COBAS TaqMan® HBV Test

Transcription

COBAS® TaqMan® HBV Test
For Use With The High Pure System
DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HBV HPS
48 Tests
48 Tests
P/N: 03500756 190
P/N: 03502295 001
UTILISATION
Le test HBV COBAS® TaqMan®, à utiliser avec le système High Pure (HPS) est un test d'amplification in
vitro de l'acide nucléique destiné à doser l'ADN du virus de l'hépatite B (HBV) dans le sérum ou le plasma
humain, en utilisant le nécessaire Acide nucléique viral High Pure System pour la préparation manuelle
d'échantillons et l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 pour la détection et l'amplification automatisées.
Le test COBAS® TaqMan® HBV n'est pas n'est pas conçu pour le dépistage du HBV dans le sang ou
les produits sanguins ni en tant que test diagnostique pour confirmer l'existence d'une infection par
le HBV.
RESUME ET DESCRIPTION DU TEST
Le virus de l'hépatite B (HBV) est l'un des différents virus responsables de l'hépatite virale. Dans le monde,
plus de 2 milliards de personnes ont été infectées par le HBV et plus de 350 millions d'entre elles ont une
infection chronique1. Les porteurs chroniques présentent un risque élevé de complications à long terme,
parmi lesquelles il faut citer l'hépatite chronique, la cirrhose et l'hépatocarcinome2,3,4. Des marqueurs
sérologiques sont couramment utilisés pour confirmer le diagnostic et/ou aider au pronostic d'une infection
aiguë ou chronique par le HBV. Le principal marqueur de l'infection par le HBV est la présence de l'antigène
d'enveloppe (AgHBs). Bien que les porteurs puissent éliminer l'AgHBs et développer des anticorps antiAgHBs, il semble qu'il y ait toujours un risque ultérieur de complications hépatiques graves5,6. L'antigène
e du HBV (AgHBe) est généralement utilisé comme marqueur secondaire et indique une réplication active
du HBV associée à une maladie hépatique évolutive. Une clairance incomplète de l'AgHBe semble
augmenter le risque de maladie hépatique terminale7,8. Des variants du HBV peuvent produire un AgHBe
indétectable dans le sérum, ou bien encore la souche peut perdre son aptitude à fabriquer l'AgHBe même
au cours d'une infection active9. Par conséquent, l'utilisation de ce marqueur peut avoir un intérêt limité
dans la surveillance de l'évolution de la maladie10. Certains auteurs ont signalé que l'aptitude à détecter
l'ADN du HBV dans le sérum a une valeur pronostique pour ce qui concerne l'évolution des infections
aiguës et chroniques dues au HBV11,12,13,14. La méthodologie peut permettre la détection de l'ADN du
HBV après clairance de l'AgHBs15 ou la détection du HBV en l'absence de marqueur sérologique16.
Cependant, on n'a pas encore établi de relation entre les marqueurs sérologiques et les taux d'ADN du
HBV. L'efficacité du traitement antiviral utilisé pour traiter les patients porteurs du HBV peut aussi être
évaluée grâce aux marqueurs sérologiques ou par une mesure de la fonction enzymatique du foie.
Néanmoins, le dosage quantitatif de l'ADN viral du HBV dans le sérum ou le plasma est considéré comme
la mesure la plus directe et la plus fiable de la réplication virale13,17,18,19. On a montré qu'une chute rapide
et persistante des taux d'ADN du HBV chez des patients recevant un traitement à base d'interféron alpha,
de lamivudine ou de ganciclovir est un facteur prédictif d'évolution favorable sous
traitement10,20,21,22,23,24. La surveillance des taux d'ADN du HBV permet de prédire le développement
d'une résistance à la lamivudine25. Par conséquent, un test quantitatif offrant un dosage de l'ADN du HBV
est un outil utile que l'on peut utiliser en association avec d'autres marqueurs sérologiques lors de la prise
en charge d'une infection par le HBV.
PRINCIPES DU TEST
Le test HBV COBAS® TaqMan® se base sur deux processus essentiels : (1) la préparation manuelle d'un
échantillon pour obtenir de l'ADN du HBV ; (2) l'amplification automatisée par PCR de l'ADN cible en utilisant
des amorces complémentaires spécifiques du HBV et la détection par sondes oligonucléotidiques doubles
et clivées, à marquage fluorescent, qui permettent la quantification du produit cible HBV amplifié (amplicons)
et de l'ADN du standard de quantification HBV, qui est traité, amplifié et détecté simultanément avec
l'échantillon.
1
Le mélange réactionnel (Master Mix) contient des paires d'amorces et de sondes spécifiques à la fois de
l'ADN du HBV et de l'ADN du standard de quantification HBV. Le mélange réactionnel a été développé pour
assurer une quantification équivalente des génotypes A à G du HBV. La détection de l'ADN amplifié s'effectue
en utilisant des sondes oligonucléotidiques à double marquage spécifiques de la cible et du standard de
quantification, permettant ainsi une identification indépendante de l'amplicon HBV et de l'amplicon du
standard de quantification HBV.
La mesure de l'ADN viral du HBV s'effectue en utilisant le standard de quantification du HBV. Le standard
de quantification HBV est un plasmide linéarisé non infectieux qui contient des sites de liaison aux amorces
identiques à la cible d'ADN du HBV et une région de liaison unique de liaison à la sonde qui permet à
l'amplicon du standard de quantification HBV d'être différencié de l'amplicon cible HBV. Le standard de
quantification HBV est incorporé à chaque échantillon et témoin individuel selon un nombre de copies connu,
et subit les étapes de préparation de l'échantillon, d'amplification PCR et de détection conjointement avec
la cible HBV. L'analyseur COBAS® TaqMan® 48 calcule le titre de l'ADN du HBV dans l'échantillon test en
comparant le signal HBV au signal du standard de quantification HBV pour chaque échantillon et témoin.
Le standard de quantification HBV compense les effets d'inhibition et des témoins pendant les processus
d'amplification et de préparation afin de permettre une quantification précise de l'ADN du HBV dans chaque
échantillon.
Préparation de l'échantillon
Le test COBAS® TaqMan® HBV traite les échantillons de sérum et de plasma, et isole l'ADN du HBV
grâce à une préparation manuelle standard d'un échantillon reposant sur la liaison de l'acide nucléique
contenu dans les prélèvements à des fibres de verre. Les particules de virus HBV sont lysées par
incubation à température élevée avec une protéase et un tampon chaotrope de lyse/ liaison qui libère les
acides nucléiques et protège l'ADN du HBV libéré des désoxyribonucléases du plasma et du sérum. Un
nombre connu de molécules d'ADN du standard de quantification HBV est introduit dans chaque
échantillon conjointement avec le réactif de lyse. Ensuite, on ajoute de l'isopropanol au mélange de lyse,
qui est centrifugé dans une colonne contenant un filtre en fibres de verre. Pendant la centrifugation, l'ADN
du HBV et l'ADN du standard de quantification HBV se lient à la surface du filtre en fibre de verre. Les
substances non liées, comme les sels, les protéines et d'autres impuretés cellulaires, sont éliminés par
centrifugation. Les acides nucléiques adsorbés sont lavés et élués avec une solution aqueuse. Les
pipettes jetables permettent le traitement parallèle de 12 échantillons ou de multiples de 12 échantillons.
L'échantillon traité contenant l'ADN du HBV et l'ADN du standard de quantification HBV est ajouté au
mélange de détection/amplification. L'ADN du HBV cible et l'ADN du standard de quantification HBV sont
ensuite amplifiés et détectés sur l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 en utilisant les réactifs de détection
et d'amplification qui sont fournis dans le nécessaire de test.
Amplification par PCR
Sélection de la cible
La sélection de la séquence d'ADN cible pour le HBV dépend de l'identification des régions qui, à l'intérieur
du génome du HBV et sur l'ensemble des génotypes de HBV, ont le plus fort taux de conservation de la
séquence. De la même manière, la sélection appropriée des amorces et de la sonde est essentielle pour
permettre au test de détecter tous les génotypes cliniquement pertinents de HBV. On a montré qu'une région
de l'ADN génomique circulaire partiellement monocaténaire du HBV présente une conservation maximum
de la séquence d'ADN entre les génotypes du HBV connus. Le test COBAS® TaqMan® HBV utilise des
amorces d'amplification PCR qui définissent une séquence à l'intérieur de la région hautement conservée
du pré-noyau/ noyau du génome du HBV.
Amplification de la cible
Les échantillons traités sont ajoutés au mélange d'amplification dans des tubes d'amplification (tubes K) dans
lesquels se produit l'amplification PCR. Le thermocycleur de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 chauffe le
mélange afin de dénaturer l'ADN bicaténaire et d'exposer les séquences cibles de l'amorce spécifique sur
l'ADN génomique circulaire du HBV et sur l'ADN du standard de quantification HBV. Au fur et à mesure du
refroidissement du mélange, les amorces s'hybrident à l'ADN cible. L'ADN polymérase thermostable Thermus
specie Z05 ADN (Z05), en présence de Mn2+ et d'un excès de désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP),
dont la désoxyadénosine triphosphate, désoxyguanosine triphosphate, désoxycytidine triphosphate et la
désoxyuridine triphosphate (au lieu de la thymidine), étend les amorces hybridées le long de la matrice pour
produire une molécule d'ADN bicaténaire appelée amplicon. L'analyseur COBAS® TaqMan® 48 répète
automatiquement cette opération au cours d'un nombre défini de cycles, chacun devant doubler la quantité
d'amplicons ADN produits. Le nombre de cycles nécessaires est préprogrammé dans l'analyseur COBAS®
TaqMan® 48. L'amplification ne concerne que la région du génome HBV située entre les amorces ; le génome
HBV entier n'est pas amplifié.
2
Amplification sélective
Dans le test COBAS® TaqMan® HBV l'amplification sélective d'un acide nucléique cible à partir d'un
échantillon est obtenue au moyen de l'enzyme AmpErase (uracile-N-glycosylase) et de la désoxyuridine
triphosphate (dUTP). L'enzyme AmpErase reconnaît et catalyse la destruction des brins d'ADN contenant
de la désoxyuridine26, mais non celle des brins contenant de la désoxythymidine. L'ADN naturel ne contient
pas de désoxyuridine, mais les amplicons en contiennent toujours en raison de l'utilisation de
désoxyuridine triphosphate comme dNTP dans le mélange réactionnel. Ainsi, seuls les amplicons
renferment de la désoxyuridine. La désoxyuridine permet la destruction des amplicons contaminants par
l'AmpErase avant l'amplification de l'ADN cible. De plus, elle détruit étalement tout produit non spécifique
formé après l'activation initiale du mélange réactionnel par du manganèse, ce qui améliore la sensibilité et
la spécificité. L'enzyme AmpErase, contenue dans le mélange réactionnel, catalyse le clivage de l'ADN
contenant de la désoxyuridine au niveau des résidus de désoxyuridine par ouverture de la chaîne de
désoxyribose en position C1. Au cours du réchauffage de la première étape du cycle thermique, la chaîne
de l'amplicon d'ADN se brise au niveau de la désoxyuridine, rendant l'ADN impossible à amplifier.
