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UNIVERSITE PARIS 7 – DENIS DIDEROT
UFR BIOLOGIE ET SCIENCES DE LA NATURE
THESE
pour l'obtention du Diplôme de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS 7
SPECIALITE : Génétique, Immunologie, Infectiologie et Développement
présentée et soutenue publiquement
par
Mlle Stéphanie GROSSE
le 9 septembre 2004
Titre :
Trafic intracellulaire de complexes plasmide/
polymères cationiques glycosylés dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines :
application à la thérapie génique de la mucoviscidose
JURY
Pr. Jacques ELION,
Pr. Germain TRUGNAN,
Dr. Bruno PITARD,
Dr. John TCHELINGERIAN,
Pr. Michel MONSIGNY,
Dr. Isabelle FAJAC,
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
REMERCIEMENTS
Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire de Physiologie Respiratoire
(Directeur : Professeur Anh-Tuan DINH-XUAN) à la Faculté de Médecine de Cochin à
Paris sous la direction du Docteur Isabelle FAJAC et en collaboration avec le Laboratoire
de Glycobiologie du CNRS d’Orléans dirigé par le Professeur Michel MONSIGNY.
Je tiens à exprimer mes plus sincères remerciements :
Au Docteur Isabelle FAJAC, qui m’a chaleureusement accueillie au sein de son
équipe, qui a su me faire confiance tout au long de ces années même pendant mes
périodes de doute, pour m’avoir fait bénéficier de ses nombreuses connaissances
scientifiques, de sa rigueur et de sa persévérance, pour sa grande disponibilité et ses
qualités humaines,
Au Professeur Michel MONSIGNY, pour sa précieuse collaboration et la confiance
qu’il nous témoigne depuis plusieurs années, pour ses nombreux conseils scientifiques et
pour avoir accepté d’examiner cette thèse,
Aux autres membres du jury, le Professeur Jacques ELION, qui m’a fait l’honneur
d’accepter la présidence du Jury de cette thèse ; le Professeur Germain TRUGNAN et le
Docteur Bruno PITARD, qui ont bien voulu examiner et juger ce travail et me faire
l’honneur d’en être les rapporteurs et Monsieur le Président John TCHELINGERIAN de la
société DIATOS, pour avoir accepté de participer à cette thèse en tant qu’examinateur,
Au Docteur Pascale BRIAND, qui a co-dirigé ce travail pendant les premières
années de cette thèse et qui a su me faire confiance, pour ses nombreux conseils dans
l’avancement de nos travaux de recherche,
Aux membres du laboratoire, Madame Guiti THEVENOT et Madame Yolande
ARON, pour leur précieuse aide dans l’avancement de ce projet, leur gentillesse et leur
bonne humeur quotidienne qui ont contribué à rendre ces années de thèse agréables ; le
Docteur Isabelle HONORE, que j’ai été enchantée de connaître pour son grand
optimisme ; le Docteur Dominique FRANÇOIS, pour toute son aide, sa disponibilité sans
limite et pour m’avoir transmis ses connaissances en microscopie électronique avant son
départ à la retraite ; le Docteur Jean-Christophe ALLO, le Docteur Florence FAVATIER, le
Docteur Maria BACHELET et Madame Evelyne SOUIL, pour l’aide qu’ils ont pu m’apporter
pendant cette thèse,
A toute l’équipe du Professeur Michel MONSIGNY et plus particulièrement, au
Docteur Annie-Claude ROCHE, au Docteur Christine RONDANINO et au Docteur Natacha
FRISON, pour leur collaboration fructueuse depuis plusieurs années, et au Docteur Patrick
MIDOUX, pour ses conseils au début de ce travail,
A Mademoiselle Isabelle BOUCHAERT, pour son aide technique lors des premières
analyses en microscopie confocale,
A Madame Brigitte CHANAUD et à Madame Laurence STOUVENEL, pour leur aide
en cytomètrie de flux,
A l’Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire à Strasbourg et plus
particulièrement, au Docteur Jean-Marc EGLY, pour ses conseils et au Docteur Alexandre
TREMEAU-BRAVARD, pour son temps passé à la technique de transcription in vitro,
Au Laboratoire de Physiopathologie et Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire à
l’Hôpital Hôtel-Dieu à Nantes pour leur accueil pendant quelques jours et plus
particulièrement, au Docteur Hélène POLLARD, pour m’avoir enseigné la technique de
microinjection cellulaire,
A l’Institut de Myologie à la Pitié-Salpêtrière à Paris et plus particulièrement à
Madame Andrée ROUCHE et à Monsieur Philippe BOZIN, pour leur précieuse
collaboration et leur aide en microscopie électronique,
Au Professeur Elisabeth CRAMER du Département d’Hématologie à l’Institut
Cochin et au Docteur Graça RAPOSO du Laboratoire de Microscopie Electronique des
Compartiments Cellulaires à l’Institut Curie, pour leur aide lors de l’analyse des photos en
microscopie électronique,
Au Docteur Claire DANEL, pour son aide dans la collecte des tissus bronchiques,
A Madame Michelle LIU et à Mademoiselle Murielle DAMBO, pour leur gentillesse
et leur efficacité administrative,
A l’Association Vaincre la Mucoviscidose, pour son soutien depuis le début de ce
projet et à la Fondation pour la Recherche Médicale, pour avoir accepté de financer les
derniers mois de cette thèse,
A tous ceux que j’aurais pu oublier,
Et enfin, à mes amis, à toute ma famille et surtout à Fabien, pour leur soutien
quotidien, la confiance et les encouragements qu’ils me témoignent depuis le début de
mes projets.
ABRÉVIATIONS
Å
angstrom (1 Å = 0,1 nm)
AAV
Adeno-Associated Virus, virus associé à l’adénovirus
ABC
ATP binding cassette
Ad
adénovirus
ADA
adénosine déaminase
ADN
acide désoxyribonucléique
ADNc
ADN complémentaire
aGM1
asialoganglioside 1
α1-AT
alpha1-antitrypsine
AMPc
adénosine monophosphate cyclique
ARNm
acide ribonucléique messager
ASOR
asialo-orosomucoïde
ATP
adénosine 5’-triphosphate
BET
bromure d'éthydium
BGSC
bis(guanidiniun)-spermidine-cholestérol
BGTC
bis(guanidinium)-tren-cholestérol
BIV
Bovine Immunodeficiency Virus
BSA
Bovine Serum Albumin, albumine sérique bovine
CAR
Coxsackievirus and Adenovirus Receptor
CBP
carbohydrate-binding proteins
CFTR
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
CGN
cis-Golgi network, saccule cis de l’appareil de Golgi
Cl-
ions chlorures
CLIP170
cytoplasmic linker protein 170
COP
coat protein
CPX
8-cyclopentyl-1,2-dipropylxanthine
Da
Dalton
DC-Chol
3[N-(N’,N’-diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol
DDAB
bromure de diméthyl-dioctadécylammonium
DMP 777
[S-R*,S*]-N[1-(1,3-benzodioxol-5-yl)butyl]-3,3-diethyl-2-[4-[(4-methyl-1piperazinyl)carbonyl]phenoxy]-4-oxo-1-azetidinecarboxamide
DMPTA
dimyristoleoyl phosphonomethyl trimethyl ammonium
DMRIE
dimyristyloxypropyl-3-diméthyl-hydroxyéthylammonium
DMSO
dimethyl sulfoxide
DNase I
désoxyribonucléase I
DOGS
dioctadécylamine-glycine-spermine
DOPE
dioléoylphosphatidyléthanolamine
DOSPA
2,3-dioléyloxy-N-2-(spermine-carboxamido)éthyl-N,N-diméthyl-1propanammonium
DOTAP
méthylsulfate de dioléyloxypropyl-triméthylammonium
DOTMA
chlorure de dioléyloxypropyltrimethyl-ammonium
EDMPC
p-ethyl-dimyristoylphosphaditylcholine
ENaC
Epithelial Sodium Channel
ER
Endoplasmic Reticulum
EV
Endosomal Vesicle, vésicule endosomale
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
FIV
Feline Immunodeficiency Virus
GAP
GTPase activating protein
GDP
guanosine diphosphate
GFP
Green Fluorescent Protein
GTP
guanosine triphosphate
HBS
HEPES Buffered Saline
HEPES
N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethane-sulfonic acid]
HIV
Human Immunodeficiency Virus
Hsp 70
Heat shock protein 70, protéine de choc thermique inductible
HSPGs
protéoglycanes héparanes sulfates
HVJ
Haemagglutinating Virus of Japan (Sendai virus)
Ig
Immunoglobuline
INS37217
P(1)-(uridine 5')-P(4)-(2'-deoxycytidine 5')tetraphosphate, tetrasodium salt
kb
kilobase
L
lysosome
LAMP1
lysosomal-associated membrane protein
LDLs
Low Density Lipoproteins
LE
Late Endosome, endosome tardif
Luc
Luciférase
M
macropinosome
MDR
Multi Drug Resistance P-glycoprotein
MLV
Murine Leukemia Virus
Mo-MLV
virus de la leucémie murine de Moloney
MVB
multivesicular body, corps multivésiculaire
NBD
Nucleotide Binding Domain
NLS
Nuclear Localization Signal, signal de localisation nucléaire
N/P
nombre de charges positives des groupes amines du polymère cationique/
nombre de charges négatives du groupe phosphate de l’ADN plasmidique
NPC
Nuclear Pore Complex, complexe du pore nucléaire
ORCC
Outwardly Rectifying Chloride Channel
pb
paire de bases
PEI
polyéthylèneimine
PEI-Lac
polyéthylèneimine lactosylé
PEG
polyéthylène glycol
pfu
plaque forming unit
pLK
polylysine
R
regulator
rAAV
AAV recombinant
rAd
adénovirus recombinant
Ran
ras related nuclear protein
RCC1
Regulator of Chromosome Condensation 1
RE
réticulum endoplasmique
REG
réticulum endoplasmique granulaire
REL
réticulum endoplasmique lisse
RGD
Arginine-Glycine-Asparagine
RNP
ribonucléoprotéiques
ROMK2
Renal Outer Medullary Potassium Channel
RRL
Rabbit Reticulocyte Lysate, extraits cytosoliques de reticulocytes de lapin
RT-PCR
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
SCID-X1
déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X
SEC
serpin-enzyme complex
SV40
Simian Virus 40, virus simien 40
TGN
trans-Golgi network, saccule trans de l’appareil de Golgi
TMD
Transmembrane Domain
TRITC
Tetramethylrhodamine Isothiocyanate
UTP
uridine-5’-triphosphate
WGA
Wheat Germ Agglutinin, agglutinine de germe de blé
SOMMAIRE
INTRODUCTION .................................................................................12
I - GENERALITES...............................................................................19
1 - LA MUCOVISCIDOSE .............................................................................................20
1 - 1 - LA MALADIE.................................................................................................20
1 - 1 - 1 - Epidémiologie......................................................................................20
1 - 1 - 2 - Aspects cliniques ................................................................................20
a) L’atteinte respiratoire : ..............................................................................21
b) Les autres atteintes cliniques : .................................................................21
1 - 2 - LE GENE ET LA PROTEINE CFTR..............................................................22
1 - 2 - 1 - Le gène CFTR.....................................................................................22
1 - 2 - 2 - Structure de la protéine CFTR et son activation..................................23
1 - 2 - 3 - L’expression de la protéine CFTR.......................................................25
1 - 2 - 4 - Les fonctions de la protéine CFTR......................................................25
1 - 2 - 5 - Les mutations du gène CFTR et leurs conséquences sur la protéine .27
1 - 3 - LES TRAITEMENTS ACTUELS DE LA MALADIE ET LES RECHERCHES
PHARMACOLOGIQUES.........................................................................................30
2 - LA THERAPIE GENIQUE ........................................................................................34
2 - 1 - GENERALITES.............................................................................................34
2 - 2 - LES VECTEURS DE TRANSFERT DE GENES...........................................36
2 - 2 - 1 - Les vecteurs viraux .............................................................................36
a) Généralités : .............................................................................................36
b) Les vecteurs rétroviraux : .........................................................................38
c) Les vecteurs lentiviraux : ..........................................................................39
d) Les vecteurs adénoviraux :.......................................................................40
e) Les vecteurs AAVs : .................................................................................41
2 - 2 - 2 - Les vecteurs synthétiques...................................................................43
a) Les lipides cationiques : ...........................................................................43
Les lipides monocationiques : ..............................................................46
Les lipides polycationiques :.................................................................46
Les dérivés du cholestérol :..................................................................47
b) Les polymères cationiques : .....................................................................48
Les dérivés de polylysine : ...................................................................49
Les dérivés de polyéthylèneimines :.....................................................52
Les dendrimères :.................................................................................53
Les nanosphères polymèriques : .........................................................54
2 - 2 - 3 - Synthèse .............................................................................................55
2 - 3 - LES ESSAIS CLINIQUES : GENERALITES .................................................56
2 - 4 - LA THERAPIE GENIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE ..................................57
2 - 4 - 1 - Les cellules cibles ...............................................................................57
2 - 4 - 2 - Les modèles animaux .........................................................................58
2 - 4 - 3 - Les études pré-cliniques .....................................................................59
a) A l’aide de vecteurs viraux :......................................................................59
b) A l’aide de vecteurs synthétiques : ...........................................................62
2 - 4 - 4 - Les essais cliniques ............................................................................64
a) A l’aide de vecteurs adénoviraux :............................................................65
b) A l’aide de vecteurs AAVs : ......................................................................66
c) A l’aide de lipides cationiques :.................................................................67
d) A l’aide de polymères cationiques : ..........................................................68
e) Le bilan des essais cliniques : ..................................................................69
3 - LES ETAPES CELLULAIRES DU TRANSFERT DE GENES A L’AIDE DE
VECTEURS SYNTHETIQUES ......................................................................................70
3 - 1 - GENERALITES.............................................................................................70
3 - 2 - LA FORMATION DES COMPLEXES ...........................................................71
3 - 2 - 1 - Généralités..........................................................................................71
3 - 2 - 2 - La caractérisation des complexes .......................................................72
a) Caractérisation des lipoplexes :................................................................72
b) Caractérisation des polyplexes :...............................................................75
3 - 3 - L’ENTREE DES COMPLEXES DANS LA CELLULE....................................79
3 - 3 - 1 - Les différentes voies d’entrée cellulaire ..............................................79
a) Généralités : .............................................................................................79
b) L’endocytose dépendante de la clathrine : ...............................................80
c) La micropinocytose :.................................................................................82
d) La potocytose : .........................................................................................82
e) La phagocytose : ......................................................................................84
f) La macropinocytose : ................................................................................86
3 - 3 - 2 - Les "marqueurs" et les inhibiteurs des différentes voies d’entrée
cellulaire .............................................................................................................87
3 - 3 - 3 - Le mode d’entrée cellulaire des lipoplexes .........................................88
3 - 3 - 4 - Le mode d’entrée cellulaire des polyplexes ........................................90
3 - 4 - L’ECHAPPEMENT ENDOSOMAL DES COMPLEXES ................................92
3 - 4 - 1 - Le devenir de particules endocytées : généralités ..............................92
3 - 4 - 2 - Les agents endosomolytiques.............................................................93
a) Les lipides déstabilisants :........................................................................94
b) Les agents lysosomotropiques : ...............................................................94
c) Les virus inactivés : ..................................................................................94
d) Les peptides fusogènes :..........................................................................95
3 - 4 - 3 - L’échappement endosomal des lipoplexes .........................................96
3 - 4 - 4 - L’échappement endosomal des polyplexes ........................................98
3 - 5 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES .....................................................100
3 - 6 - LES NUCLEASES CYTOSOLIQUES .........................................................101
3 - 7 - LE TRAFIC CYTOSOLIQUE.......................................................................102
3 - 8 - L’ENTREE NUCLEAIRE .............................................................................103
3 - 8 - 1 - Le noyau et les pores nucléaires : généralités ..................................103
3 - 8 - 2 - L’importation nucléaire de protéines NLS .........................................104
3 - 8 - 3 - L’importation nucléaire d’un ADN thérapeutique ...............................105
3 - 8 - 4 - Les stratégies d’amélioration de l’importation nucléaire d’un ADN
thérapeutique....................................................................................................108
a) L’addition de peptides NLS :...................................................................108
b) L’addition d’osides : ................................................................................109
3 - 9 - L’EXOCYTOSE...........................................................................................111
3 - 9 - 1 - La sécrétion contrôlée ou constitutive à partir du TGN .....................111
3 - 9 - 2 - La sécrétion exosomale à partir des MVBs .......................................113
3 - 10 - SYNTHESE...............................................................................................115
II - BUT DE L’ETUDE ........................................................................118
III - RESULTATS ..............................................................................120
1 - ARTICLE 1 : « Intracellular rate-limiting steps of gene transfer using
glycosylated polylysines in cystic fibrosis airway epithelial cells ».....................121
2 - ARTICLE 2 : « Lactosylated polyethylenimine for gene transfer into airway
epithelial cells: role of the sugar moiety in cell delivery and intracellular
trafficking of the complexes » ..................................................................................130
3 - ARTICLE 3 : « Potocytosis and cellular exit of complexes may limit the
efficiency of gene transfer by polycations » ...........................................................144
4 - RESULTATS COMPLEMENTAIRES.....................................................................174
4 - 1 - MECANISME D’ENTREE DANS LE NOYAU .............................................174
4 - 2 - ROLE DU CYTOSQUELETTE....................................................................179
IV - DISCUSSION GENERALE ...........................................................186
1 - ETAPES CELLULAIRES DU TRANSFERT DE GENES A L’AIDE DE
POLYLYSINES GLYCOSYLEES DANS LES CELLULES EPITHELIALES DES
VOIES AERIENNES HUMAINES................................................................................187
1 - 1 - L’ENTREE CELLULAIRE............................................................................187
1 - 2 - L’ECHAPPEMENT ENDOSOMAL ..............................................................189
1 - 3 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES .....................................................189
1 - 4 - L’ENTREE NUCLEAIRE .............................................................................190
1 - 5 - L’EXOCYTOSE...........................................................................................190
1 - 6 - SYNTHESE.................................................................................................191
2 - ROLE DES RESIDUS DE LACTOSE SUR L’ENTREE ET LE TRAFIC
INTRACELLULAIRE DE COMPLEXES PLASMIDE/PEI LACTOSYLE DANS DES
CELLULES EPITHELIALES DES VOIES AERIENNES HUMAINES .........................193
2 - 1 - LE MECANISME D’ENDOCYTOSE ...........................................................194
2 - 2 - LE POUVOIR ENDOSOMOLYTIQUE ........................................................195
2 - 3 - LE TRAFIC CYTOSOLIQUE.......................................................................196
2 - 4 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES .....................................................196
2 - 5 - LE MECANISME D’ENTREE NUCLEAIRE.................................................197
2 - 6 - LA SORTIE DES COMPLEXES..................................................................198
2 - 7 - SYNTHESE.................................................................................................198
V - CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................201
VI - BIBLIOGRAPHIE ........................................................................205
VII - ANNEXES ................................................................................242
1 - ANNEXE 1 : Revue ...............................................................................................243
2 - ANNEXE 2 : Revue ...............................................................................................246
3 - ANNEXE 3 : Résumé sélectionné pour une présentation orale .......................256
4 - ANNEXE 4 : Résumé sélectionné pour une présentation orale .......................257
5 - ANNEXE 5 : Article ...............................................................................................258
Stéphanie Grosse, 2004
INTRODUCTION
12/269
INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
La mucoviscidose est une maladie monogénique, autosomique et récessive grave
due à des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance
Regulator) qui code pour un canal pour les ions chlorures, la protéine CFTR. Elle se
manifeste, entre autres, par une insuffisance respiratoire qui conditionne le pronostic vital.
Elle n'est traitée actuellement que de façon symptomatique mais depuis la découverte du
gène et de son produit, la thérapie génique semble un traitement envisageable.
La thérapie génique consiste à introduire dans les cellules cibles le gène
thérapeutique où il devra efficacement être transcrit puis traduit afin qu’il y ait synthèse de
la protéine thérapeutique. Dans le cas de la mucoviscidose, cette approche thérapeutique
consiste à introduire l’ADN complémentaire du gène CFTR normal dans les cellules
épithéliales des voies aériennes, afin qu’il y ait expression d’une protéine CFTR normale
et correction des anomalies de transport ionique. Cependant, pour pouvoir pénétrer à
travers la membrane plasmique cellulaire qui est constituée d’une bicouche lipidique
chargée négativement, le gène thérapeutique anionique doit être transporté par un vecteur
viral ou synthétique. Plusieurs essais cliniques ont permis d’étudier l’efficacité de différents
vecteurs de transfert de gènes dans le cas de la mucoviscidose, tels que les vecteurs
adénoviraux, AAVs (virus associé à l’adénovirus) ou lipidiques. Si peu d'effets toxiques ont
été notés, l'efficacité s'est avérée être ponctuelle, très modérée et transitoire (pour
revues : Boucher, 1999 ; Griesenbach et al., 2002). La poursuite de travaux de recherche
fondamentale semble donc nécessaire. En effet, une meilleure compréhension des étapes
cellulaires limitant l’efficacité de transfection permettrait la conception de nouveaux
vecteurs de transfert de gènes efficaces in vivo pour une application à la thérapie génique
de la mucoviscidose.
Les vecteurs synthétiques sont actuellement les vecteurs de transfert de gènes
les moins utilisés et les moins efficaces. Cependant, ils nous semblent plus intéressants
que les vecteurs viraux pour une application à la mucoviscidose dans la mesure où ils
présentent une plus grande innocuité et sont plus faciles à produire en grande quantité et
à faible coût (pour revues : Li et al., 2001 ; Davis, 2002). Deux principaux types de
vecteurs synthétiques sont développés, les lipides cationiques et les polymères
cationiques. La propriété de base commune à tous ces vecteurs synthétiques est leur
caractère cationique qui leur permet de s’associer à l’ADN plasmidique (chargé
négativement) par interactions électrostatiques. Il en résulte des complexes ADN/vecteurs
13/269
INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
synthétiques plus ou moins homogènes et cationiques. L’ADN plasmidique est ainsi
compacté et capable de traverser la membrane plasmique des cellules cibles. Le trafic
intracellulaire d’un ADN plasmidique complexé à un vecteur synthétique est supposé
comporter plusieurs étapes : l'entrée du complexe dans les cellules cibles et sa présence
dans des vésicules d’endocytose, l'échappement du complexe des vésicules endosomales
avant leur fusion avec les lysosomes et leur dégradation, la dissociation éventuelle du
complexe plasmide/vecteur synthétique, le trafic cytosolique de l’ADN plasmidique et sa
protection contre les nucléases, le passage nucléaire de l’ADN plasmidique et l'expression
du produit du gène (pour revues : Luo and Saltzman, 2000 ; Thomas and Klibanov, 2003).
Au laboratoire de Physiologie Respiratoire (Faculté de Médecine Cochin, Paris) où j’ai
effectué ma thèse en collaboration avec le laboratoire de Glycobiologie (CNRS, Orléans),
nous nous sommes intéressés au trafic intracellulaire d’un ADN plasmidique complexé à
des polymères cationiques dans des cellules épithéliales des voies aériennes humaines.
Le premier polymère cationique que nous avons utilisé a été la polylysine
glycosylée. La polylysine est une chaîne polycationique qui permet la formation avec
l’ADN plasmidique d’un complexe électrostatique transitoirement stable. Sa substitution
par des résidus osidiques reconnus par des lectines membranaires présentes à la
surface des cellules cibles permet d’améliorer le ciblage cellulaire (Midoux et al., 1993).
Parmi les polylysines substituées par différents osides, il a été précédemment montré,
dans le laboratoire, que c’est la polylysine substituée par du mannose qui est la plus
efficacement endocytée par les cellules épithéliales des voies aériennes humaines en
raison de la présence majoritaire de lectines reconnaissant le mannose à la surface de
ces cellules (Fajac et al., 1999 ; Allo et al., 2000). Cependant, la polylysine mannosylée
est inefficace pour le transfert de gènes rapporteurs et du gène CFTR. En revanche, la
polylysine lactosylée, dont le récepteur spécifique du lactose est en beaucoup moins
grand nombre à la surface des cellules épithéliales des voies aériennes humaines, assure
une endocytose limitée mais une meilleure efficacité de transfection (Fajac et al., 1999 ;
Allo et al., 2000). Ainsi, les complexes plasmide/polylysines glycosylées les mieux
endocytés ne sont pas nécessairement les plus efficaces en transfert de gènes, ce qui
suggère un rôle majeur des résidus de sucres dans le trafic intracellulaire de ces
complexes vers le noyau (pour revue : Monsigny et al., 1999). De plus, même si la
polylysine lactosylée est apparue comme un vecteur de transfert de gènes peu toxique et
efficace in vitro pour le transfert de gènes rapporteurs et du gène CFTR dans les cellules
14/269
INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
épithéliales des voies aériennes humaines mutées ou non pour le gène CFTR, l’efficacité
de transfection est insuffisante pour une application in vivo (Kollen et al., 1996 ; Fajac et
al., 1999 ; Kollen et al., 1999 ; Allo et al., 2000). Suite à ces résultats, notre première étude
(voir Article 1 de la Partie III) a été d’étudier et de comparer le trafic intracellulaire de
complexes
plasmide/polylysine
lactosylée
et
de
complexes
plasmide/polylysine
mannosylée dans une lignée de cellules épithéliales humaines dérivées de cellules
épithéliales ciliées des voies aériennes avec mutation homozygote ∆F508 de l’exon 10 du
gène CFTR (les cellules ΣCFTE29o-). Ceci nous a permis de déterminer quelles étaient
les étapes cellulaires limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de polylysines
glycosylées. Les résultats de cette étude ont montré qu’une des étapes limitant l’efficacité
du transfert de gènes à l’aide de polylysines glycosylées était un échappement inefficace
des vésicules d’endocytose malgré l’adjonction d’agents endosomolytiques, comme la
chloroquine, dans le milieu de transfection.
Nous avons amélioré cette étape du trafic intracellulaire et modifié les vecteurs en
conséquence en travaillant dans un deuxième temps, avec des polyéthylèneimines
glycosylés. Le polyéthylèneimine est un polymère cationique commercialisé qui, de par
ses propriétés endosomolytiques, permet aux complexes plasmide/polyéthylèneimines de
quitter les endosomes après leur entrée dans les cellules cibles et ainsi d’échapper à la
dégradation lysosomale sans adjonction d’agents endosomolytiques (Behr, 1996 ; Kichler
et al., 2001 ; Sonawane et al., 2003). Ce polymère permet un transfert de gènes efficace
in vitro dans des cellules épithéliales immortalisées des voies aériennes humaines
(Boussif et al., 1996 ; Fajac et al., 1999 ; Allo et al., 2000 ; Wiseman et al., 2003) et in vivo
chez la souris (Goula et al., 1998a ; Densmore et al., 2000 ; Gautam et al., 2000 ; Gautam
et al., 2001 ; Kichler et al., 2002 ; Rudolph et al., 2002 ; Wiseman et al., 2003) mais
insuffisant pour une application clinique. Quelques équipes ont montré que des
polyéthylèneimines glycosylés pouvaient être des vecteurs de transfert de gènes efficaces
dans les hépatocytes (Zanta et al., 1997) et les cellules dendritiques (Diebold et al., 1999).
Compte tenu de nos travaux précédents, nous avons développé un dérivé de
polyéthylèneimine substitué par des résidus de lactose. Notre deuxième étude (voir
Article 2 de la Partie III) a donc été d’étudier in vitro l’efficacité de transfection et le trafic
intracellulaire de ce nouveau vecteur dans les cellules ΣCFTE29o- et en culture primaire
en le comparant au polyéthylèneimine non glycosylé. Nous avons ainsi mieux compris le
15/269
INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
rôle des résidus de sucres dans le trafic intracellulaire des complexes plasmide/dérivés de
PEIs.
Ces deux précédentes études (Articles 1 et 2 de la Partie III) ont essentiellement
nécessité l’emploi de techniques de microscopie confocale. Nous avons complété et
précisé nos travaux par une troisième étude du trafic intracellulaire d’un ADN plasmidique
complexé soit aux polylysines glycosylées, soit au polyéthylèneimine lactosylé ou non
substitué en utilisant des techniques de microscopie électronique (voir Article 3 de la
Partie III). Ceci nous a permis de mieux comprendre le trafic intracellulaire de ces
complexes suivant la nature du polymère cationique utilisé et sa substitution par des
résidus osidiques. Ensuite, nous avons étudié le mécanisme d’entrée dans le noyau des
complexes plasmide/polyéthylèneimine lactosylé ou non substitué et le rôle du
cytosquelette dans le trafic intracellulaire de ces complexes (voir les Résultats
Complémentaires de la Partie III).
L’ensemble de ce travail de thèse nous a permis de mieux comprendre les
différentes étapes cellulaires du transfert de gènes à l’aide de dérivés de polycations
(polylysine, polyéthylèneimine) et de développer un vecteur, le polyéthylèneimine
lactosylé, efficace in vitro pour le transfert de gènes dans les cellules épithéliales des
voies aériennes humaines et qui peut aujourd’hui être utilisé in vivo chez la souris.
Cependant, l’étape de l’entrée dans le noyau reste une étape limitant l’efficacité de
transfection à l’aide de ce vecteur dans les cellules quiescentes. En collaboration avec le
laboratoire de Glycobiologie, des modifications de l’ADN plasmidique et/ou du vecteur sont
envisagées, comme la glycosylation directe de l’ADN afin de permettre une entrée dans le
noyau à travers les pores nucléaires. Une première étude a montré qu’un ADN
plasmidique de 6,8 kb substitué par des résidus de mannose est efficacement transloqué
dans le noyau de cellules perméabilisées par de la digitonine alors que l’ADN nu reste
dans le cytosol (Rondanino et al., 2004). De plus, la glycosylation de l’ADN ne gêne pas la
transcription de celui-ci et permet de le protéger contre les nucléases cytosoliques
(Rondanino et al., 2004). Ainsi, des études de transfections à l’aide de ces plasmides
glycosylés complexés à des vecteurs synthétiques peuvent être envisagées dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines.
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INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
Dans la première partie de ce mémoire, nous présenterons les généralités sur la
mucoviscidose, la thérapie génique et les étapes cellulaires du transfert de gènes à l’aide
de vecteurs synthétiques.
Dans une deuxième partie, nous exposerons les résultats de nos travaux de
recherche qui ont fait l’objet de trois publications, dont une est actuellement soumise pour
publication :
¾ Grosse S., Tremeau-Bravard A., Aron Y., Briand P. et Fajac I. (2002) Intracellular
rate-limiting steps of gene transfer using glycosylated polylysines in cystic fibrosis
airway epithelial cells. Gene Ther., 9 (15) : 1000-1007
¾ Grosse S., Aron Y., Honore I., Thevenot G., Danel C., Roche A.C., Monsigny M. et
Fajac I. (2004) Lactosylated polyethylenimine for gene transfer into airway epithelial
cells: role of the sugar moiety in cell delivery and intracellular trafficking of the
complexes. J. Gene Med., 6 : 345-356
¾ Grosse S., Aron Y., Thevenot G., François D., Monsigny M. et Fajac I. (2004)
Potocytosis and cellular exit of complexes may limit the efficiency of gene transfer
by polycations. Soumis pour publication
Deux autres publications actuellement en cours de préparation seront exposées en
résultats complémentaires.
Dans une troisième partie, nous discuterons des résultats de nos travaux de
recherche qui nous ont permis d’identifier les étapes cellulaires limitant l’efficacité du
transfert de gènes à l’aide de polymères cationiques nus ou glycosylés dans des cellules
épithéliales des voies aériennes humaines et de modifier les vecteurs en conséquence.
Nos travaux ont également montrer que le trafic intracellulaire de complexes
plasmide/polymères cationiques variait suivant la nature du polymère cationique utilisé et
sa substitution par des résidus de sucres, déterminant ainsi l’efficacité de transfection.
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INTRODUCTION
Stéphanie Grosse, 2004
Par ailleurs, nous avons participé à deux revues sur le rôle des résidus osidiques
dans l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de polymères cationiques glycosylés :
¾ Fajac I., Grosse S., Briand P. et Monsigny M. (2002) Targeting of cell receptors
and gene transfer efficiency: a balancing act. Gene Ther., 9 (11) : 740-742 (voir
Annexe 1)
¾ Roche A.C., Fajac I., Grosse S., Frison N., Rondanino C., Mayer R. et Monsigny M.
(2003) Glycofection: facilitated gene transfer by cationic glycopolymers. Cell. Mol.
Life Sci., 60 (2) : 288-297 (voir Annexe 2)
Nos résultats ont fait également l’objet de onze résumés présentés à des congrès
internationaux dont deux ont été sélectionnés pour une présentation orale au 15ème
« Annual North American Cystic Fibrosis Conference » à Orlando aux Etats-Unis en
octobre 2001 :
¾ Fajac I., Grosse S., Midoux P., Monsigny M. et Briand P. Rate-limiting steps of
gene transfer using glycosylated polylysines in cystic fibrosis airway epithelial cells.
Pediatr. Pulmonology, S22 : 204 (voir Annexe 3)
et au 5ème « Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy » à Boston aux
Etats-Unis en juin 2002 :
¾ Grosse S., Aron Y., Bedouet L., Roche A.C., Monsigny M. et Fajac I. Lactosylated
polyethylenimine as an efficient vector for gene transfer in cystic fibrosis airway
epithelial cells. Mol. Ther., Vol 5 (5), S436-437 : 1333 (voir Annexe 4)
De plus, les compétences techniques acquises tout au long de ce projet nous ont
été utiles pour étudier le trafic intracellulaire d’autres vecteurs. Ainsi, nous avons collaboré
avec l’équipe du Professeur Patrice Courvalin à l’Institut Pasteur à Paris et étudié le trafic
intracellulaire d’un vecteur dérivé d’Escherichia coli dans des cellules épithéliales des
voies aériennes humaines. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication :
¾ Fajac I., Grosse S., Collombet J.M., Thevenot G., Goussard S., Danel C., GrillotCourvallin C. (2004) Recombinant Escherichia coli as a gene delivery vector into
airway epithelial cells. J. Control. Release, 97 (2) : 371-381 (voir Annexe 5)
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Stéphanie Grosse, 2004
I - GENERALITES
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
1 - LA MUCOVISCIDOSE
La mucoviscidose, appelée Cystic Fibrosis en anglais, est une maladie
monogénique, autosomique et récessive dont le gène responsable est le gène CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) qui code pour la protéine CFTR,
un canal ionique pour les chlorures.
1 - 1 - LA MALADIE
1 - 1 - 1 - Epidémiologie
La mucoviscidose est la maladie génétique grave la plus fréquente dans la
population caucasienne. En effet, elle affecte un enfant sur 2500 et la fréquence des
porteurs sains dans la population générale est de 1/25 (pour revue : Davis et al., 1996). En
Europe, cette maladie touche plus de 20000 personnes. En France, environ 180 à 250
nouveaux cas sont pris en charge chaque année. Ceci permet d’évaluer entre 4000 et
6000 le nombre actuel des sujets atteints dans notre pays. Il s’agit d’une population jeune
(âge médian de 13,0 ans). Les malades de moins de 18 ans représentent 65,5 % de
l’ensemble de cette cohorte.
En 1960, la médiane de survie était estimée à 5 ans. La précocité du diagnostic
ainsi que l’efficacité des traitements symptomatiques (en particulier l’antibiothérapie et la
kinésithérapie respiratoire) ont permis d’augmenter l’espérance de vie des malades, qui
est actuellement de 25 à 30 ans en moyenne. La mucoviscidose reste cependant une
maladie très sévère pour laquelle aucun traitement curatif (si ce n’est la transplantation
pulmonaire) n’est actuellement disponible.
1 - 1 - 2 - Aspects cliniques
La présentation clinique de la mucoviscidose est très polymorphe tant entre les
différentes familles qu’au sein d’une même famille. Cependant, les manifestations
respiratoires et digestives dominent le tableau clinique et l’atteinte respiratoire conditionne
le pronostic vital (Derelle et al., 1998).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
a) L’atteinte respiratoire :
Les manifestations respiratoires apparaissent précocement, dans plus de 80 %
des cas au cours de la première année de vie. Les symptômes sont peu spécifiques,
marqués par une toux chronique rapidement productive, des bronchites infectueuses et/ou
asthmatiformes récidivantes puis, par l’installation d’une bronchorrhée chronique
purulente. Celle-ci est souvent révélatrice d’une dilatation des bronches et est liée à une
obstruction des bronchioles par un mucus épais et visqueux.
Cette obstruction des voies aériennes favorise une infection chronique par des
bactéries pathogènes, particulièrement agressives, telles que Haemophilus influenzae,
Staphylococcus aureus et Pseudomenas aeruginosa. Les bactéries de type Pseudomonas
aeruginosa sont naturellement résistantes à de nombreux antibiotiques et deviennent
prépondérantes au niveau des voies respiratoires. L’allongement de la survie et les
antibiothérapies fréquentes ont conduit à l’émergence de pathogènes particulièrement
résistants :
Burkholderia
cepacia,
Stenotrophomonas
maltophilia,
Alcaligenes
xylosoxidans. Une colonisation bronchique aspergillaire peut également avoir lieu donnant
une aspergillose bronchopulmonaire allergique.
Les épreuves fonctionelles respiratoires montrent un trouble ventilatoire obstructif
ou mixte, avec une hyperréactivité bronchique réversible sous broncho-dilatateurs dans 40
à 70 % des cas. Un syndrome restrictif tardif ou une distension thoracique peuvent être
associés. L’altération des gaz du sang est souvent tardive avec apparition progressive
d’une hypoxémie et d’une acidose respiratoire chronique.
L’évolution se fait vers des complications avec exacerbations correspondant à des
poussées de surinfection bronchique, une insuffisance respiratoire chronique, des
hémoptysies (présence de sang dans les crachats) très fréquentes chez l’adulte et des
pneumothorax associés à un risque accru de mortalité. L’atteinte respiratoire est
responsable du décès des patients dans plus de 90 % des cas.
b) Les autres atteintes cliniques :
Les
patients
mucoviscidosiques
présentent
également
des
manifestations
digestives. Il s’agit d’une insuffisance pancréatique exocrine (défaut de production des
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
enzymes) due à une obstruction des canaux pancréatiques. Elle est présente chez plus de
80 % des patients et est à l’origine d’une malabsorption, responsable d’une diarrhée
graisseuse caractéristique, associée à des carences en vitamines liposolubles. La
prescription d’extraits pancréatiques gastro-protégés permet de compenser le déficit
enzymatique et d’améliorer le statut nutritionnel des patients. Parfois, la maladie se
manifeste très précocement et, dans 10 à 15 % des cas, on observe une occlusion
néonatale (ileus méconial).
