Influenza A+B Assay Instructions for Use

Transcription

Influenza A+B Assay
Instructions for Use
For the qualitative detection and identification of influenza A and influenza B viral nucleic acids
extracted from nasal swab, nasopharyngeal swab, and nasal aspirate/wash specimens.
Quidel Molecular Influenza A+B Assay (CE)
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Contents
Intended Use ................................................................................................................................................. 4
Summary and Explanation ............................................................................................................................ 4
Principle of the Procedure ............................................................................................................................ 4
Materials Provided ........................................................................................................................................ 6
Optional Materials ........................................................................................................................................ 6
Materials Required But Not Provided ........................................................................................................... 6
Warnings and Precautions ............................................................................................................................ 7
Storage and Handling of Kit Reagents .......................................................................................................... 7
Specimen Collection, Storage, and Handling ................................................................................................ 7
Nucleic Acid Extracts Storage........................................................................................................................ 8
Nucleic Acid Extraction Programming Instructions ...................................................................................... 8
Initial Thermocycler Programming ............................................................................................................. 10
SmartCycler II Programming Instructions ............................................................................................... 10
7500 Fast DX Programming Instructions ................................................................................................ 12
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument Programming Instructions .............. 15
Assay Procedure.......................................................................................................................................... 15
Amplification Protocol on the SmartCycler II ......................................................................................... 16
Amplification Protocol on the ABI 7500 Fast Dx Thermocycler .............................................................. 17
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ........................................... 17
Interpretation of Results ............................................................................................................................. 19
Interpretation of Results using the SmartCycler II.................................................................................. 19
Interpretation of Results using the 7500 Fast Dx Thermocycler ............................................................ 19
Interpretation of Results using the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ................................... 20
Quality Control ............................................................................................................................................ 20
Limitations .................................................................................................................................................. 20
Clinical Performance ................................................................................................................................... 21
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Analytical Performance ............................................................................................................................... 23
Level of Detection ....................................................................................................................................... 23
Competitive Inhibition ................................................................................................................................ 24
Analytical Reactivity (Inclusivity) ................................................................................................................ 24
Reproducibility ............................................................................................................................................ 26
Analytical Specificity – Cross-reactivity....................................................................................................... 26
Carryover and Cross-contamination Studies .............................................................................................. 29
Additional Source Material ......................................................................................................................... 29
Customer and Technical Support ................................................................................................................ 29
Intellectual Property ................................................................................................................................... 29
Trademarks ................................................................................................................................................. 29
Glossary ....................................................................................................................................................... 30
References .................................................................................................................................................. 31
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Intended Use
The Quidel Molecular Influenza A+B assay is a multiplex Real Time RT-PCR assay for the qualitative detection and
identification of influenza A and/or influenza B viral nucleic acids extracted from nasal swabs, nasopharyngeal
swabs, and nasal aspirate/wash specimens. This in vitro diagnostic test is intended to aid in the differential
diagnosis of influenza A and/or influenza B viral infections in humans. The assay does not detect the presence of
influenza C virus.
Negative results do not preclude Influenza virus infection and should not be used as the sole basis for diagnosis,
treatment or other management decisions. Performance characteristics for influenza A were established when
influenza A/H3 and A/H1 were the predominant influenza A viruses in circulation. When other influenza A viruses
are emerging, performance characteristics may vary.
Summary and Explanation
Influenza viruses (family Orthomyxoviridae) contain a single-stranded RNA genome which is present in 8 separate
segments of ribonucleoprotein. This segmentation of the genome is rare among viruses and probably contributes
to the rapid development of new influenza strains through interchange of gene segments if two different viruses
infect the same cell. There are 3 types of influenza- A, B and C. Type A has counterparts in birds and pigs as well as
humans, while types B and C are known only in humans. Due to the possibility of another pandemic caused by
1
influenza A, as occurred in 1918 when 30-50 million people worldwide died , the Centers for Disease Control (CDC)
and the World Health Organization (WHO) maintain surveillance of influenza strains and make predictions of
suitable strains for vaccine production.
2
It is estimated that in the U.S. there are 30,000-49,000 deaths annually caused by flu-associated illnesses.
Worldwide, annual epidemics of influenza result in about three to five million cases of severe illness, and about
3
250,000-500,000 deaths. Pandemics of influenza A occur about every 10 to 30 years and epidemics of influenza A
or B occur annually. Infections are seasonal, typically extending from November to April in the northern
hemisphere. Complications tend to occur in the young, elderly and persons with chronic cardio-pulmonary
diseases.
Incubation time is 1-3 days with rapid spread by inhalation via aerial droplets and fomites. It is characterized by
fever, myalgia, headache and pharyngitis.
Principle of the Procedure
The assay detects viral nucleic acids that have been extracted from a patient sample. A multiplex Real-time RT-PCR
reaction is carried out under optimized conditions in a single tube generating amplicons for each of the target
viruses present in the sample. Identification of influenza A occurs by the use of target specific primers and a
fluorescent- labeled probe that hybridizes to a conserved influenza A sequence within the matrix protein gene.
Identification of influenza B occurs by the use of target specific primers and fluorescent-labeled probes that will
hybridize to a conserved influenza B sequence within the neuraminidase gene.
Quidel Molecular Probe Labels
Target
Dye
Influenza A
FAM
Influenza B
CAL Fluor Orange® 560
Process Control (PRC)
Quasar® 670
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The following is a summary of the procedure:
1.
Sample Collection: Obtain nasal swabs, nasopharyngeal swabs, and nasal aspirate/wash specimens using
standard techniques from symptomatic patients. These specimens are transported, stored, and processed
4
according to established laboratory procedures.
2.
Nucleic Acid Extraction: Extract Nucleic Acids from the specimens with the NucliSENS® easyMAG® System
following the manufacturer’s instructions and using the appropriate reagents (See Materials Required but Not
Provided). Use of other extraction systems with the Quidel Molecular Influenza A+B assay has not been
validated. Validation of these other systems is the responsibility of the end-user.
Prior to the extraction procedure, add 20 µL of the Process Control (PRC) to each 180 µL aliquot of specimen.
The PRC serves to monitor inhibitors in the extracted specimen, assures that adequate amplification has taken
place, and confirms that the nucleic acid extraction was sufficient.
3.
Rehydration of Master Mix: Rehydrate the lyophilized Master Mix using the Rehydration Solution. The Master
Mix contains oligonucleotide primers, fluorophore and quencher-labeled probes targeting conserved regions
of the influenza A and influenza B viruses, as well as the process control sequence.
4.
Nucleic Acid Amplification and Detection: Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction tube or
plate well. Then add 5 µL of extracted nucleic acids (specimen with PRC) to the plate well or appropriately
TM
labeled reaction tube Place the plate or tube into either the Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time
PCR Instrument, Applied Biosystems® 7500 Fast Dx or Cepheid ® SmartCycler® II instruments, respectively.
The assay has been validated with the 7500 series of instruments.
Once the reaction tube or plate is added to the instrument, the assay protocol is initiated. This protocol
initiates reverse transcription of the RNA targets generating complementary DNA, and the subsequent
amplification of the target amplicons occurs. The Quidel Molecular Influenza A+B assay is based on TaqMan®
chemistry and uses an enzyme with reverse transcriptase, DNA polymerase, and 5’-3’ exonuclease activities.
During DNA amplification, this enzyme cleaves the probe bound to the complementary DNA sequence,
separating the quencher dye from the reporter dye. This step generates an increase in fluorescent signal upon
excitation by a light source of the appropriate wavelength. With each cycle, additional dye molecules are
separated from their quenchers resulting in additional signal. If sufficient fluorescence is achieved by 45
cycles, the sample is reported as positive for the detected nucleic acid.
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Materials Provided
SKU # M100
Detection Kit (96 Reactions) – Store at 2° to 8°C
#
Component
Quantity


Rehydration Solution Part M5003
1 vial/kit 1.9 mL
Quidel Molecular Influenza A+B Master Mix Part M5004
12 vials/kit,
8 reactions/vial
Lyophilized Contents:
DNA polymerase enzyme with reverse transcriptase activity
Primers and probes
dNTPs
Stabilizers
Process Control Part M5005
1 vial/kit 2.0 mL
Optional Materials
•
Positive controls for influenza A and influenza B (i.e. Quidel Molecular Influenza A+B Control Set #M106 which
serves as an external processing and extraction control)
Materials Required But Not Provided
•
•
•
•
•
•
Micropipettors (range between 1 to 10 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument or Applied Biosystems 7500 Fast Dx
instrument
Applied Biosystems 7500 Fast Dx 96 well PCR plate
Applied Biosystems optical plate films
Plate centrifuge for ABI 96 well plate
Or
•
•
•
•
•
Micropipettors (range between 1 to 10 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
SmartCycler® II
SmartCycler disposables
SmartCycler centrifuge
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Warnings and Precautions
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
For In Vitro Diagnostic Use
If infection with a novel influenza A virus is suspected based on current clinical and epidemiological screening
criteria recommended by public health authorities, specimens should be collected with appropriate infection
control precautions for novel virulent influenza viruses and sent to state or local health departments for
testing.
Performance characteristics of this test have been established with the specimen types listed in the Intended
Use Section only. The performance of this assay with other specimen types or samples has not been
evaluated.
Use of extraction systems other than the NucliSENS easyMAG System has not been validated. Validation of
these systems is the responsibility of the end-user.
Using cycling conditions other than those indicated in the Thermocycler Programming Instructions section may
give erroneous results.
Use of this product should be limited to personnel with sufficient training in PCR and RT-PCR techniques.
Treat all specimen/samples as potentially infectious. Follow universal precautions when handling samples,
this kit, and its contents.
Proper sample collection, storage and transport are essential for correct results.
Store assay reagents as indicated on their individual labels.
Wear suitable protective clothing, gloves, eye and face protection when using this kit.
For accurate results, pipette carefully using only calibrated equipment.
Thoroughly clean and disinfect all surfaces with a 10% bleach solution followed by molecular grade water.
Use micropipettes with an aerosol barrier or positive displacement tips for all procedures.
Avoid microbial and cross contamination of the kit reagents. Follow Good Laboratory Procedures.
Do not mix reagents from kits with different lot numbers.
Do not use reagents from other manufacturers with this kit.
Do not use product after its expiration date.
Proper workflow planning is essential to minimize contamination risk. Always plan laboratory workflow in a
uni-directional manner, beginning with pre-amplification and moving through amplification and detection.
Use dedicated supplies and equipment in pre-amplification and amplification areas.
Do not allow cross movement of personnel or equipment between areas.
Keep amplification supplies separate from pre-amplification supplies at all times.
Do not open sample tubes or unseal plates post amplification.
Dispose of amplified material carefully and in accordance with local laws and regulations in order to minimize
the risk of amplicon contamination.
Do not use supplies dedicated for reagent or sample preparation for processing target nucleic acid.
MSDS is available upon request or can be accessed on the product website.
Storage and Handling of Kit Reagents
•
•
Store the unopened kit at 2° to 8°C until the expiration date listed on the outer kit box.
The rehydrated Master Mix may be stored at room temperature (20° to 25°C) for up to 24 hours. For longer
storage, the rehydrated Master Mix should be recapped, sealed with parafilm, and stored in an upright
position at ≤ –20°C for up to 14 days. Protect the Master Mix from light during storage.
Indications of Instability or Deterioration of Reagents: Cloudiness of the Rehydration Solution may indicate
deterioration of this reagent. Contact Quidel Technical Support for a replacement.
Specimen Collection, Storage, and Handling
Specimens used for the validation of the Quidel Molecular Influenza A+B assay were obtained using standard
techniques from patients with upper respiratory tract infection symptoms. These specimens were collected,
transported, stored, and processed according to CLSI M41-A.
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Nucleic Acid Extracts Storage
The user is responsible for validation of the storage procedures and conditions used in their laboratory. Eluates can
typically be stored at room temperature (20° to 25°C) for 2 hours, at 2-8°C for 8 hours, and 1 month at –20°C to
-70°C. Storage of small quantities of nucleic acid extract (e.g. 5 μL or less) is not recommended.
Nucleic Acid Extraction Programming Instructions
1.
Turn on the instrument and wait for instrument light to appear orange. Then switch on the computer/launch
easyMAG software.
2.
Barcode reagents after pressing the ‘Instrument’
3.
To enter samples, press the ‘Daily Use’
button, which will default to the ‘Define Request’
screen. Select the following settings:
a. Sample ID:
Enter the sample name using the keyboard.
b. Matrix:
Select Other from the drop-down menu
c. Request:
Select Generic from the drop-down menu
d. Volume (mL):
Select 0.200 from the drop-down menu
e. Eluate (µL):
Select 50 from the drop-down menu
f. Type:
Primary
g. Priority:
Normal
4.
Upon pressing the ‘Save’
and ‘Reagent Inventory’
buttons.
button, the sample will appear in the ‘Unassigned Sample’ window on the left
side of the screen. Press the ‘Enter New Extraction Request’
button, and repeat the process for
additional samples. Alternatively multiple samples can be entered by pressing the ‘Auto Create New Extraction
Requests’
5.
button.
Once all samples are created, go to ‘Organize Runs’ by clicking on the
Create a run by pressing the ‘Create Run’
6.
icon near the top of the page.
button. Enter a run name or use the default.
button (auto fills up to 24 samples from the
Add samples to the run by using the ‘Auto Fill Run’
‘Unassigned Sample list’ on the left hand side of the screen). Alternatively, individual samples can be moved
after selecting the
into and out of the run by using the left and right ‘Positioning icons’
appropriate sample. The sample order within the run can be changed using the ‘Move Extraction Request
7.
8.
9.
.
Up/Down’ buttons
Obtain 1 to 3 (for 8 to 24 samples, respectively) sample vessel(s), and add 20 µl of Process Control to each
sample well used.
Add 180 µl of each sample to the appropriate well as designated.
Go to ‘Load Run’ by pressing the
into the instrument
button near the top of the screen. Insert tips and sample vessel(s)
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10. Enter the barcode(s) of the sample vessel(s)
11. Enter the barcode(s) of silica beads to be used
12. Assign silica beads to samples as follows:
a. Click the reagents symbol below number 1 in the picture below. The lot number of the silica beads
should appear below the Silica tab at number 2 in the picture below.
b. Highlight and select the samples in the run for which beads need to be assigned (in the box
containing number 3 in the picture below).
c.
d.
positioning icon (below number 4 in the picture below) to assign the silica lot number
Click the
to the selected samples
If the bead symbol to the right of number 5 in the picture below is selected, the silica bead lot
number should be displayed for each sample
13. Print work list by touching ‘Load Run’ icon followed by pressing the ‘Print Work List’ icon
.
14. Press the ‘Dispense Lysis’
button. The on-board lysis will take approximately 12 minutes to complete.
15. For each sample vessel, prepare magnetic particles using the Biohit pipettor and tips for up to eight reactions
as follows:
a. Using 1 tip and Program 1, aspirate 550 µl nuclease-free water and dispense into a 1.5 ml DNAse /
RNAse free microfuge tube.
b. Vortex the magnetic silica. Using 1 tip and Program 1, aspirate 550 µl of magnetic silica, dispense into
the water and mix by vortexing.
c. Using 1 tip and Program 2, aspirate 1050 µl of the magnetic silica mixture and dispense 25 µl back
into the same tube.
d. Dispense 125 µl magnetic silica mixture 8 times into 8 wells of an ELISA strip plate. Discard tip.
e. After Lysis is complete (NB: the ‘Instrument Status’ at the bottom of the screen must be ‘IDLE’!),
using 8 tips and Program 3, aspirate 100 µl of magnetic silica mixture in strip wells, dispense 100 µl of
magnetic silica mixture in strip wells, and aspirate 100 µl of magnetic silica mixture in strip wells.
f. Insert tips into liquid within the sample vessels. Aspirate 800 µl then dispense 900 µl of magnetic
silica mixture back into vessel. Aspirate 1000 µl of magnetic silica mixture from vessel and dispense
1000 µl of magnetic silica back into vessel. Repeat aspiration / dispensing of 1000 µl two more times.
16. Close the instrument and press the ‘Start’
button to begin the run.
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17. Upon completion of run, transfer purified nucleic acid to nuclease-free tubes. Use purified nucleic acids
immediately, or freeze at –70°C.
Limitations: The following protocol was developed for use with this assay specifically. Its suitability for other
assays is unknown. Check with bioMérieux S.A. to ensure software compatibility.
Initial Thermocycler Programming
SmartCycler II Programming Instructions
1.
2.
Launch the SmartCyclerDx Version 3.0b software package
Create the Quidel Molecular Influenza A+B Assay
a. Select the Define Assays button from the top of the screen
b. Name the assay
i. Select the New button at the bottom left corner of the screen
ii. Type in ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ and select the OK
iii. ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ will be added to the top of the Assay Name list located on the
upper left-hand of the screen
c. Set the analysis values: Under the Assay Type: Research section, select the Analysis Settings tab and
make sure the following specifications are made:
i. Select FATA25 from the Dye Set drop-down menu
ii. The Analysis Type drop-down menu should be set to Qualitative (Default setting)
iii. In the Channel Name column, enter ‘Influenza A’ for FAM, ‘Influenza B’ for Alx532 and ‘PRC’ for
Alx647
In the Usage column, select Target from the drop down menus for Influenza A and Influenza B, and
select Internal Control for PRC. When selecting Internal Control a window will pop up warning
below. Select the Yes button.
iv.
v. In the Curve Analysis column, enter Primary Curve for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC)
(Default setting).
vi. In the Thresh Setting column, enter Manual Threshold for each channel (Influenza A, Influenza B,
PRC) (Default setting).
vii. In the Manual Thresh Fluor Units column, enter the following thresholds:
a. Influenza A:
20.0
b. Influenza B:
20.0
c. PRC:
20.0
viii. In the Valid Min Cycler column, enter 10 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC).
ix. In the Valid Max Cycler column, enter 45 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC).
x. In the Bkgnd Sub column, use “ON” for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC) (Default
setting).
xi. In the Bkgnd Min Cycle column, enter 5 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC) (Default
setting).
xii. In the Bkgnd Max Cycle column, enter 45 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC).
Page 10 of 31
xiii. In the Boxcar Avg cycles column, keep 0 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC) (Default
setting).
xiv. In the End Pt Threshold column, enter 20 for each channel (Influenza A, Influenza B, PRC) (Default
setting).
xv. In the NC IC% column, keep “NA” for each channel (PRC) (Default setting).
xvi. In the IC Delta column, keep “NA” for each channel (Influenza A, Influenza B) (Default setting).
xvii. In the Customize Result Text section (below the table), select Organism Based Result Text from
the drop-down menu. A window will pop up warning below. Select Yes.
xviii. Select the Customize button to open the Organism-Based Result Text dialog window. Select the
Add button, enter ‘Influenza A’ in the Organism Name column and check the Influenza A box.
Select the Add button again, enter ‘Influenza B’ in the Organism Name column and check the
Influenza B box.
d.
Click OK at the bottom of the pop up window
Set the RT-PCR cycling times and temperatures at the bottom of the screen as follows:
i. Stage 1
1. Hold
2. Temp:
55.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
ii. Stage 2
1. Hold
2. Temp:
60.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
iii. Stage 3
1. Hold
2. Temp:
65.0
3. Secs:
300
4. Optics:
OFF
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iv. Stage 4
1.
2.
3.
3.
2-Temperature Cycle
Times to Repeat:
50
First Temperature Row:
a. Temp:
92.0
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
4. Second Temperature Row
a. Temp:
57.0
b. Secs:
40
c. Optics:
ON
Save the protocol by selecting the Save button at the bottom of the screen
Figure of the completed Quidel Molecular Influenza A+B Protocol
Quidel Molecular Influenza A+B
Limitations: The following protocol was developed for use with Quidel Molecular Influenza A+B Real-time RT-PCR
assay specifically. Its suitability for other assays is unknown. Check with Cepheid to ensure software compatibility.
7500 Fast DX Programming Instructions
1.
2.
Launch the 7500 Fast Dx software package.
The Quick Startup document dialog window will open. Select the Create New Document button to start the
New Document Wizard. Follow each step to initiate the Quidel Molecular Influenza A+B protocol.
a. Define Document: Most of the following should be the default setting. If not, change accordingly.
i. Confirm or enter the following information.
Assay:
Standard Curve (Absolute Quantitation)
Container:
96-Well Clear
Template:
Blank Document
Run Mode:
Fast 7500
Operator:
your operator name
Comments:
SDS v1.4 (add more if needed)
Plate Name:
‘Quidel Molecular Influenza A+B’
ii. Select the Next button.
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b.
Select Detectors: New detectors for Influenza A, Influenza B and the process control (PRC) must be
added. For each target, select the New Detector button to open the New Detector pop-up window.
Alternatively, use the Create Another button from within the New Detector pop-up window for the
last two detectors.
i. Enter the following information for each detector.
Name
Reporter Dye
Quencher Dye
Influenza A
FAM
(none)
Influenza B
JOE
(none)
PRC
Cy5
(none)
c.
d.
Color
(Select)
(Select)
(Select)
ii. Select a unique color to represent each detector.
iii. Highlight the new detectors and add to the Detectors in Document column using the Add
button.
iv. Select (none) from the Passive Reference drop-down menu.
v. Select the Next button.
vi. Select the Finish button without setting any wells.
The wizard will close and the software will open, starting with the Setup tab. This will show the
sample plate that was set up during the quick start. For the initial set up, nothing needs to be
changed here.
Defining the Theromocycler Protocol: Select the Instrument tab to set up the Quidel Molecular
Influenza A+B RT-PCR cycling times and temperatures. Under Thermal Profile there should be a
default 2-stage protocol. Each stage will have 3 user-editable text boxes. The top box value
represents the number of reps or cycles for that stage. The middle box value represents the
temperature (˚C) and the lowest box value represents the time (minutes: seconds).
i. Make the following changes to the default Thermal Cycler Protocol:
1. Stage 1
a. Reps:
1
b. Temp:
55
c. Time:
5:00
2. Select the bar between Stage 1 and Stage 2. Select the Add Hold button to add
another stage.
3. Stage 2
a. Reps:
1
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b. Temp:
60
c. Time:
5:00
4. Select the bar between Stage 2 and Stage 3. Select the Add Hold button to add
another stage.
5. Stage 3
a. Reps:
1
b. Temp:
65
c. Time:
5:00
6. Stage 4 (2-Step Dissociation Stage)
a. Reps: 10
b. Step 1
i. Temp:
92
ii. Time:
0:05
c. Step 2
i. Temp:
57
ii. Time:
0:40
7. Select the bar to the right of Stage 4. Select the Add Cycle button to add another
stage.
8. Stage 5 (2-Step Dissociation Stage)
a. Reps: 35
b. Step 1
i. Temp:
92
ii. Time:
0:05
c. Step 2
i. Temp:
57
ii. Time:
0:40
9. If a wrong stage is added the stage can be removed by pressing the Delete button
after highlighting the stage between the vertical lines
ii. Under Settings enter the following:
Sample Volume (μL):
20 (default)
Run Mode:
7500 Fast (default)
Data Collection:
Stage 5, Step 2 (57.0 @ 0:40)
NOTE: Do not check the check box next to ‘Expert Mode’.
iii. Final protocol
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e.
Set threshold for each analyte.
i. Select the Results tab.
ii. Select the Amplification Plot tab.
iii. Select Influenza A from the Detector tab in the top right corner.
iv. In the Analysis Settings block, set the Threshold to 1.5e5.
v. Select the Auto Baseline radio button.
vi. Repeat iii-v for Influenza B setting the Threshold to 1.2e5.
vii. Repeat iii-v for PRC setting the Threshold to 2.7e4.
f.
Save the new protocol as a template for future use.
i. At the top of the screen select File and then Save As.
ii. Save In: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. File name: ‘Quidel Molecular Influenza A+B’
iv. Save as type: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Exit the software.
g.
Limitations: The following protocol was developed for use with this specifically. Its suitability for other assays is
unknown. Check with Life Technologies to ensure software compatibility.
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument Programming Instructions
The programming of the instrument is performed by use of the TDD file that accompanies the test kit.
Assay Procedure
Run the following procedures at controlled room temperature of 20° to 25°C.
Nucleic Acid Extraction Procedure
Refer to the NucliSENS easyMAG System Programming Instructions above.
1. Add 20 µL of the Process Control to the sample extraction well.
2. Add 180 µL of patient sample or external control to a sample extraction well.
3. Follow extraction instructions as per manufacturer’s instructions.
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Master Mix Rehydration Procedure
1. Determine the number of specimens to be tested, and obtain the correct number of eight-test lyophilized
Master Mix vials for testing.
2. Return unused reagents to the appropriate storage conditions.
3. Open Master Mix carefully to avoid disruption of the pellet.
4. Add 135 µL of Rehydration Solution to the Master Mix.
5. Place vial at room temperature for 1-2 minutes to allow rehydration of pellet.
6. Gently pipette up and down 2-3 times (avoiding the formation of bubbles) prior to dispensing into the first
PCR tube or plate well.
Note: The rehydrated Master Mix is sufficient for eight reactions.
Note: The rehydrated Master Mix may be kept at room temperature for up to 24 hours or at ≤ –20°C for
up to 14 days. (See “Storage and Handling of Kit Reagents” section for additional storage options)
RT-PCR Set-up Procedure:
1. Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction tube or plate well.
2. Add 5 µL of extracted nucleic acid (specimen with the process control) into the reaction tubes or plate
wells. Mixing of reagents is not required.
Note: Use a micropipettor with a new non-aerosol tip with each extracted specimen.
3. Close the reaction tubes or seal the plate.
Note: Quidel suggests each thermocycler run should include a reaction tube or well with an influenza
A/influenza B External Positive Control and Negative Control. Run controls in keeping with your lab
practices and policies.
4. Centrifuge the reaction tubes or plate for a minimum of 15 seconds. Ensure that all liquid is at the bottom
of the tube.
5. Insert tubes or plate into the thermocycler.
Amplification Protocol on the SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
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13.
Switch on SmartCycler Block(s)
Launch the SmartCycler Dx Version 3.0b software package
Select the Create Run button from the top of the screen to set up the run
Under Run Name, enter a name for the current run (YYMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B)
Under Notes, enter any notes about the run for future reference
Under Assay, select the ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ assay from the drop-down menu
Under Assay Information, enter lot number and expiration date of the kit.
To select the wells that will be used, do one of the following:
a. To automatically assign wells do the following:
i. Under Number of specimens, enter the number of samples in the provided text box.
ii. Select the Apply button. The entered number of rows will appear in the Site Table.
b. To manually close wells on the SmartCycler blocks, do the following:
i. Select the Add/Remove Sites button towards the bottom of the screen.
ii. This will open the Select Sites pop-up window with two columns. The column on the left (Sites)
lists all available sites, and the column on the right (Selections) holds all selected sites.
iii. To select all sites, click the Select All Sites button.
iv. To select specific sites, highlight one or more sites, and select the right arrow to add the site(s) to
the Selections column.
v. Select the OK button to close the window. The selected sites will appear in the Site Table.
Enter the sample identifiers under the Sample ID column within the Site Table (this can also be done after
the run is started).
Enter any notes under the Notes column, and leave the Sample Type column entries as ‘SPEC’.
Select the Start Run button at the bottom of the screen.
Select the View Results button to view the progress of the run.
Save the run after it is finished and prior to exiting the software.
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Amplification Protocol on the ABI 7500 Fast Dx Thermocycler
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Switch on the ABI 7500 Fast Dx.
Launch the ABI 7500 Fast Dx software package.
The Quick Startup document dialog window will open.
Click on Create a new document.
Most of the following should be the default setting. If not, change accordingly.
Assay:
Standard Curve (Absolute Quantitation)
Container:
96-Well Clear
Template:
Run Mode:
Fast 7500
Operator:
your operator name
Comments:
SDS v1.4 (add more if needed)
Plate Name:
YYMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Set Up Sample Plate
a. Under the Setup and Plate tabs the plate setup will appear.
b. Select all wells that will contain sample, right-click and select the Well Inspector from the drop-down
menu. When the Well Inspector pop-up window opens, select the detectors for influenza A, influenza
B and PRC.
c. Use the Well Inspector to enter the sample names. Patient IDs may be entered in the Well Inspector
window; however it is recommended that this is done prior to resuspending the lyophilized master
mix, post run, or using the import function to minimize the time the PCR reactions will sit at room
temperature prior to starting the run.
d. Save the run as YYMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
e. A window will open asking for the “Reason for change of entry”. Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
Starting the PCR
a. Select the Instrument tab.
b. Insert the 96 well PCR plate into the machine.
c. Under Instrument Control, select the Start button to initiate the run.
Post PCR
a. IMPORTANT: When the run is finished, press OK. Analyze the data by pressing the “Analyze” button
in the top menu, and save the file.
b. Save the file by pressing Save Document in the task bar. A window will open asking for the “Reason
for change of entry”. Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant to the run.
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
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Switch on QuantStudio Dx.
Choose IVD mode on the instrument.
Launch the QuantStudio Dx IVD software package.
Enter the system Username and Password when prompted.
The Home screen window will open.
In the Setup box, highlight the previously loaded test name “Quidel Molecular Influenza A + B Assay”
Click the Setup button to begin a run.
The Setup, Test Properties screen will be displayed. Enter run information accordingly.
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Enter the Experiment Name (default setting launches the run with a date and time stamp).
Enter the Plate Barcode information.
Record material lot numbers under Reagent Information.
Save the run as YYMMDD-Quidel Molecular Influenza A + B.sds.
A window will open asking for the “Reason for change of entry.” Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
In the left menu bar, select Define.
Edit sample information.
a. Enter specific sample information for each well by deleting the default identifier (Patient 1, Patient 2,
etc.) and entering new information, OR
b. Select Import from File across the top of the display to upload a predefined plate map from a Text
(tab delimited) file.
In the left menu bar, select Assign to verify proper plate setup.
Loading the sample plate.
a. Eject the instrument tray.
b. Insert the 96 well PCR plate into the machine with the A1 well positioned in the top, left corner.
c. Retract the instrument tray.
Starting the run.
a. In the left menu bar, select Run.
b. Click the green Start Run button at the top of the screen.
i. If prompted, select the serial number specific to the instrument being used.
When the run is complete, select Analysis in the left menu bar.
a. Save the file by pressing Save in the task bar. A window will open asking for the “Reason for change
of entry”. Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant to the run.
b. The Amplification Plot will show by default. To view other plot types, select them from the left menu
bar.
c. To view run information with Ct values, select the Well Table tab in the right side of the screen.
Printing a report.
a. In the top menu bar, select Print Report. Customize the report contents by selecting or deselecting
boxes from the report window.
b. Select the “Print Report” button at the bottom of the dialogue box.
Exporting data files.
a. In the left menu bar, select Export.
b. Enter the Export File Location OR click Browse to locate the desired path.
c. The Export File Name will default to that of the saved run.
d. Select Excel as the file type.
e. Customize the exported data report by toggling across the provided tabs and selecting or deselecting
options.
f. Select Start Export along the bottom of the screen.
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Interpretation of Results
Interpretation of Results using the SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Select View Results tab after the run is finished.
Select Sample Results tab.
The SmartCycler software will automatically call whether the samples are influenza positive or negative,
or whether the run was invalid (unresolved).
More detailed information may be found under the respective tabs of each analyte in the same window. If
there is a positive call for either influenza A or B (or both), the PRC result is not applicable. The PRC is only
required for negative calls.
Interpretation of the Quidel Molecular Influenza A+B Assay Printed Results on SmartCycler II
Assay Result
Process
Control Result
Influenza A
Influenza B
Negative
Pass
NEG
NEG
Influenza A or Influenza B nucleic acid not
detected; PRC Detected
NA*
POS
NEG
Influenza A nucleic acid detected
NA*
NEG
POS
Influenza B nucleic acid detected
NA*
POS
POS
Influenza A and Influenza B nucleic acid
detected
NEG
Unresolved – PCR inhibition or reagent
failure. Repeat testing from the purified
nucleic acid or collect and test a new
sample.
Influenza A
Positive
Influenza B
Positive
Influenza A and
Influenza B
Positive
Invalid
Fail
NEG
*No value is required for the Process Control to make a positive call.
Error Code 3079: Warning/Error Code 3079 may be observed with influenza A and influenza B positive samples.
Warning/Error Code 3079 occurs when the fluorescence (RFU) signal is too high. In this case, all results for that
sample are reported by the Dx software as ND (Not Determined). If a Ct value ≥ 10 or ≤ 45 is reported for influenza
A or influenza B, the sample results can be recorded as POS for influenza A or influenza B.
Interpretation of Results using the 7500 Fast Dx Thermocycler
Interpretation of the Quidel Molecular Influenza A+B Assay Results on the 7500 Fast Dx Thermocycler
Assay Result
Detector:
Influenza A
Detector:
Influenza B
Negative
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Influenza A
Positive
Influenza B
Positive
Influenza A and B
Positive
5.0 ≤ Ct ≤ 35.0
Detector:
Process
Control
5.0 ≤ Ct ≤35.0
No influenza A or influenza B nucleic
acid detected; PRC Detected
NA*
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
5.0 ≤ Ct ≤35.0
NA*
5.0 ≤ Ct ≤ 35.0
5.0 ≤ Ct ≤35.0
NA*
Invalid
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Ct < 5.0 or
Ct > 35.0
Invalid
Undetermined
Undetermined
Undetermined
Influenza A and Influenza B nucleic
acid detected
No Influenza A or Influenza B and PRC
nucleic acid detected; invalid run,
Re-run or re-extract
Not Determined,
*No Ct value is required for the Process Control to make a positive call.
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Interpretation of Results using the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Interpretation of the Quidel Molecular Influenza A+B Assay Results on the QuantStudio Dx RealTime PCR Instrument
Assay Result
Detector:
Influenza A
Detector:
Influenza B
Negative
No Ct provided
(Blank)
No Ct provided
(Blank)
No Ct provided
(Blank)
Influenza A
Positive
Influenza B
Positive
Influenza A and B
Positive
No Ct provided
(Blank)
Invalid
Ct ≤40.0
Detector:
Process
Control
Ct ≤40.0
No influenza A or influenza B nucleic
acid detected; PRC Detected
NA*
Ct ≤40.0
NA*
Ct ≤40.0
Ct ≤40.0
NA*
No Ct provided
(Blank)
No Ct provided
(Blank)
No Ct provided
(Blank)
Influenza A and Influenza B nucleic
acid detected
No Influenza A or Influenza B and PRC
nucleic acid detected; invalid run,
*No Ct value is required for the Process Control to make a positive call.
Quality Control
The Quidel Molecular Influenza A+B assay incorporates several controls to monitor assay performance.
1.
2.
3.
The Process Control should be used during extraction and amplification in the assay. This control should be
added to each sample aliquot prior to extraction.
Commercially available external positive influenza A/B controls may be treated as a patient specimen and
should be used in accordance with your lab standards. Previously characterized positive influenza A or
influenza B specimens may be used lieu of a commercial influenza A/B control.
Viral transport media or previously characterized negative specimen may be used as an external negative
control. This must be treated as a patient specimen and should be performed in accordance with current lab
standards.
Limitations
•
•
•
•
•
This test is not intended to differentiate influenza A subtypes, such as novel Influenza A H1N1. Additional
testing is required if subtype differentiation is required.
Negative results do not preclude infection with influenza virus and should not be the sole basis of a treatment
decision.
As with other assays of this type, there is a risk of false negative results due to the presence of sequence
variants in the viral target.
Improper collection, storage, or transport may lead to false negative results.
Inhibitors present in the sample and/or errors in following the assay procedure may lead to false negative
results.
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Clinical Performance
Performance characteristics of the Quidel Molecular Influenza A+B assay were established during a prospective
study during the 2011 respiratory virus season (January to March). Samples used for this study were nasal and
nasopharyngeal swab specimens that were collected for routine influenza testing.
The reference method was rapid culture (shell vial) followed by direct fluorescent antibody (DFA) screening and
identification.
A total of 637 swab samples were tested with Quidel Molecular Influenza A+B assay and by culture. Six (6) samples
that initially gave unresolved results remained unresolved upon retesting with the Quidel Molecular Influenza A+B
assay and are not included in the analysis below.
A total of 6 samples were DFA Respiratory Virus Screen positive (screening reagent detects Influenza A and B, RSV,
Parainfluenza 1, 2, and 3, and Adenovirus), but contained too few cells to obtain a specific positive identification. A
total of 3 samples were toxic in cell culture. These 9 specimens are not included in the analysis below.
Discrepant analysis for samples where Quidel Molecular Influenza A+B assay and culture results were in
disagreement was performed using a CE-marked RT-PCR assay and where appropriate bidirectional sequencing.
Influenza A
Fresh nasal/nasopharyngeal
Swab (N=622)
Quidel Molecular
Influenza A+B Assay
Positive
Comparator: Culture with DFA
Positive
Negative
Total
93
18*
111
Negative
1**
510
511
Total
94
528
622
95% CI
Sensitivity
93/94
98.9%
94.2% to 100%
Specificity
510/528
96.6%
94.7% to 98.0%
*17 of these specimens were influenza A positive by the CE-IVD device. The remaining
1 specimen was influenza A negative by the CE-IVD device, but positive for influenza A
virus by sequence analysis
** The specimen was also influenza A negative by the CE-IVD device.
Influenza B
Swab (N=622)
Quidel Molecular
Influenza A+B Assay
Positive
Comparator: Culture with DFA
Positive
Negative
Total
74
7*
81
Negative
2**
539
541
Total
76
546
622
95% CI
Sensitivity
74/76
97.4%
90.8% to 99.7%
Specificity
539/546
98.7%
97.4% to 99.5%
*5 specimens were influenza B positive by the CE-IVD device, 2 specimens were
influenza B negative by the CE-IVD device, but were positive for influenza B virus by
sequence analysis
**1 specimen was influenza B positive by the CE-IVD device, 1 specimen was
influenza B negative by the CE-IVD device
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A total of 626 swab samples were also tested with Quidel Molecular Influenza A+B assay and by a CE-marked IVD
RT-PCR assay. Six (6) samples that initially gave unresolved results in both assays remained unresolved upon
retesting with both assays and are not included in the analysis below. An additional 10 specimens gave unresolved
results in the CE-marked IVD RT-PCR assay and remained unresolved upon retesting with the assay and are not
included in the analysis below. Discrepant analysis for samples where Quidel Molecular Influenza A+B assay and
CE-marked IVD RT-PCR assay results were in disagreement was performed using sequencing.
Influenza A
Swab (N=610)
Quidel Molecular
Influenza A+B Assay
Comparator: CE-IVD device
Positive
Negative
Total
Positive
107
3*
110
Negative
0
500
500
107
503
610
Total
95% CI
Sensitivity
107/107
100%
96.6% to 100%
Specificity
500/503
99.4%
98.3% to 99.9%
*3 specimens were positive for influenza A virus by sequence analysis
Influenza B
Swab (N=610)
Quidel Molecular
Influenza A+B Assay
Comparator: CE-IVD device
Positive
Negative
Total
Positive
77
5*
82
Negative
4**
524
528
Total
81
529
610
95% CI
Sensitivity
77/81
95.1%
87.8% to 98.6%
Specificity
524/529
99.1%
97.8% to 99.7%
*5 specimens were positive for influenza B virus by sequence analysis
**4 specimens were negative for influenza B virus by sequence analysis
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A subset of two-hundred and eleven (211) specimens from the study above was tested on the QuantStudio Dx
Real-Time PCR Instrument. The results from this testing were compared to data from concurrent testing on the ABI
7500 Fast Dx. This comparison is provided below.
Quidel Molecular Influenza A+B Assay
Influenza A
Comparator: ABI 7500 Fast Dx
QuantStudio Dx Real-Time
PCR Instrument
Positive
Negative
Total
Positive
63
0
63
Negative
0
148
148
Total
63
148
211
95% CI
Sensitivity
63/63
100%
94.3% to 100%
Specificity
148/148
100%
97.5% to 100%
Quidel Molecular Influenza A+B Assay
Influenza B
Comparator: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positive
Negative
Total
Positive
28
0
28
Negative
0
183
183
Total
28
183
211
95% CI
Sensitivity
28/28
100%
87.9% to 100%
Specificity
183/183
100%
97.9% to 100%
Analytical Performance
Level of Detection
The analytical sensitivity (limit of detection or LoD) of the Quidel Molecular Influenza A+B assay was determined
using quantified (TCID50/mL) cultures of 3 influenza A strains (1 H1N1, 1 2009H1N1 and 1 H3N2), 3 influenza B
strains, serially diluted in negative nasopharyngeal matrix. Each dilution was extracted using the NucliSENS
easyMAG System and tested in replicates of 20 per concentration of virus on both the Applied Biosystems® 7500
Fast Dx or Cepheid SmartCycler® II platforms. Analytical sensitivity (LoD) is defined as the lowest concentration at
which 95% of all replicates tested positive.
Level of Detection
Strain
Final TCID50/mL LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1.16E+01
1.74E+01
A/Mexico/4108/2009
1.61E+01
1.82E+01
A/Victoria/3/75
2.29E+01
2.29E+01
B/Florida/04/2006
6.95E+00
6.95E+00
Page 23 of 31
Level of Detection
Strain
Final TCID50/mL LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
B/RCHIN 8/05
4.44E+00
4.44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2.85E+00
2.85E+00
Competitive Inhibition
Competitive inhibition of the Quidel Molecular Influenza A+B assay was evaluated using simulated samples with
varying concentrations of influenza A virus (2x LoD to 4 logs above LoD) and influenza B virus (2x LoD to 4 logs
above LoD) in a single sample. Samples were extracted using the NucliSENS easyMAG System and tested in
triplicate. The presence of both influenza A virus and influenza B virus at varying concentrations in a single sample
had no effect on the analytical sensitivity (limit of detection or LoD) of the Quidel Molecular Influenza A+B assay.
Analytical Reactivity (Inclusivity)
The reactivity of the Quidel Molecular Influenza A+B assay was evaluated against multiple strains of influenza A,
and influenza B viruses. The clinical panel consisted of 10 Influenza A subtype H1N1, 2 Influenza A subtype
2009H1N1, 8 Influenza A subtype H3N2, 2 Influenza A subtype H5N1, 13 Influenza B, strains. An additional panel of
non-clinical restricted isolates was also tested. Each panel member was extracted using the NucliSens easyMAG
instrument and tested in triplicate.
The Quidel Molecular Influenza A+B assay detected 100% of the influenza A (38/38) and influenza B strains (15/15)
2
3
at 10 to 10 TCID50/mL levels including novel, pandemic and avian influenza A strains and recent circulating
influenza B strains.
Clinical Panel Influenza A Viruses
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1.45E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
A/New Caledonia/20/1999
1.12E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/New Jersey/8/76
3.80E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/PR/8/34
5.89E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/NWS/33
NA
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/Denver/1/57
1.26E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/FM/1/47
3.80E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1.40E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A1/Mal/302/54
4.19E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/Taiwan/42/06
3.39E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/Brisbane/59/07
7.24E+01
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/Solomon Islands/3/06
1.41E+01
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1.15E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7.24E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Aichi/2/68
4.17E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
Subtype
Strain
TCID50/mL
H1N1
H1N1 A/California/07/2009
H1N1
Page 24 of 31
Clinical Panel Influenza A Viruses
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
4.57E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
A/Perth/16/2009
9.83E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1.03E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Victoria/3/75
2.19E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H3N2
A/Brisbane/10/07
4.17E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
Subtype
Strain
TCID50/mL
H3N2
A/Port Chalmers/1/73
H3N2
Clinical Panel Influenza B Viruses
Strain
TCID50/mL
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6.67E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Panama/45/90
1.02E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Florida/02/2006
3.16E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Florida/04/2006
3.80E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Florida/07/2004
1.26E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Malaysia/25/06/04
3.41E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Maryland/1/59
1.15E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Allen/45
4.17E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Taiwan/2/62
1.51E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Russia/69
2.19E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Mass/3/66
1.38E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/Lee/40
1.95E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
B/GL/1739/54
6.30E+02
Negative
Positive
Negative
Positive
Non-clinical Restricted Viruses
Subtype
Strain
TCID50/mL
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H2N2
A/Mallard/NY/6750/78 (H2N2)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H7N3
A/Chicken/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H9N2
A/Chicken/NJ/12220/97 (H9N2)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H4N8
A/Mallard/OH/338/86 (H4N8)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
Page 25 of 31
Non-clinical Restricted Viruses
Subtype
Strain
TCID50/mL
H6N2
A/Chicken/CA/431/00 (H6N2)
H8N4
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
A/Blue Winged Teal/LA/B174/86 (H8N4)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H5N1
A/Anhui/01/2005(H5N1)-PR8-IBCDC-RG5
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H10N7
A/GWT/LA/169GW/88 (H10N7)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H11N9
A/Chicken/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H12N5
A/Duck/LA/188D/87 (H12N5)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H13N6
A/Gull/MD/704/77 (H13N6)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H14N5
A/Mallard/GurjevRussia/262/82 (H14N5)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H15N9
A/Shearwater/Australia/2576/79 (H15N9)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
H16N3
A/Shorebird/DE/172/2006(H16N3)
2.00E+02
Positive
Negative
Positive
Negative
Reproducibility
The intra-laboratory reproducibility of the Quidel Molecular Influenza A+B assay was evaluated at 3 laboratory
sites. Reproducibility was assessed using a panel of 6 simulated samples that include medium (10x LoD), high
negative (C20-60 concentration) influenza A virus, influenza B virus, positive and negative control samples. Panels
and controls were tested at each site by 2 operators for 5 days (8 samples and 3 controls × 2 operators × 5 days ×
3 sites = 330). The panels and controls were extracted using the NucliSENS easyMAG system and tested on the
7500 Fast Dx instrument.
Reproducibility
Panel
Member ID
Influenza A
High Negative
Site 1
Site 2
Site 3
Agreement
with
expected
results
AVE
Ct
%CV
Agreement
with
expected
results
AVE
Ct
%CV
Agreement
with
expected
results
AVE
Ct
%CV
6/10
31.5*
8.8
10/10
N/A
N/A
9/10
34.3*
N/A
Total
Agreement
with expected
result
25/30
Influenza A
Positive (10x LoD)
Influenza B
High Negative
Influenza B
Positive (10x LoD)
Influenza A
Positive Control
Influenza B
Positive Control
10/10
24.7
2.1
10/10
26.0
9.0
9/10
28.1
7.6
29/30
9/10
34.9
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
10/10
25.1
12.0
10/10
28.3
9.3
9/10
27.2
10.1
29/30
10/10
12.0
2.4
10/10
11.9
4.0
10/10
13.5
8.3
30/30
10/10
14.7
2.2
10/10
15.1
3.7
10/10
16.0
7.6
30/30
Negative Control
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
Analytical Specificity – Cross-reactivity
The analytical specificity of the Quidel Molecular Influenza A+B assay was evaluated by testing a panel consisting of
26 viral, 24 bacterial, and 1 yeast strain representing common respiratory pathogens or flora commonly present in
5
10
nasopharynx. Bacteria and yeast were tested at concentrations of 10 to 10 CFU/mL. Viruses were tested at
3
6
concentrations of 10 to 10 TCID50/mL. Samples were extracted using the NucliSENS easyMAG instrument and
tested in triplicate. Analytical specificity of the Quidel Molecular influenza A+B assay was 100%.
Page 26 of 31
Cross-reactivity
3.70E+04
Influenza A
Result
Negative
Influenza B
Result
Negative
hMPV B1
2.37E+04
Negative
Negative
RSV Long
4.40E+04
Negative
Negative
RSV Washington
1.75E+0
Negative
Negative
Adenovirus 1/Adenoid 71
5.67E+04
Negative
Negative
Coronavirus 229E
1.70E+06
Negative
Negative
Coronavirus OC43
1.67E+06
Negative
Negative
Coxsackievirus B4
2.43E+06
Negative
Negative
Coxsackievirus B5/10/2006
2.28E+06
Negative
Negative
Cytomegalovirus
8.76E+05
Negative
Negative
Echovirus 7
5.38E+08
Negative
Negative
Echovirus 9
1.50E+06
Negative
Negative
Echovirus 6
1.05E+08
Negative
Negative
Echovirus 11
1.50E+05
Negative
Negative
Enterovirus 71
2.68E+03
Negative
Negative
Enterovirus 70
1.66E+05
Negative
Negative
Epstein Barr Virus
5,000cp/mL
Negative
Negative
HSV Type 1 Maclnytre strain
1.95E+06
Negative
Negative
HSV Type 2 G strain
3.67E+06
Negative
Negative
Rubeola
3.78E+05
Negative
Negative
Mumps virus
8.43E+04
Negative
Negative
Parainfluenza Type 1
2.50E+05
Negative
Negative
2.20E+04
Negative
Negative
9.10E+05
Negative
Negative
9.57E+06
Negative
Negative
Varicella Zoster Virus
7.50E+02
Negative
Negative
Bordetella pertussis
1.04E+07
Negative
Negative
Bordetella bronchiseptica
2.55E+07
Negative
Negative
Chlamydia trachomatis
2.10E+05
Negative
Negative
Legionella pneumophila
2.05E+08
Negative
Negative
Mycobacterium intracellulare
6.90E+08
Negative
Negative
Mycobacterium tuberculosis
6.60E+07
Negative
Negative
Mycobacterium avium
1.36E+10
Negative
Negative
Haemophilus influenzae
5.90E+07
Negative
Negative
Organism ID
Final Conc.
hMPV A1
Page 27 of 31
Cross-reactivity
5.15E+07
Influenza A
Result
Negative
Influenza B
Result
Negative
Proteus vulgaris
2.65E+08
Negative
Negative
Proteus mirabilis
2.75E+07
Negative
Negative
Neisseria gonorrhoeae
2.15E+07
Negative
Negative
Neisseria menigitidis
1.85E+08
Negative
Negative
Neisseria mucosa
1.85E+08
Negative
Negative
Klebsiella pneumoniae
3.30E+07
Negative
Negative
Escherichia coli
6.80E+07
Negative
Negative
Moraxella catarrhalis
5.85E+07
Negative
Negative
Corynebacterium diptheriae
6.0E+05
Negative
Negative
Lactobacillus plantarum
1.03E+08
Negative
Negative
Streptococcus pneumoniae
4.5E+07
Negative
Negative
Streptococcus pyogenes
2.05E+08
Negative
Negative
Streptococcus salivarius
2.50E+06
Negative
Negative
Staphylococcus epidermidis
2.6E+07
Negative
Negative
Staphylococcus aureus
5.15E+08
Negative
Negative
Candida albicans
1.07E+06
Negative
Negative
Organism ID
Final Conc.
Pseudomonas aeruginosa
Analytical Specificity – Interfering Substances
The performance of Quidel Molecular Influenza A+B assay was evaluated with potentially interfering substances
that may be present in nasopharyngeal specimens. The potentially interfering substances were evaluated in
influenza A (A/Mexico/4108/2009), and influenza B (B/Florida/04/2006) at a concentrations of 3x and 10x LoD.
There was no evidence of interference caused by the substances tested below at with 3x or 10x LoD.
60 µg/mL
Influenza A
Result (3x LoD)
Positive
Influenza B
Result (3x LoD)
Positive
Blood (human), EDTA anticoagulated
2% (vol/vol)
Positive
Positive
Neo-Synephrine
15% (vol/vol)
Positive
Positive
Afrin Nasal Spray
15% (vol/vol)
Positive
Positive
Zicam Homeopathic Non-Drowsy Allergy
Relief No Drip Liquid Nasal Gel
5% (vol/vol)
Positive
Positive
15% (vol/vol) of dose
Positive
Positive
0.68g/mL; 1/18 drop,
crushed; active ingredients:
1.7 mg/mL menthol
Positive
Positive
3.3-5 mg/mL
Positive
Positive
4.0 µg/mL
Positive
Positive
Substance Name
Concentration Tested
Mucin (Bovine Submaxillary Gland, type I-S)
Saline Nasal Spray
Throat Lozenges
Zanamivir
Tobramycin
Page 28 of 31
Mupirocin
6.6-10 mg/mL
Influenza A
Result (3x LoD)
Positive
Oseltamivir phosphate
7.5-25 mg/mL
Positive
Substance Name
Concentration Tested
Influenza B
Result (3x LoD)
Positive
Positive
Carryover and Cross-contamination Studies
In an internal study there was no evidence of carry-over/cross contamination with the Quidel Molecular Influenza
A+B assay using the bioMériuex NucliSENS easyMAG automated nucleic acid extraction instrument.
Additional Source Material
1.
Guidance on Class II Special Controls Guidance Document: Reagents for Detection of Specific Novel Influenza A
Viruses (March 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
2. Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path (April
2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1594.pdf.
3. Guidance on Informed Consent for In Vitro Diagnostic Device Studies Leftover Human Specimens that are Not
Individually Identifiable (April 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
4. Draft Guidance on Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens (Dec
2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
5. CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations (Vol.
2, No. 34) (Oct 2004).
6. CLSI MM13-A: Guidance for the Collection, Transport, Preparation and Storage of Specimens for Molecular
Methods (Vol. 25, No. 31) (Dec 2005).
7. CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov 2005).
8. CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14) (Sept
2002).
9. CLSI MM6-A: Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, No.28) (Oct
2003).
10. CLSI EP5-A2: Guidance for Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods (Vol.
24, No. 25 Second Ed.) (Aug 2004).
Customer and Technical Support
To place an order or for technical support, please contact a Quidel Representative at (800) 874-1517 (toll-free in
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Intellectual Property
Trademarks
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trademark of Life Technologies. NucliSENS® and easyMAG® are registered trademarks of bioMerieux, Inc.
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registered trademarks of BioSearch Technologies, Inc.
Patents
Dye compounds in this product are sold under license from BioSearch Technologies, Inc. and protected by U.S. and
world-wide patents either issued or under application.
The purchase of this product grants the purchaser rights under certain Roche patents to use it solely for providing
human in vitro diagnostic services. No general patent or other license of any kind other than this specific right of
use from purchase is granted hereby.
Page 29 of 31
Glossary
Contents / Contains
Control
Consult instructions for use
Intended Use
96
Contains sufficient for 96 determinations
Page 30 of 31
References
1
http://1918.pandemicflu.gov accessed on 6/9/11.
2
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/.
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm accessed on 6/9/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A
[ISBN 1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898, USA 2006.
M100 – Quidel Molecular Influenza A+B Assay Kit
Quidel Corporation
Worldwide Headquarters
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 USA
quidel.com
M0002G (12/2012)
Page 31 of 31
Influenza A+B-analyse
Brugervejledning
Til kvalitativ påvisning og identifikation af influenza A og influenza B virale nukleinsyrer
ekstraheret fra nasale vatpindsprøver, nasopharyngeale vatpindsprøver og nasale
aspirat-/vask-prøver.
Quidel Molecular influenza A+B-analyse (CE)
Side 1 af 31
Indholdsfortegnelse
Tilsigtet anvendelse ...................................................................................................................................... 4
Sammendrag og forklaring............................................................................................................................ 4
Basis for fremgangsmåden ........................................................................................................................... 4
Medfølgende materialer ............................................................................................................................... 6
Eventuelle materialer.................................................................................................................................... 6
Påkrævede materialer, der ikke medfølger .................................................................................................. 6
Advarsler og forholdsregler .......................................................................................................................... 7
Opbevaring og håndtering af kitreagenser ................................................................................................... 7
Indsamling, opbevaring og håndtering af prøver ......................................................................................... 7
Opbevaring af nukleinsyreekstrakter............................................................................................................ 7
Programmeringsanvisninger til ekstraktion af nukleinsyre .......................................................................... 8
Indledende Thermocycler-programmering ................................................................................................ 10
Programmeringsanvisninger til SmartCycler II ....................................................................................... 10
Programmeringsanvisninger til 7500 Fast DX ......................................................................................... 12
Programmeringsanvisninger til Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR-instrumentet ... 15
Analyseprocedure ....................................................................................................................................... 15
Amplifikationsprotokol på SmartCycler II ............................................................................................... 16
Amplifikationsprotokol på 7500 Fast Dx Thermocycler .......................................................................... 16
Amplifikationsprotokol på QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrumentet ............................................. 17
Fortolkning af resultater ............................................................................................................................. 20
Fortolkning af resultater vha. SmartCycler II .......................................................................................... 18
Fortolkning af resultater vha. 7500 Fast Dx Thermocycler ..................................................................... 20
Fortolkning af resultater vha. QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrumentet ........................................ 19
Kvalitetskontrol ........................................................................................................................................... 20
Begrænsninger ............................................................................................................................................ 20
Klinisk ydeevne............................................................................................................................................ 20
Analytisk ydeevne ....................................................................................................................................... 23
Detektionsgrad............................................................................................................................................ 23
Side 2 af 31
Kompetitiv inhibering ................................................................................................................................. 24
Analytisk reaktivitet (inklusivitet) ............................................................................................................... 24
Reproducerbarhed ...................................................................................................................................... 26
Analytisk specificitet – Krydsreaktivitet ...................................................................................................... 26
Studier af overførsel og krydskontaminering ............................................................................................. 31
Yderligere kildemateriale ............................................................................................................................ 31
Kundesupport og teknisk supportafdeling.................................................................................................. 31
Intellektuel ejendom ................................................................................................................................... 31
Varemærker ................................................................................................................................................ 31
Terminologi ................................................................................................................................................. 30
Referencer................................................................................................................................................... 31
Side 3 af 31
Tilsigtet anvendelse
Quidel Molecular influenza A+B-analyse er en multipleks realtids RT-PCR-analyse til kvalitativ påvisning og
identifikation af influenza A og/eller influenza B virale nukleinsyrer ekstraheret fra nasale vatpindsprøver,
nasopharyngeale vatpindsprøver og næseaspirat-/vask-prøver. Denne in vitro diagnostiske test er beregnet til at
hjælpe med differentialdiagnosen for influenza A og/eller influenza B virale infektioner hos mennesker. Analysen
detekterer ikke tilstedeværelsen af influenza C-virus.
Negative resultater udelukker ikke influenzavirusinfektion og bør ikke anvendes som det eneste grundlag for
diagnose, behandling eller andre beslutninger om indgift. Ydelseskarakteristika for influenza A blev fastlagt, mens
influenza A/H3 og A/H1 var de dominerende influenza A-virustyper. Når andre influenza A-vira opstår, kan
ydelseskarakteristika variere.
Sammendrag og forklaring
Influenzavira (familien Orthomyxoviridae) indeholder et enkeltstrenget RNA-genom, som er til stede i 8 separate
segmenter af ribonukleoprotein. Denne segmentering af genomet forekommer sjældent for vira og bidrager
sandsynligvis til den hastige udvikling af nye influenzastammer gennem udveksling af gensegmenter, såfremt to
forskellige vira inficerer den samme celle. Der findes tre typer influenza, A, B og C. Type A har modstykker i fugle,
grise samt mennesker, mens type B eller C kun er fundet i mennesker. Grundet muligheden for endnu en pandemi
1
forårsaget af influenza A, som det skete i 1918, da mellem 30 og 50 millioner mennesker verden over døde , fører
Centers for Disease Control (CDC) og World Health Organization (WHO) tilsyn med influenzastammer og forsøger
at forudsige egnede stammer til fremstilling af vacciner.
Det anslås, at der i USA alene forekommer 30.000-49.000 dødsfald årligt som følge af influenza-associerede
2
sygdomme. På verdensplan resulterer årlige influenzaepidemier i omkring 3-5 millioner tilfælde af alvorlig sygdom
3
og ca. 250.000-500.000 dødsfald. Influenza A-pandemier opstår omtrent hvert 10. til 30. år, mens B- og Cepidemier forekommer årligt. Infektioner forekommer indenfor visse tider på året og strækker sig typisk fra
november til april på den nordlige halvkugle. Komplikationer forekommer sædvanligvis hos unge, ældre samt
personer med kroniske hjerte- eller lungesygdomme.
Inkubationstiden er 1-3 dage med hurtig spredning via inhalation, smådråber og smittespredende genstande. Det
er karakteriseret ved feber, myalgi, hovedpine og pharyngitis.
Basis for fremgangsmåden
Analysen opfanger virale nukleinsyrer, udvundet fra en patientprøve. En multipleks RT-PCR-reaktion i realtid
udføres i et enkelt rør og under optimerede betingelser, hvilket genererer amplikoner til den enkelte af de aktuelle
vira til stede i prøven. Identificering af influenza A sker ved anvendelse af målspecifikke primere samt en
fluorescens-mærket probe, som hybridiserer til en konserveret influenza A-sekvens i matrice-proteingenet.
Identificering af influenza B sker ved anvendelse af målspecifikke primere og fluorescens-mærkede prober, der
hybridiserer til en konserveret influenza B-sekvens i neuraminidase-genet.
Etiketter for Quidel Molecular probe
Retning
Farvning
Influenza A
FAM
Influenza B
Proces-kontrol (PRC)
Quasar® 670
Side 4 af 31
Det følgende er en opsummering af fremgangsmåden:
1.
Prøveindsamling: Anvend nasale og nasopharyngeale vatpindsprøver samt nasale aspirations-/vask-prøver i
henhold til standardprocedurer for symptomatiske patienter. Disse prøver skal transporteres, opbevares og
4
behandles i overensstemmelse med etablerede laboratorieprocedurer.
2.
Ekstraktion af nukleinsyre: Ekstraktion af nukleinsyrer fra prøverne vha. NucliSENS® easyMAG®-systemet skal
ske i overensstemmelse med producentens anvisninger og ved anvendelse af de passende reagenser (se
påkrævede materialer, der ikke medfølger). Anvendelsen af andre ekstraktionssystemer med Quidel
Molecular influenza A + B-analysen er ikke blevet valideret. Validering af disse andre systemer er på brugerens
eget ansvar.
Før ekstraktionsproceduren, tilsæt da 20 µL af proceskontrollen (PRC) til den enkelte 180 µL alikvot af prøven.
PRC'en har til formål at overvåge inhibitorer i de ekstraherede prøver, sikre, at tilstrækkelig amplifikation har
fundet sted, og bekræfter samtidig, at nukleinsyreekstraktionen var tilstrækkelig.
3.
Rehydrering af stamblanding: Rehydrér den lyofiliserede stamblanding vha. rehydreringsopløsningen.
Stamblandingen indeholder oligonukleotidprimere, fluorophor og quencher-mærkede prober rettet mod
konserverede regioner af influenza A- og influenza B-vira, såvel som proceskontrolsekvensen.
4.
Nukleinsyreamplifikation og detektion: Tilføj 15 µL af rehydreret stamblanding til hvert enkelt reagensrør
eller pladebrønd. Tilsæt derefter 5 µL nukleinsyre-ekstraktion (prøve med PRC) til hulpladen eller til det
TM
behørigt mærkede reagensrør. Placer pladen eller røret i enten Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time
PCR-instrumentet, Applied Biosystems® 7500 Fast Dx-instrumentet eller Cepheid® SmartCycler® IIinstrumentet. Analysen er blevet valideret i forbindelse med anvendelsen af 7500-serien af instrumenter.
Så snart reagensrøret eller pladebrønden tilføjes til instrumentet, igangsættes analyseprotokollen. Denne
protokol igangsætter en omvendt transskription af RNA-målene, hvilket genererer komplementært DNA, og
den efterfølgende amplifikation af mål-amplikonerne forekommer. Quidel Molecular influenza A+B-analysen
baserer sig på TaqMan®-kemi og anvender et enzym med revers transkriptase, DNA-polymerase og 5’-3’
exonuklease-aktiviteter. Under DNA-amplifikation spalter dette enzym proben bundet til den komplementære
DNA-sekvens og adskiller derved quencher-farvestoffet fra rapportørfarvestoffet. Dette trin frembringer en
stigning i det fluorescerende signal efter excitation med en lyskilde med passende bølgelængde. Ved hver
cyklus adskilles yderligere farvestofmolekyler fra deres quencher-farvestoffer, hvilket resulterer i ekstra signal.
Hvis tilstrækkelig fluorescens opnås efter 45 cyklusser, er prøven angivet som positiv for den detekterede
nukleinsyre.
Side 5 af 31
Medfølgende materialer
SKU # M100
Detektionssæt (96 reaktioner) – Opbevares ved 2 °C til 8 °C
#
Komponent
Antal


Rehydreringsopløsning Del M5003
1 hætteglas/sæt, 1,9 mL
Quidel Molecular influenza A+B stamblanding Del M5004
12 hætteglas/sæt,
8 reaktioner/hætteglas
Lyofiliseret indhold:
DNA-polymeraseenzym med revers transkriptase-aktivitet
Primere og prober
dNTPer
Stabilisatorer
Proceskontrol Del M5005
1 hætteglas/sæt, 2,0 mL
Eventuelle materialer
Positive kontroller for influenza A og B (dvs. Quidel Molecular influenza A+B-kontrolsæt #M106, hvilket tjener
som en ekstern behandlings- og ekstraktionskontrol)
Påkrævede materialer, der ikke medfølger
Mikropipetter (volumen på mellem 1-10 μL og 100-1.000 μL)
Ikke-aerosole pipettespidser
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR -instrumentet eller Applied Biosystems
7500 Fast Dx-instrumentet
Applied Biosystems 7500 Fast Dx 96, PCR-pladebrønd
Applied Biosystems optisk pladefilm
Pladecentrifuge til ABI 96 pladebrønd
Eller
Mikropipetter (volumen på mellem 1-10 μL og 100-1.000 μL)
Ikke-aerosole pipettespidser
SmartCycler® II
SmartCycler-engangsartikler
SmartCycler-centrifuge
Side 6 af 31
Advarsler og forholdsregler
Til in vitro diagnostisk anvendelse
Hvis der er mistanke om infektion med en ny type influenza A-virus på grundlag af aktuelle kliniske og
epidemiologiske screeningskriterier anbefalet af myndigheder inden for sundhedssektoren, skal prøverne
tages under hensyntagen til korrekte infektionskontrolregler gældende for nye virulente influenzavira og
sendes til den lokale sundhedsstyrelse til testning.
Denne tests ydelseskarakteristika er kun blevet etableret med prøvetyperne, der er angivet i afsnittet Tilsigtet
anvendelse. Ydelsen af denne analyse med andre prøvetyper eller prøver er ikke blevet evalueret.
Anvendelsen af ekstraktionssystemer ud over NucliSENS easyMAG-systemet er ikke blevet valideret.
Validering af disse systemer er slutbrugerens ansvar.
Hvis der anvendes andre cyklusforhold ud over dem, der er anført i programmeringsanvisningerne for
Thermocycler, kan det give fejlbehæftede resultater.
Anvendelse af dette produkt skal begrænses til personale med tilstrækkelig uddannelse i PCR- og RT-PCRteknikker.
Behandl alle prøver som muligt smittefarlige. Følg universelle forholdsregler, når der håndteres prøver, dette
kit og dets indhold.
Korrekt prøvetagning, -opbevaring og -transport er vigtig for at få korrekte resultater.
Opbevar analysereagenser som indikeret på deres individuelle mærkater.
Brug egnet beskyttelsestøj, handsker, øjen- og ansigtsværn, når dette kit anvendes.
Pipettér nøjagtigt med kalibreret udstyr for at opnå nøjagtige resultater.
Rengør og desinficér alle overflader omhyggeligt med en 10 % blegemiddelopløsning efterfulgt af vand af
molekylær kvalitet.
Anvend mikropipetter med en aerosolbarriere eller positive forskydningsspidser til alle procedurer.
Undgå, at kitreagenserne udsættes for mikrobiel og krydskontaminering. Anvend god laboratoriepraksis.
Bland ikke reagenser fra kit med forskellige partinumre.
Anvend ikke reagenser fra andre producenter sammen med dette kit.
Produktet må ikke anvendes efter udløbsdatoen.
Korrekt planlægning af arbejdsgang er vigtig for at minimere risikoen for kontaminering. Planlæg altid
laboratoriets arbejdsgang ensrettet, hvor der begyndes med præ-amplifikation og derefter fortsættes med
amplifikation og påvisning.
Anvend dedikerede materialer og udstyr i præ-amplifikations- og amplifikationsområder.
Tillad ikke krydsbevægelse af personale eller udstyr mellem områderne.
Hold altid amplifikationsmaterialerne adskilt fra præ-amplifikationsmaterialerne.
Prøverør eller -plader må ikke åbnes efter amplifikation.
Bortskaf amplificeret materiale forsigtigt og i henhold til lokale love og bestemmelser for at minimere risikoen
for amplikonkontaminering.
Anvend ikke materialer, der er dedikeret til reagens- eller prøveklargøring til behandling af målnukleinsyre.
Datasikkerhedsbladet for materialet kan fås efter anmodning eller kan ses på produktets webside.
Opbevaring og håndtering af kitreagenser
Opbevar det uåbnede kit ved 2 °C til 8 °C indtil udløbsdatoen, der er angivet på den udvendige kitboks.
Den rehydrerede stamblanding kan opbevares ved stuetemperatur (20 °C til 25 °C) i op til 24 timer. Ved
opbevaring i længere tid skal den rehydrerede stamblanding lukkes med hætte igen, forsegles med parafilm
og opbevares opretstående ved ≤ -20 °C i op til 14 dage. Beskyt stamblandingen mod lys under opbevaring.
Indikationer på reagensers ustabilitet eller forringelse: Hvis rehydreringsopløsningen er uklar, kan det indikere
forringelse af dette reagens. Kontakt Quidels tekniske support for at få et nyt produkt.
Indsamling, opbevaring og håndtering af prøver
Prøver anvendt til validering af Quidel Molecular influenza A+B-analysen blev opnået fra patienter med symptomer
på infektion af de øvre luftveje ved anvendelse af standardteknikker. Disse prøver blev indsamlet, transporteret,
opbevaret og behandlet i overensstemmelse med CLSI M41-A.
Opbevaring af nukleinsyreekstrakter
Brugerne er ansvarlige for validering af opbevaringsprocedurerne og -betingelserne, der er gældende i deres
laboratorium. Eluater kan typisk opbevares ved stuetemperatur (20 °C til 25 °C) i 2 timer ved 2-8 °C i 8 timer og 1
Side 7 af 31
måned ved -20 °C til -70 °C. Opbevaring af mindre mængder nukleinsyreekstrakt (f.eks. 5 μl eller mindre) anbefales
ikke.
Programmeringsanvisninger til ekstraktion af nukleinsyre
1.
Tænd for instrumentet og vent på, at instrumentets lys bliver orange. Tænd så for computeren/start
easyMAG-softwaren.
2.
Sæt stregkode på reagenserne, når du har trykket på knapperne ‘Instrument’
og ‘Reagensbeholdning’
.
3.
For at indtaste prøver skal du trykke på knappen ’Daglig brug’
’Definer anmodning’
a. Prøve-id:
b. Matrice:
c. Anmodning:
d. Volumen (ml):
e. Eluat (µl):
f. Type:
g. Prioritet:
4.
, som vil vende tilbage til skærmen
. Vælg de følgende indstillinger:
Indtast prøvenavnet med tastaturet.
Vælg Andet fra rullemenuen
Vælg Generisk fra rullemenuen
Vælg 0,200 fra rullemenuen
Vælg 50 fra rullemenuen
Primær
Normal
Når du trykker på knappen ‘Gem’
, vil prøven komme til syne i vinduet ‘Ikke tildelt prøve’ i venstre side
af skærmen. Tryk på knappen ‘Indtast ny ekstraktionsanmodning’
, og gentag processen for yderligere
prøver. Ellers kan multiple prøver indtastes ved at trykke på knappen ‘Automatisk oprettelse af nye
ekstraktionsanmodninger’
5.
.
Gå til ‘Organiser kørsler’ ved at klikke på ikonet
kørsel ved at trykke på knappen ‘Opret kørsel’
6.
øverst på siden, når alle prøver er oprettet. Opret en
. Indtast et kørselsnavn eller brug standarden.
Tilføj prøver til kørslen vha. knappen ‘Automatisk påfyldningskørsel’
(påfylder automatisk op til 24
prøver fra ’Liste over utildelte prøver i venstre side af skærmen). Ellers kan individuelle prøver flyttes ind og ud
af kørslen vha. venstre og højre ’Positioneringsikoner’
7.
8.
efter valg af den relevante prøve.
Prøverækkefølgen i kørslen kan ændres vha. knapperne ‘Flyt ekstraktionsanmodning op/ned’
.
Tag 1 til 3 (for henholdsvis 8 og 24 prøver) prøvebeholder(e), og tilsæt 20 µl proceskontrol til hver prøvebrønd,
der anvendes.
Tilsæt 180 µl af hver prøve til den relevante brønd som tildelt.
9.
Gå til knappen ‘Isæt kørsel’
næsten øverst på skærmen. Sæt spidser og prøvebeholder(e) i
instrumentet.
10. Indtast stregkode(r) for prøvebeholder(e).
11. Indtast stregkode(r) for de silicaperler, der skal anvendes.
12. Tildel silicaperler til prøver som følger:
Side 8 af 31
a.
b.
c.
d.
Klik på reagenssymbolet under nummer 1 på billedet nedenfor. Silicaperlernes partinummer bør
komme til syne under silicafanen ved nummer 2 i billedet nedenfor.
Fremhæv og vælg de prøver i kørslen, der skal tildeles perler til (i boksen med nummer 3 på billedet
nedenfor).
Klik på positioneringsikonet
(under nummer 4 på billedet nedenfor) for at tildele
silicapartinummeret til de valgte prøver.
Hvis perlesymbolet til højre for nummer 5 på billedet nedenfor er valgt, bør silicaperlepartinummeret
vises for hver prøve.
13. Udskriv arbejdsliste ved at berøre ikonet ‘Isæt kørsel’ og derefter trykke på ikonet ‘Udskriv arbejdsliste’
.
14. Tryk på knappen ‘Dosér lyse’
. Det tager ca. 12 minutter at udføre lyseringen.
15. For hver prøvebeholder klargøres de magnetiske partikler vha. Biohit-pipetten og spidser til op til otte
reaktioner som følger:
a. Vha. 1 spids og Program 1 aspireres 550 µl nukleasefrit vand, som doseres i et 1,5 ml DNAse/RNAsefrit mikrofugeglasrør.
b. Det magnetiske silica hvirvles rundt. Vha. 1 spids og Program 1 aspireres 550 µl magnetisk silica, som
doseres i vandet og blandes ved at blive hvirvlet rundt.
c. Vha. 1 spids og Program 2 aspireres 1050 µl af den magnetiske silicablanding, og der doseres 25 µl
tilbage i samme rør.
d. Dosér 125 µl magnetisk silicablanding 8 gange i 8 brønde på en ELISA-strimmelplade.
Bortskaf spidsen.
e. Når lysen er færdig (NB: ‘Instrumentstatus’ nederst på skærmen skal være ‘LEDIG’!), anvendes 8
spidser og Program 3, og 100 µl magnetisk silicablanding aspireres i strimmelbrønde. Der doseres 100
µl magnetisk silicablanding i strimmelbrønde, og der aspireres 100 µl magnetisk silicablanding i
strimmelbrønde.
f. Sæt spidserne i væsken i prøvebeholderne. Aspirér først 800 µl og dernæst 900 µl magnetisk
silicablanding tilbage i beholderen. Aspirér 1000 µl magnetisk silicablanding fra beholderen, og
dosér 1000 µl magnetisk silica tilbage i beholderen. Gentag aspiration/dosering af 1000 µl
yderligere to gange.
16. Luk instrumentet, og tryk på knappen ‘Start’
for at begynde kørslen.
17. Når kørslen er færdig, overføres den oprensede nukleinsyre til nukleasefri glasrør. Anvend oprensede
nukleinsyrer straks eller frys dem ved -70 °C.
Side 9 af 31
Begrænsninger: Den følgende protokol blev udviklet til anvendelse specifikt sammen med denne analyse. Dens
egnethed til andre analyser er ukendt. Tjek med bioMérieux S.A. for at sikre, at softwaren er kompatibel.
Indledende Thermocycler-programmering
Programmeringsanvisninger til SmartCycler II
1.
2.
Start SmartCycler Dx, version 3.0b-softwarepakken
Opret Quidel Molecular influenza A+B-analysen
a. Vælg knappen Definer analyser øverst på skærmen
b. Giv analysen et navn
i. Vælg knappen Ny nederst i det venstre hjørne af skærmen
ii. Indtast ‘Quidel Molecular influenza A+B’, og vælg dernæst OK
iii. ‘Quidel Molecular influenza A+B’ vil så blive tilføjet øverst på Analysenavnelisten, der befinder sig
i øverste venstre hjørne af skærmen
c. Indstil analyseværdierne: Under afsnittet Analysetype: Forskning vælges fanen Analyseindstillinger, og
der sørges for, at de følgende specifikationer er indstillet:
i. Vælg FATA25 fra rullemenuen Farvesæt
ii. Rullemenuen Analysetype skal indstilles til Kvalitativ (standardindstillingen)
iii. I kolonnen Kanalnavn indtastes ‘Influenza A’ for FAM, ‘Influenza B’ for Alx532 og ‘PRC’ for Alx647
iv. I kolonnen Anvendelse vælges Mål fra rullemenuerne for Influenza A og Influenza B, og der vælges
Intern kontrol for PRC. Når Intern kontrol vælges, popper der et vindue op med advarsel. Vælg
knappen Ja.
v. I kolonnen Kurveanalyse indtastes Primær kurve for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
(standardindstilling).
vi. I kolonnen Tærskelindstilling indtastes Manuel tærskel for hver kanal (Influenza A, Influenza B,
PRC) (standardindstilling).
vii. I kolonnen Manuelle tærskelfluorenheder indtastes de følgende tærskler
a. Influenza A:
20,0
b. Influenza B:
20,0
c. PRC:
20,0
viii. I kolonnen Gyldig min. cyklus indtastes 10 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC).
ix. I kolonnen Gyldig maks. cyklus indtastes 45 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC).
x. I kolonnen Baggr. sub anvendes ’TÆNDT’ for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
xi. I kolonnen Baggr. min. cyklus indtastes 5 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
xii. I kolonnen Baggr. maks. cyklus indtastes 45 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC).
xiii. I kolonnen Boxcar gns. cykler bevares 0 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
xiv. I kolonnen Slut deltærskel indtastes 20 for hver kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
xv. I kolonnen NC IC % bevares ’Ikke relevant’ for hver kanal (PRC) (standardindstilling).
xvi. I kolonnen IC Delta bevares ’Ikke relevant’ for hver kanal (Influenza A, Influenza B)
Side 10 af 31
xvii. I afsnittet Tilpas resultattekst vælges Organismebaseret resultattekst fra rullemenuen. Et vindue
vil poppe op med advarslen nedenfor. Vælg Ja.
xviii. Vælg knappen Tilpas for at åbne dialogboksen Organismebaseret resultattekst. Vælg knappen
Tilføj, indtast ‘Influenza A’ i kolonnen Organismenavn, og afkryds feltet Influenza A. Vælg knappen
Tilføj igen, indtast 'Influenza B' i kolonnen Organismenavn, og afkryds feltet Influenza B.
d.
Klik på OK nederst i pop-op-vinduet.
Indstil RT-PCR-cyklustider og -temperaturer nederst på skærmen som følger:
i. Trin 1
1. Hold
2. Temp:
55,0
3. Sek.:
300
4. Optik:
Slukket
ii. Trin 2
1. Hold
2. Temp:
60,0
3. Sek.:
300
4. Optik:
Slukket
iii. Trin 3
1. Hold
2. Temp:
65,0
3. Sek.:
300
4. Optik:
Slukket
iv. Trin 4
1. 2-temperaturcyklus
2. Gange det skal gentages:
50
3. Første temperaturrække:
a. Temp:
92,0
b. Sek.:
5
c. Optik:
Slukket
4. Anden temperaturrække
a. Temp:
57,0
b. Sek.:
40
c. Optik:
Tændt
Side 11 af 31
3.
Gem protokollen ved at vælge knappen Gem nederst på skærmen.
Figur over den fuldstændige Quidel Molecular influenza A+B-protokol
Quidel Molecular influenza A+B
Begrænsninger: Den følgende protokol blev udviklet til brug sammen med Quidel Molecular influenza A+B realtids
RT-PCR-analyse specifikt. Dens egnethed til andre analyser er ukendt. Tjek med Cepheid for at sikre, at softwaren
er kompatibel.
Programmeringsanvisninger til 7500 Fast DX
1.
2.
Start softwarepakken 7500 Fast Dx.
Dialogvinduet Dokument til hurtig start vil åbne. Vælg knappen Opret nyt dokument for at starte Guiden til
nyt dokument. Følg hvert trin for at påbegynde Quidel Molecular influenza A+B-protokollen.
a. Definer dokumentet: Det meste af det følgende skal være standardindstillingen. Hvis ikke, ændres
dette i henhold hertil.
i. Bekræft eller indtast den følgende information.
b.
Analyse:
Standardkurve (absolut kvantificering)
Beholder:
96-brønd, klar
Skabelon:
Blankt dokument
Kørselstilstand:
Fast 7500
Operatør:
Dit operatørnavn
Bemærkninger:
SDS v1.4 (tilføj flere, om nødvendigt)
Pladens navn:
‘Quidel Molecular influenza A+B’
ii. Vælg knappen Næste.
Vælg detektorer: Der skal tilføjes nye detektorer for influenza A, influenza B og proceskontrollen
(PRC). For hvert mål vælges knappen Ny detektor for at åbne pop-op-vinduet Ny detektor. Ellers
anvendes knappen Opret en ny fra pop-op-vinduet Ny detektor for de sidste to detektorer.
i. Indtast den følgende information for hver detektor.
Navn
Rapportørfarve Quencher-farve
Influenza A
FAM
(ingen)
Influenza B
JOE
(ingen)
PRC
Cy5
(ingen)
Farve
(vælg)
(vælg)
(vælg)
ii. Vælg en unik farve, der skal repræsentere hver detektor.
iii. Fremhæv de nye detektorer, og tilføj til kolonnen Detektorer i dokument vha. knappen
Tilføj.
iv. Vælg (ingen) fra rullemenuen Passiv reference.
Side 12 af 31
c.
d.
v. Vælg knappen Næste.
vi. Vælg knappen Færdig uden at indstille nogen brønde.
Guiden vil lukke, og softwaren vil åbne og starte med fanen Opsætning. Dette vil vise prøvepladen,
der blev opsat under hurtigstarten. For den indledende opsætning er der intet, der skal ændres her.
Definition af Thermocycler-protokollen: Vælg fanen Instrument for at indstille Quidel Molecular
influenza A+B RT-PCR-cyklustiderne og temperaturerne. Under Thermal-profil skal der være en 2trins-standardprotokol. Hvert trin vil have 3 brugerredigerbare tekstbokse. Den øverste boksværdi
repræsenterer antallet af gentagelser eller cykler for det trin. Den mellemste boksværdi
repræsenterer temperaturen (˚C), og den laveste boksværdi repræsenterer tiden (minutter:
sekunder).
i. Foretag de følgende ændringer til standardindstillingen Thermalcycler-protokol:
1. Trin 1
a. Gent:
1
b. Temp:
55
c. Tidspunkt: 5:00
2. Vælg bjælken mellem trin 1 og 2. Vælg knappen Tilføj Hold for at tilføje endnu et
trin.
3. Trin 2
a. Gent:
1
b. Temp:
60
c. Tidspunkt: 5:00
4. Vælg bjælken mellem trin 2 og 3. Vælg knappen Tilføj Hold for at tilføje endnu et
trin.
5. Trin 3
a. Gent:
1
b. Temp:
65
c. Tidspunkt: 5:00
6. Trin 4 (2-trin dissociationstrin)
a. Gent: 10
b. Trin 1
i. Temp:
92
ii. Tidspunkt: 0:05
c. Trin 2
i. Temp:
57
ii. Tidspunkt: 0:40
7. Vælg bjælken til højre for trin 4. Vælg knappen Tilføj cyklus for at tilføje endnu et
trin.
Side 13 af 31
8.