L'enzyme AmpErase est inactive à une température supérieure à 55 °C, c'est-à-dire pendant toutes les
étapes du cycle thermique et, de ce fait, ne détruit pas l'amplicon cible formé pendant l'amplification.
Détection des produits PCR dans un test COBAS® TaqMan®
Le test COBAS® TaqMan® HBV utilise une technologie PCR en temps réel27,28. L'utilisation de sondes
fluorescentes à double marquage permet une détection en temps réel de l'accumulation des produits PCR
en surveillant l'intensité de l'émission des fluorohphores rapporteurs fluorescents libérés pendant le processus
d'amplification. Les sondes consistent en oligonucléotides spécifiques du HBV et du standard de
quantification HBV marqués par un fluorohphore rapporteur (ou Reporter Dye) et un fluorohphore quencher
(ou Quencher Dye). Dans le test COBAS® TaqMan® HBV, le HBV et les sondes du standard de quantification
du HBV sont marquées par différents fluorohphores rapporteurs de fluorescence. Lorsque les amorces à
colorants à double fluorescence sont intactes, la fluorescence du fluorohphore rapporteur est supprimée en
raison de la proximité du fluorohphore quencher en raison des effets Förster de transfert d'énergie. Pendant
la phase PCR, la sonde hybride une séquence cible et se trouve clivée par l'activité de la nucléase 5' → 3'
de l'ADN-polymérase Z05 thermostable. Une fois que les fluorohphores rapporteurs et fluorohphores
quencher sont libérés et séparés, l'extinction (quenching) ne se produit plus et la fluorescence du fluorohphore
rapporteur augmente. L'amplification de l'ADN du HBV et de l'ADN du standard de quantification HBV sont
mesurées indépendamment à des longueurs d'onde différentes. Ce processus est répété pendant un nombre
déterminé de cycles, chacun d'entre eux augmentant effectivement l'intensité de l'émission des fluorohphores
rapporteurs individuels, permettant une identification indépendante de l'ADN du HBV et de l'ADN du standard
de quantification HBV. L'intensité des signaux est fonction de la quantité initiale de matériel au
commencement de la PCR.
Points fondamentaux du dosage par le test COBAS® TaqMan® HBV
Le test COBAS® TaqMan® HBV fournit avec précision des résultats quantitatifs dans une plage dynamique
très étendue dans la mesure où le monitorage de l'amplicon a lieu pendant la phase exponentielle de
l'amplification. Plus le titre en HBV de l'échantillon est élevé, plus rapidement la fluorescence du
fluorohphore rapporteur de la sonde HBV dépasse le niveau de fluorescence de base (voir la Figure 1). La
quantité d'ADN du standard de quantification (QS) du HBV étant constante entre tous les échantillons, la
fluorescence du fluorohphore rapporteur de la sonde QS HBV doit apparaître selon le même cycle pour tous
les échantillons (voir la Figure 2). Dans les cas où l'amplification QS et la détection sont affectées par une
inhibition ou par un prélèvement inadéquat de l'échantillon, la fluorescence apparaît plus lentement,
permettant ainsi aux titres calculés de l'ADN cible HBV d'être ajustés en conséquence. L'apparition de
signaux fluorescents spécifiques est considérée comme étant une valeur critique de seuil (Ct). La Ct est
définie comme étant le numéro de cycle fractionnel la fluorescence du fluorohphore rapporteur dépasse un
seuil prédéterminé (le niveau de fluorescence attribué) et représente le début d'une phase de croissance
exponentielle de ce signal (voir la Figure 3). Une valeur Ct plus élevée est l'indication d'un titre initial d'ADN
cible HBV plus bas. Lorsque le titre double, le Ct diminue de 1 point pour l'ADN du HBV cible alors qu'une
multiplication par 10 du titre est corrélée à une diminution de 3,3 Ct.
La Figure 1 présente les courbes de croissance de la cible pour une série de dilution du virus s'étageant
sur une gamme de 5 log10. Au fur et à mesure de l'augmentation de la concentration du virus, les courbes
de croissance se décalent vers les cycles précédents. C'est pourquoi, la courbe de croissance la plus à
gauche correspond au niveau de titre viral le plus élevé alors que la courbe de croissance la plus à droite
correspond au niveau de titre viral le plus faible.
3
Figure 1
9,00
8,00
Fluorescence normalisée
7,00
6,00
5,00
4,00
Titre le
plus élevé
3,00
2,00
Titre le
plus faible
1,00
0,00
-1,00
0
10
20
30
40
50
60
Nombre de cycles
La Figure 2 montre les courbes de croissance du standard de quantification pour les échantillons
provenant d'une série de dilution virale s'étageant sur une gamme de 5 log10. La quantité de standard
de quantification ajoutée à chaque échantillon est constante pour chaque réaction. La valeur de Ct du
standard de quantification est la même quel que soit le titre viral.
Figure 2
35,00
Titre le
plus faible
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
Titre le
plus élevé
5,00
0,00
-5,00
0
10
20
30
40
50
60
Nombre de cycles
La Figure 3 présente un exemple de la manière avec laquelle sont normalisées les valeurs de fluorescence
lors de chaque cycle pour chaque courbe de croissance. Le nombre de cycles fractionnels (Ct) est calculé
à l'emplacement où le signal de fluorescence croise le niveau de fluorescence attribué.
4
Figure 3
1
0,9
0,8
Valeur Ct = 27,1
Fluorescence attribuée
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Nombre de cycles
Mesure de l'ADN du HBV
Le test COBAS® TaqMan® HBV quantifie l'ADN viral du HBV en utilisant une deuxième séquence cible
(standard de quantification du HBV) qui est ajoutée à chaque échantillon selon une concentration connue.
Le standard de quantification du HBV est une construction d'ADN plasmidique linéarisé non infectieux,
contenant des fragments de séquences du HBV avec une amorce liant des régions identiques à celles
de la séquence cible HBV. Le standard de quantification HBV génère aussi un produit d'amplification de
même longueur et de même composition en bases que l'ADN du HBV cible. La région d'hybridation de
la sonde de détection du standard de quantification HBV a été modifiée pour différencier l'amplicon du
standard de quantification HBV de l'amplicon HBV cible.
Pendant la phase d'hybridation de la PCR sur l'analyseur COBAS® TaqMan® 48, les échantillons sont
illuminés et excités par une lumière filtrée, et les données de fluorescence de l'émission filtrée sont
recueillies pour chaque échantillon. Les mesures provenant de chaque échantillon sont alors corrigées
en fonction des variations de l'appareil. Ces mesures de fluorescence sont envoyées par l'appareil vers
le logiciel AMPLILINK et stockées dans une base de données. Des vérifications préalables servent à
déterminer si les données concernant l'ADN du HBV et l'ADN du standard de quantification HBV
constituent des éléments valides, et des messages sont émis lorsque ces données se situent en dehors
des limites prédéfinies. Quand toutes les vérifications préalables sont terminées et acceptées, les mesures
de fluorescence sont traitées pour générer des valeurs Ct pour l'ADN du HBV et à l'ADN du standard de
quantification HBV. Les constantes d'étalonnage spécifiques du lot fournies avec le test COBAS®
TaqMan® HBV sont utilisées pour calculer le titre des échantillons et des témoins en se basant sur les
valeurs Ct de l'ADN du HBV et de l'ADN du standard de quantification HBV. Le test COBAS® TaqMan®
HBV est normalisé par rapport au standard international HBV de l'OMS pour le test NAT 97/74629 et les
résultats du titrage sont fournis en unités internationales (UI/ml).
REACTIFS
Nécessaire Acide nucléique viral High Pure System
(P/N: 03502295 001)
48 Tests
LYS
(Tampon de lyse/de liaison)
2 x 25 ml
+
Tris
52 % Guanidine-HCl
< 1 % Urée
20 % Triton X-100
Xn
52 % Guanidine-HCl (m/m)
Nocif
5
CAR
(ARN porteur, lyophilisat)
2 x 2 mg
PK
(Protéinase K, lyophilisat)
2 x 100 mg
99% Protéinase K, lyophilisat
99 % Protéinase K, lyophilisat
+
Xn
Nocif
IRB
(Tampon d'élimination de l'inhibiteur)
1 x 33 ml
Tris
65 % Guanidine-HCl
(ajouter 20 ml d'éthanol)
65 % Guanidine-HCl (m/m)
+
Xn
Nocif
WASH
(Tampon de lavage)
1 x 20 ml
Tris
Chlorure de sodium
(ajouter 80 ml d'éthanol)
ELB
(Tampon d'élution)
1 x 30 ml
RS
(Nécessaire de portoirs de système pour acide nucléique viral High Pure)
Portoir à
Portoir
Portoir
Portoir
Pinces
4 x par unité
lyse
de tube filtrant avec portoir de vidange
à élution
à couvercles
WR
(Portoir à vidange système pour acide nucléique viral High Pure)
(P/N: 03500756 190)
HBV HPS
8 x par unité
48 Tests
Préparation des échantillons et des témoins
HBV QS
(réactif de standard de quantification COBAS® TaqMan® HBV)
Tampon de Tris-HCl
EDTA
< 0,001 % d'ADN plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant un
insert avec des séquences de liaison à l'amorce HBV et une seule
région de liaison de la sonde.
Amarante (colorant)
< 0,005 % d'ARN poly rA (synthétique)
0,05 % d'azide de sodium
6
2 x 1,0 ml
HBV H(+)C
[Témoin HBV Haut (+)]
< 0,001 % d'ADN plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant
des séquences HBV.
Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine de
détection des anticorps anti-HCV, des anticorps anti-HIV-1 et
anti-HIV-2, de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs.
ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR.
0,1 % de conservateur ProClin® 300
2 x 1,0 ml
HBV L(+)C
[Témoin HBV Bas (+)]
< 0,001 % d'ADN plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant
des séquences HBV.
Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine
de détection des anticorps anti-HCV, des anticorps anti-HIV-1et
anti-HIV-2, de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs.
ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR.
2 x 1,0 ml
CTM (–) C
[Témoin négatif COBAS® TaqMan® (Plasma humain)]
Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine de
détection des anticorps anti-HCV, des anticorps anti-HIV-1 et anti-HIV-2,
de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs. ARN-HIV-1,
ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR.
