lionel stéphan

LIONEL STÉPHAN
AMÉLIORATION DE LA TRANSPLANTATION DE
MYOBLASTES UN TRAITEMENT POSSIBLE DE LA
DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE
Utilisation de la forme active de la vitamine D3 et
obtention d’une tolérance immunologique
par l’administration de drogues cytoréductrices
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Microbiologie et Immunologie
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph. D.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2007
©Lionel Stéphan, 2007
Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne, maladie héréditaire causée par la mutation
du gène codant la protéine appelée dystrophine, se caractérise par une dégénérescence
musculaire progressive et létale. Présentement, c’est une maladie incurable. La
transplantation de cellules myogéniques (TM) est une des approches thérapeutiques
envisagées pour améliorer la condition et l’espérance de vie des patients. Cette thérapie
consiste à prélever des myoblastes d’un donneur sain et de les transplanter dans les muscles
d’un patient dystrophique. Cette approche comporte plusieurs difficultés, dont la survie des
myoblastes post-transplantation. Premièrement, les myoblastes injectés meurent rapidement
et massivement, le succès de la transplantation ne reposant alors que sur une faible portion
de cellules transplantées. Tous les facteurs impliqués dans cette mortalité cellulaire ne sont
pas encore déterminés. Néanmoins, il est établi que la régénération musculaire se base sur
les capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes. Le premier article de
cette thèse propose l’administration de la forme active de la vitamine D3 pour compenser la
perte initiale des myoblastes injectés. Nous avons confirmé l’effet mitogénique et
morphogénique de la vitamine D3 sur les myoblastes humains permettant ainsi, via son
administration, d’augmenter le succès des TMs. La deuxième partie de cette thèse traite du
rejet immunitaire lié à la TM allogénique. Actuellement, pour bloquer ce rejet, les
approches cliniques proposent une immunosuppression soutenue des patients, se révélant
toxique à long terme et augmentant le risque de contracter des maladies iatrogènes. Une
autre procédure, moins délétère, repose sur le développement d’une tolérance
immunologique, via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte. Pour obtenir
ce chimérisme, les procédures existantes nécessitent un lourd conditionnement des patients,
incluant l’injection d’anticorps bloquants ou déplétants, ainsi qu’une irradiation
pancorporelle. Le deuxième article de ce manuscrit propose l’administration de drogues
cytoréductrices, déjà connues et approuvées en clinique. Ce protocole conduit au
développement d’un statut de tolérance stable ainsi que le maintien à long terme des TMs.
Les travaux effectués au cours de cette thèse proposent donc deux solutions pour
circonvenir à la destruction précoce et plus tardive des myoblastes transplantés. Ces deux
approches pourraient réduire l’aspect invasif de l’essai clinique basé sur la TM.
ii
Abstract
Duchenne muscular dystrophy is a fatal neuromuscular recessive disease
characterized by widespread muscle damage throughout the body. No cure is currently
available this disease. Myoblast transplantation (MT) is an interesting approach to enhance
the life quality and life expectancy of patients. This therapy consists in harvesting
myoblasts of a non-dystrophic donor and in transplanting them in dystrophic muscles. This
approach involves many drawbacks and predominantly the loss of the grafted cells in posttransplantation period. Firstly, an important part of injected myoblasts quickly dies
following their injection. Thus, the graft success relies on the survival of a little proportion
of grafted cells. The pathways involved in this important death of cells are not well
established. However, following a muscle injury, the muscular regeneration depends on the
proliferation and the differentiation of myoblasts. In a first study, we propose an
administration of the activated form of vitamin D3 on human myoblasts to compensate the
early loss of injected cells. Actually, some previous studies demonstrated that this vitamin
acted directly on myoblasts, regulating their proliferation and fusion. We have confirmed
these effects and demonstrated that the administration of the vitamin D3 enhances the
success of human MT. The second part of this thesis broaches the specific immune
rejection associated with the allogeneic MT. Currently, Duchenne patients are treated with
chronic immunosuppression for MT. However, the problem in humans is that the long-term
use of immunosuppressive treatments has adverse effects: nephrotoxicity, increased cancer
risk etc... Mixed-haematopoietic chimerism is a promising approach to circumvent
sustained immunosuppression but most of proposed protocols need antibodies treatment or
host irradiation. The second study of this thesis shows that we have developed a protocol
based on a short term administration of two cytoreductive drugs, both approved for clinical
use. The mixed-chimerism development obtained with our conditioning regimen promotes
donor specific stable tolerance. Taken together, this thesis gives two solutions to
circumvent the early and late destruction of transplanted myoblasts. These approaches
could be further included in the clinical essay developed for the Duchenne muscular
dystrophy by promoting the efficiency and decrease the clinical risk related to the MT.
Avant-Propos
Comme pensait Confusius (Kong Fu Zi) « C’est du doute que jaillit la lumière ». Et
bien, ces études doctorales m’ont particulièrement bien éclairé. Dans l’univers de la
recherche, il faut avoir de l’opiniâtreté, de la conviction, de l’acharnement, de la
compassion, de l’humilité et la capacité à accepter un nombre considérable de coups de
bâton avant d’avoir comme récompense la reconnaissance de ses pairs. Pour pouvoir
supporter ces conditions, il est indispensable d’avoir la foi en son travail. Heureusement
pour moi et heureusement pour la recherche, je me suis rendu à l’évidence qu’il me
manquait cette foi pour continuer dans cette voie. Néanmoins, l’expérience que j’ai acquise
au cours de ces années sera certainement profitable au développement de mes projets
actuels…
Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, le Dr. Jacques-P.
Tremblay, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Il m’a donné la chance de voir ce
qu’était la recherche au Canada. Son expérience, sa gentillesse et son professionnalisme
m’ont guidé tout au long de ma thèse. C’est grâce à des hommes comme lui que la
recherche avance à pas de géants.
Je voudrais naturellement remercier mes collègues de travail. Anciens et jeunes du
laboratoire, vous m’avez apporté beaucoup de joie et de soutien. Vous avez été une équipe
formidable avec laquelle j’ai partagé des moments extraordinaires. J’ai eu beaucoup de
chance d’être étudiant au sein de cette équipe. Une pensée particulière pour ce Québécois
sans lequel les soirées dans le vieux Québec auraient certainement été moins colorées.
Merci pour tout Philippe, mon ami à jamais.
Je tenais également à remercier ma famille, et plus spécialement mes parents. Vous
avez cru en moi jusqu’au bout, merci pour tout, votre éducation et bien entendu votre
amour m’ont aidé incontestablement à poursuivre mes études.
Je terminerai par le soutien de ma famille par alliance qui me va droit au cœur… Et
bien sûr, tout mon amour pour ma femme, ma petite Québécoise. Merci pour tout Isabelle
St-Pierre, ton soutien, ta patience, ta compréhension, ton amour… Je t’aime plus que tout.
« Tout ce qui ne nous tue pas nous rend plus
forts ». Friedrich Wilhelm Nietzsche.
Table des matières
Chapitre 1 : Introduction ......................................................................................................... 1 1 Quelques notions de myologie ........................................................................................ 1 1.1 Les types de tissus musculaires .............................................................................. 1 1.1.1 Le tissu musculaire strié squelettique ................................................................. 1 1.1.2 Le tissu musculaire strié cardiaque ................................................................... 12 1.1.3 Le tissu musculaire lisse ................................................................................... 15 2 La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) ........................................................... 16 2.1 Myopathies et dystrophies musculaires ................................................................ 16 2.2 Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne .......................................... 16 2.3 Étiologie ................................................................................................................ 18 2.4 La dystrophine et son complexe protéique associé ............................................... 19 2.4.1 Gène de la dystrophine et mutations ................................................................. 19 2.4.2 La dystrophine .................................................................................................. 19 2.4.3 Protéines associées ............................................................................................ 20 2.5 Pathologie ............................................................................................................. 24 2.5.1 Prévalence ......................................................................................................... 24 2.5.2 Signes cliniques ................................................................................................ 24 2.5.3 Histopathologie du tissu musculaire strié squelettique ..................................... 27 2.5.4 Histopathologie du tissu musculaire strié cardiaque......................................... 30 2.5.6 Histopathologie du tissu musculaire lisse ......................................................... 31 2.5.7 La DMD et le système nerveux central ............................................................ 31 2.6 Modèles d’études animaux ................................................................................... 31 2.6.1 Dystrophie murine ............................................................................................ 32 2.6.2 Dystrophie canine ............................................................................................. 33 2.6.3 Dystrophie féline............................................................................................... 34 3 Approches thérapeutiques ............................................................................................. 35 3.1 Thérapies pharmaceutiques................................................................................... 36 3.1.1 Inhibition de la myostatine ............................................................................... 36 3.1.2 Administration de glucocorticoïdes .................................................................. 37 3.1.3 Administration d’aminoglycosides ................................................................... 37 3.2 Thérapies géniques ............................................................................................... 38 3.2.1 Les adénovirus .................................................................................................. 38 3.2.2 Les oligonucléotides ......................................................................................... 40 3.2.3 Approche plasmidique ...................................................................................... 43 4 Thérapie cellulaire ........................................................................................................ 44 4.1 Transplantation et immunité ................................................................................. 44 4.1.1 Notions d’immunobiologie ............................................................................... 45 4.1.2 Cellules du système immunitaire ...................................................................... 46 4.1.3 Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)............................................ 64 4.1.4 Immunobiologie du muscle .............................................................................. 65 4.2 Transplantation et rejet immunitaire ..................................................................... 70 4.2.1 Généralités ........................................................................................................ 70 4.2.2 Transplantation d’organes................................................................................. 71 4.2.3 Greffe de cellules souches hématopoïétiques ................................................... 72 vi
4.2.4 La greffe de peau .............................................................................................. 73 4.2.5 Immunologie de la réaction d’allogreffe .......................................................... 73 4.3 La transplantation de cellules myogéniques (TM) ............................................... 77 4.3.1 Complémentation génique ................................................................................ 77 4.3.2 Renforcement de la capacité myogénique ........................................................ 80 4.3.3 Les limites de la transplantation de cellules myogéniques ............................... 81 4.3.4 Premiers essais difficiles ................................................................................... 81 4.3.5 Quelles cellules transplanter ? .......................................................................... 82 4.3.6 Comment les transplanter ?............................................................................... 86 Chapitre 2: Survie des cellules transplantées ........................................................................ 89 1 Perte cellulaire à court terme ........................................................................................ 89 1.1 Causes ................................................................................................................... 89 1.2 Solutions précédemment envisagées .................................................................... 91 1.2.1 Le facteur de croissance hépatique (HGF) ....................................................... 92 1.2.2 Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF) ............................................. 93 1.2.3 Les récepteurs du HGF et des FGFs ................................................................. 95 1.2.4 Les facteurs de croissance de la famille des insulines (IGF) ............................ 95 1.2.5 La famille des molécules appartenant au TGF-β .............................................. 96 1.2.6 Le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) ............................................................ 97 2 Article I : Le 1,α25-dihydroxycholécalciférol augmente le succès des transplantations
de myoblastes humains chez la souris SCID. ....................................................................... 98 2.1 Résumé.................................................................................................................. 98 2.2 Abstract ................................................................................................................. 99 3 Title : 1,25-dihydroxyvitamin D3 increases the transplantation success of human
muscle precursor cells in SCID mice. ................................................................................. 100 3.1 Introduction ......................................................................................................... 100 3.2 Materials and Methods........................................................................................ 102 3.2.1 Human muscle precursor cell (hMPC) culture ............................................... 102 3.2.2 Fusion assay .................................................................................................... 102 3.2.3 In vitro proliferation assay .............................................................................. 103 3.2.4 In vitro cellular mortality assay ...................................................................... 103 3.2.5 Hoechst/PI labeling protocol .......................................................................... 103 3.2.6 Animals and conditioning ............................................................................... 104 3.2.7 Graft success evaluation ................................................................................. 104 3.2.8 In vivo cellular mortality and proliferation assay ........................................... 105 3.2.9 Statistical analysis ........................................................................................... 106 3.3 Results ................................................................................................................. 107 3.3.1 In vitro Fusion Assay ...................................................................................... 107 3.3.2 In vitro Proliferation Assay............................................................................. 107 3.3.3 In vitro Mortality Assay .................................................................................. 107 3.3.4 Graft Success .................................................................................................. 108 3.3.5 In vivo Mortality and Proliferation ................................................................. 108 3.4 Discussion ........................................................................................................... 110 3.4.1 MPC transplantation success is reduced by cell death ................................... 110 3.4.2 1,25-D3 signalization pathways in skeletal muscle cells ................................ 110 3.4.3 1,25-D3 enhanced hMPC proliferation and fusion ......................................... 111 3.4.4 Possible interaction of 1,25-D3 with the specific and innate immunities ...... 112 vii
3.4.5 1,25-D3 did not reduce apoptosis ................................................................... 112 3.5 Conclusion .......................................................................................................... 113 4 Perte cellulaire à moyen et long terme........................................................................ 120 4.1 Causes ................................................................................................................. 120 4.2 Solutions précédemment envisagées .................................................................. 121 4.2.1 Immunosuppression ........................................................................................ 121 4.2.2 Tolérance immunologique .............................................................................. 122 5 Article II : Induction d’une tolérance pour des greffes allogéniques par un protocole de
myéloablation partiel ne requérant ni anticorps ni irradiation du receveur. ....................... 138 5.1 Résumé de l’article II .......................................................................................... 139 5.2 Abstract ............................................................................................................... 139 6 Title : Induction of tolerance across fully mismatched barriers by a non myeloablative
treatment excluding antibodies or irradiation use. .............................................................. 140 6.1 Introduction ......................................................................................................... 140 6.2 Materials and methods ........................................................................................ 142 6.2.1 Animals ........................................................................................................... 142 6.2.2 BMT ................................................................................................................ 143 6.2.3 MPC culture .................................................................................................... 143 6.2.4 MPC transplantation (MT).............................................................................. 144 6.2.5 Skin transplantation ........................................................................................ 144 Blood and muscle collection ....................................................................................... 144 6.2.6 Immunohistochemical detection of Dystrophin .............................................. 144 6.2.7Immunohistochemical detection of CD4 or CD8 T cells ................................... 144 6.2.8 Elispot ............................................................................................................. 145 6.2.9 Statistical analysis. .......................................................................................... 146 6.3 Results ................................................................................................................. 146 6.3.1 Cyclophosphamide/Treosulfan combination permits bone marrow engraftment
146 6.3.2 Clonal deletion of allo-reactive T cells occurred in response to BMT after the
TTCB treatment .......................................................................................................... 147 6.3.3 The TTCB treatment led to long-term survival of fully allogeneic MPC
transplantation (MT). .................................................................................................. 147 6.3.4 No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TAs of the
TTCB treated mice...................................................................................................... 148 6.3.5 The TTCB treated mice developed a donor specific tolerance. ...................... 149 6.4 Discussion ........................................................................................................... 150 Discussion générale ............................................................................................................ 162 Conclusion générale ............................................................................................................ 171 Bibliographie ...................................................................................................................... 172 Liste des tableaux
Tableau1………………………………………………………….......................................11
Tableau2………………………………………………………….....................................130
Liste des figures
Figure 1 : Hercule de Farnèse.. .............................................................................................. 2
Figure 2 : Anatomie et histologie du muscle strié squelettique.. ........................................... 5
Figure 3 : Anatomie et histologie du tissu musculaire cardiaque.. ...................................... 14
Figure 4 : Photographie du premier patient de Guillaume Boulogne de Duchenne ............ 17
Figure 5 : Schématisation du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. .............. 22
Figure 6 : Signes cliniques de Gowers.. .............................................................................. 26
Figure 7 : Dégénérescence d’un muscle squelettique touché par la dystrophie musculaire
de Duchenne. ................................................................................................................ 29
Figure 8 : Mécanisme moléculaire de la correction génomique médiée par les
oligodésoxynucleotides.. ............................................................................................... 42
Figure 9 : Schématisation de l’hématopoïèse ...................................................................... 48
Figure 10 : Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités
membranaires. ............................................................................................................... 51
Figure 11 : Sélection positive et négative au sein du thymus. ............................................. 53
Figure 12 : Représentation schématique d’une immunoglobuline (Ig).. ............................. 58
Figure 13 : Maturation des lymphocytes B.......................................................................... 61
Figure 14 : Immunobiologie du muscle.. ............................................................................. 67
Figure 15 : Lois de la transplantation. ................................................................................. 75
Figure 16 : La transplantation de myoblastes. ..................................................................... 79
Figure 17 : 1,25-D3 increases hMPC differentiation......................................................... 114
Figure 18 : 1,25-D3 enhances hMPC proliferation ........................................................... 115
Figure 19 : The 1,25-D3 does not reduce the hMPC mortality induced by staurosporin,
TNF-α or glucose oxydase. ........................................................................................ 116
Figure 20 : 1,25-D3 improves the graft success of hMPCs. .............................................. 117
Figure 21 : FK506 does not interfere with the 1,25-D3 treatment. ................................... 118
Figure 22 : In vivo mortality and proliferation index of hMPCs. ...................................... 119
Figure 23 : Schématisation de l’activation des lymphocytes T.. ....................................... 128
Figure 24 : Tolerance induction protocol and MPC transplantation chronology .............. 155
Figure 25 : Peripheral mixed-chimerism level evaluation ................................................. 156
Figure 26 : Clonal deletion of allo-reactive T cells occurs in response to TTCB
conditioning. ............................................................................................................... 157
Figure 27 : Stable mixed chimerism led to long-term survival of several fully allogeneic
MPC transplantations. ................................................................................................. 158
Figure 28 : The success of MPC transplantation in mixed-chimeric mice is similar to that
observed in FK506 chronically immunosuppressed mice. ......................................... 159
Figure 29 : No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TA of
mixed-chimeric mice. ................................................................................................. 160
Figure 30 : Mixed-chimeric mice developed a stable donor specific tolerance. ............... 161
Figure 31 : Signalisation intracellulaire dépendante de la forme active de la vitamine D3
.................................................................................................................................... 164
Chapitre 1 : Introduction
1
Quelques notions de myologie
Le muscle symbolise depuis l’aube de l’humanité la force. La statue du héros grec
Héraclès de Farnese, sculptée par Glykon au 3e siècle après. J.-C., témoigne de cette pensée
(Figure 1). La myologie a ouvert ce concept en attribuant également aux muscles, des
fonctions de motricité et de thermogenèse. L’ensemble de ces fonctions est attribuable à la
succession des contractions et relâchements musculaires.
1.1 Les types de tissus musculaires
Les tissus musculaires représentent un ensemble de muscles. Ces tissus sont classés
en trois catégories selon la fonction et la structure histologique des muscles qui les
composent. On parle ainsi de tissus musculaires striés squelettiques, striés cardiaques et de
tissus musculaires lisses (Tortora & Grabowski 1993). Ces trois tissus seront abordés
successivement, cependant l’accent sera mis sur le muscle strié squelettique qui est en
relation directe avec la thématique de cette thèse.
1.1.1 Le tissu musculaire strié squelettique
1.1.1.1 Développement embryologique
Tous les muscles squelettiques des vertébrés dérivent de cellules souches originaires
de structures embryonnaires mésodermiques appelées somites. Lors du développement de
l’embryon, la différenciation de ces cellules souches est régulée par des signaux, positifs ou
négatifs, provenant des structures embryonnaires voisines. Les cellules souches, une fois
différenciées, expriment fortement les facteurs MyoD et Myf5 (facteurs de transcription de
type hélice-boucle-hélice)(Charge & Rudnicki 2004). Ces cellules en prolifération, MyoD
et/ou Myf5 positives, sont appelées cellules myogéniques (myoblastes). À l’instant où ces
cellules sortent de leur cycle prolifératif, elles deviennent des myocytes. Elles expriment
alors des facteurs de transcription tels que la myogénine et le « Myogenic Regulatory
Factor 4» (MRF4). Il faut noter aussi que les gènes codants pour
2
Figure 1 : Hercule de Farnèse. Découvert en 1546 dans les thermes de Caracalla à Rome,
est une des pièces majeures de la collection Farnèse à Naples. Il s'agit d'une statue colossale
en marbre. Cette copie romaine, datant du IIIe siècle après Jésus-Christ., reproduit en
l'agrandissant un original grec en bronze de la fin du IVe siècle avant Jésus-Christ, du
sculpteur grec Lysippe de Sicyone.
3
la chaîne lourde de la myosine et de la phosphate créatine kinase (PCK) musculaire
s’expriment dans les myocytes. Enfin, les myocytes, en fusionnant entre eux, forment un
syncytium qui donnera par la suite une fibre musculaire ou myotube. Pendant le
développement musculaire, une sous population de cellules myogéniques, restent
quiescentes et demeurent à la surface des fibres musculaires. Ces cellules sont appelées les
cellules satellites du muscle (Mauro 1961). L’origine embryologique de ces cellules
demeure hypothétique (Shi & Garry 2006). Classiquement nous considérons que ces
cellules sont aussi majoritairement d’origine somitique (Armand et al 1983), mais de
récentes études laissent penser que les cellules satellites pourraient dériver de la
vascularisation aortique, et plus précisément de l’aorte dorsale embryonnaire (De Angelis et
al 1999; Shi & Garry 2006). Somme toute, le muscle squelettique adulte se définit comme
étant un tissu stable constitué de myotubes post-mitotiques multi-nucléés (Charge &
Rudnicki 2004).
1.1.1.2 Histologie
Le tissu musculaire squelettique (Figure 2) doit sa nomenclature au fait qu’il est
relié au squelette et impose ainsi un mouvement à l’ensemble de la structure osseuse.
Toutefois, certains muscles squelettiques peuvent être attachés à la peau, à d’autres muscles
ou encore à des structures fibreuses (fascias). La dénomination striée provient de la
structure histologique musculaire, qui dévoile au microscope électronique une succession
de bandes claires ou sombres.
Un tissu conjonctif appelé fascia profond enveloppe chaque structure musculaire.
Cette protection, formée de tissus conjonctifs fibreux, maintien les muscles ensemble et les
sépare en groupe fonctionnel. Le fascia permet le mouvement libre des muscles, sert de
support aux systèmes nerveux, sanguin, lymphatique et remplit les espaces interstitiels
musculaires.
Trois autres structures conjonctives, l’épimysium, le périmysium et l’endomysium,
viennent renforcer et protéger davantage le muscle squelettique. L’épimysium enveloppe
tout le muscle, le périmysium, situé dessous, entoure des faisceaux de 10 à 100 fibres
musculaires distinctes. Enfin, l’endomysium sépare chacune des fibres musculaires
composant le faisceau musculaire.
4
5
Figure 2 : Anatomie et histologie du muscle strié squelettique. (Tortora et al) 1994.
6
Les fibres musculaires ou myotubes, sont disposées en rangs parallèles et mesurent
de 10 à 100 µm de diamètre. La longueur des fibres est très variable selon les muscles
observés, néanmoins, certaines d’entre elles peuvent atteindre la taille de 30 cm de long. La
membrane plasmique de ces fibres est appelée sarcolemme et délimite le cytoplasme
nommé sarcoplasme. Les myotubes correspondent à la fusion de nombreuses cellules
musculaires, appelées myoblastes. Les noyaux des fibres musculaires sont situés en
périphérie du sarcoplasme, entre le sarcolemme et le réticulum sarcoplasmique. Les
mitochondries sont disposées en rangées dans toute la fibre musculaire et situées en
périphérie du sarcoplasme comme les noyaux. Finalement, le sarcoplasme est composé
d’un très grand nombre de petits filaments agencés longitudinalement dans la fibre
musculaire. Ces filaments sont les myofibrilles.
Les myofibrilles sont principalement et respectivement constituées de deux types de
myofilaments : la myosine et l’actine. L’enchevêtrement de ces filaments forme les stries
transversales, claires ou sombres, qui donnent cet aspect strié au muscle squelettique
lorsqu’il est observé au microscope. L’ensemble de ces sillons délimite des structures
fonctionnelles, appelées sarcomères, et jouent un rôle prépondérant dans la contraction
musculaire (Figure 2).
Les deux protéines majeures de la contraction musculaire sont la myosine et
l’actine. Les myofilaments de myosine comptent près de 200 protéines du même nom. Ces
molécules ressemblent à deux pipes entrecroisées ; les queues pointent vers le milieu du
sarcomère (bande M) alors que les cheminées sont orientées vers les myofilaments fins
d’actine. Les queues des molécules sont parallèles et forment le corps du filament de
myosine ; les cheminées font saillies en spirales autour de ce corps. Ces têtes de myosine
déplacent les myofilaments d’actine vers le centre du sarcomère pendant la contraction
musculaire.
Les myofilaments d’actine s’étendent depuis des points d’ancrage appelés disque Z.
La composition protéique de ces filaments indique la présence d’actine, de troponine et de
tropomyosine. Les myofilaments d’actine, qui glissent le long des filaments de myosine
lors de la contraction, contiennent les sites de liaison aux têtes de myosine.
7
Enfin un troisième type de myofibrilles, composé de titine et appelé filament
élastique, vient achever la structure des fibres musculaires. Lors de la contraction
musculaire, cette myofibrille assure une stabilité aux myofilaments de myosine en les
ancrant aux disques Z.
Toutes les fibres musculaires squelettiques n’arborent pas la même structure et la
même fonction. La teneur en myoglobine, protéine qui permet le stockage de l’oxygène
dans le muscle, varie selon le type de fibres musculaires. C’est cette différence de
concentration qui est à l’origine de la classification première des myotubes. Les fibres sont
dites rouges ou blanches selon qu’elles contiennent une quantité élevé ou faible en
myoglobine. On note également que les fibres rouges possèdent plus de mitochondries et de
capillaires que les blanches. Enfin, les fibres musculaires se distinguent également par leur
vitesse de contraction, par leur résistance à la fatigue et par leur rythme de métabolisation
de la molécule d’ATP (Adénosine triphosphate). Tous ces critères permettent de classer les
fibres musculaires en trois catégories :
Les fibres de type I : Oxydatives à contractions lentes.
Ces fibres sont résistantes à la fatigue et contiennent un taux élevé de myoglobine,
de mitochondries et de capillaires. Elles produisent facilement de l’ATP par voie de
synthèse aérobie, d’où leur nom d’oxydatives. Cependant, elles catabolisent lentement
l’ATP, générant ainsi des contractions lentes. Ces fibres constituent essentiellement les
muscles de posture.
Les fibres de types II A : Oxydatives à contractions rapides.
