thèse - Myobase

 THÈSE En vue de lʹobtention du D OCT OR AT DE L ’U NIV ER SI TÉ DE T OUL OU S E Délivré par Université Toulouse III – Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Gènes, Cellules et Développement Présen tée et soutenu e par Emilie PECO Le mercredi 10 décembre Titre : Contrôle du cycle cellulaire et neurogenèse dans la moelle épinière embryonnaire des Vertébrés : Rôle de la phosphatase CDC25B JURY M me Ca th erin e SO ULA, Profe sseu r à l’U niversité P . Sabatier , Toulouse M me Ca th erin e JESS US, Directrice de recherche C NR S, P aris M . Xavie r M O RIN , C hargé de rech erch e C NRS, Marseille M me Jean nette N AR DE LL I, Cha rgée d e r echer che INS ERM, P aris M me Fabienn e PITUE LLO , Directrice d e reche rche, CN RS, Toulouse M . Berna rd D UCO M MUN , P rofesseur à l’Université P. Sabatier, T ou louse P résid ente R apporteur R apporteur R apporteur D irectrice d e thèse D irecteur de thèse Ecole doctorale : Biologie, Santé, Biotechnologies Unité de recherche : Centre de Biologie du Développement CN RS UMR 5547 Directeur(s) de Thèse : Fabienne PITUELLO et Bernard DUCOMMUN 2 Remerciements
Merci aux membres du jury, Xavier Morin, Catherine Jessus, Jeannette Nardelli et Cathy Soula
d’avoir accepté de juger mon travail de thèse. Merci également au Ministère de la recherche et à
l’Association Française contre les Myopathies grâce à qui ce travail a pu être réalisé.
Merci à Alain Vincent et Marc Haenlin, directeurs du Centre de Biologie du Développement, pour
m’avoir permis de faire partie de ce laboratoire pendant ces 4 années (et quelques) de thèse. Le CBD a des
qualités scientifiques et humaines sans précédent, au sein duquel les étudiants sont amenés à évoluer dans
une ambiance chaleureuse et non moins de qualité, sérieuse et ambitieuse. C’est ce qui fait tout le charme de
ce laboratoire : je regrette que les personnels du CBD aient trop tendance à l’oublier.
Merci à Fabienne et Bernard de m’avoir fait confiance pour réaliser ce projet commun. Je remercie
tout particulièrement Fabienne pour tout ce qu’elle m’a apporté par ses qualités scientifiques que tout
étudiant sous sa direction apprécie énormément, tout comme sa pédagogie, sa présence qui laisse une grande
place à de nombreuses et agréables discussions « de comptoir » (la paillasse des chercheurs), son humour et
surtout son don en chant...
Merci aux membres passés et présents de cette merveilleuse équipe Pituello et pour les citer je ferais
par ordre chronologique : François, Sophie, Bertrand, Valérie, Virginie, Marine, Timothé, Andrew. Un
grand merci à mon grand frère du thème Shh/CDC25, Bertrand, qui par ses travaux a initié les miens et m’a
grandement aidée à aborder ce projet de thèse avec un peu plus de sérénité. Un grand merci à Virginie pour
les travaux réalisés pendant son M2R et qui m’ont permis d’avancer dans mes études de CDC25 et pour son
amitié. Merci à François pour son immense contribution à ma thèse : j’ai gracieusement profité de ses talents
en biologie moléculaire. Heureusement pour moi notre magicien de la Bio. Mol. est toujours prêt à affronter
de nouveaux challenges : non, les enzymes de restriction ne lui font pas peur !! Je tiens aussi à le remercier
pour son humour et sa gentillesse à toute épreuve. Quelle joie de travailler avec lui ! Merci à Sophie pour
tous ses conseils avisés sur mon projet et son ouverture d’esprit, et aussi pour les nombreuses discussions et
rigolades non scientifiques et entre autres les : « mais c’est qui qui chante ? ». Merci à Marine pour ellemême : joyeuse, intelligente et sincère. Merci à Tim de prendre le relai sur ce projet pas si facile... Merci à
l’équipe Ducommun, et en particulier Odile et Christine.
Merci à l’équipe poulet d’en face : Cathy, Philippe, Nathalie, Bruno, Alex, p’tite Cathy, Yacine, Eric,
Chadi. Personne ne pourrait imaginer l’ambiance qu’ils font régner de ce côté du couloir : la colocation avec
eux est une partie de plaisir !!!
Merci à tous les membres du CBD pour leur soutien, leur dynamisme et leur sympathie. Une
attention particulière pour Alain, Seb, Bruno, Brice et Daniel qui m’ont chacun aidé à leur manière.
3 Merci à mon Rami de toujours : c’est quand tu veux où tu veux la pause kit-kat !! Merci à Jon,
« Regarde il gèle »...Merci à Alex : t’es tellement marseillais que je ne comprends toujours pas comment tu
peux supporter les Parisiens ! La vie n’a pas de sens...Merci à Gaga et Nico. Vive les Baleines !
Merci à Maman, Papa et à mes Sœurettes adorées Vivie et Sof pour leur amour et leur soutien à
toute épreuve (et je leur en fait passer des épreuves...). Merci à Tatie, Tonton, Claire et Fred. Merci à la
famille Blanc : Jean-Claude, Jérôme, Damien, et bien sûr Hélène.
Merci à toutes mes Chéries et en particulier ma Paulasse toujours là pour moi, ma Vicat, Baby Love,
mon Gérard, Véro, Titie, Mégaloche, Elo...Sans elles je n’aurais pas été capable d’aller au bout de tout ça. Je
n’oublie pas les hommes de toutes les situations et parmi les meilleurs Simon, NifNif et Nico.
Et le meilleur pour la fin : Merci à Rémy, mon Alexandre le Grand, d’exister et de m’avoir si bien
épaulée pendant toutes ces années.
A la mémoire de ma grand-mère Pilar et d’Hélène.
4 RÉSUMÉ DES TRAVAUX 5 6 Le système nerveux central est un réseau complexe de circuits élaborés formé par de nombreux types de neurones par lesquels circule l’influx nerveux, et de cellules de soutien, les cellules gliales. La neurogenèse repose sur une séquence stéréotypée d’évènements de prolifération, spécification et différenciation des cellules neurales progénitrices qui doivent être coordonnés pour générer en nombre approprié les divers types neuronaux. Initialement, la population progénitrice de la moelle épinière embryonnaire est constituée de cellules souches en prolifération capables de produire tous les types neuraux. Au cours de la neurogenèse des signaux externes vont restreindre les potentiels de ces cellules. Une cellule est instruite à acquérir un destin spécifique et ainsi à se diviser un certain nombre de fois dans ce lignage avant de se différencier en neurone post‐mitotique. Sonic Hedgehog (Shh) est un de ces signaux. L’activité de morphogène de Shh, accomplie par les facteurs de transcription GLI, intervient d’une part dans la spécification neuronale et d’autre part dans le contrôle de la prolifération. Notre objectif était d’identifier les régulateurs du cycle cellulaire médiateurs de l’action mitogène de Shh. Nous avons identifié CDC25B comme cible transcriptionnelle de Shh/GLI (Benazeraf et al., 2006). Les phosphatases de la famille CDC25 déphosphorylent et activent les complexes CDK/Cyclines responsables de la progression dans le cycle cellulaire. Les deux gènes de la famille CDC25 identifiés chez le poulet CDC25A et CDC25B sont exprimés au cours de la neurogenèse spinale. Dans ce contexte, mes travaux ont concerné la régulation transcriptionnelle et la fonction de ces phosphatases, en particulier de CDC25B. L’activation transcriptionnelle de CDC25B par la voie Shh/GLI est une réponse rapide suggérant que CDC25B soit une cible directe (Benazeraf et al., 2006). J’ai analysé in silico le locus du gène CDC25B à la recherche de sites putatifs de liaison à GLI et identifié un site conservé dans l’Intron1 du gène. Des expériences de transgénèse dans le tube neural d’embryons de poulet ont montré que l’Intron1 se comporte comme un élément cis‐
régulateur suffisant pour répondre à la voie Shh/GLI, suggérant une régulation directe de CDC25B par Shh/GLI. Les patrons d’expression différentiels de CDC25A et CDC25B dans le tube neural suggèrent qu’ils soient distinctement sollicités pendant la neurogenèse. CDC25B, au contraire de CDC25A, n’est pas exprimé dans la zone souche. Son expression initiée par Shh/GLI, est corrélée avec la différenciation neuronale. Nous avons réalisé des expériences de perte de fonction de CDC25B par interférence à l’ARN qui ont montré que l’inhibition de CDC25B réduisait significativement le nombre de neurones produits. Une hypothèse était que cet effet 7 soit dû à un défaut de prolifération qui réduirait les populations progénitrices et par voie de conséquence les neurones qui en sont issus. L’analyse de la prolifération montre qu’inhiber CDC25B a un effet mineur sur la prolifération. CDC25B est fortement exprimé dans le domaine des progéniteurs de motoneurones. Alors que la quantité de motoneurones générés est nettement diminuée, la taille de la population progénitrice n’est pas affectée voire augmentée. Cette observation montre qu’en absence de CDC25B les cellules destinées à produire des neurones sont anormalement maintenues à l’état de progéniteurs. En résumé, l’ensemble de ces données conduit à un modèle dans lequel CDC25B serait spécifiquement sollicité par Shh pour l’accomplissement d’une prolifération neurogénique. Ce contrôle par Shh permettrait de coordonner la division cellulaire au processus de spécification et de différenciation et ainsi d’assurer l’histogenèse neuronale. 8 TABLE DES MATIERES 9 10 INTRODUCTION I. CONSTRUCTION DE LA MOELLE ÉPINIÈRE EMBRYONNAIRE 17 21 I.1. INDUCTION NEURALE ET NEURULATION ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 21 I.1.01. Induction neurale: de l’ectoderme à la plaque neurale ...................................................... 21 I.1.02. La neurulation : de la plaque neurale au tube neural ......................................................... 23 I.1.03. La formation de la moelle épinière repose sur l’élongation caudale de la plaque neurale 25 I.2. ORGANISATION INITIALE DU TUBE NEURAL ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 27 I.2.01. Polarité apico‐basale des progéniteurs neuraux ................................................................. 27 I.2.02. Cycle cellulaire et Migration interkinétique des noyaux ..................................................... 29 II. LA NEUROGENÈSE 33 II.1. L’ANTAGONISME ENTRE LES SIGNALISATIONS DU FGF ET DE L’ACIDE RÉTINOIQUE CONTRÔLE L’INITIATION DE LA NEUROGENÈSE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 33 II.2. L’ACQUISITION DES IDENTITÉS RÉGIONALES RÉGIT LA DIVERSITÉ NEURONALE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 35 II.2.01. L’identité rostro‐caudale est acquise progressivement au cours de la maturation du tube neural ......................................................................................................................................... 35 II.2.02. La régionalisation dorso‐ventrale ou spécification des progéniteurs ................................. 37 II.3. ENGAGEMENT DANS LA DIFFÉRENCIATION ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 47 II.4. LES DIVISIONS NEUROGÉNIQUES ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 51 II.5. DÉTERMINATION DES SOUS‐TYPES NEURONAUX ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 55 II.5.01. Les protéines à bHLH et à homédomaines interviennent dans la spécification des sous‐
types neuronaux............................................................................................................................... 55 II.5.02. L’acide rétinoique est requis tout au long de la formation des motoneurones ................. 55 III. INTÉGRATION DU CONTRÔLE DU CYCLE CELLULAIRE DANS LE PROCESSUS DE NEUROGENÈSE 57 III.1. LA MACHINERIE DU CYCLE CELLULAIRE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 59 III.2. LES FACTEURS RÉGULANT LA PROGRESSION DANS LE CYCLE CELLULAIRE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 60 III.2.01. Les Protéines de différenciation inhibent la progression dans le Cycle Cellulaire .............. 60 III.2.02. les Mitogènes Favorisent la progression dans le cycle cellulaire ........................................ 63 III.3. LES PHOSPHATASES DE LA FAMILLE CDC25 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 71 III.3.01. Introduction ......................................................................................................................... 71 III.3.02. Rôles des CDC25 au cours du cycle cellulaire ...................................................................... 71 III.3.03. Les CDC25s au cours du développement embryonnaire .................................................... 73 OBJECTIFS 75 RÉSULTATS 77 I. RÉGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DE CDC25B PAR LA VOIE DE SIGNALISATION SHH/GLI 78 IDENTIFICATION DES ÉLÉMENTS DE RÉGULATION DE CDC25B SUSCEPTIBLES DE RÉPONDRE À SHH/GLI ‐‐‐ 79 L’INTRON1 DE CDC25B EST SUFFISANT POUR RÉPONDRE À LA VOIE DE SIGNALISATION SHH/GLI ‐‐‐‐‐‐‐‐ 83 II. LES PHOSPHATASES CDC25A ET CDC25B SONT EXPRIMÉES TOUT LE LONG DE LA NEUROGENÈSE SPINALE 87 II.1. CDC25A ET CDC25B SONT DIFFÉREMMENT EXPRIMÉS ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 87 II.1.01. L’expression de CDC25B est corrélée aux phases de production neuronale ...................... 87 II.1.02. CDC25B est fortement exprimé dans la zone de transition ................................................ 91 II.1.03. Étude du comportement prolifératif des cellules dans les territoires exprimant des combinaisons différentes de CDC25A et B ....................................................................................... 93 II.2. ESSAIS DE LOCALISATION DE LA PROTÉINE CDC25B AVIAIRE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 93 III. ÉTUDE DE LA FONCTION DES PHOSPHATASES CDC25 AU COURS DE LA NEUROGENÈSE 97 III.1. LES CDC25 AVIAIRES ONT UNE ACTIVITÉ CATALYTIQUE CONSERVÉE ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 97 III.1.01. Test de complémentation chez la levure S.pombe ............................................................. 97 III.1.02. Essais de surexpression de CDC25B dans le tube neural aviaire ....................................... 101 III.2. ANALYSE DU RÔLE DE CDC25B DANS LA NEUROGENÈSE SPINALE PAR INTERFÉRENCE À L’ARN‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 103 III.2.01. Conception des outils pour inhiber la fonction de CDC25B .............................................. 103 I.1. I.2. 11 III.2.02. Réduire l’expression de CDC25B n’empêche pas les cellules neuro‐épithéliales de se diviser ....................................................................................................................................... 105 III.2.03. La production neuronale est diminuée suite à l’inhibition de CDC25B ............................ 107 III.2.04. Les populations neuronales dorsales et ventrales sont affectées .................................... 109 III.2.05. Les progéniteurs des motoneurones sont anormalement maintenus dans la zone ventriculaire ................................................................................................................................... 111 III.2.06. Les populations tardives de motoneurones sont produites avec du retard et en nombre moindre ....................................................................................................................................... 113 DISCUSSION I. CDC25B, UNE NOUVELLE CIBLE DIRECTE DE LA SIGNALISATION SHH/GLI ? II. FONCTION DÉVELOPPEMENTALE DE CDC25B DANS LA NEUROGENÈSE SPINALE 115 117 119 CARACTÉRISATION DES CDC25 AVIAIRES ET RÔLE DE CDC25B DANS LA PROLIFÉRATION DES CELLULES PROGÉNITRICES ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 119 II.2. LA PRODUCTION NEURONALE DIMINUE SUITE À LA DÉLÉTION DE CDC25B ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 121 II.3. LES PROGÉNITEURS DES MOTONEURONES SONT ANORMALEMENT MAINTENUS ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 122 II.4. UN RÔLE INATTENDU DE CDC25B DANS LES DIVISIONS NEUROGÉNIQUES ? ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 122 II.5. FONCTION DE CDC25B SUR LA SORTIE DU CYCLE CELLULAIRE ET LES FACTEURS NEUROGÉNIQUES ‐‐‐‐‐‐‐ 124 II.1. CONCLUSION 127 BIBLIOGRAPHIE 131 ANNEXES 145 ‐‐ Annexe I: Bénazéraf B. et al., 2006 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 147 ‐‐ Annexe II: Peco E. et al., soumis ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 165 12 LISTE DES FIGURES Figures de la partie Introduction : Figure 1. Vue d’ensemble du système nerveux central. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 18 Figure 2. L’induction neurale. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 20 Figure 3. La neurulation primaire est le processus au cours duquel la jeune plaque neurale est façonnée en tube neural. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 22 Figure 4. Organisation du tube neural et des cellules neuroépithéliales qui le composent. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 26 Figure 5. Migration interkinétique des noyaux des cellules du neuro‐épithélium en fonction du cycle cellulaire et différenciation neuronale. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 30 Figure 6. L’antagonisme entre les voies de signalisation du FGF et de l’acide rétinoique contrôle l’initiation de la neurogenèse. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 32 Figure 7. L’information de position rostro‐caudale est acquise au fur et à mesure que les régions postérieures du système nerveux central se forment. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 34 Figure 8. La régionalisation fonctionnelle de la moelle épinière adulte dérive de la régionalisation dorso‐ventrale du tube neural en domaines de progéniteurs. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 36 Figure 9. Voies de signalisation contrôlant la régionalisation dorso‐ventrale. Erreur ! Signet non défini. Figure 10. La voie de signalisation du morphogène Sonic Hedgehog et ses principaux intervenants. ‐ 38 Figure 11. Régulation des facteurs de transcription à homéodomaines et à domaines bHlH de régionalisation par les voies de signalisation extracellulaires. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 40 Figure 12. La voie de signalisation WNT canonique et ses principaux intervenants. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 44 Figure 13. Initiation de la différenciation neuronale: signalisation Notch/Delta et gènes proneuraux. ‐ 48 Figure 14. Résumé des différents types de gènes et de leurs interactions mis en jeu pour la régionalisation dorso‐ventrale et la différenciation des progéniteurs neuraux en neurones post‐
mitotiques matures. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 50 Figure 15. Principaux acteurs du cycle cellulaire ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 58 Figure 16. Les voies de signalisation de Wnt et de Shh contrôlent la prolifération des cellules progénitrices neurales. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 62 Figure 17. Composants du cycle cellulaire activés par la voie de signalisation Wnt, Shh/GLI et par les gènes de différenciation. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 68 Figure 18. La famille des phosphatases CDC25 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 70 Figures de la partie Résultats : Figure 19. Analyse in silico du locus du gène CDC25B. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 80 Figure 20. Expression de la β‐galactosidase dépendante du mIntron1. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 82 Figure 21. Patrons d’expression des phosphatases CDC25A et CDC25B au cours de la neurogenèse dans l’embryon de poulet. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 86 Figure 22. L’expression de CDC25B est corrélée aux phases de production neuronale. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 88 Figure 23. CDC25B est exprimé à la transition entre zone ventriculaire et zone de différenciation ‐‐‐‐‐ 90 Figure 24. Étude du comportement prolifératif des cellules progénitrices exprimant des combinatoires distinctes de phosphatases CDC25. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 92 Figure 25. La protéine CDC25B ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 94 Figure 26. Test de complémentation chez la levure S.pombe cdc25‐22. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 96 Figure 27. Essais de surexpression de CDC25B dans le tube neural ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 100 Figure 28. Utilisation de la technique d’interférence à ARN pour inhiber CDC25B. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 102 Figure 29. Réduire l’expression de CDC25B n’empêche pas les cellules de proliférer. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 104 Figure 30. Réduire l’expression de CDC25B diminue la quantité de neurones produits. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 106 Figure 31. La survie cellulaire n’est pas affectée suite à la délétion de CDC25B.‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 106 Figure 32. Effet de la réduction de CDC25B sur les populations de motoneurones et d’interneurones108 Figure 33. La délétion de CDC25B augmente le nombre de progéniteurs des motoneurones. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 110 Figure 34. La délétion de CDC25B entraine un retard dans la production des populations tardives de motoneurones. ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 112 13 14 LISTE DES ABREVIATIONS aPKC ADN ARN bHlH BMP BrdU CCRR CDC25 CDK CHK CKI CMV D(1‐6) Ebf FGF GFP GMC GSK3β H3P Hes HH Id Lef/TCF LMC LRP Mash1 Ngn PAR Pax PP PT Ptc RA RALDH2 RAR/RXR Shh siARN Smo SNC TUNEL ZO atypical Protein Kinase C Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique basic Helix loop Helix Bone Morphogenetic Protein Bromo déoxy Uridine Cell Cycle Related Repressor Cell Division Cycle 25 Cyclin‐Dependent Kinase Checkpoint Kinase Cyclin‐dependent kinase inhibitor Cytomégalovirus Neurons dorsaux Early B cell Factor Fibroblast Growth Factor Green Fluorescent Protein Ganglion mother cell Glycogen Synthase Kinase 3β Histone H3 phosphorylé homologues des gènes de Drosophile Hairy and Enhancer of Split Hambergur and Hamilton (auteurs d’une table de développement de poulet) Inhibiteurs de différenciation Lymphoid enhanced factor/T‐cell Factor lateral motor colomn Low‐density lipoprotein Receptor‐related Protein Mouse Achaete Scute homogue Neurogénine PARtitioning defective protein Paired‐type box Plaque du plancher Plaque du toit Patched Acide Rétinoique Rétinaldéhyde déshydrogénase 2 Récepteurs de l’Acide rétinoique Sonic Hedgehog small interference ARN Smoothened Système Nerveux Central Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin‐dUTP Nick End Labeling Zona Occludens 15 16 INTRODUCTION Système nerveux central
Moelle épinière humaine
Coupe sagittale obtenue par
imagerie à résonance magnétique
Antérieur = Rostral
Encéphale
Cerveau
postérieur
Moelle épinière
Moelle épinière
Vertèbres
www.csmc.edu/images/MRI-Spine-9238.jpg
Postérieur = Caudal
Figure 1. Vue d’ensemble du système nerveux central. 18 Introduction Avant propos Le système nerveux des Vertébrés se compose de deux entités : le système nerveux central (SNC) qui reçoit et traite de façon appropriée les informations émanant de la périphérie et le système nerveux périphérique (nerfs) qui relie le SNC aux organes périphériques. Anatomiquement, le SNC est constitué dans sa partie antérieure (dite rostrale) de l’encéphale logé dans la boîte crânienne (cerveau, tronc cérébral et cervelet) et dans sa partie postérieure (dite caudale) de la moelle épinière située dans le canal rachidien (figure 1). Dans l’introduction, nous décrirons les différents évènements mis en jeu au cours de la formation de la moelle épinière chez les Vertébrés aux niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire. Les notions développées permettront d’aborder sereinement les études qui seront présentées dans la partie « Résultats » et les interprétations proposées dans la partie « Discussion ». 19 19 Hypoblaste
Epiblaste
A
Futur territoire neural
Site d’injection du marqueur DiI
Futur épiderme
B
Ligne primitive
E
Plaque neurale
Nœud de Hensen
Zone souche présomptive
C
D
Corde
Somite
Mésoderme présomitique
Zone souche
Figure 2. L’induction neurale. A‐ Première phase d’induction neurale. Les cellules de l’épiblaste médian sont orientées vers une
destinée neurale (en bleu, territoire neural présomptif). B‐ Début de la gastrulation avec la formation de la ligne primitive qui va s’allonger antérieurement.
Les cellules superficielles s’invaginent à partir de la ligne primitive (flèches vertes). C‐ La ligne primitive a fini son allongement antérieur: le Nœud de Hensen se forme et va stabiliser la destinée neurale du territoire épiblastique médian. D‐ Recul postérieur de la ligne primitive et du Nœud de Hensen. E‐ Lorsqu’au stade HH6 une goutte de DiI est déposée au niveau de la zone souche, les cellules marquées avec le DiI se retrouvent dispersées dans toute la moelle épinière et le cerveau postérieur,
preuve de l’existence de la zone souche caudale (Brown et al., 2000). 20 Introduction I. CONSTRUCTION DE LA MOELLE ÉPINIÈRE EMBRYONNAIRE I.1.INDUCTION NEURALE ET NEURULATION I.1.01.INDUCTION NEURALE: DE L’ECTODERME À LA PLAQUE NEURALE Le SNC se forme à partir d’une structure embryonnaire simple, le tube neural lui‐
même dérivé de l’épiblaste (ou ectoderme), feuillet embryonnaire dorsal. Dans l’embryon de poulet, l’induction neurale est réalisée en deux phases temporellement distinctes qui reposent sur une cascade d’évènements moléculaires faisant intervenir les tissus environnants en cours de développement (figure 2). Au cours de la première phase, qui a lieu avant la gastrulation, la signalisation du FGF (Fibroblast Growth Factor) oriente les cellules de l’épiblaste central vers une destinée neurale (figure 2A) (Wilson et al., 2000; Wittler et al., 2004). La source de FGF pourrait être la partie postérieure du blastoderme (qui est à l’origine de la ligne primitive) mais aussi l’hypoblaste (futur feuillet endodermique extra‐cellulaire) s’étendant au‐dessous de l’épiblaste. L’action du FGF sur l’épiblaste médian réprime la signalisation du BMP (Bone Morphogenetic Protein) active ubiquitairement dans l’épiblaste ; la présence de Wnt dans les parties latérales empêche cette répression et favorise l’identité épidermique (Liu et al., 2005). La deuxième phase s’opère au cours de la gastrulation et consiste en la stabilisation de la destinée neurale des cellules de l’épiblaste médian toujours associée à la répression de la destinée épidermique. A la future extrémité postérieure de l’embryon se forme un épaississement qui va être à l’origine de la ligne primitive (le blastopore des Amphibiens) (figure 2A‐B). C’est au niveau de la ligne primitive que les cellules superficielles s’invaginent pour mettre en place tout d’abord le feuillet endodermique puis le feuillet mésodermique qui se localisera entre l’ectoderme et l’endoderme profond. La formation de la ligne primitive est l’évènement qui initie la gastrulation. La ligne primitive commence son allongement le long de l’axe antéro‐postérieur et arrivée au bout de sa course, à son extrémité antérieure se forme un renflement qui correspond au Nœud de Hensen ou organisateur de Spemann chez l’Amphibien (figure 2C). L’organisateur de Spemann des Amphibiens, représenté par la lèvre dorsale du blastopore, a été identifié au début des années 20 par Spemann et Mangold comme étant capable de conférer l’identité 21 21 Embryon de Poulet HH10
1,5 jours de développement (E1.5)
Embryon entier
Coupes transversales
Rostral
1
2
4
3
3
4
2
1
Developmental Biology 6th edition Scott F. Gilbert
Caudal
Figure 3. La neurulation primaire est le processus au cours duquel la jeune plaque
neurale est façonnée en tube neural. Dans un embryon de poulet au stade HH10 ou E1.5 on peut observer les différents stades de
morphogenèse du tube neural : (1) stade plaque neurale juste après l’induction neurale, (2) la courbure
de la plaque neurale en gouttière neurale, (3) la convergence des bourrelets neuraux et (4) leur fusion
pour former le tube neural. 22 Introduction neurale à l’ectoderme (Stern, 2005). Le Nœud de Hensen va exercer son action d’inducteur neural en produisant Noggin et Chordin, des antagonistes du BMP (Wittler & Kessel, 2004). Les cellules du neurectoderme ainsi stabilisées dans leur identité neurale expriment des facteurs de transcription de la famille SoxB1 tel que Sox2 (Briscoe et al., 2008) et sont à partir de là insensibles à l’influence pro‐épiderme du BMP. I.1.02.LA NEURULATION : DE LA PLAQUE NEURALE AU TUBE NEURAL Une fois son identité neurale acquise, le neurectoderme flanqué latéralement de l’ectoderme épidermique subit de grands remaniements morphologiques afin d’aboutir à la formation du tube neural primitif qui sera à l’origine de tout le SNC. C’est ce qu’on appelle la neurulation (figure 3) (Colas et al., 2001). Neurulation primaire Les cellules du neurectoderme s’agrandissent en hauteur structurant un épithélium cylindrique, la plaque neurale, qui contraste alors nettement avec l’épithélium cubique pré‐
épidermique (figure 3‐1). Puis les bords de la plaque neurale s’épaississent pour former les bourrelets neuraux bilatéraux. Ces derniers vont se soulever et converger vers la ligne médiane entrainant la courbure de la plaque neurale en gouttière neurale (figure 3‐2,3). L’accolade des bourrelets neuraux et leur fusion signent la fermeture de la gouttière neurale en tube neural alors isolé de l’ectoderme épidermique qui le recouvre. Les cellules à la jonction donneront naissance aux cellules de crêtes neurales qui vont rapidement migrer hors de cette région. Elles seront à l’origine d’une grande diversité de cellules dispersées dans tout l’organisme telles que les cellules des ganglions du système nerveux périphérique mais aussi des cellules du squelette cranio‐facial et des cellules pigmentaires. Neurulation secondaire Le tube neural caudal, au niveau des vertèbres lombaires et sacrées, se forme par un autre mécanisme : la neurulation secondaire. Il consiste en la formation d’un cordon médullaire (au lieu d’une plaque). Au sein de ce cordon apparaissent des cavités dont la fusion permettra la formation du tube neural. 23 23 Les régions antérieures du SNC dont le prosencéphale qui sera à l’origine du tél‐ et du di‐encéphale, le mésencéphale, le rhombencéphale qui sera à l’origine du més‐ et du mét‐
encéphale, et les régions cervicales et thoraciques de la moelle épinière sont issues de la neurulation primaire. Les régions lombaires et sacrées de la moelle épinière sont formées par neurulation secondaire (Muhr et al., 1999). Les régions les plus antérieures du système nerveux central entament leur neurulation alors que caudalement la plaque neurale est en pleine extension (figure 3). Ainsi dans un embryon de poulet au stade 1,5 jours, soit stade Hamburger et Hamilton 10 (HH10), le tube neural montre différents degrés de maturation selon l’axe rostro‐caudal, les stades les plus avancés se trouvant dans les régions rostrales. La maturation du mésoderme présomitique (cʹest‐à‐dire sa segmentation en somites) se fait elle aussi de façon coordonnée avec l’extension de l’axe du corps et donc avec l’allongement et la maturation du tissu neural. 24 Introduction I.1.03.LA FORMATION DE LA MOELLE ÉPINIÈRE REPOSE SUR L’ÉLONGATION CAUDALE DE LA PLAQUE NEURALE Les régions de la moelle épinière issues de la neurulation primaire vont être formées par l’élongation progressive de la plaque neurale selon une séquence rostro‐caudale qui suit l’extension de l’axe du corps (figure 2 C‐E). L’élongation de la plaque neurale repose sur l’existence d’une zone souche caudale au niveau de la plaque neurale caudale. Cette région est constituée d’un pool de cellules progénitrices résidentes indifférenciées et en intense prolifération. Leur division cellulaire génère de nouvelles cellules qui par des mouvements d’extension convergente vont peupler la plaque neurale juste au dessus et permettre son élongation caudale (Brown & Storey, 2000; Mathis et al., 2001; Mathis et al., 2000). Le FGF (en particulier le FGF8) est à l’origine de la spécification de la plaque neurale caudale: les cellules souches caudales se distinguent par l’expression de gènes activés par le FGF tel que le gène à homéodomaine Sax1 (Spann et al., 1994) ou le gène homologue des proneuraux de Drosophile Cash4 (Bertrand et al., 2000; Henrique et al., 1997). Le FGF contribue également au maintien d’un pool de progéniteurs crucial pour assurer l’élongation caudale du tube neural (Mathis et al., 2001). Enfin, le FGF contrôle la prolifération dans cette zone par un mécanisme mettant en jeu la signalisation Notch/Delta1. Dans ce contexte une forte activité de la voie Notch requise pour la prolifération résulte en de forts niveaux d’expression de Notch et Delta1 dans toutes les cellules de la zone souche (Akai et al., 2005; Hammerle et al., 2007). 25 25 A.