4 x 1,0 ml
Réactifs d'amplification et de détection
HBV MMX
(Mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HBV)
Tampon de Tricine
Potassium hydroxide
Acétate de potassium
Glycérol
< 0,001 % de dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,001 % d'amorces d'amont et d'aval pour la région
du pré-noyau/ noyau du HBV
< 0,001 % de sondes oligonucléotidiques marquées par
fluorescence, spécifiques pour l'ADN du HBV et le standard
de quantification du HBV
< 0,001 % d'aptamère d'oligonucléotide
< 0,05 % d'ADN-Polymérase Z05 (microbienne)
< 0,1 % d'AmpErase (uracile-N-glycosylase) (microbienne)
2 x 24 Tests
2 x 1,4 ml
CTM Mn2+
(Solution de manganèse COBAS® TaqMan®)
< 1,2 % d'acétate de manganèse
Acide acétique
2 x 24 Tests
2 x 1,0 ml
7
PRÉCAUTIONS D’EMPLOI
A.
DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO.
B.
Ce test doit être utilisé avec du plasma humain recueilli sur anticoagulant EDTA et du sérum humain.
C.
Ne pas pipetter à la bouche.
D.
Ne pas manger, boire ou fumer dans les zones de travail du laboratoire. Porter des gants de
protection jetables, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation
des échantillons et des réactifs se trouvant dans le nécessaire. Se laver soigneusement les mains
après la manipulation des echantillons et des réactifs du nécessaire.
E.
Éviter toute contamination microbienne et contamination par la ribonucléase des réactifs
lors de l'extraction des parties aliquotes des flacons de réactifs.
F.
L'utilisation de pipettes stériles jetables ou d'embouts de pipettes sans ADNases est
recommandée.
G.
Ne pas regrouper des réactifs de differents lots ou de différents flacons du meme lot.
H.
Ne pas mélanger des réactifs provenant de différents nécessaires.
I.
Éliminer les réactifs, déchets et échantillons inutilisés conformement aux règlements nationaux,
fédéraux et locaux.
J.
Ne pas utiliser un nécessaire après sa date de péremption.
K.
Des fiches de sécurité (Material Safety Data Sheets = MSDS) des produits sont disponibles sur
demande auprès bureau Roche le plus proche.
L.
Les échantillons et les témoins doivent être manipulés comme s'ils étaient infectieux en recourant
aux bonnes pratiques de laboratoire conformément aux directives décrites dans Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories30 et sur le document M29-A31 du CLSI. Nettoyer et
désinfecter soigneusement tous les plans de travail avec une solution a 0,5 % d'hypochlorite de
sodium préparée extemporanément avec de l'eau distillée ou demineralisée.
REMARQUE: l'« eau de Javel » du commerce contient généralement de l'hypochlorite de sodium à
une concentration de 5,25 %. Une dilution de l'eau de Javel au 1/10 produira une
solution d'hypochlorite de sodium a 0,5 %.
M.
ATTENTION : Les réactifs CTM (–) C, HBV L(+)C et HBV H(+)C contiennent du plasma humain
dérivé de sang humain. Le matériel source a été soumis aux tests agréés par la FDA américaine
et s'est avéré être non réactif à la recherche de l'antigene de surface de l'hépatite B (AgHBs), des
anticorps anti-HIV-1, anti-HIV-2, et anti-HCV, de l'antigènes HIV p24. Les tests par PCR sur le
plasma humain négatif n'ont détecté aucun ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV. Cependant,
aucune méthode de test ne peut garantir avec une certitude absolue que des produits dérivés du
sang humain sont exempts de risques de transmission d'agents infectieux. C'est pourquoi, tout
produit d'origine humaine doit être considéré comme potentiellement infectieux. CTM (–) C,
HBV L(+)C et HBV H(+)C doivent être manipulés comme s'ils étaient infectieux en respectant les
consignes de sécurité de laboratoire conformément aux directives de Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories30 et sur le document M29-A31 du CLSI. Nettoyer et désinfecter
soigneusement tous les plans de travail avec une solution a 0,5 % d'hypochlorite de sodium
préparée extemporanément avec de l'eau distillée ou déminéralisée.
N.
HBV MMX, HBV QS et CTM Mn2+ contiennent de l'azide de sodium. L'azide de sodium peut réagir
avec le plomb ou le cuivre des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs.
Lors de l'élimination de solutions contenant de l'azide de sodium dans les eviers du laboratoire, rincer
les canalisations avec une grande quantité d'eau afin d'éviter l'accumulation d'azides.
O.
Porter des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et des gants de protection jetables
lors de la manipulation des réactifs. Éviter tout contact de ces produits avec la peau, les yeux ou
les muqueuses. En cas de contact, rincer immédiatement avec de grandes quantités d'eau. Des
brûlures peuvent se produire en l'absence de traitement. Si de tels réactifs sont repandus, les diluer
avec de l'eau avant de les essuyer.
CONSERVATION ET MANIPULATION
Réactifs de préparation de l'échantillon
A.
Conserver les réactifs d'acide nucléique viral High Pure System à une température de 15 à 25 °C
des leur arrivée.
B.
Conserver le tampon d'élution (ELB) et le tampon de lyse/ liaison (LYS) entre 15 et 25 °C. Une fois
ouverts, les flacons de ELB et LYS doivent être conservés entre 15 et 25 °C ; les flacons de ELB
et LYS doivent être utilisés dans les 30 jours suivant leur ouverture ou jusqu'à leur date de
péremption, selon ce qui survient en premier.
8
C.
Après avoir ajouté du tampon d'élution (ELB) pour reconstituer l'ARN porteur et la protéinase K,
conserver l'ARN porteur reconstitue (CAR) et la protéinase K reconstituée (PK) non utilisés entre
-15 et -25 °C. Une fois reconstitués, l'ARN porteur et la protéinase K doivent être utilisés dans les
30 jours ou jusqu'à leur date de péremption, selon ce qui survient en premier.
D.
Après avoir ajouté de l'éthanol, conserver le tampon d'élimination de l'inhibiteur (IRB) et le tampon
de lavage (WASH) a une température comprise entre 15 et 25 °C. Ces solutions actives restent
stables pendant 30 jours ou jusqu'a leur date de péremption, selon ce qui survient en premier.
E.
La solution de lyse/ liaison active [tampon de lyse/ liaison avec de l'ARN porteur, de la protéinase
K et du HBV QS] doit être utilisée immédiatement après sa préparation. Éliminer tout excédent.
A.
Ne pas congeler les réactifs ou les témoins.
B.
Conserver HBV MMX, CTM (–) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS et CTM Mn2+ à une
température comprise entre 2 et 8 °C. Tant qu'ils n'ont pas été ouverts, ces réactifs restent stables
jusqu'a la date de péremption indiquée. Une fois qu'ils ont ete ouverts afin d'en extraire une partie
aliquote pour un lot de 12 échantillons, conserver le reste de HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C,
HBV QS et de CTM Mn2+ à une température comprise entre 2 et 8 °C. Une fois ouverts, HBV
MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS et CTM Mn2+ sont stables entre 2 et 8 °C pendant 30
jours ou jusqu'à la date de péremption, selon ce qui survient en premier. Une fois le flacon ouvert,
toute partie inutilisee de CTM (–) C doit être éliminée.
C.
Le mélange réactionnel actif (préparé en additionnant du CTM Mn2+ a du HBV MMX) doit être
conservé à une température comprise entre 2 et 8 °C, a l'abri de la lumiere. Les échantillons et les
témoins préparés doivent être ajoutés dans les 2 heures suivant la préparation du mélange
reactionnel.
D.
La durée maximale de stabilité des échantillons et les témoins traités est de 3 heures à une
température comprise entre 20 et 30 °C, de 24 heures entre 2 et 8 °C et d'une semaine s'ils sont
congeles a -20 °C.
E.
L'amplification doit être démarrée dans les 3 heures suivant l'ajout des témoins et des échantillons
au mélange réactionnel.
MATERIEL FOURNI
Réactifs de préparation des échantillons
A.
Nécessaire Acide nucléique viral High Pure System
(P/N: 03502295 001)
LYS
(tampon de lyse/liaison)
CAR
(ARN porteur)
PK
(Protéinase K)
IRB
(Tampon d'élimination de l'inhibiteur)
WASH
(Tampon de lavage)
ELB
(Tampon d'élution)
RS
(Ensemble de portoirs de système pour acide nucléique viral High Pure System)
WR
(Portoir de vidange pour système pour acide nucléique viral High Pure)
9
B.
HBV HPS
(P/N: 03500756 190)
HBV QS
(Réactif de standard de quantification COBAS® TaqMan® HBV)
HBV H(+)C
[HBV Témoin Haut (+)]
HBV L(+)C
[HBV Témoin Bas (+)]
CTM (–) C
[Témoin négatif COBAS® TaqMan® (Plasma humain)]
HBV MMX
(Master Mix HBV COBAS® TaqMan®)
CTM Mn2+
(Solution de mangànese COBAS® TaqMan®)
MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
Instrumentation et logiciel
• Analyseur COBAS® TaqMan® 48
• Logiciel AMPLILINK
• Station de données pour le logiciel AMPLILINK
• Manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à utiliser avec le logiciel AMPLILINK, version 3.1.0
ou manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à utiliser avec le manuel d'application du logiciel
AMPLILINK, version 3.2
• Manuel d'application du logiciel AMPLILINK, version 3.1 à utiliser avec l'appareil COBAS® AmpliPrep,
l'analyseur COBAS® TaqMan® et l'analyseur COBAS® TaqMan® 48, ou manuel d'application du
logiciel AMPLILINK, version 3.2 à utiliser avec l'appareil COBAS® AmpliPrep, l'analyseur COBAS®
TaqMan®, l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 et l'analyseur COBAS® AMPLICOR®
• Capsulateur de tube K (P/N : 03516539001)
Matériels à usage unique
• Boîte de 12 x 96 tubes K (P/N : 03137082001)
Centrifugeuse
• Une centrifugeuse Sigma 4-15 °C de table ou une centrifugeuse de plaques à titrage
équivalente, capable d'atteindre une force centrifuge de 4 600 g
• Un rotor horizontal de centrifugeuse Sigma, n° 11118 (comprenant 2 godets, P/N: 13218 et
2 porte plaques, P/N: 17978) ou équivalent
AUTRES MATERIELS NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS
• Isopropanol (> 99 %) - conforme ou supérieur aux spécifications ACS
• Éthanol (96 - 100 %) - conforme ou supérieur aux spécifications ACS
• Pipettes ajustables* : (capacité de 250 µl et 1000 µl) avec barrière aérosol ou embouts à
déplacement positif sans ADNase
• Aide pipettes : Drummond (P/N: 4-000-100) ou équivalent
• Bain-marie à 50 °C (± 2 °C)
• Bloc à chaleur sèche réglé à 70 °C (± 2 °C)
• Pipettes sérologiques, stériles et jetables : 5, 10 et 25 ml
• Tubes coniques stériles en polypropylène, 15 et 50 ml : Corning (P/N: 430052 et 430290) ou
équivalent
• Tubes microfuges stériles de 2 ml : Sarstedt (P/N: 72.693.005) ou équivalent
• Mélangeur Vortex
• Portoirs
• Gants jetables, non poudrés
• Thermomètres étalonnés pour bain-marie et bloc à chaleur sèche
*
La capacité des pipettes ne peut différer de plus de 3 % du volume indiqué. Lorsque cela est spécifié, utiliser des embouts
avec barrère contre les aerósols ou à déplacement positif, sans ADNases, pour éviter une contamination croisée de
l'échantillon et de l'amplicon.
