La rhinopneumonie équine

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1993, 12 (2), 493-504
La rhinopneumonie équine : épidémiologie
moléculaire et diagnostic par sondes
moléculaires à partir d'organes
S. ZIENTARA et C. SAILLEAU *
Résumé : Les auteurs rappellent brièvement les formes cliniques de la
rhinopneumonie équine et présentent les modifications de la nomenclature des
herpèsvirus équins. Ils décrivent l'intérêt des profils de restriction dans le cadre
d'études épidémiologiques en prenant l'exemple de souches virales isolées en
France.
D'autre part, sont présentées une méthodologie d'obtention de sondes
moléculaires ainsi que l'utilisation de ces sondes comme outils de diagnostic
direct à partir de prélèvements biologiques.
MOTS-CLÉS : Diagnostic - Herpèsvirus équins - Profils de restriction Rhinopneumonie équine - Sondes moléculaires.
INTRODUCTION
A l'origine de troubles respiratoires, abortifs ou nerveux, les herpèsvirus équins (ou
equine herpes virus) 1 et 4 ( E H V - 1 et E H V - 4 ) sont responsables de lourdes p e r t e s
économiques à la fois au niveau de l'élevage et de l ' e n t r a î n e m e n t . Bien q u e la
vaccination soit maintenant largement répandue, les faibles propriétés immunogènes et
la biologie de ces herpèsvirus (notamment les phénomènes de latence - réactivation)
expliquent l'apparition régulière d'épizooties dans les régions d'élevage. Depuis une
dizaine d'années, la biologie moléculaire a permis, d'une part de mieux appréhender le
monde des herpèsvirus en général et des herpèsvirus équins en particulier et, d'autre
part, de disposer d'outils moléculaires susceptibles d'améliorer considérablement le
diagnostic de ces infections.
LES DIFFÉRENTS HERPÈSVIRUS ÉQUINS ET L'ÉVOLUTION
DE LA NOMENCLATURE
Les herpèsvirus des différentes espèces animales ont des caractéristiques structurales
communes : un corps c o n t e n a n t une molécule d'acide désoxyribonucléique ( A D N )
linéaire double brin, une capside icosaédrique et une enveloppe hérissée de spicules
* Centre national d'études vétérinaires et alimentaires, Laboratoire central de recherches
vétérinaires, 22, rue Pierre-Curie, 94703 Maisons-Alfort, France.
494
glycoprotéiques. Cette famille des Herpesviridae est divisée en trois sous-familles en
fonction de leurs propriétés biologiques (16) : les alpha herpesvirinae, les bêta
herpesvirinae et les gamma herpesvirinae. Depuis une dizaine d'années, la classification
des herpèsvirus équins a évolué en même temps que se précisaient les connaissances sur
le génome et la biologie de ces virus et qu'étaient isolés de nouveaux virus, notamment à
partir d'asins (15).
TABLEAU I
Les différents herpèsvirus
(24)
Génome
Sousfamille
G +C
Herpesvirus équin 1 EHV-1 ; virus de l'avortement
a
Herpesvirus équin 2
EHV-2 ; cytomegalovirus
Herpesvirus équin 3
EHV-3 ; virus de l'exanthème
coital
Herpesvirus équin 4
Groupe
Taille
(kb)
57
D
142
ß
a
57
A
192
66
D
148
EHV-4 ; virus de la
rhinopneumonie équine
a
56
D
148
Herpesvirus équin 5
EHV-5
Herpesvirus équin 6
HV-1 asinien
ß
a
Herpesvirus équin 7
HV-2 asinien
Herpèsvirus équin 8
HV-3 asinien
Désignation
Nom commun
(%)
150
ß
a
G + C (% ) : pourcentage de guanine + cytosine
kb : kilobase
Huit herpèsvirus ont été décrits dans la famille des équidés (Tableau I). Chez le
cheval, les principaux virus sont les suivants :
- le virus E H V - 1 ou virus de l ' a v o r t e m e n t , r e s p o n s a b l e é g a l e m e n t d e troubles
respiratoires ou nerveux,
- le virus EHV-2, ou cytomégalovirus, dont le pouvoir pathogène est peu connu,
- le virus E H V - 3 , ou virus de l ' e x a n t h è m e coïtal, à l'origine
vénériennes,
d'infections
- le virus EHV-4, ou virus de la rhinopneumonie équine stricto sensu, à l'origine de
troubles respiratoires essentiellement (mais parfois isolé chez des avortons).