Des manifestations hépatiques peuvent également être présentes. Elles se
résument dans 30 % des cas à une hépatomégalie (gros foie) et dans 9 % des cas à une
élévation enzymatique isolée. L’atteinte hépatique ne se retrouve que chez les patients
insuffisants pancréatiques. Elle est liée à l’obstruction des voies biliaires intra-hépatiques
ou extra-hépatiques (par compression au niveau du pancréas). Dans 10 à 15 % des cas,
ces lésions conduisent à une cirrhose du foie qui représente la seconde cause de
mortalité.
La mucoviscidose entraîne aussi chez 98 % des hommes atteints, une stérilité due
à l’obstruction des canaux déférents, et chez 80 % des femmes atteintes, une hypofertilité
due à des modifications de la glaire cervicale.
Enfin, en raison d’un mauvais fonctionnement des glandes sudoripares, la
transpiration contient une concentration anormalement élevée de sel (chlorure de sodium).
Cette dernière caractéristique est utilisée pour confirmer le diagnostic de la maladie (test
de la sueur).
1 - 2 - LE GENE ET LA PROTEINE CFTR
1 - 2 - 1 - Le gène CFTR
Le gène responsable de la mucoviscidose a été localisé en 1985 sur le bras long du
chromosome 7, en 7q31.2, par une approche de génétique inverse (la protéine
responsable n’étant pas identifiée). Le gène CFTR a ensuite été cloné puis séquencé en
1989 (Kerem et al., 1989 ; Riordan et al., 1989 ; Rommens et al., 1989). Il s’étend sur 250
kilobases d’ADN et est constitué de 27 exons et donne un ARNm de 6129 nucléotides. Ce
gène code pour une protéine de 1480 acides aminés appelée la protéine CFTR (Figure 1).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 1 : Du gène à la protéine CFTR
1 - 2 - 2 - Structure de la protéine CFTR et son activation
La protéine CFTR est une glycoprotéine de 140 kDa sous sa forme native et de 170
kDa sous sa forme glycosylée. C’est un canal ionique pour les ions chlorures, AMP
cyclique-dépendant. Elle appartient à la famille des protéines ABC (ATP Binding Cassette)
qui sont impliquées dans le transport transmembranaire ATP-dépendant et dont le
représentant le plus connu est la protéine MDR (Multi Drug Resistance P-glycoprotein).
La protéine CFTR comporte 5 domaines (pour revue : Sheppard and Welsh, 1999).
A partir de son extrémité N-terminale se situent (Figure 2) :
•
Un premier domaine transmembranaire formé de 6 segments transmembranaires
hydrophobes (TMD-1 pour Transmembrane Domain),
•
Un premier domaine hydrophile cytosolique contenant un site de liaison à l’ATP
(NBD1 pour Nucleotide Binding Domain),
•
Un domaine de regulation (R pour Regulator) cytosolique riche en acides aminés
ionisables et contenant des sites de phosphorylation pour la protéine kinase A,
•
Un second domaine transmembranaire (TMD-2)
•
Et enfin un second site de fixation des nucléotides (NBD2).
23/269
I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Les deux domaines transmembranaires (TMD-1 et TMD-2) forment le pore du canal
ionique alors que les domaines hydrophiles (NBD1 et NBD2) contenant les sites de
fixation à l’ATP et le domaine de régulation R phosphorylable par des protéines kinases
contrôlent l’activité du canal.
Figure 2 : Structure de la protéine CFTR (d’après Sheppard and Welsh, 1999)
L’activation du canal CFTR nécessite deux étapes successives et obligatoires (pour
revues : Gadsby and Nairn, 1999 ; Sheppard and Welsh, 1999). La première étape
implique la phosphorylation du domaine R par la protéine kinase A (PKA) activée par
l’AMP cyclique. Une fois le domaine R phosphorylé, l’ouverture et la fermeture du canal
sont sous la dépendance de la fixation et de l’hydrolyse de l’ATP cytosolique. En effet,
l’hydrolyse de l’ATP par le domaine NBD1 entraîne des modifications conformationnelles
des domaines transmembranaires ce qui permet l’ouverture du canal CFTR et le passage
passif des ions chlorures. L’hydrolyse de l’ATP par le domaine NBD2 entraîne la fermeture
du canal. L’activité du canal CFTR est donc régulée par l’ATP cytosolique et les protéines
kinases cellulaires mais également par les phosphatases cellulaires qui désactivent la
protéine CFTR en déphosphorylant le domaine R (Berger et al., 1993).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
1 - 2 - 3 - L’expression de la protéine CFTR
La protéine CFTR s’exprime au pôle apical de nombreuses cellules épithéliales,
notamment dans l’arbre trachéobronchique, les canaux pancréatiques et biliaires, les
cryptes intestinales, l’appareil génital et les glandes sudoripares. Dans les voies aériennes
supérieures et inférieures, l’étude de l’expression des ARN messagers de la protéine
CFTR par hybridation in situ et l’analyse immunocytochimique de la protéine CFTR ont
mis en évidence une grande hétérogénicité d’expression de cette protéine par les cellules
épithéliales bronchiques. Dans l’épithélium de surface, les cellules ciliées sont les cellules
exprimant le plus la protéine CFTR alors que les cellules caliciformes ne l’exprimeraient
pas. Dans l’épithélium glandulaire, une très forte expression de CFTR est observée dans
les cellules glandulaires séreuses et dans les cellules épithéliales bordant le canal
collecteur (Figure 3) (Engelhardt et al., 1992 ; Jacquot et al., 1993 ; Engelhardt et al.,
1994).
Figure 3 : Expression de CFTR (
) par les cellules de l’épithélium respiratoire
1 - 2 - 4 - Les fonctions de la protéine CFTR
La protéine CFTR est principalement un canal chlorure de faible conductance
régulé par l’AMP cyclique. Mais, il a également été montré que cette protéine pouvait
moduler les fonctions d’autres canaux ioniques (Figure 4) (pour revue : Schwiebert et al.,
1999). En effet, le canal CFTR stimule un autre canal chlorure appelé ORCC (Outwardly
Rectifying Chloride Channel) (Gabriel et al., 1993 ; Schwiebert et al., 1995). Le canal
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
CFTR régule aussi, mais de façon négative, l’activité du canal sodique sensible à
l’amiloride ENaC (Epithelial Sodium Channel). Il limite donc l’absorption des ions sodium
par les cellules épithéliales (Stutts et al., 1995 ; Ismailov et al., 1996). L’activité du canal
potassique ROMK2 (Renal Outer Medullary Potassium Channel) est également sous la
dépendance du canal CFTR (McNicholas et al., 1997). Les mécanismes exacts par
lesquels le canal CFTR régule les autres canaux ne sont pas encore entièrement connus.
Des études ont montré que l’activation du canal CFTR serait associée à une sortie d’ATP
des cellules épithéliales. L’ATP irait ensuite se fixer sur des récepteurs purinergiques qui,
par l’intermédiaire d’une protéine G, activeraient l’ouverture du canal ORCC et l’efflux
d’ions chlorures, et fermeraient les canaux ENaC. Ainsi, la protéine CFTR interviendrait de
façon majeure dans le transport d’ions par les cellules épithéliales et dans l’hydratation du
liquide de surface (le sodium entraînant avec lui de l’eau via les aquaporines). Ces
échanges permettent au mucus de rester fluide en régulant le volume et le degré
d’hydratation des sécrétions. La présence d’une protéine CFTR non fonctionnelle se
caractérise par une baisse de la sécrétion des ions chlorures et par une augmentation de
l’absorption des ions sodium ce qui conduit à une mauvaise hydratation des sécrétions et
à un épaississement du mucus.
La protéine CFTR interviendrait aussi dans le recyclage des membranes en
favorisant les phénomènes d’exocytose et en inhibant ceux d’endocytose (Bradbury and
Bridges, 1992a ; Bradbury et al., 1992b). Elle régulerait également le pH des organites
intracellulaires (Barasch et al., 1991) (Figure 4). En effet, il a été montré qu’une mauvaise
acidification
des
compartiments
intracellulaires
dans
les
cellules
épithéliales
mucoviscidosiques entraîne une hypersulfatation et une sialylation défectueuse des
protéines
et
des
lipides
responsable
de
l’apparition
des
récepteurs
aGM1
(asialoganglioside 1) liant spécifiquement Pseudomonas aeruginosa (Imundo et al., 1995).
L’hypersulfatation des mucines entraîne quant à elle une plus grande viscosité du mucus
(pour revue : Barasch and al-Awqati, 1993).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 4 : Les multiples fonctions de la protéine CFTR dans une cellule épithéliale
(d’après Schwiebert et al., 1999). La protéine CFTR est un canal chlorure (1). Elle facilite
la sortie de l’ATP (2). Elle régule positivement les canaux ORCC (3) et négativement les
canaux EnaC (4). La protéine CFTR aurait également un rôle dans le recyclage des
membranes (5) et dans la régulation du pH des organites intracellulaires (6). Enfin, la
protéine CFTR a une action sur les canaux potassiques ROMK2 (7).
1 - 2 - 5 - Les mutations du gène CFTR et leurs conséquences
sur la protéine
Depuis l’identification du gène CFTR, plus de 1000 mutations et 200
polymorphismes ont été rapportés au Consortium International d’Etudes du gène CFTR
(Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, CFGAC : http://genet.sickkids.on.ca/cftr/).
La mutation la plus fréquente est la mutation ∆F508 qui correspond à une délétion de trois
paires de bases adjacentes situées dans l’exon 10. Cette délétion respecte le cadre de
lecture et conduit à la perte d’une phénylalanine en position 508 de la protéine. Cette
mutation est présente sur au moins un chromosome chez 70% des malades caucasiens.
Sa fréquence suit un gradient décroissant du nord au sud de l’Europe (Lucotte et al.,
1991). Parmi les autres mutations, seules quelques-unes ont une fréquence qui dépasse
1%. Ce sont les mutations G542X, G551D, W1282X et N1303K qui ont une fréquence
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
comprise entre 1 et 2,5%. Dix-neuf autres mutations ont une fréquence comprise entre 0,1
et 1% tandis que la majorité des mutations sont présentes en un seul exemplaire.
Cependant, il est important de noter que la fréquence relative des mutations du gène
CFTR peut varier suivant les populations étudiées. En effet, certaines mutations sont
présentes préférentiellement dans certains groupes ethniques comme les mutations
G542X et W1282X chez les Juifs ashkénazes ou la mutation G551D dans les populations
d’origine Celte. Cela signifie que la recherche de mutations du gène responsable de la
mucoviscidose doit être faite en fonction des origines ethniques des patients.
La distribution des mutations dans le gène CFTR n’est pas homogène (Figure 5).
En effet, certains exons sont plus souvent le siège de mutations que d’autres. C’est le cas
des exons 10, 11, 19, 20 et 21, codant pour les deux domaines de fixation à l’ATP de la
protéine CFTR (NBD1 et NBD2), qui contiennent les 5 mutations les plus communes. Les
exons codant pour les régions transmembranaires du gène (TMD-1 et TMD-2), en
particulier les exons 3, 4, 7 et 17b, sont aussi le siège de nombreuses mutations bien que
leur fréquence respective soit peu élevée. C’est également le cas de l’exon 13 qui code
pour le domaine R.
Figure 5 : Distribution des mutations dans le gène CFTR. Les flèches indiquent la
localisation des 5 mutations les plus fréquentes du gène CFTR. Les exons en bleu foncé
représentent les exons les plus fréquemment mutés dans la population Caucasienne avec
une fréquence supérieure à 1 %.
Les anomalies moléculaires du gène CFTR ont des conséquences variables sur la
protéine CFTR. Une classification de ces mutations selon les conséquences qu’elles
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
entraînent sur la protéine CFTR a été établie par Welsh et Smith en 1993 et modifiée par
Zielenski et Tsui en 1995 (Figure 6) :
¾ La classe I est constituée de mutations qui entraînent une absence de production
de la protéine CFTR ou la production de protéines tronquées ou aberrantes qui sont
souvent instables. Il s’agit de mutations non sens, de mutations d’épissage, ou de
microinsertions et microdélétions qui entraînent un déphasage du cadre de lecture.
Environ la moitié des mutations connues appartient à cette classe comme la W1282X et la
G542X.
¾ La classe II regroupe des mutations qui perturbent le processus de maturation de
la protéine CFTR. Elles conduisent à un trafic anormal dans le réticulum endoplasmique
(RE) et l’appareil de Golgi. Cette classe inclut la mutation la plus commune ∆F508 et la
N1303K qui entraînent un repliement anormal de la protéine CFTR et empêchent sa
glycosylation. La protéine anormale est reconnue et séquestrée par la cellule, empêchant
ainsi l’adressage vers la membrane cellulaire.
¾ La classe III comprend des mutations qui entraînent un défaut de régulation et
d’activation de la protéine CFTR. La protéine est normalement produite et insérée dans la
membrane mais elle est peu activable et donc peu fonctionnelle. Ces mutations se situent
au niveau des deux domaines de liaison de l’ATP (NBD1 et NBD2) comme la mutation
G551D.
¾ La classe IV contient des mutations qui altèrent sans l’abolir la conduction des ions
chlorures, en diminuant le temps d’ouverture du canal ou bien en modifiant la sélectivité
du canal aux ions. Ce sont des mutations faux sens qui affectent les deux domaines
transmembranaires de la protéine (TMD-1 et TMD-2).
¾ La classe V comprend des mutations qui sont associées à une importante
diminution de l’expression membranaire de la protéine CFTR fonctionnelle. Elles sont
dues à des altérations du promoteur ou de l’épissage de l’ARNm.
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 6 : Effets des mutations du gène CFTR sur la biosynthèse et la fonction de la
protéine CFTR dans une cellule épithéliale (d’après les revues : Welsh and Smith,
1993 ; Zielenski and Tsui, 1995)
L’étude des relations phénotype/génotype s’est avérée difficile dans le cas de la
mucoviscidose. Il existe cependant une association des formes homozygotes ∆F508 et
plus généralement des mutations des classes 1, 2 et 3 à une insuffisance pancréatique, à
une plus grande sévérité de l’atteinte pulmonaire et à un diagnostic précoce dans
l’enfance. A l’inverse, les mutations des classes 4 et 5 n’entraînent pas ou peu
d’insuffisance pancréatique, sont associées à une plus lente détérioration de la fonction
respiratoire et à une médiane de survie plus élevée (pour revues : Kerem et al., 1995 ;
Zielenski and Tsui, 1995 ; Mickle et al., 2000 ; Rowntree et al., 2003).
1 - 3 - LES TRAITEMENTS ACTUELS DE LA MALADIE ET LES RECHERCHES
PHARMACOLOGIQUES
La mucoviscidose n’est actuellement traitée que de façon symptomatique (Derelle
et al., 1998). En effet, la prise en charge respiratoire repose essentiellement sur une
kinésithérapie respiratoire quotidienne pour mobiliser et évacuer les sécrétions
bronchiques
et
une
antibiothérapie
pour
traiter
les
infections.
Parallèlement,
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
l’aérosolisation de DNases recombinantes (Pulmozyme®) permet de diminuer la viscosité
des sécrétions, en hydrolysant l’ADN extracellulaire. La prise en charge digestive et
nutritionnelle repose sur l’administration d’enzymes pancréatiques qui permettent une
digestion des graisses, et un régime adapté avec un supplément en vitamines liposolubles
(vitamines A, D, E et K) et en oligo-éléments. Les traitements chirurgicaux et la
transplantation pulmonaire ou hépatique interviennent le plus souvent en dernière
extrémité et restent encore peu fréquents. De nombreuses voies de recherches
thérapeutiques
sont
actuellement
en
cours,
notamment
des
approches
pharmacologiques (pour revues : Clement et al., 1998 ; Zeitlin, 2000 ; Rodgers et al.,
2001 ; Ratjen and Doring, 2003).
Une des approches pharmacologiques est de corriger l’anomalie de CFTR selon la
classe de mutation. Les mutations de classe I entraînent une absence de production de la
protéine CFTR ou la production d’une protéine anormale dues à un déphasage du cadre
de lecture au niveau de l’ARNm. Il a été montré que certains aminoglycosides comme la
gentamycine était capable de restaurer la transcription du gène CFTR en négligeant un
codon stop anormal (Howard et al., 1996). Un essai clinique utilisant ce composé chez des
patients mucoviscidosiques ayant une mutation non sens vient d’être publié par une
équipe israëlienne (Wilschanski et al., 2003). Les résultats ont montré que l’administration
de gentamycine permet de restaurer l’expression de la protéine CFTR au niveau de la
surface apicale des cellules épithéliales et d’obtenir une correction partielle des anomalies
de transport des ions chlorures. Un autre essai clinique utilisant la gentamycine est
actuellement en cours aux Etats-Unis (www.cff.org/research). Concernant les mutations
de classes II qui entraînent des perturbations dans le processus de maturation de la
protéine CFTR, plusieurs laboratoires ont montré que la culture à basse température (2529°C) de cellules avec mutation homozygote ∆F508 permet de corriger l’anomalie du trafic
intracellulaire de la protéine mutée (Egan et al., 1995 ; Brown et al., 1997). Un effet
analogue peut être obtenu avec certaines molécules comme le glycérol ou le
dimethylsulfoxide (Brown et al., 1996). Cependant, les fortes concentrations nécessaires
empêchent des applications in vivo. D’autres composés, comme le phénylbutyrate ou la
désoxyspergualine, pourraient réguler les interactions entre CFTR et les molécules
chaperons du RE et normaliser le trafic de CFTR mutée vers la membrane cellulaire
(Rubenstein et al., 1997 ; Jiang et al., 1998a ; Rubenstein and Zeitlin, 2000). Un essai
clinique administrant par voie orale du sodium 4-phénylbutyrate chez des patients
mucoviscidosiques homozygotes ∆F508 a montré une restauration partielle (pendant une
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
semaine) du transport des ions chlorures dans les cellules épithéliales nasales
(Rubenstein and Zeitlin, 1998). Une autre classe de composants pourrait également être
utilisée pour le traitement de patients porteurs de la mutation ∆F508, les antagonistes du
récepteur adénosine-α1 (Eidelman et al., 1992). Le 8-cyclopentyl-1,2-dipropylxanthine
(CPX), qui ressemble au récepteur adénosine-α1, peut en effet se lier à la protéine CFTR
(Cohen et al., 1997). Cette interaction permettrait de restaurer le mouvement de la
protéine CFTR vers la surface des cellules épithéliales ce qui activerait le transport des
ions chlorures dépendant de l’AMP cyclique (Guay-Broder et al., 1995). Un essai clinique
de phase I/II utilisant le CPX est actuellement en cours aux Etats-Unis. Pour les mutations
de classe III et IV qui entraînent un défaut d’activation de la protéine CFTR, des inhibiteurs
de la phosphodiestérase comme la milrinone et de la tyrosine kinase comme la génistéine
pourraient être utilisés (Illek et al., 1995 ; Kelley et al., 1995). Ces deux composés peuvent
en effet interagir avec la protéine CFTR mutée et ainsi activer la conduction du chlorure
(Weinreich et al., 1997).
Une autre approche consiste à essayer d’activer des canaux chlorures autres que le
canal CFTR présents dans l’épithélium des voies aériennes. En effet, un canal chlorure
activé par le calcium est fortement exprimé dans les voies aériennes de la souris et non
dans le tractus digestif et pourrait expliquer le peu de symptômes respiratoires observés
chez la souris ayant une inactivation du gène CFTR endogène (pour revue : Grubb and
Boucher, 1999). Chez l’homme, le canal chlorure activé par le calcium est présent dans
les voies aériennes et peut être stimulé par l’application locale de nucléotides se fixant à
des récepteurs purinergiques et permettant d’augmenter la concentration en calcium
cytosolique. Ainsi, l’aérosolisation d’UTP associé à l’amiloride qui inhibe les canaux
sodium permet d’améliorer la clairance mucociliaire (processus d’évacuation du mucus par
les cils à la surface de certaines cellules respiratoires) de patients mucoviscidosiques
(Bennett et al., 1996). Plus récemment, la société américaine Inspire Pharmaceuticals a
mis au point un nouveau composé, l’INS37217, qui comme l’UTP permet l’activation d’un
canal chlorure différent de CFTR et a les propriétés de favoriser l’hydratation du mucus et
d’améliorer la clairance mucociliaire (Yerxa et al., 2002). Une étude de phase II menée
chez 90 patients ayant reçu par nébulisation de l’INS37217 ou un placebo montre que la
nouvelle molécule est bien tolérée chez les malades. De plus, après 4 semaines de
traitement, les sujets ayant reçu de l’INS37217 présentaient une fonction respiratoire
significativement meilleure que le groupe placebo. Un autre essai clinique visant à
confirmer ces premiers résultats est envisagé.
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
De nouvelles molécules ont également été développées ces dernières années pour
améliorer le traitement de l’infection et de l’inflammation chez les patients atteints de
mucoviscidose. Ces nouvelles molécules sont principalement des antibiotiques, comme la
tobramycine modifiée (non irritante) commercialisée sous le nom de TOBI®, qui appartient
à la famille des aminosides et qui permet de se défendre contre l’infection pulmonaire de
Pseudomonas aeruginosa (pathogène majeur de la mucoviscidose, aussi appelée
pyocyanique). En effet, il a été montré que des patients mucoviscidosiques ayant été
traités par cette tobramycine spéciale par aérosol pendant la phase précoce de
colonisation à Pseudomonas aeruginosa ne présentaient pas d’infection chronique, la
bactérie étant éradiquée (Ratjen et al., 2001). Un autre antibiotique, l’azithromycine qui
appartient à la famille des macrolides et qui est commercialisé sous le nom de Zithromax®,
pourrait également être utilisé chez les patients mucoviscidosiques, ayant une action antiinflammatoire (Equi et al., 2002 ; Wolter et al., 2002). L’inflammation peut également être
traitée par des molécules à activité anti-élastase, tel que le DMP 777, qui devraient
neutraliser l’élastase en partie responsable de la destruction des cellules de l’épithélium
bronchique lors des réactions inflammatoires (Birrer, 1995).
Enfin, une autre approche thérapeutique serait de faire synthétiser la protéine CFTR
normale par les cellules des organes atteints. Pour cela, le gène codant pour la protéine
CFTR normale doit être introduit dans les cellules malades pour y être efficacement
transcrit et traduit. Dans cette approche appelée la thérapie génique, l’ADN deviendrait
alors un médicament.
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
2 - LA THERAPIE GENIQUE
2 - 1 - GENERALITES
L'exploration du génome humain a évolué depuis quelques années avec son
séquençage quasi complet depuis 2000. Cette connaissance du génome a permis de
découvrir les gènes responsables des maladies génétiques et ce savoir génétique a
contribué à la conception d’une nouvelle approche thérapeutique, la thérapie génique, qui
consiste à introduire dans les cellules malades le gène d’intérêt afin d’obtenir la synthèse
d’une protéine thérapeutique. Plus précisément, la thérapie génique a pour but de
remplacer la fonction d’un gène défectueux, dans le cas des maladies génétiques comme
la mucoviscidose, ou de commander la synthèse d’une protéine qui apportera une
nouvelle fonction aux cellules, par exemple en aidant le système immunitaire à éliminer
des cancers.
Pour pouvoir introduire le gène thérapeutique dans les cellules cibles, la stratégie la
plus simple est de prélever les cellules à traiter chez le patient, d'introduire ex vivo le gène
thérapeutique dans les cellules cibles et de sélectionner les cellules traitées puis de les
réimplanter chez le patient (Figure 7A). Cependant, certains types cellulaires ne peuvent
ni être facilement prélevés, ni efficacement réinjectées. Ainsi, le gène thérapeutique doit
être directement introduit chez le patient, soit in situ, lorsque le gène est directement
injecté au sein du tissu cible (Figure 7B), soit plus généralement in vivo, ce qui consiste à
administrer le gène par voie sanguine ou autre, en espérant qu’il atteindra spécifiquement
les cellules cibles de l'organisme (Figure 7C).
Figure 7 : Les différentes stratégies d’introduction du gène thérapeutique dans les
cellules cibles. (A) Introduction ex vivo du gène thérapeutique dans les cellules du patient
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Stéphanie Grosse, 2004
et réadministration des cellules au patient ; (B) Introduction in situ du gène thérapeutique
dans le tissu cible ; (C) Introduction in vivo du gène thérapeutique par voie sanguine.
Si le principe de la thérapie génique repose sur l'idée simple de transférer dans les
cellules cibles de l’organisme le gène thérapeutique, sa mise en application est beaucoup
plus complexe car la pénétration spontanée d'une molécule d'ADN dans une cellule est un
événement exceptionnel. En effet, le gène thérapeutique est, comme l'ADN génomique,
une molécule polyanionique hydrophile de grande taille qui n'est pas apte à traverser les
membranes cellulaires constituées elles-mêmes d'une bicouche lipidique chargée
négativement. C'est pourquoi, différents systèmes de transfert de gènes ont été
développés depuis les années 80 : soit l’ADN thérapeutique est introduit dans les cellules
cibles à l’aide d’une technique physique, soit à l’aide d’un vecteur.
Les techniques physiques les plus prometteuses pour le transfert de gènes sont le
bombardement (Qiu et al., 1996), l’électroporation (Matthews et al., 1995) et l’ultrason
(Kim et al., 1996). Le bombardement consiste à bombarder un organe par des particules
métalliques (d'or par exemple) que l'on a préalablement recouvertes de l'ADN
thérapeutique. Ainsi, l'ADN pénètre dans les cellules de cet organe et éventuellement s'y
exprime. Appliquée à l'animal, cette technique n'a permis pour l'instant qu'une expression
transitoire du gène, mais son caractère non invasif en fait potentiellement une méthode de
transfert de gènes intéressante et qui peut être répétée sans risque majeur chez un
patient. L’électroporation consiste à faire pénétrer l’ADN thérapeutique dans des cellules
qui ont subi préalablement des impulsions électriques ce qui permet d’augmenter la
perméabilité membranaire. Les ultrasons ont également pour but d’augmenter la
perméabilité membranaire et d’augmenter les chances de pénétration cellulaire de l’ADN
thérapeutique. L’ensemble de ces techniques se sont révélées peu toxiques, faciles
d’utilisation mais leur efficacité de transfection reste faible et transitoire. En effet, l’ADN
thérapeutique qui n’a pas la capacité de se répliquer, disparaît des cellules cibles au cours
des divisions successives par effet de dilution.
Les recherches se sont donc portées sur l’utilisation de vecteurs qui soient
capables de contenir le gène, de le transporter au bon endroit, avec efficacité et en toute
sécurité afin d'obtenir un effet thérapeutique. Schématiquement, deux types de vecteurs
sont développés en thérapie génique, les vecteurs dérivés de virus qui utilisent la
capacité naturelle des virus à infecter des cellules et à y faire exprimer leur matériel
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Stéphanie Grosse, 2004
génétique (Jolly, 1994 ; Mah et al., 2002), et les vecteurs non viraux dits synthétiques qui
sont des molécules chimiques capables de lier l’ADN par interactions de charges et qui
présentent plusieurs avantages sur le plan de la sécurité, du coût et de la facilité de
réalisation des thérapies géniques (pour revues : Li et al., 2001 ; Davis, 2002).
2 - 2 - LES VECTEURS DE TRANSFERT DE GENES
2 - 2 - 1 - Les vecteurs viraux
Tout au long de l'évolution biologique, les virus ont élaboré et perfectionné des
mécanismes sophistiqués et performants pour assurer le transfert et la réplication de leur
génome dans les tissus cibles de leur hôte naturel. Au début des années 80, ces
propriétés particulières ont été exploitées pour utiliser les virus comme outils potentiels de
vecteurs de transfert de gènes (Levine, 1987). Aujourd'hui, les vecteurs viraux sont les
vecteurs de transfert de gène les plus utilisés en thérapie génique. Ils représentent 70 %
des protocoles cliniques et dérivent principalement des rétrovirus, des adénovirus, des
virus AAVs (Adeno-Associated Virus) et plus récemment des lentivirus (www.wiley.co.uk/
genetherapy).
a) Généralités :
Les virus sont composés de matériel génétique (ADN ou ARN) entouré d'une
enveloppe protéique protectrice appelée capside, protégée ou non par une enveloppe de
nature lipidique. Ils sont capables de reconnaître et de pénétrer dans leur cellule hôte, et
d'utiliser la machinerie cellulaire pour se reproduire. Certains virus sont mêmes capables
d'intégrer leur propre matériel génétique dans le génome de la cellule hôte. Cependant,
pour pouvoir être utilisés comme vecteurs de transfert de gènes, les virus doivent êtres
génétiquement modifiés. En effet, ils ne doivent pas être capables de se multiplier au sein
des cellules qu'ils ont infectées et doivent contenir le gène d’intérêt afin de permettre
l'expression de la protéine thérapeutique.
La première étape pour produire des vecteurs dérivés de virus utilisables en
thérapie génique est la construction d'une lignée cellulaire d'encapsidation qui exprime les
gènes de structure du virus codant pour les protéines de la capside et de l'enveloppe, et
pour les activités enzymatiques de transcription du matériel génétique. On obtient ainsi
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une lignée de cellules qui est capable de produire des particules virales vides car il
n'existe pas dans la cellule le génome viral. La seconde étape consiste alors à introduire
dans ces cellules une construction génétique qui contient la séquence d'ADN
thérapeutique que l'on veut transférer aux cellules malades. A la suite de cette seconde
manipulation, les cellules de la lignée d'encapsidation sont alors capables de produire des
virus dits recombinants contenant le gène thérapeutique. Ces virus recombinants ne sont
plus pathogènes pour la cellule hôte et peuvent être utilisés pour infecter les cellules que
l'on veut traiter. Ils ne contiennent plus le matériel génétique viral nécessaire à la synthèse
des protéines virales et ils ne peuvent pas produire de nouvelles particules virales dans
les cellules qu'ils ont infectées. En revanche, la capside et l’enveloppe étant toujours
conservées, ces virus recombinants sont toujours capables de transférer leur matériel
génétique contenant le gène thérapeutique aux cellules cibles, et ces mêmes cellules
peuvent exprimer le gène thérapeutique qui leur a été apporté par ces virus recombinants,
comme s'il s'agissait d'un gène viral (Figure 8).
Figure 8 : Synthèse de virus recombinants par une lignée cellulaire d'encapsidation
et transfection d'une cellule malade par ces vecteurs viraux afin d'obtenir
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l'expression de la protéine thérapeutique (http://www.inapg.inra.fr/ens_rech/bio/biotech/
textes/techniqu/therapge/aspectec.htm)
Cependant cette production de virus recombinants capables de transfecter et de
faire produire à la cellule cible la protéine thérapeutique ne peut pas s'appliquer facilement
à tous les virus. En effet, comme nous allons le voir ci-dessous chaque virus a ses
avantages et ses inconvénients pour une application en thérapie génique.
b) Les vecteurs rétroviraux :
Les rétrovirus sont des virus enveloppés dont le génome est un ARN simple brin. Ils
ont été les premiers virus utilisés comme vecteurs de transfert de gènes (Varmus, 1988) et
les plus couramment utilisés dérivent des rétrovirus de la leucémie murine (MLV) et plus
particulièrement du virus de Moloney (Mo-MLV) (Dardalhon et al., 2000).
Ces vecteurs rétroviraux présentent de nombreux avantages dans le cadre de la
thérapie génique : ils sont capables d'infecter une grande variété de cellules ; ils
peuvent intégrer de façon stable leur génome dans celui de la cellule hôte qu'ils
infectent ce qui permet une expression à long terme du gène thérapeutique dans
l'organisme ; sous forme naturelle, ils ne sont pas très nocifs ce qui signifie que leur
utilisation comme vecteur de transfert de gènes présente peu de risque.
Cependant, ces vecteurs rétroviraux ne peuvent pas infecter des cellules
quiescentes comme les neurones, les cellules musculaires, pulmonaires ou hépatiques
car ils nécessitent une rupture de la membrane nucléaire pour que le transgène puisse
pénètrer dans le noyau. Cette particularité explique que l'utilisation de ces vecteurs se
limite souvent au transfert de gènes ex vivo dans des cellules cultivées au laboratoire et
qui ont un fort indice prolifératif. Une autre difficulté pour une application in vivo est la non
spécificité cellulaire des vecteurs rétroviraux. De nombreuses études en cours visent à
améliorer cette spécificité cellulaire en construisant des vecteurs rétroviraux hybrides
appelés "pseudotypés" contenant l’enveloppe d'un autre virus mieux reconnue par les
cellules cibles (Sinclair et al., 1997 ; Movassagh et al., 1998). Une autre alternative est de
modifier la protéine virale de l'enveloppe responsable de la liaison aux récepteurs
cellulaires en greffant un ligand reconnu par un récepteur plus rare qui n'apparaît que sur
les cellules ciblées par la thérapie (Cosset and Russell, 1996). Les autres désavantages
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sont : leur production difficile en grande quantité (il est en effet délicat de les concentrer
car ils sont fragiles et peuvent être facilement détruits durant leur préparation) ; la taille
limitée (8 kb) de la séquence génique que l'on peut transférer ; les risques de
mutagenèse insertionnelle. En effet, l'intégration du gène thérapeutique dans le génome
de la cellule hôte n'est pas contrôlée.
Ces nombreuses difficultés rencontrées avec les vecteurs rétroviraux font,
qu’aujourd’hui, leur utilisation en thérapie génique ne cesse de décroître. Une nouvelle
classe de vecteurs viraux appartenant à la famille des rétrovirus, mais qui permet
d’infecter des cellules quiescentes, est actuellement développée. Ce sont les vecteurs
lentiviraux.
c) Les vecteurs lentiviraux :
Les lentivirus, dont le plus connu est le virus du HIV (Human Immunodeficiency
Virus), appartiennent à la famille des rétrovirus (virus à ARN) mais, contrairement aux
rétrovirus, ils sont capables de transduire des cellules qui ne sont pas en voie de division
(les cellules quiescientes) (Lewis et al., 1992). En effet, ils sont capables d’accéder au
noyau des cellules cibles en l’absence de rupture de la membrane nucléaire en passant à
travers les nucléopores grâce à un signal de transport nucléaire présent à la surface de
leur capside (Gallay et al., 1996).
Dès le milieu des années 90, les vecteurs lentiviraux ont montré leur efficacité à
transduire in vitro et in vivo de nombreux types cellulaires différenciés comme les cellules
de la rétine (Miyoshi et al., 1997), du cerveau (Naldini et al., 1996 ; Blomer et al., 1997), de
l’épithélium bronchique (Limberis et al., 2002), du muscle et du foie (Kafri et al., 1997)
avec une stabilité de l’expression du transgène pouvant aller jusqu’à 6 mois et de faibles
réactions immunitaires.
Les vecteurs lentiviraux offrent donc une excellente opportunité pour leur utilisation
en thérapie génique. Cependant, comme pour les vecteurs rétroviraux, les vecteurs
lentiviraux manquent d’une spécificité cellulaire pour être efficacement utilisés in vivo.
Certaines équipes ont remplacé l'enveloppe du virus HIV par celle d'un autre virus pour
permettre un meilleur ciblage cellulaire (Kobinger et al., 2001 ; MacKenzie et al., 2002 ;
Lim et al., 2003). Néanmoins, le mécanisme d'infection de ces virus doit être
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Stéphanie Grosse, 2004
complètement élucidé et la sécurité de ces vecteurs doit réellement être évaluée avant de
pouvoir les utiliser dans des essais cliniques. De plus, la production de vecteurs
lentiviraux est difficile en grande quantité et doit être sécurisée. Différentes alternatives
sont développées pour obtenir des systèmes plus sûrs, notamment la délétion de plus
grandes parties du génome viral, la séparation en différentes unités des éléments
nécessaires à leur production pour éviter tout risque de formation de virus compétents ou
le développement de vecteurs lentiviraux non-humains obtenus à partir de lentivirus nonhumains
comme
le
FIV
(Feline
Immunodeficiency
Virus)
et
le
BIV
(Bovine
Immunodeficiency Virus) qui sont non pathogènes chez l’homme et qui semblent plus
acceptables pour une application clinique (Metharom et al., 2000 ; Vigna and Naldini,
2000 ; Sauter and Gasmi, 2001 ; Sauter et al., 2003). Des premières études ont déjà été
effectuées à l’aide de ces nouveaux vecteurs et ont montré qu’ils permettaient un transfert
de gènes efficace dans les cellules humaines (Poeschla et al., 1998). Ces résultats sont
très encourageants mais, là aussi, leur sûreté reste à être parfaitement étudiée pour
pouvoir un jour les utiliser dans un protocole clinique.
d) Les vecteurs adénoviraux :
Les adénovirus (Ad), sous leur forme naturelle, ne sont pas très nocifs. En effet,
chez les hommes, ce sont principalement des pathogènes respiratoires mineurs, ils sont
responsables des rhinites infectueuses banales chez les sujets non immunodéprimés. En
1985, le premier adénovirus recombinant (rAd) a été mis au point (Karlsson et al., 1985).
Aujourd'hui, les vecteurs rAd sont utilisés dans 27 % des protocoles cliniques et les plus
utilisés dérivent des sérotypes 2 et 5.
Les rAd présentent de nombreux avantages par rapport aux vecteurs rétroviraux
(pour revue : Lai et al., 2002). En effet, les rAd sont des virus contenant un large génome
à double brin d'ADN (36 kb) ce qui laisse prévoir qu'ils pourront transporter de longs
fragments d'ADN ; ils sont capables d'infecter in vitro et in vivo une grande variété de
cellules (musculaires, hépatiques, neuronales, pulmonaires) qu'elles soient quiescentes
ou en division avec une efficacité pouvant atteindre 100 % in vitro ; ils entrent dans les
cellules cibles par endocytose spécifique, grâce à leur reconnaissance par des
récepteurs cellulaires spécifiques et ils peuvent être produits à des concentrations
élevées.
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Stéphanie Grosse, 2004
Cependant, les rAd n'intègrent pas leur matériel génétique dans le génome de la
cellule hôte. Ceci limite le risque de mutagenèse insertionnelle mais l'expression du
transgène reste transitoire. L'ADN thérapeutique qui n'a pas la capacité de se répliquer
disparaît des cellules filles, au cours des divisions successives, par effet de dilution. Pour
compenser cet inconvénient, une administration répétée du gène thérapeutique semble
être une solution mais cette opération est délicate car les particules adénovirales sont
fortement immunogènes. En effet, les vecteurs rAd dits de première génération, qui
contiennent
la
majorité
des
gènes
viraux,
entraînent
d'importantes
réactions
immunitaires et inflammatoires dirigées contre les protéines adénovirales exprimées à
faible niveau (Bout et al., 1994a ; Tripathy et al., 1996). Ce sont ces réactions
immunitaires et inflammatoires qui ont provoqué aux Etats-Unis la mort du jeune Jesse
Gelsinger, en septembre 1999, qui avait subi 4 jours auparavant un traitement par thérapie
génique
utilisant
un
vecteur
rAd
(Teichler-Zallen,
2000).
