Compte-rendu projet innovant - - Soutenu en 2008

Le 21 juillet 2011
Département
Ecologie des Forêts, Prairies et milieux
Aquatiques
- Compte-rendu projet innovant - Soutenu en 2008 Unité :
Responsable (nom et
adresse électronique) :
Titre du projet
UMR 1202 Biodiversité, Gènes et Communautés (BioGeCo)
Carole Kerdelhué ([email protected])
Recherche de marqueurs liés à la phénologie chez la
Processionnaire du Pin, Thaumetopoea pityocampa
Nature et objectifs du projet :
La processionnaire du pin est un modèle biologique qui fait l'objet de nombreuses recherches complémentaires au
sein du département EFPA. Depuis plusieurs années, les chercheurs de l'URZF à Orléans, et plus récemment de
BioGeCo à Pierroton, ont mené des études importantes sur la structuration génétique neutre chez cette espèce. Les
objectifs du présent projet étaient de développer des marqueurs situés au sein de gènes candidats potentiellement
impliqués dans des caractères adaptatifs. L'opportunité d'une collaboration fructueuse avec une équipe de
l'Université Technique de Lisbonne autour du co-encadrement d'une thèse nous a fourni la possibilité de
commencer de telles recherches sur la phénologie de l'insecte. En effet, une population de cette espèce présentant
un cycle biologique décalé (population d'été) par rapport à toutes les autres populations connues, et n'ayant de ce
fait plus de flux de gènes avec les individus sympatriques présentant le cycle biologique normal (population
d'hiver), a été découverte en 1997 au Portugal (1). Nous sommes chargés de l'encadrement et du développement des
recherches génétiques sur cette population. Si nous avons commencé à bien la caractériser à l'aide de marqueurs
génétiques neutres (2), nous voulions explorer diverses possibilités de travailler sur des gènes candidats
potentiellement impliqués dans cette mutation phénologique.
Pour cela, nous avions identifié plusieurs étapes:
- Réaliser une étude bibliographique pour identifier les gènes candidats les plus prometteurs;
- Réaliser des tests d'amplification à partir d'amorces utilisées chez d'autres Lépidoptères, si possible de la
même famille;
- Si nécessaire, réaliser des séquences consensus à partir de données disponibles dans les banques de gènes,
et dessiner des amorces dégénérées pour de nouveaux tests d'amplification;
- Amplifier ces gènes pour une quinzaine d'individus de chaque type de population puis les séquencer (avec
ou sans clonage) afin de déterminer leur polymorphisme nucléotidique et de comparer les indices de différentiation
par rapport à des gènes neutres déjà séquencés.
D'autre part, nous avions identifié pour un des loci microsatellites (MS-ThPit2) des allèles atypiques dans la
population d'été, avec des longueurs de fragments plus élevées, et un fort polymorphisme (Santos, in prep.). Nous
avions également comme objectif de mieux caractériser ces allèles.
Enjeux originaux :
L'enjeu principal est la mise au point de marqueurs situés dans des régions du génome impliquées dans un caractère
adaptatif majeur chez la processionnaire du pin, et de réaliser ainsi un tournant dans les approches de génétique des
populations dans le domaine de l'entomologie forestière. Si de tels marqueurs peuvent être mis au point, nul doute
qu'ils nous permettraient de développer des projets de recherche ambitieux et novateurs.
A Champenoux, le lundi 21 juillet 2011
Département Écologie des Forêts,
Prairies et milieux Aquatiques
Principaux résultats (cette rubrique est évidemment essentielle) :
Une vaste étude bibliographique a permis de sélectionner 14 gènes pouvant avoir un lien avec la phénologie. Les
recherches dans les banques de gènes nous ont amenés à en sélectionner 7. Quatre sont impliqués dans les horloges
biologiques [period, cryptochrome, timeless et cycle], un dans la régulation de la diapause et du développement
[DH-pBAN (Diapause Hormone – pheromone biosynthesis activating neuropeptide)], et deux sont liés au
chromosome sexuel, au sein duquel des groupes de liaisons impliqués dans la levée de diapause ont été mis en
évidence chez d'autres Lépidoptères [LdH (lactate déshydrogénase) et Tpi (triose-phosphate isomérase)].
Pour chacun de ces gènes, nous avons aligné les séquences présentes dans les banques de gènes chez des
Lépidoptères, en privilégiant les espèces de la famille des Notodontidae. Il s’agit dans la plupart des cas de
séquences obtenues à partir de cDNA. Nous avons positionné sur les séquences consensus les amorces décrites
dans la littérature pour amplifier des portions de ces gènes. A partir de ces consensus, nous avons redessiné des
amorces dégénérées, en y insérant de l’Inosine, pour augmenter les chances d’amplification. En effet, les
alignements ont révélé un polymorphisme important au sein de ces gènes, même entre espèces de la même famille.