Trin 5 (2-trin dissociationstrin)
a. Gent: 35
b. Trin 1
i. Temp:
92
ii. Tidspunkt: 0:05
c. Trin 2
i. Temp:
57
ii. Tidspunkt: 0:40
9. Hvis et forkert trin tilføjes, kan trinnet fjernes ved at trykke på knappen Slet efter at
have fremhævet trinnet mellem de lodrette linjer.
ii. Under Indstillinger indtastes det følgende:
Prøvevolumen (μL):
20 (standard)
Kørselstilstand:
7500 Fast (standard)
Dataindsamling:
Trin 5, trin 2 (57,0 ved 0:40)
BEMÆRK: Afkryds ikke feltet ved siden af ’Eksperttilstand’.
iii. Endelig protokol
e.
Sæt tærsklen for hver analyt.
i. Vælg fanen Resultater.
ii. Vælg fanen Amplikationsplot.
iii. Vælg influenza A fra fanen Detektor i øverste højre hjørne.
iv. I gruppen Analyseindstillinger indstilles Tærskel til 1.5e5.
v. Vælg radioknappen Automatisk baseline.
vi. Gentag iii-v for influenza B, og indstil Tærskel til 1.2e5.
vii. Gentag iii-v for PRC, og indstil Tærskel til 2.7e4.
Side 14 af 31
f.
g.
Gem den nye protokol som en skabelon til senere brug.
i. Øverst på skærmen vælges Fil og dernæst Gem som.
ii. Gem i: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Filnavn: ‘Quidel Molecular influenza A+B’
iv. Gem som type: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Gå ud af softwaren.
Begrænsninger: Den følgende protokol blev udviklet til anvendelse med dette specifikt. Dens egnethed til andre
analyser er ukendt. Tjek med Life Technologies for at sikre, at softwaren er kompatibel.
Programmeringsanvisninger til Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR-instrumentet
Programmeringen af instrumentet udføres vha. TDD-filen, som følger med testsættet.
Analyseprocedure
Kør de følgende procedurer ved kontrolleret stuetemperatur på 20 °C til 25 °C.
Procedure til ekstraktion af nukleinsyre
Se programmeringsanvisningerne til NucliSENS easyMAG-systemet ovenfor.
1. Tilsæt 20 µl proceskontrol til prøveekstraktionsbrønden.
2. Tilsæt 180 µl patientprøve eller ekstern kontrol til en prøveekstraktionsbrønd.
3. Følg ekstraktionsvejledningen ifølge producentens anvisninger.
Procedure til rehydrering af stamblanding
1. Bestem antallet af prøver, der skal testes, og tag det korrekte antal otte-test lyofiliserede
stamblandingshætteglas til testning.
2. Sæt ubrugte reagenser tilbage under korrekte opbevaringsforhold.
3. Åbn forsigtigt for stamblandingen for at undgå forstyrrelse af pellet.
4. Tilsæt 135 µl rehydreringsopløsning til stamblandingen.
5. Anbring hætteglasset ved stuetemperatur i 1-2 minutter for at muliggøre rehydrering af pellet.
6. Pipettér forsigtigt op og ned 2-3 gange (undgå dannelse af bobler), før det tilsættes det første PCR-rør
eller pladebrønd.
Bemærk: Den rehydrerede stamblanding er tilstrækkelig til otte reaktioner.
Bemærk: Den rehydrerede stamblanding kan opbevares ved stuetemperatur i op til 24 timer eller
ved ≤ -20 °C i op til 2 uger. (Se afsnittet “Opbevaring og håndtering af kitreagenser” for
yderligere opbevaringsmuligheder)
Side 15 af 31
Proceduren til RT-PCR-opsætning
1. Tilføj 15 µL af rehydreret stamblanding til hvert enkelt reagensrør eller pladebrønd.
2. Tilsæt 5 µl ekstraheret nukleinsyre (prøve med proceskontrol) i reagensrør eller pladebrønde. Det er ikke
nødvendigt at blande reagenserne.
Bemærk: Anvend en ny mikropipette med en non-aerosol-spids til hver ekstraheret prøve.
3. Luk reagensrørene, eller forsegl pladen.
Bemærk: Quidel foreslår, at hver Thermocycler-kørsel skal omfatte et reagensrør eller en brønd med en
influenza A/influenza B ekstern positiv og negativ kontrol. Kør kontroller i henhold til dit laboratoriums
praksisser og retningslinjer.
4. Centrifugér reagensrørene eller pladen i mindst 15 sekunder. Sørg for, at al væske befinder sig i bunden af
røret.
5. Isæt rør eller plade i Thermocycler.
Amplifikationsprotokol på SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Tænd for SmartCycler-blokken(e).
Start SmartCycler Dx, version 3.0b-softwarepakken.
Vælg knappen Opret kørsel øverst på skærmen for at opsætte kørslen.
Under Kørselsnavn indtastes navnet på den aktuelle kørsel (DDMMÅÅ-Quidel Molecular influenza A+B).
Under Bemærkninger indtastes eventuelle bemærkninger om kørslen til senere brug.
Under Analyse vælges analysen ‘Quidel Molecular influenza A+B’ fra rullemenuen.
Under Analyseinformation indtastes kittets partinummer og udløbsdato.
For at kunne vælge de brønde, der vil blive anvendt, gøres et af følgende:
a. For automatisk at tildele brønde gøres følgende:
i. Under Antal prøver indtastes antallet af prøver i den pågældende tekstboks.
ii. Vælg knappen Anvend. Det indtastede antal rækker vil komme til syne i Sitetabel.
b. For manuelt at lukke brøndene på SmartCycler-blokkene gøres følgende:
i. Vælg knappen Tilføj/fjern sites næsten nederst på skærmen.
ii. Dette vil åbne pop-op-vinduet Vælg sites med to kolonner. Kolonnen til venstre (Sites) angiver
alle tilgængelige sites, og kolonnen til højre (Valg) indeholder alle valgte sites.
iii. For at vælge alle sites klikkes der på knappen Vælg alle sites.
iv. For at vælge specifikke sites fremhæves en eller flere sites, og højre pil vælges for at tilføje sites
til kolonnen Valg.
v. Vælg knappen OK for at lukke vinduet. De valgte sites vil komme til syne i Sitetabel.
Indtast prøveidentifikatorerne under kolonnen Prøve-id i Sitetabel (dette kan også gøres, når kørslen er
startet).
Indtast eventuelle bemærkninger under kolonnen Bemærkninger, og efterlad indtastningerne i kolonnen
Prøvetype som ‘SPEC’.
Vælg knappen Start kørsel nederst på skærmen.
Vælg knappen Vis resultater for at se kørslens fremskridt.
Gem kørslen, når den er færdig, og før du afslutter softwaren.
Amplifikationsprotokol på 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
Tænd for 7500 Fast Dx.
Start softwarepakken 7500 Fast Dx.
Dialogvinduet Dokument til hurtig start vil åbne.
Klik på Opret nyt dokument.
Det meste af det følgende skal være standardindstillingen. Hvis ikke, ændres dette i henhold hertil.
Side 16 af 31
6.
7.
8.
Analyse:
Standardkurve (absolut kvantificering)
Beholder:
96-brønd, klar
Skabelon:
Quidel Molecular influenza A+B
Kørselstilstand:
Fast 7500
Operatør:
Dit operatørnavn
Bemærkninger:
SDS v1.4 (tilføj flere, om nødvendigt)
Pladens navn:
DDMMÅÅ-Quidel Molecular influenza A+B
Opsætning af prøveplade
a. Under fanerne Opsætning og Plade vil pladeopsætningen komme til syne.
b. Vælg alle brønde, der skal indeholde prøven; højreklik og vælg Brøndkontrollant fra rullemenuen.
Når pop-op-vinduet Brøndkontrollant åbnes, vælges detektorer til influenza A, influenza B og PRC.
c. Anvend Brøndkontrollant til at indtaste prøvenavnene. Patient-id’er kan indtastes i vinduet
’Brøndkontrollant’. Det anbefales imidlertid, at dette gøres før resuspendering af den lyofiliserede
stamblanding, efter kørsel eller ved at bruge importfunktionen til at minimere den tid, som PCRreaktionerne skal stå ved stuetemperatur før start af kørsel.
d. Gem kørslen som DDMMÅÅ-Quidel Molecular influenza A + B.sds.
e. Der åbnes et vindue, hvor der spørges efter ’Årsag til ændring af indtastning’. Indtast ’Opsætning’ og
andre relevante bemærkninger til kørslen.
Start af PCR
a. Vælg fanen Instrument.
b. Sæt PCR-pladen med 96 brønde ind i maskinen.
c. Under Instrumentkontrol vælges knappen Start for at starte kørslen.
Efter PCR
a. VIGTIGT: Tryk på OK, når kørslen er færdig. Analysér dataene ved at trykke på knappen ’Analysér’ i
menuen foroven, og gem filen.
b. Gem filen ved at trykke på Gem dokument på værktøjslinjen. Der åbnes et vindue, hvor der spørges
efter ’Årsag til ændring af indtastning’. Indtast ’Opsætning’ og andre relevante bemærkninger til
kørslen.
Amplifikationsprotokol på QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrumentet
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Tænd for QuantStudio Dx.
Vælg IVD-tilstanden på instrumentet.
Start QuantStudio Dx IVD-softwarepakken.
Indtast systemets Brugernavn og Adgangskode, når du bliver bedt herom.
Vinduet Startskærm åbnes.
I feltet Opsætning markeres det tidligere hentede testnavn ’Quidel Molecular influenza A + B-analyse’.
Klik på knappen Opsætning for at starte en kørsel.
Skærmen Opsætning, testegenskaber vises. Indtast de nødvendige kørselsoplysninger.
a. Indtast Eksperimentnavnet (standardindstillingerne starter kørslen med et tids- og datostempel).
b. Indtast oplysningerne for Pladens stregkode.
c. Angiv materialets batchnumre under Oplysninger om reagens.
d. Gem kørslen som DDMMÅÅ-Quidel Molecular influenza A + B.sds.
e. Der åbnes et vindue, hvor der spørges efter ’Årsag til ændring af indtastning’. Indtast ’Opsætning’ og
andre relevante bemærkninger til kørslen.
9. I venstre menulinje skal du vælge Definer.
10. Rediger prøveoplysninger.
a. Indtast specifikke prøveoplysninger for hvert hul ved at slette standardidentifikator (Patient 1, Patient
2 osv.) og indtaste de nye oplysninger, ELLER
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b.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Vælg Importér fra fil øverst oppe på displayet for at uploade et foruddefineret pladekort fra en
tekstfil (TAB-afgrænset).
I venstre menulinje vælges Tildel for at verificere korrekt pladeopsætning.
Hent prøveplade.
a. Skub instrumentbakken ud.
b. Isæt PCR-pladen med 96 huller i maskinen med A1-hullet placeret i øverste venstre hjørne.
c. Skub instrumentbakken tilbage.
Kørselsstart.
a. I venstre menulinje skal du vælge Kør.
b. Klik på den grønne knap Start kørsel øverst på skærmen.
i. Hvis du bliver bedt herom, skal du vælge det specifikke serienummer for det instrument,
der benyttes.
Når kørslen er færdig, skal du vælge Analyse i venstre menulinje.
a. Gem filen ved at trykke på Gem i proceslinjen. Der åbnes et vindue, hvor der spørges efter ’Årsag til
ændring af indtastning’. Indtast ’Opsætning’ og andre relevante bemærkninger til kørslen.
b. Forstørrelsesplot vises som standard. Du kan få vist andre plottyper ved at vælge dem fra venstre
menulinje.
c. Du kan få vist kørselsoplysninger med Ct-værdier ved at vælge fanen Hultabel i skærmens højre side.
Udskrivning af rapport.
a. I den øverste menulinje vælger du Udskriv rapport. Du kan tilpasse rapportens indhold ved at vælge
eller fravælge felterne i rapportvinduet.
b. Vælg knappen ’Udskriv rapport’ nederst i dialogboksen.
Eksport af datafiler.
a. I venstre menulinje skal du vælge Eksportér.
b. Indtast Placering af eksportfil, ELLER klik på Gennemse for at finde den ønskede sti.
c. Navn på eksportfil får som standard navnet på den gemte kørsel.
d. Vælg Excel som filtype.
e. Tilpas den eksporterede datarapport ved at skifte mellem de eksisterende faner og ved at vælge eller
fravælge indstillinger.
f. Vælg Start eksport nederst på skærmen.
Fortolkning af resultater
Fortolkning af resultater vha. SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Vælg fanen Vis resultater, når kørslen er færdig.
Vælg fanen Prøveresultater.
SmartCycler-softwaren vil automatisk fortælle, om prøverne er influenza-positive eller negative, eller om
kørslen var ugyldig (uafklaret).
Flere udførlige oplysninger er at finde under de respektive faner for hver analyt i samme vindue. Hvis der
er en positiv melding om enten influenza A eller B (eller begge), gælder PRC-resultatet ikke. PRC er kun
påkrævet ved negative meldinger.
Side 18 af 31
Fortolkning af Quidel Molecular influenza A+B-analysens udskrevne resultater på SmartCycler II
Analyseresultat
Resultat af
proceskontrol
Influenza A
Influenza B
Negativ
Bestået
NEG
NEG
Influenza A positiv
Ikke relevant*
POS
NEG
Influenza A eller influenza B nukleinsyre ikke
detekteret; PRC detekteret
Influenza A nukleinsyre detekteret
Influenza B positiv
Ikke relevant*
NEG
POS
Influenza B nukleinsyre detekteret
Influenza A og B
positive
Ikke relevant*
Influenza A og influenza B nukleinsyre
detekteret
Uafklarede – PCR-hæmning eller reagensfejl.
Ugyldig
Mislykket
NEG
NEG
Gentag testningen fra den oprensede
nukleinsyre, eller tag og test en ny prøve.
*Ingen værdi er påkrævet for, at proceskontrollen kan give en positiv melding.
POS
POS
Fejlkode 3079: Der kan observeres en advarsel/fejlkode 3079 med influenza A og influenza B positive prøver.
Advarsel/fejlkode 3079 opstår, når fluorescenssignalet (RFU-signalet) er for højt. Hvis det er tilfældet, rapporteres
alle resultater for denne prøve af Dx-softwaren som ’Ikke bestemt’. Hvis en Ct-værdi ≥ 10 eller ≤ 45 rapporteres for
influenza A eller influenza B, kan prøveresultaterne registreres som POS for influenza A eller influenza B.
Fortolkning af resultater vha. 7500 Fast Dx Thermocycler
Fortolkning af Quidel Molecular influenza A+B analyseresultater på 7500 Fast Dx Thermocycler
Analyseresultat
Detektor:
Influenza A
Detektor:
Influenza B
Detektor:
Proceskontrol
Negativ
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Ingen influenza A eller influenza B
nukleinsyre detekteret; PRC
detekteret
Influenza A positiv
5,0 ≤ Ct ≤ 35,
0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ikke relevant*
Influenza B positiv
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Ikke relevant*
Influenza A og B
positive
5,0 ≤ Ct ≤ 35,
0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Ikke relevant*
Influenza A og influenza B
nukleinsyre detekteret
Ingen influenza A eller influenza B og
PRC-nukleinsyre påvist - ugyldig test,
Ugyldig
kør test igen eller foretag ny
ekstraktion
Ikke bestemt - kør test igen eller
Ugyldig
Ikke bestemt
Ikke bestemt
Ikke bestemt
foretag ny ekstraktion
*Ingen Ct-værdi er påkrævet for, at proceskontrollen kan give en positiv melding.
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Fortolkning af resultater vha. QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrumentet
Fortolkning af Quidel Molecular influenza A+B analyseresultater på QuantStudio Dx Real-Time PCRinstrument
Analyseresultat
Negativ
Influenza A
Detektor:
Influenza A
Detektor:
Influenza B
Detektor:
Proceskontrol
Ingen Ct vist
(blank)
Ingen Ct vist
(blank)
Ct ≤ 40,0
Ct ≤ 40,0
Ingen Ct vist
Ikke relevant*
Ingen influenza A eller influenza B
nukleinsyre detekteret; PRC
detekteret
Side 19 af 31
Fortolkning af Quidel Molecular influenza A+B analyseresultater på QuantStudio Dx Real-Time PCRinstrument
Analyseresultat
positiv
Influenza B
positiv
Influenza A og B
positive
Detektor:
Influenza A
Ingen Ct vist
(blank)
Detektor:
Influenza B
(blank)
Detektor:
Proceskontrol
Ct ≤ 40,0
Ikke relevant*
Influenza A og influenza B
nukleinsyre detekteret
Ingen influenza A eller influenza B og
Ingen Ct vist
Ingen Ct vist
Ingen Ct vist
PRC-nukleinsyre påvist - ugyldig test,
Ugyldig
(blank)
(blank)
(blank)
kør test igen eller foretag ny
ekstraktion
*Ingen Ct-værdi er påkrævet for, at proceskontrollen kan give en positiv melding.
Ct ≤ 40,0
Ct ≤ 40,0
Ikke relevant*
Kvalitetskontrol
Quidel Molecular influenza A+B-analyse har adskillige kontroller indbygget til at overvåge analysepræstationen.
1.
2.
3.
Proceskontrollen skal anvendes under ekstraktion og amplifikation i analysen. Denne kontrol skal tilsættes til
hver prøvealikvot før ekstraktion.
Kommercielt tilgængelige eksterne positive influenza A/B-kontroller kan behandles som en patientprøve og
skal anvendes i henhold til dit laboratoriums standarder. Tidligere karakteriserede positive influenza A- eller
influenza B-prøver kan anvendes i stedet for en kommerciel influenza A/B-kontrol.
Virustransportmedie eller tidligere karakteriseret negativ prøve kan anvendes som en ekstern negativ kontrol.
Dette skal behandles som en patientprøve og udføres i henhold til aktuelle laboratoriestandarder.
Begrænsninger
Denne test er ikke beregnet til at differentiere influenza A-subtyper, såsom den nye influenza A H1N1.
Yderligere testning er påkrævet, hvis subtypedifferentiering er påkrævet.
Negative resultater udelukker ikke infektion med influenzavirus og må ikke være det eneste grundlag for en
behandlingsbeslutning.
Som det er tilfældet med andre analyser af denne type, er der risiko for falsk negative resultater pga.
tilstedeværelsen af sekvensvarianter i det virale mål.
Ukorrekt prøvetagning, opbevaring eller transport kan føre til falsk negative resultater.
Inhibitorer til stede i prøven og/eller fejl i at følge analyseproceduren kan føre til falsk negative resultater.
Klinisk ydeevne
Ydelseskarakteristika for Quidel Molecular influenza A+B-analysen etableredes i løbet af et prospektivt studie
under den respiratoriske virussæson (januar til marts) i 2011. Prøverne, der blev anvendt til dette studie, var
nasale og nasopharyngeale vatpindsprøver, der indsamledes med henblik på rutinemæssig influenzatestning.
Til reference anvendtes Rapid Culture-metoden (fladbundet centrifugeglas) efterfulgt af en screening og
identificering af direkte fluorescerende antistof (DFA).
I alt blev 637 vatpindsprøver testet med Quidel Molecular influenza A+B-analysen samt per kultur. Seks (6) prøver,
der oprindeligt gav uløste resultater, forblev uløste ved gentagelsen af testen med Quidel Molecular influenza A+Banalysen og er ikke medtaget i analysen nedenfor.
I alt blev 6 prøver erklæret positive efter DFA-respiratorisk virusscreening (screeningsreagens registrerer influenza
A og B, RSV, parainfluenzavirus 1, 2, og 3 samt adenovirus), men indeholdte for få celler til opnåelse af specifik,
positiv identifikation. I alt var 3 prøver erklæret giftige i deres cellekultur. Disse 9 prøver er ikke inkluderet i
analysen nedenfor.
Uoverensstemmende analyse for prøver, hvor hhv. Quidel Molecular influenza A+B analyse- og kulturresultater
ikke stemte overens, blev udført ved hjælp af en CE-mærket RT-PCR-analyse og, i fald dette forekom relevant,
bidirektionel sekvensering.
Side 20 af 31
Influenza A
Friske nasale/nasopharyngeale
vatpindsprøver (N=622)
Quidel Molecular influenza
A+B-analyse
Positiv
Komparator: Kultur med DFA
Positiv
Negativ
I alt
93
18*
111
Negativ
1**
510
511
I alt
94
528
622
95 % CI
Sensitivitet
93/94
98,9 %
94,2 % til 100 %
Specificitet
510/528
96,6 %
94,7 % til 98,0 %
*17 af disse prøver blev testet positive for influenza A af CE-IVD-enheden. Den sidste
enkelte prøve blev testet influenza A-negativ af CE-IVD-enheden, men positiv for influenza
A-virus ved sekvensanalyse.
** Prøven var desuden influenza A-negativ ifølge CE-IVD-enheden.
Influenza B
A+B-analyse
Positiv
Positiv
Negativ
I alt
74
7*
81
Negativ
2**
539
541
I alt
76
546
622
95 % CI
Sensitivitet
74/76
97,4 %
90,8 % til 99,7 %
Specificitet
539/546
98,7 %
97,4 % til 99,5 %
*5 prøver blev testet influenza B-positive af CE-IVD-enheden, 2 prøver var influenza Bnegative ifølge CE-IVD-enheden, men positive for influenza B-virus ifølge sekvensanalysen.
**1 prøve var influenza B-positiv ifølge CE-IVD-enheden, 1 prøve var influenza B-negativ
ifølge CE-IVD-enheden.
Side 21 af 31
I alt blev 626 vatpindsprøver testet med Quidels Molecular influenza A+B-analyse samt via en CE-mærket IVD RTPCR-analyse. Seks (6) prøver, der i første omgang gav uløste resultater i begge analyser, forbliver uløste efter
omprøvning ved begge analyser og er ikke inkluderet i analysen herunder. Yderligere 10 prøver gav uløste
resultater gennem den CE-mærkede IVD RT-PCR-analyse og forblev uløste ved omprøvning med analysen. Disse er
heller ikke inkluderet i analysen herunder. Afvigende analyseresultater for prøverne, hvor resultaterne for hhv.
Quidel Molecular influenza A+B-analysen samt den CE-mærkede IVD RT-PCR-analyse ikke stemte overens, blev
udført via sekvensering.
Influenza A
Friske nasale/nasofaryngale
A+B-analyse
Komparator: CE-IVD-enhed
Positiv
Negativ
I alt
Positiv
107
3*
110
Negativ
0
500
500
107
503
610
I alt
95 % CI
Sensitivitet
107/107
100 %
96,6 % til 100 %
Specificitet
500/503
99,4 %
98,3 % til 99,9
%
*3 prøver erklæredes influenza A-positive via sekvensanalyse.
Influenza B
A+B-analyse
Komparator: CE-IVD-enhed
Positiv
Negativ
I alt
Positiv
77
5*
82
Negativ
4**
524
528
I alt
81
529
610
95 % CI
Sensitivitet
77/81
95,1 %
87,8 % til 98,6
%
Specificitet
524/529
99,1 %
97,8 % til 99,7
%
*5 prøver erklæredes influenza B-positive via sekvensanalyse.
**4 prøver erklæredes influenza B-negative via sekvensanalyse.
Side 22 af 31
Et delsæt bestående af tohundrede og elleve (211) prøver fra ovenstående undersøgelse blev testet på
QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrumentet. Testresultaterne blev sammenlignet med data fra sideløbende test
på ABI 7500 Fast Dx. Denne sammenligning kan ses herunder.
Quidel Molecular influenza A+B-analyse
Influenza A
Komparator: ABI 7500 Fast Dx
PCR-instrument
Positiv
Negativ
I alt
Positiv
63
0
63
Negativ
0
148
148
I alt
63
148
211
95 % CI
Sensitivitet
63/63
100 %
94,3 % til 100 %
Specificitet
148/148
100%
97,5 % til 100 %
Quidel Molekylær Influenza A+B-analyse
Influenza B
PCR-instrument
Positiv
Negativ
I alt
Positiv
28
0
28
Negativ
0
183
183
I alt
28
183
211
95 % CI
Sensitivitet
28/28
100 %
87,9 % til 100 %
Specificitet
183/183
100%
97,9 % til 100 %
Analytisk ydeevne
Detektionsgrad
Den analytiske sensitivitet (detektionsgrænse eller LoD) for Quidel Molecular influenza A+B-analysen blev bestemt
ved anvendelsen af kvantificerede (TCID50/ml) kulturer af 3 influenza A-stammer (1 H1N1, 1 2009H1N1 og 1 H3N2)
og 3 influenza B-stammer, seriefortyndet i negativ nasopharyngeal matrice. Hver fortynding blev ekstraheret vha.
NucliSENS easyMAG-systemet og testet i replikationer af 20 per viruskoncentration på både Applied Biosystems®
7500 Fast Dx- og Cepheid SmartCycler® II-platformene. Analytisk sensitivitet (LoD) defineres som den laveste
koncentration, med hvilken 95 % af alle replikationer vil blive testet positive.
Detektionsgrad
Stamme
Endelig TCID50/ml LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Side 23 af 31
Kompetitiv inhibering
Kompetitiv inhibering af Quidel Molecular influenza A+B-analysen vurderes gennem anvendelsen af simulerede
prøver med forskellige koncentrationer af influenza A-virus (2x LoD til 4 log over LOD) og influenza B-virus (2x LoD
til 4 log over LOD) i en enkelt prøve. Prøver blev ekstraheret ved hjælp af NucliSENS easyMAG-systemet og testet
tre gange. Tilstedeværelsen af både influenza A- og B-vira i varierende koncentrationer i en enkelt prøve havde
ingen effekt på den analytiske sensitivitet (detektionsgrænse eller LoD) for Quidel Molecular influenza A+Banalysen.
Analytisk reaktivitet (inklusivitet)
Reaktiviteten for Quidel Molecular influenza A+B-analysen vurderedes ift. talrige influenza A- og B-virusstammer.
Det kliniske panel bestod af 10 influenza A-, subtype H1N1, 2 influenza A-, subtype 2009H1N1, 8 influenza A-,
subtype H3N2, 2 influenza A-, subtype H5N1, og 13 influenza B-stammer. Yderligere blev ét panel af ikke-kliniske,
begrænsede isolater testet. Hvert enkelt panelelement blev ekstraheret vha. NucliSens easyMAG-instrumentet og
testet tre gange.
Quidel Molecular influenza A+B-analyse opfangede 100 % af influenza A- (38/38) og influenza B-stammer (15/15)
2
3
ved 10 til 10 TCID50/ml-niveauer, herunder nye, pandemiske og aviære influenza A-stammer samt nyligt
cirkulerende influenza B-stammer.
Klinisk panel, influenza A-vira
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
A/Ny Kaledonien/20/1999
1,12E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/NWS/33
NA
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Salomonøerne/3/06
1,41E+01
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Hongkong/8/68
1,15E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
4,57E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Subtype
Stamme
TCID50/ml
H1N1
H1N1 A/Californien/07/2009
H1N1
Side 24 af 31
Klinisk panel, influenza B-vira
Stamme
TCID50/mL
B/Hongkong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Malaysia/25/06/04
3,41E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Allen/45
4,17E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Rusland/69
2,19E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Lee/40
1,95E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Ikke-kliniske, begrænsede vira
Subtype
Stamme
TCID50/mL
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positiv
Negativ
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H2N2
A/Gråand/NY/6750/78 (H2N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H7N3
A/Kylling/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H9N2
A/Kylling/NJ/12220/97 (H9N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H4N8
A/Gråand/OH/338/86 (H4N8)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H6N2
A/Kylling/CA/431/00 (H6N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H8N4
A/Blåvingeand/LA/B174/86 (H8N4)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H5N1
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H10N7
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H11N9
A/Kylling/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H12N5
A/And/LA/188D/87 (H12N5)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H13N6
A/Måge/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H14N5
A/Gråand/Gurjev, Rusland/262/82 (H14N5)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H15N9
A/Skråpe/Australien/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H16N3
A/Kystfugl/DE/172/2006(H16N3)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Side 25 af 31
Reproducerbarhed
Den intra-laboratoriale reproducerbarhed for Quidel Molecular influenza A+B-analysen blev evalueret i 3
forskellige laboratorier. Reproducerbarheden blev vurderet vha. et panel af 6 simulerede prøver, hvilke
inkluderede medium (10x LoD), høj negativ (C 20-60-koncentration) influenza A-virus, influenza B-virus samt positive
og negative kontrolprøver. Paneler og kontroller blev testet på den enkelte lokation af 2 operatører over 5 dage (8
prøver og 3 kontroller × 2 operatører × 5 dage × 3 lokationer = 330). Panelerne og kontrollerne blev ekstraheret
vha. NucliSENS easyMAG-systemet og testet på 7500 Fast-Dx-instrumentet.
Reproducerbarhed
Panelmedlems-id
Influenza A,
høj negativ
Influenza Apositiv (10x LoD)
Influenza B,
høj negativ
Influenza Bpositiv (10x LoD)
Influenza Apositiv kontrol
Influenza Bpositiv kontrol
Negativ kontrol
Lokation 1
Lokation 2
Lokation 3
Overensstemmelse
med
forventede
resultater
Overensstemmelse
med
forventede
resultater
Overensstemmelse
med
forventede
resultater
AVE
Ct
%CV
AVE
Ct
%CV
6/10
31.5*
8,8
10/10
N/A
N/A
10/10
24.7
2,1
10/10
26.0
9/10
34.9
N/A
10/10
10/10
25.1
12,0
10/10
12.0
10/10
10/10
Total
overensstemmelse med
forventede
resultater
AVE
Ct
%CV
9/10
34.3*
N/A
25/30
9,0
9/10
28.1
7,6
29/30
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
10/10
28.3
9,3
9/10
27.2
10,1
29/30
2,4
10/10
11.9
4,0
10/10
13.5
8,3
30/30
14.7
2,2
10/10
15.1
3,7
10/10
16.0
7,6
30/30
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
Analytisk specificitet – Krydsreaktivitet
Den analytiske specificitet for Quidel Molecular influenza A+B-analysen blev evalueret ved at teste et panel
bestående af 26 vira, 24 bakterier og 1 gærstamme, der repræsenterede almindelige respiratoriske patogener og
5
10
planteliv sædvanligvis tilstede i nasopharynx. Bakterier og gær blev testet ved koncentrationer på 10 til 10
3
6
CFU/ml. Vira blev testet ved koncentrationer på 10 til 10 TCID50/ml. Prøverne blev ekstraheret vha.
NucliSENS easyMAG-instrumentet og testet tre gange. Analytisk specificitet for Quidel Molecular influenza A+Banalysen var 100 %.
Krydsreaktivitet
hMPV A1
Endelig
konklusion
3,70E+04
Influenza Aresultat
Negativ
Influenza Bresultat
Negativ
hMPV B1
2,37E+04
Negativ
Negativ
RSV Lang
4,40E+04
Negativ
Negativ
RSV Washington
1,75E+0
Negativ
Negativ
5,67E+04
Negativ
Negativ
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negativ
Negativ
Coronavirus OC43
1,67E+06
Negativ
Negativ
Coxsackievirus B4
2,43E+06
Negativ
Negativ
2,28E+06
Negativ
Negativ
Cytomegalovirus
8,76E+05
Negativ
Negativ
Echovirus 7
5,38E+08
Negativ
Negativ
Echovirus 9
1,50E+06
Negativ
Negativ
ID for organisme
Side 26 af 31
Krydsreaktivitet
Echovirus 6
Endelig
konklusion
1,05E+08
Influenza Aresultat
Negativ
Influenza Bresultat
Negativ
Echovirus 11
1,50E+05
Negativ
Negativ
Enterovirus 71
2,68E+03
Negativ
Negativ
Enterovirus 70
1,66E+05
Negativ
Negativ
Epstein Barr Virus
5,000cp/mL
Negativ
Negativ
HSV Type 1 Maclnytre-stamme
1,95E+06
Negativ
Negativ
HSV Type 2 G-stamme
3,67E+06
Negativ
Negativ
Rubeola
3,78E+05
Negativ
Negativ
Mumps virus
8,43E+04
Negativ
Negativ
2,50E+05
Negativ
Negativ
2,20E+04
Negativ
Negativ
9,10E+05
Negativ
Negativ
9,57E+06
Negativ
Negativ
7,50E+02
Negativ
Negativ
1,04E+07
Negativ
Negativ
2,55E+07
Negativ
Negativ
2,10E+05
Negativ
Negativ
2,05E+08
Negativ
Negativ
6,90E+08
Negativ
Negativ
6,60E+07
Negativ
Negativ
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativ
Negativ
5,90E+07
Negativ
Negativ
5,15E+07
Negativ
Negativ
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativ
Negativ
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativ
Negativ
2,15E+07
Negativ
Negativ
1,85E+08
Negativ
Negativ
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativ
Negativ
3,30E+07
Negativ
Negativ
Escherichia coli
6,80E+07
Negativ
Negativ
5,85E+07
Negativ
Negativ
6,0E+05
Negativ
Negativ
1,03E+08
Negativ
Negativ
4,5E+07
Negativ
Negativ
2,05E+08
Negativ
Negativ
2,50E+06
Negativ
Negativ
2,6E+07
Negativ
Negativ
ID for organisme
Side 27 af 31
Krydsreaktivitet
Endelig
konklusion
5,15E+08
Influenza Aresultat
Negativ
Influenza Bresultat
Negativ
Candida albicans
1,07E+06
Negativ
Negativ
ID for organisme
Analytisk specificitet – Interfererende stoffer
Ydeevnen for Quidel Molecular influenza A+B-analysen blev evalueret i forbindelse med potentielt interfererende
stoffer, der kan være til stede i nasopharyngeale prøver. De potentielt interfererende stoffer blev evalueret i
influenza A (A/Mexico/4108/2009) og influenza B (B/Florida/04/2006) ved koncentrationer på 3x og 10x LoD. Der
var intet bevis på nogen form for interferens forårsaget af de herunder opførte teststoffer ved koncentrationer på
3x eller 10x LoD.
60 µg/ml
Influenza
A-resultat
(3x LoD)
Positiv
Influenza
B-resultat
(3x LoD)
Positiv
Blod (menneske), EDTA antikoaguleret
2 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Neo-synephrin
15 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Afrin næsespray
15 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Zicam homøopatisk, ikke-døsende
allergiafhjælpende, ikke-dryppende,
flydende næsegel
5 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
15 % (vol/vol) af dosis
Positiv
Positiv
0,68 g/ml; 1/18 dråbe,
knust; aktive ingredienser:
1,7 mg/ml mentol
Positiv
Positiv
3,3-5 mg/ml
Positiv
Positiv
4,0 µg/ml
Positiv
Positiv
Mupirocin
6,6-10 mg/ml
Positiv
Positiv
Oseltamivirphosphat
7,5-25 mg/ml
Positiv
Positiv
Stofnavn
Testet koncentration
Mucin (submaxillær kirtel på kvæg, type I-S)
Saltvandsnæsespray
Sugetabletter til halsen
Zanamivir
Tobramycin
Studier af overførsel og krydskontaminering
I et internt studie var der ingen beviser for overførsel eller krydskontaminering gennem Quidel Molecular influenza
A+B-analysen ved anvendelse af bioMériuex NucliSENS easyMAG-instrumentet til automatiseret nukleinsyreekstraktion.
Yderligere kildemateriale
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Vejledningsdokument til Klasse II specialkontroller: Reagenser til påvisning af specifikke, nye influenza A-vira
(marts 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
Vejledning til in vitro diagnosticeringsenheder til påvisning af influenza A-vira: Mærkning og reguleringer (april
Vejledning om informeret samtykke til in vitro diagnosticering af tiloversblevne menneskeprøver, der ikke er
individuelt identificerbare (april 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
Vejledningsudkast om nukleinsyrebaserede in vitro diagnosticeringsenheder til påvisning af mikrobielle
patogener (december 2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
CLSI EP17-A: Vejledning til protokoller til bestemmelse af detektions- og kvantificeringsgrænser (vol. 2, nr. 34)
(oktober 2004).
CLSI MM13-A: Vejledning til indsamling, transport, forberedelse og opbevaring af prøver til molekylære
metoder (vol. 25, nr. 31) (december 2005).
CLSI EP7-A2: Vejledning til interferenstestning i klinisk kemi (vol. 25, nr. 27, anden udg.) (november 2005).
Side 28 af 31
8.
CLSI EP12-A: Vejledning til brugerprotokol til evaluering af kvalitative testpræstationer (vol. 22, nr. 14)
(september 2002).
9. CLSI MM6-A: Vejledning til kvantitative, molekylære metoder til infektionssygdomme (vol. 23, nr. 28) (oktober
2003).
10. CLSI EP5-A2: Vejledning til evaluering af præcision for de kvantitative målemetoder (vol. 24, nr. 25, anden
udg.) (august 2004).
Kundesupport og teknisk supportafdeling
For at afgive en ordre eller for teknisk support bedes du kontakte en Quidel-repræsentant på (800) 874-1517
(gratis i USA) eller (858) 552-1100, mandag til fredag mellem 8 og 17, amerikansk østkysttid. Bestillinger kan også
afgives via fax på (740) 592-9820. For e-mailsupport kontaktes [email protected] eller
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information om Quidel, vores produkter og vores forhandlere fås på vores website quidel.com.
Intellektuel ejendom
Varemærker
Cepheid® og Smartcycler® er registrerede varemærker, der tilhører Cepheid Corporation. Applied Biosystems® er
et registreret varemærke, der tilhører Life Technologies. NucliSENS® og easyMAG® er registrerede varemærker,
der tilhører bioMerieux, Inc. TaqMan® er et registreret varemærke, der tilhører Roche. CAL Flour® Orange 560, CAL
Flour® Red 610 og Quasar®670 er registrerede varemærker, der tilhører BioSearch Technologies, Inc.
Patenter
Farveforbindelser i dette produkt sælges under licens fra BioSearch Technologies, Inc. og er beskyttet af
amerikanske og verdensomspændende patenter, der enten er udstedt eller afventes.
Købet af dette produkt giver køberen ret til under visse Roche-patenter at anvende dette udelukkende til in vitro
diagnostisk anvendelse på mennesker. Intet generelt patent eller licens af nogen art ud over denne specifikke ret
til anvendelse fra købet gives hermed.
Side 29 af 31
Terminologi
Autoriseret repræsentant i det
Europæiske Fællesskab
Producent
Indhold/indeholder
Kontrol
Anvendes inden
Katalognummer
Batch-kode
Til in vitro diagnostisk
anvendelse
Se brugsanvisningen
Tilsigtet anvendelse
96
Indeholder nok til 96 bestemmelser
Temperaturbegrænsning
Side 30 af 31
REFERENCER
1
http://1918.pandemicflu.gov besøgt d. 9/6/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm besøgt d. 9/6/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viralkultur; godkendte retningslinjer. CLSI-dokument M41-A
Pennsylvania 19.087-1898, USA, 2006.
M100 – Quidel Molecular influenza A+B-analysekit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Tyskland
Quidel Corporation
Global Headquarters
quidel.com
M0002GDA00 (12/2012)
Side 31 af 31
Influenza A+B-assay
Gebruiksaanwijzing
Voor de kwalitatieve opsporing en identificatie van nucleïnezuren van influenza A en influenza B
virussen, verkregen uit nasale teststaafjes, nasofaryngeale teststaafjes en specimen verzameld
met nasaal aspiraat/lavage.
Quidel Molecular Influenza A+B-assay (CE)
pagina 1 van 32
Inhoud
Beoogd gebruik ............................................................................................................................................. 4
Samenvatting en omschrijving ...................................................................................................................... 4
Principe van de procedure ............................................................................................................................ 4
Verstrekte materialen ................................................................................................................................... 6
Optionele materialen .................................................................................................................................... 6
Benodigde maar niet verstrekte materialen................................................................................................. 6
Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen ................................................................................................ 7
Opslag en hanteren van reagentia uit de kit ................................................................................................ 7
Verzamelen, opslaan en verwerken van specimen ...................................................................................... 7
Opslag van nucleïnezuurextracten ............................................................................................................... 8
Programmeerinstructies nucleïnezuurextractie ........................................................................................... 8
Initiële programmering van de Thermocycler ............................................................................................ 10
Programmeerinstructies voor de SmartCycler II .................................................................................... 10
Programmeerinstructies voor 7500 Fast DXP ......................................................................................... 12
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument Programmeerinstructies ................. 16
Assayprocedure .......................................................................................................................................... 16
Amplificatieprotocol op de SmartCycler II .............................................................................................. 16
Amplificatieprotocol op de 7500 Fast Dx Thermocycler......................................................................... 17
Amplificatie-protocol op het QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ............................................. 18
De resultaten interpreteren ........................................................................................................................ 19
Interpretatie van de resultaten verkregen met de SmartCycler II.......................................................... 19
Interpretatie van de uitslag verkregen met de 7500 Fast Dx thermocycler ........................................... 20
Interpretatie van de resultaten met het QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ........................... 20
Kwaliteitscontrole ....................................................................................................................................... 20
Beperkingen ................................................................................................................................................ 21
Klinische prestaties ..................................................................................................................................... 21
Analytische prestaties ................................................................................................................................. 24
Detectieniveau (LoD) .................................................................................................................................. 24
pagina 2 van 32
Competitieve remming ............................................................................................................................... 25
Analytische reactiviteit (inclusiviteit) .......................................................................................................... 25
Reproduceerbaarheid ................................................................................................................................. 27
Analytische specificiteit - Kruisreactiviteit .................................................................................................. 27
Onderzoek naar overdracht en kruisbesmetting ........................................................................................ 29
Aanvullende bronmaterialen ...................................................................................................................... 29
Klantenservice en technische ondersteuning ............................................................................................. 30
Intellectueel eigendom ............................................................................................................................... 30
Handelsmerken ........................................................................................................................................... 30
Woordenlijst ............................................................................................................................................... 31
Bronnen....................................................................................................................................................... 32
pagina 3 van 32
Beoogd gebruik
De Quidel Molecular Influenza A+B-assay is een multiplex Real Time RT-PCR-assay voor de kwalitatieve opsporing
en identificatie van nucleïnezuren van influenza A- en/of influenza B-virussen, verkregen uit nasale teststaafjes,
nasofaryngeale teststaafjes en specimen verzameld met nasaal aspiraat/lavage. Deze in vitro diagnostische test is
bedoeld in de onderscheidende diagnose van virale infecties met influenza A en/of influenza B in mensen. De assay
detecteert de aanwezigheid van het influenza C-virus.
Een negatief resultaat sluit een infectie met het influenzavirus niet uit en moet niet worden gebruikt als de enige
basis voor diagnose, behandeling of andere operationele beslissingen. Prestatiekarakteristieken voor influenza A
zijn vastgesteld op een moment dat A/H3 en A/H1 de meestvoorkomende influenza A-virussen waren. Wanneer
andere influenza A-virussen opduiken, kunnen de prestatiekarakteristieken variëren.
Samenvatting en omschrijving
Influenza-virussen (familie Orthomyxoviridae) bevatten een enkelstrengs RNA-genoom dat aanwezig is in 8
afzonderlijke segmenten ribonucleoproteïne. Deze segmentatie van het genoom is zeldzaam onder virussen en
draagt, door de uitwisseling van gensegmenten bij infectie van één cel door twee verschillende virussen,
waarschijnlijk bij aan de snelle ontwikkeling van nieuwe influenza-stammen. Er zijn 3 soorten influenza: A, B en C.
Type A kent tegenhangers in vogels, varkens en mensen, terwijl de types B en C alleen bij mensen voorkomen.
Vanwege de kans op een nieuwe pandemie als gevolg van influenza A, zoals ook gebeurde in 1918, toen
1
wereldwijd 30-50 miljoen personen stierven , houden de Centers for Disease Control (CDC) en de
Wereldgezondheidsorganisatie de influenza-stammen in de gaten, en maken ze voorspellingen over stammen die
geschikt zijn voor het produceren van vaccins.
2
Naar schatting sterven in de VS jaarlijks 30.000-49.000 personen aan aan griep gerelateerde ziekten. Wereldwijd
resulteren jaarlijkse griepepidemieën in circa drie tot vijf miljoen gevallen van ernstige ziekte en circa 250.0003
500.000 sterfgevallen. Influenza A-pandemieën vinden circa iedere 10 tot 30 jaar plaats en Influenza A- of Bepidemieën vinden jaarlijks plaats. Infecties vinden seizoensgebonden plaats. Het seizoen loopt op het noordelijk
halfrond gewoonlijk van november tot april. Complicaties vinden vooral bij kinderen, ouderen en personen met
chronische hart-longziekten plaats.
De incubatietijd duurt 1-3 dagen, waarbij de verspreiding razendsnel plaatsvindt via inademing van druppeltjes in
de lucht, en via fomieten. Kenmerken zijn: koorts, spierpijn, hoofdpijn en keelontsteking.
Principe van de procedure
De test detecteert virale nucleïnezuren die uit een patiëntpreparaat zijn geëxtraheerd. Er wordt in een enkele buis
onder geoptimaliseerde omstandigheden een multiplex real-time PT-CPR-reactie uitgevoerd. Hierbij
worden voor alle in het monster aanwezige doelvirussen amplicons gegenereerd. Influenza A wordt vastgesteld
door doelspecifieke primers en een fluorescent gelabelde probe te gebruiken die hybridiseert met een
geconserveerde influenza A-reeks in het matrixeiwit-gen. Influenza B wordt vastgesteld door doelspecifieke
primers en fluorescent gelabelde probes te gebruiken die hybridiseren met een geconserveerde influenza B-reeks
in het neuraminidase-gen.
Labels voor Quidel moleculaire probe
Doel
Kleurstof
Influenza A
FAM
Influenza B
Procescontrole (PRC)
Quasar® 670
pagina 4 van 32
Hieronder volgt een samenvatting van de procedure:
1.
Monstercollectie: Verkrijg door middel van de standaardtechnieken neusteststaafjes, nasofaryngeale
teststaafjes en nasale slijm-/lavagespecimen van symptomatische patiënten. Deze preparaten worden
4
vervoerd, opgeslagen en verwerkt overeenkomstig vastgestelde laboratoriumprocedures.
2.
Extraheren van nucleïnezuur: Extraheer met behulp van het NucliSENS® easyMAG®-systeem nucleïnezuur uit
de specimen volgens de instructies van de fabrikant en met gebruik van het juiste reagens (zie Benodigde
maar niet verstrekte materialen). Het gebruik van andere extractiesystemen bij de Quidel Molecular Influenza
A+B-test is niet gevalideerd. Validatie van deze andere systemen valt onder de verantwoordelijkheden van
de eindgebruiker.
Voeg voorafgaand aan de extractieprocedure 20 µL van de Procescontrole (PRC) aan iedere 180 µL specimen
toe. De PRC is bedoeld om te controleren op inhibitors in het geëxtraheerde specimen, garandeert dat de
juiste versterking heeft plaatsgevonden en bevestigt dat de extractie van nucleïnezuur voldoende was.
3.
Rehydratie van Master Mix: Rehydrateer de gevriesdroogde Master Mix met behulp van de rehydratieoplossing. De Master Mix bevat oligonucleotide-primers, fluorofore en uitdover-gelabelde probes die zijn
gericht op geconserveerde gebieden van de influenza A- en influenza B-virussen, alsmede op
de procescontrole.
4.
Versterking en detectie van nucleïnezuur: Voeg 15 µL van de gerehydrateerde Master Mix aan iedere
reageerbuis of well op de plaat toe. Voeg vervolgens 5 µL geëxtraheerde nucleïnezuren (PRC) toe aan de well
op de plaat of passend gelabelde reageerbuis. Plaats de plaat of buis in ofwel het Life Technologies
TM
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument, Applied Biosystems® 7500 Fast Dx of respectievelijk de Cepheid®
SmartCycler® II instrumenten. De analyse is gevalideerd met de 7500-instrumentenserie.
Nadat de reageerbuis of plaat aan het instrument is toegevoegd, begint het analyseprotocol. Dit protocol zet
omgekeerde transcriptie van de RNA-doelen in gang, zodat aanvullend DNA wordt gegenereerd en vervolgens
de versterking van de doelamplicons plaatsvindt. De Quidel Molecular Influenza A+B-test is gebaseerd op
TaqMan®-chemie en maakt gebruik van een enzym met reverse transcriptase-, DNA-polymerase- en 5’-3’
exonuclease-activiteiten. Tijdens de DNA-versterking splijt dit enzym de probe die op de aanvullende DNAreeks is gebonden, waarna de dovende kleurstof van de meldende kleurstof wordt gescheiden. Deze stap leidt
bij excitatie door een lichtbron met de juiste golflengte tot een toename van het fluorescente signaal. Bij
iedere cyclus worden extra kleurstofmoleculen van hun uitdovende varianten gescheiden, wat resulteert in
meer signaal. Wanneer binnen 45 cycli voldoende fluorescentie wordt bereikt, wordt het monster
gerapporteerd als zijnde positief voor het gedetecteerde nucleïnezuur.
pagina 5 van 32
Verstrekte materialen
SKU # M100
Detectiekit (96 reacties) – Bewaren bij 2° tot 8°C
#
Component
Hoeveelheid


Rehydratieoplossing Onderdeel M5003
1 flesje/set 1,9 mL
Quidel Molecular Influenza A+B Master Mix Onderdeel M5004
12 flesjes/set,
8 reacties/flesje
Gevriesdroogde inhoud:
DNA-polymerase-enzym met reverse transcriptase-activiteit
Primers en probes
dNTPs
Stabilisatoren
Werkwijze Onderdeel M5005
1 flesje/kit 2,0 mL
Optionele materialen
Positieve controles voor influenza A en influenza B (bv. Quidel Molecular Influenza A+B controleset #M106, die
dient als een externe verwerkings- en extractiecontrole)
Benodigde maar niet verstrekte materialen
Micropipetten (variërend van 1 tot 10 μL en 100 tot 1000 μL)
Aerosolvrije pipettips
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument of Applied Biosystems 7500 Fast Dx instrument
Applied Biosystems 7500 Fast Dx 96 well PCR-plaat
Applied Biosystems optische plaatfilm
Plaatcentrifuge voor ABI 96 plaat met holtes
Of
Micropipetten (variërend van 1 tot 10 μL en 100 tot 1000 μL)
Aerosolvrije pipettips
SmartCycler® II
SmartCycler-wegwerpmaterialen
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Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen
Voor in-vitro-diagnoses
Als een infectie met een nieuw influenza A-virus wordt vermoed op basis van de actuele klinische en
epidemiologische screeningscriteria die door de autoriteiten op het gebied van volksgezondheid worden
aanbevolen, moeten specimen worden verzameld met inachtneming van passende voorzorgsmaatregelen
voor nieuwe virulente influenzavirussen, en deze vervolgens naar verantwoordelijke instantie worden
gestuurd voor tests.
Prestatiekarakteristieken voor deze test zijn vastgesteld met alleen de typen specimen uit de lijst in de sectie
Beoogd gebruik. De prestaties van deze assay met andere typen specimen of monsters is niet geëvalueerd.
Het gebruik van extractiesystemen anders dan het NucliSENS easyMAG System is niet gevalideerd. Validatie
van deze andere systemen valt onder de verantwoordelijkheden van de eindgebruiker.
Het gebruik van cycluscondities anders dan die aangegeven in de Thermocycler-programmeerinstructies sectie
kan foutieve resultaten geven.
Het gebruik van dit product moet worden beperkt tot personeel met voldoende training in PCR- en RT-PCRtechnieken.
Behandel alle specimen/monsters als potentieel besmettelijk. Neem de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen in
het omgaan met monsters, deze kit en de inhoud ervan.
Correct verzamelen, opslaan en vervoeren van monsters is essentieel voor correcte resultaten.
Bewaar de reagentia voor de assay zoals is aangegeven op hun afzonderlijke etiketten.
Draag bij gebruik van deze kit geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming voor ogen
en gezicht.
Pipetteer zorgvuldig met gekalibreerd materiaal voor nauwkeurige resultaten.
Maak alle oppervlakken schoon en desinfecteer ze met een oplossing van 10% bleekwater gevolgd door
‘molecular grade’ water.
Gebruik micropipetten met een aerosol-barrière of positive displacement tips voor alle procedures.
Vermijd microbiële en kruis-contaminatie van de reagentia in de kit. Volg goede laboratoriumprocedures
Mix geen reagentia van kits met verschillende partijnummers.
Gebruik geen reagentia van andere fabrikanten bij deze kit.
Gebruik het product niet na de houdbaarheidsdatum.
Een juiste planning van de workflow is essentieel voor het minimaliseren van contaminatie-risico’s. Plan de
laboratoriumworkflow altijd in één richting, beginnend met de voorversterking en dan door naar de
versterking en de detectie.
Gebruik speciaal geschikte materialen en uitrusting in de gebieden voor de voorversterking en de versterking.
Sta geen verplaatsingen van personeel of apparatuur tussen de gebieden toe.
Houd versterkingsmaterialen te allen tijde gescheiden van voorversterkingsmaterialen.
Open reageerbuizen of verzegelde platen na de versterking niet meer.
Voer versterkt materiaal zorgvuldig en in overeenstemming met de geldende wetgeving af om het risico van
amplicon-contaminatie te minimaliseren.
Gebruik materiaal dat speciaal bedoeld is als reagens of voor het opwerken van monsters niet voor het
opwerken van doelnucleïnezuur.
Een MSDS is op aanvraag beschikbaar en kan worden bekeken op de productwebsite.
Opslag en hanteren van reagentia uit de kit
Sla de ongeopende kit op bij 2° tot 8°C tot de houdbaarheidsdatum op de buitenste verpakking van de kit.
De gerehydrateerde Master Mix kan maximaal 24 uur op kamertemperatuur (20° tot 25 C) worden bewaard.
Voor langere opslag moet de gerehydrateerde Master Mix worden afgesloten, geseald met parafilm, en bij
≤ -20°C maximaal 14 dagen rechtop worden weggezet. Bescherm de Master Mix tijdens opslag tegen licht.
Indicaties voor instabiliteit of achteruitgang van reagentia: Ondoorzichtigheid van de rehydratatieoplossing kan
wijzen op achteruitgang van dit reagens. Neem contact op met de technische service van Quidel voor vervanging.
Verzamelen, opslaan en verwerken van specimen
De specimen die gebruikt worden voor de validatie van de Quidel Molecular Influenza A+B-test werden met behulp
van standaardtechnieken verkregen van patiënten met symptomen van infecties in de bovenste luchtwegen. Deze
specimen werden verzameld, vervoerd, opgeslagen en verwerkt overeenkomstig CLSI M41-A.
pagina 7 van 32
Opslag van nucleïnezuurextracten
De gebruiker is verantwoordelijk voor validatie van de opslagprocedures en de condities die voorkomen in zijn
laboratorium. Eluaten kunnen doorgaans gedurende 2 uur worden opgeslagen op kamertemperatuur (20° tot
25°C), 8 uur bij 2-8°C, of 1 maand bij -20°C tot -70°C. Het opslaan van kleine hoeveelheden nucleïnezuurextract (bv.
5 μl of minder) wordt niet aanbevolen.
Programmeerinstructies nucleïnezuurextractie
1.
Schakel het instrument in en wacht tot het lampje erop oranje wordt. Zet dan de computer aan/start
easyMAG-software.
2.
Lees de barcodes van de reagentia in nadat u op de knoppen ‘Instrument’
en ‘Reagent Inventory’
heeft gedrukt.
3.
Druk om monsters in te voeren op de knop Dagelijks gebruik
, waardoor het scherm Aanvraag
definiëren
wordt geopend. Selecteer de volgende instellingen:
a. Monster-ID:
Voer de naam van het monster in met behulp van het toetsenbord.
b. Matrix:
Selecteer Anders in het vervolgkeuzemenu
c. Aanvraag:
Selecteer Generiek in het vervolgkeuzemenu
d. Volume (ml):
Selecteer 0.200 in het vervolgkeuzemenu
e. Eluaat (µl):
Selecteer 50 in het vervolgkeuzemenu
f. Type:
Primair
g. Prioriteit:
Normaal
4.
Na het indrukken van de knop Opslaan
, verschijnt het monster in het venster Niet-toegewezen
monster aan de linkerkant van het scherm. Druk op de knop Nieuwe extractieaanvraag invoeren
en
herhaal het proces voor volgende monsters. Meerdere monsters kunnen ook worden ingevoerd door op de
knop Nieuwe extractieaanvragen automatisch aanmaken
5.
te drukken.
Ga nadat alle monsters zijn aangemaakt naar Runs organiseren door op het pictogram
pagina te klikken. Maak een run aan door op de knop Run aanmaken
of gebruik de standaardnaam.
6.
8.
te drukken. Voer een runnaam in
Voeg monsters toe aan de run met de knop Run automatisch vullen
(hiermee kunnen automatisch
maximaal 24 monsters uit de Lijst niet-toegewezen monsters aan de linkerkant van het scherm worden
ingevuld). Ook kunnen afzonderlijke monsters aan de run worden toegevoegd respectievelijk uit de run
worden verwijderd door het toepasselijke monster te selecteren en dan de linker en rechter
positioneringspictogrammen
7.
boven aan de
te gebruiken. De monstervolgorde in de run kan worden
gewijzigd met behulp van de knoppen Extractieaanvraag omhoog/omlaag verplaatsen
.
Neem 1 tot 3 monstervaten (voor respectievelijk 8 tot 24 monsters) en voeg 20 µl procescontrolevloeistof toe
aan elke gebruikte well voor monsters.
Voeg 180 µl van elk monster toe aan de well die aan dat monster is toegewezen.
pagina 8 van 32
9.
Ga naar Run laden door op de knop
bovenaan het scherm te drukken. Breng tips en monstervat(en)
in het instrument in
10. Voer de barcode(s) van de/het monstervat(en) in
11. Voer de barcode(s) van te gebruiken silicakorrels in
12. Wijs silicakorrels als volgt aan monsters toe:
a. Klik op het reagentiasymbool onder nummer 1 in onderstaande afbeelding. Het partijnummer van de
silicakorrels moet onder het tabblad Silica bij nummer 2 in onderstaande afbeelding verschijnen.
b. Markeer en selecteer de monsters in de run waaraan korrels moeten worden toegewezen (in het vak
met nummer 3 in onderstaande afbeelding).
c.
d.
Klik op het
positioneringspictogram (onder nummer 4 in onderstaande afbeelding) om het
silicapartijnummer aan de geselecteerde monsters toe te wijzen
Als het korrelsymbool rechts naast nummer 5 in onderstaande afbeelding is geselecteerd, moet het
silicakorrelpartijnummer voor elk monster worden weergegeven
13. Druk de werklijst af door het pictogram Run laden aan te raken, gevolgd door het pictogram Werklijst
afdrukken
.
14. Druk op de knop Lysisreagens afgeven
. Het duurt ongeveer 12 minuten voordat lysis in het instrument
voltooid is.
15. Bereid als volgt voor elk monstervat magnetische deeltjes voor met behulp van de Biohit-pipet en pipettips
voor maximaal acht reacties:
a. Zuig met 1 tip en programma 1 550 µl nucleasevrij water op en pipetteer dit in een 1,5 ml
DNAse/RNAse-vrije microfugebuis.
b. Vortex de magnetische silica. Zuig met 1 tip en programma 1 550 µl magnetische silica op, pipetteer
dit bij het water en meng door vortexen.
c. Zuig met 1 tip en programma 2 1050 µl van het magnetische silicamengsel op en pipetteer 25 µl terug
in dezelfde buis.
d. Pipetteer 125 µl magnetisch silicamengsel 8 keer in 8 wells van een ELISA-stripplaat. Gooi de tip weg.
e. Zuig na voltooiing van de lysis (NB: de Instrumentstatus onderin het scherm moet op Stil staan!), met
8 tips en programma 3 100 µl magnetisch silicamengsel op uit de stripwells, pipetteer 100 µl
magnetisch silicamengsel terug in de stripwells en zuig nogmaals 100 µl magnetisch silicamengsel op
uit de stripwells.
f. Laat de tips in de vloeistof in de monstervaten zakken. Zuig 800 µl op en pipetteer daarna 900 µl
magnetisch silicamengsel terug in het vat. Zuig 1000 µl magnetisch silicamengsel uit het vat en doe
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1000 µl magnetisch silicamengsel terug in het vat. Herhaal het opzuigen/terugpipetteren van 1000 µl
nog twee keer.
16. Sluit het instrument en druk op de knop ‘Start’
om de run te starten.
17. Breng na voltooiing van de run het gezuiverde nucleïnezuur over naar nucleasevrije buizen. Gebruik
gezuiverde nucleïnezuren onmiddellijk of vries ze in bij -70°C.
Beperkingen: Het volgende protocol is specifiek ontwikkeld voor gebruik met deze assay. Of het voor andere
assays geschikt is, is niet bekend. Vraag bij bioMérieux S.A. na of uw software compatibel is.
Initiële programmering van de Thermocycler
Programmeerinstructies voor de SmartCycler II
1.
2.
De SmartCyclerDx-software versie 3.0b opstarten
De Quidel Molecular Influenza A+B-assay invoeren
a. Selecteer de knop Define Assays boven aan het scherm
b. Geef de assay een naam
i. Selecteer de knop Nieuw in de linkeronderhoek van het scherm
ii. Type ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ en selecteer OK
iii. ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ wordt nu toegevoegd boven aan de lijst Assay Name linksboven
in het scherm
c. Stel de analysewaarden in: Selecteer onder Assay Type: Research het tabblad Analysis Settings en
verzeker u ervan dat de volgende specificaties zijn ingesteld:
i. Selecteer FATA25 in het vervolgkeuzemenu kleurstofset.
ii. Het vervolgkeuzemenu Type analyse moet worden ingesteld op Kwalitatief (standaardinstelling)
iii. Voer in de kolom Naam kanaal ‘Influenza A’ voor FAM, ‘Influenza B’ voor Alx532 en ‘PRC’ voor
Alx647 in
iv. Selecteer in de kolom Gebruik Doel in de vervolgkeuzemenu’s voor influenza A en influenza B, en
selecteer Interne controle voor PRC. Bij het selecteren van Interne controle verschijnt
onderstaande waarschuwing in beeld. Selecteer de knop Ja.
v. Voer in de kolom Analyse van de curve voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) Primaire
curve in (de standaardinstelling).
vi. Voer in de kolom Drempelinstelling voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) Handmatige
drempel in (de standaardinstelling).
vii. Voer in de kolom Handmatige drempel fluoreenheden de volgende drempelwaarden in:
a. Influenza A:
20.0
b. Influenza B:
20.0
c. PRC:
20.0
viii. Voer in de kolom Waarde min cyclus voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 10 in.
ix. Voer in de kolom Waarde max cyclus voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 45 in.
x. Gebruik in de kolom Achtergrondaftrek voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) “AAN” (de
standaardinstelling).
xi. Voer in de kolom Achtergrond minimale cyclus voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 5 in
(de standaardinstelling).
xii. Voer in de kolom Waarde max cyclus voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 45 in.
pagina 10 van 32
xiii. Houd in de kolom Boxcar gemiddelde cycli voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 0 aan (de
xiv. Voer in de kolom Eindpunt drempelwaarde voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B, PRC) 20 in (de
xv. Houd in de kolom NC IC% voor elk kanaal (PRC) “Niet van toepassing” aan (de standaardinstelling).
xvi. Houd in de kolom IC Delta voor elk kanaal (Influenza A, Influenza B) “Niet van toepassing” aan (de
xvii. Selecteer in het gedeelte Tekst resultaat aanpassen (onder de tabel) Tekst resultaat o.b.v.
organisme in het vervolgkeuzemenu. Er verschijnt een venster met onderstaande waarschuwing in
beeld. Selecteer Ja.
xviii. Selecteer de knop Aanpassen om het dialoogvenster Tekst resultaat o.b.v. organisme organisme
te openen. Selecteer de knop Toevoegen, voer ‘Influenza A’ in de kolom Naam organisme in en
vink het vakje Influenza A aan. Selecteer nogmaals de knop Toevoegen, voer ‘Influenza B’ in de
kolom Naam organisme in en vink het vakje Influenza B aan.
d.
Klik op OK onderin het pop-upvenster
Stel de cyclustijden en temperaturen voor RT-PCR onderin het scherm als volgt in:
i. Fase 1
1. Aanhouden
2. Temp:
55.0
3. Secs:
300
4. Optica:
UIT
ii. Fase 2
1. Aanhouden
2. Temp:
60.0
3. Secs:
300
4. Optica:
UIT
iii. Fase 3
1. Aanhouden
2. Temp:
65.0
3. Secs:
300
4. Optica:
UIT
iv. Fase 4
1. 2-temperatuurcyclus
pagina 11 van 32
2.
3.
3.
Aantal keer te herhalen:
50
Eerste temperatuurrij:
a. Temp:
92.0
b. Secs:
5
c. Optica:
UIT
4. Tweede temperatuurrij
a. Temp:
57.0
b. Secs:
40
c. Optica:
AAN
Sla het protocol op met de knop Opslaan onderin het scherm te selecteren
Afbeelding van het gehele Quidel Molecular Influenza A+B-protocol
Beperkingen: Het volgende protocol is specifiek ontwikkeld voor gebruik met de Quidel Molecular Influenza A+B
Real-time RT-PCR-assay. Of het voor andere assays geschikt is, is niet bekend. Controleer bij Cepheid of uw
software compatibel is.
Programmeerinstructies voor 7500 Fast DXP
1.
2.
Start de 7500 Fast Dx-software op.
Het dialoogvenster Snel opstartdocument gaat open. Selecteer de knop Nieuw document aanmaken om de
Nieuw document-wizard te starten. Voer alle stappen uit om het Quidel Molecular Influenza A+B-protocol op
te starten.
a. Definieer het document: De meeste van de onderstaande instellingen horen fabrieksinstellingen te
zijn. Zo nee, verander ze dan dienovereenkomstig.
i. Bevestig dit of voer de volgende informatie in.
b.
Assay:
Standaardcurve (absolute kwantificering)
Container:
96-Well doorzichtig
Sjabloon:
Blanco document
Runmodus:
Fast 7500
Bediener:
voer uw naam in
Opmerkingen:
SDS v1.4 (vul meer in indien nodig)
Naam van de plaat:
ii. Selecteer de knop Volgende.
Selecteer de detectoren: Er moeten nieuwe detectoren voor Influenza A, Influenza B en de
procescontrole (PCR) worden toegevoegd. Selecteer per doel de knop Nieuwe detector om het pop-
pagina 12 van 32
upvenster Nieuwe detector te openen. Ook kan de knop Nog een aanmaken in het pop-upvenster
Nieuwe detector gebruikt worden voor de laatste twee detectoren.
i. Voer per detector de volgende informatie in.
Naam
Indicatiekleurstof
Quencher-kleurstof
Influenza A
FAM
(geen)
Influenza B
JOE
(geen)
PRC
Cy5
(geen)
c.
d.
Kleur
(selecteren)
(selecteren)
(selecteren)
ii. Selecteer voor elke detector een unieke kleur.
iii. Markeer de nieuwe detectoren en voeg ze toe aan de kolom Detectoren in document met
behulp van de knop Toevoegen.
iv. Selecteer (geen) in het vervolgkeuzemenu Passieve referentie.
v. Selecteer de knop Volgende.
vi. Selecteer de knop Voltooien zonder wells in te stellen.
De wizard sluit af en de software start op met het tabblad Setup. Nu wordt de monsterplaat getoond
die tijdens de snelstart is ingesteld. Voor de initiële set-up hoeft hier niets gewijzigd te worden.
Het Theromocycler-protocol definiëren: Selecteer het tabblad Instrument om de cyclustijden en
temperaturen voor de Quidel Molecular Influenza A+B RT-PCR in te stellen. Onder Thermisch profiel
hoort een standaard 2-fasenprotocol te staan. Elke fase heeft 3 door de gebruiker bewerkbare
tekstvakken. De waarde in het bovenste vak staat voor het aantal herhalingen of cycli voor die fase.
De waarde in het middelste vak staat voor de temperatuur (°C) en de waarde in het onderste vak
staat voor de tijd (minuten: seconden).
i. Wijzig het volgende in het standaard Protocol thermische cycler:
1. Fase 1
a. Herhalingen:
1
b. Temp:
55
c. Tijd:
5:00
2. Selecteer de balk tussen fase 1 en fase 2. Selecteer de knop Toevoegen aanhouden
om nog een fase toe te voegen.
3. Fase 2
a. Herhalingen:
1
b. Temp:
60
c. Tijd:
5:00
4. Selecteer de balk tussen fase 2 en fase 3. Selecteer de knop Toevoegen aanhouden
om nog een fase toe te voegen.
5. Fase 3
a. Herhalingen:
1
pagina 13 van 32
b. Temp:
65
c. Tijd:
5:00
6. Fase 4 (2-staps dissociatiefase)
a. Reps: 10
b. Stap 1
i. Temp:
92
ii. Tijd:
0:05
c. Stap 2
i. Temp:
57
ii. Tijd:
0:40
7. Selecteer de balk rechts van fase 4. Selecteer de knop Cyclus toevoegen om nog
een fase toe te voegen.
8. Fase 5 (2-staps dissociatiefase)
a. Reps: 35
b. Stap 1
i. Temp:
92
ii. Tijd:
0:05
c. Stap 2
i. Temp:
57
ii. Tijd:
0:40
9. Als er een verkeerde fase wordt toegevoegd, kan deze worden verwijderd door
deze tussen de verticale lijnen te markeren en daarna op de knop Wissen
te drukken
ii. Voer onder Instellingen het volgende in:
Monstervolume (μl):
20 (standaard)
Runmodus:
7500 Fast (standaard)
Gegevensverzameling:
Fase 5, stap 2 (57.0 @ 0:40)
OPMERKING: Vink het vakje naast Expertmodus niet aan.
pagina 14 van 32
iii. Definitief protocol
e.
Stel per analyt de drempelwaarde in.
i. Selecteer het tabblad Resultaten.
ii. Selecteer het tabblad Amplificatiegrafiek.
iii. Selecteer Influenza A in het tabblad ‘Detector’ in de rechter bovenhoek.
iv. Stel in het blok Analyse-instellingen de Threshold in op 1.5e5.
v. Selecteer het keuzerondje Auto Baseline.
vi. Herhaal iii-v voor Influenza B met de Drempelwaarde op 1.2e5.
vii. Herhaal iii-v voor PCR met de Drempelwaarde op 2.7e4.
f.
Sla het nieuwe protocol op als sjabloon voor toekomstig gebruik.
i. Selecteer boven in het scherm Bestand en daarna Opslaan als.
ii. Opslaan in: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Bestandsnaam: ‘Quidel Molecular Influenza A+B’
iv. Opslaan als type: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Sluit de software af.
g.
Beperkingen: Het volgende protocol is specifiek ontwikkeld voor dit gebruik. Of het voor andere assays geschikt is,
is niet bekend. Controleer bij Life Technologies of uw software compatibel is.
pagina 15 van 32
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument Programmeerinstructies
Het programmeren van het instrument wordt gedaan met gebruik van het TDD-bestand dat bij de
testset zit.
Assayprocedure
Voer de volgende procedures uit bij een constante kamertemperatuur tussen 20° en 25°C.
Procedure voor het extraheren van nucleïnezuur
Raadpleeg de programmeerinstructies voor het NucliSENS easyMAG-systeem hierboven.
1. Voeg 20 µl procescontrole toe aan de monsterextractie-well.
2. Voeg 180 µl patiëntenmonster of externe controle toe aan een monsterextractie-well.
3. Voer de extractie uit volgens de instructies van de fabrikant.
Rehydratieprocedure voor de mastermix
1. Stel vast hoeveel monsters er getest moeten worden en neem een dienovereenkomstig aantal flacons
met gelyofiliseerde mastermix (één flacon voor acht tests) om de test mee uit te voeren.
2. Bewaar eventueel ongebruikt reagens onder de juiste opslagomstandigheden.
3. Open de mastermixflacon voorzichtig zodat het pellet ongestoord blijft liggen.
4. Voeg 135 µl rehydratieoplossing toe aan de mastermix.
5. Laat de flacon 1-2 minuten bij kamertemperatuur staan zodat het pellet gerehydrateerd wordt.
6. Pipetteer voorzichtig 2-3 keer op en neer (en vermijd het ontstaan van belletjes) alvorens de mix in de
eerste PCR-buis of microtiterwell te pipetteren.
Opmerking: De gerehydrateerde Master Mix is voldoende voor acht reacties.
Opmerking: De gerehydrateerde Master Mix kan maximaal 24 uur bij kamertemperatuur bewaard
worden of maximaal 2 weken bij -20°C of lager. (Zie het deel “Opslag en hantering van reagentia uit de
kit” voor verdere mogelijkheden voor opslag)
RT-PCR-set-up-procedure:
1. Voeg 15 µL van de gerehydrateerde Master Mix aan iedere reageerbuis of well op de plaat toe.
2. Voeg 5 µl geëxtraheerd nucleïnezuur (monster met de procescontrole) toe per reageerbuis of well op de
plaat. Mengen van de reagentia is niet nodig.
Opmerking: Gebruik voor elk geëxtraheerd monster een nieuwe micropipet met tip met aerosolfilter.
3. Sluit de reageerbuisjes of verzegel de plaat.
Opmerking: Quidel beveelt aan bij elke thermocycler-run een reageerbuisje of een well met een externe
positieve controle voor Influenza A/Influenza B en een negatieve controle mee te nemen. Neem controles
mee volgens het gebruik en het beleid in uw laboratorium.
4. Centrifugeer de reageerbuisjes of de plaat minimaal 15 seconden. Zorg dat alle vloeistof zich onder in het
buisje bevindt.
5. Plaats de buisjes of de plaat in de thermocycler.
Amplificatieprotocol op de SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Schakel het/de blok(ken) van de SmartCycler aan
Start de SmartCyclerDx-software op (versie 3.0b)
Selecteer de knop Run creëren van boven in het scherm om de run aan te maken
Voer onder Naam van de run een naam in voor de run in kwestie (JJMMDD-Quidel Molecular Influenza
A+B)
Onder Notities kunt u allerlei informatie over de run invullen om later terug te lezen
Onder Assay kiest u de ‘Quidel Molecular Influenza A+B’ assay uit het vervolgkeuzemenu
Onder Assayinformatie voert u het partijnummer en de houdbaarheidsdatum van de kit in.
Kies de wells die gebruikt gaan worden op een van de volgende manieren:
a. Ga als volgt te werk voor volledig automatische toewijzing van wells:
i. Onder Aantal monsters voert u het aantal monsters in in het tekstvakje dat verschijnt.
ii. Selecteer de knop Toepassen. Het ingevoerde aantal rijen verschijnt in de Locatietabel.
b. Voor het handmatig sluiten van wells op de SmartCycler-blokken doet u het volgende:
i. Selecteer de knop Locaties toevoegen/verwijderen bij de onderkant van het scherm.
ii. Dit opent het pop-up-venster Locaties kiezen met twee kolommen. De linker kolom (Sites) geeft
alle beschikbare locaties weer en de rechter kolom (Selections) bevat alle gekozen locaties.
pagina 16 van 32
9.
10.
11.
12.
13.
iii. Om alle locaties te kiezen, klikt u op de knop Alle locaties selecteren.
iv. Om specifieke locaties te kiezen, markeert u een of meer locaties en gebruikt u het pijltje naar
rechts om die locatie(s) aan de Selections-kolom toe te voegen.
v. Selecteer de knop OK om het venster te sluiten. De gekozen locaties zullen in de Locatietabel
verschijnen.
Voer in de de identificatiegegevens van de monsters in onder de kolom Monster-ID in de tabel
Locatietabel (dit kan ook worden gedaan nadat de run is gestart).
Voer eventuele opmerkingen in de kolom Notes in en laat de entry’s in de kolom Soort monster staan op
‘SPEC’.
Selecteer de knop Start Run onder in het scherm.
Selecteer de knop Resultaten aflezen om de voortgang van de run te zien.
Sla de run op nadat hij afgelopen is en voordat u de software verlaat.
Amplificatieprotocol op de 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Zet de 7500 Fast Dx aan.
Start de 7500 Fast Dx-software op.
Het dialoogvenster Ssnel opstartdocument gaat open.
Klik op Een nieuw document aanmaken.
De meeste van de onderstaande instellingen zouden standaard moeten zijn ingesteld. Zo nee, verander ze
dan dienovereenkomstig.
Assay:
Standaardcurve (absolute kwantificering)
Container:
96-Well doorzichtig
Sjabloon:
Runmodus:
Fast 7500
Bediener:
voer uw naam in
Opmerkingen:
SDS v1.4 (vul meer in indien nodig)
Naam van de plaat:
JJMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Set-up van een plaat met monsters
a. Onder de tabbladen Setup en Plaat verschijnt de set-up van de plaat.
b. Selecteer alle wells waar monster in komt te zitten, klik met de rechtermuisknop en selecteer de Well
Inspector uit het vervolgkeuzemenu. Als het pop-up-venster Well Inspector verschijnt, selecteert u
de detectoren voor Influenza A, Influenza B en PRC.
c. Gebruik de Well Inspector om de namen van de monsters in te voeren. In het Well Inspector-venster
mogen identificatienummers van patiënten worden ingevoerd; het verdient echter aanbeveling dit te
doen vóórdat de gelyofiliseerde mastermix geresuspendeerd wordt, na afloop van de run, of met de
importfunctie, om de tijd die de PCR-reacties op kamertemperatuur doorbrengen vóór de run
te minimaliseren.
d. Sla de run op als JJMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
e. Een venster wordt geopend met de vraag Reden van verandering invoer. Voer “Setup” in en ander
commentaar relevant voor de run.
De PCR starten
a. Selecteer het tabblad Instrument.
b. Zet de 96-well-PCR-plaat in de machine.
c. Selecteer onder Instrument Control de Start-knop om de run te starten.
pagina 17 van 32
8.
Na afloop van de PCR
a. BELANGRIJK: Druk als de run afgelopen is op OK. Analyseer de data door op de knop Analyseren in
het bovenste menu te drukken en sla het bestand op.
b. Sla het bestand op door in de taakbalk op Document opslaan te drukken. Een venster wordt geopend
waarin gevraagd wordt naar de Reden van verandering invoer. Voer “Data-analyse post-run” in en
ander commentaar relevant voor de run.
Amplificatie-protocol op het QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Zet QuantStudio Dx aan.
Kies de IVD-modus op het instrument.
Start het QuantStudio Dx IVD softwarepakket.
Voer de Gebruikersnaam en het Wachtwoord in voor het systeem wanneer daarom wordt gevraagd.
Het venster Home wordt geopend.
Markeer in de box Setup de eerder geladen testnaam “Quidel Molecular Influenza A + B Assay”
Klik op de knop Setup om een run te starten.
Het scherm Setup, testeigenschappen wordt getoond. Voer de betreffende run-informatie in.
a. Voer de Experimentnaam in (standaardinstelling start de run met datum-tijdstempel).
b. Voer de Barcode van de plaat in.
c. Leg de partijnummers van het materiaal vast onder Reagens-informatie.
d. Sla de run op als JJMMDD-Quidel Molecular Influenza A + B.sds.
e. Een venster wordt geopend waarin gevraagd wordt naar de Reden van verandering invoer. Voer
“Setup” in en ander commentaar relevant voor de run.
Selecteer in de linker menubalk Definiëren.
Bewerk de monsterinformatie.
a. Voer specifieke monsterinformatie in voor elke well door de standaardidentificator (Patiënt 1,
Patiënt 2, etc.) te verwijderen en nieuwe informatie in te voeren, OF
b. Selecteer Import uit bestand bovenaan de weergave om een voorgedefinieerde plaatkaart uit een
tekstbestand (tab delimited) te uploaden.
Selecteer in de linker menubalk Toewijzen om de correcte setup van de plaat te verifiëren.
Laden van de monsterplaat.
a. Werp de instrumentenlade uit.
b. Voer de 96 well PCR plaat in in de machine met de A1 well gepositioneerd in de linker bovenhoek.
c. Schuif de instrumentenlade terug.
Starten van de run.
a. Selecteer in de linker menubalk Run.
b. Klik op de groene knop Start Run bovenaan het scherm.
i. Selecteer als daarom gevraagd wordt het serienummer dat specifiek is voor het
gebruikte instrument.
Wanneer de run klaar is selecteert u Analyse in de linker menubalk.
a. Sla het bestand op door op Opslaan te drukken in taakbalk. Een venster wordt geopend waarin
gevraagd wordt naar de Reden van verandering invoer. Voer “Data-analyse post-run” in en ander
commentaar relevant voor de run.
b. Standaard wordt de Amplificatiegrafiek getoond. Om andere grafieken te zien selecteert u deze van
de linker menubalk.
c. Om informatie over de run te bekijken met Ct-waarden, selecteert u de tab Well-tabel aan de
rechterkant van het scherm.
Een rapport afdrukken.
a. Selecteer in de bovenste menubalk Rapport afdrukken. Pas het rapport aan aan uw wensen door
vakken te (de)selecteren van het rapportagevenster.
b. Selecteer de knop “Rapport afdrukken” onder in de dialoogbox.
pagina 18 van 32
16. Databestanden exporteren.
a. Selecteer in de linker menubalk Exporteren.
b. Voer de Exportlocatie voor het bestand in OF klik op Browse om het gewenste pad te vinden.
c. De Exportnaam bestand wordt standaard die van de opgeslagen run.
d. Selecteer Excel als bestandstype.
e. Pas het geëxporteerde datarapport aan door de beschikbare tabs aan en uit te zetten en opties te
selecteren en deselecteren.
f. Selecteer Start Export aan de onderkant van het scherm.
De resultaten interpreteren
Interpretatie van de resultaten verkregen met de SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Selecteer het tabblad Resultaten inzien nadat de run is afgelopen.
Selecteer het tabblad Resultaten van de monsters.
De software van de SmartCycler geeft automatisch aan of de monsters positief of negatief zijn voor
Influenza of dat de run ongeldig is (niet beoordeelbaar).
Meer gedetailleerde informatie is te vinden onder de respectievelijke tabbladen van elk analyt in
hetzelfde venster. Als er een positieve uitslag wordt gegeven voor hetzij Influenza A hetzij B (of beide), is
het PRC-resultaat niet van toepassing. De PRC speelt alleen een rol bij negatieve uitslagen.
Interpretatie van de uitdraai van de resultaten van de Quidel Molecular Influenza A+B assay op
de SmartCycler II.
Resultaat van
de assay
Procescontroleresultaat
Influenza A
Influenza B
Negatief
Goed
NEG
NEG
Niet van toepassing*
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
Positief voor
Influenza A
Positief voor
Influenza B
Positief voor
Influenza A en
Influenza B
Geen nucleïnezuur van Influenza A of
Influenza B gedetecteerd;
PRC gedetecteerd
Influenza A-nucleïnezuur
gedetecteerd
Influenza B-nucleïnezuur
gedetecteerd
Nucleïnezuur van Influenza A en
Influenza B gedetecteerd
Niet te beoordelen – remming van
de PCR of slecht reagens. Herhaal de
Ongeldig
Slecht
NEG
NEG
test met het gezuiverde nucleïnezuur
of neem een nieuw monster af en
test dat.
*Er is geen waarde vereist om bij de controle van het proces een positieve uitslag te krijgen.
Foutcode 3079: Waarschuwing/foutcode 3079 kan gezien worden met monsters die positief zijn voor Influenza A
en Influenza B. Waarschuwing/foutcode 3079 treedt op als het fluorescentiesignaal (RFU) te hoog is. In een
dergelijk geval worden alle resultaten voor het monster in kwestie door de Dx-software gegeven als ND (Not
Determined) [niet bepaald]. Als er een uitslag gerapporteerd wordt met een Ct-waarde ≥ 10 of ≤ 45 voor Influenza
A of Influenza B, dan kan het resultaat van het monster als POS voor Influenza A of Influenza beschouwd worden.
pagina 19 van 32
Interpretatie van de uitslag verkregen met de 7500 Fast Dx thermocycler
Interpretatie van de resultaten van de Quidel Molecular Influenza A+B-assay op de
7500 Fast Dx thermocycler
Resultaat van
de assay
Detector:
Influenza A
Detector:
Influenza B
Detector:
Procescontrole
Influenza B gedetecteerd;
PRC gedetecteerd
Positief voor
Ct < 5,0 of
Niet van
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Influenza A
Ct > 35,0
toepassing*
gedetecteerd
Positief voor
Ct < 5,0 of
Niet van
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Influenza B
Ct > 35,0
toepassing*
gedetecteerd
Positief voor
Niet van
5,0 ≤ Ct ≤35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Influenza A en B
toepassing*
Ct < 5,0 of
Ct < 5,0 of
Ct < 5,0 of
Influenza B en PRC gedetecteerd;
Ongeldig
Ct > 35,0
Ct > 35,0
Ct > 35,0
ongeldige run, draai de run nogmaals
of extraheer opnieuw
Niet bepaald, draai de run nogmaals
Ongeldig
Niet bepaald
Niet bepaald
Niet bepaald
*Er is geen Ct-waarde nodig voor de procescontrole om een monster positief te noemen.