10
PRELEVEMENT, TRANSPORT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS
REMARQUE : manipuler tous les échantillons et témoins comme s'ils étaient susceptibles de
transmettre des agents infectieux.
A.
Prélèvement des échantillons
Le test COBAS® TaqMan® HBV doit être exclusivement utilisé avec des échantillons de sérum ou de
plasma. Le sang doit être recueilli dans des tubes séparateurs de sérum BD SST ou dans des tubes
contenant de l'EDTA comme anticoagulant (bouchon lavande).
Conserver le sang total à une température comprise entre 2 et 25 °C pendant moins de 24 heures.
L'utilisation de plasma EDTA ou de sérum aboutit à des résultats de tests équivalents. La Figure 4
présente l'influence du type de matrice sur les résultats d'ADN du HBV à partir d'échantillons de patients.
Figure 4
Comparaison des échantillons sur plasma EDTA et sur sérum
12,00
8,00
6,00
10
Résultat moyen des échantillons de plasma
(UI/ml [Log ] ADN du HBV, n = 2)
10,00
y = 1,0139x - 0,0703
2
R = 0,9984
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Résultat moyen des échantillons de sérum
(UI/ml [Log10 ] ADN du HBV, n = 2)
Séparer le sérum ou le plasma du sang total dans les 24 heures suivant le recueil par centrifugation entre
800 et 1600 g pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le sérum ou le plasma dans un tube
en polypropylène stérile. La Figure 5 présente les donnees issues des études après recueil des échantillons.
Figure 5
Stabilité du HBV dans du sang total sur anticoagulant EDTA ou dans des tubes pour
séparation du sérum avant séparation en plasma ou en sérum
4,5
6 heures 25-30C
24 heures 25-30C
48 heures 25-30C
3,5
72 heures 25-30C
< 1 heure 2-8C
3,0
6 heures 2-8C
24 heures 2-8C
10
Résultat moyen de lADN du HBV
(UI/ml [log ] ADN du HBV, n = 2)
< 1 heure 25-30C
4,0
48 heures 2-8C
2,5
72 heures 2-8C
2,0
Plasma-1
Plasma-2
Plasma-3
Plasma-4
Plasma-5
Numéro didentification de léchantillon
11
Sérum-1
Sérum-2
B.
Transport des échantillons
Le transport de sang total, de sérum ou de plasma doit être conforme aux lois nationales, fédérales et
régionales relatives au transport d'agents étiologiques32. Le sang total doit être transporté à une
température comprise entre 2 et 25 °C et traité dans le jour suivant le recueil. Le plasma ou le sérum
peuvent être transportes a une température comprise entre 2 et 8 °C ou congelés entre -20 et -80 °C.
C.
Conservation des échantillons
Les échantillons de plasma ou de sérum peuvent être conservés à température ambiante pendant 3 jours
maximum, pendant 7 jours maximum à une température comprise entre 2 et 8 °C, ou congelés pendant
au moins six semaines à une température comprise entre -20 et -80 °C. Il est recommandé de conserver
les échantillons sous formes de parties aliquotes de 800 a 900 µl dans des tubes de 2 ml en polypropylène
avec bouchon à vis (du type Sarstedt, P/N: 72.694.006). La Figure 6 presente les données des études de
conservation d'échantillons.
(UI/ml [log10 ] ADN du HBV, n = 2)
Figure 6
Stabilite du HBV dans du plasma EDTA ou du sérum
4,5
heure 0
1 Jour RT
4,0
3 Jours RT
5 Jours RT
3,5
7 Jours RT
1 Jour 2-8C
3,0
3 Jours 2-8C
5 Jours 2-8C
2,5
2,0
7 Jours 2-8C
6 semaines -80C
Plasma-1
Plasma-2
Plasma-3
Plasma-4
Plasma-5
Sérum-1
Sérum-2
Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être congelés et decongelés cinq fois au maximum sans
aucune perte d'ADN du HBV. La Figure 7 présente les données issues des etudes après congelationdécongélation des échantillons.
Figure 7
Résultats HBV après cinq cycles de congélation-décongélation
(UI/ml [log10 ] ADN du HBV, n = 2)
4,5
4,0
Témoin
1 C-D
3,5
2 C-D
3 C-D
3,0
4 C-D
5 C-D
2,5
2,0
Plasma-1
Plasma-2
Plasma-3
Plasma-4
Sérum-1
12
Sérum-2
MODE D'EMPLOI
REMARQUE : pour de plus amples informations sur les instructions d'utilisation, sur l'impression
des résultats et l'interprétation des messages, commentaires et messages d'erreur, se
reporter aux manuels suivants : (1) manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à utiliser
avec le logiciel AMPLILINK, version 3.1.0, et manuel d'application du logiciel AMPLILINK,
version 3.1 à utiliser avec l'appareil COBAS® AmpliPrep, l'analyseur COBAS® TaqMan® et
l'analyseur COBAS® TaqMan® 48, ou (2) manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à
utiliser avec le manuel d'application du logiciel AMPLILINK, version 3.2, et manuel
d'application du logiciel AMPLILINK, version 3.2 à utiliser avec l'appareil COBAS®
AmpliPrep, l'analyseur COBAS® TaqMan®, l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 et l'analyseur
COBAS® AMPLICOR®.
REMARQUE : tous les réactifs de détection et d'amplification doivent être à température ambiante
avant utilisation ; les sortir de l'endroit de conservation a 2-8 °C au moins 30 minutes avant
l'emploi.
REMARQUE : les échantillons de plasma et de sérum doivent être stabilisés pendant 15 à 30 minutes
a température ambiante avant d'être utilisés.
REMARQUE : utiliser des pipetteurs et des embouts avec barrière contre les aérosols ou à
déplacement positif quand cela est spécifié. La plus grande prudence est de rigueur afin
d'éviter toute contamination.
Taille de la serie :
Chaque nécessaire contient une quantité suffisante de réactifs pour quatre séries d'analyses de 12 tests,
pouvant être effectuées séparément ou simultanément. Un exemplaire de CTM (–) C, de HBV L(+)C et
de HBV H(+)C doit être inclus dans chaque série de tests comptant un maximum de 24 échantillons et
témoins (Cf. Le chapitre « Contrôle de qualité »). Les réactifs d'amplification et de détection sont
conditionnés dans des flacons doubles pour 24 tests. Pour une utilisation optimale des réactifs, traiter
les échantillons et les témoins par lots multiples de 12.
REMARQUE : en cas d'utilisation d'échantillons congelés de sérum ou de plasma, laisser les
échantillons à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient completement décongelés et
les passer au vortex pendant 5 à 10 secondes avant utilisation.
REMARQUE : laisser tous les réactifs revenir à température ambiante avant de les utiliser.
Prechauffer les blocs chauffants a une température de 70 °C (± 2 °C) et le bain-marie à une
température de 50 °C (± 2 °C) avant de commencer les réactions de purification.
A.
Préparation des réactifs
REMARQUE : préparer la solution de travail de lyse/ liaison seulement après que les échantillons
et les témoins ont été stabilisés à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.
1.
Préparer le tampon d'élimination de l'inhibiteur en pipettant 20 ml d'éthanol a 96-100 % du flacon
IRB. Retourner 5 à 10 fois pour mélanger. Cette quantite de tampon d'élimination de l'inhibiteur
reconstitué est suffisante pour réaliser 48 tests.
2.
Préparer le tampon de lavage en pipettant 80 ml d'éthanol à 96-100 % du flacon marqué (WASH).
Mélanger par retournement 5 à 10 fois. Cette quantite de tampon de lavage reconstitué est
suffisante pour realiser 48 tests.
3.
Préchauffer le tampon d'élution (ELB) à 70 °C (± 2 °C) dans un tube microfuge de 2,0 ml avec
bouchon à vis. Plusieurs tubes peuvent être utilisés. Le volume d'élution par échantillon est de
75 µl. Préchauffer le volume indique dans le tableau ci-dessous en fonction du nombre de tests.
Nombre de replicats
4.
Réactif
12
24
Tampon d'elution (ml)
2,0
4,0
Pipetter le volume d'isopropanol indiqué dans le tableau ci-dessous dans un tube stérile et propre
en fonction du nombre de tests.
Nombre de replicats
Réactif
12
24
Isopropanol (ml)
5,0
10,0
13
5.
Pipetter 0,5 ml de tampon d'élution (ELB) dans l'ARN porteur (CAR) Remettre le bouchon en place,
retourner le flacon et le passer au vortex jusqu'à dissolution complète de tout l'ARN porteur. L'ARN
porteur reconstitue suffit pour effectuer 24 tests. La quantité non utilisée d'ARN porteur reconstitué
peut être conservée à une température de -15 a -25 °C pendant 30 jours maximum ou jusqu'à la
date de péremption, selon ce qui survient en premier.
6.
Pipetter 5,0 ml du tampon d'élution (ELB) dans la protéinase K (PK). Remettre le bouchon en place,
retourner le flacon et mélanger au vortex jusqu'à ce que toute la protéinase K soit dissoute. La
protéinase K reconstituée est suffisante pour effectuer 24 tests. La quantité non utilisée de
protéinase K peut être conservée entre -15 et -25 °C pendant 30 jours maximum ou jusqu'à la date
de péremption, selon ce qui survient en premier.
7.
Préparez la solution active de lyse/liaison en pipettant les volumes indiques dans le tableau cidessous, en fonction du nombre d'échantillons et de témoins à traiter :
Nombre de replicats
Réactifs
12
24
Tampon de lyse/ liaison (ml)
7,0
14,0
ARN porteurs (µl)
140
280
HBV QS (µl)
39
78
Protéinase K (ml)
1,4
2,8
REMARQUE : le volume du standard de quantification (HBV QS) est spécifique au test COBAS®
TaqMan® HBV.
REMARQUE : en cas d'utilisation d'ARN porteur reconstitué congelé ou de protéinase K, décongeler
à la température ambiante et retourner les flacons plusieurs fois avant utilisation.
•
Ajouter le volume indiqué de tampon de lyse/liaison dans un tube stérile propre de 50 ml.
•
Ajouter le volume indiqué d'ARN porteur reconstitué dans le tube contenant le tampon de lyse/ liaison.
•
Mélanger au vortex le standard de quantification du HBV (HBV QS) pendant 3 à 5 secondes et
ajouter le volume indiqué du standard de quantification du HBV (HBV QS) dans le tube contenant
le tampon de lyse/liaison et l'ARN porteur reconstitué.
•
Reboucher le tube et mélanger en retournant le tube 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex le mélange au vortex provoquerait l'apparition de bulles dans la solution.