Pour
réduire
cette
immunogénicité, des vecteurs rAd de seconde et troisième génération sont actuellement
en cours de développement (Wang and Finer, 1996). Ces nouveaux vecteurs rAd sont
soient des Ad chimériques où des protéines de la capside virale sont remplacées afin
d'être moins immunogènes, soient des vecteurs rAd qui ne comportent pas ou très peu de
séquences codant pour les protéines virales, appelés vecteurs "gutless" (Stecher et al.,
2001). Une autre méthode consiste à développer un vecteur chimère composé d'Ad et de
rétrovirus où l'Ad permet le ciblage cellulaire et le rétrovirus l'intégration du gène
thérapeutique (Feng et al., 1997). Ainsi, avec ce type de vecteur une administration unique
du gène thérapeutique pourrait être envisageable limitant les effets immunogènes.
Cependant, ce système a encore besoin d'être mieux caractérisé avant de pouvoir être
utilisé dans des essais cliniques car il présente des risques de mutagenèse insertionnelle.
e) Les vecteurs AAVs :
Les AAVs sont des petits virus non enveloppés à ADN simple brin appartenant à la
famille des parvovirus. Ils ont besoin de la présence d’un virus « helper » adénoviral pour
pouvoir se répliquer, d'où leur nom de virus associés aux adénovirus.
L'intérêt de leur utilisation en tant que vecteur pour le transfert de gènes provient du
fait qu'ils sont non pathogènes. Dans la population humaine, 70 à 90% des individus ont
été au moins une fois infectés par des AAVs sans conséquences pathologiques connues.
Ils sont capables d'infecter efficacement in vitro et in vivo de nombreux types cellulaires
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comme les cellules musculaires (Xiao et al., 1996 ; Fisher et al., 1997), hépatiques
(Koeberl et al., 1997), hématopoïétiques (Fisher-Adams et al., 1996), pulmonaires (Flotte
et al., 1992 ; Flotte et al., 1993 ; Conrad et al., 1996) et du cerveau (Kaplitt et al., 1994) et
quelque soit l’état des cellules, en division ou quiescentes (Podsakoff et al., 1994). De
plus, contrairement aux adénovirus, ils intègrent leur génome viral dans le génome de la
cellule hôte et contrairement aux rétrovirus, chez l'homme, cette insertion n'est pas
aléatoire mais se fait au niveau d’un site spécifique situé sur le bras long du chromosome
19 (Samulski et al., 1991 ; Samulski, 1993), ce qui pourrait limiter le risque de mutagénèse
insertionnelle.
Cependant, lorsqu'on modifie le génome des AAVs pour y introduire le gène
thérapeutique, les vecteurs AAVs recombinants (rAAV) restent capables d'infecter des
cellules quiescentes mais ne s'intègrent plus de façon spécifique dans le génome de la
cellule hôte (Kearns et al., 1996). De plus, la taille du gène thérapeutique à intégrer est
limitée à environ 5 kb et la production importante de vecteurs rAAV est très difficile
car il faut séparer l’AAV du virus « helper » pour une bonne purification. Aujourd’hui, de
nouvelles stratégies sont développées afin de permettre leur utilisation en thérapie
génique : une équipe allemande a permis de restaurer l’intégration spécifique en cotransfectant des cellules Hela avec un virus rAAV et un plasmide codant pour la séquence
du génome viral nécessaire à l'intégration (séquence codant pour la protéine Rep)
(Huttner et al., 2003). Pour augmenter la production, Liu et al. de Philadelphie, ont mis au
point un système de "roller bottles" qui permet une production de vecteurs AAVs 10 fois
supérieure à celle obtenue avec les méthodes conventionnelles (Liu et al., 2003).
Ces difficultés expliquent que les vecteurs AAVs aient été pendant longtemps peu
utilisés chez l'homme mais aujourd'hui, avec les nouvelles avancées, ils sont utilisés dans
2,4 % des protocoles cliniques.
En conclusion, les vecteurs viraux permettent un transfert de gènes efficace in vitro
et in vivo dans différents types cellulaires et les protocoles cliniques réalisés depuis
plusieurs années à l’aide de ces vecteurs sont encourageants. Cependant, leur
pathogénicité, les fortes réactions immunitaires et inflammatoires observées, la taille
limitée du gène thérapeutique à transfecter, les risques de mutagenèse insertionnelle et
leur faible production rendent leur utilisation à grande échelle difficile. C’est pourquoi, des
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vecteurs non viraux, dits synthétiques, sont développés. Ils présentent plusieurs
avantages sur le plan de la sécurité, du coût et de la facilité d’utilisation en thérapie
génique (pour revues : Li et al., 2001 ; Davis, 2002).
2 - 2 - 2 - Les vecteurs synthétiques
Les vecteurs synthétiques présentent plusieurs qualités par rapport aux vecteurs
viraux pour permettre un transfert de gènes simple et efficace : ils sont peu toxiques et
peu immunogènes ce qui permet des administrations répétées du transgène, il n'y a
théoriquement pas de limites à la taille du transgène à transférer (jusqu’à 50 kb) et ils
peuvent être produits facilement, en grande quantité et de façon stable. De plus, l’ADN
contenant le gène thérapeutique est un ADN plasmidique produit par fermentation
bactérienne, ce qui est très simple à produire. On peut distinguer deux classes de
vecteurs synthétiques : les lipides cationiques et les polymères cationiques. La
propriété de base commune à tous ces vecteurs synthétiques est leur caractère cationique
qui leur permet de s’associer à l’ADN (chargé négativement) par interactions
électrostatiques. Il en résulte des complexes (ADN/vecteur synthétique) plus ou moins
homogènes et cationiques où l’ADN se retrouve compacté, protégé et capable d’entrer
dans les cellules cibles.
a) Les lipides cationiques :
Les vecteurs lipidiques sont les vecteurs synthétiques les plus utilisés en thérapie
génique. Ils représentent 12 % des protocoles cliniques (www.wiley.co.uk/genetherapy).
Les premiers lipides cationiques utilisés pour le transfert de gènes ont été des lipides
classiques, des phospholipides, qui encapsulaient l’ADN plasmidique pour former des
complexes (ADN/lipide) appelés lipoplexes (Fraley et al., 1980 ; Nicolau and Sene, 1982).
Ces lipides ont montré une certaine efficacité de transfection, mais depuis 1987, de
nombreux lipides cationiques synthétiques ont été développés. C’est l’équipe californienne
de P. L. Felgner qui a développé le premier vecteur lipidique cationique synthétique
appelé le DOTMA (chlorure de dioléyloxypropyltrimethyl-ammonium) (Felgner et al.,
1987). Peu de temps après, en 1989, c’est l’équipe française de J. P. Behr qui mettait au
point un autre vecteur lipidique, une lipopolyamine appelée DOGS (dioctadécylamineglycine-spermine) (Behr et al., 1989). Tous ces vecteurs lipidiques synthétiques partagent
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une même structure schématique globale ; il s’agit de molécules amphiphiles composées
de trois domaines (Figure 9) :
•
Une tête polaire hydrophile chargée positivement, composée le plus souvent de
fonctions amines protonées pouvant interagir avec les phosphates de l’ADN pour
former les lipoplexes.
•
Un bras espaceur, dont la taille et la nature influencent la stabilité et la
biodégradabilité du vecteur lipidique.
•
Une partie hydrophobe, composée soit de deux chaînes d’acides gras (Figure
9A), soit de cholestérol (Figure 9B).
Figure 9 : Structure schématique globale des lipides cationiques synthétiques. (A)
Partie hydrophobe composée de deux chaînes d’acides gras ; (B) Partie hydrophobe
composée de cholestérol.
Ils peuvent être classés en trois grandes familles (Figure 10A) :
•
Les lipides monocationiques caractérisés par la présence d’une unique fonction
amine au niveau de la tête polaire.
•
Les lipides polycationiques dont la tête polaire est constituée d’une polyamine de
type spermine.
•
Les dérivés du cholestérol mono ou polycationiques.
Pour permettre un transfert de gènes efficace, la plupart de ces lipides cationiques
synthétiques
doivent
être
associés
à
un
co-lipide
neutre
comme
le
DOPE
(dioléoylphosphatidyléthanolamine) (Figure 10B). Il aide à déstabiliser la membrane
plasmique des cellules ce qui permet une meilleure entrée des lipoplexes dans les cellules
cibles et par ses propriétés fusogènes, permet un meilleur trafic intracellulaire des
lipoplexes (voir § 3 - 4 - 2a de la Partie I).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 10 : Structure chimique des vecteurs lipidiques cationiques synthétiques (A)
et du DOPE (B).
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Stéphanie Grosse, 2004
Les lipides monocationiques :
Une grande variété de lipides monocationiques est synthétisée afin d’augmenter
l’efficacité de transfection en jouant à la fois sur la longueur de la chaîne d’acide gras et
sur la taille et la nature du bras espaceur. Dans tous les cas, ils sont composés de deux
chaînes d’acides gras reliées grâce à un bras espaceur à une amine quaternaire simple.
Parmi les plus connus, on peut citer :
¾ Le DOTMA qui mélangé au DOPE est commercialisé sous le nom de Lipofectine®
et qui a montré sa capacité à transfecter efficacement de nombreux types cellulaires in
vitro et in vivo et ainsi la faisabilité du transfert de gènes à l’aide de vecteurs lipidiques
(Felgner and Ringold, 1989).
¾ Le DOTAP (méthylsulfate de dioléyloxypropyl-triméthylammonium) qui a in vivo une
faible toxicité, ce qui permet d’envisager des administrations répétées du transgène
(McLachlan et al., 1995).
¾ Le DDAB (bromure de diméthyl-dioctadécylammonium) qui s’est montré efficace
pour le transfert de gènes mais qui a une forte toxicité due à l’absence d’un bras espaceur
biodégradable (Rose et al., 1991).
¾ Le DMRIE (dimyristyloxypropyl-3-diméthyl-hydroxyéthylammonium) qui associé au
DOPE a permis d’augmenter d’un facteur 1000 la quantité d’ADN plasmidique
administrable in vivo et ceci en l’absence de toute toxicité. Ceci laisse penser que des
administrations répétées du transgène seraient possible à l’aide de ce type de lipide
(DMRIE/DOPE) (San et al., 1993).
¾ Enfin, l’équipe française de C. Férec a récemment développé une nouvelle famille
de lipides monocationiques, les phosphonolipides, dont la structure s’apparente à celle
des phospholipides membranaires. Ceci leur permet de fusionner plus facilement avec la
membrane plasmique des cellules cibles et donc une meilleure entrée cellulaire (Floch et
al., 1997). Ces phosphonolipides ont montré une efficacité de transfection in vitro et in vivo
dans différents types cellulaires, notamment dans les cellules hématopoïétiques et
pulmonaires (Guillaume-Gable et al., 1998 ; Delepine et al., 2000). Un des
phosphonolipides est le DMPTA (dimyristoleoyl phosphonomethyl trimethyl ammonium)
commercialisé sont le nom de LyoVec™ lorsqu’il est couplé au DOPE.
Les lipides polycationiques :
Les lipides polycationiques permettent un transfert de gènes plus efficace que les
lipides monocationiques. En effet, la liaison entre les chaînes grasses et la polyamine de
type spermine est une liaison peptidique métabolisable ce qui favorise une meilleure
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Stéphanie Grosse, 2004
biodégradabilité. De plus, les nombreuses fonctions amines protonées permettent une
meilleure compaction de l’ADN plasmidique.
Le premier lipide polycationique synthétisé a été le DOGS qui permet un transfert
de gènes efficace même en l’absence de DOPE (Behr et al., 1989). Cependant, les
lipoplexes (DOGS/DOPE), commercialisés sous le nom de Transfectam®, ont une
meilleure efficacité de transfection que le DOGS seul.
Un autre lipide polycationique connu est le DOSPA (2,3-dioléyloxy-N-2-(sperminecarboxamido)éthyl-N,N-diméthyl-1-propanammonium) appelé la Lipofectamine® lorsqu’il
est mélangé au DOPE (Hawley-Nelson et al., 1993). La Lipofectamine® a été utilisée in
vitro pour la transfection de très nombreuses lignées cellulaires et cultures primaires de
cellules et a une efficacité supérieure aux lipides monocationiques.
Les dérivés du cholestérol :
Plus récemment, plusieurs équipes ont développé des lipides dérivés du cholestérol
mono ou polycationiques. Le cholestérol facilite la fusion avec la membrane plasmique
des cellules cibles et permet ainsi une meilleure entrée cellulaire des lipoplexes (Chen and
Rand, 1997).
Le premier dérivé cationique du cholestérol a été le DC-Chol (3[N-(N’,N’diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol), synthétisé par Gao et Huang, qui peut être
produit facilement et de façon stable (Gao and Huang, 1991). Le DC-Chol permet un
transfert de gènes dans de nombreux types cellulaires avec une efficacité beaucoup plus
élevée que la Lipofectine® et une plus faible toxicité.
Aujourd’hui, la plupart des lipides dérivés du cholestérol développés sont
polycationiques. Ils sont caractérisés soit par une tête polaire de type spermine comme le
cholestéryl-spermidine commercialisé sous le nom de Transfectall® (Moradpour et al.,
1996) et le GL67 synthétisé par la société Genzyme (Cambridge, MA, USA) (Lee et al.,
1996) qui ont une efficacité de transfection 100 fois supérieure à celle obtenue avec
d’autres lipides cationiques ; soit ils sont caractérisés par une tête polaire de type
guanidinium où les groupements guanidinium favorisent les interactions avec l’ADN
plasmidique. Ces derniers ont été développés par l’équipe de P. Lehn, notamment le
BGSC (bis(guanidiniun)-spermidine-cholestérol) et le BGTC (bis(guanidinium)-trencholestérol) (Vigneron et al., 1996).
Les lipides cationiques représentent un outil souple et efficace pour le transfert de
gènes dans des cellules en culture et in vivo chez l’animal (pour revue : Gao and Huang,
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
1995). Des essais cliniques utilisant des lipides cationiques pour le traitement de maladies
génétiques, comme la mucoviscidose, ont été et sont entrepris (voir § 2 - 4 - 4c de la
Partie I). Cependant, l'efficacité de transfection à l'aide des lipides cationiques reste
inférieure à celle des vecteurs viraux et dépend de nombreux paramètres. En effet, les
variations des groupes polaires et la nature des chaînes acyles des lipides, le ratio
ADN/lipide, la taille et la forme des lipoplexes et le type de cellules à transfecter (en
division ou quiescentes) déterminent les propriétés de chaque lipide cationique et leur
efficacité de transfection (pour revues : Katsel and Greenstein, 2000 ; Pitard, 2002). Les
inconvénients majeurs des lipides cationiques pour le transfert de gènes sont rencontrés
lors des études in vivo : les lipoplexes ont un court pouvoir circulant et une demi-vie
courte après injection intraveineuse (Senior, 1987) ; de plus, les vecteurs lipidiques ne
permettent pas un ciblage cellulaire. Des efforts ont été effectués afin d'augmenter la
demi-vie des lipoplexes dans le système circulatoire en "coatant" les lipoplexes avec du
polyethylène glycol (PEG). Le PEG permet d’obtenir des lipoplexes neutres qui ne peuvent
plus interagir avec les protéines du sérum chargées négativement et qui ont ainsi une plus
longue circulation plasmatique (Klibanov et al., 1990 ; Allen et al., 1991). Pour permettre
un meilleur ciblage cellulaire, des protéines ou des peptides d’un manteau viral peuvent
être additionnés aux lipides cationiques donnant ainsi des vecteurs hybrides reconnus
spécifiquement par les cellules cibles (Yonemitsu et al., 1997) (voir § 2 - 4 - 3b de la Partie
I).
b) Les polymères cationiques :
Parmi les vecteurs synthétiques, une alternative à l’utilisation de lipides cationiques
pour le transfert de gènes est représentée par les polymères cationiques également
appelés polycations. Comme les lipides cationiques, ils se lient à l’ADN plasmidique par
interactions de charges formant des complexes (ADN/polycation) appelés polyplexes
(Felgner et al., 1997). Les polycations permettent un transfert de gènes efficace in vitro et
in vivo chez l’animal, mais aucun essai clinique utilisant ces composés n’est actuellement
publié. En thérapie génique, quatre types de polycations sont utilisés : des dérivés de
polylysine (Figure 11), des dérivés de polyéthylèneimine (Figure 12), des dendrimères
(Figure 13) et des nanosphères polymèriques.
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Les dérivés de polylysine :
La polylysine (pLK) est un polymère de lysine portant une charge cationique
uniforme ce qui lui permet de se lier à l’ADN plasmidique par interactions de charges afin
de former des polyplexes (Figure 11A). Toutefois, la pLK en tant que telle est peu active.
Pour obtenir un transfert de gènes efficace, la pLK doit être substituée par différents
ligands et doit être associée à un agent endosomolytique. En effet, la substitution de la
pLK par différents ligands reconnus spécifiquement par des récepteurs membranaires
présents à la surface des cellules cibles permet l’entrée cellulaire des polyplexes. Et
l’addition d’un agent endosomolytique dans le milieu de transfection favorise le trafic
intracellulaire des polyplexes (voir § 3 - 4 - 2 de la Partie I).
Le premier dérivé de pLK substitué par une glycoprotéine, l’asialo-orosomucoïde
(ASOR), a été développé en 1987 par l’équipe de Wu (Wu et al., 1987). L’ASOR étant
connue pour être un excellent ligand d’une lectine membranaire des cellules du
parenchyme hépatique, Wu et al. ont montré que les polyplexes (ADN/pLK-ASOR)
permettaient un transfert de gènes efficace in vitro dans des cellules d’hépatome humain
(cellules HepG2) qui expriment la lectine spécifique des asialoglycoprotéines (Wu et al.,
1987). Wu et al. ont également montré que le transfert de gènes à l’aide de pLK-ASOR
était sélectif puisqu’aucune efficacité de transfection n’était détectée dans des cellules qui
n’exprimaient pas la lectine spécifique des asialoglycoprotéines (Wu et al., 1988). Enfin, in
vivo, après injection par voie intraveineuse de polyplexes (ADN/pLK-ASOR), une
expression transitoire du transgène était observée (Wu et al., 1989). Ainsi, dès le début
des années 1990, une équipe avait montré qu’une pLK substituée par un ligand permettait
un transfert de gènes efficace in vitro et in vivo dans des cellules cibles.
Depuis, de nombreuses autres pLKs substituées par différents ligands ont été
développées. Les ligands les plus utilisés sont souvent de nature protéique comme la
transferrine
(Wagner
et
al.,
1990 ;
Zenke
et
al.,
1990)
ou
des
fragments
d’immunoglobuline (Ferkol et al., 1995) qui permettent un transfert de gènes efficace et
spécifique dans différents types cellulaires, comme les cellules hématopoïétiques ou les
cellules épithéliales des voies aériennes. Cependant, la synthèse de pLKs substituées par
des protéines est difficile et les conjugués obtenus pouvent être immunogènes. Plusieurs
équipes ont donc développé des pLKs substituées par des résidus osidiques comme le
lactose ou le mannose (Figures 11Ba et b) qui sont, comme les protéines, reconnus
spécifiquement par des récepteurs membranaires, les lectines présentes à la membrane
plasmique de nombreuses cellules animales (Monsigny et al., 1988 ; Midoux et al., 1993 ;
Ferkol et al., 1996). La glycosylation de la pLK est un processus simple où les différentes
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Stéphanie Grosse, 2004
étapes de glycosylation peuvent être bien contrôlées et le degré de substitution bien
maîtrisé. En général, une molécule de pLK contenant environ 190 résidus de lysine est
substituée par 50 unités osidiques ce qui confère à la pLK glycosylée la capacité d’être
reconnue par les lectines membranaires ayant une affinité pour l’unité osidique substituant
la pLK.
Un transfert de gènes efficace avec les pLKs glycosylées a été observé in vitro
dans des cellules d’hépatome (Midoux et al., 1993), dans des macrophages (Erbacher et
al., 1996a ; Ferkol et al., 1996) et dans des cellules épithéliales des voies aériennes
(Kollen et al., 1996 ; Fajac et al., 1999 ; Kollen et al., 1999 ; Allo et al., 2000). Il a été
vérifié que les pLKs glycosylées permettent un ciblage cellulaire spécifique. En effet,
Midoux et al. ont montré que la pLK lactosylée (Galβ-4Glc) était reconnue par les cellules
HepG2 qui expriment la lectine membranaire spécifique du galactose, mais qu’elle n’était
pas reconnue par les cellules tumorales humaines HeLa qui n’expriment pas la lectine du
galactose (Midoux et al., 1993). La pLK mannosylée était, quant à elle, reconnue par les
macrophages qui expriment la lectine du mannose mais pas par les cellules HepG2 qui
n’expriment pas cette lectine (Midoux et al., 1993 ; Ferkol et al., 1996). La pLK
mannosylée permettait donc un transfert de gènes efficace seulement dans les
macrophages. Ainsi, chaque pLK glycosylée permet un transfert de gènes in vitro dans un
type cellulaire donné. Cependant, les pLKs glycosylées les mieux endocytées ne sont pas
forcément les plus efficaces en transfert de gènes (Fajac et al., 1999 ; Allo et al., 2000).
En effet, dans les cellules épithéliales des voies aériennes humaines, les complexes
plasmide/pLK mannosylée sont les mieux endocytés en raison de la présence majoritaire
d’une lectine spécifique au mannose à la surface de ces cellules mais ne permettent pas
un transfert de gènes efficace. En revanche, les complexes plasmide/pLK lactosylée qui
sont peu endocytés en raison d’un plus faible nombre de récepteurs au lactose à la
surface de ces cellules assurent une meilleure transfection (Fajac et al., 1999 ; Allo et al.,
2000). Ainsi, après reconnaissance de l’oside, les lectines favorisent l’entrée cellulaire
des complexes (ADN/pLKs glycosylées), appelés glycoplexes™, mais joueraient
également un rôle dans le trafic intracellulaire de ces glycoplexes™ (pour revue :
Monsigny et al., 1999).
Les dérivés de pLKs nécessite l’addition d’agents endosomolytiques pour permettre
un transfert de gènes efficace, ce qui rend leur utilisation in vivo difficile. Plusieurs études
ont été effectuées afin de développer de nouveaux dérivés de pLKs qui ne nécessitent pas
d’agents endosomolytiques. En 1999, l’équipe du Pr. M. Monsigny développait une pLK
partiellement substituée par des résidus histidyles (Midoux and Monsigny, 1999). Les
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résidus histidyles (Figure 11Bc) ont un groupement imidazole qui se protone à pH
légèrement acide (pH < 6) ce déstabilise la membrane des vésicules endosomales et donc
améliore le trafic intracellulaire des complexes (ADN/pLK histidylée) (voir § 3 - 4 - 4 de la
Partie I). Ce nouveau dérivé de pLK permet un transfert de gènes efficace in vitro dans
différents types cellulaires, notamment dans les cellules épithéliales ou glandulaires
séreuses des voies aériennes, sans que l’addition d’agents endosomolytiques n’augmente
l’efficacité de transfection (Midoux and Monsigny, 1999 ; Fajac et al., 2000). Cependant,
cette pLK histidylée ne permet plus d’obtenir un ciblage cellulaire spécifique.
Figure 11 : Structure chimique des dérivés de polylysine. (A) Structure de la
polylysine ; (B) Structure de différents résidus pouvant substituer la polylysine : (a) résidus
de lactose, (b) résidus de mannose, (c) résidus histidyle.
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Les dérivés de polyéthylèneimines :
Le polyéthylèneimine (PEI) est un polymère utilisé depuis longtemps dans
l’industrie en chromatographie liquide de haute performance pour séparer les protéines
des acides nucléiques. Il a été utilisé pour la première fois comme vecteur de transfert de
gènes en 1995 par l’équipe française de J. P. Behr et a l’avantage de posséder une
activité endosomolytique intrinsèque (Boussif et al., 1995).
Le PEI est un polymère formé par la répétition d’unité d’éthylène-imine présentant
une amine tous les trois atomes (Figure 12). Il a ainsi la possiblité d’avoir une densité de
charges positives extrêmement élevée ce qui lui permet de bien condenser l’ADN
plasmidique par interactions électrostatiques. Cependant, toutes les amines du PEI ne
sont pas protonées à pH physiologique et les fonctions amines restantes jouent un rôle
important durant le trafic intracellulaire des complexes (ADN/PEI) (Behr, 1996) (voir § 3 - 4
- 4 de la Partie I). Suivant le mode de polymérisation, il existe deux formes de PEIs : une
branchée (Figure 12A) et une linéaire (Figure 12B). Il existe également des composés de
poids moléculaires variables en fonction du degré de polymérisation : 800 Da, 2 kDa, 25
kDa, 50 kDa, 800 kDa (PEIs branchés) et 22 kDa, 88 kDa, 220 kDa (PEIs linéaires).
Figure 12 : Structure chimique des dérivés de polyéthylèneimine (PEI)
(A) PEI branché ; (B) PEI linéaire
Depuis 1995, de nombreuses études in vitro et in vivo de transfert de gènes à l’aide
de dérivés de PEIs ont été effectuées dans différents types cellulaires (fibroblastes,
cellules rénales, hépatocytes, cellules pulmonaires, cellules endothéliales…). Cependant,
l’efficacité de transfection à l’aide de ces vecteurs varie suivant la forme et le poids
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moléculaire du PEI utilisé (pour revues : Demeneix et al., 1998 ; Kircheis et al., 2001). Il a
ainsi été montré que des PEIs de faibles poids moléculaires, comme les PEIs branchés de
0,7 et 2 kDa, permettaient un transfert de gènes beaucoup moins efficace que les PEIs
branchés ou linéaires ayant un poids moléculaire supérieure à 20 kDa mais que
l’augmentation du poids moléculaire jusqu’à 800 kDa n’améliorait pas cette efficacité. En
effet, des études in vivo ont montré que le PEI branché de 25 kDa donnait un transfert de
gènes plus efficace que les PEIs branchés de 50 et 800 kDa. In vitro, il a été montré que
l’efficacité des PEIs linéaires était comparable à celle des PEIs branchés de même poids
moléculaire. Cependant, in vivo, il a été montré que le PEI linéaire de 22 kDa,
commercialisé sous le nom de ExGen 500, permettait une meilleure efficacité de
transfection. Dans tous les cas, l’ensemble de ces travaux a montré qu’in vivo certains
dérivés de PEIs avaient une efficacité de transfection supérieure à celle des dérivés de
pLKs et des lipides cationiques (pour revue : Lemkine and Demeneix, 2001). Certaines
études ont cependant montré que les dérivés de PEIs provoquaient une toxicité cellulaire
(pour revue : Godbey et al., 1999b).
Pour pouvoir un jour les utiliser dans des essais cliniques, leur efficacité de
transfection doit encore être améliorée (pour revue : Kichler, 2004). Pour cela, plusieurs
équipes ont "coaté" le PEI avec du PEG. Comme pour les lipides cationiques, l’addition de
PEG permet d’augmenter la durée de vie des complexes (ADN/PEI) dans le système
circulatoire et de baisser la toxicité en inhibant les interactions entre les polyplexes et les
protéines du sérum (Ogris et al., 1999 ; Kichler et al., 2002 ; Rudolph et al., 2002). Les
PEIs peuvent aussi être couplés à différents ligands pour améliorer le ciblage cellulaire.
Ces ligands peuvent être, comme pour les dérivés de pLKs, soit de nature protéique
comme la transferrine (Kircheis et al., 1997 ; Rudolph et al., 2002), soit des résidus
osidiques comme le galactose qui est reconnu par des lectines membranaires présentes à
la surface des hépatocytes (Zanta et al., 1997) ou le mannose qui est reconnu par les
cellules dendritiques (Diebold et al., 1999).
Les dendrimères :
Les dendrimères (Figure 13) sont des polymères de polyamidoamines qui ont été
développés en 1993 par l’équipe californienne de F. C. Szoka pour pouvoir être utilisés
comme vecteurs de transfert de gènes (Haensler and Szoka, 1993). Ils sont solubles dans
l’eau, ils ont une structure ramifiée et comportent une forte densité d’amines qui permet
une bonne compaction avec l’ADN plasmidique par interactions de charges et une activité
endosomolytique intrinsèque. Ces fonctions amines sont primaires en surface et tertiaires
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à l’intérieur. La croissance du dendrimère se fait par couches concentriques à partir d’un
noyau initiateur, trivalent ou tétravalent, sur lesquelles se greffent deux nouveaux
polymères par groupe. Ainsi, la taille ou le diamètre du dendrimère est fonction du nombre
de cycles de polymérisation effectués lors de leur synthèse. Il est important de bien
déterminer le nombre de cycles de polymérisation nécessaire pour permettre une bonne
efficacité de transfection. En effet, l’efficacité de transfection à l’aide des dendrimères est
optimale avec des dendrimères de génération 5 à 10 ce qui correspond au moins à 6
cycles de polymérisation, les dendrimères de génération inférieure à 5 sont peu efficaces
(Kukowska-Latallo et al., 1996).
Figure 13 : Structure chimique d’un dendrimère
Globalement, les dendrimères sont plus performants que les lipides cationiques
pour le transfert de gènes. Ils ont une efficacité de transfection in vitro dans de nombreux
types cellulaires avec une faible toxicité (Haensler and Szoka, 1993 ; Kukowska-Latallo et
al., 1996). Ils sont également capables de transfecter efficacement ex vivo des cellules
endothéliales (Hudde et al., 1999) et in vivo, des cellules de l’épithélium respiratoire
(Kukowska-Latallo et al., 2000). Cependant, leur efficacité est inférieure à celle des
dérivés de PEIs et des modifications sont actuellement en cours pour pouvoir les
améliorer. Pour cela, certaines équipes ont déjà développé des dendrimères dégradés
appelés «fractured dendrimers» qui sont vraisemblablement plus flexibles, moins toxiques
et qui permettent de former des polyplexes plus stables que les dendrimères non
dégradés (Tang et al., 1996 ; Turunen et al., 1999).
Les nanosphères polymèriques :
Les nanosphères polymèriques sont synthétisées en mélangeant un ADN
plasmidique avec une solution aqueuse de polymère linéaire cationique, comme la
gélatine ou le chitosan, afin d’obtenir des nanoparticules de moins de 25 nm de diamètre
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(Truong-Le et al., 1998 ; Mao et al., 2001). La formation de ces nanosphères implique des
interactions ioniques mais aussi des modifications physiques de l’ADN encapsulé à
l’intérieur des particules. Les nanosphères permettent un transfert de gènes efficace in
vitro et in vivo dans plusieurs types cellulaires et notamment dans les cellules quiescentes
car l’encapsulation de l’ADN plasmidique protége l’ADN contre les nucléases et leur petite
taille favorise une entrée nucléaire à travers les pores. Cependant, l’efficacité reste plus
faible que celle obtenue à l’aide de lipides cationiques ou d’autres polymères cationiques
(pour revue : Li and Ma, 2001). Des études sont en cours pour améliorer le ciblage
cellulaire (addition de ligands comme la transferrine) et l’échappement endosomal
(addition d’agents endosomolytiques) (Leong et al., 1998).
2 - 2 - 3 - Synthèse
Le tableau 1 résume les principales caractéristiques (avantages et inconvénients)
des principaux vecteurs utilisés en thérapie génique et montre qu’il n’existe toujours pas à
l’heure actuelle de vecteur idéal (pour revue : Breyer et al., 2001).
Tableau 1 : Les principaux vecteurs utilisés en thérapie génique et leurs principales
caractéristiques (pour revue : Breyer et al., 2001)
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2 - 3 - LES ESSAIS CLINIQUES : GENERALITES
Les essais cliniques en thérapie génique ont officiellement commencé en 1990,
lorsque l’équipe de F. Anderson aux Etats-Unis a débuté le premier protocole de transfert
de gènes dans des lymphocytes d'un enfant atteint de déficit en adénosine déaminase
(ADA) (Anderson et al., 1990). Ce protocole a ensuite été suivi par beaucoup d'autres. En
effet, depuis le début des années 90, à travers le monde, 636 essais cliniques de
thérapie génique ont été ou sont en cours de réalisation incluant 3496 patients
(www.wiley.co.uk/genetherapy). La plupart de ces essais cliniques sont des essais de
phase I (étude de faisabilité et de toxicité) ou II (étude d'efficacité sur un faible nombre de
patients) et concernent principalement les cancers mais aussi les maladies monogéniques
(mucoviscidose, hémophilie B, myopathie…), infectieuses et vasculaires.
Les premiers résultats de ces essais cliniques ont montré que la thérapie génique
oscille entre espoirs et déceptions. En effet, de nombreux obstacles sont apparus à la
réalisation de la thérapie génique : il est nécessaire de connaître le gène responsable de
la maladie et sa séquence, de savoir le cloner mais surtout, de mettre au point un vecteur
de transfert de gènes efficace et sélectif, de réussir à obtenir une expression stable de la
protéine thérapeutique et de s’assurer qu’il n’y a pas d’effets secondaires nocifs causés
par cette procédure. Toutefois, en décembre 1999, a été publié en France le premier
succès probant de thérapie génique par l'équipe française du Pr. A. Fisher de l'unité
Inserm U429 pour le traitement d'un déficit immunitaire d'origine génétique (CavazzanaCalvo et al., 2000).
Depuis 1999, Cavazzana et al. ont montré que neuf enfants atteints d’un déficit
immunitaire combiné sévère lié au chromosome X (SCID-X1) ont pu être soignés par la
thérapie génique ex vivo (pour revue : Hacein-Bey-Abina et al., 2002). Ce déficit est lié au
blocage de la différenciation des cellules T et NK (Natural Killer). Il est dû à une anomalie
d’un gène porté par l’X qui code une sous-unité (gamma-c) commune aux récepteurs des
interleukines 2, 4, 7, 9 et 15 responsables de la stimulation, de la prolifération et de la
différenciation des progéniteurs lymphoïdes (pour revue : Hacein-Bey et al., 2001). Les
cellules souches des lymphocytes T ponctionnées dans la moelle osseuse ont été
sélectionnées (cellules CD34+), transfectées à l’aide d’un vecteur rétroviral contenant le
gène thérapeutique, sélectionnées, puis réinjectées par voie intraveineuse chez les
patients. Trois mois après la réimplantation des cellules traitées, le développement de
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lymphocytes T et NK a été observé. Cette belle réussite démontrait la faisabilité de la
thérapie génique. Cependant, en octobre 2002 puis en janvier 2003, est survenue une
complication chez deux des neuf enfants traités. Ils ont développé une maladie
leucémique due à une prolifération non contrôlée des lymphocytes T. Cette complication
serait due à une mutagenèse insertionnelle. En effet, le gène thérapeutique se serait
intégré au niveau du promoteur de l’oncogène LMO-2 ce qui aurait provoqué une
augmentation de l’expression de LMO-2 (Hacein-Bey-Abina et al., 2003). Aujourd’hui, un
traitement par chimiothérapie a été entrepris pour ces deux enfants avec une réponse
thérapeutique satisfaisante. Les autres enfants font l’objet d’une surveillance clinique et
biologique renforcée et les essais cliniques qui avaient été stoppés vont reprendre chez
ces patients dont la thérapie génique reste la seule chance de survie. Un nouveau vecteur
viral dérivé d’un lentivirus est actuellement en cours de développement par l’équipe d’Alain
Fischer. Néanmoins, plusieurs patients sont actuellement guéris du syndrôme SCID-X1
grâce à la thérapie génique, ce qui conforte l’idée de continuer à développer des vecteurs
de transfert de gènes efficaces et sûrs pour le traitement d’autres maladies comme la
mucoviscidose.
2 - 4 - LA THERAPIE GENIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE
La caractérisation du gène CFTR et la démonstration in vitro que le transfert du
gène CFTR normal dans des cellules épithéliales issues de patients mucoviscidosiques
corrige les anomalies de transports ioniques (Rich et al., 1990) ont encouragé de
nombreuses équipes à envisager la thérapie génique comme une voie permettant de
traiter la cause de la maladie et non plus ses conséquences (pour revue : Clement et al.,
1998).
2 - 4 - 1 - Les cellules cibles
Dans le cas de la mucoviscidose, comme nous l’avons vu précédemment, l’appareil
respiratoire apparaît être l'organe à traiter préférentiellement, notamment les cellules
épithéliales des voies aériennes qui expriment le plus la protéine CFTR. Cependant, les
caractéristiques anatomiques et histologiques de cet organe font qu’un transfert de gènes
ex vivo ne peut pas être utilisé. Seule une stratégie de transfert de gènes in vivo (par voie
sanguine ou respiratoire) semble possible, mais reste peu performante pour atteindre les
cellules cibles. Cependant, une modification génétique de toutes les cellules épithéliales
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des voies aériennes peut ne pas être nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique. En
effet, des expérimentations in vitro et in vivo ont montré qu’un transfert du gène CFTR
dans seulement 10 % des cellules épithéliales permettrait une correction des anomalies
de transport des ions chlorures de la population cellulaire dans son ensemble (Johnson et
al., 1992 ; Dorin et al., 1996). L’ensemble de ces données ont encouragé de nombreuses
équipes à entreprendre des études pré-cliniques de transfert du gène CFTR chez l’animal.
2 - 4 - 2 - Les modèles animaux
De nombreux travaux ont été effectués chez des animaux sains (souris, rats, porc,
primates…) ou avec des modèles murins mucoviscidosiques (pour revue : Grubb and
Boucher, 1999). La première lignée de souris homozygotes pour une mutation dans le
gène responsable de la mucoviscidose fut construite par Snouwaert et al. en 1992, par
interruption du gène CFTR au niveau de l’exon 10 (Snouwaert et al., 1992). Depuis,
plusieurs autres lignées de souris transgéniques mucoviscidosiques ont été générées. La
plupart portent une anomalie au niveau de l’exon 10 soit par insertion (Dorin et al., 1992 ;
Ratcliff et al., 1993 ; Kent et al., 1997), soit par recombinaison homologue afin d’obtenir
des lignées « ∆F508 » (Colledge et al., 1995 ; van Doorninck et al., 1995 ; Zeiher et al.,
1995). Parmi les autres lignées générées, une est mutée au niveau de l’exon 11 (génotype
G551D) (Delaney et al., 1996) et deux autres portent une mutation entraînant un
déphasage du cadre de lecture soit par duplication de l’exon 3 (O'Neal et al., 1993), soit
par une insertion au niveau de l’exon 1 (Rozmahel et al., 1996). L’ensemble de ces souris
transgéniques développe rapidement des troubles gastro-intestinaux semblables à ceux
décrits chez l'homme. Cependant, malgré une déficience du transport des ions chlorures
dans les cellules épithéliales des voies aériennes, aucune maladie spontanée n'est
évidente dans l'appareil respiratoire de ces souris. Ces animaux développent seulement
plus fréquemment que les souris normales des lésions pulmonaires à la suite d'infections
bactériennes expérimentales (Davidson et al., 1995).
