Titre 200

Impact fonctionnel in vivo des hétéromères de récepteurs opioïdes mu et delta en conditions
physiopathologiques.
Contexte : Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines membranaires
intégrales aux rôles physiologiques clés. Plusieurs pathologies leur sont associées et ils
représentent la cible d’un tiers des médicaments commercialisés à ce jour. L’unité
fonctionnelle des RCPGs de classe A, auxquels appartiennent les récepteurs opioïdes, est le
monomère mais dans certains cas, deux récepteurs différents pourraient s’associer pour
former un hétéromère aux propriétés fonctionnelles modifiées. La formation d’hétéromères
est donc un mécanisme moléculaire qui pourrait être impliqué dans des pathologies telles que
asthme, inflammation ou hypertension. Dans le système nerveux, elle pourrait contribuer au
développement de dérèglements fonctionnels et de désordres psychiatriques. Les hétéromères
sont donc de nouvelles cibles thérapeutiques désignées.
Le système opioïde joue un rôle modulateur dans le comportement affectif, la
physiologie neuroendocrine et les fonctions autonomes. Les récepteurs mu sont aussi la cible
première de drogues telles la morphine et l’héroïne. La prise chronique de ces substances
induit tolérance et dépendance pour lesquelles une interaction fonctionnelle entre récepteurs
mu et delta a été postulée. Les résultats obtenus en système hétérologue indiquent que la coexpression des récepteurs mu et delta affecte l’affinité des ligands et la signalisation. La
formation d’hétéromères a été suggérée mais la démonstration in vivo de leur existence et
impact fonctionnel demeure un défi majeur.
Nous avons généré des souris knock in doubles fluorescentes co-exprimant des
récepteurs delta et mu fonctionnels, respectivement en fusion avec la protéine fluorescente
verte eGFP ou la protéine fluorescente rouge mcherry. Ces animaux génétiquement modifiés
permettent, pour la première fois, de visualiser directement les récepteurs endogènes avec
une résolution subcellulaire. Nous avons récemment établi la cartographie des récepteurs
dans le système nerveux et identifié les régions de co-localisation. Ces animaux représentent
donc un outil original et sans précédent pour aborder in vivo l’existence d’hétéromères en
testant le lien de causalité entre proximité physique et interactions fonctionnelles.
Projet : Le but de ce projet est d’établir si la co-expression in vivo des récepteurs mu et
delta aboutit à la formation d’hétéromères ayant un impact sur la physiologie cellulaire et le
comportement de l’animal. Il contribuera également à évaluer le potentiel de ces hétéromères
en tant que nouvelle cible thérapeutique.
L’utilisation de tissus et/ou de cultures neuronales primaires de souris knock in doubles
fluorescentes permettra (1) d’examiner la proximité physique in vivo au niveau spinal et
supraspinal. Nous aborderons ensuite, dans les neurones co-exprimant les deux récepteurs,
les modifications de signalisation et de trafic des récepteurs en réponse à une stimulation
pharmacologique ou physiologique. Nous établirons (2) l’impact de la co-expression sur
l’internalisation et le devenir intracellulaire des récepteurs, et (3) son influence sur la
signalisation par les protéines G et la voie dépendante des β-arrestines. (4) Nous
examinerons si un traitement chronique à la morphine modifie les propriétés de signalisation
et/ou de trafic, en particulier l’export à la surface de la cellule, lorsque les récepteurs sont
co-exprimés. (5) Nous examinerons au niveau comportemental l’impact fonctionnel de
l’activation préférentielle des récepteurs mu-delta dans le cadre de la prise de drogues
opiacées afin d’évaluer leur potentiel en tant que nouvelle cible thérapeutique (6)
Finalement, nous déterminerons comment ce rôle est modulé en condition de douleur
neuropathique.
Compétences souhaitées
L’étudiant(e) doit être motivé(e) par les neurosciences, doit avoir des connaissances en
biologie moléculaire/cellulaire et/ou en pharmacologie et être intéressé(e) par le
développement de modèles animaux et l’étude de la signalisation cellulaire et du trafic des
récepteurs couplés aux protéines G.
Compétences développées durant la thèse
L’étudiant(e) acquerra diverses techniques d’imagerie cellulaire en microscopie de
fluorescence. Il (elle) utilisera différents tests comportementaux et travaillera également ex
vivo (cultures primaires neuronales et tranches vivantes de cerveau). Il (elle) aura aussi la
possibilité de se familiariser avec la pharmacologie des récepteurs aux opioïdes. Il (elle)
bénéficiera d’un environnement scientifique et technologique de qualité qui lui permettra de
développer son potentiel de chercheur et ses capacités de communication.
Publications majeures de l’équipe relatives au sujet au cours des 3 dernières années
Snook L.A.S., Milligan G., Kieffer B. L. and Massotte D. (2008) « Co-expression of mu and
delta opioid receptors as receptor-G protein fusons enhances both mu and delta
signaling via distinct mechanisms. » Journal of Neurochemistry 105, 865-873
Yalcin I, Bohren Y, Waltisperger E, Sage-Ciocca D, Yin JC, Freund-Mercier MJ, Barrot M
(2011) A time-dependent history of mood disorders in a murine model of
neuropathic pain. Biol Psychiatry 70:946-953.