Dorsal
Apical
Basal
PT
Zone ventriculaire
PP
Ventral
B.
Chorde
Apical
Basal
Membrane plasmique apicale
Jonctions d’adhérence
Membrane plasmique basale
Lumen
Figure 4. Organisation du tube neural et des cellules neuroépithéliales qui le
composent. A‐ Représentation schématique du tube neural en coupe transversale. Plaque du toit (PT), Plaque du
plancher (PP). Aux stades jeunes, le tube neural est constitué d’une seule couche: la zone
ventriculaire qui contient les cellules progénitrices neurales en prolifération. B‐ Polarité apico‐basale des cellules neuroépithéliales. 26 Introduction I.2.ORGANISATION INITIALE DU TUBE NEURAL Quand le tube neural vient de se former sa paroi est –tout comme dans la plaque neurale‐ composée d’une unique couche de cellules formant un neuro‐épithélium dit pseudo‐stratifié, et appelé zone ventriculaire (figure 4A). Les cellules de la zone ventriculaire sont des cellules souches neurales multipotentes en constante prolifération et qui seront à l’origine de tous les lignages neuronaux et gliaux. Au sein du tube neural, deux régions se comportent différemment. Ces régions ne sont pas à l’origine du lignage neural et prolifèrent peu mais seront les sources de molécules signalisatrices jouant un rôle primordial dans la régionalisation du tube neural (figure 4A): • la plaque du toit qui définit l’extrémité dorsale du tube. Elle est induite au cours de la fermeture du tube neural par l’action du BMP issu de l’ectoderme non neural adjacent. • la plaque du plancher qui constitue l’extrémité ventrale du tube. Sa différenciation est dépendante de l’action de Shh (Sonic Hedgehog) issu de la chorde, un autre centre de signalisation organisateur.
I.2.01.POLARITÉ APICO‐BASALE DES PROGÉNITEURS NEURAUX Les cellules progénitrices neurales sont hautement polarisées le long de leur axe apico‐
basal. Elles s’étendent de tout leur long sur l’épaisseur du tube chacune connectant par leurs « pieds » les surfaces du tube neural (figure 4B). L’extrémité apicale constitue la surface intérieure du tube neural qui entoure le lumen (ou canal central) et est ainsi exposée au fluide ventriculaire. Le « pied » apical permet l’adhésion entre cellules adjacentes grâce aux jonctions d’adhérence dont l’intégrité repose entre autres sur les protéines de la famille des cadhérines attachées au cytosquelette d’actine grâce à des protéines de liaison, les caténines (Aaku‐Saraste et al., 1996). Ainsi les jonctions d’adhérence assurent le maintien de la polarité apico‐basale et de l’architecture de l’épithélium (Chenn et al., 1998; Gotz et al., 2005). Les régions basales des cellules contactent la lamina basale à la périphérie externe du tube neural. La membrane plasmique basale ne semble pas contenir de jonctions particulières mais on y trouve des récepteurs aux constituants de la matrice extra‐cellulaire (Gotz & Huttner, 2005). Cette différence de composition entre les membranes apicales et basales contribue fortement à la polarité apico‐basale du tube neural. La polarité des cellules du tube neural est distincte de celle des cellules de la plaque neurale. En effet, les membranes apicales et basales des cellules de la plaque neurale contiennent des jonctions serrées 27 27 (occludin, ZO‐1). Quand le tube se forme ces jonctions sont perdues et à la place apparaissent les jonctions d’adhérence (ZO‐1, cadhérines) mais seulement à la membrane apicale (Aaku‐
Saraste et al., 1996). 28 Introduction I.2.02.CYCLE CELLULAIRE ET MIGRATION INTERKINÉTIQUE DES NOYAUX Les cellules neuroépithéliales sont en intense prolifération tout au long de la formation de la moelle épinière (figure 5A‐A’‐C). Leur noyau est en mouvement constant au sein du cytoplasme, évoluant entre les limites apicales et basales de la zone ventriculaire donnant la fausse impression que le neuro‐épithélium est multi‐couches (Hollyday, 2001). Ce processus est la migration interkinétique des noyaux : la position apico‐basale du noyau évolue en fonction du cycle cellulaire (figure 5C) (Frade, 2002). La migration interkinétique des noyaux est un processus caractéristique des régions du système nerveux central. Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires qui la contrôlent et la lient au cycle cellulaire restent inconnus à ce jour, de même que sa fonction pour l’accomplissement de la neurogenèse. Le cycle cellulaire est une succession invariable de phases qui va aboutir à la génération de deux cellules filles à partir d’une cellule mère (Meijer, 2003). Les phases sont au nombre de quatre (figure 5C) : deux phases de Gap G1 et G2 qui préparent respectivement les cellules à réaliser les phases clés de réplication de l’ADN (phase S) et de division cellulaire (phase de Mitose). Au cours de la mitose, les chromosomes dupliqués sont ségrégés et répartis aux deux cellules filles. Lorsque les cellules ne se divisent pas elles sont dites quiescentes, ou post‐mitotiques et sont dites en phase G0. Les quatre phases se succèdent dans cet ordre invariable et une phase ne peut commencer que si la précédente s’est parfaitement déroulée. 29 29 A’
A
C
BrdU / H3P
Mitose
G1
(C)
Cycle cellulaire
G2
G0
S
Zone ventriculaire
B’
Phases de Gap
G0
G1
Neurones
Phase S
BrdU+
(C)
Apical
Mitose
H3P+
Lumen
B
Basal
G2
Zone de différentiation
(zone du manteau)
Zone de transition Figure 5. Migration interkinétique des noyaux des cellules du neuro‐épithélium en
fonction du cycle cellulaire et différenciation neuronale. A‐ Tube neural jeune monocouche (zone ventriculaire). B‐ Tube neural multicouches : la couche externe (zone de différenciation ou zone du manteau) est
formée par les neurones. A’‐B’‐ Images du tube neural en microscopie à fluorescence montrant les progéniteurs en phase S
(BrdU) et en mitose (H3P) à E1.5 et les neurones différenciés localisés en périphérie à E3.5 grâce à un
marquage de la β‐tubuline III. C‐ Cycle cellulaire et migration interkinétique des noyaux. Les noyaux des cellules du tube neural
migrent le long de l’axe apico‐basal en fonction de la phase du cycle cellulaire dans laquelle la cellule
se trouve. 30 Introduction Dans le tube neural, le noyau est situé le plus basalement lorsque la cellule est en phase S (BrdU+) (figure 5A’‐C). A la fin de la phase S, le noyau de phase G2 se déplace en direction du lumen. La cellule commence à s’arrondir à la surface apicale tout en conservant un processus basal et entreprend la phase de division cellulaire (H3P+) (figure 5A’‐C). Après la cytokinèse les cellules filles peuvent soit rester dans le cycle cellulaire soit sortir du cycle cellulaire pour se différencier en neurones. Les cellules filles qui restent dans le cycle cellulaire ont hérité de la portion membranaire apicale (Gotz & Huttner, 2005; Wodarz et al., 2003) et entament un nouveau cycle cellulaire : leur noyau de phase G1 va migrer basalement puis elles vont entrer en phase de réplication de l’ ADN. Au cours de la phase neurogénique, au moins une des deux cellules filles quittent le cycle cellulaire : elles vont alors renouveler un processus apical (Mizuhara et al., 2005), migrer basalement puis perdre leur attachement à la surface apicale et migrer vers la surface externe basale. Elles vont s’accumuler à la périphérie du tube pour former une nouvelle stratification : la zone du manteau où elles entament leur différenciation (figure 5B, B’). Les premières cellules à se différencier correspondent aux neurones, les cellules gliales (oligodendrocytes et astrocytes) seront générées plus tardivement. La couche contenant les corps des neurones formera la substance grise. Les prolongements des neurones sortent de la zone du manteau et feront partie de la substance blanche. 31 31 Rostral
Gradient de neurogenèse
Tube neural
Somites
Mésoderme
présomitique
Pré‐
tube
neural
Mésoderme
Présomitique
caudal
Plaque neurale
caudale
Caudal
RA
Initiation de la différenciation neuronale
Æinhibition latérale Notch/Delta
Zone de transition
ÆDelta commence à se restreindre à quelques cellules
FGF
Zone souche
Æ Expression uniforme de Notch et Delta
Nœud de Hensen
Figure 6. L’antagonisme entre les voies de signalisation du FGF et de l’acide
rétinoique contrôle l’initiation de la neurogenèse. La signalisation du FGF issue de la plaque neurale et du mésoderme présomitique maintient les
cellules du neuroépithélium dans un état immature et inhibe la différenciation neuronale. L’atténuation
du FGF et l’apparition dans le mésoderme présomitique rostral et les somites de l’acide rétinoique (RA)
permettent l’initiation de la neurogenèse. 32 Introduction II. LA NEUROGENÈSE II.1.L’ANTAGONISME ENTRE LES SIGNALISATIONS DU FGF ET DE L’ACIDE RÉTINOIQUE CONTRÔLE L’INITIATION DE LA NEUROGENÈSE L’initiation de la neurogenèse a lieu à la transition entre la zone souche et le tube neural, dans une région appelée pré‐tube neural (figure 6). En effet, lorsque les cellules neurales sortent de la zone souche elles entrent dans le pré‐tube neural rostralement au Nœud de Hensen puis vont peupler le jeune tube neural (figure 6) (Diez del Corral et al., 2002). Dans la région caudale du pré‐tube le FGF issu du mésoderme présomitique caudal maintient les cellules dans un état prolifératif indifférencié et inhibe l’expression des gènes impliqués dans la régionalisation dorso‐ventrale du tube neural et la spécification neuronale. Ainsi il prévient l’initiation prématurée de la neurogenèse (Bertrand et al., 2000; Diez del Corral et al., 2003; Novitch et al., 2003). De façon opposée l’acide rétinoique issu du mésoderme présomitique rostral ou des somites permet d’initier le programme de spécification neuronale et de différenciation. Ces deux signaux exercent un antagonisme mutuel (Delfino‐Machin et al., 2005; Diez del Corral et al., 2002; Diez del Corral et al., 2003). Ainsi les cellules progénitrices neurales se retrouvent progressivement libérées de l’influence du FGF et exposées à l’acide rétinoique. Elles perdent leurs caractéristiques de cellules souches caudales cʹest‐à‐dire l’expression de Cash4 et Sax1 (Diez del Corral et al., 2002; Henrique et al., 1997) et commencent à exprimer des gènes conférant une identité régionale tel que le facteur de transcription Pax6. C’est le début de la neurogenèse. L’expression mosaïque de Delta1 commence à se renforcer dans quelques cellules sélectionnées pour entreprendre la différenciation neuronale et l’expression de NeuroM un facteur de transcription à domaine bHlH (basic Helix‐loop‐Helix) marqueur précoce générique de la différenciation neuronale est initiée (Diez del Corral et al., 2002; Roztocil et al., 1997). Il a été montré que le FGF inhibe l’expression de NeuroM, alors que le RA l’induit (Diez del Corral et al., 2003). 33 33 Figure 7. L’information de position rostro‐caudale est acquise au fur et à mesure
que les régions postérieures du système nerveux central se forment. L’action combinée des signalisations Wnt, RA et FGF spécifie des profils d’expression de gènes Hox
caudaux. Ces gènes détermineront l’identité de deux classes majeures de motoneurones caractérisées
par des projections axonales distinctes : ventrales (vMN) et dorsales (dMN). Les vMN sont largement
représentés dans la moelle épinière, les dMN sont présents dans le cerveau postérieur (cHB pour
« caudal hindbrain ») et la moelle épinière cervicale (cSC pour « caudal spinal cord »). Moelle épinière
rostrale (rSC pour « rostral spinal cord »). Issu de (Nordstrom et al., 2006). 34 Introduction II.2.L’ACQUISITION DES IDENTITÉS RÉGIONALES RÉGIT LA DIVERSITÉ NEURONALE Initialement la population neurale progénitrice est homogène, constituée de cellules neurales en prolifération capables de produire tous les types neuraux. La régionalisation du tube neural va informer les cellules neuroépithéliales de leur position selon les axes rostro‐
caudal et dorso‐ventral. Cette information de position est transmise par des signaux externes dont l’interprétation par la cellule les recevant va l’engager vers une destinée neuronale ou gliale bien précise. Ainsi un progéniteur neural du cerveau aura une identité distincte d’un progéniteur de la moelle épinière dorsale ou ventrale. Le facteur temps va aussi influencer le destin cellulaire puisque les neurones sont typiquement produits avant les cellules gliales. II.2.01.L’IDENTITÉ ROSTRO‐CAUDALE EST ACQUISE PROGRESSIVEMENT AU COURS DE LA MATURATION DU TUBE NEURAL La moelle épinière acquiert son identité progressivement au cours de l’élongation de la plaque neurale, par exposition à des signaux caudalisants : Wnt, FGF et l’acide rétinoique (RA) (figure 7) (Stern, 2005). Ces signaux induisent l’expression de gènes HOX qui sont les marqueurs de l’identité de position rostro‐caudale. La caudalisation établit des domaines chevauchants d’expression des gènes Hox (figure 7) (Bel‐Vialar et al., 2002; Liu et al., 2001; Muhr et al., 1999). L’expression de Hoxb8 identifie la région de la moelle épinière (Muhr et al., 1999). L’induction de l’expression de ces gènes repose sur l’antagonisme du FGF et du RA (Bel‐Vialar et al., 2002; Liu et al., 2001). Le RA produit par le mésoderme paraxial et les somites induit l’expression de gènes Hox caractéristiques du rhombencéphale caudal et de la moelle épinière rostrale (Wilson & Maden, 2005). Le FGF va progressivement induire l’expression de gènes HoxC plus caudaux de façon dose‐dépendante. L’effet de cet antagonisme sur l’identité de position rostro‐caudale ne se réalise que si au préalable Wnt a établi un contexte de position (Nordstrom et al., 2006). Au sein de la moelle épinière, les gènes Hox vont se réprimer mutuellement pour établir des limites rostro caudales définitives qui mèneront à une régionalisation plus fine: cervical, brachial, thoracique, lombaire et sacrée. Cette régionalisation préfigure la génération de sous types de motoneurones à différents niveaux selon l’axe rostro‐caudal (Jessell et al., 2000; Wilson & Maden, 2005). 35 35 A. Domaines de progéniteurs
B. Circuits fonctionnels C.
Neurones
principaux
Lhx2/9
Neurones sensoriels
Islet1
Lim1/2 ‐ Brn3a
Lim1/2
Interneurones
Lmx1b
Lhx2/9
Evx1/2
Interneurones
En1
Chx10
Neurones moteurs
MNR2/Hb9/Islet1/2
Figure 8. La régionalisation fonctionnelle de la moelle épinière adulte dérive de la
régionalisation dorso‐ventrale du tube neural en domaines de progéniteurs. Modifié d’après (Maden, 2006; Wilson et al., 2005). Dorsal
Ventral
Figure 9 Voies de signalisation contrôlant la régionalisation dorso‐ventrale. La régionalisation dorso‐ventrale est contrôlée par l’action de quatre molécules signalisatrices issues
des structures environnantes mais aussi du tube neural lui‐même : Sonic Hedgehog (Shh), d’abord
produit par la chorde puis par la plaque du plancher ; BMP synthétisé par l’épiderme dorsal et la
plaque du toit ; Wnt aussi produit par la plaque du toit et enfin l’acide rétinoique issu des somites. 36 Introduction II.2.02.LA RÉGIONALISATION DORSO‐VENTRALE OU SPÉCIFICATION DES PROGÉNITEURS La régionalisation dorso‐ventrale est responsable de la génération au moment approprié des nombreux types cellulaires neuronaux qui formeront les circuits fonctionnels de la moelle épinière mature et de leur ségrégation anatomique. Dans la région dorsale seront formés les circuits sensoriels alors que ventralement se formeront les circuits neuronaux moteurs (figure 8B) (Jessell & Sanes, 2000). Des différences liées à la position dorso‐ventrale dans le tube neural établissent des groupes distincts de progéniteurs (figure 8A). Chaque cellule appartenant à un groupe de progéniteurs exprime une combinatoire unique de facteurs de transcription propre à ce groupe et qui le définit. Ces facteurs de transcription confèrent aux cellules progénitrices les compétences nécessaires à la génération d’une classe particulière de neurones en temps et en lieu appropriés (figure 8C). Pour la plupart, ces facteurs de transcription fonctionnent en réprimant l’expression des gènes de régionalisation exprimés dans les domaines voisins. Cette restriction des programmes établie, les gènes de régionalisation activent les programmes de différenciation spécifiques mettant en jeu un grand nombre de facteurs de transcription qui contrôlent l’identité cellulaire, dont d’autres protéines de détermination et des protéines impliquées dans le programme générique de différenciation dont les protéines proneurales (bHlH) (figure 14). Chaque combinatoire de protéines de régionalisation et de protéines proneurales va restreindre d’une part le type cellulaire neural (neurone, astrocyte, oligodendrocyte), et d’autre part au sein des progéniteurs neuronaux, le sous type de neurones (motoneurone, interneurone ventral, dorsal) (figure 14) (Guillemot, 2007; Sugimori et al., 2007). Le long de l’axe dorso‐ventral du tube neural on distingue six groupes de progéniteurs dans la partie dorsale (pD1 à pD6) et cinq dans la moitié ventrale comprenant les progéniteurs des motoneurones (pMN) et de quatre groupes d’interneurones (pVO à pV3) (figure 8A) (Jessell & Sanes, 2000). Le programme transcriptionnel associé à chacun de ces groupes est contrôlé par l’action de quatre molécules signalisatrices issues des structures environnantes mais aussi du tube neural lui‐même (figure 9) : Sonic Hedgehog (Shh), d’abord produit par la chorde puis par la plaque du plancher ;BMP synthétisé par l’épiderme dorsal et la plaque du toit ; Wnt aussi produit par la plaque du toit et enfin l’acide rétinoique issu des somites (Wilson & Maden, 2005). 37 37 En absence de Shh
En présence de Shh
Figure 10. La voie de signalisation du morphogène Sonic Hedgehog et ses
principaux intervenants. Patched (Ptc1) Récepteur de Shh, aussi inhibiteur de la voie en absence de Shh; Smoothened (Smo)
une protéine transmembranaire inhibée par Ptc1 en absence de Shh; les facteurs de transcription GLI
sous leur forme répresseur (GLIRép) ou activateur (GLIAct). 38 Introduction II.2.02.a.MISE EN PLACE DES DOMAINES DE PROGÉNITEURS VENTRAUX PAR LES VOIES DE SIGNALISATION SHH/GLI ET RA Shh est initialement généré par la chorde, structure mésodermique axiale formée au fur et à mesure de l’extension de l’axe du corps par dépôt de cellules à partir du Nœud de Hensen. Au cours de la maturation progressive du tube neural, Shh induit les cellules de la future plaque du plancher à produire à leur tour Shh édifiant ainsi une deuxième zone de production ventrale (Wijgerde et al., 2002; Wilson & Maden, 2005). Shh est une molécule diffusible de type morphogène : il agit de manière dose‐dépendante sur la spécification des domaines de progéniteurs ventraux (Briscoe & Novitch, 2008; McMahon et al., 2003). La transduction du signal Shh repose sur les facteurs de transcription de la famille GLI. Ces protéines à doigts de zinc homologues de Cubitus interruptus de Drosophile sont au nombre de trois chez les Vertébrés (GLI1, GLI2, GLI3) et peuvent agir comme activateurs ou inhibiteurs de transcription. La production des formes répresseurs de GLI repose sur leur clivage protéolytique mettant en jeu la machinerie du protéasome. GLI1 est uniquement un activateur transcriptionnel, GLI2 est essentiellement activateur alors que GLI3 fonctionne principalement comme un répresseur transcriptionnel et donc joue un rôle antagoniste de la voie Shh. Ainsi, GLI1 et GLI2 sont les principaux médiateurs de la voie Shh. (Briscoe & Novitch, 2008; Fuccillo et al., 2006; Ruiz i Altaba et al., 2003). Le récepteur de Shh, Patched (Ptc), est une molécule à sept domaines transmembranaires (figure 10). En absence de Shh, Ptc agit comme un régulateur négatif de la voie Shh en inhibant l’activité d’une autre protéine transmembranaire Smoothened (Smo). L’inhibition de Smo empêche la transduction du signal ce qui résulte en la phosphorylation de GLI3 et potentiellement GLI2. Les protéines GLI ainsi phosphorylées sont protéolytiquement clivées en formes répresseurs qui vont aller réprimer les gènes cibles de la voie Shh (figure 10). En se fixant à Ptc Shh lève la répression sur Smo et permet ainsi la transduction du signal et l’inhibition du clivage protéolytique de GLI2 et GLI3 en forme répresseur. Les facteurs GLI maturés sous la forme d’activateur de transcription entrent dans le noyau et activent les gènes cibles de la voie (figure 10). Gli1 est une cible directe de la voie Shh ce qui crée une boucle d’amplification positive. La voie Shh réprime l’expression de Gli3 et inhibe la production de la forme répresseur (Ruiz i Altaba et al., 2003). 39 39 A.
RA
classe I
FGF
SHH
classe II
B.
Dorsal
Ventral
Figure 11. Régulation des facteurs de transcription à homéodomaines et à
domaines bHlH de régionalisation par les voies de signalisation extracellulaires. A‐ Régulation des gènes de classe I et classe II par les voies de signalisation du FGF, du RA et de Shh.
B‐ La régulation des facteurs de régionalisation par BMP et Shh et les répressions mutuelles entre
gènes de classe I et II définissent des domaines de progéniteurs (notés pD1‐6, pVO‐3 et pMN) le long de l’axe dorso‐ventral. Chaque domaine est caractérisé par une combinatoire spécifique de facteurs de transcription. Les gènes de la famille SoxB1 sont exprimés par tous les progéniteurs neuraux. 40 Introduction La dose de Shh reçue par les cellules du tube neural dépend de leur distance par rapport aux sources d’où il diffuse. La réponse des cellules est spécifique de la dose qu’elles reçoivent : de fortes doses de Shh induisent les gènes définissant les domaines les plus ventraux pV3 et pMN alors que de plus faibles doses induisent les gènes requis pour la formation des interneurones ventraux pV0‐pV2 (Ericson et al., 1997). Son rôle crucial dans l’édification de ces domaines est démontré par leur absence lorsque la signalisation Shh est bloquée (Chiang et al., 1996; Ruiz i Altaba et al., 2003). L’effet de Shh sur la spécification ventrale est réalisé en totalité par l’activité combinée des protéines GLI. De part son action différentielle sur les protéines GLI (décrit dans le paragraphe précédent) la voie Shh crée des gradients opposés d’activité GLI qui sont à l’origine de l’interprétation du gradient de Shh (Stamataki et al., 2005). La répression ventrale de GLI3 est cruciale pour la formation des progéniteurs de motoneurones et des domaines plus dorsaux. Dans les souris mutantes pour GLI3 les domaines de progéniteurs intermédiaires s’étendent dorsalement, mettant en évidence la répression exercée par GLI3 sur la voie de signalisation Shh. La perte des domaines de progéniteurs ventraux observée dans les souris mutantes pour Shh ou Smoothened est partiellement rétablie si on réprime l’expression de GLI3 (Dessaud et al., 2008; Wijgerde et al., 2002). Les facteurs de transcription régulés par la voie de signalisation Shh/GLI sont pour la plupart des protéines à homéodomaines (HD). Seul Olig2, marqueur unique des progéniteurs des motoneurones, appartient à la famille des facteurs de transcription à bHlH. Ces facteurs de transcription sont divisés en deux groupes dits de classe I (par exemple Pax6, Pax7, Irx3 et Dbx1/2) et classe II (par exemple Nkx2.2, Nkx6.1) selon qu’ils sont respectivement réprimés ou activés par la voie de signalisation Shh/GLI (figure 11A) (Briscoe et al., 2001; Briscoe et al., 2000; Guillemot, 2007; Jessell & Sanes, 2000). Une partie des gènes de classe I sont induits par la signalisation de l’acide rétinoique (figure 11A) (Diez del Corral et al., 2003; Wilson & Maden, 2005). Par conséquent, le gradient d’activité Shh/GLI va délimiter les limites d’expression ventrales des gènes de classe I et par opposition définir les limites d’expression dorsales des gènes de classe II (figure 11B). Finalement, les limites propres d’expression de ces gènes préfigurant les différents domaines de progéniteurs sont établies par la répression mutuelle des gènes de classe I et classe II (figure 11A‐B) (Dessaud et al., 2008). Concernant le domaine des motoneurones, Pax6 et Nkx6.1 exprimés dans ce domaine vont réprimer les gènes Dbx et Nkx2.2 inhibiteurs de la formation du domaine des motoneurones, puis le RA intervient pour activer l’expression d’Olig2 (Diez del Corral et al., 41 41 2003; Novitch et al., 2003). En absence de RA ; les gènes de différenciation motoneuronale Hb9, MNR2 et Islet‐1 sont dérégulés (Wilson et al., 2004; Wilson & Maden, 2005). Ainsi, l’expression combinée des homéodomaines Nkx6.1 et Pax6, et du bHlH Olig2 définit le domaine des progéniteurs de motoneurones alors que ces deux homéodomaines combinés à Irx3 définissent le domaine pV2 juste au dessus (figure 11 B). II.2.02.b.MISE EN PLACE DES DOMAINES DE PROGÉNITEURS DORSAUX La mise en place des domaines de progéniteurs dorsaux pD1‐6 n’est pas aussi bien comprise que celle des domaines ventraux. La signalisation issue de la plaque du toit et de l’épiderme sur jacent joue un rôle crucial. L’apposition d’explants neuraux immatures à la plaque du toit in vitro entraine la génération des types cellulaires dorsaux. i.BMP Dans la moitié dorsale du tube neural, des membres de la famille BMP (entre autres BMP2, 4, 5 et 7, Gdf7) sont produits par la plaque du toit et l’épiderme sus‐jacent (figure 9). L’exposition d’explants neuraux immatures à BMP mime l’effet de l’apposition de la plaque du toit (Liem et al., 1997). In vivo, l’expression ectopique de récepteurs aux BMPs activés (BMPR1) dans le tube neural d’embryons de poulet est capable de dorsaliser les populations ventrales tout en étendant les populations dorsales (Liu & Niswander, 2005; Timmer et al., 2002). Cependant, les données suggèrent que la formation des domaines pD1‐3 dépende de la signalisation de la plaque du toit mais la formation des domaines pD4‐6 s’avère en être indépendante (Helms et al., 2003; Lee et al., 1999). Les souris mutantes pour des BMP ou leurs récepteurs apportent peu d’informations sur leurs fonctions car les mutations entrainent une mort précoce (Caspary et al., 2003). L’action des BMPs à induire les populations les plus dorsales semble procéder de façon dose‐dépendante, aux vues de l’expression en gradient dorso‐ventral des différentes gènes de la famille Msx qui sont des cibles transcriptionnelles directes de la voie BMP (Caspary & Anderson, 2003; Chizhikov et al., 2005; Lee & Jessell, 1999; Liu & Niswander, 2005; Timmer et al., 2002). Les facteurs de transcription conférant l’identité aux domaines de progéniteurs dorsaux appartiennent pour la plupart à la famille des gènes proneuraux (bHlH) homologues vertébrés des familles Atonal (Ath1), Achaete Scute (Ash1) et Neurogénine (Ngn1 et 2) de Drosophile (figure 11B). Ainsi Math1 définit le domaine le plus dorsal pDI1, Ngn1/2 le domaine DI2, Mash1 est exprimé du pD3 au pD5. Les limites nettes d’expression 42 Introduction de ces facteurs et donc des domaines de progéniteurs dorsaux sont le résultat de répressions croisées mutuelles : Math1 et Ngn1/2 s’inhibent mutuellement, et Mash1 inhibe Ngn1/2 (Caspary & Anderson, 2003). De plus, des facteurs à homéodomaines sont exprimés dorsalement (Pax3, Pax6, Pax7, Irx3, Dbx2) et contribuent à distinguer les domaines de progéniteurs. Leurs limites d’expression dépendent de l’action opposée de Shh et BMPs. Ainsi, la combinatoire Mash1‐Pax7‐Dbx2 définit le domaine dorsal pD5 alors que le domaine pD6 placé sous le pD5 est défini par Ngn1/2‐Pax7‐Dbx2 (Helms & Johnson, 2003). 43 43 En absence de Wnt
En présence de Wnt
Figure 12. La voie de signalisation WNT canonique et ses principaux intervenants.