•
Ajouter le volume indiqué de protéinase K reconstituée dans le tube contenant le tampon de lyse/liaison.
•
Reboucher le tube et mélanger en retournant le tube 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex le mélange au vortex provoquerait l'apparition de bulles dans la solution. Commencer à utiliser la
solution active de lyse/liaison immédiatement après l'ajout et le mélange de la protéinase K avec
le tampon de lyse/ liaison.
Le tampon de lyse/de liaison (LYS) inutilisé peut être conservé à une température comprise entre
15 et 25 °C pendant 30 jours ou jusqu'a la date de péremption, selon ce qui survient en premier.
Toute solution active de lyse/de liaison non utilisée doit être eliminée.
B.
REMARQUE : l'emploi de pipetteurs ajustables avec embouts résistants aux aérosols est
recommandé pour cette procedure.
REMARQUE : une pipette à répétition avec embouts combi-tips stériles de taille appropriée peut être
utilisée aux etapes 14,16, 19 et 22. Cependant, il faut veiller à prendre le plus grand soin d'éviter
toute éclaboussure de réactifs et toute contamination croisée.
1.
Pipetter 625 µl de solution active de lyse/ liaison dans chaque puits du portoir de lyse (I, transparent).
Refermer les couvercles.
2.
En ouvrant un puits à la fois, pipetter 500 µl d'échantillon ou de témoin dans le puits approprie. Après
addition de chaque échantillon ou de témoin, abaisser le couvercle jusqu'a enclenchement du
mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étancheité de chaque puits.
3.
Après avoir ajouté tous les échantillons et les témoins, mélanger au vortex le portoir de lyse pendant
10 secondes environ. Examiner visuellement tous les puits pour s'assurer que le mélange au vortex est
satisfaisant.
4.
Incuber le portoir de lyse dans un bain-marie préchauffé à 50 °C (± 2 °C) pendant 10 minutes. Laisser
flotter le portoir de lyse dans un bain-marie rempli d'environ 5 à 7 cm d'eau. Secher le portoir de lyse
après l'avoir retiré du bain-marie.
14
5.
Centrifuger le portoir de lyse pendant 10 à 20 secondes à 4 600 g dans la centrifuge de plaques de
titrage. La centrifuge peut ne pas atteindre la vitesse réglée.
6.
Ouvrir un puits à la fois et y pipetter 250 µl d'isopropanol. Après chaque ajout, abaisser le couvercle
jusqu'à enclenchement du mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étanchéité de chaque puits.
REMARQUE : le volume d'isopropanol est spécifique de chaque test COBAS® TaqMan®.
7.
Mélanger les échantillons en retournant le portoir trois fois de suite puis en le mélangeant au vortex
pendant 10 secondes environ. Examiner visuellement tous les puits pour s'assurer que le mélange
au vortex est satisfaisant.
8.
Centrifuger le portoir de lyse pendant 10 à 20 secondes à 4 600 g dans la centrifugeuse de plaques
à titrage. La centrifugeuse peut ne pas atteindre la vitesse réglée.
9.
Ouvrir un puits à la fois, transférer 750 µl d'échantillon ou de témoin dans les puits correspondants
du portoir à tubes filtrants (II, jaune) avec portoir de vidange apposé (blanc). Après addition de
chaque échantillon ou de mélange témoin, abaisser le couvercle jusqu'à enclenchement du
mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étanchéité de chaque puits.
10.
Après avoir ajouté tous les échantillons et témoins, centrifuger le portoir de tubes filtrants pendant
2 minutes à 4 600 g dans la centrifugeuse à plaques de titrage.
11.
Ouvrir un puits à la fois, transférer le reste du mélange d'échantillon ou de témoins dans les puits
correspondants du portoir à tubes filtrants. Après avoir ajouté chaque mélange d'échantillon ou de
témoin, fermer hermétiquement le couvercle du puits. Éliminer le portoir à lyse de manière
appropriée.
12.
Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 2 minutes à 4 600 g dans la centrifugeuse à plaques
de titrage.
13.
Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de
fixation situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Éliminer le portoir de vidange.
Remplacer par un nouveau portoir de vidange et fixer enclencher le portoir à tubes filtrants sur le
portoir de vidange.
14.
Ouvrir tous les couvercles du portoir à tubes filtrants avec les pinces et pipetter 400 µl de tampon
d'élimination d'inhibiteur (IRB) le long des côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du
puits. Après avoir ajouté le tampon d'élimination de l'inhibiteur dans chaque puits, fermer
hermétiquement les couvercles.
15.
Centrifuger l'ensemble portoir à tubes filtrants-portoir à vidange pendant 2 minutes à 4 600 g dans
la centrifugeuse de plaques à titrage.
16.
Ouvrir chaque couvercle avec les pinces et pipetter 700 µl de tampon de lavage (WASH) le long
des côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après avoir ajouté le tampon de
lavage dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles.
17.
Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 2 minutes à 4 600 g dans la centrifugeuse de plaques
à titrage.
18.
Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de
fixation situés sur la partie supérieure du portoir tubes filtrants. Éliminer le portoir de vidange.
Remplacer par un nouveau portoir de vidange et enclencher le portoir à tubes filtrants sur le portoir
de vidange.
19.
Ouvrir tous les couvercles à l'aide des pinces et pipetter 700 µl de tampon de lavage le long des
côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après avoir ajouté le tampon de
lavage dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles.
20.
à titrage.
21.
Enlever le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de
fixation situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Placer le portoir à tubes filtrants
sur le portoir à élution (IIIA, bleu) et enclencher le portoir à tubes filtrants sur le portoir à élution.
Éliminer le portoir de vidange de manière appropriée.
22.
Ouvrir chaque couvercle avec les pinces et pipetter 75 µl du tampon d'élution préchauffé (ELB) au
centre de chaque filtre sans toucher le filtre.
REMARQUE : ne pas ajouter de tampon d'élution en le versant le long du côté du puits du puits.
Après avoir ajouté le tampon d'élution dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles.
Laisser incuber le portoir à élution à température ambiante pendant au moins 3 minutes après avoir
ajouté le tampon d'élution au dernier puits.
15
23.
à titrage.
24.
Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir à élution en appuyant sur les deux dispositifs de fixation
situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Éliminer le portoir à tubes filtrants de manière
appropriée.
25.
Mettre le portoir à couvercle (IIIB, bleu) sur le portoir à élution (IIIA, bleu). Appuyer fermement et
enclencher les dispositifs de fixation sur le portoir à élution. Fermer chaque couvercle.
26.
Les échantillons et témoins traités sont utilisés directement pour la PCR. Utiliser 50 µl des échantillons
et témoins pour l'amplification. Ajouter les échantillons et témoins traités au mélange réactionnel actif
dans les 3 heures qui suivent leur préparation. Si les échantillons et témoins traités ne peuvent pas
être utilisés dans les 3 heures qui suivent leur préparation, les échantillons et témoins traités peuvent
être conservés à une température de 2 à 8 °C pendant 24 heures maximum dans le portoir à élution
avec couvercle fermé ou congelés à -20 °C pendant au maximum 1 semaine dans des tubes stériles
en polypropylène de 2,0 ml, avec bouchon à vis (par exemple Sarstedt, P/N: 72.694.006). Amplifier
les échantillons et témoins traités dans les 3 heures suivant l'ajout des échantillons et des témoins
au mélange réactionnel actif.
Amplification et détection
REMARQUE : il faut essuyer les porteurs K et les supports de porteurs K à l'aide d'un chiffon non
pelucheux imprégné d'une solution d'isopropanol à 70 %.
C.
Réparation du réactif
REMARQUE : le mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HBV Master Mix (HBV MMX), le mélange
réactionnel actif (Working MMX) et le mélange réactionnel actif + échantillons et témoins
traités sont sensibles à la lumière. Protéger ces réactifs de la lumière.
REMARQUE : il faut stabiliser le mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HBV (HBV MMX) et la
solution de manganèse COBAS® TaqMan® (CTM Mn2+) à température ambiante pendant
au moins 30 minutes avant la préparation du mélange réactionnel actif.
REMARQUE : préparer le mélange réactionnel actif après avoir terminé la préparation des échantillons
et témoins.
REMARQUE : le mélange réactionnel actif doit être utilisé dans les 2 heures qui suivent la préparation.
REMARQUE : l'amplification doit débuter dans les 3 heures qui suivent l'ajout des échantillons et
témoins traités au mélange réactionnel actif.
1.
Stabiliser un flacon de HBV MMX et un flacon de CTM Mn2+ à température ambiante pendant au
moins 30 minutes.
2.
Placer un porteur K dans un support de porteur K.
3.
Placer des tubes K neufs dans le porteur K sans toucher les parois des tubes K.
REMARQUE : si la série comporte moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24 doivent
être occupées pour équilibrer le porteur K dans le thermocycleur.
4.
Déboucher les tubes K à l'aide du décapsuleur de tubes K. Placer les bouchons dans le dispositif
de maintien des tubes K.
5.
Préparer le mélange réactionnel actif de la façon suivante :
Pour 24 tests, ajouter 191 µl de CTM Mn2+ à un flacon de HBV MMX . Boucher le flacon et bien
mélanger en le retournant 10 fois. Ne pas mélanger le mélange réactionnel actif au vortex. Tenir le
mélange réactionnel actif à l'abri de la lumière solaire et l'utiliser dans les 2 heures qui suivent.
Pour 12 tests, prélever 660 µl de HBV MMX et les mettre dans un tube de 2 ml. Ajouter 90 µl de
CTM Mn2+ au tube de 2 ml contenant le HBV MMX, boucher le tube et bien mélanger en
retournant le tube 10 fois. Tenir le mélange réactionnel actif à l'abri de la lumière solaire et l'utiliser
dans les 2 heures qui suivent. Conserver le HBV MMX et le CTM Mn2+ non utilisés dans leurs
flacons d'origine à une température comprise entre 2 et 8 °C. Après ouverture, le HBV MMX et le
CTM Mn2+ sont stables à 2 - 8 °C pendant 30 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon ce
qui survient en premier.
REMARQUE : le volume de CTM Mn2+ est spécifique au test COBAS® TaqMan® HBV.
6.
Pipeter 50 µl de mélange réactionnel actif dans chaque tube K.
REMARQUE : si des échantillons et des témoins traités ont été conservés congelés avant amplification,
les laisser décongeler à température ambiante avant de passer à l'étape 7.
16
7.
Ajouter 50 µl de chaque échantillon et témoin au tube K approprié contenant le mélange réactionnel
actif à l'aide d'une micropipette avec filtre contre les aérosols ou embout à déplacement positif.
Mélanger doucement chaque échantillon en déplaçant le micropipetteur trois fois de haut en bas sans
créer des bulles.
8.
Répéter l'étape 7 pour chaque échantillon et témoin traités jusqu'à ce qu'ils soient tous transférés
dans des tubes K. Utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon ou témoin traité. Inspecter
visuellement chaque tube à la recherche de bulles et les éliminer s'il y a lieu. Boucher les tubes K
avec un capsuleur de tubes K. Vérifier visuellement que les volumes appropriés ont bien été ajoutés.