Ces fibres sont résistantes à la fatigue, et produisent des contractions rapides. À
l’instar des fibres de type I, elles ont une forte concentration en myoglobine, mitochondries
et capillaires. Ces fibres sont retrouvées en grand nombre par exemple dans les muscles des
membres inférieurs des « sprinters ».
Les fibres de type II B : Glycolytiques à contractions rapides.
8
La vascularisation de ces fibres est peu développée impliquant une voie métabolique
de type anaérobie glycolytique. Ainsi, la concentration en glycogène au sein de ces fibres
est élevée. Très peu de mitochondries sont dénombrées et la teneur en myoglobine est
faible. Ces fibres à contractions rapides, mais peu endurantes, se retrouvent principalement
dans les muscles des membres supérieurs.
1.1.1.3 Régénération
Le muscle strié squelettique est un tissu stable présentant un renouvellement peu
fréquent de ses fibres. En effet, les lésions mineures qui surviennent quotidiennement dans
les muscles, engendrent un renouvellement cellulaire lent et diffus. Ainsi, dans un muscle
de rat adulte, chaque semaine, seulement 1 à 2 % des noyaux des myotubes sont remplacés
(Decary et al 1997; Schmalbruch & Lewis 2000). Cependant, le tissu musculaire
squelettique présente une forte capacité de régénération lors de dommages plus sévères.
Ces dommages peuvent être provoqués par des exercices musculaires intensifs, des lésions
physiques ou bien encore des lésions chimiques. Les maladies génétiques affectant le
système musculaire, nommées myopathies, sont aussi responsables de détériorations plus
ou moins sévères des tissus musculaires. Quelques soient les origines du traumatisme, la
régénération musculaire s’effectue en deux phases : la phase dégénérative et la phase
régénérative (Charge & Rudnicki 2004; Shi & Garry 2006).
1.1.1.3.1
Phase dégénérative
L’évènement premier de la phase dégénérative est la nécrose des fibres musculaires.
Cette nécrose est déclenchée lors de la rupture du sarcolemme des myotubes. Les zones de
lésions peuvent être localisées ou diffuses selon l’importance du traumatisme infligé au
muscle. La perméabilité des fibres endommagées est augmentée permettant une diffusion
des protéines musculaires dans les compartiments extracellulaires. Ainsi, la PCK, qui
normalement n’est détectée qu’au niveau du sarcoplasme, se retrouve alors au niveau
sérique. Cette accumulation sérique est observée chez l’homme ou chez d’autres modèles
d’études lorsqu’ils sont soumis à des exercices physiques intenses. La présence de PCK
dans le sérum est aussi un moyen diagnostique pour les myopathies telles que les
dystrophies musculaires (Coulton et al 1988; Nicholson et al 1979; Percy et al 1979).
L’intégrité des fibres musculaires étant touchée, des colorants de faible poids moléculaire
9
peuvent de ce fait pénétrer les myofibrilles endommagées. À titre d’exemple, les
colorations à l’Evans Bleu ou au procion orange révèlent, sur des coupes histologiques de
muscles, des zones où des myofibrilles ont été lésées (Brussee et al 1997; Straub et al 1998;
Straub et al 1997). La rupture des fibres provoque également une perte de l’homéostasie
calcique au sein du tissu musculaire. Il est tout à fait envisageable que la protéolyse
dépendante du calcium aggrave de ce fait la dégénération tissulaire (Alderton & Steinhardt
2000). Par exemple, les calpaïnes qui sont des protéases activables par le calcium, peuvent
entre autre cliver les myotubes et des protéines sarcoplasmiques. En conséquence, elles
participent au processus dégénératif des muscles endommagés.
Des cellules de l’inflammation, résidentes du muscle, s’activent très rapidement
après un traumatisme musculaire sévère. Il s’agit des macrophages résidents. De récentes
études démontrent que les facteurs cellulaires libérés par ces macrophages sont à l’origine
de l’infiltration massive qui survient dans la phase dégénérative précoce du tissu
musculaire (Rappolee & Werb 1992; Tidball 1995). Chronologiquement, les neutrophiles
(1-6 heures post-trauma) (Fielding et al 1993; Orimo et al 1991), puis les macrophages (48
heures post-trauma) (Orimo et al 1991; Tidball 1995), se succèdent au sein du muscle lésé.
Ces cellules pénètrent le muscle par diapédèse. La capacité phagocytique des neutrophiles
est activée lors de la phase dégénérative. De plus, il a été clairement démontré que les
neutrophiles participent à la destruction des fibres musculaires par des mécanismes
impliquant directement la superoxyde dismutase et indirectement par le peroxyde
d’hydrogène et la myéloperoxydase (Tidball 2005). Les macrophages phagocytent les
débris cellulaires et pourraient participer à la régénération musculaire en activant les
cellules satellites (Merly et al 1999; Robertson et al 1993). De nombreux autres facteurs
viennent influencer directement ou indirectement la réponse inflammatoire au niveau
musculaire, cependant, l’importance et la fonction exacte de chacun d’eux demeurent
nébuleuse (Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003).
1.1.1.3.2
Phase régénérative
La phase régénérative succède à la phase dégénérative du tissu musculaire. La
prolifération des cellules satellites constitue le premier évènement clef du processus
régénératif. L’injection de colchicine (inhibiteur de la division cellulaire) ainsi que
10
l’irradiation des muscles réduisent considérablement la capacité de réparation des tissus
musculaires (Pietsch & McCollister 1965; Quinlan et al 1995). Ces résultats corroborent le
fait que la division des cellules satellites contribue au processus de réparation. De plus, il
est communément établi que l’expansion des cellules satellites suffit à restaurer l’intégrité
des fibres musculaires détruites (Grounds et al 2002; Irintchev & Wernig 1987). Le
deuxième évènement majeur impliqué dans la réparation musculaire repose sur la capacité
de différenciation des cellules satellites. Cette différenciation cellulaire est comparable à
celle qui se produit lors du développement embryonnaire du muscle. Ainsi, les cellules
satellites prolifèrent puis se différencient en myocytes, répondant à des facteurs tissulaires
libérés lors du trauma musculaire. Ces myocytes finiront par fusionner soit entre eux, soit
avec les fibres détruites (Charge & Rudnicki 2004). Plusieurs marqueurs des cellules
satellites (plus ou moins établis) définissent leur état de quiescence ou de prolifération
(Tableau 1)(Charge & Rudnicki 2004). Ces dernières années, plusieurs équipes ont
démontré l’existence d’autres populations cellulaires qui contribuent à la réparation des
fibres lésées. Ces populations cellulaires ont des origines diverses (cellules souches
hématopoiétiques, mésoangioblastes…). Cependant, le degré de leur participation ainsi que
les mécanismes qu’ils impliquent restent à définir (Shi & Garry 2006). Enfin, la phase
régénérative revêt quelques traits histologiques distincts. Sur des coupes de muscles
fraîchement restaurés, les nouvelles myofibrilles apparaissent plus petites et sont centronucléées. Les myotubes néo-formés sont souvent basophiles du fait de la forte synthèse
protéique dans le sarcoplasme et une forte expression de chaîne lourde de myosine y est
aussi détectée (Whalen et al 1990). En considérant une fibre selon un plan longitudinal, il
est constaté que la centro-nucléation s’observe soit continuellement au sein des fibres néoformées, soit sporadiquement sur des fibres réparées. Cette observation suggère que la
fusion des cellules satellites n’est pas diffuse mais focalisée aux sites de rupture fibrillaire
(Blaveri et al 1999). Enfin, la régénération musculaire étant achevée, les fibres musculaires
grossissent et les noyaux regagnent la périphérie du sarcoplasme. Ainsi, dans un cadre
physiologique normal, le muscle régénéré revêt la même apparence et retrouve la même
fonctionnalité qu’un muscle non lésé.
11
État cellulaire
Membrane
plasmique
Cytosquelette
Facteurs de
transcription
Marqueurs
Moléculaires
Quiescent
Prolifération
M-cadherine
+/-
+
Syndécan-3
Syndécan-4
c-met
VCAM-1
NCAM
Glyoprotéine
Leu-19
CD34
Desmine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
+/+
Pax7
+
+
Myf5
MyoD
MSTN
+/+
+
+
+/-
Tableau 1 : Cette table représente l’expression de marqueurs des cellules satellites en
fonction de leur état. Un signe (+) désigne une expression marquée du marqueur, un signe
(-) une absence d’expression. La combinaison des deux signes représente une faible
présence du marqueur. Myostatine (MSTN); Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire de
type-1 (VCAM-1); Molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM). Chargé et al 2004.
12
1.1.2 Le tissu musculaire strié cardiaque
Le tissu musculaire cardiaque (Figure 3) compose la paroi du cœur. À l’instar du
muscle squelettique ce tissu est strié. Cependant, ces contractions sont involontaires. De
plus, certaines des fibres qui le composent sont dotées d’autorythmicité, leur permettant
d’établir une cadence inhérente et alternative de contractions et de relâchements.
Les fibres du tissu musculaire cardiaque sont de forme parallélépipédique et font
près de 14µm de large. Elles sont composées de cellules mononuclées appelées
cardiomyocytes. Les noyaux de ces cellules sont au centre du sarcolemme. Bien que
ressemblant à celui des fibres musculaires squelettiques, le sarcolemme des myotubes
cardiaques contient plus de mitochondries. Ces mitochondries sont par ailleurs plus
volumineuses. Enfin, l’unité sarcomèrique est également semblable à celle observée dans le
tissu musculaire strié squelettique (Figure 3). L’ensemble des fibres musculaires cardiaques
se ramifient et s’anastomosent formant ainsi deux réseaux distincts. Les oreillettes,
définissant la partie supérieure des cloisons cardiaques, constituent le premier réseau. Les
ventricules, définissant la partie inférieure du cœur composent quant à elles le deuxième
réseau. Pour un réseau donné, chaque fibre s’interconnecte au niveau d’épaississements
transverses irréguliers du sarcolemme appelés disques intercalaires (Figure 3). Ces disques
comprennent des desmosomes et des jonctions lacunaires. Ces structures assurent
réciproquement entre les fibres, un maintien structural et un passage des potentiels d’action
musculaires qui sont à l’origine des contractions cardiaques. Ainsi lorsqu’une fibre est
stimulée, toutes les autres fibres du réseau le sont également. De ce fait, chaque réseau se
comporte comme une unité fonctionnelle.
Les fibres musculaires cardiaques sont des fibres à contractions perpétuelles et
extrêmement rapides. Cette distinction majeure avec les fibres qui composent le tissu
musculaire strié squelettique implique que le tissu musculaire cardiaque bénéficie d’une
bonne vascularisation et de la présence d’un nombre conséquent de mitochondries de
grande taille. Conséquemment, le muscle cardiaque utilise la voie de synthèse aérobie
comme mode principal de production de l’ATP. Enfin, à la différence du muscle strié
squelettique, le muscle cardiaque peut se contracter sans stimulation nerveuse extrinsèque
13
ou hormonale. En effet, des fibres cardiaques spécialisées lui confèrent une capacité
contractile autonome.
14
Figure 3 : Anatomie et histologie du tissu musculaire cardiaque. Tortora et al 1994.
15
1.1.3 Le tissu musculaire lisse
Le muscle lisse est non strié et sa contraction est de type involontaire. Les fibres qui
le composent contiennent des filaments intermédiaires et des corps denses qui fonctionnent
comme les disques Z. Nous distinguons deux types de muscles lisses. Le muscle lisse
viscéral (mono-unitaire) se retrouve dans les parois des viscères et des petits vaisseaux
sanguins. Les fibres sont disposées en réseau. Le muscle lisse multi-unitaire se retrouve
dans les gros vaisseaux sanguins, les muscles érecteurs des poils et dans l’œil. Les fibres
fonctionnent indépendamment les unes des autres.
La durée de contraction et de relâchement du muscle est plus longue que celle du
muscle strié squelettique et cardiaque. Les fibres du muscle lisse se contractent en réaction
aux influx nerveux, aux hormones et à certains facteurs locaux. Enfin, le tissu musculaire
lisse a la capacité de s’étirer considérablement sans produire de tension.
16
2
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)
2.1 Myopathies et dystrophies musculaires
Les myopathies sont des maladies qui touchent les muscles. Elles se caractérisent
par une atrophie des tissus musculaires conséquente à une dégénération progressive de ces
mêmes tissus. Les dystrophies sont des myopathies dont l’origine symptomatique est le
plus souvent liée à une mutation du gène codant pour une protéine sarcoplasmique appelée
dystrophine (Koenig et al 1988). Les dystrophies sont donc des maladies génétiques. Une
des principales dystrophies recensées, de part sa prévalence et sa sévérité, est la dystrophie
musculaire de Duchenne (DMD). La DMD est une maladie infantile létale associée à
l’absence de dystrophine dans les tissus musculaires (Franzini-Armsrong 1994).
2.2 Historique de la dystrophie musculaire de Duchenne
Les premières descriptions de cas pouvant s’apparenter à la DMD furent
répertoriées dans la première moitié du XIXème siècle (Tyler 2003). Ainsi, Charles Bell
(1774-1842), Gaetano Conte (1798-1858), Richard Partridge (1805-1873) et William John
Little contribuèrent à dresser le tableau pathologique de ce qui allait devenir la DMD. Cette
dystrophie doit son nom à Guillaume Benjamin Amand Duchenne. Ce physiologiste
Français (1806-1875), natif de Boulogne sur mer, fit en 1861 la description détaillée d’un
patient (Figure 4)(Tyler 2003) atteint de dystrophie dans un feuillet intitulé « De
l’électrisation localisée et de son application à la pathologie et à la thérapeutique »
(Duchenne 1861). Cependant la paternité de la DMD reste controversée, puisque quelques
années auparavant (1851-1852) un anglais du nom de Edward Meryon (1807-1880) fit la
description de plusieurs cas identiques à celui décrit par Guillaume Duchenne (Meryon
1851). Edward Meryon attribua les causes de la maladie à une carence en éléments
nutritionnels (Tyler 2003). G. Duchenne, lui, pensa tout d’abord, que la maladie avait une
origine cérébrale « Paraplégie hypertrophique de l’enfance d’origine cérébrale » (Duchenne
1861). Puis en 1868, des études plus poussées, notamment d’un point de vue histologique,
permirent à G. Duchenne de conclure à une origine
17
Figure 4 : Photographie du premier patient de Guillaume Boulogne de Duchenne (Cas I,
Joseph Sarrazin). Kenneth, L. Tyler 2003
18
musculaire de la maladie qu’il nommait alors « paralysie musculaire pseudohypertrophique ou paralysie myo-sclérosique » (Duchenne 1868a; 1868b). Il associa la
pseudo-hypertrophie musculaire, observable dans les premières années des patients, à
l’invasion du tissu musculaire par du tissu conjonctif et adipeux (Duchenne 1872b). Enfin,
il remarqua que des séances d’hydrothérapie et de massothérapie complétées de
stimulations électriques pouvaient améliorer la condition des patients dans les phases
précoces du développement de la maladie (Duchenne 1872a). C’est ainsi que G. Duchenne
laissa son nom à la DMD en se différenciant de E. Meryon par une étude étiologique plus
approfondie et en présentant une première approche thérapeutique.
2.3 Étiologie
En 1886, Sir William Richard Gowers (1845-1915) remarqua qu’il y avait des cas
isolés de DMD, sans antécédent familial. La fréquence de ces cas était toutefois moins
élevée que les cas avec antécédents. De plus, il constata que pour les familles touchées les
cas déclarés étaient toujours du côté maternel. Au début des années 1980, deux équipes de
recherche démontrèrent que les patients touchés par la DMD avaient des altérations
(translocation ou délétion) dans le Chromosome X. À chaque fois, les erreurs
chromosomiques survenaient dans la bande 1 de la région 2 du bras court (noté Xp21)
(Francke et al 1985; Verellen-Dumoulin et al 1984). Parallèlement, un autre groupe de
recherche remarqua qu’il y avait des polymorphismes de séquence d’ADN (acidedésoxyribonucléique) dans la région Xp21 au sein des familles où la DMD survenait. Ainsi,
des patients ne présentant aucune délétion ou translocation chromosomique pouvaient être
touchés par la DMD (Davies et al 1983). Le groupe de Kunkel et Monaco isola un ARN
messager (ARNm) correspondant à un gène, de la région Xp21 de patients atteints de
DMD, où des délétions y étaient fréquentes (Kunkel et al 1985; Monaco et al 1986).
L’ARNm ainsi isolé avait une taille de 14 kilobases (kb). La séquence nucléotidique
correspondante amena à la découverte de la dystrophine, protéine qui était jusqu'alors
inconnue (Hoffman et al 1988). Ainsi, la DMD se définit comme étant une maladie
génétique héréditaire récessive conduisant à l’altération du chromosome X dans la région
Xp21. Cette altération engendre une absence d’expression de dystrophine au sein du tissu
musculaire (Hoffman et al 1987).
19
2.4 La dystrophine et son complexe protéique associé
2.4.1 Gène de la dystrophine et mutations
Le gène de la dystrophine est un des plus gros gènes connus puisqu’il affiche une
taille faramineuse de 2.4 mégabases. (Mb) d’ADN soit environ 1% de l’ADN du
chromosome X. La séquence codante est composée de 79 exons séparés par des introns de
200 kb. Seulement 0.6% du gène code pour l’ARNm de la dystrophine (Franzini-Armsrong
1994). Diverses mutations peuvent survenir dans le gène de la dystrophine et induire une
DMD. Ces mutations touchent soit de larges segments génomiques (par délétions ou
duplications) soit de plus petits fragments (par mutations ponctuelles ou micro délétions)
(Franzini-Armsrong 1994). Les mutations impliquant de grandes portions d’ADN
constituent 60 à 70% des cas de DMD (10, 87, 128), le reste des cas étant imputables aux
petites mutations (Franzini-Armsrong 1994). Les grandes mutations sont sensiblement plus
fréquentes dans les exons ou les introns de tailles importantes. Ces zones de fortes
probabilités mutationnelles sont appelées « points chauds » (Den Dunnen et al 1989;
Koenig et al 1989; Koenig et al 1987). Enfin, il ne semble pas exister de corrélation entre la
taille de la mutation et la sévérité de la maladie (Monaco et al 1988). Cependant, il est
établi que les mutations modifiant le cadre de lecture de l’ADN conduisent à une synthèse
protéique partielle. Ainsi, la partie carboxy-terminale de la dystrophine est souvent
manquante chez les patients atteints de DMD (Beggs et al 1991; Koenig et al 1989;
Monaco et al 1988).
2.4.2 La dystrophine
La dystrophine est une protéine qui représente 2% des protéines sarcoplasmiques
exprimées dans le muscle (Ervasti & Campbell 1993). La présence de plusieurs promoteurs
ainsi que l’épissage alternatif des pré-ARNms conduit à la production de plusieurs
isoformes de dystrophine. L’isoforme prédominant se retrouve dans le muscle squelettique
et cardiaque. C’est une protéine d’environ 427 kDa contenant 3685 acides aminés (Davison
& Critchley 1988; Koenig et al 1988). La séquence protéique de la dystrophine est
relativement bien conservée entre différentes espèces telles que l’homme, les rongeurs et le
poulet (Franzini-Armsrong 1994). Cette protéine peut être divisée en quatre domaines :
20
La séquence formée par les premiers 240 acides aminés (en commençant par la
partie amino-terminale) a une forte homologie avec le domaine de liaison à l’actine. De ce
fait, la dystrophine et l’actine sont liées (Matsumura et al 1993).
La seconde portion de la protéine, la plus longue, compte près de 2400 acides
aminés. En fait c’est une séquence répétitive de 100 acides aminés (Emery 1993; Gomez et
al 1977). Chaque séquence forme une structure de type hélicoïdale.
Le troisième domaine de 280 acides aminés affiche une homologie de 24% avec la
partie carboxy-terminale de l’α-actine (Koenig et al 1988).
Enfin la quatrième portion de la protéine, composée de 420 acides aminés, présente
une forte homologie avec une autre protéine appelée utrophine (Love et al 1993; Love et al
1989; Love et al 1991). Cette partie carboxy-terminale est très importante puisqu’elle se lie
à un complexe protéique associé au sarcolemme servant ainsi de pont physique entre le
sarcoplasme et la membrane plasmique.
Deux isoformes de même longueur sont exprimées dans le cerveau (Boyce et al
1991; Gorecki et al 1992). Enfin, il existe quatre autres variantes de dystrophine contenant
uniquement le premier exon. Il s’agit des protéines Dp260 (260kDa), Dp140 (140kDa)
Dp116 (116kDa) et Dp71 (71kDa) (Byers et al 1993; D'Souza et al 1995; Feener et al 1989;
Lidov et al 1995; Muntoni et al 2003). Ces dernières isoformes ne possèdent pas de
domaine de liaison à l’actine. Ceci suggère que ces isoformes pourraient avoir des
fonctions différentes que celles attribuées à leur homologue de 427kDa.
La dystrophine exprimée dans le tissu musculaire s’accumule en grande partie sur la
face cytoplasmique du sarcolemme (Watkins et al 1988; Zubrzycka-Gaarn et al 1988). La
distribution de cette protéine est assez homogène néanmoins, son expression est encore plus
marquée aux jonctions myotendineuses et neuromusculaires (Arahata et al 1988; Bonilla et
al 1988; Byers et al 1991; Carpenter et al 1990; Zubrzycka-Gaarn et al 1988).
2.4.3 Protéines associées
La dystrophine ne possède pas de domaine transmembranaire propre. Néanmoins, la
dystrophine est fortement encrée au sarcolemme via un complexe protéique (Figure 5)
21
appelé « dystrophin associated protein » (DAP) (Ehmsen et al 2002). Ce complexe est
composé de 18 protéines : la laminine-α2 (mérosine), les dystroglycans (α et β), les
sarcoglycans (α, β, δ, ε et γ), la sarcospan, la dystrobrévine, les syntrophines (α1, β1 et β2),
la
« nitrique
oxyde
synthase
neuronale »
(nNos),
la
« microtubule
associated
serine/threonine kinase 205 kDa» (MAST205), la syncoiline, la cavéoline-3 et la Grb2.
22
Figure 5 : Schématisation du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. nNOS
(Neuronal oxyde nitrique synthase). Des mutations survenant dans la dystrophine vont
conduire au développement d’une DMD (Dystrophie musculaire de Duchenne) ou d’une
DMB (Dystrophie musculaire de Becker). Les mutations survenant dans les sarcoglycans
vont induire des DMCts (Dystrophie musculaire des ceintures type 2C, 2D, 2E, 2F). Les
mutations survenant dans la mérosine vont conduire au développement d’une DMC
(Dystrophie musculaire congénitale).
23
L’interaction de la dystrophine avec ce complexe protéique laisse deviner leur rôle
de support, pour la structure musculaire, via la formation d’un pont entre le cytosquelette
d’actine sarcoplasmique et la matrice extracellulaire (Ervasti & Campbell 1991; 1993).
L’absence de dystrophine se traduit par une disparition du complexe DAP au niveau du
sarcolemme chez les patients DMD ainsi que dans le modèle de souris dystrophique (cf.
chapitre 1 : 2.6) (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992; Matsumura et al 1994). La rupture
du lien entre l’intérieur et l’extérieur des fibres musculaires fragilise le sarcolemme et
facilite la destruction des myotubes lors d’un effort physique (Moens et al 1993; Petrof et al
1993). Il est intéressant de noter que des mutations survenant dans les gènes codant pour les
protéines du DAP sont à l’origine de plusieurs types de dystrophies (Figure 5) (Dalkilic &
Kunkel 2003; Durbeej & Campbell 2002). En conséquence, il apparaît évident que la
dystrophine et son complexe protéique associé assurent un rôle crucial pour le maintien de
l’intégrité des fibres musculaires.
En outre, la position de la dystrophine et du DAP au niveau membranaire laisse
entrevoir une fonction de ce complexe dans la signalisation intracellulaire. À titre
d’exemples, la liaison de l’α-sarcoglycan à la laminine extracellulaire peut induire le
recrutement membranaire de molécules de signalisation telles que Rac1 (Oak et al 2003).
D’autres molécules du DAP (Nos, Grb2) peuvent également acheminer des signaux
intracellulaires (Brenman et al 1995; Yang et al 1995). De ce fait, il semble que le
complexe dystrophine-DAP puisse avoir une fonctionnalité importante autre que celle de
soutien. La non conduction de certains signaux cellulaires pourrait également contribuer
partiellement au développement de la pathologie de la DMD.
Enfin, certaines études laissent suggérer que la dystrophine participerait au maintien
de l’homéostasie du calcium. Chez les patients ainsi que chez les souris dystrophiques, la
concentration de calcium intracellulaire est anormalement élevée (Fong et al 1990; Turner
et al 1991). Par ailleurs, la culture de myotubes de patients DMD ou de souris
dystrophiques a révélé une augmentation de l’activité des canaux calciques affectant la
perméabilité du sarcolemme (Fong et al 1990; Iwata et al 1993; Vandebrouck et al 2002).
La perte de l’homéostasie du calcium pourrait être une des causes impliquées dans
l’augmentation du statut inflammatoire des muscles des patients DMD (Porter et al 2003;
24
Porter et al 2002; Spencer et al 2001; Spencer & Tidball 2001). Cependant, il reste
beaucoup d’investigations à faire pour comprendre l’ensemble des mécanismes impliqués.
2.5 Pathologie
2.5.1 Prévalence
La DMD est la forme de dystrophie la plus fréquente. La prévalence de cette
maladie est environ de 1/3500 nouveaux-nés mâles (Emery 1993). Étant donné que la
DMD est liée au chromosome X, presque tous les patients atteints sont mâles. Cependant,
certains cas de patientes étant diagnostiquées DMD sont recensés. Ces patientes ont
concurremment un syndrome de Turner (un seul chromosome X) ou un syndrome de
Turner de type mosaïque (X/XX ou X/XX/XXX). Encore plus exceptionnellement, des cas
de DMD sont décelés chez des patientes ayant un profil chromosomique sexuel standard
(X/X) (Ferrier et al 1965; Jalbert et al 1966; Walton 1956). Ce diagnostique s’explique par
une déficience de compensation du chromosome sain vis-à-vis du chromosome touché
(Gomez et al 1977).
2.5.2 Signes cliniques
Les premiers signes cliniques de la DMD sont décelables à la période néonatale.