Frizzled est le récepteur de WNT présent à la surface des cellules et LRP (Low‐density lipoprotein Receptor related Protein) est transmembranaire et forme un complexe avec Frizzled. La β‐
caténine (β‐cat) est le co‐activateur transcriptionnel de la voie Wnt et en absence de Wnt β‐cat est inhibée par phosphorylation par la kinase GSK3‐β qui la dirige à la dégradation par le protéasome. En présence de Wnt, Dishevelled est phosphorylée et activée par le complexe ternaire formé par
Wnt/Frizzled/LRP, et ainsi inhibe GSK3‐β. Ceci résulté en la stabilisation de la β‐cat qui va entrer dans le noyau et agir comme co‐activateur transcriptionnel des facteurs de transcription Lef/TCF. 44 Introduction ii.Wnt Une autre signalisation extracellulaire émane de la plaque du toit, la signalisation Wnt (Chizhikov & Millen, 2005). Wnt signalise via sa fixation aux protéines trans‐membranaires Frizzled et LRP (Low‐density lipoprotein Receptor‐related Protein). Dans la voie Wnt canonique (figure 12), l’activité de LRP/Frizzled va aboutir à la stabilisation du co‐activateur transcriptionnel β‐caténine. En absence de fixation de Wnt à ses récepteurs, la β‐caténine est inhibée par la phosphorylation de la GSK3β (Glycogen‐Synthase Kinase 3beta) qui la dirige au protéasome. Sa stabilisation en présence d’une signalisation Wnt active résulte en son accumulation dans le cytoplasme. Cette accumulation promeut sa translocation dans le noyau où elle s’associe avec les facteurs de transcription Lef/TCF (Lymphoid‐enhanced factor/T‐cell factor) pour activer les gènes cibles de Wnt (Ille et al., 2007). Initialement la signalisation Wnt était référée comme la signalisation responsable de la prolifération des progéniteurs de la moitié dorsale de la moelle épinière (Chesnutt et al., 2004; Megason et al., 2002). L’implication de Wnt dans la spécification des populations dorsales a émergé il y a peu grâce à l’analyse de souris mutantes pour Wnt1 et Wnt3a (tous deux normalement exprimés dans la plaque du toit). Ces souris montrent une sévère réduction des neurones dorsaux D1, D2 et D3 causée par une diminution de la prolifération, et au contraire une expansion des neurones D4. Les auteurs ont vérifié l’expression de la signalisation des TGFbeta dans la plaque du plancher et elle n’est pas ou peu modifiée (Muroyama et al., 2002). Cependant il ne peut pas être exclu que l’expansion du domaine D4 soit en fait le résultat de la modification de l’expression des facteurs proneuraux. La diminution de l’expression de Ngn1/2 pourrait tout à fait résulter en l’extension de l’expression de Mash1. Récemment, l’étude réalisée par Zechner et ses collègues vient confirmer le rôle de Wnt dans la spécification dorsale. Ils ont mis en évidence que Wnt, activé par BMPs, contrôle l’identité des domaines pD2 et pD3 et réprime les identités pD4‐6. Cet effet de Wnt sur la spécification est dépendant de l’activation du facteur de transcription à bHlH Olig3 (exprimé dans les domaines D1‐3) et séparable de son effet sur la prolifération. En effet, dans un contexte mutant pour Olig3 la suractivation de la signalisation Wnt n’a plus d’effet sur la spécification bien qu’elle conserve son action mitogène (Zechner et al., 2007). L’interaction entre la signalisation Wnt et BMP semble donc se coordonner pour la spécification des domaines de progéniteurs pD1‐3. Cependant, bien qu’on connaisse quelques gènes importants pour définir les domaines pD4‐6 (tel que Lbx1) les détails mécanistiques qui sous‐tendent leur spécification restent à élucider. Dans les mutants souris Lbx1‐/‐, les domaines pD4 et pD5 45 45 sont spécifiés respectivement en pD2 et pD3. Il semble donc que d’autres signaux soient requis pour la génération des neurones dorsaux intermédiaires (Caspary & Anderson, 2003; Chizhikov & Millen, 2005). II.2.02.c.INTERACTIONS ENTRE WNT ET GLI Des études récentes prouvent que les voies de signalisation Shh et Wnt interagissent dans la régulation de GLI3. Dans les embryons mutants pour Shh, l’activité de la voie Wnt est diminuée (Ulloa et al., 2007b). Les données montrent que l’augmentation de l’expression de GLI3 répresseur dans la partie dorsale suite à l’absence de Shh, est responsable de l’inhibition de la signalisation Wnt, sans doute via l’interaction entre GLI3 répresseur et la β‐
caténine (Ulloa et al., 2007b). Parallèlement, les souris mutantes pour Wnt1/Wnt3a n’expriment plus GLI3 et la surexpression de Wnt active l’expression de GLI3 et ce de façon spécifique puisque GLI2 n’est pas affecté (Alvarez‐Medina et al., 2008). Weiying Yu et ses collaborateurs ont récemment montré que la surexpression de Wnt spécifiquement dans la partie ventrale du tube neural a pour conséquence l’expansion du domaine ventral pV2 au détriment des domaines les plus ventraux MN et V3 et ce de façon dépendante de GLI3 mais pas de GLI2. L’absence de Wnt précocement entraine l’expansion des domaines ventraux (Yu et al., 2008). Ceci est en accord avec l’activité répresseur exercée par GLI3 sur les gènes cibles de la voie Shh. Il semble donc que GLI3 permette de restreindre les activités Shh et Wnt. Enfin, une dernière étude réalisée en 2006 implique des inhibiteurs de la signalisation Wnt dans l’établissement des frontières entre les domaines ventraux pMN et pV3. Les auteurs ont découvert que dans la partie ventrale du tube neural, Pax6 active l’expression de sFRP2 et TCF4, deux protéines inhibitrices de la voie Wnt. En effet, en absence de Wnt, TCF4 agit comme un répresseur des gènes cibles de la voie Wnt et sFRP2 est nécessaire pour cette activité TCF4 répresseur. La présence de ces deux inhibiteurs de Wnt dans le domaine des motoneurones permet l’inhibition de l’expression de Nkx2.2 activée par la signalisation Shh et permet ainsi de restreindre l’expression de Nkx2.2 au domaine pV3 (Lei et al., 2006). 46 Introduction II.3.ENGAGEMENT DANS LA DIFFÉRENCIATION L’avancée dans le processus de neurogenèse va faire évoluer l’état de compétence des cellules progénitrices qui vont devoir choisir entre continuer à cycler et rester à l’état de progéniteur indifférencié ou sortir du cycle cellulaire et se différencier en neurones post‐
mitotiques (Lillien, 1998). Au sein d’une population initialement homogène, un progéniteur neural sélectionné à se différencier informe les cellules qui l’entourent de son engagement et les empêche de se différencier. Cette communication établit une balance entre les cellules qui se différencient et celles qui prolifèrent essentielle pour maintenir un pool de cellules indifférenciées qui permettront la génération des types cellulaires plus tardifs. Cette communication est largement déterminée par l’inhibition latérale médiée par la voie de signalisation Notch/Delta et par l’action des régulateurs négatifs (gènes SoxB1, Hes et Id) et positifs (gènes proneuraux) de la différenciation (figure 13) (Briscoe & Novitch, 2008; Bylund et al., 2003; le Roux et al., 2003). L’initiation de la différenciation requiert l’activité des gènes proneuraux (figures 13 et 14). Ces gènes, initialement identifiés chez la Drosophile, codent des facteurs de transcription à domaine bHlH qui sont nécessaires et suffisants pour engager les cellules progénitrices vers la différenciation en un type neuronal particulier (Bertrand et al., 2002). Parmi eux, les homologues vertébrés des gènes des familles achaete scute (mAsh1 chez la souris, cAsh1 chez le poulet) et neurogénine (Ngn1 et Ngn2). Les gènes proneuraux exprimés à de forts niveaux initient un programme moléculaire qui va aboutir à la différenciation neuronale. Ils induisent l’expression de plusieurs gènes à domaines HlH impliqués dans les étapes ultérieures de différenciation tel que NeuroM (Roztocil et al., 1997), ou les membres des familles NeuroD et Ebf (early B cell factor) (figures 13 et 14) (Garcia‐Dominguez et al., 2003). Dans le tube neural des Vertébrés, l’expression des gènes proneuraux est initiée dans une population de cellules neuro‐épithéliales en prolifération et déjà spécifiées. A ce stade, les cellules sont équivalentes en termes d’expression des gènes proneuraux mais aussi du ligand Notch et de son récepteur Delta résultant en une activité égale de la voie Notch (figure 13). Les signaux Notch sont responsables du maintien des cellules progénitrices dans leur état pluripotent via leurs effecteurs principaux, les protéines Hes à domaines bHlH répresseur, homologues des gènes de Drosophile Hairy et Enhancer of split (figure 13) (Bai et al., 2007; Bertrand et al., 2002; Guillemot, 2007; Kageyama et al., 2005). 47 47 Figure 13. Initiation de la différenciation neuronale: signalisation Notch/Delta et gènes
proneuraux. Issu de Bertrand N. et al. 2002 48 Introduction L’activité des protéines de la famille SoxB1 (Sox1, 2 et 3), exprimées dans tous les progéniteurs neuraux sans distinction dorso‐ventrale (Bylund et al., 2003; Graham et al., 2003; Pevny et al., 2005), et enfin des protéines Id (Inhibiteurs de différenciation) est aussi requise pour maintenir l’état indifférencié et inhiber la différenciation. Ce réseau de protéines converge vers l’inhibition de l’expression et de l’activité des protéines proneurales (figure 13) (Holmberg et al., 2008). Ainsi, l’expression native des proneuraux ne signe pas l’engagement définitif vers la différenciation car elle résulte en un niveau d’activité qui ne permet pas d’aller à l’encontre de la répression soutenue par les protéines inhibitrices SoxB1, Hes et Id. Cependant, par l’inhibition latérale Notch/Delta, une boucle de régulation est établie entre les cellules et va résulter en l’augmentation du niveau d’expression de Delta sélectionnant ainsi une cellule progénitrice. Une conséquence de cette augmentation est l’augmentation de l’expression des gènes proneuraux signant l’engagement irrévocable de la cellule dans la différenciation neuronale. Dans les cellules voisines, la voie Notch fortement activée va aboutir à la répression des gènes proneuraux (figure 13). Dans la cellule alors engagée dans la différenciation, l’activité proneurale va promouvoir la sortie du cycle cellulaire en induisant l’expression d’inhibiteurs de la progression dans le cycle cellulaire ; activer l’expression de Sox21, inhibiteur des protéines SoxB1 ; promouvoir l’expression des marqueurs généraux transitoires caractéristiques des jeunes neurones post‐mitotiques tel que NeuroM dont les cibles transcriptionnelles permettent la progression dans les étapes suivantes de la différenciation; et enfin, activer des protéines caractéristiques des neurones matures tel que HB9 (Bertrand et al., 2002; Farah et al., 2000; Guillemot, 2007). Une étude récente réalisée dans le laboratoire d’Isabelle Le Roux a mis en évidence l’intervention des voies de signalisation extracellulaires FGF, RA et Shh/Gli dans le contrôle de l’expression précoce de Ngn2 (Ribes et al., 2008). Leurs résultats montrent que le FGF exerce une régulation négative sur l’expression de Ngn2 dans les cellules de la plaque neurale caudale afin d’éviter que la neurogenèse soit initiée prématurément. Au niveau du tube neural, les effecteurs du RA (RAR/RXR) et de Shh (GLI) coopèrent sur les régions régulatrices du gène Ngn2 pour initier son expression dans les progéniteurs neuraux en prolifération. Les auteurs mettent ainsi en évidence un rôle crucial de l’action combinée des voies de signalisation RA et Shh qui en plus de contrôler les étapes successives de la régionalisation de la moelle épinière, interviennent dans l’initiation de la neurogenèse. 49 49 Progéniteur
neural
Progéniteur neural
spécifié
Progéniteur neuronal
Notch /
Gènes de régionalisation
bHlH ou HD
Progéniteur neuronal engagé définitivement
Neurone post‐mitotique
Delta
Gènes proneuraux Régionalisation Sélection du type neural
D/V
Spécification du sous‐type
Sortie du cycle cellulaire
Gènes de différenciation
Différenciation
Maintien de l’état indifférencié
Régulateurs négatifs de la différenciation
SoxB1 – Notch/Delta – Id – Hes
Figure 14. Résumé des différents types de gènes et de leurs interactions mis en jeu
pour la régionalisation dorso‐ventrale et la différenciation des progéniteurs
neuraux en neurones post‐mitotiques matures. 50 Introduction Le minutage de la différenciation dépend aussi des protéines de régionalisation. En effet, Sophie Bel‐Vialar, chercheur dans notre équipe, a récemment montré que Pax6, un facteur de transcription de classe I, régule positivement l’expression de Ngn2 et participe à son amplification (figure 14) (Bel‐Vialar et al., 2007). Pax6 est initialement exprimé à de faibles niveaux dans les progéniteurs neuraux en prolifération. Le niveau de Pax6 va progressivement augmenter et atteindre un niveau suffisant pour augmenter l’expression de Ngn2. L’expression de Ngn2 va être amplifiée au fur et à mesure jusqu’à atteindre un niveau qui permettra de diriger de façon irréversible les progéniteurs neuronaux vers la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. A ce stade, Ngn2 va exercer un rétro‐contrôle négatif sur Pax6 permettant son extinction, étape requise pour la différenciation neuronale. Ainsi, la différenciation neuronale fait intervenir de nombreux processus moléculaires inter‐
dépendants dont la coordination assure le minutage de la différenciation. II.4.LES DIVISIONS NEUROGÉNIQUES Avant le début de la neurogenèse à proprement parler cʹest‐à‐dire la production neuronale, les cellules neuroépithéliales prolifèrent activement afin d’amplifier les pools de progéniteurs. Une cellule mère indifférenciée donne naissance à deux cellules filles indifférenciées identiques et qui continuent à cycler : ce type de division est appelé division proliférative symétrique, dite PP (progéniteur + progéniteur). La neurogenèse débute au niveau du pré‐tube neural lorsque les premières cellules post‐mitotiques sont produites ce qui nécessite un changement dans le mode de division cellulaire (Gotz & Huttner, 2005). Les neurones sont générés par division neurogénique qui peut‐être de deux types. La division neurogénique asymétrique va aboutir à la naissance de deux cellules filles aux destins différents : l’une continue son cycle cellulaire alors que l’autre initie le processus de différenciation neuronale et sort du cycle cellulaire. Ce type de division est dit PN (progéniteur + neurone) et permet de maintenir la population progénitrice tout en générant des neurones. Ce mode de division est utilisé chez l’adulte dans les niches de cellules souches. Le principe de la division asymétrique est que les cellules filles ont un destin distinct qui leur est conféré par un héritage différent. La division neurogénique symétrique est aussi appelée division terminale ou NN (neurone + neurone) car elle génère deux cellules filles post‐mitotiques, ce qui aboutit à la déplétion des populations de progéniteurs. Dans le tube neural, divisions prolifératives PP et neurogéniques PN et NN co‐existent temporellement et spatialement, et la balance entre ces modes de division est cruciale car elle 51 51 déterminera la taille finale et la diversité cellulaire des tissus neuraux (Huttner et al., 2005; Morin et al., 2007; Wilcock et al., 2007). Une hypothèse est que la symétrie de division est régulée par l’orientation du fuseau mitotique (Wodarz & Huttner, 2003). Dans le tube neural des Vertébrés les études initiales postulaient que lorsque le fuseau mitotique était aligné parallèle à la surface du neuroépithélium (polarité planaire) la division était symétrique : il diviserait la cellule mère en deux cellules filles ayant un même héritage cellulaire ; un fuseau mitotique aligné perpendiculairement à l’axe du neuroépithélium serait associé à la division asymétrique, générant une cellule apicale qui resterait dans le cycle cellulaire et une cellule basale qui se différencierait (Gotz & Huttner, 2005). Or les études récentes ont pu observer que plus de 90% des cellules neuro‐épithéliales ont un plan de clivage vertical. De plus, il a récemment été montré que dans le tube neural des Vertébrés, l’orientation du fuseau mitotique n’a pas d’influence sur la destinée cellulaire (Konno et al., 2008; Morin et al., 2007; Yingling et al., 2008). Des études réalisées dans le cortex et la moelle épinière embryonnaires montrent que perturber l’orientation du fuseau mitotique n’a pas d’impact sur le destin cellulaire. Les divisions neurogéniques ne sont pas affectées, par contre la polarité planaire est dramatiquement perdue ce qui a pour conséquence la délamination de progéniteurs neuraux en prolifération hors de la zone ventriculaire ou leur entrée en apoptose. Ainsi, il apparait que chez les Vertébrés l’orientation du fuseau ne détermine pas la symétrie de division dans le tube neural et donc le destin cellulaire ni la balance prolifération/différenciation. Les données semblent plutôt suggérer que les progéniteurs neuraux auraient une orientation planaire fixe dont le maintien serait crucial pour l’architecture du neuro‐épithélium et la survie des cellules progénitrices. La division asymétrique est associée à une ségrégation inégale de composants cellulaires entre les cellules filles et donc sur la distribution asymétrique de ces composants dans la cellule mère avant la division. Dans le tube neural nous avons vu que les cellules neuro‐épithéliales sont hautement polarisées le long de l’axe apico‐basal, les membranes apicales et basales étant de différentes compositions. Des jonctions d’adhérence sont présentes à la membrane plasmique apicale et y recrutent des protéines de polarités cellulaires telles que les protéines aPKC (atypical Protein Kinase C), Par3, Par6 (PARtitioning‐defective protein) et la petite Rho‐GTPase Cdc42 (Gotz & Huttner, 2005). Ces protéines ont été très étudiées au cours de la division asymétrique des progéniteurs neuraux du système nerveux central embryonnaire de Drosophile, les neuroblastes. Les neuroblastes 52 Introduction se divisent asymétriquement pour générer un autre neuroblaste et pour produire une cellule ganglionnaire appelée GMC (Ganglion Mother Cell), dont la division terminale produira deux neurones. Les protéines de polarités précédemment citées sont asymétriquement localisées au cortex apical du neuroblaste. Leur ségrégation asymétrique dans la cellule fille maintenue dans le cycle cellulaire est permise grâce à l’orientation du fuseau mitotique dans l’axe apico‐basal. Elles participent à la polarité apico‐basale cruciale pour contrôler le mode de division et donc le destin cellulaire (Zhong et al., 2008). Dans le tube neural des Vertébrés, ces protéines sont là aussi associées au maintien des capacités d’auto‐renouvellement des progéniteurs neuraux. La perturbation de leur expression désorganise les jonctions d’adhérence ce qui a pour conséquence la perte de l’architecture du neuro‐épithélium et la modification de la balance entre auto‐renouvellement et différenciation (Afonso et al., 2006; Cappello et al., 2006; Ghosh et al., 2008; Manabe et al., 2002). Des données suggèrent que la fraction de membrane plasmique apicale soit inégalement distribuée aux cellules filles issues de la division asymétrique, la cellule en héritant étant destinée à continuer à cycler et l’autre à se différencier en un type cellulaire spécialisé (Kosodo et al., 2004; Wodarz & Huttner, 2003). Dans ce contexte, la membrane plasmique apicale contiendrait des composants cellulaires qui maintiendraient les progéniteurs dans le cycle cellulaire et dans un état indifférencié (Chenn et al., 1998; Gotz & Huttner, 2005; Huttner & Kosodo, 2005). La portion de membrane plasmique apicale ne représentant que 1‐2% du total de la membrane plasmique, une légère différence dans l’orientation du fuseau pourrait tout à fait permettre la ségrégation asymétrique de composants cellulaires. Cependant, l’influence de la membrane plasmique apicale et de ses composants sur le destin cellulaire reste encore à démontrer. Chez la Drosophile, Prospero et Numb sont des déterminants de l’identité cellulaire asymétriquement ségrégés au cours de la division asymétrique des neuroblastes à la cellule GMC destinée à générer deux neurones. Prospero est un facteur de transcription répresseur qui va inhiber l’expression de gènes impliqués dans la progression dans le cycle cellulaire et ainsi favoriser l’arrêt des divisions et la sortie du cycle cellulaire ; Numb est un antagoniste de la voie de signalisation Notch, qui comme nous l’avons vu est cruciale pour le maintien de l’état indifférencié des cellules. Deux homologues Vertébrés de la protéine Numb de Drosophile ont été identifiés : Numb et Numb‐like. Ils montrent une localisation asymétrique dans les cellules neuro‐épithéliales de souris et de poulet où ils sont localisés baso‐
latéralement à proximité des jonctions d’adhérence, en accord avec les données de 53 53 Drosophile (Rasin et al., 2007; Wakamatsu et al., 1999; Wakamatsu et al., 2007). Leur rôle a longtemps été soumis à controverse et le reste encore sans doute dû à leurs implications dans plusieurs processus dans ces modèles : d’une part ils contribuent au maintien de l’architecture du neuro‐épithélium en régulant l’intégrité des jonctions d’adhérence, les impliquant ainsi dans le maintien de pools de progéniteurs en prolifération ; mais d’autre part ils apparaissent aussi requis pour la différenciation neuronale (Johnson, 2003; Rasin et al., 2007; Wakamatsu et al., 1999; Wakamatsu et al., 2007). Ainsi dans les cellules neuro‐
épithéliales des Vertébrés les fonctions de Numb et Numb‐like sont plus complexes que chez la Drosophile et semblent jouer différents rôles selon les contextes cellulaires au cours du développement embryonnaire. Enfin, un autre paramètre semble intervenir dans les différences entre les divisions prolifératives et neurogéniques : la longueur du cycle cellulaire. Des travaux dans le cortex embryonnaire murin ont démontré que les divisions neurogéniques, identifiées par le marqueur Tis21, sont caractérisées par un cycle cellulaire long, par comparaison avec les divisions prolifératives Tis21‐négatives qui apparaissent plus courtes (Calegari et al., 2003). Ainsi, l’allongement du cycle cellulaire et en particulier de la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant un inhibiteur pharmacologique dans le cortex embryonnaire murin, est suffisant pour induire une neurogenèse prématurée (Calegari & Huttner, 2003). Dans le tube neural d’embryons de poulet, l’équipe de Kate Storey a mis en culture des tubes neuraux et ainsi observé le comportement des cellules neuro‐épithéliales en prolifération sur tissu vivant. Les résultats obtenus sont en accord avec des cycles cellulaires plus longs pour les progéniteurs neurogéniques. Qui plus est, le traitement des cultures avec du FGF, connu pour son rôle dans le maintien de l’état de cellules souches neurales, a pour conséquence la réduction de la longueur du cycle cellulaire des cellules neuro‐épithéliales mais dans ce contexte la destinée des cellules n’a pas été étudiée (Wilcock et al., 2007). Les hypothèses émises proposent qu’un cycle cellulaire plus long permettrait aux facteurs neurogéniques d’exercer leur fonction, ou à leur accumulation mais aussi la localisation asymétrique des déterminants d’identité cellulaire. Cependant dans le contexte de la moelle épinière embryonnaire, il reste à identifier les marqueurs qui permettraient clairement de distinguer les populations prolifératives des populations neurogéniques, et qui permettraient ainsi d’analyser en détail les paramètres du cycle cellulaire et de les impliquer dans la transition entre division proliférative et neurogénique. 54 Introduction II.5.DÉTERMINATION DES SOUS‐TYPES NEURONAUX II.5.01.LES PROTÉINES À BHLH ET À HOMÉDOMAINES INTERVIENNENT DANS LA SPÉCIFICATION DES SOUS‐TYPES NEURONAUX Les protéines proneurales sont différentiellement exprimées dans l’axe dorso‐ventral du tube neural ce qui semble en accord avec leur autre fonction en tant que déterminants des sous‐types neuronaux. Cette activité est propre à chaque protéine proneurale et dépend du contexte cellulaire au sein duquel elle opère (Briscoe & Novitch, 2008; Guillemot, 2007; Helms et al., 2005). En effet, les activités des protéines responsables de la spécification le long de l’axe dorso‐ventral (à homéodomaines ou bHlH) et des protéines proneurales se régulent mutuellement. D’une part, leur répression mutuelle génère une balance entre leurs niveaux d’expression respectifs et détermine le moment précis où les progéniteurs vont s’engager dans la différenciation (Bel‐Vialar et al., 2007; Mizuguchi et al., 2001). D’autre part, leurs activités se coordonnent pour induire l’expression d’autres facteurs de transcription qui vont contrôler le type neural (neurone, oligodendrocyte, astrocyte) qui sera généré mais aussi la spécification du sous‐type neuronal (figure 14) (Guillemot, 2007; Sugimori et al., 2007). Aux stades précoces, la combinaison Olig2/Ngn2 promeut la génération des motoneurones. Aux stades plus tardifs, Olig2 est requis pour générer les oligodendrocytes en association avec Mash1. Mais précocement, Mash1 en combinaison avec Pax6 est nécessaire pour la spécification des interneurones V2 et Math1 des interneurones D1. (Battiste et al., 2007; Farah et al., 2000; Guillemot, 2007; Helms et al., 2005; Mizuguchi et al., 2001; Nakada et al., 2004). II.5.02.L’ACIDE RÉTINOIQUE EST REQUIS TOUT AU LONG DE LA FORMATION DES MOTONEURONES En plus de son rôle aux phases précoces de la spécification des motoneurones l’acide rétinoique est requis pour la spécification tardive de sous‐populations de motoneurones : les colonnes latérales de motoneurones qui émergent au niveau des membres. Aux niveaux brachial et lombaire, les cornes ventrales de la moelle épinière contiennent des populations de motoneurones bien particulières, colonnes latérales de motoneurones (LMC), qui assurent l’innervation des muscles des membres. Ces populations LMC sont subdivisées en deux groupes selon vers quels muscles ils projettent : les LMC médianes vont innerver les muscles ventraux alors que les LMC latérales innervent les muscles dorsaux. Les LMC médianes sont produites en premier. Cette population commence à exprimer l’enzyme RALDH2. La 55 55 synthèse de RA par cette population précoce va signaliser sur les populations de motoneurones produites tardivement et ainsi induire leur spécification en LMC latéraux (Sockanathan et al., 1998; Wilson & Maden, 2005). 56 Introduction III.INTÉGRATION DU CONTRÔLE DU CYCLE CELLULAIRE DANS LE PROCESSUS DE NEUROGENÈSE Le bon déroulement de la neurogenèse nécessite le contrôle strict de la génération de tous les types cellulaires neuraux qui formeront les circuits fonctionnels du système nerveux central, en temps et en lieu appropriés, mais aussi en nombre adéquat. Les régions du système nerveux central ont des tailles différentes, et au sein de chaque région, les populations de neurones sont elles aussi de tailles caractéristiques. La régulation du cycle cellulaire fait partie intégrante des programmes de neurogenèse : une cellule est instruite à acquérir un destin spécifique et ainsi à se diviser un certain nombre de fois dans ce lignage avant de se différencier. La croissance du système nerveux fait intervenir les acteurs du cycle cellulaire et va impliquer leur contrôle spécifique par les réseaux de signalisation responsables de la spécification et de la différenciation. Comme nous avons pu le voir dans les chapitres précédents les mécanismes moléculaires responsables de la spécification de tous les types cellulaires ont été particulièrement bien étudiés. Par contre, les mécanismes de régulation du cycle cellulaire restent plus énigmatiques. 57 57 Figure 15. Principaux acteurs du cycle cellulaire 58 Introduction III.1. LA MACHINERIE DU CYCLE CELLULAIRE Rappelons que le cycle cellulaire est une succession invariable de phases qui va aboutir à la génération de deux cellules filles à partir d’une cellule mère. Les phases sont au nombre de quatre : deux phases de Gap G1 et G2 qui préparent respectivement les cellules à réaliser les phases clés de réplication de l’ADN (phase S) et de division cellulaire (phase de Mitose) au cours de laquelle les chromosomes dupliqués sont ségrégés et répartis aux deux cellules filles (figure 15). Lorsque les cellules ne se divisent pas elles sont dites quiescentes, ou post‐
mitotiques et sont dites en phase G0. Les quatre phases se succèdent dans cet ordre invariable et une phase ne peut commencer que si la précédente s’est parfaitement déroulée. La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par des complexes kinases universels hétérodimériques composés d’une sous‐unité catalytique appartenant à la famille des protéines kinases dépendantes des Cyclines (Cyclin‐Dependent Kinase ou CDK) et d’une sous unité régulatrice Cycline (figure 15). La progression et la transition entre chaque phase du cycle cellulaire est médiée par un complexe CDK/Cycline bien spécifique (Meijer, 2003). CDK4 et CDK6 s’associent aux Cyclines de type D pour progresser en G1 ; la transition G1/S est assurée par le complexe CDK2/Cycline E ; puis CDK2 s’associe à la Cycline A pour la progression dans la phase S ; l’association de CDK1 (aussi appelé cdc2) et de la Cycline A assure le déroulement de la phase G2 ; puis CDK1 s’associe à la Cycline B pour la transition de la phase G2 à la mitose et la progression en mitose (figure 15). Les complexes CDK/Cycline sont activement modifiés post‐traductionnellement sur la sous‐unité catalytique par des séries de phosphorylation/déphosphorylation résultant en la modulation de leur état activé/inactivé et de leur localisation subcellulaire. Les complexes natifs CDK/Cycline sont maintenus inactifs par des phosphorylations inhibitrices sur la tyrosine 14 et la thréonine 15 catalysées par les kinases Wee1 et Myt1. Cette inhibition est levée par l’action des phosphatases CDC25 à double spécificité (Ser/Thréo‐Tyr). Les détails concernant cette famille de phosphatase sont décrits ultérieurement (cf III.3). Enfin, l’activité des complexes CDK/Cycline est aussi régulée par interaction avec des inhibiteurs protéiques qui appartiennent à la famille INK4 (Inhibitors of CDK4) dont p16Ink4a et p19Ink4d qui agissent sur CDK4 et CDK6 et à la famille Cip/Kip dont p21Cip1, p27Kip1 et p57Kip2 qui jouent un rôle plus étendu puisqu’ils peuvent interagir avec tous les complexes CDK/Cycline (figure 15). L’intervention de ces inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes (CKIs) promeut la sortie du cycle cellulaire (Meijer, 2003). 59 59 III.2.LES FACTEURS RÉGULANT LA PROGRESSION DANS LE CYCLE CELLULAIRE III.2.01.LES PROTÉINES DE DIFFÉRENCIATION INHIBENT LA PROGRESSION DANS LE CYCLE CELLULAIRE La sortie du cycle cellulaire tient un rôle central dans la génération des neurones post‐
mitotiques et sa régulation doit être coordonnée avec les gènes responsables de la différenciation afin d’assurer l’histogenèse neurale (Ohnuma et al., 2003). Des études ont montré que les gènes proneuraux à bHlH tels que Ngn2, Mash1 ou NeuroD induisent l’expression des CKIs, étape requise pour pouvoir progresser dans la différenciation (Farah et al., 2000). Il a été mis en évidence que p27kip1 activé par Ngn2 stabilise en retour Ngn2 permettant de fixer l’engagement vers la différenciation (Nguyen et al., 2006). D’autres protéines impliquées dans la différenciation interviennent dans l’inhibition de la progression dans le cycle cellulaire. Ci‐dessous quelques exemples de protéines dont l’expression initiée dans les progéniteurs guide leur choix vers l’arrêt de la prolifération et la différenciation. Dans la moelle épinière de souris, Cux2 est requis pour la différenciation des interneurones ventraux. Il a été montré que Cux2 lie les promoteurs de NeuroD1 et p27Kip1 afin d’activer leur expression coordonnant ainsi le cycle cellulaire à l’acquisition d’une destinée (Iulianella et al., 2008). GATA2 est un facteur de transcription à doigts de zinc requis pour la différenciation des interneurones ventraux issus du domaine pV2. L’expression de GATA2 est initiée dans la population progénitrice et sa surexpression dans le tube neural d’embryons de poulet inhibe la prolifération ce qui est accompagné d’une diminution de l’expression de la Cycline D1 et l’induction de p27Kip1 et de protéines impliquées dans la différenciation. Qui plus est, GATA2 régule négativement la signalisation du récepteur Notch interférant avec les mécanismes de maintenance des cellules dans un état indifférencié (El Wakil et al., 2006). BM88 aussi appelée CEND1 (Cell cycle Exit and Neuronal Differentiation 1) est une protéine ancrée à la membrane des organelles intra‐cellulaires. Initialement identifiée par son expression dans les neurones différenciés, BM88 s’avère être aussi exprimée dans les progéniteurs neuronaux du cerveau antérieur et de la moelle épinière chez le poulet et la souris (Koutmani et al., 2004; Politis et al., 2007a; Politis et al., 2007b). De façon intéressante, son expression dans les progéniteurs est temporellement et spatialement associée aux divisions neurogéniques (Koutmani et al., 2004) et des expériences ont pu montrer que BM88 60 Introduction était suffisant pour inhiber la progression dans le cycle cellulaire et induire la différenciation neuronale (Politis et al., 2007a). Les souris mutantes pour p27kip1 ou p57kip2 montrent des défauts de prolifération associés à l’élargissement des tissus neuraux (Ohnuma & Harris, 2003). La surexpression de p57Kip2 dans le tube neural d’embryons de poulet arrête la prolifération en interférant avec l’activité de la Cycline D1 (Gui et al., 2007). Dans la moelle épinière de souris, p57Kip2 est spécifiquement et transitoirement exprimé dans les jeunes interneurones en cours de différenciation. De façon inattendue, la déplétion de p57Kip2 n’empêche pas ces interneurones de sortir du cycle cellulaire et de se différencier. Néanmoins, les interneurones générés re‐
entrent rapidement dans le cycle cellulaire malgré leur état de neurone mature et réalisent des divisions additionnelles ectopiquement dans la zone de différenciation (Gui et al., 2007). Ainsi, il semble que le rôle des CKI soit indépendant du processus de différenciation mais qu’ils soient cruciaux pour stabiliser l’état post‐mitotique des neurones et ainsi assurer la production des neurones en nombre approprié. 61 61 A.