(Tab 1).
gène
amorce F
timeless
cryptochrome
period
dh-pban
lactate dehydrog.
Tpi
amorce R
tim_Kti_F
tim_Zhu_F
cry_Kti2_Ch_F
cry_Mer_Ch_F
cyc_Kti_Ch_F
per_Kti_Ch_F
per_Mer_Ch_F
tim_Kti_R
Tim_Zhu_R
cry_M_K_Ch_R
cry_M_K_Ch_R
cyc_Kti_R
per_Kti_Ch_R
per_Kti_Ch_R
per_Reg177_Ch_F
per_Reg197_Ch_F
per_Reg197_Ch_F
per_Reg341_Ch_F
per_Reg532_R
per_Reg397_Ch_R
per_Reg532_R
per_Reg532_R
pb_Jin_Ch_F
pb_Jin_Ch_R
Ldh_Dop65_F
Ldh_Dop376_R
Tpi_Kwia_Ch_F Tpi_Kwia_R
taille
(pb)
710
900
790
1200
1070
450
430
1100
700
1000
600
2700
330
500
Ref
PCR
3
4
3, 5
3, 5
3
3
3, 5
6
6
6
6
7
8
9
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Séquençage
oui
oui
oui
oui
oui
Tab. 1 Tests PCR. « Ch »dans le nom d’une amorce indique une dégénérescence supplémentaire que nous avons effectuée
après alignement. Un résultat positif d’amplification indique que des profils de bandes ont été obtenus. Les deuxièmes
amplifications ont ensuite permis d’effectuer un séquençage pour les fragments indiqués dans la dernière colonne.
Les tests PCR ont été effectués en modifiant les paramètres classiques, concentration en MgCl 2 , température
d'hybridation, temps d’élongation etc. Seules 11 paires d’amorces ont permis l’obtention d’amplifiats. Les profils
multibandes ne permettant pas de séquençage direct, nous avons dû effectuer des PCR en récupérant les amplifiats
sur gels (toothtpick method). A partir de cette deuxième amplification, nous avons obtenus des séquences pour 6
paires d’amorces et 3 gènes. Les séquences ont été finalement comparées avec les séquences des banques
Institut National de la Recherche Agronomique
Etablissement public à caractère scientifique et technologique placé sous la tutelle conjointe des ministres chargés de la Recherche et de l’Agriculture
INRA – Département EFPA - Route d’Amance – 54280 CHAMPENOUX
Tél : 03.83.39.41.04 - Fax : 03.83.39.73.19 - Mail : [email protected]
A Champenoux, le lundi 21 juillet 2011
Département Écologie des Forêts,
Prairies et milieux Aquatiques
(BLASTN), ce qui a malheureusement montré qu’aucune des bandes séquencées ne correspondait à un des gènes
recherchés.
En ce qui concerne le marqueur microsatellite MS-ThPit2, les allèles de taille moyenne et des allèles de grande
taille ont été clonés et séquencés. Cela a démontré que l'augmentation de la taille des allèles était simplement due à
une augmentation du nombre de répétition, sans polymorphisme dans les régions flanquantes ni insertion majeure.
Nous avons réalisé une recherche d'homologie de séquence par Blast sur les séquences disponibles dans les bases
de données internationales, mais n'avons obtenu aucun résultat significatif. Le génotypage de femelles a montré de
plus que ce locus n'est pas situé sur le chromosome sexuel. Nous n'avons pas réussi à l'amplifier sur les populations
Nord-Africaines pour déterminer si des allèles longs sont naturellement présents dans cette partie de l'aire de
distribution de l'insecte. De nouvelles investigations seront donc nécessaires pour proposer un scénario expliquant
l'évolution atypique de ce locus dans la population d'été.
Conclusions et perspectives :
Ce résultat négatif pour l'amplification et le séquençage de portions de gènes candidats est sans doute dû à des
amorces trop dégénérées ou à une trop grande divergence des séquences de T. pityocampa par rapport aux
Lépidoptères les mieux étudiés. Les amplifications étant réalisées à partir d’ADN génomique, alors que les
séquences disponibles dans les banques proviennent de cDNA, il est également possible que de grands introns aient
empêché l’amplification de certains fragments (par exemple le fragment de dh-pban de 330 pb de cDNA
correspond à 2720 pb avec les introns chez Clostera anastomosis).