Premièrement, les patients ont une concentration sérique de PCK très élevée, témoignant
d’un statut de dégénérescence musculaire. Puis, des biopsies musculaires révèlent, après
analyse histologique, la présence de fibres musculaires nécrotiques (Arikawa et al 1991;
Prelle et al 1992). Bien que le poids et la taille des patients soient normaux à la naissance,
un ralentissement de la croissance survient dans les premières années de l’enfance (Eiholzer
et al 1988). Quelques signes précoces sont épisodiquement rapportés par les parents tels
qu’un léger retard mental, de la difficulté à courir ou encore à se déplacer dans les escaliers
(Firth et al 1983). Entre 3 et 6 ans, les enfants présentent fréquemment une lordose
pathologique et une faiblesse musculaire, contraignant les patients à effectuer la manœuvre
de Gowers (Figure 6) (Tyler 2003) pour passer de la position horizontale à la position
verticale. À ce stade, les muscles les plus touchés sont les muscles proximaux et les
muscles situés dans la partie inférieure du corps. Entre 6 et 11 ans, la force des muscles du
torse et des jambes baisse sensiblement et de façon linéaire (Allsop & Ziter 1981; Cohen et
25
al 1982). Les réflexes tendineux diminuent jusqu’à disparaître dans les muscles les plus
faibles. La capacité des patients à marcher sur une courte distance ou à se redresser décroît
rapidement entre 7 et 8 ans (Brooke et al 1981). Après une dizaine d’années, et plus
spécialement après que les patients aient perdu leur mobilité, la grosseur de tous les
muscles des jambes et du torse diminue progressivement.
26
Figure 6 : Signes cliniques de Gowers. Cette manœuvre de redressement est caractéristique
des enfants atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Cette série de photos a été
réalisée à Paris à l’hôpital Bicêtre sur un enfant âgé de douze ans et atteint de dystrophie de
Duchenne.Kenneth, L. Tyler 2003.
27
Cette période régressive est également marquée par la réduction de la capacité respiratoire
des patients (Fukunaga et al 1991; Inkley et al 1974). En phase terminale, les infections
respiratoires, la rétention de dioxyde de carbone et l’anoxémie causent le décès d’environ
40% des patients. Les autres meurent par insuffisance cardiaque (Mukoyama et al 1987).
Une étude de cas entre 1980 et 1984 a révélé que la mort survenait en moyenne à 20 + 3.9
ans (Franzini-Armsrong 1994).
2.5.3 Histopathologie du tissu musculaire strié squelettique
La dystrophine et son complexe glycoprotéique associé assurent la stabilité de la
structure musculaire. Notamment, la dystrophine joue un rôle clef lorsque les fibres
musculaires sont physiquement sollicitées. La déficience en dystrophine chez les patients
atteints de DMD cause une rupture du lien entre la matrice extracellulaire et le
cytosquelette d’actine des fibres musculaires (Franzini-Armsrong 1994), fragilisant les
fibres à l’effort. La conséquence immédiate est la destruction plus fréquente et plus massive
des myotubes (Carpenter & Karpati 1979; Lotz & Engel 1987; Mokri & Engel 1975; 1998).
La succession de phases de dégénérescence et de régénération musculaires explique
l’évolution de l’histopathologie du muscle classiquement décrite chez les patients
(Franzini-Armsrong 1994). La plupart des éléments caractérisant ces phases sont regroupés
dans les diverses coupes histologiques de muscle strié squelettique provenant d’un patient
DMD (Figure 7).
Les zones musculaires en phase dégénérative se distinguent par la présence de
myotubes nécrotiques (Gilbert & Hawk 1963; Pearce & Walton 1962; Pearson 1962). Les
fibres en nécrose n’ont plus de membrane plasmique mais conservent leur membrane basale
(Mokri & Engel 1975; 1998). Des altérations de la membrane plasmique de myotubes non
nécrotiques sont également visibles en microscopie électronique (Bradley & Fulthorpe
1978; Carpenter & Karpati 1979). La fréquence pathologique des ruptures des myotubes est
à l’origine du taux sérique élevé en PCK des patients atteints de DMD. Cette particularité a
permis le développement d’un test enzymatique utilisé fréquemment en clinique pour
diagnostiquer les patients dystrophiques (Brooke et al 1983; Zellweger et al 1972). La
nécrose tissulaire est aussi à l’origine de la présence permanente de cellules inflammatoires
28
infiltrantes (Engel & Biesecker 1982; Oberc & Engel 1977). Les cellules sont localisées
aux sites péris-vasculaires ainsi qu’autour du périmysium et de l’endomysium (Arahata &
Engel 1984).
29
Figure 7 : Dégénérescence d’un muscle squelettique touché par la dystrophie musculaire
de Duchenne. (A) Illustration de l’histologie d’un muscle sain : Les myotubes ont un aspect
polygonal, sont de tailles normales et disposés de façon étriquée. Les myotubes sont
séparées par un mince tissu conjonctif (l’endomysium) et regroupées en faisceaux séparés
par le périmysium. (B) Des signes distinctifs d’un muscle en dégénérescence apparaisse
progressivement dans les muscles dystrophiques : Les flèches désignent différents stades de
nécrose des myofibrilles. La tête de flèche marque un myotube nouvellement formée. Dans
l’ensemble, les myotubes sont plus petits et apparaissent plus arrondies suite à
l’épaississement des tissus conjonctifs. Les petits grains désignent une infiltration cellulaire
et enfin, l’astérisque marque la présence d’un tissu adipeux infiltrant le muscle. (C) et (D)
correspondent à un stade plus avancé de la maladie. Skuk Daniel 2004.
30
Les muscles des patients se réparent en suivant le processus physiologique de la
phase régénérative. La formation de nouvelles fibres est caractérisée par la présence de
fibres de plus petites tailles, centro-nucléées, et basophiles (Franzini-Armsrong 1994). Les
fibres de types II sont préférentiellement remplacées par des fibres de type I (Dubowitz
1974). Les patients DMD voient également leur nombre de fibres IIB décliné en faveur des
fibres IIC (Dubowitz 1974; Imoto & Nonaka 2001; Minetti et al 1991; Nonaka et al 1981;
Webster et al 1988). Les cellules satellites participent à cette restauration tissulaire. Le
nombre moyen de cellules satellites par fibre musculaire est 3 à 7 fois plus élevé chez les
patients DMD (Ishimoto et al 1983; Wakayama et al 1979). Cependant, même si leur
nombre est plus élevé, la sollicitation permanente des cellules satellites accélère leur
sénescence (Blau et al 1983; Webster & Blau 1990). L’évolution de la DMD chez un
patient pourrait être représentée par la victoire progressive et inéluctable de la phase
dégénérative musculaire sur la phase régénérative.
Enfin, il est important de noter l’invasion progressive du tissu musculaire par du
tissu conjonctif et adipeux (Duchenne 1868b; Meryon 1851). La fibrose n’apparaît pas en
période néonatale, mais elle devient évidente vers l’age de 4-5 ans (Franzini-Armsrong
1994). Ce tissus fibreux est essentiellement composé de collagène de type III (Stephens et
al 1982). La présence de tissu fibreux et adipeux au sein du tissu musculaire, est à l’origine
de la pseudo hypertrophie des muscles gastrocnémiens des patients (Figure 7). Bien qu’il
soit aisé d’attribuer la fibrose à l’inflammation chronique du tissu musculaire, il n’en est
pas de même pour expliquer l’invasion adipeuse. Quoiqu’il en soit, les tissus adipeux et
fibreux sont les constituants majeurs des muscles striés squelettiques des patients atteints de
DMD (Figure 7).
2.5.4 Histopathologie du tissu musculaire strié cardiaque
L’absence d’expression de dystrophine au niveau cardiaque est une des causes
principales du décès des patients. La dégénérescence cardiaque touche les ventricules,
l’atrium et le système contractile autonome du cœur (Farah & Suneja 1993; Perloff et al
1967; Sanyal & Johnson 1982; Sanyal et al 1978). Peu à peu, les cardiomyocytes sont
remplacés par du tissu conjonctif fibreux diminuant la contractilité et le rythme du muscle
cardiaque (D'Orsogna et al 1988; Farah & Suneja 1993). À la différence du muscle strié
31
squelettique, l’évolution de la DMD au niveau cardiaque est plus lente, se traduisant par
l’immobilité du patient bien avant son décès (D'Orsogna et al 1988; Hunsaker et al 1982).
De plus, même si 40% des patients meurent d’une insuffisance cardiaque, cette insuffisance
est souvent liée à l’hypertension pulmonaire et à l’insuffisance respiratoire suscitée par la
dégradation plus marquée du diaphragme (Yotsukura et al 1988).
2.5.6 Histopathologie du tissu musculaire lisse
Bien que l’infiltration du muscle lisse par des cellules inflammatoires soit
répertoriée chez les patients dystrophiques (Huvos & Pruzanski 1967), peu de signes
pathologiques visibles sont attribuables à la déficience en dystrophine dans ce tissu.
Toutefois, des vomissements, des douleurs et dilations abdominales ainsi que des troubles
digestifs peuvent parfois survenir chez les patients (Barohn et al 1988; Robin & de 1963).
2.5.7 La DMD et le système nerveux central
Certains patients dystrophiques peuvent souffrir d’un léger retard mental. Cette
observation fut établie dès les premiers cas de DMD décrits (Tyler 2003). Le retard survient
en bas âges, ne semble pas progressif et ne pourrait pas être imputable à un développement
moteur anormal. La capacité verbale des patients est affectée mais les fonctions cognitives
demeurent inchangées (Dubowitz 1967; Marsh & Munsat 1974; Worden & Vignos 1962;
Yoshioka et al 1980; Zellweger & Hanson 1967). Il ne semble pas impensable qu’une
déficience en dystrophine pourrait corréler avec l’émergence de troubles neurologiques.
Cependant, que ce soit dans les cellules corticales ou dans les cellules de Purkinje, le rôle
cellulaire de la dystrophine reste à déterminer.
2.6 Modèles d’études animaux
Les cas de déficiences en dystrophine se limitent seulement à quelques espèces
animales. Ainsi, à titre d’exemple, le singe génétiquement proche de l’Humain ne
développe pas de dystrophie. De plus, il existe une variabilité notoire entre les formes de
dystrophie qui peuvent survenir dans les différentes espèces touchées. Les cas spontanés de
dystrophie sont pour l’instant répertoriés chez 3 espèces autres que l’Humain. Ces trois
espèces sont les muridés, les canidés et les félidés. L’utilisation des modèles animaux
dystrophiques
est
indispensable
au
développement
d’approches
thérapeutiques.
32
Malheureusement, aucun modèle n’est parfaitement adéquat pour répondre aux attentes
expérimentales.
2.6.1 Dystrophie murine
C’est en 1984 qu’une mutation dans l’exon 23 (445) fut identifiée sur le
chromosome X de la souris C57Bl/10JScSn (mdx). En outre, cette souris présentait un taux
sérique élevé de PCK ainsi que quelques autres signes pathologiques laissant présager une
homologie de mutation avec le gène de la dystrophine humain (Bulfield et al 1984). Ce fut
officiellement confirmé en 1987 après la découverte du gène de la dystrophine (Hoffman et
al 1987). La mutation affecte la partie amino-terminale de la dystrophine donnant ainsi une
protéine tronquée incapable de s’encrer au sarcolemme. À l’instar de l’Homme, le
complexe protéique associé à la dystrophine fait également défaut (Ohlendieck et al 1993).
Cependant, à la différence de l’Homme, la souris mdx n’est que peu affectée par sa
mutation. La nécrose des fibres musculaires est quasiment indécelable à la naissance,
augmente rapidement après une vingtaine de jours, régresse aux alentours de soixante jours
puis demeure épisodique jusqu'à la mort des souris. Dans la plupart des muscles, les fibres
nécrotiques sont remplacées continuellement par de nouvelles fibres et non par du tissu
conjonctif. Curieusement, les fibres restent centronucléées et ce, même après leur
maturation (Karpati & Carpenter 1986; Karpati et al 1988a). À trois mois, 70 à 80% des
fibres musculaires des cuisses sont centro-nucléées (Tanabe et al 1986; Torres & Duchen
1987). Les fibres de type II sont, similairement aux patients DMD, préférentiellement
remplacées par des fibres de type I (Carnwath & Shotton 1987; Head et al 1992). Le
diaphragme est le muscle le plus touché par la maladie. Le nombre de fibres nécrotiques et
la présence de zone fibreuse différencient le diaphragme des autres muscles. Néanmoins,
les souris mdx ne souffrent pas d’insuffisance respiratoire (Grounds & McGeachie 1992).
Les mécanismes expliquant la faible gravité de la dystrophie chez la souris mdx ne sont pas
encore pleinement établi. Toutefois certaines hypothèses constituent un début
d’argumentation convainquant. Tout d’abord, les cellules satellites des souris mdx semblent
avoir un potentiel réplicatif plus élevé que les cellules humaines (DiMario et al 1989;
DiMario & Strohman 1988; Grounds & McGeachie 1992). Ceci permettrait d’augmenter
temporellement la capacité régénératrice musculaire. Enfin, la protéolyse dépendante du
33
calcium, amplificatrice de la destruction des myotubes (Alderton & Steinhardt 2000), est
absente chez les souris mdx (DiMario et al 1989). L’utilisation de la souris mdx est
fréquente pour le développement de nombreuses thérapies pour la DMD. La possibilité de
reproduire ces souris, le faible coût de leur maintien, ainsi que l’évolution bénigne de leur
dystrophie facilite leur usage en recherche fondamentale. Néanmoins, de part sa robustesse,
elle ne présente pas un modèle idéal de DMD.
D’autres souris dystrophiques ont été produites par mutagenèse chimique. Toutes
ces souris arborent comme la souris mdx une absence marquée en dystrophine, mais ne
développent que peu de fibrose et d’adipose (Cox et al 1993b).
2.6.2 Dystrophie canine
Plusieurs signes cliniques similaires à ceux observés chez la DMD font du modèle
canin dystrophique un bon modèle (Cooper et al 1990; Cooper et al 1988; McCully et al
1991; Valentine & Cooper 1991; Valentine et al 1990; Valentine et al 1986; Valentine et al
1988; Valentine et al 1989; Valentine et al 1992). Seule la partie amino-terminale de la
dystrophine canine peut être détectée à l’aide d’anticorps chez les chiens atteints de la
maladie. La mutation est causée par un changement d’une base A pour G à l’intérieur d’un
site d’épissage consensus situé à l’extrémité 3’ de l’intron 6, ce qui résulte en une protéine
manquant les exons 6 à 8 (Gaschen et al 1992; Sharp et al 1992). La maladie a été très bien
caractérisée chez les Golden Retriver, mais n’est pas exclusive à cette race. Les Terriers
Irlandais, les Rottweilers ainsi que les Samoyèdes peuvent également être touchés. Le taux
sérique en PCK des chiens dystrophiques est élevé dès la naissance et augmente encore
plus lors d’un effort physique. Entre la huitième et la dixième semaine, les chiens
dystrophiques sont affublés d’une stature rigide, ont une démarche chancelante, et
éprouvent de la difficulté à ouvrir la mâchoire et à se nourrir. Le rétrécissement de la base
de leur langue provoque une salivation excessive. La dégénérescence musculaire
s’accompagne d’une fibrose. L’atrophie musculaire qui en résulte conduit à la paralysie des
membres postérieurs et au développement d’une scoliose (Valentine et al 1992). Enfin, les
chiens dystrophiques développent des signes de cardiomyopathies (Valentine et al 1986).
Le modèle de chien dystrophique représente un intérêt certain pour l’établissement de
thérapies en faveur de la DMD. Cependant, les coûts exorbitants, que peuvent entraîner
34
l’hébergement et l’achat de tels animaux, ne permettent pas d’approches fondamentales. Il
ne peut être utilisé que dans des protocoles pré cliniques.
2.6.3 Dystrophie féline
Jusqu’à présent, peu de formes de dystrophies félines ont été étudiées (Carpenter et
al 1989; Gaschen et al 1992). Le site de mutation n’a pas encore été identifié. La partie
amino-terminale de la dystrophine est exprimée normalement mais, l’expression de la partie
carboxy-terminale est atténuée (Gaschen et al 1992). Les premiers signes de la maladie
apparaissent à un ou deux ans. Les chats atteints ont une langue épaissie, développent une
pseudo hypertrophie des muscles postérieurs et éprouvent beaucoup de difficulté à se
déplacer. Une échocardiographie permet de révéler des signes de cardiomyopathies. Les
biopsies musculaires montrent la présence de fibres nécrotiques. Ainsi, bien que présentant
des signes semblables à ceux observés chez les cas de DMD, la rareté des cas de
dystrophies félines ne permettent pas d’utiliser cet animal en recherche pour le
développement d’une thérapie.
35
3
Approches thérapeutiques
Les thérapies développées dans le cadre des myopathies, notamment de la DMD, se
doivent d’atteindre au moins un des effets thérapeutiques suivant : ralentir voire arrêter la
dégénérescence musculaire ; estomper les divers signes cliniques en corrigeant l’origine de
la pathologie ; restaurer la capacité musculaire des patients. Presque 150 ans se sont écoulés
depuis la description des premiers cas de DMD et presque 20 ans depuis que le gène codant
pour la dystrophine fut identifié. Néanmoins, il n’existe pour l’instant aucun traitement
curatif pour cette maladie. La difficulté à établir une thérapie efficace est particulièrement
due aux obstacles représentés par le remplacement ou la réparation du gène défectueux.
Pareillement, la pluralité des pathologies associées à la dégénérescence musculaire
permanente oblige les équipes de recherche à travailler sur « un terrain miné ». Pour
l’instant, les palliatifs se limitent à améliorer le confort et la qualité de vie des patients.
Pour ralentir un peu l’atrophie musculaire, des séances de physiothérapies peuvent être
prescrites. Pour augmenter la mobilité des patients, cannes puis chaises roulantes
électriques ont été mises à leur disposition. Pour augmenter leur capacité respiratoire les
patients sont mis sous assistance respiratoire. Également, des interventions chirurgicales
lourdes peuvent être envisagées pour les patients qui développent une lordose pathologique.
Des barres métalliques sont alors vissées le long de la colonne vertébrale pour éviter son
affaissement (Franzini-Armsrong 1994).
De 1940 à 1979, une pléthore de drogues et d’agents fut administrée aux patients.
L’ensemble de ces traitements ne rentrait pas dans le cadre d’études scientifiques contrôlées
rigoureusement. Aucun des traitements prescrits ne donna des résultats convaincants. Parmi
eux nous noterons : la vitamine E, des androgènes, des stéroïdes anabolisants avec ou sans
digitoxine, des nucléosides, des nucléotides, de l’adrénaline, des vasodilatateurs, de la
glycine, autres acides aminés etc.… Puis, au début des années 80, les traitements proposés
entrèrent dans des programmes scientifiques plus sévèrement encadrés (Franzini-Armsrong
1994). Actuellement, les thérapies pharmaceutiques, géniques et cellulaires constituent
l’ensemble des approches envisagées pour traiter la DMD. Ces différentes approches seront
tour à tour abordées. Cette section inclura l’approche pharmaceutique et génique.
36
L’emphase sera mise sur la thérapie cellulaire (section 5), puisque les deux articles de cette
thèse s’articulent autour de cette dernière.
3.1 Thérapies pharmaceutiques
Plusieurs stratégies pharmaceutiques ont été proposées pour répondre aux
problèmes liés à la DMD. De nombreux composés tels que la vitamine E (Backman et al
1988), le sélénium, le mazindol (Zatz et al 1986; Zatz et al 1988) se sont avérés inefficaces.
Malgré
tout,
l’approche
pharmaceutique
demeure
une
approche
thérapeutique
contemporaine.
3.1.1 Inhibition de la myostatine
Les cellules satellites sont des cellules myogéniques en phase quiescente situées
entre la lame basale et le sarcolemme. Ces cellules ont la capacité de réparer les lésions des
fibres musculaires (cf. chapitre 1 : 1.1.1.3). Les cellules satellites des patients DMD ont une
capacité proliférative réduite et deviennent plus rapidement sénescentes que des cellules
satellites de sujets sains (Blau et al 1983; Blau et al 1985). La myostatine est une molécule
de la famille du « Transforming Growth Factor –β » (TGF–β) qui est un inhibiteur de la
croissance musculaire. Les mécanismes impliqués dans l’hypertrophie musculaire des
animaux ayant une mutation dans le gène codant pour la myostatine ont été pour la plupart
bien définis (Kambadur et al 1997; McPherron et al 1997; McPherron & Lee 1997). Une
récente étude associe l’hypertrophie musculaire de souris myostatine (-/-) à l’augmentation
de la capacité proliférative et au retardement de la phase différenciative de leurs cellules
satellites (McCroskery et al 2003). En outre, il a été rapporté que l’inhibition de la
myostatine au sein de la souris mdx permettait d’augmenter leur masse musculaire
(Bogdanovich et al 2002). D’autres observations intéressantes ont été énoncées telles
qu’une baisse significative de la dégénérescence des fibres musculaires ainsi qu’une
réduction du taux sérique de PCK (Bogdanovich et al 2002). Ces résultats suscitent
néanmoins un questionnement « Comment améliorer le profil pathologique des patients
dystrophiques en augmentant la masse d’un muscle néanmoins dépourvu de
dystrophine ? ». Plusieurs investigations restent à effectuer pour justifier ce type
d’approche thérapeutique. Il faut concurremment garder en mémoire que les résultats
37
préliminaires d’inhibition de la myostatine ont été obtenus chez la souris mdx qui ne
représente pas un modèle d’étude suffisant.
3.1.2 Administration de glucocorticoïdes
Les glucocorticoïdes, tels que la prednisone, ont démontré une certaine efficacité à
ralentir la progression de la DMD (DeSilva et al 1987; Fenichel et al 1991; Mendell et al
1989). Cette molécule visait à réduire l’inflammation chronique des muscles des patients
DMD. Malgré cela, il semblait peu envisageable de traiter continuellement un patient avec
des glucocorticoïdes compte tenu des effets secondaires qui leurs sont associés.
L’utilisation du déflazacort, un dérivé de la prednisone, entraînant moins d’effets néfastes,
apparaît comme un traitement palliatif prometteur (Bonifati et al 2000; Mesa et al 1991). Il
a donné de bons résultats chez la souris mdx (Anderson et al 1996; Anderson & Vargas
2003; Anderson et al 2000). Une récente étude clinique chez des patients atteints de DMD a
révélé que l’administration de glucocorticoïdes (déflazocort, prédnisolone) permettait
d’augmenter temporairement (six mois à un an) la force musculaire des patients. Cette
augmentation se traduisait par un gain de mobilité des patients. Le régime le plus efficace
semblait être l’administration de prédnisolone. La liste des effets secondaires engendrée par
ces traitements est assez conséquente mais reste admissible cliniquement. Cependant, ces
essais ne permettaient pas d’évaluer les risques d’une administration à long terme (Manzur
et al 2004).
3.1.3 Administration d’aminoglycosides
Quelques mutations provoquant le développement d’une DMD (10%) sont dues à la
formation prématurée d’un codon stop à l’intérieur de la séquence codante de la
dystrophine. Certaines études visent à supprimer ce codon en causant une relaxation de
l’ARNm lors de la reconnaissance des codons par la machinerie traductionnelle. (BartonDavis et al 1999a; Palmer et al 1979). Le traitement de souris mdx à la gentamicine à tout
d’abord laisser une bonne impression quant à son potentiel thérapeutique. Une
augmentation de 10 à 20% du niveau d’expression de dystrophine et du DAP a été
répertoriée chez les souris traitées (Barton-Davis et al 1999a). Malheureusement les
résultats ont été inexistants lors de la première tentative clinique (Wagner et al 2001) et
38
pour couronner le tout, de nouvelles expériences effectuées chez la souris n’ont pas
reproduits les premiers résultats obtenus (Dunant et al 2003).
3.2 Thérapies géniques
L’étiologie de la DMD est liée à l’absence d’expression de dystrophine viable.
L’ensemble des thérapies géniques vise à exploiter la machinerie cellulaire des patients
pour lui faire traduire une séquence génique codant pour la dystrophine ou pour une
protéine mimant sa fonction. Certaines équipes de recherche ont tout d’abord vérifié que
l’expression de dystrophine chez la souris mdx permettait de modifier son profil
pathologique (Cox et al 1993a; Phelps et al 1995; Sakamoto et al 2002). Les souris
exprimant la dystrophine pleine longueur ne montraient quasiment plus de signes
pathologiques et ce, même si seulement 70% du niveau d’expression de la protéine étaient
atteint (Goyenvalle et al 2004; Phelps et al 1995). De plus, il semblerait qu’une correction
partielle de l’expression de dystrophine permettrait une amélioration significative de profil
pathologique des souris traitées (DelloRusso et al 2002; Phelps et al 1995). Diverses
approches ont été développées depuis afin de répondre aux exigences requises à une
application clinique.
3.2.1 Les adénovirus
3.2.1.1 Adénovirus de première génération
Une des principales avenues en thérapie génique est l’utilisation de vecteurs viraux
capable d’introduire l’ADNc (~14kb) de la dystrophine dans les fibres dystrophiques. Les
adénovirus ont été souvent utilisés à cette fin. La capacité d’encapsulation des adénovirus
de première génération, étant d’environ 8 kb, nécessita l’utilisation d’un ADNc de
dystrophine tronqué (~6.3 kb) appelé mini dystrophine. Les adénovirus de première
génération ont ainsi été les premiers vecteurs permettant de délivrer un ADNc tronqué de
dystrophine dans des souris mdx (Kumar-Singh & Chamberlain 1996; Petrof et al 1995).
Toutefois, les adénovirus provoquaient une réponse immunitaire importante, de type
cellulaire ainsi qu’humorale, et ne permettaient qu’une expression transitoire de la mini
dystrophine. Ces limitations amenèrent au développement de nouvelles générations
d’adénovirus (Amalfitano & Parks 2002).
39
3.2.1.2 Helper dependent adénovirus
Les « helper dependent Adenovirus » (hdAd) sont des adénovirus dépourvus des
séquences codant pour les protéines virales. Ils induisent de ce fait une réponse immunitaire
réduite et permettent l’encapsulation de gènes plus grands (36 kb) (Acsadi et al 1996; Parks
et al 1996). Des souriceaux mdx traités avec ces vecteurs viraux ont montré une bonne
restauration de l’expression du complexe dystrophine-DAP (DelloRusso et al 2002; Dudley
et al 2004; Gilbert et al 2003). Le traitement de souris mdx adulte s’est révélé plus
problématique dû au manque d’efficacité des adénovirus à infecter un muscle mature. En
effet, le récepteur cellulaire de surface des adénovirus est le « coxsackie-adenovirus
receptor » (CAR). L’expression de ce récepteur est fortement diminuée au cours du
développement musculaire réduisant ainsi la capacité infectieuse des adénovirus
(Nalbantoglu et al 1999). L’utilisation in vitro d’héparane sulfate a permis de contourner ce
problème en augmentant la transduction des adénovirus (Bramson et al 2004). Néanmoins,
il est apparu que la fréquence des phases dégénératives et régénératives musculaires
réduisait également l’efficacité des adénovirus (Bramson et al 2004).