WT
β‐caténine constitutivement active BrdU / Tuj1
B.
WT Shh exprimé ectopiquement en dorsal
BrdU
C.
Figure 16. Les voies de signalisation de Wnt et de Shh contrôlent la prolifération des
cellules progénitrices neurales. A. Wnt issu de la plaque du toit et Shh issu de la chorde et de la plaque du plancher influencent la
prolifération dorsale et ventrale. B. Zechner et ses collaborateurs ont démontré l’action mitogène de Wnt en faisant exprimer une forme
constitutivement active de la β‐caténine dans le tube neural d’embryons de souris. On peut observer une
hyperprolifération majoritairement ventrale (Zechner et al., 2003). C. Rowitch et ses collaborateurs ont construit des souris mutantes surexprimant Shh dans la partie dorsale
du tube neural. Il en résulte une dramatique hyperprolifération dorsale (Rowitch et al., 1999). Marquage des cellules en phase S (BrdU+) et des neurones (TuJ1). 62 Introduction III.2.02.LES MITOGÈNES FAVORISENT LA PROGRESSION DANS LE CYCLE CELLULAIRE Trois voies de signalisations ont été impliquées dans le contrôle de la prolifération des précurseurs neuraux spinaux. Comme décrit précédemment, la voie du FGF maintient les cellules de la région caudale du tube neural en prolifération via une activation de la voie Notch. Dans le pré‐tube le FGF régule positivement l’expression de la Cycline D2 qui contribue à maintenir les cellules dans le cycle; la voie Wnt qui génère un gradient de prolifération dorso‐ventral décroissant dans le tube neural et la voie Sonic Hegdehog (Shh) qui en plus de son action sur la spécification des progéniteurs neuraux de la région ventrale du tube neural, joue un rôle de mitogène (figure 16A). III.2.02.a.WNT, LE MITOGÈNE DORSAL Des études réalisées in vitro et in vivo ont mis en évidence l’action mitogène de Wnt dans différentes zones du système nerveux central embryonnaire mais aussi dans d’autres cellules telles que les cellules du système hématopoïétique ou les cellules souches embryonnaires (Ille et al., 2005). Des mutations résultant en l’activation incontrôlée de Wnt ou l’accumulation anormale de la β‐caténine sont à l’origine de la formation de tumeurs (Beachy et al., 2004). Au niveau du système nerveux central, les molécules Wnt jouent un rôle crucial dans le maintien de la prolifération des progéniteurs neuraux (Ulloa et al., 2007a; Ulloa et al., 2007b) : la surexpression de Wnt1 dans les régions du mésencéphale et du rhombencéphale chez la souris résulte en une hyperprolifération des progéniteurs neuraux (Panhuysen et al., 2004) ; Wnt3a régule l’expansion de la zone du cortex à l’origine de l’hippocampe dans l’embryon de souris (Lee et al., 2000) et qui plus est contrôle la taille du cortex cérébral (Chenn et al., 2002). L‘expression d’une forme stabilisée de la β‐caténine dans les progéniteurs neuraux du cerveau murin augmente drastiquement la taille du cerveau. La β‐caténine ne semble pas affecter le taux de prolifération mais agit en favorisant la reprise du cycle cellulaire au détriment de la différenciation (Chenn & Walsh, 2002). L’inhibition de la β‐caténine dans le cortex murin provoque de façon prématurée la sortie du cycle cellulaire et ainsi la déplétion des pools de progéniteurs (Woodhead et al., 2006). Dans la moelle épinière embryonnaire, la signalisation de Wnt1 et Wnt3a, issue de la plaque du toit, est présente en gradient dorso‐ventral décroissant, mais la β‐caténine est exprimée dans tout le tube neural (Megason & McMahon, 2002). L’expression dorso‐ventrale 63 63 des Wnts et des composants de la voie Wnt est régulée par la signalisation BMP ce qui coordonne la régionalisation et l’expansion des populations progénitrices dorsales (Chesnutt et al., 2004; Ille et al., 2007). Des expériences de gain de fonction de Wnt1/3a ou d’une forme activée de la β‐caténine chez le poulet et la souris induisent une hyper‐prolifération des tissus neuraux, et ce plus particulièrement dans les régions ventrales (figure 16B) (Dickinson et al., 1994; Ille et al., 2007; Megason & McMahon, 2002). En parallèle de l’effet sur la prolifération ces expériences montrent que la signalisation Wnt/β‐caténine inhibe la différenciation neuronale (Dickinson et al., 1994; Megason & McMahon, 2002, Ille, 2007 #263; Zechner et al., 2003). Les défauts de prolifération observés suite à l’inhibition du BMP sont restaurés par Wnt3a (Chesnutt et al., 2004). Par opposition, dans les souris mutantes pour la β‐caténine les régions de la moelle épinière montrent une réduction du taux de prolifération et en parallèle une augmentation de la proportion de cellules en différenciation ce qui résulte en la diminution de la taille des pools de progéniteurs (Zechner et al., 2003). Récemment, Shimizu et ses collaborateurs ont mis en évidence des effets additifs du FGF2 et de Wnt sur la prolifération des progéniteurs neuraux. La signalisation du FGF2 permettrait l’accumulation nucléaire de la β‐caténine via l’inhibition de la GSK3β mais par un mécanisme différent de celui mis en jeu dans la voie Wnt canonique (figure 12). La β‐caténine nucléaire contrôlerait la prolifération en activant Lef/TCF et via son association à Notch contrôlerait l’expression du gène anti‐neurogénique Hes1 permettant le maintien de l’état indifférencié (Shimizu et al., 2008). Ainsi, la voie de signalisation Wnt/β‐caténine semble cruciale pour le maintien des progéniteurs en prolifération dans la région dorsale du tube neural en contrôlant la taille des populations de progéniteurs et en influant dans le choix de continuer dans le cycle cellulaire ou de se différencier : l’action de Wnt semble être en défaveur des divisions neurogéniques. 64 Introduction III.2.02.b. SONIC HEDGEHOG, LE MITOGÈNE VENTRAL La fonction mitogène de la voie de signalisation Shh est largement démontrée par les données émanant de l’étude de divers cancers. La mutation des composants de la voie de signalisation Shh (cf. § II.2.02 et figure 10) tel que Patched (Ptc) ou Smoothened (Smo) résultant en son activation incontrôlée est à l’origine du développement de nombreux cancers humains, tels que cancers de la peau, mais aussi du système nerveux (médulloblastomes et glioblastomes), de la prostate ou du pancréas (Ruiz i Altaba, 2008; Ruiz i Altaba et al., 2004). La voie Shh est essentielle pour la prolifération et la survie cellulaire des progéniteurs neuraux de plusieurs régions du système nerveux central embryonnaire dont le cervelet (issu du rhombencéphale) et la moelle épinière (Ruiz i Altaba et al., 2003). Qui plus est, Shh joue un rôle crucial dans la maintenance des cellules souches neurales du système nerveux central adulte (Lai et al., 2003; Machold et al., 2003). L’action mitogène de la voie Shh est réalisée là aussi par les facteurs de transcription GLI. Dans la moelle épinière de souris, l’expression ectopique dans le tube neural dorsal de Shh (Rowitch et al., 1999) ou la surexpression de GLI1 ou Smoothened (Hynes et al., 1997; Hynes et al., 2000) mais aussi l’activation de la voie par l’utilisation d’une forme dominant‐négative de la protéine kinase A (Epstein et al., 1996) ou par l’ablation génétique de Ptc1 entrainent une hyperprolifération dramatique (figure 16C). La manipulation génétique de deux régulateurs négatifs de la voie Shh, Hip1 (HH‐
interacting protein 1) et Ptc1, résulte en un élargissement dose dépendant des tissus neuraux (Jeong et al., 2005). Dans le tube neural d’embryons de poulet, l’inhibition de la voie Shh par surexpression d’une forme activée de Patched induit une forte mortalité cellulaire et diminue la prolifération (Cayuso et al., 2006). L’effet pro‐apoptotique de Ptc1 est mimée par l’expression ectopique de GLI3 répresseur, et cet effet peut‐être contré par la co‐expression d’un gène anti‐apoptotique Bcl‐2. Dans ces conditions l’effet sur la prolifération persiste mettant en évidence que la voie Shh contrôle la survie cellulaire et la prolifération de façon indépendante. L’inhibition de la prolifération suite au blocage de la voie Shh semble se réaliser via l’inhibition de la transition G1/S et n’est pas associée à une augmentation de la proportion de cellules qui se différencient. Ces données suggèrent que, à la différence de la signalisation Wnt, la prolifération induite par Shh soit permissive pour la différenciation. Les auteurs ont réalisé l’expérience inverse cʹest‐à‐dire la surexpression d’une forme activatrice de GLI3 et montrent que GLI3 activateur induit une hyperprolifération dans le tube neural (Cayuso et al., 2006). Malheureusement ils n’analysent pas l’effet sur la différenciation dans 65 65 ce contexte. L’effet mitogène se réalise autant en ventral qu’en dorsal en accord avec la diminution de la taille de la totalité du tube neural lorsque Shh est génétiquement muté. L’analyse de la répartition dans les différentes phases du cycle cellulaire a mis en évidence que l’activation de la prolifération par Shh est associée à une réduction de la longueur du cycle cellulaire (Cayuso et al., 2006). Une conclusion identique a été suggérée par deux études récentes. Dans le cerveau antérieur de souris, plus précisément dans la partie dorsale du télencéphale (pallium) la suppression de Shh diminue la prolifération via un allongement de la longueur du cycle cellulaire et diminue la proportion de cellules sortant du cycle cellulaire (Komada et al., 2008). Dans la rétine de Xénope en développement, Shh accélère le cycle cellulaire en réduisant la longueur des phases G1 et G2. Les cellules cyclant rapidement sortent du cycle cellulaire plus tôt (Locker et al., 2006). Toutes ces études introduisent la notion que le rythme auquel les cellules progénitrices prolifèrent a une influence majeure sur le moment où elles vont se différencier, et que Shh est capable d’influencer ce rythme. Comme nous venons de le voir, le récepteur Ptc1 régule négativement la prolifération. Des travaux réalisés en 2001 ont montré par un crible double hybride que Ptc1 était capable d’interagir physiquement avec une forme phosphorylée active de la Cycline B1. Cette interaction a été confirmée in cellulo, et les expériences de co‐immunoprécipitation ont montré que CDK1 le partenaire de Cycline B1 faisait partie du complexe. Cette interaction a pour conséquence la séquestration du complexe CDK1/Cycline B1 actif l’empêchant ainsi d’agir sur ces cibles. La fixation de Shh sur Ptc libère le complexe CDK/Cycline B1 (Barnes et al., 2001). 66 Introduction III.2.02.c.COMPOSANTS DU CYCLE CELLULAIRE QUI SONT LES CIBLES DES MITOGÈNES Les différentes combinatoires de régulateurs du cycle cellulaire contrôlés par les mitogènes vont permettre d’orchestrer les différents rythmes de prolifération en fonction de la progression dans la neurogenèse (Calegari et al., 2005; Calegari & Huttner, 2003; Takahashi et al., 1995). Les voies de Wnt et de Shh semblent en partie agir sur les mêmes régulateurs du cycle cellulaire (figure 17). Peu de données sont connues quant aux cibles de la voie de Wnt. Wnt/β‐caténine active l’expression des Cyclines D1 et D2 dans le tube neural mais ne semble pas modifier l’expression des cyclines de la progression G2/M (Ille et al., 2007; Megason & McMahon, 2002; Shimizu et al., 2008). Cependant l’activation de ces Cyclines ne semble pas suffisante pour expliquer l’action mitogène de Wnt (Megason & McMahon, 2002). c‐myc et la cycline D1 ont été mis en évidence comme étant des cibles directes de Wnt dans les cancers du colon (Logan et al., 2004). Les bases moléculaires de l’action de Shh/GLI sur la prolifération ont suscité plus d’intérêt que pour Wnt mais restent bien moins comprises que celles mises en jeu pour la spécification des progéniteurs. Cependant, de nombreuses études réalisées au cours du développement du cervelet chez la souris ont permis d’avancer dans cet objectif. N‐myc, E2F1 et E2F2 ont été identifiés comme des cibles directes de la voie Shh/GLI dans les progéniteurs des neurones granulaires du cervelet mais aussi dans les médulloblastomes (Oliver et al., 2003). Dans un contexte mutant pour Shh, les progéniteurs des cellules granulaires cultivés in vitro peuvent continuer à proliférer seulement si on leur fournit N‐
myc (Kenney et al., 2003; Oliver et al., 2003). N‐myc semble médier l’action mitogène de Shh en activant l’expression des Cyclines D et en réprimant l’expression des CKIs (Knoepfler et al., 2006). Qui plus est, dans ce contexte les voies Shh et Pi3‐Kinase convergent dans la régulation de N‐myc. En effet, la phosphorylation par GSK3‐β de la protéine N‐myc entraine sa dégradation par le protéasome. La Pi3‐K va intervenir dans l’inhibition de GSK3β et ainsi permettre la stabilisation de la protéine N‐myc (Knoepfler & Kenney, 2006); (Kenney et al., 2003). FoxM1, un facteur de transcription connu pour son rôle dans la progression G2/M, est activé par Shh dans le cervelet mais de façon indirecte (Schuller et al., 2007), tout comme les Cyclines de G2/M Cycline A‐B et de G1/S Cycline D1‐D2 (Kenney et al., 2000). Les cellules progénitrices du cervelet issues des souris FoxM1 mutantes sont toujours capables de proliférer en réponse à Shh mais expriment des taux plus faibles de Cycline B1 et de Cdc25B associé à des perturbations de la mitose. 67 67 Myc
E2F
Figure 17. Composants du cycle cellulaire activés par la voie de signalisation Wnt,
Shh/GLI et par les gènes de différenciation. Les flèches vertes représentent les molécules régulées par Wnt, les flèches rouges par Shh et jaunes par les
gènes de différenciation. 68 Introduction Les auteurs suggèrent que dans le contexte du cervelet, l’activation indirecte de FoxM1 par Shh contribue à maintenir l’expression d’autres régulateurs de la transition G2/M (Schuller et al., 2007). Dans la rétine de Xénope, la surexpression de Shh active l’expression de la Cycline D1, mais aussi de la Cycline A2, B1 et de Cdc25C mais il reste à savoir si ce sont des cibles directes ou indirectes (Locker et al., 2006). Afin de mieux comprendre comment Shh agit sur le contrôle de la prolifération notre équipe a réalisé un crible et a identifié deux régulateurs du cycle cellulaire comme étant des cibles transcriptionnelles de cette voie au cours de la formation de la moelle épinière: la Cycline D1, acteur de la phase G1 qui contrôle la balance entre prolifération et différenciation (Lobjois et al., 2004), et la phosphatase CDC25B, un acteur majeur du cycle cellulaire et particulièrement de l’entrée en mitose (cf. Annexe I) (Benazeraf et al., 2006). La surexpression des Cycline D1 ou D2 dans le tube neural aviaire va initialement maintenir les cellules progénitrices dans le cycle cellulaire cependant cela ne les empêche pas de se différencier (Lobjois et al., 2008). Il semble donc que les Cyclines de type D ne soient pas des déterminants majeurs pour le choix d’un progéniteur de s’engager dans le processus de différenciation. Mes travaux de thèse concernent plus particulièrement la régulation et la fonction des phosphatases CDC25, et principalement de CDC25B. 69 69 Figure 18. La famille des phosphatases CDC25
(a)Analyse phylogénétique des différents gènes de la famille CDC25 identifiés dans les
diverses espèces animales. (b)Les protéines CDC25 sont caractérisées par deux domaines: un domaine catalytique très
conservé à l’extrémité carboxy‐terminale, et un domaine régulateur très variable et soumis à
épissage alternatif du côté amino‐terminal. (c)Mode d’action des phosphatases CDC25 sur leurs substrats physiologiques, les complexes
CDK/Cycline Les illustrations (a) et (b) sont issues de la revue de nos collaborateurs (Boutros et al., 2007a).