Certaines équipes ont mis l’accent sur la nécessité de créer d’autres modèles
animaux, comme des lapins mucoviscidosiques (Vuillaumier et al., 1997) ou des
moutons mucoviscidosiques (Tebbutt et al., 1995 ; Harris, 1997) car la séquence du
gène CFTR et la spécificité d’expression de la protéine CFTR, ainsi que la biologie du
poumon sont très proches entre ces espèces et l’homme. Parallèlement, d’autres équipes
se sont attachées à développer des souris portant des xénogreffes de tissus pulmonaire
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mucoviscidosique fœtal humain (Peault et al., 1994). Un nombre relativement important de
travaux a également utilisé comme modèle animal des primates non humains qui ont,
contrairement aux rongeurs, une structure trachéobronchique semblable à celle de
l'homme (Engelhardt et al., 1993 ; Simon et al., 1993 ; Conrad et al., 1996 ; McDonald et
al., 1998). L’ensemble de ces animaux ont permis d’étudier dans un premier temps la
toxicité et l’efficacité des vecteurs de transfert de gènes in vivo.
2 - 4 - 3 - Les études pré-cliniques
a) A l’aide de vecteurs viraux :
Les vecteurs viraux les plus utilisés pour les études in vivo de thérapie génique de
la mucoviscidose sont les vecteurs adénoviraux. En effet, plusieurs caractéristiques
biologiques font des adénovirus un outil de choix pour le traitement de la mucoviscidose
(voir § 2 - 2 - 1d de la Partie I). Brièvement, ils possèdent un tropisme naturel pour les
voies respiratoires et peuvent infecter très efficacement des cellules quiescentes.
Des instillations nasales ou trachéo-bronchiques d'ADNc CFTR à l'aide d'un vecteur
adénoviral ont été réalisées chez le singe (Engelhardt et al., 1993 ; Simon et al., 1993 ;
Bout et al., 1994a ; Bout et al., 1994b ; Brody et al., 1994 ; Zabner et al., 1994 ; Sene et
al., 1995). Ces travaux ont confirmé ceux effectués chez le rat des cotonniers (Rosenfeld
et al., 1992 ; Zabner et al., 1994) : l'ARN CFTR était détecté par RT-PCR jusqu'à 128 jours
après l'instillation virale, le vecteur viral recombinant restait confiné dans le tissu cible
(épithélium respiratoire) et ne se disséminait que rarement (œsophage et rate), ou pas du
tout dans d'autres organes. Ces résultats étaient très encourageants. Cependant, une
toxicité était observée chez les singes ayant reçu les plus fortes doses de vecteur
adénoviral. Ainsi, dès les premières études in vivo, était mise en évidence
l’immunogénicité des vecteurs adénoviraux qui constitue encore aujourd’hui leur
inconvénient majeur.
Un autre inconvénient rencontré lors des études in vivo de transfert de gènes à
l’aide de vecteurs adénoviraux est leur faible entrée dans les cellules de l’épithélium
respiratoire. En effet, les vecteurs adénoviraux entrent dans les cellules par endocytose
spécifique grâce à des récepteurs cellulaires spécifiques (CAR, intégrines αv et β3/5)
(Wickham et al., 1993 ; Bergelson et al., 1997 ; Tomko et al., 1997). Cependant, il
semblerait que dans les cellules différenciées des voies aériennes, l’entrée des vecteurs
adénoviraux soit limitée par une faible capacité d’endocytose de la membrane apicale de
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ces cellules et une absence de récepteurs et d’intégrines spécifiques à la membrane
apicale (Zabner et al., 1997 ; Pickles et al., 1998). Les récepteurs seraient plus présents
au pôle baso-latéral des cellules, mais celui-ci est inaccessible en raison des jonctions
serrées présentes entre les cellules. Différentes voies de recherche sont proposées :
ouvrir transitoirement les jonctions serrées pour permettre l’accès du vecteur à son
récepteur (Parsons et al., 1998) ou recibler les vecteurs adénoviraux avec des peptides
reconnus par des récepteurs présents à la surface apicale des cellules épithéliales des
voies aériennes (Zabner et al., 1999 ; Jost et al., 2001).
D’autres vecteurs viraux sont actuellement utilisés pour une application à la thérapie
génique de la mucoviscidose, ce sont les vecteurs AAVs. Ils ont les mêmes
caractéristiques biologiques que les adénovirus avec en plus, la particularité de pouvoir
intégrer leur génome viral dans le génome de la cellule hôte (voir § 2 - 2 - 1e de la Partie
I).
L’instillation d’AAV-CFTR dans le poumon de lapins a permis le transfert et la
persistance du gène durant plus de 6 mois et peu de réponses immunitaires étaient
observées (Flotte et al., 1993). Des résultats identiques ont été retrouvés chez le singe
(Conrad et al., 1996). Ainsi, la faisabilité de la technique, l’expression à long terme du
transgène et la relative innocuité des vecteurs AAVs ont pu être démontrées.
Cependant, les vecteurs AAVs n’intègrent pas leur génome contenant le transgène
de façon spécifique dans celui de la cellule hôte, contrairement aux AAVs sauvages, ce
qui implique des risques de mutagénèse insertionnelle (Kearns et al., 1996). De plus, tous
les sérotypes d’AAVs ne permettent pas un transfert de gènes efficace dans l’épithélium
respiratoire. En effet, comme pour les vecteurs adénoviraux, l’entrée de certains sérotypes
d’AAVs dans les cellules de l’épithélium respiratoire est limitée en raison d’une absence
de récepteurs spécifiques des AAVs à la surface apicale de ces cellules. Ainsi, l’AAV2 qui
est reconnu par les récepteurs protéoglycanes héparanes sulfates (HSPGs) (Summerford
et al., 1998) a une entrée in vivo limitée dans les cellules épithéliales des voies aériennes
due à l’absence de HSPGs à la membrane apicale de ces cellules (Zabner et al., 2000).
Alors que l’AAV5 permet un transfert de gène plus efficace en raison d’une entrée
cellulaire via les acides sialiques qui sont présents à la surface apicale des cellules
épithéliales des voies aériennes (Zabner et al., 2000 ; Walters et al., 2001). Un autre
obstacle à l’utilisation des vecteurs AAVs est la taille limitée du transgène à insérer qui est
d’environ 5 kb. Afin de contrer cette difficulté, une équipe américaine a délété une partie
du gène CFTR et a montré que l’utilisation d’un gène CFTR délété au niveau des parties
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codant pour le domaine R n’empêchait pas d’obtenir in vivo une amélioration des
anomalies de transport des ions chlorures (Ostedgaard et al., 2002).
Les vecteurs lentiviraux sont également des vecteurs de choix pour les études
pré-cliniques de thérapie génique de la mucoviscidose : ils sont capables de transfecter
des cellules quiescentes, contrairement aux vecteurs rétroviraux, et sont capables
d’intégrer leur génome dans celui de la cellule hôte (voir § 2 - 2 - 1c de la Partie I).
Limberis et al. ont montré qu’un vecteur lentiviral HIV permettait un transfert du
gène CFTR efficace in vivo dans l’épithélium respiratoire de souris mucoviscidosiques
avec une persistance de l’expression du transgène pouvant aller jusqu’à 92 jours et une
correction du transport ionique visible au moins pendant 110 jours (Limberis et al., 2002).
Cependant, comme pour les vecteurs adénoviraux et AAVs, l’entrée des vecteurs
lentiviraux dans les cellules épithéliales des voies aériennes par la surface apicale est
difficile (Goldman et al., 1997).
Pour augmenter l’entrée cellulaire et l’efficacité de transfection à l’aide des vecteurs
lentiviraux, certaines équipes les ont pseudotypés avec des glycoprotéines de l’enveloppe
de virus appartenant à la famille des Filovirus qui affectent naturellement les cellules de
l’épithélium respiratoire. Ainsi, ce type de vecteur devrait avoir une meilleure entrée in vivo
dans les cellules épithéliales des voies aériennes. En effet, Kobinger et al. ont montré
qu’un vecteur HIV pseudotypé par les protéines de l’enveloppe du virus Ebola était
capable d’infecter des cellules épithéliales des voies aériennes humaines via une entrée
par la surface apicale. Après instillation intratrachéale de ce vecteur chez la souris, une
forte expression du transgène était observée dans les cellules de l’épithélium respiratoire,
notamment dans les cellules des glandes sous muqueuses (65 % des cellules étaient
transfectées) avec une persistance de l’expression jusqu’au 63ème jour après
l’administration (Kobinger et al., 2001). Ces résultats sont très encourageants pour une
application clinique mais il est encore difficile d’obtenir un haut titre de vecteurs lentiviraux
pseudotypés et leur sûreté d’emploi doit être parfaitement étudiée.
Les difficultés à transfecter efficacement les cellules épithéliales différenciées des
voies aériennes par la surface apicale, les risques de mutagénèse insertionnelle, la taille
limitée du transgène à insérer, les réponses immunitaires observées avec les vecteurs
viraux, leur production difficile en grande quantité et les risques liés à l’utilisation de virus
font que de nombreuses équipes préfèrent utiliser des vecteurs synthétiques pour le
transfert du gène CFTR.
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b) A l’aide de vecteurs synthétiques :
Plusieurs équipes ont montré la capacité de différents lipides cationiques
(DOTMA, DOTAP, phosphonolipides, DOGS, BGTC…) à transférer efficacement chez la
souris un gène rapporteur dans les cellules de l’épithélium respiratoire (les cellules
épithéliales de surface et les cellules glandulaires) en l’absence de toute toxicité
(McLachlan et al., 1995 ; Fortunati et al., 1996 ; Oudrhiri et al., 1997 ; Guillaume-Gable et
al., 1998). D’autres équipes ont montré qu’après instillation intratrachéale ou nébulisation
chez la souris de complexes (CFTR/lipides cationiques), l'ARN CFTR pouvait être détecté
jusqu'à 4 semaines dans les cellules épithéliales des voies aériennes, qu’une correction
partielle des anomalies de transport ionique et qu’une faible immunogénicité pouvaient
être observées (Yoshimura et al., 1992 ; Alton et al., 1993 ; Hyde et al., 1993). Une étude
effectuée chez le rat Sprague-Dawley a montré qu’après instillation dans les voies
aériennes de complexes (CFTR/DOTMA-DOPE) ou (CFTR/DMRIE-DOPE), 30-50 % des
cellules épithéliales des voies aériennes exprimaient CFTR (Logan et al., 1995).
L’ensemble de ces résultats semblent montrer que les lipides cationiques sont
moins toxiques que les vecteurs viraux (Alton et al., 1993 ; Guillaume-Gable et al., 1998)
et que des administrations répétées du transgène peuvent être envisagées (McLachlan et
al., 1995). Cependant, quel que soit le lipide utilisé, l’efficacité du transfert de gènes reste
inférieure à celle obtenue avec les vecteurs adénoviraux et dépend de nombreux
paramètres qui commencent à être mieux connus comme les caractéristiques physicochimiques des lipoplexes (Lee et al., 1996 ; Densmore et al., 1999). Mais, outre leur faible
efficacité, leur inconvénient majeur reste l'absence de ciblage cellulaire. Pour permettre un
meilleur ciblage cellulaire, Yonemitsu et al. ont développé un vecteur hybride « liposomeHVJ » constitué d’un lipoplexe et de l’enveloppe du virus Sendai (HVJ), un membre de la
famille des paramyxovirus de souris qui entre dans les cellules épithéliales des voies
aériennes via le cholestérol et les acides sialiques présents à la membrane apicale des
cellules. Après une administration par aérosol dans des poumons de rats, ce vecteur est
capable de cibler les cellules de l’épithélium des voies aériennes et permet une efficacité
de transfection supérieure à celle obtenue avec les lipoplexes non hybrides (Yonemitsu et
al., 1997), mais l’addition de protéines virales n’est pas dénuée de toxicité.
Les polymères cationiques (dérivés de pLKs, de PEIs, dendrimères et
nanosphères polymèriques) sont depuis quelques années, de plus en plus utilisés dans
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les protocoles pré-cliniques de transfert de gènes rapporteurs ou du gène CFTR. Les
polycations permettent un meilleur ciblage cellulaire que les vecteurs viraux et les lipides
cationiques car ils peuvent facilement être substitués par des ligands reconnus par des
récepteurs spécifiques localisés à la membrane plasmique des cellules cibles, les cellules
épithéliales des voies aériennes dans le cas de la mucoviscidose. Ainsi, des fragments
d’immunoglobulines (Ig) (Ferkol et al., 1995), un ligand peptidique issu de l’α1-antitrypsine
(α1-AT) (reconnu par le récepteur SEC exprimé à la surface des cellules épithéliales des
voies aériennes) (Ziady et al., 2002) et la transferrine (Rudolph et al., 2002) peuvent être
facilement additionnés aux vecteurs polycationiques.
L’injection intraveineuse de complexes (ADN/pLK-Ig) chez le rat a montré une
expression du transgène dans l’épithélium respiratoire, notamment dans les cellules
épithéliale de surface et dans les cellules des glandes sous-muqueuses (Ferkol et al.,
1995). Ziady et al. ont montré que des complexes (ADNc CFTR/pLK-α1-AT) permettaient
une expression du transgène dans l’épithélium nasal de souris jusqu’à 18 jours après
l’administration des complexes avec une correction partielle des anomalies de transport
des ions chlorures (Ziady et al., 2002). Ainsi, les dérivés de pLKs substituée par certains
ligands permettent un transfert de gènes in vivo efficace dans l’épithélium respiratoire.
Cependant, les dérivés de PEIs se sont avérés encore plus efficaces.
En effet, une administration par aérosol de complexes (ADN/PEI branché) a montré
une expression du transgène dans les cellules épithéliales des voies aériennes de souris
jusqu’à 28 jours après l’administration, soit 10 jours de plus qu’avec les pLKs et cette
efficacité de transfection était 100 fois supérieure à celle obtenue avec les lipides
cationiques (Densmore et al., 2000 ; Gautam et al., 2000 ; Gautam et al., 2001). Des
résultats identiques ont été obtenus chez le lapin avec le PEI linéaire de 22 kDa (Ferrari et
al., 1997). Cette équipe a également montré qu’une administration répétée des complexes
(ADN/PEI 22 kDa) chez l’animal était possible jusqu’à 21 jours consécutifs sans provoquer
de réponses immunitaires contre les complexes (Ferrari et al., 1999). Goula et al. ont
observé qu’après injection intraveineuse de complexes (ADN/PEI 22 kDa) chez la souris,
des groupes d’une dizaine de cellules étaient transfectés dans le parenchyme pulmonaire
(Goula et al., 1998a). Après instillation intranasale, Wiseman et al. ont montré que le PEI
linéaire de 22 kDa permettait une expression du transgène dans les cellules pulmonaires
350 fois plus élevée que celle obtenue à l’aide de DC-Chol/DOPE (Wiseman et al., 2003).
Pour augmenter le ciblage cellulaire, Rudolph et al. ont substitué du PEI par de la
transferrine et pour assurer une meilleure stabilité in vivo des complexes, un "coating" par
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du PEG a été effectué (Rudolph et al., 2002). Kichler et al. ont montré qu’après instillation
nasale de complexes (ADN/PEI 22 kDa-PEG) chez la souris, une expression élevée mais
transitoire du transgène pouvait être obtenue (Kichler et al., 2002). Compte tenu de ces
résultats, la mise en place d’essais cliniques de traitement de la mucoviscidose à l’aide de
dérivés de PEIs peut être envisagée (pour revue : Bragonzi and Conese, 2002). Même si
leur efficacité de transfection est encore transitoire et inférieure à celle obtenue à l’aide de
vecteurs adénoviraux.
D’autres polymères cationiques sont actuellement utilisés dans des études précliniques de thérapie génique de la mucoviscidose : les dendrimères et les nanosphères
polymèriques. Kukowska-Latallo et al. ont observé qu’après injection intravasculaire de
complexes (ADN/dendrimère) chez la souris, des cellules pulmonaires comme les cellules
alvéolaires et épithéliales étaient transfectées et qu’une administration répétée des
complexes pouvait être envisagée sans provoquer de toxicité (Kukowska-Latallo et al.,
2000). Walsh et al. ont montré qu’après instillation de nanosphères polymèriques (CFTRgélatine) chez le lapin, les cellules de l’épithélium respiratoire étaient également
transfectées avec une détection de l’expression de la protéine CFTR jusqu’à 2 semaines
(Walsh et al., 1996).
Ces études pré-cliniques indiquent qu'une approche par thérapie génique du
traitement de la mucoviscidose est envisageable puisqu'elles montrent que des vecteurs
viraux et synthétiques permettent de transférer efficacement le gène CFTR dans les
cellules de l’épithélium respiratoire, qu’une expression de ce gène est détectable et qu’une
correction partielle des anomalies de transport ioniques est observée.
2 - 4 - 4 - Les essais cliniques
L’étape ultime de la thérapie génique est le transfert du gène thérapeutique chez
l’homme, c’est à dire dans le cas de la mucoviscidose, le transfert du gène CFTR dans les
cellules épithéliales des voies aériennes humaines (pour revue : Bigger and Coutelle,
2001). La faisabilité d’un transfert du gène CFTR chez l’homme a été démontrée en 1993
par l’équipe de Welsh après administration nasale d’une solution adénovirale-CFTR chez
trois patients mucoviscidosiques (Zabner et al., 1993). Depuis cette étude, plus de 25
protocoles cliniques de thérapie génique de la mucoviscidose, achevés ou en cours, ont
été mis en œuvre dans le monde. Ces essais cliniques visent tous à transférer un gène
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CFTR fonctionnel dans les cellules épithéliales pulmonaires ou nasales (le nez étant
tapissé d'un épithélium de type respiratoire et étant un organe facilement accessible), par
instillation ou par aérosolisation. Parmi ces études, nombreuses sont celles qui ont utilisé
comme vecteurs, des vecteurs adénoviraux ou des lipides cationiques, quelques unes ont
utilisé des vecteurs AAVs et une étude en cours utilise un polymère cationique. Tous ces
essais sont des essais de phase I ou II portant donc sur un faible nombre de patients.
a) A l’aide de vecteurs adénoviraux :
Neuf essais cliniques ayant utilisé des vecteurs adénoviraux codant pour CFTR
chez des patients mucoviscidosiques ont été publiés (Zabner et al., 1993 ; Crystal et al.,
1994 ; Hay et al., 1995 ; Knowles et al., 1995 ; Zabner et al., 1996 ; Bellon et al., 1997 ;
Harvey et al., 1999 ; Zuckerman et al., 1999 ; Perricone et al., 2001). D’autres sont en
cours d’étude surtout pour étudier la faisabilité d’administrations répétées. Les conclusions
et les généralisations à partir de ces essais sont difficiles dues au faible nombre de
patients inclus par essai. De plus, les vecteurs adénoviraux utilisés différent par leurs
sérotypes, les séquences génomiques délétées, les promoteurs dirigeant l’expression de
l’ADNc CFTR et les doses administrées varient entre 2.106 et 2.1010 pfu (plaque forming
unit).
Ces études ont montré qu’après une administration unique par instillation nasale
et/ou bronchique ou par aérosol, l’ADNc CFTR pouvait parfois être détecté dans les
cellules prélevées au niveau du nez ou des bronches (Crystal et al., 1994 ; Bellon et al.,
1997) et une expression de la protéine CFTR dans quelques unes de ces cellules pouvait
être observée chez quelques patients jusqu’à 1 mois après l’administration (Crystal et al.,
1994 ; Bellon et al., 1997 ; Harvey et al., 1999). Les résultats sur la correction des
anomalies de transport des ions chlorures sont très hétérogènes et ont montré que celle-ci
était rare et de courte durée (2 semaines au plus) (Zabner et al., 1993 ; Hay et al., 1995 ;
Zabner et al., 1996). En terme de toxicité, des effets locaux transitoires de type rhinite ont
été notés dans deux essais pour lesquels une administration nasale a été pratiquée
(Zabner et al., 1993 ; Knowles et al., 1995). Les patients ayant reçu une forte dose de
vecteurs par administration bronchique ont eu de la fièvre, des douleurs thoraciques de
type pleural et un infiltrat pulmonaire à la radiographie du thorax, voire une insuffisance
respiratoire aigüe réversible sous traitement symptomatique (Crystal et al., 1994 ;
Zuckerman et al., 1999). Cet effet secondaire a été attribué à une réaction inflammatoire
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peut-être relayée par l’interleukine 6 (McElvaney et al., 1995). Des anticorps neutralisants
systémiques spécifiques des adénovirus utilisés n’ont été trouvés que dans un essai
(Zabner et al., 1996). Enfin, aucune dissémination virale n’a été notée sur les
prélèvements étudiés (pharynx, urine, rectum, sang). Les expériences d’administrations
répétées de vecteurs adénoviraux restent limitées à celle de Zabner et al. au niveau de la
muqueuse nasale (Zabner et al., 1996) et à celle de Harvey et al. au niveau de la
muqueuse bronchique (Harvey et al., 1999). Une diminution de l’efficacité avec les
réadministrations a été mise en évidence dans ces deux essais. Pour l’essai concernant
une administration par les bronches, trois instillations ont été effectuées à un mois
d’intervalle et l’expression de CFTR observée au 3ème jour (Harvey et al., 1999). Après la
première administration, l’expression de CFTR était dose-dépendante, avec aucune
expression observée chez tous les patients ayant reçu des faibles doses, une expression
détectable chez tous les patients ayant reçu de fortes doses et une expression variable
selon les patients aux doses intermédiaires. Lors de la deuxième instillation, une
diminution d’efficacité a été notée : seule une expression était observée pour les doses
intermédiaires. Lors de la troisième instillation, aucune expression de CFTR n’a été mise
en évidence ce qui suggère le rôle délétère probable de la réponse immunitaire cellulaire.
Le développement, ces dernières années, de nouvelles générations de vecteurs
adénoviraux moins toxiques, laisse espérer une amélioration de leur efficacité de
transfection. Cependant, un essai clinique réalisé à l’aide d’un vecteur adénoviral de
troisième génération a montré que malgré l’augmentation de la persistance du transgène,
l’efficacité de transfection restait très faible (Zuckerman et al., 1999). Perricone et al. ont
montré que la faible efficacité de transfection à l’aide de vecteurs adénoviraux serait due à
une faible transduction des cellules épithéliales des voies aériennes humaines. En fait, il
apparaît que la majorité des cellules transfectées ne sont pas les cellules épithéliales des
voies aériennes (Perricone et al., 2001). Ces résultats confirment ceux observés in vivo
chez l’animal (voir § 2 - 4 - 3a de la Partie I) et montrent que des progrés sur les vecteurs
adénoviraux, notamment une amélioration du ciblage cellulaire, sont nécessaires avant
de continuer à effectuer des études cliniques.
b) A l’aide de vecteurs AAVs :
Cinq essais cliniques de phase I et/ou II utilisant des vecteurs AAVs sont
actuellement publiés (Flotte et al., 1996 ; Wagner et al., 1998 ; Wagner et al., 1999 ;
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Aitken et al., 2001 ; Wagner et al., 2002). Les résultats ont montré un transfert du gène
CFTR efficace avec une persistance du transgène jusqu’à 70 jours après l’administration
du vecteur viral. Une correction partielle des anomalies de transport ionique pour les
patients ayant reçu les doses les plus élevées d’rAAV a également été rapportée et aucun
signe d’inflammation n’a été observé. Cependant, le risque de mutagénèse insertionnelle,
la taille limitée du transgène à insérer et les difficultés associées à la production des
vecteurs AAVs n’en font pas pour l’instant un vecteur de choix pour la thérapie génique de
la mucoviscidose.
c) A l’aide de lipides cationiques :
Neuf essais cliniques ayant utilisé des lipides cationiques comme vecteur de l'ADNc
CFTR chez des patients mucoviscidosiques ont été publiés (Middleton et al., 1994 ;
Caplen et al., 1995 ; Gill et al., 1997 ; Porteous et al., 1997 ; Zabner et al., 1997 ; Alton et
al., 1999 ; Hyde et al., 2000 ; Noone et al., 2000 ; Ruiz et al., 2001). Comme pour les
essais cliniques ayant utilisé des vecteurs viraux, un faible nombre de patients a été inclus
par essai (11 patients au plus). De même, les vecteurs utilisés, les promoteurs du gène
CFTR et les doses de plasmide différaient selon les essais.
La première formulation de lipides cationiques utilisés pour des essais cliniques de
thérapie génique de la mucoviscidose a été le DC-Chol additionné au DOPE et complexé
à un ADN plasmidique codant pour le gène CFTR (Middleton et al., 1994). Depuis,
plusieurs essais cliniques ont été réalisés avec cette formulation (Caplen et al., 1995 ; Gill
et al., 1997 ; Hyde et al., 2000). Ces études cliniques ont montré la bonne tolérance des
malades aux lipoplexes et dans certains cas, une correction des anomalies de transport
des ions chlorures dans l’épithélium nasal a pu être associée au transfert du gène CFTR.
De plus, Hyde et al. ont observé qu’une administration répétée des complexes (DCChol:DOPE/ADNc CFTR) (trois instillations nasales à un mois d'intervalle) chez neuf
patients mucoviscidosiques ne provoquait aucune réponse immunologique (Hyde et al.,
2000).
Depuis, différentes formulations de lipides cationiques ont été testées. Ainsi,
Porteous
et
al.
ont
(DOTAP/plasmide-CFTR)
rapporté
permettait
qu’une
une
administration
expression
de
nasale
CFTR
de
complexes
détectable
dans
l’épithélium nasal, chez 7 des 8 patients mucoviscidosiques traités, jusqu’à 28 jours après
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Stéphanie Grosse, 2004
le traitement. Aucune réaction inflammatoire n’a été observée et une correction des
anomalies de transport ionique a été observée chez deux patients (Porteous et al., 1997).
Quatre autres équipes ont évalué le GL67 sur des patients mucoviscidosiques
(Zabner et al., 1997 ; Alton et al., 1999 ; Ruiz et al., 2001) ou sur des volontaires sains
(Chadwick et al., 1997). Après instillation nasale suivie d’une aérosolisation dans les voies
pulmonaires, aucune toxicité n’était observée chez les volontaires sains (Chadwick et al.,
1997) et une correction partielle des anomalies de transport ionique pouvait être obtenue
chez les patients mucoviscidosiques (Alton et al., 1999). Cependant, Zabner et al. ont
montré que le plasmide seul administré par instillation nasale était aussi efficace en terme
de correction du transport des ions chlorures que le plasmide véhiculé à l’aide de GL67
(Zabner et al., 1997). En terme d’effets secondaires, pendant l’administration nasale d’une
forte dose de lipoplexes, un patient a développé une rhinorrhée avec urticaire qui ont été
résolutifs en quelques heures (Zabner et al., 1997). Après aérosolisation dans les voies
pulmonaires, quelques patients ont développé une fièvre avec de fortes douleurs
musculaires et articulaires également résolutives en quelques heures (Alton et al., 1999 ;
Ruiz et al., 2001). Aucun anticorps spécifiques du lipide cationique et du plasmide n’ont
été observé (Ruiz et al., 2001).
Enfin, une autre équipe vient d’évaluer un nouveau composé lipidique, l’EDMPC
cholestérol (p-ethyl-dimyristoylphosphaditylcholine cholesterol) (Noone et al., 2000).
Cette équipe a montré que l’ADNc CFTR transfecté dans l’épithélium nasal de patients
mucoviscidosiques était détectable jusqu’à 10 jours après le traitement. Aucun ARNm et
aucune correction des anomalies de transport des ions chlorures n’ont pu être observés.
Dans l’ensemble, peu d’effets secondaires ont été observés avec les lipides
cationiques. Cependant, aucun vecteur lipidique ne permet un bénéfice clinique. Les
corrections des anomalies de transport ionique sont partielles et transitoires et semblent
aussi efficaces que le plasmide administré seul (Zabner et al., 1997).
d) A l’aide de polymères cationiques :
Malgré leur attrait, aucun essai clinique avec des polymères cationiques n’a été
jusqu’à ce jour publié. Certains sont en cours d’études depuis le développement de
nouvelles molécules polycationiques comme certains dérivés de PEIs ou les nanosphères
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Stéphanie Grosse, 2004
polymèriques qui ont montré un transfert de gènes efficace in vivo chez l’animal dans
l’épithélium respiratoire (Walsh et al., 1996 ; Ferrari et al., 1997 ; Densmore et al., 2000 ;
Gautam et al., 2000 ; Gautam et al., 2001 ; Wiseman et al., 2003). En effet, un essai
clinique de phase I et II utilisant une nanosphère polymèrique a été mis en place en avril
2002 par la société Copernicus Therapeutics de l’Ohio (Etats-Unis) pour le traitement de la
mucoviscidose (www.cgsys.com/clinical/cysticfibrosis.asp).
e) Le bilan des essais cliniques :
En 1995, le National Institute of Health (NIH) a fait le point sur les différents essais
cliniques de thérapie génique, toutes indications confondues. Ces conclusions
s'appliquent parfaitement aux essais cliniques concernant la mucoviscidose : ces essais
ont montré la faisabilité de la thérapie génique et une absence d'effets toxiques ou
secondaires
graves.
Cependant,
l'efficacité
est
ponctuelle,
transitoire
et
quasi
anecdotique. Ainsi, deux recommandations ont été faites par le NIH : celle du "follower
effect" ou effet à suivre, c'est-à-dire qu'un essai ayant montré une certaine efficacité devait
être poursuivi dans les mêmes conditions pour inclure un plus grand nombre de patients,
et celle du "back to the bench" ou retour à la paillasse. En effet, il apparaît clairement que
la plupart des essais cliniques ont été pratiqués trop tôt, en l'absence de connaissances
suffisantes sur les vecteurs et leurs mécanismes d'action et même en l'absence de
connaissances suffisamment précises sur certains aspects physiopathologiques de la
maladie. Il est donc nécessaire de revenir à la recherche fondamentale afin de mieux
comprendre les étapes cellulaires limitant l’efficacité de transfection à l’aide des vecteurs
de transfert de gènes et de développer de nouveaux vecteurs ou d’améliorer les vecteurs
déjà existants.
Nous aborderons maintenant les différentes étapes cellulaires du transfert de gènes
à l’aide de vecteurs synthétiques qui se rapportent plus précisément à notre travail.
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
3 - LES ETAPES CELLULAIRES DU TRANSFERT DE GENES A L’AIDE
DE VECTEURS SYNTHETIQUES
3 - 1 - GENERALITES
Les étapes cellulaires mises en jeu lors du transfert de gènes à l’aide de vecteurs
synthétiques sont encore relativement mal connues et demandent à être mieux comprises.
La figure 14 représente globalement les diverses barrières que l’ADN thérapeutique doit
traverser avant d’arriver au noyau des cellules cibles (pour revues : Luo and Saltzman,
2000 ; Thomas and Klibanov, 2003). La première étape consiste en la formation de
complexes (lipoplexes ou polyplexes) compacts et résistant à la dégradation par les
nucléases. Ces complexes doivent ensuite se lier à la membrane plasmique des cellules
cibles (de façon non-spécifique ou spécifique grâce à un récepteur cellulaire), être
internalisés et gagner le cytosol (par sortie des endosomes lorsque la pénétration dans la
cellule se fait par endocytose). Enfin, l’ADN doit migrer vers le noyau et entrer dans celuici afin d’y être transcrit, étape ultime pour permettre l’expression de la protéine
thérapeutique.
Figure 14 : Représentation schématique des étapes cellulaires du transfert de gènes
à l’aide de vecteurs synthétiques (d’après la revue : Luo and Saltzman, 2000). (A)
Formation des complexes par liaisons électrostatiques entre l’ADN et le vecteur cationique
synthétique ; (B) Liaison entre les complexes et la membrane plasmique de la cellule
cible ; (C) Internalisation des complexes ; (D) Libération des complexes dans le cytosol ;
(E) Dégradation lysosomale des complexes ; (F) Dissociation éventuelle des complexes ;
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Stéphanie Grosse, 2004
(G) Dégradation cytosolique de l’ADN ; (H) Diffusion cytosolique de l’ADN ; (I) Importation
nucléaire et expression de la protéine thérapeutique.
In vivo, dans le cas de la thérapie génique de la mucoviscidose, il existe en amont
de ces étapes une barrière extracellulaire qui est le passage des complexes à travers le
mucus. En effet, la fonction majeure de l’épithélium respiratoire est de prévenir l’entrée de
corps étrangers grâce à son système de défense qu’est l’escalator muco-ciliaire. Ce
système de défense est constitué par le mucus qui est capable de capturer les particules
étrangères et les cils des cellules ciliées. Le battement ciliaire permet le mouvement du
mucus jusqu'au carrefour oro-pharyngé où il est dégluti. Ainsi, après administration dans
les voies aériennes de l'ADN thérapeutique complexé à un vecteur synthétique, l'ADN et
son vecteur peuvent être captés par ce système de défense. Stern et al. ont montré que
l'application de mucus de patients atteints de mucoviscidose sur des cellules in vitro
diminuait de 90 % l'efficacité des transfections faites à l'aide de vecteurs lipidiques. Avant
les transfections, un pré-traitement par un mucolytique comme la RhDNAse (Pulmozyme®)
réduit la viscosité du mucus ce qui permet de retrouver un niveau de transfections à 40 %
de celui observé en l'absence de mucus (Stern et al., 1998).
3 - 2 - LA FORMATION DES COMPLEXES
3 - 2 - 1 - Généralités
L’obtention des complexes (ADN plasmidique/lipide ou polymère cationique) se fait
spontanément en solution par simple mélange. La formation des lipoplexes ou des
polyplexes repose donc sur un mécanisme d’auto-assemblage qui fait principalement
intervenir des interactions électrostatiques (entre l’ADN plasmidique anionique et le
vecteur synthétique cationique) mais aussi des interactions hydrophobes (dans le cas des
lipoplexes). Il est important de bien définir pour chaque complexe le rapport des charges
+/- (quantité de vecteurs et d’ADN à mélanger) qui détermine la taille et la charge des
complexes, ainsi que le degré de compaction de l’ADN et donc l’efficacité de transfection.
En effet, selon le degré de compaction de l’ADN, celui-ci sera plus ou moins protégé de la
dégradation par les nucléases. Par ailleurs, en fonction de leur charge, les complexes vont
diversement interagir avec les composants du milieu extracellulaire. En effet, les
complexes chargés positivement se lient aux charges négatives portées par les protéines
présentes dans le milieu extracellulaire ou à la membrane plasmique des cellules. Cette
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Stéphanie Grosse, 2004
propriété d’adhésion peut être avantageuse pour la transfection. Elle pose cependant un
problème dans le cadre d’une administration in vivo du complexe et résulte la plupart du
temps en son élimination à la suite d’interactions avec les protéines sériques. Pour cette
raison, comme nous avons pu le voir précédemment, des complexes neutres sont
développés et leur efficacité in vivo semble supérieure. En effet, l’addition de PEG aux
lipides et polymères cationiques donne des lipoplexes et polyplexes neutres qui ne
peuvent plus interagir avec les protéines anioniques du sang et qui ont donc une plus
longue circulation plasmatique et une meilleure efficacité de transfection (Klibanov et al.,
1990 ; Allen et al., 1991 ; Ogris et al., 1999 ; Kichler et al., 2002). La substitution des
lipides et des polymères cationiques par des ligands (protéines, peptides viraux, résidus
osidiques) diminue également les charges cationiques de ces vecteurs synthétiques mais
surtout, améliore les interactions entre les complexes et les cellules cibles et par
conséquent le ciblage cellulaire (Wagner et al., 1990 ; Kircheis et al., 1997 ; Yonemitsu et
al., 1997 ; Monsigny et al., 1999).
3 - 2 - 2 - La caractérisation des complexes
Diverses techniques physico-chimiques et microscopiques ont été développées
pour caractériser les complexes (ADN plasmidique/vecteur synthétique) sur le plan de leur
structure supramoléculaire et pour essayer de comprendre les mécanismes impliqués
dans leur formation : mesure de la taille par diffusion quasi-élastique de la lumière et par
microscopie électronique ; état de la compaction et mesure du potentiel zêta (charge de
surface) par migration électrophorétique ; visualisation de l’ultrastructure par diverses
techniques de microscopie électronique. Cependant, la caractérisation des lipoplexes ou
des polyplexes n’est pas encore très claire car cette étude dépend de nombreux
paramètres (pour revues : Bally et al., 1999 ; Vivien et al., 1999 ; Kircheis et al., 2001) : la
nature du vecteur synthétique, les quantités respectives d’ADN et de vecteur cationique, la
nature du solvant et le mode opératoire.
a) Caractérisation des lipoplexes :
Pitard et al. ont montré que la taille et la charge de surface de complexes formés
d’ADN plasmidique et de lipopolyamine variaient suivant le rapport de charges lipide
cationique/ADN (+/-) utilisé (Figure 15A) (Pitard et al., 1997). L’utilisation d’un rapport de
charges faible (< 1) donne des lipoplexes stables, de petites tailles (< 500 nm) et
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anioniques (- 40 mV). L’utilisation d’un rapport de charges un peu plus élevé (compris
entre 1 et 2) donne un précipité de lipoplexes neutre, de très grande taille (> 700 nm) et
l’utilisation d’un rapport de charges élevé (> 2) donne des lipoplexes stables, de petites
tailles (< 300 nm) et cationiques (+ 30 mV). On peut noter que seuls les lipoplexes de
petites tailles et cationiques permettent un transfert de gènes in vitro efficace (Pitard et al.,
1997). Sakurai et al. ont observé des résultats similaires avec des lipoplexes formés
d’ADN plasmidique et de DOTMA-DOPE (Figure 15B) (Sakurai et al., 2000).
Figure 15 : Variation de la taille et de la charge de surface des lipoplexes suivant les
quantités respectives de charges négatives de l’ADN plasmidique et de charges
positives du lipide cationique utilisées. (A) Schéma représentatif de cette variation
avec des lipoplexes formés d’ADN plasmidique et de lipopolyamine (Pitard et al., 1997) ;
(B) Graphiques obtenus avec des lipoplexes formés d’ADN plasmidique et de DOTMADOPE (Sakurai et al., 2000).
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En ce qui concerne la structure des lipoplexes, Gershon et al. ont montré que la
structure des lipides cationiques de départ est profondément modifiée en présence de
l’ADN plasmidique : les lipides cationiques apparaissent condensés avec perte de leur
contenu aqueux. Il semble ainsi y avoir un réarrangement des structures de départ
reposant sur la fusion des lipides cationiques et la condensation de l’ADN plasmidique
(Gershon et al., 1993). Ces données sont différentes de l’hypothèse initiale qui suggérait
que les lipides cationiques non modifiés recouvraient progressivement l’ADN plasmidique
selon un schéma de type « collier de perles » (Felgner and Ringold, 1989). Divers types
d’organisation structurale des lipoplexes ont été décrits (Figure 16) (pour revues : Vivien et
al., 1999 ; Templeton, 2002) :
•
Structures tubulaires de type « Spaghetti » et sphériques de type « Meatballs »
obtenues à partir de lipides unilamellaires qui condense l’ADN sur une surface
(Sternberg et al., 1994).
•
Structures multilamellaires de type « Swiss Rolls » qui donnent des particules
sphériques où l’ADN plasmidique est intercalé entre les bicouches lipidiques d’un
lipide multilamellaire (Gustafsson et al., 1995 ; Radler et al., 1997 ; Pitard et al.,
1999).