Les deux herpèsvirus EHV-1 et EHV-4, responsables de la rhinopneumonie équine
au sens large, sont à l'origine d'énormes pertes économiques et sont l'objet de très
n o m b r e u x travaux de recherche, n o t a m m e n t dans le domaine de l'immunologie, la
prophylaxie médicale pouvant parfois s'avérer déficiente.
Les sous-types 1 et 2 d'un même virus dit de la rhinopneumonie équine sont décrits
depuis une vingtaine d'années et ont pu être différenciés par la t e c h n i q u e de
neutralisation sérologique. L'analyse des variations génétiques des A D N génomiques
495
de ces deux sous-types viraux, initialement p a r l'emploi d'enzymes de restriction
(18,20) puis par séquençage, a permis ultérieurement de modifier la taxonomie virale
et de distinguer les sous-types 1 et 2 en deux virus, EHV-1 et EHV-4 respectivement.
LES FORMES CLINIQUES DE LA RHINOPNEUMONIE
La rhinopneumonie se manifeste sous diverses formes cliniques dont l'épidémiologie
est différente.
La forme respiratoire
La forme respiratoire affecte le poulain nouveau-né et le poulain d'un an au cours de
l'automne et de l'hiver. Les adultes sont plus rarement atteints. Après deux à vingt jours
d'incubation, le cheval présente une hyperthermie pouvant atteindre 40,5 °C à 41 °C
pendant cinq à sept jours. Apparaissent ensuite un jetage séreux abondant, parfois du
larmoiement, et une toux sèche et improductive qui peut être déclenchée par palpation
du pharynx. La maladie évolue en une à deux semaines. Cette évolution est rarement
fatale. Il est toutefois possible d'observer des complications, sous la forme de rhinite
mucopurulente due à u n e infection b a c t é r i e n n e secondaire ( s t r e p t o c o q u e s ) , de
pharyngite purulente, d'atteinte des poches gutturales, de toux persistante, de bronchopneumonie et de pneumonie interstitielle chez le poulain nouveau-né.
La forme abortive
En F r a n c e , le virus E H V - 1 est la p r e m i è r e cause d ' a v o r t e m e n t d'origine virale
chez le cheval. La prévalence varie d'une a n n é e à l'autre et d é p e n d de l'apparition
d'épizooties (7, 12, 13). D a n s de rares cas, le virus E H V - 4 p e u t é g a l e m e n t être à
l'origine d'avortement (1,20).
e
e
L'avortement survient généralement entre le 6 et le 1 1 mois de gestation avec une
plus grande fréquence entre le 8 et le 1 0 mois. La j u m e n t ne présente aucun signe
précurseur. Le fœtus est expulsé rapidement, suivi du placenta.
e
e
Dans le cas d'infections tardives de l'utérus et du fœtus, le poulain, à la naissance, est
faible, hypotrophique ou apparemment sain. Mais rapidement, il cesse de téter, ne peut
se tenir sur ses membres, présente une détresse respiratoire, parfois de la diarrhée et
meurt en quelques jours.
La forme nerveuse
La forme nerveuse est caractérisée par de la parésie, de l'incoordination motrice, de
la paralysie et peut entraîner la mort. Elle peut apparaître chez des poulinières après
avortement mais aussi, après des troubles respiratoires, chez des chevaux ou des
juments de tout âge.
