changement conformationnel supplémentaire en concentration saturante de LTB4. Dans ces conditions, une deuxième molécule de L L LTB4 se fixe au niveau du site de faible affinité de R0 (état R : R0 ) (figure 8). Supprimé : quand Supprimé : la Supprimé : est Mis en forme : Indice Supprimé : Lorsqu’en Supprimé : Supprimé : quand, en concentration Figure 8 : Activation du protomère R dans l’hétérodimère R : R0 en absence et présence de protéine G A. En absence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et changements normalisés dans la fluorescence du 234 du protomère R (carrés remplis) en 5-OH-Trp fonction du log de la concentration en LTB4. B. En présence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et changements normalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp234 du protomère R (carrés remplis) en fonction du log de la concentration en LTB4. L L L Les états R : R0 et R : R0 sont indiqués sur la courbe. 16 b. Changements conformationnels du récepteur R0 Supprimé : Afin de suivre sélectivement les changements conformationnels du protomère mutant au niveau de l’hétérodimère R : R0, celui-ci a été marqué avec le 5-OH-Trp en position 234. Puis, l’hétérodimère a été stimulé avec l’agoniste LTB4 en présence ou non de protéine G. Les résultats obtenus se sont avérés différents de ceux obtenus pour le protomère sauvage (figure 9). En absence de protéine G (figure 9.A), l’activation du récepteur R0 se fait en Supprimé : Tout d’abord, lorsqu’e deux temps. En faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe sur le site de haute affinité de R (état RL : R0), R0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaire Supprimé : nfin, lorsqu’e entre les états inactif et actif. En concentration saturante, LTB4 se fixe au niveau du site de faible affinité de R0 (état RL : R0L), le récepteur mutant entre ainsi dans son état complètement actif. En présence de protéine G (figure 9.B), tout comme en absence de protéine Supprimé : , lorsqu’e G, en faible concentration d'agoniste, LTB4 se fixe sur le site de haute affinité de R (état RL : R0), R0 passe alors dans un état conformationnel intermédiaire. En revanche, en concentration saturante, la deuxième molécule de LTB4 se fixe sur R0 (état RL : R0L), mais R0 ne subit alors pas de changement conformationnel supplémentaire et reste donc dans son état intermédiaire. Figure 9 : Activation du protomère R0 dans l’hétérodimère R : R0 en absence et présence de protéine G A. En absence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et changements normalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp 234 du protomère R0 (carrés remplis) en fonction du log de la concentration en LTB4. B. En présence de protéine G, fixation de LTB4 sur R : R0 (ratio de fixation X, carrés vides) et changements normalisés dans la fluorescence du 5-OH-Trp 234 du protomère R0 (carrés remplis) en fonction du log de la concentration en LTB4. Les états RL : R0 et RL : R0L sont indiqués sur la courbe. 17 Ces résultats ont permis de souligner le fait que le couplage du dimère BLT1 à la protéine G influence les changements conformationnels du récepteur, notamment en empêchant le protomère R0 d’atteindre sa conformation pleinement active. 4. Caractéristiques conformationnels du dimère BLT1 en Supprimé : complètement chargé Mis en forme : Indice présence d'une concentration saturante de LTB4 a. Hétérodimère RL : R0L En absence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, les deux protomères de l’hétérodimère présentent les mêmes spectres d’émission de fluorescence, et donc les mêmes caractéristiques conformationnels. En effet, R et R0 se retrouvent tous deux dans leur état complètement actif (figure 10.A). Cependant, en présence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, les spectres d’émission de fluorescence de R et R0 diffèrent. Seul le protomère sauvage atteint l’état complètement actif tandis que le protomère mutant reste bloqué dans l’état intermédiaire (figure 10.B). Ces résultats indiquent que la protéine G induit une conformation asymétrique du dimère BLT1. Figure 10 : Conformations de R et R0 en absence ou en présence de protéine G A. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R0 marqués au 5-OH-Trp, en absence de protéine G et en absence ou présence de concentration saturante en LTB4. B. Spectre d’émission de fluorescence de R ou R0 marqués au 5-OH-Trp, en présence de protéine G et en absence ou présence de concentration saturante en LTB4. 