9.
L'amplification doit commencer dans les 3 heures qui suivent l'ajout des échantillons et témoins
traités aux tubes K contenant le mélange réactionnel actif.
D.
1.
Chargement et fonctionnement de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48
Allumer l'ordinateur du poste de travail et ouvrir une session Windows XP à l'aide du code
utilisateur et du mot de passe appropriés.
2.
Mettre l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 sous tension. Vérifier que l'appareil s'initialise et qu'il
est prêt à fonctionner. Si des porteurs K d'une ou de plusieurs séries antérieures se trouvent
encore dans l'un ou l'autre des thermocycleurs, les retirer à l'aide du transporteur de porteurs K.
3.
Lancer le logiciel AMPLILINK de l'ordinateur. Ouvrir une session à l'aide du code utilisateur et du
mot de passe appropriés.
4.
Pour créer des commandes de porteurs K pour les échantillons à analyser, cliquer sur l'icône
Orders. Sélectionner l'onglet Sample puis cliquer sur le bouton New et saisir le numéro de
commande de chaque échantillon à l'aide du clavier ou du lecteur de codes barres. Sélectionner
la définition de test correspondant au test COBAS® TaqMan® HBV. Répéter cette étape pour
chaque échantillon. Cliquer sur le bouton Save.
REMARQUE : si la série comporte moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24 doivent
être occupées pour équilibrer le porteur K dans le thermocycleur.
5.
Saisir les données de contrôle de qualité en sélectionnant l'onglet Quality Control dans la fenêtre
Orders. Cliquer sur le bouton New et entrer les données de la carte de valeur des témoins du test
COBAS® TaqMan® HBV (COBAS® TaqMan® HBV Test Controls Value Card) fournie avec le
nécessaire, soit à l'aide du clavier soit à l'aide du lecteur de codes barres. Saisir le numéro de lot
du test COBAS® TaqMan® HBV, la date de péremption, les seuils des témoins Bas (+) et Haut (+)
ainsi que les coefficients d'étalonnage spécifiques à chaque lot dans les champs prévus à cet effet.
Cliquer sur OK.
6.
Assigner un numéro de porteur K à la série en cliquant sur l'onglet K-Carrier dans la fenêtre
Orders. Cliquer sur New dans la fenêtre K-Carrier. Dans la cellule à droite de K-Carrier ID, entrer
le numéro du porteur K figurant sur le code barre du porteur K à l'aide du clavier ou du lecteur de
codes barres. Remarque : pour que les résultats d'une série antérieure dotée du même numéro
d'identification de porteur K doivent être acceptés. Sélectionner la définition de test correspondant
au test COBAS® TaqMan® HBV depuis le panneau de test dans la partie inférieure de la fenêtre.
7.
Dans la liste de travail (Worklist), sélectionner la première rangée de la colonne de Type (T). Mettre
ce champ en surbrillance afin d'accéder au menu déroulant puis sélectionner le type de contrôle
requis. Double-cliquer ensuite sur le champ du numéro d'identification d'échantillon (sample ID)
correspondant à la même rangée. La fenêtre LookUp Control s'affiche avec toutes les témoins
disponibles. Après avoir sélectionné le témoin, les valeurs d'étalonnage et de témoins
correspondantes seront affichées dans le panneau d'information inférieur droit. Répéter cette
procédure pour tous les témoins souhaités.
8.
Pour entrer des échantillons dans la liste de travail (Worklist), double-cliquer sur la première
position (rangée) des entrées d'échantillons. La fenêtre Lookup Sample s'affiche et contient les
commandes d'échantillons assignés. Utiliser les touches Shift + Arrow pour mettre en surbrillance
plus d'un numéro de commande à la fois. Vérifier que la définition de test correspondant au test
COBAS® TaqMan® HBV a été attribuée à tous les ordres.
9.
Cliquer sur Save pour enregistrer les commandes de porteur K.
E.
Amplification et détection
1.
Sélectionner l'icône Systems dans l'onglet System ; cliquer sur Open pour activer le thermocycleur.
Lorsque le couvercle du thermocycleur est complètement ouvert et que la fenêtre Systems affiche
le message « Ready to Load », soulever et maintenir le couvercle du thermocycleur ouvert. A l'aide
du transporteur de porteurs K, transférer le porteur K chargé, avec les tubes K bouchés contenant
le mélange réactionnel actif, les échantillons et les témoins, dans le thermocycleur. Fermer le
couvercle du thermocycleur.
17
2.
Cliquer sur Start dans la fenêtre Systems sous l'icône TC (thermocycleur) pour fermer le couvercle
du thermocycleur et lancer la série.
3.
L'analyseur COBAS® TaqMan® 48 effectue automatiquement l'amplification et la détection.
RESULTATS
Calcul des résultats
L'analyseur COBAS® TaqMan® 48 détermine automatiquement le titre de l'ADN HBV de l'échantillon ou
du témoin. Le titre de l'ADN HBV est exprimé en unités internationales (UI)/ml. Le facteur de
conversion entre copies/mL HBV et unités internationales/ml est de 5,82 copies/UI, selon le standard
international HBV de l'OMS pour le test NAT 97/74629.
L'analyseur COBAS® TaqMan® 48 :
•
Détermine la valeur de seuil par cycle (Ct) de l'ADN du HBV et de l'ADN du standard de
quantification HBV.
•
Détermine le titre d'ADN du HBV d'après les valeurs de Ct pour l'ADN du HBV et l'ADN du
standard de quantification HBV et des coefficients d'étalonnage spécifiques à chaque lot.
• Vérifie que les titres calculés en UI/ml pour HBV L(+)C et HBV H(+)C se trouvent dans les plages
assignées.
Validation de la série
Vérifier la fenêtre des résultats AMPLILINK ou les messages et commentaires du résultat imprimé
pour s'assurer de la validité de la série.
La série est valide si aucun message n'apparaît concernant les témoins COBAS® TaqMan® HBV.
La série n'est pas valide si l'un des messages suivants apparaît pour les témoins COBAS®
TaqMan® HBV :
Témoin négatif :
Message
Résultat
__N_NC_INVALID
Invalid
Interprétation
Un résultat non valide ou un
résultat « valide » qui n'était
pas négatif pour la cible HBV
Témoin HBV positif bas :
Message
Résultat
__L_LPCINVALID
< 6.00E+00 IU/mL
Témoin en dessous des limites
Target Not Detected
Titre numérique, X.XXE+XX IU/mL
Témoin hors limites
> 1.10E+08 IU/ml
Témoin au dessus des limites
Invalid
Résultat non valide
Témoin HBV positif haut :
Message
__H_HPCINVALID
Résultat
Interprétation
Interpretation
< 6.00E+00 IU/mL
Target Not Detected
Titre numérique, X.XXE+XX IU/mL
Témoin hors limites
> 1.10E+08 IU/mL
Témoin au- dessus des limites
Invalid
Résultat non valide
Si la série n'est pas valide, la recommencer complètement, y compris la préparation des échantillons et
des témoins, la transcription inverse, et l'amplification.
18
Interprétation des résultats :
Pour déterminer si une série est valide, vérifier les messages ou commentaires apparaissant sur l'imprimé
pour chaque échantillon. Interpréter les résultats comme suit :
⇒
Une série valide peut comprendre des résultats d'échantillons valides et non valides selon qu'un
échantillon donné est assorti de messages et/ou de commentaires.
Les résultats d'échantillons sont interprétés comme suit :
Commentaire
Target Not Detected
Cause
La valeur Ct du HBV dépasse la valeur limite du test ou aucune valeur
Ct pour le HBV n'a été obtenue. Fournit le résultat suivant : « ADN du
HBV non détecté ».
< 6.00E+00 IU/mL
Les UI/ml calculées sont inférieures à la plage du test. Fournit le résultat
suivant : « ADN HBV détecté, inférieur à 6 ADN HBV UI/ml ».
≥ 6.00E+00 IU/mL et
< 2.90E+01 IU/mL
Les valeurs IU/ml calculées se situent en dessous de la limite du
domaine linéaire du test. Ces résultats ont un degré élevé de variabilité
et par conséquent ne peuvent pas être considérés comme exacts. Ces
résultats doivent être interprétés avec prudence.
≥ 2.90E+01 IU/mL et
≤ 1.10E+08 IU/mL
Les résultats calculés supérieurs ou égaux à 29 IU/ml et inférieurs ou
égaux à 1,10E+08 IU/ml sont dans le domaine linéaire du test.
> 1.10E+08 IU/mL
Les UI/ml calculées sont supérieures à la plage du test.Fournit le résultat
suivant : « greater than 1.10E+08 HBV ADN IU/mL » (supérieur à
1,10E + 08 ADN HBV UI/ml). Si des résultats quantitatifs sont souhaités,
diluer l'échantillon d'origine dans du plasma ou sérum humain négatif
pour le HBV, selon la nature de l'échantillon d'origine, et reprendre le test.
Multiplier le résultat obtenu par le facteur de dilution.
REMARQUE : un échantillon se situant au dessus de la limite du test peut également produire un
résultat non valide accompagné du message : « QS_INVALID » . Si l'on souhaite obtenir des
résultats quantitatifs, il faut diluer l'échantillon d'origine dans du plasma ou sérum humain
HBV négatif, selon la nature de cet échantillon d'origine, et reprendre le test. Multiplier le
résultat rapporté par le facteur de dilution.
19
CONTROLE DE QUALITE
Chaque série de tests contenant jusqu'à 24 échantillons et témoins doit comprendre un exemplaire du
témoin négatif COBAS® TaqMan®, du témoin COBAS® TaqMan® HBV bas (+) et du témoin COBAS®
TaqMan® HBV élevé (+). Comme avec toute nouvelle procédure de laboratoire, les nouveaux utilisateurs
doivent prévoir d'utiliser des témoins supplémentaires du laboratoire chaque fois que le test est réalisé,
jusqu'à ce qu'ils aient atteint un certain degré de confiance en leur habilité à effectuer le test
correctement. Il n'existe aucune exigence particulière relative au positionnement des témoins dans le
porteur K. Vérifier les messages et commentaires du résultat imprimé de la série pour s'assurer que celleci est valide.
Témoin négatif
CTM (–) C doit produire le résultat « Target Not Detected », c'est à dire que la valeur Ct de l'ADN HBV
est supérieure à la valeur limite du test ou qu'aucune valeur Ct de l'ADN HBV n'a été obtenue, mais qu'une
valeur Ct valide a été obtenue pour l'ADN du standard de quantification du HBV. Si CTM (–) C ne satisfait
pas à ce critère, la série entière est non valide. Recommencer tout le processus (préparation des
échantillons et des témoins, amplification et détection). If CTM (–) C continue à ne pas être valide,
contacter le bureau Roche local pour assistance technique.