En France, dominent les formes respiratoires et abortives qui ont pour conséquence,
chaque année, de sérieuses pertes économiques, tant au haras qu'à l'entraînement. Les
mesures sanitaires préventives ainsi que le développement de la prophylaxie médicale à
l'aide de vaccins (virus atténués, virus inactivés, sous-unités virales et bientôt virus
recombinants) permettent de diminuer l'incidence de cette pathologie.
496
LA LATENCE DES HERPÈSVIRUS
U n e des propriétés communes à l'ensemble des herpèsvirus des mammifères est leur
capacité à persister dans l'organisme, dans des sites spécifiques (leucocytes, neurones)
à l'état quiescent (8). Ce p h é n o m è n e de latence virale est très i m p o r t a n t dans
l'épidémiologie de ces infections. Après plusieurs mois ou années, le virus va retrouver
sa virulence, suite à une réactivation dont les causes sont mal connues.
Chez le cheval, les virus EHV-1 et EHV-4 peuvent être hébergés par leur hôte dans
un état de non réplication. Après réactivation, les animaux infectés constituent une
source dangereuse d'infection dans un troupeau.
Le prototype des alpha herpèsvirus (le virus herpes simplex humain) est connu pour
entraîner une infection latente des ganglions nerveux chez l'Homme, la souris et lé lapin
(11,17,24).
D e n o m b r e u x auteurs ont m o n t r é que l'administration de fortes doses de
corticostéroïdes à des chevaux sains permettait de réactiver et de réisoler les virus
EHV-1 et E H V - 4 (5,6).
Contrairement à de nombreux autres alpha herpèsvirus, les virus EHV-1 et EHV-4
ne semblent pas présenter de neurotropisme.
Les lésions du système nerveux central dans les formes neurologiques de la
r h i n o p n e u m o n i e sont, semble-t-il, la conséquence de vascularites dues à la
multiplication du virus EHV-1 dans les cellules endothéliales et non à une infection des
neurones par ce virus (9,14).
PROFILS DE RESTRICTION ET ÉPIDÉMIOLOGIE
MOLÉCULAIRE
Le développement spectaculaire de la biologie moléculaire depuis dix ans a permis
de mieux a p p r é h e n d e r le m o n d e des herpèsvirus équins. Les p r e m i e r s travaux de
comparaison de souches par profil de restriction datent de 1981 (18,20,21).
La possibilité d'identifier les deux types viraux sans ambiguïté - et ceci de façon plus
précise que par des méthodes sérologiques - permet de mieux cerner l'épidémiologie de
ces virus.
En effet, les enzymes de restriction sont des endonucléases bactériennes qui clivent
l ' A D N en des sites très spécifiques (de quatre à six paires de bases en moyenne). Les
fragments d ' A D N génomique ainsi obtenus peuvent être séparés en fonction de leur
poids moléculaire et visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose en présence de
bromure d'éthidium.
La perte ou l'acquisition de sites de restriction, conséquences d'une modification de
la séquence génétique de l ' A D N viral, se traduit par une modification du profil de
restriction (disparition ou apparition de nouveaux segments d ' A D N ) . Ainsi, la
comparaison des profils électrophorétiques de différentes souches virales permettra de
les classer selon leurs différences génétiques.
497
C'est ainsi que les deux sous-types 1 et 2 du virus E H V - 1 ont été reconnus comme
étant deux virus distincts du cheval, respectivement EHV-1 et EHV-4.
D ' a u t r e p a r t , la variabilité g é n é t i q u e de ces virus a pu être confirmée p a r la
comparaison des profils de restriction de souches virales avant et après de nombreux
passages en cultures cellulaires hétérologues (10,23).
Par contre, A l l e n et coll. ont m o n t r é que le g é n o m e du virus E H V - 1 était
suffisamment stable lors de la réplication du virus en cultures cellulaires d'origine
équine p o u r p e r m e t t r e d'utiliser les profils de restriction c o m m e m é t h o d e de
comparaison de souches virales entre elles (2).