18 b. Homodimère RL : RL En absence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, les protomères sauvages présentent les mêmes spectres d’émission de fluorescence que les protomères sauvage et mutant dans l’hétérodimère RL : R0L. Tous les deux se retrouvent donc leur état pleinement actif (figure 11). De la même façon que pour l’hétérodimère RL : R0L, en présence de protéine G et en concentration saturante en LTB4, un seul des deux protomères est présent dans son état actif tandis que l’autre reste bloqué dans l’état intermédiaire (figure 11). Il apparaît donc que, comme pour l’hétérodimère RL : R0L, la protéine G induit une conformation asymétrique du dimère BLT1 dans laquelle un seul des protomères est présent dans son état complètement actif. Figure 11 : Activation du récepteur dans le dimère BLT1 en absence ou présence de protéine G La figure représente les changements normalisés de la fluorescence dans l’hétérodimère R : R0 et dans l’homodimère R : R en absence et en présence de protéine G. Dans tous les cas d’étude, seul un des protomères du dimère est marqué au 5-OH-Trp234 : R0 dans l’hétérodimère et un des protomères R dans l’homodimère. Les barres d’erreur correspondent à la déviation standard de la valeur moyenne calculée sur trois expériences indépendantes. 19 Supprimé : 5. Conclusion D’une part, cette étude a permis de mettre en évidence le fait que l’activation Supprimé : D’une part, c d’un seul des protomères d’un récepteur BLT1 dimérique permet de déclencher l’activation complète de la protéine G. De plus, le monomère est lui-même capable d’assurer l’activation de la protéine G. Cependant, l’activation complète nécessite l’étape de dimérisation du récepteur. On peut donc supposer que cette dimérisation augmente l’efficacité de couplage du fait que les deux protomères interagissent avec des régions distinctes de la protéine G associée. Supprimé : . De plus, le monomère est lui-même capable d’assurer l’activation de la protéine G Supprimé : la Supprimé : D’autre part, la preuve a été apportée que la protéine G est responsable du fonctionnement asymétrique du dimère BLT1 : en concentration saturante en agoniste LTB4, un seul des protomères est complètement activé, l’autre restant bloqué dans un état intermédiaire entre états inactif et actif. Pour résumer, le fait qu’un seul des protomères soit capable d’activer la protéine G démontre que ce protomère interagit avec la sous-unité α de la protéine G. Le deuxième protomère, voyant sa conformation limitée par le couplage avec la Supprimé : De plus, l protéine G, interagit lui-aussi de façon spécifique avec son partenaire intracellulaire. Cependant, il reste encore à déterminer si cette interaction se fait également au niveau de la sous-unité α sur une région distincte de celle avec laquelle interagit le Supprimé : (mais avec Supprimé : ) premier protomère, ou si elle se fait au niveau de la sous-unité βγ de la protéine G. III. Projet de recherche Les principales études menées sur le récepteur au LTB4 ont permis de mettre en évidence son homodimérisation in vitro. Le récepteur BLT1 humain a été produit chez E. coli puis correctement foldé (Banères et al., 2003). Ce récepteur recombinant présente, en présence de protéine G, une affinité pour LTB4 (la constante de dissociation Kd mesurée est de 1,8.10-9 M) qui est très proche de celle du récepteur 20 humain exprimé dans les cellules Cos-7 (Kd ≈ 10-9 M). De plus, le récepteur isolé dans du détergent est capable d’activer l’échange GDP-GTP au niveau de la sousunité α de la protéine G associée, et ce, en présence de concentration saturante de LTB4. Enfin, le récepteur interagit de manière spécifique avec la sous-unité Gαi tandis qu’il est incapable d’interagir avec la sous-unité Gαq (Banères et Parello, 2003). Tous ces éléments prouvent que le récepteur recombinant BLT1 est un bon modèle pour l’étude du récepteur natif. En 2004, Mesnier et Banères ont montré que, solubilisé dans un détergent adéquat (dans notre cas, l’hexadecyl-β-D-maltoside), le récepteur BLT1 recombinant est présent essentiellement sous forme dimérique, et ce, en présence ou non d’agoniste. En outre, la présence de l’agoniste LTB4 stabilise ces dimères. De la même façon, il a été montré que BLT1 recombinant dimérise dans des liposomes reconstitués. Ces différentes observations laisseraient penser que BLT1 homodimérise in vivo. De