70 Introduction III.3.LES PHOSPHATASES DE LA FAMILLE CDC25 III.3.01.INTRODUCTION Le régulateur du cycle cellulaire cdc25 a été initialement identifié chez la levure comme un activateur mitotique dose‐dépendant. Les phosphatases CDC25 sont essentielles pour la progression dans le cycle cellulaire en déphosphorylant et activant les complexes CDK/Cycline (figure 18C) (Russell et al., 1986). De nombreuses protéines homologues de cdc25 ont été identifiées dans différents organismes (Boutros et al., 2007a) tel que le nématode C.elegans, le xénope X. laevis et récemment le poisson zèbre Danio rerio (Nogare et al., 2007) mais aussi l’oiseau Gallus gallus et les Mammifères (figure 18A). Chez les Mammifères, il existe 3 membres de la famille des phosphatases CDC25: CDC25A, ‐B et –C (Boutros et al., 2007a). Les gènes CDC25 sont soumis à l’épissage alternatif produisant 2 isoformes pour CDC25A et 5 isoformes pour CDC25B et CDC25C. Cependant à l’heure actuelle la fonction spécifique de chacun des variant d’épissage est peu documentée. Les protéines CDC25 sont structurellement caractérisées par deux domaines : un domaine catalytique carboxy‐terminal très bien conservé entre protéines et entre espèces, et un domaine régulateur amino‐terminal très variable qui est cible de nombreuses modifications post‐traductionnelles influençant la localisation, l’activité et le renouvellement de la protéine (figure 18B) (Boutros et al., 2007). CDC25A et CDC25B, mais pas CDC25C sont surexprimées dans de nombreux cancers humains, suggérant que la dérégulation de l’activité des CDC25 contribue à la prolifération incontrôlée des cellules tumorales (Galaktionov et al., 1996; Kristjansdottir et al., 2004). Par exemple, un fort niveau d’expression de CDC25B a été observé dans les gliomes (Nakabayashi et al., 2006) et dans les neuroblastomes (Sato et al., 2001) et est corrélé à des hauts grades tumoraux. III.3.02.RÔLES DES CDC25 AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE Bien que partageant un même mécanisme d’action (figure 18C), les membres de la famille CDC25 ont des caractéristiques uniques et des rôles spécifiques au cours du cycle cellulaire. Cependant, les données émanant de l’étude des souris mutantes (cf § III.3.03) montrent que les fonctions de CDC25B et CDC25C sont en fait substituables. Originellement le modèle du fonctionnement des CDC25 au cours du cycle cellulaire, élaboré à partir des données issues d’études in vitro utilisant les cellules de mammifères, proposait que chaque 71 71 CDC25 agisse spécifiquement à une transition du cycle cellulaire. L’inhibition de CDC25A par l’utilisation d’anticorps bloquants empêche le passage en phase S (Blomberg et al., 1999; Hoffmann et al., 1994) alors que sa surexpression accélère l’entrée en phase S (Jinno et al., 1994). L’utilisation d’anticorps bloquants CDC25B et CDC25C ont pour conséquence un arrêt des cellules en phase G2 (Gabrielli et al., 1996; Karlsson et al., 1999; Lammer et al., 1998). Cependant CDC25B se distingue par une plus forte activité en tant qu’inducteur mitotique. En effet, sa surexpression et non celle de CDC25C est capable de faire entrer prématurément en mitose des cellules n’ayant pas encore répliquées leur ADN, un phénomène défini par une condensation prématurée des chromosomes (PCC) (Karlsson et al., 1999). Dans ce modèle, CDC25A serait donc dédiée au contrôle de la transition G1‐S, CDC25B et CDC25C assureraient l’entrée en mitose avec néanmoins des rôles distincts (Karlsson et al., 1999). Les données actuelles suggèrent un modèle plus complexe où les phosphatases CDC25 ont des rôles plus larges et où elles apparaissent toutes trois requises pour la réalisation de la mitose (Boutros et al., 2006). En effet, l’utilisation de siARN contre CDC25A ou CDC25B dans des cellules non synchronisées a permis de montrer un retard de l’entrée en mitose et dans ce contexte les siARN dirigés contre CDC25C ont peu ou pas d’effets (Lindqvist et al., 2005). Qui plus est lorsque CDC25A et CDC25B sont tous deux inhibés dans un essai de synchronisation des cellules en phase M l’accumulation des cellules en mitose est plus drastiquement ralentie (Lindqvist et al., 2005). Cette étude a aussi permis de montrer que CDC25A était spécifiquement requis pour la condensation de la chromatine alors que CDC25B est crucial pour la séparation des centrosomes. Ainsi, dans le modèle actuel CDC25A a un rôle plus général dans le contrôle de la transition G1/S et G2/M (Busino et al., 2004) coopérant avec CDC25B pour initier l’activation du complexe CDK1/Cycline B et permettre l’entrée en mitose (Lindqvist et al., 2005) alors que CDC25C assure la progression dans la mitose. CDC25B a été proposé comme l’activateur initial du pool de CDK1/Cycline B au centrosome à la transition G2/M (Boutros et al., 2006). Des études ont aussi proposé un rôle pour CDC25B et CDC25C dans l’entrée et le déroulement de la phase S cependant cette fonction n’est pas claire et controversée (Boutros et al., 2007a; Garner‐Hamrick et al., 1998). Enfin, il a été récemment montré que CDC25B et CDC25C sont localisées aux centrosomes de la fin de la phase S à la phase M, où ils initient l’activation du complexe CDK1/Cycline B requise pour l’entrée en mitose. De plus, au cours de l’interphase, l’activité de CDC25B est requise dans le cycle du centrosome (Bonnet et al., 2008; Boutros et al., 2007b). Les différences fonctionnelles entre ces phosphatases leur sont conférées par des affinités bien 72 Introduction spécifiques pour les différents complexes CDK/Cycline, mais toutes sont capables de déphosphoryler le complexe mitotique CDK1/Cycline B (figure 15) (Boutros et al., 2007a). Afin d’assurer la progression stéréotypée dans les différentes phases du cycle cellulaire les phosphatases CDC25 sont hautement régulées par des mécanismes interdépendants. Ces mécanismes mettent en jeu des phosphorylations activatrices et inhibitrices, des ubiquitinylation pour dégrader la protéine, des liaisons à des protéines partenaires tels que les protéines 14‐3‐3 et des changements de localisation (Boutros et al., 2007a). Les trois CDC25 portent des motifs de localisation ou d’exclusion nucléaire (Boutros et al., 2007a; Karlsson‐Rosenthal et al., 2006). Leur phosphorylation par des kinases multiples, dont les complexes CDK/Cycline, va moduler leur activité mais aussi leur stabilité. Par exemple, CDC25B est nécessaire aux centrosomes pour activer localement le pool de CDK1/Cycline B qui va initier la mitose en augmentant la nucléation des microtubules (Bailly et al., 1989; Jackman et al., 2003; Lindqvist et al., 2005). La localisation centrosomale de CDC25B est due à sa phosphorylation par la kinase Aurora‐A (Dutertre et al., 2004). CDC25B est aussi phosphorylée aux centrosomes par la kinase pEg3 (Mirey et al., 2005) et la kinase de checkpoint CHK1 (Kramer et al., 2004; Schmitt et al., 2006). Dans ces cas là, les phosphorylations maintiennent CDC25B dans un état non‐actif et contribuent ainsi au cours d’un cycle cellulaire normal au contrôle temporel de l’entrée en mitose. Ce mécanisme de maintien des CDC25 dans un état inactif est hautement utilisé en réponse à des dommages ou des stress. En effet, dans ce contexte, les CDC25 vont être activement inhibées par des phosphorylations catalysées par exemple par les kinases des points de contrôle CHK1 et CHK2. Ces phosphorylations vont promouvoir la dégradation protéique des CDC25 et/ou induire leur liaison aux protéines 14‐3‐3 entrainant leur séquestration cytoplasmique qui va les empêcher d’interagir avec leurs substrats. Cette inhibition par les protéines activées suite à des dommages ont donc pour conséquence l’arrêt du cycle cellulaire nécessaire à la réparation des dommages (Donzelli et al., 2003; Karlsson‐
Rosenthal & Millar, 2006). III.3.03.LES CDC25S AU COURS DU DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE Des études réalisées au cours du développement de la Drosophile D. melanogaster ont établi l’importance de cdc25 (string) dans la coordination entre la prolifération cellulaire et les évènements développementaux. Chez la Drosophile deux homologues de cdc25 on été identifiés : string requis dans les cellules somatiques et twine restreint à la lignée germinale 73 73 (Edgar et al., 1989). Dans l’embryon de Drosophile la transcription de string est nécessaire et suffisante pour la progression en G2/M. Les pics de transcription de string déterminent le moment précis de l’entrée dans la division cellulaire. Lorsque string est génétiquement délété, les cellules embryonnaires soient arrêtées en G2. Sa surexpression entraine l’entrée prématurée des cellules en mitose. L’activité de string est principalement régulée transcriptionnellement et ce par les mêmes réseaux protéiques qui contrôlent la destinée cellulaire (Edgar et al., 1994; Lehman et al., 1999; Mozer et al., 1999). Dans les embryons de souris, les trois phosphatases CDC25 sont exprimées au cours du développement dans de nombreux tissus et en particulier dans l’ébauche de moelle épinière (V. Sabado données non publiées). Leurs expressions sont différentes suggèrant qu’ils soient distinctement sollicités au cours de l’embryogenèse et que leurs fonctions biologiques sont séparées (Kakizuka et al., 1992; Wickramasinghe et al., 1995; Wu et al., 1995). De façon surprenante, les souris invalidées pour les gènes CDC25B, CDC25C ou CDC25B et CDC25C se développent normalement (Chen et al., 2001; Ferguson et al., 2005; Lincoln et al., 2002). Cependant l’invalidation de CDC25B rend les femelles stériles. Les ovocytes sont incapables d’activer le MPF (M‐phase Promoting Factor : CDK1/Cycline B) et restent donc arrêtés en phase de prophase de méiose I suggérant un rôle bien spécifique de CDC25B à la méiose qui ne peut être remplacé par les autres phosphatases (Lincoln et al., 2002). Ces données indiquent que CDC25B et CDC25C semblent dispensables au développement et à la progression dans le cycle cellulaire des cellules somatiques, et que CDC25A soit capable de catalyser toutes les phases du cycle cellulaire. L’importance de CDC25A a été récemment démontrée par la génération de souris invalidées pour CDC25A : ces souris meurent à des stades embryonnaires très précoces. Les auteurs n’ont pas encore caractérisé le phénotype plus en détail (Ray et al., 2007). Ces résultats suggèrent que CDC25A joue un rôle non redondant pendant l’embryogenèse. Dans les embryons de poulet notre équipe a mis en évidence que CDC25A e CDC25B, les seules phosphatases CDC25 aviaires identifiées à ce jour, sont différentiellement exprimées et régulées au cours de la neurogenèse spinale ((Benazeraf et al., 2006); Sabado V. données non publiées). Je reviendrai sur ce point dans la partie Résultats. 74 OBJECTIFS Mon projet de thèse a porté en premier lieu sur l’identification de la cascade moléculaire qui lie CDC25B à la voie de signalisation Shh/GLI afin de définir si CDC25B est une cible directe de Shh/GLI; en second lieu, sur la caractérisation de l’expression des phosphatases CDC25A et CDC25B au cours de la neurogenèse spinale ; et enfin, sur l’étude de la fonction développementale de CDC25B dans les processus de prolifération et différenciation des progéniteurs neuraux. Mon objectif final étant de comprendre si l’activation de CDC25B par la voie Shh/GLI avait pour but d’influencer le destin des cellules progénitrices neurales cʹest‐à‐dire leur comportement dans le cycle cellulaire et leur engagement dans la différenciation. 76 RÉSULTATS I. RÉGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DE CDC25B PAR LA VOIE DE SIGNALISATION SHH/GLI L’importance de la voie de signalisation Shh/GLI au cours du développement mais aussi dans les maladies humaines n’est plus à démontrer. Cependant, il reste à élucider quelles sont les cibles transcriptionnelles de la voie Shh via les facteurs de transcription GLI, qui seraient les acteurs de sa fonction mitogène. A mon arrivée au laboratoire, j’ai participé au travail de Bertrand Bénazéraf qui avait pour objectif de comprendre comment la voie Shh/GLI contrôlait la prolifération. Bertrand avait montré que la voie Shh/GLI était nécessaire et suffisante pour l’expression de CDC25B dans le tube neural. La question alors à l’étude était de savoir si l’expression de CDC25B dépendante de Shh/GLI était la conséquence de l’action de la voie de signalisation sur la prolifération cellulaire. Pour répondre à cette question l’analyse de l’expression de CDC25B a été réalisée après blocage du cycle cellulaire. Nous avons montré que dans ces conditions l’expression de CDC25B n’était pas affectée. En parallèle, j’ai étudié l’effet du blocage de la voie Shh/GLI par traitement de 6 heures à la cyclopamine sur la prolifération des cellules neuroépithéliales par cytométrie de flux et par quantification de la population en mitose (cf. Annexe I). Ces traitements, suffisants pour abolir l’expression de CDC25B, ont peu d’impact sur le cycle cellulaire suggérant que l’inhibition de CDC25B dans ce contexte n’est pas la conséquence d’une modification de la prolifération. Cette étude nous a permis d’identifier un lien inattendu entre la phosphatase CDC25B et la voie Shh/GLI dans le tube neural murin et aviaire (cf. Annexe I) (Benazeraf et al., 2006). En conséquent, l’un des objectifs de ma thèse a été d’établir la mécanistique moléculaire de cette relation. 78 Résultats I.1.IDENTIFICATION DES ÉLÉMENTS DE RÉGULATION DE CDC25B SUSCEPTIBLES DE RÉPONDRE À SHH/GLI Les expériences de surexpression de Shh ou de GLI activé, mais aussi d’inhibition de la voie Shh par la cyclopamine modulent l’expression du transcrit CDC25B, par contre l’expression de CDC25A n’est pas ou peu affectée. L’effet de la voie Shh/GLI sur le transcrit de CDC25B est visible en des temps très courts comme c’est le cas pour N‐myc et Cycline D1 des cibles directes de la voie Shh (Benazeraf et al., 2006). Nous avons donc envisagé l’hypothèse que l’expression de CDC25B soit directement régulée par fixation des facteurs de transcription GLI sur les séquences régulatrices du gène CDC25B. La transcription d’un gène est initiée par les séquences promotrices localisées dans les régions 5’ en amont de la séquence codante et qui contiennent des éléments de séquences permettant de recruter les protéines de liaison à la boîte TATA avec le complexe TFIID d’initiation de la transcription (Levine et al., 2000). Cette unité de transcription va être contrôlée par plusieurs séquences régulatrices hautement spécialisées qui vont diriger l’expression du gène dans différents types cellulaires et/ou tissus pendant le développement. Chaque séquence régulatrice utilisée, aussi appelée élément cis‐régulateur, sera responsable d’une fraction du patron d’expression complet du gène. Les éléments cis‐régulateurs peuvent être localisés en amont (extrémité 5’) ou en aval (extrémité 3’) de l’unité de transcription mais aussi dans les introns des gènes (Levine et al., 2000). Ils sont typiquement constitués de plusieurs sites de liaison à des facteurs de transcription activateurs ou inhibiteurs. La stratégie a été de rechercher in silico dans l’unité de transcription du gène CDC25B les potentielles régions régulatrices. Le génome de Gallus gallus est séquencé en quasi‐totalité et partiellement annoté, mais il n’a pas encore été possible d’y localiser le gène CDC25B. Une tentative de localisation a été entreprise dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe d’Alain Vignal à l’INRA. Cependant, au jour d’aujourd’hui, aucunes données de séquences génomiques n’ont été apportées (figure 19A). Bénazéraf B. a montré que la relation entre CDC25B et Shh/GLI est conservée chez Mus musculus (cf. Annexe I) (Benazeraf et al., 2006). Nous avons donc décidé de procéder à une analyse du locus du gène CDC25B murin. 79 79 A.
Souris/rat
Souris/humain
Souris/poulet: pas de données génomiques pour CDC25B de poulet
Région régulatrice candidate = Intron 1
B.
Intron1 de souris
5’
3’
Intron1 de rat
5’
3’
C.
Souris
CTCCTTAACCGTGCCTGTGGGGTCCCAGGTGGGT----GGTCCAGCTGCA
Rat
CTCCTTAA-----CCTGTGGGGTCCCAGCTGGGTGGTCGGTCCAGCTGCA
Humain
CTCCCTAAGT----CTGCAAGGGGAGAGCTGGGTTG--TTCCAG------
Rhesus
CTCCCTAAG------TGCAAGGGGAGAGCTGGGTTG--TTCCAG------
Cheval
CTCCCTGAGCAAGTCTGCAGGGTCCAGGCGGGGTTG--TCCTTG--AGCA
Chien
CTTCCTGAGCAA-CCTGCAGTGTCCAGGCTGGGTTG--CCCTCAGCAGCA
D.
Figure 19. Analyse in silico du locus du gène CDC25B. A‐ Comparaison avec le programme « VISTA » browser des séquences génomiques des gènes CDC25B de
différentes espèces animales : souris/rat, souris/humain, souris/poulet. Les exons sont en violet, les UTRs
en bleu. L’axe des ordonnées représente le pourcentage de conservation qui lorsqu’il est élevé est
représenté en rose. B‐ Présence de sites putatifs de liaison à GLI (vert) et à Lef/TCF (bleu) dans l’Intron 1 de souris et de rat
identifiés grâce au programme MatInspector du logiciel «Génomatix ». C‐ Alignement des sites GLI conservés entre souris et rat. D‐ Exemple de matrice GLI définie par Vokes SA et ses collaborateurs (Vokes et al., 2007). 80 Résultats Deux paramètres ont été pris en compte pour la sélection des régions candidates : d’une part la présence de sites putatifs de fixation des facteurs de transcription GLI ; et d’autre part la conservation entre souris, rat et humain puisqu’il est admis que des régions non codantes sont conservées au cours de l’évolution afin de maintenir des fonctions biologiques critiques. Pour cela, nous avons utilisé le logiciel Génomatix avec son programme MatInspector qui contient les données de matrices d’un grand nombre de facteurs de transcription dont celles de la famille GLI. La matrice GLI utilisée est en accord avec les matrices définies par différentes équipes et qui ont permis d’identifier des gènes cibles directs de Shh/GLI (figure 19D) (Hallikas et al., 2006; Lei et al., 2006; Ribes et al., 2008; Vokes et al., 2007). La région promotrice de 1Kb du gène CDC25B murin a été étudiée par l’équipe de Rolf Müller sur la base de sa régulation transcriptionnelle cycle cellulaire dépendante (Korner et al., 2001). En lignées cellulaires cet élément est suffisant pour récapituler le patron d’expression physiologique de CDC25B au cours du cycle cellulaire. Le promoteur murin contient les séquences typiques permettant le recrutement de la machinerie d’initiation de la transcription cʹest‐à‐dire une boîte TATA canonique, une séquence consensus d’initiation appelée Initiateur (Inr) et un point +1 de départ de transcription. Cette étude a permis d’identifier un élément de régulation par le facteur nucléaire NF‐Y qui en coopération avec une séquence répresseur appelée CCRR (Cell Cycle Related Repressor) régulent l’expression cycle cellulaire dépendante. Nous avons analysé si cet élément promoteur contenait des éléments de régulation par GLI avec nos outils bio‐informatiques mais aucun site putatif n’a été identifié dans cette région. Nous avons donc étendu notre analyse au reste du locus du gène CDC25B. Plusieurs sites de liaisons GLI consensus ont été identifiés par cette méthode, et une région candidate nous a particulièrement intéressée car elle contient deux motifs potentiels de liaison de GLI qui sont conservés en position et en séquences entre souris et rat alors que les autres sites ne le sont pas. Cette région génomique correspond à l’Intron1, et contient aussi des sites putatifs de liaisons conservés pour les facteurs de transcription Lef/TCF effecteurs de la voie Wnt (figure 19B). Ces deux sites GLI putatifs ne sont pas conservés chez l’humain cependant nous avons identifié des sites putatifs dans la région promotrice en amont de la boîte TATA mais aussi un site dans l’intron 1 qui sont conservés chez diverses espèces de primates. 81 81 Figure 20. Expression de la β‐galactosidase dépendante du mIntron1. Représentation schématique de la technique d’électroporation in ovo dans l’embryon de poulet. En
vert est représentée la solution d’ADN (A). Expression de la β‐galactosidase dans les embryons
électroporés avec le vecteur d’expression contenant le mIntron1 en aval d’un promoteur basal et
codant pour le gène rapporteur LacZ. Embryons entiers (B,C), coupes transversales (D‐F). En G,
quantification des embryons présentant une expression de la β‐galactosidase suite à l’électroporation
d’un vecteur contrôle (pLacZ) ou contenant le mIntron1 (pmIntron1 LacZ) dans des conditions
sauvages (pCiG) ou de surexpression d’une forme activateur (GliAct) ou répresseur de GLI (GliRep).
La quantification est représentée en pourcentage du nombre d’embryons exprimant la β‐galactosidase
sur le nombre d’embryons total. 82 Résultats I.2.L’INTRON1 DE CDC25B EST SUFFISANT POUR RÉPONDRE À LA VOIE DE SIGNALISATION SHH/GLI L’Intron1 murin de CDC25B (mIntron1) a été isolé par PCR à partir d’une banque génomique d’embryons de souris et cloné en amont d’un gène rapporteur codant pour la β‐
galactosidase (lacZ) sous le contrôle d’un promoteur minimal hétérologue (béta‐globine). Sachant que les éléments régulateurs murins fonctionnent chez le poulet (Itasaki et al., 1999; Timmer et al., 2001), j’ai d’abord vérifié si mIntron1 était suffisant pour permettre l’expression de cette construction dans le tube neural, par électroporation in ovo d’embryons de poulet au stade E1.5 (figure 20A). L’efficacité de transfection et l’étendue de la zone ayant reçu le transgène sont visualisées par co‐électroporation d’un vecteur contrôle codant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire CMV (pCiG). J’ai pu observer que mIntron1 était suffisant pour activer l’expression du lacZ dans 50% des embryons électroporés (figure 20B,C,G). Des coupes transversales de ces embryons nous ont permis d’observer que l’expression du gène rapporteur ne montre pas de localisation spécifique le long des axes dorso/ventrale et apico/basale comme observé normalement chez le poulet pour le transcrit CDC25B (figure 20D‐F). Cependant, compte tenu qu’il s’agit d’une séquence murine et que les patrons d’expression de CDC25B chez le poulet et la souris ne sont pas tout à fait similaires (Annexe I), l’expression du transcrit étant plus large dans le tube neural de souris, nous avons choisi de poursuivre l’étude de mIntron1. Afin de déterminer si mIntron1 était capable de répondre aux effecteurs de la voie Shh, les protéines GLIs, j’ai réalisé des expériences de co‐électroporation avec des vecteurs pCiG codant pour des formes modifiées des protéines GLIs. Rappelons qu’il existe trois protéines GLIs chez les Vertébrés : GLI1 qui agit seulement comme activateur transcriptionnel et GLI2, GLI3 qui ont des propriétés à la fois d’activateur et de répresseur. J’ai utilisé une forme de GLI3 délétée du domaine N‐terminal répresseur, qui ne porte que le domaine carboxy‐
terminal activateur et se comporte comme un activateur constitutif (GliAct) et une forme délétée du domaine carboxy‐terminal qui se comporte comme un répresseur constitutif (GliRép) de la voie Shh (Lei et al., 2004). Le pourcentage d’embryons présentant une activité β‐galactosidase a été déterminé pour chaque conditions expérimentales. Les résultats sont résumés (figure 20G). La co‐électroporation de GliAct avec mIntron1 augmente nettement l’efficacité du mIntron1 à activer l’expression du gène LacZ comparé aux contrôles, et inversement la co‐électroporation avec GliRép la diminue. 83 83 Ces données suggèrent que le mIntron1 contienne des éléments cis‐régulateurs lui conférant la potentialité de répondre à Shh/GLI. Cependant les expériences réalisées avec le vecteur rapporteur sans mIntron1 montrent une expression basale du gène rapporteur qui bien que plus faible qu’avec le mIntron1 reste anormalement élevée (particulièrement apparent dans l’expérience n°5). Des difficultés techniques du même ordre nous ont été rapportées par d’autres équipes utilisant ce vecteur rapporteur dans l’embryon de poulet. Ainsi, ces résultats sont encourageants mais restent à confirmer. La poursuite de cette analyse nécessitant la mise en œuvre de nouvelles stratégies dont la mise au point s’annonçait longue, nous avons choisi de focaliser mes travaux de thèse sur le rôle de CDC25B au cours de la neurogenèse embryonnaire. 84 Résultats 85 85 E1.5
CDC25A
CDC25B
A
F
B
C
G
H
D
I
E
J
BB et al 2006 ‐ Annexe I E3
E4.5
E5.5
L
M
O
P
Q
N
CDC25A
K
E7
CDC25B
R
Figure 21. Patrons d’expression des phosphatases CDC25A et CDC25B au
cours de la neurogenèse dans l’embryon de poulet. Images d’hybridations in situ pour CDC25A et CDC25B de poulet. Au stade E1.5 les
hybridations in situ sont réalisées sur embryons entiers puis analysées sur embryons entiers
(A,B‐F,G) et sur coupes transversales (C‐E,H‐J) (Bénazéraf B. et al., 2006 ; Annexe I). Aux stades plus tardifs l’hybridation in situ est directement réalisée sur coupes
transversales de tube neural (K‐R). 86 Résultats II. LES PHOSPHATASES CDC25A ET CDC25B SONT EXPRIMÉES TOUT LE LONG DE LA NEUROGENÈSE SPINALE II.1.CDC25A ET CDC25B SONT DIFFÉREMMENT EXPRIMÉS Nous avons étudié l’expression des CDC25 aviaires par hybridation in situ : les sondes ARN utilisées sont dirigées contre la partie régulatrice de l’ARNm de CDC25A, et la partie catalytique de CDC25B. A E1.5 (HH10) (figure 21A‐J), CDC25A est présent dans la plaque neurale caudale composée de cellules souches neurales en prolifération qui sont maintenues dans un état indifférencié grâce aux signalisations du FGF et de Notch/Delta (figure 21 A,B,E). CDC25B est absent de cette zone (figure 21 F,G,J). Son expression est initiée par Shh/GLI dans le tube neural ventral et précède juste l’initiation de la différenciation neuronale (figure 21 I,H ; Annexe I). Avant toute étude fonctionnelle, nous avons décidé de réaliser l’étude détaillée de la cinétique d’expression de CDC25A et CDC25B dans la moelle épinière en développement par hybridation in situ. Ces expériences ont été effectuées du stade E3 au stade E7 dans l’embryon de poulet avec l’aide de Virginie Sabado, étudiante en M2R. Comme illustré dans la figure 21K‐R, CDC25A et CDC25B sont largement exprimés au cours du développement de la moelle épinière. Les transcrits sont restreints à la zone ventriculaire et ne sont pas détectés dans la zone du manteau. L’expression de CDC25B apparait plus dynamique que CDC25A. II.1.01.L’EXPRESSION DE CDC25B EST CORRÉLÉE AUX PHASES DE PRODUCTION NEURONALE Afin de définir si la dynamique d’expression des CDC25s est liée à un évènement particulier de la neurogenèse nous avons comparé l’expression de ces phosphatases à des marqueurs de prolifération (cellules en phase S et mitose), de spécification, de jeunes neurones post‐mitotiques et de différenciation, et ce aux stades E2.5, E4‐4,5 et E7. Les résultats sont présentés en figure 22. L’analyse de la prolifération a été réalisée par marquage des cellules en phase S en appliquant in ovo un pulse de 30 minutes de BrdU avant de prélever les embryons et de réaliser une immuno‐fluorescence avec un anticorps dirigé contre le BrdU. Les cellules en mitose sont visualisées avec un anticorps dirigé contre l’histone H3 phosphorylée. 87 87 CDC25A
CDC25B
H3P
H3P
H3P
NeuroM
H3P
N
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 22. L’expression de CDC25B est corrélée aux phases de production neuronale.
Coupes de moelle épinière aux stades E2.5 (A‐E), E4.5 (F‐J) et E7 (K‐O). Hybridation in situ de CDC25A
(A,F,K) et CDC25B (B,G,L). Immunodétection de l’histone H3 phosphorylée (H3P) utilisé pour visualiser les
cellules en mitose (C,G,L,M), du BrdU pour identifier les cellules en phase S (C,D,H,M), de Pax7 et Olig2 pour
définir les domaines de progéniteurs (D), de NeuroM pour identifier les jeunes neurones post‐mitotiques
localisés dans la zone de transition (D,I,N). p27Kip1 marque les neurones post‐mitotiques localisés dans la
zone du manteau (E,J), Islet1/2 les motoneurones (E,J), et Pax2 les derniers neurones produits aux stades
tardifs (O). 88 Résultats A tous les stades analysés les régions qui expriment CDC25A sont en prolifération (figure 22A,C ; F,H ; K,M). Ceci est particulièrement bien illustré au stade E7 dans les domaines (a) et (c) au niveau desquels on observe une intense prolifération, par opposition aux domaines (b) et (d) où les cellules ne prolifèrent plus et qui n’expriment pas CDC25A (figure 22K,M). CDC25A est parfois exprimé seul tel que dans la région dorsale du tube neural au stade E2.5 (figure 22A) suggérant que l’activité de CDC25A est suffisante dans ce contexte pour accomplir la division cellulaire alors que d’autres domaines expriment aussi CDC25B. L’expression de CDC25B apparait plus dynamique et est associée aux phases de production neuronale. A E2.5 l’expression de CDC25B, au contraire de celle de CDC25A, n’est pas homogène dans la zone ventriculaire (figure 22B). En effet, CDC25B est fortement exprimé dans un domaine ventral qui correspond aux progéniteurs des motoneurones identifiés par l’expression du facteur de transcription à bHlH, Olig2 (figure 22B,D). A ce stade la production neuronale a principalement lieu dans ce domaine. Ceci est illustré par l’expression de p27Kip1, un marqueur général de sortie du cycle cellulaire, mais aussi celle d’Islet1 un facteur de transcription à homéodomaine de type LIM qui marque spécifiquement les motoneurones post‐mitotiques en différenciation (figure 22E). On peut observer que l’expression de CDC25B s’étend à des cellules localisées le long du lumen dans la zone intermédiaire du tube neural (figure 22B). Si on compare l’évolution de l’expression de CDC25B à celle du facteur de transcription à bHlH NeuroM qui marque de façon transitoire tous les jeunes neurones post‐mitotiques on s’aperçoit que leurs domaines d’expression évoluent de façon parallèle suggérant que CDC25B est associé à la génèse des neurones (figure 22B,D ; G,I ; L,N et figure 23A‐C). Ceci est vrai tout au long de la neurogenèse. Enfin, on observe une évolution de l’expression de CDC25B dans la partie basale de la zone ventriculaire qui apparait de plus en plus soutenue au fur et à mesure de l’intensification de la production neuronale (figure 22 G,I). Cette expression basale persiste tardivement dans des domaines qui ne prolifèrent plus (E7 (b) et (d)). 89 89 E7
(a)
(b)
(c)
E4.5
(d)
Figure 23. CDC25B est exprimé à la transition entre zone ventriculaire et zone de
différenciation Hybridations in situ pour CDC25B (A), Cash1 (B) et NeuroM (C) à E7 sur des coupes adjacentes. AB et
AC correspondent à la superposition manuelle des coupes adjacentes. A E4.5, hybridation in situ de
CDC25B révélée en fluorescence combinée à un marquage en immunoflorescence des cellules ayant
incorporé le BrdU (après un pulse de 30 min) (D) ou p27Kip1 (E). D’ et E’ correspondent à la mesure
automatisée des intensités des différents marquages aux niveaux représentés en D et E respectivement
par les encadrés blancs.
F‐ Représentation schématique des résultats obtenus en figures 25 et 26 (cf texte pour détails).
90 Résultats II.1.02.CDC25B EST FORTEMENT EXPRIMÉ DANS LA ZONE DE TRANSITION Afin d’identifier le statut des cellules exprimant CDC25B basalement j’ai comparé l’expression de CDC25B au stade E7 à celle du gène proneural à domaine bHlH cAsh1 restreinte aux progéniteurs dorsaux de la zone ventriculaire, et du facteur NeuroM exprimé dans la zone de transition (figure 23 A‐C). J’ai réalisé cette analyse au stade E7 car la situation y est plus tranchée et ainsi plus facile d’interprétation. La comparaison par superposition d’images du patron d’expression de ces gènes réalisée sur des coupes adjacentes révèle que les expressions de cAsh1 et de NeuroM sont totalement exclusives, et qu’au contraire l’expression de CDC25B recoupe l’expression de cAsh1 dans la zone ventriculaire et celle de NeuroM dans la zone de transition (figure 23AB, AC respectivement). Ces données montrent que CDC25B est exprimé dans les progéniteurs de la zone ventriculaire et persiste dans les jeunes neurones localisés à la périphérie de cette zone. Afin de confirmer ces résultats, j’ai comparé l’expression de CDC25B aux cellules en phase S dont les noyaux marquent la limite basale de la zone ventriculaire, et à celles exprimant p27Kip1 localisées dans la zone du manteau (figure 23D, E respectivement). Cette étude a été réalisée au stade E4.5 et analysée par microscopie confocale, puis les profils des marquages le long de l’axe apico‐basal ont été mesurés sous ImageJ grâce une macro élaborée Brice Ronsin (Ingénieur responsable de la plateforme imagerie du laboratoire) (figure 23D’, E’). Si certaines cellules CDC25B+ incorporent le BrdU, d’autres sont clairement localisées plus latéralement que la population en S (figure 23D, D’). On n’observe pas de cellules CDC25B+ qui co‐expriment p27Kip1 (figure 23E, E’). Ces données confirment que l’expression basale de CDC25B correspond à des cellules localisées dans la zone de transition et que cette expression est rapidement éteinte dès que ces cellules acquièrent leur statut de neurones matures et migrent dans la zone du manteau. En conclusion, nous distinguons trois profils distincts d’expression de CDC25A et CDC25B dans le tube neural en développement (figure 23F). CDC25A est exprimé seul dans la zone souche à E1,5 et dans la région dorsale à E2, deux régions actives en prolifération mais où la neurogenèse n’a pas débuté ; CDC25A est associé à CDC25B dans les régions prolifératives neurogéniques ; lorsque CDC25B est exprimé seul, il est restreint à la partie basale de la zone ventriculaire probablement persistant dans les jeunes neurones. Dans ce cas on observe peu ou pas de prolifération dans la zone ventriculaire. 91 91 CDC25B
CDC25A
B
A
% de cellules BrdU+ au sein des
populations progénitrices
F.