3.2.1.3 Les « adeno-associated virus »
Les « adeno-associated » virus (AAV) à l’instar des hdAd, déclenchent une réponse
inflammatoire réduite en comparaison aux adénovirus. Cependant, leur capacité
d’encapsulation est faible (~4kb). La micro dystrophine a permis de contourner ce
problème (Gregorevic et al 2004; Wang et al 2000; Watchko et al 2002). Ainsi, l’injection
systémique d’AAV-micro dystrophine, à des souris adultes mdx, a permis l’infection de
presque tous les muscles striés squelettiques ainsi que du muscle cardiaque (Gregorevic et
al 2004).
L’utilisation des vecteurs viraux est une approche intéressante pour traiter la DMD.
L’injection systémique de virus contenant l’ADNc de la dystrophine pleine longueur ou des
séquences réduites telles que la mini ou la micro dystrophine permettrait d’atteindre des
muscles difficiles d’accès comme le diaphragme et le cœur. L’affaiblissement de ces
muscles étant à l’origine du décès des patients, leur traitement se révèle incontournable
pour réduire la létalité de cette maladie. Néanmoins, la réaction immunitaire imputable à
l’utilisation de vecteurs viraux est le problème majeur qui freine le développement de
40
thérapie en phase clinique. Ainsi, et ce même si les hdAd ou les AAV ont un caractère
immunogénique plus faible que les adénovirus, l’injection de fortes doses de ces vecteurs
viraux peut provoquer une réaction inflammatoire létale (Muruve et al 1999; Muruve et al
2004). Même si certaines améliorations ont été apportées pour réduire la réponse
immunitaire (Jiang et al 2004; Mok et al 2005), il n’en demeure pas moins qu’une grande
efficacité des vecteurs viraux ne pourrait être atteinte qu’en traitant des enfants en bas âges
(moins de particules virales à utiliser) avec cependant des doses conséquentes de virus. Il
semble difficile pour l’instant de concevoir une telle approche aussi bien techniquement
qu’éthiquement.
3.2.2 Les oligonucléotides
3.2.2.1 Le saut d’éxon
Les oligonucléotides anti-sens sont composés de portions d’ARNs. Ils ont été
utilisés en premier lieu pour bloquer l’évènement de la traduction. La liaison des AONs
(antisens-oliglonucleotides) à l’ARNm conduit à la dégradation du complexe ainsi formé
(Good 2003). De plus, il a été décrit que les AONs pouvaient cibler les régions régulatrices
de l’épissage des ARNs pré-messager altérant ainsi l’épissage en question (Kole & Sazani
2001). De nombreux cas de DMD sont dus à des délétions du gène causant un changement
du cadre de lecture (Koenig et al 1989). Les délétions qui n’entrainent pas de changement
du cadre de lecture semblent générer un profil dystrophique adouci tel que le profil de
patients atteints de DMB. Ainsi, l’altération de l’épissage de l’ARNm codant pour la
dystrophine, par saut de l’éxon, permettrait de générer des protéines partiellement
tronquées mais gardant une certaine fonctionnalité. Les patients passeraient ainsi d’un
profil Duchenne à un profil Becker. Cette preuve de principe a été publiée il y a une dizaine
d’années (Dunckley et al 1998; Wilton et al 1997). Depuis, plusieurs thérapies ont vu le
jour chez la souris mdx (Mann et al 2001; van Deutekom et al 2001; Wilton et al 1999),
certaines ayant débouchées à des essais cliniques (Wilton & Fletcher 2006). Pour l’instant
la voie d’administration consiste en une injection intramusculaire, mais des tests réalisés
chez la souris visent une administration systémique (Alter et al 2006; Lu et al 2003; Sirsi et
al 2005; Williams et al 2006). Néanmoins, cette approche est limitée par le fait qu’il faut
construire autant d’AONs qu’il y a de mutations possibles. Certes, un nombre relativement
41
petit de délétions représente une bonne partie des cas de DMDs (Aartsma-Rus et al 2003),
mais en l’absence d’éxamen diagnostique moléculaire précis et systématique, cette therapie
n’est pas applicable. Enfin, une des limites intrinsèque à cette approche demeure son effet
transitoire. En effet, les AONs sont instables dans la cellule. Chez les souris mdx traitées,
les niveaux détectables d’expression de dystrophine ont été obtenus par injections
séquentielles d’AONs. Malheureusement, les niveaux d’expression ont decliné selon une
demie-vie variant de 2 à 4 mois (Lu et al 2003). Ainsi, une thérapie basée sur cette
approche impliquerait une répétition fréquente d’injections d’AONs. La seule façon de
remédier à ce probleme serait d’utiliser un vecteur viral pour stabiliser l’expression des
AONs (De Angelis et al 2002; Denti et al 2006; Goyenvalle et al 2004). Mais cela
confronterait cette therapie au même défi éthique qui se dresse devant l’administration de
vecteurs viraux en systémique.
3.2.2.2 Correction génomique
Les mutations ponctuelles du gène de la dystrophine représentent jusqu'à 15% des
cas de DMD. L’utilisation d’oligodésoxynucléotides (Figure 8), permet de réparer ce style
de mutations. La souris mdx fut un excellent modèle pour vérifier ce principe. En effet, la
déficience en dystrophine chez cette souris est due à une mutation ponctuelle générant un
codon stop dans le gène codant pour la dystrophine. Ainsi les premières expériences
réalisées chez cette souris donnèrent des résultats encourageants. La correction fut
démontrée au niveau génomique ainsi qu’au niveau de l’ARNm (Bertoni et al 2005;
Bertoni & Rando 2002; Rando et al 2000). L’expression de dystrophine fut aussi décrite in
vitro et in vivo. Une tentative similaire fut également réussie chez le chien dystrophique
(Bartlett et al 2000). À l’instar des AONs, l’utlisation des oligodésoxynucléotides
requièreraient une ingéniérie constante de ces vecteurs pour chaque zone de mutation. De
plus, il faut noter la faible efficacité de cette approche, puisque seulement 1 à 5% des
cellules traitées produisent de la dystrophine. Enfin, même si la correction au sein des
cellules répondantes est permanente et donc intéressante, il n’en demeure pas moins qu’il y
a un renouvellement cellulaire important lors du roulement des évènements de
dégénérescence/ régénérescence musculaire (Rando 2007).
42
Figure 8 : Mécanisme moléculaire de la correction génomique médiée par les
oligodésoxynucleotides. Dans cet exemple, le phénotype sauvage G-C est remplacé par une
hypothétique mutation de bases T-A. L’oligodésoxynucléotide présente une parfaite
homologie de séquence avec la zone entourant la mutation à l’exception de la base mutée.
Ce non appariement au niveau de la base mutée est corrigé par la machinerie endogène de
réparation de l’ADN en deux phases successives.
43
3.2.3 Approche plasmidique
Cette approche consiste à injecter en intramusculaire de l’ADN plasmidique codant
pour la dystrophine (Wolff et al 1992). Cette stratégie simpliste permet de contourner
l’utilisation des vecteurs viraux, qui peuvent potentiellement provoquer des réponses
immunes ou détériorer la cellule infectée (par leur toxicité ou par mutagenèse d'insertion).
En effet, l’injection d’ADN plasmidique ne semble pas engendrer de réponse immunitaire
de type cellulaire contre les fibres exprimant la dystrophine d’origine plasmidique (Zhang
et al 2004). Plusieurs paramètres tels que la taille, la concentration et la séquence du
promoteur ont été testés (Bartlett et al 1996; Manthorpe et al 1993; Wells et al 1998; Wolff
et al 1991). Des résultats encourageants obtenus chez la souris ont permis d’amener au
développement d’un essai clinique (Romero et al 2002; Romero et al 2004; Zhang et al
2004). Toutefois, même si aucun effet néfaste ne fut répertorié, le niveau d’expression de
dystrophine détecté après traitement fut très faible (Romero et al 2004). Plusieurs
approches ont été testées pour augmenter la distribution, et l’expression des plasmides
injectés. Parmis ces approches nous noterons l’utilisation de l’électroporation, des
ultrasons, ainsi que la co-injection d’enzymes (hyaluronidase) (Aihara & Miyazaki 1998;
Danialou et al 2002; Mennuni et al 2002; Schratzberger et al 2002; Taniyama et al 2002).
Bien que l’augmentation de l’expression génique du plasmide transféré par ces méthodes
soit notable, il est difficile d’envisager une telle méthode pour traiter tous les muscles des
patients notemment des muscles tels que le diaphragme et le cœur. De ce fait, une
distribution systémique des plasmides semble plus convaincante. Ainsi, l’injection au
niveau des cuisses par voie intra-artérielle de plasmides codant pour la dystrophine a été
effectuée chez la souris et chez le singe (Zhang et al 2001; Zhang et al 2004). Seulement 1
à 5% de fibres positives pour la dystrophine ont été comptabilisées chez les animaux ainsi
traités témoignant de la faible efficacité de cette approche. Enfin, une question persiste
quant au potentiel de l’injection plasmidique comme principe curatif de la DMD. En effet,
l’injection de plasmides chez la souris a révélé que l’expression des transgènes restait
détectable plusieurs mois après injection. Néanmoins, il y a une perte significative de cette
expression au cours du temps (Molnar et al 2004). Ce facteur est important considérant
qu’une expression permanente du transgène de la dystrophine est nécessaire pour être
44
efficace. Pour remédier à ce problème, il faut noter que l’utilisation récente de plasmides
intégratifs offre une solution intéressante (Quenneville et al 2004; Quenneville et al 2007).
4
Thérapie cellulaire
La thérapie cellulaire a vu le jour au cours des années 80, dans les services
d'hématologie et les établissements de transfusion sanguine, avec le développement des
techniques de greffe de moelle osseuse. D'autres formes de thérapie cellulaire sont apparues
pendant ces dernières années (cellules souches hématopoïétiques du sang circulant et
fœtales, cellules immunocompétentes, endothéliales, nerveuses, cellules des îlots de
Langerhans, kératinocytes, hépatocytes…), pour la plupart encore au stade expérimental,
mais porteuses de grands espoirs thérapeutiques. Parmi elles, la transplantation de cellules
myogéniques (TM) correspond à la stratégie cellulaire développée pour répondre aux
problèmes liés aux myopathies.
Au cours de la première partie de ce chapitre, les transplantations dans leur sens
médical le plus large seront évoquées. Le rôle du système immunitaire dans le cadre d’une
transplantation est prépondérant et le succès des greffes intentées repose sur la
compréhension des mécanismes immunitaires impliqués. Ainsi, les principaux intervenants
cellulaires et moléculaires reliés à l’acceptation du transplant par le receveur seront
abordés. Puis, la transplantation sera introduite dans ce contexte immunitaire.
La deuxième partie de ce chapitre mettra l’accent sur la TM en tant que telle. En
effet, plusieurs approches expérimentales sont envisagées pour transplanter des cellules
myogéniques. Les cellules utilisées ainsi que leurs modes d’administration peuvent varier
et influencer grandement les résultats escomptés. Parmi les approches abordées, la TM par
injections intramusculaires sera évoquée puisqu’elle constitue l’approche thématique de
cette thèse. Les difficultés liées à cette transplantation seront soulignées à l’instar des
problèmes associés aux autres types de TM.
4.1 Transplantation et immunité
Depuis la première transplantation rénale en 1956 (Harrison et al 1956; Merrill et al
1956), les transplantations d’organes ont bénéficié de progrès remarquables aussi bien du
45
point de vue chirurgicale qu’immunologique. La diversité des tissus et des organes s’est
également élargie (moelle osseuse, cœur, foie etc et la durée de vie des transplants a
augmenté à moyen terme. Cependant l’évolution à long terme des greffons (10 à 20 ans)
pose encore de nombreux problèmes non résolus dont la plupart sont liés à
l’immunobiologie.
4.1.1 Notions d’immunobiologie
L’immunité peut être définie comme l’ensemble des mécanismes biologiques
permettant à un organisme pluricellulaire de maintenir la cohérence des cellules et des
tissus qui le constituent et d’assurer son intégrité. Ce processus s’effectue par l’élimination,
de ses propres constituants altérés, des substances étrangères et des agents infectieux
auxquels l’organisme est exposé. Cette fonction met en jeu deux catégories de mécanismes,
apparus successivement au cours de l’évolution des espèces et étroitement intriquées dans
les organismes supérieurs. La première est l’immunité « non spécifique » ou naturelle de
mise en jeu immédiate. L’autre est l’immunité spécifique, acquise ou adaptative, qui se
développe en quelques jours et qui est caractérisée par une mémoire immunologique.
Immunités naturelle et spécifique impliquent, au niveau moléculaire, une capacité de
distinction ou de reconnaissance, entre les constituants de l’organisme ou le « soi » et les
autres molécules dont l’ensemble constitue le « non soi ». Également, les deux types
d’immunité mettent en jeu des cellules (immunité à médiation cellulaire) et des molécules
en solution dans les liquides biologiques (immunité humorale). L’ensemble constitue le
système immunitaire dont l’organisation générale ressemble à celle du système nerveux
central : traitement d’un nombre conséquent d’informations, forte intégration et régulation
faisant appel à des médiateurs ou « molécules messages ».
L’immunité naturelle utilise les fonctions d’exclusion du revêtement cutanéomuqueux et la mise en jeu de signaux d’activation entre des ensembles de molécules
plasmatiques (complément, coagulation) et des cellules [(polynucléaires, neutrophiles,
macrophages, cellules « natural killer » (NK)]. Cette immunité conduit notamment à la
réaction inflammatoire.
46
L’immunité spécifique utilise les mécanismes effecteurs de l’immunité naturelle en
y ajoutant quelques propriétés. En effet, cette immunité implique la reconnaissance de
constituants appelés antigènes (Ag) par des molécules complémentaires très diversifiées
(récepteurs d’Ags). Ces récepteurs d’Ags peuvent être des molécules d’immunoglobulines
(Ig) ou anticorps (Ac). Les récepteurs antigéniques sont aussi présents sur des cellules de
l’immunité spécifique (les lymphocytes T et B) et sont appelés respectivement : TCR « T
cell receptor » ou BCR « B cell receptor ». Néanmoins la reconnaissance antigénique dans
le cas des TCRs et BCRs ne peut s’effectuer uniquement si l’Ag est présenté par une
molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).
La plupart des cellules du système immunitaire sont d’origine hématopoïétique.
Seuls les lymphocytes T et B (LT et LB) ont la capacité d’assurer l’immunité spécifique.
Cependant, un grand nombre d’autres cellules hématopoïétiques participent directement à
l’induction, la régulation et l’expression de la réponse immunitaire spécifique, en même
temps qu’elles assurent l’immunité naturelle de mise en jeu rapide. Il s’agit des
polynucléaires (neutrophiles, éosinophiles basophiles), des mastocytes et des cellules de la
lignée monocytes/macrophages dont les multiples formes tissulaires constituent le système
réticulo-histiocytaire. L’ensemble de ces cellules va brièvement être détaillé dans la section
suivante. Cependant, étant donnée l’importance des cellules de l’immunité spécifique dans
le cadre de la transplantation ainsi que dans le contexte de cette thèse, l’accent sera mis sur
les LTs ainsi que sur les cellules présentatrices d’Ags (CPA).
4.1.2 Cellules du système immunitaire
Les cellules matures du système immunitaire dérivent des cellules souches
hématopoïétiques pluripotentes. Ces cellules sont localisées dans le foie, pendant la vie
fœtale, puis dans la moelle osseuse. La mitose de ces cellules conduit à la formation d’une
nouvelle cellule souche et d’une cellule qui va s’engager dans l’une des lignées
érythrocytaire, mégacaryocytaire, granulocytaire ou lymphoïde (Figure 8). Cette
différenciation cellulaire, qui se passe au niveau médullaire, s’appelle l’hématopoïèse.
L’hématopoïèse est caractérisée par des étapes séquentielles de différenciation. Ces
étapes sont définies par des modifications phénotypiques, avec expression de molécules
47
membranaires, et par des propriétés fonctionnelles particulières à certains stades de
maturation. La prolifération et la différenciation de chaque lignée sont contrôlées par des
signaux extracellulaires, sous forme de contact membranaire ou par l’action de cytokines et
de facteurs de croissance.
4.1.2.1 Les polynucléaires
4.1.2.1.1
Polynucléaires neutrophiles
Ces cellules représentent 60 à 70% des leucocytes du sang. La demi vie des
neutrophiles est de l’ordre de 4 à 10 heures après avoir quitté la moelle osseuse. Les
neutrophiles ont la capacité de migrer en réponse à un signal chimiotactique. Par leurs
récepteurs aux molécules du complément et leur récepteurs aux Acs, ils fixent et
phagocytent les particules opsonisées par ces derniers. Ils jouent donc un rôle essentiel dans
la défense contre les microorganismes à réplication extracellulaire, principalement les
bactéries et les levures. Ils interviennent aussi lors des lésions tissulaires.
4.1.2.1.2
Polynucléaires éosinophiles
Représentant 3% des cellules des leucocytes, les éosinophiles se localisent, après un
bref passage dans le sang, dans les tissus infectés ou endommagés. Lorsqu’ils sont activés
par des Acs, ces cellules sécrètent beaucoup de cytokines cytotoxiques.
48
Figure 9 : Schématisation de l’hématopoïèse
49
4.1.2.1.3
Polynucléaires basophiles
Les basophiles constituent moins de 1% des leucocytes. Lorsqu’ils sont tissulaires,
ces cellules sont appelées mastocytes. Basophiles et mastocytes possèdent des récepteurs
aux Igs de type E (cf. chapitre 1 : 4.2.2.2.2). La fixation des Igs sur leurs récepteurs de forte
affinité provoque une dégranulation de plusieurs facteurs impliqués dans la réaction
d’allergie.
4.1.2.2 Lignées lymphocytaires
Les lymphocytes T et B se différencient à partir des cellules souches
hématopoïétiques par un stade intermédiaire de cellules souches lymphoïdes. Ces deux
lignées lymphocytaires sont caractérisées, à la différence des autres cellules de l’organisme,
par une différenciation en deux phases : la phase centrale et la phase périphérique.
La phase centrale de différenciation a lieu dans le thymus pour la lignée des LTs et
dans la moelle osseuse pour la celle des LBs. Au sein du microenvironnement de ces
organes lymphoïdes centraux, les cellules lymphoïdes subissent un phénomène de
différenciation irréversible. Cette différenciation est caractérisée par des réarrangements de
segments géniques aboutissant à l’expression membranaire d’un récepteur d’Ags le TCR ou
BCR. Cette phase centrale comporte en outre un processus de sélection, par des molécules
du CMH associées à des peptides pour les LT, et par les épitopes de l’Ag qui interagissent
avec le BCR pour les LBs.
La phase périphérique de différenciation a lieu dans les organes lymphoïdes
périphériques. Elle dépend d’un signal activateur induit par l’interaction du BCR avec
l’épitope antigénique et celle du TCR avec un peptide associé à une molécule du CMH.
D’autres molécules membranaires doivent interagir pour apporter les co-signaux
nécessaires à l’activation.
Les LTs activés lors de la phase périphérique se différencient en LTs effecteurs,
cytotoxiques ou sécréteurs de cytokines, permettant l’activation des macrophages. D’autres
LTs se différencient après activation en LTs à mémoire. Leur activation induit une
expansion clonale par prolifération des LTs exprimant une même espèce moléculaire de
TCR.
50
Les LBs activés subissent un processus d’expansion clonale et de différenciation
soit en LBs à mémoire, soit en plasmocytes, étape terminale de différenciation des LBs.
Ces plasmocytes sécrètent les Acs de structure très voisine de celle des BCRs dont ils sont
issus. Ces molécules d’Acs ont cependant pour la plupart subi des mutations somatiques et
une sélection par l’Ag au sein des centres germinatifs des organes lymphoïdes
périphériques.
4.1.2.2.1 Lymphocyte T
4.2.2.1.1.1
Le récepteur des lymphocytes T
Les TCRs sont des hétérodimères formés par l’association de deux chaînes
polypeptidiques α et β ou γ et δ (Figure 9). Environ 90% des LTs circulants portent des
TCRs de type αβ les autres portant des TCRs de type γδ. Le site de liaison des TCRs αβ
interagit avec des peptides présentés par des molécules du CMH de classe I ou II. Les
récepteurs γδ peuvent lier des épitopes non associés aux molécules du CMH. Cependant,
ces derniers n’étant pas d’intérêt direct avec cette thèse, ils ne seront pas abordés.
Les TCRs sont associés sur la membrane des LTs au complexe moléculaire CD3.
Ce complexe est nécessaire pour la transduction des signaux provoqués par l’interaction
des TCRs avec l’Ag. Le complexe TCR/CD3 est également associé pour la majorité des
LTs à des molécules invariantes : CD4 ou CD8. Ces molécules interagissent respectivement
avec le CMH de classe II ou de Classe I et participent à la transduction du signal activateur
via le CD3.
Le site de liaison de l’Ag au sein des TCRs est formé de 3 régions hypervariables,
déterminant la complémentarité des deux chaînes Vα et Vβ. L’extrême diversité des
récepteurs portant les sites de liaison à l’Ag (paratope) est obtenue par leur structure
bicaténaire hétérodimérique et par la combinaison des réarrangements géniques. Ce
réarrangment des gènes codant pour les TCRs, se déroule au cours de la maturation des
LTs.
51
Figure 10 : Récepteur d’une cellule lymphocytaire de type T et ses sous unités
membranaires.
52
Le répertoire des TCRs est modulé par les stimulations antigéniques et par les mécanismes
de sélections thymiques. Chaque LT utilise une combinaison de segments géniques qui sera
maintenue dans l’ensemble des cellules issues de ce LTs. Les proliférations monoclonales
seront donc définies par la présence d’un clone cellulaire dont les cellules filles
exprimeront le même récepteur. Il est important de noter que l’expansion clonale des LBs
suit les mêmes règles.
4.2.2.1.1.2
Maturation des LTs
Les cellules lymphoïdes, qui quittent la moelle osseuse pour gagner le thymus afin
de maturer, s’appellent des prothymocytes ou thymocytes corticaux. Ces prothymocytes
n’expriment pas encore le complexe CD4 ou CD8. Ces cellules ont une activité
recombinase permettant le réarrangement des gènes codant pour les chaînes γ et δ. Un petit
contingent de cellules γδ+ exprimant le CD3 mais CD4/CD8 négatif, quitte alors le thymus.
Sur d’autres thymocytes, l’expression de la chaîne pTα (substitut de la chaîne α) est induite
par la synthèse des chaînes CD3. Ceux-ci deviennent des thymocytes doubles positifs CD4
et CD8. Ces cellules blastiques en division forment alors des petites cellules et procèdent au
réarrangement et à l’expression de la chaîne α. Ces cellules font l’objet des sélections
positives et négatives. Les cellules cessant de transcrire les gènes CD4 ou CD8, deviennent
alors des thymocytes matures simples positifs CD4+/CD8- ou CD4-/CD8+ (Figure
10)(Richard A. Goldsby 2006) .
Les LTs ayant des réarrangements non fonctionnels des segments géniques, codant les
chaînes du TCR, comme celles n’ayant pas subi de sélection positive ou ayant fait l’objet
d’une sélection négative, meurent par apoptose. Leurs débris sont alors phagocytés par les
macrophages du thymus. Ceci représente 98% des lymphocytes formés au sein du thymus.
Les autres se différencient en LTs matures dans la zone médullaire corticale.
53
Figure 11 : Sélection positive et négative au sein du thymus.
Goldsby (2006)
54
4.2.2.1.1.2.1
Sélection positive
Cette étape de la maturation thymique contrôle le réarrangement des gènes de la
chaîne α du TCR et l’expression des co-récepteurs CD4 et CD8. Les réarrangements de la
chaîne α se poursuivent jusqu’à ce que les cellules fassent l’objet d’une sélection positive
ou bien meurt. Une même cellule peut donc « essayer » successivement plusieurs chaînes α.
Environ 1/3 des LTs matures exprime deux chaînes α différentes. Mais en règle générale un
seul des deux TCRs est capable de reconnaître une molécule du CMH du soi, l’autre n’étant
pas fonctionnel. Ce mécanisme de production successive de plusieurs chaînes α augmente
les chances de survie par sélection positive participe à la fréquence élevée des LTs matures
allo-réactifs.
La sélection positive s’applique aux thymocytes doubles positifs CD4/CD8. Cette
sélection conduit à l’expression de thymocytes simples positifs CD4+ ou CD8+.
L’interaction du TCR avec un peptide associé à une molécule de classe I ou II entraîne
respectivement l’arrêt de l’expression des molécules CD4 et CD8. Cette présentation du
CMH est assurée par les cellules épithéliales corticales. La survie des thymocytes dépend
de la capacité de reconnaissance de leur TCR avec les molécules du CMH des cellules
épithéliales corticales.
La cellule épithéliale corticale thymique est une cellule critique pour la sélection
positive des lymphocytes T. Les cellules épithéliales corticales forment un réseau qui
permet un contact étroit entre les récepteurs T des cellules double-positives et les molécules
de CMH des cellules stromales.
Il est clairement établi que les cellules épithéliales corticales thymiques sont à
l’origine de la sélection positive des lymphocytes T. Une expérience ingénieuse l’a
démontré. Des souris dont les gènes du CMH de classe II sont éliminés ne produisent pas
des cellules T CD4+. Pour examiner le rôle de l'épithélium thymique dans la sélection
positive, un gène de classe II du CMH, placé sous la commande d'un promoteur limitant
son expression aux cellules épithéliales corticales thymiques, a été présenté comme
transgène dans ces souris mutantes. Des cellules LTs CD4+ se sont alors développées. Une
autre variante de cette expérience proposait l’utilisation d’un transgène du CMH de la
classe II exprimé au niveau du thymus et contenant une mutation empêchant toute
55
intéraction avec un LT CD4+. Dans ce contexte, très peu de cellules CD4+ peuvent se
développer. Des études équivalentes de l'interaction du CD8 avec des molécules du CMH
de classe I prouvent que la liaison de TCR/CMH est également nécessaire pour la sélection
positive des cellules CD8.