plus, des expériences de cross-link chimique ont permis d’estimer l’état d’oligomérisation du récepteur BLT1 recombinant solubilisé dans du détergent et en présence de protéine G purifiée. L’analyse par gel-filtration puis SDS-PAGE des complexes formés a mis en évidence la formation d’un complexe pentamérique constitué d’un dimère de BLT1 et d’une protéine G hétérotrimérique (Banères et Parello, 2003). Enfin, plus récemment, Damian et al. (2006) se sont interrogés sur le rôle de la dimérisation dans l’activation de la protéine G. Pour cela, le récepteur BLT1 reconstitué dans des liposomes a été mis en présence du peptide TM6 afin de dissocier les dimères. Cette expérience a révélé que les monomères sont capables d’activer la protéine G, mais de manière moindre que le récepteur sous forme dimérique. Le rôle de la dimérisation dans l’activation de la protéine G n’est donc pas clairement défini. En fin de compte, les études précédentes ayant été menées uniquement in vitro sur un récepteur recombinant, on peut se demander si la dimérisation observée ne résulterait pas d’un artefact expérimental. Il serait donc intéressant de confirmer par des expériences supplémentaires les résultats obtenus précédemment in vitro, ainsi que de prouver l’existence de l’homodimérisation de BLT1 in vivo. 21 1. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vitro Comme décrit par Banères et al. (2003), le récepteur BLT1 recombinant est produit chez E. coli dans un vecteur pET21b (figure 12). Il est exprimé en fusion avec un tag His en C-terminal. Après induction par l’IPTG, le récepteur BLT1 est produit en corps d'inclusion. Après solubilisation dans l'urée 8 M, le récepteur est purifié sur colonne Ni-NTA (Nickel- NitriloTriacetic Acid), puis refoldé. Enfin, le tag C-terminal est clivé par digestion à la thrombine. His-tag R MCS Amp Promoteur T7 pET21b (5442 pb) lac I ori pBR322 Figure 12 : Vecteur pET21b Ce vecteur comprend une origine de réplication bactérienne (ori pBR322), un gène de sélection (AmpR) permettant la synthèse d’une β-lactamase, un promoteur T7 régulé par un opérateur lac O, le gène lac I permettant la régulation de l’opérateur lac O et enfin un tag histidine que l’on retrouvera en C-terminal de notre protéine de fusion. La protéine d'intérêt est clonée en utilisant les sites uniques de restriction du site de clonage multiple (MCS). Le problème majeur rencontré lors de la production du récepteur recombinant est sa surexpression. En effet, celle-ci pourrait être à l’origine d’une dimérisation artefactuelle. Par exemple, il a été montré pour le récepteur à la neurotensine NST1 (GPCR de classe A) que, pour une faible concentration en détergent, l’oligomérisation du récepteur est dépendante de sa concentration. En effet, à faible 22 Supprimé : la fraction membranaire est récupérée puis dénaturée dans l’urée. Le récepteur recombinant est alors purifié concentration, il est présent sous forme monomérique, tandis qu’à forte concentration, il dimérise (White et al., 2007). Il serait donc utile d’étudier si la concentration du récepteur BLT1 recombinant a un effet sur son état d’oligomérisation. Il a été précédemment montré que le détergent hexadecyl-β-D-maltoside est idéal pour l’étude de la dimérisation de BLT1 (Mesnier et Banères, 2004). C’est pourquoi nous travaillons avec ce dernier à faible concentration. En effet, de fortes concentrations en détergent pourraient interférer avec la dimérisation du récepteur. Cette étude nécessite une gamme de concentrations de BLT1 purifié et solubilisé dans le détergent. Puis, une gel-filtration permet de déterminer la masse moléculaire des espèces présentes en solution sachant, qu’en théorie, les masses moléculaires des monomère et dimère sont respectivement de 37,9 kDa et 75,8 kDa. Enfin, une électrophorèse en conditions non-dénaturantes permet d’estimer la proportion de chaque espèce pour une concentration de BLT1 donnée. Des expériences contrôles peuvent être réalisées en utilisant différents détergents tels que le β-D-dodecyl maltoside dans lequel le récepteur est présent dans un équilibre monomère-dimère (Mesnier et Banères, 2004). Ceci nous permet de vérifier que ce n’est pas l’utilisation d’un détergent particulier qui induit la dimérisation. De plus, le Kd du dimère peut être également modifié par la concentration du détergent (White et al., 2007). Il est donc nécessaire de réaliser un contrôle supplémentaire où la