•
Structures bilamellaires où l’ADN plasmidique est intercalé entre deux lipides
bilamellaires (Templeton et al., 1997).
•
Structures hexagonales directes (Labat-Moleur et al., 1996) ou inversées (Koltover
et al., 1998).
On peut noter que l’efficacité de transfection des lipoplexes varie suivant leur structure
(pour revue : Templeton, 2002) : les lipoplexes hexagonaux permettent un transfert de
gènes peu efficace in vitro et n’ont pas montré d’efficacité in vivo ; les lipoplexes
unilamellaires permettent un transfert de gènes efficace in vitro dans de nombreux types
cellulaires mais cette efficacité diminue in vivo en raison d’une demi-vie courte dans le
système circulatoire ; les lipoplexes multilamellaires sont efficaces in vitro mais leur trop
grande taille empêche de les utiliser in vivo ; les lipoplexes bilamellaires seraient les plus
efficaces pour le transfert de gènes.
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Figure 16 : Représentation schématique des différentes structures des complexes
ADN plasmidique/lipide cationique (d’après Templeton, 2002)
b) Caractérisation des polyplexes :
Les polyplexes les plus étudiés sont ceux formés d’ADN plasmidique et de dérivés
de PEIs. Ainsi, dans le cas de complexes (ADN plasmidique/dérivés de PEIs), une
condensation complète de l’ADN est observée pour un rapport N/P (nombre de charges
positives des groupes amines du polymère cationique/nombre de charges négatives du
groupe phosphate de l’ADN plasmidique) compris entre 2 et 3 (Figures 17A, B et C)
(Bieber et al., 2002). Suivant le degré de condensation de l’ADN, par le polymère
cationique, l’efficacité de transfection est variable (Figure 17, graphique violet). En effet,
l’utilisation d’un rapport N/P ≤ 2 ne permet pas un transfert de gènes efficace alors que
l’utilisation d’un rapport N/P > 2 assure une meilleure efficacité de transfection (Bieber et
al., 2002). Il a en fait été montré que l’utilisation d’un rapport N/P < 2 donne des
polyplexes anioniques de taille moyenne (200 à 500 nm) peu condensés et sous forme de
« loopings », que l’utilisation d’un rapport N/P = 2 donne des polyplexes neutres qui ont
tendance à s’agréger et qui sont de très grande taille (> 1000 nm) et que l’utilisation d’un
rapport N/P > 2 permet d’obtenir des polyplexes cationiques de petite taille (environ 150
nm) et le plus souvent de forme sphèrique (Figure 17, courbe rouge et Figure 18) (Tang
and Szoka, 1997 ; Erbacher et al., 1999a). Plus précisément, Tang et Szoka ont montré
qu’à un rapport N/P ≤ 0,5, la charge de surface des polyplexes est de -45 mV. Qu’ensuite,
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Stéphanie Grosse, 2004
cette charge augmente très rapidement, pour devenir neutre pour un rapport N/P = 1 et
cationique pour tous rapports N/P > 1. Elle atteint un plateau à +35 mV dès le rapport N/P
= 2.5 (Figure 17, courbe rouge) (Tang and Szoka, 1997). Il est intéressant de noter que le
PEI seul a un potentiel zeta de +37 mV (Godbey et al., 1999a) et que la charge de surface
des polyplexes ne varie pas selon la nature du polymère cationique utilisé (Tang and
Szoka, 1997).
Figure 17 : La condensation de l’ADN plasmidique, la charge de surface des
polyplexes ainsi que leur efficacité de transfection dépendent du rapport N/P
(d’après Tang and Szoka, 1997 ; Bieber et al., 2002). A, B et C représentent le degré de
condensation de l’ADN plasmidique par le polymère cationique après une étude par
électrophorèse sur gel d’agarose contenant du BET : (A) Pour un N/P <2, l’ADN peu
complexé par le PEI migre facilement dans le gel ; (B) Pour un N/P = 2, l’addition de PEI
rend la migration de l’ADN difficile ; (C) Pour un N/P > 2, la complexation complète de
l’ADN par le PEI empêche l’intercalation du BET dans l’ADN ce qui explique l’absence
d’une bande. La charge de surface des polyplexes, représentée en rouge, a été obtenue
en utilisant un ZetaSizer IV (Malvern Instruments). L’efficacité de transfection exprimée en
RLU/cellules et représentée en violet a été obtenue après avoir transfecté une lignée de
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cellules de carcinome pancréatique (cellules PaTu 8902) à l’aide de complexes formés
d’un ADN plasmidique codant pour la luciférase et de PEI au rapport N/P indiqué.
Figure 18 : La taille et la forme des polyplexes varient suivant le rapport N/P (d’après
Goula et al., 1998b ; Erbacher et al., 1999a). Les polyplexes ont été formés dans 1 ml de
NaCl à 150 mM en mélangeant 20 µg d’ADN plasmidique et une quantité adéquate de PEI
afin d’obtenir le rapport N/P indiqué. La taille et la forme des polyplexes ainsi formés ont
été étudiées respectivement par diffusion quasi-élastique de la lumière (graphiques) et par
microscopie électronique (photos) (barre : 100 nm).
La taille des polyplexes varie également en fonction du solvant dans lequel ils sont
formés. En effet, plusieurs équipes ont montré que la formation de complexes (ADN
plasmidique/PEI) dans un solvant contenant une concentration physiologique en sel (150
mM de NaCl, HBS (145 mM de NaCl/20 mM d’HEPES)) donne des particules qui peuvent
faire de 100 nm à plus de 1000 nm de diamètre (Figure 19A). Alors que, l’utilisation d’un
solvant ayant une faible concentration en sel (15 mM de NaCl, 5 % de glucose, eau…)
donne des particules de plus petite taille (20 à 100 nm de diamètre) (Figure 19B) (Dunlap
et al., 1997 ; Tang and Szoka, 1997 ; Goula et al., 1998b ; Ogris et al., 1998 ; Wightman et
al., 2001). Des résultats similaires ont été obtenu avec la pLK histidylée (Fajac et al.,
2000). En effet, la formation de complexes (ADN plasmidique/pLK histidylée) dans du
milieu de culture donne des particules de très grande taille (environ 800 nm de diamètre)
alors que l’utilisation de l’eau ou du glucose 5 % permet d’obtenir des particules de plus
petite taille, 150 nm et 100 nm (Fajac et al., 2000). Selon la nature du solvant utilisé et
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pour un même rapport N/P, les polyplexes de tailles différentes donneront un transfert de
gènes in vitro ou in vivo d’efficacité variable. En effet, Ogris et al. ont montré que les
complexes (ADN plasmidique/PEI 800 kDa) de grande taille formés dans du HBS
permettaient un transfert de gènes in vitro plus efficace que les complexes de petite taille
formés dans du glucose 5% (Ogris et al., 1998). Des résultats similaires ont été observés
avec les PEIs 25 et 22 kDa (Wightman et al., 2001). Les complexes formant de larges
aggrégats auraient une meilleure sédimentation dans le milieu de transfection ce qui
assurerait un meilleur transport jusqu’à la surface des cellules. Pour des études in vivo,
Wigthman et al. et Goula et al. ont montré que les complexes (ADN plasmidique/PEI 22
kDa) de petite taille permettaient une meilleure efficacité de transfection que les
complexes de grande taille grâce à une meilleure diffusion dans l’espace extracellulaire
(Goula et al., 1998b ; Wightman et al., 2001). In vitro, il semble donc préférable de faire les
polyplexes dans un solvant ayant une concentration physiologique en sel alors qu’in vivo,
il semble préférable de faire les polyplexes dans un solvant ayant une faible concentration
en sel.
Figure 19 : La taille des polyplexes varie suivant la nature du solvant (Ogris et al.,
1998). (A) Les complexes ADN/PEI sont formés dans du HBS (HEPES Buffered Saline) ;
(B) Les complexes ADN/PEI sont formés dans de l’eau, barre : 100 nm.
En ce qui concerne la structure des polyplexes, Tang et Szoka ont décrit, en
microscopie électronique, des structures sphériques de type « Donuts » ou « Rings »
pour tous les complexes formés d’ADN plasmidique et de polymères cationiques tels que
les dérivés de pLKs, de PEIs ou de dendrimères. Plus précisément, les complexes formés
à l’aide de PEIs ou de dendrimères fracturés forment des particules sphériques uniques,
parfois en dimère et plus rarement en trimère. Alors que, les complexes formés à l’aide de
pLK ou de dendrimères intacts forment souvent des particules sphériques en amas (Tang
and Szoka, 1997). Afin d’obtenir une meilleure résolution de la stucture des polyplexes,
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Dunlap et al. ont utilisaient un Scanning Force Microscope (SFM) (Hansma et al., 1988 ;
Dunlap et al., 1997). En observant des complexes formés d’ADN plasmidique et de PEIs,
ils ont retrouvé pour un même rapport N/P des structures sphériques sous formes de
« Donuts » (Figure 20A) mais ils ont également observé des structures sous forme de
« Loops » plus ou moins compacts (Figure 20B et C) (Dunlap et al., 1997).
Figure 20 : Structures des polyplexes après une étude à l’aide d’un Scanning Force
Microscope (Dunlap et al., 1997). (A) Structure sphérique sous forme de « Donuts » ; (B)
Structure sous forme de « Loops » compacts ; (C) Structure sous forme de « Loops » peu
compactés, barre : 50 nm.
3 - 3 - L’ENTREE DES COMPLEXES DANS LA CELLULE
3 - 3 - 1 - Les différentes voies d’entrée cellulaire
a) Généralités :
In vivo, lorsque les complexes faits d’ADN plasmidique et de vecteurs cationiques
synthétiques ont atteint l’organe cible ou in vitro sur culture cellulaire, la première étape
cellulaire de transfection est l’entrée de l’ADN plasmidique dans la cellule cible. La figure
21 montre les différentes voies possibles d’entrée dans la cellule de solutés ou de
substance d’origine extracellulaire qui aboutissent à la formation de vésicules ou de
vacuoles distinctes contenant le matériel à importer (pour revues : Mukherjee et al., 1997 ;
Benmerah and Lamaze, 2002 ; Maillet, 2002a ; Conner and Schmid, 2003) : l’endocytose
dépendante de la clathrine et la micropinocytose à vésicule lisse qui aboutissent à la
formation d’un endosome précoce, la potocytose qui aboutit à la formation de cavéoles,
la macropinocytose qui donne des macropinosomes et la phagocytose qui donne des
phagosomes. Ces voies endocytaires peuvent coexister dans une même cellule et les
différentes vésicules peuvent ensuite être dirigées vers un même organite. Une simple
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fusion avec la membrane plasmique peut également avoir lieu ce qui aboutit à la
pénétration directe du soluté ou de la substance dans le cytosol de la cellule.
Figure 21 : Les différentes voies d’endocytose (d’après Maillet, 2002a)
b) L’endocytose dépendante de la clathrine :
L’endocytose dépendante de la clathrine est aujourd’hui le mode d’entrée
cellulaire le plus étudié et le mieux compris (pour revues : Takei et al., 2001 ; Benmerah
and Lamaze, 2002 ; Maillet, 2002a ; Conner and Schmid, 2003). C’est une endocytose
hautement spécifique qui se produit lorsqu’il y a reconnaissance entre un ligand et son
récepteur membranaire. Elle correspond à la formation de vésicules d’environ 200 nm
de diamètre, recouvertes par des molécules de clathrine, parfois appelées réceptosomes.
Plus précisément (Figure 22), cette endocytose fait intervenir dans un premier
temps une reconnaissance spécifique entre un ligand et un récepteur adaptine-dépendant.
Une fois que les ligands se sont fixés à leurs récepteurs, les récepteurs adaptinedépendant se regroupent et forment une dépression de la membrane plasmique
recouverte à sa surface cytoplasmique de complexes moléculaires adaptine/clathrine.
Cette dépression aboutit à la formation d’un puit recouvert « coated pit » (Figure 23).
Alors, la membrane des puits recouverts s’invagine grâce aux forces développées par
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l’assemblage des molécules de clathrine et d’autres protéines comme l’actine (Salisbury
et al., 1982). L’invagination des puits se ferme grâce à la dynamine ce qui forme des
vésicules d’endocytose recouvertes par des complexes moléculaires adaptine/clathrine.
Une fois dans le cytosol, ces vésicules vont pouvoir se déplacer grâce aux microtubules
et à la présence d’une protéine, CLIP170 (Cytoplasmic Linker Protein). En effet, cette
protéine relie la membrane des vésicules aux microtubules et la dépolymérisation des
microtubules provoque le déplacement des vésicules. Puis, très rapidement, sous l’action
d’une enzyme, l’ATPase de déshabillage clathrine-dépendante (une protéine chaperonne
Hsp70) et en présence d’ATP, les vésicules d’endocytose se débarrassent des molécules
de clathrine et d’adaptine, puis se transforment en un endosome précoce contenant les
macromolécules (récepteurs/ligands) endocytées. Ces macromolécules endocytées sont
ensuite, soit dirigées vers la voie de recyclage vers la membrane plasmique des cellules,
soit dirigées vers la voie de dégradation lysosomale, soit vers la voie de sécrétion (Schmid
et al., 1988).
Figure 22 : Schéma détaillé de l’endocytose dépendante de la clathrine induite par la
reconnaissance entre un ligand et son récepteur (d’après Maillet, 2002a)
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Figure 23 : Visualisation au microscope électronique d’un puit recouvert de
clathrine (« Coated pit ») et de cavéoles (« Caveolae ») (voir § 3 - 3 - 1d de la Partie I),
X50000, (http://healthcare.partners.org/orthopaedic/hoj2000/html/articles11.htm)
c) La micropinocytose :
La micropinocytose est une endocytose à vésicule lisse (non recouverte de
clathrine) (Nichols and Lippincott-Schwartz, 2001). C’est une endocytose non spécifique
aussi appelée endocytose de phase fluide ou endocytose adsorptive (Kumagai et al.,
1987). Elle permet une endocytose constitutive (par défaut) de fluides et de solutés et se
caractérise par la formation de vésicules lisses d’environ 150 nm de diamètre.
Le devenir de ces vésicules dans la cellule n’est pas encore très clair. Il semblerait
que deux voies soient possibles : soit les vésicules livrent leur contenu à la cellule,
lorsqu’elles fusionnent et forment un endosome précoce (Figure 21) ; soit les vésicules
transportent leur contenu à travers la cellule (transcytose) pour le libérer par exocytose
dans le milieu extracellulaire (Maillet, 2002a).
d) La potocytose :
La potocytose a été décrite en 1992 par l’équipe américaine d’Anderson (pour
revue : Anderson et al., 1992). C’est une endocytose de petites molécules de moins de 1
kDa qui sont reconnues par des récepteurs membranaires. Cette endocytose aboutit à la
formation de cavéoles (Figure 23) qui ont un diamètre moyen de 50 à 100 nm (inférieur à
celui des vésicules lisses et des vésicules recouvertes) et qui sont constituées de
cavéoline, une protéine de 22 kDa aussi appelée VIP21 (Rothberg et al., 1992).
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Stéphanie Grosse, 2004
Le devenir de ces cavéoles dans la cellule n’est pas encore très clair. Différentes
voies semblent possibles selon la nature des ligands internalisés (Figure 24) (pour
revues : Mineo and Anderson, 2001 ; Maillet, 2002a ; Pelkmans and Helenius, 2002a). Les
cavéoles peuvent rester attachées à la membrane plasmique des cellules ou s’isoler pour
former des vésicules. Ces vésicules contenant les ligands fixés aux récepteurs peuvent
ensuite soit retourner vers la membrane plasmique (voie de recyclage) (Figure 24A) ; soit
être transportées vers le RE ou d’autres organites comme l’appareil de Golgi pour y
déverser leur contenu (Figure 24B) ; soit directement libérer leur contenu dans le cytosol
(Figure 24C) ; soit transporter leur contenu à travers la cellule (transcytose) pour le libérer
par exocytose dans le milieu extracellulaire (Figure 24D).
Figure 24 : Schéma montrant les différents devenirs possibles d’une cavéole
suivant la nature des ligands fixés aux récepteurs membranaires (d’après la revue :
Mineo and Anderson, 2001). (A) Les ligands liés aux récepteurs sont internalisés et
recyclés vers la membrane plasmique des cellules ; (B) Les ligands liés aux récepteurs
sont délivrés dans le réticulum endoplasmique (ER) ou d’autres organites ; (C) Les ligands
sont libérés dans le cytosol ; (D) Transcytose et exocytose des ligands. AP : alkaline
phosphatase, bFGF : basic fibroblast growth factor, AMF : autocrine motility factor, GH :
growth hormone, CT : cholera toxin
Le transport direct du virus SV40 de la membrane plasmique au RE par la voie des
cavéoles a été rapporté par l’équipe de Helenius (Kartenbeck et al., 1989 ; Pelkmans et
al., 2001). En effet, après internalisation par la voie des cavéoles grâce au cytosquelette
d’actine (Pelkmans et al., 2002b), le virus SV40 est observé dans des vésicules
endosomales marquées par la cavéoline, appelés cavéosomes. Après plusieurs heures
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dans ces organites (environ 4 h), le virus sort des cavéosomes par des extensions
tubulaires. Ces vésicules tubulaires non marquées par la cavéoline et contenant les virus
migrent alors vers le réticulum endoplasmique lisse (REL) grâce aux microtubules
(Figure 25A). On ne sait pas aujourd’hui comment le génome viral passe ensuite du REL
au noyau pour pouvoir infecter les cellules cibles (Figure 25B) (pour revue : Pelkmans and
Helenius, 2002a).
Figure 25 : Visualisation au micoscope électronique du virus SV40 (flèche) dans des
cellules cibles (Kartenbeck et al., 1989). (A) Localisation du virus SV40 dans le réticulum
endoplasmique lisse (REL) ; (B) Localisation du virus SV40 dans l’espace périnucléaire.
C : cytosol, N : noyau, barre : 100 nm
e) La phagocytose :
La phagocytose ou le processus d’ « ingestion » implique l’internalisation de
larges particules, comme les bactéries, qui sont reconnues par des récepteurs
spécifiques présents à la surface de cellules phagocytaires (pour revues : Brown, 1995 ;
Maillet, 2002a ; Conner and Schmid, 2003). Les récepteurs les plus connus sont le
récepteur
au
mannose
(CD206)
qui
reconnaît
les
résidus
de
mannose
des
mannoprotéines présentes sur la paroie bactérienne, les récepteurs aux intégrines et le
récepteur Fcγ qui reconnaît le domaine Fc des IgG et E. Une fois la reconnaissance entre
le ligand et son récepteur effectuée, la cellule émet des expansions membranaires,
appelées pseudopodes, qui englobent la particule à ingérer et fusionnent par leurs
extrémités pour former des phagosomes, des vacuoles de plus de 500 nm de diamètre.
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Stéphanie Grosse, 2004
Le devenir de ces phagosomes est de fusionner avec les lysosomes qui contiennent
des hydrolases pour donner des phagolysosomes. Ainsi, le contenu des phagolysosomes
est dégradé avant d’être éliminé à l’extèrieur de la cellule (Figure 26). Ce processus est
dépendant du cytosquelette, plus précisément des filaments d’actine (Stossel et al., 1976)
et a surtout lieu dans les cellules phagocytaires telles que les macrophages ou les
leucocytes qui jouent un rôle dans la défense de l’organisme contre les micro-organismes.
Figure 26 : Les principales étapes de la phagocytose
L’équipe de M. Desjardins a récemment montré que dans les macrophages, la
phagocytose est également médiée par le RE (Figure 27) (pour revue : Desjardins, 2003).
En effet, alors qu’il est souvent décrit dans la littérature que la principale source de
membrane des phagosomes est la membrane plasmique dont la perte est compensée par
l’exocytose de vésicules (par exemple des endosomes de recyclage). Il apparaît en fait,
que le RE viendrait fusionner avec la membrane plasmique des macrophages afin de
constituer une grande partie de la membrane des phagosomes (Gagnon et al., 2002).
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Stéphanie Grosse, 2004
Figure 27 : La phagocytose médiée par le RE dans un macrophage. (A)
Représentation schématique (d’après la revue : Desjardins, 2003) ; (B) Visualisation en
microscopie électronique (Gagnon et al., 2002). MEC : milieu extracellulaire, MIC : milieu
intracellulaire, RE : réticulum endoplasmique
f) La macropinocytose :
La macropinocytose est une endocytose induite par un stimulus contrairement à la
micropinocytose qui est une endocytose constitutive. Elle permet l’entrée dans la cellule
de solutés de grande taille (endocytose de phase fluide) mais également de bactéries ou
de virus (Hacker et al., 1997 ; Marechal et al., 2001 ; Watarai et al., 2001). La
macropinocytose aboutit à la formation de vacuoles non recouvertes, très hétérogènes
et de grande taille (diamètre compris entre 0,5 et 500 µm), appelées macropinosomes.
Elle ressemble à la phagocytose, la formation des macropinosomes pouvant
s’accompagner d’expansions membranaires (Figure 21)
entourant les solutés
extracellulaires à internaliser. Elle est dépendante du cytosquelette, plus précisément des
filaments d’actine (Lee and Knecht, 2002) mais, il n’est pas encore très clair si elle fait
intervenir une reconnaissance ligand-récepteur.
Le devenir des macropinosomes depend du type cellulaire dans lequel ils se
trouvent. En effet, dans les cellules A431 (cellules de carcinomes épithéliaux) (Hewlett et
al., 1994) et les fibroblates (Veithen et al., 1998), les macropinosomes sont réfractaires à
la fusion avec les endosomes précoces. Ils fusionnent donc entre eux avant de régurgiter
leur contenu dans le milieu extracellulaire. Dans les macrophages, au contraire, les
macropinosomes fusionnent entre eux mais aussi avec les endosomes précoces et tardifs,
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Stéphanie Grosse, 2004
puis avec les lysosomes où leur contenu est dégradé. Dans le deuxième cas, les
macropinosomes ont une morphologie tubulo-vésiculaire (Racoosin and Swanson, 1993).
Pour revues : (Swanson and Watts, 1995 ; Amyere et al., 2002 ; Benmerah and Lamaze,
2002 ; Maillet, 2002a ; Conner and Schmid, 2003).
3 - 3 - 2 - Les "marqueurs" et les inhibiteurs des différentes voies
d’entrée cellulaire
Afin de déterminer par quelle voie une particule donnée entre dans une cellule, il
est possible d’utiliser des marqueurs ou des inhibiteurs spécifiques d’une des voies (pour
revue : Benmerah and Lamaze, 2002). Par exemple, le marquage du récepteur à la
transferrine permet d’étudier spécifiquement l’endocytose dépendante de la clathrine ;
l’utilisation de la filipine, une drogue se liant au cholestérol de la membrane plasmique,
inhibe sélectivement l’internalisation par les cavéoles, c’est à dire la potocytose. Le
tableau 2 résume pour une voie d’entrée cellulaire donnée, son ou ses marqueurs et
inhibiteurs pharmacologiques spécifiques.
Tableau 2 : Marqueurs et inhibiteurs spécifiques des différentes voies d’entrée
cellulaire (d’après la revue : Benmerah and Lamaze, 2002)
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3 - 3 - 3 - Le mode d’entrée cellulaire des lipoplexes
Les premières études réalisées dans ce domaine datent des années 1980 et ont
donné lieu à une controverse : l’équipe de C. Nicolau prônait une entrée par endocytose
(Nicolau and Sene, 1982), alors que l’équipe de P. L. Felgner était plutôt en faveur d’une
entrée par fusion membranaire (Felgner et al., 1987). En effet, Nicolau et Sene ont
montré qu’un plasmide associé à un phospholipide (phosphatidylcholine) était internalisé
dans les cellules par endocytose puisque l’utilisation d’un inhibiteur de cette voie diminuait
fortement l’expression du gène rapporteur (Nicolau and Sene, 1982). Felgner et al. ont,
quant à eux, montré que lors de l’entrée de lipoplexes formés d’ADN plasmidique et de
DOTMA fluorescent, il y avait une diffusion rapide de la fluorescence au niveau de la
membrane cellulaire. Les éléments hydrophobes du lipide cationique, en contact avec la
bicouche lipidique de la membrane plasmique au cours de l’entrée dans la cellule,
provoquaient une désorganisation membranaire et ainsi, une pénétration directe de l’ADN
plasmidique dans la cellule (Felgner et al., 1987). De nombreuses équipes ont ensuite
étudié la voie majoritaire d’entrée des lipoplexes dans les cellules. Ces travaux, réalisés
avec différents types de lipides et sur différentes lignées cellulaires, ont permis d’aboutir
aux mêmes conclusions : les lipoplexes seraient majoritairement internalisés dans la
cellule par endocytose après interactions électrostatiques avec la membrane plasmique
(Nicolau and Sene, 1982 ; Legendre and Szoka, 1992 ; Watanabe et al., 1994 ; Wrobel et
al., 1995 ; Zabner et al., 1995 ; Friend et al., 1996 ; Hui et al., 1996 ; Labat-Moleur et al.,
1996 ; Zelphati and Szoka, 1996a ; Matsui et al., 1997 ; Dini et al., 1998 ; Zuhorn et al.,
2002). En effet, les charges globalement positives des lipides cationiques peuvent
interagir avec les charges négatives des phospholipides membranaires c’est-à-dire avec
les HSPGs présents à la surface de toutes les cellules et ainsi permettre l’endocytose des
lipoplexes (Legendre and Szoka, 1992 ; Yanagishita et al., 1992 ; Mislick et al., 1996 ; Dini
et al., 1998 ; Mounkes et al., 1998 ; Ruponen et al., 1999 ; Templeton, 2002).
Par la suite, certaines équipes ont tenté d’affiner cette étude en cherchant plus
précisément quel était le mode d’endocytose des lipoplexes (endocytose dépendante de la
clathrine, micropinocytose, macropinocytose, phagocytose ou potocytose). Pour cela,
différentes
techniques
ont
été
utilisées,
notamment
l’utilisation
d’inhibiteurs
pharmacologiques, la microscopie électronique ou à fluorescence. Une équipe a montré
que les lipoplexes n’entraient pas dans les cellules par potocytose (Zuhorn et al., 2002).
Beaucoup d’équipes ont observé pour plusieurs types de lipoplexes que l’entrée dans les
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cellules se faisait principalement par phagocytose (Figure 28A) (Nicolau and Sene,
1982 ; Watanabe et al., 1994 ; Hui et al., 1996 ; Labat-Moleur et al., 1996 ; Zelphati and
Szoka, 1996a ; Matsui et al., 1997 ; Dini et al., 1998). L’utilisation d’un inhibiteur
pharmacologique de cette voie, la cytochalasine B (Pratten and Lloyd, 1986) entrainait une
diminution de l’entrée des lipoplexes dans la cellule suivie d’une diminution de l’efficacité
de transfection. D’autres équipes ont suggéré que certains lipoplexes entraient dans les
cellules par endocytose dépendante de la clathrine (Figure 28B) (Wrobel et al., 1995 ;
Friend et al., 1996 ; Zuhorn et al., 2002). L’utilisation d’un milieu hypertonique (Heuser and
Anderson, 1989) ou déplété en potassium (Larkin et al., 1983), deux inhibeurs de cette
voie, provoquait une inhibition de l’entrée cellulaire des lipoplexes (Wrobel et al., 1995).
De plus, certains lipoplexes internalisés colocalisaient avec la transferrine (Zuhorn et al.,
2002) qui entre dans les cellules par endocytose dépendante de la clathrine. Enfin, en
microscopie électronique, certains lipoplexes formés d’ADN plasmidique et de DOTMADOPE étaient observés dans des vésicules recouvertes de clathrine (Friend et al., 1996).
Cependant, d’autres études en microscopie électronique ont rapporté qu’après
internalisation, des lipoplexes formés d’ADN plasmidique et de DMRIE-DOPE étaient
plutôt observés dans des vésicules lisses, ce qui suggérait une entrée cellulaire par
pinocytose (Figure 28C) (Zabner et al., 1995 ; Labat-Moleur et al., 1996). Ceci était
conforté par les travaux de l’équipe de J. Zabner qui a montré que le trafic intracellulaire
de complexes (ADN plasmidique/DMRIE-DOPE) fluorescents était comparable à celui
d’une molécule de dextran fluorescente qui est un marqueur de la pinocytose (Zabner et
al., 1995).
Figure 28 : Visualisation au microscope électronique des différentes voies
d’endocytose de lipoplexes. (A) Entrée des lipoplexes par phagocytose (Labat-Moleur et
al., 1996) ; (B) Entrée des lipoplexes par endocytose dépendante de la clathrine (Friend et
al., 1996) ; (C) Entrée des lipoplexes par pinocytose (Zabner et al., 1995) ; Barre : 200 nm.
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Ainsi, les lipoplexes entreraient dans les cellules selon différents mécanismes qui
seraient déterminés en partie par le type de lipide cationique utilisé, la taille des lipoplexes
et le type cellulaire. Les lipoplexes de grande taille ne pourraient pas entrer dans les
cellules par endocytose dépendante de la clathrine ou par micropinocytose qui permettent
l’internalisation de molécules < 200 nm, mais pourraient être internalisés par phagocytose
ou macropinocytose. Dans des cellules hépatocytaires et les cellules en suspension
(lymphocytes et monocytes), les lipoplexes entreraient par phagocytose (Labat-Moleur et
al., 1996 ; Dini et al., 1998). Dans des cellules adhérentes comme les cellules 293M
(cellules rénales humaines), 3T3 (fibroblastes de souris) ou MRC5 (cellules épithéliales
pulmonaires humaines), ils entreaient par pinocytose (Labat-Moleur et al., 1996). Enfin,
dans des cellules endothéliales, ils entreraient par fusion (Dini et al., 1998).
Il est souvent admis que cette étape d’entrée cellulaire n’est pas une étape limitant
l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de lipides cationiques car de nombreux lipoplexes
semblent capables d’entrer dans les cellules (Zabner et al., 1995 ; Lechardeur and
Lukacs, 2002 ; Wiethoff and Middaugh, 2003). Cependant, quelques études se sont
attachées à travailler sur des cellules différenciées et confluentes comme les cellules de
l’épithélium respiratoire. Et, ces études ont montré une diminution de l’efficacité des
transfections à l'aide de lipides cationiques principalement en raison d’une diminution
d’entrée des lipoplexes dans ces cellules (Fasbender et al., 1997b ; Matsui et al., 1997).
En effet, il existerait une diminution des charges négatives à la surface des cellules
différenciées et ceci entrainerait une diminution de la fixation et de l’endocytose des
lipoplexes.
3 - 3 - 4 - Le mode d’entrée cellulaire des polyplexes
Il est aujourd’hui admis que les complexes formés d’ADN plasmidique et de
polymères cationiques entrent dans les cellules par un mécanisme d’endocytose. Le type
exact d’endocytose (pinocytose, endocytose dépendante de la clathrine, phagocytose ou
potocytose) utilisé par les polyplexes dépend cependant, comme pour les lipoplexes, du
type de polymère utilisé (substitué ou non par un ligand), de la charge et de la taille du
polyplexe c’est-à-dire du rapport N/P utilisé et du type cellulaire qui détermine la quantité
de récepteurs ou d’HSPGs présents à la surface des cellules cibles (pour revue : Kircheis
et al., 2001).
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Les polyplexes ayant une charge positive élevée (N/P élevé) peuvent interagir
facilement avec les HSPGs présents à la surface des cellules cibles et ainsi entrer dans
les cellules majoritairement par pinocytose (endocytose adsorptive ou de phase fluide).
Plusieurs études ont ainsi montré qu’une inhibition de l’expression des HSPGs à la
surface des cellules provoquait une baisse de l’entrée cellulaire des polyplexes (Duncan et
al., 1979 ; Mislick et al., 1996 ; Klemm et al., 1998 ; Remy-Kristensen et al., 2001 ; Zuber
et al., 2001 ; Bieber et al., 2002).
Les polyplexes formés d’ADN plasmidique et de polymères cationiques substitués
par des ligands de nature protéique ou osidique entreraient plutôt par endocytose
dépendante de la clathrine (endocytose médiée par un récepteur spécifique) (Wagner et
al., 1990 ; Zenke et al., 1990 ; Wagner et al., 1992 ; Cristiano et al., 1993 ; Michael and
Curiel, 1994 ; Ferkol et al., 1995 ; Kircheis et al., 1997 ; Erbacher et al., 1999b). En effet, il
a été montré que l’entrée cellulaire de complexes ADN/pLK ou PEI substitué par un ligand
(transferrine, lactose, mannose…) était diminuée en présence d’un excès de ligands libres
dans le milieu de transfection, alors qu’une meilleure entrée était observée lorsque
l’expression du récepteur spécifique au ligand était augmentée. De plus, ces complexes
n’entraient que dans les cellules exprimant le récepteur spécifique du ligand (Cotten et al.,
1990 ; Midoux et al., 1993 ; Ferkol et al., 1996 ; Fisher et al., 2000 ; Klink et al., 2001b).
Klink et al. ont également observés en microscopie électronique la présence de
complexes plasmide/pLK lactosylée dans un puit recouvert de clathrine (Klink et al., 2003).
Cependant, Erbacher et al. ont montré que l’entrée cellulaire de complexes formés
d’ADN plasmidique et d’un PEI 25 kDa substitué par un peptide RGD (liant les intégrines)
ayant une charge faible quasi neutre (N/P faible) se faisait plutôt par phagocytose que
par endocytose dépendante de la clathrine. En effet, les polyplexes formaient de trop
larges aggrégats pour pouvoir être endocytés par un mécanisme dépendant de la clathrine
(Erbacher et al., 1999b).
Une dernière voie possible d’internalisation des polyplexes est une entrée cellulaire
par potocytose. Le récepteur au folate, présent principalement à la surface des cellules
tumorales, est connu pour internaliser le folate par ce mode d’endocytose. Gottschalk et
al. et Mislick et al. ont substitué une pLK avec du folate et ont observé que les complexes
(ADN/pLK-folate)
entraient
dans
les
cellules
tumorales
par
potocytose
via
la
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reconnaissance entre le ligand et son récepteur (Gottschalk et al., 1994 ; Mislick et al.,
1995).
3 - 4 - L’ECHAPPEMENT ENDOSOMAL DES COMPLEXES
3 - 4 - 1 - Le devenir de particules endocytées : généralités
Après internalisation de particules extracellulaires, ces particules se retrouvent dans
des vésicules endosomales (endosomes précoces) qui sont localisés à la périphérie des
cellules. Une fois dans les endosomes précoces, les particules endocytées sont triées et
peuvent être dirigées vers différentes voies (Figure 29) (pour revues : Mukherjee et al.,
1997 ; Maillet, 2002b ; Gruenberg, 2003) :
¾ La voie de recyclage où les particules à recycler se retrouvent dans une portion
des endosomes précoces qui bourgeonne afin de former des endosomes de recyclage.
Les endosomes de recyclage sont ensuite redirigés vers la membrane plasmique avec
laquelle ils fusionnent. Cette voie est souvent celle empruntée par des récepteurs
membranaires comme le récepteur à la transferrine ou le récepteur aux LDLs (Low
Density Lipoproteins) qui après fixation avec leur ligand et internalisation, retournent vers
la membrane plasmique des cellules pour être réutilisés (Dautry-Varsat and Lodish, 1984).
¾ La voie de dégradation lysosomale où les particules non recyclées se retrouvent
dans une portion des endosomes précoces qui bourgeonne pour former des vésicules
endosomales de transport appellées MVBs (Multivesicular bodies) ou ECVs (Endosomal
carrier vesicles) qui ont un aspect tubulo-vésiculaire. Les MVBs sont ensuite transportés,
grâce aux microtubules, de la périphérie cellulaire vers la région périnucléaire afin de
fusionner avec les endosomes tardifs qui ont un aspect multilamellaire (van Deurs et al.,
1993). Les endosomes tardifs fusionnent ensuite avec les vésicules lysosomales acides
(pH 4,5 - 5) à l’apparence très dense. Ces lysosomes contiennent des enzymes de
dégradation (hydrolases acides lysosomales) et de nombreuses DNases qui sont actives à
pH acide et peuvent ainsi dégrader leur contenu.
¾ La voie de sécrétion (voir § 3 - 9 de la Partie I) où les vésicules endosomales de
transport (MVBs) contenant les particules à exocyter se dirigent, soit vers le TGN (transGolgi network) à partir duquel bourgeonnent des vésicules d’exocytose qui sécrètent leur
contenu dans le milieu extracellulaire (Rohn et al., 2000), soit directement vers la
membrane plasmique avec laquelle elles fusionnent afin de déverser là aussi leur contenu
dans le milieu extracellulaire (Johnstone et al., 1987).
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Figure 29 : Trafic intracellulaire d’une vésicule endosomale. (1) Voie de recyclage ;
(2) Voie de dégradation ; (3) Voie de sécrétion à partir du TGN ; (4) Voie de sécrétion à
partir des MVBs. MVB : multivesicular body, TGN : trans-Golgi network, CGN : cis-Golgi
network
Pour permettre un transfert de gènes efficace, les lipoplexes ou les polyplexes
doivent s’échapper des vésicules endosomales afin d’éviter d’être dégradés ou exocytés
et ainsi être libérés dans le cytosol et pouvoir atteindre le noyau.
3 - 4 - 2 - Les agents endosomolytiques
Certains lipides ou polymères cationiques sensibles au pH (lipopolyamines, pLK
histidylée, PEI…) possèdent une activité endosomolytique intrinsèque. D’autres
nécessitent
l’addition
d’agents
endosomolytiques
(DOPE,
chloroquine,
peptides
fusogènes…) dans le milieu de transfection pour s’échapper des vésicules endosomales.
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Stéphanie Grosse, 2004
a) Les lipides déstabilisants :
Le DOPE (Figure 10B) est un phospholipide neutre qui a des propriétés fusogènes
ce qui lui permet de déstabiliser la membrane des endosomes (Farhood et al., 1995 ; Hui
et al., 1996 ; Mui et al., 2000 ; Hafez et al., 2001). Associé à certains lipides cationiques
(DMRIE, BGTC, DOSPA…), il est capable d’améliorer l’efficacité de transfection (San et
al., 1993 ; Fasbender et al., 1997a ; Oudrhiri et al., 1997 ; Tucker et al., 2003).
b) Les agents lysosomotropiques :
La chloroquine (Figure 30) est une base faible, non chargée à pH neutre mais qui
se protone à pH acide (pH = 5,5). Dans sa forme neutre, lorsqu’elle est ajoutée au milieu
de transfection, elle passe facilement les membranes. Une fois dans les cellules, elle
s’accumule dans les compartiments acides et les neutralise. Elle inhibe ainsi l’activité des
enzymes lysosomales. La chloroquine est souvent utilisée in vitro avec les polymères
cationiques tels que les dérivés de pLKs. A concentration suffisante (100 µM), elle permet
de protéger les polyplexes contre la dégradation et ainsi d’augmenter l’efficacité de
transfection (Midoux et al., 1993 ; Mislick et al., 1995 ; Erbacher et al., 1996b). Cependant,
l’utilisation de la chloroquine in vivo est difficilement applicable.