Témoins positifs
La plage assignée pour HBV L(+)C et HBV H(+)C est spécifique pour chaque lot de contrôles et est indiquée
sur la carte des valeurs de contrôles du test COBAS® TaqMan® HBV, fournie dans le kit. Ces plages de
valeur sont entrées dans la station de données du logiciel AMPLILINK
Les taux d'ADN du HBV (UI/ml) pour HBV L(+)C et HBV H(+)C doivent se trouver dans les limites indiquées
dans la carte des valeurs des témoins du test COBAS® TaqMan® HBV fournie avec le nécessaire. La série
entière n'est pas valide si un des témoins positifs ou les deux ne satisfont pas à ce critère. Recommencer
tout le processus (préparation des échantillons et des témoins, amplification et détection). Si le titre de l'ADN
du HBV calculé de l'un ou des deux témoins positifs se situe constamment en dehors des limites assignées,
contacter le bureau Roche local pour obtenir une aide technique.
PRECAUTIONS GENERALES
1.
Comme pour toute procédure de test, une bonne technique de laboratoire est essentielle au
déroulement correct du test. En raison de la sensibilité analytique élevée de ce test, il faut prendre
des précautions extrêmes pour préserver la pureté des réactifs du nécessaire ou des mélanges
d'amplification. La pureté de tous les réactifs doit être scrupuleusement contrôlée. Éliminer tout
réactif qui semble suspect.
LIMITES DU TEST
1.
L'emploi de ce test a été validé avec du sérum ou plasma humain prélevé sur EDTA. L'utiliser avec
des échantillons d'autre nature peut produire des résultats incorrects, des résultats faux négatifs
ou des faux positifs.
2.
Pour que les résultats obtenus soient fiables, il faut que les échantillons aient été prélevés,
transportés, conservés et traités de façon appropriée.
3.
La présence de l'enzyme AmpErase dans le mélange réactionnel HBV COBAS® TaqMan® HBV
réduit le risque de contamination de l'amplicon. Une contamination par des témoins et des
échantillons cliniques positifs pour le HBV ne peut toutefois être évitée que par un scrupuleux
respect des bonnes pratiques de laboratoire et des procédures décrites dans ce manuel de
méthodologie.
4.
L'utilisation de ce produit est réservée au personnel formé aux techniques de PCR.
5.
Ce produit ne peut être utilisé qu'avec l'analyseur COBAS® TaqMan® 48.
6.
La détection de l'ADN du HBV dépend du nombre de particules virales présentes dans l'échantillon
et peut être affectée par les méthodes de collecte d'échantillons et les facteurs relatifs aux patients
(par exemple, l’âge, la présence de symptômes et/ou le stade de l’infection).
7.
Bien qu'il s'agisse d'un cas rare, des mutations au niveau de la zone hautement conservée du
génome viral couverte par les amorces et/ou la sonde du test risquent d'entraîner une sousestimation de la quantification du virus ou l'échec de la détection du virus.
8.
En raison des différences inhérentes à chaque technologie, il est recommandé aux utilisateurs,
avant de passer d'une technologie à l'autre, de mener des études de corrélation de méthodes au
sein de leur laboratoire afin de quantifier les différences entre les diverses technologies.
20
SUBSTANCES INTERFERENTES
Il a été prouvé qu'un taux élevé de lipides, de bilirubine, d'albumine et d'hémoglobine dans les
échantillons ne perturbe pas le dosage de l'ADN du HBV par ce test.
Il a été également montré que les médicaments suivants n'interfèrent pas avec le dosage de l'ADN du
HBV par ce test.
Inhibiteurs nucléotidiques de
l'ADN polymérase
Adéfovir dipivoxil
Ténofovir disoproxil fumarate
Inhibiteurs nucléosidiques de la
transcriptase inverse et de l'ADN
polymérase
Lamivudine
Zidovudine
Zalcitabine
Stavudine
Abacavir
Inhibiteurs de protéase du HIV
Indinavir
Ritonavir
Nelfinavir
Saquinavir
Amprénavir
Lopinavir/Ritonavir
Inhibiteurs non nucléosidiques
de la transcriptase inverse du HIV
Névirapine
Efavirenz
Modulateurs de l'immunité
Interféron alpha-2a
Interféron alfa-2b
Inhibiteur de fusion du HIV
Enfuvirtide
Produits participant au traitement du CMV
Ganciclovir
Valganciclovir chlorhydrate
Acyclovir
Valacyclovir chlorhydrate
21
EVALUATION DES RESULTATS NON CLINIQUES
Description de l'étude
Les limites de détection du test COBAS® TaqMan® HBV ont été déterminées en analysant des dilutions
sérielles d'échantillons cliniques du HBV (génotypes A et D) dans du plasma EDTA et du sérum humains
HBV-négatifs. Par ailleurs, la précision et la linéarité du test COBAS® TaqMan® HBV ont été déterminées
en analysant des dilutions sérielles d'échantillons cliniques de HBV (génotypes A et D) uniquement dans
du plasma EDTA humain HBV-négatif. La concentration du HBV (exprimée en copies/ml) dans les
échantillons cliniques a été déterminée par le test COBAS® AMPLICOR® MONITOR HBV pour des
dilutions situées à l'intérieur des limites de ce test, puis cette concentration a été multipliée par le facteur
de dilution. La concentration mesurée dans les dilutions a été convertie en unités internationales (UI/ml)
grâce au facteur de conversion entre unités/ml de l'OMS et copies/ml d'ADN du HBV ; ce facteur de
conversion a été déterminé à l'aide du test COBAS® AMPLICOR® MONITOR HBV et le test COBAS®
TaqMan® HBV.
A.
Limite de détection
Les études décrites ci-dessous démontrent que le test COBAS® TaqMan® HBV peut détecter de l'ADN
du HBV dans du plasma EDTA et dans du sérum à des concentrations aussi faibles que 5,9 UI/ml avec
un taux de positivité supérieur à 95 %. La concentration d'ADN du HBV, pouvant être détectée à un taux
de positivité supérieur à 95 % par la méthode des probits est de, respectivement, 4,8 UI/ml et de 6,7
UI/ml dans le plasma EDTA et dans le sérum.
Tableau 1
Limite de détection du test COBAS® TaqMan® HBV dans le plasma EDTA
Titre nominal
(ADN du HBV UI/ml)
Nbre de réplicats
Nbre de positifs
Taux de positivité
12,9
120
120
100 %
8,6
120
118
98 %
6,0
120
119
99 %
3,4
120
105
88 %
1,7
120
99
83 %
0,9
120
67
56 %
0,4
120
57
48 %
Valeur en probit à 95 %
4,8 UI/ml [Intervalle de confiance à 95 % : 3,1 - 9,9 UI/ml]
Tableau 2
Limite de détection du test COBAS® TaqMan® HBV dans le sérum
Titre nominal
(ADN du HBV UI/ml)
Nbre de réplicats
Nbre de positifs
Taux de positivité
12,9
120
120
100 %
8,6
117
110
94 %
6,0
114
111
97 %
3,4
120
103
86 %
1,7
114
73
64 %
0,9
120
47
39 %
0,4
120
28
23 %
Probit 95% Hit Rate
6,7 UI/ml [Intervalle de confiance à 95 % : 4,7 - 11,1 UI/ml]
22
B.
Précision
La précision (totale, intra-sérielle et inter-sérielle) a été calculée conformément aux méthodes définies
dans la recommandation EP5-A CLSI : « Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry
Devices »33. Cette procédure permet de déterminer à la fois la précision totale et la précision intra-sérielle
sur la base des résultats d'une seule étude menée sur plusieurs jours et par des techniciens différents.
Une série consistant en 3 réplicats de chaque échantillon a été exécutée quotidiennement pendant 15
jours. Chaque échantillon a été soumis au test COBAS® TaqMan® HBV dans son entier, y compris la
préparation, l'amplification et la détection des échantillons. En conséquence, la précision rapportée ici
est représentative de tous les aspects de la procédure. L'étude a utilisé trois lots de réactifs du test
COBAS® TaqMan® HBV ; les résultats combinés sont présentés dans le tableau 3 (UI/ml ADN du HBV)
et dans le tableau 4 (log10 UI/ml ADN du HBV).
Tableau 3
Précision du test COBAS® TaqMan® HBV (en UI/ml)
Échantillon
7
8
9
10
Titre moyen
1,07E8 5,33E7 1,04E7 8,52E5 9,28E4 1,21E4
d'ADN-HBV(UI/ml)
1200
111
49
14
CV intra-sérielle
19 %
10 %
12 %
7%
14 %
16 %
14 %
22 %
27 %
50 %
CV inter-sérielle
11 %
14 %
12 %
14 %
16 %
18 %
18 %
26 %
17 %
22 %
CV totale
23 %
17 %
17 %
16 %
22 %
24 %
22 %
34 %
32 %
54 %
Nbre total de
réplicats
132
134
134
135
135
134
135
135
135
135
9
10
Échantillon
Titre moyen
d'ADN-HBV
(Log10 UI/ml)
1
2
3
4
5
6
Tableau 4
Précision du test COBAS® TaqMan® HBV (en log10 UI/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
8,02
7,72
7,01
5,92
4,94
4,06
3,07
2,03
1,67
1,05
0,07
0,04
0,05
0,03
0,21
0,18
0,06
0,09
0,11
0,59
Ecart-type intersériel
0,05
0,06
0,05
0,06
0,07
0,07
0,08
0,10
0,07
0,00
Ecart-type total
0,08
0,07
0,07
0,07
0,22
0,19
0,10
0,13
0,13
0,59
Ecart-type intrasériel
23
C.
Linéarité du test
Comme le montre le tableau 8, le test COBAS® TaqMan® HBV s'est avéré fournir une réponse linéaire
comprise entre 29 (Log10 = 1,46) UI/ml d'ADN du HBV et au moins 1,10E8 (Log10 = 8,02) UI/ml d'ADN
du HBV. L'étude a été réalisée à l'aide de trois lots de réactifs du test COBAS® TaqMan® HBV,
comportant de 131 à 135 réplicats par stade.
Nécessaire pour acide nucléique viral High
Pure/Résultat du test COBAS® TaqMan® HBV
Log10 (ADN du HBV en UI/ml)
Figure 8
Linéarité du test COBAS® TaqMan® HBV
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
y = 1,0124x - 0,2358
2
R = 0,9989
Barres d'erreur = 1 écart-type
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Concentration nominale
Log10 (ADN du HBV UI/ml)
D.
Génotypes inclus
Sur la base d'une divergence nucléotidique de plus de 8 % de la composition du génome, on a proposé
de classer les HBV en sept groupes génotypiques34,35. Ces génotypes sont désignés par des lettres
majuscules, de A à G. Les génotypes HBV ont une répartition géographique particulière36.