Le rôle critique de l'épithélium thymique dans la sélection positive soulève une
question : Est-ce que la présentation antigénique dans l’épithélium thymique est la même
que dans les autres tissus lymphoïdes ? Pour l’instant ce n'est pas clair. Cependant, il est
établi que l'épithélium thymique se différencie suite à l’action des protéases qui sont
employées pour dégrader la chaîne invariable « Li »par exemple. La cathepsine L de
protéase domine dans l'épithélium cortical thymique, tandis que la cathepsine S semble être
la plus importante dans les autres tissus. Conséquemment, le développement des cellules
TCD4+ est sévèrement touché chez les souris KO pour la cathépsine de type L. Les cellules
épithéliales thymiques semblent présenter à leur surface une densité importante de
molécules de CMH de classe II qui ont conservé la chaîne-associée invariable « CLIP) ».
Cependant, ils présentent également une gamme d'autres peptides. Il reste à savoir si les
complexes CMH-peptides sont présentés par ces cellules ont toutes les caractéristiques
requises pour la sélection positive (Richard A. Goldsby 2006).
4.2.2.1.1.2.2
Sélection négative
Une fois la sélection positive effectuée dans la zone corticale, les thymocytes se
dirigent vers la zone médullaire où ils vont subir la sélection négative. Cette sélection est
exercée par des cellules dendritiques et les macrophages de la jonction cortico-médullaire.
Ces cellules présentent des peptides endogènes ou issus des protéines du milieu
extracellulaire. Les affinités entre les TCRs et les CMH peuvent varier de faible à forte. La
sélection négative permet la discrimination entre les différentes affinités. Elle élimine ainsi
les thymocytes qui réagissent fortement aux interactions entre le CMH présentant un
peptide du soi. Cette sélection est importante pour développer une tolérance au soi. Les
mécanismes précis de la sélection négative ne sont pas encore connus, néanmoins il est
établi que les cellules meurent par apoptose.
56
Toutes les protéines d’un individu ne sont pas exprimées au niveau du thymus.
Cependant, les peptides qui existent dans d'autres tissus que le tissu thymique, ou qui sont
exprimés à différentes étapes de la vie d’une personne, comme après la puberté,
rencontreront les cellules de T matures qui auront le potentiel de répondre en leurs
présences. Néamoins, il y a des mécanismes qui empêchent les cellules de T matures de
répondre en présence de tels antigènes (4.2.2.2.3).
La sélection négative peut être effectuée par différentes cellules du thymus. Les plus
importantes sont les cellules macrophages et les cellules dendritiques dérivées de la moelle
osseuse. Ce sont ces cellules présentatrices d’antigènes qui activent également les cellules
de T matures dans les tissus lymphoïdes périphériques. Les antigènes présentés par ces
cellules sont donc la source principale des réponses autoimmunes potentielles qui peuvent
se développer en périphérie. C’est pourquoi il est capital d’éliminer dans le thymus des
cellules T répondant à de tels peptides
Il est claire que la sélection positive et négative dépendent toutes les deux de
l’intéraction des peptides présentés par les cellules thymiques et des TCRs des cellules T
qui sont en maturation. Une question persiste. Comment une même interaction peptideCMH/TCR du soi conduit elle à la survie de cellules ou à leur mort ? Pour l’instant la
réponse n’est pas encore claire. Il faut prendre deux éléments en considération pour
résoudre un tel problème. Le premier, c’est que les interactions qui régissent la sélection
positive impliquent plus de spécificité que celles qui régissent la sélection négative. Le
second, c’est que la conséquence des interactions qui conduisent à la sélection positive ou
négative doit différer. La seule hypothèse recevable pour l’instant repose sur la notion
d’avidité. Si l’avidité de la liaison entre le TCR et le complexe peptide-CMH est élevée,
alors la cellule rentre en apoptose et est donc suprimée (sélection négative). Cependant, si
l’interaction est faible alors la cellule survit (sélection positive). Puisqu’il y a
vraisemblablemt plus de complexes qui se lient faiblement que fortement, alors il y a une
sélection positive d’un large répertoire de cellules T qui seront sélectionées négativement
par la suite. La deuxième hypothèse repose sur le fait que le signal délivré par un peptide du
soi (Richard A. Goldsby 2006)
57
4.2.2.1.1.2.3 Cas particulier : Les superantigènes murins.
Les super-antigènes endogènes murins Mls sont des produits de gènes du virus des
tumeurs mammaires intégrés dans le génome cellulaire et transmis à la descendance. Ces
super-antigènes viraux induisent, par sélection négative, la délétion de thymocytes. Les
thymocytes ainsi éliminés sont ceux qui possèdent un TCR ayant des chaînes β appartenant
aux familles d’homologie qui interagissent spécifiquement avec le super-antigène. Cette
particularité permet notamment de mettre en évidence expérimentalement une délétion
thymique clonale spécifique.
4.1.2.2.2
Lymphocyte B
4.1.2.2.2.1
Le récepteur des cellules LBs (BCR)
Le récepteur des lymphocytes B est composé d’une immunoglobuline (Ig)
transmembranaire et de deux hétérodimères liés par des ponts disulfures appelés Ig-α/Ig-β.
Les chaînes Ig-α et Ig-β possèdent une longue queue cytoplasmique qui leur permet
d’interagir avec des molécules de signalisation intracellulaire.
4.1.2.2.2.2
Les immunoglobulines (Ig)
Les principaux acteurs de la réaction humorale sont les immunoglobulines, appelées
aussi anticorps. Ces molécules sont produites par les LBs. Les immunoglobulines sont
constituées de quatre chaînes peptidiques : deux chaînes légères identiques de 25 kDa et
deux chaînes lourdes identiques de 50 kDa et plus (Figure 11). Chaque chaîne légère est
liée à une chaîne lourde par des ponts disulfures. Enfin les deux chaînes lourdes sont
également reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne contient des régions
constantes et des régions variables. Les régions variables sont constituées d’environ 110
acides aminés et sont différentes pour chaque LB. Généralement, un LB ne produit qu’un
seul type d’Ig spécifique. À l’intérieur des régions variables se retrouvent les régions
hypervariables. Il existe trois de ces régions par chaîne lourde et légère et elles constituent
de 15-20% du domaine variable. Les régions hypervariables sont les portions des Igs qui
lient les Ags. La portion de l’Ag qui est reconnue par les Igs se nomme épitope. La
diversité du répertoire de reconnaissance des Ags par les Igs est attribuable à quelques
processus majeurs.
58
Figure 12 : Représentation schématique d’une immunoglobuline (Ig). Les chaînes L
(légères) κ et λ sont formées de 2 domaines, un domaine variable (Vκ ou Vλ) et un domaine
constant (Cκ ou Cλ). Les chaînes H (lourdes) comportent un domaine N-terminal variable
(VH) et 3 (pour les Igδ, Igγ, Igα) ou 4 (pour les Igµ, Igε) domaines constants (CH). Chacun
des domaines variables et VL et VH possède 3 zones hypervariables ou régions déterminant
la complémentarité. Le paratope est formé par la juxtaposition dans l’espace des zones
hypervariables séparées par des régions plus conservées (régions charpentes). L’action de la
papaïne sur l’Ig libère 2 fragments FAB monovalents et un fragment FC.
59
Tout d’abord, les régions variables sont formées par la recombinaison des gènes V et J pour
les chaînes légères et V, D et J pour les chaînes lourdes. Également, les gènes V existent en
plusieurs copies différentes à l’intérieur du génome. Toutefois, une seule de ces copies sera
sélectionnée aléatoirement. Ainsi, la combinaison des chaînes lourdes et légères, lors de la
formation d’une molécule d’Ig complète, augmente la diversité du répertoire des Acs.
Enfin, le LB mature subit des mutations au niveau des gènes de la région variable
réarrangés.
Il existe 5 classes différentes d’immunoglobulines : IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Chaque classe d’Ig se distingue par le type de leur chaînes lourdes : γ, µ, α, ε, δ. Chaque
classe peut aussi posséder différentes chaînes légères : κ ou λ. Chaque Ig est composée de
deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères identiques. De plus, les IgG et
IgA se subdivisent en sous-classe, dû à des différences mineures en acides aminés de leurs
chaînes γ et α. Chez l’humain, les IgA se sub-divisent en deux (α1 et α2) et les IgG en
quatre (γ1, γ2, γ3 et γ4). Chez la souris, seulement les Igs se subdivisent en quatre sous
classes (γ1, γ2a, γ2b et γ3). Les classes d’Ig possèdent des activités biologiques différentes
dues à la séquence distincte des régions constantes de leurs chaînes lourdes. Ainsi, les IgG
peuvent traverser le placenta, les IgG et les IgM activent la voie classique du complément
et les IgE possèdent une haute affinité avec les récepteurs des Ig sur les mastocytes et les
basophiles.
4.1.2.2.2.3
Maturation des LBs
Cette étape centrale conduit de la cellule souche lymphoïde à la cellule B mature qui
exprime IgM et/ou IgD membranaires (Figure 12) (Révillard 2001). Les cellules
lymphoïdes provenant de la moelle osseuse, se différencient en cellules progénitrices (ProB). Ces cellules expriment le CD45R, une tyrosine phosphatase (appelée également B220
chez la souris). Puis les cellules passent du stade pro-B à pré-B. Cette différenciation est
sous le contrôle des cellules stromales par interactions membranaires et fait également
intervenir une cytokine appelée interleukine-7 (IL-7). Les intéractions membranaires des
cellules pro-B avec les cellules stromales impliquent des molécules d’adhésion telles que le
VLA-4 et VCAM-1 (présentes respectivement sur les cellules B et les cellules stromales).
Suite à ces contacts cellulaires, les cellules pro-B expriment alors un récepteur appelé c-kit.
60
Le ligand de ce récepteur est le SCF (stem cell factor). C-kit est une tyrosine kinase et son
activation déclenche la prolifération et la différenciation des cellules pro-B en pré-B. Pour
parachever leur maturation, les cellules pré-B se mettent à exprimer le récepteur à l’IL-7.
La sécrétion d’IL-7 par les cellules stromales est essentielle à la maturation des cellules préB. La cellules pré-B mature exprimera alors le récepteur à l’IL-2 et commencera le
réarrangement
génique
de
la
chaîne
lourde
d’immunoglobuline.
L’expression
d’immunoglobulines de type M à la surface des lymphocytes pré-B leur confère un
nouveau degré de maturation et s’appellent alors lymphocytes B immatures. Les LBs
immatures, n’exprimant que l’IgM membranaire, font l’objet d’une sélection négative par
l’Ag. Lorsque la cellule B immature exprime une IgM à sa surface, sa survie dépend de la
nature des signaux qu’elle recevra par ce récepteur. Si un LB immature ne réagit pas contre
un Ag du soi, la cellule est sauvée et elle poursuivra sa différenciation. Cependant, si les
LBs immatures reçoivent un signal par leur BCR dû à une interaction avec un Ag du soi,
alors 4 possibilités peuvent survenir : la mort par apoptose, la production d’un nouveau
récepteur réarrangé, l’induction d’un état de non-réponse permanente aux antigènes
(anergie) et l’ignorance.
61
Figure 13 : Maturation des lymphocytes B. Lors de la première stimulation antigénique, les
LBs vont se transformer en plasmocytes sécrétant essentiellement des immunoglobulines
de types M. Lors de la deuxième stimulation antigénique, les LBs mémoires se
transforment en plasmocytes sécrétant essentiellement des immunoglobulines de type G, A
ou E selon la nature de la stimulation.
Révillard 2001.La cellule B immature subira une délétion clonale par apoptose en
réagissant aux antigènes du soi par plusieurs récepteurs simultanément. Néanmoins, la
cellule B immature peut encore réarranger sa chaîne légère et exprimer un nouveau
récepteur à sa surface, qui pourrait être non réactif au soi, on parle alors de « receptor
editing ». Si la cellule B immature reçoit un faible signal par son récepteur, causé par une
réactivité de faible valence (cas des antigènes solubles), elle devient alors inactive et ce de
62
façon permanente (anergie). Ces cellules migrent aux organes lymphoïdes secondaires,
mais mourront relativement tôt, dû à leur incapacité de s’activer. Finalement, les LBs
immatures, possédant une faible affinité aux antigènes du soi resteront en état d’ignorance
face à leur antigène (ignorance). Néanmoins, ces cellules ignorantes pourraient être
impliquées dans le développement de maladies auto-immunes s’activant contre un antigène
du soi lors de circonstances particulières.
La différenciation terminale des LBs conduit aux LBs à mémoire et aux
plasmocytes. Cette différenciation s’accompagne de modifications morphologiques, de
changements dans l’expression de molécules membranaires et d’une diminution
progressive des Igs de surface avec augmentation des Igs cytoplasmiques. La régulation de
la production d’Acs s’effectue donc au cours du stade de différenciation situé entre le LB
mature et le plasmocyte. Le maintien d’un taux d’Acs stable dans le sérum (par exemple
après vaccination) met donc en jeu l’activation répétée de nouveaux LBs matures et leur
différenciation en plasmocytes à courte durée de vie.
4.1.2.3 Cellules présentatrices d’antigènes (CPA)
4.1.2.3.1
CPA « professionnelles »
Les cellules dendritiques du tissu conjonctif de différents organes (cœur, foie, rein,
muscle…), les dendrocytes I et II du derme et les cellules de Langerhans de l’épiderme sont
les principales CPA permettant l’induction d’une réponse des LTs à un Ag exogène. Ces
cellules sont d’origine hématopoïétique (CD45+). Ces cellules présentent constitutivement
le CMH de classe I et de classe II à leur surface lorsqu’elles sont dans leurs tissus
respectifs. Puis, lors d’une stimulation par l’Ag ou par différents types de cytokines, les
CPA perdent leur morphologie dendritique et deviennent arrondies. Elles migrent alors vers
le ganglion lymphatique régional où elles se localisent dans le cortex profond dans lequel
elles retrouveront alors leur profil inter-digité. L’expression des molécules du CMH est très
fortement augmentée à la membrane et leur taux de renouvellement est très faible.
Conséquemment, les cellules après avoir capté et apprêté l’Ag en périphérie et l’avoir
transporté jusqu’au ganglion, vont présenter pendant plusieurs jours les mêmes peptides
d’origine exogène à un grand nombre de LTs passant au contact de leurs prolongements
63
dendritiques. C’est cette interaction des CPA avec les LTs qui permet l’induction d’une
réponse immunitaire T spécifique.
Un autre type de CPA sont les cellules dendritiques folliculaires. Ces cellules ne
sont cependant pas d’origine hématopoïétique (CD45-). Elles fixent l’Ag sur leurs
récepteurs membranaires et l’exposent de façon prolongée aux LBs dans les centres
germinatifs ganglionnaires. Cette présentation antigénique est nécessaire à la maturation
des LBs. En effet, les LBs exposés à l’Ag présenté par les cellules dendritiques folliculaires
reçoivent deux types de signal : soit un signal de survie et de différenciation en cellules B
mémoires, qui passent dans la circulation lymphatique, soit un signal de différenciation en
plasmocytes qui gagnent la zone médullaire ganglionnaire puis pour la plupart, la moelle
osseuse. L’absence d’interaction efficace BCR/Ag conduit à l’apoptose des LBs. Ce
processus de sélection positive par l’Ag est à l’origine de la maturation d’affinité des
anticorps.
4.1.2.3.2
CPA « non professionnelles »
Les LBs peuvent dans certains cas participer à la présentation antigénique aux LT
CD4+ pour le développement d’une réponse Ac dépendant des LTs. En effet, les LBs
reconnaissent l’Ag par leurs Igs membranaires et peuvent l’internaliser. Le peptide
antigénique est alors dégradé et présenté par le CMH de classe II des LBs.
La présentation de l’Ag aux LT CD4+ peut être également assurée par des cellules
endothéliales, et épithéliales exprimant des molécules de classe II du CMH après
stimulation par l’INFγ ou des mastocytes. Les LTs CD8+, quant à eux, interagissent avec
toutes les cellules exprimant des molécules de classe I du CMH. Cette interaction induit
une lyse de la CPA par cytotoxicité et/ou la synthèse de différentes cytokines (INFγ,
TNFα).
De plus, les monocytes/macrophages peuvent par leur capacité phagocytique
absorber des bactéries, parasites, levures et débris cellulaires. Puis, les peptides
antigéniques résultants de la destruction des absorbas exogènes peuvent être présentés par
le CMH de classe II aux LT CD4+ et induire une réponse T spécifique (cf. chapitre 1 :
4.3.6.2).
64
4.1.3 Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
L’ensemble des gènes du CMH code pour des molécules qui s’expriment à la
surface des cellules. Ces molécules appartiennent chez l’humain au système HLA («
Human Leukocyte Antigen »). Ce système est impliqué fortement dans le rejet des greffes
inter espèces non identiques génétiquement (allogéniques). Les gènes HLA se retrouvent
sur le chromosome 6 (bande p 21.3), tandis que chez la souris, les gènes codant pour les
CMH sont appelés H-2 et se retrouvent sur le chromosome 17 (Benjamini 1996). Le CMH
a une organisation relativement conservée au sein des espèces animales. Il s’agit d’un
système multigénique, multiallélique, d’expression codominante. Le CMH comprend 3
classes de gènes qui s’assemblent pour former des molécules différentes : CMH de classe I,
II et III. Les locus du CMH de classe I inclus les gènes HLA-A, B et C pour l’humain et H2K, D et L pour la souris. Les locus du CMH de classe II regroupent les gènes HLA-DP,
DQ, DR pour l’humain et I-A, I-E chez la souris. Les gènes des CMHs de classe III codent
entre autre pour des facteurs impliqués dans le système du complément. Les molécules des
CMH de classe I sont des glycoprotéines hétérodimériques transmembranaires composées
d’une chaîne α de 44 kDa et d’une chaîne légère appelée β2-microglobuline (β2M, non
codée par le locus CMH) de 12 kDa. La partie extracellulaire de la chaîne α est divisée en
trois domaines globulaires : α1, α2 et α3. Les domaines α1 et α2 servent à la liaison d’un
antigène et sont des régions variables, tandis que le domaine α3 est essentiellement
conservé. La variabilité des domaines α1 et α2 permet la liaison d’un grand nombre de
peptides aux molécules de CMH. Les CMH de classe I sont exprimés sur toutes les cellules
somatiques et leur reconnaissance est restreinte aux lymphocytes CD8+. Les peptides,
présentés par les CMHs de classe I, sont endogènes. C’est à dire qu’ils sont généralement
synthétisés à l’intérieur de la cellule à l’instar des antigènes viraux. Ces antigènes sont
découpés en peptides par le protéasome dans le cytosol. La longueur des peptides capables
de se lier à la niche peptidique du CMH de classe I varie de 10 à 20 acides aminés. Le
polymorphisme de la niche peptidique des différents allèles permet ainsi différentes
affinités à différents peptides. D’autres résidus polymorphiques de la molécule de classe I
forment des contacts avec les TCRs. Ainsi, les TCRs interagissent spécifiquement avec les
CMHs et le peptide qu’ils présentent. Les CMHs de classe II sont composés de deux
65
chaînes polypeptidiques non covalentes (α et β). Ces deux chaînes sont codées aux locus
des CMHs de classe II. Comme les molécules de classe I, les CMHs de classe II possèdent
un polymorphisme élevé et chaque allèle est exprimé en co-dominance. Cette expression
co-dominante permet l’association des chaînes α et β des deux allèles, générant ainsi
plusieurs molécules différentes pouvant être exprimées à la surface d’une même cellule. La
distribution des molécules de classe II est plus limitée que celle de classe I. Les molécules
de classe II s’expriment de manière constitutive et seulement sur les cellules comme les
LBs, les cellules dendritiques et les cellules de l’épithélium thymique. L’ensemble de ces
cellules appartenant à la famille des CPAs. Plusieurs autres types cellulaires dont les
macrophages et les myoblastes expriment le CMH de classe II sous induction par des
facteurs comme l’INFγ. Les molécules de classe II se retrouvent également sur les LTs
humains activés, mais sont absents chez la souris. La liaison d’un CMH de classe II est
restreinte à un TCR exprimé sur les lymphocytes T CD4+. La fonction phagocytaire des
CPAs, exprimant les CMHs de classe II, permet la présentation de peptides exogènes par
ces molécules. Les particules phagocytées par les CPAs se retrouvent dans les endosomes
pour être clivées par des protéases. Les endosomes fusionnent avec les vésicules de
l’appareil de Golgi contenant les CMHs de classe II (Abbas et al 1991). Les CMHs de
classe II se retrouvent ensuite à la surface des CPAs pour permettre une présentation d’Ags
aux lymphocytes T.
4.1.4 Immunobiologie du muscle
La liste des principaux acteurs du sytème immunitaire venant d’être dressée, il est
intéressant, dans le contexte de cette thèse, d’établir un lien entre ces derniers et le tissu
musculaire. En effet, le muscle peut, dans certaines circonstances, être le terrain de
réactions immunitaires. Cet état survient dans le cas de maladies autoimmunes,
d’infections, de dommages musculaires et lors de l’application de traitements tels que les
thérapies cellulaire ou génique (Dalakas & Hohlfeld 2003; Prud'homme et al 2001; Vincent
2002). Outre la participation classique des cellules du système immunitaire dans ces
réactions, le muscle devient lui-même acteur de ces réponses immunitaires intramusculaires
(Hohlfeld & Engel 1994). Ce rôle actif du muscle repose principalement sur l’expression,
par les myoblastes ou par les fibres musculaires, des molécules du CMH et de
costimulation (Nagaraju 2001). De plus, la capacité des myoblastes à sécréter des
66
cytokines, des chémokines ainsi qu’à exprimer des molécules d’adhésion cellulaires vient
renforcer le degré de participation du tissu musculaire dans la réaction immunitaire
impliquées dans la phase de l’inflammation (Figarella-Branger et al 2003; Nagaraju 2001)
(Figure 14).
67
(Heinz Wiendl et al. 2005)
Figure 14 : Immunobiologie du muscle. Ce schéma représente toutes les molécules
exprimées ou sécrétées par un myoblaste de façon constitutive ou induite.
68
4.1.4.1 Le muscle exprime les CMHs classiques de type I, II et non classique de type
HLA-G
Les myoblastes humains expriment constitutivement le CMHI (HLA-A,-B,-C)
(Goebels et al 1992; Hardiman et al 1993; Hohlfeld & Engel 1990b; Mantegazza et al 1991;
Michaelis et al 1993; Nagaraju et al 1998; Roy et al 1991; Wiendl et al 2000). Le niveau
d’expression de ces molécules est augmenté en présence de cytokines proinflammatoires
(INFγ, TNFα, IL1-α; 1-β) et de chémokines (MIP-1α). Notons que la présence de TGF-β
provoque l’effet opposé (Marino et al 2003). Quant à l’INF-γ, il induit l’expression du
CMHII au niveau des myotubes et des myoblastes (Goebels et al 1992; Mantegazza et al
1991; Michaelis et al 1993). Il est intéressant de noter que dans les conditions
physiologiques, ni le CMHI, ni le CMHII ne sont exprimés par les fibres musculaires.
Cependant dans le cadre de certaines myopathies (polymyosite), l’expression du CMHI et
du CMHII est augmentée (Emslie-Smith et al 1989; Karpati et al 1988b). En dehors de
l’expression des CMH classiques, les myoblastes arborent dans certaines conditions le
CHMI « non-classique » appelé HLA-G. HLA-G est un CMH de classe Ib qui est relié
structurellement au CMHIa (HLA-A, -B, -C). Le rôle immunobiologique de ce CMH n’est
pas encore clairement connu, mais il est incontestablement impliqué dans le non-rejet du
fœtus par la mère (Carosella et al 2001; Diehl et al 1996). L’expression de cette molécule
de CMH a notemment été détectée dans les tissus musculaires provenant de patients atteints
de myopathies inflammatoires telle que la polymyosite. Cette expression serait
supposément reliée aux fortes concentrations en cytokines dans les tissus musculaires
atteints (Wiendl et al 2000). En exprimant à leur surface diverses molécules du CMH, les
myoblastes empruntent le costume des CPAs. Par ailleurs, le fait que leur machinerie de
présentation de l’Asg soit belle et bien fonctionnelle, vient renforcer cette idée (Ferrer et al
2004; Hohlfeld & Engel 1991; Inukai et al 2000; Kloetzel & Ossendorp 2004; Kumamoto
et al 1997).
4.1.4.2 Le muscle exprime d’autres molécules participant à la réaction immunitaire.
Nous avons vu que les myoblastes semblaient s’approprier un rôle de CPAs.
Cependant pour être réellement efficaces, d’autres molécules doivent venir compléter leur
profil de CPAs comme les molécules de costimulation, par exemple. Les myoblastes
n’expriment pas en culture les molécules de costimulation classique que sont le B7-1
69
(CD80) et le B7-2 (CD86) (Behrens et al 1998; Bernasconi et al 1998). L’INFγ et le TNFα
ne modifient pas ce profil de non-expression. Cependant, les myoblastes peuvent exprimer
d’autres molécules de costimulation. ICOS-L « Inducible Costimulator Ligand » appartient
à la famille B7. L’expression physiologique d’ICOS-L est faible voire néant dans le
muscle, mais forte en présence de TNFα, comme c’est le cas dans les myopathies
inflammatoires (Schmidt et al 2004; Wiendl et al 2003b). Le récepteur de cette molécule se
trouve sur les LTs activés. L’intéraction d’ICOS-L avec son récepteur favorise la
costimulation des LTs CD4 et CD8 (Greenwald et al 2005; Wiendl et al 2003b). Un second
membre de la famille des molécules B7, le B7-H1 est retrouvé sur les myoblastes stimulés
par l’INFγ. À l’opposé d’ICOS-L, B7-H1 inhibe l’activation des LTs CD4 et CD8 et réduit
leur production de cytokines (Chen 2004; Wiendl et al 2003a). Le CD40, autre molécule de
costimulation participant à la régulation de l’activation des LTs, est exprimé par les
myoblastes humains. Son niveau d’expression dépend des concentrations d’INFγ et de
TNFα auxquels les myoblastes sont exposés (Behrens et al 1998; Sugiura et al 2000).
Chez la souris, il a été observé que les fibres musculaires synthétisaient des
chemokines lors d’injection d’oligonucléotides contenant des motifs CpG non-méthylés.