Figure 30 : Structure chimique de la chloroquine
c) Les virus inactivés :
Les virus sont capables, grâce à des protéines présentes à leur surface, de
déstabiliser la membrane des endosomes. Ils sont ainsi libérés dans le cytosol. Cette
capacité des virus à s’échapper des endosomes a été mise au service des vecteurs
synthétiques en ajoutant dans le milieu de transfection des virus inactivés, le plus souvent
des adénovirus déficients pour la réplication. Dans un premier temps, les adénovirus
inactivés étaient simplement mélangés avec les complexes (plasmide/vecteur synthétique)
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au moment de la transfection (Curiel et al., 1991 ; Gottschalk et al., 1994). Cependant
pour permettre un échappement endosomal efficace des complexes, il fallait que les virus
inactivés et les complexes se retrouvent dans les mêmes endosomes. Les virus inactivés
peuvent également être couplés directement aux complexes par l’intermédiaire d’un
anticorps ou d’une liaison chimique, ce qui permet une colocalisation des virus inactivés et
des complexes dans les endosomes et donc une meilleure efficacité de transfection
(Cristiano et al., 1993 ; Baker et al., 1997). Cependant, le couplage des virus inactivés aux
complexes pose un certain nombre de problèmes : la taille des complexes résultant, la
difficulté de production des virus inactivés, l’immunogénicité et la perte de spécificité de
ciblage cellulaire. Certaines équipes ont alors ajouté aux complexes uniquement les
éléments viraux permettant l’échappement endosomal, les peptides fusogènes.
d) Les peptides fusogènes :
Les peptides fusogènes sont en général composés de séquences où alternent des
régions d’acides aminés hydrophobes et des régions d’acides aminés hydrophiles. Quand
le pH diminue (lorsque les complexes liés aux peptides se retrouvent dans les endosomes
tardifs), ces peptides ont la capacité de changer de conformation pour former une hélice α
qui ne présente à sa surface que les parties hydrophobes. Cette nouvelle conformation
permet aux peptides d’interagir avec les phospholipides membranaires, de déstabiliser les
membranes endosomales, d’induire la lyse des vésicules endosomales et par conséquent
la libération des complexes dans le cytosol (White et al., 1983).
Certains de ces peptides sont dérivés de séquences virales : c’est le cas des
peptides E5 (Murata et al., 1991), E5CA (Midoux et al., 1993) et E5WYG (Kichler et al.,
1999 ; Freulon et al., 2000) qui sont apparentés à la séquence N-terminale de la sousunité HA-2 de l’hémagglutinine du virus de la grippe (Wagner et al., 1992 ; Plank et al.,
1994 ; Simoes et al., 1998). C’est aussi le cas de peptides dérivés de la partie N-terminale
de la protéine VP1 du rhinovirus humain (Zauner et al., 1995) ou de la protéine G du virus
de la stomatite vésiculaire (Schuster et al., 1999). Des peptides fusogènes ont aussi été
dérivés de protéines bactériennes : c’est le cas du peptide dérivé de l’exotoxine A de
Pseudomonas (Fominaya et al., 1998). Un peptide synthétique a également été
développé : le GALA (oligomère du tétrapeptide glutamyl-alanyl-leucyl-alanine) qui
possède des propriétés comparables aux peptides fusogènes viraux ou bactériens
(Subbarao et al., 1987 ; Parente et al., 1988 ; Parente et al., 1990 ; Simoes et al., 1998).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
3 - 4 - 3 - L’échappement endosomal des lipoplexes
Le mécanisme exact d’échappement des vésicules endosomales des lipoplexes est
encore mal connu mais passerait par une déstabilisation des membranes endosomales.
Selon l’équipe de F. C. Szoka, les interactions électrostatiques entre les lipides
cationiques du lipoplexe et les lipides anioniques de la membrane des endosomes
induiraient un phénomène de « flip-flop » qui déstabiliserait à la fois le lipoplexe et la
membrane endosomale et permettrait ainsi la diffusion de l’ADN plasmidique libre dans le
cytosol (Figure 31) (Xu and Szoka, 1996 ; Zelphati and Szoka, 1996b). Ce modèle
suggère donc que la sortie du lipoplexe des vésicules endosomales entraîne également sa
dissociation. Afin d’améliorer ce mode de déstabilisation membranaire des endosomes, du
DOPE peut être additionné aux lipoplexes (Farhood et al., 1995 ; Hui et al., 1996 ;
Fasbender et al., 1997a ; Mui et al., 2000 ; Hafez et al., 2001). Des peptides fusogènes
peuvent également être additionnés comme un peptide dérivé de l’hémagglutine du virus
de la grippe ou le peptide GALA (Kichler et al., 1997 ; Simoes et al., 1998). Certains
auteurs ont suggéré que l’association de ces éléments serait nécessaire à la sortie des
lipoplexes des endosomes. En effet, le changement de conformation à pH acide du
peptide fusogène provoquerait la dissociation du lipoplexe. Les lipides cationiques ainsi
libérés de l’ADN plasmidique pourraient alors induire un mécanisme de « flip-flop » au
niveau de la membrane endosomale et la présence d’un co-lipide neutre, par ses pouvoirs
endosomolytiques, amplifierait cette sortie (Simoes et al., 1999).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 31 : Représentation schématique du phénomène de « flip-flop » des
lipoplexes (Xu and Szoka, 1996 ; Zelphati and Szoka, 1996b). (1) Endocytose du
lipoplexe qui se retrouve dans une vésicule endosomale ; (2) Déstabilisation membranaire
de l’endosome par un phénomène de « flip-flop » entre les lipides anioniques de la
membrane endosomale et les lipides cationiques du lipoplexe ; (3) Dissociation de l’ADN
plasmidique du lipide cationique et (4) sa libération dans le cytosol.
Un autre mode de déstabilisation des membranes endosomales a été décrit à l’aide
de lipides cationiques. En effet, certaines équipes ont développé des lipides cationiques
sensibles au pH, des lipopolyamines, qui romptent la membrane endosomale à un pH
acide (pH 5) comme celui des endosomes tardifs (Huang et al., 1987 ; Wang and Huang,
1989 ; Legendre and Szoka, 1992 ; Budker et al., 1996 ; Labat-Moleur et al., 1996 ; Byk et
al., 2000 ; Reddy et al., 2000). Ces lipides présentent en fait de nombreuses fonctions
amines non protonées à pH physiologique et peuvent ainsi tamponner le milieu acide des
endosomes. Ceci aboutit grâce à la pompe à protons, à une hypertonicité endosomale, à
une entrée importante d'eau, à la rupture de la membrane endosomale sous l'effet du
gonflement osmotique et finalement, à la libération des lipoplexes dans le cytosol (LabatMoleur et al., 1996).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
3 - 4 - 4 - L’échappement endosomal des polyplexes
Comme nous l’avons vu précédemment, la plupart des dérivés de pLKs nécessitent
l’addition d’agents endosomolytiques, tels que de la chloroquine (Midoux et al., 1993 ;
Mislick et al., 1995 ; Erbacher et al., 1996b), des adénovirus inactivés (Curiel et al., 1991 ;
Cristiano et al., 1993 ; Gottschalk et al., 1994) ou des peptides fusogènes (Wagner et al.,
1992 ; Midoux et al., 1993 ; Plank et al., 1994 ; Fominaya et al., 1998 ; Kichler et al.,
1999 ; Schuster et al., 1999), pour permettre un transfert de gènes efficace. Néanmoins, il
est évident que la nécessité d'ajouter des agents endosomolytiques à certains polymères
cationiques rend leur utilisation difficile in vivo. C’est pourquoi, certaines équipes ont
développé des polymères cationiques capables de déstabiliser par eux-mêmes les
membranes endosomales. Ces polymères ne nécessitent pas l’addition d’agents
endosomolytiques dans le milieu de transfection pour être efficaces (Boussif et al., 1995 ;
Midoux and Monsigny, 1999).
Le PEI présente comme certains lipides cationiques sensibles au pH, de
nombreuses fonctions amines non protonées à pH physiologique ce qui permet de
tamponner le milieu acide des endosomes (la protonation du PEI passe de 20 à 40 %
entre pH 7 et 5) et d’aboutir, grâce à la pompe à protons, à une hypertonicité endosomale,
à une entrée importante d'eau, à la rupture de la membrane endosomale sous l'effet du
gonflement osmotique et finalement, à la libération des polyplexes dans le cytosol (Figure
32) (Behr, 1996 ; Kichler et al., 2001 ; Sonawane et al., 2003). Ce mécanisme « d’éponge
à protons » permettant aux complexes de s’échapper des vésicules endosomales est
confirmé par le fait que l’efficacité de transfection à l’aide de ces polymères cationiques
n’augmente pas en présence d’agents endosomolytiques mais est inhibée en présence de
bafilomycine A1, un inhibiteur de la pompe à protons (Kichler et al., 2001). Un mécanisme
comparable est probablement en jeu avec la pLK histidylée (Midoux and Monsigny, 1999).
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Stéphanie Grosse, 2004
Figure 32 : Mécanisme de « l’éponge à protons » (Behr, 1996 ; Kichler et al., 2001).
Une fois endocyté (1), le polyplexe formé d’ADN plasmidique et de PEI qui est un
polymère cationique présentant de nombreuses fonctions amines non protonées à pH
physiologique, tamponne le milieu acide de la vésicule endosomale. Ceci provoque une
augmentation de la pression osmotique (2), la lyse de l’endosome et finalement, la
libération du polyplexe dans le cytosol (3).
D’autres équipes (Klemm et al., 1998 ; Bieber et al., 2002) suggèrent que le PEI
branché (25 ou 50 kDa) serait capable de s’échapper des vésicules endosomales par un
mécanisme semblable aux lipides cationiques (Xu and Szoka, 1996 ; Zelphati and Szoka,
1996b). En effet, Bieber et al. ont montré, après une étude en microscopie électronique,
qu’une interaction directe entre le PEI 25 kDa et la membrane des endosomes provoquait
une perméabilisation membranaire et ainsi la sortie des polyplexes dans le cytosol (Figure
33) (Bieber et al., 2002). Cette observation peut être en accord avec de précédentes
études qui ont montré que le PEI était capable de perméabiliser la membrane de bactéries
(Helander et al., 1997 ; Helander et al., 1998) ou de liposomes (Oku et al., 1986).
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 33 : Visualisation au microscope électronique de la perméabilisation
membranaire via une interaction directe entre le PEI et la membrane des vésicules
(Bieber et al., 2002). Lors de la transfection, les polyplexes formés d’ADN plasmidique et
de PEI 25 kDa se retrouvent dans des vésicules (flèches blanches). Certains se lient à la
membrane de ces vésicules (flèches noires) ce qui provoque une perméabilisation
membranaire (flèches bleues). Barre : 1,6 µm
Il apparaît probable que, quel que soit l'état des cellules, cette étape d’échappement
endosomal est déterminante pour permettre un transfert de gènes efficace à l’aide de
vecteurs synthétiques. Beaucoup d’études suggèrent que seule une faible proportion de
lipoplexes ou de polyplexes ou d’ADN plasmidique seul (si la dissociation a eu lieu) se
retrouve dans le cytosol. La majorité des lipoplexes ou des polyplexes, entrant par
endocytose, se retrouvent dans les endosomes qui sont rapidement transportés, grâce
aux microtubules, vers les lysosomes où ils sont dégradés (Zabner et al., 1995 ; El
Ouahabi et al., 1997 ; Hasegawa et al., 2001 ; Lechardeur and Lukacs, 2002 ; Wiethoff
and Middaugh, 2003). Pour un transfert de gènes efficace, les lipoplexes ou les polyplexes
doivent donc s’échapper précocément des endosomes (Zelphati and Szoka, 1996a). La
quantité de complexes qui parvient à s’échapper des endosomes dépendrait
essentiellement du type de lipide ou de polymère cationique utilisé. En effet, plus les
lipides ou les polymères cationiques présenteraient des charges positives, plus cette
étape serait efficace (Kichler et al., 1997 ; Kichler et al., 2001 ; Sonawane et al., 2003).
3 - 5 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES
Divers arguments expérimentaux suggèrent que les lipoplexes se dissocient dans le
cytosol et que c’est de l'ADN plasmidique quasi-nu qui pénètre dans le noyau. En effet,
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lors d’études en microscopie à fluorescence où le lipide cationique et l’ADN plasmidique
sont marqués, seul l’ADN plasmidique est retrouvé dans le noyau (Zelphati and Szoka,
1996b ; Marcusson et al., 1998). De même, aucune activité transcriptionnelle n'est
observée après microinjection de lipoplexes dans le noyau, les interactions entre le lipide
et l’ADN plasmidique inhibant certainement l’accès de l’ADN aux facteurs de transcription
(Zabner et al., 1995 ; Pollard et al., 1998).
Contrairement aux lipoplexes, divers arguments expérimentaux suggèrent qu’après
échappement des endosomes, l’ADN plasmidique reste associé au polymère cationique.
En effet, lors d’une étude en microscopie à fluorescence où le polymère cationique et
l’ADN plasmidique étaient marqués, les polyplexes fluorescents étaient retrouvés non
dissociés dans le noyau (Godbey et al., 1999c ; Fisher et al., 2000 ; Klink et al., 2001a).
De même, une transcription efficace a été observée après microinjection de polyplexes
dans le noyau (Pollard et al., 1998). Enfin, une activité transcriptionnelle in vitro a été
observée lorsque l’ADN plasmidique était complexé à des quantités croissantes de
polymères cationiques (Bieber et al., 2002).
L’ensemble des ces résultats suggère que la dissociation des complexes n’est pas
obligatoire pour assurer une efficacité de transfection. La non dissociation des polyplexes
permettrait même une meilleure protection de l’ADN plasmidique contre les nucléases
cytosoliques (Pollard et al., 2001). Cependant, suivant le degré de compaction de l'ADN et
la charge des polyplexes, l’accessibilité de l’ADN aux facteurs de transcription serait
variable (Pollard et al., 1998 ; Bieber et al., 2002).
3 - 6 - LES NUCLEASES CYTOSOLIQUES
L’échappement endosomal empêche la dégradation des complexes par les
enzymes lysosomales. Cependant, une fois dans le cytosol, les complexes ou l’ADN
plasmidique seul peuvent être dégradés par les nucléases cytosoliques. L’ADN doit donc
être protégé durant son passage dans le cytosol pour échapper à ces nucléases
(Lechardeur et al., 1999 ; Pollard et al., 2001).
Comme nous l’avons vu précédemment, la non dissociation des complexes
(ADN/PEI) protègerait l’ADN (Pollard et al., 2001). D’autres méthodes pour protéger l’ADN
des nucléases cytosoliques ont été développées : Katayose et al. ont coaté l’ADN
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complexé à son vecteur synthétique (une pLK) avec du PEG, ce qui permet de rendre
l’ADN résistant à la DNase I et de le protéger (Katayose et al., 1997) ; Ross et al. ont
utilisé un inhibiteur spécifique de la DNase, le DMI-2, pendant la transfection ce qui a
permis d’augmenter significativement l’efficacité de transfection (Ross et al., 1998). Ainsi,
la stabilité de l’ADN plasmidique dans le cytosol joue un rôle déterminant pour l’efficacité
de transfection.
3 - 7 - LE TRAFIC CYTOSOLIQUE
Une fois dans le cytosol, l’ADN plasmidique, libre ou toujours complexé à son
vecteur synthétique, doit traverser le cytosol (solution aqueuse à pH 7) afin d’atteindre le
noyau. Les mouvements de l’ADN dans le cytosol semblent se faire par diffusion, ce qui
est un processus assez lent, non dirigé vers un endroit précis de la cellule et qui dépend
de la taille de l’ADN. En effet, des études quantitatives sur la mobilité d’une molécule
d’ADN microinjecté dans le cytoplasme ont été réalisées sur des fragments d’ADN
fluorescents de différentes tailles et par recouvrement de fluorescence après
photoblanchiement (Lukacs et al., 2000). Ces études ont montré une diffusion élevée des
fragments d’ADN de taille inférieure à 100 pb, une diminution considérable de la mobilité
lorsque la taille de l’ADN augmente et une absence pratiquement totale de diffusion
cytosolique au-delà de 2 kb.
Un transport actif de l’ADN faisant intervenir le cytosquelette assurerait un meilleur
trafic vers le noyau (pour revues : Godbey et al., 1999b ; Wiethoff and Middaugh, 2003).
En effet, le cytosquelette constitué de microfilaments d’actine (polymères d’actine), de
filaments intermédiaires (filaments de cytokératine, de vimentine et de desmine), de
microtubules (polymères de tubuline) et de trois protéines mécanochimiques (la myosine,
la dynéine et la kinésine) permet le déplacement de divers composants à travers la cellule.
Plus précisément, la protéine motrice qu’est la dynéine permet un transport actif le long
des microtubules ou des microfilaments d’actine, de vésicules ou de certaines substances
cellulaires de la périphérie cellulaire vers la région péri-nucléaire (pour revue : Cole and
Lippincott-Schwartz, 1995). Deux équipes américaines ont récemment montré que
l’adénovirus (sérotype 5) et le virus HIV utilisaient la dynéine et les microtubules pour
migrer vers le noyau des cellules (Leopold et al., 2000 ; McDonald et al., 2002). Ainsi,
l’utilisation d’un système vectoriel ayant un ligand de la dynéine pourrait permettre un
transport cytosolique rapide et dirigé vers le noyau, de l’ADN thérapeutique (Pouton and
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Stéphanie Grosse, 2004
Seymour, 1998). Une étude a récemment montré que des nanopolyplexes (polyplexes
ayant une taille < 100 nm) formés d’ADN et de PEI 25 kDa étaient transportés du
cytoplasme vers le noyau le long des microtubules grâce aux protéines motrices du
cytosquelette, ce qui permettait leur accumulation en région périnucléaire (Suh et al.,
2003). Plus précisément, ce serait les vésicules endosomales contenant ces
nanopolyplexes qui seraient transportées le long des microtubules. Une fois en région
périnucléaire, les nanopolyplexes s’échapperaient de ces vésicules (Suh et al., 2003).
Ainsi, le transport cytosolique vers le noyau ne semble pas être une étape limitant
l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de polymères cationiques.
3 - 8 - L’ENTREE NUCLEAIRE
Une fois en région péri-nucléaire, l’ADN plasmidique seul ou complexé à son
vecteur synthétique doit pénétrer dans le noyau des cellules afin d’y être transcrit puis
traduit en une protéine thérapeutique.
3 - 8 - 1 - Le noyau et les pores nucléaires : généralités
Le noyau constitue un compartiment cellulaire difficile d’accès car il est limité par
une double membrane (l’enveloppe nucléaire) qui ne comporte que des pores de petite
taille (les pores nucléaires). L’enveloppe nucléaire est constituée de deux membranes,
une externe en relation avec le réticulum endoplasmique granulaire (REG) et une interne
séparée de l’hétérochromatine par l'intermédiaire de filaments de lamine. Un espace
périnucléaire sépare ces deux membranes. Ces deux membranes se rejoignent en
différents points de l’enveloppe nucléaire au niveau des pores nucléaires qui permettent le
passage de molécules aussi bien dans le sens noyau-cytosol que dans le sens cytosolnoyau (le transport nucléocytoplasmique).
Chaque pore nucléaire est formé d’une structure élaborée appelée le complexe du
pore nucléaire (NPC) constitué d’une centaine de protéines (nucléoporines) arrangées
selon une symétrie octagonale. Des études par reconstitution tridimensionnelle, d’après
des données de microscopie électronique, ont montré que chaque NPC est constitué de
deux types de canaux (Figure 34) : un canal central de 9 nm de diamètre qui peut tripler
de diamètre pour permettre le passage actif de grosses molécules (jusqu’à 50
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Stéphanie Grosse, 2004
mégadaltons) et huit petits canaux latéraux situés en périphérie assurant la diffusion
passive de petites molécules (< 40 kDa) (Hinshaw et al., 1992).
Figure 34 : Reconstitution en trois dimension du complexe de pore nucléaire
(Hinshaw et al., 1992)
3 - 8 - 2 - L’importation nucléaire de protéines NLS
Des protéines de masse moléculaire supérieure à 40 kDa peuvent passer à travers
les pores nucléaires par un processus actif. Cependant, la protéine à importer doit porter
une séquence peptidique particulière, appelée NLS (Nuclear Localisation Signal). Cette
séquence est reconnue par des récepteurs (les caryophérines) qui font la navette entre le
cytosol et le noyau (pour revue : Izaurralde and Adam, 1998). Elle peut être localisée
n’importe où sur la protéine. Elle est généralement constituée de 4 à 8 acides aminés
variables selon les protéines, mais souvent riche en acides aminés chargés positivement
comme la lysine ou l’arginine (exemple d’une séquence NLS : LysLysLysArgLys). Parfois,
elle contient également des prolines.
La figure 35 montre le mécanisme de l’importation nucléaire d’une protéine NLS
(protéine caryophile). La première étape est la reconnaissance entre la séquence NLS et
une première protéine caryophérine, l’importine α. Une fois l’interaction entre l’importine α
et la séquence NLS effectuée, une seconde protéine caryophérine, l’importine β, intervient
et le complexe (importines β/α-NLS-protéine) est alors transporté dans le noyau au travers
du NPC. Ainsi, le transport actif fait intervenir deux protéines cytoplasmiques solubles,
l’importine α qui reconnaît la séquence NLS et l’importine β qui interagit avec les
séquences répétées FG (phénylalanine-glycine) des nucléoporines et permet le passage à
travers les pores nucléaires (Gorlich et al., 1995a ; Gorlich et al., 1995b). Une fois dans le
noyau, le complexe se dissocie grâce à l’intervention d’une protéine G, la protéine Ran
GTPase. En effet, une association avec la protéine Ran sous une forme GTP provoque
une désorganisation du complexe, les importines sont alors recyclées vers le cytosol
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Stéphanie Grosse, 2004
laissant la protéine NLS seule dans le noyau. La protéine G intervient en fait dans le
contrôle de la direction du transport nucléaire. Dans le cytoplasme, Ran, sous l’action de
ses protéines activatrices (GAP), hydrolyse le GTP : la forme cytoplasmique est donc
RanGDP. Au contraire, dans le noyau, sous l’action du facteur d’échange de Ran (RCC1),
le GDP est converti en GTP : la forme nucléaire est donc RanGTP. Ainsi, en présence de
RanGDP, c’est l’importation nucléaire du complexe (importines β/α-NLS-protéine) et en
présence de RanGTP, c’est l’exportation nucléaire des importines α et β laissant la
protéine NLS seule dans le noyau (pour revues : Gorlich and Mattaj, 1996 ; Mattaj et al.,
1998 ; Talcott et al., 1999 ; Kuersten et al., 2001 ; Rout and Aitchison, 2001 ; Maillet,
2002c).
Figure 35 : Mécanisme d’importation nucléaire d’une protéine contenant une
séquence NLS (http://virologie.free.fr/04-transport_nucleaire/transport_nucleaire.htm)
Ainsi, des molécules de grande taille peuvent pénétrer dans le noyau interphasique
en passant à travers les pores nucléaires par un mécanisme signal-dépendant, qui
requiert de l’énergie et qui fait intervenir des récepteurs cytosoliques d’importation
nucléaire. Pour les études de transfert de gènes à l’aide de vecteurs synthétiques,
plusieurs équipes essayent de comprendre et d’améliorer l’entrée de l’ADN plasmidique
dans le noyau des cellules.
3 - 8 - 3 - L’importation nucléaire d’un ADN thérapeutique
Comme nous l’avons vu précédemment, le noyau est limité par une enveloppe
nucléaire. Cependant, cette barrière disparaît transitoirement lors de la mitose. L’étape
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d’entrée nucléaire d’un ADN thérapeutique dépend donc de l’état prolifératif des cellules
transfectées (en division ou quiescientes) (Wilke et al., 1996 ; Fasbender et al., 1997b ;
Jiang et al., 1998b), mais aussi de la taille et de la forme de l’ADN (Hagstrom et al., 1997)
et du type de vecteur synthétique utilisé (Pollard et al., 1998).
Une meilleure efficacité de transfection est observée avec les lipides cationiques
lorsque les cellules sont en mitose : le blocage de cellules en phase G1 provoque une
baisse de l’expression du transgène ; en revanche, des cellules transfectées juste avant
ou pendant qu’elles sont en mitose ont une plus grande expression du transgène (Nicolau
and Sene, 1982 ; Mortimer et al., 1999 ; Tseng et al., 1999 ; Brunner et al., 2000 ; Escriou
et al., 2001). Cependant, après une étude en microscopie électronique, une équipe a
observé des vésicules intranucléaires dans le noyau de cellules transfectées avec des
lipoplexes (Figure 36) (Friend et al., 1996). Ainsi, l’ADN plasmidique encore complexé à
son lipide cationique pourrait être capable d’entrer dans le noyau des cellules,
indépendamment du cycle cellulaire, par un mécanisme de fusion membranaire avec
l’enveloppe nucléaire favorisant aussi la dissociation des lipoplexes (Friend et al., 1996).
Figure 36 : Visualisation au microscope électronique d’une cellule non transfectée
(A) ou transfectée (B) avec des lipoplexes (ADN/DOTMA-DOPE) (Friend et al., 1996).
Nu : noyau, Cy : cytoplasme, NV : vésicules intranucléaires, barre : 200 nm
Le mécanisme par lequel les polyplexes entrent dans le noyau n’est pas encore
très clair. Brunner et al. suggèrent que le mode d’entrée des polyplexes dans le noyau des
cellules dépend du type du polymère cationique utilisé lors de la transfection (Brunner et
al., 2002). En effet, les polyplexes formés d’ADN plasmidique et de PEI linéaire 22 kDa
entreraient dans le noyau des cellules indépendamment du cycle cellulaire (Brunner et al.,
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2002) alors que les polyplexes formés d’ADN plasmidique et de pLK ou de PEI branché 25
kDa ou 800 kDa entreraient plutôt dans le noyau des cellules en faveur des mitoses
(Brunner et al., 2000 ; Remy-Kristensen et al., 2001 ; Brunner et al., 2002). Des cellules
transfectées à l’aide de pLK ou de PEI 800 kDa juste avant la division cellulaire (en phase
S/G2) avaient une expression du transgène 500 fois plus élevée que celles transfectées
en phase G1 (Brunner et al., 2000). Cependant, d’autres équipes suggèrent que le
polymère cationique favoriserait l’entrée de l’ADN plasmidique dans le noyau de cellules
quiescentes soit en passant à travers les pores nucléaires (Pollard et al., 1998), soit par
fusion membranaire (Godbey et al., 1999c). En effet, Pollard et al. ont montré qu’après
microinjection cytoplasmique, les polyplexes (ADN/PEI 25 kDa) étaient efficacement
transloqués dans le noyau des cellules indépendamment du cycle cellulaire. Le PEI
associé à l’ADN plasmidique permettrait de garder l’ADN sous une forme compactée,
compatible avec un passage à travers les pores nucléaires (Pollard et al., 1998). Godbey
et al. suggèrent que pendant l’échappement endosomal, quelques phospholipides
membranaires anioniques interagiraient avec les polyplexes cationiques formés de PEI 25
kDa (Godbey et al., 1999c). Ainsi, dans le cytosol, les polyplexes seraient coatés de
phospholipides facilitant ainsi la fusion membranaire avec l’enveloppe nucléaire et la
libération des polyplexes dans le noyau, comme pour les lipoplexes (Friend et al., 1996).
Certaines équipes ont étudié le mécanisme d’importation nucléaire d’ADN
plasmidique libre (non complexé à un vecteur synthétique) soit dans des cellules
perméabilisées par de la digitonine (Adam et al., 1990), soit par microinjection
cytoplasmique. Une étude a suggéré qu’un ADN plasmidique pouvait entrer dans le noyau
en passant à travers les pores nucléaires par un mécanisme semblable à celui des
macromolécules caryophiles. En effet, Dowty et al. ont observé qu’après injection
cytoplasmique d’un ADN plasmidique dans des cultures primaires de myotubes, 70 % des
myotubes injectés exprimaient le transgène et que cette expression était inhibée en
présence d’une molécule bloquant les pores nucléaires, la lectine du germe de blé (WGA,
Wheat Germ Agglutinin) (Dowty et al., 1995). Cependant, Hagstrom et al. ont montré que
seul un ADN linéaire inférieur à 1,5 kb pouvait entrer dans le noyau via un mécanisme
semblable aux macromolécules caryophiles (Hagstrom et al., 1997) et beaucoup d’études
ont plutôt noté qu’un ADN plasmidique seul dans le cytosol n’arrivait pas à entrer dans le
noyau des cellules (Colin et al., 2001), sauf lorsque les cellules étaient en mitose (Escriou
et al., 2001).
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Ainsi, l’ADN plasmidique libre ou complexé, localisé en région péri-nucléaire
entrerait dans le noyau des cellules préférentiellement lors de la disparition transitoire de
la membrane nucléaire, c’est à dire lors de la mitose. De plus, lors de la mitose, des
facteurs nucléaires capables de protéger et de stabiliser l’ADN sont présents dans la
cellule. Ceci pourrait expliquer la meilleure efficacité de transfection dans des cellules en
division (Strain et al., 1985 ; Dingwall and Laskey, 1992). Cependant, des mitoses
successives entraînent la perte du transgène non intégré et beaucoup de cellules de
l’organisme, comme celles de l’épithélium respiratoire, prolifèrent peu. Il est alors apparu
nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour améliorer l’entrée de l’ADN
thérapeutique dans le noyau de cellules interphasiques (pour revues : Cartier and Reszka,
2002 ; Monsigny et al., 2004).
3 - 8 - 4 - Les stratégies d’amélioration de l’importation nucléaire
d’un ADN thérapeutique
a) L’addition de peptides NLS :
Des études sur l’importation nucléaire de protéines ont montré que des particules
d’or d’un diamètre supérieur à 170 Å ou des protéines cytoplasmiques comme la βgalactosidase ou la pyruvate kinase coatées avec des séquences NLS pouvaient
s’accumuler dans le noyau (Feldherr et al., 1984 ; Bustamante et al., 2000). Ces
observations ont suggéré qu’il était peut-être possible d’utiliser des peptides NLS pour
obtenir une meilleure importation nucléaire de l’ADN thérapeutique (pour revues : Cartier
and Reszka, 2002 ; Escriou et al., 2003).
La séquence NLS la plus utilisée pour le transfert de gènes à l’aide de vecteurs
synthétiques est la séquence dérivée de l’antigène grand T du virus SV40
126
PKKKRKV132
(Kalderon et al., 1984). D’après certaines études, ce peptide NLS améliorerait l’efficacité
de transfection grâce à un meilleur ciblage nucléaire : Chan et Jans ont en effet montré
que l’addition de ce peptide NLS à une pLK permettait d’obtenir une efficacité de
transfection 1,3 fois plus élevée (Chan and Jans, 1999) ; Zanta et al. ont montré que
l’addition de ce même peptide NLS à un ADN complexé ensuite au PEI 22 kDa permettait
une efficacité de transfection 1000 fois plus élevée que celle obtenue sans l’addition du
NLS (Zanta et al., 1999) ; trois autres équipes travaillant avec de l’ADN seul ou complexé
à des lipides cationiques ont montré des résultats similaires (Fritz et al., 1996 ; Aronsohn
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
and Hughes, 1998 ; Ludtke et al., 1999). Cependant, de nombreuses autres équipes
utilisant ce peptide NLS n’ont pas montré de résultats très convainquants (Sebestyen et
al., 1998 ; Branden et al., 1999 ; Ciolina et al., 1999 ; Neves et al., 1999).
Cette stratégie d’amélioration dépend en fait de nombreux paramètres comme le
rapport N/P, utilisé lors des transfections, qui détermine le degré de compaction de l’ADN
et donc l’accessibilité de la séquence NLS aux protéines caryophérines (Chan et al.,
2000). La forme et la taille de l’ADN jouent également un rôle. En effet, la plupart des
études qui ont montré une forte amélioration de l’efficacité de transfection utilisaient un
ADN linéaire et de petite taille (Ludtke et al., 1999 ; Zanta et al., 1999). Malheureusement,
pour le transfert de gènes ce sont le plus souvent des ADN plasmidiques de grande taille
qui sont complexés aux vecteurs synthétiques.
b) L’addition d’osides :
Des travaux de Duverger et al., sur des cellules Hela électroporées, incubées en
présence de néoglycoprotéines (glycoprotéines de synthèse) fluorescentes, ont mis en
évidence une voie de transport nucléaire médiatisée par les oses (Duverger et al., 1993).
Des BSA (bovine serum albumin) substituées par des résidus α-D-glucosyles, α-Dmannosyles,
α-L-fucosyles
ou
β-di-N-acétylchitobiosyles
(GlcNAcβ4GlcNAc)
sont
transportées efficacement dans le noyau des cellules alors que la BSA nue reste dans le
cytosol. Le mécanisme d’importation nucléaire de glycoconjugués est un mécanisme qui
requiert de l’énergie et qui est inhibé par la WGA comme pour les protéines NLS. En
revanche, il ne nécessite pas la présence de facteurs cytosoliques et n’est pas inhibé par
un large excés de protéines NLS (Duverger et al., 1995 ; Duverger et al., 1996 ;
Rondanino et al., 2003). La voie de transport nucléaire glycodépendante est différente de
la voie NLS-dépendante et dépend de la nature de l’ose : les BSA substituées par des
résidus α-N-acétyl-D-galactosaminyles, 6-phospho-α-D-mannosyles ou β-lactosyles reste
dans le cytosol. Le transport des glycoconjugués du cytosol au noyau pourrait en fait
impliquer
des
lectines
nucléocytoplasmiques
appartenant
aux
complexes
ribonucléoprotéiques (RNP) qui lient des sucres et circulent entre le cytosol et le noyau
(pour revues : Wang et al., 1991 ; Wang et al., 1992 ; Snow and Hart, 1998). Cinq lectines
du complexe RNP sont actuellement caractérisées : CBP35 (galectin 3) et CBP14
(galectin 1) liant des résidus galactosides ; CBP67, CBP70 et CBP33 liant des résidus
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Stéphanie Grosse, 2004
glucosides. Ainsi, la néoglycoprotéine substituée avec des résidus de glucose pourrait être
transportée dans le noyau des cellules grâce à la CBP67 (Duverger et al., 1993).
Suite à ces résultats, une autre approche pour améliorer l’importation nucléaire de
l’ADN thérapeutique est la substitution du vecteur synthétique ou de l’ADN plasmidique
par des résidus de sucres (pour revue : Monsigny et al., 2004). Klink et al. ont en effet
montré qu’une pLK lactosylée complexée ou non à un ADN plasmidique était capable
d’être transloquée efficacement dans le noyau des cellules contrairement à une pLK non
glycosylée et que cette transloquation était inhibée en présence de WGA (Klink et al.,
2001a). Cette équipe a émis l’hypothèse que les résidus de lactose substituant la pLK
pouvaient être reconnus par la galectine 3, elle-même reconnue par la protéine Chrp
(histidine-rich cytoplasmic protein) connue pour faciliter la translocation nucléaire de
glycoprotéines (Menon et al., 2000) (pour revue : Klink et al., 2001b). Cependant, ces
résultats ne sont pas en accord avec ceux trouvés avec les néoglycoprotéines qui
montraient qu’une BSA substituée par du lactose ne pouvait pas être transloquée dans le
noyau des cellules (Duverger et al., 1993). Rondanino et al. ont substitué directement un
ADN plasmidique par des résidus de mannose et ont montré que, dans des cellules
perméabilisées par de la digitonine, l’ADN mannosylé pouvait entrer dans le noyau des
cellules alors que l’ADN nu restait dans le cytosol (Rondanino et al., 2004). Cette équipe a
également observé que cet ADN plasmidique mannosylé complexé à la Lipofectine®
permettait un transfert de gènes 250 fois plus élevé que l’ADN modifié mais non glycosylé
(Rondanino et al., 2004).
Cette technique de substitution par des sucres est très prometteuse pour le
transfert de gènes à l’aide de vecteurs synthétiques car les sucres qui permettent déjà un
meilleure ciblage cellulaire, comme nous l’avons vu précédemment, pourraient permettre
également une meilleure entrée nucléaire et donc une meilleure efficacité de transfection.
Malgré le développement de nouvelles stratégies pour améliorer l’entrée nucléaire
de l’ADN thérapeutique, cette étape reste aujourd’hui l’étape intracellulaire la plus limitante
pour le transfert de gènes à l’aide de vecteurs synthétiques, surtout dans les cellules
quiescentes (pour revues : Lechardeur and Lukacs, 2002 ; Wiethoff and Middaugh, 2003).
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Stéphanie Grosse, 2004
3 - 9 - L’EXOCYTOSE
Une autre voie possible et encore inexplorée qui pourrait limiter l’efficacité de
transfection à l’aide de vecteurs synthétiques est l’exocytose des complexes (plasmide/
vecteur synthétique) dans le milieu extracellulaire, c’est-à-dire leur libération hors de la
cellule avant qu’ils n’atteignent le noyau. En effet, une fois que les complexes sont
endocytés par les cellules cibles, ils se retrouvent dans des vésicules d’endocytose. Si les
complexes ne sont pas libérés de ces vésicules alors, comme nous l’avons vu
précédemment, ils peuvent être dégradés dans les lysosomes. Ils pourraient aussi être
rejetés par la cellule, notamment en étant dirigés vers les MVBs puis le TGN, qui sont tous
deux des compartiments à partir desquels peut avoir lieu une exocytose (Figure 29).
3 - 9 - 1 - La sécrétion contrôlée ou constitutive à partir du TGN
Certaines vésicules endosomales dont le contenu est à exocyter sont transportées
vers l’appareil de Golgi et plus particulièrement vers la saccule trans de l’appareil de Golgi
(le TGN) à partir de laquelle se forment des vésicules de sécrétion (Rohn et al., 2000).
Ces vésicules de secrétion, contennant des produits du RE ou des vésicules
endosomales, sont ensuite transportées vers la membrane plasmique des cellules et
exocytent leur contenu. L’exocytose à partir du TGN revêt deux formes : la sécrétion
contrôlée (phénomène discontinu) et la sécrétion constitutive (phénomène continu) (Figure
37) (pour revues : Traub and Kornfeld, 1997 ; Maillet, 2002a ; Maillet, 2002d).
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Stéphanie Grosse, 2004
Figure 37 : Voie de sécrétion contrôlée ou constitutive (d’après Maillet, 2002d). REG :
réticulum endoplasmique granulaire, CGN : saccule cis de l’appareil de Golgi, TGN :
saccule trans de l’appareil de Golgi, COP : coat protein
La sécrétion contrôlée concerne des produits comportant des signaux de
reconnaissance et se fait grâce à un stimulus (signal provenant de la cellule elle-même ou
d’origine extracellulaire). Plus précisément, les produits (après un triage dans l’appareil de
Golgi) se retrouvent dans des vésicules à clathrine d’origine golgienne. Ces vésicules sont
ensuite déshabillées afin de devenir lisses. Puis, suite à un stimulus, elles fusionnent avec
la membrane plasmique des cellules afin d’exocyter leur contenu (Figure 37).