Ct < 5,0 of
Ct > 35,0
Negatief
Ct < 5,0 of
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Interpretatie van de resultaten met het QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Interpretatie van de resultaten van de Quidel Molecular Influenza A+B-assay op het QuantStudio Dx
Real-Time PCR Instrument
Resultaat van
de assay
Detector:
Influenza A
Detector:
Influenza B
Detector:
Procescontrole
Geen nucleïnezuur van Influenza A
of Influenza B gedetecteerd;
PRC gedetecteerd
Positief voor
Geen Ct
Niet van
Ct ≤40,0
Influenza A
vermeld (leeg)
toepassing*
gedetecteerd
Positief voor
Geen Ct
Niet van
Ct ≤40,0
Influenza B
vermeld (leeg)
toepassing*
gedetecteerd
Positief voor
Niet van
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
Influenza A en B
toepassing*
Geen Ct
Geen Ct
Geen Ct
Influenza B en PRC gedetecteerd;
Ongeldig
vermeld (leeg)
vermeld (leeg)
vermeld (leeg) ongeldige run, draai de run nogmaals
*Er is geen Ct-waarde nodig voor de procescontrole om een monster positief te noemen.
Negatief
Geen Ct
vermeld (leeg)
Geen Ct
vermeld (leeg)
Ct ≤40,0
Kwaliteitscontrole
De Quidel Molecular Influenza A+B-assay bevat een aantal controles om de prestatie van de assay to bewaken.
1.
2.
3.
De procescontrole moet worden meegenomen bij de extractie en de amplificatiestap van de assay. Deze
controle moet voorafgaand aan de extractie van het monster worden toegevoegd aan elk aliquot.
In de handel verkrijgbare externe positieve Influenza A/B-controles kunnen als patiëntenmonster worden
behandeld en moeten volgens de standaardmethode van uw laboratorium worden gebruikt.
Patiëntenmateriaal waarvan eerder is vastgesteld dat het positief is voor Influenza A of Influenza B mag een
commerciële Influenza A/B-controle vervangen.
Virale transportmedia of patiëntenmateriaal waarvan eerder is vastgesteld dat het negatief is, mag als externe
negatieve controle worden gebruikt. Dit moet als patiëntenmateriaal behandeld worden en de test moet
worden uitgevoerd volgens de huidige laboratoriumnormen.
pagina 20 van 32
Beperkingen
Deze test is niet bedoeld om te differentiëren tussen Influenza A-subtypes zoals het nieuwe Influenza A-H1N1.
Aanvullend onderzoek is nodig als subtypedifferentiatie gewenst is.
Negatieve uitslagen sluiten een infectie met Influenzavirus niet uit en dienen niet de enige basis te vormen
voor een beslissing al dan niet te behandelen.
Zoals met andere assays van dit type bestaat het risico van vals negatieve resultaten door aanwezigheid van
variante gensequenties in het virale doelmateriaal.
Onjuiste afname, opslag of transport kunnen aanleiding geven tot vals negatieve resultaten.
In het monster aanwezige remmers en/of fouten bij het uitvoeren van de assayprocedure kunnen leiden tot
vals negatieve resultaten.
Klinische prestaties
De prestatiekenmerken van de Quidel Molecular Influenza A+B-test werden verkregen tijdens een prospectieve
studie in het seizoen voor ademhalingsvirussen in 2011 (januari t/m maart). Voor deze studie gebruikte monsters
waren: specimen verzameld met nasale en nasofaryngeale teststaafjes die werden verzameld voor het
routinematig testen op influenza.
De referentiemethode was snelle cultuur (‘rapid culture, shell vial’), gevolgd door directe fluorescente
antilichaamscreening (direct fluorescent antibody - DFA-screening) en -identificatie.
In totaal werden 637 monsters van teststaafjes getest met Quidel Molecular Influenza A+B-test en op cultuur.
Zes (6) monsters die in eerste instantie leidden tot onopgeloste resultaten, bleven ook na het opnieuw testen met
de Quidel Molecular Influenza A+B-test onopgelost en werden niet in onderstaande analyse opgenomen.
In totaal bleken 6 monsters DFA Respiratory Virus Screen-positief (het screenreagens detecteert Influenza A en B,
RSV, Parainfluenza 1, 2 en 3 en Adenovirus). Deze monsters bevatten echter te weinig cellen om een specifieke
positieve identificatie te verkrijgen. In totaal 3 monsters hadden een toxische celcultuur. Deze 9 specimen zijn niet
in de onderstaande analyse opgenomen.
Tegenstrijdigheidsanalyse voor monsters waarbij de resultaten van Quidel Molecular Influenza A+B-test en de
cultuur niet met elkaar overeenkwamen, werd uitgevoerd met behulp van een CE-gekeurde RT-PCR-test en, waar
gepast, bidirectionele sequencing.
pagina 21 van 32
Influenza A
Vers nasaal/nasofaryngeaal
teststaafje (N=622)
Quidel Molecular
Influenza A+B-test
Positief
Vergelijker: Cultuur met DFA
Positief
Negatief
Totaal
93
18*
111
Negatief
1**
510
511
Totaal
94
528
622
95% CI
Gevoeligheid
93/94
98,9%
94,2% tot 100%
Specificiteit
510/528
96,6%
94,7% tot 98,0%
*17 van deze specimen werden door het CE-IVD-instrument aangemerkt als influenza
A-positief. Het resterende specimen (1) werd door het CE-IVD-instrument aangemerkt
als influenza A-negatief, maar sequentie-analyse toonde aan dat het preparaat positief
was voor het influenza A-virus
** Het specimen was volgens het CE-IVD-instrument ook influenza A-negatief.
Influenza B
teststaafje (N=622)
Quidel Molecular
Influenza A+B-test
Positief
Vergelijker: Cultuur met DFA
Positief
Negatief
Totaal
74
7*
81
Negatief
2**
539
541
Totaal
76
546
622
95% CI
Gevoeligheid
74/76
97,4%
90,8% tot 99,7%
Specificiteit
539/546
98,7%
97,4% tot 99,5%
*5 specimen werden door het CE-IVD-instrument aangemerkt als influenza B-positief,
2 preparaten werden door het CE-IVD-instrument aangemerkt als influenza B-negatief,
maar werden bij sequentie-analyse gekarakteriseerd als positief voor het influenza B-virus.
**1 specimen werd door het CE-IVD-instrument als influenza B-positief aangeduid,
1 specimen was volgens het CE-IVD-instrument influenza B-negatief
pagina 22 van 32
In totaal werden 626 monsters getest met Quidel Molecular Influenza A+B-test en middels een CE-gekeurde IVD
RT-PCR-test. Zes (6) monsters die in eerste instantie leidden tot onopgeloste resultaten, bleven ook na het
opnieuw testen middels beide analyses onopgelost en werden niet in onderstaande analyse opgenomen. Nog 10
specimen leidden in de CE-gekeurde IVD RT-PCR-test tot onopgeloste resultaten en bleven tot het opnieuw testen
met de analyse onopgelost. Deze preparaten zijn niet in onderstaande analyse opgenomen.
Tegenstrijdigheidsanalyse voor monsters waarbij de resultaten van Quidel Molecular Influenza A+B-test en een CEgekeurde RT-PCR-test niet met elkaar overeen kwamen werd uitgevoerd middels sequencing.
Influenza A
teststaafje (N=610)
Quidel Molecular
Influenza A+B-test
Vergelijker: CE-IVD-instrument
Positief
Negatief
Totaal
Positief
107
3*
110
Negatief
0
500
500
107
503
610
Totaal
95% CI
Gevoeligheid
107/107
100%
96,6% tot 100%
Specificiteit
500/503
99,4%
98,3% tot 99,9%
*sequentie-analyse toonde aan dat 3 preparaten positief waren voor het influenza A-virus
Influenza B
teststaafje (N=610)
Quidel Molecular
Influenza A+B-test
Vergelijker: CE-IVD-instrument
Positief
Negatief
Totaal
Positief
77
5*
82
Negatief
4**
524
528
Totaal
81
529
610
95% CI
Gevoeligheid
77/81
95,1%
87,8% tot 98,6%
Specificiteit
524/529
99,1%
97,8% tot 99,7%
*sequentie-analyse toonde aan dat 5 preparaten positief waren voor het influenza B-virus
**sequentie-analyse toonde aan dat 4 preparaten negatief waren voor het influenza B-virus
Een subset van tweehonderdelf (211) specimen van de bovenstaande studie werd getest op het QuantStudio Dx
Real-Time PCR Instrument. De resultaten van deze test werden vergeleken met data van de tegelijk verlopende
test op de ABI 7500 Fast Dx. Deze vergelijking wordt hieronder getoond.
pagina 23 van 32
Quidel Molecular Influenza A+B-test
Influenza A
Vergelijker: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positief
Negatief
Totaal
Positief
63
0
63
Negatief
0
148
148
Totaal
63
148
211
95% CI
Gevoeligheid
63/63
100%
94,3% tot 100%
Specificiteit
148/148
100%
97,5% tot 100%
Quidel Molecular Influenza A+B-test
Influenza B
Vergelijker: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positief
Negatief
Totaal
Positief
28
0
28
Negatief
0
183
183
Totaal
28
183
211
95% CI
Gevoeligheid
28/28
100%
87,9% tot 100%
Specificiteit
183/183
100%
97,9% tot 100%
Analytische prestaties
Detectieniveau (LoD)
De analytische gevoeligheid (detectieniveau; LoD) van de Quidel Molecular Influenza A+B-test werd vastgesteld
met behulp van gekwantificeerde (TCID50/mL) culturen van 3 influenza A-stammen (1 H1N1, 1 2009H1N1 en
1 H3N2), 3 influenza B-stammen, serieel verdund in een negatieve nasofaryngeale matrix. Elke verdunning werd
geëxtraheerd met behulp van het NucliSENS easyMAG-systeem en getest in replicaties van 20 per concentratie
virus op zowel de Applied Biosystems® 7500 Fast Dx- of Cepheid SmartCycler® II-platforms. Analytische sensitiviteit
(LoD) is vastgesteld als de laagste concentratie waarbij 95% van alle replicaties positief getest werd.
Detectieniveau (LoD)
Stam
Uiteindelijke TCID50/mL LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Maleisië/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
pagina 24 van 32
Competitieve remming
Competitieve remming van de Quidel Molecular Influenza A+B-test werd beoordeeld met behulp van gesimuleerde
monsters met wisselende concentraties van het influenza A-virus (2x LoD tot 4 logs boven LoD) en het influenza Bvirus (2x LoD tot 4 logs boven LoD) in één monster. De monsters werden geëxtraheerd met behulp van het
NucliSENS easyMAG-systeem en in triplo getest. De aanwezigheid van zowel het influenza A-virus en het influenza
B-virus in wisselende concentraties in één monster had geen invloed op de analytische gevoeligheid
(detectieniveau, LoD) van de Quidel Molecular Influenza A+B-test.
Analytische reactiviteit (inclusiviteit)
De reactiviteit van de Quidel Molecular Influenza A+B-test werd beoordeeld tegen meerdere stammen van
influenza A- en influenza B-virussen. Het klinische panel bestond uit 10 Influenza A subtype H1N1, 2 Influenza A
subtype 2009H1N1, 8 Influenza A subtype H3N2, 2 Influenza A subtype H5N1 en 13 Influenza B-stammen. Ook
werd er een extra panel met niet-klinische beperkte isolaten getest. Alle panelonderdelen werden geëxtraheerd
met behulp van het NucliSENS easyMAG-instrument en in triplo getest.
De Quidel Molecular Influenza A+B-test detecteerde 100% van de influenza A- (38/38) en influenza B-stammen
2
3
(15/15) bij 10 tot 10 TCID50/mL-niveaus, waaronder nieuwe, pandemische en aviaire influenza A-stammen en
recentelijk circulerende influenza B-stammen.
Klinisch panel Influenza A-virussen
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
A/Nieuw Caledonië/20/1999
1,12E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/NWS/33
NA
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/Solomon-eilanden/3/06
1,41E+01
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
4,57E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
Subtype
Stam
TCID50/mL
H1N1
H1N1 A/Californië/07/2009
H1N1
pagina 25 van 32
Klinisch panel Influenza B-virussen
Stam
TCID50/mL
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Maleisië/25/06/04
3,41E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Allen/45
4,17E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Rusland/69
2,19E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/Lee/40
1,95E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negatief
Positief
Negatief
Positief
Niet-klinisch beperkte virussen
Subtype
Stam
TCID50/mL
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H2N2
A/Wilde eend/NY/6750/78 (H2N2)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H7N3
A/Kip/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H9N2
A/Kip/NJ/12220/97 (H9N2)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H4N8
A/Wilde eend/OH/338/86 (H4N8)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H6N2
A/Kip/CA/431/00 (H6N2)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H8N4
A/Blauwe taling/LA/B174/86 (H8N4)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H5N1
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H10N7
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H11N9
A/Kip/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H12N5
A/Eend/LA/188D/87 (H12N5)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H13N6
A/Meeuw/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H14N5
A/Wilde Eend/GurjevRusland/262/82 (H14N5)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H15N9
A/Pijlstormvogel/Australië/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
H16N3
A/Kustvogel/DE/172/2006(H16N3)
2,00E+02
Positief
Negatief
Positief
Negatief
pagina 26 van 32
Reproduceerbaarheid
De reproduceerbaarheid in het laboratorium van de Quidel Molecular Influenza A+B-analyse werd gecontroleerd in
3 verschillende laboratoria. De reproduceerbaarheid werd beoordeeld aan de hand van een panel met 6
gesimuleerde monsters van middelmatige (10x LoD), zeer negatieve (C20-60-concentratie) influenza A-virus,
influenza B-virus, positieve en negatieve controlemonsters. De panels en controlemonsters werden op elke locatie
gedurende 5 dagen getest door 2 operators (8 monsters en 3 controles x 2 operators x 5 dagen x 3 locaties = 330).
De panels en controlemonsters werden geëxtraheerd met behulp van het NucliSENS easyMAG-systeem en getest
op het 7500 Fast Dx-instrument.
Reproduceerbaarheid
Panel
ID van lid
Influenza A
Zeer negatief
Influenza A
Positief
(10x LoD)
Influenza B
Zeer negatief
Influenza B
Positief
(10x LoD)
Influenza A
Positieve controle
Influenza B
Positieve controle
Negatieve
controle
Locatie 1
Locatie 2
Locatie 3
Overeenkomst
met
Gem.
verwachte
Ct
resultaten
Overeenkomst
met
Gem.
verwachte
Ct
resultaten
Overeenkomst
met
Gem.
verwachte
Ct
resultaten
6/10
31,5*
%CV
8,8
10/10
N.v.t.
%CV
N.v.t. 9/10
%CV
34,3*
Totale
overeenkomst
met
verwachte
resultaat
N.v.t. 25/30
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
9/10
34,9
N.v.t.
10/10
N.v.t.
N.v.t.
10/10
N.v.t.
N.v.t.
30/30
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
10/10
N.v.t.
N.v.t.
10/10
N.v.t.
N.v.t.
10/10
N.v.t.
N.v.t.
30/30
Analytische specificiteit - Kruisreactiviteit
De analytische specificiteit van de Quidel Molecular Influenza A+B-analyse werd beoordeeld door een panel
bestaande uit 26 virale en 24 bacteriële stammen en 1 giststam te testen. De inhoud van dit panel
vertegenwoordigde veelvoorkomende respiratoire pathogenen of flora die veel voorkomen in nasofarynx. De
5
10
bacteriën en gist werden getest bij concentraties van 10 tot 10 CFU/mL. De virussen werden getest bij
3
6
concentraties van 10 tot 10 TCID50/mL. De monsters werden geëxtraheerd met behulp van het NucliSENS
easyMAG-instrument en driedubbel getest. De analytische specificiteit van de Quidel Molecular influenza A+Banalyse was 100%.
Kruisreactiviteit
3,70E+04
Resultaat
Influenza A
Negatief
Resultaat
Influenza B
Negatief
hMPV B1
2,37E+04
Negatief
Negatief
RSV Lang
4,40E+04
Negatief
Negatief
RSV Washington
1,75E+0
Negatief
Negatief
5,67E+04
Negatief
Negatief
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negatief
Negatief
Coranavirus OC43
1,67E+06
Negatief
Negatief
Coxsackievirus B4
2,43E+06
Negatief
Negatief
2,28E+06
Negatief
Negatief
Cytomegalovirus
8,76E+05
Negatief
Negatief
ID van het organisme
Slotconclusie
hMPV A1
pagina 27 van 32
Kruisreactiviteit
5,38E+08
Resultaat
Influenza A
Negatief
Resultaat
Influenza B
Negatief
Echovirus 9
1,50E+06
Negatief
Negatief
Echovirus 6
1,05E+08
Negatief
Negatief
Echovirus 11
1,50E+05
Negatief
Negatief
Enterovirus 71
2,68E+03
Negatief
Negatief
Enterovirus 70
1,66E+05
Negatief
Negatief
Epstein Barr Virus
5.000cp/mL
Negatief
Negatief
HSV Type 1 Maclnytre-stam
1,95E+06
Negatief
Negatief
HSV Type 2 G-stam
3,67E+06
Negatief
Negatief
Rubeola
3,78E+05
Negatief
Negatief
Mumpsvirus
8,43E+04
Negatief
Negatief
2,50E+05
Negatief
Negatief
2,20E+04
Negatief
Negatief
9,10E+05
Negatief
Negatief
9,57E+06
Negatief
Negatief
Varicella Zoster-virus
7,50E+02
Negatief
Negatief
1,04E+07
Negatief
Negatief
2,55E+07
Negatief
Negatief
2,10E+05
Negatief
Negatief
2,05E+08
Negatief
Negatief
6,90E+08
Negatief
Negatief
6,60E+07
Negatief
Negatief
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negatief
Negatief
5,90E+07
Negatief
Negatief
5,15E+07
Negatief
Negatief
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negatief
Negatief
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negatief
Negatief
2,15E+07
Negatief
Negatief
1,85E+08
Negatief
Negatief
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negatief
Negatief
3,30E+07
Negatief
Negatief
Escherichia coli
6,80E+07
Negatief
Negatief
5,85E+07
Negatief
Negatief
6,0E+05
Negatief
Negatief
1,03E+08
Negatief
Negatief
4,5E+07
Negatief
Negatief
2,05E+08
Negatief
Negatief
Slotconclusie
Echovirus 7
pagina 28 van 32
Kruisreactiviteit
2,50E+06
Resultaat
Influenza A
Negatief
Resultaat
Influenza B
Negatief
2,6E+07
Negatief
Negatief
5,15E+08
Negatief
Negatief
Candida albicans
1,07E+06
Negatief
Negatief
Slotconclusie
Analytische specificiteit - Storende verbindingen
De prestatie van de Quidel Molecular Influenza A+B-analyse werd beoordeeld met mogelijk storende verbindingen
die in nasofaryngeale monsters aanwezig kunnen zijn. De mogelijk storende verbindingen werden beoordeeld in
influenza A (A/Mexico/4108/2009), en influenza B (B/Florida/04/2006) bij concentraties van 3x en 10x LoD. Er was
geen bewijs dat de hieronder vermelde geteste verbindingen storingen veroorzaakten bij 3x of 10x LoD.
Mucin (onderkaak rund, type I-S)
60 µg/mL
Resultaat
Influenza A
(3x LoD)
Positief
Bloed (menselijk) EDTA ontstold
2% (vol/vol)
Positief
Positief
Neo-Synephrine
15% (vol/vol)
Positief
Positief
Afrin-neusspray
15% (vol/vol)
Positief
Positief
Zicam homeopathische niet slaperig
makend anti-allergiemiddel, zonder
druppels, vloeibare neusgel
5% (vol/vol)
Positief
Positief
15% (vol/vol) van dosis
Positief
Positief
0,68g/mL; 1/18 drop,
vermalen, actieve
bestanddelen:
1,7 mg/mL menthol
Positief
Positief
3,3-5 mg/mL
Positief
Positief
Tobramycine
4,0 µg/mL
Positief
Positief
Mupirocine
6,6-10 mg/mL
Positief
Positief
Oseltamivirfosfaat
7,5-25 mg/mL
Positief
Positief
Naam van de verbinding
Neusspray met zoutoplossing
Zuigtabletten voor keel
Geteste concentratie
Zanamivir
Resultaat
Influenza B
(3x LoD)
Positief
Onderzoek naar overdracht en kruisbesmetting
Een intern onderzoek leverde geen bewijs voor overdracht/kruisbesmetting met de Quidel Molecular
Influenza A+B-analyse met behulp van het bioMériuex NucliSENS easyMAG geautomatiseerde nucleïnezuurextractie-instrument.
Aanvullende bronmaterialen
1.
2.
3.
4.
5.
Viruses (maart 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path
(april 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1594.pdf.
Guidance on Informed Consent for In Vitro Diagnostic Device Studies Leftover Human Specimens that are Not
Individually Identifiable (april 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
Draft Guidance on Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens
(december 2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations
(Vol. 2, No. 34) (oktober 2004).
pagina 29 van 32
6.
CLSI MM13-A: Guidance for the Collection, Transport, Preparation and Storage of Specimens for Molecular
Methods (Vol. 25, No. 31) (december 2005).
7. CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed)
(november 2005).
8. CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14)
(september 2002).
9. CLSI MM6-A: Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, No.28)
(oktober 2003).
10. CLSI EP5-A2: Guidance for Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods
(Vol. 24, No. 25 Second Ed.) (augustus 2004).
Klantenservice en technische ondersteuning
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gedeponeerd handelsmerk van Life Technologies. NucliSENS® en easyMAG® zijn gedeponeerde handelsmerken van
bioMerieux, Inc. TaqMan® is een gedeponeerd handelsmerk van Roche. CAL Flour® Orange 560, CAL Flour® Red
610 en Quasar® 670 zijn gedeponeerde handelsmerken van BioSearch Technologies, Inc.
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De aankoop van dit product verleent de koper onder bepaalde Roche-octrooien het recht om het product
uitsluitend te gebruiken voor de levering van diensten op het gebied van humane in vitro diagnostiek. Hierbij
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pagina 30 van 32
Woordenlijst
Bevoegde vertegenwoordiger
in de Europese Unie
Fabrikant
Inhoud / bevat
Controle
Houdbaar tot
Catalogusnummer
Partijcode
Voor in-vitro-diagnoses
Raadpleeg de instructies voor gebruik
Beoogd gebruik
96
Bevat genoeg voor 96 bepalingen
Temperatuurbeperking
pagina 31 van 32
Bronnen
1
http://1918.pandemicflu.gov, bezocht op 6/9/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm bezocht op 6/9/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Virale cultuur; Goedgekeurde richtlijnen. CLSI document M41-A
M100 - Quidel Molecular Influenza A+B-assaykit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover
Duitsland
Quidel Corporation
Wereldwijd hoofdkantoor
quidel.com
M0002GNL00 (12/2012)
pagina 32 van 32
Dosage de l'influenza A+B
Instructions d'utilisation
Pour la détection qualitative et l'identification des acides nucléiques viraux de l'influenza A et
l'influenza B extraits d'écouvillons à prélèvement nasal, d'écouvillons à prélèvement
rhinopharyngé et d'échantillons d'aspirât / de lavage nasal.
Dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular (CE)
Page 1 sur 33
Sommaire
Utilisation prévue.......................................................................................................................................... 4
Résumé et explication ................................................................................................................................... 4
Principe de la procédure ............................................................................................................................... 4
Matériel fourni .............................................................................................................................................. 6
Matériel facultatif ......................................................................................................................................... 6
Matériel requis non fourni ............................................................................................................................ 6
Mises en garde .............................................................................................................................................. 7
Stockage et manipulation des kits de réactifs .............................................................................................. 7
Prélèvement, stockage et manipulation ....................................................................................................... 8
Stockage des extraits d'acide nucléique ....................................................................................................... 8
Instructions de programmation de l'extraction des acides nucléiques ........................................................ 8
Programmation initiale du thermocycleur ................................................................................................. 10
Instructions de programmation du SmartCycler II ................................................................................. 10
Instructions de programmation 7500 Fast DX ........................................................................................ 12
Instructions de programmation de l'appareil de détection en temps réel d'ACP Life Technologies
QuantStudioTM Dx.................................................................................................................................. 16
Procédure de test........................................................................................................................................ 16
Protocole d'amplification sur l’instrument SmartCycler II...................................................................... 16
Protocole d'amplification sur le thermocycleur ABI 7500 Fast Dx ......................................................... 17
Protocole d'amplification sur l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx ................ 18
Interprétation des résultats ........................................................................................................................ 19
Interprétation des résultats à l'aide du SmartCycler II ........................................................................... 19
Interprétation des résultats en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Dx ............................................... 20
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx . 20
Contrôle qualité .......................................................................................................................................... 20
Limitations .................................................................................................................................................. 21
Performance clinique .................................................................................................................................. 21
Performances analytiques .......................................................................................................................... 24
Page 2 sur 33
Niveau de détection .................................................................................................................................... 24
Inhibition compétitive................................................................................................................................. 25
Réactivité analytique (inclusion) ................................................................................................................. 25
Reproductibilité .......................................................................................................................................... 27
Tableau Spécificité analytique – réactivité croisée..................................................................................... 28
Études de rémanence et de contamination croisée ................................................................................... 30
Documentation source supplémentaire ..................................................................................................... 30
Assistance clientèle et technique ............................................................................................................... 30
Propriété intellectuelle ............................................................................................................................... 31
Marques déposées ...................................................................................................................................... 31
Glossaire...................................................................................................................................................... 32
Références .................................................................................................................................................. 33
Page 3 sur 33
Utilisation prévue
Le dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular est un dosage multiplex RT-PCR en temps réel pour la détection
qualitative et l'identification des acides nucléiques viraux de l'influenza A et l'influenza B extraits d'écouvillons à
prélèvement nasal, d'écouvillons à prélèvement rhinopharyngé et d'échantillons d'aspirat / de lavage nasal. Ce test
de diagnostic in vitro est destiné à contribuer au diagnostic différentiel des infections virales de l'influenza A et/ou
l'influenza B chez les humains. Le dosage ne permet pas de déceler la présence du virus de l’influenza C.
Des résultats négatifs n'excluent pas une infection par le virus de l'influenza et ne doivent pas constituer la seule
base pour le diagnostic, le traitement ou d'autres décisions de prise en charge. Des caractéristiques de
performance de l'influenza A ont été établies lorsque les influenzas A/H3 et A/H1 ont prédominé les virus de
l’influenza de type A en circulation. Les caractéristiques de performance peuvent varier lors de l’émergence
d’autres virus de l’influenza de type A.
Résumé et explication
Les virus de l’influenza (famille des Orthomyxoviridae) contiennent un génome à ARN monocaténaire, présent dans
8 segments distincts de ribonucléoprotéine. La segmentation du génome est rare parmi les virus et contribue
probablement au développement rapide de nouvelles souches d’influenza par l'échange de segments génétiques si
deux virus différents infectent la même cellule. Il existe 3 types d’influenza : A, B et C. Le type A a des équivalents
chez les oiseaux et les porcs ainsi que chez les êtres humains, alors que les types B et C ne sont connus que chez les
êtres humains. En raison de la possibilité d'une autre pandémie causée par l’influenza A, comme celle qui a
1
provoqué la mort de 30 à 50 millions de personnes dans le monde en 1918 , les centres de contrôle et de
prévention des maladies (CDC) et l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) assurent une surveillance constante
des s et réalisent des prévisions concernant les souches appropriées en vue de la production de vaccins.
2
On estime que 30 000 à 49 000 décès par an aux États-Unis sont causés par des maladies liées à l’influenza. Au
niveau mondial, les épidémies d’influenza annuelles causent trois à cinq millions de cas de maladie grave et près
3
de 250 000 à 500 000 décès. Les pandémies liées à l’influenza A surviennent environ tous les 10 à 30 ans et les
épidémies d’influenza A ou B surviennent tous les ans. Les infections sont saisonnières et s'étendent en général de
novembre à avril dans l'hémisphère Nord. Des complications ont tendance à se produire chez les jeunes, les
personnes âgées et les personnes ayant des maladies cardio-pulmonaires chroniques.
La période d'incubation est de 1 à 3 jours, avec une propagation rapide par l'inhalation des gouttelettes aériennes
et des objets contaminés. Elle est marquée par de la fièvre, des myalgies, des maux de tête et des pharyngites.
Principe de la procédure
Le test détecte les acides nucléiques viraux qui ont été extraits à partir d'un échantillon du patient. Une réaction
RT-PCR multiplexée en temps réel est réalisée dans des conditions optimisées dans un seul tube générant des
amplicons pour chaque virus cible présent dans l'échantillon. L'identification de l’influenza A se produit grâce à
l'utilisation d'amorces spécifiques de la cible et d'une sonde fluorescente qui hybrident les séquences de grippe A
conservées dans le gène de la protéine de matrice. L'identification de l’influenza B se produit grâce à l'utilisation
d'amorces spécifiques de la cible et de sondes fluorescentes qui hybrident les séquences d’influenza B conservées
dans le gène de la neuraminidase.
Étiquettes de sonde Quidel Molecular
Cible
Colorant
Influenza A
FAM
Influenza B
Témoin (ACP)
Quasar® 670
Page 4 sur 33
Voici un résumé de la procédure :
1.
Prélèvement : Obtenir les écouvillons de prélèvement nasal, rhinopharyngé et des échantillons d’aspirat / de
lavage nasal de patients symptomatiques en utilisant les techniques standard. Ces échantillons sont
4
transportés, stockés et traités conformément aux procédures de laboratoire établies.
2.
Extraction des acides nucléiques : Extraire les acides nucléiques des échantillons avec le système NucliSENS®
easyMAG® en suivant les instructions du fabricant et en utilisant les réactifs appropriés (voir les équipements
requis mais non fournis). L'utilisation d'autres systèmes d'extraction avec le test de l’influenza A+B de
Quidel Molecular n'a pas été validée. La validation de ces autres systèmes relève de la responsabilité de
l'utilisateur final.
Avant la procédure d'extraction, ajouter 20 µl de solution témoin (ACP) dans chaque 180 µl d’aliquote
d’échantillon. Le PRC contrôle les inhibiteurs dans l'échantillon extrait, assure que l'amplification adéquate a
eu lieu et confirme que l'extraction de l'acide nucléique est suffisante.
3.
Réhydratation du Mélange étalon : Réhydrater le Mélange étalon lyophilisé en utilisant la solution de
réhydratation. Le Mélange étalon contient des oligonucléotides amorces, des sondes marquées par un
fluorophore et une solution d’extinction ciblant les régions conservées des virus de l’influenza de type A et de
l’influenza B, ainsi que la séquence témoin.
4.
Amplification et détection de l'acide nucléique : Ajouter 15 µl de mélange étalon réhydraté dans chaque tube
de réaction ou puits à fond plat. Puis ajouter 5 µl d'acides nucléiques extraits (échantillon avec ACP) dans le
puits à fond plat ou dans le tube à réaction convenablement étiqueté. Placer le puits ou le tube
TM
respectivement dans l'appareil de détection en temps réel d'ACP Life Technologies QuantStudio Dx, dans
l'instrument Applied Biosystems® 7500 Fast Dx ou dans l'instrument Cepheid® SmartCycler® II. Le test a été
validé avec les instruments de la série 7500.
Une fois que le tube à réaction ou la plaque est ajouté dans l'instrument, initier le protocole de test. Ce
protocole lance la transcription inverse de l'ARN cible générant de l’ADN complémentaire. L'amplification des
amplicons cibles se produit ensuite. Le test de l’influenza A+B de Quidel Molecular est basé sur le principe
chimique TaqMan® et utilise une enzyme avec transcription inverse, ADN polymérase et activités
exonucléases 5’-3’. Pendant l'amplification de l'ADN, cette enzyme clive la sonde liée à la séquence ADN
complémentaire, séparant alors l'inhibiteur de signal fluorescent du rapporteur fluorescent. Cette étape
génère une augmentation du signal de fluorescence lors de l'inhibition par une source de lumière de longueur
d'onde appropriée. Avec chaque cycle, d'autres molécules de colorant sont séparées de leurs solutions
d’extinction résultant en un signal supplémentaire. Si une fluorescence suffisante est obtenue via 45 cycles,
l'échantillon est signalé positif pour l'acide nucléique détecté.
Page 5 sur 33
Matériel fourni
SKU n°M100
Kit de détection (96 réactions) – Entreposé entre 2 et 8 °C
#
Composant
Quantité


Solution de réhydratation Réf. M5003
1 fiole / kit de 1,9 ml
Mélange étalon l’influenza A+B de Quidel Molecular Partie M5004
12 fioles / kit,
8 réactions / fiole
Contenus lyophilisés :
Enzyme ADN polymérase avec activité transcriptase inverse
Amorces et sondes
dNTPs
Stabilisants
Témoin Réf. M5005
1 fiole / kit de 2,0 ml
Matériel facultatif
Témoins positifs pour l’influenza A et l’influenza B (c'est-à-dire le kit de contrôle n°M106 de l’influenza A+B de
Quidel Molecular, qui sert de traitement externe et de contrôle d'extraction)
Matériel requis non fourni
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μl et 100 et 1 000 μl)
Embouts de pipette sans aérosol
TM
Appareil de détection en temps réel d'ACP Life Technologies QuantStudio Dx ou instrument Applied
Biosystems 7500 Fast Dx
Plaque PCR à 96 puits 7500 Fast Dx Applied Biosystems
Films pour plaque de réaction optique Applied Biosystems
Plaque centrifuge pour plaque ABI à 96 puits
Ou
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μl et 100 et 1 000 μl)
Embouts de pipette sans aérosol
SmartCycler® II
SmartCycler jetable
Page 6 sur 33
Mises en garde
Usage en Diagnostic In Vitro
Si une infection par un nouveau de l'influenza de type A est suspectée sur la base des critères de dépistage
cliniques et épidémiologiques actuels recommandés par les autorités sanitaires, des échantillons doivent être
prélevés en respectant les précautions appropriées de contrôle des infections par de nouveaux virus de
l’influenza virulents, et envoyés aux départements sanitaires nationaux ou locaux pour analyse.
Les caractéristiques de performance de ce test ont été établies avec les types d'échantillons indiqués dans la
section Utilisation prévue uniquement. La mise en œuvre de ce test avec d'autres types d'échantillons ou de
spécimens n'a pas été évaluée.
L’utilisation d’un système d’extraction différent du NucliSENS easyMAG n'a pas été validée. La validation de
ces systèmes relève de la responsabilité de l'utilisateur final.
L’utilisation de conditions de cycle autres que celles indiquées dans la section Instructions de programmation
du thermocycleur peut donner des résultats erronés.
L’utilisation de ce produit doit être limitée aux personnes parfaitement formées aux techniques PCR
et RT-PCR.
Traiter tous les spécimens/échantillons comme étant potentiellement infectés. Suivre les précautions
universelles lors de la manipulation des échantillons, de ce kit et de son contenu.
Un prélèvement, un stockage et un transport adéquats des échantillons sont indispensables pour obtenir des
résultats corrects.
Stocker les réactifs du test comme indiqué sur leurs étiquettes individuelles.
Porter des vêtements de protection, des gants, des protections oculaire et faciale lors de l'utilisation de ce kit.
Pour des résultats précis, pipeter soigneusement en utilisant uniquement un équipement calibré.
Nettoyer et désinfecter toutes les surfaces avec une solution à 10 % de javel puis avec de l'eau de
qualité moléculaire.
Utiliser des micropipettes avec une barrière aérosol ou des embouts volumétriques pour toutes
les procédures.
Éviter toute contamination croisée et microbienne des réactifs du kit. Suivre les procédures de bonnes
pratiques de laboratoire.
Ne pas mélanger les réactifs provenant de kits avec des numéros de lot différents.
Ne pas utiliser de réactifs d'autres fabricants avec ce kit.
Ne pas utiliser le produit après sa date de péremption.
Une planification appropriée du déroulement est essentielle pour minimiser le risque de contamination.
Toujours planifier le déroulement des tâches de laboratoire d'une manière unidirectionnelle, à commencer
par la pré-amplification puis seulement l'amplification et la détection.
Utiliser des fournitures et un équipement dédiés dans les zones de pré-amplification et d'amplification.
Ne pas autoriser le déplacement du personnel et des équipements entre les zones.
Toujours tenir à l'écart les fournitures pour pré-amplification et celles employées dans le cadre
de l’amplification.
Ne pas ouvrir les tubes d'échantillons ou les plaques non-scellées après l’amplification.
Mettre les matériaux amplifiés au rebut avec précaution et conformément aux lois et règlements locaux afin
de minimiser le risque de contamination induit par les amplicons.
Ne pas utiliser les fournitures dédiées à la préparation des réactifs ou des échantillons pour le traitement de
l'acide nucléique cible.
Une fiche de données de sécurité est disponible sur simple demande ou peut être consultée sur le site Web
du fabricant.
Stockage et manipulation des kits de réactifs
Conserver le kit non-ouvert entre 2 et 8 °C jusqu'à la date de péremption indiquée à l'extérieur du
conditionnement du kit.
Le mélange étalon réhydraté peut être conservé à température ambiante (20 °C à 25 °C) pendant une durée
maximale de 24 heures. Pour une plus longue durée de conservation, le récipient du mélange étalon réhydraté
doit être refermé, scellé avec du parafilm et conservé en position verticale à une température ≤ -20 °C
pendant une durée maximale de 14 jours. Protéger le Mélange étalon de la lumière pendant le stockage.
Indications d'instabilité ou de détérioration des réactifs : Une nébulosité dans la solution de réhydratation peut
indiquer une détérioration de ce réactif. Contacter l’assistance technique Quidel pour un remplacement.
Page 7 sur 33
Prélèvement, stockage et manipulation
Les échantillons utilisés pour la validation du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular ont été obtenus auprès
de patients présentant des symptômes d’infection des voies respiratoires supérieures par le biais des
techniques standard. Ces échantillons ont été collectés, transportés, stockés et traités conformément à
l’instruction CLSI M41-A.
Stockage des extraits d'acide nucléique
L'utilisateur est responsable de la validation des procédures et des conditions de conservation utilisées dans son
laboratoire. Les éluats peuvent généralement être conservés à température ambiante (20 °C à 25 °C) pendant
2 heures, entre 2 °C et 8 °C pendant 8 heures, et entre -20 °C et -70 °C pendant un mois. La conservation de petites
quantités d’extraits d’acides nucléiques (par exemple 5 μl ou moins) n’est pas recommandée.
Instructions de programmation de l'extraction des acides nucléiques
1.
Mettre l’instrument sous tension et attendre que le voyant orange de l’instrument s’allume. Mettre le PC sous
tension et lancer le logiciel easyMAG.
2.
Scanner le code à barres des réactifs après avoir appuyé sur les boutons « Instrument »
des réactifs »
3.
et « Inventaire
.
Pour entrer les échantillons, appuyer sur le bouton « Utilisation quotidienne »
, qui ouvre par défaut
l'écran « Définir la requête »
. Sélectionner les paramètres suivants :
a. ID échantillon : Entrer le nom de l'échantillon à l'aide du clavier.
b. Matrice :
Sélectionner Autre dans le menu déroulant
c. Requête :
Sélectionner Générique dans le menu déroulant
d. Volume (ml) :
Sélectionner 0,200 dans le menu déroulant
e. Éluat (µl) :
Sélectionner 50 dans le menu déroulant
f. Type :
Primaire
g. Priorité :
Normale
4.
En cliquant sur le bouton « Enregistrer »
, l'échantillon va apparaître dans la fenêtre « Échantillon nonattribué » sur le côté gauche de l'écran. Cliquer sur le bouton « Entrer une nouvelle demande d'extraction »
, et répéter le traitement des échantillons supplémentaires. Par ailleurs, plusieurs échantillons peuvent
être entrés en appuyant sur le bouton « Création automatique de nouvelles demandes d'extraction »
5.
Dès que tous les échantillons sont créés, aller à « Organiser les tests » en cliquant sur l'icône
de la page. Créer un test en utilisant le bouton « Créer un test »
nom par défaut.
6.
.
en haut
. Entrer un nom de cycle ou utiliser le
Ajouter des échantillons au test en utilisant le bouton « Test à remplissage automatique »
(permettant
de remplir automatiquement jusqu'à 24 échantillons à partir de la liste d'échantillons non attribués (située sur
le côté gauche de l'écran). Des échantillons individuels peuvent également être insérés / retirés du cycle en
utilisant les « icônes de positionnement » gauche et droite
après avoir sélectionné
Page 8 sur 33
l'échantillon approprié. L'ordre des échantillons à l'intérieur du cycle peut être modifié en utilisant les boutons
7.
8.
« Déplacer les demandes d'extraction vers le haut / vers le bas »
.
Obtenir 1 à 3 récipients d'échantillon (pour respectivement 8 à 24 échantillons) et ajouter 20 µl de solution
témoin pour chaque puits d'échantillon utilisé.
Ajouter 180 µl de chaque échantillon dans le puits approprié.
9.
Aller à «Charger un test » en cliquant que le bouton
en haut de l'écran. Insérer les embouts et le(s)
récipient(s) d'échantillon dans l'instrument.
10. Entrer le(s) code(s) à barres du(des) récipient(s) d'échantillon
11. Entrer le(s) code(s) à barres des billes de silice à utiliser
12. Attribuer des billes de silice aux échantillons comme suit :
a. Cliquer sur le symbole des réactifs en dessous du repère 1 dans l'image ci-dessous. Le numéro de lot
des billes de silice doit apparaître sous l'onglet Silice au numéro 2 de l'image ci-dessous.
b. Mettre en surbrillance et sélectionner les échantillons de test pour lesquels des billes doivent être
attribuées (dans la boîte avec le repère 3 dans l'image ci-dessous).
c.
d.
Cliquer sur
l'icône de positionnement (sous le numéro 4 de l'image ci-dessous) pour assigner
le numéro de lot des billes de silice aux échantillons sélectionnés
Si le symbole des billes situé à droite du numéro 5 de l'image ci-dessous est sélectionné, le numéro
de lot des billes de silice doit apparaître pour chaque échantillon
13. Imprimer la liste de travail en cliquant sur l'icône « Charger le cycle » puis sur l'icône « Imprimer la liste de
travail »
.
14. Cliquer sur le bouton «Distribuer des tampons de lyse »
. La réalisation de la lyse prendra environ
12 minutes.
15. Pour chaque récipient contenant un échantillon, préparer des particules magnétiques à l'aide de la pipette
Biohit et suivre les conseils pour un maximum de huit réactions comme suit :
a. En utilisant 1 embout et le programme 1, aspirer 550 µl d’eau sans nucléase et distribuer le tout dans
un tube microfuge de 1,5 ml sans DNase / RNase.
b. Agiter la silice magnétique. En utilisant 1 embout et le programme 1, aspirer 550 µl de silice
magnétique, verser dans l'eau et mélanger à l'aide d'un agitateur vortex.
c. En utilisant 1 embout et le programme 2, aspirer 1050 µl de silice magnétique et reverser 25 µl dans
le même tube.
Page 9 sur 33
d.
e.
f.
Verser 125 µl de mélange de silice magnétique à 8 reprises dans 8 puits d'une plaque ELISA.
Jeter l'embout.
Une fois que la lyse est terminée (Remarque : le « statut de l'instrument » en bas de l'écran doit
indiquer « EN ATTENTE » !), aspirer 100 µl de mélange de silice magnétique dans la bande de puits en
utilisant 8 embouts et le programme 3, verser 100 µl de mélange de silice magnétique dans la bande
de puits, puis aspirer 100 µl de mélange de silice magnétique dans la bande de puits.
Insérer les embouts dans le liquide contenu dans les récipients d'échantillon. Aspirer 800 µl et
reverser 900 µl de mélange de silice magnétique dans le récipient. Aspirer 1 000 µl de mélange de
silice magnétique du récipient et reverser 1 000 µl de mélange de silice magnétique dans le récipient.
Répéter encore deux fois la procédure d'aspiration / de distribution de 1 000 µl.
16. Fermer l'instrument et appuyer sur le bouton « Démarrer »
pour démarrer le cycle.
17. À la fin du cycle, transférer l'acide nucléique purifié dans des tubes sans nucléase. Utiliser immédiatement les
acides nucléiques purifiés, ou les congeler à -70 °C.
Limitations : Le protocole suivant a été développé pour être utilisé spécifiquement avec ce dosage. Son aptitude
pour d’autres tests est inconnue. Vérifier la compatibilité du logiciel auprès de la société bioMérieux S.A.
Programmation initiale du thermocycleur
Instructions de programmation du SmartCycler II
1.
2.
Lancer le progiciel SmartCyclerDx Version 3.0b
Entrer le dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular
a. Sélectionner le bouton Définir les dosages en haut de l'écran
b. Nommer le dosage :
i. Sélectionner le bouton Nouveau en bas à gauche de l'écran
ii. Entrer « Influenza A+B Quidel Molecular » et sélectionner OK
iii. « Influenza A+B Quidel Molecular » sera ajouté au début de la liste Nom du dosage en haut à
gauche de l'écran
c. Définir les valeurs d'analyse : Dans la section Type de dosage : recherche, sélectionner l'onglet
Paramètres d'analyse et s'assurer que les spécifications suivantes sont bien définies :
i. Sélectionner FATA25 dans le menu déroulant Kit colorant
ii. Le menu déroulant Type d'analyse doit être réglé sur Qualitatif, par défaut
iii. Dans la colonne Nom du canal, entrer « Influenza A » pour FAM, « Influenza B » pour Alx532 et
« ACP » pour Alx647
Dans la colonne Utilisation, sélectionner Cible dans les menus déroulants pour l'influenza A et
l'influenza B, et sélectionner Témoin interne pour l'ACP. En sélectionnant Témoin interne, la
fenêtre de mise en garde ci-dessous s'ouvre. Cliquer sur le bouton Oui.
iv.
v. Dans la colonne Analyse de la courbe, entrer Courbe primaire pour chaque canal (Influenza A,
Influenza B, ACP) (réglage par défaut).
vi. Dans la colonne Réglage du seuil, entrer Seuil manuel pour chaque canal (Influenza A, Influenza B,
ACP) (réglage par défaut).
Page 10 sur 33
vii. Dans la colonne Seuil manuel unités fluorescentes, entrer les seuils suivants :
a. Influenza A :
20.0
b. Influenza B :
20.0
c. ACP :
20.0
viii. Dans la colonne Cycle min. valide, entrer 10 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP).
ix. Dans la colonne Cycle max. valide, entrer 45 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP).
x. Dans la colonne Bkgnd Sub, sélectionner « ON » pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP)
(réglage par défaut).
xi. Dans la colonne Bkgnd Min Cycle, entrer 5 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP)
xii. Dans la colonne Bkgnd Max Cycle, entrer 45 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP).
xiii. Dans la colonne Boxcar Avg cycles, laisser 0 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP)
xiv. Dans la colonne End Pt Threshold, entrer 20 pour chaque canal (Influenza A, Influenza B, ACP)
xv. Dans la colonne NC IC%, laisser « S.O. » pour chaque canal (ACP) (réglage par défaut).
xvi. Dans la colonne IC Delta, laisser « S.O. » pour chaque canal (Influenza A, Influenza B) (réglage par
défaut).
xvii. Dans la section Personnaliser le libellé du résultat (sous le tableau), sélectionner Libellé du
résultat basé sur l'organisme dans le menu déroulant. La fenêtre de mise en garde ci-dessous
s'ouvre. Cliquer sur Oui.
xviii. Cliquer sur le bouton Personnaliser pour ouvrir la fenêtre de dialogue Libellé du résultat basé sur
l'organisme. Sélectionner le bouton Ajouter, entrer « Influenza A » dans la colonne Nom de
l'organisme et cocher la case Influenza A. Sélectionner à nouveau le bouton Ajouter, entrer
« Influenza B » dans la colonne Nom de l'organisme et cocher la case Influenza B.
d.
Cliquer sur OK en bas de la fenêtre contextuelle
Régler les durées et les températures de cycles RT-PCR en bas de l'écran comme suit :
i. Niveau 1
1. T° de
2. Temp. :
55,0
3. Secondes : 300
4. Optiques : OFF
Page 11 sur 33
ii. Niveau 2
1.
2.
3.
4.
T° de
Temp. :
Secondes :
Optiques :
60,0
300
OFF
1.
2.
3.
4.
T° de
Temp. :
Secondes :
Optiques :
65,0
300
OFF
iii. Niveau 3
iv. Étape 4
1.
2.
3.
3.
Cycle de température 2
Nombre de répétitions :
50
Première ligne de température :
a. Temp. :
92,0
b. Secondes :
5
c. Optiques :
OFF
4. Deuxième ligne de température
a. Temp. :
57,0
b. Secondes :
40
c. Optiques :
ON
Enregistrer le protocole en sélectionnant le bouton Enregistrer en bas de l'écran
Représentation du protocole Influenza A+B Quidel Molecular terminé
Grippe A+B de Quidel Molecular
Limitations : Le protocole suivant a été développé pour être utilisé spécifiquement avec le dosage RT-PCR en
temps réel de l’influenza A+B Quidel Molecular. Son aptitude pour d’autres tests est inconnue. Consulter la société
Cepheid pour vérifier la compatibilité du logiciel.
Instructions de programmation 7500 Fast DX
1.
2.
Lancer le package logiciel 7500 Fast Dx.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre. Cliquer sur le bouton Créer un nouveau
document pour démarrer l'Assistant Nouveau Document. Suivre chaque étape pour initier le protocole
Influenza A+B Quidel Molecular.
a. Définir un document : Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier
en conséquence.
Page 12 sur 33
i. Confirmer ou entrer les informations suivantes.
b.
c.
d.
Test :
Courbe standard (quantification absolue)
Conteneur :
Transparent avec 96 puits
Modèle :
Document vide
Mode d'exécution :
Fast 7500
Opérateur :
le nom de l'opérateur
Commentaires :
SDS v1.4 (ajouter davantage le cas échéant)
Désignation de la
plaque :
« Influenza A+B Quidel Molecular »
ii. Cliquer sur le bouton Suivant.
Sélectionner les détecteurs : De nouveaux détecteurs pour l'influenza A, l'influenza B et le témoin
ACP doivent être ajoutés. Pour chaque cible, cliquer sur le bouton Nouveau détecteur pour ouvrir la
fenêtre Nouveau détecteur. Il est également possible d'utiliser le bouton Créer un autre dans la
fenêtre contextuelle Nouveau détecteur pour les deux derniers détecteurs.
i. Entrer les informations suivantes pour chaque détecteur :
produit
Colorant
Colorant
Couleur
chimique
de notification
d'extinction
Influenza A
FAM
(aucun)
(sélectionner)
Influenza B
JOE
(aucun)
(sélectionner)
ACP
Cy5
(aucun)
(sélectionner)
ii. Sélectionner une couleur unique pour représenter chaque détecteur.
iii. Mettre en surbrillance les nouveaux détecteurs et les ajouter dans la colonne Détecteurs
dans un document en utilisant le bouton Ajouter.
iv. Sélectionner (aucun) dans le menu déroulant Référence passive.
v. Cliquer sur le bouton Suivant.
vi. Sélectionner le bouton Terminer sans effectuer de réglage des puits.
L'assistant se ferme et le logiciel s'ouvre, puis démarre avec l'onglet Installation. Cela va faire
apparaître la plaque d'échantillon qui a été installée pendant le démarrage rapide. Rien ne doit être
changé ici pour l'installation initiale.
Définir le protocole du thermocycleur : Sélectionner l'onglet Instrument pour configurer les durées et
les températures de cycles RT-PCR de l'influenza A+B Quidel Molecular. Sous l'option Profil
thermique se trouve un protocole par défaut à 2 niveaux. Chaque niveau comporte 3 zones de texte
modifiables par l'utilisateur. La valeur de la zone supérieure représente le nombre de répétitions ou
de cycles pour ce niveau. La valeur de la zone intermédiaire représente la température (˚C), et la
valeur de zone inférieure représente le temps (minutes : secondes).
Page 13 sur 33
i. Apporter les changements suivants au protocole du thermocycleur par défaut :
1. Niveau 1
a. Répétition : 1
b. Temp. :
55
c. Heure :
5h
2. Sélectionner la barre entre le Niveau 1 et le Niveau 2. Sélectionner le bouton
Ajouter rétention pour ajouter un autre stade.
3. Niveau 2
a. Répétition : 1
b. Temp. :
60
c. Heure :
5h
4. Sélectionner la barre entre le Niveau 2 et le Niveau 3. Sélectionner le bouton
Ajouter rétention pour ajouter un autre stade.
5. Niveau 3
a. Répétition : 1
b. Temp. :
65
c. Heure :
5h
6. Stade 4 (Stade de dissociation en 2 étapes)
a. Répétition : 10
b. Étape 1
i. Temp. :
92
ii. Heure :
0 h 05
c. Étape 2
i. Temp. :
57
ii. Heure :
0 h 40
7. Sélectionner la barre sur la droite du Niveau 4. Cliquer sur le bouton Ajouter un
cycle pour ajouter un autre cycle.
8. Stade 5 (Stade de dissociation en 2 étapes)
a. Répétition : 35
b. Étape 1
i. Temp. :
92
ii. Heure :
0 h 05
c. Étape 2
i. Temp. :
57
ii. Heure :
0 h 40
9. Si un stade erroné est ajouté, le stade peut être supprimé en appuyant sur le
bouton Supprimer après avoir mis en surbrillance le stade entre les lignes
verticales.
ii. Entrer les informations suivantes sous Paramètres :
Volume d'échantillon (μl) :
20 (par défaut)
Mode d'exécution :
7500 Fast (par défaut)
Collecte des données :
Stade 5, étape 2 (57,0 à 0:40)
REMARQUE : Ne pas cocher la case à côté de « Mode expert ».
Page 14 sur 33
iii. Protocole final
e.
Régler le seuil pour chaque analyte.
i. Sélectionner l'onglet Résultats.
ii. Sélectionner l'onglet Tracé d'amplification.
iii. Sélectionner Influenza A dans l'onglet Détecteur situé dans le coin supérieur droit.
iv. Dans le bloc Paramètres d'analyse, régler le seuil sur 1.5e5.
v. Sélectionner le bouton radio Base de référence auto.
vi. Répéter iii-v pour l'influenza B en réglant le seuil sur 1.2e5.
vii. Répéter iii-v pour l'ACP en réglant le seuil sur 2.7e4.
f.
Sauvegarder le nouveau protocole comme modèle pour de futures utilisations.
i. En haut de l'écran, cliquer sur Fichier puis sur Enregistrer sous.
ii. Enregistrer sous : D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nom de fichier : « Influenza A+B Quidel Molecular »
iv. Type d'enregistrement : « Modèles SDS (*.sdt) ».
Quitter le logiciel.
g.
Limitations : Le protocole suivant a été développé pour être utilisé spécifiquement avec ce dosage. Son aptitude
pour d’autres tests est inconnue. Vérifier la compatibilité du logiciel auprès de Life Technologies.
Page 15 sur 33
Instructions de programmation de l'appareil de détection en temps réel d'ACP Life Technologies
QuantStudioTM Dx
La programmation de l'appareil s'effectue avec le fichier TDD fourni avec le kit de test.
Procédure de test
Exécuter les procédures suivantes, à une température ambiante régulée entre 20 et 25 °C.
Procédure d'extraction des acides nucléiques
Se reporter aux instructions de programmation du système NucliSENS easyMAG ci-dessus.
1. Ajouter 20 µl de la solution témoin dans le puits d'extraction de l'échantillon.
2. Ajouter 180 µl de l'échantillon du patient ou de solution témoin externe dans un puits
d’extraction d'échantillons.
3. Suivre la procédure d'extraction conformément aux instructions du fabricant.
Procédure de réhydratation du mélange étalon
1. Déterminer le nombre de spécimens destinés à être testés et obtenir le nombre correct de huit fioles de
Mélange étalon lyophilisé pour les tests.
2. Retourner les réactifs non utilisés dans les conditions de stockage appropriées.
3. Ouvrir soigneusement le Mélange étalon pour éviter toute perturbation des pastilles.
4. Ajouter 135 µl de solution de réhydratation au Mélange étalon.
5. Placer la fiole à température ambiante pendant 1 à 2 minutes afin de permettre la réhydratation
des pastilles.
6. Pipeter doucement de haut et en bas à 2 ou 3 reprises (en évitant la formation de bulles) avant toute
distribution dans le premier tube ou puits PCR.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté est suffisant pour huit réactions.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté peut être conservé à température ambiante pendant une durée
maximale de 24 heures ou à une température ≤ -20 °C pendant une durée maximale de 14 jours. (Voir
« Manipulation et entreposage des kits de réactifs » pour les options de stockage supplémentaires)
Procédure d'installation RT-PCR
1. Ajouter 15 µl de mélange étalon réhydraté dans chaque tube de réaction ou puits à fond plat.
2. Ajouter 5 µl d'acide nucléique extrait (spécimen avec le témoin) dans les tubes à réaction ou les puits. Le
mélange des réactifs n'est pas nécessaire.
Remarque : Utiliser une micropipette pourvue d’un nouvel embout sans aérosol avec chaque
échantillon extrait.
3. Fermer les tubes réactionnels ou sceller la plaque.
Remarque : Quidel suggère que chaque cycle du thermocycleur utilise un tube à réaction ou un puits avec
un témoin positif et un témoin négatif externe de l'influenza A/influenza B. Mesurer les témoins en
appliquant les pratiques et politiques en vigueur dans le laboratoire.
4. Centrifuger les tubes réactionnels ou la plaque durant un minimum de 15 secondes. Faire en sorte que
tout le liquide se trouve au fond du tube.
5. Insérer les tubes ou la plaque dans le thermocycleur.
Protocole d'amplification sur l’instrument SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Mettre le(s) bloc(s) SmartCycler sous tension.
Lancer le progiciel SmartCycler Dx Version 3.0b.
Sélectionner le bouton Créer un cycle en haut de l'écran pour configurer le cycle
Sous Nom du cycle, entrer un nom pour le cycle actuel (Influenza A+B Quidel Molecular-AAMMJJ)
Sous Notes, entrer des remarques sur le cycle pour référence ultérieure
SousDosage, sélectionner le dosage « Influenza A+B Quidel Molecular » dans le menu déroulant
Sous Information de test, entrer un numéro de lot et la date d'expiration du kit.
Pour sélectionner les puits qui seront utilisés, procéder avec l'une des options suivantes :
a. Pour attribuer automatiquement des puits, procéder comme suit :
i. Sous Nombre de spécimens, entrer le nombre d'échantillons dans la zone de texte prévue.
ii. Cliquer sur le bouton Appliquer. Le nombre de lignes entrées apparaît dans le tableau des sites.
b. Pour fermer manuellement les puits sur les blocs du SmartCycler, procéder comme suit :
i. Cliquer sur le bouton Ajouter / supprimer des sites en bas de l'écran.
Page 16 sur 33
9.
10.
11.
12.
13.
ii. Cela va ouvrir la fenêtre contextuelle Sélectionner des sites avec deux colonnes. La colonne de
gauche (Sites) récapitule tous les sites disponibles et la colonne de droite (Selections) contient
tous les sites sélectionnés.
iii. Pour sélectionner tous les sites, cliquer sur le bouton Sélectionner tous les sites.
iv. Pour sélectionner des sites spécifiques, mettre en évidence un ou plusieurs sites puis cliquer sur
la flèche droite pour ajouter le(s) site(s) dans la colonne Sélections.
v. Cliquer sur le bouton OK pour fermer la fenêtre. Les sites sélectionnés vont apparaitre dans le
Tableau des sites.
Entrer les identifiants d'échantillons dans la colonne Sample ID (ID échantillon) du Tableau des sites
(cette opération peut être réalisée après le démarrage du cycle).
Entrer des notes dans la colonne Notes et laisser les entrées de la colonne Type d'échantillon avec la note
« SPEC ».
Cliquer sur le bouton Lancer cycle en bas de l'écran.
Cliquer sur le bouton Afficher les résultats pour visualiser la progression du cycle.
Enregistrer le cycle après son achèvement et avant de quitter le logiciel.
Protocole d'amplification sur le thermocycleur ABI 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Allumer l'appareil ABI 7500 Fast Dx.
Lancer le package logiciel ABI 7500 Fast Dx.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre.
Cliquer sur Créer un nouveau document.
Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier en conséquence.
Test :
Courbe standard (quantification absolue)
Conteneur :
Transparent avec 96 puits
Modèle :
Grippe A+B de Quidel Molecular
Mode d'exécution :
Fast 7500
Opérateur :
le nom de l'opérateur
Commentaires :
SDS v1.4 (ajouter davantage le cas échéant)
Désignation de
la plaque :
Influenza A+B Quidel Molecular-AAMMJJ
Installation d'une plaque d'échantillon
a. La procédure d'installation d'une plaque apparaît sous les onglets Installation et Plaque.
b. Sélectionnez tous les puits qui contiennent un échantillon, cliquer droit et sélectionner Inspecteur de
puits dans le menu déroulant. Lorsque la fenêtre contextuelle Inspecteur de puits s'ouvre,
sélectionner les détecteurs pour l'influenza A, l'influenza B et l'ACP.
c. Utiliser le Inspecteur de puits pour entrer les noms d'échantillons. Les identifiants de patients
peuvent être entrés dans la fenêtre Inspecteur de puits; il est toutefois recommandé que cela soit fait
avant la remise en suspension du mélange étalon lyophilisé, après amplification. Sinon l'utilisation de
la fonction d'importation pour minimiser la durée de réaction ACP va nécessiter une stabilisation à
température ambiante avant toute exécution.
d. Enregistrer le cycle sous Influenza A+B Quidel Molecular-AAMMJJ.sds.
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer la
« Configuration » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Démarrage de l'ACP
a. Cliquer sur l'onglet Instrument.
b. Insérer la plaque ACP à 96 puits dans l'instrument.
c. Sous Contrôle d'instrument, cliquer sur le bouton Start pour démarrer l'amplification.
Page 17 sur 33
8.
Post ACP
a. IMPORTANT : Cliquer sur OK lorsque le test est terminé. Analyser les données en cliquant sur le
bouton « Analyze » dans le menu supérieur puis enregistrer le fichier.
b. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer le document dans la barre des tâches. Une fenêtre va
s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer « l'analyse des
données après amplification » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Protocole d'amplification sur l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Mettre l'appareil QuantStudio Dx sous tension.
Choisir le mode IVD de l'appareil.
Lancer le progiciel QuantStudio Dx IVD.
Saisir le nom d'utilisateur et le mot de passe du système au moment de la requête.
La fenêtre Écran d'accueil va s'ouvrir.
Dans la fenêtre Configurer, mettre en surbrillance le nom du test précédemment chargé « Dosage de
l'influenza A+B Quidel Molecular »
Cliquer sur le bouton Setup pour lancer un cycle.
L'écran Configurer, propriétés du test est affiché. Saisir les informations du cycle en conséquence.
a. Saisir le nom de l'expérience (le paramétrage par défaut lance le cycle avec un horodatage).
b. Saisir les informations du code à barres de la plaque.
c. Consigner les numéros de lot des matériaux sous Informations sur les réactifs.
d. Enregistrer le cycle sous Influenza A+B Quidel Molecular-JJMMAA.sds.
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer la
« Configuration » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Dans la barre de menu gauche, sélectionner Définir.
Modifier les informations de l'échantillon.
a. Entrer des informations d’échantillon spécifiques pour chaque puits en écrasant l’identifiant par
défaut (Patient 1, Patient 2, etc.) et saisir de nouvelles informations, OU
b. Sélectionner Importer à partir du fichier dans la partie supérieure de l'écran pour télécharger une
configuration de plaque prédéfinie depuis un fichier texte (délimité par des tabulations).
Dans la barre de menu gauche, cliquer sur Attribuer pour vérifier la configuration correcte de la plaque.
Chargement de la plaque d'échantillon.
a. Éjecter le plateau de l'instrument.
b. Insérer la plaque APC à 96 puits dans l’appareil avec le puits A1 bien positionné en haut à gauche.
c. Retirer le plateau de l'instrument.
Démarrage du cycle.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Cycle.
b. Cliquer sur le bouton vert Lancer cycle situé dans la partie supérieure de l'écran.
i. En cas d’invite, sélectionner le numéro de série spécifique de l'instrument utilisé.
Lorsque le cycle est terminé, sélectionner Analyse dans la barre de menu à gauche.
a. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer dans la barre des tâches. Une fenêtre va s'ouvrir pour
demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer « l'analyse des données après
amplification » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
b. Le tracé d'amplification sera affiché par défaut. Pour afficher d'autres types de tracés, sélectionner
ces derniers dans la barre de menu à gauche.
c. Pour afficher des informations de cycle avec les valeurs Ct, cliquer sur l'onglet Tableau des puits sur
le côté droit de l'écran.
Impression d'un rapport.
a. Dans la barre de menu supérieure, sélectionner Imprimer un rapport. Personnaliser le contenu du
rapport en cochant ou décochant des cases dans la fenêtre des rapports.
b. Cliquer sur le bouton «Imprimer un rapport » en bas de la boîte de dialogue.
Page 18 sur 33
16. Exportation des fichiers de données.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Exporter.
b. Spécifier l'emplacement du fichier d'exportation OU cliquer sur Parcourir pour localiser le chemin
souhaité.
c. Le nom du fichier d'exportation sera par défaut celui du cycle enregistré.
d. Sélectionner Excel comme type de fichier.
e. Personnaliser le rapport de données exporté en basculant entre les onglets et en sélectionnant ou
désélectionnant les options.
f. Sélectionner Démarrer l'exportation au bas de l'écran.
Interprétation des résultats
Interprétation des résultats à l'aide du SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Sélectionner l'onglet Afficher les résultats dès la fin du cycle de mesure.
Cliquer sur l'onglet Résultats de l'échantillon).
Le logiciel SmartCycler demandera automatiquement si les échantillons sont positifs ou négatifs à
l'influenza, ou si le cycle n'était pas valide (non résolu).
Des informations plus détaillées sont disponibles sous les onglets respectifs de chaque analyte dans la
même fenêtre. En cas de faux positif pour l'influenza A ou B (ou les deux), le résultat de l'ACP n'est pas
applicable. L'ACP est seulement nécessaire en cas de faux négatifs.
Interprétation des résultats d'analyse de l'influenza A+B Quidel Molecular imprimés
sur SmartCycler II
Résultat du test
Résultat du
témoin ACP
Grippe A
Grippe B
Négatif
Accepté
NÉG
NÉG
Positif à l'influenza A
S/O*
POS
NÉG
Acide nucléique de l'influenza A ou
l'influenza B non détecté; ACP détecté
Acide nucléique de l'influenza A détecté
Positif à l'influenza B
S/O*
NÉG
POS
Acide nucléique de l'influenza B détecté
Positif à l'influenza A
et B
S/O*
POS
POS
Acide nucléique de l'influenza A et B détecté
NÉG
Non résolu - inhibition PCR ou échec du
réactif. Répéter le test à partir d'acides
nucléiques purifiés ou prélever un nouvel
échantillon et effectuer un test.
Non valide
Échec
NÉG
*Aucune valeur n'est requise en cas de faux positif du témoin.
Code d'erreur 3079 : Le code d'avertissement / d’erreur 3079 peut être observé avec des échantillons positifs à
l'influenza A et B. Le code d’avertissement / d'erreur 3079 se produit lorsque le signal fluorescent (RFU) est trop
élevé. Dans ce cas, tous les résultats pour cet échantillon sont signalés par le logiciel Dx comme ND (non
déterminés). Si une valeur Ct ≥ 10 ou ≤ 45 est indiquée pour l'influenza A ou l'influenza B, les résultats de
l'échantillon peuvent être enregistrés comme POS (positifs) pour l'influenza A ou l'influenza B.
Page 19 sur 33
Interprétation des résultats en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Dx
Interprétation des résultats d'analyse de l'influenza A+B Quidel Molecular sur le
thermocycleur 7500 Fast Dx
Résultat du test
Détecteur :
Influenza A
Détecteur :
Influenza B
Détecteur :
contrôle du
procédé
Négatif
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
S/O*
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
S/O*
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
S/O*
Non valide
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Non valide
Indéterminé
Indéterminé
Indéterminé
Positif à
l'influenza A
Positif à
l'influenza B
Positif à
l'influenza A et B
Acide nucléique de l'influenza A
ou l'influenza B non détecté;
ACP détecté
détecté
Acide nucléique de l'influenza B
détecté
Acide nucléique de l'influenza A et
B détecté
Acide nucléique de l'influenza A ou
de l'influenza B et de l'ACP non
détecté; cycle non valide,
recommencer le cycle ou l'extraction
Non déterminé, recommencer le
cycle ou l'extraction
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx
Interprétation des résultats du dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular sur l'appareil de
détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx
Résultat du test
Détecteur :
Influenza A
Négatif
Aucune valeur
Ct fournie (vide)
Positif à
l'influenza A
Positif à
l'influenza B
Positif à
l'influenza A et B
Non valide
Ct ≤40,0
Détecteur :
Influenza B
Détecteur :
contrôle du
procédé
Aucune valeur
Ct fournie
(vide)
Aucune valeur
Ct fournie
(vide)
Ct ≤40,0
ou l'influenza B non détecté;
ACP détecté
S/O*
détecté
Aucune valeur
Ct fournie (vide)
Ct ≤40,0
S/O*
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
S/O*
Aucune valeur
Ct fournie (vide)
Aucune valeur
Ct fournie
(vide)
Aucune valeur
Ct fournie
(vide)
Acide nucléique de l'influenza B
détecté
et B détecté
Acide nucléique de l'influenza A ou de
l'influenza B et de l'ACP non détecté;
cycle non valide, recommencer le cycle
ou l'extraction
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
Contrôle qualité
Le dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular incorpore plusieurs témoins pour contrôler les performances
du dosage.
1.
2.
Le témoin ACP doit être utilisé lors de l'extraction et de l'amplification pendant le dosage. Ce témoin doit être
ajouté à chaque aliquote d’échantillon avant l'extraction.
Disponibles dans le commerce, les témoins positifs externes de l'influenza A/B peuvent être traités comme des
échantillons de patient et doivent être utilisés conformément aux normes de votre laboratoire. Les
Page 20 sur 33
3.
échantillons de l'influenza A ou de l'influenza B précédemment caractérisés comme positifs peuvent être
utilisés à la place des témoins commerciaux de l'influenza A/B.
Un milieu de transport viral ou un spécimen précédemment caractérisé négatif peut être utilisé comme
témoin négatif externe. Ils doivent être traités comme des échantillons de patient et doivent être utilisés
conformément aux normes de laboratoire actuelles.
Limitations
Ce test n'est pas destiné à distinguer les sous-types de l’influenza A, tels que le nouveau virus de l’influenza de
type A A H1N1. La différenciation des sous-types nécessite la réalisation de tests supplémentaires.
Des résultats négatifs n'excluent pas une infection par le virus de l'influenza et ne doivent pas constituer la
seule base d'une décision thérapeutique.
Comme avec d'autres essais de ce type, il existe un risque de faux négatifs dû aux variantes de séquences dans
la cible virale.
Un prélèvement, un stockage voire un transport inapproprié peut induire des faux négatifs.
Les inhibiteurs présents dans l'échantillon et / ou les erreurs dans la procédure de test suivante peuvent
induire des faux négatifs.
Performance clinique
Les caractéristiques de performance du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular ont été établies dans le cadre
d'une étude prospective durant la saison du virus respiratoire de 2011 (entre janvier et mars). Les échantillons
utilisés pour cette étude étaient des prélèvements par écouvillon nasal et rhinopharyngé qui ont été collectés pour
les tests de routine de l’influenza.
La méthode de référence a été la culture rapide (flacon cylindrique), suivie du dépistage et de l'identification par
immunofluorescence directe (DFA).
Au total, 637 échantillons sur écouvillon ont été soumis au test de l’influenza A+B de Quidel Molecular et testés
par culture. Six (6) échantillons qui ont initialement donné des résultats non résolus sont restés non résolus après
avoir été soumis une nouvelle fois au test de l’influenza A+B de Quidel Molecular. Ils ne sont pas inclus dans
l'analyse ci-dessous.
Au total, le dépistage du virus respiratoire DFA a donné un résultat positif pour 6 échantillons (le réactif de
dépistage détecte l’influenza A et B, le VRS, le parainfluenza 1, 2 et 3 et l'adénovirus), mais ces échantillons
contenaient trop peu de cellules pour obtenir une identification positive spécifique. Trois échantillons étaient
toxiques dans la culture de cellules. Ces 9 échantillons ne sont pas inclus dans l'analyse ci-dessous.
L'analyse discordante des échantillons où les résultats du test et de la culture de l’influenza A+B de Quidel
Molecular ont été divergents a été réalisée à l'aide d'un test RT-PCR marqué CE et d'un séquençage bidirectionnel
approprié.
Page 21 sur 33
Grippe A
Écouvillons à prélèvement
nasal et rhinopharyngé frais
(N = 622)
Test de l’influenza A+B de
Quidel Molecular
Positif
Comparateur : Culture avec DFA
Positif
Négatif
Total
93
18*
111
Négatif
1**
510
511
Total
94
528
622
95 % IC
Sensibilité
93/94
98,9 %
94,2 % à 100 %
Spécificité
510/528
96,6 %
94,7 % à 98,0 %
*17 de ces échantillons se sont révélés positifs à l’influenza A via l'appareil CE-IVD.
L'échantillon restant s'est révélé négatif à l’influenza A via l'appareil CE-IVD, mais positif
pour le virus de l’influenza A par séquençage
** L'échantillon s'est également révélé négatif à l’influenza A via l'appareil CE-IVD.
Grippe B
Écouvillons à prélèvement
(N = 622)
Quidel Molecular
Positif
Comparateur : Culture avec DFA
Positif
Négatif
Total
74
7*
81
Négatif
2**
539
541
Total
76
546
622
95 % IC
Sensibilité
74/76
97,4 %
90,8 % à 99,7 %
Spécificité
539/546
98,7%
97,4 % à 99,5 %
*5 échantillons se sont révélés positifs à l’influenza B via l'appareil CE-IVD, 2 échantillons
se sont révélés négatifs à l’influenza B via l'appareil CE-IVD, mais se sont révélés positifs
au virus de l’influenza de type B par séquençage
**1 échantillon s'est révélé positif à l’influenza B via l'appareil CE-IVD et 1 échantillon s'est
révélé négatif à l’influenza B via l'appareil CE-IVD
Page 22 sur 33
Au total, 626 échantillons sur écouvillon ont été soumis au test de l’influenza A+B de Quidel Molecular et à un test
IVD RT-PCR marqué CE. Six (6) échantillons qui ont initialement donné des résultats non résolus sont restés non
résolus après avoir été soumis une nouvelle fois aux deux tests et ne sont pas inclus dans l'analyse ci-dessous.
10 échantillons supplémentaires ont donné des résultats non résolus dans le test IVD RT-PCR marqué CE et sont
restés non résolus après avoir été soumis une nouvelle fois au test. Ils ne sont pas inclus dans l'analyse ci-dessous.
L'analyse discordante des échantillons où les résultats du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular et du test IVD
RT-PCR marqué CE ont été divergents a été réalisée avec le séquençage.
Grippe A
Écouvillon à prélèvement
(N = 610)
Quidel Molecular
Comparateur : Appareil CE-IVD
Positif
Négatif
Total
Positif
107
3*
110
Négatif
0
500
500
107
503
610
Total
95 % IC
Sensibilité
107/107
100 %
96,6 % à 100 %
Spécificité
500/503
99,4 %
98,3 % à 99,9 %
*3 échantillons se sont révélés positifs au virus de l’influenza de type A par séquençage
Grippe B
Écouvillon à prélèvement
(N = 610)
Quidel Molecular
Comparateur : Appareil CE-IVD
Positif
Négatif
Total
Positif
77
5*
82
Négatif
4**
524
528
Total
81
529
610
95 % IC
Sensibilité
77/81
95,1 %
87,8 % à 98,6 %
Spécificité
524/529
99,1 %
97,8 % à 99,7 %
*5 échantillons se sont révélés positifs au virus de l’influenza de type B par séquençage
**4 échantillons se sont révélés négatifs au virus de l’influenza de type B par séquençage
Page 23 sur 33
Un sous-ensemble de deux cent onze (211) échantillons provenant de l'étude mentionnée ci-dessus a été testé sur
l'appareil de détection en temps réel d'ACP QuantStudio Dx. Les résultats de ce test ont été comparés aux données
tirées d'un autre test mené simultanément sur l'instrument ABI 7500 Fast Dx. Les résultats de cette comparaison
sont fournis ci-dessous.
Test de l’influenza A+B de Quidel Molecular
Grippe A
Comparateur : ABI 7500 Fast Dx
Appareil de détection en
temps réel d'ACP
QuantStudio Dx
Positif
Négatif
Total
Positif
63
0
63
Négatif
0
148
148
Total
63
148
211
95 % IC
Sensibilité
63/63
100 %
94,3 % à 100 %
Spécificité
148/148
100%
97,5 % à 100 %
Test de l’influenza A+B de Quidel Molecular
Grippe B
Comparateur : ABI 7500 Fast Dx
Appareil de détection en
temps réel d'ACP
QuantStudio Dx
Positif
Négatif
Total
Positif
28
0
28
Négatif
0
183
183
Total
28
183
211
95 % IC
Sensibilité
28/28
100 %
87,9 % à 100 %
Spécificité
183/183
100%
97,9 % à 100 %
Performances analytiques
Niveau de détection
La sensibilité analytique (limite de détection ou LoD) du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été
déterminée en utilisant des cultures quantifiées (TCID50/ml) de 3 souches de l’influenza A (1 H1N1, 1 2009H1N1 et
1 H3N2) et de 3 souches de l’influenza B, diluées en série dans une matrice rhinopharyngée négative. Chaque
dilution a été extraite en utilisant le système NucliSENS easyMAG et testée en mesure de 20 par concentration du
virus, à la fois sur les plateformes Applied Biosystems® 7500 Fast Dx et Cepheid SmartCycler® II. La sensibilité
analytique (limite de détection ou LoD) est définie comme étant la concentration la plus faible à laquelle 95 % de
toutes les répétitions ont été testées positives.
Page 24 sur 33
Niveau de détection
Souche
TCID50 final/ml LoD
7500 Fast Dx
SmartCycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Floride/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaisie/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Inhibition compétitive
L'inhibition compétitive du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été évaluée en utilisant des échantillons
simulés avec des concentrations différentes du virus de l’influenza de type A (2x LoD à 4 points au-dessus de LoD)
et de virus de l’influenza de type B (2x LoD à 4 points au-dessus de LoD) dans un échantillon simple. Les
échantillons ont été extraits à l'aide du système NucliSens easyMAG et testés en triple exemplaire. La présence du
virus de l’influenza de type A et du virus de l’influenza de type B à des concentrations différentes dans un
échantillon simple n'a eu aucun effet sur la sensibilité analytique (limite de détection ou LoD) du test de
l’influenza A+B de Quidel Molecular.
Réactivité analytique (inclusion)
La réactivité du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été évaluée sur plusieurs souches de virus de
l’influenza de type A et de l’influenza de type B. Le panel clinique consistait en 10 souches du sous-type H1N1 de
l’influenza A, 2 souches du sous-type 2009H1N1 de l’influenza A, 8 souches du sous-type H3N2 de l’influenza A,
2 souches du sous-type H5N1 de l’influenza A et 13 souches de l’influenza B. Un panel supplémentaire d'isolats
limités non cliniques a été également testé. Chaque membre du panel a été extrait à l'aide de l'instrument
NucliSens easyMAG et testé en triple exemplaire.
Le test de l’influenza A de Quidel Molecular a détecté 100 % des souches de l’influenza A (38/38) et de l’influenza B
2
3
(15/15) à des niveaux de 10 à 10 TCID50/ml, y compris les souches nouvelles, pandémiques et aviaires de
l’influenza A et les récentes souches de l’influenza B en circulation.
Virus de l’influenza de type A du panel clinique
Sous-type
Souche
TCID50/mL
H1N1
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
A/Nouvelle-Calédonie/20/1999
1,12E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/NWS/33
Non
disponible
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positif
Négatif
Positif
Négatif
Page 25 sur 33
Virus de l’influenza de type A du panel clinique
Sous-type
Souche
TCID50/mL
H1N1
A/Îles Salomon/3/06
H3N2
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,41E+01
Positif
Négatif
Positif
Négatif
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
4,57E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
Virus de l’influenza de type B du panel clinique
Souche
TCID50/mL
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Panama/45/90
1,02E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Floride/02/2006
3,16E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Floride/04/2006
3,80E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Floride/07/2004
1,26E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Malaisie/25/06/04
3,41E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Allen/45
4,17E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Russie/69
2,19E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Mass/3/66
1,38E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/Lee/40
1,95E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
B/GL/1739/54
6,30E+02
Négatif
Positif
Négatif
Positif
Virus limités non cliniques
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
Soustype
Souche
TCID50/mL
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H2N2
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H7N3
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
A
B
A
B
Positif
Négatif
Positif
Négatif
Positif
Négatif
Positif
Négatif
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Virus limités non cliniques
Soustype
Souche
TCID50/mL
H9N2
H4N8
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H6N2
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H8N4
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H5N1
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H10N7
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H11N9
A/Chicken/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H12N5
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H13N6
A/Gull/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H14N5
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H15N9
A/Shearwater/Australie/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
H16N3
2,00E+02
Positif
Négatif
Positif
Négatif
Reproductibilité
La reproductibilité intralaboratoire du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été évaluée sur 3 sites de
laboratoire. La reproductibilité a été évaluée en utilisant un panel de 6 échantillons simulés qui comprennent des
virus de l’influenza de type A en concentration moyenne (10x LoD) et hautement négative (concentration C 20-60),
des virus de l’influenza de type B et des échantillons de témoins positifs et négatifs. Les panels et les témoins ont
été testés sur chaque site par 2 opérateurs durant 5 jours (8 échantillons et 3 témoins × 2 opérateurs × 5 jours ×
3 sites = 330). Les panels et les témoins ont été extraits en utilisant le système NucliSENS easyMAG et testés sur
l'instrument 7500 Fast Dx.