Ces chemokines attirent les cellules impliquées dans la phase de l’inflammation et sécrétant
entre autre de l’INFγ (Stan et al 2001). Cette cytokine pousse alors les myotubes à exprimer
le CMHII et d’autres molécules impliquées dans la présentation de l’Ag. Ces résultats sont
particulièrement problématiques si nous considérons les thérapies impliquant l’injection
d’ADN nu (cf chapitre des thérapies géniques). Les « toll-like receptor » (TLR)
contribuent, via leur capacité à capter des pathogènes ou des signaux endogènes du danger,
à établir un lien entre la réponse immunitaire innée et adaptative. In vitro, les myoblastes
expriment constitutivement le TLR de type 3 (Schreiner et al 2006). La fixation d’ADN
double brin ou d’ARN double brin au TLR des myoblastes active la cascade dépendante du
NF-κB et augmente la sécrétion de nombreuses cytokines (Figure 14) (Schreiner et al
2006).
Ainsi, il existe une multitude de molécules exprimées ou sécrétées par le tissu
musculaire qui peuvent participer étroitement à des réactions immunitaires survenant dans
le muscle. La liste des ces molécules n’est pas exhaustive (Figure 14). Enfin, il reste
70
beaucoup d’études à effectuer pour établir clairement toutes leurs implications dans
l’inflammation ainsi que vis-à-vis des thérapies intentées dans le cadre des myopathies ou
dystrophies.
4.2 Transplantation et rejet immunitaire
4.2.1 Généralités
Le devenir d’un transplant dépend essentiellement de la réaction immunologique du
receveur vis-à-vis d’Ags de transplantation propres au donneur et portés par le greffon.
Parmi les nombreuses substances antigéniques faisant l’objet d’un polymorphisme au sein
d’espèces (allotypes), la transplantation a permis d’identifier un ensemble d’Ag tissulaires
codés par des gènes alléliques définissant des systèmes d’histocompatibilité. Par exemple,
le système des groupes sanguins A, B, O correspond à des molécules tissulaires très
fortement antigéniques. L’un de ces systèmes très impliqué dans le rejet des transplants par
le receveur est le CMH. Un ensemble d’autres systèmes d’histocompatibilité appelés
mineurs codent des Ags de transplantation qui sont soit des super antigènes (cf. chapitre 1 :
4.2.2.1.2.3) soit des Ags présentés sous formes de peptides en association avec les produits
du CMH du donneur ou bien du receveur.
La réaction immunologique du receveur envers les Ags portés par le greffon met en
jeu essentiellement des LTs et des Acs. Ces derniers, engagés dans une réaction du receveur
envers les Ags du donneur, induisent des lésions tissulaires caractéristiques. Également, il
survient des perturbations des fonctions biologiques du transplant, décrites sous le nom de
réaction de rejet ou de crise de rejet. Selon leurs mécanismes immunopathologiques et leur
intensité, ceux-ci peuvent être suraiguës, aiguës ou chroniques, réversibles ou irréversibles.
Lorsque le receveur est incapable de rejeter un greffon allogénique, par déficit
immunitaire pathologique ou consécutif à une immunosuppression, et si ce greffon contient
des LTs, ces derniers peuvent reconnaître les Ags du receveur et induire une réaction du
greffon contre l’hôte « graft versus host disease » (GVHD).
71
En transplantation on parle classiquement d’autogreffe lorsque donneur et receveur
sont le même individu, de greffes syngénique ou isogreffe lorsqu’ils sont génétiquement
identiques (jumeaux homozygotes), d’allogreffe lorsqu’ils sont génétiquement différents
mais de la même espèce et enfin de xénogreffe lorsqu’ils appartiennent à des espèces
animales différentes.
4.2.2 Transplantation d’organes
Tous les receveurs d’organes allogéniques sont soumis à un traitement
immunosuppresseur, maintenu tant que le transplant demeure fonctionnel. Les doses
d’immunosuppresseurs peuvent néanmoins être progressivement diminuées (phénomène
d’adaptation du greffon).
Le rejet suraigu se manifeste dans les heures qui suivent le rétablissement de la
continuité vasculaire par un infarctus du transplant, parfois associé à une coagulopathie de
consommation. L’un des mécanismes de ces rejets suraigus est la fixation sur l’endothélium
vasculaire d’Acs préformés chez le receveur. Ce type de rejet peut être évité en effectuant
antérieurement à la transplantation certains tests immunologiques qui permettent de
s’assurer (le plus souvent) de l’absence de ces Acs préformés.
Le rejet aigu survient à partir du 4ème jour après la greffe, il se traduit parfois par
des signes généraux (fièvre, malaise), des signes fonctionnels ou biologiques qui dépendent
de l’organe transplanté. Le mécanisme essentiel est une infiltration du greffon par des
cellules LTs du receveur. Une étude histologique du transplant montre des altérations
typiques du rejet aigu : LTs activés, éosinophiles, monocytes, augmentation de l’expression
des Ags, CMH présents sur l’endothélium et l’épithélium consécutive à la production locale
de cytokines (INFγ, TNFα). Les crises de rejet aigu constituent une urgence médicale, leur
réversibilité dépend de la précocité de leur traitement. La présence d’un infiltrat de cellules
mononucléées à la biopsie peut exister en l’absence de rejet et n’a pas de valeur
pronostique.
Les rejets chroniques se traduisent par la détérioration lente, progressive et
irréversible des fonctions du transplant. Les lésions histologiques associent une fibrose
72
périvasculaire et interstitielle et des lésions vasculaires. L’aspect agiographique est celui
d’un « arbre mort ».
4.2.3 Greffe de cellules souches hématopoïétiques
Les autogreffes de moelle osseuse s’adressent essentiellement à des malades atteints
de différentes formes de leucémies, lymphomes ou cancers métastatiques résistants aux
autres traitements. Les patients sont conditionnés par radiothérapie et/ou chimiothérapie à
dose létale ou supra létale, puis réinjectés avec leur propre moelle débarrassée des cellules
tumorales. Dans ce type de greffe, il n’y a évidemment pas de GVHD.
Les allogreffes peuvent s’adresser à des nourrissons atteints de diverses formes de
déficit immunitaire sévère, dont le système immunitaire pourra être reconstitué par apport
de cellules souches de la moelle osseuse. Cependant, dans l’immense majorité des cas, les
allogreffes de moelle osseuse sont réalisées chez des malades atteints de leucémies aiguës
ou de leucémies myéloïdes chroniques. Ces malades sont soumis à un lourd protocole
d’immunosuppression associant irradiation totale et chimiothérapie immédiatement avant la
greffe. Puis, la reconstitution de leur système immunitaire s’effectue progressivement.
Les principales complications de ces greffes sont la survenue de GVHD,
d’infections et de tumeurs. Les réactions aiguës de GVHD sont classées en 4 grades de
sévérités. Ces réactions se manifestent par la fièvre, divers signes cutanés, une hépatite
cholestatique et des lésions intestinales (diarrhées). Ces formes aiguës sont généralement
réversibles par administration d’immunosuppresseurs. Les GVHDs chroniques induisent
des signes cutanés, hématologiques, et des réactions auto-immunes. Les infections sont
typiquement des infections opportunistes à virus du groupe Herpès (en particulier
pneumopathies à cytomégalovirus), à bactéries encapsulées (Haemophilus influanzae) ou à
protozoaires (Janeway 2001). Des lymphomes associés au virus d’Epstein-Barr peuvent
apparaître sous immunosuppression intensive ou dans le cadre d’une GVHD chronique. Il
est important de noter que l’affaiblissement du système immunitaire dû à l’utilisation
indispensable et prolongée d’immunosuppresseurs favorise le développement de ces
infections opportunistes.
73
4.2.4 La greffe de peau
Les allogreffes de peau font l’objet d’un épaississement et d’une induration du 6ème
au 8ème jour par infiltration périvasculaire du derme par des cellules mononucléées
(lymphocytes, macrophages). La peau greffée se nécrose du 8ème au 10ème jour. Enfin,
l’élimination du greffon fait place à la cicatrisation. Les temps moyens de survie des
allogreffes atteignent 3 à 4 semaines chez les brûlés du fait du déficit immunitaire. Les
greffes d’épiderme cultivé in vitro (kératinocytes dépourvus de cellules de Langerhans
déposés sur une couche de collagène) ne sont, en principe pas rejetées.
4.2.5 Immunologie de la réaction d’allogreffe
4.2.5.1 Lois de la transplantation
Le développement de lignées de souris consanguines, homozygotes au niveau du
CMH, a permis de réaliser les observations suivantes connues sous le nom de « lois de la
transplantation », qui s’appliquent aux animaux non traités par des immunosuppresseurs
(Figure 13).
Les greffes, isogéniques entre deux souris d’une même lignée n’induisent pas de
rejet. Les greffes allogéniques entre deux lignées incompatibles pour le CMH induisent le
rejet aigu irréversible d’une greffe. Ce rejet est plus tardif si l’incompatibilité ne porte que
sur des systèmes mineurs d’histoincompatibilité. Une deuxième greffe du même donneur
est rejetée plus rapidement, ce qui implique l’induction d’une mémoire immunologique
spécifique vis-à-vis des Ags d’histocompatibilité du donneur. Par ailleurs, les greffes de
chaque lignée parentale à un hybride de première génération sont acceptées, alors que les
greffes de l’hybride à l’une ou l’autre des lignées parentales sont rejetées. Ce phénomène
correspond au fait que l’expression des produits du CMH des deux haplotypes de l’hybride
est co-dominante, chaque cellule de l’organisme exprime les Ags des deux lignées
parentales. Il est important de noter que le rejet est dû aux LTs. En effet, il n’apparaît pas
dans les souris athymiques.
74
4.2.5.2 Présentation des allo-antigènes
L’activation des LTs allo-réactifs du receveur par les Ags de transplantation du
donneur met en jeu deux mécanismes complémentaires : la reconnaissance indirecte et la
reconnaissance directe.
La reconnaissance directe fait intervenir des CPA du donneur (cellules dendritiques
tissulaires, endothélium vasculaire ou cellules épithéliales stimulées par de l’INFγ au cours
d’une crise de rejet). Les TCRs des LTs CD4+ et CD8+ interagissent par réaction croisée,
avec des complexes peptides/molécules du CMH du greffon.
75
Figure 15 : Lois de la transplantation.
76
La reconnaissance indirecte fait intervenir les CPAs du receveur. Les peptides associés aux
molécules de classe II du CMH proviennent des protéines solubles et des protéines
cellulaires libérées lors de la cytolyse des cellules du donneur. Les peptides associés aux
molécules de classe I dérivent quant à elles des protéines synthétisées par des cellules du
transplant. Les protéines polymorphiques au sein de l’espèce (codées par des gènes
alléliques) ainsi que les protéines d’agents infectieux localisés dans le greffon (cas du
cytomégalovirus) peuvent interagir avec des LTs du receveur. Ce type d’activation
indirecte des LTs joue un rôle important dans les rejets aigus tardifs et les rejets chroniques.
4.2.5.3 Mécanismes effecteurs de la réaction de rejet.
Trois composantes interviennent dans la dégénérescence du transplant : la
production de cytokines, les cellules T cytotoxiques alloréactives et les alloanticorps.
Les LTs CD4+ allo-réactifs, stimulés par les Ags couplés au CMH de classe II
portés par l’endothélium du greffon, les cellules dendritiques (exemple : cellules de
Langerhans de l’épiderme) et les cellules CD8+, activées par les Ags couplés au CMH de
classe I, produisent une première vague de cytokines (IL-2, INFγ, TNFα). Puis, ces
cytokines stimulent à leur tour la production d’IL-1, de TNF, d’IL-6 et d’IL-8 et
l’expression d’Ag présentés par le CMH de classe II présent sur les cellules endothéliales.
La deuxième vague de cytokines augmente la perméabilité vasculaire et provoque
l’infiltration caractéristique par les cellules mononucléées et, à plus long terme, la
prolifération endothéliale.
Les cellules T cytotoxiques détruisent les cellules du transplant par reconnaissance
des Ags associés au CMH de classe I. En effet, cette reconnaissance engendre la synthèse
de lymphokines (granzyme, perforine, TNF…), qui vont provoquer la mort des cellules du
transplant. En plus de cette réaction spécifique, d’autres cellules (monocytes,
polynucléaires neutrophiles et éosinophiles) stimulées par les cytokines, peuvent participer
à la lyse des cellules du greffon.
Enfin, les allo-anticorps se fixent sur les Ags du transplant. Le recouvrement des
cellules du donneur par ces allo-anticorps (opsonisation) peut engendrer leur phagocytose,
par les macrophages tissulaires, mais également leur lyse, par fixation du complément. Bien
77
que les principes de lyse cellulaire induite par le complément ne soient pas abordés dans
cette thèse, il est important de mentionner ce mécanisme qui est en outre responsable des
lésions vasculaires qui surviennent dans le cadre du rejet chronique d’un organe.
Cette relation étroite entre le système immunitaire et la survie du greffon est à
l’origine d’une des principales barrières biologiques auxquelles se heurte le développement
de la transplantation de cellules myogéniques.
4.3 La transplantation de cellules myogéniques (TM)
La transplantation de cellules myogéniques (TM) se définit par l’injection à un
patient dystrophique de cellules, provenant d’un donneur sain, capables de ce différencier
en tissus musculaires striés et de réparer les fibres lésées des patients. Les principes de cette
approche datent du début des années 1980 (Partridge et al 1978). Le terrain d’étude de la
TM est essentiellement le muscle strié squelettique ainsi que le muscle cardiaque. Par ce
biais, cette thérapie vise premièrement à ralentir voir à arrêter la dégénérescence
musculaire. Puis, s’appuyant sur le contrôle de la détérioration musculaire, la TM s’attelle à
restaurer la capacité musculaire des patients traités. Pour parvenir à répondre à ces attentes,
la TM repose sur deux dogmes : la complémentation génique et le renforcement de la
capacité myogénique des muscles traités (Figure 14) (Skuk et al 2000)
4.3.1 Complémentation génique
Lipton et Schultz furent les pionniers de la TM (Lipton & Schultz 1979). Ils
observèrent que l’injection de cellules musculaires conduisait à la formation de deux types
de fibres musculaires. Premièrement, ils distinguèrent des fibres de petites tailles
constituées des cellules injectées. Deuxièmement, ils décrivirent un autre type de fibres.
Les cellules musculaires du donneur avaient été incorporées par les fibres du receveur. Ils
les nommèrent : fibres hybrides. Un phénomène de complémentation génique survenait au
sein des ces fibres. En effet, le syncytium des fibres hybrides contenait des protéines codées
par les noyaux de l’hôte et par ceux du donneur (protéines exogènes) (Skuk 2004). Dans le
contexte de la DMD, la déficience en dystrophine pouvait de ce fait être compensée au sein
des fibres hybrides. Cette complémentation s’est vérifiée chez la souris mdx pour la
dystrophine, chez la souris dy/dy pour la mérosine (un modèle murin de dystrophie
78
congénitale caractérisée par l’absence de mérosine) et chez la souris SJL pour la dysferline
(un modèle murin de dysferlinopathie) (Leriche-Guerin et al 2002; Partridge et al 1989;
Vilquin et al 1996). Le principe de complémentation génique fut également et
indiscutablement confirmé en 1995 chez des patients atteints de DMD par l’équipe de
Mendell (Mendell et al 1995). Plusieurs autres études cliniques vinrent par la suite appuyer
ce résultat (Skuk et al 2006; Skuk et al 2004).
79
Figure 16 : La transplantation de myoblastes. La cible du transfert de myoblastes (ou de
cellules myogéniques) est le muscle squelettique. (1) Le tissu musculaire peut être prélevé
d'un donneur. (2) Les cellules satellites, situées en périphérie des fibres musculaires (3),
peuvent être cultivées et proliférées in vitro (4). Après avoir obtenu un nombre suffisant de
cellules, elles peuvent être implantées dans le muscle (5) pour participer à la régénération
induite au site d’injection par les dommages causés par les injections. Avant la
transplantation, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour exprimer des gènes
traceurs (comme la β-galactosidase) ou des gènes candidats comme la dystrophine. Le
panneau (6) montre une coupe transversale des fibres multinucléées générées dans le biceps
d'un singe greffé avec des cellules marquées à la β- Galactosidase.
Skuk et al 2000.
80
Chez la souris mdx, l’expression de dystrophine par complémentation a permis de
protéger les fibres musculaires à l’effort physique (Brussee et al 1998). De plus, le nombre
de fibres exprimant la dystrophine semblait se maintenir dans le temps par rapport aux
fibres ne l’exprimant pas (Morgan et al 1993). Cependant, la complémentation génique ne
permet pas d’assurer une expression des protéines exogènes dans l’ensemble de la fibre
hybride. L’expression est localisée au site nucléaire (domaine nucléaire) des noyaux du
donneur qui ont fusionné sporadiquement le long de la fibre du receveur (Pavlath et al
1994). Cette restriction dépend de la capacité des protéines à se détacher ou à s’ancrer sur
les divers composants stationnaires des myotubes (Hall & Ralston 1989). En outre, la
dispersion des ARNms qui codent pour la dystrophine se limite autour du noyau qui les a
produit (Ralston & Hall 1992). Chez la souris mdx ayant subi une TM, le domaine
nucléaire de la dystrophine exogène a été estimé à 500 µm de long (Kinoshita et al 1998).
4.3.2 Renforcement de la capacité myogénique
La force produite par un muscle est proportionnelle aux nombres et aux diamètres
de ses fibres musculaires. Dans le cadre des myopathies, plus spécifiquement de la DMD,
la diminution du nombre de fibres musculaires et de leurs tailles est particulièrement
marquée et croissante au cours de l’évolution de la maladie. De ce fait, il semble évident
que plus la succession de phases dégénératives et régénératives du muscle s’opèrent, plus la
quantité de noyaux exogènes incorporés par les fibres du receveur devrait augmenter. La
résultante de ce phénomène devrait être une augmentation de la force des muscles traités.
Ce principe a été démontré chez des souris ayant subi des dommages musculaires
irréversibles (cryo-dommages, irradiation). Ainsi, la perte de masse musculaire engendrée a
été restaurée à la suite d’une TM (Alameddine et al 1994a; Alameddine et al 1994b;
Irintchev et al 1997a; Irintchev et al 1997b; Wernig & Irintchev 1995; Wernig et al 2000).
Ce concept laisse à penser qu’un patient atteint de DMD, dont l’évolution de la maladie est
assez avancée pourrait retrouver sa capacité musculaire. Néanmoins, ce principe se base sur
une présence encore suffisante de fibres des patients.
Par ailleurs, des expériences effectuées chez la souris renforcent l’idée que les
cellules musculaires injectées sont recrutées aux cours des phases régénératives se
81
déroulant bien après leur injection (Gross & Morgan 1999; Yao & Kurachi 1993). Ainsi les
cellules exogènes injectées peuvent être considérées comme une source potentielle de
cellules satellites (Heslop et al 2001). Ce résultat est d’un intérêt primordial pour justifier la
TM comme approche thérapeutique. En effet, une seule séance de plusieurs TM pourrait
avoir un effet à long terme sur les patients traités, les cellules injectées participant
continuellement à la régénération musculaire des patients. Subséquemment à une TM, il a
été observé chez des patients atteints de DMD que plusieurs cellules issues du donneur
pouvaient se positionner et rester autour des fibres du patient. Ce résultat intéressant vient
étayer la possibilité de retrouver des cellules musculaires injectées en position de cellules
satellites (Gussoni et al 1997).
4.3.3 Les limites de la transplantation de cellules myogéniques
4.3.4 Premiers essais difficiles
L’engouement provoqué par les résultats obtenus chez la souris (Morgan et al 1987;
Morgan et al 1990; Partridge et al 1989), précipita les premiers essais cliniques de TM.
Malheureusement, ces premières tentatives donnèrent des résultats assez peu convaincants
(Huard et al 1991; Huard et al 1992; Karpati et al 1993; Karpati et al 1992; Mendell et al
1995; Miller et al 1997; Neumeyer et al 1998; Tremblay et al 1993). L’analyse des sites
d’injection ne révélait que peu de fibres exprimant de novo la dystrophine. De plus, la
détection spécifique de la dystrophine d’origine du donneur n’étant pas effectuée, il était
difficile de tirer des conclusions claires quant à l’origine de la dystrophine observée (Skuk
2004). Néanmoins, la présence de dystrophine chez les patients traités, même faible,
encouragea les chercheurs à déterminer quelle pouvait être l’origine des limitations de la
TM chez l’homme. Ainsi, les résultats obtenus grâce à l’expérimentation animale, dans son
ensemble, amenèrent à la conclusion suivante.
82
La transplantation de cellules myogéniques est limitée par :
la capacité myogénique des cellules transplantées,
le mode d’administration des cellules à transplanter,
la survie des cellules injectées.
4.3.5 Quelles cellules transplanter ?
Indubitablement, les cellules utilisées à des fins de transplantation peuvent être soit
des cellules différenciées, soit indifférenciées. Les cellules différenciées doivent être
similaires à celles qui constituent le parenchyme de l’organe ou du tissu ciblé. Les cellules
indifférenciées doivent être capables de se spécifier en cellules qui constitueront le
parenchyme de l’organe ou du tissu ciblé. En raison leurs caractéristiques propres, les
cellules différenciées qui composent le tissu musculaire squelettique ne peuvent être
transplantées. Les myotubes sont longs, et leur syncytium très spécialisé ne peut leurs
permettre d’entrer en mitose. De ce fait, le succès d’une TM repose sur l’utilisation de
cellules indifférenciées présentant incontestablement une capacité myogénique. Il existe
plusieurs types de cellules qui offrent cette capacité. Ces cellules participeraient toutes plus
ou moins à la phase physiologique de régénération musculaire (Charge & Rudnicki 2004).
La difficulté à bien définir ces différents types cellulaires amène une certaine variabilité
quant aux résultats de leur transplantation. Néanmoins, leur utilisation offre divers
avantages thérapeutiques.
Par ailleurs, il est important de noter que dans le cadre de cette thèse, la
transplantation de cellules myogéniques est basée sur la transplantation de myoblastes
(TM). Les diverses sections suivantes apporteront plus de précisions quant aux myoblastes,
mais permettront aussi de couvrir l’ensemble des types cellulaires utilisés dans le cadre des
TMs.
4.3.5.1 Cellules myogéniques résidentes du tissu musculaire strié
Le tissu musculaire squelettique bien que nettement différencié, possède en son sein
des cellules satellites. Ces cellules mononuclées sont accolées au sarcolemme et englobées
par la lame basale qui entoure chaque fibre musculaire (Mauro 1961). Comme cela a été
83
abordé précédemment (cf. chapitre 1 : 1.1.1.1 et 1.1.1.3.2), les cellules satellites constituent
un réservoir de cellules myogéniques impliquées dans la régénération musculaire ainsi que
dans l’embryogenèse. Les cellules mononuclées résultantes de l’activation et de la
prolifération des cellules satellites vont devenir des myoblastes (Lewis 1915). Ces
myoblastes vont enfin se différencier en myocytes et fusionner entre eux ou avec les fibres
musculaires lésées. Les cellules satellites peuvent être isolées in vitro à partir d’une biopsie
musculaire par digestion enzymatique. Elles peuvent proliférer en culture et fusionner en
myotubes (Konigsberg 1960). Il a été aussi démontré que l’injection de myoblastes issus de
culture primaire conduisait à l’expression de protéines du donneur dans le tissu musculaire
squelettique de singes (Kinoshita et al 1996; Kinoshita et al 1995a; Skuk et al 2000; 2002b;
Skuk et al 1999b) et d’humains (Mendell et al 1995; Skuk et al 2004).
Diverses expériences, réalisées chez la souris, soulèvent l’existence d’autres sous
populations cellulaires présentant des capacités myogéniques similaires aux myoblastes.
Ces cellules n’auraient pas pour origine les cellules satellites mais pourraient entre autre
provenir des péricytes qui sont juchés autour du système vasculaire (Asakura et al 2002;
Tamaki et al 2002). Quoiqu’il en soit, qu’ils soient originaires des cellules satellites ou non,
les myoblastes représentent une population cellulaire d’intérêt pour la fonctionnalité
thérapeutique d’une TM. En outre, il est possible d’obtenir une culture cellulaire enrichie
en myoblastes à partir d’une biopsie musculaire. Cette purification est possible grâce à
l’expression de certains marqueurs de surfaces exprimés par les myoblastes. Ainsi, chez le
singe (Skuk et al 2000), le chien (Ito et al 1998b), la souris (Belles-Isles et al 1993) et chez
l’homme (Huard et al 1994b), les cultures primaires de cellules musculaires ont pu être
enrichies en myoblastes. Les cultures primaires de souriceaux sont particulièrement riches
en fibroblastes. Les fibroblastes ont la particularité d’adhérer rapidement aux pétris de
culture par rapport aux myoblastes. Il est ainsi possible de récupérer les cellules non
adhérentes afin d’enrichir la culture cellulaire en myoblastes (Polinger 1970; Yaffe 1968).
La facilité à obtenir des cultures primaires de myoblastes associée à leur potentiel
myogénique avéré, a conduit à l’aboutissement d’essais cliniques dont les résultats étaient
assez prometteurs (Charge & Rudnicki 2004; Skuk et al 2004).
84
Récemment, certaines équipes de recherche focalisent leurs efforts sur des cellules
souches présentes dans le tissu musculaire squelettique de souris. Il s’agit des cellules
MDSCs, « muscle derived stem cells ») qui offrent une certaine plasticité cellulaire. Les
MDSCs offrent des capacités ostéogéniques, adipogéniques, chondrogéniques et
hématopoïétiques (Deasy et al 2001). De plus, les MDSCs possédant une forte capacité
prolifératrice (Deasy et al 2001), leur confère un avantage pour le développement de
thérapies géniques. En effet, comme cela a été évoqué dans l’ensemble de la sectiona 3.2, la
thérapie génique s’accompagne souvent d’une réponse immunitaire dirigée contre les
vecteurs utilisés pour modifier génétiquement les cellules. Une manière de contourner
partiellement le problème est de combiner la thérapie génique et cellulaire. Cette
combinaison est appelée : thérapie génique ex vivo. Par ce biais, des cellules isolées à partir
d’une biopsie musculaire d’un patient atteint de DMD peuvent être modifiées
génétiquement in vitro. Cette modification cellulaire s’effectue à l’aide de vecteurs viraux
ou plasmidiques et permet une restauration de l’expression la dystrophine. Les cellules
modifiées sont par la suite transplantées. Ainsi dans le cadre de cette transplantation
autologue, seul le transgène est exogène au receveur, limitant la réaction immunitaire
(Quenneville et al 2004). Cette approche nécessite une modification des cellules
transplantées sans altération de leur capacité myogénique (Quenneville et al 2004). De plus,
les cellules d’intérêt doivent posséder originellement une bonne capacité myogénique
(Skuk 2004). Malheureusement, les cellules myogéniques qui sont issues de patients DMD
n’ont qu’un faible potentiel prolifératif (Webster & Blau 1990). Ainsi, l’utilisation des
MDSCs, présenterait un avantage indéniable, subséquemment à leur fort potentiel
prolifératif, dans le développement de la thérapie génique ex vivo.