La sécrétion constitutive est une sécrétion par défaut. Elle concerne des produits
n’ayant pas de signaux de reconnaissance et qui, par défaut, sont transportés vers la
membrane plasmique des cellules. Elle a surtout lieu dans les cellules non polarisées.
Plus précisément, les produits se retrouvent dans des vésicules recouvertes d’un manteau
de COPs (coat proteins) qu’elles perdent très rapidement après leur individualisation. Les
vésicules sont ensuite transportées vers la membrane plasmique des cellules afin de
libérer leur contenu dans le milieu extracellulaire (Figure 37).
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Stéphanie Grosse, 2004
3 - 9 - 2 - La sécrétion exosomale à partir des MVBs
Nous avons vu précédemment que les MVBs pouvaient être dirigés soit vers le
TGN, soit vers les vésicules lysosomales (Figure 29). En 1987, Johnstone et al. ont
également montré que les MVBs pouvaient être dirigés vers la membrane plasmique des
cellules afin d’exocyter leur contenu (Johnstone et al., 1987). Cette équipe a en effet
observé que dans des reticulocytes, la membrane des MVBs (vacuoles de 200 à 800 nm
de diamètre) s’invaginait pour former des petites vésicules de 40 à 100 nm de diamètre
appelées exosomes qui étaient ensuite sécrétées hors des cellules par fusion
membranaire entre les MVBs et la membrane plasmique (Figures 38 et 39) (Johnstone et
al., 1987). Depuis, ce phénomène de sécrétion exosomale a été observé dans plusieurs
types cellulaires (lymphocytes B et T, cellules dendritiques, macrophages, cellules
alvéolaires du poumon, cellules épithéliales intestinales) et suivant l’origine cellulaire, cette
sécrétion aurait des fonctions biologiques différentes (pour revues : Denzer et al., 2000 ;
Stoorvogel et al., 2002). Dans les réticulocytes, la sécrétion exosomale assure la
maturation des réticulocytes en hématies en éliminant des protéines membranaires
présentes dans les exosomes (Johnstone et al., 1987 ; Vidal et al., 1993). Dans les
lymphocytes B (Raposo et al., 1996) et T (Peters et al., 1989), les cellules dendritiques
(Zitvogel et al., 1998 ; Thery et al., 2001), les cellules épithéliales intestinales (van Niel et
al., 2001) et les cellules pulmonaires (Admyre et al., 2003), elle jouerait un rôle dans la
présentation antigénique afin de stimuler le système immunitaire. Ainsi, les exosomes
participeraient à la sortie de lipides ou de protéines provenant des voies d’endocytose et à
la communication cellulaire. Suivant le type cellulaire, les exosomes peuvent être nommés
différemment, ce sont des télérosomes dans les cellules épithéliales intestinales (Karlsson
et al., 2001), des prostasomes dans les cellules épithéliales de la prostate (Kravets et al.,
2000) et des argosomes chez la Drosophile (Greco et al., 2001).
Figure 38 : Maturation des endosomes précoces en MVB et libération dans le milieu
extracellulaire des exosomes. MVB : multivesicular body, MIC : milieu intracellulaire,
MEC : milieu extracellulaire
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Stéphanie Grosse, 2004
Figure 39 : Visualisation au microscope électronique d’un MVB (A) et de la sécrétion
exosomale (B) (d’après Stoorvogel et al., 2002). (A) MVB constitué de petites vésicules
internes (flèches) ; (B) Sécrétion des exosomes (flèches) dans le milieu extracellulaire
(MEC). MIC : milieu intracellulaire, barre : 50 nm
Cette voie de sécrétion exosomale est aussi une voie empruntée par de nombreux
virus, bactéries et protéines cationiques pour sortir des cellules cibles. En ce qui concerne
les protéines cationiques, Greco et al. ont montré que chez la Drosophile, après
endocytose de la protéine Wingless via une interaction avec les HSPGs présents à la
surface des cellules, les complexes (Wingless/HSPGs) se trouvaient incorporés dans les
vésicules internes des MVBs (les argosomes), puis sécrétés rapidement hors de la cellule
après fusion des MVBs avec la membrane plasmique (Greco et al., 2001). Cette voie
d’entrée via les HSPGs est également empruntée par des virus, notamment par le HIV-1
grâce à sa protéine cationique Tat (Tyagi et al., 2001). Les virus HIV-1 s’accumulent
ensuite dans les MVBs et sortent des cellules par la voie des exosomes (Raposo et al.,
2002). En thérapie génique, les complexes (ADN plasmidique/vecteur cationique) ont
souvent une charge de surface cationique ce qui permet, en partie, une entrée cellulaire
des complexes via des interactions électrostatiques avec les HSPGs présents à la surface
des cellules cibles (Yanagishita et al., 1992 ; Mislick et al., 1996 ; Ruponen et al., 1999). Il
pourrait être intéressant de vérifier si cette entrée via les HSPGs peut provoquer une
exocytose des complexes par la voie de sécrétion exosomale.
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Stéphanie Grosse, 2004
3 - 10 - SYNTHESE
Les schémas ci-dessous récapitulent globalement les différentes étapes du trafic
intracellulaire d’un ADN plasmidique complexé soit à un lipide cationique (Figure 40),
soit à un polymère cationique (Figure 41).
Figure 40 : Trafic intracellulaire d’un lipoplexe (d’après les revues : Lechardeur and
Lukacs, 2002 ; Templeton, 2002 ; Wiethoff and Middaugh, 2003). L’ADN plasmidique est
complexé à un lipide cationique par simple mélange (1) afin de former un lipoplexe (2). Le
lipoplexe par interaction de charges se lie à la membrane plasmique (3) puis entre dans la
cellule soit par un mécanisme de fusion membranaire (4a) libérant directement l’ADN
plasmidique nu dans le cytosol (7), soit par un mécanisme d’endocytose (4b). Une fois
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
dans la vésicule endosomale (5), le lipoplexe est souvent transporté vers les lysosomes
où il est dégradé (6a). Pour assurer un transfert de gènes efficace, le lipoplexe s’échappe
de la vésicule endosomale par un phénomène de « flip-flop » membranaire provoquant le
plus souvent sa dissociation (6b). Une fois dans le cytosol (7), l’ADN plasmidique peut être
dégradé par les nucléases cytosoliques (8). Seule une faible portion d’ADN plasmidique
réussit à atteindre le noyau (9), principalement pendant la mitose, permettant ainsi
l’expression de la protéine thérapeutique (10). L’épaisseur des flèches est proportionnelle
à l’importance quantitative de la voie indiquée.
Figure 41 : Trafic intracellulaire d’un polyplexe (d’après les revues : Godbey et al.,
1999b ; Kircheis et al., 2001 ; Zuber et al., 2001 ; Wiethoff and Middaugh, 2003). L’ADN
plasmidique est complexé à un polymère cationique par simple mélange (1) afin de former
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I - GENERALITES
Stéphanie Grosse, 2004
un polyplexe (2). Le polyplexe entre ensuite dans la cellule par un mécanisme
d’endocytose (3). Une fois dans la vésicule endosomale (4), le polyplexe peut être
transporté vers la voie de dégradation lysosomale (5a). La vésicule endosomale contenant
le polyplexe peut aussi être transportée grâce au cytosquelette vers la région périnucléaire
(5b). Puis, le polyplexe peut être libéré de cette vésicule par le mécanisme « d’éponge à
protons » (6). Une fois dans le cytosol (7), le polyplexe entre dans le noyau (8),
principalement pendant la mitose, permettant ainsi l’expression de la protéine
thérapeutique (9). L’épaisseur des flèches est proportionnelle à l’importance quantitative
de la voie indiquée.
Une meilleure compréhension des étapes cellulaires limitant l’efficacité du transfert
de gènes à l’aide de vecteurs synthétiques a permis de développer de nouveaux vecteurs,
notamment de nouveaux polymères cationiques qui permettent aujourd’hui un meilleur
trafic intracellulaire de l’ADN plasmidique que les lipides cationiques. En effet, leur
substitution par des ligands favorise une meilleure entrée dans les cellules cibles et leur
activité endosomolytique intrinsèque évite une trop forte dégradation dans les lysosomes.
De plus, ils protègeraient l’ADN contre les nucléases cytosoliques et permettraient un
meilleur trafic cytosolique de l’ADN vers le noyau.
Une même étude dans les cellules épithéliales des voies aériennes humaines
permettrait peut être de développer de nouveaux vecteurs qui soient efficaces pour le
traitement de la mucoviscidose par thérapie génique.
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II - BUT DE L’ETUDE
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II - BUT DE L’ETUDE
Stéphanie Grosse, 2004
L’objectif de notre travail a été d’étudier le trafic intracellulaire d’un ADN
plasmidique complexé à différents polymères cationiques (polylysine, polyéthylèneimine)
substitués ou non par des résidus osidiques dans les cellules épithéliales des voies
aériennes humaines immortalisées ou en culture primaire afin de répondre aux questions
suivantes :
¾ Quelles sont les étapes cellulaires limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide
de polymères cationiques nus ou substitués par des résidus osidiques ?
¾ La nature du polymère cationique et/ou sa substitution par des résidus osidiques
modifient-ils le trafic intracellulaire de l’ADN plasmidique vers le noyau et donc
l’efficacité de transfection ?
Ces travaux devraient contribuer au développement de nouveaux vecteurs de
transfert de gènes qui soient efficaces in vivo pour une application à la thérapie génique
de la mucoviscidose.
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III - RESULTATS
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III - RESULTATS (Article 1)
Stéphanie Grosse, 2004
1 - ARTICLE 1 : « Intracellular rate-limiting steps of gene transfer using
glycosylated polylysines in cystic fibrosis airway epithelial cells »
Dans cet article publié dans Gene Therapy, nous avons comparé le trafic
intracellulaire d’un ADN plasmidique complexé soit à une pLK lactosylée, soit à une pLK
mannosylée dans les cellules épithéliales des voies aériennes humaines immortalisées
dérivées de cellules épithéliales ciliées avec mutation homozygote ∆F508 de l’exon 10 du
gène CFTR (les cellules ΣCFTE29o-). En effet, il a été précédemment montré au
laboratoire que les complexes plasmide/pLK mannosylée les mieux endocytés par ces
cellules, ne permettent pas un transfert de gènes efficace alors que les complexes
plasmide/pLK lactosylée peu endocytés assurent une meilleure efficacité de transfection
(Fajac et al., 1999 ; Allo et al., 2000).
Pour cela, nous avons utilisé un ADN plasmidique substitué par des résidus de
biotine ou par du Texas Red et des pLKs glycosylées pouvant être marquées à la
fluorescéine (FITC). Nous avons incubé les cellules ΣCFTE29o- en présence de ces
complexes pendant 1 heure à 4°C. A cette température les complexes se lient à la
membrane plasmique des cellules mais ne sont pas endocytés. Au bout d’1 h, la solution
de complexes était enlevée et les cellules incubées à 37°C et étudiées à différents temps,
de 10 minutes à 48 heures. L’ADN biotinylé était révélé avec de la streptavidinerhodamine et la localisation intracellulaire des complexes étudiée en microscopie
confocale après marquage de certains organites intracellulaires (endosomes, lysosomes,
noyau) par immunocytochimie. L’efficacité de transcription de l’ADN plasmidique complexé
aux pLKs glycosylées a également été étudiée par des techniques de transcription in vitro.
Nos principaux résultats ont montré qu’en dépit d’une importante entrée des
complexes mannosylés dans les cellules ΣCFTE29o- (Fajac et al., 1999), ceux-ci ont une
faible efficacité de transfection comparés aux complexes lactosylés en partie en raison
d’un échappement inefficace des vésicules endosomales, d’une importante
localisation lysosomale et d’une diminution de l’efficacité de transcription de l’ADN
plasmidique.
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III - RESULTATS (Article 1)
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III - Résultats (Article 2)
Stéphanie Grosse, 2004
2 - ARTICLE 2 : « Lactosylated polyethylenimine for gene transfer into
airway epithelial cells: role of the sugar moiety in cell delivery and
intracellular trafficking of the complexes »
En collaboration avec l’équipe du Pr. M. Monsigny, nous avons amélioré l’étape de
l’échappement endosomal en utilisant un autre polymère, le polyéthylèneimine (PEI) qui
permet aux complexes plasmide/vecteur de quitter les vésicules endosomales sans
l’adjonction d’agents endosomolytiques dans le milieu de transfection, contrairement aux
pLKs (Behr, 1996 ; Kichler et al., 2001 ; Sonawane et al., 2003). Un PEI de 25 kDa
branché substitué par différents résidus de sucres a été développé au laboratoire de
Glycobiologie (CNRS, Orléans). Puis, nous avons étudié l’efficacité de transfection de ces
PEIs glycosylés et comparé leur efficacité à d’autres polymères cationiques dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines immortalisées ou en culture primaire
(Fajac et al., 2003). Parmis les différents polymères cationiques utilisés (pLKs glycosylées,
PEIs non substitué ou glycosylés), le PEI lactosylé était le plus efficace pour le transfert de
gènes rapporteurs dans les cellules immortalisées et ceci sans l’adjonction d’agents
endosomolytiques. Dans les cellules en culture primaire, seul le PEI lactosylé permettait
un transfert de gènes rapporteurs efficace.
Dans cet article publié dans The Journal of Gene Medicine, nous avons dans un
premier temps étudié l’efficacité de transfection et la cytotoxicité du PEI lactosylé comparé
au PEI non substitué dans les cellules ΣCFTE29o-. Puis, dans un deuxième temps, nous
avons étudié le mode d’entrée des complexes formés de PEI lactosylé dans les cellules
ΣCFTE29o- et comparé par des techniques d’immunocytochimie et de microscopie
confocale le trafic intracellulaire (localisation endosomale, lysosomale et nucléaire) d’un
ADN plasmidique complexé au PEI non substitué ou au PEI lactosylé dans les cellules
ΣCFTE29o- et en culture primaire. L’efficacité de transcription et d’expression de l’ADN
plasmidique complexé au PEI non substitué ou lactosylé ont également été étudiées par
des techniques de transcription in vitro et de microinjection nucléaire.
Nos principaux résultats ont montré qu’en dépit d’une localisation endosomale et
lysosomale plus importante, les complexes plasmide/PEI lactosylé sont plus efficaces pour
le transfert de gènes rapporteurs dans les cellules épithéliales des voies aériennes
humaines que les complexes plasmide/PEI non substitué. Cette plus grande efficacité de
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III - RESULTATS (Article 2)
Stéphanie Grosse, 2004
transfection à l’aide du PEI lactosylé était en partie due à une meilleure entrée cellulaire,
grâce aux résidus de lactose qui permettent un meilleur ciblage cellulaire et une entrée
des complexes lactosylés majoritairement par endocytose dépendante de la clathrine, et
une plus faible toxicité cellulaire qui peut être due à une diminution du pouvoir
endosomolytique. Cependant, l’étape de l’entrée nucléaire reste une étape cellulaire
limitante pour l’efficacité du transfert de gènes à l’aide du PEI lactosylé. Les résidus de
lactose substituant le PEI n’améliorent pas cette étape cellulaire du transfert de gènes.
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III - RESULTATS (Article 3)
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3 - ARTICLE 3 : « Potocytosis and cellular exit of complexes may limit
the efficiency of gene transfer by polycations »
Afin de vérifier et de compléter l’ensemble de nos résultats obtenus en microscopie
confocale (Articles 1 et 2), nous avons étudié le trafic intracellulaire d’un ADN plasmidique
complexé aux différents polymères cationiques (pLKs glycosylées, PEI non substitué, PEI
lactosylé) par microscopie électronique dans les cellules épithéliales des voies aériennes
humaines immortalisées ou en culture primaire.
Dans cette étude soumise au journal Molecular Therapy, l’ADN plasmidique a été
marqué par des billes d’or de 10 nm de diamètre puis complexé soit à la pLK lactosylée ou
mannosylée, soit au PEI non substitué ou lactosylé. Le trafic intracellulaire de ces
complexes a ensuite été étudié dans les cellules ΣCFTE29o- ou en culture primaire par
microscopie électronique après fixation, marquage à l’acide osmique et à l’acétate uranyl,
déshydratation, inclusion et coupes des cellules.
Nos principaux résultats confirment ceux précédemment obtenus en microscopie
confocale et ceux de la littérature (pour revues : Lechardeur and Lukacs, 2002 ; Wiethoff
and Middaugh, 2003) montrant que la principale étape limitant l’efficacité de transfection à
l’aide de dérivés de polymères cationiques est l’entrée dans le noyau. De plus, cette
étude a permis de mettre en évidence deux autres voies limitant certainement l’efficacité
de transfection à l’aide de ces vecteurs. En effet, alors qu’il est souvent admis dans la
littérature qu’il est préférable d’utiliser des complexes de petites tailles pour des études in
vivo (Goula et al., 1998b ; Wightman et al., 2001), nous avons montré qu’ils entrent dans
les cellules majoritairement par potocytose ce qui aboutit à leur accumulation dans le
réticulum endoplasmique et certainement à leur séquestration. De plus, l’exocytose des
complexes plasmide/pLKs glycosylées par la voie des exosomes et des complexes
plasmide/dérivés de PEIs par un phénomène de régurgitation pourrait expliquer la courte
durée d’expression du transgène obtenue à l’aide de ces vecteurs.
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
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4 - RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Afin de compléter l’ensemble de ces travaux de recherche, il nous a semblé
nécessaire de mieux comprendre par quel mécanisme les complexes plasmide/PEI
lactosylé ou non substitué entraient dans le noyau des cellules épithéliales des voies
aériennes humaines et quel était le rôle du cytosquelette dans le trafic intracellulaire de
ces complexes. L’ensemble des résultats ci-dessous font l’objet de deux articles en
préparation.
4 - 1 - MECANISME D’ENTREE DANS LE NOYAU
Le mécanisme d’entrée dans le noyau de complexes plasmide/PEI lactosylé ou non
substitué pourrait se faire soit à la faveur des mitoses, c’est-à-dire lorsque la membrane
nucléaire disparaît, soit à travers les pores nucléaires. Il peut être étudié par des
techniques de synchronisation des cellules (importance du cycle cellulaire) ou de
perméabilisation des cellules par de la digitonine (importance des pores nucléaires).
Nous avons dans un premier temps synchronisé les cellules ΣCFTE29o- par un
double blocage à la thymidine (Spector et al., 1998) et vérifié le blocage des cellules à la
transition des phases G1/S par cytométrie en flux après marquage de l’ADN par du iodure
de propidium (Tas et al., 1981) : 86,5 % des cellules étaient en phase G0/G1, 8 % en
phase S et 5,5 % en phase G2/M (Figure 42A, T0). La thymidine était alors enlevée du
milieu de culture et nous avons vérifié que les cellules ΣCFTE29o- étaient capables de
passer par une étape de mitose. Dix heures après la levée du blocage, 55 % des cellules
étaient en phase G2/M (Figure 42A, 10 h). Si nous laissions la thymidine pendant 24 h
supplémentaires après le double blocage, 70 % des cellules ΣCFTE29o- restaient
bloquées en phase S (Figure 42B). Les cellules ΣCFTE29o- asynchrones ont également
été étudiées et 58 % d’entre elles étaient en phase G0/G1, 21 % en phase S et 21 % en
phase M (Figure 42C).
Les cellules ΣCFTE29o- synchronisées par le bouble blocage à la thymidine
majoritairement en phase G0/G1 au temps T0 étaient ensuite incubées pendant 1 heure à
37°C en présence d’un ADN plasmidique (pCMVGFP) codant pour la green fluorescent
protein et complexé au PEI lactosylé ou au PEI non substitué. L’efficacité de transfection
était ensuite étudiée 24 heures après par cytométrie en flux et comparée à celle obtenue
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
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sur des cellules ΣCFTE29o- asynchrones ou arrêtées en phase S (Figure 43). Nous avons
montré que le transfert de gènes à l’aide du PEI lactosylé ou du PEI non substitué était
plus efficace si au cours de l’étape de la transfection, les cellules passaient par une étape
de mitose (Figure 43). Ces résultats ont été confirmés après microinjection de complexes
pCMVGFP/PEI lactosylé ou non substitué dans le cytoplasme des cellules ΣCFTE29o-. En
effet, seules les cellules passées en mitose exprimaient la protéine GFP (Figure 44).
Figure 42 : Flow cytometric analysis of DNA content of ∑CFTE29o- cells. (A) After
synchronization of cells at the G1/S boundary by double-thymidine block (T0), cells were
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
analyzed at different times after the release from the second thymidine block (from 2 h to
24 h). (B) After the double-thymidine block, cells were incubated once more in the
presence of thymidine (2 mM) during 24 h and analyzed. (C) Asynchronous cells were also
analyzed. For each condition, the breakdown of the population according to cell cycle
phase is indicated.
Figure 43 : Transfection of synchronized cells. Immediately after the double-thymidine
block release, synchronized ∑CFTE29o- cells at the G1/S boundary (
) were incubated
during 1 h at 37 °C in the presence of 2.5 µg of plasmid encoding the gfp gene complexed
to lactosylated PEI (Lac-PEI) or unsubstituted PEI (PEI). Twenty-four hours later, the
percentage of fluorescent cells was determined by flow cytometry. The GFP expression
was compared with that obtained with asynchronous cells (
phase (
) or cells blocked at the S
) transfected with the same complexes.
Figure 44 : Cytoplasmic microinjection of synchronized cells. Immediately after the
double-thymidine block release, synchronized ∑CFTE29o- cells at the G1/S boundary
were microinjected into the cytoplasm with a TRITC-dextran solution (A) and a plasmid
encoding the gfp gene complexed to lactosylated PEI (B). Twenty-four hours later, cells
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
were examined by epifluorescence microscopy. The same experiment has been
performed with unsubstitued PEI and same results were observed.
Pour étudier l’importance éventuelle des pores nucléaires dans le transfert de
gènes à l’aide du PEI lactosylé ou du PEI non substitué, les cellules ΣCFTE29o- étaient
perméabilisées par de la digitonine (40 µg/ml) selon le protocole de Moore et Blobel
(Moore and Blobel, 1992). Ainsi, la membrane plasmique des cellules est rendue
perméable et les composants du cytosol sont éliminés, tout en laissant l’enveloppe
nucléaire intacte. Dans un premier temps, nous avons vérifié le protocole sur nos cellules
ΣCFTE29o-, en étudiant l’importation nucléaire d’une albumine sérique bovine (BSA) de
85 kDa portant un signal NLS. Comme attendu, la BSA-NLS n’entre dans le noyau des
cellules ΣCFTE29o- qu’en présence d’ATP et d’extraits cytosoliques (rabbit reticulocyte
lysate, RRL) qui apportent les protéines caryophérines (voir § 3 - 8 - 2 de la Partie I). La
présence de WGA, qui bloque les pores nucléaires (Finlay et al., 1987), inhibe cette entrée
(Figure 45). Une fois le protocole mis au point, nous avons étudié l’importation nucléaire
d’un ADN plasmidique de 5 kDa seul ou complexé au PEI non substitué ou au PEI
lactosylé dans les cellules ΣCFTE29o- perméabilisées par de la digitonine (Figure 46).
Nos résultats ont montré que ni la présence d’ATP et/ou d’extraits cytosoliques ne permet
une entrée dans le noyau des cellules ΣCFTE29o- à travers les pores nucléaires de l’ADN
plasmidique seul ou complexé au PEI non substitué ou lactosylé (Figure 46).
Figure 45 : Nuclear import of NLS-bearing bovine serum albumin. ΣCFTE29o-cells
were permeabilized using digitonin and incubated in the presence of 40 µg/ml rhodaminelabeled bovine serum albumin substituted with the SV40 nuclear localization signal (RhNLS-BSA) for 1 hour at 37°C either in the import buffer alone (∅) or in the import buffer
supplemented with 0.5 mM ATP or/and 50 % cytosolic extract (RRL) or in the import buffer
supplemented with 0.5 mM ATP, 50 % RRL and 50 µg/ml WGA. Then, cells were fixed in
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
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methanol-acetone and nuclear localization of Rh-NLS-BSA analyzed by confocal
microscopy.
Figure 46 : Nuclear import of a plasmid free or complexed to unsubstituted PEI (PEI)
or lactosylated PEI (Lac-PEI). ΣCFTE29o-cells were permeabilized using digitonin and
incubated in the presence of 40 µg/ml of free biotinylated plasmid (pCMVLuc) or
complexed to PEI or Lac-PEI (charge ratio PEI nitrogen/DNA phosphorus of 10) for 1 hour
at 37°C either in the import buffer alone (∅) or in the import buffer supplemented with 0.5
mM ATP or/and 50% cytosolic extract (RRL). Then, cells were fixed in methanol-acetone,
the biotinylated plasmid was labeled with rhodamine-labeled streptavidin and appears red;
the nuclear membrane was immunolabeled with anti-lamin A/C antibodies, followed by
fluorescein-labeled anti-goat antibodies and appears green. The nuclear localization of the
plasmid was analyzed by confocal microscopy.
L’ensemble de ces résultats est en accord avec ceux précédemment trouvés par
Brunner et al. et Remy-Kristensen et al. qui ont montré que des polyplexes formés de PEI
branché 25 kDa entraient dans le noyau des cellules à la faveur des mitoses et non en
passant à travers les pores nucléaires (Remy-Kristensen et al., 2001 ; Brunner et al.,
2002). Il confirme également nos précédents résultats (voir Articles 2 et 3 de la Partie III)
sur le fait que les résidus de lactose substituant le PEI 25 kDa ne favorisent pas l’entrée
nucléaire de l’ADN plasmidique dans les cellules quiescentes.
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Stéphanie Grosse, 2004
4 - 2 - ROLE DU CYTOSQUELETTE
Nous avons étudié le rôle des microfilaments d’actine et des microtubules dans
le trafic intracellulaire des complexes plasmide/PEI lactosylé et des complexes
plasmide/PEI non substitué dans les cellules ΣCFTE29o-. Pour cela, nous avons utilisé un
inhibiteur de la polymérisation des polymères d’actine, la cytochalasine D (25 µM, soluble
dans le diméthyl sulfoxide (DMSO)) (Wodnicka et al., 1992) et un inhibiteur de la
polymérisation des polymères de tubuline, le nocodazole (25 µM, soluble dans le DMSO)
(Luduena and Roach, 1991). L’actine a également été marquée par de la phalloidine-FITC
(Sigma ; 0,5 µg/ml) qui est une toxine se liant aux polymères d’actine (Wulf et al., 1979) et
la tubuline, par un anticorps anti-α-tubuline de souris (Sigma ; dilution 1/2000) marqué par
un anticorps secondaire anti-souris-FITC (Molecular Probes ; dilution 1/200).
Nous avons tout d’abord incubé les cellules ΣCFTE29o- en présence de complexes
pCMVGFP/PEI lactosylé ou PEI non substitué et de nocodazole ou de cytochalasine D et
étudié l’efficacité de transfection. Les agents désorganisant les microtubules ou les
microfilaments d’actine diminuaient fortement l’efficacité de transfection à l’aide du PEI
lactosylé et du PEI non substitué (Figure 47). Nous avons ensuite étudié l’action des
inhibiteurs du cytosquelette sur l’entrée des complexes dans les cellules ΣCFTE29o- en
utilisant des complexes plasmide/PEI-FITC. Seule la cytochalasine D provoquait une
baisse de l’entrée cellulaire des complexes plasmide/PEI lactosylé et des complexes
plasmide/PEI non substitué (Figure 48). Puis, nous nous sommes intéressés à l’effet des
inhibiteurs du cytosquelette sur l’efficacité de transfection lorsqu’ils étaient ajoutés dans le
milieu après que les complexes pCMVGFP/PEI lactosylé ou PEI non substitué soient
entrés dans les cellules. Le nocodazole provoquait une baisse un peu plus importante que
la cytochalasine D de l’efficacité de transfection à l’aide du PEI lactosylé ou du PEI non
substitué (Figure 49). Ainsi, les microfilaments d’actine semblent jouer un rôle lors de
l’entrée des complexes dans les cellules ΣCFTE29o- alors que les microtubules semblent
plutôt intervenir dans le transport cytosolique.
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 47 : Effect of cytoskeletal inhibitors on unsubstituted PEI or lactosylated PEImediated gene transfer efficiency. After a 1 h preincubation at 37°C either in MEM
containing DMSO (0,05 %), nocodazole (25 µM) or cytochalasin D (25 µM), ∑CFTE29ocells were incubated for 2 h at 37°C in the same medium in the presence of complexes
made with a plasmid encoding the gfp gene complexed to unsubstituted PEI (
lactosylated PEI (
) or
). Then, complexes were removed and the cells were postincubated
for 4 h at 37°C in the medium used for preincubation. Twenty-four hours later, cells were
trypsinized, washed and fixed with 3% paraformaldehyde and the percentage of
fluorescent cells was determined by flow cytometry.
Figure 48 : Effect of cytoskeletal inhibitors on uptake of complexes made with
fluorescein-labeled unsubstituted PEI or lactosylated PEI by ∑CFTE29o- cells. After
a 1 h preincubation at 37°C either in MEM containing DMSO (0,05 %), nocodazole (25
µM) or cytochalasin D (25 µM), ∑CFTE29o- cells were incubated for 2 h at 37°C in the
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
same medium in the presence of complexes made with a plasmid pCMVLuc complexed to
fluorescein-labeled unsubstituted PEI (
) or lactosylated PEI (
). Cell fluorescence
intensity was measured by flow cytometry (expressed as relative units).
Figure 49 : Effect of cytoskeletal inhibitors on unsubstituted PEI or lactosylated PEImediated gene transfer efficiency once the complexes have been taken up by
∑CFTE29o- cells. Cells were incubated for 1 h at 37°C in the presence of complexes
made with a plasmid encoding the gfp gene complexed to unsubstituted PEI (
lactosylated PEI (
) or
) in MEM, then washed and postincubated for 5 h at 37°C in MEM
containing DMSO (0,05 %), nocodazole (25 µM) or cytochalasin D (25 µM). Twenty-four
hours later, the percentage of fluorescent cells was determined by flow cytometry.
Afin de vérifier ces résultats, nous avons étudié en microscopie confocale la
localisation aux microfilaments d’actine (Figure 50) et aux microtubules (Figure 51) de
complexes plasmide biotinylé/PEI lactosylé ou PEI non substitué. Nos résultats ont montré
une localisation des complexes plasmide/PEI lactosylé et des complexes plasmide/PEI
non substitué aux microfilaments d’actine jusqu’à 1 heure après l’incubation des
complexes en présence des cellules ΣCFTE29o-, avec une localisation maximale entre 10
et 30 minutes (Figure 50). En ce qui concerne les microtubules, nous avons observé une
colocalisation entre 10 minutes et 4 heures pour les complexes plasmide/PEI lactosylé
(Figure 51) et entre 10 minutes et 3 heures pour les complexes plasmide/PEI non
substitué (résultats non montrés). Ainsi, ces résultats confirment que les microfilaments
d’actine jouent un rôle dans l’entrée des complexes et les microtubules plutôt dans le
transport cytosolique. Cependant, ces études ne permettent pas de déterminer si se sont
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
les complexes eux-mêmes ou les vésicules endosomales contenant les complexes qui
sont transportés le long des microtubules.
Figure 50 : Colocalization of complexes made with lactosylated PEI and actin
filaments. ∑CFTE29o- cells were incubated with biotinylated DNA/lactosylated PEI
complexes for 1 h at 4°C, then washed, incubated at 37°C for the indicated times, fixed in
3 % paraformaldehyde, permeabilized with 0.2 % Triton-X-100, incubated with 0.5 µg/ml
FITC-phalloidin for 30 min and examinated by confocal microscopy. Biotinylated DNA
labeled with rhodamine-labeled streptavidin appears red and actin filaments labeled with
FITC-phalloidin appear green in the top-hand panels. In the down-hand panels, pixel
analysis of colocalization of plasmid DNA and actin filaments appears in yellow (bar = 10
µm). The same experiment has been performed with unsubstituted PEI and same results
were observed.
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
Figure 51 : Colocalization of complexes made with lactosylated PEI and
microtubules. ∑CFTE29o- cells were incubated with biotinylated DNA/lactosylated PEI
complexes for 1 h at 4°C, then washed, incubated at 37°C for the indicated times, fixed in
3 % paraformaldehyde, permeabilized with 0.05 % saponin and examinated by confocal
microscopy. Biotinylated DNA labeled with rhodamine-labeled streptavidin appears red
and microtubules immunolabeled with anti-α-tubulin antibodies and fluorescein-labeled
anti-mouse antibodies appear green in the top-hand panels. In the down-hand panels,
pixel analysis of colocalization of plasmid DNA and microtubules appears in yellow (bar =
10 µm). The same experiment has been performed with unsubstituted PEI and a
localization at microtubules was observed between 10 min and 3 h.
Une troisième étude a été effectuée en microscopie confocale afin d’étudier les
effets des inhibiteurs du cytosquelette sur les localisations endosomale et lysosomale des
complexes plasmide/PEI lactosylé et des complexes plasmide/PEI non substitué (Tableau
3). Les cellules ont été incubées en présence de nocodazole ou de cytochalasine D et des
complexes. Les localisations endosomale et lysosomale des complexes ont ensuite été
étudiées selon notre technique habituelle. Les temps étudiés étaient ceux précédemment
déterminés comme étant les temps de colocalisation maximale (voir Article 2 de la Partie
III). Ainsi, nous avons observé l’effet des inhibiteurs du cytosquelette sur la localisation
endosomale à 30 min pour les complexes plasmide/PEI non substitué et à 1 h pour les
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
complexes plasmide/PEI lactosylé. Pour la localisation lysosomale, nous avons observé
l’effet des inhibiteurs du cytosquelette à 1 h pour les complexes plasmide/PEI non
substitué et à 2 h pour les complexes plasmide/PEI lactosylé. Cette étude a tout d’abord
confirmé qu’en présence de cytochalasine D, une baisse significative du nombre de
complexes formés de PEI lactosylé ou de PEI non substitué dans les cellules ΣCFTE29oétait observée. Pour les complexes ayant réussi à entrer dans les cellules ΣCFTE29o-,
leur localisation endosomale n’était pas perturbée par la présence des inhibiteurs du
cytosquelette. Par contre, une baisse significative de leur localisation lysosomale était
observée en présence de nocodazole. Ainsi, ce sont certainement les vésicules
endosomales contenant les complexes qui sont transportées le long des microtubules vers
les lysosomes et non les complexes eux-mêmes.
Tableau 3 : Effect of cytoskeletal inhibitors on endosomal and lysosomal
localizations of complexes made with unsubstituted PEI or lactosylated PEI and on
the number of complexes in ∑CFTE29o- cells. After a 1 h preincubation at 37°C either
in MEM containing DMSO (0.05 %), nocodazole (25 µM) or cytochalasin D (25 µM),
∑CFTE29o- cells were incubated with biotinylated DNA/unsubstituted (PEI) or lactosylated
PEI (Lac-PEI) complexes for 1 h at 4°C in the same medium, then washed and incubated
in the same medium free of complexes at 37°C up to times of maximal localization. Then,
cells were fixed, biotinylated DNA was labeled with rhodamine-labeled streptavidin,
endosomes were immunolabeled with anti-transferrin receptor antibodies and fluoresceinlabeled anti-mouse antibodies and lysosomes were immunolabeled with anti-LAMP1
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III – RESULTATS COMPLEMENTAIRES
Stéphanie Grosse, 2004
antibodies and fluorescein-labeled anti-mouse antibodies. Fifteen cells were analyzed by
confocal microscopy and all complexes within a given cell were counted and their
localization inside a given organelle was determined. Comparisons were made using the
non-parametric Mann-Whitney U-Test. * :p<0.05, ** :p<0.005, *** :p<0.0005 when the
numbers of complexes by cell or the percentages of colocalization were compared
between DMSO and inhibitors.
En conclusion, il semblerait que les complexes formés de PEI lactosylé ou de PEI
non substitué entrent dans les cellules ΣCFTE29o- grâce aux microfilaments d’actine qui
sont en effet impliqués dans de nombreux modes d’endocytose tels que l’endocytose
dépendante de la clathrine (Salisbury et al., 1982), la potocytose (Pelkmans et al., 2002b),
la phagocytose (Stossel et al., 1976) et la macropinocytose (Lee and Knecht, 2002). Une
fois internalisés, ils se retrouvent dans des vésicules endosomales qui sont transportées le
long des microtubules jusqu’aux lysosomes (Matteoni and Kreis, 1987). Ces résultats sont
en accord avec ceux trouvés par Suh et al. (Suh et al., 2003) qui ont montré que les
vésicules endosomales contenant des nanopolyplexes formés d’ADN et de PEI 25 kDa
étaient transportées le long des microtubules vers la région périnucléaire où se trouvent
les lysosomes (Suh et al., 2003).
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IV - DISCUSSION
GENERALE
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IV - DISCUSSION GENERALE
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Les complexes formés d’ADN plasmidique et de polymères cationiques glycosylés
les mieux endocytés ne sont pas forcément les plus efficaces en transfert de gènes (Fajac
et al., 1999 ; Allo et al., 2000). Les résidus de sucres tels que le lactose ou le mannose
substituant certains polymères cationiques comme la pLK ou le PEI peuvent interagir à
différentes étapes dans le trafic intracellulaire de ces complexes (pour revue : Monsigny et
al., 1999). En effet, la découverte de lectines membranaires présentes à la surface de
nombreuses cellules animales et dans les membranes des organites intracellulaires (pour
revues : Monsigny et al., 1988 ; Varki, 1992) ainsi que de lectines nucléocytoplasmiques
(pour revues : Wang et al., 1991 ; Wang et al., 1992 ; Snow and Hart, 1998) laisse penser
que la glycosylation de certains polymères cationiques pourrait intervenir dans
l’endocytose et le trafic intracellulaire, notamment dans le transport du cytosol au noyau,
de complexes plasmide/polymères cationiques glycosylés. Nous avons donc étudié le
trafic intracellulaire de complexes plasmide/polymères cationiques glycosylés ou nus dans
des cellules épithéliales des voies aériennes humaines dans le but de mieux comprendre
les étapes limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de ces vecteurs et de mieux
comprendre le rôle du polymère cationique et de sa substitution par des résidus de sucres
dans le trafic intracellulaire de ces complexes.
1 - ETAPES CELLULAIRES DU TRANSFERT DE GENES A L’AIDE DE
POLYLYSINES GLYCOSYLEES DANS LES CELLULES EPITHELIALES
DES VOIES AERIENNES HUMAINES
Le trafic intracellulaire d’un ADN plasmidique complexé à un polymère cationique
comprend plusieurs étapes : l’entrée dans les cellules cibles, la libération des vésicules
endosomales avant la dégradation dans les lysosomes, la dissociation éventuelle du
complexe plasmide/vecteur, la protection contre les nucléases cytosoliques, le transport
cytosolique jusqu’au noyau, l’entrée nucléaire, la transcription et l’expression de la
protéine thérapeutique (pour revues : Luo and Saltzman, 2000 ; Thomas and Klibanov,
2003).