Reproductibilité
Identifiant du
membre
du panneau
Hautement
négatif à
l’influenza A
Positif à
l’influenza A
(10x LoD)
Site n°1
Site n°2
Concordanc
e avec les
résultats
attendus
Concordanc
e avec les
résultats
attendus
AVE
Ct
%CV
10/10
Non
disp
oni
ble
Non
disp
oni
ble
26,0
9,0
6/10
10/10
AVE
Ct
%CV
31,5*
8,8
24,7
2,1
10/10
Site n°3
Concordanc
e avec les
résultats
attendus
9/10
9/10
AVE
Ct
%CV
34,3*
Non
disp
oni
ble
28,1
7,6
Concordance
totale avec le
résultat
attendu
25/30
29/30
Page 27 sur 33
Reproductibilité
Identifiant du
membre
du panneau
Site n°1
Concordance
avec les
résultats
attendus
AVE Ct
%CV
Site n°2
Concordance
avec les
résultats
attendus
AVE
Ct
%CV
Site n°3
Concordance
avec les
résultats
attendus
AVE Ct
%CV
Concordance
totale avec le
résultat attendu
Hautement négatif
à l’influenza B
9/10
34,9
Non
dispon
ible
10/10
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
10/10
Non
disponi
ble
Non
dispo
nible
30/30
Positif à
l’influenza B
(10x LoD)
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
Témoin positif à
l’influenza A
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
Témoin positif à
l’influenza B
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
Témoin négatif
10/10
Non
disponible
Non
dispon
ible
10/10
Non
dispo
nible
Non
dispo
nible
10/10
Non
disponi
ble
Non
dispo
nible
30/30
Tableau Spécificité analytique – réactivité croisée
La spécificité analytique du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été évaluée en testant un panel
comprenant 26 souches virales, 24 souches bactériennes et 1 souche de levure représentant des pathogènes
respiratoires courants ou la flore généralement présente dans le rhinopharynx. Les bactéries et les levures ont été
5
10
3
6
testées à des concentrations de 10 à 10 CFU/ml. Les virus ont été testés à des concentrations de 10 à 10
TCID50/ml. Les échantillons ont été extraits à l'aide de l'instrument NucliSens easyMAG et testé en triple
exemplaire. La spécificité analytique du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular était de 100%.
Résultat de réactivité
hMPV A1
Conc.
finale
3,70E+04
Résultat de
l’influenza A
Négatif
Résultat de
l’influenza B
Négatif
hMPV B1
2,37E+04
Négatif
Négatif
RSV Long
4,40E+04
Négatif
Négatif
RSV Washington
1,75E+0
Négatif
Négatif
Adénovirus 1/Adénoïde 71
5,67E+04
Négatif
Négatif
Coronavirus 229E
1,70E+06
Négatif
Négatif
Coronavirus OC43
1,67E+06
Négatif
Négatif
Coxsackie virus B4
2,43E+06
Négatif
Négatif
Coxsackie virus B5/10/2006
2,28E+06
Négatif
Négatif
Cytomégalovirus
8,76E+05
Négatif
Négatif
Échovirus 7
5,38E+08
Négatif
Négatif
Échovirus 9
1,50E+06
Négatif
Négatif
Échovirus 6
1,05E+08
Négatif
Négatif
Échovirus 11
1,50E+05
Négatif
Négatif
Entérovirus 71
2,68E+03
Négatif
Négatif
Entérovirus 70
1,66E+05
Négatif
Négatif
Virus Epstein-Barr
5,000
cp/mL
Négatif
Négatif
Souche Maclnytre HSV Type 1
1,95E+06
Négatif
Négatif
Souche HSV Type 2 G
3,67E+06
Négatif
Négatif
ID organisme
Page 28 sur 33
Résultat de réactivité
Rougeole
Conc.
finale
3,78E+05
Résultat de
l’influenza A
Négatif
Résultat de
l’influenza B
Négatif
Virus des oreillons
8,43E+04
Négatif
Négatif
2,50E+05
Négatif
Négatif
2,20E+04
Négatif
Négatif
9,10E+05
Négatif
Négatif
9,57E+06
Négatif
Négatif
Virus varicelle-zona
7,50E+02
Négatif
Négatif
1,04E+07
Négatif
Négatif
2,55E+07
Négatif
Négatif
2,10E+05
Négatif
Négatif
2,05E+08
Négatif
Négatif
6,90E+08
Négatif
Négatif
6,60E+07
Négatif
Négatif
Mycobacterium avium
1,36E+10
Négatif
Négatif
5,90E+07
Négatif
Négatif
5,15E+07
Négatif
Négatif
Proteus vulgaris
2,65E+08
Négatif
Négatif
Proteus mirabilis
2,75E+07
Négatif
Négatif
2,15E+07
Négatif
Négatif
1,85E+08
Négatif
Négatif
Neisseria mucosa
1,85E+08
Négatif
Négatif
3,30E+07
Négatif
Négatif
Escherichia coli
6,80E+07
Négatif
Négatif
5,85E+07
Négatif
Négatif
Corynebacterium diphtheriae
6,0E+05
Négatif
Négatif
1,03E+08
Négatif
Négatif
4,5E+07
Négatif
Négatif
2,05E+08
Négatif
Négatif
2,50E+06
Négatif
Négatif
2,6E+07
Négatif
Négatif
5,15E+08
Négatif
Négatif
Candida albicans
1,07E+06
Négatif
Négatif
ID organisme
Spécificité analytique – Substances interférentes
La performance du test de l’influenza A+B de Quidel Molecular a été évaluée avec des substances potentiellement
interférentes qui peuvent être présentes dans les échantillons rhinopharyngés. Les substances potentiellement
interférentes ont été évaluées dans l’influenza A (A/Mexico/4108/2009), et l’influenza B (B/Floride/04/2006) à des
concentrations de 3x et 10x LoD. Il n'y avait pas de preuve d'interférence induite par les substances testées en
dessous de 3x ou 10x LoD.
Page 29 sur 33
Concentration testée
Résultat de
l’influenza A
(3x LoD)
Résultat de
l’influenza B
(3x LoD)
60 µg/mL
Positif
Positif
Sang (humaine), anticoagulé à l'EDTA
2 % (vol/vol)
Positif
Positif
Neosynephrine
15 % (vol/vol)
Positif
Positif
Aérosol nasal Afrin
15 % (vol/vol)
Positif
Positif
Gel nasal liquide homéopathique
antiallergique sans goutte et sans
somnolence Zicam
5 % (vol/vol)
Positif
Positif
15 % (vol/vol) de la dose
Positif
Positif
0,68 g/mL; goutte 1/18,
concassé; ingrédients actifs :
1,7 mg/mL menthol
Positif
Positif
3,3-5 mg/mL
Positif
Positif
Tobramycine
4,0 µg/mL
Positif
Positif
Mupirocine
6,6-10 mg/mL
Positif
Positif
Phosphate d'oseltamivir
7,5-25 mg/mL
Positif
Positif
Nom de la substance
Mucine (glande sous-maxillaire bovine,
type I-S)
Aérosol nasal contenant une solution saline
Pastilles pour la gorge
Zanamivir
Études de rémanence et de contamination croisée
Une étude interne a démontré l'absence de preuve de rémanence / contamination croisée avec le test de
l’influenza A+B de Quidel Molecular utilisant l'instrument d'extraction automatisée des acides nucléiques
bioMériue NucliSENS easyMAG.
Documentation source supplémentaire
1.
2. Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path
(April 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1594.pdf.
4. Draft Guidance on Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens
(Dec 2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
5. CLSI EP17-A : Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations
(Vol. 2, No. 34) (Oct 2004).
6. CLSI MM13-A : Guidance for the Collection, Transport, Preparation and Storage of Specimens for Molecular
7. CLSI EP7-A2 : Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov 2005).
8. CLSI EP12-A : Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14)
(Sept 2002).
9. CLSI MM6-A : Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, No.28)
(Oct 2003).
10. CLSI EP5-A2 : Guidance for Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods
(Vol. 24, No. 25 Second Ed.) (Aug 2004).
Assistance clientèle et technique
Pour passer une commande ou pour obtenir une assistance technique, veuillez contacter un représentant Quidel
au (800) 874-1517 (appel gratuit aux États-Unis) ou (858) 552-1100, du lundi au vendredi, de 8 h à 17 h, heure de
l'Est. Les commandes peuvent être passées par télécopieur au (740) 592-9820. Pour toute assistance par courriel,
veuillez contacter [email protected] ou [email protected]. Pour tout service à l'extérieur des ÉtatsUnis, veuillez contacter votre distributeur local. Des informations supplémentaires sur Quidel, nos produits et nos
distributeurs sont consultables sur notre site Web à l’adresse quidel.com.
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Propriété intellectuelle
Marques déposées
Cepheid® et Smartcycler® sont des marques déposées de Cepheid Corporation. Applied Biosystems® est une
marque déposée de Life Technologies. NucliSENS® et easyMAG® sont des marques déposées de bioMérieux, Inc.
TaqMan® est une marque déposée de Roche. CAL Flour® Orange 560, CAL Flour® Red 610 et Quasar® 670 sont des
marques déposées de BioSearch Technologies, Inc.
Brevets
Les composés colorants de ce produit sont commercialisés sous licence de Biosearch Technologies, Inc. et protégés
par des brevets américains et du monde entier soit émis soit en application.
L'achat de ce produit accorde à l'acheteur des droits conférés par certains brevets de Roche visant à autoriser son
utilisation uniquement dans le cadre de la fourniture de services de diagnostic in vitro pour l'homme. Aucun brevet
général ni aucune autre licence de toute autre nature que ce droit d'usage spécifique à l'achat n’est accordée par
les présentes.
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Glossaire
Représentant autorisé dans
la Communauté européenne
Fabricant
Contenu / Contient
Témoin
Utilisé par
Numéro de catalogue
Code de lot
Réservé au diagnostic in vitro
Consulter les instructions d’utilisation
Utilisation prévue
96
Contenu suffisant pour 96 déterminations
Limite de température
Page 32 sur 33
Références
1
http://1918.pandemicflu.gov consulté le 09/06/2011.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm consulté le 09/06/2011.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI document M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
M100 – Kit de dosage de l'influenza A+B Quidel Molecular
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanovre,
Allemagne
Quidel Corporation
Siège mondial
San Diego, CA 92121 États-Unis
quidel.com
M0002GFR00 (12/2012)
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Influenza A+B-Assay
Gebrauchsanweisung
Für die qualitative Erkennung und Identifizierung viraler Nukelinsäuren von Influenza A und
Influenza B, die aus Nasenabstrichen, Nasenrachenabstrichen und Nasenaspirat/-spülflüssigkeit
extrahiert wurden.
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Inhalt
Einsatzbereich ............................................................................................................................................... 4
Zusammenfassung und Erläuterung ............................................................................................................. 4
Funktionsprinzip............................................................................................................................................ 4
Mitgelieferte Materialien.............................................................................................................................. 6
Optionale Materialien ................................................................................................................................... 6
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien .................................................................................. 6
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen.................................................................................................... 7
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien .................................................................................. 7
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben ............................................................................ 8
Aufbewahrung von Nukleinsäureextrakten .................................................................................................. 8
Anleitung zum Programmieren der Nukleinsäureextraktion........................................................................ 8
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers ............................................................................................. 10
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II ................................................................................. 10
Anleitung zum Programmieren des 7500 Fast DX .................................................................................. 13
Programmierungsanweisungen für das Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time
PCR Instrument ....................................................................................................................................... 16
Assayverfahren ........................................................................................................................................... 16
Amplifikationsprotokoll auf dem SmartCycler II ..................................................................................... 16
Amplifikationsprotokoll auf dem ABI 7500 Fast Dx Thermocycler ......................................................... 17
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ...................................... 18
Auswertung der Ergebnisse ........................................................................................................................ 19
Auswertung der Ergebnisse mit dem SmartCycler II .............................................................................. 19
Auswertung der Ergebnisse mit dem 7500 Fast Dx Thermocycler ......................................................... 20
Auswertung der Ergebnisse mit dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ................................ 20
Qualitätskontrolle ....................................................................................................................................... 20
Einschränkungen ......................................................................................................................................... 21
Klinische Leistung ........................................................................................................................................ 21
Analytische Leistung ................................................................................................................................... 24
Seite 2 von 32
Nachweisempfindlichkeit............................................................................................................................ 24
Kompetitive Hemmung ............................................................................................................................... 25
Analytische Reaktivität (Inklusivität)........................................................................................................... 25
Reproduzierbarkeit ..................................................................................................................................... 27
Analytische Spezifität – Kreuzreaktivität .................................................................................................... 27
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien ............................................................................................. 29
Weiteres Quellenmaterial........................................................................................................................... 29
Kundendienst und technischer Support ..................................................................................................... 30
Geistiges Eigentum ..................................................................................................................................... 30
Handelsmarken ........................................................................................................................................... 30
Glossar ........................................................................................................................................................ 31
Literaturverweise ........................................................................................................................................ 32
Seite 3 von 32
Einsatzbereich
Der Quidel Molecular Influenza A+B Assay ist ein Multiplex-Echtzeit-RT-PCR-Assay für den qualitativen Nachweis
und die Identifizierung viraler Nukleinsäuren von Influenza A und/oder Influenza B, die aus Nasenabstrichen,
Nasenrachenabstrichen und Nasenaspirat/-spülflüssigkeit extrahiert wurden. Dieser Invitro-Labortest ist dafür
vorgesehen, bei der Differenzialdiagnose von viralen Infektionen mit Influenza A und/oder Influenza B bei
Menschen zu helfen. Der Assay weist nicht das Vorhandensein des Influenza C-Virus nach.
Negative Ergebnisse schließen eine Influenza-Infektion nicht aus und sollten nicht als alleinige Basis für die
Diagnose, Behandlung oder andere Patienten-Management-Entscheidungen herangezogen werden.
Leistungsmerkmale für Influenza A wurden festgelegt, als Influenza A/H3 und A/H1, welche die vorherrschenden
Influenza-A-Viren im Blut waren. Wenn andere Influenza A-Viren auftauchen, können die Leistungsmerkmale
variieren.
Zusammenfassung und Erläuterung
Grippeviren (Familie Orthomyxoviridae) enthalten ein einzelsträngiges RNA-Genom, das in 8 getrennten
Ribonukleoprotein-Segmenten vorliegt. Diese Segmentierung des Genoms ist in Viren selten und trägt
wahrscheinlich durch den Austausch von Gensegmenten zur raschen Entwicklung neuer Grippestämme bei, wenn
zwei verschiedene Viren dieselbe Zelle infizieren. Es gibt drei Arten von Grippe (Influenza): A, B und C. Von Typ A
existieren gleichartige Viren für Vögel, Schweine und Menschen, während die Typen B und C nur beim Menschen
bekannt sind. Da es zu einer weiteren, durch das Grippevirus A ausgelösten Pandemie kommen kann, wie sie 1918
1
auftrat, als 30 - 50 Millionen Menschen weltweit starben, überwachen die Zentren für Krankheitskontrolle
(Centers for Disease Control, CDCs) und die Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization, WHO) die
Grippestämme und erstellen Prognosen, welche Virusstämme sich für die Herstellung von Impfstoffen eignen.
2
Schätzungsweise resultieren in den USA 30.000 - 49.000 Todesfälle pro Jahr aus Grippeerkrankungen. Weltweit
erkranken in jährlichen Grippeepidemien drei bis fünf Millionen Menschen schwer, bei zusätzlich rund 250.000 3
500.000 Todesfällen. Influenza A-Pandemien treten ungefähr alle 10 bis 30 Jahre auf, Epidemien von Influenza A
oder B jährlich. Die Infektionen sind saisonal bedingt und breiten sich üblicherweise von November bis April in der
nördlichen Hemisphäre aus. Komplikationen treten meist bei Kindern, älteren Menschen und Personen mit
chronischen Herz-Lungen-Erkrankungen auf.
Die Inkubationszeit beträgt 1 - 3 Tage. Die Ausbreitung erfolgt rasch durch Tröpfcheninfektion und kontaminierte
Gegenstände. Die Krankheit äußert sich durch Fieber, Muskelschmerzen, Kopfschmerzen und Rachenentzündung.
Funktionsprinzip
Der Assay weist virale Nukleinsäuren nach, die aus einer Patientenprobe extrahiert wurden. Unter optimierten
Bedingungen wird eine Multiplex-RT-PCR-Reaktion in Echtzeit in einem einzigen Röhrchen durchgeführt, wobei für
jedes Ziel-Virus in der Probe Amplifikate generiert werden. Die Identifizierung von Influenza A erfolgt mit
zielspezifischen Primern und einer fluoreszenzmarkierten Sonde, die sich durch Hybridisierung an eine
konservierte Influenza-A-Sequenz im Matrixprotein-Gen anlagert. Die Identifizierung von Influenza B erfolgt durch
zielspezifische Primer und fluoreszenzmarkierte Sonden, die sich durch Hybridisierung an eine konservierte GrippeB-Sequenz im Neuraminidase-Gen anlagern.
Quidel Molecular Sonden-Etiketten
Ziel
Farbstoff
Influenza A
FAM
Influenza B
Prozesskontrolle (PRC)
Quasar® 670
Seite 4 von 32
Zusammenfassung des Verfahrens:
1.
Probennahme: Unter Anwendung von Standardverfahren Nasenabstriche, Nasenrachenabstriche und
Nasenaspirat/-spülflüssigkeit von symptomatischen Patienten entnehmen. Diese Proben werden gemäß
4
etablierten Laborverfahren transportiert, gelagert und bearbeitet.
2.
Nukleinsäureextraktion: Mithilfe des NucliSENS® easyMAG®-Systems unter Einhaltung der
Herstelleranweisungen und Verwendung der entsprechenden Reagenzien (siehe Erforderliche, jedoch nicht
mitgelieferte Materialien) Nukleinsäure aus den Proben extrahieren. Die Verwendung anderer
Extraktionssysteme mit dem Influenza A+B Assay von Quidel Molecular wurde nicht validiert. Die Validierung
dieser anderen Systeme liegt in der Verantwortung des Endbenutzers.
Vor dem Extraktionsverfahren 20 µl der Prozesskontrolle (PRC) zu je 180 µl Aliquot der Probe hinzugeben. Die
PRC dient der Überwachung von Inhibitoren in der extrahierten Probe, gewährleistet, dass eine angemessene
Amplifikation stattgefunden hat und bestätigt, dass die Extraktion der Nukleinsäure ausreichend war.
3.
Rehydrierung des Mastermix: Den lyophilisierten Mastermix mithilfe der Rehydrierungslösung rehydrieren.
Der MasterMix enthält Oligonukleotidprimer sowie mit einem Fluorophor und Quencher markierte Sonden,
die konservierte Genregionen der Influenza A- und Influenza B-Viren sowie die Prozesskontrollsequenz
erfassen.
4.
Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäure: In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung
15 µl des rehydrierten Mastermix geben. Anschließend 5 µl extrahierte Nukleinsäuren (Präparat mit PRC) in
die Testplattenvertiefung oder das entsprechend beschriftete Reagenzröhrchen geben. Die Testplatte oder
TM
das Reagenzröhrchen jeweils in das Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument, Applied
Biosystems® 7500 Fast Dx Instrument oder Cepheid® SmartCycler® II Instrument stellen. Der Assay wurde mit
der Geräteserie 7500 validiert.
Nachdem das Reagenzröhrchen oder die Testplatte in das Testgerät gestellt wurde, wird das Assay-Protokoll
gestartet. Dieses Protokoll initiiert eine Reverse Transkription der Ziel-RNA, wobei komplementäre DNA
generiert wird, und die anschließende Amplifikation der Zielamplifikate findet statt. Der Molecular Influenza
A+B-Assay von Quidel basiert auf der TaqMan®-Chemie und nutzt ein Enzym mit Reverse-Transkriptase-, DNAPolymerase- und 5’-3’-Exonuklease-Aktivitäten. Während der DNA-Amplifikation spaltet dieses Enzym die an
der komplementären DNA-Sequenz gebundene Sonde und löst den Quencher-Farbstoff vom ReporterFarbstoff. Dieser Schritt generiert bei Anregung durch eine Lichtquelle von entsprechender Wellenlänge einen
Anstieg des Fluoreszenzsignals. Mit jedem Zyklus werden weitere Farbstoffmoleküle von ihren Quenchern
getrennt, was ein weiteres Signal verursacht. Wenn mit 45 Zyklen eine ausreichende Fluoreszenz erzielt wird,
wird für die Probe in Bezug auf die nachgewiesene Nukleinsäure ein positives Ergebnis gemeldet.
Seite 5 von 32
Mitgelieferte Materialien
SKU-Nr. M100
Nachweiskit (96 Reaktionen) – Bei 2 bis 8 °C aufbewahren
#
Komponente
Menge/Anzahl


Rehydrierungslösung Artikel-Nr. M5003
1 Fläschchen/Kit 1,9 ml
Quidel Molecular Influenza A+B MasterMix Teil M5004
12 Fläschchen/Kit,
8 Reaktionen/Fläschchen
Lyophilisierter Inhalt:
DNA-Polymerase-Enzym mit Reverse-Transkriptase-Aktivität
Primer und Sonden
dNTPs
Stabilisatoren
Prozesskontrolle Artikel-Nr. M5005
1 Fläschchen/Kit 2,0 ml
Optionale Materialien
Positiv-Kontrollen für Influenza A und Influenza B (z.B. Molecular Influenza A+B Control Set Nr. M106 von
Quidel, das als externe Verabarbeitungs- und Extraktionskontrolle dient)
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl sowie 100 und 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument oder Applied Biosystems
7500 Fast Dx Instrument
Applied Biosystems 7500 Fast Dx PCR-Testplatte mit 96 Vertiefungen
Applied Biosystems Verschlussfolie
Plattenzentrifuge für ABI-Testplatte mit 96 Vertiefungen
Oder
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl sowie 100 und 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
SmartCycler® II
SmartCycler II-Verbrauchsmaterial
SmartCycler II-Zentrifuge
Seite 6 von 32
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnose
Wenn, basierend auf den von den Gesundheitsbehörden empfohlenen aktuellen klinischen und
epidemologischen Screening-Kriterien, Verdacht auf eine Infektion mit einem neuen Influenza A-Virus besteht,
müssen unter entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen gegen eine Infektion für neue virulente Influenzaviren
Proben gesammelt und zur Untersuchung an die staatlichen oder örtlichen Gesundheitsbehörden geschickt
werden.
Die Leistungsmerkmale dieses Tests wurden nur anhand der im Abschnitt Bestimmungsgemäßer Gebrauch
aufgeführten Präparattypen bestimmt. Die Leistung dieses Assays mit anderen Präparattypen oder Proben
wurde nicht untersucht.
Die Verwendung anderer Extraktionssysteme als dem NucliSENS easyMAG-System wurde nicht geprüft. Die
Validierung dieser Systeme liegt in der Verantwortung des Endbenutzers.
Die Verwendung anderer Zyklusbedingungen als der im Abschnitt „Anleitung zum Programmieren des
Thermocyclers“ beschriebenen kann zu falschen Ergebnissen führen.
Die Verwendung dieses Produkts sollte Personen mit ausreichender Übung bei PCR- und RT-PCR-Methoden
vorbehalten sein.
Alle Präparate/Proben sind als potenziell infektiös zu behandeln. Bei der Arbeit mit Proben, diesem Kit und
dessen Inhalt sind universelle Vorsichtsmaßnahmen zu befolgen.
Korrekte Ergebnisse setzen eine ordnungsgemäße Gewinnung und Lagerung und einen sachgemäßen
Transport der Proben voraus.
Die Assay-Reagenzien sind entsprechend den Angaben auf ihren jeweiligen Etiketten aufzubewahren.
Bei der Verwendung dieses Kits geeignete Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille und Mundschutz tragen.
Um genaue Ergebnisse beim Pipettieren zu erhalten, sorgfältig vorgehen und nur kalibrierte Geräte
verwenden.
Alle Oberflächen mit einer 10%igen Bleichelösung und anschließend mit molekularbiologisch gereinigtem
Wasser reinigen und desinfizieren.
Bei allen Arbeitsschritten Mikro-Pipettierer mit einer Aerosolbarriere oder Spitzen mit positiver Verdrängung
verwenden.
Mikrobielle Kontamination bzw. Kreuzkontamination der Kitreagenzien vermeiden. Nach den Prinzipien der
Guten Laborpraxis arbeiten.
Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen Chargennummern dürfen nicht gemischt werden.
Keine Reagenzien anderer Hersteller mit diesem Kit verwenden.
Das Produkt nicht nach Ablauf seines Verfallsdatums nicht verwenden.
Die richtige Planung des Arbeitsablaufs ist eine Grundvoraussetzung zur Minimierung des
Kontaminationsrisikos. Den Arbeitsablauf im Labor stets in eine Richtung, beginnend bei der Präamplifikation
und weiter in Richtung Amplifikation und Detektion ablaufend, planen.
Im Präamplifikations- und Amplifikationsbereich jeweils eigenes Zubehör und eigene Gerätschaften
verwenden.
Zwischen den Bereichen darf weder Personenverkehr noch Austausch von Gerätschaften stattfinden.
Das Zubehör für die Amplifikation und das Zubehör für die Präamplifikation jederzeit voneinander getrennt
halten.
Probenröhrchen oder Platten nach der Amplifikation nicht mehr öffnen bzw. entsiegeln.
Amplifiziertes Material sorgfältig und nach vor Ort geltenden Gesetzen und Bestimmungen entsorgen, um das
Risiko einer Amplifikatkontamination zu minimieren.
Zubehör, das nur für die Reagenzien- oder Probenvorbereitung bestimmt ist, nicht für die Verarbeitung von
Zielnukleinsäure verwenden.
Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich und stehen auf der Produkt-Website zur Verfügung.
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien
Das ungeöffnete Kit bis zu dem auf der äußeren Kitschachtel aufgedruckten Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C
aufbewahren.
Der rehydrierte Mastermix kann bei Raumtemperatur (20 bis 25 °C) bis zu 24 Stunden aufbewahrt werden. Bei
längerer Lagerung muss der rehydrierte Mastermix wieder mit einem Deckel verschlossen und mit Parafilm
versiegelt werden und kann bis zu 14 Tage in aufrechter Position bei ≤ -20 °C gelagert werden. Den Mastermix
lichtgeschützt aufbewahren.
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Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsbeeinträchtigung der Reagenzien: Eine Trübung der Rehydrierungslösung
kann ein Anzeichen für eine Qualitätsbeeinträchtigung dieses Reagenzes sein. In diesem Fall kann beim
Technischen Kundendienst von Quidel ein Ersatzreagenz angefordert werden.
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben
Für die Validierung des Influenza A+B Assays von Quidel Molecular verwendete Proben werden Patienten mit
Symptomen einer Infektion der oberen Atemwege mittels Standardverfahren entnommen. Diese Proben wurden
in Übereinstimmung mit CLSI M41-A entnommen, transportiert, gelagert und verarbeitet.
Aufbewahrung von Nukleinsäureextrakten
Der Benutzer ist für die Überprüfung der Lagerverfahren und -bedingungen in dem Labor verantwortlich. Eluate
können bei Raumtemperatur (20 bis 25 °C) 2 Stunden, bei 2-8 °C 8 Stunden, bei -20 °C bis -70 °C 1 Monat lang
aufbewahrt werden. die Aufbewahrung kleiner Mengen Nukleinsäureextrakts (z.b. 5 μL oder weniger) wird nicht
empfohlen.
Anleitung zum Programmieren der Nukleinsäureextraktion
1.
Das Gerät einschalten und warten, bis das Lämpchen auf orange umschaltet. Anschließend den Computer
einschalten und die easyMAG-Software starten.
2.
Nach Drücken der Schaltfläche „Instrument“
Barcode versehen.
3.
Zur Eingabe von Proben die Schaltfläche „Tägliche Verwendung“
und „Reagenzinventar“
die Reagenzien mit
drücken, mit der standardmäßig der
Bildschirm „Anforderung definieren“
geöffnet wird. Folgende Einstellungen auswählen:
a. Proben-ID:
Mit der Tastatur den Probennamen eingeben.
b. Matrix:
Aus dem Dropdown-Menü Andere auswählen
c. Anforderung:
Aus dem Dropdown-Menü Generisch auswählen
d. Volumen (ml): Aus dem Dropdown-Menü 0,200 auswählen
e. Eluat (µl):
Aus dem Dropdown-Menü 50 auswählen
f. Typ:
Primär
g. Priorität:
Normal
4.
Nach Drücken der Schaltfläche „Speichern“
wird die Probe im Fenster „Nicht zugewiesene Probe“ links
auf dem Bildschirm angezeigt. Die Schaltfläche „Neue Extraktionsanforderung eingeben“
drücken und
den Vorgang für die anderen Proben wiederholen. Alternativ können durch Drücken der Schaltfläche „Neue
Extraktionsanforderungen automatisch erstellen“
5.
mehrere Proben eingegeben werden.
Nach Erstellung aller Proben durch Anklicken des Symbols
aufrufen. Durch Drücken der Schaltfläche „Lauf erstellen“
den Lauf eingeben oder die Standardbezeichnung verwenden.
6.
oben auf der Seite „Läufe organisieren“
einen Lauf erstellen. Eine Bezeichnung für
Mithilfe der Schaltfläche „Lauf automatisch füllen“
können dem Lauf Proben hinzugefügt werden (aus
der Liste „Liste nicht zugewiesener Proben“ links im Bildschirm werden dem Lauf automatisch bis zu 24
Proben hinzugefügt). Alternativ können mithilfe der Positionierungssymbole links und rechts
nach entsprechender Auswahl einzelne Proben in den Lauf eingefügt oder daraus entfernt werden. Mit den
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7.
8.
Schaltflächen „Extraktionsanforderung nach oben/unten verschieben“
kann die Reihenfolge
der Proben im Lauf geändert werden.
1 bis 3 Probengefäße (für 8 bis 24 Proben) bereitstellen und in jede verwendete Probenvertiefung 20 µl
Prozesskontrolle pipettieren.
In die entsprechenden Vertiefungen 180 µl jeder Probe pipettieren.
9.
Durch Drücken der Schaltfläche
oben im Bildschirm „Lauf beladen“ aufrufen. Spitzen und
Probengefäß(e) in das Instrument einsetzen
10. Den/die Barcode(s) des/der Probengefäße(s) eingeben
11. Den/die Barcode(s) der zu verwendenden Silica-Kügelchen eingeben
12. Die Silica-Kügelchen wie folgt den Proben zuweisen:
a. Auf das Reagenziensymbol unter der Nummer 1 im Bild unten klicken. Die Chargennummer der SilicaKügelchen sollte nun unterhalb der Registerkarte „Silica“ bei der Nummer 2 im Bild unten
angezeigt werden.
b. Die Proben in dem Lauf, denen die Kügelchen zugewiesen werden müssen, markieren und auswählen
(in dem Kästchen mit der Nummer 3 im Bild unten).
c.
d.
Zur
Zuweisung der Silica-Chargennummer zu den ausgewählten Proben das
Positionierungssymbol (unter der Nummer 4 im Bild unten) anklicken
Wenn das Symbol für die Kügelchen rechts von der Nummer 5 im Bild unten ausgewählt wird, muss
für jede Probe die Chargennummer der Silica-Kügelchen angezeigt werden
13. Die Arbeitsliste ausdrucken, indem zuerst das Symbol für „Lauf beladen“ und anschließend das Symbol
„Arbeitsliste ausdrucken“
gedrückt wird.
14. Die Schaltfläche „Lysepuffer verteilen“
drücken. Der vom Gerät durchgeführte Lysevorgang dauert ca.
12 Minuten.
15. Die Magnetpartikel für jedes Probengefäß mit der Biohit-Pipette und die Spitzen für bis zu acht Reaktionen wie
folgt vorbereiten:
a. Unter Verwendung von 1 Spitze und von Programm 1 550 µl nukleasefreies Wasser aufziehen und in
ein 1,5 ml DNase-/RNase-freies Mikrofugenröhrchen pipettieren.
b. Die Silica-Magnetkügelchen vortexen. Unter Verwendung von 1 Spitze und dem Programm 1 550 µl
Silica-Magnetkügelchen aufziehen, in das Wasser geben und auf dem Vortex mischen.
c. Unter Verwendung von 1 Spitze und dem Programm 2 1050 µl des Silica-MagnetkügelchenGemisches aufziehen und 25 µl zurück in das Röhrchen geben.
Seite 9 von 32
d.
e.
f.
125 µl Silica-Magnetkügelchen-Gemisch 8 Mal in 8 Vertiefungen einer ELISA-Teststreifenplatte
pipettieren. Die Spitze entsorgen.
Nach Beendigung der Lyse (Hinweis: Der unten im Bildschirm angezeigte „Gerätestatus“ muss
„BEREIT“ lauten!) unter Verwendung von 8 Spitzen und Programm 3 100 µl Silica-MagnetkügelchenGemisch aus den Vertiefungen der Teststreifen aufziehen, 100 µl Silica-Magnetkügelchen-Gemisch in
die Vertiefungen der der Teststreifen geben und 100 µl Silica-Magnetkügelchen-Gemisch aus den
Vertiefungen der Teststreifen aufziehen.
Die Spitzen jeweils in die Flüssigkeit derselben Gefäße eintauchen. Von dem Silica-MagnetkügelchenGemisch 800 µl aufziehen und dann wieder 900 µl in das Gefäß zurückgeben. 1000 µl des SilicaMagnetkügelchen-Gemischs aus dem Gefäß aufziehen und wieder zurück in das Gefäß geben. Die
Aspiration/Rückführung der 1000 µl noch zweimal wiederholen.
16. Das Gerät schließen und die Schaltfläche „Start“
drücken, um mit dem Lauf zu beginnen.
17. Nach Abschluss des Laufs die gereinigten Nukleinsäuren in nukleasefreie Röhrchen übertragen. Die gereinigten
Nukleinsäuren sofort verwenden oder bei -70 °C einfrieren.
Einschränkungen: Das folgende Protokoll wurde speziell für dieses Assay entwickelt. Seine Eignung für andere
Assays ist nicht bekannt. Die Kompatibilität der Software durch Rücksprache mit bioMérieux S.A. sicherstellen.
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II
1.
2.
Das Softwarepaket des SmartCyclerDx Version 3.0b starten
Den Quidel Molecular Influenza A+B-Assay erstellen
a. Oben im Bildschirm die Schaltfläche Assays definieren auswählen
b. Eine Bezeichnung für den Assay eingeben
i. Unten links im Bildschirm die Schaltfläche Neu auswählen
ii. „Quidel Molecular Influenza A+B“ eintippen und OK wählen
iii. Nun wird „Quidel Molecular Influenza A+B“ der Liste Assayname oben links im Bildschirm
hinzugefügt
c. Die Analysewerte festlegen: Im Abschnitt Assaytyp: Forschung die Registerkarte Analyseeinstellungen
auswählen und folgende Spezifikationen verwenden:
i. Aus dem Dropdown-Menü Farbstoffe FATA25 wählen
ii. Das Dropdown-Menü Analysetyp sollte auf Qualitativ (Standardeinstellung) eingestellt werden
iii. In der Spalte Kanal-Name „Influenza A“ für FAM, „Influenza B“ für Alx532 und „PRC“ für Alx647
eingeben
iv. In der Spalte Gebrauch aus dem Dropdown-Menü Ziel für Influenza A und Influenza B eingeben und
für PRC Interne Kontrolle auswählen. Bei Auswahl von Interne Kontrolle öffnet sich die folgendes
Warnfenster. Die Schaltfläche Ja auswählen.
v. In der Spalte Kurvenanalyse die Option Primäre Kurve für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B,
PRC) wählen (Standardeinstellung).
vi. In der Spalte Einstellung des Schwellenwerts für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC)
Manueller Schwellenwert eingeben (Standardeinstellung).
vii. In der Spalte Manueller Schwellenwert für Fluoreszenzeinheiten folgende Schwellenwerte
eingeben:
Seite 10 von 32
viii.
ix.
x.
xi.
xii.
xiii.
xiv.
xv.
xvi.
xvii.
a. Influenza A:
20.0
b. Influenza B:
20.0
c. PRC:
20.0
In der Spalte Gültige Mindestzahl Zyklen für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 10
eingeben.
In der Spalte Gültige Höchstzahl Zyklen für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 45 eingeben.
In der Spalte Leerwertsubtraktion für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) „ON” eingeben
(Standardeinstellung).
In der Spalte Mindestanzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 5
eingeben (Standardeinstellung).
In der Spalte Höchstzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 35
eingeben.
In der Spalte Durchschnittl. Anzahl Zyklen Boxcar für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 0
beibehalten (Standardeinstellung).
In der Spalte Endpunkt Schwellenwert für jeden Kanal (Influenza A, Influenza B, PRC) 20, 10, 10
eingeben (Standardeinstellung).
In der Spalte NC IC% für jeden Kanal (PRC) „NA“ belassen (Standardeinstellung).
In der Spalte IC Delta für jeden Kanal (RSV, hMPV) „NA“ belassen (Standardeinstellung).
Im Abschnitt Ergebnistext anpassen (unterhalb der Tabelle) aus dem Dropdown-Menü
Organismusbasierter Ergebnistext wählen. Das nachstehende Warnfenster wird geöffnet. Ja
wählen.
xviii. Mit der Schaltfläche Anpassen das Dialogfenster Organismusbasierter Ergebnistext öffnen. Noch
einmal die Schaltfläche Hinzufügen auswählen, in der Spalte Bezeichnung des Organismus
„Influenza A“ eingeben und das Kästchen Influenza A markieren. Noch einmal die Schaltfläche
Hinzufügen auswählen, in der Spalte Bezeichnung des Organismus „Influenza B“ eingeben und das
Kästchen Influenza B markieren.
d.
Unten in dem Popup-Fenster auf OK klicken
Die Dauer und die Temperaturen der RT-PCR-Zyklen unten auf dem Bildschirm wie folgt einstellen:
i. Phase 1
1. Halten
2. Temperatur: 55,0
3. Sekunden: 300
4. Optik:
AUS
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ii. Phase 2
1.
2.
3.
4.
Halten
Temperatur: 60,0
Sekunden: 300
Optik:
AUS
1.
2.
3.
4.
Halten
Temperatur: 65,0
Sekunden: 300
Optik:
AUS
iii. Phase 3
iv. Phase 4
1.
2.
3.
3.
Zyklus mit 2 Temperaturen
Anzahl der Wiederholungen: 50
Erste Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
92,0
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
4. Second Temperature Row Zweite Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
57,0
b. Sekunden:
40
c. Optik:
EIN
Das Protokoll durch Auswahl der Schaltfläche Speichern unten im Bildschirm speichern
Abbildung des vollständigen Protokolls für das Quidel Molecular A+B-Protokoll
Einschränkungen: Das folgende Protokoll wurde speziell für die Verwendung mit dem Influenza A+B Echtzeit-RTPCR-Assay von Quidel Molecular entwickelt. Seine Eignung für andere Assays ist nicht bekannt. Die Kompatibilität
der Software durch Rücksprache mit Cepheid sicherstellen.
Seite 12 von 32
Anleitung zum Programmieren des 7500 Fast DX
1.
2.
Das 7500 Fast Dx Softwarepaket starten.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet. Die Schaltfläche Neues Dokument
erstellen auswählen, um den Assistenten für neue Dokumente aufzurufen. Zur Initiierung des Protokolls für
Quidel Molecular A+B die nachstehenden einzelnen Schritte befolgen.
a. Dokument definieren: Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um
Standardeinstellungen. Andernfalls die entsprechenden Änderungen vornehmen.
i. Die folgenden Daten bestätigen bzw. eingeben.
b.
Assay:
Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
Behältnis:
96 Vertiefungen, transparent
Vorlage:
Leeres Dokument
Laufmodus:
Fast 7500
Bediener:
Ihr Bedienername
Anmerkungen:
SDS v1.4 (ggf. weitere hinzufügen)
Bezeichnung der Platte:
„Quidel Molecular Influenza A+B“
ii. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
Detektoren auswählen: Es müssen neue Detektoren für Influenza A, Influenza B und die
Prozesskontrolle (PRC) hinzugefügt werden. Für jedes Ziel die Schaltfläche Neuer Detektor
auswählen, um das Popup-Fenster Neuer Detektor aufzurufen. Alternativ die Schaltfläche Weiteren
erstellen aus dem Popup-Fenster Neuer Detektor für die letzten zwei Detektoren verwenden.
i. Für jeden Detektor die folgenden Informationen eingeben:
Bezeichnung
Reporter-Farbstoff Quencher-Farbstoff
Influenza A
FAM
(keiner)
Influenza B
JOE
(keiner)
PRC
Cy5
(keiner)
c.
d.
Farbe
(Auswahl)
(Auswahl)
(Auswahl)
ii. Für jeden Detektor eine eigene Farbe auswählen.
iii. Die neuen Detektoren markieren und der Spalte Detektoren in Dokument mit der
Schaltfläche Hinzufügen hinzufügen.
iv. Aus dem Dropdown-Menü Passive Referenz Keine auswählen.
v. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
vi. Die Schaltfläche Fertigstellen auswählen, ohne jedoch vorher Vertiefungen festzulegen.
Der Assistent wird geschlossen, und die Software wird aufgerufen, wobei zunächst die Registerkarte
Vorbereitung angezeigt wird. Hier wird die Probenplatte angezeigt, die während des Schnellstarts
erstellt worden ist. Bei der ersten Einrichtung muss auf dieser Registerkarte nichts geändert werden.
Definition des Thermocycler-Protokolls: Die Registerkarte Gerät auswählen, um Dauer und
Temperaturen der RT-PCR-Zyklen für den Quidel Molecular Influenza A+B einzustellen. Unter
Thermoprofil sollte ein aus 2 Phasen bestehendes Standardprotokoll vorhanden sein. Jede Phase hat
3 vom Benutzer bearbeitbare Textfelder. Der Wert im obersten Feld gibt die Anzahl der
Wiederholungen oder Zyklen für die betreffende Phase an. Der Wert im mittleren Feld gibt die
Temperatur (˚C) und das unterste Feld gibt die Zeit (in Minuten: Sekunden) an.
Seite 13 von 32
i. Das Thermalcycler-Standardprotokoll wie folgt ändern:
1. Phase 1
a. Wiederholungen:
1
b. Temperatur:
55
c. Dauer:
5:00
2. Den Balken zwischen Phase 1 und Phase 2 auswählen. Die Schaltfläche Pause
hinzufügen auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
3. Phase 2
a. Wiederholungen:
1
b. Temperatur:
60
c. Dauer:
5:00
4. Den Balken zwischen Phase 2 und Phase 3 auswählen. Die Schaltfläche Pause
hinzufügen auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
5. Phase 3
a. Wiederholungen:
1
b. Temperatur:
65
c. Dauer:
5:00
6. Phase 4 (2-Schritt-Dissotiationsphase)
a. Wiederholungen: 10
b. Schritt 1
i. Temperatur: 92
ii. Dauer:
0:05
c. Schritt 2
i. Temperatur: 57
ii. Dauer:
0:40
7. Den Balken rechts von Stage 4 wählen. Die Schaltfläche Zyklus hinzufügen
auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
8. Phase 5 (2-Schritt-Dissotiationsphase)
a. Wiederholungen: 35
b. Schritt 1
i. Temperatur: 92
ii. Dauer:
0:05
c. Schritt 2
i. Temperatur: 57
ii. Dauer:
0:40
Seite 14 von 32
9.
Wurde eine falsche Phase hinzugefügt, kann diese entfernt werden, indem nach
Markieren der Phase zwischen den senkrechten Linien die Schaltfläche Löschen
gedrückt wird.
ii. Unter Einstellungen Folgendes eingeben:
Probenvolumen (μl):
20 (Standard)
Laufmodus:
7500 Fast (Standard)
Datenerfassung:
Phase 5, Schritt 2 (57,0 @ 0:40)
HINWEIS: Das Kontrollkästchen neben „Expertenmodus“ nicht markieren.
iii. Endgültiges Protokoll
e.
Den Schwellenwert für jeden Analyten einstellen.
i. Die Registerkarte Ergebnisse öffnen.
ii. Die Registerkarte Amplifikationsplot öffnen.
iii. Aus der Registerkarte „Detektor“ oben rechts „Influenza A“ wählen.
iv. Im Block Analyseeinstellungen den Schwellenwert auf 1,5e5 setzen.
v. Das Optionsfeld Automatische Basislinie auswählen.
vi. Schritt iii-v für Influenza B wiederholen und den Schwellenwert auf 1,2e5 setzen.
vii. Schritt iii-v für PRC wiederholen und den Schwellenwert auf 2,7e4 setzen.
Seite 15 von 32
f.
g.
Das neue Protokoll für spätere Verwendungen als Matrize speichern.
i. Oben im Bildschirm Datei und anschließend Speichern als auswählen.
ii. Speichern unter: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Dateiname: „Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular“
iv. Dateityp: „SDS Templates (*.sdt)“
Die Software beenden.
Einschränkungen: Das folgende Protokoll wurde speziell für die Verwendung damit entwickelt. Seine Eignung für
andere Assays ist nicht bekannt. Die Kompatibilität der Software durch Rücksprache mit Life Technologies
sicherstellen.
Programmierungsanweisungen für das Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time
PCR Instrument
Das Instrument wird unter Verwendung der mit dem Test-Kit gelieferten TDD-Datei durchgeführt.
Assayverfahren
Die folgenden Arbeitsschritte werden bei einer geregelten Raumtemperatur von 20 bis 25 °C durchgeführt.
Vorgehensweise zur Nukleinsäureextraktion
Die Anleitung zum Programmieren des NucliSENS easyMAG Systems oben beachten.
1. In die Probenextraktionsvertiefung 20 µl der Prozesskontrolle geben.
2. In die Probenextraktionsvertiefung 180 µl Patientenprobe oder externe Kontrolle geben.
3. Die Extraktion nach den Anweisungen des Herstellers durchführen.
Vorgehensweise zum Rehydrieren des Mastermix
1. Die Anzahl der zu testenden Präparate bestimmen und die entsprechende Anzahl an lyophilisierten
Mastermix-Fläschchen (für jeweils 8 Reaktionen) für den Assay bereitstellen.
2. Unbenutzte Reagenzien wieder unter ihren jeweiligen Aufbewahrungsbedingungen aufbewahren.
3. Den Mastermix vorsichtig öffnen, um eine Beschädigung des Pellets zu vermeiden.
4. Dem Mastermix 135 µl der Rehydrierungslösung zugeben.
5. Das Fläschchen 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit das Pellet rehydriert.
6. Vor dem Verteilen in das erste PCR-Röhrchen oder die Testplattenvertiefung vorsichtig und unter
Vermeidung der Bildung von Luftbläschen 2 bis 3 Mal auf- und abpipettieren.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix ist ausreichend für acht Reaktionen.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix kann bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden oder bei ≤ -20 °C bis zu
14 Tage aufbewahrt werden. (Weitere Optionen zur Aufbewahrung sind dem Abschnitt „Aufbewahrung
und Handhabung der Kit-Reagenzien“ zu entnehmen)
Vorgehensweise zum Vorbereiten der RT-PCR:
1. In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung 15 µl des rehydrierten Mastermix geben.
2. In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung 5 µl extrahierte Nukleinsäure (Präparat mit
Prozesskontrolle) geben. Ein Mischen der Reagenzien ist nicht erforderlich.
Hinweis: Für jeden Probenextrakt eine neue Mikro-Pipettierer mit einer neuen aerosolfreien
Spitze verwenden.
3. Die Reagenzröhrchen schließen bzw. die Platte versiegeln.
Hinweis: Quidel empfiehlt, bei jedem Thermocycler-Lauf ein Reagenzröhrchen oder eine Vertiefung mit
Influenza A/Influenza B und externer Positiv- und Negativkontrolle mitzuführen. Die Kontrollen nach den
jeweils im Labor üblichen Vorgehensweisen und Protokollen testen.
4. Die Reagenzröhrchen bzw. die Platte mindestens 15 Sekunden zentrifugieren. Darauf achten, dass sich die
gesamte Flüssigkeit am Boden der Platte befindet.
5. Die Röhrchen bzw. die Platte in den Thermocycler setzen.
Amplifikationsprotokoll auf dem SmartCycler II
1.
2.
3.
Den Block/die Blöcke des SmartCyclers einschalten
Das Softwarepaket des SmartCycler Dx Version 3.0b starten
Die Schaltfläche Lauf erstellen oben im Bildschirm auswählen, um den Lauf einzustellen
Seite 16 von 32
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Unter Name des Laufs einen Namen für den aktuellen Lauf eingeben (JJMMTT-Quidel Molecular Influenza
A+B)
Unter Anmerkungen etwaige Anmerkungen zu dem Lauf für künftige Bezugnahme eingeben
Unter Assay „Quidel Molecular Influenza A+B-Assay“ aus dem Dropdown-Menü auswählen
Unter Assay-Informationen die Chargennummer und das Verfallsdatum des Kits eingeben.
Zur Auswahl der zu verwendenden Vertiefungen wie folgt vorgehen:
a. Zur automatischen Zuordnung von Vertiefungen wie folgt vorgehen:
i. Unter Anzahl der Proben die Anzahl der Proben in das dazu vorgesehene Textfeld eingeben.
ii. Die Schaltfläche Anwenden auswählen. Die eingegebene Anzahl an Reihen wird in der
Positionstabelle angezeigt.
b. Manuelles Schließen der Vertiefungen der SmartCycler-Blöcke:
i. Die Schaltfläche Positionen hinzufügen/entfernen weiter unten auf dem Bildschirm wählen.
ii. Dadurch wird das Popup-Fenster Positionen auswählen mit zwei Spalten aufgerufen. Die Spalte
links (Positionen) führt alle verfügbaren Positionen auf, die Spalte rechts (Auswahlen) enthält
alle ausgewählten Positionen.
iii. Zur Auswahl aller Positionen auf die Schaltfläche Alle Positionen wählen klicken.
iv. Zur Auswahl spezifischer Positionen mindestens eine Position markieren und die Position(en)
mithilfe des Nach-rechts-Pfeils der Spalte Auswahlen hinzufügen.
v. Zum Schließen des Fensters die Schaltfläche OK drücken. Die ausgewählten Positionen werden in
der Positionstabelle angezeigt.
Die Probenkennungen in die Spalte Proben-ID in der Positionstabelle eingeben (dies kann auch erst nach
Beginn des Laufs durchgeführt werden).
In die Spalte Anmerkungen etwaige Anmerkungen eintragen und die Einträge in der Spalte Probentyp bei
„SPEC“ belassen.
Unten im Bildschirm die Schaltfläche Lauf starten auswählen.
Zur Anzeige des Fortschritts des Laufs die Schaltfläche Ergebnisse anzeigen wählen.
Den Lauf nach seinem Abschluss und vor dem Schließen der Software speichern.
Amplifikationsprotokoll auf dem ABI 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Den ABI 7500 Fast Dx einschalten.
Das ABI 7500 Fast Dx Softwarepaket starten.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet.
Auf Neues Dokument erstellen klicken.
Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um Standardeinstellungen. Andernfalls die
entsprechenden Änderungen vornehmen.
Assay:
Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
Behältnis:
96 Vertiefungen, transparent
Vorlage:
Laufmodus:
Fast 7500
Bediener:
Ihr Bedienername
Anmerkungen:
SDS v1.4 (ggf. weitere hinzufügen)
Bezeichnung der Platte:
JJMMTT-Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular
Vorbereitung einer Platte mit Proben
a. Auf den Registerkarten Vorbereitung und Platte wird das Platten-Layout angezeigt.
b. Alle Vertiefungen auswählen, die Proben enthalten werden, die rechte Maustaste drücken und aus
dem Dropdown-Menü die Option Kavitätenprüfung wählen. Wenn sich das Popupfenster
Kavitätenprüfung öffnet, die Detektoren für Influenza A, Influenza B und PRC auswählen.
c. Zur Eingabe der Probenbezeichnungen die Option Kavitätenprüfung verwenden. Im Fenster
„Kavitätenprüfung“ können auch die Patienten-IDs eingegeben werden. Es wird empfohlen, dies vor
Seite 17 von 32
7.
8.
dem Resuspendieren des lyophilisierten Mastermix, nach dem Lauf oder mithilfe der Import-Funktion
durchzuführen, damit die PCR-Reaktionen vor Beginn des Laufs möglichst kurze Zeit der
Raumtemperatur ausgesetzt sind.
d. Den Lauf als JJMMTT-Quidel Molecular Influenza A+B.sds speichern.
e. Es wird ein Fenster geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Starten der PCR
a. Die Registerkarte Gerät aufrufen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in das Gerät setzen.
c. Unter Gerätesteuerung die Schaltfläche Start wählen, um den Lauf zu starten.
Nach der PCR
a. WICHTIG: Nach Beendigung des Laufs auf OK drücken. Die Daten durch Drücken der Schaltfläche
„Analysieren“ im Menü oben analysieren. Anschließend die Datei speichern.
b. Zum Speichern der Datei Dokument speichern in der Taskleiste drücken. Es wird ein Fenster geöffnet,
in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach dem Lauf“ bzw.
andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Den QuantStudio Dx einschalten.
Den IVD-Modus auf dem Instrument auswählen.
Das QuantStudio Dx IVD Softwarepaket starten.
Wenn eine entsprechende Aufforderung angezeigt wird, Benutzername und Passwort eingeben.
Der Startbildschirm wird geöffnet.
Im Kästchen Vorbereitung den Namen des zuvor geladenen Tests „Quidel Molecular Influenza A+B
Assay“ eingeben.
Auf die Schaltfläche Vorbereitung klicken, um einen Lauf zu starten.
Der Bildschirm Vorbereitung, Testeigenschaften erscheint. Entsprechende Lauf-Informationen eingeben.
a. Experimentname eingeben (Standardeinstellung startet den Lauf mit einem Datum und Zeitstempel).
b. Die Information Platten-Barcode eingeben.
c. Unter Reagent Information (Reagenzinformationen) die Material-Chargennummern notieren.
d. Den Lauf als JJMMTT-Quidel Molecular Influenza A+B.sds speichern.
e. Ein Fenster wird geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
In der linken Menüleiste Definieren auswählen.
Die Probeninformationen bearbeiten.
a. Spezifische Probeninformationen für jede Vertiefung eingeben, indem die Standard-ID (Patient 1,
Patient 2 usw.) gelöscht wird und neue Informationen eingegeben werden, ODER
b. Oben auf der Anzeige Aus Datei importieren auswählen, um eine vordefinierte Plattenkarte aus einer
Text-Datei (tabulator-getrennt) auszuwählen.
In der linken Menüleiste Zuweisen auswählen, um die richtige Plattenvorbereitung sicherzustellen.
Laden der Probenplatte.
a. Den Instrumententräger auswerfen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in die Maschine einführen, wobei die Vertiefung A1 in der linken
oberen Ecke positioniert wird.
c. Den Instrumententräger einziehen.
Den Lauf starten.
a. In der linken Menüleiste Lauf auswählen.
b. Oben im Bildschirm auf die Schaltfläche Lauf starten klicken.
i. Bei entsprechender Aufforderung die Seriennummer für das verwendete Instrument auswählen.
14. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, in der linken Menüleiste Lauf auswählen.
Seite 18 von 32
a.
Zum Speichern der Datei Speichern in der Taskleiste drücken. Es wird ein Fenster geöffnet, in dem
der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach dem Lauf“ bzw. andere
Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
b. Standardmäßig erscheint Amplifikationsplot. Um andere Plotarten anzuzeigen, können diese aus der
linken Menüleiste ausgewählt werden.
c. Um Laufinformationen mit Ct-Werten anzuzeigen, die Registerkarte Vertiefungstabelle rechts im
Bildschirm auswählen.
15. Drucken eines Berichts.
a. In der oberen Menüleiste Bericht drucken auswählen. Den Inhalt des Berichts anpassen, indem
Kontrollkästchen im Berichtsfenster ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
b. Unten im Dialogfeld die Schaltfläche Bericht drucken auswählen.
16. Exportieren von Datendateien.
a. In der linken Menüleiste Exportieren auswählen.
b. Den Pfad der Exportdatei auswählen ODER auf Durchsuchen klicken, um den gewünschten Pfad zu
suchen.
c. Der Name der Exportdatei ist standardmäßig der des gespeicherten Laufs.
d. Excel als Dateityp auswählen.
e. Den exportierten Datenbericht anpassen, indem zwischen den Registerkarten hin- und hergewechselt
wird und Optionen ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
f. Unten im Bildschirm die Schaltfläche Export starten auswählen.
Auswertung der Ergebnisse
Auswertung der Ergebnisse mit dem SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Nach Beendigung des Laufs die Registerkarte Ergebnisse anzeigen aufrufen.
Die Registerkarte Probenergebnisse öffnen.
Die SmartCycler-Software gibt automatisch an, ob die Proben Influenza-positiv oder -negativ sind oder ob
der Lauf ungültig war (nicht erkannt).
Ausführlichere Informationen sind in den jeweiligen Registerkarten jedes Analyten im selben Fenster
angegeben. Wenn ein positives Ergebnis auf Influenza A oder B (oder beides) vorliegt, kommt das PRCErgebnis nicht zum Tragen. Die PRC ist nur für negative Ergebnisse erforderlich.
Interpretation der Ergebnisse des Quidel Molecular Influenza A+B-Assays auf dem
Cepheid SmartCycler II
Assay-Ergebnis
Ergebnis der
Prozesskontrolle
Influenza A
Influenza B
Negativ
Bestanden
NEG.
NEG.
Nukleinsäure für Influenza A oder Influenza
B nicht nachgewiesen; PRC nachgewiesen
N. z.*
POS.
NEG.
Nukleinsäure von Influenza A nachgewiesen
N. z.*
NEG.
POS.
Nukleinsäure von Influenza B nachgewiesen
N. z.*
POS.
POS.
Nukleinsäure von Influenza A und
Influenza B nachgewiesen
Influenza
A-positiv
Influenza
B-positiv
Influenza Aund Influenza
B-positiv
Nicht erkannt – PCR-Hemmung oder
Reagenzversagen. Des Test mit gereinigter
Ungültig
Fehlgeschlagen
NEG.
NEG.
Nukleinsäure wiederholen oder eine neue
Testprobe sammeln.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Wert erforderlich.
Fehlercode 3079: Der Warnhinweis/Fehlercode 3079 kann bei Influenza A- und/oder Influenza B-positiven Proben
angezeigt werden. Der Warnhinweis/Fehlercode 3079 bedeutet, dass das Fluoreszenzsignal (RFU) zu hoch ist. In
diesem Fall werden alle Ergebnisse für die jeweilige Probe von der Dx-Software als ND (Not Determined; Nicht
bestimmt) angegeben. Wenn ein Ct-Wert ≥ 10 oder ≤ 45 für Influenza A oder Influenza B gemeldet wird, können
die Ergebnisse der Probe als POS für Influenza A oder Influenza B aufgezeichnet werden.
Seite 19 von 32
Auswertung der Ergebnisse mit dem 7500 Fast Dx Thermocycler
Interpretation der Ergebnisse des Quidel Molecular Influenza A+B -Assays auf dem
7500 Fast Dx Thermocycler
Assay-Ergebnis
Detektor:
Influenza A
Detektor:
Influenza B
Detektor:
Prozesskontrolle
Negativ
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
5 0 ≤ Ct ≤35,0
Nukleinsäure von Influenza A oder
Influenza B nicht nachgewiesen; PRC
nachgewiesen
Influenza
A-positiv
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
N. z.*
Nukleinsäure von Influenza A
nachgewiesen
Influenza
B-positiv
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
5 0 ≤ Ct ≤35,0
N. z.*
Nukleinsäure von Influenza B
nachgewiesen
Influenza A-und
B-positiv
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5 0 ≤ Ct ≤35,0
N. z.*
Influenza B und PRC nicht
Ungültig
nachgewiesen; ungültiger Lauf, Lauf
wiederholen oder erneut extrahieren
Nicht
Nicht
Nicht bestimmt, Lauf wiederholen
Ungültig
Nicht bestimmt
bestimmt
bestimmt
oder erneut extrahieren
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
Ct < 5,0 oder
Ct > 35,0
Auswertung der Ergebnisse mit dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Interpretation der Ergebnisse des Quidel Molecular Influenza A+B Assays auf dem QuantStudio Dx
Real-Time PCR Instrument
Assay-Ergebnis
Detektor:
Influenza A
Negativ
Kein Ct
angegeben (Leer)
Influenza
A-positiv
Influenza
B-positiv
Influenza A-und
B-positiv
Ct ≤40,0
Kein Ct
angegeben (Leer)
Detektor:
Influenza B
Kein Ct
angegeben
(Leer)
Kein Ct
angegeben
(Leer)
Detektor:
Prozesskontrolle
Ct ≤40,0
N. z.*
Influenza B nicht nachgewiesen; PRC
nachgewiesen
Nukleinsäure von Influenza A
nachgewiesen
Nukleinsäure von Influenza B
nachgewiesen
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
N. z.*
Kein Ct
Kein Ct
Kein Ct
Influenza B und PRC nicht
Ungültig
angegeben
angegeben
angegeben (Leer)
nachgewiesen; ungültiger Lauf, Lauf
(Leer)
(Leer)
wiederholen oder erneut extrahieren
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
Ct ≤40,0
N. z.*
Qualitätskontrolle
Der Quidel Molecular Influenza A+B-Assay enthält mehrere Kontrollen zur Überwachung der Leistung des Assays.
1.
Während der Extraktion und der Amplifikation im Assay muss die Prozesskontrolle verwendet werden. Diese
Kontrolle muss vor der Extraktion jedem Probenaliquot zugegeben werden.
Seite 20 von 32
2.
3.
Handelsübliche externe positive Influenza A-/B-Kontrollen können wie ein Patientenpräparat behandelt
werden. Ihre Handhabung sollte nach den im Labor üblichen Standardvorgehensweisen erfolgen. Vorher
unterschiedene positive Influenza A- oder Influenza B-Proben können anstatt einer handelsüblichen Influenza
A/B-Kontrolle verwendet werden.
Als externe Negativkontrolle eignen sich ein Virustransportmedium oder bereits charakterisierte negative
Präparate. Diese sind wie ein Patientenpräparat und nach den aktuellen Standardvorgehensweisen im Labor
zu behandeln.
Einschränkungen
Dieser Test ist nicht dafür vorgesehen, Influenza A-Subtypen wie einen neuen Influenza A H1N1-Stamm zu
differenzieren. Wenn eine Differenzierung des Subtyps erforderlich ist, müsse weitere Tests durchgeführt
werden.
Negative Ergebnisse schließen eine Influenza-Infektion nicht aus und dürfen nicht als alleinige Basis für eine
Behandlungsentscheidung herangezogen werden.
Wie bei anderen Assays dieser Art besteht ein Risiko für falschnegative Ergebnisse aufgrund des
Vorhandenseins von Variationen in der viralen Zielsequenz.
Unsachgemäße Entnahme und Lagerung oder unsachgemäßer Transport können zu falschnegativen
Ergebnissen führen.
Auch Inhibitoren in der Probe und/oder Fehler bei der Durchführung des Assays können zu falschnegativen
Ergebnissen führen.
Klinische Leistung
Leistungsmerkmale des Influenza A+B-Assays von Quidel Molecular wurden anhand einer prospektiven Studie
während der Welle viraler Atemwegserkrankungen in 2011 (Januar bis März) bestimmt. Die für diese Studie
verwendeten Proben waren Nasenrachenabstriche, die während routinemäßiger Influenzatests gesammelt
wurden.
Das Vergleichsverfahren war das Schnellkulturverfahren (Shell Vial-Technik), gefolgt von einer direkten
Fluoreszenz-Antikörper- (DFA)-Untersuchung und -Identifikation.
Insgesamt 637 Abstrichproben wurden mit dem Influenza A+B-Assay von Quidel Molecular und der Anlage von
Kulturen geprüft. Sechs (6) Proben, die anfangs unklare Ergebnisse lieferten, ergaben auch bei der Prüfung mit
dem Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular unklare Ergebnisse und wurden in der nachstehenden Analyse
nicht berücksichtigt.
Insgesamt 6 Proben des DFA-Screenings auf virale Erreger von Atemwegserkrankungen waren positiv (das
Screening-Reagens erkennt Influenza A und B, RSV, Parainfluenza 1, 2 und 3 und das Adenovirus), enthielten aber
zu wenig Zellen für eine eindeutig positive Identifizierung. Insgesamt 3 Proben waren in der Zellkultur toxisch.
Diese 9 Proben werden bei der nachstehenden Analyse nicht berücksichtigt.
Eine diskrepante Analyse für Proben, in der der Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular und die Ergebnisse der
Kultur nicht übereinstimmten, wurde mit einem CE-gekennzeichneten RT-PCR-Assay und ggf. mit einer
bidirektionalen Sequenzierung durchgeführt.
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Influenza A
Frischer Nasen-/
Nasenrachenabstrich (N=622)
Influenza A+B -Assay
von Quidel Molecular
Positiv
Vergleichsinstrument: Kultur mit DFA
Positiv
Negativ
Gesamt
93
18*
111
Negativ
1**
510
511
Gesamt
94
528
622
95 % KI
Empfindlichkeit
93/94
98,9 %
94,2 % bis 100 %
Spezifität
510/528
96,6 %
94,7 % bis 98,0 %
*17 dieser Proben waren bei Analyse mit dem CE-IVD-Gerät für Influenza A positiv.
Die restliche 1 Probe war mit dem CE-IVD-Gerät für Influenza A negativ, aber bei
Sequenzanalyse für Influenza A positiv
** Die Probe war mit dem CE-IVD-Gerät ebenfalls für Influenza A negativ.
Influenza B
Frischer Nasen-/
Nasenrachenabstrich (N=622)
Positiv
Vergleichsinstrument: Kultur mit DFA
Positiv
Negativ
Gesamt
74
7*
81
Negativ
2**
539
541
Gesamt
76
546
622
95 % KI
Empfindlichkeit
74/76
97,4 %
90,8 % bis 99,7 %
Spezifität
539/546
98,7 %
97,4 % bis 99,5 %
*5 Proben waren bei Analyse mit dem CE-IVD-Gerät für Influenza B positiv, 2 Proben
waren mit dem CE-IVD-Gerät für Influenza B negativ, aber bei Sequenzanalyse für
Influenza B positiv
**1 Probe war mit dem CE-IVD-Gerät positiv für Influenza B, 1 Probe war mit dem
CE-IVD-Gerät negativ für Influenza B
Insgesamt 626 Abstrichproben wurden auch mit dem Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular und dem
CE-markierten IVD RT-PCR-Assay geprüft. Sechs (6) Proben, die anfangs in beiden Assays ein unklares Ergebnis
aufwiesen, zeigten bei erneuter Prüfung ebenfalls ein unklares Ergebnis und werden in der nachstehenden Analyse
nicht berücksichtigt. Zusätzliche 10 Proben lieferten unklare Ergebnisse im CE-markierten IVD RT-PCR-Assay. Die
Ergebnisse blieben bei erneutem Prüfen mit dem Assay unklar und werden in der nachstehenden Analyse nicht
berücksichtigt. Eine diskrepante Sequenzierungsanalyse wurde für Proben durchgeführt, bei denen die Ergebnisse
des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular und des CE-markierten IVD RT-PCR-Assays nicht übereinstimmten.
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Influenza A
Frischer Nasen-/
Nasenrachenabstrich (n=610)
Vergleichsinstrument: CE-IVD-Gerät
Positiv
Negativ
Gesamt
Positiv
107
3*
110
Negativ
0
500
500
Gesamt
107
503
610
95 % KI
Empfindlichkeit
107/107
100 %
96,6 % bis 100 %
Spezifität
500/503
99,4 %
98,3 % bis 99,9 %
*3 Proben waren laut Sequenzanalyse für das Influenza A-Virus positiv
Influenza B
Frischer Nasen-/
Nasenrachenabstrich (n=610)
Influenza A+B -Assay v
on Quidel Molecular
Vergleichsinstrument: CE-IVD-Gerät
Positiv
Negativ
Gesamt
Positiv
77
5*
82
Negativ
4**
524
528
Gesamt
81
529
610
95 % KI
Empfindlichkeit
Spezifität
77/81
95,1 %
87,8 % bis 98,6 %
524/529
99,1 %
97,8 % bis 99,7 %
*5 Proben waren laut Sequenzanalyse für das Influenza B-Virus positiv
**4 Proben waren laut Sequenzanalyse für das Influenza B-Virus negativ
Seite 23 von 32
Eine Untergruppe von zweihundertelf (211) Proben aus der oben genannten Studie wurde auf dem QuantStudio
Dx Real-Time PCR Instrument getestet. Die Testergebnisse wurden mit Daten aus gleichzeitig durchgeführten Tests
auf dem ABI 7500 Fast Dx verglichen. Der Vergleich ist unten aufgeführt.
Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular
Influenza A
Vergleichsinstrument: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positiv
Negativ
Gesamt
Positiv
63
0
63
Negativ
0
148
148
Gesamt
63
148
211
95 % KI
Empfindlichkeit
Spezifität
63/63
100 %
94,3 % bis 100 %
148/148
100 %
97,5 bis 100 %
Influenza A+B -Assay von Quidel Molecular
Influenza B
Vergleichsinstrument: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positiv
Negativ
Gesamt
Positiv
28
0
28
Negativ
0
183
183
Gesamt
28
183
211
95 % KI
Empfindlichkeit
Spezifität
28/28
100 %
87,9 % bis 100 %
183/183
100 %
97,9 bis 100 %
Analytische Leistung
Nachweisempfindlichkeit
Die analytische Sensitivität (Nachweisgrenze bzw. LoD) des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular wurde
mithilfe quantifizierter (TCID50/ml) Kulturen von 3 Influenza A-Stämmen (1 H1N1, 1 2009H1N1 und 1 H3N2) und
3 Influenza B-Stämmen ermittelt, die in einer negativen Nasenrachen-Matrix seriell verdünnt wurden. Jede
Verdünnung wurde mithilfe des NucliSENS easyMAG-Systems in Replikaten von 20 pro Virus-Konzentration
extrahiert und auf der Applied Biosystems® 7500 Fast Dx- oder der Cepheid SmartCycler II-Plattform getestet.
Analytische Empfindlichkeit (LoD) wird als die niedrigste Konzentration definiert, bei der 95 % aller Replikate
positiv testeten.
Nachweisempfindlichkeit
Stamm
Endgültiges TCID50/ml LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexiko/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Seite 24 von 32
Kompetitive Hemmung
Die kompetitive Hemmung des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular wurde mittels simulierter Proben mit
unterschiedlichen Konzentrationen des Influenza A-Virus (2x LoD zu 4 Protokollen über LoD) und Influenza B-Virus
in einer einzigen Probe bewertet. Die Proben wurde mit dem NucliSENS easyMAG-System extrahiert und als
Triplikat getestet. Das Vorhandensein des Influenza A- und Influenza B-Virus in unterschiedlichen Konzentrationen
in einer einzigen Probe hatte keine Auswirkungen auf die analytische Sensitivität (Nachweisgrenze bzw. LoD) des
Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular.
Analytische Reaktivität (Inklusivität)
Die Reaktivität des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular wurde gegenüber mehreren Stämmen von
Influenza A- und Influenza B-Viren bewertet. Das klinische Panel bestand aus 10 Influenza A-Stämmen, Subtyp
H1N1, 2 Influenza A-Stämmen, Subtyp 2009H1N1, 8 Influenza A-Stämmen, Subtyp H3N2, 2 Influenza A-Stämmen,
Subtyp H5N1 und 13 Influenza B-Stämmen. Auch ein zusätzliches Panel nicht-klinischer eingeschränkter Isolate
wurde geprüft. Jedes Panel-Element wurde mit dem NucliSens easyMAG Gerät extrahiert und als Triplikat getestet.
Der A+B -Assay von Quidel Molecular entdeckte 100 % der Influenza A- (38/38) und Influenza B-Stämme (15/15)
2
3
bei einer Konzentration von 10 zu 10 TCID50/ml, einschließlich Stämme neuer und pandemischer Influenza
A-Stämme sowie Stämme der Vogelgrippe A und derzeit zirkulierende Influenza B-Stämme.
Klinisches Panel, Influenza A-Viren
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
A/Neukaledonien/20/1999
1,12E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/NWS/33
N. z.
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Mexiko/4108/2009
1,40E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H1N1
A/Salomonen/3/06
1,41E+01
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Hongkong/8/68
1,15E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
4,57E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Subtyp
Stamm
TCID50/ml
H1N1
H1N1 A/Kalifornien/07/2009
H1N1
Klinisches Panel, Influenza B-Viren
Seite 25 von 32
Stamm
TCID50/ml
B/Hongkong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Malaysia/25/06/04
3,41E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Allen/45
4,17E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Russland/69
2,19E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Masse/3/66
1,38E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/Lee/40
1,95E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Nicht klinische eingeschränkte Viren
Subtyp
Stamm
TCID50/ml
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positiv
Negativ
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H2N2
A/Stockente/NY/6750/78 (H2N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H7N3
A/Huhn/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H9N2
A/Huhn/NJ/12220/97 (H9N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H4N8
A/Stockente/OH/338/86 (H4N8)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H6N2
A/Huhn/CA/431/00 (H6N2)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H8N4
A/Blauflügelente/LA/B174/86 (H8N4)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H5N1
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H10N7
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H11N9
A/Huhn/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H12N5
A/Ente/LA/188D/87 (H12N5)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H13N6
A/Möwe/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H14N5
A/Stockente/GurjevRussia/262/82 (H14N5)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H15N9
A/Shearwater/Australien/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
H16N3
A/Watvogel/DE/172/2006(H16N3)
2,00E+02
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Seite 26 von 32
Reproduzierbarkeit
Die Reproduzierbarkeit des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular im Labor wurde an 3 Laborstandorten
bewertet. Die Reproduzierbarkeit wurde mithilfe eines Panels von 6 simulierten Proben beurteilt, die mittlere (10x
LoD), hoch negative (C20-60 Konzentration) Influenza A- und Influenza B-Viren-Proben von positiven und negativen
Kontrollen umfassten. Panels und Kontrollen wurden an jedem Standort von 2 Bedienern 5 Tage lang getestet
(8 Proben und 3 Kontrollen × 2 Bediener × 5 Tage × 3 Standorte = 330). Die Panels und Kontrollen wurden
mithilfe des NucliSENS easyMAG-Systems extrahiert und auf dem 7500 Fast Dx-Gerät getestet.
Reproduzierbarkeit
Panel
Mitglieds-ID
Influenza A
hoch negativ
Influenza A
positiv (10x LoD)
Influenza B hoch
negativ
Influenza B
positiv (10x LoD)
Influenza A
positiv-Kontrolle
Influenza B
positiv-Kontrolle
Negative
Kontrolle
Standort 1
Standort 2
Übereinstimmung
mit dem
erwarteten
Ergebnis
%
Vertr
auens
wert
Übereinstimmung
mit dem
erwarteten
Ergebnis
AVE
Ct
Standort 3
AVE
Ct
%
Vert
raue
nsw
ert
Übereinstimmung
mit dem
erwarteten
Ergebnis
AVE
Ct
%
Vertr
auens
wert
Vollständige
Übereinstimmung mit
dem
erwarteten
Ergebnis
6/10
31,5*
8,8
10/10
N. z.
N. z.
9/10
34,3*
N. z.
25/30
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
9/10
34,9
N. z.
10/10
N. z.
N. z.
10/10
N. z.
N. z.
30/30
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
10/10
N. z.
N. z.
10/10
N. z.
N. z.
10/10
N. z.
N. z.
30/30
Analytische Spezifität – Kreuzreaktivität
Die analytische Spezifität des Influenza A+B-Assays von Quidel Molecular wurde durch Testen eines Panels,
bestehend aus 26 viralen, 24 bakteriellen Stämmen und 1 Hefestamm evaluiert, die häufige respiratorische
Pathogene oder häufig im Nasenrachenraum anzutreffende Flora repräsentieren. Bakterien und Hefe wurden bei
5
10
3
6
Konzentrationen von 10 bis 10 CFU/ml getestet. Viren wurden bei Konzentrationen von 10 bis 10 TCID50/ml
getestet. Die Proben wurden mit dem NucliSens easyMAG Gerät extrahiert und als Triplikate getestet. Die
analytische Spezifität des Influenza A+B -Assays von Quidel Molecular betrug 100 %.
Kreuzreaktivität
hMPV A1
Endgültige
Konzentration
3,70E+04
Ergebnis
Influenza A
Negativ
Ergebnis
Influenza B
Negativ
hMPV B1
2,37E+04
Negativ
Negativ
RSV Lang
4,40E+04
Negativ
Negativ
RSV Washington
1,75E+0
Negativ
Negativ
5,67E+04
Negativ
Negativ
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negativ
Negativ
Coronavirus OC43
1,67E+06
Negativ
Negativ
Coxsackievirus B4
2,43E+06
Negativ
Negativ
2,28E+06
Negativ
Negativ
Cytomegalovirus
8,76E+05
Negativ
Negativ
Echovirus 7
5,38E+08
Negativ
Negativ
Echovirus 9
1,50E+06
Negativ
Negativ
Organismus-ID
Seite 27 von 32
Kreuzreaktivität
Echovirus 6
Endgültige
Konzentration
1,05E+08
Ergebnis
Influenza A
Negativ
Ergebnis
Influenza B
Negativ
Echovirus 11
1,50E+05
Negativ
Negativ
Enterovirus 71
2,68E+03
Negativ
Negativ
Enterovirus 70
1,66E+05
Negativ
Negativ
Epstein-Barr-Virus
5.000 cp/ml
Negativ
Negativ
HSV Typ 1 MacIntyre-Stamm
1,95E+06
Negativ
Negativ
HSV Typ 2 G-Stamm
3,67E+06
Negativ
Negativ
Röteln
3,78E+05
Negativ
Negativ
Mumpsvirus
8,43E+04
Negativ
Negativ
Parainfluenza Typ 1
2,50E+05
Negativ
Negativ
Parainfluenza Typ 2
2,20E+04
Negativ
Negativ
Parainfluenza Typ 3
9,10E+05
Negativ
Negativ
Parainfluenza Typ 4
9,57E+06
Negativ
Negativ
Varicella-Zoster-Virus
7,50E+02
Negativ
Negativ
1,04E+07
Negativ
Negativ
2,55E+07
Negativ
Negativ
2,10E+05
Negativ
Negativ
2,05E+08
Negativ
Negativ
6,90E+08
Negativ
Negativ
6,60E+07
Negativ
Negativ
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativ
Negativ
5,90E+07
Negativ
Negativ
5,15E+07
Negativ
Negativ
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativ
Negativ
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativ
Negativ
2,15E+07
Negativ
Negativ
1,85E+08
Negativ
Negativ
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativ
Negativ
3,30E+07
Negativ
Negativ
Escherichia coli
6,80E+07
Negativ
Negativ
5,85E+07
Negativ
Negativ
6,0E+05
Negativ
Negativ
1,03E+08
Negativ
Negativ
4,5E+07
Negativ
Negativ
2,05E+08
Negativ
Negativ
2,50E+06
Negativ
Negativ
2,6E+07
Negativ
Negativ
Organismus-ID
Seite 28 von 32
Kreuzreaktivität
Endgültige
Konzentration
5,15E+08
Ergebnis
Influenza A
Negativ
Ergebnis
Influenza B
Negativ
Candida albicans
1,07E+06
Negativ
Negativ
Organismus-ID
Analytische Spezifität – Störsubstanzen
Die Leistung des Influenza A+B-Assays von Quidel Molecular wurde mit potenziellen Störsubstanzen beurteilt, die
in Nasenrachen-Proben vorhanden sein können. Die potenziellen Störsubstanzen wurden bei Influenza A
(A/Mexiko/4108/2009), und Influenza B (B/Florida/04/2006) bei Konzentrationen von 3x LoD und 10x LoD
beurteilt. Es gab keine Hinweise darauf, dass die bei 3x oder 10x LoD getesteten, unten angeführten Substanzen
Störungen verursachten
60 µg/ml
Ergebnis
Influenza A
(3x LoD)
Positiv
Ergebnis
Influenza B
(3x LoD)
Positiv
Blut (vom Menschen), EDTA-antikoaguliert
2 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Neo-Synephrine
15 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Afrin-Nasenspray
15 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Zicam Allergie-Homöopathikum, nicht
ermüdendes, tropffreies flüssiges Nasengel
5 % (vol/vol)
Positiv
Positiv
Kochsalzlösung-Nasenspray
15 % (vol/vol) der Dosis
Positiv
Positiv
Halsbonbons
0,68g/ml; 1/18 Bonbon,
zerstampft; Wirkstoffe:
1,7 mg/ml Menthol
Positiv
Positiv
3,3 bis 5 mg/ml
Positiv
Positiv
4,0 µg/ml
Positiv
Positiv
Mupirocin
6,6 bis 10 mg/ml
Positiv
Positiv
Oseltamivirphosphat
7,5 bis 25 mg/ml
Positiv
Positiv
Bezeichnung der Substanz
Getestete Konzentration
Mucin (Rinder-Unterkieferdrüse, Typ I-S)
Zanamivir
Tobramycin
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien
Eine interne Studie lieferte keine Hinweise auf Carryover-/Kreuzkontamination mit dem Influenza A+B -Assay von
Quidel Molecular unter Verwendung des automatischen NucliSens easyMAG Nukleinsäureextraktionsgeräts.
Weiteres Quellenmaterial
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path (April
Draft Guidance on Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens (Dec
CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations (Bd.
2, Nr. 34) (Okt. 2004).
CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov 2005).
CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14) (Sept
2002).
Seite 29 von 32
9.
CLSI MM6-A: Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, No.28) (Oct
2003).
24, No. 25 Second Ed.) (Aug 2004).
Kundendienst und technischer Support
Um eine Bestellung aufzugeben oder technischen Support anzufordern, wenden Sie sich bitte an einen QuidelRepräsentanten unter der Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder (858) 552-1100, Montag bis
Freitag zwischen 8 und 17 Uhr (Ostküstenzeit). Bestellungen können auch per Fax aufgegeben werden: (740) 5929820. Für E-Mail-Support wenden Sie sich bitte an [email protected] oder [email protected]. Für
Dienstleistungen außerhalb der USA wenden Sie sich bitte an Ihren Distributor vor Ort. Weitere Informationen
über Quidel, unsere Produkte und unsere Distributoren sind auf unserer Website quidel.com zu finden.
Geistiges Eigentum
Handelsmarken
Cepheid® und Smartcycler® ist eine eingetragene Marke der Cepheid Corporation. Applied Biosystems® ist eine
eingetragene Marke von Life Technologies. NucliSENS® und easyMAG® sind eingetragene Marken von bioMerieux,
Inc. TaqMan® ist eine eingetragene Marke von Roche. CAL Flour® Orange 560, CAL Flour® Red 610 und Quasar®670
sind eingetragene Marken von BioSearch Technologies, Inc.
Patente
Die Farbstoffe in diesem Produkt werden unter Lizenz von BioSearch Technologies, Inc. verkauft und sind durch
ausgestellte oder angemeldete US- und weltweite Patente geschützt.
Der Käufer dieses Produkts gewährt dem Käufer Rechte unter bestimmten Roche-Patenten zur Verwendung
ausschließlich als In-Vitro-Diagnostikservice für den Menschen. Keine allgemeinen Patente oder anderen Lizenzen
jeglicher Art, außer diesem Recht zur Nutzung aufgrund von Erwerb, werden hiermit gewährt.
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Glossar
Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Gemeinschaft
Hersteller
Inhalt/Enthält
Kontrolle
Verwenden bis
Katalog-Nr.
Chargencode
Zur In-vitro-Diagnose
Gebrauchsanweisung lesen
Einsatzbereich
96
Inhalt ist ausreichend für 96 Bestimmungen
Temperaturbegrenzung
Seite 31 von 32
Literaturverweise
1
http://1918.pandemicflu.gov, Zugriff auf 6/9/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm, Zugriff auf 6/9/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. CLSI-Dokument M41-A [ISBN
1562386239] Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
M100 – Quidel Molecular Influenza A+B Assay Kit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Deutschland
Quidel Corporation
Weltweite Unternehmenszentrale
quidel.com
M0002GDE00 (12/2012)
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Dosaggio Influenza A+B
Istruzioni per l’uso
Per il rilevamento quantitativo e l'identificazione degli acidi nucleici virali dell'influenza
A e dell'influenza B estratti da tamponi nasali, tamponi rinofaringei e campioni di
aspirato/lavaggio nasale.
Dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B (CE)
Pagina 1 di 31
Contenuto
Uso previsto .................................................................................................................................................. 4
Riassunto e spiegazione ................................................................................................................................ 4
Principio della procedura .............................................................................................................................. 4
Materiali forniti ............................................................................................................................................. 6
Materiali facoltativi ....................................................................................................................................... 6
Materiali necessari ma non forniti ................................................................................................................ 6
Avvertenze e precauzioni.............................................................................................................................. 7
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit .................................................................................... 7
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni ............................................................................... 7
Conservazione degli acidi nucleici estratti .................................................................................................... 8
Istruzioni di programmazione per l'estrazione degli acidi nucleici ............................................................... 8
Programmazione iniziale del termociclatore .............................................................................................. 10
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II ............................................................................... 10
Istruzioni per la programmazione di 7500 Fast DX ................................................................................. 12
Istruzioni per la programmazione dello strumento Life Technologies QuantStudio DX per la
reazione PCR in tempo reale ................................................................................................................... 15
Procedura del dosaggio............................................................................................................................... 15
Protocollo di amplificazione su SmartCycler II........................................................................................ 16
Protocollo di amplificazione sul termociclatore ABI 7500 Fast Dx ......................................................... 16
Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudioDx per la reazione PCR in tempo reale ....... 17
Interpretazione dei risultati ........................................................................................................................ 18
Interpretazione dei risultati con SmartCycler II ...................................................................................... 18
Interpretazione dei risultati con il termociclatore 7500 Fast Dx ............................................................ 19
Interpretazione dei risultati con lo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale .... 20
Controllo di qualità ..................................................................................................................................... 20
Limitazioni ................................................................................................................................................... 20
Prestazioni cliniche ..................................................................................................................................... 20
Prestazioni analitiche .................................................................................................................................. 23
Pagina 2 di 31
Livello di rilevamento .................................................................................................................................. 23
Inibizione competitiva................................................................................................................................. 23
Reattività analitica (Inclusività) ................................................................................................................... 23
Riproducibilità ............................................................................................................................................. 26
Specificità analitica – Reattività crociata .................................................................................................... 26
Carry-over e contaminazione crociata ........................................................................................................ 28
Materiali di riferimento aggiuntivi .............................................................................................................. 28
Servizio clienti e assistenza tecnica ............................................................................................................ 29
Proprietà intellettuale................................................................................................................................. 29
Marchi di fabbrica ....................................................................................................................................... 29
Glossario ..................................................................................................................................................... 30
Bibliografia .................................................................................................................................................. 31
Pagina 3 di 31
Uso previsto
Il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è un dosaggio multiplex Real Time RT-PCR per il rilevamento
quantitativo e l'identificazione degli acidi nucleici virali dell'influenza A e/o dell'influenza B estratti da tamponi
nasali, tamponi rinofaringei e campioni di aspirato/lavaggio nasale. Questo test diagnostico in vitro è d'ausilio
nella diagnosi differenziale delle infezioni virali da influenza A e/o influenza B negli esseri umani. Il dosaggio
non rileva la presenza del virus dell'influenza C.
I risultati negativi non escludono l'infezione da virus dell'influenza e non devono essere utilizzati come sola
base per la diagnosi, il trattamento o altre decisioni di gestione del paziente. Le caratteristiche di performance
per l'influenza A sono state stabilite nei casi in cui l'influenza A/H3 e A/H1 erano i virus dell'influenza A
predominanti in circolazione. Qualora stessero emergendo altri virus dell'influenza A, le caratteristiche di
performance potrebbero variare.
Riassunto e spiegazione
I virus dell'influenza (famiglia degli Orthomyxoviridae) contengono un genoma con RNA a singolo filamento che
è presente in 8 segmenti separati di ribonucleoproteina. Tale segmentazione del genoma è rara fra i virus e
probabilmente contribuisce al rapido sviluppo di nuovi ceppi influenzali, attraverso l'interscambio di segmenti
di geni quando due virus diversi infettano la stessa cellula. Ci sono 3 tipi di influenza: A, B e C. Il tipo A ha
corrispettivi negli uccelli e nei maiali, mentre i tipi B e C sono noti solo negli esseri umani. A causa della
possibilità di un'altra pandemia causata dall'influenza A (come quella del 1918, che provocò la morte di 30-50
1
milioni di persone in tutto il mondo) , i Centers for Disease Control (Centri per la prevenzione e il controllo
delle malattie, CDC) e l'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) sorvegliano costantemente i ceppi
dell'influenza e fanno previsioni sui ceppi idonei alla produzione di vaccini.
Si stima che negli Stati Uniti avvengano ogni anno 30.000-49.000 decessi causati da patologie associate
2
all'influenza. A livello mondiale, le epidemie annuali di influenza causano da tre a cinque milioni di casi di
3
patologie gravi, con 250.000-500.000 decessi. Le pandemie di influenza A si verificano ogni 10-30 anni, mentre
le epidemie di influenza A o B si verificano ogni anno. Le infezioni sono stagionali e tipicamente si manifestano
da novembre ad aprile nell'emisfero settentrionale. Le complicazioni tendono a colpire i giovani, gli anziani e le
persone affette da patologie cardiopolmonari croniche.
Il tempo di incubazione è di 1-3 giorni, con una rapida diffusione per inalazione attraverso goccioline aeree e
fomiti. L'influenza è caratterizzata da febbre, mialgia, mal di testa e faringite.
Principio della procedura
Il dosaggio rileva gli acidi nucleici che sono stati estratti da un campione del paziente. Viene eseguita una
reazione multiplex Real-time RT-PCR in condizioni ottimizzate all'interno di una singola provetta, generando
ampliconi per ciascuno dei virus target presenti nel campione. L'identificazione dell'influenza A avviene tramite
l'uso di inneschi specifici per il target e di una sonda con etichetta fluorescente, che si ibridizza in una sequenza
conservata di influenza A all'interno del gene della proteina matrice. L'identificazione dell'influenza B avviene
tramite l'uso di inneschi specifici per il target e di una sonda con etichetta fluorescente, che si ibridizza in una
sequenza conservata di influenza B all'interno del gene della neuraminidasi.
Etichette per sonde Quidel Molecular
Target
Colorante
Influenza A
FAM
Influenza B
Controllo di processo (PRC)
Quasar® 670
Pagina 4 di 31
Di seguito viene riepilogata la procedura.
1.
Raccolta dei campioni: acquisire campioni di tamponi nasali, tamponi rinofaringei e aspirati/lavaggi nasali
da pazienti sintomatici, utilizzando le tecniche standard. Tali campioni devono essere trasportati,
4
conservati ed elaborati conformemente alle procedure di laboratorio stabilite.
2.
Estrazione degli acidi nucleici: estrarre gli acidi nucleici dai campioni utilizzando il sistema NucliSENS®
easyMAG®, seguendo le istruzioni del produttore e usando i reagenti appropriati (vedere la sezione
Materiali necessari ma non forniti). L'uso di altri sistemi di estrazione con il dosaggio Quidel Molecular
Influenza A+B non è stato convalidato. La convalida di tali altri sistemi è di responsabilità dell'utente finale.
Prima della procedura di estrazione, aggiungere 20 µL di controllo di processo (PRC) a ciascuna aliquota di
campione da 180 µL. Il PRC monitora gli inibitori all'interno del campione estratto, garantisce che avvenga
un'adeguata amplificazione e verifica che l'estrazione degli acidi nucleici sia sufficiente.
3.
Reidratazione del master mix: reidratare il master mix liofilizzato usando la soluzione reidratante. Il
master mix contiene inneschi oligonucleotidici, sonde etichettate con fluorocromo e quencher che hanno
come target le regioni conservate di virus dell'influenza A e dell'influenza B, nonché la sequenza del
controllo di processo.
4.
Amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici: aggiungere 15 µL di master mix reidratato a ciascuna
provetta di reazione o pozzetto della piastra. Aggiungere poi 5 µL di acidi nucleici estratti (campione con
PRC) al pozzetto della piastra oppure a una provetta di reazione adeguatamente etichettata. Posizionare la
TM
piastra o la provetta nello strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo
reale o nello strumento Cepheid® SmartCycler® II, rispettivamente. Il dosaggio è stato convalidato con gli
strumenti della serie 7500.
Dopo aver aggiunto allo strumento la provetta di reazione o la piastra, il protocollo del dosaggio viene
avviato. Questo protocollo avvia la trascrizione inversa dei target RNA generando DNA complementare e
portando alla conseguente amplificazione degli ampliconi target. Il dosaggio Quidel Molecular Influenza
A+B si basa sui sistemi di analisi chimica TaqMan® e utilizza un enzima con trascrittasi inversa, DNA
polimerasi e attività esonucleasiche 5’-3’. Durante l’amplificazione del DNA, questo enzima divide la sonda
legata alla sequenza di DNA complementare, separando il colorante quencher dal colorante reporter.
Questa fase genera un aumento del segnale fluorescente in risposta all’eccitazione da parte di una fonte
luminosa con opportuna lunghezza d’onda. Ad ogni ciclo, altre molecole di colorante vengono separate dai
loro quencher, dando origine a segnale aggiuntivo. Se si ottiene una fluorescenza sufficiente dopo 45 cicli,
il campione viene refertato come positivo all'acido nucleico rilevato.
Pagina 5 di 31
Materiali forniti
Codice di inventario M100
Kit di rilevazione (96 reazioni) – Conservare a una temperatura compresa fra 2°C e 8°C
#
Componente
Quantità


Soluzione reidratante Parte M5003
1 flacone/kit da 1,9 mL
Master mix Quidel Molecular Influenza A+B Parte M5004
12 flaconi/kit,
8 reazioni/flacone
Contenuti liofilizzati:
enzima DNA polimerasi con attività di trascrittasi inversa;
inneschi e sonde;
dNTP (deossinucleotidi trifosfati);
stabilizzatori.
Controllo di processo Parte M5005
1 flacone/kit da 2,0 mL
Materiali facoltativi
Controlli positivi per l'influenza A e l'influenza B (cioè il set di controllo Quidel Molecular Influenza A+B
codice M106, che serve da controllo esterno per l'elaborazione e l'estrazione)
Materiali necessari ma non forniti
Micropipettatori (da 1 a 10 μL e da 100 a 1.000 μL)
Punte non aerosol per pipette
TM
Strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale o strumento Applied
Biosystems 7500 Fast Dx
Piastra PCR per pozzetto Applied Biosystems 7500 Fast Dx 96
Pellicole ottiche per piastra Applied Biosystems
Centrifuga per piastra a pozzetti ABI 96
Oppure
Micropipettatori (da 1 a 10 μL e da 100 a 1.000 μL)
Punte non aerosol per pipette
SmartCycler® II
Materiali di consumo SmartCycler
Centrifuga SmartCycler
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Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro
Se si sospetta un'infezione da virus della nuova influenza A, sulla base degli attuali criteri di screening
clinico ed epidemiologico raccomandati dalle autorità sanitarie pubbliche, i campioni devono essere
prelevati adottando le appropriate precauzioni di controllo delle infezioni per i nuovi virus dell'influenza
virulenta; i campioni devono poi essere inviati ai distretti sanitari locali o statali per le analisi.
Le caratteristiche di rendimento di questo test sono state stabilite solo con i tipi di campioni elencati nella
sezione Uso previsto. Il rendimento di questo dosaggio con altri tipi di campioni non è stato valutato.
Sistemi di estrazione diversi dal sistema NucliSENS easyMAG non sono stati convalidati per l'uso. La
convalida di tali sistemi è di responsabilità dell'utente finale.
L’utilizzo di condizioni di ciclaggio diverse da quelle indicate nella sezione Istruzioni per la
programmazione del termociclatore può produrre risultati erronei.
L'utilizzo di questo prodotto deve essere limitato a personale competente nelle tecniche di PCR e RT-PCR.
Considerare tutti i campioni come potenzialmente infettivi. Rispettare le precauzioni universali nel
maneggiare i campioni, questo kit e il suo contenuto.
Raccolta, conservazione e trasporto adeguati dei campioni sono elementi essenziali per ottenere
risultati corretti.
Conservare i reagenti del dosaggio come indicato sulle rispettive etichette.
Indossare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione degli occhi e del viso adeguati quando si
usa questo kit.
Per ottenere risultati accurati, pipettare con cura utilizzando solo apparecchiature calibrate.
Pulire a fondo e disinfettare tutte le superfici con una soluzione di candeggina al 10% seguita da acqua
ultrapura per applicazioni in biologia molecolare.
Utilizzare micropipette con barriera aerosol o punte a erogazione positiva in tutte le procedure.
Evitare la contaminazione microbica e crociata dei reagenti del kit. Seguire le buone pratiche di
laboratorio.
Non mescolare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto diversi.
Non utilizzare reagenti di altri produttori con questo kit.
Non utilizzare il prodotto oltre la data di scadenza.
Una pianificazione accurata del flusso di lavoro è essenziale per ridurre al minimo il rischio di
contaminazione. Pianificare sempre il flusso di lavoro in maniera unidirezionale, partendo dalla preamplificazione e procedendo con l’amplificazione e il rilevamento.
Utilizzare forniture e apparecchiature specifiche per le aree di pre-amplificazione e amplificazione.
Impedire il movimento incrociato di personale o apparecchiature fra aree diverse.
Mantenere sempre separati gli articoli per l’amplificazione da quelli per la pre-amplificazione.
Non aprire le provette dei campioni né dissigillare le piastre dopo l’amplificazione.
Smaltire il materiale amplificato con cura e nel rispetto delle norme locali vigenti in proposito, al fine di
ridurre al minimo il rischio di contaminazione degli ampliconi.
Non utilizzare articoli destinati alla preparazione di reagenti o campioni per il trattamento dell’acido
nucleico bersaglio.
Le schede tecniche MSDS sono disponibili su richiesta, oppure sul sito web del prodotto.
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit
Conservare il kit non aperto a 2–8 °C fino alla data di scadenza riportata sulla scatola esterna.
Il master mix reidratato può essere conservato a temperatura ambiente (da 20 a 25 C) per un periodo
massimo di 24 ore. In caso di conservazione per un periodo maggiore, richiudere il master mix reidratato,
sigillare con parafilm e conservare in posizione verticale a temperature ≤ -20 °C per un massimo di 14
giorni. Proteggere il master mix dalla luce durante la conservazione.
Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti: la torbidezza della soluzione reidratante può indicare
il deterioramento del reagente. Contattare l’assistenza tecnica Quidel per richiederne la sostituzione.
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni
I campioni usati per la convalida del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B sono stati ottenuti da pazienti
con sintomi di infezione del tratto respiratorio superiore, utilizzando tecniche standard. Tali campioni sono
stati raccolti, trasportati, conservati ed elaborati conformemente allo standard CLSI M41-A.
Pagina 7 di 31
Conservazione degli acidi nucleici estratti
L'utente ha la responsabilità di convalidare le procedure e le condizioni di conservazione utilizzate nel suo
laboratorio. Gli eluati possono generalmente essere conservati a temperatura ambiente (da 20 a 25 C) per 2
ore, a 2-8 °C per 8 ore e a temperature fra -20 °C e -70 °C per 1 mese. La conservazione di piccole quantità di
estratto di acidi nucleici (ad es. 5 μL o meno) non è consigliata.
Istruzioni di programmazione per l'estrazione degli acidi nucleici
1.
Accendere lo strumento e attendere che la spia dello strumento diventi arancione. Accendere quindi il
computer e lanciare il software easyMAG.
2.
Leggere il codice a barre dei reagenti dopo aver premuto i tasti “Strumento”
reagenti”
3.
e “Inventario
.
Per immettere i campioni, premere il tasto “Uso giornaliero”
, che richiamerà automaticamente la
schermata “Definizione richiesta”
. Selezionare le
seguenti impostazioni:
a. ID campione:
digitare con la tastiera il nome del campione;
b. Matrice:
selezionare Altro dal menu a discesa;
c. Richiesta:
selezionare Generica dal menu a discesa;
d. Volume (mL):
selezionare 0.200 dal menu a discesa;
e. Eluato (µL):
selezionare 50 dal menu a discesa;
f. Tipo:
Primario;
g. Priorità:
Normale.
4.
Dopo aver premuto il tasto “Salva”
, il campione verrà visualizzato nella finestra “Campione non
assegnato” sul lato sinistro dello schermo. Premere il tasto “Immettere nuova richiesta di estrazione”
e ripetere l'operazione per gli altri campioni. Si possono immettere campioni multipli anche
premendo il tasto “Crea automaticamente nuove richieste di estrazione”
5.
Una volta creati tutti i campioni, passare a “Organizza cicli” facendo clic sull'icona
superiore della pagina. Creare un ciclo premendo il tasto “Crea ciclo”
ciclo, o usare il nome predefinito.
6.
8.
vicino alla parte
. Immettere un nome per il
Aggiungere i campioni al ciclo usando il tasto “Riempi automaticamente il ciclo”
(che aggiunge
automaticamente fino a 24 campioni dall'elenco “Campioni non assegnati” a sinistra dello schermo). Si
possono spostare campioni singoli nel ciclo e fuori dal ciclo anche usando le “icone di posizionamento”
sinistra e destra
7.
.
dopo aver selezionato il campione appropriato. L'ordine dei campioni nel
ciclo può essere cambiato usando i tasti “Sposta richiesta di estrazione Su/Giù”
.
Reperire 1 o 3 contenitori (per 8 o 24 campioni, rispettivamente) e aggiungere 20 µL di controllo di
processo a ciascun pozzetto di campione usato.
Aggiungere 180 µL di ciascun campione al pozzetto appropriato, come designato.
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9.
Passare a “Carica ciclo” premendo il tasto
nella parte superiore dello schermo. Inserire le punte
e il/i vaso/i campione nello strumento.
10. Immettere i codici a barre dei contenitori del/dei vaso/i campione
11. Immettere i codici a barre delle perle di silice da usare
12. Assegnare le perle di silice ai campioni nel seguente modo:
a. Fare clic sul simbolo dei reagenti sotto il numero 1 nella figura qui sotto; il numero di lotto delle
perle di silice dovrebbe apparire sotto la scheda Silica, numero 2 nella figura qui sotto.
b. Evidenziare e selezionare i campioni del ciclo a cui devono essere assegnate le perle (nella casella
con il numero 3 nella figura qui sotto).
c.
d.
Fare clic sull'icona di posizionamento
(sotto al numero 4 nella figura qui sotto) per
assegnare il numero di lotto della silice ai campioni selezionati.
Se si seleziona il simbolo delle perle a destra del numero 5 nella figura qui sotto, il numero di
lotto delle perle di silice dovrebbe apparire per ciascun campione
13. Stampare l'elenco di lavoro toccando l'icona “Carica ciclo” e premendo l'icona “Stampa elenco di lavoro”
.
14. Premere il tasto “Distribuisci lisi”
. Per il completamento della lisi incorporata occorrono circa 12
minuti.
15. Per ciascun contenitore di campione, preparare particelle magnetiche usando il pipettatore Biohit e punte
per un massimo di otto reazioni, nel seguente modo:
a. Usando una punta e il Programma 1, aspirare 550 µL di acqua senza nucleasi e versare in una
provetta microfuga senza DNAse / RNAse da 1,5 mL.
b. Vorticare le particelle magnetiche di silice. Usando una punta e il Programma 1, aspirare 550 µL di
silice magnetica, aggiungere all'acqua e mescolare vorticando.
c. Usando una punta e il Programma 2, aspirare 1.050 µL della miscela magnetica di silice e
rimettere 25 µL nella stessa provetta.
d. Versare 125 µL della miscela magnetica di silice 8 volte negli 8 pozzetti di una piastra di strisce
ELISA. Gettare la punta.
e. Una volta completata la lisi (NB: “Stato strumento” in fondo alla schermata deve indicare
“INATTIVO”!), usando 8 punte e il Programma 3 aspirare 100 µL della miscela magnetica di silice
nei pozzetti della striscia, versare 100 µL della miscela magnetica di silice nei pozzetti della striscia
e aspirare 100 µL della miscela magnetica di silice nei pozzetti della striscia.
f. Inserire le punte nel liquido negli stessi contenitori dei campioni. Aspirare 800 µL, quindi
rimettere 900 µL della miscela magnetica di silice nel contenitore. Aspirare 1.000 µL della miscela
Pagina 9 di 31
magnetica di silice dal contenitore e rimettere 1.000 µL di silice magnetica nel contenitore.
Ripetere l'aspirazione / distribuzione dei 1.000 µL altre due volte.
16. Chiudere lo strumento e premere il tasto “Avvio”
per avviare il ciclo.
17. Al completamento del ciclo, trasferire l'acido nucleico purificato nelle provette prive di nucleasi. Usare
immediatamente gli acidi nucleici purificati, oppure congelarli a -70 °C.
Limitazioni: il seguente protocollo è stato sviluppato appositamente per questo dosaggio. Non è noto se possa
essere usato con altri dosaggi. Rivolgersi a bioMérieux S.A. per verificare la compatibilità del software.
Programmazione iniziale del termociclatore
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II
1.
2.
Lanciare il pacchetto software SmartCyclerDx versione 3.0b
Creare il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B
a. Selezionare il tasto Definisci dosaggi nella parte superiore dello schermo
b. Assegnare un nome al dosaggio
i. selezionare il tasto Nuovo in basso a sinistra dello schermo
ii. digitare “Quidel Molecular Influenza A+B” e selezionare OK
iii. “Quidel Molecular Influenza A+B” sarà aggiunto nella parte superiore dell’elenco Nome
dosaggio, nell’angolo in alto a sinistra dello schermo.
c. Impostare i valori dell’analisi: nella sezione Tipo dosaggio: Ricerca, selezionare la scheda Impostazioni
analisi ed eseguire quanto segue:
i. Selezionare FATA25 dal menu a discesa Imposta colorante
ii. Il menu a discesa Tipo analisi deve essere impostato su Qualitativo (impostazione predefinita).
iii. Nella colonna Nome canale, digitare “Influenza A” per FAM, “Influenza B” per Alx532 e “PRC”
per Alx647
iv. Nella colonna Utilizzo, selezionare Target dal menu a discesa per Influenza A e Influenza B,
quindi selezionare Controllo interno per PRC. Quando si seleziona Controllo interno appare la
finestra di avvertenza mostrata qui sotto. Selezionare Sì
v. Nella colonna Analisi curva, immettere Curva principale per ciascun canale (Influenza A,
Influenza B e PRC) (impostazione predefinita).
vi. Nella colonna Impostazione soglia, immettere Soglia manuale per ciascun canale (Influenza A,
Influenza B e PRC) (impostazione predefinita).
vii. Nella colonna Unità soglia fluor manuale, immettere le seguenti soglie:
a. Influenza A:
20,0
b. Influenza B:
20,0
c. PRC:
20,0
viii. Nella colonna Ciclo min valido, immettere 10 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e
PRC).
ix. Nella colonna Ciclo max valido, immettere 45 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e
PRC).
x. Nella colonna Sub sfondo, usare “ON” per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e PRC)
(impostazione predefinita).
Pagina 10 di 31
xi. Nella colonna Ciclo min sfondo, immettere 5 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e PRC)
xii. Nella colonna Ciclo max sfondo, immettere 45 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e
PRC).
xiii. Nella colonna Cicli medi boxcar, immettere 0 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e
PRC) (impostazione predefinita).
xiv. Nella colonna Soglia PT finale, immettere 20 per ciascun canale (Influenza A, Influenza B e PRC)
xv. Nella colonna NC IC%, lasciare “NA” per ciascun canale (PRC) (impostazione predefinita).
xvi. Nella colonna IC Delta, lasciare “NA” per ciascun canale (Influenza A e Influenza B)
xvii. Nella sezione Personalizza testo risultati, sotto la tabella, selezionare Testo risultati basato
sugli organismi dal menu a discesa. Apparirà la finestra di avvertenza mostrata qui sotto.
Selezionare Sì.
xviii. Selezionare il tasto Personalizza per aprire la finestra di dialogo Testo risultati basato sugli
organismi. Selezionare il tasto Aggiungi , immettere “Influenza A” nella colonna Nome
organismo e spuntare la casella Influenza A. Selezionare di nuovo il tasto Aggiungi, immettere
“Influenza B” nella colonna Nome organismo e spuntare la casella Influenza B.
d.
Fare clic su OK in fondo alla finestra
Impostare i tempi di ciclo RT-PCR e le temperature sul fondo della schermata, nel seguente modo:
i. Fase 1
1. Mantenimento
2. Temp:
55,0
3. Sec:
300
4. Elementi ottici:
OFF
ii. Fase 2
1. Mantenimento
2. Temp:
60,0
3. Sec:
300
4. Optics (Elementi ottici):
OFF
iii. Fase 3
1. Mantenimento
2. Temp:
65,0
Pagina 11 di 31
3.
4.
Sec:
Elementi ottici:
300
OFF
iv. Fase 4
1.
2.
3.
3.
Ciclo 2 temperature
Ripetizioni:
50
Fila prima temperatura:
a. Temp:
92,0
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
4. Fila seconda temperatura:
a. Temp:
57,0
b. Sec:
40
c. Elementi ottici:
ON
Salvare il protocollo selezionando il tasto Salva in fondo alla schermata
Illustrazione del protocollo Quidel Molecular Influenza A+B completato
Limitazioni: il seguente protocollo è stato sviluppato appositamente per l'uso con il dosaggio RT-PCR in tempo
reale Quidel Molecular Influenza A+B. Non è noto se possa essere usato con altri dosaggi. Rivolgersi a Cepheid
per verificare la compatibilità del software.
Istruzioni per la programmazione di 7500 Fast DX
1.
2.
Lanciare il pacchetto software 7500 Fast Dx.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento. Selezionare il tasto Crea nuovo documento per
avviare Creazione automatica nuovo documento. Seguire tutte le fasi per avviare il protocollo Quidel
Molecular Influenza A+B.
a. Definizione del documento: la maggior parte di quanto segue dovrebbe essere l’impostazione
predefinita. Se non è così, cambiare di conseguenza.
i. Confermare o immettere le seguenti informazioni.
Dosaggio:
Curva standard (Quantificazione assoluta)
Contenitore:
96-Well Clear
Modello:
Documento vuoto
Run Mode (Modalità ciclo):
Fast 7500
Operatore:
Nome dell'operatore
Commenti:
SDS v1.4 (aggiungerne altri se necessario)
Nome della piastra:
“Quidel Molecular Influenza A+B”
Pagina 12 di 31
b.
ii. Selezionare il tasto Avanti.
Selezione dei rilevatori: è necessario aggiungere i nuovi rilevatori per l'influenza A, l'influenza B e
il controllo di processo (PRC). Per ciascun target, selezionare il tasto Nuovo rilevatore per aprire
la finestra Nuovo rilevatore. In alternativa si può usare il pulsante Crea un altro dalla finestra
popup Nuovo rilevatore per gli ultimi due rilevatori.
i. Immettere le seguenti informazioni per ciascun rilevatore.
Nome
Colorante reporter Colorante quencher
Influenza A
FAM
(nessuno)
Influenza B
JOE
(nessuno)
PRC
Cy5
(nessuno)
c.
d.
Colore
(selezionare)
(selezionare)
(selezionare)
ii. Selezionare un colore univoco per rappresentare ciascun rilevatore.
iii. Evidenziare i nuovi rilevatori e aggiungere alla colonna Rilevatori nel documento usando
il tasto Aggiungi.
iv. Selezionare (nessuno) dal menu a discesa Riferimento passivo.
v. Selezionare il tasto Avanti.
vi. Selezionare il tasto Fine senza impostare alcun pozzetto.
La creazione automatica si chiuderà e il software si avvierà con la scheda Impostazione, che
mostra la piastra dei campioni impostata durante l’avviamento rapido. Per l’impostazione iniziale,
non occorre fare cambiamenti in questo momento.
Definizione del protocollo del termociclatore: selezionare la scheda Strumento per impostare i
tempi e le temperature di ciclo della RT-PCR Quidel Molecular Influenza A+B. Sotto Profilo
termico dovrebbe essere presente un protocollo predefinito in 2 fasi. Ciascuna fase ha 3 caselle
di testo modificabili dall’utente. Il valore della prima casella in alto rappresenta il numero di
ripetizioni o cicli per quella fase. Il valore della seconda casella rappresenta la temperatura (˚C) e
il valore dell’ultima casella rappresenta il tempo (minuti: secondi).
i. Apportare le seguenti modifiche al Protocollo termociclatore predefinito:
1. Fase 1
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
55
c. Tempo:
5:00
2. Selezionare la barra fra Fase 1 e Fase 2. Selezionare il tasto Aggiungi
mantenimento per aggiungere un'altra fase.
3. Fase 2
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
60
c. Tempo:
5:00
Pagina 13 di 31
4.
Selezionare la barra fra Fase 2 e Fase 3. Selezionare il tasto Aggiungi
mantenimento per aggiungere un'altra fase.
5. Fase 3
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
65
c. Tempo:
5:00
6. Fase 4 (fase di dissociazione in due passaggi)
a. Ripetizioni: 10
b. Passaggio 1
i. Temp:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passaggio 2
i. Temp:
57
ii. Tempo:
0:40
7. Selezionare la barra alla destra della Fase 4. Selezionare il tasto Aggiungi ciclo
per aggiungere un’altra fase.
8. Fase 5 (fase di dissociazione in due passaggi)
a. Ripetizioni: 35
b. Passaggio 1
i. Temp:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passaggio 2
i. Temp:
57
ii. Tempo:
0:40
9. Se si aggiunge una fase errata, la si può rimuovere premendo il tasto Elimina
dopo averla evidenziata fra le righe verticali.
ii. Sotto Impostazioni, immettere quanto segue:
Volume campione (μL):
20 (predefinito)
Modalità ciclo:
7500 Fast (predefinita)
Raccolta dati:
Fase 5, Passaggio 2 (57,0 @ 0:40)
NOTA: non spuntare la casella accanto a “Modalità esperta”.
iii. Protocollo finale
e.
Impostare la soglia per ciascun analita.
i. Selezionare la scheda Risultati.
ii. Selezionare la scheda Tracciato amplificazione.
iii. Selezionare Influenza A dalla scheda Rilevatore nell'angolo in alto a destra.
iv. Nel blocco Impostazioni analisi, impostare Soglia su 1.5e5.
Pagina 14 di 31
v. Selezionare il tasto Linea base automatica.
vi. Ripetere i passaggi iii-v per Influenza B, impostando il valore di Soglia su 1.2e5.
vii. Ripetere i passaggi iii-v per PRC, impostando il valore di Soglia su 2.7e4.
f.
g.
Salvare il nuovo protocollo come modello per uso futuro.
i. Nella parte superiore della schermata, selezionare File e poi Salva con nome.
ii. Salvare in: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nome file: “Quidel Molecular Influenza A+B”
iv. Salvare come: “SDS Templates (*.sdt)”
Uscire dal software.
Limitazioni: il seguente protocollo è stato sviluppato appositamente per questo dosaggio. Non è noto se possa
essere usato con altri dosaggi. Rivolgersi a Life Technologies per verificare la compatibilità del software.
Istruzioni per la programmazione dello strumento Life Technologies QuantStudio DX per la
reazione PCR in tempo reale
La programmazione dello strumento viene eseguita mediante l'uso del file TDD che accompagna il kit
del test.
Procedura del dosaggio
Eseguire le seguenti procedure alla temperatura ambiente controllata di 20–25°C.
Procedura di estrazione degli acidi nucleici
Consultare le istruzioni di programmazione del sistema NucliSENS easyMAG System riportate sopra.
1. Aggiungere 20 µL di controllo di processo al pozzetto di estrazione del campione.
2. Aggiungere 180 µL di campione clinico o di controllo esterno al pozzetto di estrazione del campione.
3. Seguire le istruzioni fornite dal produttore circa la procedura di estrazione.
Procedura di reidratazione del master mix
1. Stabilire il numero di campioni da testare e ottenere il numero corretto di flaconi di master mix
liofilizzato per otto test.
2. Riportare gli agenti inutilizzati alle condizioni di conservazione appropriate.
3. Aprire con cura il master mix, evitando di rovinare i pellet.
4. Aggiungere 135 µL di soluzione reidratante al master mix.
5. Lasciare il flacone a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti per consentire la reidratazione dei pellet.
Pagina 15 di 31
6.
Pipettare delicatamente su e giù per 2 o 3 volte, evitando la formazione di bolle, prima di dispensare
nella prima provetta PCR o nel pozzetto della piastra.
Nota: il master mix reidratato è sufficiente per otto reazioni.
Nota: Il master mix reidratato può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 24
ore, oppure a temperature ≤ -20 °C per un massimo di 14 giorni. (vedere la sezione “Conservazione e
manipolazione dei reagenti del kit” per ulteriori opzioni di conservazione).
Procedura di approntamento RT-PCR
1. Aggiungere 15 µL di master mix reidratato a ciascuna provetta di reazione o pozzetto della piastra.
2. Aggiungere 5 µL di acido nucleico estratto (campione con il controllo di processo) alle provette di
reazione o ai pozzetti della piastra. Non è necessario mescolare i reagenti.
Nota: per ciascun campione estratto, usare un micropipettatore con una punta non aerosol nuova.
3. Chiudere le provette di reazione o sigillare la piastra.
Nota: Quidel suggerisce che ogni ciclo del termociclatore includa una provetta di reazione o un
pozzetto con controllo positivo e controllo negativo esterni per influenza A/influenza B. Eseguire i
controlli secondo le prassi e le procedure del proprio laboratorio.
4. Centrifugare le provette di reazione o la piastra per un minimo di 15 secondi. Assicurarsi che tutto il
liquido si trovi sul fondo della provetta.
5. Inserire le provette o la piastra nel termociclatore.
Protocollo di amplificazione su SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Attivare il blocco (o i blocchi) SmartCycler
Lanciare il pacchetto software SmartCycler Dx versione 3.0b
Selezionare il tasto Crea ciclo in alto nella schermata per impostare il ciclo
Sotto Nome del ciclo, digitare un nome per il ciclo attuale (AAMMGG-Quidel Molecular Influenza A+B)
Sotto Note, inserire eventuali note sul ciclo per riferimento futuro
Sotto Dosaggio, selezionare il dosaggio “Quidel Molecular Influenza A+B” dal menu a discesa
Sotto Dati del dosaggio, digitare il numero di lotto e la data di scadenza del kit.
Per selezionare i pozzetti da usare, procedere in uno dei modi seguenti:
a. Per assegnare automaticamente i pozzetti, procedere nel modo seguente:
i. Sotto Numero di campioni, digitare il numero di campioni nella casella di testo fornita.
ii. Selezionare il tasto Applica. Il numero di file immesse compare nella Tabella del sito.
b. Per scegliere manualmente i pozzetti sui blocchi SmartCycler, procedere nel modo seguente:
i. Selezionare il tasto Aggiungi/Rimuovi siti, verso la parte bassa dello schermo.
ii. Si aprirà la finestra popup Seleziona siti, con due colonne. La colonna a sinistra (Siti) elenca
tutti i siti disponibili, mentre quella di destra (Selezioni) mostra tutti i siti selezionati.
iii. Per selezionare tutti i siti, fare clic sul tasto Seleziona tutti i siti.
iv. Per selezionare siti specifici, evidenziarne uno o più e selezionare la freccia destra per
aggiungerli alla colonna Selezioni.
v. Selezionare il tasto OK per chiudere la finestra. I siti selezionati appariranno nella Tabella del
sito.
Digitare gli identificatori dei campioni sotto la colonna ID campione della Tabella dei siti: questa
operazione può essere eseguita anche dopo l’inizio del ciclo.
Inserire eventuali note nella colonna Note e lasciare invariate le voci “SPEC” della colonna Tipo di
campione.
Selezionare il tasto Esegui ciclo in fondo allo schermo.
Selezionare il tasto Visualizza risultati per lo stato di avanzamento del ciclo.
Salvare il ciclo quando è terminato e prima di uscire dal software.
Protocollo di amplificazione sul termociclatore ABI 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
Accendere l'ABI 7500 Fast Dx.
Lanciare il pacchetto software ABI 7500 Fast Dx.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento.
Fare clic su Crea un nuovo documento.
Pagina 16 di 31
5.
6.
7.
8.
La maggior parte di quanto segue dovrebbe essere l’impostazione predefinita. Se non è così, cambiare
di conseguenza.
Dosaggio:
Curva standard (Quantificazione assoluta)
Contenitore:
96-Well Clear
Modello:
Run Mode (Modalità ciclo):
Fast 7500
Operatore:
Nome dell'operatore
Commenti:
SDS v1.4 (aggiungerne altri se necessario)
Nome della piastra:
AAMMGG-Quidel Molecular Influenza A+B
Impostazione della piastra dei campioni
a. Sotto le schede Impostazione e Piastra apparirà l’impostazione della piastra.
b. Selezionare tutti i pozzetti che conterranno il campione, fare clic con il tasto destro del mouse e
selezionare Ispettore pozzetto dal menu a discesa. Quando si apre la finestra popup Ispettore
pozzetto, selezionare i rilevatori di influenza A, influenza B e PRC.
c. Usare Ispettore pozzetto per inserire i nomi dei campioni. Gli ID paziente possono essere inseriti
nella finestra Ispettore pozzetto; si consiglia però di farlo prima di procedere con la risospensione del master mix liofilizzato, dopo il ciclo o utilizzando la funzione di importazione per
ridurre al minimo il tempo durante il quale le reazioni PCR vengono tenute a temperatura
ambiente prima di iniziare il ciclo.
d. Salvare il ciclo come AAMMGG-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
e. Si aprirà una finestra che chiede “Motivo della modifica della voce”. Inserire “Impostazione” e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
Avvio della PCR
a. Selezionare la scheda Strumento.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina.
c. Sotto Controllo strumento, selezionare il tasto Avvio per avviare il ciclo.
Dopo la PCR
a. IMPORTANTE: al termine del ciclo, premere OK. Analizzare i dati premendo il tasto “Analizza” nel
menu superiore, poi salvare il file.
b. Salvare il file premendo Salva documento nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che
chiede “Motivo della modifica della voce”. Inserire “Analisi dati post ciclo” e altri eventuali
commenti attinenti al ciclo.
Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudioDx per la reazione PCR in tempo reale
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Accendere il QuantStudio Dx.
Scegliere la modalità IVD sullo strumento.
Lanciare il pacchetto software QuantStudio Dx IVD.
Quando viene richiesto, inserire nome utente e password del sistema.
Si aprirà la finestra Schermata principale.
Nella casella Impostazioni, evidenziare il nome del test caricato precedentemente: “Dosaggio Quidel
Molecular Influenza A+B”.
Fare clic sul tasto Impostazioni per avviare un ciclo.
Verrà visualizzata la schermata Impostazioni, Proprietà del test. Inserire i dati relativi al ciclo.
a. Inserire Nome esperimento (per impostazione predefinita, il ciclo viene avviato con un indicatore
data e ora).
b. Immettere i dati del codice a barre piastra.
c. Registrare i numeri di lotto del materiale sotto Dati del reagente.
d. Salvare il ciclo come AAMMGG-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
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e.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Si aprirà una finestra che chiede “Motivo della modifica della voce”. Inserire “Impostazione” e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
Nella barra del menu di sinistra, selezionare Definisci.
Modificare i dati dei campioni.
a. Immettere i dati dei campioni specifici di ciascun pozzetto, cancellando l’elemento identificativo
predefinito (Paziente 1, Paziente 2, ecc.) e inserendo i nuovi dati, OPPURE
b. selezionare Importa da file nella parte superiore dello schermo per caricare una mappa
predefinita della piastra da un file di testo (delimitato da tabulazioni).
Nella barra del menu di sinistra, selezionare Assegna per verificare le corrette impostazioni
della piastra.
Caricamento della piastra dei campioni.
a. Espellere il vassoio strumenti.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina con il pozzetto A1 posizionato nell’angolo in
alto
a sinistra.
c. Retrarre il vassoio strumenti.
Avviare il ciclo.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Ciclo.
b. Fare clic sul tasto verde Esegui ciclo nella parte superiore dello schermo.
i. Se richiesto, selezionare il numero di serie specifico dello strumento in uso.
Una volta completato il ciclo, nella barra del menu di sinistra, selezionare Analisi.
a. Salvare il file premendo Salva nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che chiede
“Motivo della modifica della voce”. Inserire “Analisi dati post ciclo” e altri eventuali commenti
attinenti al ciclo.
b. Per impostazione predefinita, viene visualizzata la finestra Tracciato amplificazione. Per
visualizzare altri tipi di tracciato, selezionarli dalla barra del menu a sinistra.
c. Per visualizzare i dati sul ciclo con i valori Ct, selezionare la scheda Tabella pozzetti sulla destra
dello schermo.
Stampa di un rapporto.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Stampa rapporto. Personalizzare i contenuti del
rapporto selezionando o deselezionando i riquadri nella finestra.
b. Selezionare il tasto Stampa rapporto in fondo allo schermo.
Esportazione dei file di dati.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Esporta.
b. Inserire la Posizione del file di esportazione OPPURE fare clic su Sfoglia per individuare il
percorso desiderato.
c. Per impostazione predefinita, il campo Nome file di esportazione sarà compilato con il nome del
ciclo salvato.
d. Come tipo di file, selezionare Excel.
e. Personalizzare il rapporto dei dati esportati scorrendo le schede e selezionando o deselezionando
le opzioni.
f. Selezionare il tasto Avvia esportazione nella parte inferiore dello schermo.
Interpretazione dei risultati
Interpretazione dei risultati con SmartCycler II
1.
2.
3.
Selezionare la scheda Visualizza risultati al termine del ciclo.
Selezionare la scheda Campione risultati.
Il software SmartCycler indicherà automaticamente se i campioni sono positivi o negativi per
l'influenza, oppure se il ciclo non è valido (non risolto).
Pagina 18 di 31
4.
Nelle schede di ciascun analita, nella stessa finestra, sono presenti informazioni più dettagliate. In
caso di indicazione positiva per l'influenza A o l'influenza B (o entrambe), il risultato PRC non è
applicabile. Il PRC è richiesto solo per le indicazioni negative.
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B stampati su SmartCycler II
Risultato
dosaggio
Risultato del
controllo di
processo
Influenza A
Influenza B
Negativo
Superato
NEG.
NEG.
Acido nucleico dell'influenza A o
dell'influenza B non rilevato; rilevato PRC
N.A.*
POS.
NEG.
Acido nucleico dell'influenza A rilevato
N.A.*
NEG.
POS.
Acido nucleico dell'influenza B rilevato
N.A.*
POS.
POS.
Acido nucleico dell'influenza A e
dell'influenza B rilevato
Positivo per
l'influenza A
Positivo per
l'influenza B
Positivo per
l'influenza A e
per l'influenza B
Non risolto – Inibizione PCR o insuccesso
del reagente. Ripetere il test dall'acido
Non valido
Non superato
NEG.
NEG.
nucleico purificato o prelevare e testare un
nuovo campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore per riferire un'indicazione positiva.
Codice errore 3079: L'Avvertenza/Codice errore 3079 è possibile con campioni positivi per l'influenza A e per
l'influenza B. L'Avvertenza/Codice errore 3079 è presente quando il segnale di fluorescenza (RFU) è troppo
elevato. In questo caso, tutti i risultati del campione vengono refertati dal software Dx come ND (Non
determinato). Se viene refertato un valore Ct ≥ 10 o ≤ 45 per l'influenza A o per l'influenza B, i risultati del
campione possono essere registrati come POS per l'influenza A o per l'influenza B.
Interpretazione dei risultati con il termociclatore 7500 Fast Dx
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B sul termociclatore 7500
Fast Dx
Risultato
dosaggio
Rilevatore:
Influenza A
Rilevatore:
Influenza B
Rilevatore:
controllo di
processo
Negativo
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
N.A.*
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
N.A.*
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
N.A.*
Positivo per
l'influenza A
Positivo per
l'influenza B
Positivo per
influenza A e
B
Nessun acido nucleico dell'influenza
A o dell'influenza B rilevato; rilevato
PRC
Acido nucleico dell'influenza A
rilevato
Acido nucleico dell'influenza B
rilevato
Nessun acido nucleico dell'influenza A,
dell'influenza B o del PRC rilevato; ciclo
Non valido
non valido, eseguire nuovamente il
ciclo o ri-estrarre
Indeterminat Non determinato, eseguire
Non valido
Indeterminato
Indeterminato
o
nuovamente il ciclo o ri-estrarre
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
Ct < 5,0 oppure
Ct > 35,0
Ct < 5,0
oppure
Ct > 35,0
Pagina 19 di 31
Interpretazione dei risultati con lo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B sullo strumento
QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
Risultato
dosaggio
Rilevatore:
Influenza A
Rilevatore:
Influenza B
Negativo
Nessun valore
Ct fornito
(vuoto)
Nessun valore
Ct fornito
(vuoto)
Nessun valore
Ct fornito
(vuoto)
Positivo per
l'influenza A
Ct ≤40,0
Positivo per
l'influenza B
Nessun valore
Ct fornito
(vuoto)
Positivo per
influenza A e B
Rilevatore:
controllo
di processo
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
Nessun acido nucleico dell'influenza
A o dell'influenza B rilevato; rilevato
PRC
N.A.*
Acido nucleico dell'influenza A
rilevato
N.A.*
Acido nucleico dell'influenza B
rilevato
Nessun acido nucleico dell'influenza A,
Nessun valore Nessun valore Nessun valore
dell'influenza B o del PRC rilevato; ciclo
Non valido
Ct fornito
Ct fornito
Ct fornito
non valido, eseguire nuovamente il
(vuoto)
(vuoto)
(vuoto)
ciclo o ri-estrarre
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
N.A.*
Controllo di qualità
Il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B incorpora numerosi controlli per monitorare le prestazioni
del dosaggio.
1.
2.
3.
Il controllo di processo deve essere utilizzato durante l'estrazione e l'amplificazione nel dosaggio. Questo
controllo va aggiunto a ciascuna aliquota di campione prima dell'estrazione.
I controlli positivi esterni per l'influenza A/B disponibili in commercio possono essere trattati come
campioni del paziente e utilizzati conformemente agli standard del laboratorio. Al posto di controlli
influenza A o influenza B disponibili in commercio è possibile usare campioni precedentemente
caratterizzati come positivi all'influenza A/B.
Come controllo negativo esterno si possono utilizzare terreni di trasporto per colture virali o campioni
precedentemente caratterizzati come negativi. Essi vanno trattati come campioni del paziente e
conformemente agli attuali standard del laboratorio.
Limitazioni
Questo test non è destinato alla differenziazione dei sottotipi di influenza A, quali la nuova influenza A
H1N1. La differenziazione dei sottotipi richiede ulteriori test.
I risultati negativi non escludono l'infezione da virus dell'influenza e non devono essere utilizzati come sola
base per una decisione di trattamento.
Come accade per altri dosaggi di questo tipo, esiste un rischio di risultati falsi negativi a causa della
presenza di varianti di sequenza nel target virale.
Il prelievo, la conservazione o il trasporto impropri possono causare risultati falsi negativi.
Gli inibitori presenti nel campione e/o gli errori nel seguire la procedura del dosaggio possono portare a
risultati falsi negativi.
Prestazioni cliniche
Le caratteristiche di performance del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B sono state stabilite attraverso
uno studio prospettico svoltosi durante la stagione dei virus respiratori 2011 (da gennaio a marzo). I campioni
usati per tale studio erano campioni di tamponi nasali e rinofaringei prelevati per test di routine sull'influenza.
Pagina 20 di 31
Il metodo di riferimento era la coltura rapida (shell vial) seguita dallo screening e dall'identificazione
dell'anticorpo fluorescente diretto (DFA).
È stato testato un totale di 637 campioni di tamponi, sia con il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B che
mediante la coltura. Sei (6) campioni che inizialmente avevano dato risultati irrisolti sono rimasti irrisolti dopo
essere stati nuovamente sottoposti a test con il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B, e non sono inclusi
nell'analisi qui sotto.
Un totale di 6 campioni è risultato positivo allo screening del virus respiratorio DFA (il reagente di screening
rileva il virus dell'influenza A e B, l'RSV, il virus della parainfluenza 1, 2 e 3 e l'adenovirus), ma conteneva un
numero troppo basso di cellule per ottenere un'identificazione positiva specifica. Un totale di 3 campioni è
risultato tossico nella coltura cellulare. Tali 9 campioni non sono inclusi nell'analisi qui sotto.
L'analisi discrepante dei campioni per cui i risultati del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B e quelli della
coltura erano in disaccordo è stata eseguita usando un dosaggio RT-PCR a marchio CE, nonché il sequencing
bidirezionale laddove appropriato.
Influenza A
Tamponi nasali/rinofaringei
freschi (N=622)
Dosaggio Quidel Molecular
Influenza A+B
Positivo
Confronto: coltura con DFA
Positivo
Negativo
Totale
93
18*
111
Negativo
1**
510
511
Totale
94
528
622
95% CI
Sensibilità
93/94
98,9%
da 94,2% a 100%
Specificità
510/528
96,6%
da 94,7% a 98,0%
*17 di tali campioni sono risultati positivi per l'influenza A attraverso il dispositivo CE-IVD.
Il restante campione è risultato negativo per l'influenza A attraverso il dispositivo CE-IVD,
ma positivo per il virus dell'influenza A attraverso l'analisi sequenziale.
** Il campione è risultato negativo per l'influenza A anche attraverso il dispositivo CE-IVD.
Influenza B
freschi (N=622)
Influenza A+B
Positivo
Confronto: coltura con DFA
Positivo
Negativo
Totale
74
7*
81
Negativo
2**
539
541
Totale
76
546
622
95% CI
Sensibilità
74/76
97,4%
da 90,8% a 99,7%
Specificità
539/546
98,7%
da 97,4% a 99,5%
*5 campioni sono risultati positivi per l'influenza B attraverso il dispositivo CE-IVD;
2 campioni sono risultati negativi per l'influenza B attraverso il dispositivo CE-IVD,
ma sono risultati positivi per il virus dell'influenza B attraverso l'analisi sequenziale.
**1 campione è risultato positivo per l'influenza B attraverso il dispositivo CE-IVD;
1 campione è risultato negativo per l'influenza B attraverso il dispositivo CE-IVD.
Un totale di 626 campioni di tamponi è stato testato anche con il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B e
con un dosaggio RT-PCR IVD a marchio CE. Sei (6) campioni che inizialmente avevano dato risultati irrisolti sono
rimasti irrisolti dopo essere stati nuovamente sottoposti a test con entrambi i dosaggi, e non sono inclusi
nell'analisi qui sotto. Altri 10 campioni hanno dato risultati irrisolti attraverso il dosaggio RT-PCR IVD a marchio
CE e sono rimasti irrisolti dopo essere stati nuovamente sottoposti a test con il dosaggio, e non sono inclusi
nell'analisi qui sotto. L'analisi discrepante dei campioni per cui i risultati del dosaggio Quidel Molecular
Pagina 21 di 31
Influenza A+B e quelli del dosaggio RT-PCR IVD a marchio CE erano in disaccordo è stata eseguita usando il
sequencing.
Influenza A
freschi (N=610)
Influenza A+B
Confronto: Dispositivo CE-IVD
Positivo
Negativo
Totale
Positivo
107
3*
110
Negativo
0
500
500
107
503
610
Totale
95% CI
Sensibilità
107/107
100%
da 96,6% a 100%
Specificità
500/503
99,4%
da 98,3% a 99,9%
*3 campioni sono risultati positivi per il virus dell'influenza A attraverso
l'analisi sequenziale.
Influenza B
freschi (N=610)
Influenza A+B
Confronto: Dispositivo CE-IVD
Positivo
Negativo
Totale
Positivo
77
5*
82
Negativo
4**
524
528
Totale
81
529
610
95% CI
Sensibilità
77/81
95,1%
da 87,8% a 98,6%
Specificità
524/529
99,1%
da 97,8% a 99,7%
*5 campioni sono risultati positivi per il virus dell'influenza B attraverso
**4 campioni sono risultati negativi per il virus dell'influenza B attraverso
Un sottoinsieme di duecentoundici (211) campioni dello studio sopra indicato è stato testato sullo strumento
QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale. I risultati di tale test sono stati confrontati con i dati
provenienti dal concomitante test sullo strumento ABI 7500 Fast Dx. Tale confronto viene descritto qui sotto.
Dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B
Influenza A
Confronto: ABI 7500 Fast Dx
Strumento QuantStudio Dx per
la reazione PCR in tempo reale
Positivo
Negativo
Totale
Positivo
63
0
63
Negativo
0
148
148
Totale
63
148
211
95% CI
Sensibilità
63/63
100%
da 94,3% a 100%
Specificità
148/148
100%
da 97,5% a 100%
Pagina 22 di 31
Dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B
Influenza B
Confronto: ABI 7500 Fast Dx
Strumento QuantStudio Dx per
la reazione PCR in tempo reale
Positivo
Negativo
Totale
Positivo
28
0
28
Negativo
0
183
183
Totale
28
183
211
95% CI
Sensibilità
28/28
100%
da 87,9% a 100%
Specificità
183/183
100%
da 97,9% a 100%
Prestazioni analitiche
Livello di rilevamento
La sensibilità analitica (limite di rilevamento o LoD) del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è stata
stabilita usando colture quantificate (TCID50/mL) di 3 ceppi di influenza A (1 H1N1, 1 2009H1N1 e1 H3N2) e di 3
ceppi di influenza B, diluiti serialmente in una matrice rinofaringea negativa. Ogni diluizione è stata estratta
usando il sistema NucliSENS easyMAG ed è stata testata in repliche di 20 per ciascuna concentrazione di virus,
sia sulla piattaforma Applied Biosystems® 7500 Fast Dx che sulla piattaforma Cepheid SmartCycler® II. La
sensibilità analitica (LoD) è definita come la concentrazione più bassa in corrispondenza della quale il 95% di
tutti i duplicati risulta positivo al test.
Livello di rilevamento
Ceppo
TCID50/mL LoD finale
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Inibizione competitiva
L'inibizione competitiva del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è stata valutata usando campioni simulati
con concentrazioni variabili di virus dell'influenza A (da 2x LoD a 4 log al di sopra del LoD) e di virus
dell'influenza B (da 2x LoD a 4 log al di sopra del LoD) in uno stesso campione. I campioni sono stati estratti
usando il sistema NucliSENS easyMAG e testati tre volte. La presenza sia del virus dell'influenza A che del virus
dell'influenza B in concentrazioni variabili in uno stesso campione non ha avuto effetto sulla sensibilità
analitica (limite di rilevamento o LoD) del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B.
Reattività analitica (Inclusività)
La reattività del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è stata valutata in relazione a ceppi multipli di virus
dell'influenza A e virus dell'influenza B. Il panel clinico era costituito da 10 ceppi di virus dell'influenza A
sottotipo H1N1, 2 ceppi di virus dell'influenza A sottotipo 2009H1N1, 8 ceppi di virus dell'influenza A sottotipo
H3N2, 2 ceppi di virus dell'influenza A sottotipo H5N1 e 13 ceppi di virus dell'influenza B. È stato testato anche
un panel aggiuntivo di isolati ristretti non clinici. Ciascun componente del panel è stato estratto usando lo
strumento NucliSens easyMAG e testato tre volte.
Pagina 23 di 31
Il dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B ha rilevato il 100% dei ceppi del virus dell'influenza A (38/38) e del
2
3
virus dell'influenza B (15/15) a livelli da 10 a 10 TCID50/mL, compresi ceppi della nuova influenza,
dell'influenza pandemica e dell'influenza aviaria A e ceppi di virus della recente influenza B.
Virus dell'influenza A nel panel clinico
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
1,12E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/NWS/33
N.A.
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
1,41E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
4,57E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Sottotipo
Ceppo
TCID50/mL
H1N1
H1N1
Virus dell'influenza B nel panel clinico
Ceppo
TCID50/mL
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Malaysia/25/06/04
3,41E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Allen/45
4,17E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Pagina 24 di 31
Virus dell'influenza B nel panel clinico
Ceppo
TCID50/mL
B/Taiwan/2/62
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,51E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Russia/69
2,19E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Lee/40
1,95E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Virus ristretti non clinici
Sottotip
o
Ceppo
TCID50/m
L
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
H2N2
2,00E+02
H7N3
2,00E+02
H9N2
2,00E+02
H4N8
2,00E+02
H6N2
2,00E+02
H8N4
2,00E+02
H5N1
2,00E+02
H10N7
2,00E+02
H11N9
A/Chicken/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
H12N5
2,00E+02
H13N6
A/Gull/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
H14N5
2,00E+02
H15N9
A/Shearwater/Australia/2576/79
(H15N9)
2,00E+02
H16N3
2,00E+02
(7500 Fast Dx)
A
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
B
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
(SmartCycler)
A
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
B
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Pagina 25 di 31
Riproducibilità
La riproducibilità del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è stata valutata presso 3 laboratori. La
riproducibilità è stata analizzata usando un panel di 6 campioni simulati, comprendente virus dell'influenza A
medi (10x LoD) e alti negativi (concentrazione C20-60), virus dell'influenza B e campioni di controllo positivi e
negativi. I panel e i controlli sono stati testati presso ciascun centro da 2 operatori per 5 giorni (8 campioni e 3
controlli × 2 operatori × 5 giorni × 3 siti = 330). I panel e i controlli sono stati estratti usando il sistema
NucliSENS easyMAG e testati sullo strumento 7500 Fast Dx.
Riproducibilità
ID del
componente
del panel
Influenza A
alto negativo
Influenza A
positivo (10x LoD)
Influenza B
alto negativo
Influenza B
positivo (10x LoD)
Influenza A
controllo positivo
Influenza B
controllo positivo
Controllo
negativo
Sito 1
Sito 2
Sito 3
Accordo con
i risultati
previsti
AVE
Ct
%CV
Accordo con
i risultati
previsti
AVE
Ct
%CV
Accordo con
i risultati
previsti
6/10
31,5*
8,8
10/10
N/D
N/D
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9/10
34,9
N/D
10/10
10/10
25,1
12,0
10/10
12,0
10/10
10/10
Accordo
totale con
il risultato
previsto
AVE
Ct
%CV
9/10
34,3*
N/D
25/30
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
30/30
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
30/30
Specificità analitica – Reattività crociata
La specificità analitica del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B è stata valutata testando un panel formato
da 26 ceppi virali, 24 ceppi batterici e 1 ceppo di lievito, che rappresentavano patogeni respiratori comuni o
flora comunemente presente nella rinofaringe. I batteri e il lievito sono stati sottoposti a test in concentrazioni
5
10
3
6
da 10 a 10 CFU/mL. I virus sono stati testati a concentrazioni da 10 a 10 TCID50/mL. I campioni sono stati
estratti usando lo strumento NucliSens easyMAG e testati tre volte. La specificità analitica del dosaggio Quidel
Molecular Influenza A+B è stata del 100%.
Reattività crociata
3,70E+04
Risultato
influenza A
Negativo
Risultato
influenza B
Negativo
hMPV B1
2,37E+04
Negativo
Negativo
RSV Long
4,40E+04
Negativo
Negativo
RSV Washington
1,75E+0
Negativo
Negativo
Adenovirus 1/Adenoidi 71
5,67E+04
Negativo
Negativo
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negativo
Negativo
Coronavirus OC43
1,67E+06
Negativo
Negativo
Coxsackievirus B4
2,43E+06
Negativo
Negativo
2,28E+06
Negativo
Negativo
Citomegalovirus
8,76E+05
Negativo
Negativo
Ecovirus 7
5,38E+08
Negativo
Negativo
Ecovirus 9
1,50E+06
Negativo
Negativo
Ecovirus 6
1,05E+08
Negativo
Negativo
ID organismo
Conc. finale
hMPV A1
Pagina 26 di 31
1,50E+05
Risultato
influenza A
Negativo
Risultato
influenza B
Negativo
Enterovirus 71
2,68E+03
Negativo
Negativo
Enterovirus 70
1,66E+05
Negativo
Negativo
Virus di Epstein-Barr
5.000 cp/mL
Negativo
Negativo
HSV Tipo 1, ceppo Maclnytre
1,95E+06
Negativo
Negativo
HSV Tipo 2, ceppo G
3,67E+06
Negativo
Negativo
Rosolia
3,78E+05
Negativo
Negativo
Parotite
8,43E+04
Negativo
Negativo
Parainfluenza Tipo 1
2,50E+05
Negativo
Negativo
2,20E+04
Negativo
Negativo
9,10E+05
Negativo
Negativo
9,57E+06
Negativo
Negativo
7,50E+02
Negativo
Negativo
1,04E+07
Negativo
Negativo
2,55E+07
Negativo
Negativo
2,10E+05
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
6,90E+08
Negativo
Negativo
6,60E+07
Negativo
Negativo
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativo
Negativo
5,90E+07
Negativo
Negativo
5,15E+07
Negativo
Negativo
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativo
Negativo
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativo
Negativo
2,15E+07
Negativo
Negativo
1,85E+08
Negativo
Negativo
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativo
Negativo
3,30E+07
Negativo
Negativo
Escherichia coli
6,80E+07
Negativo
Negativo
5,85E+07
Negativo
Negativo
6,0E+05
Negativo
Negativo
1,03E+08
Negativo
Negativo
4,5E+07
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
2,50E+06
Negativo
Negativo
2,6E+07
Negativo
Negativo
5,15E+08
Negativo
Negativo
ID organismo
Conc. finale
Ecovirus 11
Pagina 27 di 31
ID organismo
Conc. finale
Candida albicans
1,07E+06
Risultato
influenza A
Negativo
Risultato
influenza B
Negativo
Specificità analitica – Sostanze interferenti
Le prestazioni del dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B sono state valutate con sostanze potenzialmente
interferenti che potrebbero essere presenti nei campioni rinofaringei. Le sostanza potenzialmente interferenti
sono state valutate nell'influenza A (A/Mexico/4108/2009) e nell'influenza B (B/Florida/04/2006) a
concentrazioni di 3x e 10x LoD. Le sostanze testate non hanno dato alcun segno di interferenza in tali
condizioni.
Concentrazione testata
Risultato
influenza A
(3x LoD)
Risultato
influenza B
(3x LoD)
60 µg/mL
Positivo
Positivo
Sangue (umano), EDTA anticoagulante
2% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Neo-sinefrina
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Spray nasale Afrin
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Zicam Allergy Relief Nasal Gel
5% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Spray nasale salino
15% (vol/vol) della dose
Positivo
Positivo
Pastiglie per la gola
0,68g/mL; 1/18 sbriciolato;
ingredienti attivi: 1,7
mg/mL di mentolo
Positivo
Positivo
3,3–5 mg/mL
Positivo
Positivo
Tobramicina
4,0 µg/mL
Positivo
Positivo
Mupirocina
6,6–10 mg/mL
Positivo
Positivo
Oseltamivir fosfato
7,5–25 mg/mL
Positivo
Positivo
Nome della sostanza
Mucina
(ghiandola sottomascellare bovina, tipo I-S)
Zanamivir
Carry-over e contaminazione crociata
Uno studio interno non ha evidenziato alcuna prova di carry-over/contaminazione crociata con il dosaggio
Quidel Molecular Influenza A+B usando lo strumento di estrazione degli acidi nucleici automatizzata
bioMériuex NucliSENS easyMAG.
Materiali di riferimento aggiuntivi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Guidance on Class II Special Controls Guidance Document: Reagents for Detection of Specific Novel
Influenza A Viruses (March 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path (April
Guidance on Informed Consent for In Vitro Diagnostic Device Studies Leftover Human Specimens that are
Not Individually Identifiable (April 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
(Vol. 2, No. 34) (Oct 2004).
CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov
2005).
Pagina 28 di 31
8.
CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14)
(Sept 2002).
(Oct 2003).
Servizio clienti e assistenza tecnica
Per ordini o assistenza tecnica, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 874-1517 (gratuito negli
Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100, dal lunedì al venerdì, dalle 8:00 alle 17:00, ora della costa
orientale. Gli ordini possono essere effettuati anche via fax al numero +1 (740) 592-9820. Per avere assistenza
via e-mail, scrivere a [email protected] oppure a [email protected]. Per servizi al di fuori degli
Stati Uniti, contattare il distributore di zona. Maggiori informazioni su Quidel, i nostri prodotti e i nostri
distributori sono disponibili sul sito web quidel.com.
Proprietà intellettuale
Marchi di fabbrica
Cepheid® e Smartcycler® sono marchi depositati di Cepheid Corporation. Applied Biosystems® è un marchio
depositato di Life Technologies. NucliSENS® ed easyMAG® sono marchi depositati di bioMerieux, Inc. TaqMan®
è un marchio depositato di Roche. CAL Flour® Orange 560, CAL Flour® Red 610 e Quasar®670 sono marchi
depositati di BioSearch Technologies, Inc.
Brevetti
I composti coloranti in questo prodotto sono venduti su licenza di BioSearch Technologies, Inc. e sono tutelati
da brevetti statunitensi e internazionali, già rilasciati o in attesa di rilascio.
L’acquisto di questo prodotto concede all’acquirente i diritti previsti da determinati brevetti di Roche, per l’uso
esclusivamente nell’ambito di servizi diagnostici in vitro per esseri umani. Al di là di questo specifico diritto
all’uso, con l’acquisto non vengono concessi brevetti generali o altre licenze di alcun tipo.
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Glossario
Rappresentante autorizzato nella
Comunità Europea
Produttore
Contenuto / Contiene
Controllo
Data di scadenza
Numero di catalogo
Codice lotto
Per uso diagnostico in vitro
Leggere le istruzioni per l'uso
Uso previsto
96
Contenuto sufficiente per 96 determinazioni
Limiti di temperatura
Pagina 30 di 31
Bibliografia
1
http://1918.pandemicflu.gov accessed on 6/9/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm accessed on 6/9/11.
4
M100 – Kit per dosaggio Quidel Molecular Influenza A+B
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Germania
Quidel Corporation
Sede internazionale
San Diego, CA 92121, Stati Uniti
quidel.com
M0002GIT00 (12/2012)
Pagina 31 di 31
Test Influenza A+B
Instrukcja użytkowania
Do jakościowego wykrywania i identyfikacji kwasów nukleinowych wirusa grypy typu A i B
wyekstrahowanych z próbek typu wymaz z nosa, nosogardła, oraz popłuczyny/aspirat
z nosa.
Test Quidel Molecular Influenza A+B (CE)
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Spis treści
Przeznaczenie................................................................................................................................................ 4
Podsumowanie i wyjaśnienie ........................................................................................................................ 4
Zasada procedury.......................................................................................................................................... 4
Dostarczane materiały .................................................................................................................................. 6
Materiały opcjonalne .................................................................................................................................... 6
Materiały wymagane, ale nie dostarczone ................................................................................................... 6
Ostrzeżenia i środki ostrożności.................................................................................................................... 7
Przechowywanie i posługiwanie się odczynnikami zawartymi w zestawie .................................................. 7
Pobieranie próbek, przechowywanie i obsługa ............................................................................................ 8
Przechowywanie wyekstrahowanych kwasów nukleinowych...................................................................... 8
Instrukcja programowania ekstrakcji kwasów nukleinowych ...................................................................... 8
Wstępne programowanie termocyklera ..................................................................................................... 10
Instrukcja programowania termocyklera SmartCycler II ........................................................................ 10
Instrukcja programowania termocyklera 7500 Fast Dx .......................................................................... 12
Instrukcje programowania urządzenia Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR .............. 16
Procedura testu........................................................................................................................................... 16
Protokół amplifikacji w termocyklerze SmartCycler II ............................................................................ 16
Protokół amplifikacji w termocyklerze ABI 7500 Fast Dx ....................................................................... 17
Protokół amplifikacji w urządzeniu do Real-Time PCR QuantStudio Dx ................................................. 18
Interpretacja wyników ................................................................................................................................ 19
Interpretacja wyników przy użyciu termocyklera SmartCycler II ........................................................... 19
Interpretacja wyników przy użyciu termocyklera 7500 Fast Dx ............................................................. 19
Interpretacja wyników przy użyciu urządzenia QuantStudio Dx Real-Time PCR .................................... 20
Kontrola jakości ........................................................................................................................................... 21
Ograniczenia ............................................................................................................................................... 21
Skutecznośd kliniczna .................................................................................................................................. 21
Wydajnośd analityczna................................................................................................................................ 24
Poziom wykrywalności ................................................................................................................................ 24
Strona 2 z 32
Inhibicja kompetycyjna ............................................................................................................................... 25
Reaktywnośd analityczna (inkluzywnośd) ................................................................................................... 25
Powtarzalnośd ............................................................................................................................................. 27
Swoistośd analityczna – reaktywnośd krzyżowa ......................................................................................... 27
Badania przenoszenia i zanieczyszczenia krzyżowego ................................................................................ 30
Dodatkowy materiał źródłowy .................................................................................................................... 30
Obsługa klienta i wsparcie techniczne ........................................................................................................ 30
Własnośd intelektualna ............................................................................................................................... 30
Znaki handlowe towarowe ......................................................................................................................... 30
Słowniczek................................................................................................................................................... 31
Odnośniki .................................................................................................................................................... 32
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Przeznaczenie
Test Quidel Molecular Influenza A+B jest multipleksowym testem RT (real time)-PCR do jakościowego wykrywania
i identyfikacji kwasów nukleinowych wirusa grypy typu A i/lub B wyekstrahowanych z próbek typu wymaz z nosa,
nosogardła, oraz popłuczyny/aspirat z nosa. Niniejszy test diagnostyczny in vitro przewidziany jest do stosowania w
celu ułatwienia diagnostyki różnicowej zakażeo wirusem grypy typu A i/lub B u ludzi. Test nie wykrywa obecności
wirusa grypy typu C.
Ujemne wyniki testu nie wykluczają zakażenia wirusem grypy i nie powinny byd jedyną podstawą postawienia
rozpoznania ani podejmowania decyzji terapeutycznych. Charakterystykę testu pod względem oznaczania wirusa
grupy typu A określono w warunkach, gdy wśród krążących wirusów tego typu dominowały wirusy grypy A/H3
i A/H1. W razie pojawienia się innych podtypów wirusa grypy typu A, charakterystyka działania testu może
byd inna.
Podsumowanie i wyjaśnienie
Wirusy grypy (rodzina Orthomyxoviridae) zawierają genom w postaci pojedynczoniciowego RNA, który jest obecny
jako 8 odrębnych segmentów rybonukleoproteiny. Ta segmentacja genomu stanowi rzadkośd wśród wirusów
i prawdopodobnie przyczynia się do szybkiego rozwoju nowych szczepów grypy przez wymianę segmentów genów,
gdy dwa różne wirusy zainfekują tę samą komórkę. Istnieją 3 rodzaje grypy — typ A, B i C. Typ A ma odpowiedniki
u ptaków i świo, a także u ludzi, podczas gdy typy B i C znane są wyłącznie u ludzi. Ze względu na możliwośd
wystąpienia kolejnej pandemii spowodowanej grypą typu A, jak to miało miejsce w 1918 roku, kiedy zmarło 30–50
1
milionów ludzi na całym świecie , Centrum Kontroli Chorób (CDC) i Światowa Organizacja Zdrowia (WHO)
prowadzą stały nadzór szczepów wirusa grypy oraz dokonują prognoz, który szczep będzie odpowiedni do
produkcji szczepionek.
Szacuje się, że w USA dochodzi do 30 000–49 000 zgonów rocznie, spowodowanych przez choroby powiązane
2
z grypą. Na całym świecie coroczne epidemie grypy prowadzą do wystąpienia około trzech do pięciu milionów
3
przypadków ciężkich zachorowao, oraz około 250 000–500 000 zgonów. Pandemia grypy A występuje co około
10 do 30 lat, a epidemie grypy A lub B występują corocznie. Zakażenia są sezonowe, zwykle rozciągając się na
półkuli północnej od listopada do kwietnia. Powikłania zdarzają się u osób młodych, starszych i cierpiących na
przewlekłe choroby sercowo-płucne.
Czas inkubacji wynosi 1–3 dni z szybkim rozprzestrzenianiem się drogą wziewną, za pomocą kropelek unoszących
się w powietrzu i przedmiotów przenoszących zarazki. Charakteryzuje się gorączką, bólem mięśni, bólem głowy
i zapaleniem gardła.
Zasada procedury
Test wykrywa wirusowe kwasy nukleinowe, które zostały wyekstrahowane z próbki pochodzącej od pacjenta.
Przeprowadza się reakcję multiplex RT-PCR, w optymalnych warunkach, w pojedynczej probówce, z generowaniem
amplikonów dla każdego z wirusów docelowych obecnych w próbce. Identyfikacja grypy A zachodzi za pomocą
swoistych starterów docelowych i znakowanej fluorescencyjnie sondy, która hybrydyzuje z zachowawczą
sekwencją grypy A w obrębie genu białka macierzy. Identyfikacja grypy B zachodzi za pomocą swoistych starterów
docelowych i znakowanych fluorescencyjnie sond, które hybrydyzują z zachowawczą sekwencją grypy B w obrębie
genu neuraminidazy.
Molekularne znaczniki sond Quidel
Obiekt docelowy
Barwnik
Grypa typu A
FAM
Grypa typu B
Kontrola procesu (PRC)
Quasar® 670
Strona 4 z 32
Poniżej przedstawiono podsumowanie procedury:
1.
Pobieranie próbek: Uzyskad wymazy z nosa, wymazy z nosogardła oraz próbki odessanego aspiratu/popłuczyn
z nosa przy użyciu standardowych technik, od pacjentów z objawami. Próbki te są transportowane,
4
przechowywane i przetwarzane zgodnie z ustalonymi procedurami laboratoryjnymi.
2.
Ekstrakcja kwasów nukleinowych: Ekstrahowad kwasy nukleinowe z próbek za pomocą systemu NucliSENS®
easyMAG® zgodnie z instrukcjami producenta i za pomocą odpowiednich odczynników (patrz Materiały
wymagane, ale nie dostarczone). Stosowanie innych systemów ekstrakcji wraz z testem Quidel
Molecular Influenza A+B nie zostało zatwierdzone. Zatwierdzanie tych innych systemów jest obowiązkiem
użytkownika koocowego.
Przed procedurą ekstrakcji, dodad 20 µl kontroli procesu (PRC) do każdych 180 µl porcji próbki. PRC służy do
monitorowania inhibitorów w ekstrahowanej próbce, zapewnia, że doszło do odpowiedniej amplifikacji,
i potwierdza, że ekstrakcja kwasów nukleinowych była wystarczająca.
3.
Rehydratacja mieszaniny Master Mix: Rehydratowad liofilizowaną mieszaninę Master Mix za pomocą
Rehydration Solution (Roztworu do rehydratacji). Mieszanina Master Mix zawiera startery oligonukleotydowe,
fluorofor i znakowane wygaszaczem sondy, ukierunkowane na konserwatywne regiony wirusa grypy typu A
oraz wirusa grypy typu B, jak również sekwencję kontroli procesu.
4.
Amplifikacja i detekcja kwasów nukleinowych: Dodad 15 µl z rehydratowanej mieszaniny Master Mix do
każdej probówki reakcyjnej lub studzienki płytki. Następnie dodad 5 µl ekstrahowanych kwasów nukleinowych
(próbka z PRC) do studzienki w płytce lub odpowiednio oznakowanej probówki reakcyjnej. Umieścid płytkę lub
TM
probówkę odpowiednio w urządzeniu Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR lub urządzeniach
Applied Biosystems® 7500 Fast Dx lub Cepheid® SmartCycler® II. Test został zatwierdzony przy pomocy
urządzeo z serii 7500.
Po umieszczeniu probówki reakcyjnej lub płytki w urządzeniu, rozpoczyna się protokół testowy. Protokół ten
inicjuje odwrotną transkrypcję docelowych RNA, generując komplementarne DNA, a następnie dochodzi do
dalszej amplifikacji docelowych amplikonów. Test molekularny grypy typu A+B firmy Quidel jest oparty na
chemii TaqMan® i wykorzystuje enzym o aktywnościach odwrotnej transkryptazy, polimerazy DNA
i egzonukleazy 5’-3’. Podczas amplifikacji DNA enzym ten rozszczepia sondę związaną do komplementarnej
sekwencji DNA, oddzielając barwnik wygaszacza od barwnika reporterowego. Etap ten powoduje
podwyższenie sygnału fluorescencyjnego po wzbudzeniu przez źródło światła o odpowiedniej długości fali.
W każdym cyklu oddzielane są dodatkowe cząsteczki barwnika od wygaszaczy, co powodujące dodatkowe
nasilenie sygnału. Jeżeli osiągnie się wystarczający poziom fluorescencji podczas 45 cykli, próbka określana
jako dodatnia względem wykrywanego kwasu nukleinowego.
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Dostarczane materiały
SKU # M100
Zestaw do detekcji (96 reakcji) – Przechowywad w 2° do 8°C
#
Składnik
Ilośd


Roztwór do rehydratacji nr M5003
1 fiolka/zestaw 1,9 ml
Test Quidel Molecular Influenza A+B – Mieszanina Master Mix nr
M5004
12 fiolek/zestaw,
8 reakcji/fiolka
Zawartośd liofilizowana:
Enzym polimerazy DNA o aktywności odwrotnej transkryptazy
Startery i sondy
dNTPs
Stabilizatory
Kontrola procesu nr M5005
1 fiolka/zestaw 2,0 ml
Materiały opcjonalne
Kontrole pozytywne dla grypy typu A i grypy typu B (tj. zestaw kontrolny nr M106 dla testu Quidel Molecular
Influenza A+B, który służy jako zewnętrzna kontrola przetwarzania i ekstrakcji)
Materiały wymagane, ale nie dostarczone
Mikropipety (zakres od 1 do 10 μl oraz 100 do 1000 μl)
Koocówki pipet typu non-aerosol
TM
Urządzenie Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR lub urządzenie Applied Biosystems
7500 Fast Dx
96-studzienkowa płytka 7500 Fast Dx firmy Applied Biosystems
Folie płytki optycznej Applied Biosystems
Wirówka do płytek do 96-studzienkowych płytek ABI
Lub
Mikropipety (zakres od 1 do 10 μl oraz 100 do 1000 μl)
Koocówki pipet typu non-aerosol
SmartCycler® II
Elementy jednorazowego użytku SmartCycler
Wirówka SmartCycler
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Ostrzeżenia i środki ostrożności
Wyrób do diagnostyki in vitro
W razie podejrzenia zakażenia nową odmianą wirusa grypy typu A, opartego na aktualnych kryteriach
klinicznych i epidemiologicznych badao przesiewowych zalecanych przez organy zarządzające publiczną służbą
zdrowia, należy pobrad próbki zgodnie z odpowiednimi zaleceniami dotyczącymi kontroli zakażeo nowymi
odmianami wirusa grypy i przesład je do krajowych lub lokalnych wydziałów zdrowia w celu przebadania.
Charakterystykę tego testu określono wyłącznie dla typów próbek wymienionych w punkcie Przeznaczenie.
Nie oceniano działania tego testu dla innych typów próbek.
Nie walidowano stosowania systemów ekstrakcji innych niż NucliSENS easyMAG. Walidacja innych systemów
należy do zakresu odpowiedzialności użytkownika koocowego.
Stosowanie warunków cyklu innych niż wskazane w punkcie Instrukcja programowania termocyklera może dad
błędne wyniki.
Stosowanie tego produktu powinno byd ograniczone do personelu z odpowiednim przeszkoleniem w zakresie
technik PCR i RT-PCR.
Wszystkie próbki należy traktowad jak materiał potencjalnie zakaźny. Przy obchodzeniu się z próbkami,
niniejszym zestawem i jego zawartością należy stosowad uniwersalne środki ostrożności.
Właściwe pobieranie, przechowywanie i transport próbek mają zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia
prawidłowych wyników.
Przechowywad odczynniki zestawu w warunkach wskazanych na indywidualnych etykietach.
Podczas stosowania tego zestawu należy nosid odpowiednią odzież ochronną, rękawice oraz ochronę oczu
i twarzy.
Aby osiągnąd dokładne wyniki należy pipetowad ostrożnie, stosując wyłącznie kalibrowany sprzęt.
Dokładnie oczyścid i dezynfekowad wszystkie powierzchnie 10% roztworem podchlorynu sodu, a następnie
wodą o czystości molekularnej.
Przy wszystkich procedurach stosowad mikropipety z barierą zatrzymującą aerozole lub koocówki wyporowe
(z tłoczkiem).
Unikad skażenia mikrobiologicznego i krzyżowego odczynników zawartych w zestawie. Stosowad się do zasad
Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
Nie mieszad ze sobą odczynników pochodzących z zestawów o różnych numerach serii.
Nie stosowad z niniejszym zestawem odczynników pochodzących od innych producentów.
Nie stosowad produktu po upływie terminu ważności.
Prawidłowo zaplanowany tok pracy ma zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania ryzyka skażenia. Zawsze
należy planowad jednokierunkowy tok pracy w laboratorium, zaczynając od preamplifkacji, a następnie
wykonad amplifikację i wykrywanie.
W obszarach preamplifkacji i amplifikacji należy stosowad dedykowane materiały i sprzęt.
Nie dopuszczad do przemieszczania personelu ani sprzętu pomiędzy tymi obszarami.
Materiały do amplifikacji muszą byd przez cały czas trzymane osobno od materiałów do preamplifkacji.
Nie otwierad probówek z próbkami ani zamkniętych płytek po amplifikacji.
Usuwad amplifikowany materiał ostrożnie i zgodnie z obowiązującymi procedurami i przepisami, aby
zminimalizowad ryzyko skażenia amplikonami.
Nie używad materiałów przewidzianych do przygotowywania odczynników lub próbek w celu przetwarzania
docelowych kwasów nukleinowych.
Karta charakterystyki produktu (MSDS) jest dostępna na żądanie, jak również na stronie
internetowej produktu.
Przechowywanie i posługiwanie się odczynnikami zawartymi w zestawie
Przechowywad nieotwarty zestaw w lodowce (w temperaturze 2 do 8°C) do upływu terminu ważności
podanego na zewnętrznym opakowaniu zestawu.
Rehydratowaną mieszaninę Master Mix można przechowywad w temperaturze pokojowej (20 do 25°C) do
24 godzin. W celu dłuższego przechowywania rehydratowanej mieszaniny Master Mix należy ja zamknąd
w próbówce/fiolce, zabezpieczyd folią Parafilm i przechowad w pozycji pionowej w temperaturze ≤ -20°C do
14 dni. Podczas przechowywania chronid mieszaninę Master Mix przed światłem.
Oznaki niestabilności lub rozkładu odczynników: Zmętnienie roztworu do rehydratacji (Rehydration Solution)
może wskazywad na rozkład tego odczynnika. Skontaktowad się z Działem Pomocy Technicznej firmy Quidel w celu
wymiany odczynnika.
Strona 7 z 32
Pobieranie próbek, przechowywanie i obsługa
Próbki służące do zatwierdzenia testu Quidel Molecular Influenza A+B otrzymywano przy zastosowaniu
standardowych technik od pacjentów z objawami infekcji górnych dróg oddechowych. Próbki te były zbierane,
transportowane, przechowywane i przetwarzane zgodnie z CLSI M41-A.
Przechowywanie wyekstrahowanych kwasów nukleinowych
Walidacja procedur przechowywania i warunków panujących w laboratorium należy do zakresu odpowiedzialności
użytkownika. Eluaty można zwykle przechowywad w temperaturze pokojowej (20 do 25°C) przez 2 godziny,
w temperaturze 2–8°C przez 8 godzin, a w temperaturze -20°C do 70°C przez 1 miesiąc. Nie zaleca się
przechowywania małych objętości wyekstrahowanych kwasów nukleinowych (np. 5 μl lub mniej).
Instrukcja programowania ekstrakcji kwasów nukleinowych
1.
Włączyd urządzenie i poczekad, aż lampka
komputer/uruchomid oprogramowanie easyMAG.
zapali
się
2.
Po wciśnięciu przycisków „Urządzenie”
odczynników.
3.
Aby wprowadzid próbki, wcisnąd przycisk „Codzienne użycie”
na
pomaraoczowo.
i „Lista odczynników”
Następnie
włączyd
odczytad kody paskowe
, który domyślnie otworzy ekran
„Zdefiniuj zlecenie”
. Wybrad następujące ustawienia:
a. Identyfikator próbki:
Wprowadzid nazwę próbki przy użyciu klawiatury.
b. Macierz:
Wybrad Inna z rozwijanego menu
c. Żądanie:
Wybrad Ogólny z rozwijanego menu
d. Objętośd (ml):
Wybrad 0,200 z rozwijanego menu
e. Eluat (µl):
Wybrad 50 z rozwijanego menu
f. Typ:
Pierwotny
g. Priorytet:
Normalny
4.