En outre, certaines études suggèrent que les MDSCs seraient à l’origine de la
formation cellules satellites (Seale et al 2000). Chez la souris, la transplantation de ces
cellules souches, bénéficiant d’un meilleur potentiel prolifératif (Deasy et al 2001), semble
donner de meilleurs résultats que la TM (Deasy et al 2001). De plus, le nombre de fibres
positives pour la dystrophine comptabilisées dans des muscles de souris mdx, transplantés
avec ces cellules souches était 10 fois supérieur à celui observé dans des muscles
transplantés avec des myoblastes (Qu-Petersen et al 2002). Toutefois, ce résultat fut
controversé par un autre groupe de recherche qui ne vit aucune différence selon le type de
85
cellules injectées (Mueller et al 2002). Cette dissimilitude des résultats serait peut être liée à
l’insuffisance d’études physiotypiques préalables à l’injection des MDSCs (Charge &
Rudnicki 2004). Pour l’instant, la difficulté à établir une définition précise des marqueurs
caractérisant les cellules souches d’origine musculaire freine leur éventuelle utilisation en
clinique. Plusieurs études fondamentales restent à effectuer pour mieux les caractériser.
4.3.5.2 Cellules myogéniques non résidentes du muscle
4.3.5.2.1
Cellules issues de la moelle osseuse
La participation à la régénération musculaire de cellules issues de la moelle osseuse
fut démontrée au début des années 80 (Meyer & Yarom 1983). Depuis, plusieurs travaux
ont mis en évidence la capacité de cellules issues des lignées hématopoïétique et stromale à
se différencier in vitro en cellules de la lignée myogénique (Bittner et al 1999; Ferrari et al
1998; Gussoni et al 1999; LaBarge & Blau 2002).
L’importance de la différenciation de cellules de la lignée hématopoïétique en
cellules myogéniques ne réside pas seulement dans la diversification de disponibilité de
sources cellulaires aptes à être employées dans le cadre d’une TM. Pour traiter
complètement un patient dystrophique avec une thérapie cellulaire, cela impliquerait que
tous les muscles soient traités. L’administration systémique de cellules à capacité
myogénique réduirait ainsi considérablement le niveau de difficulté d’une thérapie
cellulaire. Une étude encourageante chez la souris mdx confirma qu’une administration
systémique de cellules souches hématopoïétiques, issues de souris non dystrophiques,
conduisait à l’apparition de quelques fibres dystrophiques dans quelques muscles (Ferrari et
al 1998; Gussoni et al 1999). Cependant, le nombre de fibres positives pour la dystrophine
étant excessivement faible subséquemment à cette administration systémique n’argumentait
pas en la faveur d’un développement thérapeutique possible de cette méthode. De plus, une
étude effectuée chez un patient dystrophique vint étayer le manque d’efficacité de cette
approche. En effet, souffrant également d’une déficience immunitaire liée au chromosome
X, un patient DMD reçu une greffe de moelle osseuse à l’age d’un an. Néanmoins, peu de
fibres exprimant de la dystrophine étaient distinguables 13 ans plus tard (Gussoni et al
2002). Pour parachever le tout, l’enrichissement de la moelle en cellules exprimant des
protéines spécifiques aux cellules du muscle squelettique (matures ou non) ne permit pas de
86
potentialiser l’approche (Corti et al 2002). Ces résultats décevant pourraient s’expliquer par
la faible participation des cellules souches hématopoïétiques dans le cadre d’une
régénération musculaire (Grounds 1983; Robertson et al 1992; Rosenblatt & Parry 1992;
Schultz et al 1986; Wakeford et al 1991; Weller et al 1991).
Par ailleurs, il a été démontré chez la souris que les cellules mésenchymateuses de la
moelle osseuse (cellules stromales) étaient capables de se différencier en myotubes
(Grigoriadis et al 1988; Wakitani et al 1995). Inopportunément, il semblerait que l’injection
de ces cellules mésenchymateuses chez le singe ne semble pas conduire à leur
différenciation en cellules musculaires (Skuk & Tremblay 2003).
4.3.5.2.2
Autres cellules ?
Les fibroblastes sont des cellules faciles à cultiver et faciles à prélever. Le gène
MyoD1 (cf. chapitre 1 : 1.1.1.1) est un gène important pour le développement
embryologique du tissu musculaire. Il est également impliqué dans la différenciation des
cellules satellites en myocytes. L’introduction de MyoD1 dans des fibroblastes leur a donné
des capacités myogéniques (Huard et al 1992). Une fois transplantés dans des muscles de
souris, les fibroblastes exprimant MyoD1 sont capables de fusionner (faiblement) avec des
myotubes de la souris hôte (Huard et al 1998). En outre, la galectine-1, (une lectine sécrétée
par les myoblastes et les myotubes in vitro) est capable de modifier les fibroblastes issus du
derme en cellules myogéniques (Goldring et al 2002). L’ensemble de ces études donne un
bon espoir quant à l’utilisation de fibroblastes comme cellules myogéniques. Il reste
néanmoins beaucoup de travail à effectuer avant de penser à cette possibilité pour une
éventuelle approche clinique.
4.3.6 Comment les transplanter ?
Les patients atteints de DMD présentent une déficience en dystrophine qui touche
l’ensemble des muscles striés. Or le tissu musculaire constitue un ensemble tissulaire plutôt
vaste puisqu’il représente 40 à 50 % du poids d’un individu adulte (Franzini-Armsrong
1994). De ce fait, les thérapies cellulaires envisagées se doivent pour être efficaces de
« semer » les cellules d’intérêts dans des « champs » musculaires les plus étendus
possibles. Pareillement, la technique de distribution utilisée ne doit pas entraver la capacité
myogénique des cellules mais au contraire et idéalement l’augmenter.
87
4.3.6.1 Administration systémique
L’importance de la vascularisation du système musculaire confère à l’administration
systémique de cellules myogéniques le statut de solution idéale pour le développement
d’une thérapie cellulaire. Notamment, cette stratégie de distribution cellulaire permettrait
d’atteindre des muscles importants (cœur, diaphragme) et pourtant difficiles d’accès pour
des injections intramusculaires. Pour l’instant les résultats obtenus chez les modèles murins
sont toutefois peu convaincants. En effet, l’injection de myoblastes, que cela soit par voie
intra veineuse ou intra péritonéale, s’avère pour l’instant infructueuse (Partridge 1991). La
délivrance de cellules myogéniques par voie intra artérielle donne par contre des résultats
plus convaincants. Mais, ces résultats dépendent de la provocation simultanée de
dommages aux fibres musculaires et aux vaisseaux qui leurs sont juxtaposés (Neumeyer et
al 1992; Torrente et al 2001). Cette condition au bon fonctionnement de l’administration
intra artérielle, réduit de ce fait l’avantage de cette approche par rapport aux injections
intramusculaires. L’utilisation de cellules myogéniques qui seraient capables de migrer du
sang vers le muscle et ce dans un contexte ne nécessitant ni dommages vasculaires ou
musculaires pourrait remédier au problème. Une récente étude effectuée chez la souris,
montre que les mésangioblastes, cellules isolées à partir des vaisseaux sanguins présents
dans le tissu musculaire squelettique, offriraient cette capacité migratoire (Sampaolesi et al
2005; Sampaolesi et al 2003). Ces résultats ont été confirmés chez le chien dystophique
(Sampaolesi et al 2006). Cette nouvelle avenue thérapeutique basée sur les mésangioblastes
offre de grandes possibilités. Cependant, il faudrait être capable de confirmer le potentiel de
ces cellules chez l’homme et ne pas oublier que l’administration de ces cellules par voie
systémique pourrait engendrer de graves problèmes si ces cellules venaient à se loger dans
les poumons par exemple. En effet, 3 des chiens ayant reçu ces cellules en systémique sont
décédés suite à des complications d’ordre pulmonaire.
4.3.6.2 Administration localisée
La distribution de myoblastes par injection intramusculaire (Figure 14) est
classiquement la méthode utilisée dans le contexte des TMs. Plusieurs avantages sont
associés à l’injection de myoblastes dans le tissu musculaire strié. Premièrement, cette
méthode permet de délivrer, dans le muscle traité, un nombre suffisant de myoblastes et de
s’assurer ainsi de la formation de fibres hybrides ou de néo fibres à un niveau appréciable
88
(Skuk 2004; Skuk & Tremblay 2003). Deuxièmement, l’injection en elle-même provoque
une succession de bris au niveau musculaire. La déstructuration éparse de la matrice
extracellulaire, qui en résulte, ouvre une voie physique aux cellules injectées leur
permettant d’approcher les myotubes de l’hôte. Parallèlement, la rupture des myotubes
augmente leur probabilité d’incorporer les cellules myogéniques injectées. Enfin,
conséquemment à l’injection, le processus physiologique de régénération musculaire qui
s’instaure va lui aussi faciliter la fusion des cellules du donneur avec les myotubes du
receveur (Charge & Rudnicki 2004).
Malgré ces traits plutôt avantageux, l’injection intra musculaire de myoblastes est
néanmoins affublée d’un point limitant. En effet, la dispersion des cellules après leur
injection est quasiment nulle. De ce fait, les cellules du donneur fusionnent majoritairement
avec des fibres du receveur qui sont proches des sites d’injections (Skuk et al 2000; 2002b).
Ces observations effectuées sur la souris et le singe furent confirmées dans le cadre
d’injections de myoblastes réalisées sur des patients atteints de DMD (Skuk et al 2004).
Cette constatation pourrait entre autres expliquer la faible efficacité des premières TMs
effectuées en clinique où les injections de myoblastes étaient peu nombreuses et trop
distancées par rapport au volume musculaire greffé. Deux facteurs incontournables
participent à l’amenuisement des TMs effectuées en intra-musculaire. Tout d’abord, les
myoblastes injectés n’ont qu’une faible capacité à migrer dans le muscle (El Fahime et al
2002). Ensuite, les myotubes situés en dehors des trajectoires d’injections ne sont pas
nécessairement endommagés, et de ce fait n’offrent pas aux cellules injectées de participer
à un processus de régénération musculaire (Skuk 2004). Plusieurs travaux effectués sur les
modèles murins ont démontré qu’il était possible d’augmenter la capacité migratoire des
cellules myogéniques injectées (Caron et al 1999; Huard et al 1994a; Ito et al 1998a). Par
contre, ces résultats n’ont pas été encore reproduits dans d’autres modèles d’animaux
comme le singe. Enfin pour favoriser la fusion des myoblastes injectés avec les fibres de
l’hôte, deux procédés sont utilisés seuls ou en combinaison chez la souris. L’injection de
notexine (Huard et al 1994b; Skuk et al 1999a; Vilquin et al 1995), avant ou simultanément
à l’injection de myoblastes, (phospholipase myotoxique issue extraite d’un venin de
serpent) permet de détruire les fibres musculaires et favorise ainsi le processus de
régénération musculaire. La bupivicaïne (anesthésique) a démontré des propriétés similaires
89
chez les rongeurs (Cantini et al 1994; Pin & Merrifield 1997). Toutefois, l’utilisation de tels
composés ne peut évidemment être envisagés chez l’homme. Parallèlement, l’irradiation
ionisante préalable des muscles transplantés permet d’augmenter l’efficacité des TMs. En
effet, lors du processus de régénération musculaire, les cellules myogéniques de l’hôte
peuvent faire compétition aux cellules injectées. Les radiations ionisantes détruisant les
cellules myogéniques de l’hôte, favorisent la participation des myoblastes injectés à
fusionner avec les myotubes du receveur. Ce principe a été vérifié maintes fois chez les
rongeurs (Alameddine et al 1994b; Huard et al 1994b; Morgan et al 1990; Vilquin et al
1995; Wernig et al 2000), mais à l’instar de la notexine et de la bupivicaïne il n’est pas
pensable d’utiliser un tel procédé chez les patients atteints de DMD.
Chapitre 2: Survie des cellules transplantées
1
Perte cellulaire à court terme
1.1 Causes
La survie d’un organe fraîchement transplanté est rapidement hypothéquée par les
mécanismes du rejet suraigu (cf. chapitre 1 : 4.3.6). Ce rejet survient dans les minutes voir
les heures qui précèdent la transplantation. L’existence chez le receveur d’Acs circulants,
préformés et dirigés contre le donneur, est à l’origine de ce rejet. Ce problème est devenu
rarissime en clinique puisqu’il est évité par une détection systématique, antérieure à la
transplantation, de la présence éventuelle de ces Acs chez le receveur. Les patients
dystrophiques ont bénéficié d’examens similaires pour assurer la survie des myoblastes
transplantés lors d’un essai clinique récent (Skuk 2004). Néanmoins plusieurs autres
facteurs, autres que ceux impliqués dans le rejet suraigu, compromettent la survie des
cellules injectées. Tout d’abord, la survie post-transplantation des myoblastes peut être
influencée par les conditions de culture qui précèdent leur injection (Rando et al 1995).
Puis, il a été établi que les myoblastes transplantés, à la différence des organes, étaient
potentiellement plus fragiles à certains mécanismes de mortalité cellulaire tels que l’anoïkis
(Zvibel et al 2002). Enfin, certaines évidences pointent l’inflammation comme étant un des
facteurs grandement impliqués dans la mort précoce des myoblastes transplantés (Hodgetts
et al 2003; Skuk et al 2003; Skuk et al 2004).
90
L’implication du système immunitaire dans la mort précoce des myoblastes
s’appuie sur plusieurs expériences effectuées chez la souris. Premièrement, il a été
démontré que l’irradiation létale de souris permettait de réduire la mortalité précoce des
myoblastes transplantés. Cette augmentation de la survie des myoblastes a également été
observée avec l’injection d’un anticorps anti-LFA-1 (présent sur les leucocytes et
participant à leur activation). Néanmoins, les myoblastes injectés mouraient similairement
qu’ils soient transplantés à des souris immunodéficientes (SCID) ou immunocompétentes
(Guerette et al 1997a; Guerette et al 1997b). Ce résultat permettait déjà d’exclure une
participation du système immunitaire spécifique dans la mortalité précoce des myoblastes.
De plus, d’autres études venaient renforcer l’idée de la participation des macrophages et
neutrophiles à la destruction rapide des myoblastes injectés. Une augmentation de la survie
a été obtenue en utilisant des myoblastes génétiquement modifiés et exprimant le TGF-β
(Merly et al 1998). Ce résultat fut également observé lors de l’utilisation de myoblastes
exprimant une protéine antagoniste pouvant se lier au récepteur à l’IL-1 (Qu et al 1998).
Ces résultats peuvent s’expliquer par le fait que les neutrophiles et les macrophages, qui
infiltrent rapidement le muscle, produisent des radicaux oxygénés et des protéases qui
détruisent les myoblastes lorsqu’ils interagissent avec eux (Guerette et al 1997b; Skuk et al
2002a). Néanmoins le rôle des macrophages et des neutrophiles dans la mort précoce des
myoblastes a été remis en question. En effet, une étude a révélé que la déplétion de ces
deux types de cellules n’engendrait pas de variation quant à la survie des myoblastes
(Sammels et al 2004). Toutefois, cette étude contradictoire montrait quelques lacunes.
Enfin, comme cela a été décrit dans la section 1.1.1.3, la régénération musculaire suite à un
dommage plonge les cellules injectées dans un contexte inflammatoire (Charge & Rudnicki
2004). Ce contexte pourrait participer à la destruction des myoblastes injectés, notamment
lorsque ceux-ci sont introduits dans un muscle dystrophique où la succession des phases de
dégénérescence et de régénération est constante. Quoiqu’il en soit, et bien que les
mécanismes de l’inflammation responsables de la mort des myoblastes restent à établir, il
semble évident que le taux élevé de mortalité précoce des myoblastes transplantés soit
imputable en partie à l’inflammation. Ainsi, l’amalgame des conditions de culture, de
l’anoïkis et de l’inflammation provoquent la perte d’une grande partie (~75%) des
91
myoblastes dans les premiers jours (2 à 3 jours) qui suivent leur transplantation (Skuk et al
2003).
Heureusement, la forte mortalité des myoblastes transplantés n’empêche pas en soit
le succès de la TM. Ceci peut s’expliquer par la combinaison de deux facteurs.
Premièrement, toutes les cellules ne meurent pas. Deuxièmement la prolifération des
cellules survivantes permet de compenser partiellement ou totalement la perte initiale des
myoblastes injectés (Beauchamp et al 1999; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003). En se
basant sur ces deux principes, il semble évident qu’en augmentant la survie des myoblastes
transplantés, on devrait augmenter le nombre de cellules capables de participer à la
réparation musculaire et donc améliorer le résultat de la TM. Malheureusement, comme
cela vient d’être mentionné, les causes de la mortalité précoce des myoblastes ne sont pas
encore bien définies. De plus, les degrés d’implication des différents facteurs intervenant
dans cette mort cellulaire ne sont pas encore clairement évalués. Ainsi, il devient difficile
d’élaborer une approche pour réduire cette perte de cellules et augmenter le succès de leur
transplantation.
1.2 Solutions précédemment envisagées
Une autre alternative, pour compenser la perte initiale des myoblastes injectés, vise
à favoriser le processus de régénération musculaire. Le processus de réparation des muscles
repose entre autre sur l’augmentation de l’activité de prolifération et/ou de différenciation
des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). L’utilisation de facteurs qui modulent ces
activités pourrait potentialiser l’action des myoblastes qui survivent à la mortalité survenant
dans les premiers instants après leur transplantation.
L’étude physiologique du muscle, après un bris musculaire, a permis de révéler
l’existence de plusieurs facteurs sécrétés participant à la régénération musculaire. Ce
processus finement orchestré implique l’activation des cellules satellites leur permettant de
proliférer et de se différencier afin de réparer les fibres lésées. Cette activation cellulaire
suit une chronologie précise mettant en jeu la régulation de facteurs de transcription, qui à
leur tour, vont moduler l’expression de gènes spécifiques aux cellules musculaires.
L’ensemble de ce processus repose sur des interactions cellulaires. Conjointement, la
92
régénération musculaire tient compte des interactions cellulaires avec la matrice
extracellulaire et avec des facteurs sécrétés par le compartiment extracellulaire. Il est
notamment établi que l’altération d’un muscle provoque la libération, au sein de l’espace
extracellulaire, de plusieurs molécules biologiquement actives. Ainsi, il a été démontré que
des extraits de muscles, préalablement endommagés, contenaient des substances mitogènes
pour les cellules satellites. Ces substances ne se retrouvaient pas dans des extraits
provenant de muscles intacts (Bischoff 1986; Chen & Quinn 1992). Différents types de
stimuli ont été proposés comme étant à l’origine de l’activation des cellules satellites
(Grounds 1999). Le nombre considérable d’études réalisées in vitro a permis de grossir le
catalogue des facteurs touchant la prolifération et/ou la différenciation des myoblastes.
Néanmoins peu d’entre eux ont conduit à des études in vivo démontrant leur implication
dans la régénération musculaire suite à un dommage musculaire. De plus, l’utilisation de
ces facteurs dans le cadre d’une TM n’est pas monnaie courante. Ainsi, les sections
suivantes vont introduire quelques facteurs qui ont démontré une certaine capacité in vivo à
participer à la régénération musculaire. Certaines fois ces facteurs ont même contribué à
l’augmentation du succès d’une TM Les mécanismes cellulaires par lesquels ils ont
contribué à cet effet seront brièvement abordés. Enfin, le premier article de cette thèse
introduira un nouveau facteur qui conduit à l’amélioration de la TM : le 1-α,25dihydroxycholecalciferol.
1.2.1 Le facteur de croissance hépatique (HGF)
L’« Hepatocyte Growth Factor » (HGF), est un facteur de croissance ayant une forte
activité mitogénique. Cette capacité lui a été attribuée lorsqu’il fut déposé sur des cultures
hépatocytaires (Nakamura et al 1989; Nakamura et al 1986). Par la suite le HGF s’est
révélé comme un des plus importants facteurs impliqués dans la régénération des organes
(Charge & Rudnicki 2004). Également, de façon plus contextuelle, le HGF se révèle être un
des régulateurs clefs de la régénération musculaire via son effet sur les cellules satellites
(Charge & Rudnicki 2004). La première association entre le HGF et la régénération
musculaire fut effectuée alors que le transcrit, du HGF, fut détecté dans les broyats de
muscles en régénération (Jennische et al 1993). Depuis, il est communément établi que les
transcrits de HGF ainsi que les concentrations en HGF augmentent lors de la phase précoce
d’un muscle en régénération. De plus, la quantité de HGF produite est directement corrélée
93
avec le degré de dommages infligés au muscle (Suzuki et al 2002; Tatsumi et al 1998;
Tatsumi et al 2001). Des études, réalisées in vitro, ont démontré que le HGF pouvait
stimuler les cellules satellites quiescentes et ainsi augmenter la prolifération cellulaire au
sein de cultures de myoblastes. Néanmoins, cette augmentation de la prolifération
s’accompagnait d’une diminution de la différenciation des myoblastes, réduisant ainsi leur
capacité à fusionner pour former des myotubes (Allen et al 1995; Armand et al 1983; Miller
et al 2000; Tatsumi et al 1998). L’implication du HGF dans la prolifération et la
différenciation des myoblastes fut renforcée par une expérience utilisant une lignée de
myoblastes exprimant une forme activée du récepteur du HGF (c-met). La différenciation
de ces cellules fut alors inhibée (Francavilla et al 1997). Par ailleurs, l’injection de HGF
dans des muscles endommagés a engendré le blocage du processus de réparation. Ce
résultat démontrait la capacité des myoblastes à proliférer (leur quantité ayant triplé au
cours de l’expérience) mais leur incapacité à fusionner en présence de HGF (Miller et al
2000). De ce fait, l’HGF semble plus important dans la phase précoce de la régénération
musculaire. Ce concept fut démontré par la diminution de la sécrétion de HGF à partir du
moment où le dommage est effectué dans un muscle. De plus, l’injection tardive de HGF
n’influençait aucunement le processus de régénération appuyant l’argumentation d’une
fonction précoce dans le processus de réparation (Miller et al 2000). D’autre part, il
semblerait que le HGF joue un rôle dans la migration des myoblastes aux sites de
réparation des lésions musculaires. En effet, une étude in vitro, effectuée sur des lignées de
myoblastes de souris, a mis en évidence l’activité chémotactique de ce facteur (Bischoff
1997; Suzuki et al 2000). Ainsi, le HGF apparaît comme fortement impliqué dans le
processus de réparation musculaire. Cependant, son utilisation pour la greffe de myoblastes
ne permettrait que d’augmenter la prolifération des cellules injectées dans une période
limitée à quelques heures post-transplantation.
1.2.2 Les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF)
À l’instar du HGF, plusieurs « Fibroblastic Growth Factors » (FGF), sont considérés
comme étant des activateurs de la prolifération et comme des inhibiteurs de la
différenciation des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). Un de ces FGFs, le FGF-6 est
spécifiquement exprimé dans le muscle. De plus, son expression est augmentée suite à un
bris musculaire (deLapeyriere et al 1993; Floss et al 1997; Kastner et al 2000). Néanmoins,
94
son implication dans la phase de régénération musculaire est plus controversée. Une équipe
a observé que la capacité de régénération, de souris déficientes pour le FGF-6, était
diminuée (Floss et al 1997). Ce déficit de régénération était caractérisé par la diminution du
nombre de cellules positives pour les marqueurs MyoD et de myogénine. En opposition,
une autre équipe n’observa aucune défaillance de la régénération musculaire en réponse à
l’injection de notexine, à un écrasement musculaire ou chez des souris FGF-6 déficientes et
dystrophiques (mdx) (Fiore et al 1997; Fiore et al 2000). Ce désaccord n’est
malheureusement pas encore éclairci (Charge & Rudnicki 2004). Un autre FGF, le FGF-2,
a montré (in vitro) des propriétés mitogéniques sur les myoblastes (Charge & Rudnicki
2004). Par ailleurs, l’injection intramusculaire, à des souris mdx, d’un Ac anti-FGF-2 au
moment où la lésion musculaire est effectuée, a permis de réduire le nombre et le diamètre
des fibres en régénération. Cette observation soulevait le rôle possible (in vivo) du FGF-2
dans la prolifération et/ou la différenciation des myoblastes (Lefaucheur & Sebille 1995b).
Par ailleurs, l’injection aux souris mdx de FGF-2 semblait promouvoir la prolifération des
cellules satellites et favoriser la régénération musculaire (Lefaucheur & Sebille 1995a).
Enfin, le prétraitement de culture de myoblastes au FGF-2 a permis d’augmenter le succès
de leur transplantation dans des souris mdx (Kinoshita et al 1995b). Cependant, l’utilisation
de modèles murins autre que la souris mdx ne permit pas de conforter ces résultats
(Mitchell et al 1996). Ce problème amena à conclure que, selon les modèles utilisés, le
FGF-2 ne constituait pas un facteur essentiel du processus de régénération. Malgré tout,
même si les FGFs ne semblent pas jouer un rôle critique dans la réparation musculaire, via
l’intermédiaire des cellules satellites, leurs actions dans ce mécanisme de régénération
pourraient être imputable à leur rôle dans la revascularisation musculaire (Lefaucheur et al
1996).
Quatre récepteurs pour les FGFs (1 à 4) ont été identifiés jusqu’à présent, chacun
ayant une affinité différente pour chaque FGF. Les récepteurs 1 et 4 sont les plus exprimés
sur les cellules satellites. En outre, le récepteur 1 est surexprimé lors de la phase
d’activation des cellules satellites en réponse à une exposition au FGF-1 (Sheehan & Allen
1999). Cet effet est exacerbé si les cellules sont simultanément exposées au HGF.
Toutefois, le récepteur 1 n’est pas un récepteur spécifique au muscle puisqu’il est présent
sur les fibroblastes.