La performance du test COBAS® TaqMan® HBV sur les génotypes HBV a été évaluée par l'analyse de
22 ADN plasmidiques quantifiés, linéarisés et purifiés contenant des inserts séquentiels représentatifs de
génotypes A à G (Cf. Tableau 5). En outre, un plasmide représentant la mutation fréquente G/A du prénoyau en position 1896 a été testé. Chaque ADN plasmidique a été dilué à des concentrations de 15,
1 500, 1,5E5 et 1,5E8 copies par PCR. Chaque dilution a été co-amplifiée avec de l'ADN du standard de
quantification (QS DNA) et analysée en 3 exemplaires à l'aide du test COBAS® TaqMan® HBV. Les titres
de tous les plasmides ont été comparés avec celui d'un ADN plasmidique témoin (pc).
Le test COBAS® TaqMan® HBV a produit des résultats équivalents pour les 23 ADN plasmidiques (cf.
Figure 9) ; tous les génotypes et la mutation de pré-noyau ont présenté une bonne concordance, pour
le nombre de copies, entre eux et avec l'ADN plasmidique témoin.
24
Tableau 5
Test COBAS® TaqMan® HBV
Test d'inclusivité - ADN plasmidique typé testé
Désignation (plasmid)
Génotype
Origine de la souche
p8423-c1
A
Indes
p1115-c1
A
Burundi
p3952-c1
A
Cameroun
p4199-c2
A
Norvège
p1764-c1
B
Chine
p1767-c1
B
Chine
p3958-c1
B
Asie de l'Est
p830-c1
B
Iles de la Société
p3982-c1
B
Vietnam
p1786-c1
C
Chine
p11549-1
C
Bangladesh
p3872-c1
D
Iran
p1103-c1
D
Tunisie
p3953-c2
D
Afrique du Nord
p18-c1
D
Suède
p30893-5
D
Suède
p4244-c1
D
Danemark
p3217-c1
E
Sénégal
p3963-c2
E
Niger
p9203-c1
F
Colombie
p479-c1
F
Venezuela
p1009-c1
F
Espagne
p00042975-4
G
États-Unis
pIT1896
Pré-noyau
Italie
25
Nombre moyen de copies
Log10 ADN du HBV/PCR (n = 3)
Figure 9
Performance du test COBAS® TaqMan® HBV sur les génotypes
A à G du HBV et un mutant de pré-noyau
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
A
B
C
D
E
F
G
Témoin
Plasmide
Mutant de pré-noyau
E.
Spécificité clinique
La spécificité clinique du test COBAS® TaqMan® HBV a été déterminée par l'analyse de sérum et de
plasma EDTA HBV-négatifs de donneurs de sang. Un total de 220 échantillons (110 échantillons de
plasma EDTA et 110 échantillons de sérum), AgHBs et anti-HBc-négatifs, ont été testés. Tous les
échantillons ont été négatifs pour l'ADN HBV. Sur la base de ces résultats, la spécificité clinique du test
COBAS® TaqMan® HBV est 100 %.
F.
Spécificité analytique
La spécificité analytique du test COBAS® TaqMan® HBV a été évaluée en ajoutant un virus de culture au
plasma EDTA humain HBV-négatif ou en analysant des échantillons provenant de patients infectés (Cf.
Tableau 6). Aucun des virus ADN ou ARN non-HBV testés n'a été positif pour l'ADN du HBV.
Tableau 6
Échantillons de spécificité analytique
Virus ajoutés au plasma
Échantillons de patients infectés (n)
Adénovirus type 7
Patients infectés par le cytomégalovirus (2)
Cytomégalovirus AD-169
Patients infectés par le virus d'Epstein-Barr (2)
Virus d'Epstein-Barr
(lymphome de Burkitt)
Patients infectés par le virus de l'hépatite A (2)
Virus de l'hépatite A PA 21
Patients infectés par le génotype 4 du virus de l'HBC (1)
Herpes simplex type 1, MacIntyre
Patients infectés par le génotype 6a du virus de l'HBC (1)
Herpes simplex type 2, MS
Patients infectés par le HIV-1 (2)
Cellules HTL V-1
Virus grippal A/Hong Kong/8/68
Virus grippal B B/R75
Virus varicelle-zona Ellen
Virus West Nile
26
G.
Performance comparée au test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR
Les performances du test COBAS® TaqMan® HBV et du test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR ont
été comparées par l'analyse d'échantillons de sérum et de plasma de sujets infectés par le HBV. Les
échantillons ont été obtenus auprès de Teragenix (Fort Lauderdale, Floride) et de Serologicals Corporation
(Norcross, Géorgie). Au total, 65 échantillons au total ont été dupliqués et analysés par les deux tests :
les résultats moyens ont été comparables. Les échantillons produisant des résultats supérieurs à la plage
linéaire avaient été dilués avant analyse et les résultats ont été multipliés par le facteur de dilution pour
obtenir le titre de l'échantillon d'origine. Les titres en UI/ml obtenus à l'aide du test COBAS® TaqMan®
HBV ont été convertis en copies/ml par multiplication d'un facteur de conversion de 5,82 copies/UI d'ADN
HBV. L'analyse de régression linéaire a été effectuée sur les échantillons contenant au moins 500
copies/ml selon les deux test. La corrélation entre les résultats obtenus avec le test COBAS® TaqMan®
HBV et le test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR est très élevée, comme l'indique la Figure 10.
Nécessaire pour acide nucléique viral High Pure
Test COBAS® TaqMan® HBV
Nombre moyen de copies/ml d'ADN du HBV Log10
Figure 10
Corrélation entre le test COBAS® TaqMan® HBV et le test
COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR sur des échantillons
de sérum et de plasma de patients infectés par le HBV.
10,0
9,0
y = 0,9327x + 0,4855
2
R = 0,977
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
Test COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR
Nombre moyen de copies/ml d'ADN du HBV Log10
27
10,0
BIBLIOGRAPHIE
1.
Lee. W. 1997. Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337:1733-1745.
2.
Beasley, R.P. 1988. Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer.
61:1942-1956.
3.
Wong, D.H.K., Cheung, A.M., Orourke, K., et al. 1993. Effect of alpha-interferon treatment in
patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal
Medicine. 119:312-323.
4.
Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D. 1999. Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look
promising. British Medical Journal. 319:799-800.
5.
McMahon, B.J. 1998. Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen:
Are they really "off the hook"? Hepatology. 28:265-267.
6.
Huo, T., Wu, J., Lee, P., et al. 1998. Sero-clearance of hepatitis b surface antigen in chronic carriers
does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28:231-236.
7.
Niederau, C., Heintges, T., Lange, S., et al. 1996. Long-term follow-up of HBeAg-positive patients
treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334:14221427.
8.
Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G., et al. 1997. Long term outcome of hepatitis B e antigenpositive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26:13381342.
9.
Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C. 1992. The clinical significance of molecular variation
within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15:144-148.
10.
Hoofnagle, J.H. 1990. Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B.
recommendations. Hepatology. 11:S100-S107.
11.
Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J., et al. 1985. Hepatitis B virus DNA in sérum from patients
with acute hepatitis B. Hepatology. 5:10-13.
12.
Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F., et al. 1996. The value of quantitative détection of HBV-DNA
amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24:680-685.
13.
Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M., et. al. 1997. Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase
chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus
carriers. American Journal of Gastroenterology. 92:119-123.
14.
Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R., et al. 1995. Quantification of hepatitis B virus DNA over a
wide range from sérum for studying viral replicative activity in response to treatment and in
recurrent infection. Hepatology. 21:1492-1499.
15.
Mason, A.L., Xu, L., Guo, L., et al. 1998. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection
in the liver after clearance of sérum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27:1736-1742.
16.
Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T., et al. 1999. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B
viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology.
58:325-331.
17.
Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G., et al. 1989. Natural course and response to interferon of
chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10:198-202.
18.
Saracco, G., Mazella, G., Rosina, F., et al. 1989. A controlled trial of human lymphoblastoid
interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10:336-341.
19.
Perillo, R., Schiff, R., Davis, G., et al. 1990. A randomized controlled trial of interferon alpha-2b
alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England
Journal of Medicine. 323:295-301.
20.
Perez, V., Tanno, H., Villamil, F., et al. 1990. Recombinant interferon alfa-2b following prednisone
withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S117.
21.
Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M., et al. 1997. Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis
B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology.
25:241-244.
22.
Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V., et al. 1999. The role of HBV DNA quantitative PCR in
monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of
Hepatology. 30:965-969.
28
Current status and
23.
Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K. and Papakonstantinou, A. 1999. Oral ganciclovir treatment in
chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31:210-214.
24.
Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G., et al. 2003. Adefovir dipivoxil for the treatment of Hepatitis B
e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348:808-816.
25.
Puchhammer-Stöckl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J., et al. 2000. Monitoring the virus load can
predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during
lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181:2063-2066.
26.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
27.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and
détection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
28.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K. and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome
Research 6:986-994.
29.
Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A. and the WHO Collaborative
Study Group. 2001. An international collaborative study to establish a World Health Organization
international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox
Sanguinis 80:63-71.
30.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
31.
CLSI. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids,
and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
32.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
33.
CLSI. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guidelines.
CLSI Document EP5-A Wayne, PA: CLSI, 1999.
34.
Okamoto, H., Tsuda, F., Sakugawa, H., Sastrosowignjo, R.I., Imai, M., Miyakawa, Y. and Mayumi,
M. 1988. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface
antigen subtypes. Journal of General Virology 69:2575-2583.
35.
Norder, H., Hammas, B., Löfdahl, S., Couroucé, A.M. and Magnius, L.O. 1992. Comparison of the
amino acid sequences of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the
corresponding hepatitis B virus strains. Journal of General Virology 73:1201-1208.
36.
Norder, H., Hammas, B., Lee, S.-D., Bile, K., Couroucé, A.M., Mushahwar, I.K. and Magnius, L.O.
1993. Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural
variations in the primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74:13411348.
29
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit est fabriqué pour :
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Société du groupe Roche
"
Distributed by
COBAS® TaqMan® HBV Test est fabriqué par :
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA
Société du groupe Roche
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
ROCHE, AMPLICOR, AMPERASE, AMPLILINK, TAQMAN, COBAS et HIGH PURE sont des marques
commerciales de Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER est une marque de service de Roche.
ProClin une marque commerciale déposée de Rohm and Haas Company.
Microsoft et Windows XP sont des marques déposées ou de commerce de Microsoft Corporation aux
États-Unis et/ou autres pays.
BD SST est une marque commerciale déposée de Becton Dickinson and Company.
Copyright 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Tous droits réservés.
9/2007
Doc Rev. 4.0
03584933001-04
30

COBAS TaqMan® HBV Test

Transcription

Documents pareils

Hépatite B chronique

Faites entrer un rayon de soleil dans votre quotidien

Tribune de Montélimar

DNA Script - Réseau Entreprendre Sud Ile-de

cobas 6800 - Roche Diagnostics France

N° lot Désignation Gagnant 1 XBOX Belhomme

DEFENDER DPSMCHD5