C
Proportion de cellules en phase M
% de cellules H3P+/BrdU+ au
sein des cellules H3P+
Temps d’exposition au BrdU en minutes
92 D
Cycline D2
E
Figure 24. Étude du comportement prolifératif des cellules progénitrices exprimant des combinatoires distinctes de phosphatases CDC25. H. Estimation de la durée de la phase G2
Cycline D1
Proportion de cellules en phase S
% de cellules H3P+ au sein des
populations progénitrices
G.
Pax7 Olig2
Les progéniteurs des motoneurones Olig2+ expriment CDC25A et CDC25B. Les progéniteurs dorsaux Pax7+ expriment seulement CDC25A
(A‐C). Il est intéressant de noter que les Cyclines de type D sont aussi différentiellement exprimées dans ces deux domaines (D,E). Estimation des paramètres du cycle cellulaire dans les domaines Olig2+ et Pax7+. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules BrdU+ ou MPM2+ parmi la population Olig2+ ou Pax7+ (F et G respectivement) ou en pourcentage de cellules MPM2+/BrdU+ parmi les cellules BrdU+ au sein de chacun des domaines de progéniteurs (H). Seule l’estimation de la durée de la phase G2 montre une différence entre ces deux domaines: la phase G2 apparait plus courte dans le domaine Olig2. Résultats II.1.03.ÉTUDE DU COMPORTEMENT PROLIFÉRATIF DES CELLULES DANS LES TERRITOIRES EXPRIMANT DES COMBINAISONS DIFFÉRENTES DE CDC25A ET B Nous avons voulu savoir si des régions qui exprimaient des combinaisons différentes de phosphatases CDC25 avaient des comportements prolifératifs distincts. Nous avons réalisé cette étude sur des coupes transversales de tube neural à E2 (figure 24). A ce stade le domaine de progéniteurs neuraux défini par l’expression d’Olig2 exprime la combinaison CDC25A+CDC25B, le domaine Pax7 exprime uniquement CDC25A (figure 24A‐C). Il faut noter que ces domaines expriment également différentiellement Cycline D1 et D2 (figure 24D, E). Dans chacun de ces domaines nous avons quantifié : la proportion de cellules en phase S (détection du BrdU après un pulse de 30 minutes), en mitose (anticorps MPM2) et nous avons estimé la longueur de la phase G2 en quantifiant le pourcentage de cellules en mitoses qui sont BrdU+, 90 minutes à 180 minutes après le pulse de BrdU. Nos données montrent que la proportion de cellules en phase S est la même (figure 24F) et que celle des cellules en mitose n’est pas significativement différente entre les deux domaines analysés (figure 24G). L’observation la plus marquante est que la G2 semble plus courte dans la région coexprimant CDC25A+CDC25B que dans celle exprimant CDC25A seulement (figure 24H). Il est donc possible que la présence de CDC25B modifie la cinétique du cycle en particulier en raccourcissant la durée de la G2. II.2.ESSAIS DE LOCALISATION DE LA PROTÉINE CDC25B AVIAIRE La protéine CDC25B est finement régulée post‐traductionnellement (phosphorylations, ubiquitinylation etc…) et ces modifications complexes influencent sa localisation sub‐
cellulaire, sa stabilité et par conséquent son activité. Certains des résidus dont la modification module l’activité de la protéine CDC25B humaine ont été identifiés (Bouche et al., 2008) et semblent conservés chez la protéine aviaire (figure 25A). Par exemple, il a été montré que CDC25B humain est phosphorylé sur sa sérine 353 par la protéine kinase Aurora‐A, ce site est conservé dans la séquence aviaire (figure 25A flèche bleue pleine). Cette forme de CDC25B est détectée aux centrosomes pendant la phase de mitose, et participerait au contrôle de l’entrée en mitose. Ainsi, il était important d’une part d’analyser la répartition de la protéine CDC25B par rapport au transcrit, mais aussi d’analyser la localisation des formes modifiées de la protéine pour identifier les cellules dans lesquelles elle était présente sous sa forme active. 93 93 A.
NES
NES
Anticorps 14‐3‐3
Boîte KEN
Boîte
β‐TRCP
14‐3‐3
NLS
NLS
DOMAINE CATALYTIQUE
CDK1/Cycline B
Autres kinases (Aurora‐A, Eg3, MK2)
Plk1
Ubiquitinylation
CHK1
B.
C.
Superposition
nuGFP
CDC25B
Figure 25. La protéine CDC25B A‐ Modifications post‐traductionnelles potentielles de la protéine aviaire obtenues par
comparaison avec les données connues chez la protéine humaine (Bouche et al., 2008).
B‐ Validation par western‐blot de l’anticorps anti‐CDC25B aviaire. La séquence reconnue
correspond aux 15 acides aminés de l’extrémité amino‐terminale (pointillés vert en A).
C‐ Essai de détection de la protéine aviaire par immuno‐fluorescence après surexpression de
la protéine CDC25B de poulet (cellules transgéniques visualisées avec la GFP nucléaire) 94 Résultats Nos collaborateurs (équipe B. Ducommun, LBCMCP) disposent de nombreux anticorps dirigés contre les différentes formes humaines de CDC25B. J’ai donc testé ces anticorps par immunofluorescence sur des coupes d’embryons de poulet. Malheureusement ces expériences n’ont pas été concluantes, aucun des anticorps testés ne reconnaissant la protéine aviaire. Nous avons donc décidé de faire produire un anticorps polyclonal de lapin spécifiquement dirigé contre la partie N‐terminale de la protéine CDC25B aviaire (figure 25A) (Eurogentec, service de production d’anticorps). J’ai tout d’abord validé cet outil par western‐blot sur des extraits protéiques issus soit d’embryons sauvages soit d’embryons surexprimant la protéine CDC25B aviaire (figure 25B). L’immunsérum reconnait une protéine aux alentours de 70 KDa, qui est beaucoup plus représentée dans les extraits d’embryons surexprimant CDC25B, suggérant que l’anticorps reconnait la protéine CDC25B au moins en conditions dénaturantes. J’ai ensuite réalisé des expériences d’immunofluorescences sur coupes de tube neural d’embryons de poulet en utilisant différents protocoles mais dans ce cas là je n’ai pas été capable de détecter la protéine excepté en conditions de surexpression de la protéine CDC25B de poulet par électroporation in ovo (figure 25C). L’impossibilité de détecter la protéine endogène pourrait être due à son faible niveau d’expression et à son instabilité. Le laboratoire de B. Ducommun produit régulièrement de nouveaux anticorps que nous testons mais à ce jour sans succès. Qui plus est, même en conditions de surexpression, seule une partie des cellules transgéniques GFP+ montrent un marquage (figure 25C) suggérant que le système de régulation de la protéine est extrêmement efficace (via le système Ubiquitine/Protéasome) et empêche toute accumulation anormale de CDC25B. Cependant nous ne pouvons exclure que l’anticorps ne puisse reconnaître la protéine sous sa forme native si l’épitope présente une modification post‐traductionnelle dans les cellules. En conditions de surexpression, une fraction de la protéine pourrait échapper à cette modification et être reconnue par l’immunsérum. A ce jour nous n’avons pas été capables de déterminer la localisation de la protéine. 95 95 S.Pombe cdc25‐22, +25°C
B
A
S.Pombe cdc25‐22, +36°C, + thiamine
Vecteur vide
B
F.
S.pombe cdc25
G.gallus Cdc25A
C
D
G.gallus Cdc25B
E
Vecteurs utilisés pour transformer les levures
Index de septation (%)
Taille moyenne (μm)
Vecteur vide
1
40.07+/‐ 9.2
S.pombe Cdc25
20.5
12.92 +/‐ 6.8
G.gallus Cdc25A
22.3
18.98 +/‐ 10.1
G.gallus Cdc25B
21.4
13.53 +/‐ 6
Figure 26. Test de complémentation chez la levure S.pombe cdc25‐22. A‐Morphologie des levures thermosensibles cdc25‐25. A 25°C la mutation ne s’exprime pas, les levures se comportent normalement (A). A 36°C les levures cdc25‐22 transformées ou non avec un vecteur vide expriment la mutation cdc25 et sont alors arrêtées à la transition G2/M ce qui se traduit
par un phénotype allongé (B). C‐E‐Morphologie des levures cdc25‐22 transformées avec le vecteur codant pour cdc25 de S.pombe
(C), CDC25A de poulet (D), CDC25B de poulet (E) visualisée par microscopie à fluorescence après marquage de l’ADN au DAPI et marquage des septa au calcofluor. F‐Mesure de l’index de septation reflet de l’activité mitotique des levures, et de la taille moyenne
après transformation avec les différents vecteurs.
96 Résultats III.ÉTUDE DE LA FONCTION DES PHOSPHATASES CDC25 AU COURS DE LA NEUROGENÈSE III.1.LES CDC25 AVIAIRES ONT UNE ACTIVITÉ CATALYTIQUE CONSERVÉE III.1.01.TEST DE COMPLÉMENTATION CHEZ LA LEVURE S.POMBE Partie réalisée en collaboration avec Odile Mondesert, LBCMCP. Afin de s’assurer que les gènes CDC25A et CDC25B identifiés chez le poulet étaient fonctionnellement homologues à cdc25 et que donc leur activité catalytique était conservée, j’ai réalisé un test de complémentation chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. La souche cdc25‐22 de S.pombe contient un allèle thermosensible du gène cdc25. Les mutations thermosensibles s’expriment à une température dite restrictive (36°C) mais à température permissive (25°C) les levures se comportent normalement. Ainsi, à température restrictive, le mutant cdc25‐22 est arrêté à la transition G2/M ce qui se caractérise par un allongement des cellules car bien que l’entrée en mitose soit bloquée la croissance cellulaire continue ‐ chez la levure la croissance se fait exclusivement par allongement des extrémités de la cellule (figure 26A,B) (Russell & Nurse, 1986). Nous avons cloné les séquences codantes de CDC25A et CDC25B aviaires (notées ggCDC25 pour gallus gallus) dans le vecteur pREP3X permettant de surexprimer les protéines dans la levure. L’expression des transgènes est sous le contrôle du promoteur nmt1 (no messenger in thiamine 1) cʹest‐à‐dire qu’il est réprimé lorsque la thiamine est présente dans le milieu de culture. Les levures cdc25‐22 ont été transformées avec les vecteurs codant soit pour la protéine cdc25 de S.pombe soit pour ggCDC25A ou ggCDC25B. Le phénotype des levures transformées est analysé à température restrictive en absence de thiamine (figure 26B‐
E). Deux paramètres sont mesurés : ‐la taille moyenne des levures exprimée en μm ‐le pourcentage de levures contenant un septum. Le septum est une structure composée de matériel de la paroi cellulaire qui au cours de la mitose divise la cellule S.pombe en deux cellules filles égales en taille. L’apparition de cette structure indique donc que la cellule est en mitose. Les septa sont visualisés grâce au calcofluor, un agent fluorescent qui lie le matériel de paroi cellulaire nouvellement déposé et la fraction de cellules marquées au calcofluor est référée à l’index de septation. 97 97 Les résultats (figure 26F) indiquent que ggCDC25A et ggCDC25B sont capables de remplacer la fonction de cdc25 endogène puisque l’index de septation est restauré à un pourcentage normal (22,3 et 21,4 % respectivement contre 20,5% pour le contrôle positif et 1% pour le contrôle négatif), de même que la taille des levures. Cependant, la taille cellulaire moyenne des levures transformées avec ggCDC25A (18.98 μm) est plus grande que celle des levures transformées avec cdc25 de S.pombe (12.92 μm) ou ggCDC25B (13.53 μm) suggérant que ggCDC25A soit moins efficace pour complémenter la mutation. Des différences dans la capacité à complémenter les mutants cdc25‐22 est aussi observée lorsque l’expérience est réalisée avec différents variants d’épissage de CDC25B humain B1, B2 et B3 (notées hsCDC25 pour homo sapiens) (Lemaire et al., 2004). Dans ces expériences, le variant le moins efficace est hsCDC25B1 qui se distingue seulement de hsCDC25B2 et hsCDC25B3 par l’absence au sein du domaine régulateur d’une séquence appelée domaine A. L’ensemble de ces données suggère que bien que les activités catalytiques des homologues de cdc25 soient conservées et leur permettent de complémenter la mutation cdc25‐22, la composition du domaine régulateur, qui comme nous l’avons vu est très variable, génère des différences entre les isoformes de CDC25 qui vont influer sur leurs activités et contribuer à leurs spécificités. 98 Résultats 99 99 24h PE
6h PE
C.
A’
A’’
D
B
B’
B’’
E
hsCDC25B3
contrôle
A
ggCDC25B
faible
ggCDC25B fort
24h PE
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
Figure 27. Essais de surexpression de CDC25B dans le tube neural A‐C‐ Effet d’inducteur mitotique de CDC25B humain (hsCDC25B3). Embryons électroporés avec un
vecteur contrôle (A), ou un vecteur codant pour CDC25B3 humain (B). Quantification de la
proportion de cellules transgéniques GFP+ en mitose 6h après électroporation (C). 24h après
électroporation de hsCDC25B les cellules entrent massivement en apoptose (E). Contrôle (D).
F‐Q‐ Tentatives de surexpression de CDC25B de poulet (ggCDC25B). A 24h après électroporation
on observe une réduction du tube neural du côté électroporé liée à l’effet délétère sur la survie
cellulaire (F‐I). La protéine ggCDC25B surexprimée n’est détectée que dans une fraction des cellules
transgéniques (I‐L). En conditions de surexpression à des niveaux plus faibles, nous sommes
incapables de détecter la protéine ggCDC25B surexprimée (N‐Q). 100 Résultats III.1.02.ESSAIS DE SUREXPRESSION DE CDC25B DANS LE TUBE NEURAL AVIAIRE Au début de ma thèse la séquence aviaire de CDC25B n’était pas disponible mais nos collaborateurs disposaient de la forme humaine clonée sous le contrôle d’un promoteur CMV (CytoMegaloVirus, promoteur de forte expression). Afin de tester si cette protéine hsCDC25B était fonctionnelle dans le contexte de la moelle épinière de poulet j’ai électroporé in ovo cette construction. Au bout de 6h les cellules neuroépithéliales surexprimant hsCDC25B sont rapidement poussées en mitose (15% pour hsCDC25B contre 4% pour le contrôle) (figure 27A‐
C) et au bout de 24h ces cellules entrent en apoptose (non quantifiée) (figure 27D,E). Ainsi, comme décrit pour les cellules de mammifères en culture, la surexpression de hsCDC25B pousse les cellules en mitose même si elles n’ont pas répliqué leur ADN ce qui déclenche le programme apoptotique qui va éliminer ces cellules anormales. J’ai alors cloné la séquence codant CDC25B aviaire (ggCDC25B), homologue du variant d’épissage humain hsCDC25B3, qui serait potentiellement moins délétère que hsCDC25B. Le clonage a été réalisé dans un vecteur utilisé en routine pour les expériences de gain de fonction chez le poulet et qui génère de forts niveaux d’expression (pCIG, promoteur CMV, enhancer β‐actine): 24 heures après électroporation j’ai observé le même effet qu’avec hsCDC25B sur la viabilité cellulaire (figure 27F‐I). L’effet délétère sur la survie des cellules n’était donc pas liée à l’utilisation de hsCDC25B mais au fait que l’on exprime de forts niveaux de CDC25B. Le phénotype dramatique observé suite à l’utilisation d’un promoteur fort pour surexprimer ggCDC25B nous empêche d’analyser l’effet à long terme sur la neurogenèse. J’ai donc décidé de cloner ggCDC25B sous le contrôle d’un promoteur de plus faible expression (vecteur pECE, promoteur SV40 ; Stamataki & Briscoe, 2005). Mais dans ces conditions il a été impossible de détecter la protéine surexprimée même en analysant les extraits protéiques par western‐blot (figure 27N‐Q). Qui plus est, même en conditions de forte surexpression, seule une fraction des cellules GFP+ montrent un marquage positif pour la protéine CDC25B, et dans ce cas là les cellules ont une morphologie anormale (figure 27G‐M). Ces données suggèrent que le système de régulation de la protéine soit extrêmement efficace (via le protéasome) pour empêcher toute accumulation anormale de ggCDC25B. Lorsque néanmoins la protéine s’accumule suite à une très forte expression les cellules apparaissent rapidement anormales et entrent en apoptose. Ainsi, la technique de surexpression apparait inadaptée pour étudier la fonction de ggCDC25B au cours de la neurogenèse spinale. 101 101 Cassette d’expression de l’opéron de microARN
A
Promoteur
β-actine
cyGFP
Promoteur
U6 de
poulet
Poly A
------------- séquence cible BOUCLE séquence cible -------------
Terminateur POLIII
AMP
Figure 28. Utilisation de la technique d’interférence à ARN pour inhiber CDC25B.
A‐ Vecteur utilisé pour l’expérimentation (Das et al. 2006).
B‐D : Alors qu’un vecteur contrôle « scramble » n’a pas d’effet sur l’expression de CDC25B (B,B’), le siARN
–CDC25B diminue fortement le niveau d’expression de CDC25B (C,C’) sans affecter celle de CDC25A (D). 102 Résultats III.2.ANALYSE DU RÔLE DE CDC25B DANS LA NEUROGENÈSE SPINALE PAR INTERFÉRENCE À L’ARN L’ensemble de ces résultats fait partie d’un manuscrit soumis pour publication et consultable en Annexe II. III.2.01.CONCEPTION DES OUTILS POUR INHIBER LA FONCTION DE CDC25B Afin d’étudier la fonction de CDC25B pendant la neurogenèse embryonnaire j’ai utilisé la technique d’interférence à l’ARN. Pour cela, j’ai exploité les outils vectoriels élaborés par Das et ses collaborateurs (Das et al., 2006) qui sont basés sur la structure des opérons de microARN (figure 28A). Ces vecteurs ADN sont électroporés in ovo dans le tube neural d’embryons de poulet. Les microARN sont maturés in cellulo pour aboutir à la production de petits ARNs (small interférence ARN ou siARNs) qui vont spécifiquement interférer avec les transcrits des gènes cibles. Les séquences de CDC25B cibles des siARN ont été choisies dans la région régulatrice de CDC25B pour limiter au maximum les croisements potentiels avec CDC25A, et définies grâce à un programme spécifique en libre accès sur internet (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php). Quatre séquences codant pour quatre siARNs différents ont ainsi été clonées dans le vecteur d’expression modifié par rapport à la version originale (remplacement du rapporteur RFP par la GFP cytoplasmique). Deux des quatre siARNs réduisent efficacement l’expression de CDC25B 48h après électroporation comme illustré figure 28A, A’ sans affecter l’expression de CDC25A (figure 28D). Les embryons électroporés avec un vecteur contrôle (« scramble » obtenu sur le site http://www.sirnawizard.com/scrambled.php) ne montrent aucune réduction du transcrit de CDC25B mettant en évidence que la perte du transcrit de CDC25B est un effet spécifique des siARNs. (figure 28C, C’) 103 103 C.%GFP+/BrdU+
F. %GFP+/H3P+
Figure 29. Réduire l’expression de CDC25B n’empêche pas les cellules de proliférer.
Analyse de la prolifération 24h après électroporation d’un vecteur contrôle (A,A’, D,D’) ou codant
pour les siARN‐CDC25B (B,B’,E,E’) par détection des cellules en phase S après un pulse de 30
minutes de BrdU (A‐B’) ou des cellules en mitose avec l’anticorps anti‐H3P (D‐E’). Les
quantifications correspondent aux pourcentages de cellules BrdU+ (C) ou H3P+ (F) dans la
population transgénique GFP+. 104 Résultats III.2.02.RÉDUIRE L’EXPRESSION DE CDC25B N’EMPÊCHE PAS LES CELLULES NEURO‐
ÉPITHÉLIALES DE SE DIVISER Tout d’abord, j’ai analysé les conséquences de la délétion de CDC25B sur la prolifération des cellules neuroépithéliales 24h après électroporation. La fraction mitotique est visualisée grâce à un marquage de l’histone H3 phosphorylée (figure 29D,D’‐E,E’). La fraction de cellules en phase S est visualisée en appliquant un pulse de BrdU de 30 minutes aux embryons in ovo juste avant de les récupérer (figure 29A,A’‐B,B’). La proportion de cellules transgéniques en phase S et en mitose a été quantifiée (figure 29C, F respectivement). La déplétion de CDC25B n’empêche pas la réalisation de la division cellulaire (4,5% + 2 de cellules H3P+ pour les siARN‐CDC25B contre 5,2% + 1,6 pour les contrôles) mais augmente significativement la proportion de cellules en phase S (35,7% + 5,2 pour les siARN‐CDC25B contre 29,7% + 6,2 pour les contrôles). Il est important de noter que la population transgénique sur laquelle est réalisée cette quantification ne contient pas que des cellules en prolifération ; elle comprend aussi une fraction de cellules qui ont arrêté de proliférer et ont débuté leur différenciation. Ainsi dans ce contexte, l’augmentation du nombre de cellules en phase S peut être interprétée comme une augmentation de la proportion de cellules maintenues en prolifération mais pourrait aussi indiquer un délai dans l’accomplissement de la phase S spécifiquement ou un ralentissement général de la progression dans le cycle cellulaire. Des études des paramètres du cycle restreintes à la fraction cellulaire proliférante permettront de discriminer entre ces différentes hypothèses. La conclusion de ces expériences est que la réduction du niveau de CDC25B a peu d’effet sur la prolifération. 105 105 Figure 30. Réduire l’expression de CDC25B diminue la quantité de neurones produits. Analyse de marqueurs neuronaux 48h après électroporation d’un vecteur contrôle (A,A’) ou codant pour siARN‐
CDC25B. p27Kip1 (B,B’) marque les cellules sorties du cycle cellulaire, TUJ1 marque les neurones (A,A’ ;C,C’). 24H PE
GFP
A’
ADN
A’’
siARN CDC25B
Contrôle
A
TUNEL
B
106 B’
B’’
Figure 31. La survie
cellulaire n’est pas
affectée suite à la
délétion de
CDC25B. Analyse de la survie
cellulaire par essai
TUNEL 24h après
électroporation d’un
vecteur contrôle (A‐A’’)
ou codant pour siARN‐
CDC25B (B‐B’’). Résultats III.2.03.LA PRODUCTION NEURONALE EST DIMINUÉE SUITE À L’INHIBITION DE CDC25B Comme nous l’avons vu le patron d’expression de CDC25B est corrélé aux phases de production neuronale (figure 22 et 23). Nous avons donc analysé si la réduction du niveau d’expression de CDC25B avait un impact sur la différenciation neuronale. Nous avons visualisé les neurones post‐mitotiques 48h après électroporation d’un vecteur contrôle ou codant pour siARN‐CDC25B par immunofluorescence avec deux marqueurs génériques des neurones post‐mitotiques, p27Kip1 et la béta‐tubuline III (TuJ1) (figure 30). Ces deux marqueurs sont diminués du côté électroporé avec le siARN‐CDC25B comparé au côté non électroporé révélant que la fraction neuronale post‐mitotique est réduite (figure 30B,B’‐C,C’). Ceci n’est pas du à une incapacité des cellules à sortir du cycle cellulaire et à initier leur programme de différenciation puisqu’on peut observer de nombreuses cellules transgéniques qui sont p27Kip1 ou TuJ1 positives dans la zone du manteau. Les embryons contrôles ne montrent pas de réduction significative des marqueurs TuJ1 et p27kip1 (figure 30 A,A’). A 48h après électroporation, je n’observe pas de noyaux pycnotiques, caractéristiques de noyaux fragmentés suite au processus de mort cellulaire, dans la population transgénique. L’une des possibilités est que la réduction de la zone de différenciation soit une conséquence d’évènements de mort cellulaire qui auraient lieu plus précocement qu’à 48h. J’ai donc réalisé à 12h et 24h après électroporation un essai TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin‐dUTP Nick End Labeling) qui permet de visualiser les morceaux d’ADN fragmentés des cellules qui subissent une mort cellulaire (figure 31). Le marquage TUNEL à 12h et 24h n’est pas augmenté dans les embryons électroporés avec le siARN‐CDC25B comparés aux contrôles indiquant que la diminution de la population différenciée suite à la déplétion de CDC25B n’est pas le résultat d’une augmentation de la mort cellulaire. En conclusion la délétion de CDC25B s’accompagne d’une réduction de la zone de différenciation suggérant une réduction de la production neuronale. 107 107 C. Islet1+ CE/CNE
F. LIM1/2+ CE/CNE
Figure 32. Effet de la réduction de CDC25B sur les populations de motoneurones et
d’interneurones dorsaux. Analyse de la proportion de motoneurones détectés par immunofluorescence avec Islet1/2 (A‐C) et
d’interneurones marqués avec Lim1/2 (D‐F) 48h après électroporation d’un vecteur contrôle (A,A’ ;D,D’) ou
codant les siARN‐CDC25B (B,B’ ;E,E’). La quantification correspond au ratio du nombre de neurones côté
électroporé (CE) sur côté non électroporé (CE) pour les motoneurones (C) et pour les interneurones (F). En C,
la colonne notée « F » représente la valeur du ratio d’un embryon où l’ARNm de CDC25B est fortement
réduit, celle notée « f » représente le ration mesuré dans un contexte où CDC25B est peu diminué. 108 Résultats III.2.04.LES POPULATIONS NEURONALES DORSALES ET VENTRALES SONT AFFECTÉES CDC25B est fortement exprimé dans le domaine des progéniteurs de motoneurones au pic de production de ce type de neurones (figure 22B,D,E). Nous avons donc utilisé cette population neuronale pour quantifier l’impact d’une réduction du niveau de CDC25B sur la production neuronale (figure 32A,A’‐B,B’). Nous avons comparé la quantité de motoneurones produits visualisés par immunofluorescence avec Islet1/2 entre le côté électroporé avec le siARN‐CDC25B ou un vecteur contrôle et le côté non électroporé. Les résultats sont exprimés par le ratio côté électroporé sur côté non électroporé (CE/CNE) (figure 32C). Nous avons ainsi pu observer que diminuer CDC25B réduit de façon significative le nombre de motoneurones Islet1/2+ produits (0,84 + 0,12) alors que la transfection avec un vecteur contrôle n’a pas d’effet (0,98 + 0,09). Qui plus est, nous observons une corrélation claire entre l’efficacité du siARN à éteindre CDC25B et le phénotype sur la différenciation des motoneurones associé. Ainsi, une forte réduction du transcrit CDC25B résulte en un ratio CE/CNE de 0,6 (figure 32C « F »., alors que le ratio CE/CNE se porte à 0,9 dans un cas où l’expression de CDC25B persiste dans le domaine des progéniteurs de motoneurones (figure 32C « f »). En conclusion, la réduction de CDC25B affecte de façon dose‐dépendante la production des motoneurones. Nous nous sommes alors demandés si la délétion de CDC25B affectait d’autres populations neuronales, puisqu’au fur et à mesure du développement de la moelle épinière son expression apparait dans d’autres domaines que le domaine des progéniteurs de motoneurones (figure 22G,I). LIM1/2 est exprimé dans la plupart des populations d’interneurones dorsaux et intermédiaires, nous avons donc analysé l’effet de la dérégulation de CDC25B sur la population LIM1/2+ (figure 32D,D’‐E,E’). Les résultats, là aussi exprimés sous la forme du ratio CE/CNE, indiquent que la population post‐mitotique LIM1/2+ est elle aussi réduite (0,86 + 0,13 dans les embryons siARN‐CDC25B contre 1,015 + 0,14 dans les embryons contrôles) (figure 32F). L’ensemble de ces données montre que CDC25B joue un rôle dans la production des populations neuronales en général. Cependant, les phénotypes associés à la population LIM1/2+ montrent moins de variations que ceux observés pour les motoneurones. Qui plus est, l’électroporation est réalisée au stade E2 et analysée 48h après c’est à dire au stade E4‐
E4.5, soit pendant la période qui correspond au pic de production des motoneurones. Ainsi, le fait que le plus fort phénotype soit associé aux populations motoneuronales suggère que la fonction de CDC25B soit particulièrement importante au moment où la production neuronale est massive. 109 109 A
A’
B
B’
C. Olig2+ CE/CNE
Figure 33. La délétion de CDC25B augmente le nombre de progéniteurs des motoneurones.
