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Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIV, n° 1, 2002 Dépistage urinaire : les limites de Timmunoanalyse Urine screening, limitations of immunoanalysis Bernard CAPOLAGHI* Laboratoire d e Biochimie-Toxicologie, Hôpital Bel-Air, C H R Metz-Thionville - 5 7 1 0 0 T H I O N V I L L E * A u t e u r à qui adresser la correspondance : Bernard C A P O L A G H I , Laboratoire d e Biochimie-Toxicologie, Hôpital Bel-Air, C H R Metz-Thionville - B P 60327 - 5 7 1 2 6 T H I O N V I L L E C e d e x Tel : 0 3 82 55 81 99 - Fax : 0 3 82 55 82 01 - e-mail : [email protected] (Reçu le 10 février 2002 ; accepté le 20 février 2002) RÉSUMÉ SUMMARY Le dépistage de substances psychoactives est généralement synonyme de méthodes immunologiques et de prélèvement urinaire. Il s'agit d'une part de privilégier un prélèvement biologique non traumatisant et ne nécessitant pas de compétences professionnelles au niveau du recueil et d'autre part de disposer d'une technique facile à utiliser transposable aisément et automatisable. Cette adéquation théorique se heurte cependant à de nombreuses contraintes analytiques qui limitent le champ d'application du dépistage urinaire. Les méthodes immunologiques utilisent toute la reconnaissance épitopique spécifique de la molécule à doser ou du chef defile de la famille à rechercher. Par contre, la méthodologie utilisée peut être très différente tant pour la nature des anticorps utilisés que pour le choix du mode de séparation et de révélation du complexe Ag-Ac et du type de signal généré. Cette hétérogénéité des techniques explique les similitudes et les différences observées dans le dosage ou le dépistage de substances psychoactives au sein d'une matrice biologique comme le milieu urinaire. Cette matrice non protéique peutêtre considérée comme un milieu biologique de choix ; cependant, la complexité physiologique dont elle est issue induit de nombreux problèmes liés le plus souvent soit à une dilution trop importante, soit à une concentration exagérée de composés endogènes ou exogènes pouvant interférer sur les réactions immunologiques. Ces différents aspects nécessitent d'identifier clairement les incidences du choix d'une technique d'immunoanalyse en milieu urinaire sur le résultat. Psychoactive drugs ' screening usually means immunological methods and urine analysis. The goal is first to propose the use of a non-invasive sample, easy to obtain even for nonprofessional people, and also to perform the analysis with an automated convenient method. In fact, analytical problems limit the validity of urinary screening. Immunological methods are based on the reaction between a specific epitope and a dedicated antibody. Of course, antibodies can vary in different methods (monoclonal antibodies, polyclonal antibodies,...), as can also be different the ways of detection and the separation principles. This heterogeneity can explain that there are similar or divergent results between all the available methods. If urine can be considered as a first choice biological matrix, it has to be noticed that this fluid can be too concentrated, too diluted, and can also accumulate exogenous or endogenous compounds, able to interfere with the immunological reaction. The consequences are that a perfect knowledge of the analytical performances of the immunological method used is necessary to correctly interpretate the results of a urinary analysis. MOTS-CLÉS Dépistage urinaire, Immunoanalyse, KEY-WORDS Urinary screening, immunoassay, Toxicomanie. 24 Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata/2002034 addiction. Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIV, n° 1, 2002 Introduction L'immunoanaly se L a mise en évidence d ' u n e conduite addictive en milieu professionnel nécessite u n e contribution biologique pour la recherche et l'identification des substances psychoactives impliquées. L a preuve d e la réalité de c o n s o m m a t i o n repose sur des techniques de confirmation après positività d e s m é t h o d e s d e d é p i s t a g e . L ' a p p r o c h e d e première intention nécessite d ' u n e part d e privilégier u n prélèvement biologique non traumatisant, si possible n e nécessitant pas de compétences professionnelles au niveau du recueil, et d'autre part de disposer d ' u n e technique analytique facile à utiliser. L