Po wciśnięciu przycisku „Zapisz”
próbka pojawi się w okienku „Próbka nieprzydzielona” po lewej
stronie ekranu. Wcisnąd przycisk „Wprowadź nowe zlecenie ekstrakcji”
i powtórzyd powyższy proces
dla kolejnych próbek. Można też wprowadzid dodatkowe próbki, używając przycisku „Utwórz automatycznie
nowe zlecenia ekstrakcji”
5.
.
Po utworzeniu wszystkich próbek przejśd do funkcji „Organizuj procesy”, klikając ikonę
ekranu. Utworzyd proces, klikając przycisk „Utwórz proces”
nazwę domyślną.
6.
w górnej części
. Wprowadzid nazwę procesu lub wybrad
Dodad próbki do procesu, używając przycisku „Automatyczne uzupełnienie procesu”
(automatycznie
dodaje do procesu do 24 próbek z listy „Lista próbek nieprzydzielonych” po lewej stronie ekranu).
Alternatywnie, można dodawad do procesu i usuwad z niego poszczególne próbki, używając strzałek „W lewo”
lub „W prawo”
, po wybraniu odpowiedniej próbki. Kolejnośd próbek w procesie można
zmienid, używając przycisków „Przesuo zlecenie ekstrakcji w górę/w dół”
.
Strona 8 z 32
7.
8.
Pobrad 1 do 3 pojemników na próbki (dla, odpowiednio, 8 do 24 próbek) i dodad po 20 µl odczynnika Process
Control (Kontrola procesu) do każdej używanej studzienki na próbkę.
Dodad 180 µl każdej próbki do odpowiedniej wskazanej studzienki.
9.
Przejśd do okna „Załaduj proces”, naciskając przycisk
w górnej części ekranu. Umieścid w urządzeniu
koocówki i pojemnik/pojemniki z próbkami
10. Wprowadzid kod(y) paskowy(-e) pojemnika/pojemników z próbkami.
11. Wprowadzid kod(y) paskowy(-e) cząstek (kulek) krzemionki przewidzianych do użycia
12. Przydzielid cząstki krzemionki do próbek w następujący sposób:
a. Kliknąd symbol odczynnika poniżej cyfry 1 na zdjęciu poniżej. Numer serii cząstek krzemionki
powinien pojawid się poniżej zakładki Krzemionka w miejscu oznaczonym cyfrą 2 na zdjęciu poniżej.
b. Podświetlid i wybrad próbki w procesie, do których trzeba przydzielid cząstki krzemionki (w polu
oznaczonym cyfrą 3 na zdjęciu poniżej).
c.
d.
Kliknąd ikonę pozycjonującą
(oznaczoną cyfrą 4 na zdjęciu poniżej), aby przydzielid numer serii
cząstek krzemionki do wybranych próbek
Jeżeli wybrany zostanie symbol kulki na prawo od cyfry 5 na zdjęciu poniżej, numer serii cząstek
krzemionki powinien byd wyświetlony dla każdej próbki
13. Wydrukowad listę roboczą, dotykając ikony „Załaduj proces”, a następnie naciskając ikonę „Wydrukuj listę
roboczą”
.
14. Nacisnąd przycisk „Rozpocznij lizę”
. Przeprowadzenie lizy w urządzeniu zajmie około 12 minut.
15. Dla każdego pojemnika z próbkami przygotowad cząstki magnetyczne przy użyciu pipetora Biohit i koocówek
dla maksymalnie ośmiu reakcji, stosując następującą procedurę:
a. Przy użyciu 1 koocówki i stosując Program 1 pobrad 550 µl wody niezawierającej nukleaz i przenieśd ją
do probówki do mikrowirówki 1,5 ml niezawierającej DNAz ani RNAz.
b. Wymieszad zawiesinę cząstek magnetycznych krzemionki przy użyciu wstrząsarki (worteksu). Przy
użyciu 1 koocówki i stosując Program 1 pobrad 550 µl zawiesiny cząstek magnetycznych krzemionki,
przenieśd ją do probówki z wodą i wymieszad przy użyciu wstrząsarki.
c. Przy użyciu 1 koocówki i stosując Program 2 pobrad 1050 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi
krzemionki, i podad z powrotem 25 µl do tej samej próbówki.
d. Podad 8 razy po 125 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi krzemionki do 8 studzienek w płytce
ELISA. Wyrzucid koocówkę.
e. Po zakooczeniu lizy (UWAGA: pole „Status urządzenia” na dole ekranu musi wskazywad „IDLE”!), przy
użyciu 8 koocówek i stosując Program 3 pobrad 100 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi
krzemionki ze studzienek na płytce, podad 100 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi krzemionki
Strona 9 z 32
f.
do studzienek na płytce i pobrad 100 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi krzemionki ze
studzienek na płytce.
Wsunąd koocówki do płynu w pojemnikach na próbki. Pobrad 800 µl a następnie podad z powrotem
900 µl mieszaniny z cząstkami magnetycznymi krzemionki do pojemnika. Pobrad 1000 µl mieszaniny z
cząstkami magnetycznymi krzemionki, a następnie podad z powrotem 1000 µl mieszaniny z cząstkami
magnetycznymi krzemionki do pojemnika. Powtórzyd pobranie i podanie 1000 µl jeszcze dwa razy.
16. Zamknąd urządzenie i wcisnąd przycisk „Start”
, aby uruchomid proces.
17. Po zakooczeniu procesu przenieśd oczyszczone kwasy nukleinowe do probówek niezawierających nukleaz.
Wykorzystad oczyszczone kwasy nukleinowe natychmiast lub zamrozid je w temperaturze -70°C.
Ograniczenia: Następujący protokół opracowano specjalnie pod kątem stosowania z niniejszym testem. Nie
wiadomo, czy nadaje się do stosowania z innymi testami. Sprawdzid zgodnośd oprogramowania w firmie
bioMérieux S.A.
Wstępne programowanie termocyklera
Instrukcja programowania termocyklera SmartCycler II
1.
2.
Uruchomid oprogramowanie SmartCyclerDx, wersja 3.0b
Wprowadzid protokół testu Quidel Molecular Influenza A+B
a. Wybrad przycisk Zdefiniuj testy w górnej części ekranu
b. Utworzyd nazwę testu
i. Wybrad przycisk Nowy w dolnym lewym rogu ekranu
ii. Wpisad „Quidel Molecular Influenza A+B” i wybrad OK
iii. Test „Quidel Molecular Influenza A+B” zostanie dodany na górze listy Nazwa testu znajdującej się
w górnej lewej części ekranu
c. Ustawid wartości analizy: w punkcie Typ testu: Badawczy wybrad zakładkę Ustawienia analizy i upewnid
się, że wprowadzona jest następująca specyfikacja:
i. Wybrad opcję FATA25 z rozwijanego menu Ustaw barwnik
ii. W rozwijanym menu Typ analizy powinna byd ustawiona domyślna opcja Jakościowa (ustawienie
domyślne)
iii. W kolumnie Nazwa kanału wprowadzid „Influenza A” dla FAM, „Influenza B” dla Alx532 i „PRC” dla
Alx647
iv. W kolumnie Użycie wybrad Cel dla Influenza A i Influenza B, oraz Kontrola wewnętrzna dla PRC. Po
wybraniu przycisku Kontrola wewnętrzna wyskoczy widoczne poniżej okienko z ostrzeżeniem.
Wybrad przycisk Tak.
v. W kolumnie Analiza krzywej wprowadzid Krzywa pierwotna dla każdego kanału (Influenza A,
Influenza B, PRC) (ustawienie domyślne).
vi. W kolumnie Ustawienie progu wprowadzid Próg ręczny dla każdego kanału (Influenza A, Influenza
B, PRC) (ustawienie domyślne).
vii. W kolumnie Jednostki fluorescencji progu ręcznego wprowadzid następujące progi:
a. Influenza A:
20,0
b. Influenza B:
20,0
c. PRC:
20,0
Strona 10 z 32
viii. W kolumnie Ważny minimalny cykl wprowadzid 10 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B,
PRC).
ix. W kolumnie Ważny maksymalny cykl wprowadzid 45 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B,
PRC).
x. W kolumnie Odjęcie tła wybrad „ON” dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B, PRC) (ustawienie
domyślne).
xi. W kolumnie Minimalny cykl tła wprowadzid 5 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B, PRC)
(ustawienie domyślne).
xii. W kolumnie Maksymalny cykl tła wprowadzid 45 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B,
PRC).
xiii. W kolumnie Średnie cykle Boxcar zapisad 0 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B, PRC).
xiv. W kolumnie Próg punktu koocowego wprowadzid 20 dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B,
PRC) (ustawienie domyślne).
xv. W kolumnie NC IC% zapisad „Nie dotyczy” dla każdego kanału (PRC) (ustawienie domyślne).
xvi. W kolumnie IC Delta zapisad „Nie dotyczy” dla każdego kanału (Influenza A, Influenza B)
(ustawienie domyślne).
xvii. W kolumnie Dostosuj tekst wyników (pod tabelą), wybrad opcję Tekst wyników w oparciu o
mikroorganizmy z rozwijanego menu. Wyskoczy widoczne poniżej okienko z ostrzeżeniem Wybrad
Tak.
xviii. Wybrad przycisk Dostosuj, aby otworzyd okno dialogowe Tekst wyników w oparciu o
mikroorganizmy. Wybrad przycisk Dodaj, wprowadzid „Influenza A” w kolumnie Nazwa organizmu
i zaznaczyd pole wyboru Influenza A. Wybrad przycisk Dodaj ponownie, wprowadzid „Influenza B”
w kolumnie Nazwa organizmu i zaznaczyd pole wyboru Influenza B.
d.
Kliknąd OK na dole okienka
Ustawid na dole ekranu następujące czasy i temperatury cyklu RT-PCR:
i. Etap 1
1. Hold
2. Temp:
55,0
3. Sekund:
300
4. Optyka:
OFF
ii. Etap 2
1. Hold
2. Temp:
60,0
Strona 11 z 32
3.
4.
Sekund:
Optyka:
300
OFF
1.
2.
3.
4.
Hold
Temp:
Sekund:
Optyka:
300
OFF
iii. Etap 3
65,0
iv. Etap 4
1.
2.
3.
3.
Cykl 2-temperaturowy
Czas do powtórzenia: 50
Pierwszy zakres temperatur:
a. Temp:
92,0
b. Sekund:
5
c. Optyka:
OFF
4. Drugi zakres temperatur:
a. Temp:
57,0
b. Sekund:
40
c. Optyka:
ON
Zapisad protokół przy użyciu przycisku Zapisz w dolnej części ekranu
Zrzut z ekranu przedstawiający ukooczony protokół testu Quidel Molecular Influenza A+B
Ograniczenia: Następujący protokół opracowano specjalnie pod kątem stosowania z molekularnym testem Quidel
Molecular Influenza A+B Real-time RT-PCR. Nie wiadomo, czy nadaje się do stosowania z innymi testami. Sprawdzid
zgodnośd oprogramowania w firmie Cepheid.
Instrukcja programowania termocyklera 7500 Fast Dx
1.
2.
Uruchomid oprogramowanie 7500 Fast Dx.
Otworzy się okno dialogowe Szybkie uruchomienie dokumentu. Wybrad przycisk Utwórz nowy dokument,
aby uruchomid funkcję Kreator nowego dokumentu. Wykonad wszystkie poniższe kroki, aby uruchomid
protokół testu Quidel Molecular Influenza A+B.
a. Zdefiniowad dokument: w większości z poniższych pozycji należy stosowad ustawienia domyślne.
W przeciwnym razie należy je odpowiednio zmodyfikowad.
Strona 12 z 32
i. Potwierdzid lub wprowadzid następujące informacje.
b.
Test:
Standardowa krzywa (Bezwzględne oznaczenie
ilościowe)
Pojemnik:
Przezroczysta płytka 96-studzienkowa
Matryca:
Pusty dokument
Tryb procesu:
Fast 7500
Operator:
Imię i nazwisko operatora
Uwagi:
SDS v1.4
(w razie potrzeby wprowadzid dodatkowe uwagi)
Nazwa płytki:
„Quidel Molecular Influenza A+B”
ii. Wybrad przycisk Dalej.
Wybrad detektory: Należy dodad detektory dla Influenza A, Influenza B i kontroli procesu (PRC). Dla
każdego celu wybrad przycisk Nowy detektor, aby otworzyd wyskakujące okienko Nowy detektor.
Można też użyd przycisku Utwórz kolejny w okienku Nowy detektor dla dwóch ostatnich detektorów.
i. Wprowadzid następujące informacje dla każdego detektora
Nazwa
Barwnik reporterowy
Barwnik wygaszający
Grypa typu A
FAM
(żaden)
Grypa typu B
JOE
(żaden)
PRC
Cy5
(żaden)
c.
d.
Kolor
(Wybrad)
(Wybrad)
(Wybrad)
ii. Wybrad unikatowy kolor reprezentujący każdy detektor.
iii. Podświetlid nowe detektory i dodad je do kolumny Detektory w dokumencie przy użyciu
przycisku Dodaj.
iv. Wybrad opcję (żaden) z rozwijanego menu Bierne odniesienie.
v. Wybrad przycisk Dalej.
vi. Wybrad przycisk Zakoocz bez ustawiania jakichkolwiek studzienek.
Okno kreatora zamknie się i otworzy się oprogramowanie, zaczynając od zakładki Konfiguracja.
Spowoduje to wyświetlenie płytki z próbkami skonfigurowanej podczas szybkiego uruchamiania. Przy
wstępnej konfiguracji nie ma konieczności wprowadzania tutaj zmian.
Definiowanie protokołu termocyklera: Wybrad zakładkę Urządzenie, aby ustawid czasy cyklu i
temperatury testu Influenza A+B RT-PCR firmy Quidel Molecular. W zakładce Profil termiczny
powinien byd domyślnie ustawiony protokół dwuetapowy. Każdy etap ma 3 edytowalne przez
użytkownika pola tekstowe. Wartośd w górnym polu wskazuje liczbę cykli lub powtórzeo w danym
etapie. Wartośd w środkowym polu wskazuje temperaturę (w ˚C), a w dolnym polu – czas (minuty:
sekundy).
Strona 13 z 32
i. Wprowadzid następujące zmiany w domyślnych ustawieniach Protokół termocyklera:
1. Etap 1
a. Powtórzenia:
1
b. Temp:
55
c. Czas:
5:00
2. Wybrad pasek pomiędzy „Etap 1” a „Etap 2”. Wybrad przycisk Dodaj Hold, aby
dodad kolejny etap.
3. Etap 2
a. Powtórzenia:
1
b. Temp:
60
c. Czas:
5:00
4. Wybrad pasek pomiędzy „Etap 2” a „Etap 3”. Wybrad przycisk Dodaj Hold, aby
dodad kolejny etap.
5. Etap 3
a. Powtórzenia:
1
b. Temp:
65
c. Czas:
5:00
6. (Etap 4) (2-stopniowy etap dysocjacji)
a. Powtórzenia: 10
b. Etap 1
i. Temp:
92
ii. Czas:
0:05
c. Etap 2
i. Temp:
57
ii. Czas:
0:40
7. Wybrad pasek na prawo od „Etap 4”. Wybrad przycisk Dodaj cykl, aby dodad kolejny
etap.
8. Etap 5 (2-stopniowy etap dysocjacji)
a. Powtórzenia: 35
b. Etap 1
i. Temp:
92
ii. Czas:
0:05
c. Etap 2
i. Temp:
57
ii. Czas:
0:40
9. W przypadku dodania błędnego etapu można go usunąd, naciskając przycisk Usuo
po podświetleniu etapu znajdującego się pomiędzy pionowymi liniami
ii. W części Ustawienia wprowadzid następujące dane:
Objętośd próbki (μl):
20 (domyślnie)
Tryb procesu:
Szybki 7500 (domyślnie)
Zbieranie danych:
Etap 5, Stopieo 2 (57.0 @ 0:40)
UWAGA: Nie zaznaczad pola wyboru obok opcji „Tryb Ekspert”.
iii. Protokół koocowy
Strona 14 z 32
e.
Ustawid próg dla każdego analitu
i. Wybrad zakładkę Wyniki.
ii. Wybrad zakładkę Wykres amplifikacji.
iii. Wybrad „Influenza A” z zakładki Detektor w górnym prawym rogu.
iv. W części Ustawienia analizy ustawid Próg na 1.5e5.
v. Zaznaczyd przycisk radiowy Automatyczna linia bazowa.
vi. Powtórzyd kroki iii-v dla „Influenza B”, ustawiając Próg na 1.2e5.
vii. Powtórzyd kroki iii-v dla „PRC”, ustawiając Próg na 2.7e4.
f.
Zapisad nowy protokół jako szablon w celu późniejszego użycia.
i. W górnej części ekranu wybrad Plik, a następnie Zapisz jako.
ii. Zapisad w lokalizacji: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nazwa pliku: „Quidel Molecular Influenza A+B”
iv. Zapisad jako typ: „SDS Templates (*.sdt)”
Wyjśd z programu.
g.
Ograniczenia: Następujący protokół opracowano specjalnie pod kątem stosowania z niniejszym testem. Nie
wiadomo, czy nadaje się do stosowania z innymi testami. Sprawdzid zgodnośd oprogramowania w firmie
Life Technologies.
Strona 15 z 32
Instrukcje programowania urządzenia Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR
Programowanie urządzenia wykonuje się przy użyciu pliku TDD, który jest dołączony do zestawu testu.
Procedura testu
Przeprowadzid poniższe procedury w kontrolowanej temperaturze pokojowej (20 do 25°C).
Procedura ekstrakcji kwasów nukleinowych
Odnieśd się do podanej powyżej instrukcji programowania systemu NucliSENS easyMAG.
1. Dodad 20 µl odczynnika Process Control (Kontrola procesu) do studzienki do ekstrakcji próbki.
2. Dodad 180 µl próbki pobranej od pacjenta do studzienki do ekstrakcji próbki.
3. Przeprowadzid ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta.
Procedura rehydratowania mieszaniny Master Mix
1. Określid liczbę próbek przewidzianych do testowania i pobrad odpowiednią liczbę fiolek z liofilizowaną
mieszaniną Master Mix (jedna fiolka na osiem testów).
2. Odłożyd niezużyte odczynniki z powrotem, do przechowywania w odpowiednich warunkach.
3. Otworzyd ostrożnie fiolkę z mieszaniną Master Mix, aby uniknąd naruszenia osadu.
4. Dodad do mieszaniny Master Mix 135 µl roztworu do rehydratacji.
5. Pozostawid fiolkę w temperaturze pokojowej na 1–2 minuty, aby umożliwid rehydratację osadu.
6. Przed przeniesieniem pierwszej porcji do próbówki PCR lub studzienki w płytce pobrad i wycofad
mieszaninę pipetą 2–3 razy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.
Uwaga: Rehydratowana mieszanina Master Mix wystarcza na osiem reakcji.
Uwaga: Rehydratowana mieszanina Master Mix może byd przechowywana w temperaturze pokojowej do
24 godzin lub w temperaturze ≤ -20°C przez okres do 14 dni (dodatkowe możliwości przechowywania
podane są w punkcie „Przechowywanie i obchodzenie się z odczynnikami zawartymi w zestawie”).
Procedura przygotowania reakcji RT-PCR:
1. Dodad 15 µl z rehydratowanego roztworu Master Mix do każdej probówki reakcyjnej lub studzienki płytki.
2. Dodad 5 µl wyekstrahowanych kwasów nukleinowych (próbka z odczynnikiem Process Control
(Kontrola procesu)) do każdej próbówki reakcyjnej lub studzienki w płytce. Nie ma konieczności
mieszania odczynników.
Uwaga: Do każdej wyekstrahowanej próbki należy użyd nowego mikropipetora z koocówką z barierą
zatrzymującą aerozole.
3. Zamknąd próbówki reakcyjne lub zabezpieczyd płytkę folią.
Uwaga: Firma Quidel sugeruje, aby każdy proces termocyklera zawierał także próbówkę reakcyjną lub
studzienkę z zewnętrzną kontrolą dodatnią i ujemną dla wirusa grypy typu A/typu B. Kontrole należy
poddad testowi zgodnie z przyjętą w danym ośrodku praktyką i procedurami laboratoryjnymi.
4. Wirowad próbówki reakcyjne lub płytkę przez co najmniej 15 sekund. Upewnid się, że cała ciecz znajduje
się na dnie próbówki.
5. Umieścid próbówki lub płytkę w termocyklerze.
Protokół amplifikacji w termocyklerze SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Włączyd blok/bloki SmartCycler
Uruchomid oprogramowanie SmartCycler Dx, wersja 3.0b
Wybrad przycisk Utwórz proces w górnej części ekranu, aby ustawid proces
W polu Nazwa procesu, wprowadzid nazwę aktualnego procesu (RRMMDD-Quidel Molecular Influenza
A+B)
W polu Uwagi, wprowadzid dowolne uwagi na temat procesu do odniesienia w przyszłości
W polu Test wybrad z rozwijanego menu test „Quidel Molecular Influenza A+B”
W polu Informacje nt. testu wprowadzid numer serii i termin ważności zestawu.
Aby wybrad studzienki, jakie mają byd używane, wykonad jeden z poniższych kroków:
a. Aby automatycznie przydzielid studzienki, wykonad następujące czynności:
i. W polu tekstowym Liczba próbek wprowadzid liczbę próbek.
ii. Wybrad przycisk Zastosuj. Wprowadzona liczba rzędów pojawi się w polu Tabela miejsc.
b. Aby ręcznie zamknąd studzienki w blokach SmartCycler, wykonad następujące czynności:
i. Wybrad przycisk Dodaj/Usuo miejsca w dolnej części ekranu.
Strona 16 z 32
9.
10.
11.
12.
13.
ii. Otworzy to okno kontekstowe Wybierz miejsca z dwoma kolumnami. W lewej kolumnie
(Miejsca) wyświetlona jest lista dostępnych miejsc, a w prawej kolumnie (Wybory) wszystkie
wybrane miejsca.
iii. Aby wybrad wszystkie miejsca, kliknąd przycisk Wybierz wszystkie miejsca.
iv. Aby wybrad konkretne miejsca, podświetlid jedno lub więcej miejsc i użyd strzałki w prawo, aby
dodad miejsce/miejsca do kolumny Wybory.
v. Wybrad przycisk OK, aby zamknąd okno. Wybrane miejsca pojawią się w polu Tabela miejsc.
Wprowadzid numery identyfikacyjne próbek w kolumnie Identyfikator próbki w obrębie pola Tabela
miejsc (można to zrobid także po uruchomieniu procesu).
Wprowadzid dowolne uwagi w kolumnie Uwagi, a w kolumnie Typ próbki pozostawid wpis „SPEC”.
Wybrad przycisk Uruchom proces w dolnej części ekranu.
Wybrad przycisk Wyświetl wyniki, aby obserwowad postępy procesu.
Zapisad proces po jego zakooczeniu, a przed wyjściem z programu.
Protokół amplifikacji w termocyklerze ABI 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Włączyd termocykler ABI 7500 Fast Dx.
Uruchomid oprogramowanie ABI 7500 Fast Dx.
Otworzy się okno dialogowe Szybkie uruchomienie dokumentu.
Kliknąd Utwórz nowy dokument.
W większości z poniższych pozycji należy stosowad ustawienia domyślne. W przeciwnym razie należy je
odpowiednio zmodyfikowad.
Test:
Standardowa krzywa (Bezwzględne oznaczenie
ilościowe)
Pojemnik:
Przezroczysta płytka 96-studzienkowa
Matryca:
Tryb procesu:
Szybki 7500
Operator:
Imię i nazwisko operatora
Uwagi:
SDS v1.4
(w razie potrzeby wprowadzid dodatkowe uwagi)
Nazwa płytki:
RRMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Ustawienie płytki z próbkami
a. W zakładkach Konfiguracja i Płytka wyświetli się menu ustawienia płytki.
b. Wybrad wszystkie studzienki zawierające próbki, kliknąd prawym klawiszem myszy i wybrad opcję
Inspektor studzienek z rozwijanego menu. Gdy otworzy się okno kontekstowe Inspektor studzienek,
wybrad detektory dla wirusa grypy typu A, typu B i PRC.
c. Użyd okna Inspektor studzienek, aby wprowadzid nazwy próbek. W oknie Inspektor studzienek
można też wprowadzid numery identyfikacyjne pacjentów; jednakże zaleca się, aby dokonad tego
przed rekonstytuowaniem liofilizowanej mieszaniny Master mix, po procesie lub korzystając z funkcji
importu, aby zminimalizowad czas, w którym reakcje PCR, będą pozostawad w temperaturze
pokojowej przed uruchomieniem procesu.
d. Zapisad proces jako RRMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
e. Wyświetli się okno pytające o „Przyczyna zmiany wpisu”. Wprowadzid „Konfiguracja” i inne uwagi
odnoszące się do procesu.
Uruchomienie PCR
a. Wybrad zakładkę Urządzenie.
b. Włożyd 96-studzienkową płytkę PCR do urządzenia.
c. W menu Sterowanie urządzeniem wybrad przycisk Start, aby uruchomid proces.
Po zakooczeniu reakcji PCR
Strona 17 z 32
a.
b.
WAŻNE: Po zakooczeniu procesu nacisnąd OK. Uruchomid analizę danych, naciskając przycisk
„Analizuj” w górnym menu i zapisad plik.
Zapisad plik, naciskając przycisk Zapisz dokument w pasku zadao. Wyświetli się okno pytające o
„Przyczyna zmiany wpisu”. Wprowadzid „Analiza danych po zakooczeniu procesu” i inne uwagi
Protokół amplifikacji w urządzeniu do Real-Time PCR QuantStudio Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Włączyd QuantStudio Dx.
Wybrad tryb IVD na urządzeniu.
Uruchomid pakiet oprogramowania QuantStudio Dx IVD.
Wprowadzid do systemu Nazwę użytkownika oraz Hasło po wyświetleniu monitu.
Otworzy się okno Ekran startowy.
W oknie Konfiguracja podświetlid nazwę załadowanego wcześniej testu „Quidel Molecular Influenza A +
B”
Kliknąd przycisk Konfiguracja, aby rozpocząd proces.
Wyświetlony zostanie ekran Konfiguracja, właściwości testu. Wprowadzid odpowiednio informacje nt.
procesu.
a. Wprowadzid Nazwę eksperymentu (ustawienie domyślne uruchamia proces z datą i godziną).
b. Wprowadzid informacje Kod kreskowy płytki.
c. Odnotowad numery serii materiałów w polu Informacje nt. odczynnika.
d. Zapisad proces jako RRMMDD-Quidel Molecular Influenza A + B.sds.
e. Wyświetli się okno z pytaniem o „Przyczyna zmiany wpisu”. Wprowadzid „Konfiguracja” i inne uwagi
W pasku menu po lewej stronie wybrad Zdefiniuj.
Edytowad informacje nt. próbki.
a. Wprowadzid swoiste dla próbki informacje dla każdej studzienki przez usunięcie domyślnego
identyfikatora (Pacjent 1, Pacjent 2 itp.) i wprowadzenie nowych informacji; LUB
b. Wybrad Importuj z pliku w górnej części wyświetlacza, aby załadowad wstępnie zdefiniowaną mapę
płytki z pliku tekstowego (rozdzielanego tabulatorami).
Z paska menu po lewej stronie wybrad Przydziel w celu weryfikacji prawidłowej konfiguracji płytki.
Ładowanie płytki na próbki.
a. Wysunąd tacę urządzenia.
b. Włożyd 96-studzienkową płytkę PCR do urządzenia, umieszczając studzienkę A1 w lewym
górnym rogu.
c. Wycofad tacę urządzenia.
Rozpoczynanie procesu.
a. Z paska menu po lewej stronie wybrad Proces.
b. Kliknąd zielony przycisk Uruchom proces w górnej części ekranu.
i. Jeżeli pojawi się monit, wybrad numer serii swoisty dla używanego urządzenia.
Po zakooczeniu procesu wybrad Analiza z paska menu po lewej stronie.
a. Zachowad plik przez naciśnięcie przycisku Zapisz na pasku zadao. Wyświetli się okno pytające o
„Przyczyna zmiany wpisu”. Wprowadzid „Analiza danych po zakooczeniu procesu” i inne uwagi
b. Zostanie domyślnie wyświetlony Wykres amplifikacji. Aby obejrzed inne typy wykresów, należy
wybrad je z paska menu po lewej stronie.
c. Aby obejrzed informacje nt. procesu z wartościami Ct, wybrad zakładkę Tabela studzienek z prawej
strony ekranu.
Drukowanie raportu.
a. W górnym pasku menu, wybrad Drukuj raport. Dostosowad zawartośd raportu, zaznaczając lub
odznaczając pola w oknie raportu.
b. Wybrad przycisk „Drukuj raport” w dolnej części okna dialogowego.
Eksportowanie plików z danymi.
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a.
b.
c.
d.
e.
f.
Z paska menu po lewej stronie wybrad Eksportuj.
Wprowadzid Lokalizacja eksportowanego pliku LUB kliknąd Przeglądaj, aby odszukad żądaną ścieżkę.
Nazwa eksportowanego pliku będzie domyślna dla tej z zapisanego procesu.
Wybrad Excel jako typ pliku.
Dostosowad eksportowany raport danych poprzez przełączanie zapewnionych zakładek i zaznaczanie
lub odznaczanie opcji.
Wybrad Uruchom eksport w dolnej części ekranu.
Interpretacja wyników
Interpretacja wyników przy użyciu termocyklera SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Po zakooczeniu procesu wybrad zakładkę Wyświetl wyniki.
Wybrad zakładkę Wyniki próbek.
Oprogramowanie SmartCycler automatycznie poinformuje, czy próbki są ujemne czy dodatnie
w odniesieniu do wirusa grypy lub czy proces był nieważny (nierozpoznane).
Dokładniejsze informacje znajdują się w zakładkach odpowiadających każdemu analitowi w tym samym
oknie. Jeżeli wyświetli się dodatni wynik dla wirusa grypy typu A lub B (lub obu), wynik PRC nie będzie
mied zastosowania. PRC wymagana jest tylko dla ujemnych wyników.
Interpretacja wyników testu Quidel Molecular Influenza A+B wydrukowanych przez termocykler
SmartCycler II
Wynik testu
Wynik
kontroli
procesu
Ujemny
Zaliczony
Dodatni dla wirusa
grypy typu A
Dodatni dla wirusa
grypy typu B
Dodatni dla wirusa
grypy typu A i
typu B
N/D*
N/D*
N/D*
Grypa typu
A
Grypa typu
B
NEG
(ujemny)
POS
(dodatni)
NEG
(ujemny)
NEG
(ujemny)
NEG
(ujemny)
POS
(dodatni)
Nie wykryto kwasów nukleinowych wirusa
grypy typu A ani typu B; wykryto PRC
Wykryto kwas nukleinowy wirusa grypy
typu A
typu B
POS
(dodatni)
POS
(dodatni)
typu A i typu B
Nie rozpoznano – zahamowanie PCR lub
niewłaściwe działanie odczynnika. Powtórzyd
NEG
NEG
Nieważny
Niezaliczony
test od poziomu wyekstrahowanych kwasów
(ujemny)
(ujemny)
nukleinowych lub pobrad i poddad testowi
nową próbkę.
*Wskazanie dodatniego wyniku nie wymaga wartości wyniku kontroli procesu.
Kod błędu 3079: Ostrzeżenie/kod błędu 3079 może się pojawid przy próbkach dodatnich dla wirusa grypy typu A
i typu B. Ostrzeżenie/kod błędu 3079 pojawia się, gdy sygnał fluorescencji (RFU) jest zbyt wysoki. W takiej sytuacji
oprogramowanie Dx wyświetli wszystkie wyniki danej próbki jako ND (Not Determined – nieoznaczone). Jeżeli
wartośd Ct ≥ 10 lub ≤ 45 zostanie stwierdzona dla wirusa grypy typu A lub typu B, wyniki dla danej próbki zostaną
zapisane jako POS dla wirusa grypy typu A lub typu B.
Interpretacja wyników przy użyciu termocyklera 7500 Fast Dx
Interpretacja wyników testu Quidel Molecular Influenza A+B na termocyklerze 7500 Fast Dx
Wynik testu
Detektor:
Wirus grypy
typu A
Detektor:
Wirus grypy
typu B
Detektor:
Kontrola
procesu
Ujemny
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Dodatni dla wirusa
grypy typu A
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
N/D*
Nie wykryto kwasów nukleinowych
wirusa grypy typu A ani typu B;
wykryto PRC
Wykryto kwas nukleinowy wirusa
grypy typu A
Strona 19 z 32
Interpretacja wyników testu Quidel Molecular Influenza A+B na termocyklerze 7500 Fast Dx
Wynik testu
Detektor:
Wirus grypy
typu A
Detektor:
Wirus grypy
typu B
Detektor:
Kontrola
procesu
Dodatni dla wirusa
grypy typu B
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
N/D*
grypy typu B
Dodatni dla wirusa
grypy typu A i
typu B
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
N/D*
grypy typu A i typu B
wirusa grypy typu A ani typu B czy PRC;
Nieważny
nieprawidłowy proces, powtórzyd
proces lub powtórzyd ekstrakcję
Nie oznaczono, powtórzyd proces lub
Nieważny
Nieoznaczony Nieoznaczony
Nieoznaczony
powtórzyd ekstrakcję
*Określenie dodatniego wyniku nie wymaga wartości Ct dla kontroli procesu.
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
Ct < 5,0 lub
Ct > 35,0
Interpretacja wyników przy użyciu urządzenia QuantStudio Dx Real-Time PCR
Interpretacja wyników testu Quidel Molecular Influenza A+B na urządzeniu QuantStudio Dx
Real-Time PCR
Wynik testu
Detektor:
Wirus grypy
typu A
Detektor:
Wirus grypy
typu B
Ujemny
Nie podano Ct
(puste miejsce)
Nie podano Ct
(puste miejsce)
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
Nie podano Ct
(puste miejsce)
N/D*
grypy typu A
Nie podano Ct
(puste miejsce)
Ct ≤40,0
N/D*
grypy typu B
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
N/D*
grypy typu A i typu B
Dodatni dla
wirusa grypy
typu A
Dodatni dla
wirusa grypy
typu B
Dodatni dla
wirusa grypy
typu A i typu B
Detektor:
Kontrola
procesu
wirusa grypy typu A ani typu B;
wykryto PRC
wirusa grypy typu A ani typu B
Nie podano Ct
Nie podano Ct
Nie podano Ct
Nieważny
czy PRC; nieprawidłowy proces,
(puste miejsce)
(puste miejsce) (puste miejsce)
powtórzyd proces lub
powtórzyd ekstrakcję
*Określenie dodatniego wyniku nie wymaga wartości Ct dla kontroli procesu.
Strona 20 z 32
Kontrola jakości
Test Quidel Molecular Influenza A+B obejmuje kilka kontroli monitorujących działanie testu.
1.
2.
3.
W przebiegu testu podczas etapów ekstrakcji i amplifikacji należy stosowad odczynnik Process Control
(Kontrola procesu). Kontrolę tę należy dodad do każdej podzielonej próbki przed ekstrakcją.
Dostępne na rynku zewnętrzne kontrole dodatnie dla wirusa grypy typu A/B mogą byd poddane testowi tak,
jak próbki pacjentów; należy je stosowad zgodnie z procedurami przyjętymi w danym laboratorium. Zamiast
komercyjnych kontroli dla wirusa grypy typu A/B można stosowad próbki zidentyfikowane uprzednio jako
dodatnie pod kątem wirusa typu A lub typu B.
Jako zewnętrzną kontrolę ujemną można zastosowad podłoże transportowe do wirusów lub próbkę uprzednio
zidentyfikowaną jako ujemna. Kontrola taka musi byd poddana testowi tak, jak próbka pacjenta, zgodnie
z procedurami przyjętymi w danym laboratorium.
Ograniczenia
Test ten nie jest przewidziany do różnicowania podtypów wirusa grypy typu A, takich jak nowy wirus A H1N1.
W razie konieczności różnicowania podtypów należy przeprowadzid dalsze testy.
Ujemne wyniki testu nie wykluczają zakażenia wirusem grypy i nie powinny byd jedyną podstawą
podejmowania decyzji terapeutycznych.
Podobnie jak przy innych testach tego typu, istnieje ryzyko fałszywie dodatnich wyników spowodowanych
obecnością wariantów sekwencji w wirusie docelowym.
Nieprawidłowa technika pobierania próbki lub nieprawidłowe warunki przechowywania lub transportu mogą
spowodowad fałszywie ujemne wyniki.
Inhibitory obecne w próbce i/lub błędy w przeprowadzaniu procedury testu mogą spowodowad fałszywie
ujemne wyniki.
Skutecznośd kliniczna
Charakterystykę skuteczności testu Quidel Molecular Influenza A+B wyznaczano w czasie badania prospektywnego
w trakcie sezonu infekcji wirusami układu oddechowego w 2011 roku (od stycznia do marca). Próbki stosowane
w tym badaniu były próbkami wymazów z nosa i nosogardła, które zostały pobrane do rutynowych badao grypy.
Metodą referencyjną była szybka kultura (typu shell vial), z następczym bezpośrednim badaniem przesiewowym
i identyfikacją za pomocą przeciwciała fluorescencyjnego (DFA).
Testowano łącznie 637 próbek wymazów, za pomocą testu Quidel Molecular Influenza A+B i poprzez hodowlę.
Sześd (6) próbek, dla których nie uzyskano początkowo rozstrzygających wyników pozostało nierozstrzygnięte
po ponownych badaniach za pomocą testu Quidel Molecular Influenza A+B i nie uwzględniono ich w
poniższej analizie.
Ogółem, 6 próbek było dodatnich dla DFA — badania przesiewowego wirusów układu oddechowego (odczynnik do
badao przesiewowych wykrywa grypę typu A i B, RSV, paragrypę 1, 2 i 3, oraz adenowirusa), ale zawierało zbyt
mało komórek, aby uzyskad określoną identyfikację dodatnią. Ogółem 3 próbki były toksyczne w kulturze
komórkowej. Tych 9 próbek nie uwzględniono w poniższej analizie.
Wykonywano analizę sprzeczności dla próbek, dla których nie uzyskano zgodnych wyników w teście Quidel
Molecular Influenza A+B oraz kulturze, przy użyciu testu RT-PCR z oznakowaniem CE, a w stosownych przypadkach
stosowano sekwencjonowanie dwukierunkowe.
Strona 21 z 32
Grypa typu A
Świeży wymaz
z nosa/nosogardła (N=622)
Test Quidel Molecular
Influenza A+B
Dodatni
Układ do porównao: Kultura z DFA
Dodatni
Ujemny
Ogółem
93
18*
111
Ujemny
1**
510
511
Ogółem
94
528
622
95% CI
Czułośd
93/94
98,9%
94,2% do 100%
Swoistośd
510/528
96,6%
94,7% do 98,0%
*17 z tych próbek było dodatnich dla grypy typu A według urządzenia CE-IVD.
Pozostała 1 próbka była ujemna dla grypy typu A według urządzenia CE-IVD, ale
dodatnia dla grypy typu A według analizy sekwencyjnej
** Próbka była również ujemna dla grypy typu A według urządzenia CE-IVD.
Grypa typu B
Świeży wymaz
Influenza A+B
Dodatni
Układ do porównao: Kultura z DFA
Dodatni
Ujemny
Ogółem
74
7*
81
Ujemny
2**
539
541
Ogółem
76
546
622
95% CI
Czułośd
74/76
97,4%
90,8% do 99,7%
Swoistośd
539/546
98,7%
97,4% do 99,5%
*5 próbek było dodatnich dla grypy typu B według urządzenia CE-IVD, 2 próbki były
ujemne dla grypy typu B według urządzenia CE-IVD, ale dodatnie dla wirusa grypy
typu B według analizy sekwencyjnej
**1 próbka była dodatnia dla grypy typu B według urządzenia CE-IVD, 1 próbka była
ujemna dla grypy typu B według urządzenia CE-IVD
Strona 22 z 32
Testowano ogółem 626 próbek wymazów za pomocą testu Quidel Molecular Influenza A+B oraz oznaczonego
znakiem CE testu IVD RT-PCR. Sześd (6) próbek, dla których nie uzyskano początkowo rozstrzygających wyników
pozostało nierozstrzygnięte po ponownych badaniach za pomocą obu testów i nie uwzględniono ich w poniższej
analizie. Dla dodatkowych 10 próbek nie uzyskano rozstrzygających wyników w teście IVD RT-PCR oznakowanym
znakiem CE, pozostały one nierozstrzygnięte po ponownych badaniach za pomocą tego testu, i nie uwzględniono
ich w poniższej analizie. Wykonywano analizę sprzeczności dla próbek, dla których nie uzyskano zgodnych wyników
w teście Quidel Molecular Influenza A+B oraz teście IVD RT-PCR oznakowanym znakiem CE, z zastosowaniem
sekwencjonowania.
Grypa typu A
Świeży wymaz
Influenza A+B
Układ do porównao: Urządzenie CE-IVD
Dodatni
Ujemny
Ogółem
Dodatni
107
3*
110
Ujemny
0
500
500
Ogółem
107
503
610
95% CI
Czułośd
107/107
100%
96,6% do 100%
Swoistośd
500/503
99,4%
98,3% do 99,9%
*3 próbki były dodatnie dla wirusa grypy typu A według analizy sekwencyjnej
Grypa typu B
Świeży wymaz
Influenza A+B
Układ do porównao: Urządzenie CE-IVD
Dodatni
Ujemny
Ogółem
Dodatni
77
5*
82
Ujemny
4**
524
528
Ogółem
81
529
610
95% CI
Czułośd
Swoistośd
77/81
95,1%
87,8% do 98,6%
524/529
99,1%
97,8% do 99,7%
*5 próbek były dodatnich dla wirusa grypy typu B według analizy sekwencyjnej
**4 próbki były ujemne dla wirusa grypy typu B według analizy sekwencyjnej
Strona 23 z 32
Podzbiór dwustu jedenastu (211) próbek z powyższego testu badano za pomocą urządzenia QuantStudio Dx RealTime PCR. Wynik tego testowania porównywano do danych z testu prowadzonego równolegle na ABI 7500 Fast Dx.
Porównanie to zamieszczono poniżej.
Test Quidel Molecular Influenza A+B
Grypa typu A
Układ do porównao: ABI 7500 Fast Dx
Urządzenie QuantStudio Dx
Real-Time PCR
Dodatni
Ujemny
Ogółem
Dodatni
63
0
63
Ujemny
0
148
148
Ogółem
63
148
211
95% CI
Czułośd
Swoistośd
63/63
100%
94,3% do 100%
148/148
100%
97,5% do 100%
Test Quidel Molecular Influenza A+B
Grypa typu B
Układ do porównao: ABI 7500 Fast Dx
Urządzenie QuantStudio Dx
Real-Time PCR
Dodatni
Ujemny
Ogółem
Dodatni
28
0
28
Ujemny
0
183
183
Ogółem
28
183
211
95% CI
Czułośd
Swoistośd
28/28
100%
87,9% do 100%
183/183
100%
97,9% do 100%
Wydajnośd analityczna
Poziom wykrywalności
Czułośd analityczną (granicę wykrywalności lub LOD) w teście Quidel Molecular Influenza A+B określono za
pomocą scharakteryzowanych ilościowo (TCID50/ml) kultur 3 szczepów wirusa grypy typu A (1 H1N1, 1 2009H1N1
i 1 H3N2), 3 szczepów wirusa grypy typu B, rozcieoczonych w ujemnej macierzy z nosogardła. Każde rozcieoczenie
ekstrahowano za pomocą systemu NucliSENS easyMAG i testowano w 20 powtórzeniach pod kątem stężenia
wirusa na obu platformach 7500 Fast Dx lub Cepheid SmartCycler® II firmy Applied Biosystems®. Czułośd
analityczną (LoD) definiuje się jako najniższe stężenie, przy którym 95% wszystkich powtórzeo daje pozytywny
wynik.
Poziom wykrywalności
Szczep
Koocowy TCID50/ml LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Meksyk/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Wiktoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Floryda/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malezja/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Strona 24 z 32
Inhibicja kompetycyjna
Inhibicję kompetycyjną testu Quidel Molecular Influenza A+B oceniano za pomocą symulowanych próbek o
zróżnicowanych stężeniach wirusa grypy typu A (2x LoD do 4 log. powyżej LoD) oraz wirusa grypy typu B (2x LoD
do 4 log. powyżej LoD) w pojedynczej próbce. Próbki ekstrahowano za pomocą systemu NucliSENS easyMAG
i testowano w trzech powtórzeniach. Obecnośd obu wirusów, zarówno grypy typu A, jak i wirusa grypy typu B
w zróżnicowanych stężeniach w pojedynczej próbce nie wpływała na czułośd analityczną (granicę wykrywalności
lub LoD) testu Quidel Molecular Influenza A+B.
Reaktywnośd analityczna (inkluzywnośd)
Reaktywnośd testu Quidel Molecular Influenza A+B oceniano wobec licznych szczepów wirusów grypy typu A oraz
grypy typu B. Panel kliniczny składał się z 10 szczepów grypy A podtyp H1N1, 2 szczepów grypy A podtyp
2009H1N1, 8 szczepów grypy A podtyp H3N2, 2 szczepów grypy A podtyp H5N1, 13 szczepów grypy B. Testowano
również dodatkowy panel nieklinicznych, ograniczonych izolatów. Ekstrahowano każdego reprezentanta panelu,
stosując urządzenie NucliSens easyMAG i testowano w trzech powtórzeniach.
Test Quidel Molecular Influenza A+B wykrywał 100% szczepów grypy typu A (38/38) i grypy typu B (15/15) na
2
3
poziomie 10 do 10 TCID50/ml, w tym szczepy nowe, pandemiczne i szczepy ptasiej grypy typu A oraz niedawne,
pozostające w obiegu szczepy grypy typu B.
Panel kliniczny wirusów grypy typu A
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
A/Nowa Kaledonia/20/1999
1,12E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/NWS/33
NA
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/Meksyk/4108/2009
1,40E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/Tajwan/42/06
3,39E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/Wyspy Salomona/3/06
1,41E+01
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Hongkong/8/68
1,15E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
4,57E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Urugwaj/7/16/2007
1,03E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Wiktoria/3/75
2,19E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Podtyp
Szczep
TCID50/ml
H1N1
H1N1 A/Kalifornia/07/2009
H1N1
Strona 25 z 32
Panel kliniczny wirusów grypy typu B
Szczep
TCID50/ml
B/Hongkong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Panama/45/90
1,02E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Floryda/02/2006
3,16E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Floryda/04/2006
3,80E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Floryda/07/2004
1,26E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Malezja/25/06/04
3,41E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Allen/45
4,17E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Tajwan/2/62
1,51E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Rosja/69
2,19E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Mass/3/66
1,38E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/Lee/40
1,95E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
B/GL/1739/54
6,30E+02
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Wirusy ograniczone, niekliniczne
Podtyp
Szczep
TCID50/ml
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H2N2
A/Krzyżówka/NY/6750/78 (H2N2)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H7N3
A/Kurczak/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H9N2
A/Kurczak/NJ/12220/97 (H9N2)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H4N8
A/Krzyżówka/OH/338/86 (H4N8)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H6N2
A/Kurczak/CA/431/00 (H6N2)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H8N4
A/Cyranka modroskrzydła/LA/B174/86 (H8N4)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H5N1
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H10N7
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H11N9
A/Kurczak/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H12N5
A/Kaczka/LA/188D/87 (H12N5)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H13N6
A/Mewa/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H14N5
A/Krzyżówka/GurjevRosja/262/82 (H14N5)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H15N9
A/Burzyk/Australia/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
H16N3
A/Ptaki brodzące/DE/172/2006(H16N3)
2,00E+02
Dodatni
Ujemny
Dodatni
Ujemny
Strona 26 z 32
Powtarzalnośd
Powtarzalnośd wewnątrzlaboratoryjną testu Quidel Molecular Influenza A+B oceniano w 3 ośrodkach
laboratoryjnych. Powtarzalnośd oceniano za pomocą panelu 6 symulowanych próbek, które zawierały średniego
(10x LoD), wysoce negatywnego (stężenie C20-60) wirusa grypy typu A, wirusa grypy typu B, dodatnie i ujemne
próbki kontrolne. Panele i kontrole były testowane w każdym ośrodku przez 2 operatorów przez 5 dni (8 próbek i 3
kontrole × 2 operatorów × 5 dni × 3 ośrodki = 330). Panele i kontrole ekstrahowano za pomocą systemu
NucliSENS easyMAG i testowano na urządzeniu 7500 Fast Dx.
Powtarzalnośd
Panel
ID elementu
Grypa typu A,
wysoce
negatywny
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
Zgodnośd z
oczekiwanymi AVE Ct
wynikami
Zgodnośd z
AVE
oczekiwanymi
Ct
wynikami
Zgodnośd z
oczekiwanymi AVE Ct
wynikami
6/10
%CV
31,5*
8,8
10/10
%CV
N/D
N/D
9/10
%CV
34,3*
N/D
Całkowita
zgodnośd z
oczekiwanymi
wynikami
25/30
Grypa typu A
dodatni (10x LoD)
Grypa typu B,
wysoce
negatywny
Grypa typu B
dodatni (10x LoD)
Grypa typu A
kontrola dodatnia
Grypa typu B
kontrola dodatnia
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
9/10
34,9
N/D
10/10
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
30/30
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
Kontrola ujemna
10/10
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
10/10
N/D
N/D
30/30
Swoistośd analityczna – reaktywnośd krzyżowa
Swoistośd analityczną testu Quidel Molecular Influenza A+B oceniano przez testowanie panelu składającego się
z 26 szczepów wirusowych, 24 bakteryjnych i 1 drożdżowego, reprezentującego typowe patogeny układu
5
10
oddechowego lub florę powszechnie obecną w nosogardle. Bakterie i drożdże testowano w stężeniach 10 do 10
3
6
CFU/ml. Wirusy testowano w stężeniach 10 do 10 TCID50/ml. Próbki ekstrahowano za pomocą urządzenia
NucliSENS easyMAG i testowano w trzech powtórzeniach. Swoistośd analityczna testu Quidel Molecular Influenza
A+B wynosiła 100%.
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Reaktywnośd krzyżowa
hMPV A1
Stęż.
koocowe
3,70E+04
Wynik dla
grypy typu A
Ujemny
Wynik dla
grypy typu B
Ujemny
hMPV B1
2,37E+04
Ujemny
Ujemny
RSV Long
4,40E+04
Ujemny
Ujemny
RSV Waszyngton
1,75E+0
Ujemny
Ujemny
Adenowirus 1/Adenoid 71
5,67E+04
Ujemny
Ujemny
Koronawirus 229E
1,70E+06
Ujemny
Ujemny
Koronawirus OC43
1,67E+06
Ujemny
Ujemny
Wirus Coxsackie B4
2,43E+06
Ujemny
Ujemny
Wirus Coxsackie B5/10/2006
2,28E+06
Ujemny
Ujemny
Cytomegalowirus
8,76E+05
Ujemny
Ujemny
Wirus Echo 7
5,38E+08
Ujemny
Ujemny
Wirus Echo 9
1,50E+06
Ujemny
Ujemny
Wirus Echo 6
1,05E+08
Ujemny
Ujemny
Wirus Echo 11
1,50E+05
Ujemny
Ujemny
Enterowirus 71
2,68E+03
Ujemny
Ujemny
Enterowirus 70
1,66E+05
Ujemny
Ujemny
Wirus Epsteina Barr
5.000 cp/ml
Ujemny
Ujemny
HSV typu 1, szczep MacIntyre
1,95E+06
Ujemny
Ujemny
HSV typu 2, szczep G
3,67E+06
Ujemny
Ujemny
Odra
3,78E+05
Ujemny
Ujemny
Wirus świnki
8,43E+04
Ujemny
Ujemny
Paragrypa typu 1
2,50E+05
Ujemny
Ujemny
Paragrypa typu 2
2,20E+04
Ujemny
Ujemny
Paragrypa typu 3
9,10E+05
Ujemny
Ujemny
Paragrypa typu 4
9,57E+06
Ujemny
Ujemny
Wirus ospy wietrznej
7,50E+02
Ujemny
Ujemny
1,04E+07
Ujemny
Ujemny
2,55E+07
Ujemny
Ujemny
2,10E+05
Ujemny
Ujemny
2,05E+08
Ujemny
Ujemny
6,90E+08
Ujemny
Ujemny
6,60E+07
Ujemny
Ujemny
Mycobacterium avium
1,36E+10
Ujemny
Ujemny
5,90E+07
Ujemny
Ujemny
5,15E+07
Ujemny
Ujemny
Proteus vulgaris
2,65E+08
Ujemny
Ujemny
ID organizmu
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Reaktywnośd krzyżowa
Proteus mirabilis
Stęż.
koocowe
2,75E+07
Wynik dla
grypy typu A
Ujemny
Wynik dla
grypy typu B
Ujemny
2,15E+07
Ujemny
Ujemny
1,85E+08
Ujemny
Ujemny
Neisseria mucosa
1,85E+08
Ujemny
Ujemny
3,30E+07
Ujemny
Ujemny
Escherichia coli
6,80E+07
Ujemny
Ujemny
5,85E+07
Ujemny
Ujemny
6,0E+05
Ujemny
Ujemny
1,03E+08
Ujemny
Ujemny
4,5E+07
Ujemny
Ujemny
2,05E+08
Ujemny
Ujemny
2,50E+06
Ujemny
Ujemny
2,6E+07
Ujemny
Ujemny
5,15E+08
Ujemny
Ujemny
Candida albicans
1,07E+06
Ujemny
Ujemny
ID organizmu
Swoistośd analityczna – substancje zakłócające
Wydajnośd testu Quidel Molecular Influenza A+B oceniano za pomocą substancji potencjalnie zakłócających, które
mogą byd obecne w próbkach z nosogardła. Substancje potencjalnie zakłócające oceniano w odniesieniu do grypy
typu A (A/Mexico/4108/2009), i grypy typu B (B/Florida/04/2006) przy stężeniach 3x oraz 10x LoD. Nie znaleziono
dowodów na występowanie zakłóceo powodowanych testowanymi substancjami na poziomie poniżej 3x lub
10x LoD.
Badane stężenie
Wynik dla
grypy typu A
(3x LoD)
Wynik dla
grypy typu B
(3x LoD)
60 µg/ml
Dodatni
Dodatni
Krew (ludzka), ze środkiem
przeciwkrzepliwym EDTA
2% (obj./obj.)
Dodatni
Dodatni
Neo-synefryna
15% (obj./obj.)
Dodatni
Dodatni
Afrin spray do nosa
15% (obj./obj.)
Dodatni
Dodatni
Homeopatyczny, niepowodujący senności,
nieściekający, łagodzący objawy alergii
ciekły żel do nosa Zicam
5% (obj./obj.)
Dodatni
Dodatni
Spray do nosa (sól fizjologiczna)
15% (obj./obj.) dawki
Dodatni
Dodatni
Pastylki do ssania na ból gardła
0,68 g/ml; 1/18 kropli,
kruszono; składniki
aktywne: 1,7 mg/ml mentol
Dodatni
Dodatni
3,3-5 mg/ml
Dodatni
Dodatni
Tobramycyna
4,0 µg/ml
Dodatni
Dodatni
Mupirocyna
6,6-10 mg/ml
Dodatni
Dodatni
Fosforan oseltamiwiru
7,5-25 mg/ml
Dodatni
Dodatni
Nazwa substancji
Mucyna
(bydlęcy gruczoł podszczękowy, typu I-S)
Zanamiwir
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Badania przenoszenia i zanieczyszczenia krzyżowego
W badaniu wewnętrznym nie zaobserwowano dowodów na przenoszenie/zanieczyszczenia krzyżowe w teście
Quidel Molecular Influenza A+B przy użyciu automatycznego urządzenia bioMériuex NucliSENS easyMAG do
ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Dodatkowy materiał źródłowy
1.
(April 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1594.pdf.
5. CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations
(Vol. 2, No. 34) (Oct 2004).
7. CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov 2005).
(Sept 2002).
(Oct 2003).
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Słowniczek
Autoryzowany przedstawiciel
w Unii Europejskiej
Producent
Zawartość / Zawiera
Kontrola
Zużyć przed
Numer katalogowy
Kod serii
Wyrób do diagnostyki in vitro
Stosować się do instrukcji
Przewidziane zastosowanie
96
Zawartość wystarcza na 96 oznaczeń
Dopuszczalny zakres
temperatury stosowania
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Odnośniki
1
http://1918.pandemicflu.gov wizyta w dniu 6/9/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm wizyta z dnia 6/9/11.
4
M100 – Zestaw testu Quidel Molecular Influenza A+B
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Niemcy
Quidel Corporation
quidel.com
M0002GPL00 (12/2012)
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Ensaio Influenza A+B
Instruções de utilização
Para a deteção e identificação qualitativa dos ácidos nucleicos virais da influenza A e
influenza B extraídos de amostras de aspiração/lavagem nasal, esfregaço nasofaríngeo e
esfregaço nasal.
Ensaio molecular Influenza A+B da Quidel (CE)
Página 1 de 33
Índice
Utilização prevista ......................................................................................................................................... 4
Resumo e explicação ..................................................................................................................................... 4
Princípio do procedimento ........................................................................................................................... 4
Materiais fornecidos ..................................................................................................................................... 6
Materiais opcionais ....................................................................................................................................... 6
Materiais necessários mas não fornecidos ................................................................................................... 6
Aviso e precauções ....................................................................................................................................... 7
Armazenamento e manuseamento de reagentes do kit .............................................................................. 7
Recolha, armazenamento e manuseamento de amostras ........................................................................... 8
Armazenamento de extratos de ácido nucleico ........................................................................................... 8
Instruções de programação da extração de ácido nucleico ......................................................................... 8
Programação inicial do termociclador ........................................................................................................ 10
Instruções de programação do SmartCycler II ........................................................................................ 10
Instruções de programação do 7500 Fast DX ......................................................................................... 12
Instruções de programação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudioTM Dx
da Life Technologies................................................................................................................................ 16
Procedimento de ensaio ............................................................................................................................. 16
Protocolo de amplificação no SmartCycler II .......................................................................................... 16
Protocolo de amplificação no termociclador ABI 7500 Fast Dx .............................................................. 17
Protocolo de amplificação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx ............................. 18
Interpretação de resultados ....................................................................................................................... 19
Interpretação de resultados através do SmartCycler II .......................................................................... 19
Interpretação de resultados com o termociclador 7500 Fast Dx ........................................................... 20
Interpretação dos resultados utilizando o instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx ......... 20
Controlo de qualidade ................................................................................................................................ 21
Limitações ................................................................................................................................................... 21
Desempenho clínico .................................................................................................................................... 21
Desempenho analítico ................................................................................................................................ 24
Página 2 de 33
Nível de deteção ......................................................................................................................................... 24
Inibição concorrencial ................................................................................................................................. 25
Reatividade analítica (Inclusividade) .......................................................................................................... 25
Reprodutibilidade ....................................................................................................................................... 27
Especificidade analítica - Reatividade cruzada ........................................................................................... 28
Estudos de transferência e contaminação cruzada .................................................................................... 30
Fontes adicionais......................................................................................................................................... 30
Assistência técnica e ao cliente................................................................................................................... 30
Propriedade intelectual .............................................................................................................................. 30
Marcas registadas ....................................................................................................................................... 30
Glossário ..................................................................................................................................................... 32
Referências.................................................................................................................................................. 33
Página 3 de 33
Utilização prevista
O ensaio molecular Influenza A+B da Quidel é um ensaio multiplex de RT-PCR em tempo real para a deteção e
identificação qualitativa dos ácidos nucleicos virais da influenza A e/ou influenza B extraídos de amostras de
aspiração/lavagem nasal, esfregaços nasofaríngeos e esfregaços nasais. Este teste de diagnóstico in vitro
destina-se a ajudar no diagnóstico diferencial de infeções virais da influenza A e/ou influenza B em humanos. O ensaio
não deteta a presença do vírus da influenza C.
Os resultados negativos não excluem infeções causadas pelo vírus da Influenza e não devem ser utilizados
como única base para o diagnóstico, tratamento ou outras decisões relativas à gestão de doentes. Foram
estabelecidas características de desempenho para a influenza A quando a influenza A/H3 e A/H1 eram os vírus
predominantes da influenza A em circulação. No caso de aparecimento de outros vírus da influenza A, as
características de desempenho podem variar.
Resumo e explicação
Vírus da influenza (família Orthomyxoviridae) contêm um genoma ARN de cadeia única que está presente em 8
segmentos individuais de proteína ribonucleica. Esta segmentação do genoma é rara entre os vírus e
provavelmente contribui para o desenvolvimento rápido de novas estirpes de influenza através do intercâmbio
de segmentos de genes se dois vírus diferentes infetarem a mesma célula. Existem 3 tipos de influenza - A, B e
C. O tipo A tem homólogos em aves e suínos bem como em seres humanos, ao passo que os tipos B e C apenas
são conhecidos em seres humanos. Devido à possibilidade de outra pandemia causada pela influenza A, como
1
ocorreu em 1918 quando 30 a 50 milhões de pessoas morreram a nível mundial , os Centros de Controlo e
Prevenção de Doenças (CDC) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) mantêm sob vigilância as estirpes de
influenza e realizam previsões sobre as estirpes adequadas para produção de vacinas.
Estima-se que nos Estados Unidos existem 30 000 a 49 000 mortes anualmente causadas por doenças
2
associadas à gripe. A nível mundial, epidemias anuais de influenza resultam em cerca de três a cinco milhões
3
de casos de doenças graves, e em cerca de 250 000 a 500 000 mortes. Pandemias de influenza A ocorrem a
cada 10 a 30 anos e epidemias de influenza A ou B ocorrem anualmente. As infeções são sazonais, tipicamente
prolongando-se de novembro a abril no hemisfério norte. Complicações têm tendência a ocorrer nos mais
novos, nos mais idosos e em pessoas com doenças cardiopulmonares crónicas.
O tempo de incubação é de 1 a 3 dias com dispersão rápida por inalação através de gotículas aéreas e fumitos.
Caracteriza-se por febre, mialgia, dor de cabeça e faringite.
Princípio do procedimento
O ensaio deteta ácidos nucleicos virais extraídos a partir de uma amostra do doente. É realizada uma reação
multiplex de RT-PCR em tempo real sob condições otimizadas num único tubo produzindo produtos de
amplificação de cada um dos vírus alvo na amostra. A identificação da influenza A ocorre através da utilização
de iniciadores de alvos específicos e sondas etiquetadas com fluorescência que hibridam para uma sequência
de influenza A conservada no gene da proteína matriz. A identificação da influenza B ocorre através da
utilização de iniciadores de alvos específicos e sondas etiquetadas com fluorescência que hibridam para uma
sequência de influenza B conservada no gene de neuraminidase.
Etiquetas de sondas moleculares da Quidel
Alvo
Corante
Influenza A
FAM
Influenza B
Controlo de processo
Quasar® 670
(PRC)
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O seguinte é um resumo do procedimento:
1.
Recolha de amostras: obter amostras de aspiração/lavagem nasal, esfregaços nasofaríngeos e esfregaços
nasais utilizando técnicas padrão de doentes sintomáticos. Estas amostras são transportadas,
4
armazenadas e processadas de acordo com procedimentos laboratoriais estabelecidos.
2.
Extração de ácido nucleico: extraia os ácidos nucleicos a partir de amostras com o Sistema NucliSENS®
easyMAG® de acordo com as instruções do fabricante e utilizando os reagentes adequados (consulte a
secção Materiais necessários mas não fornecidos). A utilização de outros sistemas de extração com o
ensaio molecular Influenza A+B da Quidel não foi validada. A validação destes outros sistemas é da
responsabilidade do utilizador final.
Antes do procedimento de extração, adicione 20 µL do Controlo do processo (PRC) a cada alíquota de 180
µL da amostra. O PRC serve para monitorizar inibidores na amostra extraída, assegura que ocorreu a
amplificação adequada, e confirma que a extração de ácido nucleico foi suficiente.
3.
Reidratação da mistura principal: reidrate a mistura principal liofilizada utilizando a Solução de
reidratação. A mistura principal contém sondas etiquetadas com supressores, fluoróforo e iniciadores
oligonucleótidos que visam regiões conservadas dos vírus de influenza A e influenza B, bem como a
sequência de controlo do processo.
4.
Deteção e amplificação de ácido nucleico: adicione 15 µL da mistura principal reidratada a cada tubo de
reação ou poço da placa. Em seguida, adicione 5 µL de ácidos nucleicos extraídos (amostra com PRC) ao
poço da placa ou tubo de reação adequadamente etiquetado. Coloque a placa ou tubo no instrumento de
TM
PCR em tempo real QuantStudio Dx da Life Technologies, ou nos instrumentos 7500 Fast Dx da Applied
Biosystems® ou SmartCycler® II da Cepheid®, respetivamente. O ensaio foi validado com os instrumentos
da série 7500.
Uma vez adicionada a placa ou o tubo de reação ao instrumento, é iniciado o protocolo de ensaio. Este
protocolo inicia a transcrição reversa dos alvos de ARN que produzem ADN complementar, e ocorre a
subsequente amplificação dos produtos de amplificação do alvo. O ensaio molecular Influenza A+B da
Quidel baseia-se na química TaqMan® e utiliza uma enzima com transcriptase reversa, polimerase de ADN,
e atividade de exonuclease 5’-3’. Durante a amplificação de ADN, esta enzima divide a sonda ligada à
sequência de ADN complementar, separando o corante supressor do corante marcador. Este passo produz
um aumento no sinal fluorescente em consequência da estimulação por uma fonte de luz do
comprimento de onda adequado. Em cada ciclo, moléculas adicionais de corante são separadas dos seus
supressores, causando um sinal adicional. Se for obtida fluorescência suficiente com 45 ciclos, a amostra é
indicada como positiva para o ácido nucleico detetado.
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Materiais fornecidos
SKU # M100
Kit de deteção (96 reações) – Armazenar entre 2 °C e 8 °C
#
Componente
Quantidade


Solução de reidratação Item M5003
1 frasco/kit de 1,9 mL
Mistura principal para ensaio molecular Influenza A+B da Quidel
Item M5004
12 frascos/kit,
8 reações/frasco
Conteúdo liofilizado:
Enzima polimerase de ADN com atividade da transcriptase reversa
Iniciadores e sondas
dNTP
Estabilizadores
Controlo do processo Item M5005
1 frasco/kit de 2,0 ml
Materiais opcionais
Controlos positivos para influenza A e influenza B (i.e. Conjunto de controlo molecular Influenza A+B da
Quidel n.º M106 que atua como controlo de extração e processamento externo)
Materiais necessários mas não fornecidos
Micropipetadores (volume entre 1 a 10 μL e 100 a 1000 μL)
Pontas de pipetas não aerossol
TM
Instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx da Life Technologies ou instrumento 7500 Fast Dx
da Applied Biosystems
Placa de PCR de 96 poços de 7500 Fast Dx da Applied Biosystems
Películas para placas óticas da Applied Biosystems
Centrifugadora para placa de 96 poços ABI
Ou
Micropipetadores (volume entre 1 a 10 μL e 100 a 1000 μL)
Pontas de pipetas não aerossol
SmartCycler® II
Produtos descartáveis de SmartCycler
Centrifugadora SmartCycler
Página 6 de 33
Aviso e precauções
Para utilização em diagnóstico in vitro
Caso exista suspeita de infeção com uma nova estirpe do vírus da influenza A com base em critérios de
triagem clínicos e epidemiológicos atuais recomendados pelas autoridades responsável pela saúde
pública, as amostras devem ser colhidas recorrendo a precauções de controlo de infeção adequadas para
novas formas virulentas do vírus da influenza e enviadas para os departamentos de saúde estatais ou
locais para que sejam realizados testes.
Foram estabelecidas características de desempenho deste teste com os tipos de amostras indicados
apenas na secção Utilização prevista. O desempenho deste ensaio com outras amostras ou tipos de
amostras não foi avaliado.
A utilização de sistemas de extração que não os do Sistema NucliSENS easyMAG não foi validada. A
validação destes sistemas é da responsabilidade do utilizador final.
A utilização de condições cíclicas diferentes das indicadas na secção Instruções de programação do
termociclador pode produzir resultados erróneos.
A utilização deste produto deve ser limitada ao pessoal com formação suficiente em técnicas de RT-PCR e
PCR.
Tratar todas as amostras como potencialmente infecciosas. Seguir as precauções universais ao manusear
amostras, este kit, e o seu conteúdo.
A recolha, armazenamento e transporte adequados de amostras são essenciais para obter resultados
corretos.
Armazenar os reagentes do ensaio conforme indicado nos seus rótulos individuais.
Utilizar proteção facial e ocular, luvas e vestuário de proteção adequado ao utilizar este kit.
Para obter resultados precisos, pipetar cuidadosamente utilizando apenas equipamentos calibrados.
Limpar e desinfetar bem todas as superfícies com uma solução de lixívia a 10% e, em seguida, água de
grau molecular.
Utilizar micropipetas com uma barreira de aerossol ou pontas de deslocamento positivo para todos
os procedimentos.
Evitar contaminação cruzada e microbiana dos reagentes do kit. Seguir bons procedimentos laboratoriais.
Não misturar reagentes de kits com números de lote diferentes.
Não utilizar reagentes de outros fabricantes com este kit.
Não utilizar o produto após a sua data de validade.
Um planeamento correto do fluxo de trabalho é essencial para minimizar o risco de contaminação.
Planear sempre o fluxo de trabalho laboratorial de forma unidirecional, começando com a préamplificação e avançando para a amplificação e deteção.
Utilizar o equipamento e materiais dedicados em áreas de pré-amplificação e amplificação.
Não permitir o cruzamento de pessoas ou equipamentos entre as áreas.
Manter sempre os materiais de amplificação separados dos materiais de pré-amplificação.
Não abrir tubos de amostras ou quebrar o selo de placas na fase de pós-amplificação.
Eliminar material amplificado cuidadosamente e de acordo com as leis e regulamentos locais, de modo a
minimizar o risco de contaminação com produtos de amplificação.
Não utilizar materiais dedicados à preparação de amostras ou reagentes para o processamento de ácido
nucleico alvo.
Está disponível uma FDS mediante pedido ou pode ser acedida no site Web do produto.
Armazenamento e manuseamento de reagentes do kit
Armazenar o kit fechado entre 2 °C e 8 °C até à data de validade indicada na caixa exterior do kit.
A mistura principal reidratada pode ser armazenada à temperatura ambiente (entre 20 °C e 25 °C) durante
até 24 horas. Para um armazenamento mais prolongado, colocar novamente a tampa na mistura principal
reidratada, vedá-la com parafilme e armazenar numa posição vertical a ≤ -20 °C até 14 dias. Proteger a
mistura principal da luz durante o armazenamento.
Indicações de instabilidade ou deterioração de reagentes: a nebulosidade da Solução de reidratação pode ser
indicativa da deterioração do reagente. Contacte a assistência técnica da Quidel para uma substituição.
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Recolha, armazenamento e manuseamento de amostras
Amostras utilizadas para a validação do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foram obtidas utilizando
técnicas padrão junto de doentes com sintomas de infeção do trato respiratório superior. Estas amostras
foram recolhidas, transportadas, armazenadas e processadas de acordo com a norma CLSI M41-A.
Armazenamento de extratos de ácido nucleico
O utilizador é responsável pela validação das condições e procedimentos de armazenamento utilizados no seu
laboratório. Normalmente, os eluatos podem ser armazenados à temperatura ambiente (entre 20 °C e 25 °C)
durante 2 horas, a 2-8 °C durante 8 horas, e 1 mês entre -20 °C e 70 °C. O armazenamento de pequenas
quantidades de extrato de ácido nucleico (por ex. 5 μL ou menos) não é recomendado.
Instruções de programação da extração de ácido nucleico
1.
Ligue o instrumento e espere que a luz do mesmo apareça laranja. Em seguida, ligue o computador/inicie
o software easyMAG.
2.
Efetue a leitura do código de barras dos reagentes após pressionar os botões Instrumento
Inventário de reagentes
3.
4.
.
Para introduzir amostras, pressione o botão Utilização diária
pedido
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
e
, que apresentará o ecrã Definir
como predefinição. Selecione as seguintes definições:
ID da amostra: Introduza o nome da amostra utilizando o teclado.
Matriz:
Selecione Outra a partir do menu pendente
Pedido:
Selecione Genérico a partir do menu pendente
Volume (mL):
Selecione 0.200 a partir do menu pendente
Eluato (µL):
Selecione 50 a partir do menu pendente
Tipo:
Primário
Prioridade:
Normal
Ao pressionar o botão Guardar
, a amostra será apresentada na janela Amostra não atribuída no
lado esquerdo do ecrã. Pressione o botão Introduzir novo pedido de extração
, e repita o processo
para amostras adicionais. Em alternativa, podem ser introduzidas múltiplas amostras pressionando o
botão Criar automaticamente novos pedidos de extração
5.
.
Uma vez criadas todas as amostras, vá para Organizar execuções, clicando no ícone
superior da página. Crie uma execução pressionado o botão Criar execução
uma execução, ou utilize o predefinido.
6.
junto à parte
. Introduza o nome de
Adicione amostras à execução utilizando o botão Preencher automaticamente execução
(preenche
automaticamente até 24 amostras da Lista de amostras não atribuídas no lado esquerdo do ecrã). Em
alternativa, as amostras individuais podem ser movidas para dentro e fora da execução utilizando os
Ícones de posicionamento
à esquerda e à direita após a seleção da amostra adequada. A
instrução da amostra na execução pode ser alterada utilizando os botões Mover pedido de extração para
Página 8 de 33
cima/baixo
7.
8.
.
Deve obter entre 1 e 3 recipiente(s) (para 8 a 24 amostras, respetivamente) e adicionar 20 µl de Controlo
do processo a cada poço de amostra utilizado.
Adicione 180 µl de cada amostra ao poço adequado conforme designado.
9.
Vá para Carregar execução, pressionando o botão
junto à parte superior do ecrã. Introduza as
pontas e o(s) recipiente(s) de amostra no instrumento.
10. Introduza o(s) código(s) de barras do(s) recipiente(s) de amostra.
11. Introduza o(s) código(s) de barras das partículas de sílica a serem utilizadas.
12. Atribua partículas de sílica às amostras da seguinte forma:
a. Clique no símbolo dos reagentes abaixo do número 1 na imagem a seguir. O número de lote das
partículas de sílica deverá aparecer por baixo do separador Sílica no número 2 na imagem a
seguir.
b. Destaque e selecione as amostras na execução à qual é necessário atribuir partículas (na caixa
que contém o número 3 na imagem a seguir).
c.
d.
Clique no
ícone de posicionamento (abaixo do número 4 na imagem a seguir) para atribuir
o número do lote de sílica às amostras selecionadas.
Se o símbolo das partículas à direita do número 5 na imagem a seguir estiver selecionado, deverá
ser apresentado o número do lote de partículas de sílica para cada amostra.
13. Imprima a lista de trabalho tocando no ícone Carregar execução, pressionado em seguida o ícone Imprimir
lista de trabalhos
.
14. Pressione o botão Distribuir lise
. O processo de lise integrada demorará aproximadamente 12
minutos a terminar.
15. Por cada recipiente de amostra, prepare partículas magnéticas utilizando as pontas e o pipetador Biohit
para até oito reações, da seguinte forma:
a. Utilizando 1 ponta e o Programa 1, efetue a aspiração de 550 µl de água isenta de nuclease e
distribua para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml isento de DNase/RNase.
b. Agitar por movimento rotacional a sílica magnética. Utilizando 1 ponta e o Programa 1, efetue
a aspiração de 550 µl de sílica magnética, distribua na água e misture com movimento
rotacional (vórtex).
Página 9 de 33
c.
d.
e.
f.
Utilizando 1 ponta e o Programa 2, efetue a aspiração de 1050 µl da mistura de sílica magnética e
distribua novamente 25 µl para o mesmo tubo.
Distribua 125 µl da mistura de sílica magnética 8 vezes para 8 poços de uma placa de tiras ELISA.
Elimine a ponta.
Após a conclusão do processo de Lise (NB: o Estado do instrumento na parte inferior do ecrã
deve indicar “INATIVO”!), utilizando 8 pontas e o Programa 3, efetue a aspiração de 100 µl da
mistura de sílica magnética em poços de tiras, distribua 100 µl da mistura de sílica magnética em
poços de tiras, e efetue a aspiração de 100 µl da mistura de sílica magnética em poços de tiras.
Introduza as pontas no líquido contido nos recipientes da amostra. Efetue a aspiração de 800 µl
e, em seguida, distribua 900 µl da mistura de sílica magnética novamente para o recipiente.
Efetue a aspiração de 1000 µl da mistura de sílica magnética do recipiente, e distribua 1000 µl da
sílica magnética novamente para o recipiente. Repita mais duas vezes a aspiração/distribuição de
1000 µl.
16. Feche o instrumento, e pressione o botão “Iniciar”
para iniciar a execução.
17. Após a conclusão da execução, transfira o ácido nucleico purificado para tubos isentos de nuclease. Utilize
imediatamente os ácidos nucleicos purificados, ou congele-os a -70 °C.
Limitações: o seguinte protocolo foi desenvolvido especificamente para utilizar neste ensaio. Desconhece-se a
sua adequação com outros ensaios. Verifique com a bioMérieux S.A. para garantir que o software é
compatível.
Programação inicial do termociclador
Instruções de programação do SmartCycler II
1.
2.
Inicie o pacote de software SmartCyclerDx Versão 3.0b
Crie o ensaio molecular Influenza A+B da Quidel
a. Selecione o botão Definir ensaios na parte superior do ecrã
b. Atribua um nome ao ensaio
i. Selecione o botão Novo no canto inferior esquerdo do ecrã
ii. Digite “Molecular Influenza A+B da Quidel” e selecione OK
iii. “Molecular Influenza A+B da Quidel” será adicionado à parte superior da lista Nome de ensaio
localizada na parte superior esquerda do ecrã
c. Defina os valores da análise: Na secção Tipo de ensaio: pesquisar, selecione o separador Definições
de análise, e verifique se estão efetuadas as seguintes especificações:
i. Selecione FATA25 a partir do menu pendente Conjunto de corantes
ii. O menu pendente Tipo de análise deve estar definido como Qualitativo (predefinição)
iii. Na coluna Nome de canais, introduza “Influenza A” para FAM, “Influenza B” para Alx532 e
“PRC” para Alx647
iv. Na coluna Utilização, selecione Alvo a partir dos menus pendentes para Influenza A e Influenza
B, e selecione Controlo interno para PRC. Ao selecionar Controlo interno, será apresentada a
janela emergente a seguir. Selecione o botão Sim.
v. Na coluna Análise de curvas, introduza Curva primária para cada canal (Influenza A, Influenza
B, PRC) (predefinição).
vi. Na coluna Definições de limiar, introduza Limiar manual para cada canal (Influenza A,
Influenza B, PRC) (predefinição).
Página 10 de 33
vii. Na coluna Unidades de fluorescência, limiar manual, introduza os seguintes limiares:
a. Influenza A:
20,0
b. Influenza B:
20,0
c. PRC:
20,0
viii. Na coluna Ciclador mín. válido, introduza 10 para cada canal (Influenza A, Influenza B, PRC).
ix. Na coluna Ciclador máx. válido, introduza 45 para cada canal (Influenza A, Influenza B, PRC).
x. Na coluna Sub. segundo plano, utilize “ATIVADO” para cada canal (Influenza A, Influenza B,
PRC) (predefinição).
xi. Na coluna Ciclo mín. em segundo plano, introduza 5 para cada canal (Influenza A, Influenza B,
PRC) (predefinição).
xii. Na coluna Ciclo máx. em segundo plano, introduza 45 para cada canal (Influenza A, Influenza
B, PRC).
xiii. Na coluna Ciclos méd. Boxcar, introduza 0 para cada canal (Influenza A, Influenza B, PRC)
(predefinição).
xiv. Na coluna Limiar de parâmetro, introduza 20 para cada canal (Influenza A, Influenza B, PRC)
(predefinição).
xv. Na coluna NC IC%, mantenha “NA” para cada canal (PRC) (predefinição).
xvi. Na coluna IC Delta, mantenha “NA” para cada canal (Influenza A, Influenza B) (predefinição).
xvii. Na secção Personalizar texto de resultado (a seguir à tabela), selecione Texto de resultado
baseado no organismo a partir do menu pendente. Será apresentada uma janela emergente
de aviso a seguir. Selecione Sim.
xviii. Selecione o botão Personalizar para abrir a janela de diálogo Texto de resultado baseado no
organismo. Selecione o botão Adicionar, introduza “Influenza A” na coluna Nome do
organismo e assinale a caixa Influenza A. Selecione o botão Adicionar, introduza “Influenza B”
na coluna Nome do organismo e assinale a caixa Influenza B.
d.
Clique em OK na parte inferior da janela emergente
Defina as temperaturas e número de ciclos de RT-PCR na parte inferior do ecrã da seguinte forma:
i. Fase 1
1. Fixação
2. Temperatura:
55,0
3. Segundos:
300
4. Ótica:
Desligado
Página 11 de 33
ii. Fase 2
1.
2.
3.
4.
Fixação
Temperatura:
Segundos:
Ótica:
60,0
300
Desligado
1.
2.
3.
4.
Fixação
Temperatura:
Segundos:
Ótica:
65,0
300
Desligado
iii. Fase 3
iv. Fase 4
1.
2.
3.
3.
Ciclo de 2 temperaturas
N.º de repetições
50
Linha da primeira temperatura:
a. Temperatura:
92,0
b. Segundos:
5
c. Ótica:
Desligado
4. Linha da segunda temperatura
a. Temperatura:
57,0
b. Segundos:
40
c. Ótica:
Ligado
Guarde o protocolo selecionando o botão Guardar situado na parte inferior do ecrã
Figura do protocolo molecular Influenza A+B da Quidel completo
Molecular Influenza A+B da Quidel
Limitações: o protocolo seguinte foi desenvolvido para ser utilizado especificamente com o ensaio de RT-PCR
em tempo real molecular Influenza A+B da Quidel. Desconhece-se a sua adequação com outros ensaios.
Verifique com a Cepheid para garantir que o software é compatível.
Instruções de programação do 7500 Fast DX
1.
2.
Inicie o pacote de software do 7500 Fast Dx.
A janela de diálogo do documento de Iniciação rápida irá abrir-se. Selecione o botão Criar novo
documento para iniciar o Assistente de novo documento. Siga todos os passos para executar o protocolo
Molecular Influenza A+B da Quidel.
a. Definir um documento: a maior parte das opções a seguir apresentadas devem ser predefinições.
Se não for este o caso, altere de forma adequada.
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i. Confirme ou introduza a seguinte informação.
b.
Ensaio:
Curva padrão (Quantificação absoluta)
Recipiente:
Transparente com 96 poços
Modelo:
Documento em branco
Modo de execução:
Fast 7500
Operador
o seu nome de operador
Comentários
SDS v1.4 (adicione mais se necessário)
Nome da placa:
“Molecular Influenza A+B da Quidel”
ii. Selecione o botão Seguinte.
Selecionar detetores: é necessário adicionar novos detetores para Influenza A, Influenza B, bem
como o controlo do processo (PRC). Para cada alvo, selecione o botão Novo detetor para abrir a
janela emergente Novo detetor. Em alternativa, utilize o botão Criar outro na janela emergente
Novo detetor para os últimos dois detetores.
i. Introduza a seguinte informação para cada detetor.
Nome
Corante
Corante
marcador
supressor
Influenza A
FAM
(nenhum)
Influenza B
JOE
(nenhum)
PRC
Cy5
(nenhum)
c.
d.