Analyse de la quantité de progéniteurs de motoneurones par immunodétection d’Olig2 48h après
électroporation d’un vecteur contrôle (B,B’) ou codant pour siARN‐CDC25B (A,A’). La quantification est
exprimée comme le ratio entre le nombre de progéniteurs côté électroporé par rapport au côté non électroporé. 110 Résultats III.2.05.LES PROGÉNITEURS DES MOTONEURONES SONT ANORMALEMENT MAINTENUS DANS LA ZONE VENTRICULAIRE Les résultats indiquent que réduire CDC25B est délétère pour la production neuronale. Nous avons observé que réduire CDC25B s’accompagne aussi d’une augmentation de la proportion de cellules en phase S. Deux hypothèses permettent d’intégrer ces résultats : dans la première hypothèse, l’augmentation de la proportion de cellules en phases S traduirait un ralentissement global de la progression dans le cycle qui interfèrerait avec l’expansion des populations progénitrices et résulterait en la diminution du nombre de progéniteurs. Dans le second cas, l’augmentation des cellules en phases S serait due au maintien inapproprié dans le cycle cellulaire des progéniteurs destinés à sortir du cycle cellulaire et se traduirait par une augmentation des domaines de progéniteurs. Dans les deux cas, la population de neurones post‐mitotiques serait réduite. Afin de discriminer entre ces deux hypothèses, nous avons donc analysé la taille des populations progénitrices et en particulier la population progénitrice des motoneurones (figure 33). Nous avons quantifié le nombre de cellules Olig2+ représentant les progéniteurs des motoneurones du côté électroporé et non électroporé dans le contexte d’une forte diminution du nombre de motoneurones et calculé le ratio CE/CNE (figure 33C). De façon remarquable, dans les embryons électroporés avec le siARN‐CDC25B la taille du domaine des progéniteurs Olig2+ n’est pas réduite et au contraire légèrement mais significativement augmentée (1,18 + 0,13 versus 0,95 + 0,09 pour les embryons contrôles). Ces données indiquent donc que la réduction des neurones n’est pas une conséquence d’une déplétion des populations progénitrices mais au contraire d’une accumulation anormale de progéniteurs. La perte de CDC25B est donc défavorable à la production neuronale. Il serait tout à fait vraisemblable d’envisager que la réduction de CDC25B affecte en particulier les populations dites neurogéniques cʹest‐à‐dire à l’origine de la genèse des neurones par opposition aux populations dites prolifératives dont la fonction est de maintenir une fraction de progéniteurs indifférenciés en prolifération. 111 111 48H PE
B
B’
B’’
C
D
C’
D’
72H PE
GFP
E
Cdc25B
F
LIM1/2
G
*
*
Figure 34. La délétion de CDC25B entraine un retard dans la production des
populations tardives de motoneurones. Analyse des populations tardives de motoneurones par détectiond’Islet1/2 et LIM1/2 48h (A‐D’) et 72h
(E‐G) après électroporation des siARN‐CDC25B. Hybridation in situ montrant le niveau de CDC25B
48h ou 72h après électroporation des siARN‐CDC25B (A,F). Au centre, représentation schématique issue de la revue de Maden W. (Maden, 2006) des sous‐types
de motoneurones : les colonnes médianes (MMC), les colonnes latérales médianes (LMCm) et les
colonnes latérales latérales (LMCl) qui sont celles qui sont produites en dernier. On peut noter qu’à
48h les motoneurones Islet1/2+/LIM1/2+ destinés à former les LMCl sont déjà présents côté contrôle
mais encore absents côté électroporé avec le siARN‐CDC25B (C‐D’). A 72h les LMCl sont clairement
présentes côté électroporé mais réduites (E‐G). 112 Résultats III.2.06.LES POPULATIONS TARDIVES DE MOTONEURONES SONT PRODUITES AVEC DU RETARD ET EN NOMBRE MOINDRE Aux niveaux brachial et lombaire de la moelle épinière, les cornes ventrales de la moelle épinière contiennent des populations de motoneurones bien particulières, les colonnes latérales de motoneurones (LMC) qui assurent l’innervation des muscles des membres. Ces populations LMC sont subdivisées en deux groupes, les LMC médianes et les LMC latérales. Les LMC latérales sont générées plus tardivement que les LMC médianes et se localisent à l’extrémité latérale des cornes ventrales de la moelle épinière (figure 34 schéma) (Maden, 2006). Les LMC latérales peuvent être identifiées au sein de la population des motoneurones car elles co‐expriment Islet1/2 et LIM1/2. L’analyse du marquage LIM1/2 48h après électroporation au niveau des cornes ventrales brachiales de motoneurones indique qu’au moment où ces populations sont présentes du côté non électroporé elles n’ont pas encore été produites du côté électroporé (figure 34B‐C) avec le siARN‐CDC25B (figure 34D). Afin de savoir si l’émergence des LMC latérales était totalement inhibée par la perte de CDC25B je me suis placée à 72h après électroporation et j’ai réalisé un marquage LIM1/2 (figure 34E‐G). J’ai observé des cellules LIM1/2+ localisées en position latérale indiquant qu’aux stades plus tardifs les LMC latérales sont générées (figure 34G). Cependant à 72h après électroporation comme illustré figure 34F l’expression de CDC25B est partiellement restaurée sans doute à cause de la dilution du vecteur codant pour le siARN‐CDC25B au cours des divisions cellulaires successives. L’émergence des populations tardives de motoneurones pourrait alors être liée à la présence de CDC25B. Ces résultats confirment que la perte de CDC25B a pour conséquence de diminuer d’une part la quantité de neurones générés, et d’autre part que le processus général de différenciation est ralenti, ce qui est en accord avec le maintien anormal de populations progénitrices dans la zone ventriculaire. En conclusion, nos données montrent que l’expression de CDC25B est corrélée aux phases neurogéniques, et que cette phosphatase est requise pour le bon déroulement de la neurogenèse puisqu’interférer avec sa fonction entraine une diminution du nombre de neurones produits et ralentit le processus de différenciation neuronale. 113 113 114 DISCUSSION 116 Discussion I. CDC25B, UNE NOUVELLE CIBLE DIRECTE DE LA SIGNALISATION SHH/GLI ? La régulation de l’expression génique est essentielle pour le développement embryonnaire. La transcription d’un gène est initiée par les séquences promotrices et va être modulée par plusieurs séquences régulatrices spécialisées qui vont diriger l’expression du gène dans plusieurs types cellulaires pendant le développement. L’utilisation de ses séquences cis‐régulatrices permet d’accéder à un niveau de complexité supplémentaire nécessaire pour la régulation de manière spécifique des nombreux et divers processus qui sous‐tendent la formation d’un organisme pluricellulaire.
Les phosphatases CDC25 sont exprimées dans de nombreux tissus au cours du développement et chez l’adulte. Dans le tube neural aviaire et murin nous avons observé que les gènes CDC25 étaient différentiellement exprimés. Dans ce contexte nous avons montré que l’expression de CDC25B était régulée par la voie de signalisation Shh/GLI et que cette régulation était conservée chez la souris (Benazeraf et al., 2006). Nous avons étudié l’hypothèse d’une régulation transcriptionnelle directe et identifié in silico l’intron1 du gène murin comme région régulatrice candidate car il contient des sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription GLI qui sont conservés chez le rat. Cette conservation entre souris et rat peut sembler parfaitement logique compte tenu de la proximité phylogénétique de ces deux organismes. Mais au contraire de ce que l’on aurait pu penser, parmi les nombreux sites GLI putatifs identifiés dans chacun des loci de CDC25B de souris et de rat seuls les deux identifiés dans l’intron1 sont conservés en position et en séquence. L’analyse de la réponse à GLI de cette région régulatrice par électroporation in ovo dans l’embryon de poulet suggère que cette région contienne des éléments cis‐régulateurs suffisants pour répondre à GLI. Le bémol de ces expériences a été le niveau non négligeable d’expression du gène rapporteur obtenu avec le vecteur contrôle ne comportant que le promoteur minimum. De nouveaux outils vectoriels permettant de pallier à ce problème ont été récemment élaborés chez le poulet et sont actuellement utilisés dans l’équipe (Uchikawa et al., 2004). Des analyses quantitatives (mesure de la quantité d’un rapporteur luciférase) après électroporation d’un vecteur contrôle ou d’un vecteur portant l’intron1 sont également en cours. L’ensemble de ces expériences devra permettre de valider la présence d’un élément de réponse à la voie Shh/GLI dans l’intron1 et sera complétée par la caractérisation de cet élément. Les nombreuses données biologiques concernant le contrôle de la prolifération par les signalisations extracellulaires ont établi que seules les cellules en phases G0/G1 du cycle 117 117 cellulaire étaient sensibles aux mitogènes. Notre étude suggère que Shh puisse directement contrôler la prolifération en régulant des acteurs impliqués dans les phases S, G2 et M du cycle cellulaire. L’équipe d’Andrew McMahon a récemment mis en évidence la présence de Shh dans le lumen du tube neural de souris, associé au corps basal des cils des cellules neuroépithéliales (Chamberlain et al., 2008). Qui plus est, nous avons observé que l’expression de CDC25B au stade E2.5 apparaissait le long du lumen en corrélation avec la progression ventro‐dorsale de la neurogenèse. On pourrait donc proposer que dans le tube neural de poulet Shh diffusant à partir de la plaque du plancher et de la chorde soit aussi concentré aux cils des cellules neuroépithéliales et active localement l’expression de CDC25B. Étant donné que toutes les cellules progénitrices contactent la surface apicale du neuroépithélium, il serait intéressant d’établir si toutes reçoivent cette fraction de Shh. D’autres familles de protéines du cycle cellulaire présentent au cours du développement des domaines d’expression et des régulations spécifiques. Par exemple notre équipe a montré que, dans l’ébauche de moelle épinière, Cycline D1 et D2 étaient différentiellement exprimées et régulées respectivement par les voies de signalisation du FGF et de Shh (Lobjois et al., 2004). Les CKIs p27kip1, p57kip2 et p21Cip1 sont aussi distinctement sollicitées par les différents groupes de progéniteurs du tube neural (Gui et al., 2007). Ainsi, ces données indiquent que la complexité du développement embryonnaire nécessite une régulation temporelle et spatiale des acteurs du cycle cellulaire révélant de nouveaux mécanismes de régulation non identifiés en lignées cellulaires. 118 Discussion II. FONCTION DÉVELOPPEMENTALE DE CDC25B DANS LA NEUROGENÈSE SPINALE II.1.CARACTÉRISATION DES CDC25 AVIAIRES ET RÔLE DE CDC25B DANS LA PROLIFÉRATION DES CELLULES PROGÉNITRICES Nous avons cloné la séquence codant pour CDC25A et CDC25B de poulet. Les tests classiques de complémentation chez la levure S. pombe cdc25‐22 nous ont permis de valider ces séquences et d’en conclure que l’activité catalytique de CDC25A et CDC25B aviaires est conservée. Cependant, l’inhibition de CDC25B par interférence à l’ARN n’a pas d’effet significatif sur l’index mitotique et on observe des cellules en division dans des régions qui n’expriment pas CDC25B suggérant qu’il soit dispensable pour l’accomplissement de la mitose. De façon étonnante, l’index de phase S des cellules transfectées avec le siARN‐
CDC25B est lui significativement augmenté. Dans le contexte d’une population hétérogène en vertu du cycle cellulaire (cellules cyclantes ou en G0), un index de phase S plus élevé pourrait être interprété comme une augmentation de la population proliférante. Cependant comme nous venons de le voir cette augmentation de l’index de phase S n’est pas associée à une augmentation de l’index mitotique. Une augmentation de la population en S sans augmentation de la population en mitose est plus en faveur d’un effet du siARN‐CDC25B sur la cinétique du cycle. En lignées cellulaires, l’utilisation de siARN dirigés contre CDC25B n’inhibe pas non plus la mitose en 24h mais la ralentit de même que la progression en phase G2 (Lindqvist et al., 2005). Ainsi, nous proposons que l’inhibition de CDC25B dans le tube neural ralentisse le cycle cellulaire en partie au niveau des phases S et G2. Le processus de réplication de l’ADN fait intervenir un réseau complexe de protéines telles que celles formant le complexe de pré‐réplication ou les ADN polymérases. Beaucoup de ces protéines telles que les membres de la famille Mcm (Mini‐Chromosome Maintenance) sont les cibles des complexes CDK2/Cycline E et CDK2/Cycline A qui vont permettre leur activation ou promouvoir leur liaison avec les autres protéines du complexe de réplication. L’activité de CDC25B a été montrée comme capable de déphosphoryler et activer les complexes CDK2/Cycline A et CDK2/Cycline E en culture cellulaire. Dans le contexte des cellules neuro‐
épithéliales, CDC25B pourrait donc permettre l’activation des complexes CDK/Cycline de phase S et en particulier de CDK2/Cycline A qui est majoritairement actif en phase S et présent au niveau des fourches de réplication où il active entre autres les ADN polymérases α et δ, et participe aussi à l’élongation. Au cours de l’interphase G2, CDC25B a été observé 119 119 aux centrosomes où il joue un rôle dans le cycle du centrosome. Son inhibition pourrait donc avoir un effet inhibiteur sur la duplication des centrosomes et ainsi ralentir la progression en G2. Un rôle de CDC25B dans la progression de la phase G2 est en accord avec les expériences d’estimation de la longueur de la phase G2 que nous avons initié au laboratoire et qui vont dans le sens d’une phase G2 plus courte dans le domaine de forte expression de CDC25B (domaine des progéniteurs des motoneurones) comparé au domaine dorsal où CDC25B n’est pas présent. Afin de valider ce modèle, il sera nécessaire d’établir la longueur de la phase G2 (au moins) dans les cellules transfectées avec le siARN‐CDC25B et d’analyser en détail la séquence mitotique. Dans l’embryon de C.elegans au stade 2 cellules CDC25B et PLK1 sont enrichies respectivement dans le noyau et le cytoplasme de la cellule AB comparé à la cellule P1 (Rivers et al., 2008). De façon intéressante, la cellule AB se divise avant la cellule P1 et la déplétion de CDC25.1 par siARN aboutit au ralentissement de la progression dans le cycle cellulaire des deux cellules et dans quelques cas à leur synchronisation (Rivers et al., 2008). Dans la rétine de l’amphibien X. laevis des expériences modulant l’activité de Shh indiquent que Shh modifie les paramètres du cycle cellulaire (Locker et al., 2006). La surexpression de Shh accélère les phases G1 et G2 du cycle cellulaire sans affecter la longueur des phases S et M, et son inhibition pharmacologique par la cyclopamine a pour conséquence le ralentissement des phases G1 et G2. Ces modifications de la cinétique du cycle sont associées à la modulation de plusieurs acteurs positifs du cycle cellulaire de phase G1, Cycline D1, et de phase G2 et M, Cycline A2, Cycline B1 et CDC25C. Dans le tube neural aviaire nous avons montré que CDC25B et Cycline D1 sont des cibles de la voie Shh (Benazeraf et al., 2006; Lobjois et al., 2004 ). La surexpression de Cycline D1 augmente la proportion de cellules en prolifération (Lobjois et al., 2004) et la délétion de CDC25B semble ralentir la progression dans le cycle cellulaire. Ainsi l’ensemble de ces données permet de proposer que Shh module les paramètres du cycle via l’utilisation de CDC25B d’une part, et Cycline D1 d’autre part et ainsi permet aux cellules neuroépithéliales de cycler rapidement. Il serait intéressant d’analyser si l’inhibition de CDC25B et de Cycline D1 prévient l’effet mitogène de Shh dans le contexte du tube neural aviaire. Dans le cortex embryonnaire murin, il a été rapporté que le ralentissement du cycle cellulaire avec un inhibiteur pharmacologique de CDK1 a pour conséquence l’augmentation de l’expression de Tis21, marqueur de la population neurogénique associée à une neurogenèse prématurée (Calegari & Huttner, 2003). Les auteurs montrent que seule la phase 120 Discussion G1 du cycle cellulaire est affectée. Dans le cortex il semble donc que la neurogenèse soit associée à un ralentissement du cycle cellulaire en particulier un allongement de la durée de la phase G1 alors que notre hypothèse actuelle est plutôt en faveur d’un cycle plus rapide au moment de la production neuronale dans la moelle épinière. Afin de savoir si la différence phénotypique est due à une différence dans les mécanismes qui sous tendent la production neuronale dans le cortex versus le tube neural, il sera nécessaire de définir la longueur totale du cycle et la longueur de la phase G1 dans le tube neural. II.2.LA PRODUCTION NEURONALE DIMINUE SUITE À LA DÉLÉTION DE CDC25B Nous avons observé que la délétion de CDC25B entraine une diminution significative du nombre de neurones produits 48h après électroporation. Dans le neurectoderme de l’embryon de X. laevis les progéniteurs neuraux prolifèrent activement grâce entres autres à FoxM1 avant de sortir du cycle cellulaire et se différencier (Ueno et al., 2008). En lignées cellulaires, FoxM1 active la transcription de gènes tels que Cycline B et CDC25B et ainsi active la progression dans le cycle cellulaire. Les auteurs montrent que dans le neurectoderme de xénope la division cellulaire FoxM1‐dépendante est requise pour la différenciation neuronale. Les défauts de différenciation suite à la délétion de FoxM1 sont restaurés par l’expression de CDC25B (Ueno et al., 2008). Dans la rétine de l’amphibien X. laevis les cellules cyclant rapidement suite à la surexpression de Shh (cf discussion II1) sortent aussi plus vite du cycle cellulaire pour se différencier (Locker et al., 2006). Les cellules cyclant lentement suite à l’inhibition de Shh montrent un délai de sortie du cycle cellulaire. Le modèle proposé est que Shh rend la prolifération permissive pour la différenciation neuronale. Ainsi nos observations pourraient tout à fait refléter la mise en jeu de CDC25B dans la mise en place d’une prolifération neurogénique. En accord avec cette hypothèse, nous avons observé qu’interférer avec CDC25B est délétère à la production des neurones. Qui plus est nous observons que les populations tardives de motoneurones sont produites en retard lorsque CDC25B est inhibé par rapport à la situation sauvage. Ceci est en accord avec le délai de sortie du cycle cellulaire observé dans la rétine de Xénope lorsque Shh est inhibé (Locker et al., 2006). 121 121 II.3.LES PROGÉNITEURS DES MOTONEURONES SONT ANORMALEMENT MAINTENUS La diminution de la quantité de neurones produits suite à la délétion de CDC25B pourrait être due à un défaut dans l’expansion des populations progénitrices destinées à se différencier rapidement. D’après le modèle proposé par l’équipe de Muriel Perron dans la rétine de xénope (Locker et al., 2006) le ralentissement de la progression dans le cycle cellulaire a pour conséquence la diminution des populations progénitrices. Nous avons examiné la taille des populations progénitrices des motoneurones, car nous savons que CDC25B y est fortement exprimé et que la délétion de CDC25B diminue efficacement la production des motoneurones. De façon remarquable nous observons l’accumulation anormale de progéniteurs Olig2+ suite à la délétion de CDC25B. Une hypothèse serait que ces cellules progéniteurs soient maintenues dans le cycle cellulaire. Cependant, dans le tube neural, il a été montré que maintenir les cellules dans le cycle cellulaire n’empêche pas la différenciation : les cellules maintenues dans le cycle se différencient ce qui résulte en un phénotype de divisions ectopiques de « pseudo‐neurones » dans la zone de différenciation (Gui et al., 2007; Lobjois et al., 2004). Nous n’observons jamais de divisions ectopiques dans la zone de différenciation dans les embryons électroporés avec le siARN‐CDC25B même 72h après électroporation. Il semble donc que l’augmentation de la taille du domaine des progéniteurs Olig2+ ne soit pas attribuable au maintien inapproprié de ces cellules dans le cycle cellulaire. II.4.UN RÔLE INATTENDU DE CDC25B DANS LES DIVISIONS NEUROGÉNIQUES ? Une hypothèse pour expliquer ces différentes observations serait que CDC25B est particulièrement important pour assurer le déroulement correct des divisions neurogéniques. Dans la moelle épinière embryonnaire trois types de division cellulaires sont observés de façon concomitante (Morin et al., 2007; Wilcock et al., 2007). Les divisions symétriques prolifératives (dites PP) génèrent deux cellules progénitrices qui continuent à cycler. Ce type de division est crucial pour l’expansion et le maintien des pools de progéniteurs tout au long de la neurogenèse. Altérer ce type de division en interférant par exemple avec l’intégrité des jonctions d’adhérence, structures cruciales pour le maintien de la polarité apico‐basale, résulte en la déplétion précoce des populations progénitrices et par voie de conséquence en la réduction drastique de la taille finale des tissus neuraux (Wodarz & Huttner, 2003). Un autre type de division permet le maintien des populations 122 Discussion progénitrices : les divisions asymétriques neurogéniques. Ce type de division aboutit à la production d’une cellule fille qui continue à cycler alors que l’autre cellule fille sort du cycle cellulaire et se différencie. Ce mode de division repose sur la distribution asymétrique de déterminants intracellulaires importants pour influencer la destinée des cellules filles (Wodarz & Huttner, 2003). Par exemple, la protéine Numb est asymétriquement localisée au cours de ce type de division et est héritée par la cellule fille destinée à sortir du cycle cellulaire. Numb dans ce contexte inhibe la signalisation Notch (Johnson, 2003; Wakamatsu et al., 1999; Wakamatsu et al., 2007). Un autre exemple vient de l’héritage asymétrique de l’ARNm et de la protéine MNB/DYRK1A (Minibrain/Dual tyrosine Regulated Kinase) à la cellule destinée à différencier (Hammerle et al., 2002). Les mutants murins MNB‐/‐ présentent une neurogenèse réduite (Wodarz & Huttner, 2003). Enfin, le dernier type de division mis en jeu au cours de la neurogenèse est la division symétrique neurogénique qui aboutit à la production de deux cellules différenciées. J’ai imaginé plusieurs scénarios qui pourraient résulter en un phénotype proche de celui que nous observons après délétion de CDC25B cʹest‐à‐dire une augmentation des progéniteurs et une diminution des neurones. J’ai établi une simulation sur deux cycles cellulaires en tenant compte de la proportion respective de chacune des divisions dans le tube neural aviaire quantifiée par Xavier Morin soit 77% de PP, 17% de PN et 6% de NN (Morin et al., 2007). En situation normale, une population de 100 cellules génèrerait sur deux cycles cellulaires 291 progéniteurs et 80 neurones. Un scénario possible est que suite à la délétion de CDC25B les divisions NN sont défectueuses et transformées en PN : dans ce cas, 313 progéniteurs et 64 neurones seraient générés. Soit un ratio [normal/délété] de 1,07 pour les progéniteurs et 0,8 pour les neurones, des chiffres très proches de ceux que nous obtenons in vivo (1,13 et 0,84 respectivement). Les scénarios où les PN seraient totalement absentes ne sont pas du tout en accord avec nos données car résultent en une dramatique diminution du nombre de neurones. De même si les PN étaient transformées en NN cela aboutirait en une diminution des progéniteurs et une augmentation des neurones. Un dernier scénario très envisageable est un ralentissement des divisions PN. Cependant, les simulations ont été réalisées en considérant que 100% des cellules sont transgéniques. Au cours de ma soutenance, X. Morin m’a suggérée de considérer que seulement 40% des cellules sont transgéniques, et alors dans ce cas, l’hypothèse que les PN ne se fassent plus est tout à fait possible. 123 123 Chez la Drosophile, la kinase mitotique Cdc2, homologue de CDK1 des Vertébrés, est requise pour la division asymétrique des progéniteurs neuraux (neuroblastes) (Prokopenko et al., 2005; Tio et al., 2001). En effet, l’atténuation de la fonction de cdc2 (sans bloquer la mitose) rend les divisions asymétriques défectueuses dû à l’impossibilité à maintenir la localisation asymétrique des déterminants apicaux pendant la mitose. Dans notre contexte, l’activité de CDC25B connue comme très affine pour CDK1/Cycline B pourrait générer un fort niveau d’activité de CDK1/Cycline B au cours des divisions neurogéniques, qui permettrait de stabiliser la localisation de déterminants influant sur la destinée cellulaire. Nos collaborateurs ont mis en évidence que CDC25B localise aux centrosomes de l’interphase à la mitose où son activité est entre autres positivement régulée par la kinase Aurora‐A. Il intervient localement dans la duplication des centrosomes et la nucléation des microtubules pendant l’interphase (Boutros et al., 2007a; Dutertre et al., 2004). De plus, sa localisation, et celle d’autres acteurs du cycle tel que CDK1, est enrichie à un des centrosomes de la phase S à la phase G2 (Boutros et al., 2008). Il semble vraisemblable d’imaginer que l’activité asymétrique de CDC25B aux centrosomes pendant la phase G2 puisse poser les bases d’une asymétrie – d’activité CDK1/Cycline B par exemple‐ importante pour la réalisation de la division asymétrique. Qui plus est, la récente démonstration qu’Aurora‐A participe aux mécanismes de localisation de Numb au cours de la division asymétrique chez la Drosophile renforce cette idée (Wirtz‐Peitz et al., 2008). Dans le tube neural spinal, il a récemment été montré que l’accomplissement des divisions neurogéniques (symétriques et asymétriques) n’implique pas une orientation particulière du fuseau mitotique, comme cela avait longtemps été postulé (Morin et al., 2007). Seules les divisions prolifératives symétriques nécessitent un contrôle serré du plan de clivage. Dans ces conditions, d’autres mécanismes doivent être mis en jeu pour générer l’asymétrie. L’émergence du centrosome en tant que centre de contrôle des divers processus cellulaires et le rôle central que joue CDC25B dans les évènements de la mitose renforcent l’hypothèse que les mécanismes à l’origine de l’asymétrie puissent dépendre de l’activité de CDC25B aux centrosomes. II.5.FONCTION DE CDC25B SUR LA SORTIE DU CYCLE CELLULAIRE ET LES FACTEURS NEUROGÉNIQUES Dans le cervelet, il a été mis en évidence que la phosphorylation première de N‐myc par le complexe CDK1/Cycline B1 est nécessaire pour que N‐myc soit secondairement 124 Discussion phosphorylé par GSK3‐β : dans cet état la protéine N‐myc est rapidement dégradée par le protéasome. La dégradation de N‐myc au cours de la division terminale est requise pour la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux du cervelet et leur conséquente différenciation (Knoepfler & Kenney, 2006; Sjostrom et al., 2005). N‐myc est exprimé dans le tube neural de poulet (Sawai et al., 1990). On pourrait donc envisager un mécanisme similaire de régulation de la sortie du cycle cellulaire dépendante de la dégradation de N‐