dimérisation est étudiée pour une concentration élevée en détergent. En supposant que l’homodimérisation de BLT1 en présence de détergent soit confirmée in vitro par cette expérience, on pourra alors orienter notre étude sur l’existence de cette même homodimérisation in vivo. 23 2. Homodimérisation du récepteur BLT1 in vivo a. Immunoprécipitation à partir de membranes de leucocytes L’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le récepteur BLT1 humain étant disponible (GeneTex), il est possible de réaliser une immunoprécipitation afin de vérifier la dimérisation du récepteur in vivo. Le récepteur BLT1 est majoritairement exprimé chez l’homme dans les leucocytes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des membranes de leucocytes humains. La démarche expérimentale est de purifier les leucocytes à partir d’échantillons sanguins. Puis, les cellules sont soumises à un cross-link et une lyse. La fraction membranaire ensuite récupérée est solubilisée dans du détergent. On peut alors réaliser l’immunoprécipitation afin de récupérer les complexes stabilisés par le cross-linker. Ces complexes sont ensuite analysés sur gel natif dans le but de vérifier la présence de l’homodimère dont la taille attendue est d’environ 76 kDa. On peut également s’attendre à détecter le complexe pentamérique (dimère BLT1protéine G) qui a une masse théorique de 161,9 kDa (Banères et Parello, 2003). Les bandes correspondant à ces différentes espèces peuvent enfin être analysées par spectrométrie de masse pour déterminer leur masse moléculaire exacte, et par spectrométrie de masse en tandem afin d’identifier les partenaires de BLT1 dans ces complexes. Cependant, le problème majeur de l’immunoprécipitation est la possibilité d’agrégation artefactuelle des récepteurs suivant les conditions de solubilisation et de précipitation utilisées. En effet, les GPCRs sont de nature hydrophobe et ont donc tendance à s’agréger en solution. Il est alors important de réaliser des expériences de contrôle pour évaluer ce problème. D’une part, il sera pertinent de tester différents détergents aux propriétés physico-chimiques variées (par exemple : β-D-dodecyl maltoside et hexadecyl-β-D-maltoside) afin d’être sûr que le détergent n’est pas à l’origine des interactions observées. D’autre part, il faudra également tester différents agents cross-linkers (tels que : le formaldéhyde, le 2-iminothiolane hydrochloride et le dithiobis [succinimidyl propionate]) pour les mêmes raisons. 24 b. Expériences de BRET Le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) et le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) sont des techniques très utilisées pour visualiser directement les dimères de GPCR dans les cellules vivantes. Le BRET mesure le transfert d’énergie provenant de la dégradation catalytique de la coelenterazine par la Renilla luciférase (Rluc) vers l’accepteur EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) qui émet de la fluorescence en retour. L’excitation d’EYFP est directement dépendante de la proximité moléculaire entre le donneur (Rluc) et l’accepteur (EYFP) (figure 13). A B Figure 13 : Le principe du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) A. La coelenterazine, substrat de la Renilla luciférase (Rluc) est dégradé, ce qui libère une énergie lumineuse mesurable à 480 nm. Si EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) est localisée à moins de 50 Ǻ, il y a transfert d’énergie du donneur (Rluc) vers l’accepteur (EYFP) et émission de fluorescence à 530 nm. B. Le BRET a largement été utilisé pour détecter la dimérisation des GPCRs à la membrane plasmique. 25 Nous choisirions d’utiliser le BRET plutôt que le FRET car cette technique présente plusieurs avantages : - Par BRET, l’excitation d’EYFP est mesurable quand les deux protéines sont localisées à une distance maximale de 50 Ǻ, contre 100 Ǻ pour le FRET. - La méthode BRET ne nécessite pas une excitation de fluorescence par une source lumineuse externe, contrairement au FRET. Cette technique n’endommage donc pas les cellules et est insensible au photoblanchiement. Dans le but de réaliser cette expérience, il est nécessaire d’exprimer le récepteur BLT1 recombinant dans des cellules mammifères. Pour cela, nous choisissons des cellules Cos-7 puisque des études antérieures sur BLT1 recombinant ont déjà été menées dans cet hôte (Banères et Parello, 2003). Comme décrit par Kroeger et al. (2001), l’ADNc de BLT1 est cloné par PCR dans le vecteur pcDNA3 (Invitrogen) (figure 14), dans lequel on a également inséré en C-terminal la région codante soit pour Rluc (récepteur donneur), soit pour EYFP (récepteur accepteur). Figure 14 : Vecteur pcDNA3 Ce vecteur eucaryote va être utilisé pour exprimer le récepteur BLT1 en fusion avec soit Rluc, soit EYFP caractérisé par procaryote à un en C-terminal. Il est gène de résistance l’ampicilline, un gène de résistance eucaryote à la néomycine, une origine de réplication f1, ainsi qu’un promoteur CMV (CytoMegaloVirus). 