1 - 1 - L’ENTREE CELLULAIRE
Il est souvent admis que le mode d’entrée dans les cellules cibles de complexes
formés d’ADN plasmidique et de polymères cationiques se fait par pinocytose. En effet, les
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
polyplexes chargés positivement peuvent facilement interagir avec les HSPGs présents à
la surface des cellules cibles et ainsi être endocytés (pour revue : Zuber et al., 2001). Les
polyplexes formés de polymères cationiques substitués par des ligands de récepteurs
présents à la surface de cellules cibles entreraient plutôt dans les cellules par endocytose
dépendante de la clathrine (endocytose médiée par un récepteur spécifique) (pour revue :
Michael and Curiel, 1994). Le mode exact d’endocytose de nos complexes plasmide/pLK
lactosylée ou mannosylée dans les cellules épithéliales de surface des voies aériennes
humaines immortalisées avec mutation homozygote ∆F508 de l’exon 10 du gène CFTR
(les cellules ΣCFTE29o-) a été étudié en utilisant des inhibiteurs des différentes voies
d’endocytose (voir § 3 - 3 - 2 de la Partie I). Nous avons observé que l’entrée de nos
complexes dans les cellules ΣCFTE29o- était fortement diminuée en présence d’un milieu
hypertonique qui inhibe l’endocytose dépendante de la clathrine (Heuser and Anderson,
1989) et un peu diminuée en présence de colchicine qui inhibe la pinocytose (Pratten and
Lloyd, 1986). Ainsi, nos résultats sont en accord avec ceux de la littérature et plus
particulièrement avec ceux de Klink et al. qui ont montré que les complexes formés de
pLKs glycosylées entrent dans les cellules épithéliales des voies aériennes humaines
majoritairement par endocytose dépendante de la clathrine (Klink et al., 2003). Lors de
notre étude en microscopie électronique, des puits de clathrine ont également été
observés. De plus, l’entrée de nos complexes par endocytose spécifique médiée par un
récepteur est en accord avec le fait que beaucoup plus de complexes mannosylés que de
complexes lactosylés sont internalisés par les cellules ΣCFTE29o- dont le récepteur au
mannose est exprimé en plus grand nombre à la surface de ces cellules que le récepteur
au lactose (Fajac et al., 1999). Cependant, l’observation en microscopie électronique de la
large taille des complexes plasmide/pLKs glycosylées (environ 700 nm de diamètre) et
d’expansions membranaires englobant ces complexes montrent qu’un mécanisme de
macropinocytose est également impliqué dans l’endocytose de ces complexes. Plusieurs
voies endocytaires peuvent en effet coexister dans une même cellule (pour revues :
Mukherjee et al., 1997 ; Benmerah and Lamaze, 2002 ; Maillet, 2002a). Ainsi, les
complexes plasmide/pLKs glycosylées entrent dans les cellules ΣCFTE29o- à la fois par
endocytose dépendante de la clathrine et par macropinocytose. Cette étape d’entrée
cellulaire sera donc d’autant plus efficace que le nombre de récepteurs spécifiques au
ligand présents à la surface des cellules sera important.
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
1 - 2 - L’ECHAPPEMENT ENDOSOMAL
Une fois internalisés, les complexes plasmide/pLKs glycosylées sont dans des
vésicules endosomales. Lors de notre étude en microscopie électronique, nous avons
observé ces complexes dans de larges vésicules endosomales, probablement des
macropinosomes, contenant à leur surface membranaire des puits de clathrine. Ceci est
en accord avec les mécanismes d’entrée des complexes dans les cellules : l’endocytose
dépendante de la clathrine et la macropinocytose. Une fois dans les vésicules
endosomales et pour faciliter le transfert de gènes, les complexes doivent s’échapper de
ces vésicules avant leur dégradation dans les lysosomes. Pour permettre cet
échappement endosomal, des agents endosomolytiques comme la chloroquine sont
ajoutés dans le milieu de transfection (Erbacher et al., 1996b) (voir § 3 - 4 - 2b de la Partie
I). Cependant, lors de notre étude en microscopie confocale où les lysosomes étaient
marqués par immunocytochimie, beaucoup de complexes mannosylés étaient observés
dans les lysosomes. Ainsi, les résidus de mannose semblent favoriser un trafic vers les
lysosomes et l’addition de chloroquine dans le milieu de transfection ne permet pas un
échappement endosomal très efficace des complexes plasmide/pLK mannosylée. Moins
de complexes plasmide/pLK lactosylée étaient observés dans les lysosomes mais leur
quantité était cependant suffisamment importante pour penser que cette étape
d’échappement endosomal est inefficace à l’aide des pLKs glycosylées.
1 - 3 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES
Nous n’avons jamais observé de dissociation entre l’ADN plasmidique et les pLKs
glycosylées. En effet, lors de notre étude en microscopie confocale où l’ADN plasmidique
et les dérivés de pLKs étaient marqués, les complexes fluorescents étaient retrouvés non
dissociés dans le noyau des cellules ΣCFTE29o-. Ceci est en accord avec les résultats de
la littérature qui montrent que contrairement aux lipides cationiques, les polymères
cationiques restent associés à l’ADN plasmidique après l’échappement endosomal
(Godbey et al., 1999c ; Fisher et al., 2000 ; Klink et al., 2001a). Il semblerait que la non
dissociation des complexes permettrait une meilleure protection de l’ADN plasmidique
contre les nucléases cytosoliques (Lechardeur et al., 1999 ; Pollard et al., 2001).
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
1 - 4 - L’ENTREE NUCLEAIRE
Une fois dans le cytosol, les quelques complexes plasmide/pLKs glycosylées qui
ont réussi à échapper à la dégradation lysosomale doivent ensuite pénétrer dans le noyau
des cellules afin que l’ADN plasmidique soit transcrit puis traduit. Il est souvent admis que
cette étape de l’entrée nucléaire est une barrière importante au transfert de gènes à
l’aide de vecteurs synthétiques (pour revues : Lechardeur and Lukacs, 2002 ; Wiethoff and
Middaugh, 2003). Ceci est confirmé par notre étude en microscopie confocale où peu de
complexes formés d’ADN plasmidique et de pLKs glycosylées ont été observés dans le
noyau des cellules ΣCFTE29o-. Cependant, la pLK lactosylée semble permettre une
meilleure entrée nucléaire de l’ADN plasmidique que la pLK mannosylée. En effet, un peu
plus de complexes plasmide/pLK lactosylée que de complexes plasmide/pLK mannosylée
étaient observés dans le noyau des cellules et dans un plus grand nombre de cellules.
Ces résultats sont en accord avec ceux observés par Klink et al. qui ont émis l’hypothèse
que les résidus de lactose substituant la pLK favoriseraient le transport nucléaire des
complexes plasmide/pLK lactosylée à travers les pores nucléaires (Klink et al., 2001a).
On peut noter qu’à l’aide de ces vecteurs, la présence d’ADN plasmidique dans le
noyau des cellules ne signifie pas obligatoirement une expression du transgène efficace.
En effet, lors de notre étude de transcription in vitro par cartographie à la S1 nucléase,
nous avons pu observer que la pLK mannosylée complexée à l’ADN plasmidique inhibait
la transcription de cet ADN certainement en gênant l’accessibilité du plasmide aux
facteurs de transcription. Ainsi, suivant le résidu de sucre utilisé pour substituer la pLK, la
conformation des complexes doit varier car l’ADN plasmidique complexé à la pLK
lactosylée était efficacement transcrit.
1 - 5 - L’EXOCYTOSE
Lors de notre étude en microscopie confocale où l’ADN plasmidique ainsi que les
pLKs glycosylées étaient marqués, nous avons pu observer 24 h après la transfection, une
sortie des complexes fluorescents des cellules ΣCFTE29o- et 48 h après, peu de
complexes étaient encore présents dans les cellules. En microscopie électronique, nous
avons observé que de nombreux complexes plasmide/pLKs glycosylées étaient localisés
dans des MVBs. Les MVBs sont des compartiments endosomaux situés entre les
endosomes précoces et les endosomes tardifs (pour revue : Gruenberg, 2003). Ils peuvent
être transportés le long des microtubules vers la voie de dégradation lysosomale, mais
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
peuvent aussi fusionner avec la membrane plasmique des cellules afin de sécréter leur
contenu formé de petites vésicules appelées exosomes dans le milieu extracellulaire (pour
revues : Denzer et al., 2000 ; Stoorvogel et al., 2002). Ainsi, les complexes formés d’ADN
plasmidique et de pLKs glycosylées localisés dans les MVBs peuvent être sécrétés avec
les exosomes dans le milieu extracellulaire avant qu’ils aient pu atteindre le noyau.
Ceci n’a jamais été montré mais pourrait expliquer la courte durée d’expression du
transgène obtenue à l’aide de ces vecteurs (pour revue : Breyer et al., 2001).
1 - 6 - SYNTHESE
La figure 52 résume les différentes étapes du trafic intracellulaire d’un ADN
plasmidique complexé à une pLK glycosylée dans les cellules ΣCFTE29o-.
Figure 52 : Représentation schématique du trafic intracellulaire d’un complexe
plasmide/pLK glycosylée dans une cellule ΣCFTE29o-. L’épaisseur des flèches est
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
proportionnelle à l’importance quantitative de la voie indiquée. EV: endosomal vesicle,
MVB: multivesicular body, LE: late endosome, L: lysosome
Les résidus de sucres substituant la pLK permettent une endocytose dépendante
de la clathrine des complexes plasmide/pLKs glycosylées qui est efficace et médiée par
des récepteurs spécifiques présents à la surface des cellules cibles. La charge cationique
des complexes plasmide/pLKs glycosylées et leur grande taille impliquent également une
entrée par macropinocytose. Ainsi, l’étape de l’entrée cellulaire ne semble pas être une
étape limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de pLKs glycosylées et est d’autant
plus efficace lorsque le nombre de récepteurs spécifiques au ligand présents à la surface
des cellules est important. Cependant, comme il avait été précédemment montré (Fajac et
al., 1999 ; Allo et al., 2000), l’endocytose des complexes plasmide/pLKs glycosylées ne
suffit pas à obtenir un transfert de gènes efficace.
Le trafic intracellulaire qui suit l’étape d’entrée dans les cellules cibles est très
important pour obtenir un transfert de gènes efficace. En effet, alors que les complexes
plasmide/pLK mannosylée sont les mieux endocytés, les résidus de mannose substituant
la pLK semblent favoriser un trafic vers les lysosomes et l’addition de chloroquine dans le
milieu de transfection ne permet pas un échappement endosomal efficace de ces
complexes. Ainsi, dans l’ensemble peu de complexes formés de pLKs glycosylées sont
libérés dans le cytosol. La plupart des complexes sont soit dégradés dans les lysosomes,
soit sécrétés dans le milieu extracellulaire par la voie des exosomes. Une des étapes
limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de pLKs glycosylées est donc
l’échappement inefficace des vésicules endosomales malgré l'adjonction d'agents
endosomolytiques dans le milieu de transfection.
En partie en raison de cette étape inefficace, très peu de complexes plasmide/pLKs
glycosylées arrivent à atteindre le noyau. Cependant, les résidus de lactose substituant la
pLK pourraient favoriser cette entrée à travers les pores nucléaires (Klink et al., 2001a).
Une autre étape limitante serait que la présence de complexes dans le noyau des cellules
ΣCFTE29o- ne suffit pas à permettre un transfert de gènes efficace. L’absence de
dissociation entre l’ADN plasmidique et certaines pLKs glycosylées, comme la pLK
mannosylée, inhiberait la transcription de cet ADN probablement en gênant l’accessibilité
du plasmide aux facteurs de transcription.
Ainsi, en dépit d’une importante entrée des complexes plasmide/pLK mannosylée
dans les cellules ΣCFTE29o- (Fajac et al., 1999), ceux-ci ont une faible efficacité de
transfection comparés aux complexes plasmide/pLK lactosylée en partie en raison d’une
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
importante localisation lysosomale et d’une diminution de l’efficacité de transcription de
l’ADN plasmidique. Cependant, pour tous les complexes formés de dérivés de pLKs une
des principales étapes limitant leur efficacité de transfection est leur échappement
endosomal inefficace.
2 - ROLE DES RESIDUS DE LACTOSE SUR L’ENTREE ET LE TRAFIC
INTRACELLULAIRE DE COMPLEXES PLASMIDE/PEI LACTOSYLE DANS
DES CELLULES EPITHELIALES DES VOIES AERIENNES HUMAINES
En collaboration avec l’équipe du Pr. M. Monsigny, nous avons amélioré l’étape
d’échappement endosomal en utilisant un autre polymère, le PEI, qui est un polymère
cationique commercialisé ayant un pouvoir endosomolytique intrinsèque (Behr, 1996).
Contrairement aux pLKs, le PEI permet aux complexes plasmide/vecteurs de quitter les
vésicules endosomales après leur entrée dans la cellule sans l’adjonction d’agents
endosomolytiques dans le milieu de transfection et ainsi, d’échapper à la dégradation
lysosomale (Kichler et al., 2001 ; Sonawane et al., 2003) (voir § 3 - 4 - 4 de la Partie I :
Figure 32). Le laboratoire de Glycobiologie (CNRS, Orléans) a donc substitué un dérivé de
PEI (branché, 25 kDa) par différents résidus de sucres tels que le lactose ou le mannose.
Puis, nous avons étudié et comparé l’efficacité de transfection de ces différents vecteurs
avec d’autres polymères cationiques dans les cellules épithéliales des voies aériennes
humaines immortalisées ou en culture primaire (Fajac et al., 2003). Parmi les différents
polymères cationiques utilisés (pLKs glycosylées, PEIs non substitué ou glycosylés), le
PEI lactosylé est le plus efficace pour le transfert de gènes rapporteurs dans les cellules
immortalisées et ceci sans adjonction d’agents endosomolytiques. Il permet un transfert du
gène de la GFP dans 35 % des cellules ΣCFTE29o- après une transfection unique, et
dans 60 % des cellules après 3 transfections quotidiennes successives avec une très
faible toxicité cellulaire comparée au PEI non substitué qui ne permet pas de transfecter
plus de 30 % des cellules (voir Article 2 de la Partie III). Dans les cellules en culture
primaire, seul le PEI lactosylé assurait un transfert de gènes rapporteurs efficace (Fajac et
al., 2003). Suite à ces résultats et afin de mieux comprendre le rôle du résidu de lactose
dans l’amélioration de l’efficacité de transfection, nous avons étudié et comparé l’entrée et
le trafic intracellulaire de complexes formés de PEI lactosylé à ceux formés de PEI non
substitué, dans des cellules épithéliales des voies aériennes humaines immortalisées ou
en culture primaire.
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Stéphanie Grosse, 2004
2 - 1 - LE MECANISME D’ENDOCYTOSE
La glycosylation du PEI par des résidus de lactose améliore l’étape d’entrée
cellulaire de complexes plasmide/vecteurs. En effet, lors de notre étude en cytométrie de
flux où nous avons utilisé des PEI-FITC, beaucoup plus de complexes plasmide/PEI
lactosylé que de complexes plasmide/PEI non substitué entraient dans les cellules
ΣCFTE29o-. Cette glycosylation favorise une entrée spécifique des complexes
plasmide/PEI lactosylé majoritairement par endocytose dépendante de la clathrine même
si suivant leur taille, un mécanisme de macropinocytose ou de potocytose peut également
avoir lieu. En effet, lors de notre étude en microscopie électronique, nous avons observé
que les complexes plasmide/PEI lactosylé sont très hétérogènes en taille et qu’ils peuvent
entrer dans les cellules ΣCFTE29o- selon plusieurs mécanismes : les complexes ayant un
diamètre supérieur à 200 nm entrent dans les cellules par macropinocytose avec la
présence d’expansions membranaires et par endocytose dépendante de la clathrine avec
la présence de puits de clathrine ; les complexes ayant un diamètre compris entre 100 et
200 nm entrent en majorité par endocytose dépendante de la clathrine et les complexes
ayant un diamètre inférieur à 100 nm entrent plutôt par potocytose avec la présence de
cavéoles. Avec les complexes plasmide/PEI non substitué, nous n’avons jamais observé
de puits clathrine. Ceci est en accord avec les résultats de la littérature qui montrent que
les complexes formés de PEIs substitués par un ligand entrent dans les cellules
majoritairement par un mécanisme d’endocytose spécifique (Kircheis et al., 1997 ;
Erbacher et al., 1999b) alors que les complexes formés de PEIs non substitués entrent
plutôt par un mécanisme d’endocytose non spécifique (Klemm et al., 1998 ; RemyKristensen et al., 2001 ; Bieber et al., 2002). Plus précisément, nous avons observé en
microscopie électronique que les larges complexes plasmide/PEI non substitué (entre 100
et 700 nm de diamètre) entrent dans les cellules par macropinocytose, alors que les petits
complexes (< 100 nm de diamètre) entrent plutôt par potocytose. Ce mode d’entrée, via
les cavéoles, a principalement été observé avec le PEI non substitué et a été confirmé par
notre étude en microscopie confocale où de nombreux complexes plasmide/PEI non
substitué
ont
été
observés
dans
les
cavéoles
et
dans
le
RE
(marquage
immunocytochimique) qui est un des devenirs possibles de ligands internalisés par
potocytose (pour revues : Mineo and Anderson, 2001 ; Pelkmans and Helenius, 2002a).
Cependant, une fois dans le RE, il semble peu probable que les complexes puissent
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IV - DISCUSSION GENERALE
Stéphanie Grosse, 2004
pénétrer dans le noyau des cellules. Ainsi, cette voie d’entrée, via les cavéoles, semble
être une étape limitante pour le transfert de gènes à l’aide de PEIs non substitués.
Ce mode d’entrée par potocytose et cette localisation au RE des petits complexes
plasmide/PEI non substitué n’ont jamais été observés par d’autres équipes. Cependant,
ceci pourrait expliquer le fait que ces complexes de petites tailles ne permettent pas un
transfert de gènes in vitro efficace. En effet, alors que certaines équipes ont suggéré que
ceci était dû à une mauvaise sédimentation de ces petits complexes dans le milieu de
transfection (Ogris et al., 1998 ; Wightman et al., 2001), une autre hypothèse serait un
trafic intracellulaire inefficace. Pour des études in vivo, il est souvent admis qu’il est
préférable d’utiliser des petits complexes car ils permettent une meilleure diffusion dans le
milieu extracellulaire (Goula et al., 1998b ; Wightman et al., 2001). Cependant, une fois
dans les cellules, le trafic intracellulaire des petits complexes plasmide/dérivés de PEIs
pourrait ne pas être efficace ce qui expliquerait éventuellement la faible efficacité de
transfection obtenue in vivo à l’aide de ces vecteurs.
2 - 2 - LE POUVOIR ENDOSOMOLYTIQUE
La glycosylation du PEI semble diminuer le pouvoir endosomolytique de celui-ci.
En effet, lors de notre étude en microscopie confocale où les lysosomes ont été marqués
par immunocytochimie, beaucoup plus de complexes plasmide/PEI lactosylé que de
complexes plasmide/PEI non substitué étaient observés dans les lysosomes. Cette baisse
de l’activité endosomolytique du PEI lactosylé qui semble limitante dans l’efficacité de
transfection pourrait être à l’origine de la plus faible cytotoxicité observée à l’aide de ce
vecteur. En effet, nous et d’autres équipes avons montré que le PEI non substitué
provoquait une très forte toxicité cellulaire (pour revue : Godbey et al., 1999b). Cependant,
en présence de bafilomycine A1, un inhibiteur de la pompe à protons, le PEI non substitué
n’était plus cytotoxique, ce qui laisse penser que l’effet cytotoxique du PEI non substitué
serait dû au fort pouvoir endosomolytique du PEI (Behr, 1996). Ainsi, le pouvoir
endosomolytique du PEI est nécessaire pour permettre un échappement endosomal
efficace, mais doit être modéré pour ne pas provoquer une trop forte cytotoxicité. On peut
noter qu’une autre équipe a déjà observé que la glycosylation du PEI réduisait l’effet
cytotoxique du PEI (Leclercq et al., 2000).
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Stéphanie Grosse, 2004
2 - 3 - LE TRAFIC CYTOSOLIQUE
Les microfilaments d’actine interviennent majoritairement dans l’endocytose des
complexes plasmide/PEI lactosylé ou non substitué. En effet, ils interviennent dans de
nombreux modes d’endocytose, tels que l’endocytose dépendante de la clathrine
(Salisbury et al., 1982), la macropinocytose (Lee and Knecht, 2002) et la potocytose
(Pelkmans et al., 2002b) qui sont, comme nous l’avons vu précédemment, des modes
d’entrée empruntés par ces complexes. Une fois internalisés, les complexes plasmide/PEI
lactosylé ou PEI non substitué se retrouvent dans des vésicules endosomales qui sont
généralement transportées le long des microtubules vers les lysosomes (Matteoni and
Kreis, 1987). En effet, la dépolymérisation des microtubules provoque une baisse de la
localisation lysosomale de ces complexes (voir Tableau 3 du § 4 - 2 de la Partie III). De
plus, les lysosomes se trouvent généralement en région périnucléaire (Matteoni and Kreis,
1987) où nous avons observé en microscopie confocale et électronique de nombreux
complexes. Ainsi, comme l’ont aussi montré Suh et al. (Suh et al., 2003), il semblerait que
les complexes formés de PEIs, une fois dans les vésicules endosomales, seraient
véhiculés grâce aux microtubules vers la région périnucléaire où ils peuvent
éventuellement être libérés grâce à leur activité endosomolytique afin de pouvoir pénétrer
dans le noyau des cellules.
2 - 4 - LA DISSOCIATION DES COMPLEXES
Comme pour les pLKs glycosylées, il semblerait que la majorité des complexes
plasmide/PEI lactosylé ou PEI non substitué ne se dissocie pas. En effet, lors de notre
étude en microscopie confocale où l’ADN plasmidique et les dérivés de PEIs étaient
marqués, les complexes fluorescents étaient retrouvés non dissociés dans le noyau des
cellules ΣCFTE29o-. En microscopie électronique, très peu de billes d’or seules ont été
observées dans le cytosol et dans le noyau des cellules. Cette absence de dissociation
assurerait peut être une meilleure protection de l’ADN plasmidique contre les nucléases
cytosoliques (Pollard et al., 2001). De plus, lors de notre étude de transcription in vitro,
l’ADN plasmidique toujours complexé au PEI lactosylé ou au PEI non substitué était
efficacement transcrit et après microinjection de ces complexes dans le noyau des cellules
ΣCFTE29o-, une expression du transgène était observée. Ainsi, contrairement à certaines
pLKs glycosylées, la complexation de l’ADN plasmidique avec les dérivés de PEIs
n’empêche pas la transcription et la traduction de celui-ci. Ces résultats sont en accord
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Stéphanie Grosse, 2004
avec ceux précédemment trouvés à l’aide du PEI 25 kDa branché (Pollard et al., 1998 ;
Bieber et al., 2002).
2 - 5 - LE MECANISME D’ENTREE NUCLEAIRE
La glycosylation du PEI par des résidus de lactose ne permet pas d’améliorer
l’étape de l’entrée nucléaire de l’ADN plasmidique dans les cellules épithéliales des
voies aériennes humaines. En effet, nous avons montré qu’après microinjection
cytoplasmique d’un ADN plasmidique complexé au PEI lactosylé, il n’y avait pas plus de
cellules ΣCFTE29o- qui exprimaient le transgène que lorsque l’ADN était libre ou
complexé au PEI non substitué. De plus, en microscopie confocale et électronique, nous
avons observé que la majorité des complexes plasmide/PEI lactosylé s’accumulaient en
région périnucléaire et que très peu de complexes étaient localisés dans le noyau des
cellules. Ainsi, contrairement aux résultats de Pollard et al., le PEI toujours complexé à
l’ADN plasmidique ne semble pas favoriser l’entrée nucléaire de l’ADN plasmidique
(Pollard et al., 1998). Et, contrairement aux résultats de Klink et al. obtenus à l’aide de pLK
lactosylée, les résidus de lactose substitués au PEI ne permettent pas une meilleure
translocation dans le noyau des complexes plasmide/PEI lactosylé à travers les pores
nucléaires (Klink et al., 2001a). Les complexes ADN plasmidique/PEI lactosylé ou PEI non
substitué entreraient dans le noyau des cellules épithéliales des voies aériennes humaines
exclusivement à la faveur des mitoses et non à travers les pores nucléaires. Ces résultats
sont en accord avec ceux précédemment trouvés à l’aide du PEI 25 kDa branché (RemyKristensen et al., 2001 ; Brunner et al., 2002).
Par ailleurs, Hasegawa et al. ont montré que la dépolymérisation des microtubules
empêchait le transport de complexes lipidiques vers les lysosomes (Hasegawa et al.,
2001). Nous avons obtenu des résultats comparables avec les dérivés de PEIs (voir
Tableau 3 de la Partie III). Cependant, contrairement à nous (voir Figure 49 de la Partie
III), Hasegawa et al. ont montré que cette diminution de localisation lysosomale améliorait
l’efficacité de transfection (Hasegawa et al., 2001). Nos résultats peuvent être liés au fait
que le nocodazole est un agent antimitotique (Jordan et al., 1992). Ainsi, en présence de
nocodazole, les cellules ne peuvent pas passer en mitose et les complexes plasmide/PEI
lactosylé ou PEI non substitué ne sont pas pas capables de pénétrer dans le noyau de
cellules quiescentes.
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2 - 6 - LA SORTIE DES COMPLEXES
Dans notre étude en microscopie électronique, nous avons observé une sortie des
complexes plasmide/PEI lactosylé et des complexes plasmide/PEI non substitué dans le
milieu extracellulaire. Ces complexes pouvant entrer par macropinocytose, il est possible
qu’une fois dans les macropinosomes, ils soient régurgités dans le milieu
extracellulaire. En effet, un des devenirs possibles des macropinosomes est la
regurgitation de leur contenu dans le milieu extracellulaire (Hewlett et al., 1994 ; Veithen et
al., 1998). Ainsi, comme pour les pLKs glycosylées, les cellules épithéliales des voies
aériennes humaines ont trouvé un système pour rejeter les complexes plasmide/dérivés
de PEIs avant qu’ils puissent atteindre le noyau.
2 - 7 - SYNTHESE
La figure 53 résume les différentes étapes du trafic intracellulaire d’un ADN
plasmidique complexé soit à du PEI lactosylé, soit à du PEI non substitué dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines.
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Figure 53 : Représentation schématique du trafic intracellulaire de complexes
plasmide/PEI lactosylé et de complexes plasmide/PEI non substitué dans les
cellules épithéliales des voies aériennes humaines. EV: endosomal vesicle, LE: late
endosome,
L:
lysosome,
ER:
endoplasmic
reticulum,
M:
macropinosome,
MT:
microtubules
En dépit d’une importante localisation lysosomale, le PEI lactosylé permet un
transfert de gènes rapporteurs beaucoup plus efficace que le PEI non substitué dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines en partie en raison d’une meilleure
entrée cellulaire et d’une plus faible toxicité cellulaire.
En effet, la glycosylation du PEI 25 kDa branché permet une reconnaissance entre
les résidus de sucres et les lectines spécifiques présentes à la surface des cellules cibles
et donc une entrée des complexes plasmide/PEI lactosylé majoritairement par endocytose
dépendante de la clathrine, alors que les complexes plasmide/PEI non substitué entrent
majoritairement par macropinocytose ou par potocytose suivant leur taille. Cette voie
d’entrée à travers les cavéoles est probablement une étape limitant l’efficacité du transfert
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de gènes à l’aide du PEI non substitué car les complexes plasmide/vecteurs se retrouvent
ensuite dans le RE où ils sont probablement séquestrés.
Une fois internalisés, grâce aux filaments d’actine, les complexes plasmide/PEI
lactosylé ou non substitué se retrouvent dans des vésicules endosomales. Ces vésicules,
contenant les complexes, sont ensuite transportées le long des microtubules vers les
lysosomes en région périnucléaire. La glycosylation du PEI provoque une baisse du
pouvoir endosomolytique du PEI et plus de complexes plasmide/PEI lactosylé se
retouvent dans les lysosomes, comparés aux complexes plasmide/PEI non substitué.
Cependant, alors que cette baisse de l’activité endosomolytique du PEI lactosylé semble
être limitante pour l’efficacité du transfert de gènes à l’aide de ce vecteur, elle serait en fait
à l’origine de la plus faible toxicité cellulaire observée à l’aide de ce vecteur. Ainsi, la
glycosylation du PEI permet de rendre le vecteur moins cytotoxique.
Une fois en région périnucléaire, certains complexes plasmide/PEI lactosylé ou non
substitué sont libérés dans le cytosol et peuvent ainsi pénétrer dans le noyau des cellules
en l’absence de dissociation entre l’ADN plasmidique et son vecteur. Cependant, l’étape
d‘entrée dans le noyau reste la principale étape cellulaire limitant l’efficacité du transfert de
gènes à l’aide de vecteurs synthétiques (pour revues : Lechardeur and Lukacs, 2002 ;
Wiethoff and Middaugh, 2003). La glycosylation du PEI par des résidus de lactose n’a pas
amélioré cette étape. Que l’ADN plasmidique soit complexé au PEI lactosylé ou au PEI
non substitué, peu de complexes plasmide/vecteurs se retrouvent dans le noyau des
cellules. Pour les deux types de complexes, ils entrent dans le noyau des cellules
épithéliales des voies aériennes humaines à la faveur des mitoses et non à travers les
pores nucléaires.
Une autre étape limitant l’efficacité du transfert de gènes à l’aide du PEI lactosylé ou
du PEI non substitué est la possible régurgitation des complexes plasmide/vecteurs dans
le milieu extracellulaire avant qu’ils puissent atteindre le noyau.
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V - CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
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Le tableau 4 résume les différentes caractéristiques des complexes plasmide/pLK
mannosylée ou pLK lactosylée et des complexes plasmide/PEI non substitué ou PEI
lactosylé ainsi que leur efficacité de transfection et leur trafic intracellulaire dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines. Il nous montre que chaque vecteur a
un trafic intracellulaire distinct suivant la nature du polymère cationique et le sucre le
constituant. Ainsi, chacune des modifications apportées au vecteur provoquent des
modifications sur leur mode d’entrée cellulaire et sur leur trafic intracellulaire ce qui
intéragit avec l’efficacité de transfection. Pour chaque vecteur, il semble donc nécessaire
de mieux comprendre le trafic intracellulaire afin de développer de nouveaux vecteurs
efficaces pour le transfert de gènes.
L’ensemble de ce travail de thèse nous a aidé à mieux comprendre les différentes
étapes cellulaires du transfert de gènes à l’aide de ces dérivés de polycations et de
développer un vecteur, le PEI lactosylé, efficace in vitro pour le transfert de gènes dans
les cellules épithéliales des voies aériennes humaines et qui peut aujourd’hui être utilisé
dans des études in vivo. En effet, le PEI lactosylé est un vecteur de transfert de gènes peu
toxique. Il assure une entrée efficace et spécifique dans les cellules cibles et un
échappement endosomal modéré, mais suffisamment efficace pour pouvoir libérer
quelques complexes plasmide/vecteurs dans le cytosol. Sa complexation avec l’ADN
plasmidique ne gêne pas la transcription de celui-ci et permet au contraire de protéger
l’ADN contre les nucléases cytosoliques (Pollard et al., 2001). Cependant, il n’a pas
permis d’améliorer l’étape de l’entrée nucléaire qui reste l’étape cellulaire la plus limitante
dans les cellules quiescentes (pour revues : Lechardeur and Lukacs, 2002 ; Wiethoff and
Middaugh, 2003). Des modifications de l’ADN plasmidique ou du vecteur sont donc
envisagées au laboratoire de Physiologie Respiratoire en collaboration avec le laboratoire
de Glycobiologie afin d’améliorer cette étape cellulaire et de permettre une entrée dans le
noyau à travers les pores nucléaires.
Plusieurs stratégies sont actuellement développées pour améliorer l’importation
nucléaire d’un ADN thérapeutique comme l’addition de peptides NLS ou de résidus
osidiques (voir § 3 - 8 - 4 de la Partie I). L’addition de peptides NLS ne montrant pas de
résultats très convainquants (pour revues : Cartier and Reszka 2002 ; Escriou et al.,
2003), il nous semble que l’addition de résidus osidiques peut être une stratégie
prometteuse (pour revue : Monsigny et al., 2004). L’équipe du Pr. M. Monsigny a mis au
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V - CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Stéphanie Grosse, 2004
point un système facile de glycosylation de l’ADN plasmidique ne gênant pas la
transcription de celui-ci (Rondanino et al., 2004). Elle a montré qu’un ADN plasmidique de
6,8 kb ayant un poid moléculaire supérieur à 3500 kDa substitué par des résidus de
mannose était efficacement transloqué dans le noyau de cellules perméabilisées par de la
digitonine alors que l’ADN nu restait dans le cytosol (Rondanino et al., 2004). De plus, la
glycosylation de l’ADN permettait de le protéger contre les nucléases cytosoliques
(Rondanino et al., 2004). Ainsi, des études de transfections à l’aide de ces plasmides
glycosylés complexés à des vecteurs synthétiques peuvent être envisagées dans des
cellules épithéliales des voies aériennes humaines.
En conclusion, il apparaît qu’un vecteur de transfert de gènes idéal serait un
vecteur facile à produire et à moindre coût, substitué par un ligand pour permettre un
ciblage cellulaire et formant avec l’ADN glycosylé des complexes de taille homogène
comprise entre 100 et 200 nm de diamètre pour faciliter une entrée par endocytose
dépendante de la clathrine. Les complexes se retrouvant ainsi dans des endosomes
seraient transportés grâce aux microtubules vers la région périnucléaire. Il doit posséder
une activité endosomolytique intrinsèque pour éviter une trop forte localisation lysosomale
mais modérée pour éviter une trop forte cytotoxicité. Une fois dans le cytosol, il doit se
dissocier de l’ADN glycosylé pour que celui-ci puisse entrer dans le noyau des cellules à
travers les pores nucléaires pour qu’il soit transcrit puis traduit en une protéine
thérapeutique.
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Stéphanie Grosse, 2004
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241/269
Stéphanie Grosse, 2004
VII - ANNEXES
242/269
VII - ANNEXE 1
Stéphanie Grosse, 2004
1 - ANNEXE 1 : Revue
www.drgrosse.com/these/annexe1.pdf
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VII - ANNEXE 1
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VII - ANNEXE 1
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www.drgrosse.com/these/annexe1.pdf
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VII - Annexe 2
Stéphanie Grosse, 2004
2 - ANNEXE 2 : Revue
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
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www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
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www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
253/269
VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 2
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe2.pdf
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VII - ANNEXE 3
Stéphanie Grosse, 2004
3 - ANNEXE 3 : Résumé sélectionné pour une présentation orale
15th Annual Conference of the « North American Cystic Fibrosis », Oct. 2001, Orlando,
USA
Pediatr. Pulmonology, S22 : 204
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VII - ANNEXE 4
Stéphanie Grosse, 2004
4 - ANNEXE 4 : Résumé sélectionné pour une présentation orale
5th Annual Meeting of the « American Society of Gene Therapy », June 2002, Boston,
USA
Mol. Ther., Vol 5 (5), S436-437 : 1333
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VII - ANNEXE 5
Stéphanie Grosse, 2004
5 - ANNEXE 5 : Article
www.drgrosse.com/these/annexe5.pdf
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VII - ANNEXE 5
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www.drgrosse.com/these/annexe5.pdf
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VII - ANNEXE 5
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www.drgrosse.com/these/annexe5.pdf
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VII - ANNEXE 5
Stéphanie Grosse, 2004
www.drgrosse.com/these/annexe5.pdf
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www.drgrosse.com/these/annexe5.pdf
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VII - ANNEXE 5
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VII - ANNEXE 5
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RÉSUMÉS
Trafic intracellulaire de complexes plasmide/polymères cationiques glycosylés
dans des cellules épithéliales des voies aériennes humaines :
application à la thérapie génique de la mucoviscidose
La mucoviscidose est une maladie génétique qui pourrait bénéficier d’un traitement
par thérapie génique. Plusieurs essais cliniques ont été entrepris à l’aide de vecteurs
viraux ou synthétiques mais l’efficacité s’est avérée modérée et transitoire. Notre projet a
donc été de mieux comprendre les étapes cellulaires limitant l’efficacité de transfection
afin de développer de nouveaux vecteurs plus efficaces. Le premier vecteur utilisé était la
polylysine (pLK) glycosylée qui se lie au plasmide par interactions électrostatiques et qui
permet un ciblage cellulaire. Nous avons montré que l’efficacité de transfection à l’aide de
ces pLKs était limitée entre autres en raison d’un échappement endosomal inefficace. Un
nouveau polymère capable de déstabiliser la membrane des endosomes, le
polyéthylèneimine (PEI), a donc été utilisé. Nous avons montré que le PEI lactosylé
permettait un transfert de gènes efficace in vitro dans les cellules épithéliales des voies
aériennes et que l’ADN complexé à ce vecteur était efficacement transporté vers le noyau.
Des études in vivo chez la souris peuvent être envisagées. Cependant, l’entrée dans le
noyau de cellules quiescentes reste une étape limitante. Des modifications du plasmide
pour améliorer cette étape sont envisagées.
Mots clés : mucoviscidose, transfert de gènes, vecteurs synthétiques, polymères
cationiques glycosylés, endocytose, trafic intracellulaire, microscopie confocale,
microscopie électronique
Intracellular trafficking of a plasmid complexed to glycosylated cationic polymers
in cystic fibrosis human airway epithelial cells
Gene therapy represents a potential advance in the treatment of cystic fibrosis. Safe,
efficient and non-toxic gene delivery vectors are needed to allow human clinical
applications. The goal of this study was to identify the intracellular barriers to an efficient
gene transfer by using cationic polymers in order to develop more efficient vectors. We
first studied glycosylated polylysines (pLK), in which pLK condenses DNA and sugarmoieties allow a cell-specific uptake. We have shown that one major limiting step with this
vector was a delayed exit from endosomes. Glycosylated polyethylenimines (PEI) have
then been developed because PEI has an intrinsic endosomolytic activity. We have shown
that lactosylated PEI allows the most efficient in vitro gene transfer into airway epithelial
cells. Complexes are able to exit from endosomal vesicles and accumulate near the
nucleus. In vivo studies in animals are under investigation. However, the nuclear uptake in
quiescent cells remains a limiting step for gene transfer by using lactosylated PEI.
Modifications of the plasmid are under study in order to improve this step.
Key words : cystic fibrosis, gene transfer, synthetic vectors, glycosylated cationic
polymers, endocytosis, intracellular trafficking, confocal microscopy, electron microscopy
Discipline : Génétique, Immunologie, Infectiologie et Développement
Laboratoire de Physiologie Respiratoire (UPRES EA 2511)
Faculté de Médecine Cochin
24, rue du Faubourg Saint-Jacques – 75014 Paris – FRANCE
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