myc. La délétion de CDC25B par siARN diminuerait l’activité de CDK1/Cycline B requise pour la phosphorylation de N‐myc à la division terminale. Les progéniteurs neuraux destinés à différencier mettraient plus de temps à s’échapper du cycle cellulaire. Pour examiner cette hypothèse il faudra tout d’abord vérifier que N‐myc est présent dans des domaines où CDC25B est exprimé et par la suite analyser la présence et l’état de phosphorylation de la protéine suite à la délétion de CDC25B. Comme décrit dans l’introduction, le proneural Neurogénine 2 joue un rôle majeur dans la différenciation neuronale. Deux observations en font une cible candidate de CDC25B. Tout d’abord, l’expression de Ngn2 dépend de la signalisation de l’acide rétinoique (Ribes et al., 2008). Or l’une des seules fonctions connue de CDC25B indépendante de son rôle dans l’activation des complexes CDK/Cycline au cours du cycle cellulaire, est sa fonction en tant que co‐activateur des récepteurs aux stéroides (Chua et al., 2004). Ainsi on pourrait proposer que CDC25B participe à l’amplification du niveau de transcription de Ngn2 en augmentant l’activité transcriptionnelle des récepteurs à l’acide rétinoique RAR/RXR. Enfin, il a été montré que l’état de phosphorylation de Ngn2 régule sa capacité à induire la différenciation des motoneurones (Ma et al., 2008). CDC25B pourrait soit directement soit via les CDK moduler cet état de phosphorylation et ainsi rendre Ngn2 plus actif. 125 125 126 CONCLUSION 128 Conclusion Mes travaux se sont attachés à comprendre la signification de l’activation de CDC25B par la voie de signalisation Shh/GLI au cours de la formation de la moelle épinière, et me permettent de soulever plusieurs points de discussion. Nos résultats suggèrent que CDC25B puisse ne pas être indispensable, dans le contexte du développement de la moelle épinière, pour le contrôle de la prolifération à un niveau générique mais fonctionnerait plutôt dans la réalisation des processus aboutissant à la génération des neurones en temps et en nombre appropriés. Ainsi, nous avons proposé que CDC25B contrôle les divisions neurogéniques dont les divisions terminales. Il est intéressant de s’interroger sur la possibilité que ce rôle puisse aussi être requis dans d’autres types cellulaires où CDC25B est exprimé. Nous avons montré que CDC25B est exprimé et répond à Shh dans l’ébauche de membre. Pourrait‐il y être sollicité en partie pour la réalisation des divisions à l’origine de la génération des cellules osseuses ou de cartilage qui formeront les membres? Les nombreuses études sur les phosphatases CDC25 permettent de se rendre compte petit à petit de la complexité de leurs sollicitations et de mesurer l’importance de leur existence. En général, chaque étude s’attache et défend un rôle spécifique pour l’une ou l’autre des isoformes de CDC25. Ainsi, dans mon étude, je prône, d’après les expériences que j’ai réalisées, que CDC25B et non CDC25A est requise pour le bon déroulement des divisions neurogéniques. Or aucun défaut de locomotion par exemple n’a été rapporté chez les souris mutantes pour CDC25B. Le modèle murin soulève donc une question importante: pourquoi puisque chaque isoforme, tout au moins CDC25B et CDC25C, apparait si essentielle est‐elle en fait dispensable ? et donc pourquoi l’évolution a‐t‐elle sélectionné ces gènes si un seul est capable de récapituler l’activité des trois ? Les résultats récents obtenus en culture de cellules renforcent l’idée que la fonction de chaque isoforme de CDC25 ne lui est pas réellement spécifique mais générale : par exemple, la localisation centrosomale de CDC25B et son importance pour l’initiation de l’activation du complexe CDK1/Cycline B semblait être une de ses spécificités. Or, une étude réalisée en 2008 montre que CDC25C est aussi présent aux centrosomes, où il pourrait participer à l’initiation de la mitose. A l’heure actuelle, les études ont montré que seule CDC25B avait la capacité à faire sortir les cellules d’un point de contrôle. Est‐ce alors une réelle spécificité ? La complexité ne s’arrête pas aux trois gènes puisque chacun des pré‐ARNm est soumis à l’épissage alternatif et produit des variants d’épissage qui semblent eux aussi assurer une fonction bien spécifique. Comment expliquer cet autre degré de complexité ? 129 129 Une explication possible est que cette complexité a été mise en place pour minimiser les erreurs et maximiser la fidélité des processus cellulaires. Enfin, cette étude s’intègre dans un ensemble de projets visant à apporter de nouvelles connaissances aux mécanismes utilisés par la voie de signalisation de Shh/GLI pour contrôler la prolifération. Pour cela, nous nous sommes intéressés en particulier à CDC25B, dont nous avions montré que l’expression était affectée par Shh. Il apparait clairement aujourd’hui que quantité de voies de signalisation et de gènes mis en jeu tout au long du développement embryonnaire soient anormalement sollicitées au cours de la genèse de tumeurs. Shh et CDC25B sont de bons exemples de molécules du développement dérégulées dans un grand nombre de cancers, et ainsi représentent des cibles potentielles pour des approches thérapeutiques anti‐tumorales. La dissection des mécanismes moléculaires par lesquels ces protéines interviennent dans le contrôle de la prolifération en conditions physiologiques est particulièrement importante pour comprendre et appréhender leurs dérégulations en situations pathologiques. 130 BIBLIOGRAPHIE 132 Bibliographie AAKU-SARASTE, E., HELLWIG, A. & HUTTNER, W. B. (1996). Loss of occludin and functional tight
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143 143 144 ANNEXES 146 Annexes ANNEXE I 147 147 148 Annexes 149 149 150 Annexes 151 151 152 Annexes 153 153 154 Annexes 155 155 156 Annexes 157 157 158 Annexes 159 159 160 Annexes 161 161 162 Annexes 163 163 164 Annexes ANNEXE II 165 165 166 Annexes Journal section: Development/Plasticity/Repair THE PHOSPHATASE CDC25B IS REQUIRED TO SWITCH CYCLING NEURAL PROGENITORS TOWARDS NEURONAL DIFFERENTIATION Abbreviated title: CDC25B and neuronal differentiation Emilie PECO1,2,3,4, Virginie SABADO1,2,5, François MEDEVIELLE1,2, Bernard DUCOMMUN3,4, Fabienne PITUELLO1,2 Université de Toulouse ; CBD ; 118 route de Narbonne, F‐31062 Toulouse, France 1
CNRS ; CBD‐UMR5547 ; F‐31062 Toulouse, France
2 Université de Toulouse ; LBCMCP ; 118 route de Narbonne, F‐31062 Toulouse, France 3
CNRS ; LBCMCP‐UMR5088 ; F‐31062 Toulouse, France
4 Current address: Department of Craniofacial Development, Kingʹs College London Guyʹs Campus, 5
Guyʹs Tower Floor 27, London SE1 9RT, U.K Corresponding author: Fabienne PITUELLO, Université de Toulouse ; CBD and CNRS ; CBD‐
UMR5547 ; 118 route de Narbonne, F‐31062 Toulouse, France ; E‐mail address: [email protected], Fax: (33)5 61 55 65 07, Phone: (33)5 61 55 67 39 Number of figures: 4 Number of pages: 20 Number of words: Abstract (249); Introduction (500); Discussion (664)‐Total: 4499 Keywords: embryo, neurogenesis, proliferation, differentiation, CDC25 phosphatases, Sonic Hedgehog 167 167 Acknowledgements: We thank Dr. T Roztocil for the gift of NeuroM antibodies. Many thanks to S. Bel‐Vialar, A. Davy, C. Soula, F. Payre, J. Smith for helpful comments on the manuscript, F. Medevielle for excellent technical support in molecular biology, A. Le Ru and B. Ronsin for technical assistance in confocal microscopy on the Toulouse RIO imaging platform. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique, le Ministère de l’Education Nationale et de la Recherche and l’Association Française contre les Myopathies (AFM). EP is a recipient of AFM. 168 Annexes ABSTRACT Neural stem cells can either divide to self‐renew, thereby maintaining a pool of undifferentiated neural progenitors, or perform neurogenic divisions to differentiate into neurons. The molecular mechanisms that determine the decision between proliferative and neurogenic divisions are poorly understood, a correlation has been reported between the mode of division and certain features of the cell cycle, suggesting that specific regulators of the cycle may be recruited to coordinate proliferation and differentiation. Here we investigated the role of core positive cell cycle regulators, the CDC25 phosphatases, during embryonic neurogenesis. As a model, we chose the chicken developing spinal cord because of the knowledge we have of the molecular mechanisms governing proliferation of spinal progenitors. We found that only CDC25A is expressed in self‐renewing neural progenitors, suggesting that it is sufficient to drive proliferative divisions. CDC25B expression is initiated concomitantly with the onset of neuronal differentiation and progresses in correlation with the wave of neurogenesis. To determine the relevance of that correlation, we used a microRNA‐based vector to knock down CDC25B. Down‐regulating CDC25B leads to an increase in the pool of cycling neural progenitors but to a decrease in neuron production revealing that CDC25B plays a key role in the fate decision of a neural progenitor to become a neuron. CDC25B expression is initiated by the morphogen Shh and our findings reveal a novel molecular mechanism for promoting neuronal differentiation from specified neural progenitors. Such a scenario may not be exclusive to embryonic neurogenesis, but may also apply to adult neurogenesis. 169 169 INTRODUCTION A major challenge confronting the developing embryo is that of generating the constant numbers of distinct classes of neurons. This involves the tight coordination of proliferation, specification and differentiation during the course of neurogenesis. A pertinent model to dissect the cross‐talk that may exist between these programs is the developing spinal cord. The spinal cord develops from a caudal stem zone containing a pool of undifferentiated neural progenitors (Akai et al., 2005). Neural progenitors that leave the stem zone are found in the neural tube, a monolayered, pseudostratified neuroepithelium composed of proliferating cells. Spinal progenitors are there subjected to opposite gradients of secreted signals: Sonic Hedgehog (Shh) and BMP/Wnt, emanating respectively from ventral and dorsal sources. These signals not only act as morphogens, inducing different neuronal subtypes at a distance in a concentration‐dependent manner (Dessaud et al., 2008), but also promote proliferation and survival of neural progenitors (Cayuso et al., 2006; Ulloa et al., 2007b). In the stem zone, spinal progenitors only undergo proliferative symmetric divisions generating two progenitors (PP). Neurogenic divisions that can be either asymmetric giving rise to a progenitor and a neuron (PN) or terminal symmetric producing two neurons (NN) appear in the closing neural tube concomitantly with the onset of Shh activity (Hammerle & Tejedor, 2007; Morin et al., 2007; Wilcock et al., 2007). We previously reported that members of two families of cell cycle regulators, D‐type cyclins (cyclinDs) and CDC25 phosphatases, are differentially expressed in the stem zone and in the neural tube. Whereas cyclin D2 and CDC25A are already present in the stem zone, when time Shh signaling is turned on, it initiates expression of cyclin D1 and CDC25B, suggesting that thereby it adapts proliferation to neurogenesis (Benazeraf et al., 2006; Lobjois et al., 2004; Ulloa & Briscoe, 2007a). We 170 Annexes showed that D‐type cyclins, known to govern progression through G1, are sufficient to keep cells cycling but are unable to prevent their differentiation, indicating that they do not affect the decision of a neural progenitor to adopt a neuronal fate (Lobjois et al., 2008). In the present paper we investigated whether CDC25B, the second cell cycle regulator whose expression is initiated by Shh, may play such a role. In mammals, the CDC25 family contains three genes, CDC25A, CDC25B and CDC25C, but only CDC25A and CDC25B are found in the chicken genome. CDC25 phosphatases are positive regulators of the transitions between cell cycle phases, given that they activate cyclin‐dependent kinase (CDK) complexes (Boutros et al., 2007a). All three isoforms have been implicated in the control of the G1‐S and G2‐M transitions by regulating the activities of CDK1 and CDK2. Here, we provide evidence, first, that the combinatorial expression of CDC25A and CDC25B is always associated with neurogenesis during spinal cord development and, second, that down‐regulating CDC25B impedes neuron production by altering the conversion of progenitor cells to post‐mitotic neurons. These data indicate that this cell cycle regulator plays a key role in the decision of a neural progenitor to become a neuron. 171 171 MATERIALS and METHODS Embryos Fertile hensʹ eggs were incubated at 38°C in a humidified incubator to yield embryos of appropriate stages (Hamburger et al., 1992). DNA constructs and in ovo electroporation Targeted sequences were as follows: CDC25B: 5’‐
AAGATCATCACAGACAAGAAGT‐3’ and 5’‐AGGAGGATGACGGCTTCATGGA‐3’. Scramble: 5’‐
GCGGTTACGTGCGATAGGAGAA‐3’. ʺControl vectorʺ designates empty pGFPRNAiA derived from pRFPRNAiA (Das et al., 2006). In ovo electroporation experiments were performed as described (Lobjois et al., 2004) using 1.5‐ to 2‐day‐old chicken embryos, except that we first determined the lowest dose sufficient to down‐regulate CDC25B (0.8μg/μl) and used it in all experiments. In situ hybridization and immunohistochemistry Detection of transcripts and proteins were performed on 40‐μm vibratome sections, as previously described (Benazeraf et al., 2006; Lobjois et al., 2008) using the two more antibodies: rat anti‐BrdU (ABD Serotec, Oxford, UK) and anti‐p27Kip1 (BD Biosciences, Franklin lakes, NJ, USA). Cell proliferation and survival analyses Cell proliferation was evaluated by incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU, Sigma, St Louis, Missouri):10μl of a solution of BrdU 10mM was injected in the embryos which were harvested 30 min later and BrdU immunodetection was performed on vibratome sections (Lobjois et al., 2004). To quantify cells in the transgenic population, we co‐electroporated a pCS‐Histone2B‐mRFP vector (a gift from X. Morin). Cell death was analysed by TUNEL assay, using the “In situ Cell death Detection Kit TMR red” (Roche, Basel, Switzerland). Analysis and imaging of the data Forty‐μm sections were analyzed using an epifluorescent Nikon microscope or a SP2 Leica confocal microscope as described (Benazeraf et al., 2006; Lobjois et al., 2008). 172 Annexes RESULTS CDC25B expression correlates with neuron production in the developing spinal cord
In an attempt to define the role of CDC25B during neurogenesis, we performed a detailed analysis by in situ hybridization of the kinetics of its expression at milestones of spinal cord development and compared it to those of CDC25A. At E2.5, which corresponds to a peak period of motor neuron (MN) production in the ventral neural tube, CDC25B transcripts are expressed in a restricted domain located in the ventral‐
most region of the neural tube (Fig.1A). Faint staining is also observed along the lumen (Fig.1A). At this stage, intense proliferation occurs throughout the neural tube, as visualized using BrdU incorporation to detect cells in S phase and phospho‐histone‐3 (P‐H3) immunostaining to identify mitotic neural progenitors located along the lumen (Fig.1B). CDC25B is thus present in only a subset of proliferating neural progenitors. The domain of high CDC25B expression correlates with that containing the progenitors of motor neurons (pMN) expressing the bHLH transcription factor Olig2 (Fig.1A‐C). The intensive production of MN from pMN leads to the accumulation in the ventral horns of the spinal cord of this specific neuronal population, which expresses p27Kip1 and Islet1/2 (Fig.1D). Moreover, the presence of CDC25B transcripts along the lumen (Fig. 1A) accompanies the dorsal expansion of the bHLH transcription factor NeuroM, which transiently marks young post‐mitotic neurons (Fig. 1C). The domain of dorsal progenitors defined by Pax7 expression, which produces few, if any, neurons at E2.5, does not express CDC25B (Fig.1A,C). In sum, strong expression of CDC25B correlates with neuron production. To further examine the relationship between CDC25B expression and neuron production, we continued our analysis at two later stages of spinal cord development: E4.5, when neuron production is still ongoing ventrally and is progressing dorsally, and E7, when neurons are 173 173 massively produced dorsally, whilst neurogenesis has stopped in the ventral‐most domain of the neuroepithelium. At E4.5, CDC25B is present in the ventral half of the neural tube, but its expression domain now expands further dorsally in the ventricular zone (Fig.1F). Proliferation is still intense throughout the ventricular zone, including the most dorsal part, where CDC25B is not detected (Fig.1F‐G). The most notable evolution is the strong staining observed on the basal side of the ventricular zone (VZB), which extends toward the dorsal aspect of the neural tube, decreasing in intensity in its dorsal part (Fig.1F‐G), concomitant with the dorsal progression of NeuroM expression (Fig. 1H) and of neuron production (Fig. 1I). At E7, CDC25B is strongly expressed in dorsal neural progenitors expressing the proneural transcription factor Cash1 (Fig.1K‐M). This dorsal domain corresponds to a zone of intense proliferation (Fig.1K‐L) and neuron production (Fig.1N). Computer‐generated superimposition of images from serial sections revealed that CDC25B‐VZB and NeuroM domains overlap, suggesting that CDC25B expression persist transiently in young post‐
mitotic neurons (Fig.1N). CDC25B disappears from the ventral‐most neural progenitors (Fig.1M‐N) just as the Olig2+ domain switches to generating oligodendrocytes (Rowitch, 2004). Together, these observations underline the excellent correlation between CDC25B expression and neurogenic domains. By examining CDC25A expression at all stages of development, we observed, at E2.5 and E4.5, high levels of transcripts throughout ventricular zone, which contains numerous proliferating neural progenitors (Fig.1G, J) whereas, at E7, they were mainly present in the dorsal third of the neural tube, which corresponds to a hot spot of proliferation (Fig.1L, O). At E7, under this dorsal domain of high expression, CDC25A was barely detectable and proliferation was lower. Together these data show that CDC25A is predominantly associated 174 Annexes with proliferation and the combinatorial expression of CDC25A and CDC25B with neurogenesis. CDC25B down-regulation results in an increase in the pool of proliferating neural
progenitors
To investigate the function of CDC25B in neurogenesis, we performed gain‐of‐function experiments by misexpressing CDC25B in the chicken neural tube. This strategy was unsuccessful, because, as previously observed in cell lines, misexpressing CDC25B drives cells incorrectly through mitosis, leading to increased cell death (Karlsson et al., 1999). Consequently, we turned to knock‐down experiments, using in ovo electroporation of a microRNA (miRNA)‐ based vector (Das et al., 2006). CDC25 proteins contain a regulatory domain and a catalytic domain; as the regulatory regions are poorly conserved between the distinct members of the CDC25 family, the sequences targeted by the miRNAs were specifically chosen in the regulatory domain of CDC25B to limit potential cross‐reactivity with CDC25A. Four miRNAs directed against CDC25B were designed and cloned into a modified version (RFP was replaced with GFP) of the vector previously described (Das et al., 2006). Two of them efficiently reduced CDC25B messenger RNA levels, one being particularly effective (Fig.2B‐B’). After checking that these CDC25B‐miRNAs did not alter CDC25A expression (Fig.2C) and that a scramble‐CDC25B‐miRNA did not modify CDC25B expression (Fig.2A‐A’), we used mainly the most efficient CDC25B‐miRNA to knock down CDC25B in neural progenitor cells. We analyzed the consequences of CDC25B down‐regulation on cell proliferation, using BrdU labeling experiments and P‐H3 immunostaining. Twenty‐four hours after electroporation (analyses made at E2.5‐E3), we observed that a large number of transgenic CDC25B‐miRNA‐ cells were BrdU+ (Fig.2E‐E’), indicating that down‐regulation of CDC25B does not severely 175 175 impede cell proliferation. Quantification of the proportion of BrdU+ transgenic cells in control versus CDC25B‐miRNA populations revealed that the number of BrdU+ cells was slightly, but significantly increased after CDC25B knock‐down (35.7%±5.2% SEM compared to 29.7±6.2% SEM in control; p<0.001, Student’s test; Fig.2F). The number of P‐H3+ cells was not significantly different in the control‐transfected population compared to the CDC25B‐
miRNA (Fig.2I: 5.2%±1.6% SEM versus 4.5% ±2% SEM; P=0.02). Moreover, we clearly identified numerous transgenic CDC25B‐miRNA cells undergoing mitosis (Fig. 2H‐H’), showing that decreasing CDC25B levels had no severe consequence on the completion of the cell cycle. The increase in the BrdU+ population could result from cells remaining longer in the neural progenitor state. To determine whether it was the case, we quantified the number of pMN (Olig2+ cells) following down‐regulation of CDC25B. We chose that particular population because it very strongly expresses CDC25B. We compared the numbers of Olig2+ cells on the electroporated (EP) and the contralateral, non‐electroporated (NEP) sides on a given section 48h after electroporation (analysed at E3.5‐E4; Fig.2J‐K’). We determined the EP/NEP ratio of Olig2+ cells (Fig.2L). As expected, the ratio was close to 1 after electroporation with scramble vector (0.95±0.09SEM). Remarkably, after CDC25B‐miRNA transfection, the ratio was significantly increased (1.18±0.13 SEM; P<0.001), suggesting that neural progenitors were inappropriately maintained in the progenitor state. CDC25B down-regulation impedes neuron production
Retaining cells in the neural progenitor state is likely to have an impact on cell cycle exit and neuronal differentiation. Therefore, we analyzed the consequence of CDC25B down‐
regulation on cell cycle exit by examining p27Kip1 staining 48h after electroporation of CDC25B‐miRNA. We observed that p27Kip1 staining was reduced on the side containing 176 Annexes CDC25B‐miRNA (Fig.3B‐B’). We looked for differentiated neurons using the pan‐neuronal marker TuJ1. TuJ1 immunostaining revealed that whereas a control‐miRNA had no effect (Fig.3A‐A’), the differentiating zone on the side electroporated with CDC25B‐miRNA was smaller than on the contralateral control side (Fig.3C‐C’), confirming the reduction in the post‐mitotic neuronal population. We clearly observed GFP+/p27Kip1+ cells and GFP+ neuritic processes growing from transgenic cells located in the mantle zone (Fig.3, arrowhead in C and C’), indicating that transgenic CDC25B‐miRNA‐cells were able to exit the cell cycle and differentiate. One possible explanation is that the reduction of the differentiating zone is due to cell death. However, analysis of cell death by a TUNEL assay did not reveal increased apoptosis in the transgenic population (data not shown). Together, these observations show that down‐regulating CDC25B resulted in a reduction of the differentiating zone indicating that neuronal production had been impaired. To further establish the role of CDC25B in neuron production, we analyzed the consequences of its knock‐down on differentiation of MN originating from the Olig2 domain. Differentiating MN can be identified using Islet1/2 and we detected GFP+ transgenic cells co‐
expressing Islet1/2 (yellow cells in Fig.3E), showing that they could differentiate into MN. We then determined the number of Islet1/2+ MN on the electroporated and contralateral control sides (EP/NEP) following electroporation of either control‐miRNA or CDC25B‐
miRNA (Fig.3D‐F). We found that down‐regulating CDC25B reduced significantly (P<0.001) the ratio of MN (0.84±0.12 SEM), whilst misexpressing a scramble‐miRNA had no effect (0.98±0.09 SEM) (Fig.3F). Furthermore, we observed a clear correlation between the efficiency of CDC25B down‐regulation visualized by in situ hybridization and the reduction of the number of MN quantified on serial sections: a strong reduction of CDC25B transcripts resulted in a ratio of 0.6 (“HR” in Fig.3F), compared to 0.9 when CDC25B was slightly 177 177 reduced (“LR” in Fig.3F). This corroborates the causal relationship between the two events. These data show that down‐regulating CDC25B affects MN production. The next question was whether production of other neuronal populations was also affected; we quantified the effect of CDC25B down‐regulation on Lim1/2‐expressing interneurons (Fig.3G‐I). Again we observed a significant reduction of the Lim1/2+ population in embryos electroporated with CDC25B‐miRNA compared to those electroporated with a control vector (0.86±0.13 SEM versus 1.015±0.14 SEM, p<0.001; Fig.3I). These results show that down‐regulating CDC25B impedes neuron production: the effect is generic and not limited to a specific neuronal population. To establish whether the reduction in the neuronal population 48h after knocking down CDC25B is due to a delayed neuronal production, we looked at the genesis of a subtype of spinal MN, those of the late‐born lateral motor column (LMC). LMC neurons are generated selectively at brachial and lumbar levels of the spinal cord and their axons innervate target muscles in the limb, lateral LMC (LMCL) neurons projecting to dorsally‐derived limb muscles. At brachial levels, prospective LMCL neurons extinguish Islet1/2 and initiate Lim1/2 expression from stage 21 (corresponding to E3.5) as they begin to migrate past earlier‐born neurons (Sockanathan & Jessell, 1998). Accordingly, we detected Lim1/2+ cells in the MN column at the brachial level of E4 embryos on the control side but not on the CDC25B‐
miRNA‐transfected side (Fig. 4A‐H). One day later (Fig.4I‐K), due to the transient action of the miRNA, we observed a partial rescue of CDC25B transcripts which is associated with the presence of LMCL cells albeit in lower number (arrowheads in Fig.4K). This observation reinforced our proposal that knocking down CDC25B at least delays neuron production. All together, these data show that CDC25B expression is required for timely and efficient neuron production. 178 Annexes DISCUSSION We show here that different combinations of CDC25 phosphatases, correlate well with the proliferative versus neurogenic populations. Domains that exclusively express CDC25A, such as the dorsal domain at E2.5 and also the stem zone at E1.5 (Benazeraf et al., 2006), contain proliferating cells but do not produce neurons. We propose that CDC25A is sufficient to drive division, at least in non‐neurogenic progenitors. Both CDC25A and CDC25B are present in domains of neurogenic progenitors. CDC25B expression is initiated by Shh in the ventral neural tube (Benazeraf et al., 2006); its dorsal progression may be controlled by Shh as well, whose effect on proliferation extends further dorsally than on specification (Cayuso et al., 2006; Ulloa et al., 2007b). Expression of CDC25B in the dorsal spinal cord at later stages is probably not controlled by Shh but rather by Wnt signalling, since it has been suggested that both signals may converge on a common set of mitogenic genes (Ulloa & Briscoe, 2007a). It is thus tempting to propose that morphogens that control cell specification (and consequently cell differentiation) need specific cell cycle regulators to coordinate these events with neurogenic proliferation. No developmental defects have been reported in CDC25B‐deficient mice, apart from the fact that homozygote females are sterile (Lincoln et al., 2002). However, embryonic fibroblasts isolated from these CDC25B‐null mice display an upregulation of CDC25A, suggesting that other proteins may compensate for CDC25B loss of function. Nevertheless, a recent study performed in early Xenopus embryos corroborates our data (Ueno et al., 2008). It was found that the transcription factor FoxM1 is essential for neuronal differentiation and this function involves CDC25B, one of its targets. We show here that knocking down CDC25B in the neural tube results in an increase in the number of progenitors associated with a decrease in the number of neurons, suggesting that 179 179 CDC25B is a positive regulator of the neurogenic program. Several scenarios compatible with our phenotype can be proposed. CDC25B may favor neurogenic divisions, either by acting at the transition from PP to PN or by being required for terminal NN divisions. In both cases, down regulating CDC25B will lead to abnormal accumulation of progenitors to the detriment of neurons. Another possibility is that down‐regulating CDC25B induces a lengthening of the duration of neurogenic divisions. It has been reported recently in C. elegans that differential regulation of CDC25.1 may account for differences in cell cycle length (Rivers et al., 2008). Moreover, in Xenopus retina Shh speeds up the cell cycle by reducing the length of G1 and G2 phases through activation, among others, of cyclinD1 and CDC25C, fits with this hypothesis (Locker et al., 2006). However, this is not consistent with the observation that, divisions generating neuron display longer cell cycle than those generating progenitors in the neural tube (Wilcock et al., 2007). It is unlikely that CDC25B acts simply by delaying cell cycle exit, which does not affect the timing of neuronal differentiation, but instead leads to neurons differentiating while still cycling and, consequently, to the presence of ectopic mitotic cells in the differentiating zone (Gui et al., 2007; Lobjois et al., 2008). We never observed such a phenotype after CDC25B knock down (data not shown). Finally, we cannot exclude that CDC25B phosphatase, directly or indirectly, via activation of one of its substrates, modulates the activity of proteins involved in neuronal differentiation. CDC25B has been shown to be a co‐activator of steroid receptors (Chua et al., 2004) and it is noteworthy that retinoic acid is a key player in inducing neuronal differentiation. In conclusion, we propose that, during the period when the morphogen Shh controls cell fate in the spinal cord, it up‐regulates the cell cycle regulator CDC25B, which permits neuronal differentiation, thus allowing specified neuronal precursors to differentiate (Fig.4L‐M). This scenario may not be exclusive to nervous system development, but may also apply to 180 Annexes numerous organs in which Shh controls both proliferation and differentiation; it could even be a general mechanism used by morphogens to coordinate specification, proliferation and differentiation. 181 181 References Akai J, Halley PA, Storey KG (2005) FGF‐dependent Notch signaling maintains the spinal cord stem zone. Genes Dev 19:2877‐2887. Benazeraf B, Chen Q, Peco E, Lobjois V, Medevielle F, Ducommun B, Pituello F (2006) Identification of an unexpected link between the Shh pathway and a G2/M regulator, the phosphatase CDC25B. Dev Biol 294:133‐147. Boutros R, Lobjois V, Ducommun B (2007) CDC25 phosphatases in cancer cells: key players? Good targets? Nat Rev Cancer 7:495‐507. Cayuso J, Ulloa F, Cox B, Briscoe J, Marti E (2006) The Sonic hedgehog pathway independently controls the patterning, proliferation and survival of neuroepithelial cells by regulating Gli activity. 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419. 182 Annexes Sockanathan S, Jessell TM (1998) Motor neuron‐derived retinoid signaling specifies the subtype identity of spinal motor neurons. Cell 94:503‐514. Ueno H, Nakajo N, Watanabe M, Isoda M, Sagata N (2008) FoxM1‐driven cell division is required for neuronal differentiation in early Xenopus embryos. Development 135:2023‐2030. Ulloa F, Briscoe J (2007) Morphogens and the control of cell proliferation and patterning in the spinal cord. Cell Cycle 6:2640‐2649. Ulloa F, Itasaki N, Briscoe J (2007) Inhibitory Gli3 activity negatively regulates Wnt/beta‐
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