Les Figures 1 et 2 représentent les profils de restriction de vingt souches virales de
EHV-1 isolées au Laboratoire central de recherches vétérinaires à partir d'écouvillons
respiratoires ou d'organes d'avortons. Seule la souche n° 15 (Fig. 1 et 2) est un virus
EHV-4 de référence. Deux enzymes furent utilisées pour analyser ces virus (Bam H 1 et
Pst 1). La première a permis de différencier les virus EHV-1 et EHV-4 (11,20).
L'enzyme Pst 1, q u a n t à elle, n ' a jamais été employée et possède un très grand
nombre de sites de restriction sur l ' A D N du virus E H V - 1 induisant un profil de
restriction particulièrement chargé en fragments génomiques, p e r m e t t a n t ainsi une
comparaison très précise entre les souches.
Toutes les souches isolées en France ont un profil de restriction comparable à celles
décrites par Allen et coll. (1) sous le nom de «profil type EHV-1.1P». Un autre profil variant
a été décrit simultanément, le profil 1 B, qui n'a pas été observé dans la présente étude.
M : marqueurs de poids moléculaire
N° 1 à 14 : souches d'herpèsvirus équin 1
N° 15 : souche d'herpèsvirus équin 4
FIG.l
Profils de restriction obtenus par digestion par l'enzyme Bam H 1
de l'acide désoxyribonucléique génomique de 14 souches
d'herpèsvirus équin 1 et d'une souche d'herpèsvirus équin 4
498
M : marqueurs de poids moléculaire
N° 1 à 14 : souches d'herpèsvirus équin 1
N° 15 : souche d'herpèsvirus équin 4
FIG.2
Profils de restriction obtenus avec l'enzyme Pst 1 de 14 souches d'herpèsvirus équin 1
et d'une souche d'herpèsvirus équin 4
UTILISATION DE SONDES MOLÉCULAIRES POUR LE
DIAGNOSTIC DIRECT À PARTIR D'ORGANES
Dans le but d'améliorer la sensibilité et la spécificité des méthodes de diagnostic, et
grâce aux possibilités techniques qu'offrent les outils moléculaires, les auteurs ont
développé des sondes moléculaires en vue de caractériser, à partir d'échantillons
cliniques, les virus EHV-1 et EHV-4 (Fig. 3).
Méthodologie d'obtention des sondes moléculaires
L ' A D N génomique d'une souche de virus E H V - 1 isolée au Laboratoire central de
recherches vétérinaires à partir d'un avorton est extrait après deux passages en cultures
cellulaires et traitement au sodium dodécyl sulfate (SDS) et à la protéinase K, par le
phénol/chloroforme. L ' A D N , précipité par l'alcool, est soumis à une digestion totale
par l'enzyme Pst 1.
Les fragments d ' A D N ainsi o b t e n u s sont insérés dans un vecteur de clonage (le
plasmide p B R 322). Le vecteur recombinant (ADN messager + plasmide) est transfecté
dans des bactéries (Escherichia coli) afin d'amplifier les inserts d'origine virale. Les
bactéries transformées sont mises en culture sur des boîtes c o n t e n a n t le milieu
nécessaire à leur croissance et en présence du m a r q u e u r de sélection (dans le cas
présent, l'ampicilline). Les bactéries ayant intégré un plasmide r e c o m b i n a n t ne se
diviseront pas en présence d'ampicilline, les bactéries ayant un plasmide sans insert se
diviseront en présence de tétracycline et d'ampicilline.
499
EHV-l
ADN
AMP
TET
pBR 322
R
R
: herpèsvirus équin 1
: acide désoxyribonucléique
: gène de résistance à l'ampicilline
: gène de résistance à la tétracycline
: plasmide, vecteur de clonage
FIG.3
Méthodologie d'obtention des sondes moléculaires
500
L ' A D N plasmidique recombinant, contenu dans les clones sélectionnés, sera digéré
par l'enzyme de restriction Pst 1 et la taille des fragments insérés p o u r r a être
déterminée (Fig. 4).