26 Les deux plasmides sont alors transfectés dans les cellules hôtes, puis après ajout du substrat de la Renilla luciférase, à savoir, la coelenterazine, on mesure la fluorescence à 480 nm (émission de Rluc) et à 530 nm (émission d’EYFP). Afin de vérifier que l’émission de lumière à 530 nm est bien spécifique d’EYFP, on mesure la fluorescence à 530 nm dans une cellule transfectée par la construction BLT1/Rluc seule, aucun signal ne devra alors être détecté. Le signal BRET est quantifié par le calcul du ratio : (lumière émise à 530 nm) / (lumière émise à 480 nm). Avant tout, il est nécessaire de valider nos constructions en vérifiant qu’elles partagent les mêmes caractéristiques que le récepteur BLT1 natif. Pour cela, on peut utiliser la microscopie confocale afin de démontrer que les protéines de fusion sont bien exprimées à la membrane plasmique. De plus, des expériences de fixation de LTB4 radioactif permettront de s’assurer que les fusions ne modifient pas l’affinité du récepteur pour son agoniste naturel. Si une homodimérisation est observée, d’autres contrôles pourront être envisagés (figure 15). D’une part, en contrôle positif, on pourra utiliser une fusion entre Rluc et EYFP qui devra donner un signal BRET plus important que nos constructions BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. D’autre part, afin de démontrer que le signal observé ne résulte pas d’une interaction non-spécifique entre Rluc et EYFP, on coexprimera Rluc et EYFP (non-fusionnées) dans des cellules Cos-7 : aucun signal ne devra être enregistré. Enfin, pour vérifier la spécificité d’interaction entre les deux monomères BLT1, deux contrôles sont envisageables : - D’une part, la co-expression de BLT1/Rluc avec la construction récepteur β2-adrénergique/EYFP. Ces deux récepteurs n’étant pas sensés hétérodimériser, aucun signal ne devra être détecté. - D’autre part, la co-expression de BLT1/Rluc, BLT1/EYFP et BLT1 non taggué : dans ce cas, le récepteur sauvage entrera en compétition avec les deux autres, ce qui devra résulter en une diminution du signal. Enfin, il a été montré précédemment que LTB4 stabilise la dimérisation (Banères et Parello, 2003). Donc, en traitant avec LTB4 les cellules co-exprimant BLT1/Rluc et BLT1/EYFP, les dimères étant favorisés, on devra observer une augmentation du signal. 27 A BLT1 Rluc Signal ++ + BLT1 EYFP B Rluc Signal +++ EYFP C Rluc + EYFP Signal D BLT1 Rluc β2R BLT1 Signal + Rluc + EYFP BLT1 EYFP Signal + + E BLT1 Figure 15 : Expériences de BRET A. Constructions co-exprimées dans les cellules Cos-7 pour tester l’homodimérisation. B. Contrôle positif : fusion de Rluc et EYFP. Le signal BRET obtenu doit être optimal. C. Contrôle négatif : co-expression de Rluc et EYFP non-fusionnées. Ce contrôle permet de vérifier qu’il n’y a pas d’interaction non-spécifique entre les deux tags et donc pas de signal BRET. D. Contrôle permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation de BLT1. Le récepteur β2adrénergique n’étant pas sensé dimériser avec BLT1, aucun signal ne devra être observé quand les deux constructions sont co-exprimées dans les cellules Cos-7. E. Contrôle supplémentaire permettant de vérifier la spécificité de l’homodimérisation. Quand les deux fusions sont co-exprimées avec le BLT1 sauvage (non-taggué), il y a compétition et donc diminution du signal. Après avoir démontré que BLT1 homodimérise in vivo, on peut se demander à quelle étape de la biosynthèse du récepteur cette dimérisation se produit. A savoir si comme pour le récepteur GABAB, elle se produit dans le réticulum endoplasmique (Terrillon et Bouvier, 2004 ; Bulenger et al., 2005 ; Pin et al., 2005) ou après adressage à la membrane plasmique. 