Deux banques de cDNA viennent d’être constituées dans le cadre du réseau d’excellence Evoltree, une pour la
population d’été et une pour celle d’hiver. Nous venons juste de recevoir les résultats bruts du séquençage, soit
5000 EST pour chaque banque (10 000 séquences F ou R). Après traitement de ces données (avec l’aide d’un bioinformaticien de l’unité), il sera possible par blast de rechercher les gènes candidats directement dans ces banques,
et de redessiner des amorces non dégénérées permettant l’amplification de ces gènes dans les populations
naturelles. Ce travail sera probablement financé dans le cadre d'Evoltree (deux propositions de recherche ont été
déposées, dans le Jera2 et dans le Jera3 du réseau, réponses attendues courant mars 2009).
Au cas où ces gènes ne seraient pas présents dans ces banques, nous disposerons ultérieurement de ressources
génomiques plus importantes, puisque les deux banques seront séquencées à l'aide de la technologie 454
(pyroséquençage, environ 200 000 séquences attendues par banque courant 2009).
D'autre part, nous allons accroître le nombre de marqueurs microsatellites afin de mieux caractériser les profils
alléliques des marqueurs neutres et vérifier que le marqueur MS-ThPit2 est bien le seul à avoir des allèles
spécifiques de la population d'été. Nous bénéficierons pour cela de la mise au point de 10 nouveaux microsatellites
financée par le projet ANR 'Urticlim' et réalisée par la société Ecogenics, et des microsatellites en cours de
développement dans le cadre du réseau Evoltree.
Fin 2009, lorsque tous les outils auront été mis au point, nous envisageons de proposer un projet de recherche sur
les bases génétiques de la phénologie chez la Processionnaire du Pin dans le cadre de l'ANR 'Jeunes Chercheurs'.
Institut National de la Recherche Agronomique
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Prairies et milieux Aquatiques
Références citées
(1) Pimentel C., Calvao T., Santos M., Ferreira C., Neves M. & Nilsson J.-A. 2006. Establishment and expansion
of a Thaumetopoea pityocampa (Den. & Schiff.) (Lep. Notodontidae) population with a shifted life cycle in a
production pine forest, Central-Coastal Portugal. Forest Ecology and Management, 233: 108-115.
(2) Santos H., Rousselet J., Magnoux E., Paiva M.R., Branco M. & Kerdelhué C. 2007. Genetic isolation through
time: allochronic differentiation of a phenologically atypical population of the pine processionary moth.
Proceedings of the Royal Society of London Series B, 274: 935-941.
(3) Kourti A. & Gkouvitsas T. 2007. Insect photoperiodism and circadian clocks: expression patterns of genes
period, timeless, cycle and cryptochrome in Sesamia nonagrioides (Lepidoptera : Noctuidae). Journal of Insect
Science, Univ. Arizona, 7.
(4) Zhu H., Sauman I., Yuan Q., Casselman A., Emery-Le M., Emery P. & Reppert S. M. 2008. Cryptochromes
define a novel circadian clock mechanism in monarch butterflies that may underlie sun compass navigation.
PLoS Biology, 6: e4.
(5) Merlin C., François M.-C., Queguine I., Maïbèche-Coisné M. & Jacquin-Joly E. 2006. Evidence for a putative
antennal clock in Mamestra brassicae: Molecular cloning and characterization of two clock genes – period and
cryptochrome – in antennae. Insect Molecular Biology, 15(2): 137–145.
(6) Regier J., Fang Q., Mitter C., Peigler R., Friedlander T. & Solis M. 1998. Evolution and phylogenetic utility of
the period gene in Lepidoptera. Molecular Biology and Evolution, 15: 1172-1182.
(7) Jing T., Wang Z., Qi F. & Liu K. 2007. Molecular characterization of diapause hormone and pheromone
biosynthesis activating neuropeptide from the black-back prominent moth, Clostera anastomosis (L.)
(Lepidoptera, Notodontidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology, 37: 1262-1271.
(8) Dopman E.B., Pérez L., Bogdanowicz S.M. & Harrison R.G. 2005. Consequences of reproductive barriers for
genealogical discordance in the European corn borer. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,
102(41): 14706-14711.
(9) Kwiatowski J., Krawczyk M., Kornacki M., Bailey K. & Ayala F.J. 1995. Evidence against the exon theory of
genes derived from the triose-phosphate isomerase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,
92: 8503-8506.
Remerciements: Nous remercions Anna Kourti pour nous avoir aimablement fourni des séquences d’amorces non
publiées.
Publications éventuelles issues du projet : titres et références (avec renvoi éventuel vers le site de la revue ou vers le
numéro s'il est accessible en pdf.).
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