Les inserts sont localisés (après transfert sur gel de nitrocellulose par la méthode du
Southern blot et hybridation moléculaire) sur l ' A D N génomique viral : chaque insert
est utilisé comme sonde et hybridé avec l'ADN génomique digéré par les enzymes Pst 1
et Bam H 1 (dont les sites de restriction sur l'ADN du virus EHV-1 sont connus).
Par comparaison, pour un insert donné, entre les régions d'hybridation sur l'ADN
digéré par Pst 1 et B a m H 1, les inserts obtenus par Pst 1 peuvent être localisés sur la
carte de restriction par Bam H 1 du virus E H V - 1 .
M : marqueurs
Colonnes 1 et 17 : souche d'herpèsvirus équin 1
Colonnes 2 à 16 : acide désoxyribonucléique plasmidique et inserts
FIG.
4
Analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments de l'acide
désoxyribonucléique d'herpèsvirus équin 1 clonés dans le plasmide pBR 322 après
digestion par l'enzyme Pst 1
Utilisation des sondes pour le diagnostic direct
Les différentes sondes o b t e n u e s ont été soumises à un m a r q u a g e radioactif, dit
marquage à chaud (avec des atomes radioactifs comme le P par exemple) ou à un
marquage non radioactif, dit marquage à froid. Ce dernier offre l'avantage de ne pas
utiliser de radionucléides qui, o u t r e le danger que r e p r é s e n t e leur manipulation,
imposent de disposer de locaux agréés et de respecter des n o r m e s de protection
particulièrement contraignantes pour le personnel du laboratoire.
3 2
Les procédés de marquage à froid ont considérablement évolué ces dernières années
et rendent les sondes froides pratiquement aussi sensibles que les sondes chaudes.
501
Les organes d'avortons (foie, p o u m o n s , thymus, etc.) sont broyés et l ' A D N total
(cellulaire et é v e n t u e l l e m e n t viral) en est extrait selon le p r o t o c o l e décrit
précédemment.
L ' A D N est fixé sur un filtre de nitrocellulose qui est introduit dans un sachet en
plastique dans lequel sont versées les solutions de p r é h y b r i d a t i o n et d'hybridation
contenant les sondes (Fig. 5 ; dans cet exemple, des sondes chaudes sont utilisées). Le
sachet est scellé par la chaleur et incubé à une température permettant l'hybridation.
Ensuite, les filtres sont lavés, séchés et mis en contact avec des films
radiophotographiques à - 70 °C pendant 24 heures.
FIG. 5
Détection de l'acide désoxyribonucléique de l'herpèsvirus équin 1 à partir d'organes
d'avortons avec l'une des sondes
Les échantillons cliniques sont numérotés de 1 à 19.
Le dépôt témoin n° 20 correspond à de l'acide désoxyribonucléique total extrait
d'organes non infectés (foie et poumons)
La Figure 5 présente les résultats des hybridations (épreuves du dot blot). Aucune
hybridation n'est décelée avec l ' A D N total extrait de foie non infecté (n° 20) ; il existe
une très bonne corrélation entre les organes réagissant à l'épreuve du dot blot (n° 1,3,
5 à 9, et 12 à 19) d'une part et l'isolement de virus à partir de ces mêmes échantillons
cliniques d ' a u t r e part. A partir des échantillons n° 2, 4 , 1 0 et 11, aucun virus n'a pu
être réisolé, les titres viraux é t a n t p a r t i c u l i è r e m e n t faibles (inférieurs à 10 doses
cytopathogènes 50/ml).
2
Les outils moléculaires p e r m e t t e n t de d é t e c t e r l'acide nucléique g é n o m i q u e
directement, c'est-à-dire qu'il n'est pas nécessaire que le virus soit encore infectieux.
Les conditions d'envoi et de conservation des échantillons cliniques (notamment pour
502
les pays chauds) ne sont donc plus des facteurs pouvant limiter la mise en évidence au
laboratoire de l'agent pathogène. Le délai de réponse est considérablement diminué
puisque 24 à 48 heures peuvent suffire pour donner une réponse.