Cor
(Selecione)
(Selecione)
(Selecione)
ii. Selecione uma cor única para representar cada detetor.
iii. Realce os novos detetores e adicione a coluna Detetores no documento utilizando o
botão Adicionar.
iv. Selecione (nenhum) no menu pendente Referência passiva.
v. Selecione o botão Seguinte.
vi. Selecione o botão Concluir sem definir quaisquer poços.
O assistente irá fechar-se e o software irá abrir-se, apresentando o separador Configurar. Esta
operação irá apresentar a placa da amostra que foi configurada durante a iniciação rápida. Não é
necessário alterar qualquer informação aqui para a configuração inicial.
Definição do Protocolo do termociclador: selecione o separador Instrumento para configurar o
número de ciclos e temperaturas de RT-PCR do ensaio molecular de Influenza A+B da Quidel. Em
Perfil térmico deverá existir um protocolo de 2 fases predefinido. Cada fase terá 3 caixas de texto
editáveis pelo utilizador. O valor da caixa superior representa o número de repetições ou ciclos
para essa fase. O valor da caixa do meio representa a temperatura (˚C), e o valor da caixa inferior
representa o tempo (minutos: segundos).
Página 13 de 33
i. Efetue as seguintes alterações no Protocolo do termociclador predefinido:
1. Fase 1
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
55
c. Tempo:
5:00
2. Selecione a barra entre Fase 1 e Fase 2. Selecione o botão Adicionar fixação
para adicionar outra fase.
3. Fase 2
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
60
c. Tempo:
5:00
4. Selecione a barra entre Fase 2 e Fase 3. Selecione o botão Adicionar fixação
para adicionar outra fase.
5. Fase 3
a. Repetições:
1
b. Temperatura:
65
c. Tempo:
5:00
6. Fase 4 (Fase de dissociação de 2 passos)
a. Repetições: 10
b. Passo 1
i. Temperatura:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passo 2
i. Temperatura:
57
ii. Tempo:
0:40
7. Selecione a barra que se encontra do lado direito de Fase 4. Selecione o botão
Adicionar ciclo para adicionar outra fase.
8. Fase 5 (Fase de dissociação de 2 passos)
a. Repetições: 35
b. Passo 1
i. Temperatura:
92
ii. Tempo:
0:05
c. Passo 2
i. Temperatura:
57
ii. Tempo:
0:40
9. Se for adicionada uma fase incorreta, poderá removê-la pressionando o botão
Eliminar após realçar a fase entre as linhas verticais.
Página 14 de 33
ii. Em Definições, introduza os seguintes dados:
Volume da amostra (μL):
20 (predefinição)
Modo de execução:
7500 rápido (predefinição)
Recolha de dados:
Fase 5, Passo 2 (57,0 durante 0:40)
NOTA: não selecione a caixa de verificação junto de “Modo especialista”.
iii. Protocolo final
e.
Defina o limiar para cada analito.
i. Selecione o separador Resultados.
ii. Selecione o separador Gráfico de amplificação.
iii. Selecione Influenza A no separador Detetor no canto superior direito.
iv. No bloco Definições de análise, defina Limiar em 1.5e5.
v. Selecione o botão de rádio Linha de referência automática.
vi. Repita iii-v para Influenza B definindo Limiar para 1.2e5.
vii. Repita iii-v para PRC definindo Limiar para 2.7e4.
f.
Guarde o novo protocolo como modelo para utilização futura.
i. Na parte superior do ecrã, selecione Ficheiro e, em seguida, Guardar como.
ii. Guardar em: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
Página 15 de 33
g.
iii. Nome do ficheiro: “Molecular Influenza A+B da Quidel”
iv. Guardar com o tipo: “SDS Templates (*.sdt)”
Saia do software.
Limitações: o seguinte protocolo foi desenvolvido especificamente para utilizar neste ensaio. Desconhece-se a
sua adequação com outros ensaios. Verifique com a Life Technologies para garantir que o software é
compatível.
Instruções de programação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudioTM Dx
da Life Technologies
A programação do instrumento é realizada mediante a utilização do ficheiro TDD que acompanha o
kit de teste.
Procedimento de ensaio
Execute os seguintes procedimentos a uma temperatura ambiente controlada entre 20 °C e 25 °C.
Procedimento de extração de ácido nucleico
Consulte as Instruções de programação do sistema NucliSENS easyMAG a seguir.
1. Adicione 20 µL do Controlo do processo ao poço de extração de amostra.
2. Adicione 180 µL da amostra do doente ou controlo externo a um poço de extração de amostra.
3. Siga as instruções de extração de acordo com as instruções do fabricante.
Procedimento de reidratação da mistura principal
1. Determine o número de amostras a testar e obtenha o número correto de oito frascos de teste da
mistura principal liofilizada para efetuar o teste.
2. Guarde novamente os reagentes não utilizados em condições de armazenamento apropriadas.
3. Abra cuidadosamente a mistura principal para evitar a perturbação do grânulo.
4. Adicione 135 µL da Solução de reidratação à Mistura principal.
5. Coloque o frasco à temperatura ambiente durante 1-2 minutos para permitir a reidratação do
grânulo.
6. Mova suavemente a pipeta para cima e para baixo 2-3 vezes (evitando a formação de bolhas) antes
de colocar no primeiro tubo PCR ou poço da placa.
Nota: a mistura principal reidratada é suficiente para oito reações.
Nota: a mistura principal reidratada pode ser conservada à temperatura ambiente durante até 24
horas ou a ≤ -20 °C durante até 14 dias. (Consulte a secção “Armazenamento e manuseamento de
reagentes do kit” para opções de armazenamento adicionais)
Procedimento de configuração de RT-PCR:
1. Adicione 15 µL da mistura principal reidratada a cada tubo de reação ou poço da placa.
2. Adicione 5 µL do ácido nucleico extraído (amostra com o controlo de processo) aos tubos de reação
ou poços da placa. A mistura dos reagentes não é necessária.
Nota: utilize um micropipetador com uma nova ponta não aerossol com cada amostra extraída.
3. Feche os tubos de reação ou vede a placa.
Nota: a Quidel sugere que cada termociclador deve incluir um poço ou tubo de reação com Controlo
negativo e Controlo positivo externo de influenza A/influenza B. Realize os controlos de acordo com
as suas políticas e práticas laboratoriais.
4. Centrifugue a placa ou os tubos de reação durante pelo menos 15 segundos. Certifique-se de que a
totalidade do líquido se encontra na parte inferior do tubo.
5. Introduza os tubos ou a placa no termociclador.
Protocolo de amplificação no SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
Ligue o(s) bloco(s) do SmartCycler.
Inicie o pacote de software SmartCycler Dx Versão 3.0b.
Selecione o botão Criar execução na parte superior do ecrã para configurar a execução.
Em Nome da execução, introduza um nome para a execução atual (AAMMDD-Quidel Molecular
Influenza A+B).
Em Notas, introduza quaisquer notas sobre a execução para referência futura.
Página 16 de 33
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Em Ensaio, selecione o ensaio “Molecular Influenza A+B da Quidel” a partir do menu pendente.
Em Informações relativas ao ensaio, introduza o número do lote e data de validade do kit.
Para selecionar os poços que serão utilizados, proceda de uma das seguintes formas:
a. Para atribuir poços automaticamente, proceda da seguinte forma:
i. Em Número de amostras, introduza o número de amostras na caixa de texto fornecida.
ii. Selecione o botão Aplicar. O número de linhas introduzido será apresentado em Tabela de
localizações.
b. Para fechar poços manualmente nos blocos do SmartCycler, proceda da seguinte forma:
i. Selecione o botão Adicionar/Remover localizações na parte inferior do ecrã.
ii. Esta operação irá abrir a janela emergente Selecionar localizações com duas colunas. A
coluna do lado esquerdo (Localizações) apresenta todas as localizações disponíveis e a
coluna do lado direito (Seleções) fixa todas as localizações selecionadas.
iii. Para selecionar todas as localizações, clique no botão Selecionar todas as localizações.
iv. Para selecionar localizações específicas, realce uma ou mais localizações e selecione a seta
para a direita para adicionar a(s) localização(ões) à coluna Seleções.
v. Selecione o botão OK para fechar a janela. As localizações selecionadas serão apresentadas
em Tabela de localizações.
Introduza os identificadores de amostra na coluna ID de amostra em Tabela de localizações (isto
pode também ser efetuado depois da execução ser iniciada.
Introduza quaisquer notas na coluna Notas e deixe as entradas da coluna Tipo de amostra como
“SPEC”.
Selecione o botão Iniciar execução na parte inferior do ecrã.
Selecione o botão Ver resultados para ver o progresso da execução.
Guarde a execução depois desta ter terminado e antes de sair do software.
Protocolo de amplificação no termociclador ABI 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ligue o ABI 7500 Fast Dx.
Inicie o pacote de software do ABI 7500 Fast Dx.
A janela de diálogo do documento de Iniciação rápida irá abrir-se.
Clique em Criar um novo documento.
A maior parte das opções a seguir apresentadas devem ser predefinições. Se não for este o caso,
altere de forma adequada.
Ensaio:
Curva padrão (Quantificação absoluta)
Recipiente:
Transparente com 96 poços
Modelo:
Molecular Influenza A+B da Quidel
Modo de execução:
Fast 7500
Operador
o seu nome de operador
Comentários:
SDS v1.4 (adicione mais se necessário)
Nome da placa:
AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Configurar a placa da amostra
a. Nos separadores Configurar e Placa será apresentada a configuração da placa.
b. Selecione todos os poços que irão conter a amostra, clique no botão direito do rato e selecione
Inspetor de poços no menu pendente. Quando a janela emergente Inspetor de poços se abrir,
selecione os detetores para influenza A, influenza B e PRC.
c. Utilize a janela Inspetor de poços para introduzir o nome das amostras. É possível introduzir as ID
dos doentes na janela Inspetor de poços; contudo, recomenda-se que sejam introduzidas antes
da ressuspensão da mistura principal liofilizada, pós-execução ou utilização da função de
importação para minimizar o tempo que as reações de PCR ficarão à temperatura ambiente antes
da execução ser iniciada.
Página 17 de 33
d.
e.
7.
8.
Guarde a execução como AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
Irá abrir-se uma janela a solicitar o “Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Configurar” e
quaisquer outros comentários relevantes para a execução.
Iniciar a PCR
a. Selecione o separador Instrumento.
b. Introduza a placa de PCR de 96 poços na máquina.
c. Em Controlo do instrumento, selecione o botão Iniciar para dar início à execução.
Pós-PCR
a. IMPORTANTE: Quando a execução terminar, pressione OK. Analise os dados pressionando o
botão “Analisar” no menu superior e guarde o ficheiro.
b. Guarde o ficheiro pressionando Guardar documento na barra de tarefas. Irá abrir-se uma janela a
solicitar o ”Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Análise de dados pós-execução” e
Protocolo de amplificação do instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Ligue o QuantStudio Dx.
Escolha o modo IVD (diagnóstico in vitro) no instrumento.
Execute o conjunto de software IVD do QuantStudio Dx.
Introduza o nome de utilizador e a palavra-passe do sistema quando lhe forem solicitados.
A janela Ecrã inicial irá abrir-se.
Na caixa Configurar, realce o nome do teste carregado anteriormente “Ensaio Molecular Influenza A
+ B da Quidel”
Clique no botão Configurar para iniciar a execução.
O ecrã Configurar, propriedades de teste será apresentado. Introduza a informação de execução
adequada.
a. Introduza o Nome da experiência (a predefinição inicia a execução com um carimbo de data e
hora).
b. Introduza a informação Código de barras da placa.
c. Registe os números de lote do material em Informações do reagente.
d. Guarde a execução como AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A + B.sds.
e. Irá abrir-se uma janela a solicitar o “Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Configurar” e
Na barra de menus esquerda, selecione Definir.
Edite as informações da amostra.
a. Introduza as informações da amostra específicas para cada poço apagando o identificador
predefinido (Doente 1, Doente 2, etc.) e introduzindo novas informações OU
b. Selecione Importar de ficheiro na parte superior do ecrã para carregar um mapa de placas
predefinido de um ficheiro de texto (delimitado por tabulações).
Na barra de menus esquerda, selecione Atribuir para se certificar da configuração adequada da placa.
Carregar a placa de amostra.
a. Ejete o tabuleiro de instrumentos.
b. Introduza a placa de PCR de 96 poços na máquina com o poço A1 convenientemente posicionado
no canto superior esquerdo.
c. Coloque o tabuleiro de instrumentos para dentro.
Iniciar a execução.
a. Na barra de menus esquerda, selecione Execução.
b. Clique no botão Iniciar execução verde na parte superior do ecrã.
i. Se lhe for solicitado, selecione o número de série específico do instrumento utilizado.
Quando a execução estiver completa, selecione Análise na barra de menus esquerda.
a. Guarde o ficheiro pressionando Guardar na barra de tarefas. Irá abrir-se uma janela a solicitar o
“Motivo de alteração da entrada”. Introduza “Análise de dados pós-execução” e quaisquer
outros comentários relevantes para a execução.
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b.
O Gráfico de amplificação será apresentado por predefinição. Para ver outros tipos de gráficos,
selecione-os a partir da barra de menus esquerda.
c. Para ver as informações de execução com valores Ct, selecione o separador Tabela de poços no
lado direito do ecrã.
15. Imprimir um relatório.
a. Na barra de menus superior, selecione Imprimir relatório. Personalize o conteúdo do relatório
selecionando ou retirando a seleção de caixas na janela do relatório.
b. Selecione o botão “Imprimir relatório” na parte inferior da caixa de diálogo.
16. Exportar ficheiros de dados.
a. Na barra de menus esquerda, selecione Exportar.
b. Introduza Localização do ficheiro a exportar OU clique em Procurar para encontrar o caminho
pretendido.
c. O Nome do ficheiro a exportar será, por predefinição, o nome da execução guardada.
d. Selecione Excel como o tipo de ficheiro.
e. Personalize o relatório de dados exportados alternando entre os separadores fornecidos e
selecionado ou retirando a seleção de opções.
f. Selecione Iniciar exportação na parte inferior do ecrã.
Interpretação de resultados
Interpretação de resultados através do SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Selecione o separador Ver resultados depois da execução ter terminado.
Selecione o separador Resultados das amostras.
O software do SmartCycler identificará automaticamente se o resultado das amostras da influenza é
positivo ou negativo, ou se a execução era inválida (inconclusiva).
Pode encontrar mais informações nos respetivos separadores de cada analito na mesma janela. Em
caso de identificação positiva de influenza A ou B (ou ambos), o resultado de PRC não é aplicável. O
PRC só é necessária para identificações negativas.
Interpretação dos resultados impressos do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel no
SmartCycler II
Resultado
do ensaio
Resultado do
Controlo do
processo
Influenza A
Influenza B
Negativo
Aprovado
NEG
NEG
Ácido nucleico da influenza A ou influenza B
não detetado; PRC detetado
NA*
POS
NEG
Ácido nucleico da influenza A detetado
NA*
NEG
POS
Ácido nucleico da influenza B detetado
NA*
POS
POS
Ácido nucleico da influenza A e
influenza B detetado
Identificação
positiva de
influenza A
Identificação
positiva de
influenza B
Identificação
positiva de
influenza A e
influenza B
Inconclusivos - inibição de PCR ou falha
do reagente. Teste novamente o ácido
Inválido
Reprovado
NEG
NEG
nucleico purificado ou recolha e teste uma
nova amostra.
*Não é necessário qualquer valor para o Controlo de processo para fazer uma identificação positiva.
Código de erro 3079: O código de erro/aviso 3079 pode ser observado com as amostras positivas de influenza
A e influenza B. O código de erro/aviso 3079 ocorre quando o sinal de fluorescência (RFU) é demasiado
elevado. Neste caso, todos os resultados para essa amostra são comunicados pelo software Dx como ND (Não
determinado). Se um valor Ct ≥ 10 ou ≤ 45 for comunicado para influenza A ou influenza B, os resultados da
amostra podem ser registados como POS para influenza A ou influenza B.
Página 19 de 33
Interpretação de resultados com o termociclador 7500 Fast Dx
Interpretação dos resultados do Ensaio molecular Influenza A+B da Quidel no termociclador
7500 Fast Dx
Resultado
do ensaio
Detetor:
Influenza A
Detetor:
Influenza B
Detetor:
Controlo do
processo
Negativo
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
NA*
Ácido nucleico da
influenza A detetado
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Ácido nucleico da
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Identificação
positiva de
influenza A
Identificação
positiva de
influenza B
Identificação
positiva de
influenza A e
influenza B
Ácido nucleico da influenza A ou
influenza B não detetado;
PRC detetado
influenza B e PRC não detetado;
Inválido
execução inválida, Repetir execução
ou extração
Não
Não
Não
Não determinado, repetir execução
Inválido
determinado
determinado
determinado ou extração
*Não é necessário qualquer valor Ct para fazer uma identificação positiva.
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Ct < 5,0 ou
Ct > 35,0
Interpretação dos resultados utilizando o instrumento de PCR em tempo real QuantStudio Dx
Interpretação dos resultados do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel no instrumento de
PCR em tempo real QuantStudio Dx
Resultado do
ensaio
Negativo
Identificação
positiva de
influenza A
Identificação
positiva de
influenza B
Identificação
positiva de
influenza A e
influenza B
Inválido
Detetor:
Influenza A
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Ct ≤40,0
Detetor:
Influenza B
Detetor:
Controlo do
processo
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Ct ≤40,0
influenza B não detetado;
PRC detetado
NA*
Ácido nucleico da
influenza A detetado
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Ct ≤40,0
NA*
Ácido nucleico da
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
NA*
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
Nenhum Ct
fornecido
(Vazio)
influenza B e PRC não detetado;
execução inválida, Repetir execução
ou extração
*Não é necessário qualquer valor Ct para fazer uma identificação positiva.
Página 20 de 33
Controlo de qualidade
O ensaio molecular Influenza A+B da Quidel inclui vários controlos para monitorizar o desempenho do ensaio.
1.
2.
3.
O Controlo do processo deve ser utilizado durante a extração e amplificação no ensaio. Este controlo deve
ser adicionado a cada alíquota da amostra antes da extração.
Os controlos de influenza A/B positivos externos à venda no mercado podem ser tratados como uma
amostra do doente e devem ser utilizados de acordo com as normas do seu laboratório. Podem ser
utilizadas amostras de influenza A ou influenza B anteriormente caracterizadas como positivas em vez dos
controlos de influenza A/B à venda no mercado.
Os meios de transporte de vírus ou amostras anteriormente caracterizadas como negativas podem ser
utilizados como controlo negativo externo. Isto deve ser tratado como uma amostra do doente e deve ser
realizado de acordo com as normas atuais do laboratório.
Limitações
Este teste não se destina a diferenciar os subtipos da influenza A, tal como uma nova estirpe da influenza
A H1N1. Terão de ser realizados testes adicionais se for necessário efetuar a diferenciação de subtipos.
Os resultados negativos não excluem uma infeção com o vírus da influenza e não devem ser a única base
de uma decisão de tratamento.
Tal como acontece com outros ensaios deste tipo, existe o risco de resultados falsos negativos devido à
presença de variantes de sequência no alvo viral.
A recolha, armazenamento ou transporte incorretos podem dar origem a resultados falsos negativos.
Os inibidores presentes na amostra e/ou erros no seguimento do procedimento de ensaio podem originar
resultados falsos negativos.
Desempenho clínico
Características de desempenho do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foram estabelecidas durante um
estudo prospetivo durante a época de vírus respiratório de 2011 (janeiro a março). Amostras utilizadas para
este estudo foram amostras de esfregaço nasal e nasofaríngeo recolhidas para testes de influenza de rotina.
O método de referência foi uma cultura rápida (shell vial) seguido por triagem e identificação de anticorpo
fluorescente direto (DFA).
Foram testadas 637 amostras de esfregaço com o ensaio molecular Influenza A+B da Quidel e por cultura. Seis
(6) amostras que inicialmente apresentaram resultados inconclusivos mantiveram-se inconclusivas ao serem
novamente testadas com o ensaio molecular Influenza A+B da Quidel e não foram incluídas na análise a seguir.
Um total de 6 amostras apresentaram resultado positivo na triagem de vírus respiratório DFA (o reagente de
triagem deteta Influenza A e B, VSR, Parainfluenza 1, 2, e 3, e Adenovírus), mas continham células insuficientes
para obter uma identificação positiva específica. Um total de 3 amostras eram tóxicas na cultura das células.
Estas 9 amostras não foram incluídas na análise a seguir.
A análise de discrepância de amostras em que os resultados das culturas e do ensaio molecular Influenza A+B
da Quidel foram divergentes realizada utilizando um ensaio RT-PCR com certificação CE e com sequenciação
bidirecional apropriada.
Página 21 de 33
Influenza A
Esfregaço nasofaríngeo/nasal
fresco (N=622)
Teste molecular Influenza
A+B da Quidel
Positivo
Comparador: cultura com DFA
Positivo
Negativo
Total
93
18*
111
Negativo
1**
510
511
Total
94
528
622
IC de 95 %
Sensibilidade
93/94
98,9 %
94,2 % a 100 %
Especificidade
510/528
96,6 %
94,7 % a 98,0 %
*17 destas amostras foram positivas em termos de influenza A segundo o dispositivo
IVD com certificação CE. A amostra restante foi negativa em relação a influenza A segundo
o dispositivo IVD com certificação CE, mas positiva em relação a vírus de influenza A por
análise de sequenciamento
** A amostra foi igualmente negativa quanto a influenza A segundo o dispositivo IVD
de certificação CE.
Influenza B
fresco (N=622)
A+B da Quidel
Positivo
Comparador: cultura com DFA
Positivo
Negativo
Total
74
7*
81
Negativo
2**
539
541
Total
76
546
622
IC de 95 %
Sensibilidade
74/76
97,4 %
90,8 % a 99,7 %
Especificidade
539/546
98,7 %
97,4 % a 99,5 %
*5 amostras foram positivas quanto a influenza B segundo o dispositivo IVD de certificação
CE, 2 amostras foram negativas quanto a influenza B segundo o dispositivo IVD de certificação
CE, mas foram positivas quanto a vírus de influenza B através de análise de sequenciamento
**1 amostra foi positiva quanto a influenza B através do dispositivo IVD com certificação
CE, 1 amostra foi negativa quanto a influenza B através dispositivo IVD de certificação CE
Um total de 626 amostras de esfregaço foram igualmente testadas com o ensaio molecular Influenza A+B da
Quidel e através de um ensaio RT-PCR de dispositivo IVD com certificação CE. Seis (6) amostras que
inicialmente forneceram resultados inconclusivos em ambos os ensaios continuaram inconclusivas após novo
teste com ambos os ensaios e não foram incluídas na análise a seguir. Mais 10 amostras apresentaram
resultados inconclusivos no ensaio RT-PCR de dispositivo IVD com certificação CE e mantiveram-se
inconclusivas após novo teste com o ensaio e não foram incluídas na análise a seguir. A análise de discrepância
de amostras em que os resultados do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foram divergentes dos
resultados do ensaio RT-PCR de dispositivo IVD de certificação CE foi realizada utilizando sequenciamento.
Página 22 de 33
Influenza A
fresco (N=610)
A+B da Quidel
Comparador: dispositivo IVD com sinalização CE
Positivo
Negativo
Total
Positivo
107
3*
110
Negativo
0
500
500
107
503
610
Total
IC de 95 %
Sensibilidade
107/107
100 %
96,6 % a 100 %
Especificidade
500/503
99,4 %
98,3 % a 99,9 %
*3 amostras foram positivas em relação a vírus de influenza A por análise de sequenciamento
Influenza B
fresco (N=610)
A+B da Quidel
Comparador: dispositivo IVD com sinalização CE
Positivo
Negativo
Total
Positivo
77
5*
82
Negativo
4**
524
528
Total
81
529
610
IC de 95 %
Sensibilidade
77/81
95,1 %
87,8 % a 98,6 %
Especificidade
524/529
99,1 %
97,8 % a 99,7 %
*5 amostras foram positivas em relação a vírus de influenza B por análise de sequenciamento
**4 amostras foram negativas em relação a vírus de influenza B por análise de sequenciamento
Página 23 de 33
Um subconjunto de duzentas e onze (211) amostras do estudo anterior foi testado no instrumento de PCR em
tempo real QuantStudio Dx. Os resultados deste teste foram comparados com dados de testes efetuados
simultaneamente com o ABI 7500 Fast Dx. Esta comparação é fornecida a seguir.
Teste molecular Influenza A+B da Quidel
Influenza A
Comparador: ABI 7500 Fast Dx
Instrumento de PCR em
tempo real QuantStudio Dx
Positivo
Negativo
Total
Positivo
63
0
63
Negativo
0
148
148
Total
63
148
211
IC de 95 %
Sensibilidade
63/63
100 %
94,3 % a 100 %
Especificidade
148/148
100 %
97,5 % a 100 %
Teste molecular Influenza A+B da Quidel
Influenza B
Comparador: ABI 7500 Fast Dx
Instrumento de PCR em
tempo real QuantStudio Dx
Positivo
Negativo
Total
Positivo
28
0
28
Negativo
0
183
183
Total
28
183
211
IC de 95 %
Sensibilidade
28/28
100 %
87,9 % a 100 %
Especificidade
183/183
100 %
97,9 % a 100 %
Desempenho analítico
Nível de deteção
A sensibilidade analítica (limite de deteção ou LD) do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi
determinada utilizando culturas quantificadas (TCID 50/mL) de 3 estirpes de influenza A (1 H1N1, 1 2009H1N1 e
1 H3N2), e 3 estirpes de influenza B, seriamente diluídas em matriz nasofaríngea negativa. Cada diluição foi
extraída utilizando o sistema NucliSENS easyMAG e testada em réplicas de concentração a 20% do vírus nas
plataformas 7500 Fast Dx da Applied Biosystems® ou SmartCycler® II da Cepheid®. A sensibilidade analítica
(LD) foi definida como a concentração mais baixa, na qual 95 % de todas as réplicas obtiveram um teste com
resultado positivo.
Nível de deteção
Estirpe
Final TCID50/mL LD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/México/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malásia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Página 24 de 33
Inibição concorrencial
A inibição concorrencial do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi avaliada utilizando amostras
simuladas com concentrações variáveis de vírus de influenza A (2x LD a 4 log. acima de LD) e vírus de influenza
B (2x LD a 4 log. acima de LD) numa única amostra. As amostras foram extraídas com o instrumento NucliSENS
easyMAG e testadas em triplicado. A presença do vírus de influenza A e vírus de influenza B em concentrações
varáveis numa única amostra não teve qualquer efeito na sensibilidade analítica (limite de deteção ou LD) do
ensaio molecular Influenza A+B da Quidel.
Reatividade analítica (Inclusividade)
A reatividade do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi avaliada contra múltiplas estirpes de vírus de
influenza A e influenza B. O painel clínico era composto por 10 estirpes de influenza A de subtipo H1N1, 2 de
influenza A de subtipo 2009H1N1, 8 de influenza A de subtipo H3N2, 2 de influenza A de subtipo H5N1 e 13 de
influenza B. Foi igualmente testado um painel adicional de isolados restritos não clínicos. Cada membro do
painel foi extraído utilizando o instrumento NucliSens easyMAG e testado em triplicado.
O ensaio molecular Influenza A+B da Quidel detetou 100 % das estirpes de influenza A (38/38) e de influenza B
2
3
(15/15) em níveis de 10 a 10 TCID50/mL incluindo, estirpes novas, pandémicas e de influenza aviária A e
estirpes de influenza B de circulação recente.
Painel clínico de vírus de influenza A
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
A/Nova Caledónia/20/1999
1,12E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Nova Jérsei/8/76
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/NWS/33
NA
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/México/4108/2009
1,40E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Ilhas Salomão/3/06
1,41E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
4,57E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Uruguai/7/16/2007
1,03E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Subtipo
Estirpe
TCID50/mL
H1N1
H1N1 A/Califórnia/07/2009
H1N1
Página 25 de 33
Vírus de influenza B do painel clínico
Estirpe
TCID50/mL
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Panamá/45/90
1,02E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Malásia/25/06/04
3,41E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Allen/45
4,17E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Rússia/69
2,19E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Lee/40
1,95E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Vírus restritos não clínicos
Subtip
o
Estirpe
TCID50/m
L
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
H2N2
A/Pato-real/NY/6750/78 (H2N2)
2,00E+02
H7N3
A/Galinha/NJ/15086-3/94 (H7N3)
2,00E+02
H9N2
A/Galinha/NJ/12220/97 (H9N2)
2,00E+02
H4N8
A/Pato-real/OH/338/86 (H4N8)
2,00E+02
H6N2
A/Galinha/CA/431/00 (H6N2)
2,00E+02
H8N4
A/Pato-d’asa-azul/LA/B174/86 (H8N4)
2,00E+02
H5N1
2,00E+02
H10N7
2,00E+02
H11N9
A/Galinha/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
B
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
A
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
B
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Página 26 de 33
Vírus restritos não clínicos
Subtip
o
Estirpe
TCID50/m
L
H12N5
A/Pato/LA/188D/87 (H12N5)
2,00E+02
H13N6
A/Gaivota/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
H14N5
A/Pato-real/GurjevRússia/262/82
(H14N5)
2,00E+02
H15N9
A/Cagarra/Austrália/2576/79 (H15N9)
2,00E+02
H16N3
A/Ave limícola/DE/172/2006(H16N3)
2,00E+02
(7500 Fast Dx)
A
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
(SmartCycler)
B
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
A
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
Positiv
o
B
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Negativ
o
Reprodutibilidade
A reprodutibilidade intra-laboratório do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi calculada em 3
instalações laboratoriais. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando um painel de 6 amostras
simuladas que incluíram amostras de controlo positivas e negativas, de vírus de influenza A e de
influenza B médias (10x LD) e elevadas negativas (concentração C20-60). Painéis e controlos foram
testados em cada instalação por 2 operadores durante 5 dias (8 amostras e 3 controlos × 2
operadores × 5 dias × 3 instalações = 330). Os painéis e controlos foram extraídos utilizando o
sistema NucliSENS easyMAG e testados no instrumento 7500 Fast Dx.
Reprodutibilidade
Instalação 1
Painel
ID de membro
Influenza A negativa elevada
Influenza A positiva (10x LD)
Influenza B negativa elevada
Influenza B positiva (10x LD)
Controlo positivo
de influenza A
Controlo positivo
de influenza B
Controlo negativo
Instalação 2
Instalação 3
%CV
Acordo com
resultados
previstos
AVE
Ct
%CV
Acordo total
com resultado
previsto
N/A
N/A
9/10
34,3*
N/A
25/30
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
Acordo com
resultados
previstos
AVE
Ct
%CV
Acordo com
resultados
previstos
AVE
Ct
6/10
31,5*
8,8
10/10
10/10
24,7
2,1
9/10
34,9
10/10
Página 27 de 33
Especificidade analítica - Reatividade cruzada
A especificidade analítica do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi avaliada através de teste de um
painel composto por 26 estirpes virais, 24 estirpes bacteriais e 1 estirpe fúngica representantes de patogénios
respiratórios comuns ou de flora mais comum presente na nasofaringe. As bactérias e fungos foram testados
5
10
3
6
em concentrações de 10 a 10 CFU/mL. Os vírus foram testados em concentrações de 10 a 10 TCID50/mL. As
amostras foram extraídas com o instrumento NucliSENS easyMAG e testadas em triplicado. A especificidade
analítica do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi de 100%.
Reatividade cruzada
3,70E+04
Resultado de
influenza A
Negativo
Resultado de
influenza B
Negativo
hMPV B1
2,37E+04
Negativo
Negativo
VSR Long
4,40E+04
Negativo
Negativo
VSR Washington
1,75E+0
Negativo
Negativo
Adenovírus 1/Adenóide 71
5,67E+04
Negativo
Negativo
Coronavírus 229E
1,70E+06
Negativo
Negativo
Coronavírus OC43
1,67E+06
Negativo
Negativo
Vírus de Coxsackie B4
2,43E+06
Negativo
Negativo
Vírus de Coxsackie B5/10/2006
2,28E+06
Negativo
Negativo
Citomegalovírus
8,76E+05
Negativo
Negativo
Ecovírus 7
5,38E+08
Negativo
Negativo
Ecovírus 9
1,50E+06
Negativo
Negativo
Ecovírus 6
1,05E+08
Negativo
Negativo
Ecovírus 11
1,50E+05
Negativo
Negativo
Enterovírus 71
2,68E+03
Negativo
Negativo
Enterovírus 70
1,66E+05
Negativo
Negativo
Vírus de Epstein-Barr
5.000 cp/mL
Negativo
Negativo
Estirpe Maclnytre do VHS de
Tipo 1
1,95E+06
Negativo
Negativo
Estirpe G do VHS de Tipo 2
3,67E+06
Negativo
Negativo
Rubéola
3,78E+05
Negativo
Negativo
Vírus da papeira
8,43E+04
Negativo
Negativo
Parainfluenza de Tipo 1
2,50E+05
Negativo
Negativo
2,20E+04
Negativo
Negativo
9,10E+05
Negativo
Negativo
9,57E+06
Negativo
Negativo
Vírus Varicela Zoster
7,50E+02
Negativo
Negativo
1,04E+07
Negativo
Negativo
2,55E+07
Negativo
Negativo
2,10E+05
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
6,90E+08
Negativo
Negativo
ID do organismo
Conc. final
hMPV A1
Página 28 de 33
Reatividade cruzada
6,60E+07
Resultado de
influenza A
Negativo
Resultado de
influenza B
Negativo
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativo
Negativo
5,90E+07
Negativo
Negativo
5,15E+07
Negativo
Negativo
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativo
Negativo
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativo
Negativo
2,15E+07
Negativo
Negativo
1,85E+08
Negativo
Negativo
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativo
Negativo
3,30E+07
Negativo
Negativo
Escherichia coli
6,80E+07
Negativo
Negativo
5,85E+07
Negativo
Negativo
6,0E+05
Negativo
Negativo
1,03E+08
Negativo
Negativo
4,5E+07
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
2,50E+06
Negativo
Negativo
2,6E+07
Negativo
Negativo
5,15E+08
Negativo
Negativo
Candida albicans
1,07E+06
Negativo
Negativo
ID do organismo
Conc. final
Especificidade analítica - Substâncias interferentes
O desempenho do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel foi avaliado com substâncias potencialmente
interferentes passíveis de estar presentes em amostras nasofaríngeas. As substâncias potencialmente
interferentes foram avaliadas em influenza A (A/México/4108/2009), e influenza B (B/Florida/04/2006) em
concentrações de 3x e 10x LD. Não foi observada interferência causada pelas substâncias testadas a seguir
apresentadas a 3x ou 10x LD.
Concentração testada
Resultado de
influenza A
(3x LD)
Resultado de
influenza B
(3x LD)
60 µg/mL
Positivo
Positivo
Sangue (humano), EDTA anticoagulado
2% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Neo-sinefrina
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Spray nasal Afrin
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Gel nasal líquido homeopático anti-gota
que não provoca sonolência para alívio de
alergias Zicam
5% (vol/vol)
Positivo
Positivo
15% (vol/vol) da dose
Positivo
Positivo
Nome da substância
Mucina
(Glândula submaxilar de bovino, tipo I-S)
Spray nasal salino
Página 29 de 33
Nome da substância
Concentração testada
Resultado de
influenza A
(3x LD)
Resultado de
influenza B
(3x LD)
Pastilhas para a garganta
0,68 g/mL; 1/18 de
pastilha, esmagada;
ingredientes ativos:
1,7 mg/mL de mentol
Positivo
Positivo
3,3-5 mg/mL
Positivo
Positivo
Tobramicina
4,0 µg/mL
Positivo
Positivo
Mupirocina
6,6-10 mg/mL
Positivo
Positivo
Fosfato de oseltamivir
7,5-25 mg/mL
Positivo
Positivo
Zanamivir
Estudos de transferência e contaminação cruzada
Num estudo interno realizado, não foi observada transferência/contaminação cruzada com o ensaio molecular
Influenza A+B da Quidel utilizando o instrumento automatizado de extração de ácido nucleico NucliSens
easyMAG da bioMérieux.
Fontes adicionais
1.
Influenza A Viruses (março de 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
(abril de 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1594.pdf.
3. Guidance on Informed Consent for In Vitro Diagnostic Device Studies Leftover Human Specimens that are
Not Individually Identifiable (abril de 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
(dezembro de 2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
5. CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations
(Vol. 2, N.º 34) (outubro de 2004).
Methods (Vol. 25, N.º 31) (dezembro de 2005).
7. CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, N.º 27, segunda ed.)
(novembro de 2005).
8. CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, N.º 14)
(setembro de 2002).
9. CLSI MM6-A: Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, N.º 28)
(outubro de 2003).
(Vol. 24, N.º 25, segunda edição) (agosto de 2004).
Assistência técnica e ao cliente
Para efetuar uma encomenda ou solicitar assistência técnica, contacte um representante da Quidel através
do (800) 874-1517 (n.º de telefone gratuito nos EUA) ou (858) 552-1100, de segunda a sexta-feira, entre
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fax, através do (740) 592-9820. Para assistência através de e-mail, contacte [email protected] ou
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informações adicionais sobre a Quidel, os nossos produtos e distribuidores no site Web quidel.com.
Propriedade intelectual
Marcas registadas
Cepheid® e Smartcycler® são marcas comerciais registadas da Cepheid Corporation. Applied Biosystems® é
uma marca comercial registada da Life Technologies. NucliSENS® e easyMAG® são marcas comerciais
registadas da bioMerieux, Inc. TaqMan® é uma marca comercial registada da Roche. CAL Flour® Orange 560,
CAL Flour® Red 610 e Quasar® 670 são marcas comerciais registadas da BioSearch Technologies, Inc.
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Patentes
Os compostos corantes deste produto são vendidos sob licença da BioSearch Technologies, Inc. e são
protegidos por patentes norte-americanas e mundiais emitidas ou pendentes de aprovação.
A aquisição deste produto concede direitos ao comprador ao abrigo de determinadas patentes da Roche de
utilização exclusiva na prestação de serviços de diagnóstico in vitro humano. Não é concedida aqui qualquer
patente geral ou outra licença de qualquer tipo para além deste direito de utilização específico resultante
da compra.
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Glossário
Representante autorizado
na Comunidade Europeia
Fabricante
Conteúdo/Contém
Controlo
Utilizar até
Número de catálogo
Número do lote
Para utilização em
diagnóstico in vitro
Consulte as instruções de utilização
Utilização prevista
96
Contém o suficiente para 96 determinações
Limitação de temperatura
Página 32 de 33
Referências
1
http://1918.pandemicflu.gov acedido em 06/09/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm acedido em 06/09/11.
4
M100 - Kit do ensaio molecular Influenza A+B da Quidel
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Alemanha
Quidel Corporation
San Diego, CA 92121 EUA
quidel.com
M0002GPT00 (12/2012)
Página 33 de 33
Ensayo Influenza A+B
Instrucciones de uso
Para la detección cualitativa y la identificación de los ácidos nucleicos de los virus de la gripe
tipo A y tipo B extraídos de muestras de exudado nasal o nasofaríngeo, y muestras de
aspirado/lavado nasal.
Ensayo Influenza A+B (CE) de Quidel Molecular
Página 1 de 32
Contenido
Indicaciones .................................................................................................................................................. 4
Resumen y explicación .................................................................................................................................. 4
Principios del procedimiento ........................................................................................................................ 4
Materiales proporcionados........................................................................................................................... 6
Materiales opcionales ................................................................................................................................... 6
Materiales necesarios pero no proporcionados ........................................................................................... 6
Advertencias y precauciones ........................................................................................................................ 7
Conservación y manipulación de los reactivos del kit .................................................................................. 7
Recogida, conservación y manipulación de muestras .................................................................................. 8
Conservación de los extractos de ácidos nucleicos ...................................................................................... 8
Instrucciones de programación para la extracción de ácidos nucleicos ....................................................... 8
Programación inicial del termociclador ...................................................................................................... 10
Instrucciones de programación del SmartCycler II ................................................................................. 10
Instrucciones de programación del 7500 Fast DX................................................................................... 12
Instrucciones de programación de Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument . 16
Procedimiento del ensayo .......................................................................................................................... 16
Protocolo de amplificación en el SmartCycler II ..................................................................................... 16
Protocolo de amplificación en el termociclador ABI 7500 Fast Dx ......................................................... 17
Protocolo de amplificación en el QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument....................................... 18
Interpretación de los resultados ................................................................................................................. 19
Interpretación de los resultados obtenidos con el SmartCycler II .......................................................... 19
Interpretación de los resultados obtenidos con el termociclador 7500 Fast Dx .................................... 20
Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento Dx Real-Time PCR QuantStudio ......... 20
Control de calidad ....................................................................................................................................... 21
Limitaciones ................................................................................................................................................ 21
Rendimiento clínico .................................................................................................................................... 21
Rendimiento analítico ................................................................................................................................. 24
Nivel de detección ...................................................................................................................................... 24
Página 2 de 32
Inhibición competitiva ................................................................................................................................ 25
Reactividad analítica (inclusividad) ............................................................................................................. 25
Reproducibilidad ......................................................................................................................................... 27
Especificidad analítica – reactividad cruzada.............................................................................................. 27
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre ....................................................................................... 29
Material de consulta adicional .................................................................................................................... 29
Atención al cliente y servicio técnico .......................................................................................................... 30
Propiedad intelectual .................................................................................................................................. 30
Marcas comerciales .................................................................................................................................... 30
Glosario ....................................................................................................................................................... 31
Referencias.................................................................................................................................................. 32
Página 3 de 32
Indicaciones
El ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular es un ensayo de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa –
transcriptasa inversa) múltiple en tiempo real para la detección cualitativa y la identificación de los ácidos
nucleicos de los virus de la gripe tipo A y tipo B extraídos de muestras de exudado nasal o nasofaríngeo, y
muestras de aspirado/lavado nasal. Esta prueba diagnóstica in vitro está indicada como ayuda para el
diagnóstico diferencial de las infecciones causadas por el virus de la gripe tipo A o B en seres humanos. El
ensayo no detecta la presencia del virus de la gripe tipo C.
Los resultados negativos no descartan la infección del virus de la gripe y no deben ser usados como la única
base para el diagnóstico ni para tomar otras decisiones terapéuticas o similares. Las características de
rendimiento de la gripe A se determinaron cuando los virus de la gripe A predominantes en circulación
correspondían a las cepas A/H3 y A/H1. Es posible que las características de rendimiento varíen cuando
aparezcan otras cepas del virus de la gripe tipo A.
Resumen y explicación
Los virus de la gripe (de la familia Orthomyxoviridae) tienen un genoma de ARN de simple cadena, que se
encuentra en 8 segmentos distintos de ribonucleoproteínas. Esta segmentación del genoma es poco común en
los virus y es probable que tenga un papel importante en el desarrollo rápido de nuevas cepas de gripe en el
intercambio de segmentos génicos cuando dos virus distintos infectan la misma célula. Existen 3 tipos de gripe:
la A, la B y la C. La gripe A tiene sus contrapartes en aves y cerdos, además de los humanos, en tanto que los
tipos B y C solo se conocen en humanos. Frente a la posibilidad de otra pandemia provocada por la gripe A,
1
como sucedió en 1918 cuando entre 30 y 50 millones de personas murieron en todo el mundo , los Centros
para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) y la Organización Mundial de la
Salud (OMS) investigan las cepas de gripe y realizan predicciones de posibles cepas para la producción de
vacunas.
Se estima que en EE. UU. ocurren entre 30.000 y 49.000 muertes por año a causa de enfermedades asociadas
2
con la gripe. En todo el mundo, las epidemias anuales de gripe provocan entre tres y cinco millones de casos
3
de enfermedades graves y entre 250.000 y 500.000 muertes. Las pandemias de gripe A suceden cada 10 o 30
años mientras que las epidemias de gripe A o B ocurren todos los años. El contagio es estacional y, en el
hemisferio norte, se extiende generalmente entre noviembre y abril. Suele provocar complicaciones en niños,
adultos mayores y personas con enfermedades cardiopulmonares.
El tiempo de incubación es de entre 1 y 3 días y se contagia rápidamente por inhalación de gotitas aéreas u
otros vectores pasivos. Se caracteriza por causar fiebre, mialgia, dolor de cabeza y faringitis.
Principios del procedimiento
El ensayo detecta ácidos nucleicos virales que se han extraído de la muestra del paciente. Se realiza una
reacción de RT-PCR múltiple en tiempo real en condiciones optimizadas en un único tubo y se generan
amplicones para cada uno de los virus diana que se encuentran en la muestra. Para la identificación de la gripe
A, se usan cebadores específicos de diana y sondas marcadas con fluorescencia que se hibridizan con las
secuencias conservadas de gripe A dentro del gen proteínico matriz. Para la identificación de la gripe B, se usan
cebadores específicos de diana y sondas marcadas con fluorescencia que se hibridizan con las secuencias
conservadas de gripe B dentro del gen de neuraminidasa.
Marcado de las sondas Quidel Molecular
Diana
Colorante
Gripe A
FAM
Gripe B
Control del proceso (PRC)
Quasar® 670
Página 4 de 32
A continuación, se presenta un resumen del procedimiento:
1.
Recogida de muestras: Obtener muestras de exudado nasal, exudado nasofaríngeo y aspirado/lavado
nasal de pacientes con síntomas mediante técnicas estándar. Las muestras se transportan, conservan y
4
procesan de acuerdo con los procedimientos de laboratorio establecidos.
2.
Extracción de ácidos nucleicos: Extraiga ácidos nucleicos de las muestras con el sistema NucliSENS®
easyMAG® siguiendo las instrucciones del fabricante y usando los reactivos apropiados (consulte
Materiales necesarios pero no proporcionados). No se ha validado el uso de otros sistemas de extracción
con el ensayo de Quidel Molecular Influenza A+B. La validación de otros sistemas es responsabilidad del
usuario final.
Previamente al procedimiento de extracción, añada 20 µl de control del proceso (PRC) a cada alícuota de
180 µl de la muestra. El PRC permite monitorear los inhibidores en las muestras extraídas, asegurar que se
haya producido la amplificación adecuada y confirmar que la extracción de ácidos nucleicos ha sido
suficiente.
3.
Rehidratación de la mezcla maestra: Rehidrate la mezcla maestra liofilizada con la solución de
rehidratación. La mezcla maestra contiene cebadores con oligonucleótidos, fluorocromo y sondas
marcadas con colorante de extinción cuyas dianas son regiones conservadas de los virus de la gripe A y la
gripe B, así como la secuencia del control del proceso.
4.
Amplificación y detección de los ácidos nucleicos: Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a cada
tubo de reacción o pocillo de la placa. Luego, añada 5 µl de los ácidos nucleicos extraídos (muestra con
PRC) al pocillo de la placa o a los tubos de reacción etiquetados apropiadamente Coloque la placa o el
TM
tubo en los instrumentos Life Technologies QuantStudio
Dx Real-Time PCR Instrument, Applied
Biosystems® 7500 Fast Dx o Cepheid ® SmartCycler® II, respectivamente. El ensayo ha sido validado con la
serie de instrumentos 7500.
Una vez que se añade el tubo de reacción o la placa al instrumento, se inicia el protocolo del ensayo. Este
protocolo inicia la transcripción inversa de las dianas del ARN generando ADN complementario y, luego, se
produce la amplificación de los amplicones diana. El ensayo Quidel Molecular Influenza A+B está basado
en el procedimiento químico TaqMan® y utiliza una enzima que tiene actividades de transcriptasa inversa,
ADN polimerasa y exonucleasa 5’-3’. Durante la amplificación de ADN, esta enzima corta la sonda unida a
la secuencia de ADN complementario, separando el colorante de extinción del colorante de notificación.
Este paso genera un aumento en la señal de fluorescencia a partir de la excitación mediante una fuente de
luz de longitud de onda apropiada. En cada ciclo, más moléculas de colorante se separan de sus colorantes
y generan una señal mayor. Si se logran señales de fluorescencia suficientes luego de 45 ciclos, la muestra
se informa como positiva para la detección de ácidos nucleicos.
Página 5 de 32
Materiales proporcionados
SKU N.º M100
Kit de detección (96 reacciones) – Conservar a temperaturas entre 2 °C y 8 °C
#
Componente
Cantidad


Solución de rehidratación Parte M5003
1 vial/kit 1,9 ml
Mezcla maestra para Quidel Molecular Influenza A+B Parte M5004
12 viales/kit,
8 reacciones/vial
Contenido liofilizado:
Enzima ADN polimerasa con actividad de la transcriptasa inversa
Cebadores y sondas
dNTP
Estabilizantes
Control del proceso Parte M5005
1 vial/kit 2,0 ml
Materiales opcionales
Controles positivos para gripe A y B (es decir, juego de control Quidel Molecular Influenza A+B N.º M106
que funciona como un control externo de procesamiento y extracción)
Materiales necesarios pero no proporcionados
Micropipetas (rango entre 1 a 10 μl y 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas anti-aerosoles
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument o Applied Biosystems 7500 Fast Dx
instrument
Placa de PCR de 96 pocillos del Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Film óptico para placas de Applied Biosystems
Centrífuga para placas ABI de 96 pocillos
O
Micropipetas (rango entre 1 a 10 μl y 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas anti-aerosoles
SmartCycler® II
Materiales desechables del SmartCycler
Centrífuga SmartCycler
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Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro
Si existe sospecha de infección con un nuevo virus de la gripe tipo A basándose en los criterios de
selección clínicos y epidemiológicos recomendados por las autoridades de salud pública, las muestras
deben recogerse con las precauciones apropiadas de control de infecciones para nuevas cepas virulentas
del virus de la gripe y enviarse a las autoridades sanitarias locales o estatales para su análisis.
Las características de rendimiento de esta prueba solo se han establecido con los tipos de muestras
indicados en el apartado Indicaciones. El rendimiento de este ensayo con otros tipos de muestras o
especímenes no ha sido evaluado.
No se ha validado el uso de sistemas de extracción distintos del sistema NucliSENS easyMAG. La validación
de estos sistemas es responsabilidad del usuario final.
El uso de condiciones de ciclo distintas a las indicadas en el apartado Instrucciones de programación del
termociclador puede dar lugar a resultados erróneos.
El uso de este producto debe limitarse a personal con una formación suficiente en las técnicas de PCR
y RT-PCR.
Trate todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas. Siga las precauciones universales al
manipular las muestras, este kit y su contenido.
La recogida, conservación y transporte correctos de las muestras son indispensables para obtener
resultados correctos.
Conserve los reactivos del ensayo tal como se indica en las etiquetas individuales.
Utilice ropa de protección adecuada, guantes y protección facial y ocular cuando utilice este kit.
Para obtener resultados exactos, pipetee con cuidado utilizando únicamente equipo calibrado.
Limpie a fondo y desinfecte todas las superficies con una solución de lejía al 10%, seguida de agua de
calidad para biología molecular.
Utilice micropipetas con barrera anti-aerosoles o puntas de desplazamiento positivo para todos
los procedimientos.
Evite la contaminación y la contaminación microbiológica de los reactivos del kit. Siga las buenas prácticas
de laboratorio.
No mezcle reactivos de kits con números de lote distintos.
No utilice reactivos de otros fabricantes con este kit.
No utilice el producto después de la fecha de caducidad.
La planificación correcta del flujo de trabajo es fundamental para reducir al mínimo el riesgo de
contaminación. Planifique siempre el flujo de trabajo del laboratorio de forma unidireccional,
comenzando con la preamplificación y avanzando por los pasos de amplificación y detección.
Utilice suministros y equipos dedicados exclusivamente a las áreas de preamplificación y amplificación.
No permita el movimiento cruzado de personal o equipo entre una zona y otra.
Mantenga siempre los suministros de la zona de amplificación separados de los de la zona
de preamplificación.
No abra los tubos de muestra ni destape las placas después de la amplificación.
Deseche cuidadosamente el material amplificado, de acuerdo con la legislación y las normativas locales
para minimizar el riesgo de contaminación con los amplicones.
No utilice los suministros dedicados a la preparación de reactivos o muestras para procesar el ácido
nucleico diana.
La ficha de datos sobre seguridad de materiales se puede solicitar o consultar en la página web del
producto.
Conservación y manipulación de los reactivos del kit
Conserve el kit sin abrir a una temperatura de 2 °C a 8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja
exterior del kit.
La mezcla maestra rehidratada puede conservarse a temperatura ambiente (de 20 °C a 25 °C) durante 24
horas como máximo. Para conservar la mezcla maestra rehidratada durante más tiempo, es necesario
volver a taparla, sellarla con Parafilm y conservarla en posición vertical a ≤ -20 °C durante un máximo de
14 días. Durante su conservación, proteja la mezcla maestra de la luz.
Indicaciones de inestabilidad o deterioro de los reactivos: La turbidez en la solución de rehidratación puede
indicar el deterioro de este reactivo. Llame al servicio técnico de Quidel para cambiarla.
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Recogida, conservación y manipulación de muestras
Las muestras usadas para la validación del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B se obtuvieron mediante
técnicas estándar de pacientes con síntomas de infección de las vías respiratorias superiores. Estas muestras
fueron recogidas, transportadas, conservadas y procesadas de acuerdo con el CLSI M41-A.
Conservación de los extractos de ácidos nucleicos
El usuario es responsable de validar los procedimientos y las condiciones de conservación utilizados en su
laboratorio. Los eluidos pueden conservarse habitualmente a temperatura ambiente (de 20 °C a 25 °C) durante
2 horas, de 2 °C a 8 °C durante 8 horas o durante 1 mes de -20 °C a 70 °C. No se recomienda conservar
cantidades pequeñas (p. ej., 5 μl o menos) de extracto de ácidos nucleicos.
Instrucciones de programación para la extracción de ácidos nucleicos
1.
Encienda el instrumento y espere a que la luz del instrumento esté de color naranja. A continuación,
encienda el ordenador y abra el software easyMAG.
2.
Lea los códigos de barras de los reactivos después de pulsar los botones “Instrumento”
“Inventario de reactivos”
3.
4.
.
Para introducir las muestras, pulse el botón “Uso diario”
a la pantalla “Definir solicitud”
a. ID de la muestra:
b. Matriz:
c. Solicitud:
d. Volumen (ml:
e. Eluido (µl):
f. Tipo:
g. Prioridad:
Al pulsar el botón “Guardar”
e
, que lo llevará de forma predeterminada
. Seleccione los siguientes valores:
escriba el nombre de la muestra con el teclado.
seleccione Otra en el menú desplegable
seleccione Genérico en el menú desplegable
seleccione 0.200 en el menú desplegable
seleccione 50 en el menú desplegable
Principal
Normal
, la muestra aparecerá en la ventana “Muestra no asignada” en el lado
izquierdo de la pantalla. Pulse el botón “Introducir nueva solicitud de extracción”
y repita el
procedimiento con las demás muestras. También es posible introducir varias muestras con el botón
“Creación automática de nuevas solicitudes de extracción”
5.
.
Una vez que haya creado todas las muestras, vaya a “Organizar análisis”, haciendo clic en el icono
situado cerca de la parte superior de la página. Pulse el botón “Crear análisis”
análisis. Introduzca un nombre para el análisis o utilice el nombre predeterminado.
6.
para crear un
Utilice el botón “Rellenar análisis automáticamente”
para añadir muestras al análisis (la opción
automática rellena un máximo de 24 muestras de la “Lista de muestras no asignadas” en el lado izquierdo
de la pantalla). También es posible incluir o excluir muestras individuales del análisis utilizando los iconos
de posición izquierdo y derecho
después de seleccionar la muestra adecuada. El orden de
Página 8 de 32
las muestras en el análisis puede modificarse con los botones “Subir/Bajar solicitud de extracción”
7.
8.
.
Obtenga de 1 a 3 recipientes de muestra (para 8 a 24 muestras, respectivamente) y añada 20 µl de control
del proceso a cada pocillo de muestra utilizado.
Añada 180 µl de cada muestra al pocillo designado adecuado.
9.
Vaya “Cargar análisis” pulsando el botón
situado cerca de la parte superior de la pantalla.
Introduzca las puntas y los recipientes de muestra en el instrumento.
10. Introduzca el/los código(s) de barras del/de los recipiente(s) de muestra.
11. Introduzca el/los código(s) de barras de las microesferas de sílice que va a utilizar.
12. Asigne las microesferas de sílice a las muestras de la siguiente forma:
a. Haga clic en el símbolo de los reactivos que aparece debajo del número 1 en la figura siguiente. El
número de lote de las microesferas de sílice debe aparecer debajo de la ficha Sílice, señalada con
el número 2 en la siguiente figura.
b. Resalte y seleccione las muestras del análisis a las que desea asignar las microesferas (en el
cuadro señalado con el número 3 en la figura siguiente).
c.
d.
Haga clic en el icono de colocación
(debajo del número 4 en la figura siguiente) para
asignar el número de lote de sílice a las muestras seleccionadas.
Si se selecciona el símbolo de las microesferas (a la derecha del número 5 en la figura siguiente),
se mostrará el número del lote de las microesferas de sílice para cada muestra.
13. Toque el icono “Cargar análisis” y, a continuación, pulse el icono de “Imprimir lista de trabajo” para
imprimir la lista de trabajo
.
14. Pulse el botón “Dispensar lisis”
. Tardará aproximadamente 12 minutos en completarse la lisis en el
instrumento.
15. Prepare partículas magnéticas para cada recipiente de muestra utilizando la pipeta Biohit y puntas para un
máximo de ocho reacciones, de la siguiente forma:
a. Con una punta y el Programa 1, aspire 550 µl de agua sin nucleasa y dispénselos en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml sin de ADNasa y ARNasa.
b. Agite la sílice magnética en el mezclador vórtex. Con una punta y el Programa 1, aspire 550 µl de
sílice magnética, dispénselos en el agua y agite en el mezclador vórtex.
Página 9 de 32
c.
d.
e.
f.
Con una punta y el Programa 2, aspire 1050 µl de la mezcla de sílice magnética y dispense 25 µl al
mismo tubo.
Dispense 125 µl de la mezcla de sílice magnética 8 veces en 8 pocillos de una placa de tiras para
ELISA. Deseche la punta.
Cuando finalice la lisis (Nota: el estado del instrumento indicado en la parte inferior de la pantalla
debe ser “EN ESPERA”, utilice 8 puntas y el Programa 3 para aspirar 100 µl de la mezcla de sílice
magnética de los pocillos de las tiras, dispense 100 µl de la mezcla de sílice en los pocillos y aspire
de nuevo los 100 µl.
Introduzca las puntas en el líquido de los recipientes de muestra. Aspire 800 µl y después
dispense de nuevo 900 µl de la mezcla de sílice magnética en el recipiente. Aspire 1000 µl de la
mezcla de sílice magnética del recipiente y dispense los 1000 µl de nuevo en el recipiente. Repita
dos veces más la aspiración y dispensación de 1000 µl.
16. Cierre el instrumento y pulse el botón “Iniciar”
para comenzar el análisis.
17. Cuando finalice el análisis, transfiera el ácido nucleico purificado a los tubos sin nucleasa. Utilice de
inmediato los ácidos nucleicos purificados o congélelos a -70 °C.
Limitaciones: el siguiente protocolo se desarrolló específicamente para utilizarlo con este ensayo. Se
desconoce si es adecuado para utilizarlo con otros ensayos. Confirme la compatibilidad del software con
bioMérieux S.A.
Programación inicial del termociclador
Instrucciones de programación del SmartCycler II
1.
2.
Inicie el software SmartCyclerDx versión 3.0b.
Cree el ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular
a. Seleccione el botón Definir ensayos de la parte superior de la pantalla
b. Asigne un nombre al ensayo
i. Seleccione el botón Nuevo en la esquina inferior izquierda de la pantalla
ii. Escriba «Quidel Molecular Influenza A+B» y seleccione Aceptar.
iii. Se añadirá «Quidel Molecular Influenza A+B» a la parte superior de la lista Nombre del
ensayo, situada en la parte superior izquierda de la pantalla
c. Defina los valores del análisis: En el apartado Tipo de ensayo: Investigación, seleccione la ficha
Configuración del análisis y asegúrese de que estén establecidas las especificaciones siguientes:
i. Seleccione FATA25 en el menú desplegable Conjunto de colorantes
ii. El menú desplegable Tipo de análisis debe estar configurado en el valor predeterminado
iii. En la columna Nombre del canal, introduzca “Gripe A” en FAM, “Gripe B” en Alx532 y “PRC” en
Alx647
En la columna Uso, seleccione Diana en los menús desplegables para gripe A y gripe B, y
seleccione Control interno para PRC. Al seleccionar Control interno, aparecerá una ventana
emergente con la siguiente advertencia. Seleccione el botón Sí.
iv.
v. En la columna Análisis de la curva, introduzca el valor predeterminado Curva principal para
cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
vi. En la columna Valor umbral, introduzca el valor predeterminado Umbral manual para cada
canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
Página 10 de 32
vii. En la columna Unidades fluoroscópicas del umbral manual, introduzca los siguientes valores:
a. Gripe A:
20.0
b. Gripe B:
20.0
c. PRC:
20.0
viii. En la columna Ciclo mínimo válido, introduzca 10 para cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
ix. En la columna Ciclo máximo válido, introduzca 45 para cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
x. En la columna Sustracción del fondo, utilice el valor predeterminado “Activado para cada canal
(Gripe A, Gripe B, PRC).
xi. En la columna Mín. de ciclos para fondo, introduzca 5 para cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC)
(valor predeterminado).
xii. En la columna Máx. de ciclos para fondo, introduzca 45 para cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
xiii. En la columna Media de ciclos para suavizado, mantenga el valor predeterminado 0 para cada
canal (Gripe A, Gripe B, PRC).
xiv. En la columna Umbral del punto final, introduzca 20 para cada canal (Gripe A, Gripe B, PRC)
(valor predeterminado).
xv. En la columna NC IC%, mantenga el valor predeterminado «NA» para cada canal (PRC).
xvi. En la columna IC Delta, mantenga el valor predeterminado «NA» para cada canal (Gripe A,
Gripe B).
xvii. En el apartado Personalizar el texto de los resultados (a continuación de la tabla), seleccione
Texto de resultados basado en los microorganismos) en el menú desplegable. Aparecerá una
ventana emergente con la siguiente advertencia. Seleccione Sí.
xviii. Seleccione el botón Personalizar para abrir el cuadro de diálogo Texto de resultados basado
en los microorganismos. Seleccione el botón Añadir, introduzca “Gripe A” en la columna
Nombre del microorganismo y seleccione la casilla Gripe A. Seleccione de nuevo el botón
Añadir, introduzca “Gripe B” en la columna Nombre del microorganismo y seleccione la casilla
Gripe B.
d.
Haga clic en Aceptar en la parte inferior de la ventana emergente.
Configure las temperaturas y los tiempos de los ciclos de RT-PCR en la parte inferior de la pantalla de
la siguiente forma:
i. Etapa 1
1. Retener
2. Temp:
55.0
3. Segundos:
300
Página 11 de 32
4.
Óptica:
Desactivada
1.
2.
3.
4.
Retener
Temp:
Segundos:
Óptica:
60.0
300
Desactivada
1.
2.
3.
4.
Retener
Temp:
Segundos:
Óptica:
65.0
300
Desactivada
ii. Etapa 2
iii. Etapa 3
iv. Etapa 4
1.
2.
3.
3.
Ciclo con 2 temperaturas
Repetir_veces:
50
Fila de la primera temperatura:
a. Temp:
92.0
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
4. Fila de la segunda temperatura
a. Temp:
57.0
b. Segundos: 40
c. Óptica:
Activada
Guarde el protocolo seleccionando el botón Guardar en la parte inferior de la pantalla.
Figura del protocolo Influenza A+B de Quidel Molecular finalizado
Limitaciones: el siguiente protocolo se desarrolló para su uso específico con el ensayo de RT-PCR en tiempo
real Influenza A+B de Quidel Molecular. Se desconoce si es adecuado para utilizarlo con otros ensayos.
Confirme la compatibilidad del software con Cepheid.
Instrucciones de programación del 7500 Fast DX
1.
2.
Inicie el paquete de software 7500 Fast Dx.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido. Seleccione el botón Crear documento nuevo
para iniciar el Asistente para documentos nuevos. Siga cada paso para iniciar el protocolo Influenza A+B
de Quidel Molecular.
a. Defina el documento: la mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor
predeterminado. Si no es así, cámbielos según corresponda.
Página 12 de 32
i. Confirme o introduzca la siguiente información.
b.
c.
d.
Ensayo:
Curva estándar (cuantificación absoluta)
Recipiente:
Placa transparente de 96 pocillos
Plantilla:
Documento en blanco
Modo de análisis:
Fast 7500
Usuario:
el nombre del usuario
Comentarios:
SDS v1.4 (añadir más si es necesario)
Nombre de la placa:
ii. Seleccione el botón Siguiente.
Seleccione los detectores: deben añadirse nuevos detectores para gripe A, gripe B y el control del
proceso (PRC). Seleccione el botón Detector nuevo para cada diana, para abrir la ventana
emergente Detector nuevo. También puede utilizar el botón Crear otro desde de la ventana
emergente Detector nuevo para los dos últimos detectores.
i. Introduzca la siguiente información para cada detector:
Nombre
Colorante
Colorante
Color
de notificación
de extinción
Gripe A
FAM
(ninguno)
(seleccionar)
Gripe B
JOE
(ninguno)
(seleccionar)
PRC
Cy5
(ninguno)
(seleccionar)
ii. Seleccione un color único que represente a cada detector.
iii. Resalte los nuevos detectores y añádalos a la columna Detectores en el documento con
el botón Añadir.
iv. Seleccione (ninguno) en el menú desplegable Referencia pasiva.
v. Seleccione el botón Siguiente.
vi. Seleccione el botón Finalizar sin definir ningún pocillo.
El asistente se cerrará y se abrirá el software en la ficha Configuración. Aparecerá la placa de
muestras configurada durante el inicio rápido. Para la configuración inicial, no es necesario
realizar ningún cambio en esta ficha.
Definición del protocolo del termociclador: Seleccione la ficha Instrumento para configurar las
temperaturas y los tiempos de los ciclos de RT-PCR del ensayo Influenza A+B de Quidel
Molecular. En Perfil térmico, debe aparecer un protocolo de dos etapas predeterminado. Cada
etapa tiene 3 cuadros de texto que el usuario puede modificar. El valor del cuadro superior
representa el número de repeticiones o ciclos en esa etapa. El valor del cuadro central representa
la temperatura (˚C) y el valor del cuadro inferior representa el tiempo (minutos:segundos).
Página 13 de 32
i. Realice los cambios siguientes en el predeterminado:
1. Etapa 1
a. Repeticiones:
1
b. Temp:
55
c. Tiempo:
5:00
2. Seleccione la barra que aparece entre Etapa 1 y Etapa 2. Seleccione el botón
Añadir retención para añadir otra etapa.
3. Etapa 2
a. Repeticiones:
1
b. Temp:
60
c. Tiempo:
5:00
4. Seleccione la barra que aparece entre Etapa 2 y Etapa 3. Seleccione el botón
Añadir retención para añadir otra etapa.
5. Etapa 3
a. Repeticiones:
1
b. Temp:
65
c. Tiempo:
5:00
6. Etapa 4, (etapa de disociación en dos pasos)
a. Repeticiones: 10
b. Paso 1
i. Temp:
92
ii. Tiempo:
0:05
c. Paso 2
i. Temp:
57
ii. Tiempo:
0:40
7. Seleccione la barra que aparece a la derecha de Etapa 4. Seleccione el botón
Añadir ciclo para añadir otra etapa.
8. Etapa 5, (etapa de disociación en dos pasos)
a. Repeticiones: 35
b. Paso 1
i. Temp:
92
ii. Tiempo:
0:05
c. Paso 2
i. Temp:
57
ii. Tiempo:
0:40
9. Si se añade una etapa incorrecta, puede eliminarla pulsando el botón Eliminar
después de resaltar la etapa entre las líneas verticales.
ii. En Configuración, introduzca lo siguiente:
Volumen de muestra, µl:
20 (predeterminado)
Modo de análisis:
7500 Fast (predeterminado)
Recogida de datos:
Etapa 5, Paso 2 (57,0 a 0:40)
NOTA: no seleccione la casilla situada junto a “Modo experto”.
Página 14 de 32
iii. Protocolo final
e.
Defina el umbral para cada analito.
i. Seleccione la ficha Resultados.
ii. Seleccione la ficha Gráfico de amplificación.
iii. Seleccione Gripe A en la esquina superior derecha de la ficha Detector.
iv. En el bloque Configuración del análisis, establezca Umbral en 1.5e5.
v. Seleccione el botón de radio Línea base automática.
vi. Repita los pasos iii a v para la gripe B, estableciendo Umbral en 1.2e5.
vii. Repita los pasos iii a v para establecer el valor Umbral de PRC en 2.7e4.
f.
Guarde el protocolo nuevo como una plantilla utilizarlo en el futuro.
i. En la parte superior de la pantalla, seleccione Archivo y, a continuación, Guardar como.
ii. Guardar en: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nombre del archivo: ‘Quidel Molecular Influenza A+B’
iv. Guardar como tipo: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Salga del software.
g.
Limitaciones: el siguiente protocolo se desarrolló específicamente para utilizarse con este ensayo. Se
desconoce si es adecuado para utilizarlo con otros ensayos. Confirme la compatibilidad del software con Life
Technologies.
Página 15 de 32
Instrucciones de programación de Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR Instrument
La programación del instrumento se realiza mediante el uso de un archivo TDD que viene con el kit
de prueba.
Procedimiento del ensayo
Lleve a cabo los procedimientos siguientes a temperatura ambiente controlada de 20 °C a 25 °C.
Procedimiento de extracción de ácidos nucleicos
Consulte las instrucciones de programación del sistema NucliSENS easyMAG más arriba.
1. Añada 20 µl de control del proceso al pocillo de extracción de muestra.
2. Añada 180 µl de muestra de paciente o control externo a un pocillo de extracción de muestra.
3. Siga las instrucciones del fabricante para realizar la extracción.
Procedimiento de rehidratación de la mezcla maestra
1. Determine el número de muestras que va a analizar y obtenga el número correcto de viales de mezcla
maestra liofilizada para ocho pruebas para realizar el análisis.
2. Vuelva a poner los reactivos no utilizados en las condiciones de conservación adecuadas.
3. Abra con cuidado la mezcla maestra para no alterar el precipitado.
4. Añada 135 µl de solución de rehidratación a la mezcla maestra.
5. Deje el vial a temperatura ambiente durante 1-2 minutos para que se rehidrate el precipitado.
6. Pipetee suavemente aspirando y dispensando 2-3 veces, evitando la formación de burbujas, antes de
dispensar la solución en el primer tubo de PCR o pocillo de la placa.
Nota: la mezcla maestra rehidratada es suficiente para ocho reacciones.
Nota: la mezcla maestra rehidratada puede mantenerse a temperatura ambiente durante 24 horas
como máximo o a ≤ -20 °C durante 14 días como máximo. (Consulte otras opciones de conservación
en el apartado “Conservación y manipulación de los reactivos del kit”).
Procedimiento de preparación de la RT-PCR:
1. Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a cada tubo de reacción o pocillo de la placa.
2. Añada 5 µl de ácidos nucleicos extraídos (muestra con el control del proceso) a los tubos de reacción
o los pocillos de la placa. No es necesario mezclar los reactivos.
Nota: utilice una micropipeta nueva y una punta anti-aerosoles nueva para cada muestra extraída.
3. Cierre los tubos de reacción o selle la placa.
Nota: Quidel recomienda incluir un tubo de reacción o un pocillo con un control positivo externo de
gripe A/B y un control negativo en cada serie del termociclador Analice los controles de acuerdo con
las prácticas y las políticas del laboratorio.
4. Centrifugue los tubos de reacción o la placa durante 15 segundos como mínimo. Asegúrese de que
todo el líquido esté en el fondo del tubo.
5. Introduzca los tubos o la placa en el termociclador.
Protocolo de amplificación en el SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Encienda el/los bloque(s) del SmartCycler
Inicie el paquete de software SmartCycler Dx versión 3.0b
Seleccione el botón de Crear análisis de la parte superior de la pantalla para configurar el análisis
En Nombre del análisis, escriba el nombre del análisis en curso (AAMMDD-Quidel Molecular Influenza
A+B)
En Notas, escriba cualquier comentario que desee sobre el análisis para utilizarlo como referencia en
el futuro
En Ensayo, seleccione el ensayo «Quidel Molecular Influenza A+B» en el menú desplegable
En Información del ensayo, introduzca el número de lote y la fecha de caducidad del kit.
Para seleccionar los pocillos que utilizarán, siga uno de estos métodos:
a. Para asignar automáticamente los pocillos:
i. En Número de muestras, introduzca el número de muestras en el cuadro de texto
suministrado.
ii. Seleccione el botón Aplicar. El número de filas introducido aparecerá en Tabla de sitios.
b. Para cerrar manualmente los pocillos de los bloques del SmartCycler, siga estos pasos:
i. Seleccione el botón Añadir/quitar sitios situado hacia la parte inferior de la pantalla.
Página 16 de 32
9.
10.
11.
12.
13.
ii. Se abrirá la ventana emergente Seleccionar sitios con dos columnas. La columna de la
izquierda (Sitios) indica todos los sitios disponibles y la de la derecha (Selecciones), todos
los sitios seleccionados.
iii. Para seleccionar todos los sitios, haga clic en el botón Seleccionar todos los sitios.
iv. Para seleccionar sitios específicos, resalte uno o más sitios y seleccione la flecha derecha
para añadir los sitios a la columna Selecciones.
v. Seleccione el botón Aceptar para cerrar la ventana. Los sitios seleccionados aparecerán en la
Tabla de sitios.
Introduzca la identificación de las muestras en la columna ID de muestra de la Tabla de sitios; esto
también puede hacerse una vez que se ha iniciado el análisis.
Introduzca comentarios en la columna Notas y deje las entradas de la columna Tipo de muestra como
“SPEC”.
Seleccione el botón Iniciar análisis en la parte inferior de la pantalla.
Seleccione el botón de Ver resultados para ver el progreso del análisis.
Cuando finalice el análisis, guárdelo antes de salir del software.
Protocolo de amplificación en el termociclador ABI 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Encienda el ABI 7500 Fast Dx.
Inicie el paquete de software ABI 7500 Fast Dx.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido.
Haga clic en Crear un documento nuevo.
La mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor predeterminado. Si no es así,
cámbielos según corresponda.
Ensayo:
Curva estándar (cuantificación absoluta)
Recipiente:
Placa transparente de 96 pocillos
Plantilla:
Modo de análisis:
Fast 7500
Usuario:
el nombre del usuario
Comentarios:
SDS v1.4 (añadir más si es necesario)
Nombre de la placa:
AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Configure la placa de muestras
a. La configuración de la placa aparecerá en las fichas Configuración y Placa.
b. Seleccione todos los pocillos que van a contener muestra, haga clic con el botón derecho y
seleccione Inspector de pocillos en el menú desplegable. Cuando se abra la ventana emergente
Inspector de pocillos, seleccione los detectores para gripe A, gripe B y PRC.
c. Utilice el Inspector de pocillos para introducir los nombres de las muestras. Las ID de paciente se
pueden introducir en la ventana Inspector de pocillos; sin embargo, se recomienda hacerlo antes
de resuspender la mezcla maestra liofilizada, posterior al análisis o mediante la función de
importación para reducir al mínimo el tiempo que las reacciones de PCR permanecerán a
temperatura ambiente antes de iniciar el análisis.
d. Guarde el análisis como AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B.sds.
e. Se abrirá una ventana “Motivo del cambio” para que el usuario indique el motivo por el que
modificó la entrada. Escriba “Configuración” y cualquier otro comentario relevante para el
análisis.
Inicie la PCR
a. Seleccione la ficha Instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en el instrumento.
c. En Control del instrumento, seleccione el botón Iniciar para iniciar el análisis.
Página 17 de 32
8.
Después de la PCR
a. IMPORTANTE: cuando finalice el análisis, pulse Aceptar. Para analizar los datos, pulse el botón
“Analizar” en el menú superior y guarde el archivo.
b. Para guardar el archivo, pulse Guardar documento en la barra de tareas. Se abrirá una ventana
“Motivo del cambio” para que el usuario indique el motivo por el que modificó la entrada. Escriba
“Análisis de datos posterior al análisis” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
Protocolo de amplificación en el QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Encienda el QuantStudio Dx.
Elija el modo IVD en el instrumento.
Inicie el paquete de software QuantStudio Dx IVD.
Cuando se le solicite, introduzca el Nombre de usuario y la Contraseña del sistema.
Se abrirá la ventana Pantalla de inicio.
En el cuadro Configuración, seleccione el nombre de la prueba previamente cargado “Ensayo Quidel
Molecular Influenza A + B”
Haga clic en el botón Configuración para iniciar el análisis.
Se mostrará la pantalla Configuración, Propiedades de la prueba. Ingrese la información del análisis
según corresponda.
a. Escriba el Nombre del experimento (la configuración predeterminada inicia el análisis con un
sello con la fecha y la hora).
b. Introduzca la información del Código de barras de la placa.
c. Registre los números de lote del material en Información de los reactivos.
d. Guarde el análisis como AAMMDD-Quidel Molecular Influenza A + B.sds.
e. Se abrirá una ventana “Motivo del cambio de la entrada” para que se indique el motivo de la
modificación. Escriba “Configuración” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
En la barra de menú izquierda, seleccione Definir.
Edite la información de la muestra.
a. Introduzca información específica de la muestra para cada pocillo; para ello, borre el identificador
predeterminado (Paciente 1, Paciente 2, etc.) e ingrese información nueva.
b. O BIEN, puede seleccionar Importar desde archivo de la parte superior de la pantalla para cargar
un mapa de placa predefinido desde un archivo de texto (separado por medio de tabulaciones).
En la barra de menú izquierda, seleccione Asignar para verificar que la configuración de la placa sea
correcta.
Cargue la placa de muestras.
a. Eyecte la bandeja de instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en la máquina con el pocillo A1 ubicado en la esquina
superior izquierda.
c. Retraiga la bandeja de instrumento.
Inicie el análisis.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Analizar.
b. Haga clic en el botón verde Iniciar análisis que se encuentra en la parte superior de la pantalla.
i. Si el equipo se lo solicita, seleccione el número de serie específico del instrumento que se
está utilizando.
Cuando se haya completado el análisis, seleccione Análisis en la barra de menú izquierda.
a. Para guardar el archivo, pulse Guardar en la barra de tareas. Se abrirá una ventana “Motivo del
cambio” para que el usuario indique el motivo por el que modificó la entrada. Escriba “Análisis de
datos posterior al análisis” y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
b. Se mostrará la ficha Gráfico de amplificación en forma predeterminada. Para ver otro tipo de
gráficos, selecciónelos de la barra de menú izquierda.
c. Para ver información del análisis con valores de Ct, seleccione la ficha Tabla de pocillos en el
margen derecho de la pantalla.
Página 18 de 32
15. Imprima un informe.
a. En la barra de menú superior, seleccione Imprimir informe. Personalice el contenido del informe
marcando o desmarcando casillas de la ventana de informes.
b. Seleccione el botón “Imprimir informe” en la parte inferior del recuadro de diálogo.
16. Exporte los archivos de datos.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Exportar.
b. Introduzca la Ubicación del archivo para exportar O haga clic en Examinar para ubicar la ruta
deseada.
c. El Nombre del archivo para exportar será el nombre predeterminado del análisis guardado.
d. Seleccione Excel como el tipo de archivo.
e. Personalice el informe de datos exportado activando o desactivando las fichas mostradas y
marcando o desmarcando opciones.
f. Seleccione Iniciar exportación en la parte inferior de la pantalla.
Interpretación de los resultados
Interpretación de los resultados obtenidos con el SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Cuando finalice el análisis, seleccione la ficha Ver resultados.
Seleccione la ficha Resultados de la muestra.
El software SmartCycler indicará automáticamente si las muestras son positivas o negativas para el
virus de la gripe, o si el análisis no fue válido (sin resolver).
En la misma ventana, en las fichas correspondientes a cada analito, puede obtenerse información más
detallada. Si hay un resultado positivo para el virus de la gripe tipo A o B (o ambos), el resultado del
PRC no se aplica. El PRC solo es necesario para los resultados negativos.
Interpretación de los resultados impresos del ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular en el SmartCycler II
Resultado
Resultado
del control
Gripe A
Gripe B
del ensayo
de procesos
No se detectaron ácidos nucleicos de los
Negativo
Pasa
NEG
NEG
virus de la gripe A o B; PRC detectado
Positivo para el
Se detectó ácido nucleico del virus de la
NA*
POS
NEG
virus de la gripe A
gripe A
Positivo para el
Se detectó ácido nucleico del virus de la
NA*
NEG
POS
virus de la gripe B
gripe B
Positivo para los
Se detectaron ácidos nucleicos de los virus
virus de la gripe
NA*
POS
POS
de la gripe A y B
AyB
Sin resolver – inhibición de la PCR o fallo del
reactivo. Repita la prueba con el ácido
No válido
No pasa
NEG
NEG
nucleico purificado, o recoja y analice una
nueva muestra.
*No se necesita ningún valor para que el resultado del control del proceso sea positivo.
Código de error 3079: se puede obtener una advertencia o el código de error 3079 con las muestras positivas
para el virus de la gripe A o B. La advertencia o el código de error 3079 se producen cuando la señal de
fluorescencia (RFU) es demasiado alta. En este caso, el software Dx notifica todos los resultados como ND (no
determinados). Si se obtiene un valor de Ct ≥ 10 o ≤ 45 para los virus de la gripe A o B, los resultados de la
muestra pueden registrarse como POS para la gripe A o la gripe B.
Página 19 de 32
Interpretación de los resultados obtenidos con el termociclador 7500 Fast Dx
Interpretación de los resultados del ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular
en el termociclador 7500 Fast Dx
Resultado
del ensayo
Detector:
Gripe A
Detector:
Gripe B
Detector:
Control
del proceso
Negativo
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Positivo para el virus
de la gripe A
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
NA*
Se detectó ácido nucleico del
virus de la gripe A
de la gripe B
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Se detectó ácido nucleico del
virus de la gripe B
Positivo para los
virus de la gripe A y
B
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
5,0 ≤ Ct ≤ 35,0
NA*
Se detectaron ácidos nucleicos
de los virus de la gripe A y B
No se detectaron ácidos
nucleicos de los virus de la gripe
A o B; PRC detectado
No se detectaron ácidos nucleicos
de los virus de la gripe A o B ni
No válido
PRC; análisis inválido. Repita el
análisis o la extracción
No
No
No
No determinado. Repita el
No válido
determinado
determinado
determinado análisis o la extracción
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
Ct < 5,0 o
Ct > 35,0
Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento Dx Real-Time PCR QuantStudio
Interpretación del Ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular Resultados
del QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Resultado
del ensayo
Detector:
Gripe A
Detector:
Gripe B
Negativo
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
Detector:
Control
del proceso
Ct ≤ 40,0
de los virus de la gripe A o B;
PRC detectado
NA*
Se detectó ácido nucleico del virus
de la gripe A
de la gripe A
Ct ≤ 40,0
de la gripe B
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
Ct ≤ 40,0
NA*
Se detectó ácido nucleico del virus
de la gripe B
Positivo para los
virus de la gripe A y
B
Ct ≤ 40,0
Ct ≤ 40,0
NA*
Se detectaron ácidos nucleicos de
los virus de la gripe A y B
No se
obtuvo un
de los virus de la gripe A o B ni PRC;
No válido
valor de Ct análisis inválido. Repita el análisis o
(blanco)
la extracción
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
No se obtuvo
un valor de Ct
(blanco)
Página 20 de 32
Control de calidad
El ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular incluye varios controles para monitorizar el funcionamiento
del ensayo.
1.
2.
3.
El control del proceso debe utilizarse durante los pasos de extracción y amplificación del ensayo. Este
control debe añadirse a cada alícuota de muestra antes de la extracción.