Erbs E., Faget L., Scherrer G., Matifas A., Filliol D., Vonesch J.-L., Koch M., Kessler P.,
Hentsch D., Birling M.-C., Koutsourakis M., Vasseur L., Veinante P., Kieffer B.L. and
Massotte D. (2014) « A mu-delta opioid receptor brain atlas reveals neuronal cooccurrence in subcortical networks.” Brain Structure and Function DOI:
10.1007/s00429-014-0717-9.
Massotte D. « In vivo opioid receptor heteromerization : where do we stand ? » (2014) Br. J.
Pharmacol doi: 10.1111/bph.12702
Functional impact of in vivo mu and delta opioid receptor heteromers under
physiopathological conditions.
Background: G protein-coupled receptors (GPCRs) are integral membrane proteins
that play key physiological roles. Several pathologies have been associated with receptor
functional abnormalities that represent the target of about one third of the drugs currently on
the market. Class A GPCRs, to which opioid receptors belong, are functional in a monomeric
form but, in some cases, two different receptor types can associate to give rise to heteromers
with altered functional properties. Heteromer formation is a possible molecular mechanism
involved in diseases such as asthma, inflammation or hypertension. In the nervous system, it
could contribute to the development of functional dysregulations and psychiatric disorders.
Heteromers are therefore designated targets for new therapeutic drugs.
The opioid system plays a modulatory role in affective behavior, neuroendocrine
physiology, and autonomic functions. Mu opioid receptors are also the primary target of
exogenous drugs such as morphine and heroin. Chronic use of these substances induces
tolerance and dependence for which functional interactions between mu and delta opioid
receptors have been hypothesized. Numerous reports in heterologous systems established
that mu-delta receptor co-expression indeed affects binding and signaling properties.
Heteromer formation was therefore postulated but in vivo demonstration of the existence
and functional impact of mu-delta heteromers still represents a major challenge.
We have generated double fluorescent knock-in mice co-expressing functional mu and
delta opioid receptors respectively fused to the red fluorescent protein mcherry or to the
green fluorescent protein eGFP. These genetically modified animals enable for the first time
direct visualization of the endogenous receptors with subcellular resolution. Mapping the
distribution of the two receptors in the nervous system by this unique approach led us to
identify regions of neuronal co-localization. These animals therefore represent an original
and unprecedented tool to address in vivo mu-delta heteromer formation by probing a causal
link between mu-delta receptor physical proximity and functional interactions.
Project: The project will establish whether in vivo mu-delta co-expression translates
into heteromer formation and critically impacts on cellular physiology and animal behavior.
It will also contribute to evaluate the therapeutic potential of mu-delta heteromers as a new
drug target.
Using in vivo tissues and/or primary neuronal cultures from double fluorescent knock-in
mice, (1) we will determine the physical proximity between mu and delta opioid receptors at
the spinal and supraspinal levels. In neurons co-expressing the two receptors, we will then
check for alterations in receptor signaling and trafficking in response to a pharmacological or
a physiological challenge. We will provide data that establish whether mu-delta co-expression
results in (2) receptor co-internalization and modified intracellular fate and, whether (3) it
impacts on G protein- and β-arrestin-dependent signaling upon pharmacological stimulation.
(4) We will explore whether signaling and trafficking properties of co-expressed mu-delta
receptors, in particular the export to the cell surface, are modified by chronic morphine
treatment. (5) We will investigate in vivo the role of preferential mu-delta activation in the
context of opiate addiction to evaluate their potential as a novel therapeutic target. (6) Finally,
we will examine how mu-delta functional impact is modified in a model of neuropathic pain.
Expected skills
The student must be interested in neuroscience, should have basic knowledge in
cellular/molecular biology and/or pharmacology and be interested in developing animal
models and addressing cellular signalisation and G protein-coupled receptor trafficking.
Expertise provided during PhD
During his (her) PhD work, the student will acquire several cellular imaging techniques in
fluorescence microscopy. The student will use different behavioral tests and will also work ex
vivo (primary neuronal cultures and brain slices). He (she) will also get familiar with opioid
receptor pharmacology. He/she will benefit from a rich scientific and technical environment,
which will help him/her develop his/her potential as a researcher and his/her communication
skills.
Main publications of the group related to the topic (last 3 years)
Snook L.A.S., Milligan G., Kieffer B. L. and Massotte D. (2008) « Co-expression of mu and
delta opioid receptors as receptor-G protein fusons enhances both mu and delta
signaling via distinct mechanisms. » Journal of Neurochemistry 105, 865-873
Yalcin I, Bohren Y, Waltisperger E, Sage-Ciocca D, Yin JC, Freund-Mercier MJ, Barrot M
(2011) A time-dependent history of mood disorders in a murine model of
neuropathic pain. Biol Psychiatry 70:946-953.
Erbs E., Faget L., Scherrer G., Matifas A., Filliol D., Vonesch J.-L., Koch M., Kessler P.,
Hentsch D., Birling M.-C., Koutsourakis M., Vasseur L., Veinante P., Kieffer B.L. and
Massotte D. (2014) « A mu-delta opioid receptor brain atlas reveals neuronal cooccurrence in subcortical networks.” Brain Structure and Function DOI:
10.1007/s00429-014-0717-9.
Massotte D. « In vivo opioid receptor heteromerization : where do we stand ? » (2014) Br. J.
Pharmacol doi: 10.1111/bph.12702