C e p e n d a n t , la sensibilité des sondes p e u t être quelquefois inférieure au simple
isolement par culture cellulaire et, dans certains cas, des produits biologiques peuvent
inhiber la réaction d'hybridation. D'autre part, la spécificité de la réaction d'hybridation
moléculaire peut être réduite lorsque la sonde s'hybride de façon non spécifique avec
un acide nucléique hétérologue de séquence voisine.
L'amplification génique (amplification en chaîne par polymérase : P C R ) s'avère
p r o m e t t e u s e p o u r le diagnostic direct à partir d'écouvillons respiratoires ou
d'échantillons cliniques (4,19). La connaissance des phénomènes pathogéniques des
infections à E H V (notamment les phénomènes de latence - réactivation) sera sans nul
doute favorisée par cette méthode qui s'avère rapide, sensible et spécifique (22). -
CONCLUSION
G r â c e au spectaculaire d é v e l o p p e m e n t de la biologie moléculaire et plus
précisément des biotechnologies, les connaissances fondamentales en virologie
générale ont considérablement évolué. La virologie animale a profité de ces progrès
techniques et les m é t h o d e s de diagnostic se sont affinées (sondes, P C R mais aussi
anticorps monoclonaux). E n ce qui concerne les herpèsvirus équins, leur structure
g é n o m i q u e et leur biologie ont fait l'objet de n o m b r e u x travaux qui ont
considérablement enrichi nos connaissances.
L'épidémiologie, par l'analyse génétique des souches virales isolées, peut désormais
être mieux comprise et l'efficacité des méthodes de prophylaxie médicale davantage
appréciée. Quant au diagnostic, grâce à l'emploi de sondes moléculaires et de la PCR, il
sera considérablement amélioré, à la fois par la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la
facilité qui définissent ces nouvelles méthodes.
REMERCIEMENTS
Nous tenons à exprimer nos profonds remerciements pour leur aide et leurs conseils
aux D o c t e u r s C. Crucière et E. Plateau, ainsi q u ' a u D o c t e u r A. J a c q u e t (Institut
Pasteur) pour son analyse critique du manuscrit.
*
* *
E Q U I N E R H I N O P N E U M O N I T I S : M O L E C U L A R E P I D E M I O L O G Y AND
DIAGNOSIS BY MEANS OF MOLECULAR PROBES PREPARED FROM ORGANS.S. Zientara and C. Sailleau.
Summary:
The authors briefly review the clinical forms of equine
rhinopneumonitis
and indicate changes in the nomenclature of equine
herpesviral infections. The value of restriction profiles for epidemiological
studies is described, taking as an example the strains of virus isolated in France.
503
A technique is given for preparing molecular probes, as well as the
application of these probes in direct diagnosis from biological specimens.
KEYWORDS : Diagnosis - Equine herpesvirus - Equine rhinopneumonitis Molecular probes - Restriction profiles.
*
LA R I N O N E U M O N Í A E Q U I N A : E P I D E M I O L O G Í A M O L E C U L A R Y
DIAGNÓSTICO POR SONDAS MOLECULARES A PARTIR D E ÓRGANOS. S. Zientara y C. Sailleau.
Resumen: Los autores recuerdan brevemente las formas clínicas de la
rinoneumonía equina y presentan las modificaciones de la nomenclatura de los
herpesvirus equinos. Muestran el interés de los perfiles de restricción en el
marco de estudios epidemiológicos tomando como ejemplo cepas virales
aisladas en Francia.
Por otra parte, presentan una metodología de obtención de sondas
moleculares así como de utilización de estas sondas como herramientas de
diagnóstico directo a partir de muestras biológicas.
P A L A B R A S C L A V E : Diagnóstico - Herpesvirus equinos - Perfiles de
restricción - Rinoneumonía equina - Sondas moleculares.
*
* *
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