a réponse à cette problématique s'est tout naturellement orientée vers u n prélèvement urinaire associé à u n e méthode immunologique. L'évolution de l ' i m m u n o a n a l y se a permis de disposer de techniques i m m u n o l o g i q u e s faciles à utiliser, transposables et automatisables, compatibles avec u n e utilisation en routine dans le cadre du dépistage urinaire. Ces méthodes a p p a r e m m e n t simples sont en fait très complexes. Elles associent plusieurs étapes pour permettre l'identification du produit (2). Ainsi, après u n e reconnaissance épitopique spécifique d e la molécule ou du chef de file de la famille à rechercher, la m é t h o d e utilisée peut être très différente tant p o u r la nature des anticorps utilisés que pour le choix du m o d e de séparation et de révélation du c o m p l e x e A g - A c et du type d e signal généré. L'urine est en effet considérée c o m m e le milieu biologique de choix, tant par sa facilité de recueil que par ses caractéristiques physiologiques. Il s'agit en effet d ' u n e humeur biologique contenant sous formes libres et conjuguées les molécules psychoactives et leurs metabolites pendant u n e durée généralement assez longue, liée à la métabolisation du produit (tableau I) à une concentration dépendante des fonctions rénales et hépatiques du sujet ainsi que d e sa corpulence et de son état d'hydratation. L e recueil sera effectué dans un flacon à usage unique sans antiseptique, ni conservateur et conservé à 4° C. Il convient d'assurer ce recueil dans des conditions strictes d'identification et d'authenticité physiologique afin de respecter l'approche qualité de la phase pré-analytique et de n e pas induire un biais dans le résultat. P a r a l l è l e m e n t aux m é t h o d e s d ' i m m u n o a n a l y s e en milieu liquide par compétition réalisées en p h a s e h o m o g è n e ou h é t é r o g è n e ( E M I T , F P I A , C E D I A , K I M S , RIA..), de nouveaux tests i m m u n o l o g i q u e s unitaires sur support solide (immunochromatographie) sont apparus sur le m a r c h é et complètent l'offre dédiée au dépistage urinaire. A u niveau européen, le projet «Rosita» s'est fixé c o m m e objectif l'inventaire et l'évaluation de ces tests de dépistage (3). D ' a u t r e part, il est important de se prémunir contre u n e dilution ou u n e adultération d e l'urine par le patient (1) en appliquant des règles strictes au m o m e n t du recueil et en vérifiant, Te cas échéant, l'intégrité du prélèvem e n t par la m e s u r e de la créatininurie, du p H et de la température. D e la qualité du prélèvement dépend en effet le résultat. L'hétérogénéité des techniques existantes sur le m a r c h é explique les similitudes et les différences observées dans le dosage ou le dépistage de substances psychoactives au sein d ' u n e matrice biologique c o m m e le milieu urinaire. Cette matrice non protéique peut être considérée c o m m e u n milieu biologique de choix ; cependant, la complexité physiologique dont elle est issue induit de n o m b r e u x problèmes liés le plus souvent soit à u n e dilution trop importante, soit à u n e concentration exagérée de c o m p o s é s endogènes ou exogènes pouvant interférer sur les réactions i m m u n o l o g i q u e s . Tableau I : Elimination urinaire des stupéfiants. Seuil de positività Temps d'élimination (Estimation Cocaïne 300 ug/1 Benzoyl Opiacés moyenne) 2 jours Ecgonine 300 ug/1 2 jours Morphine Amphétamines 1 000 ug/1 3 jours d-Amphétamine Cannabis 50 ug/1 THC - COOH 2-4 jours (fumeur non régulier) Plusieurs semaines (fumeur régulier) 25 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIV, n° 1, 2002 Limites de l'immunoanalyse L e s partenaires d e la réaction i m m u n o l o g i q u e , l'antigèn e traceur et l'anticorps j o u e n t un rôle essentiel q u ' i l faut bien connaître p o u r interpréter correctement le résultat d ' u n e i m m u n o a n a l y s e . L a nature de l'antigène ainsi que la concentration retenue p o u r établir u n seuil de positivité ont u n rôle clé puisque chaque résultat sera interprété en c o m p a r a n t la réponse de cette m o l é cule à ce seuil. L a diversité des réponses des différentes molécules d ' u n e m ê m e classe vis-à-vis d ' u n anticorps doit inciter à la p r u d e n c e dans l'interprétation d ' u n test immunologique. L a connaissance des limites du dépistage