Los controles positivos externos para los virus de la gripe A y B disponibles comercialmente pueden
tratarse como muestras de paciente y deben utilizarse de acuerdo con las normas del laboratorio. Pueden
utilizarse muestras positivas para la gripe A o B previamente caracterizadas en lugar de un control
comercial para la gripe A/B.
Como control negativo externo, pueden utilizarse el medio de transporte de virus o una muestra negativa
previamente caracterizada. Este control debe tratarse igual que una muestra de paciente y utilizarse
según las normas vigentes del laboratorio.
Limitaciones
Esta prueba no está indicada para diferenciar subtipos del virus de la gripe A, como la nueva cepa AH1N1.
Si es necesario diferenciar subtipos, deben realizarse pruebas adicionales.
Los resultados negativos no descartan la infección con el virus de la gripe y no deben utilizarse como única
base para tomar decisiones terapéuticas.
Al igual que con otros ensayos de este tipo, existe el riesgo de obtener resultados falsos negativos debido
a la presencia de variantes de secuencia en la diana viral.
Si la muestra se recoge, se conserva o se transporta incorrectamente, se pueden obtener resultados
falsos negativos.
Los inhibidores presentes en la muestra o los errores cometidos durante el procedimiento del ensayo
también pueden dar lugar a resultados falsos negativos.
Rendimiento clínico
Las características de rendimiento del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B se establecieron en un estudio
prospectivo realizado durante la temporada de 2011 del virus respiratorio (de enero a marzo). Las muestras
utilizadas en este estudio fueron exudados nasales y nasofaríngeos recolectados para pruebas de gripe
rutinarios.
El método de referencia fue el cultivo rápido (en shell vial), seguido por la detección e identificación de
anticuerpos de fluorescencia directa (DFA).
Se evaluaron un total de 637 muestras de exudado con el ensayo Quidel Molecular Influenza A+B y por cultivo.
Seis (6) muestras que inicialmente arrojaron resultados no concluyentes, tampoco fueron concluyentes en una
segunda prueba con el ensayo Quidel Molecular Influenza A+B y no se incluyeron en el siguiente análisis.
Un total de 6 muestras resultaron positivas en la prueba DFA de virus respiratorio (el reactivo de detección
identifica la gripe A y B, RSV, parainfluenza 1, 2 y 3 y adenovirus) pero contenían muy pocas células para poder
realizar una identificación positiva específica. Un total de 3 muestras resultaron tóxicas en el cultivo celular.
Estas 9 muestras no se incluyen en el siguiente análisis.
Con un ensayo RT-PCR con marcado CE, se realizaron análisis de discrepancias de muestras en las que los
resultados del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B y el cultivo no concordaban, y donde era apropiado se
realizó una secuenciación bidireccional.
Página 21 de 32
Gripe A
Exudados nasales y
nasofaríngeos frescos (N=622)
Ensayo Quidel Molecular
Influenza A+B
Positivo
Prueba comparativa: Cultivo con DFA
Positivo
Negativo
Total
93
18*
111
Negativo
1**
510
511
Total
94
528
622
CI 95%
Sensibilidad
93/94
98,9%
94,2% a 100%
Especificidad
510/528
96,6%
94,7% a 98,0%
*17 de estas muestras resultaron positivas para gripe A con el dispositivo CE-IVD. La muestra
restante arrojó resultado negativo para gripe A con el dispositivo CE-IVD, pero arrojó resultados
positivos para el virus de la gripe A por análisis de secuencia
** La muestra también resultó negativa para gripe A con el dispositivo CE-IVD.
Gripe B
Exudados nasales y
Influenza A+B
Positivo
Prueba comparativa: Cultivo con DFA
Positivo
Negativo
Total
74
7*
81
Negativo
2**
539
541
Total
76
546
622
CI 95%
Sensibilidad
74/76
97,4%
90,8% a 99,7%
Especificidad
539/546
98,7%
97,4% a 99,5%
*5 muestras resultaron positivas para gripe B con el dispositivo CE-IVD, 2 muestras resultaron
negativas para gripe B con el dispositivo CE-IVD, pero resultaron positivas para el virus de la
gripe B por análisis de secuencia
**1 muestra resultó positiva para gripe B con el dispositivo CE-IVD, 1 muestra resultó negativa
para gripe B con el dispositivo CE-IVD
Un total de 626 muestras de exudado también fueron analizadas con el ensayo Quidel Molecular Influenza A+B
y con el ensayo IVD RT-PCR con marcado CE. Seis (6) muestras que inicialmente arrojaron resultados no
concluyentes en ambos ensayos, también lo hicieron en una repetición con ambos ensayos. No se incluyen en
el siguiente análisis. Otras 10 muestras arrojaron resultados no concluyentes en el ensayo IVD RT-PCR con
marcado CE y también lo hicieron en una repetición con el ensayo. No se incluyen en el siguiente análisis. Se
realizaron análisis de discrepancias con una secuenciación de muestras en las que los resultados del ensayo
Quidel Molecular Influenza A+B y el ensayo IVD RT-PCR con marcado CE no concordaban.
Página 22 de 32
Gripe A
Exudados nasales y
Influenza A+B
Prueba comparativa: Dispositivo CE-IVD
Positivo
Negativo
Total
Positivo
107
3*
110
Negativo
0
500
500
107
503
610
Total
CI 95%
Sensibilidad
107/107
100%
96,6% a 100%
Especificidad
500/503
99,4%
98,3% a 99,9%
*3 muestras resultaron positivas para el virus de la gripe A por análisis de secuencia
Gripe B
Exudados nasales y
Influenza A+B
Prueba comparativa: Dispositivo CE-IVD
Positivo
Negativo
Total
Positivo
77
5*
82
Negativo
4**
524
528
Total
81
529
610
CI 95%
Sensibilidad
77/81
95,1%
87,8% a 98,6%
Especificidad
524/529
99,1%
97,8% a 99,7%
*5 muestras resultaron positivas para el virus de la gripe B por análisis de secuencia
**4 muestras resultaron negativas para el virus de la gripe B por análisis de secuencia
Página 23 de 32
Se realizó la prueba con el instrumento Dx Real-Time PCR QuantStudio en un subgrupo de doscientas once
(211) muestras del estudio antes mencionado. Los resultados de esta prueba se compararon con información
obtenida de la prueba simultánea con el ABI 7500 Fast Dx. A continuación, se muestra esta comparación.
Ensayo Quidel Molecular Influenza A+B
Gripe A
Prueba comparativa: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positivo
Negativo
Total
Positivo
63
0
63
Negativo
0
148
148
Total
63
148
211
CI 95%
Sensibilidad
63/63
100%
94,3% a 100%
Especificidad
148/148
100%
97,5% a 100%
Ensayo Quidel Molecular Influenza A+B
Gripe B
Prueba comparativa: ABI 7500 Fast Dx
PCR Instrument
Positivo
Negativo
Total
Positivo
28
0
28
Negativo
0
183
183
Total
28
183
211
CI 95%
Sensibilidad
28/28
100%
87,9% a 100%
Especificidad
183/183
100%
97,9% a 100%
Rendimiento analítico
Nivel de detección
La sensibilidad analítica (límite de detección o LoD) del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B se determinó
mediante cultivos cuantificados (TCID50/ml) de 3 cepas de gripe A (1 H1N1, 1 2009H1N1 y 1 H3N2), 3 cepas de
gripe B de las que se hicieron diluciones seriadas en matriz nasofaríngea negativa. Cada dilución fue extraída
con el sistema NucliSENS easyMAG y analizada en duplicados de 20 por concentración de virus tanto con
plataformas Applied Biosystems® 7500 Fast Dx o Cepheid SmartCycler® II. La sensibilidad analítica (LoD) se
define como la concentración más baja en la cual el 95% de todos los duplicados dieron positivo.
Nivel de detección
Cepa
TCID 50 ml Final LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Página 24 de 32
Inhibición competitiva
Se evaluó la inhibición competitiva del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B mediante muestras simuladas
con concentraciones diversas del virus de la gripe A (2x LoD a 4 registros superiores a LoD) y del virus de la
gripe B (2x LoD a 4 registros superiores a LoD) en una única muestra. Se tomaron las muestras con el sistema
NucliSENS easyMAG y se analizaron por triplicado. La presencia tanto del virus de la gripe A como de la gripe B
en diversas concentraciones en una única muestra no tuvo efecto en la sensibilidad analítica (límite de
detección o LoD) del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B.
Reactividad analítica (inclusividad)
Se evaluó la reactividad del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B con múltiples cepas de virus de gripe A y
de gripe B. El panel clínico consistió de 10 cepas de gripe A subtipo H1N1, 2 de gripe A subtipo 2009H1N1, 8 de
gripe A subtipo H3N2, 2 de gripe A subtipo H5N1 y 13 de gripe B. También se analizó un panel adicional de
aislamientos restringidos no clínicos. Cada integrante del panel se extrajo con el instrumento NucliSens
easyMAG y se analizó por triplicado.
El ensayo Quidel Molecular Influenza A+B detectó el 100% de las cepas de gripe A (38/38) y de gripe B (15/15)
2
3
en niveles de 10 a 10 TCID50/ml, incluidas cepas nuevas, pandémicas y aviar de gripe A y cepas de circulación
reciente de gripe B.
Panel clínico de virus de gripe A
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
1,12E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/NWS/33
NA
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
1,41E+01
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
4,57E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Subtipo
Cepa
TCID50/ml
H1N1
H1N1
Página 25 de 32
Panel clínico de virus de la gripe B
Cepa
TCID50/ml
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Malaysia/25/06/04
3,41E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Allen/45
4,17E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Russia/69
2,19E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/Lee/40
1,95E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Virus restringidos no clínicos
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H2N2
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H7N3
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H9N2
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H4N8
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H6N2
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H8N4
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H5N1
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H10N7
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H11N9
A/Chicken/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H12N5
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H13N6
A/Gull/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H14N5
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H15N9
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
H16N3
2,00E+02
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Subtipo
Cepa
TCID50/ml
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
Página 26 de 32
Reproducibilidad
La reproducibilidad intralaboratorio del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B se evaluó en 3 laboratorios. La
reproducibilidad se evaluó con un panel de 6 muestras simuladas que incluían concentraciones media (10x
LoD), alta negativa (concentración C20-60) del virus de la gripe A, del virus de la gripe B y muestras de controles
negativos y positivos. Dos operadores evaluaron los paneles y los controles en cada sitio durante 5 días (8
muestras y 3 controles × 2 operadores × 5 días × 3 sitios = 330). Los paneles y los controles se extrajeron con
el sistema NucliSENS easyMAG y fueron analizados en el instrumento 7500 Fast Dx.
Reproducibilidad
ID del integrante
del panel
Gripe A
negativo alto
Gripe A positivo
(10x LoD)
Gripe B
negativo alto
Gripe B positivo
(10x LoD)
Control positivo
de gripe A
Control positivo
de gripe B
Control negativo
Sitio 1
Sitio 2
Sitio 3
Concordanci
a con
resultados
esperados
AVE
Ct
%CV
Concordanci
a con
resultados
esperados
AVE
Ct
%CV
Concordanci
a con
resultados
esperados
AVE
Ct
%CV
6/10
31,5*
8,8
10/10
N/A
N/A
9/10
34,3*
N/A
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
9/10
34,9
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
Concordancia
total con el
resultado
esperado
25/30
Especificidad analítica – reactividad cruzada
La especificidad analítica del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B fue evaluada por medio del análisis de un
panel compuesto de 26 cepas virales, 24 cepas bacterianas y 1 cepa de levadura que representa los patógenos
respiratorios comunes o la flora que se encuentra comúnmente en la nasofaringe. Las bacterias y la levadura
5
10
3
6
se evaluaron a concentraciones de 10 a 10 ufc/ml. Los virus se probaron a las concentraciones de 10 a 10
TCID50/ml. Las muestras se extrajeron con el instrumento NucliSens easyMAG y se analizaron por triplicado. La
especificidad analítica del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B fue del 100%.
Reactividad cruzada
3,70E+04
Resultado
gripe A
Negativo
Resultado
gripe B
Negativo
hMPV B1
2,37E+04
Negativo
Negativo
RSV Long
4,40E+04
Negativo
Negativo
RSV Washington
1,75E+0
Negativo
Negativo
Adenovirus 1/Adenoide 71
5,67E+04
Negativo
Negativo
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negativo
Negativo
Coronavirus OC43
1,67E+06
Negativo
Negativo
Virus Coxsakie B4
2,43E+06
Negativo
Negativo
Virus Coxsakie B5/10/2006
2,28E+06
Negativo
Negativo
Citomegalovirus
8,76E+05
Negativo
Negativo
Echovirus 7
5,38E+08
Negativo
Negativo
Echovirus 9
1,50E+06
Negativo
Negativo
Echovirus 6
1,05E+08
Negativo
Negativo
ID del microorganismo
Conc. final
hMPV A1
Página 27 de 32
Reactividad cruzada
1,50E+05
Resultado
gripe A
Negativo
Resultado
gripe B
Negativo
Enterovirus 71
2,68E+03
Negativo
Negativo
Enterovirus 70
1,66E+05
Negativo
Negativo
Virus de Epstein Barr
5.000
cp/ml
Negativo
Negativo
HSV Tipo 1, cepa MacIntyre
1,95E+06
Negativo
Negativo
HSV Tipo 2, cepa G
3,67E+06
Negativo
Negativo
Rubéola
3,78E+05
Negativo
Negativo
Virus de parotiditis (Mumps)
8,43E+04
Negativo
Negativo
2,50E+05
Negativo
Negativo
2,20E+04
Negativo
Negativo
9,10E+05
Negativo
Negativo
9,57E+06
Negativo
Negativo
Virus de varicella zoster
7,50E+02
Negativo
Negativo
1,04E+07
Negativo
Negativo
2,55E+07
Negativo
Negativo
2,10E+05
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
6,90E+08
Negativo
Negativo
6,60E+07
Negativo
Negativo
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativo
Negativo
5,90E+07
Negativo
Negativo
5,15E+07
Negativo
Negativo
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativo
Negativo
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativo
Negativo
2,15E+07
Negativo
Negativo
1,85E+08
Negativo
Negativo
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativo
Negativo
3,30E+07
Negativo
Negativo
Escherichia coli
6,80E+07
Negativo
Negativo
5,85E+07
Negativo
Negativo
6,0E+05
Negativo
Negativo
1,03E+08
Negativo
Negativo
4,5E+07
Negativo
Negativo
2,05E+08
Negativo
Negativo
2,50E+06
Negativo
Negativo
2,6E+07
Negativo
Negativo
Conc. final
Echovirus 11
Página 28 de 32
Reactividad cruzada
5,15E+08
Resultado
gripe A
Negativo
Resultado
gripe B
Negativo
1,07E+06
Negativo
Negativo
Conc. final
Candida albicans
Especificidad analítica – sustancias interferentes
El rendimiento del ensayo Quidel Molecular Influenza A+B se evaluó con sustancias potencialmente
interferentes que podrían estar presentes en muestras nasofaríngeas. Las sustancias potencialmente
interferentes fueron evaluadas en los virus de la gripe A (A/Mexico/4108/2009), y de la gripe B
(B/Florida/04/2006) en concentraciones de 3x y 10x LoD. No hubo evidencia de interferencia provocada por las
sustancias evaluadas debajo de 3x o 10x LoD.
Concentración analizada
Resultado de
gripe A
(3x LoD)
Resultado de
gripe B
(3x LoD)
60 µg/ml
Positivo
Positivo
Sangre (humana), anticoagulada con EDTA
2% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Neo-sinefrina
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Spray nasal Afrin
15% (vol/vol)
Positivo
Positivo
Homeopático Zicam: gel nasal líquido para
aliviar la alergia que no provoca
somnolencia ni goteo
5% (vol/vol)
Positivo
Positivo
15% (vol/vol) de la dosis
Positivo
Positivo
0,68 g/ml; 1/18 gotas,
molidas; ingredientes
activos: 1,7 mg/ml
de mentol
Positivo
Positivo
3,3-5 mg/ml
Positivo
Positivo
Tobramicina
4,0 µg/ml
Positivo
Positivo
Mupirocina
6,6-10 mg/ml
Positivo
Positivo
Fosfato de oseltamivir
7,5-25 mg/ml
Positivo
Positivo
Nombre de la sustancia
Mucina (glándula sublingual bovina,
tipo I-S)
Spray nasal salino
Pastillas para la garganta
Zanamivir
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre
En un estudio interno, no hubo evidencia de contaminación de arrastre/cruzada con el ensayo Quidel
Molecular Influenza A+B utilizando el instrumento de extracción de ácidos nucleicos automatizado NucliSENS
easyMAG de bioMériuex.
Material de consulta adicional
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Influenza A Viruses (marzo, 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1596.pdf.
Guidance on In Vitro Diagnostic Devices to Detect Influenza A Viruses: Labeling and Regulatory Path (abril,
Guidance on Informed Consent for In Vitro Diagnostic Device Studies Leftover Human Specimens that are
Not Individually Identifiable (abril, 2006) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1588.pdf.
(diciembre, 2005) – http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1560.html.
(Vol. 2, No. 34) (octubre, 2004).
Methods (Vol. 25, No. 31) (diciembre, 2005).
Página 29 de 32
7.
CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Segunda edición)
(noviembre, 2005).
(septiembre, 2002).
(octubre, 2003).
(Vol. 24, No. 25 Segunda edición) (agosto, 2004).
Atención al cliente y servicio técnico
Para hacer un pedido o solicitar servicio técnico, póngase en contacto con un representante de Quidel
llamando al (800) 874-1517 (teléfono gratuito en los EE. UU.) o +1 (858) 552-1100, de lunes a viernes de 8:00
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Marcas comerciales
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La compra de este producto concede al comprador derechos, bajo determinadas patentes de Roche, para su
uso exclusivo en servicios de diagnóstico in vitro en humanos. La compra no da derecho a ninguna patente
general ni a ningún otro tipo de licencia aparte del derecho específico de uso especificado aquí.
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Glosario
Representante autorizado en
la Comunidad Europea
Fabricante
Contenido/Contiene
Control
Fecha de caducidad
Número del catálogo
Código de lote
Para uso diagnóstico in vitro
Consulte las instrucciones de uso
Indicaciones
96
Contiene una cantidad suficiente
para 96 determinaciones
Límites de temperatura
Página 31 de 32
Referencias
1
http://1918.pandemicflu.gov, consultado el 9/6/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm, consultado el 9/6/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Viral Culture; Approved Guidelines. Documento de CLSI M41-A
Pensilvania 19087-1898, EE. UU., 2006.
M100 – Kit del Ensayo Influenza A+B de Quidel Molecular
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Alemania
Quidel Corporation
Oficina Central Mundial
San Diego, CA 92121 EE. UU.
quidel.com
M0002GES00 (12/2012)
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Influensa A+B-analys
BRUKSANVISNING
För kvalitativ detektion och identifiering av virala nukleinsyror för influensa A och influensa B
som extraheras från nasal- och nasofarynxprovpinnar samt nasala aspirat/sköljprov.
Sida 1 av 31
Innehåll
Avsedd användning ....................................................................................................................................... 4
Sammanfattning och förklaring .................................................................................................................... 4
Förfarandeprincip ......................................................................................................................................... 4
Tillhandahållet material ................................................................................................................................ 6
Valfria material ............................................................................................................................................. 6
Material som krävs men ej medföljer ........................................................................................................... 6
Varningar och försiktighetsåtgärder ............................................................................................................. 7
Förvaring och hantering av kitreagenser ...................................................................................................... 7
Insamling av prover, förvaring och hantering............................................................................................... 7
Förvaring av nukleinsyraextrakt.................................................................................................................... 7
Anvisningar för programmering av nukleinsyra extraktion .......................................................................... 8
Inledande programmering av termocyklern ............................................................................................... 10
Programmeringsanvisningar för SmartCycler II ...................................................................................... 10
Programmeringsanvisningar för 7500 Fast DX ....................................................................................... 12
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR-instrumentets instruktioner
för programmering ................................................................................................................................. 15
Analysprocedur ........................................................................................................................................... 15
Amplifieringsprotokoll på SmartCycler II ................................................................................................ 16
Amplifieringsprotokoll på 7500 Fast Dx termocykler ............................................................................. 16
Förstärkningsprotokoll på QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrument ................................................. 17
Tolkning av resultat..................................................................................................................................... 19
Tolkning av resultat med hjälp av SmartCycler II .................................................................................... 19
Tolkning av resultat med hjälp av 7500 Fast Dx Thermocycler .............................................................. 19
Tydning av resultat genom användning av QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrument ....................... 20
Kvalitetskontroll .......................................................................................................................................... 20
Begränsningar ............................................................................................................................................. 20
Klinisk prestanda ......................................................................................................................................... 21
Analytisk prestanda..................................................................................................................................... 23
Sida 2 av 31
Detekteringsnivå ......................................................................................................................................... 23
Kompetitiv hämning.................................................................................................................................... 24
Analytisk reaktivitet (integrering) ............................................................................................................... 24
Reproducerbarhet....................................................................................................................................... 26
Analytisk exakthet - korsreaktivitet ............................................................................................................ 26
Överföring och korskontaminerings-studier............................................................................................... 28
Ytterligare källmaterial ............................................................................................................................... 28
Kundtjänst och teknisksupport ................................................................................................................... 29
Immateriella rättigheter ............................................................................................................................. 29
Varumärken ................................................................................................................................................ 29
Ordlista ........................................................................................................................................................ 30
Referenser ................................................................................................................................................... 31
Sida 3 av 31
Avsedd användning
Quidel Molecular influensa A+B-analys är en multipel realtids-RT-PCR-analys för kvalitativ detektion och
identifiering av virala nukleinsyror för influensa A och influensa B som extraheras från nasal- och
nasofarynxprovpinnar samt nasala aspirat/sköljprov Detta in vitro-diagnostiska test är avsett att underlätta
differentialdiagnostisering av influensa A- och/eller influensa B-virusinfektioner hos människor. Analysen
detekterar inte förekomsten av influensa C-virus.
Negativa resultat utesluter inte influensavirusinfektion och bör inte användas som den enda grunden för diagnos,
behandling eller andra hanteringsbeslut. Prestandaegenskaper för influensa A fastställdes när influensa A/H3 och
A/H1 var de dominerande influensa A-virusen i cirkulation. När andra influensa A-virus uppstår kan
prestandaegenskaper eventuellt variera.
Sammanfattning och förklaring
Influensavirus (familj Orthomyxoviridae) innehåller en enkelsträngad RNA-genomet som är närvarande i 8 separata
segment av ribonukleoprotein. Denna segmentering av genomet är sällsynt bland virus och bidrar förmodligen till
den snabba utvecklingen av nya influensastammar genom utbyte av gensegment om två olika virus infekterar
samma cell. Det finns 3 typer av influensa- A, B och C. Typ A har motsvarigheter hos fåglar och grisar likväl som hos
människor, medan typ B och C är kända endast hos människor. På grund av risken för en ny pandemi orsakad av
1
influensavirus A, vilket skedde år 1918 då 30 till 50 miljoner människor över hela världen dog . Centers for Disease
Control (CDC) och Världshälsoorganisationen (WHO) upprätthåller övervakning av influensastammar och gör
förutsägelser av lämpliga stammar för vaccinproduktion.
2
I USA uppskattas det att 30 000-49 000 dödsfall årligen orsakas av influensa-associerade sjukdomar. Årliga
epidemier av influensa resulterar globalt i cirka tre till fem miljoner fall av svåra sjukdomar och cirka 250 000–
3
500 000 dödsfall. Pandemier av influensa A inträffar ungefär vart 10 till 30 år och epidemier av influensa A eller B
inträffar årligen. Infektioner är säsongsbetonade. På norra halvklotet sträcker de sig vanligtvis från november till
april. Komplikationer tenderar att inträffa hos unga, äldre och personer med kroniska hjärt-lungsjukdomar.
Inkubationstiden är 1-3 dagar med snabb spridning vid inandning av luftburna droppar och fomiter. De
kännetecknas av feber, myalgi, huvudvärk och faryngit.
Förfarandeprincip
Analysen detekterar virala nukleinsyror som har extraherats från ett patientprov. En multiplex realtids-RT-PCRreaktion som utförs under optimala betingelser i ett enkelrör genererar amplikoner för varje virus som närvarar i
provet. Identifiering av influensa A sker genom användning av målspecifika primers och en fluorescerande märkt
prob som hybridiseras till en konserverad influensa A-sekvens inom proteingen matrisen. Identifiering av influensa
B sker genom användning av målspecifika primers och en fluorescerande märkt prob som hybridiseras till en
konserverad influensa B-sekvens inom matrisen för proteingen.
Quidel molekylära probetiketter
Mål
Färga
Influensa A
FAM
Influensa B
Processkontroll (PRC)
Quasar® 670
Sida 4 av 31
Nedan följer en sammanfattning av förfarandet:
1.
Provtagning: Använd nasalaoch nasofaryngeala kontrollstickor och nasal aspirat/sköljprover för att erhålla
prover med standardtekniker från symtomatiska patienter. Dessa prover transporteras, lagras och behandlas i
4
enlighet med fastställda laboratorieprocedurer.
2.
Extraktion av nukleinsyra: Extrahera nukleinsyror från proverna med NucliSENS® easyMAG® System enligt
tillverkarens instruktioner och använda lämplig reagens (se material som är nödvändiga men inte medföljer).
Användning av andra extraktionssystem med Quidel Molecular Influenza A+B-analysen har inte validerats.
Validering av övriga system åligger slutanvändaren.
Före extraktionen, tillsätt 20 μl av processkontroll (PRC) till varje 180 µldelmängd av provet. BRC övervakar
inhibitorer i det extraherade provet, säkerställer att tillräcklig amplifiering har skett och bekräftar att
extraktionen av nukleinsyran var tillräcklig.
3.
Rehydrering av Master Mix: Rehydrera den lyofiliserade Master Mixen med rehydreringslösningen. Master
Mixen innehåller oligonukleotidprimers, fluorofor och quencher-märkta prober riktade mot konserverade
regioner av influensa A- och influensa B-virus, såväl som processkontrollsekvensen.
4.
Nukleinsyraamplifiering och detektion: Lägg till 15 µl av den rehydratiserade Master Mixen till varje
reaktionsrör eller mikroplatta. Tillsätt sedan 5 µL extraherade nukleinsyror (prov med PRC) till
mikrotiterplattans hål eller korrekt märkt reaktionsrör Placera plattan eller röret antingen i Life Technologies
TM
QuantStudio
Dx
Real-Time PCR-instrumentet, Applied Biosystems® 7500 Fast Dx eller Cepheid® SmartCycler® II-instrumentet.
Analysen har validerats med instrumentens 7500-serie.
När reaktionsröret eller mikroplattorna sätts till instrumentet, initieras analysprotokollet. Detta protokoll
initierar omvänd transkription av RNA-mål för att generera komplementärt DNA, och den efterföljande
amplifieringen av önskade amplikoner inträffar. Quidel Molecular Influenza A+B-analysen är baserad på
TaqMan® kemi och använder ett enzym med omvänt transkriptas, DNA-polymeras, och 5'-3 'exonukleas
aktivitet. Under DNA-amplifiering, klyver detta enzym proben bunden till den komplementära DNA-sekvensen
och skiljer quencherfärgämnet från reporterfärgämnet. Detta steg genererar en ökning i fluorescenssignal vid
excitering av en ljuskälla med lämplig våglängd. Med varje cykel separeras ytterligare färgämnesmolekyler från
sina quencher, vilket resulterar i ytterligare signal. Om tillräcklig fluorescens uppnås efter 45 cykler,
rapporteras provet som positivt för den detekterade nukleinsyran.
Sida 5 av 31
Tillhandahållet material
SKU # M100
Detekteringssats (96 Reaktioner) - Förvaras vid 2 till 8 °C
#
Komponent
Kvantitet


Rehydreringslösning del M5003
1 ampull/sats 1,9 ml
Quidel Molecular Influenza A+B Master Mix Part M5004
12 ampuller/sats,
8 reaktioner/ampull
Lyofiliserat innehåll:
DNA-polymerasenzym med omvänd transkriptas aktivitet
Primrar och prober
dNTP
Stabilisatorer
Processkontroll Del M5005
1 ampull/sats 2,0 ml
Valfria material
Positiva kontroller för influensa A och influensa B (dvs. Quidel Molecular Influenza A+B Control Set #M106 som
fungerar som en extern bearbetnings- och utvinningskontroll)
Material som krävs men ej medföljer
Mikropipetter (intervall mellan 1 till 10 μl och 100 till 1000 μl)
Icke-aerosol pipettspetsar
TM
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR -instrument eller Applied Biosystems 7500Fast Dxinstrument
Applied Biosystems 7500 Fast Dx 96 PCR mikroplattor
Applied Biosystems optiska filmplattor
Plattcentrifug för ABI 96 mikroplattor
Eller
Mikropipetter (intervall mellan 1 till 10 μl och 100 till 1000 μl)
Icke-aerosol pipettspetsar
SmartCycler® II
SmartCycler engångsartiklar
SmartCycler centrifug
Sida 6 av 31
Varningar och försiktighetsåtgärder
För in vitro-diagnostiskt bruk
Om en infektion med ett nytt influensa A-virus misstänks, baserat på aktuella kliniska och epidemiologiska
screeningkriterier rekommenderade av hälsovårdsmyndigheterna, bör prover samlas in med hjälp av tillbörliga
infektionskontrollåtgärder för nya virulenta influensavirus och skickas till statliga eller lokala hälsomyndigheter
för testning.
Prestandaegenskaper för detta test har fastställts endast med de provtyper som listas i avsnittet Avsedd
användning. Prestandan för denna analys med andra provtyper eller prover har inte utvärderats.
Användning av andra extraktionssystem än NucliSENS easyMAG-systemet har inte validerats. Validering av
dessa system ligger på slutanvändarens ansvar.
Användning av andra villkor för cykling än de som anges i avsnittet Programmeringsanvisningar för
termocykler kan ge felaktiga resultat.
Denna produkt bör endast användas av personal med tillräcklig utbildning i PCR- och RT-PCR-tekniker.
Behandla alla prover som potentiellt infektiösa. Följ allmänna försiktighetsåtgärder vid hantering av prover,
detta kit och dess innehåll.
Lämplig provinsamling, förvaring och transport är nödvändig för att erhålla korrekta resultat
Förvara analysreagensen enligt anvisningarna på respektive etikett.
Bär lämpliga skyddskläder, skyddshandskar, ögon- och ansiktsskydd när du använder detta kit.
För korrekta resultat, pipettera noggrant med hjälp av endast kalibrerad utrustning.
Rengör och desinficera alla ytor noggrant med en 10 % klorlösning och sedan med vatten av
molekylärbiologisk kvalitet.
Använd mikropipetter med aerosolbarriär eller positiv förskjutning för alla förfaranden.
Undvik mikrobiell kontaminiering och korskontaminering av satsens reagenser. Följ goda laboratorierutiner.
Blanda inte reagenser från satser med olika partinummer.
Använd inte reagenser från andra leverantörer ihop med detta kit.
Använd inte produkten efter utgångsdatumet.
Korrekt planering av arbetsflödet är nödvändig för att minimera kontamineringsrisken. Planera
alltid laboratoriets arbetsflöde i en riktning. Börja med föramplifiering och gå vidare med amplifiering
och detektion.
Använd därför avsett material och utrustning i områdena för föramplifiering och amplifiering.
Tillåt inte att personal eller utrustning flyttas korsvis mellan områdena.
Håll alltid amplifieringsmaterialet separat från föramplifieringsmaterialet.
Öppna inte provrören eller plattornas försegling efter amplifiering.
Kassera amplifierat material noggrant och i enlighet med lokala lagar och riktlinjer för att minimera risken för
kontaminering med amplikon.
Använd inte material som är avsett för beredning av reagens eller prov för preparering av målnukleinsyra.
Säkerhetsdatablad finns tillgängligt på begäran och även på produktens webbplats.
Förvaring och hantering av kitreagenser
Förvara oöppnade kit vid 2-8 °C fram till utgångsdatumet, som anges på kitets ytterkartong.
Den rehydrerade Master Mixen kan förvaras vid rumstemperatur (20 till 25 °C) i upp till 24 timmar. För längre
förvaring bör den rehydrerade Master Mixen återförslutas, förseglas med parafilm och förvaras i upprätt
position vid ≤ -20 °C i upp till 14 dagar. Under lagringen ska Master Mixen skyddas från ljus.
Indikationer på instabilitet eller försämring av reagenser: Grumlighet i rehydreringslösningen kan eventuellt
indikera försämring av detta reagens. Kontakta Quidels tekniska support för att få produkten ersatt.
Insamling av prover, förvaring och hantering
{UT1}Prover som användes för validering av Quidel Molecular Influenza A+B-analysen, erhölls vid användning av
standardmetoder från patienter med infektionssymptomer i övre luftvägarna. Dessa prover togs, transporterades,
lagrades och behandlades i enlighet med CLSI M41-A.
Förvaring av nukleinsyraextrakt
Användaren ansvarar för validering av förvaringsprocedurer och laboratorieförhållanden. Eluat kan i normalfallet
förvaras vid rumstemperatur (20-25 °C) i 2 timmar, vid 2-8 °C i 8 timmar och 1 månad vid -20 °C till -70 °C.
Förvaring av små mängder nukleinsyra-extrakt (t.ex. 5 μL eller mindre) rekommenderas inte.
Sida 7 av 31
Anvisningar för programmering av nukleinsyra extraktion
1.
Slå på instrumentet och vänta tills instrumentets lampa lyser orange. Slå sedan på datorn/starta
easyMAG-programmet.
2.
Läs av streckkoderna för reagenser efter att ha tryckt på knapparna “Instrument”
”Reagensinventering”
3.
4.
.
För att mata in prover tryck på knappen (”Daglig användning”
”Definiera begäran”
a. Prov-id:
b. Matris:
c. Begäran:
d. Volym (ml):
e. Eluat (µl):
f. Typ:
g. Prioritet:
och
vilket tar dig enligt förval till skärmen
. Välj följande inställningar:
Ange provnamn genom att använda tangentbordet.
Välj Annan från rullgardinsmenyn
Välj Generisk från rullgardinsmenyn
Välj 0,200 från rullgardinsmenyn
Välj 50 från rullgardinsmenyn
Primär
Normal
När du trycker på knappen ”Spara”
vänstra sida. Tryck på knappen ”Ange
kommer provet att visas i fönstret ”Ej tilldelat prov” på skärmens
ny extraktionsbegäran”
och upprepa processen för ytterligare prover. Alternativt kan flera prover
anges genom att tryck på knappen ” Skapa automatiskt
nya extraktionsbegäranden”
5.
.
När alla prover har skapats gå till ”Organisera körningar” genom att klicka på ikonen
i skärmens övre del. Skapa en körning genom att tryck på knappen”Skapa körning”
Ange ett namn eller använd det förvalda.
6.
Lägg till prover till körningen med hjälp av knappen ”Fyll körningen automatiskt”
(fyller automatiskt på
med
upp
till
24
prover
från
”Lista
över
ej
tilldelade
prover”
på
vänster sida av skärmen). Alternativt, efter val av lämpligt prov, kan individuella prover flyttas in och ut ur
körningen med hjälp av vänster och höger “Placeringsikoner”
7.
8.
(Skapa körning).
. Provens ordning inom
körningen kan ändras med hjälp av knapparna ”Flytta extraktionsbegäran uppåt/nedåt”
.
Skaffa 1 till 3 (för 8 till 24 prover) provbehållare och tillsätt 20 µl processkontroll till varje provbrunn
som används.
Tillsätt 180 µl från varje prov till därför avsedd brunn.
9.
Gå till ”Ladda körning” genom att trycka på knappen
i skärmens övre del. För in spetsarna och
provbehållaren(na) i instrumentet.
10. Ange provbehållarens(nas) streckkod(er)
11. Ange streckkod(er) för de kiseldioxidpartiklar som ska användas
12. Tilldela kiseldioxidpartiklar till proverna enligt följande:
Sida 8 av 31
a.
b.
c.
d.
Klicka på reagenssymbolen nedanför siffran 1 i bilden nedan. Kiseldioxidpartiklarnas partinummer bör
synas under fliken Kiseldioxid vid siffran 2 i bilden nedan.
Markera och välj proverna i den körning för vilken partiklarna måste tilldelas (i rutan som innehåller
siffran 3 i bilden nedan).
Klicka på
placeringsikonen (under siffran 4 i bilden nedan) för att tilldela
kiseldioxidpartinumret till utvalda prover
Om partikelsymbolen till höger om siffran 5 i bilden nedan väljs bör partinumret för
kiseldioxidpartiklarna visas för vart och ett av proverna
13. Skriv ut arbetslistan genom att trycka på ikonen ”Ladda körning” och därefter på ikonen ”Skriv ut arbetslista”
.
14. Tryck på knappen “Dispense Lysis” (Fördela lysering)
. Lyseringen i maskinen tar cirka 12 minuter
att slutföra.
15. Förbered magnetiska partiklar för var och en av provbehållarna med hjälp av Biohit-pipett och -spetsar för upp
till åtta reaktioner enligt nedan:
a. Aspirera 550 µl nukleasfritt vatten med hjälp av 1 spets och Program 1 och överför det till ett 1,5 ml
mikrocentrifugrör fritt från DNAse/RNAse.
b. Vortexa det magnetiska kiseldioxidet. Aspirera 550 µl magnetiskt kiseldioxid med hjälp av 1 spets och
Program 1 och överför det till vattnet och blanda genom att vortexa.
c. Aspirera 1050 µl av den magnetiska kiseldioxidblandningen med hjälp av 1 spets och Program 2 och
för tillbaka 25 µl till samma rör.
d. Överför 125 µl av den magnetiska kiseldioxidblandningen 8 gånger i 8 brunnar i en ELISA-strip-platta.
Kassera spetsen.
e. Efter slutförd lysering (OBS: måste “Instrument Status” (Instrumentstatus) längst ned på skärmen
vara ”Viloläge”), aspirera, med hjälp av 8 spetsar och Program 3, 100 µl magnetisk kiselblandning från
stripbrunnarna, överför 100 µl magnetisk kiseldioxidblandning till brunnsremsorna och aspirera 100
µl magnetisk kiseldioxidblandning från brunnsremsorna.
f. För ned spetsarna i vätskan i provbehållarna. Aspirera 800 µl och för sedan tillbaka 900 µl magnetisk
kiseldioxidblandning till behållaren. Aspirera 1000 µl magnetisk kiseldioxidblandning ur behållaren
och för tillbaka 1000 µl magnetiskt kiseldioxid till behållaren. Upprepa aspiration/överföring av 1000
µl två gånger till.
16. Stäng instrumentet och tryck på knappen “Start”
för att starta körningen.
Sida 9 av 31
17. När körningen har slutförts överför de renade nukleinsyrorna till nukleasfria rör. De renade nukleinsyrorna ska
användas omedelbart eller frysas vid -70 °C.
Begränsningar: Följande protokoll har utvecklats specifikt för användning med denna analys. Dess lämplighet vid
användning av andra analyser är okänd. För att säkerställa programkompatibilitet kolla med bioMérieux S.A.
Inledande programmering av termocyklern
Programmeringsanvisningar för SmartCycler II
1.
2.
Starta programvarupaketet SmartCyclerDx version 3.0b
Skapa Quidel Molecular Influenza A+B-analysen
a. Välj knappen Definiera analyser längst upp på skärmen
b. Namnge analysen
i. Välj knappen Ny längst ned i vänstra hörnet av skärmen
ii. Skriv “Quidel Molecular Influenza A+B” och välj OK
iii. “Quidel Molecular Influenza A+B” kommer att läggas till längst upp på listan Analysnamn som
finns längst upp i vänstra hörnet av skärmen
c. Ställ in analysvärdena: Under Analystyp: I avsnittet Forskning, välj fliken Analysinställningar och se till att
följande specifikationer anges:
i. Välj FATA25 från rullgardinsmenyn Färginställning
ii. Rullgardinsmenyn Analystyp ska vara inställd på Kvalitativ (standardinställning)
iii. I kolumnen Kanalnamn) skriv “Influenza A” för FAM, “Influenza B” för Alx532 och “PRC” för Alx647
I kolumnen Användning, välj Mål från rullgardinsmenyn för influensa A och influensa B, och välj
Intern kontroll för PRC. När Intern kontroll väljs kommer ett popup-fönster visa varningen nedan.
Välj knappen Ja.
iv.
v. I kolumnen Kurvanalys, skriv Primär kurva för varje kanal (influensa A, influensa B, PRC)
(standardinställning).
vi. I kolumnen Inställning av tröskelvärde skriv Manuellt tröskelvärde för varje kanal (influensa A,
influensa B, PRC) (standardinställning).
vii. I kolumnen Manuellt tröskelvärde, flourenheter, skriv in följande tröskelvärden:
a. Influensa A:
20.0
b. Influensa B:
20.0
c. PRC:
20.0
viii. I kolumnen Giltig minimicykel skriv 10 för varje kanal (influensa A, influensa B, PRC).
ix. I kolumnen Giltig maxcykel skriv 45 för varje kanal (influensa A, influensa B, PRC).
x. I kolumnen Bakgrundssubtraktion använd “PÅ” för varje kanal (influensa A, influensa B, PRC)
xi. I
kolumnen
Bakgrundsminimicykel
skriv
5
för
varje
kanal
(influensa
A,
influensa B, PRC) (standardinställning).
xii. I
kolumnen
Bakgrundsmaxcykel
skriv
45
för
varje
kanal
(influensa
A,
influensa B, PRC).
xiii. I kolumnen (Glidande medeltal för cykler behåll 0 för varje kanal (influensa A, influensa B,
PRC)(standardinställning).
xiv. I kolumnen Slutpunkt för trödkelvärde skriv 20 för varje kanal (influensa A, influensa B,
PRC) (standardinställning).
Sida 10 av 31
xv. I kolumnen NC IC% behåll ”Ej tillämpligt” för varje kanal (PRC) (standardinställning).
xvi. I kolumnen IC Delta behåll ”Ej tillämpligt” för varje kanal (influensa A, influensa B)
xvii. I avsnittet Anpassa resultattext (under tabellen), välj Text, organismbaserat resultat från
rullgardinsmenyn. Följande varning visas i ett popup-fönster. Välj Ja.
xviii. Välj knappen Anpassa för att öppna dialogfönstret Text, organismbaserat resultat. Välj knappen
Lägg till, skriv “Influenza A” i kolumnen Organismnamn och kryssa i rutan Influenza A. Välj knappen
Lägg till, skriv “Influenza B” i kolumnen Organismnamn och kryssa i rutan Influenza B.
d.
Klicka på OK längst ned i popup-fönstret
Ställ in tider och temperaturer för RT-PCR-cykling, längst ned på skärmen, enligt nedan:
i. Stadium 1
1. Konstanthållen
2. Temp:
55,0
3. Sek:
300
4. Optik:
AV
ii. Stadium 2
1. Konstanthållen
2. Temp:
60,0
3. Sek:
300
4. Optik:
AV
iii. Stadium 3
1. Konstanthållen
2. Temp:
65,0
3. Sek:
300
4. Optik:
AV
iv. Stadium 4
1. 2-temperaturcykeln
2. Antal upprepningar: 50
3. Första temperaturraden:
a. Temp:
92,0
b. Sek:
5
c. Optik:
AV
4. Andra temperaturraden
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3.
a. Temp:
57,0
b. Sek:
40
c. Optik:
PÅ
Spara protokollet genom att välja knappen Spara längst ned på skärmen
Bild som visar det ifyllda Quidel Molecular influensa A+B-protokollet
Begränsningar: Följande protokoll har utvecklats specifikt för användning tillsammans med Quidel Molecular
influensa A+B realtids-RT-PCR-analys. Dess lämplighet vid användning av andra analyser är okänd. För att
säkerställa programkompatibilitet kolla med Cepheid.
Programmeringsanvisningar för 7500 Fast DX
1.
2.
Starta 7500 Fast Dx-programvarupaketet.
Dialogfönstret Snabbstartsdokumentet öppnas. Välj knappen Skapa nytt dokument för att starta Guiden nytt
dokument. Starta Quidel Molecular influensa A+B-protokollet genom att följa varje steg.
a. Definiera dokument: Det mesta av följande ska vara standardinställt. Om inte, ändra efter behov.
i. Bekräfta eller skriv in följande information.
b.
Analys:
Standardkurva (Absolut kvantifiering)
behållare:
96-brunnars, klar
Mall:
Tomt dokument
Körläge:
Fast 7500
Operatör:
ditt operatörsnamn
Kommentarer:
SDS v1.4 (lätt till fler vid behov)
Plattnamn:
“Quidel Molecular Influenza A+B”
ii. Välj knappen Nästa.
Välj detektorer: Nya detektorer för influensa A, influensa B och processkontrollen (PRC) måste läggas
till. För varje mål, välj knappen Ny detektor för att öppna popup-fönstret Ny detektor. Alternativt kan
knappen Skapa en annan användas i popup-fönstret Ny detektor för de senaste två detektorerna.
Sida 12 av 31
i. Ange följande information för var och en av detektorerna.
Namn
Reporterfärg
Quencherfärg
Influensa A
FAM
(ingen)
Influensa B
JOE
(ingen)
PRC
Cy5
(ingen)
c.
d.
Färg
(Välj)
(Välj)
(Välj)
ii. Välj en unik färg som representerar varje detektor.
iii. Markera de nya detektorerna och lägg till i kolumnen Detektorer i dokumentet med hjälp av
knappen Lägg till.
iv. Väj (none)(ingen) från rullgardinsmenyn Passiv referens.
v. Välj knappen Nästa.
vi. Välj knappen Slutför utan att ställa in några brunnar.
Guiden stängs och programmet öppnas och inleder med fliken Inställningar. Den kommer att visa
den provplatta som ställdes in under snabbstarten. I den inledande inställningen behöver ingenting
ändras här.
Definiera protokollet för termocykel: Välj fliken Instrument för att ställa in tider och temperaturer för
Quidel Molecular Influenza A+B RT-PCR-cykeln. Under Termisk profil ska det finnas ett
standardprotokoll med 2 stadier. Varje stadium har 3 textrutor som kan ändras av användaren. Den
övre rutans värde representerar antalet repetitioner eller cykler för stadiet i fråga. Den mellersta
rutans värde representerar temperaturen (˚C) och den understa rutans värde representerar tiden
(minuter: sekunder).
i. Gör följande förändringar i förvalt Protokoll för termocykler:
1. Stadium 1
a. Repetitioner: 1
b. Temp:
55
c. Tid:
5:00
2. Välj fältet mellan stadium 1 och stadium 2. Välj knappen Lägg till konstanthållen för
att lägga till ytterligare ett stadium.
3. Stadium 2
a. Repetitioner: 1
b. Temp:
60
c. Tid:
5:00
4. Välj fältet mellan stadium 2 och stadium 3. Välj knappen Lägg till konstanthållen för
att lägga till ytterligare ett stadium.
5. Stadium 3
a. Repetitioner: 1
b. Temp:
65
c. Tid:
5:00
Sida 13 av 31
6.
Stadium 4 (2-stegs dissocieringsstadium)
a. Repetitioner: 10
b. Steg 1
i. Temp:
92
ii. Tid:
0:05
c. Steg 2
i. Temp:
57
ii. Tid:
0:40
7. Välj fältet till höger om stadium 4. Välj knappen Lägg till cykel för att lägga till
ytterligare ett stadium.
8. Stadium 5 (2-stegs dissocieringsstadium)
a. Repetitioner: 35
b. Steg 1
i. Temp:
92
ii. Tid:
0:05
c. Steg 2
i. Temp:
57
ii. Tid:
0:40
9. Om ett felaktigt stadium läggs till kan det tas bort genom att trycka på knappen Ta
bort efter att stadiet har markerats mellan de vertikala linjerna
ii. Ange följande under Inställningar:
Provvolym (μL):
20 (standard)
Körläge:
7500 Fast (standard)
Datainsamling:
Stadium 5, Steg 2 (57,0 @ 0:40)
OBS: Markera inte kryssrutan intill ”Expertläge”.
iii. Slutligt protokoll
e.
Ställ in tröskelvärdet för varje analyt.
i. Välj fliken Resultat.
ii. Välj fliken Amplifieringsdiagram.
iii. Välj influensa A från fliken Detektor i övre högra hörnet.
iv. I blocket Analysinställningar ställ in Tröskelvärde till 1.5e5.
v. Välj alternativknappen Autobaslinje.
vi. Upprepa iii-v för influensa B och ställ in Tröskelvärdet på 1.2e5.
vii. Upprepa iii-v för PRC och ställ in Tröskelvärdet på 2.7e4.
Sida 14 av 31
f.
g.
Spara det nya protokollet som mall för framtida använding.
i. Högst upp på skärmen väljer du File(Arkiv) och sedan Save As (Spara som).
ii. Spara i: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Filnamn: “Quidel Molecular Influenza A+B”
iv. Filformat: “SDS Templates (*.sdt)”
Avsluta programmet.
Begränsningar: Följande protokoll har utvecklats specifikt för denna användning. Dess lämplighet vid användning
av andra analyser är okänd. För att säkerställa programkompatibilitet kolla med Life Technologies .
Life Technologies QuantStudioTM Dx Real-Time PCR-instrumentets instruktioner för programmering
Programmeringen av instrumentet utförs genom att använda TDD-filen som följer med testsatsen.
Analysprocedur
Kör följande procedurer vid en kontrollerad rumstemperatur på 20-25 °C.
Procedur för extraktion av nukleinsyra
Se programmeringsanvisningarna för NucliSENS easyMAG-systemet ovan.
1. Tillsätt 20 µl processkontrollen till provets extraktionsbrunn.
2. Tillsätt 180 µl av patientprov eller extern kontroll till en extraktionsbrunn.
3. Följ extraktionsanvisningarna enligt tillverkarens instruktioner.
Procedur för rehydrering av Master Mix
1. Bestäm antal prover som ska testas och skaffa rätt antal lyofiliserade Master Mix-flaskor med åtta tester.
2. Återför oanvända reagenser till lämpliga förvaringsförhållanden.
3. Öppna Master Mix försiktigt så att pelleten inte går sönder.
4. Tillsätt 135 µl rehydreringslösning till Master Mixen.
5. Placera flaskan i rumstemperatur under 1-2 minuter medan pelleten rehydreras.
6. Pipettera försiktigt upp och ned 2-3 gånger (undvik bubbelbildning) innan dispensering till det första
PCR-röret eller mikrotiterplattan.
Obs! Den rehydrerade Master Mixen räcker till åtta reaktioner.
Obs! Den rehydrerade Master Mixen kan förvaras vid rumstemperatur i upp till 4 timmar eller
vid ≤ -20 °C i upp till 2 veckor. (Se avsnittet “Förvaring och hantering av kitreagenser” för
ytterligare förvaringsalternativ)
Inställning av RT-PCR:
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1.
2.
3.
4.
5.
Lägg 15 µl av den rehydratiserade Master Mix till varje reaktionsrör eller mikroplattorna.
Tillsätt 5 µl extraherad nukleinsyra (prov med processkontroll) till reaktionsrören eller mikrotiterplattorna.
Reagenserna behöver inte blandas.
Obs! Använd en ny mikropipett med icke-aerosolspets för varje extraherat prov.
Stäng reaktionsrören eller försegla plattan.
Obs! Quidel föreslår att varje körning med termocykler ska inkludera ett reaktionsrör eller
mikrotiterplatta med en extern positiv kontroll och negativ kontroll för influensa A/influensa B. Gör
kontroller i enlighet med laboratoriets rutiner och riktlinjer.
Centrifugera rektionsrören eller plattan i minst 15 sekunder. Se till att all vätska finns i botten på röret.
Sätt in rören eller plattorna i termocyklern.
Amplifieringsprotokoll på SmartCycler II
1.
2.
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4.
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6.
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9.
10.
11.
12.
13.
Slå på SmartCycler-blocket/en
Starta programvarupaketet SmartCycler Dx version 3.0b
Välj knappen Skapa körning längst upp på skärmen för att ställa in körningen
Under Körningens namn ange ett namn för aktuell körning (YYMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B)
Under Anteckningar, skriv in eventuella anteckningar om körningar för framtida referens
Under Analys välj “Quidel Molecular Influenza A+B-analys” från rullgardinsmenyn
Under Analysinformation ange partinummer och kitets utgångsdatum.
För att välja de brunnar som ska användas gör något av följande:
a. För att tilldela brunnar automatiskt gör något av följande:
i. Under Antal prover ange antaler prover i avsedd textruta.
ii. Välj knappen Använd. Angivet radantal visas i Platstabellen.
b. Gör så här för att stänga brunnarna på SmartCycler-blocken manuellt:
i. Välj knappen Lägg till/ta bort platser i nedre delan av skärmen.
ii. Då öppnas popup-fönstret Välj platser med två kolumner. Kolumnen till vänster (Platser) listar
alla tillgängliga platser, och kolumnen till höger (Val) visar alla valda platser.
iii. För att välja alla platser, klicka på knappen Välj alla platser.
iv. För att välja specifika platser markera en eller flera platser och välj den högra pilen för att lägga
till platsen/platserna till kolumnen Val.
v. Välj knappen OK för att stänga fönstret. Valda platser kommer att visas i Platstabellen.
Ange prov-id under kolumnen (Prov-id) i Platstabellen (detta kan också göras efter att körningen har
startats).
Skriv eventuella anmärkningar i kolumnen Anteckningar och låt anteckningar angående Provtyp stå som
“SPEC”.
Välj knappen Starta köring längst ned på skärmen.
Välj knappen Visa resultat för att se hur körningen fortskrider.
Spara körningen när det är avslutad och innan du avslutar programvaran.
Amplifieringsprotokoll på 7500 Fast Dx termocykler
1.
2.
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4.
5.
Slå på ABI 7500 Fast Dx.
Starta ABI 7500 Fast Dx-programvarupaketet.
Dialogfönstret Snabbstartsdokumentet öppnas.
Klicka på Skapa ett nytt dokument.
Det mesta av följande ska vara standardinställt. Om inte, ändra efter behov.
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6.
7.
8.
Analys:
Standardkurva (Absolut kvantifiering)
Behållare:
96-brunnars, klar
Template (Mall):
Körläge:
Fast 7500
Operatör:
ditt operatörsnamn
Kommentarer:
SDS v1.4 (lätt till fler vid behov)
Plattnamn:
ÅÅMMDD-Quidel Molecular Influenza A+B
Ställ in provplatta
a. Under flikarna Inställning och Platta kommer plattinställningen att visas.
b. Välj alla brunnar som kommer att innehålla prov, högerklicka och välj Brunnsinspektör från
rullgardinsmenyn. När popup-fönstret Brunnsinspektör öppnas välj detektorer för influensa A,
influensa B och PRC.
c. Använd Brunnsinspektören för att ange provens namn. Patient-id kan anges i fönstret Well Inspector.
Det rekommenderas dock att detta görs innan den lyofiliserade Master Mixen slammas upp, efter
körningen eller med hjälp av importfunktionen, för att minimera den tid som PCR-rektionerna
befinner sig rumstemperatur innan körningen startas.
d. Spara körningen som ÅÅMMDD-Quidel Molekylär influensa A+B.sds.
e. Ett fönster öppnas och frågar efter ”Anledning till byte av post”. Ange ”Installation” och andra
nödvändiga kommentarer om körningen.
Starta processkontrollen
a. Välj fliken Instrument.
b. Sätt in PCR-plattan med 96 brunnar i maskinen.
c. Under Instrumentkontroll välj Start-knappen för att starta körningen.
Efter processkontrollen
a. VIKTIGT: När körningen är färdig tryck på OK. Analysera data genom att trycka på knappen
”Analysera” i den övre menyn, och spara filen.
b. Spara filen genom att trycka på Spara dokument i aktivitetsfältet. Ett fönster öppnas och frågar efter
“Anledning till byte av post”. Ange “Dataanalys efter körning” och andra nödvändiga kommentarer
om körningen.
Förstärkningsprotokoll på QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrument
1.
2.
3.
4.
5.
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7.
8.
9.
Sätt på QuantStudio Dx.
Välj IVD-läge på instrumentet.
Lansera QuantStudio Dx IVD mjukvarupaket.
För in systemets användarnamn och lösenord på uppmaning.
Startfönstret öppnas.
I Installations-rutan, markera det tidigare laddade testnamnet “Quidel molekylär influensa A + B-analys”
Klicka på Installations-knappen för att köra.
Fönstret för Installation, Testa egenskaper kommer visas. Ange kör information i enlighet därmed.
a. Ange Experimentnamn (standardinställning lanserar körningen med en stämpel för tid och datum).
b. Ange information för Plattans streckkod.
c. Protokollmaterialets partinummer under Reagensinformation.
d. Spara körningen som ÅÅMMDD-Quidel Molekylär influensa A + B.sds.
e. Ett fönster öppnas och frågar efter “Anledningen till byte av post”. Ange “Installation” och andra
nödvändiga kommentarer om körningen.
I menyn på vänstersidan, välj Definiera.
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10. Redigera provinformation.
a. Ange specifik provinformation för varje hål genom att radera standardidentifieraren (Patient 1,
Patient 2, etc.) och ange ny information, ELLER
b. Välj Importera från fil på den övre delen av displayen för att ladda upp en förhandsdefinierad
plattkarta från en text-(tabbavgränsad) fil.
11. I menyn på vänstersidan, välj Tilldela för att verifiera rätt plattinstallation.
12. Ladda provplattan.
a. Mata ut instrumentbrickan.
b. Mata in den 96-håliga PCR-plattan in i maskinen med A1-hålet positionerat i det övre vänstra hörnet.
c. Dra tillbaka instrumentbrickan.
13. Starta körningen.
a. I menyn på vänstersidan, välj Kör.
b. Klicka på den gröna Starta körning-knappen på den övre delen av skärmen.
i. Vid uppmaning, välj det specifika serienumret för instrumentet som används.
14. När körningen är färdigställd, välj Analys i menyn på vänstersidan.
a. Spara filen genom att trycka Spara i aktivitetsfältet. Ett fönster öppnas och frågar efter “Anledning till
byte av post”. Ange “Dataanalys efter körning” och andra nödvändiga kommentarer om körningen.
b. Förstärkningsplottning visas som standard. För att se andra plottningstyper, välj dem från menyn
på vänstersidan.
c. För att visa körningsinformation med Ct-värden, välj fliken Brunnstabell på den högra sidan av
skärmen.
15. Skriva ut en rapport.
a. I menyn högst upp, välj Skriv ut rapport. Finjustera rapportinnehållet genom att markera eller
avmarkera rutor i rapportfönstret.
b. Välj “Skriv ut rapport”-knappen längst ner på dialogrutan.
16. Exportera datafiler.
a. I menyn på vänstersidan, välj Exportera.
b. Ange Exportera filadress ELLER klicka Sök för att leta reda på önskad sökväg.
c. Exportfilnamnet på den sparade körningen kommer ställas in som standard.
d. Välj Excel som filtyp.
e. Finjustera den exporterade datarapporten genom att växla mellan de olika flikarna och markera eller
avmarkera alternativ.
f. Välj Starta export längs med fönstrets nederkant.
Sida 18 av 31
Tolkning av resultat
Tolkning av resultat med hjälp av SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
Välj fliken Visa resultat efter avslutad körning.
Välj fliken Provresultat.
SmartCycler-programvaran kommer automatiskt att svara, oavsett om proven är positiva eller negativa
för influensa och oavsett om körningen var ogiltig (oklar) eller ej.
Mer detaljerad information finns under fliken för respektive analyt i samma fönster. Vid positivt svar för
antingen influensa A eller B (eller båda) gäller inte PCR-resultatet. PCR krävs endast för negativa svar.
Tolkning av Quidel Molecular influensa A+B-analysresultat utskrivna på SmartCycler II
Analysresultat
Processkontroll
-resultat
Influensa A
Influensa B
Negativt
Godkänt
NEG
NEG
Ingen influensa A- eller influensa Bnukleinsyra detekterad; PRC detekterad
Influensa
A-positiv
Influensa
B-positiv
Influensa
A- och influensa
B-positiv
NA
(ej tillämpligt)*
NA
(ej tillämpligt)*
POS
NEG
Influensa A-nukleinsyra detekterad
NEG
POS
Influensa B-nukleinsyra detekterad
POS
POS
Influensa A och influensa B-nukleinsyra
detekterad
NA
(ej tillämpligt)*
Oklart – PCR-hämning eller reagensfel.
Upprepa testningen från den renade
Ogiltigt
Ej godkänt
NEG
NEG
nukleinsyran eller samla in och testa ett
nytt prov.
*Inget värde behövs för att Processtyrningen ska göra ett positivt samtal.
Felkod 3079: Varning/felkod 3079 kan uppstå vid positiva prover av influensa A och influensa B. Varning/felkod
3079 uppstår när fluorescenssignalen (RFU) är för hög. I detta fall rapporteras alla resultat för detta prov av
Dx-programvaran som ND (not determined, ej bestämda). Om ett Ct-värde ≥ 10 eller ≤ 45 rapporteras för
influensa A eller influensa B kan provresultaten registreras som POS för influensa A eller influensa B.
Tolkning av resultat med hjälp av 7500 Fast Dx Thermocycler
Tolkning av resultat från Quidel Molecular influensa A+B-analysen på 7500 Fast Dx termocykler
Analysresultat
Detektor:
Influensa A
Detektor:
Influensa B
Detektor:
Processkontroll
Negativt
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
5,0 ≤ Ct ≤35,0
Ogiltigt
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ct < 5,0 eller
Ct > 35,0
Ogiltigt
Obestämd
Obestämd
Obestämd
Influensa
A-positiv
Influensa
B-positiv
Influensa Aoch B-positiv
NA
(ej tillämpligt)*
NA
(ej tillämpligt)*
NA
(ej tillämpligt)*
Ingen influensa A- eller influensa Bnukleinsyra detekterad;
PRC detekterad
Influensa A och influensa
B-nukleinsyra detekterad
Ingen influensa A-, influensa B- eller
PRC-nukleinsyra detekterad; ogiltig
körning, kör om eller extrahera om
Ej bestämt, kör om eller
extrahera om
*Inget Ct-värde behövs för att processkontrollen ska ge ett positivt svar.
Sida 19 av 31
Tydning av resultat genom användning av QuantStudio Dx Real-Time PCR-instrument
Tolkning av Quidel Molecular influensa A+B-analysresultat på QuantStudio Dx Real-Time
PCR-instrumentet
Analysresultat
Negativt
Detektor:
Influensa A
Detektor:
Influensa B
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Influensa
A-positiv
Influensa
B-positiv
Influensa A- och
B-positiv
Ct ≤40,0
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
Ct ≤40,0
Ogiltigt
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Detektor:
Processkontroll
Ct ≤40,0
NA
(ej tillämpligt)*
NA
(ej tillämpligt)*
NA
(ej tillämpligt)*
Inget Ct-värde
angivet (tomt)
Ingen influensa A- eller influensa Bnukleinsyra detekterad;
PRC detekterad
Influensa A och influensa Bnukleinsyra detekterad
Ingen influensa A-, influensa B- eller
PRC-nukleinsyra detekterad; ogiltig
körning, kör om eller extrahera om
*Inget Ct-värde behövs för att processkontrollen ska ge ett positivt svar.
Kvalitetskontroll
Quidel Molecular influensa A+B-analys innefattar flera kontroller för övervakning av analysens prestanda.
1.
2.
3.
Processkontrollen ska användas under extraktion och amplifiering i analysen. Denna kontroll ska tillsättas
varje lika stor del av provet före extraktion.
Kommersiellt tillgängliga externa positiva influensa A/B-kontroller kan behandlas som patientprover och ska
användas i enlighet med gällande laboratoriestandard. Influensa A- eller influensa B-prover som tidigare
karakteriserats positiva kan användas istället för en kommersiell influensa A/B-kontroll.
Virustransportmedia eller ett tidigare karakteriserat negativt prov kan användas som extern negativ kontroll.
Detta måste behandlas som ett patientprov och ska hanteras i enlighet med gällande laboratoriestandard.
Begränsningar
Detta test är inte avsett att differentiera influensa A-subtyper, t.ex. den nya influensan A H1N1. Ytterligare
testning krävs för differentiering av subtyper.
Negativa resultat utesluter inte infektion med influensavirus och bör inte utgöra den enda grunden för beslut
om behandling.
Liksom för andra analyser av denna typ finns det risk för falskt negativa resultat på grund av sekvensvarianter
i virusmålet.
Felaktig insamling, förvaring eller transport kan leda till falskt negativa resultat.
Hämmande ämnen i provet och/eller fel under analysproceduren kan leda till falskt negativa resultat.
Sida 20 av 31
Klinisk prestanda
Prestandaegenskaper för Quidel Molecular Influenza A+B-analys etablerades i en prospektiv studie under 2011 års
respiratoriska virus säsong (januari-mars). Prover som användes för denna studie var nasala och nasofaryngeala
stickprover som samlades in för rutinmässig influensatestning.
Referensmetoden var snabb kultur i plaströr (shell vial) följt av fluorescent antikropp (DFA) screening
och identifiering.
Sammanlagt 637 stickprover testades med Quidel Molecular Influenza A+B-analys och genom odling. Sex (6)
prover som ursprungligen gav osäkra resultat förblev osäkra efter omtestning med Quidel Molecular Influenza
A+B-analysen och ingår inte i analysen nedan.
Sammanlagt 6 prover var positiva för DFA respiratoriskt virus (screening-reagens detekterar influensa A och B, RSV,
Parainfluensa 1, 2, och 3, samt Adenovirus), men innehöll alltför få celler för att ge en specifik positiv identifiering.
Sammanlagt 3 prover var toxiska i cellkultur. Dessa 9 prover ingår inte i analysen nedan.
Avvikande analyser för prover där Quidel Molecular Influenza A+B-analysen och kulturresultaten var oeniga
genomfördes med en CE-märkt RT-PCR-analys och i förekommande fall dubbelriktad sekvensering.
Influensa A
Ny nasal/nasofaryngeal
kontrollsticka (N=622)
Quidel Molecular Influenza
A+B-analys
Positivt
Positivt
Negativt
Totalt
93
18*
111
Negativt
1**
510
511
Totalt
94
528
622
95 % CI
Känslighet
93/94
98,9 %
94,2 % till 100 %
Exakhet
510/528
96,6 %
94,7 % till 98,0 %
*17 av dessa prover var influensa A positiva enligt CE-IVD-enheten. Det återstående
enda provet var influensa A negativt enligt CE-IVD-enheten, men positivt för influensa
A-virus enligt sekvensanalysen
**Provet var även influensa A negativt enligt CE-IVD-enheten.
Influensa B
A+B-analys
Positivt
Positivt
Negativt
Totalt
74
7*
81
Negativt
2**
539
541
Totalt
76
546
622
95 % CI
Känslighet
74/76
97,4 %
90,8 % till 99,7 %
Exakhet
539/546
98,7 %
97,4 % till 99,5 %
*5 prover var influensa B positiva enligt CE-IVD-enheten, 2 prover var influensa B
negativa enligt CE-IVD-enheten, men var positiva för influensa B-virus enligt sekvensanalysen
**1 prov var influensa B positivt enligt CE-IVD-enheten, 1 prov var influensa B negativt
enligt CE-IVD-enheten
Sida 21 av 31
Sammanlagt 626 stickprover testades med Quidel Molecular Influenza A+B-analys och med en CE-märkt IVD
RT-PCR-analys. Sex (6) prover som ursprungligen gav osäkra resultat i båda analyserna förblev osäkra efter
omtestning med båda analyserna och ingår inte i analysen nedan. Ytterligare 10 prover gav osäkra resultat i den
CE-märkta IVD RT-PCR-analysen och förblev osäkra efter omtestning med analysen och ingår inte i analysen nedan.
Avvikande analyser för prover där Quidel Molecular Influenza A+B-analys och en CE-märkt IVD RT-PCR-analys var
oeniga genomfördes med en sekvensering.
Influensa A
A+B-analys
Komparator: CE-IVD-enhet
Positivt
Negativt
Totalt
Positivt
107
3*
110
Negativt
0
500
500
107
503
610
Totalt
95 % CI
Känslighet
107/107
100 %
96,6 % till 100 %
Exakhet
500/503
99,4 %
98,3 % till 99,9 %
*3 prover var positiva för influensa A-virus genom sekvensanalys
Influensa B
A+B-analys
Komparator: CE-IVD-enhet
Positivt
Negativt
Totalt
Positivt
77
5*
82
Negativt
4**
524
528
Totalt
81
529
610
95 % CI
Känslighet
Exakhet
77/81
95,1 %
87,8 % till 98,6 %
524/529
99,1 %
97,8 % till 99,7 %
*5 prover var positiva för influensa B-virus genom sekvensanalys
**4 prover var negativa för influensa B-virus genom sekvensanalys
Sida 22 av 31
En delmängd av tvåhundraelva (211) prov från studien ovan testades på QuantStudio Dx Real-Time PCRinstrumentet. Resultaten från denna testning jämfördes med data från samtidig testning på ABI 7500 Fast Dx.
Denna jämförelse redogörs nedan.
Quidel Molecular Influenza A+B-analys
Influensa A
PCR-instrument
Positivt
Negativt
Totalt
Positivt
63
0
63
Negativt
0
148
148
Totalt
63
148
211
95 % CI
Känslighet
Exakhet
63/63
100 %
94,3 % till 100 %
148/148
100%
97,5 % till 100 %
Quidel Molecular Influenza A+B-analys
Influensa B
PCR-instrument
Positivt
Negativt
Totalt
Positivt
28
0
28
Negativt
0
183
183
Totalt
28
183
211
95 % CI
Känslighet
Exakhet
28/28
100 %
87,9 % till 100 %
183/183
100%
97,9 % till 100 %
Analytisk prestanda
Detekteringsnivå
Den analytiska sensitiviteten (detektionsgräns eller LoD) för Quidel Molecular Influenza A+B-analysen bestämdes
med hjälp av kvantifierade (TCID 50/ml) kulturer av 3 influensa A-stammar (1 H1N1, 1 2009H1N1 och 1 H3N2),
3 influensa B-stammar, seriespäddes i negativ nasofaryngeal matris. Varje spädning extraherades med NucliSENS
easyMAG-systemet och testades i replikat av 20 per koncentration av virus på både Applied Biosystems® 7500 Fast
Dx eller Cepheid SmartCycler® II plattformar. Analytisk sensitivitet (LOD) definieras som den lägsta koncentration
vid vilken 95 % av alla replikat testades positivt.
Detekteringsnivå
Stam
Final TCID 50/ml LoD
7500 Fast Dx
Smart Cycler
A1/Mal/302/54
1,16E+01
1,74E+01
A/Mexico/4108/2009
1,61E+01
1,82E+01
A/Victoria/3/75
2,29E+01
2,29E+01
B/Florida/04/2006
6,95E+00
6,95E+00
B/RCHIN 8/05
4,44E+00
4,44E+00
B/Malaysia/25/06/04
2,85E+00
2,85E+00
Sida 23 av 31
Kompetitiv hämning
Kompetitiv hämning av Quidel Molecular Influenza A+B-analysen utvärderades med simulerade prover med
varierande koncentrationer av influensa A-virus (2x LoD till 4 loggar över LoD) och influensa B-virus (2x LoD till 4
loggar över LoD) i ett enda prov. Prover extraherades med hjälp av NucliSENS easyMAG-systemet och testades i
triplikat. Förekomsten av både influensa A-virus och influensa B-virus vid varierande koncentrationer i ett enda
prov hade ingen effekt på den analytiska sensitiviteten (detektionsgräns eller LoD) för Quidel Molecular Influenza
A+B-analysen.
Analytisk reaktivitet (integrering)
Reaktiviteten av Quidel Molecular Influenza A+B-analysen utvärderades mot flera stammar av influensa A och
influensa B-virus. Den kliniska Panelen bestod av 10 influensa A subtyp H1N1, 2 Influensa A subtyp 2009H1N1, 8
Influensa A subtyp H3N2, 2 Influensa A subtyp H5N1, 13 influensa B stammar. Ytterligare en panel av icke-kliniska
begränsade isolat testades också. Varje panelmedlem extraherades med NucliSens easyMAG-instrumentet och
testades i triplikat.
Quidel Molecular Influenza A+B-analysen upptäckte 100 % av influensa A (38/38) och influensa B-stammar (15/15)
2
3
vid 10 till 10 TCID50/ml nivåer, inklusivehittills okänt, pandemi och fågelinfluensa A-stammar samt
influensastammar B som cirkulerat nyligen.
Klinisk panel influensa A-virus
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
1,45E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
A/Nya Kaledonien/20/1999
1,12E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/New Jersey/8/76
3,80E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/PR/8/34
5,89E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/NWS/33
NA
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/Denver/1/57
1,26E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/FM/1/47
3,80E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/Mexico/4108/2009
1,40E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A1/Mal/302/54
4,19E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/Taiwan/42/06
3,39E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/Brisbane/59/07
7,24E+01
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H1N1
A/Salomonöarna/3/06
1,41E+01
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Hong Kong/8/68
1,15E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Wisconsin/67/2005
7,24E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Aichi/2/68
4,17E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
4,57E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Perth/16/2009
9,83E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Uruguay/7/16/2007
1,03E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Victoria/3/75
2,19E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H3N2
A/Brisbane/10/07
4,17E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
Undertyp
Stam
TCID50/ml
H1N1
H1N1 A/Kalifornien/07/2009
H1N1
Sida 24 av 31
Klinisk panel influensa B-virus
Stam
TCID50/ml
B/HongKong/5/72
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
6,67E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Panama/45/90
1,02E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Florida/02/2006
3,16E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Florida/04/2006
3,80E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Florida/07/2004
1,26E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Malaysia/25/06/04
3,41E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Maryland/1/59
1,15E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Allen/45
4,17E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Taiwan/2/62
1,51E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Ryssland/69
2,19E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Mass/3/66
1,38E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/Lee/40
1.95E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
B/GL/1739/54
6,30E+02
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
Icke-kliniskt begränsade virus
Undertyp
Stam
TCID50/ml
H3N2
A/WI/629-2/2008 (H3N2)
H1N1
(7500 Fast Dx)
(SmartCycler)
A
B
A
B
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
A/WI/629-S7(D02473)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positivt
Negativt
H1N1
A/WI/629-S5 (D02312)/2009 (H1N1pdm)
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H2N2
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H7N3
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H9N2
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H4N8
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H6N2
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H8N4
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H5N1
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H10N7
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H11N9
A/Chicken/NJ/15906-9/96 (H11N9)
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H12N5
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H13N6
A/Gull/MD/704/77 (H13N6)
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H14N5
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H15N9
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
H16N3
2,00E+02
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
Positivt
Negativt
Sida 25 av 31
Reproducerbarhet
Inomlab-reproducerbarheten hos Quidel Molecular Influenza A+B-analysen utvärderades vid 3 laboratorieplatser.
Reproducerbarheten bedömdes med hjälp av en panel med 6 simulerade prover som inkluderade medium (10x
LoD), hög negativ (C 20-60 koncentration) influensa A-virus, influensa B-virus, positiva och negativa kontrollprover.
Paneler och kontroller testades vid varje plats med 2 operatörer under 5 dagar (8 prover och 3 kontroller × 2
operatörer × 5 dagar × 3 platser = 330). Panelerna och kontrollerna extraherades med NucliSENS easyMAG
systemet och testades på 7500 Fast Dx instrumentet.
Reproducerbarhet
Panel
Medlems-id
Influensa A
hög negativ
Influensa A
positiv (10x LoD)
Influensa B
hög negativ
Influensa B
positiv (10x LoD)
Influensa A
positiv kontroll
Influensa B
positiv kontroll
Negativ kontroll
Plats 1
Plats 2
Plats 3
Överensstä
mmelse med
förväntat
resultat
AVE
Ct
%
CV
Överensstä
mmelse med
förväntat
resultat
AVE
Ct
%
CV
Överensstä
mmelse med
förväntat
resultat
AVE
Ct
%
CV
6/10
31,5*
8,8
10/10
N/A
N/A
9/10
34,3*
N/A
10/10
24,7
2,1
10/10
26,0
9,0
9/10
28,1
7,6
29/30
9/10
34,9
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
10/10
25,1
12,0
10/10
28,3
9,3
9/10
27,2
10,1
29/30
10/10
12,0
2,4
10/10
11,9
4,0
10/10
13,5
8,3
30/30
10/10
14,7
2,2
10/10
15,1
3,7
10/10
16,0
7,6
30/30
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
10/10
N/A
N/A
30/30
Total
överensstäm
melse med
förväntat
resultat
25/30
Analytisk exakthet - korsreaktivitet
Den analytiska exaktheten för Quidel Molecular Influenza A+B-analysen utvärderades genom att testa en
panel bestående av 26 virala, 24 bakteriella och 1 jäststam som representerar allmänna respiratoriska patogener
5
10
eller flora som vanligen är närvarande i nasofarynx. Bakterier och jäst testades vid koncentrationer av 10 till 10
3
6
CFU/ml. Virus testades vid koncentrationer av 10 till 10 TCID50/ml. Prover extraherades med hjälp
av NucliSENS easyMAG instrumentet och testades i triplikat. Analytisk exakthet för Quidel Molecular
Influenza A+B-analysen var 100 %.
Korsreaktivitet
hMPV A1
Slutlig
konc.
3,70E+04
Resultat
influensa A
Negativt
Resultat
influensa B
Negativt
hMPV B1
2,37E+04
Negativt
Negativt
RSV Long
4,40E+04
Negativt
Negativt
RSV Washington
1,75E+0
Negativt
Negativt
5,67E+04
Negativt
Negativt
Coronavirus 229E
1,70E+06
Negativt
Negativt
Coronavirus OC43
1,67E+06
Negativt
Negativt
Coxsackievirus B4
2,43E+06
Negativt
Negativt
2,28E+06
Negativt
Negativt
Cytomegalovirus
8,76E+05
Negativt
Negativt
Echovirus 7
5,38E+08
Negativt
Negativt
Echovirus 9
1,50E+06
Negativt
Negativt
Echovirus 6
1,05E+08
Negativt
Negativt
Organism ID
Sida 26 av 31
Korsreaktivitet
Echovirus 11
Slutlig
konc.
1,50E+05
Resultat
influensa A
Negativt
Resultat
influensa B
Negativt
Enterovirus 71
2,68E+03
Negativt
Negativt
Enterovirus 70
1,66E+05
Negativt
Negativt
Epstein Barr Virus
5.000cp/ml
Negativt
Negativt
HSV typ 1 Maclnytre stam
1,95E+06
Negativt
Negativt
HSV typ 2 G stam
3,67E+06
Negativt
Negativt
Rubeola
3,78E+05
Negativt
Negativt
Mumps virus
8,43E+04
Negativt
Negativt
Parainfluensa typ 1
2,50E+05
Negativt
Negativt
Parainfluensa typ 2
2,20E+04
Negativt
Negativt
Parainfluensa typ 3
9,10E+05
Negativt
Negativt
Parainfluensa typ 4
9,57E+06
Negativt
Negativt
Varicellazostervirus
7,50E+02
Negativt
Negativt
1,04E+07
Negativt
Negativt
2,55E+07
Negativt
Negativt
2,10E+05
Negativt
Negativt
2,05E+08
Negativt
Negativt
6,90E+08
Negativt
Negativt
6,60E+07
Negativt
Negativt
Mycobacterium avium
1,36E+10
Negativt
Negativt
5,90E+07
Negativt
Negativt
5,15E+07
Negativt
Negativt
Proteus vulgaris
2,65E+08
Negativt
Negativt
Proteus mirabilis
2,75E+07
Negativt
Negativt
2,15E+07
Negativt
Negativt
1,85E+08
Negativt
Negativt
Neisseria mucosa
1,85E+08
Negativt
Negativt
3,30E+07
Negativt
Negativt
Escherichia coli
6,80E+07
Negativt
Negativt
5,85E+07
Negativt
Negativt
6,0E+05
Negativt
Negativt
1,03E+08
Negativt
Negativt
4,5E+07
Negativt
Negativt
2,05E+08
Negativt
Negativt
2,50E+06
Negativt
Negativt
2,6E+07
Negativt
Negativt
5,15E+08
Negativt
Negativt
Organism ID
Sida 27 av 31
Korsreaktivitet
Slutlig
konc.
1,07E+06
Organism ID
Candida albicans
Resultat
influensa A
Negativt
Resultat
influensa B
Negativt
Analytisk exakthet - Interfererande ämnen
Prestandan hos Quidel Molecular Influenza A+B-analysen utvärderades med potentiellt interfererande ämnen som
kan finnas i nasofaryngeala prover. De potentiellt interfererande ämnena utvärderades i influensa A
(A/Mexico/4108/2009 ), och influensa B (B/Florida/04/2006) vid en koncentration av 3x och 10x LoD. Det fanns
inga tecken på interfereringar som orsakats av de ämnen som testats nedan med 3x eller 10x LoD.
60 µg/ml
Influensa A
resultat
(3x LoD)
Positivt
Influensa B
resultat
(3x LoD)
Positivt
Blod (människa), antikoagulerat EDTA
2 % (vol/vol)
Positivt
Positivt
Neo-Synefrin
15 % (vol/vol)
Positivt
Positivt
Afrin nässpray
15 % (vol/vol)
Positivt
Positivt
Zicam homeopatisk icke-dåsig
allergilättnad, droppfri flytande näsgel
5 % (vol/vol)
Positivt
Positivt
Nässpray med saltlösning
15 % (vol/vol) av dosen
Positivt
Positivt
Halstabletter
0,68g/ml, 1/18 droppe,
krossade, aktiva
ingredienser: 1,7 mg/ml
mentol
Positivt
Positivt
3,3-5 mg/ml
Positivt
Positivt
4,0 µg/ml
Positivt
Positivt
Mupirocin
6,6-10 mg/ml
Positivt
Positivt
Oseltamivirfosfat
7,5-25 mg/ml
Positivt
Positivt
Ämnets namn
Testad koncentration
Mucin (Bovint submaxillär körtel, IS typ)
Zanamivir
Tobramycin
Överföring och korskontaminerings-studier
I en intern studie fanns inga tecken på överföring/korskontaminering av Quidel Molecular Influenza A+B-analysen
vid användning av bioMériuex NucliSENS easyMAG automatiserade nukleinsyre extraktionsinstrument.
Ytterligare källmaterial
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Vägledningsdokument om särskilda kontroller för klass II: Reagents for Detection of Specific Novel Influenza A
Vägledning om in vitro-diagnostik för att upptäcka influensa A-virus: Labeling and Regulatory Path (April
Draft Guidance on Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens (Dec
CLSI EP17-A: Guidance for Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitations (Vol.
2, No. 34) (Oct 2004).
CLSI EP7-A2: Guidance for Interference Testing in Clinical Chemistry (Vol. 25, No.27 Second Ed) (Nov 2005).
CLSI EP12-A: Guidance for User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance (Vol. 22, No. 14) (Sept
2002).
CLSI MM6-A: Guidance for the Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases (Vol. 23, No.28) (Oct
2003).
Sida 28 av 31
24, No. 25 Second Ed.) (Aug 2004).
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som tillhör bioMerieux, Inc. TaqMan® är ett registrerat varumärke som tillhör Roche. CAL Flour® Orange 560,
CAL Flour® Red 610 och Quasar® 670 är registrerade varumärken som tillhör BioSearch Technologies, Inc.
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internationella patent eller patentsökningar.
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tillhandahålla tjänster för human in vitro-diagnos. Inga generella patent eller andra licenser av något slag, utöver
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Referenser
1
http://1918.pandemicflu.gov nås på 6/9/11.
2
3
http://www.cdc.gov/flu/about/disease/us_flu-related_deaths.htm nås på 6/9/11.
4
Clinical and Laboratory Standards Institute. Virusodling, godkända riktlinjer. CLSI dokument M41-A
M100 – Quidel Molecular Influenza A+B-analyskit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Tyskland
Quidel Corporation
quidel.com
M0002GSV00 (12/2012)
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Influenza A+B Assay Instructions for Use

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