28 c. Localisation cellulaire de la dimérisation de BLT1 Dans ce but, une étude utilisant la bréfeldine A, drogue qui bloque la formation des vésicules allant du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi, peut être réalisée. On utilise la même construction que précédemment, soit une co-expression dans les cellules Cos-7 de BLT1/Rluc et BLT1/EYFP. Puis, les cellules transfectées sont traitées à la bréfeldine A : les récepteurs sont donc bloqués au niveau du réticulum endoplasmique. Ainsi, si un signal BRET est détecté, cela signifie que la dimérisation se produit dans le réticulum endoplasmique. Comme contrôle positif, on pourra utiliser des cellules Cos-7 exprimant les récepteurs GABAB1/Rluc et GABAB2/EYFP. Après traitement à la bréfeldine A, on s’attendra à observer un signal BRET étant donné que le récepteur GABAB dimérise au niveau du réticulum endoplasmique. 3. Perspectives S’il apparaît que l’homodimérisation de BLT1 est bien confirmée in vivo, il sera alors intéressant d’étudier sa capacité à hétérodimériser avec d’autres GPCRs de la même famille ou partageant une plus faible homologie. En effet, il a été montré que par exemple, les récepteurs δ-opioïde et κ-opioïde sont capables de s’associer. L’hétérodimérisation pourra être mise en évidence par co- immunoprécipitation. Il est à noter que l’expérience d’immunoprécipitation sur les membranes de leucocytes envisagée dans notre projet de recherche peut déjà révéler la présence de nouveaux partenaires de BLT1. Ces protéines seront alors identifiées par une analyse de spectrométrie de masse en tandem. Après caractérisation des partenaires, une analyse par BRET pourra confirmer l’existence de tels hétérodimères dans les cellules vivantes. La découverte d’hétérodimères pourrait avoir une importance physiologique et pharmacologique. En effet, si les deux monomères de l’hétérodimère activent des protéines G différentes, on peut supposer que de nouvelles voies de signalisation pourront être activées. De plus, en utilisant des ligands bivalents, il serait alors possible de cibler spécifiquement ces hétérodimères, dans le cas où ils présenteraient un intérêt thérapeutique. 29 Bibliographie Bai M. (2003). 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Supprimé : ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ <sp>¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ <sp>Figure 1 : Topologie des GPCRs¶ L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité Cterminale intracellulaire. Ils présentent 3 boucles extracellulaires (E1 à 3) et 3 boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de Nglycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4.¶ ¶ ¶ <sp><sp><sp>¶ ¶ ¶ Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels relatifs du domaine transmembranaire¶ ... [1] Mis en forme : Police :Symbol 33 Page 33: [1] Supprimé petite fleur 03/02/2008 14:04:00 Figure 1 : Topologie des GPCRs L’extrémité N-terminale est extracellulaire, l’extrémité C-terminale intracellulaire. Ils présentent 3 boucles extracellulaires (E1 à 3) et 3 boucles intracellulaires (I1à 3). Notons la présence d’un pont disulfure entre les boucles E1 et E2, des sites de Nglycosylation au niveau du domaine N-terminal ainsi qu’un site d’acylation par des composés lipidiques au niveau de la pseudo-boucle I4. A Figure 2 : Mécanisme général de la transduction du signal et changements conformationnels relatifs du domaine transmembranaire A. Un GPCR au repos (1) est activé par la liaison d'un agoniste spécifique (2). Le changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, induit par cette liaison, permet l'activation de l'échange du GDP par du GTP et donc l'activation de la protéine-G hétérotrimérique : sous-unités Gα et Gβγ intracellulaires (3) qui vont aller réguler l'activité de divers effecteurs (4) membranaires ou cytosoliques. Le déclenchement de l'activité phosphatase, intrinsèque à la sous-unité G entraîne la réassociation des sous-untités Gα et Gβγ (5) et le retour à l'état initial (1). B. L’activation du récepteur par la fixation de son agoniste entraîne un changement conformationnel. On observe la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre de TM6 et un éloignement des TMs 3 et 6. ↓ Figure 3 : Internalisation d’un GPCR Le récepteur est découplé de la protéine G par phosphorylation par la GRK (Gprotein Receptor Kinase). Le récepteur phosphorylé est reconnu par l’arrestine qui induit son endocytose clathrine-dépendante. Il sera alors, soit recyclé à la membrane après déphosphorylation et élimination de l’agoniste, soit dégradé après fusion de la vésicule d’endocytose avec le lysosome.