urinaire par i m m u n o a n a l y s e est donc indispensable à son utilisation optimale. L e s performances du test utilisé en termes de sensibilité, spécificité et réactions croisées doivent être parfaitement maîtrisées en vue d ' u n e interprétation correcte du résultat. Ces indications sont données par le fournisseur et doivent être connues par le prescripteur, en particulier la nature des principales substances interférentes. L a recherche urinaire des opiacés et des a m p h é t a m i n e s est sur ce point très significative des erreurs d'interprétation q u ' i l faut absolument éviter. L e m é t a b o l i s m e des opiacés conduit à l'élimination urinaire d e la m o r p h i n e libre ou conjuguée. L'anticorps généralement utilisé reconnaît le noyau morphinane. Les urines contenant des molécules à usage thérapeutique : codéine, codéthyline, pholcodine ou des molécules d ' u s a g e illicite, 6-monoacetyl-morphine (metabolite de l'héroïne) seront indifféremment reconnues dès q u e leur concentration sera supérieure au seuil de positivité du test. A l'inverse, aucun des m o r p h i n o m i m é t i q u e s (buprénorphine, methadone, dextropropoxyphène, tramadol) dont la structure chimique correspond à u n noyau morphinane modifié n ' e n t r a î n e r a de positivité. Il y a donc lieu d'introduire la notion de présomption et non de certitude d e positivité. L a recherche d ' u n e meilleure spécificité, c'est-à-dire u n e diminution du n o m b r e de faux positifs, peut parfois être obtenue au détriment de la sensibilité en a u g m e n t a n t la valeur du seuil de positivité («cutoff»). C e fut le cas r é c e m m e n t aux Etatsunis où la Substance A b u s e and Mental Health Services Administration a relevé d e 300 à 2 0 0 0 Lig/1 le seuil d e positivité des opiacés en milieu professionnel pour réduire les faux positifs liés à la c o n s o m m a t i o n alimentaire des graines d e pavot (4). L'utilisation des trousses «amphétamines» (anticorps m o n o ou polyclonaux) d e m a n d e la m ê m e prudence d'interprétation (5) car les amines s y m p a t h o m i m é tiques, les analogues structuraux à u s a g e thérapeutique courant c o m m e les décongestionants de voies nasales 26 (éphédrine, pseudo-éphédrine, phenylpropanolamine) ou c o m m e les anorexigènes (clobenzorex, fenfluramine peuvent interférer d e façon variable. P a r ailleurs, l ' é m e r g e n c e d ' a n a l o g u e s chimiques d e l ' a m p h é t a m i n e et de la m é t h a m p h é t a m i n e (designer's drugs) c o m plique également le p r o b l è m e et nécessite lors du dépistage l ' e m p l o i d e tests plus spécifiques (6). Conclusion L'utilisation de l ' i m m u n o a n a l y s e en dépistage urinaire est a m p l e m e n t justifiée dans la mise en évidence d e conduites addictives en milieu professionnel. Cependant, elle nécessite u n e parfaite connaissance d e ces limites pour u n e utilisation optimale. L ' i m p o r t a n c e des réactions croisées illustre la n é c e s s i t é d ' u n e d é m a r c h e de confirmation d ' u n résultat positif obtenu par u n e technique i m m u n o l o g i q u e . Il convient d'opter pour u n e technique basée sur u n principe différent de la reconnaissance épitopique et présentant u n e meilleure spécificité pour u n e sensibilité au m o i n s équivalente. L e s méthodes chromatographiques sont d o n c toutes indiquées et r e c o m m a n d é e s pour cette a p p r o c h e analytique complémentaire. Références 1. Dumestre-Toulet V , Verstraete A. Les adultérants des tests urinaires. Toxicorama. 1999 ; 3 : 155-66. 2. Masseyeff R. F. Principles of Immunoassays : Classification of methods. In : Methods of Immunological Analysis. VCH, Weinheim : 1993 ; 11533. 3. Samyn N., Areschka V , Verstraete A. Evaluation de tests de dépistage des drogues sur le terrain. Ann. Toxicol. Anal., 2000 ; 2 : 105-15. 4. Lee RR, Shahala D.E. Changes to the cutoff levels for opiates for Federal Workplace Drug Testing Programs. Substance Abuse and Mental Health Services Administration. Fed Register. 1995 ; 60 : 575-85. 5. Vertraete A., Van Haute I. Spécificité des immunoessais pour la détection des amphétamines. Toxicorama. 1997 ; 2 : 65-71. 6. Lekskulchai V., Mokkhavesa X. Evaluation of Roche Abusreen Online Amphetamine Immunoassay for Screening of New Amphetamine Analogues. J. Anal. Toxicol. 2001 ; 25 : 471-5.