95
1.2.3 Les récepteurs du HGF et des FGFs
Les récepteurs aux FGFs et le récepteur au HGF (c-met), sont des récepteurs
transmembranaires à tyrosine kinase. Une fois leurs ligands respectifs liés, les récepteurs
dimérisés s’auto-phosphorylent et activent une cascade de signalisation complexe. FGFs et
HGF sont dépendants des héparanes sulfates qui facilitent l’activation de leurs récepteurs
ainsi que la transduction du signal (Rapraeger 2000). Les protéoglycans liés aux héparanes
sulfates (HSPG) se trouvent sur la surface des toutes les cellules et dans la matrice
extracellulaire de mammifères. Les syndécans (protéïnes de la famille des HSPGs) sont
particulièrement impliqués dans la signalisation cellulaire des FGFs et/ou du HGF.
L’identification des syndécans 3 et 4 à la surface des cellules satellites (quiescentes ou
actives) permet de supporter l’hypothèse d’une action des FGFs et/ou du HGF dans
l’activation initiale de ces cellules (Cornelison et al 2001). Néanmoins, aucune utilisation in
vivo de ces principes n’a été appliquée à la greffe de myoblastes.
1.2.4 Les facteurs de croissance de la famille des insulines (IGF)
Les « Insuline-like Growth Factors » (IGF) de type 1 et 2 (IGF-1, IGF-2) sont
depuis longtemps référencés comme étant des régulateurs de la croissance et du
développement de nombreux tissus (Charge & Rudnicki 2004). Pourtant, ce n’est que
récemment que leurs interventions dans l’activité musculaire ont été mises en évidence. En
effet, la régulation paracrine et autocrine de ces hormones est fortement associée au
développement et à la réparation musculaire. L’IGF-1 et l’IGF-2 sont capables (in vitro)
d’augmenter la prolifération et la fusion des myoblastes (Charge & Rudnicki 2004). Ce qui
donne à ces hormones un avantage par rapport au HGF et au FGFs (qui n’augmentent que
la prolifération) quant à leur utilisation pour la TM. L’administration d’IGF-1 (localisée ou
non) a démontré dans de nombreux cas l’augmentation de la masse musculaire des souris
traitées (Adams & McCue 1998; Barton-Davis et al 1998; Chakravarthy et al 2000;
Coleman et al 1995; Musaro et al 2001). Cet effet hypertrophique de l’IGF-1 a été attribué
à l’activation de la prolifération des cellules satellites ainsi qu’à l’augmentation de la
synthèse protéique (Bark et al 1998; Barton-Davis et al 1999b; Musaro et al 1999;
Semsarian et al 1999). Lors de la régénération musculaire, les niveaux d’expression de
l’IGF-1 et de l’IGF-2 sont augmentés (Bakay et al 2002; Edwall et al 1989; Krishan &
Dhoot 1996). De plus, ces deux hormones semblent améliorer le phénotype musculaire de
96
souris âgées ou dystrophiques (Barton et al 2002). En effet, l’observation du muscle de
souris dystrophiques (mdx : mIGF+/+), exprimant fortement l’IGF-1 au niveau du muscle
strié squelettique, a révélé une augmentation du nombre et du volume des fibres
musculaires (Barton et al 2002). Par ailleurs, l’IGF-1 pourrait permettre d’améliorer la
régénération musculaire en augmentant la survie des myoblastes (Lawlor et al 2000; Lawlor
& Rotwein 2000). Néanmoins aucune étude tangible in vivo n’est venue confirmer cette
hypothèse (Charge & Rudnicki 2004). Enfin, les IGFs pourraient être impliqués dans les
processus de réinnervation qui surviennent après un dommage musculaire (Caroni &
Grandes 1990; Vergani et al 1998). Ainsi, bien que le rôle des IGFs dans la régénération
musculaire soit évident, l’ensemble des mécanismes qui le régissent reste à définir. Par
exemple, toutes les IGFs ne semblent pas intervenir au même moment du processus de
réparation d’un muscle lésé (Charge & Rudnicki 2004). Une étude intéressante a été
effectuée en utilisant de l’IGF-1 dans le contexte d’une TM. Cette étude démontrait
l’efficacité de l’administration d’IGF-1 sur la greffe de myoblastes dans des souris mdx
ayant subi un cryodommage. Néanmoins, cette efficacité n’était visible que si les muscles
des souris étaient irradiés avant la transplantation (Brimah et al 2004). Ce qui ne serait pas
envisageable pour un patient dystrophique.
1.2.5 La famille des molécules appartenant au TGF-β
Les facteurs de croissance appartenant à la famille du TGF-β sont des cytokines
essentielles pour la régulation de la croissance cellulaire (Chen et al 2002). Ces facteurs
sont depuis longtemps connus pour leur activité inhibitrice de la prolifération et de la
différenciation des myoblastes (Lefaucheur et al 1996; Lefaucheur & Sebille 1995b).
Cependant leurs interventions au niveau de la régénération musculaire restent confuses et
complexes (Charge & Rudnicki 2004). Plus récemment, la myostatine (MSTN) a été
identifiée comme nouveau membre de la famille des TGFs (McPherron et al 1997). Cette
molécule a un effet inhibiteur sur la croissance musculaire (McPherron et al 1997). En
effet, des souris mutées et déficientes pour la MSTN exhibaient une hypertrophie et une
hyperplasie musculaire (McPherron et al 1997). Cet effet fut démontré par la suite sur
d’autres modèles murins (302, 360) et étendu à d’autres espèces, par l’identification de
mutations à l’intérieur du gène de la MSTN. Toutes ces espèces avaient en commun une
97
musculature très développée (Grobet et al 1997; Karim et al 2000; McPherron & Lee
1997). Le récepteur de la MSTN est le Act RIIB (activin receptor type II) (Lee &
McPherron 2001). Des études in vitro ont démontré que l’expression de la MSTN était
élevée pendant les stades de différenciation et de fusion (Kocamis et al 2001). Par ailleurs,
d’autres études ont montré qu’à hautes concentrations, la MSTN inhibait la prolifération
d’une lignée de myoblastes de souris (cellules C2C12) (253, 254, 309). D’autres études in
vivo ont révélé que la production endogène de MSTN était responsable de l’inhibition de la
prolifération des cellules satellites (Kocamis et al 2001; Lee & McPherron 2001). Pour
l’instant la littérature sur cette molécule et sur les mécanismes de son activité sont
particulièrement en croissance. Il reste beaucoup à apprendre sur cette molécule
extraordinaire dont l’inhibition provoque une transformation de la musculature qui fait un
peu penser à « l’incroyable Hulk ». Des études récentes réalisées dans notre laboratoire
(Benabdallah et al 2005) indique qu’une inhibition de la MSTN augmente le succès d’une
greffe de myoblastes.
1.2.6 Le facteur inhibiteur de leucémie (LIF)
Le « Leukemia Inhibitory Factor » (LIF) et a des activités liées à la régénération
musculaire. Le LIF stimule (in vitro) la prolifération des myoblastes via des mécanismes
cellulaires qui ne modifient pas la différenciation et la fusion des myoblastes (17, 44, 294,
320). Cet effet in vitro du LIF, sur la prolifération des myoblastes, semble impliqué
l’activation de la voie de signalisation des JAK2-STAT3 (Spangenburg & Booth 2002).
L’administration de LIF in vivo au site d’un dommage musculaire ou bien dans un muscle
de souris mdx permet d’augmenter le processus de régénération musculaire. Cette
conséquence visible est due à l’augmentation de la prolifération des myoblastes ainsi qu’à
l’augmentation de la taille des fibres réparées (Kurek et al 1997). En outre, l’utilisation de
souris déficientes en LIF a permis de démontrer que les bris musculaires chez ces souris
étaient nettement moins bien réparés en comparaison aux mêmes dommages réalisés chez
une souris de phénotype sauvage (Kurek et al 1997). De plus, l’administration de LIF aux
souris déficientes permettait de restaurer un niveau standard de régénération musculaire
(Kurek et al 1997). Enfin, il a été observé, chez l’homme et chez la souris, qu’après un bris
musculaire, le niveau de transcription de LIF était sensiblement augmenté (Reardon et al
98
2000). Bien que l’IL-6 ait beaucoup d’homologie avec le LIF, l’administration d’IL-6 ne
semble pas moduler la régénération musculaire (Kami & Senba 1998; Kurek et al 1996).
2 Article I : Le 1,α25-dihydroxycholécalciférol
augmente le succès des transplantations de myoblastes
humains chez la souris SCID.
Le premier article de cette thèse introduit un nouveau facteur susceptible
d’améliorer la transplantation des myoblastes : la forme active de la vitamine D3. Pour
permettre cette amélioration, cette molécule se doit d’augmenter la prolifération et/ou la
différenciation et/ou le niveau d’apoptose des myoblastes transplantés. J’ai contribué à
toutes les expériences réalisées et rédigé l’article. Manaf Bouchentouf a effetué la mise au
point de la quantification de mortalité et de prolifération des myoblastes in vivo. Philippe
Mills a effetué la mise au point du test de prolifération in vitro. Jean-François Lafrenière a
contribué à la bonne rédaction de cet article et à sa correction. Cet article a été accepté dans
la revue Cell Transplantation (Stephan et al 2007).
2.1 Résumé
La transplantation de myoblastes humains constitue une approche thérapeutique
intéressante pour les traumatismes musculaires et les myopathies. Quelques études
antérieures ont démontré que la 1,25-dihydroxyvitamine-D3 (1,25-D3) agissait directement
sur les myoblastes en régulant leur prolifération et leur fusion. Également, la vitamine 1,25D3 semble impliquée dans la régulation de l’apoptose de certains autres types cellulaires et
pourrait ainsi contribuer à protéger les myoblastes humains transplantés. De ce fait, nous
avons étudié si la vitamine 1,25-D3 nous permettait d’augmenter le succès de nos greffes
de myoblastes humains. L’effet de cette vitamine sur la prolifération, la fusion et la survie
des myoblastes humains a d’abord était mesuré in vitro. Afin de déterminer par la suite
l’effet in vivo de cette vitamine, des myoblastes humains ont été greffés dans le Tibialis
anterior de souris SCID traitées ou non avec la vitamine 1,25-D3. Le succès de greffe, la
prolifération ainsi que la survie des cellules transplantées ont été évalués. La vitamine 1,25D3 augmente la prolifération et la fusion des myoblastes humains, in vitro et in vivo.
Cependant, cette vitamine ne protège les myoblastes ni de divers facteurs pro-apoptotiques
(in vitro) ni de la mort cellulaire qui survient lors de la période post-tranplantatoire.
99
Néanmoins, la vitamine 1,25-D3 permet d’augmenter le succès des greffes puisque le
nombre de fibres exprimant la dystrophine humaine a significativement augmenté chez les
souris traitées. Ce résultat peut être partiellement attribuable à l’augmentation de la
prolifération et de la diffenciation des myoblastes transplantés. Ainsi, l’administration de
cette vitamine pourrait contribuer à augmenter le potentiel thérapeutique de la
transplantation de myoblastes.
2.2 Abstract
Human muscle precursor cell (hMPC) transplantation is a potential therapy for
severe muscle trauma or myopathies. Some previous studies demonstrated that 1, 25dihydroxyvitamin-D3 (1,25-D3) acted directly on myoblasts, regulating their proliferation
and fusion. The 1,25-D3 is also involved in apoptosis modulation of other cell types and
may thus contribute to protect the transplanted hMPCs. We have therefore investigated
whether 1,25-D3 could improve the hMPC graft success. The 1,25-D3 effects on hMPC
proliferation, fusion and survival were initially monitored in vitro. HMPCs were also
grafted in the Tibialis anterior of SCID mice treated or not with 1,25-D3 to determine its in
vivo effect. Graft success, proliferation and viability of transplanted hMPCs were evaluated.
The 1,25-D3 enhanced proliferation and fusion of hMPCs in vitro and in vivo. However,
1,25-D3 did not protect hMPCs from various pro-apoptotic factors (in vitro) or during the
early post-transplantation period. The 1,25-D3 enhanced hMPC graft success since the
number of muscle fibers expressing human dystrophin was significantly increased in the
TA sections of 1,25-D3 treated mice (166.75 + 20.64) compared to the control mice (97.5 +
16.58). This result could be partly attributed to the improvement of the proliferation and
differentiation of hMPCs in presence of 1,25-D3. Thus, 1,25-D3 administration could
improve the clinical potential of hMPC transplantation currently developed for muscle
trauma or myopathies.
100
3 Title : 1,25-dihydroxyvitamin D3 increases the
transplantation success of human muscle precursor cells
in SCID mice.
3.1 Introduction
Human muscle precursor cell (hMPC) transplantation is a promising clinical
strategy to repair severe muscle injuries (Holzer et al 2005), prevent cardiac insufficiency
(Suzuki et al 2001; Vilquin & Marolleau 2004) and delay the problems of inherited
myopathies (Skuk 2004). Briefly, hMPC transplantation consists of injecting in host muscle
hMPCs harvested from a healthy donor or from the host himself. In the case of hereditary
myopathies, the hMPC transplantation permits genetic complementation (as a vehicle of
normal genes) (Skuk & Tremblay 2003). As an example, in Duchenne muscular dystrophy
(DMD) patients, donor hMPCs fused with damaged host muscle fibers, introduce their
nuclei containing the normal dystrophin gene and thus restored dystrophin expression
(Brussee et al 1998; Skuk 2004). However, the graft success is limited due to an important
death of cells (70%) following their injection (Skuk & Tremblay 2003). It is well
established that following a muscle injury, the muscular regeneration relies on the
proliferation and the differentiation of muscle precursor cells (MPCs) (Charge & Rudnicki
2004). Thus, improvement of transplanted hMPC proliferation and/or fusion with host
fibers may be a promising strategy to improve hMPC transplantation success (Lafreniere et
al 2006; Skuk & Tremblay 2003).
It has been demonstrated that basic fibroblast growth factor (bFGF) or insulin like
growth factor type I (IGF-I) modulated the differentiation or the proliferation of MPCs
(Allen & Boxhorn 1989). Moreover, some studies reported that IGF-I and/or bFGF
improved MPC graft success (Brimah et al 2004; Kinoshita et al 1995b). However, bFGF
stimulated MPC proliferation but depressed their differentiation. In contrast, IGF-I
demonstrated a pronounced stimulation of differentiation but only stimulated proliferation
to a small extent (Allen & Boxhorn 1989; Brimah et al 2004). Even if the combination of
these two factors produced encouraging results for hMPC transplantation (Allen &
Boxhorn 1989; Brimah et al 2004), it is still of interest to find other agents improving
hMPC proliferation and fusion.
101
Classically, the hormonally active vitamin D3, 1,25α-dihydroxyvitamin D3 (1,25D3) interacts with its receptor [vitamin D receptor (VDR)] to induce or repress the
expression of a variety of genes (Kutuzova & Deluca 2004; White 2004), and thereby carry
out many of the physiological actions of vitamin D. In addition, 1,25-D3 induces, nontranscriptional responses involving activation of transmembrane signal transduction
pathways via a putative novel membrane receptor. Conversely, the VDR might also
participate in hormone-induced non-genomic responses (Boland et al 2005; Capiati et al
2002). Thus, it has been demonstrated that 1,25-D3, via a modulation of protein tyrosine
phosphorylation, stimulates proliferation of skeletal muscle myoblasts and promotes their
differentiation in myotubes (Bellido et al 1993; Boland et al 2005; Boland et al 1995;
Boland et al 1985; Capiati et al 2002; Capiati et al 1999). Furthermore, the presence of
VDR has been previously detected in human skeletal muscle cells and tissues (BischoffFerrari et al 2004; Bischoff et al 2001; Costa et al 1986; Demay 2003). Thus, the 1,25-D3
could also have proliferative and differentiative effects on hMPCs.
Additionally, 1,25-D3 is commonly known to be involved in regulation of cell
apoptosis (Boland et al 2005; Riachy et al 2002). Interestingly, a significant inflammatory
process, involving pro-inflammatory cytokines and oxidative stress, is associated with
hMPC transplantation. This inflammatory environment plays a crucial role in the early
death of donor hMPCs (Skuk et al 2002a).
The goal of the present study was to determine whether 1,25-D3 promotes hMPC
transplantation success in the Tibilalis anterior (TA) of SCID mice. We have investigated
whether 1,25-D3 increased hMPC proliferation and differentiation in vitro and protected
them from cell death induced by cytokines and oxidative stress after the in vivo
transplantation. Finally, hMPC transplantation success was monitored in SCID mice treated
with 1,25-D3. Proliferation, differentiation and viability of transplanted hMPCs were
analyzed to understand the mechanisms, which could be involved in this observed
enhancement of graft success.
102
3.2 Materials and Methods
3.2.1 Human muscle precursor cell (hMPC) culture
HMPCs were obtained from a postmortem biopsy of a 13-month-old boy (Huard et
al 1994b). Briefly, myogenic cells were released from minced fragments by enzymatic
dissociation. After 1 h of incubation in collagenase (600 UI/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA), cells were then incubated for 30 min in Hank's buffer salt solution (HBSS)
including 0.1% trypsin and 0.02% EDTA w/v (Gibco). HMPCs were cultured in modified
MCDB120 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) complemented with 10% fetal bovine
serum (FBS, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada), 10 ng/mL of basic fibroblast growth
factor (Strathmann Biotec AG, Hamburg, Germany), 100 units/mL of penicillin, and 100
µg/mL of streptomycin (Invitrogen). Cells were always kept below 80% confluence.
For all the in vitro experiences, the 1,25-D3 (17936, Sigma) was reconstituted (1
mg/mL) in ethanol. This stock of solution was then diluted in culture media to obtain the
concentration required. The same amount of ethanol as in the 1,25-D3 culture medium was
added to all the control culture media.
3.2.2 Fusion assay
This method has been described previously by Lafreniere et al. (Lafreniere et al
2006). Briefly, the hMPC differentiation was evaluated by determining a fusion index,
which represents the percentage of nuclei included in myotubes (i.e., cells with at least than
3 nuclei). To measure this fusion rate of the hMPCs in presence of 1,25-D3, 1 x 105 cells
were plated in 3 x 6-well Costar plates When 50–60% confluence was reached, the cells
were rinsed with HBSS and incubated in a differentiation medium (serum free culture
medium completed with 10 µg/mL insulin), which contained or not pharmacological (1.106 M) or physiological (1.10-8 M) 1,25-D3 concentrations (Riachy et al 2002). The
differentiation medium was changed every 48 h, and cells were fixed after 4.5 days using
4% paraformaldehyde 0.01 M phosphate buffer. Fixed cell nuclei were stained with DAPI
(4′, 6-diamidino-2-phenylindole) and observed with a UV lamp microscope using the
appropriate filter (magnification x 10). At the same time, myotubes were identified with
standard light microscopy (magnification x 10). Three pictures were taken for each well
103
with both microscopy methods. Approximately 800 nuclei were manually counted per
picture (18 pictures per group).
3.2.3 In vitro proliferation assay
To measure 1,25-D3 effect on hMPC proliferation rate, 50 000 cells/well were
initially plated in 6-wells plates (Corning Inc., MA, USA). After a 24 hours incubation, the
antibiotic free culture medium was added with or without 1.10-6 or 1.10-8 M 1,25-D3.
Media were changed 48 hours later. To determine cell population, 6 wells were harvested
and separately counted with a haematocytometer for each time point (0, 48, 96 hours).
3.2.4 In vitro cellular mortality assay
Several concentrations of staurosporin, TNF-α (Sigma) and glucose oxydase (Gox)
(Sigma) were tested in preliminary experiments to induce the highest cell mortality
(apoptosis + necrosis). The concentrations and the durations that were used to induce cell
death were as follows: staurosporin (2 µM during 16 hours), TNF-α (30 ng/mL during 24
hours) and Gox (0.1 U/mL during 24 hours) (Bouchentouf et al 2004).
HMPCs were cultured during 48 hours (5% CO2, 37 °C) in T25 flasks (Corning,
Plaza Corning, NY, USA) containing complete culture medium in presence or not of a
pharmacological concentration of 1,25-D3 (1.10-6M). Following 1,25-D3 pretreatment,
cells were harvested, washed with Hank’s balanced salt solution (HBSS, Sigma) and plated
at 1.5 x 106 cells/flask with fresh complete medium containing either staurosporin (2 µM
during 16 hours), TNF-α (30 ng/mL during 24 hours) or Gox (0.1 U/mL during 24 hours).
Apoptosis was detected 24 hours later by flow cytometry using the Hoechst33342/Propidium Iodide (PI) (Sigma, Aldrich, St-Louis, MO, USA) labeling method
described by Shah et al (Shah et al 1996).
3.2.5 Hoechst/PI labeling protocol
HMPCs were washed with HBSS and stained in 50 µL of PI (20 µg/mL) during 30
min at 4ºC in the dark. The suspension was fixed with 25% ethanol solution for 5 min.
Hoechst 33342 solution (25 µL, 112 µg/mL) was then added for 1 hour at 4ºC in the dark.
The labeling of the cells was determined by FACS.
104
3.2.6 Animals and conditioning
Female SCID mice, 6 to 8 weeks old (Charles River laboratory International,
Wilmington, MA, USA), were used as hosts for the transplantation of hMPCs. 1,25-D3
(Sigma) was dissolved in ethanol 100 % (1 mg/mL) and then diluted in corn oil.
Twelve mice were administrated 1,25-D3 orally (5 µg/kg p.o three times per week),
from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation. This dose of 1,25-D3
has been selected in conformity with a protocol reporting a physiological effect in mice,
without sign of hypercalcaemia (Cantorna et al 1998b; Gregori et al 2001). Twelve control
mice received vehicle only. Six of these control SCID mice and six of the 1,25-D3 treated
mice were injected intraperitoneally with a daily dose of FK506 during a 30 days period
post-transplantation (2.5 mg/kg/day, Fujisawa Pharmaceutical Co. ltd, Osaka, Japan).
All experiments were conducted in accordance of the Laboratory Animal Care and
Use Ethics Committee of Laval University.
3.2.7 Graft success evaluation
Mice were injected in both TAs (8-10 sites of injections) with 1 x 106 hMPCs
suspended in 10 µL of HBSS using a glass micro-pipette (Drummond Scientific Co.,
Broomall, PA, USA). Mice were sacrificed after 4 weeks and grafted TAs were harvested.
TAs were then placed in a 30% sucrose solution, embedded in OCT (Miles Inc., Elkhart,
IN), frozen in liquid nitrogen and serially sectioned at 12 µm using a Microm cryostat.
Cryostat sections were incubated with a mouse anti-human-dystrophin antibody
(Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK) followed by a goat anti-mouse IgG biotinconjugated (Dakocytomation, Mississauga, Ont., Canada) and with a streptavidin-Cy3
conjugated (Sigma). Non-specific binding sites were blocked for all immuno-histochemical
detections with FBS 10% in PBS. Human dystrophin staining was observed with a UV
lamp microscope using the appropriate filter.
The number of human dystrophin positive fibers was determined for each TA
section. The mean of the 3 best sections was calculated. Thus, to evaluate the graft success,
105
the number of human dystrophin positive fibers was represented by the mean obtained for
all the TAs of a group.
3.2.8 In vivo cellular mortality and proliferation assay
3.2.8.1 Transplantation of male radioactively labeled MPCs
HMPCs were cultured during 48 hours before the transplantation in MCDB120
containing 0.25 µCi/mL [methyl-14C] thymidine (Amersham, Montreal, QC,Canada).
HMPCs (1 x 106 cells) were grafted as described above in female SCID mice treated or not
with 1,25-D3. Three control mice and three 1,25-D3 treated mice were sacrificed for each
time point (T0, T48, T72, T96 hours). Both grafted TAs were harvested at the indicated
time points and snap-frozen in liquid nitrogen. The muscles were harvested and the DNA
was extracted using the Qiagen DNA minikit (Qiagen, Mississauga, Ontario, CA).
3.2.8.2 Quantification of cell death using radioactive labeling
To measure the rapid cell death following transplantation, the amount of radioactivity was measured on the DNA extracts using a liquid scintillation counter (Mod,
Wallac 1409, Woodbridge, Ontario, Canada). The percentage of radio-activity at all time
points and conditions and were calculated relative to the T0 value.
3.2.8.3 Evaluation of MPC survival and proliferation
To evaluate the survival and the proliferation of the transplanted hMPCs, the
presence of human Y-specific DNA was determined by real-time PCR (Rotor-gene 3000,
Sydney, Australia) in the same DNA extracts used to quantify cell death by radioactivity. A
standard curve was obtained by PCR amplification of DNA extracted from 12 female SCID
mouse muscles transplanted with various numbers of human male myoblasts (0.25, 0.5, 1.0
and 2.0 x 106 cells, 3 mice for each cell number). The standard curve was obtained by
analyzing the SYBRgreen DNA incorporation at 32 cycles (Step 1 at 94°C during 30 sec,
Step 2 at 57°C during 30 sec and Step 3 at 72°C during 20 sec) using human Y
chromosome specific primers (sens: 5’-CGTCAGACGACCCATGAA-3’ and anti-sens 5’CTCGGTGCATGGCCTGTA-3’). No Y-specific DNA was detected in the DNA extracted
of female SCID mouse muscles. The PCR amplification results obtained in different hMPC
106
transplanted muscles was compared to the standard curve to determine the quantity of
living cells.
The proliferation of transplanted hMPCs quantified by the proliferation index: i.e.,
the percentage of Y-specific DNA divided by the mean percentage of radio-labeled DNA
measured in the same DNA extract. The mean proliferation index was then calculated for
each group of SCID mice.
3.2.9 Statistical analysis
Data were expressed as the means + SD of each experimental group. Differences
among groups were statistically analyzed using a one way ANOVA test. A value of p<0.05
was considered significant.
107
3.3 Results
3.3.1 In vitro Fusion Assay
A fusion assay was used to evaluate the effect of 1,25-D3 on hMPC differentiation
rate. Cells were cultured 5 days in presence or not of two different concentrations of 1,25D3 (1.10-6M or 1.10-8M). To identify the fused nuclei, light microscopy and DAPI
coloration pictures were merged for each experimental condition. The fusion index
represents the percentage of nuclei in myotubes (cells with at least 3 nuclei). In this
experimental context, untreated hMPCs were partially differentiated (49.4 + 1.45%, figure
15). The fusion index was increased (p<0.001) for both 1,25-D3 concentrations (55.34 +
1.44% for 1.10-8M and 61.54 + 1.7% for 1.10-6M). Moreover, the fusion index for the
pharmacological 1,25-D3 concentration (1.10-6M) was significantly enhanced compared to
the physiological 1,25-D3 concentration (p<0.001).
3.3.2 In vitro Proliferation Assay
To determine whether 1,25-D3 enhances hMPC proliferation, a basic cell count was
performed. HMPCs were incubated in MCDB120 culture medium complemented with
1.10-6M or 1.10-8M 1,25-D3 and cell populations were evaluated at 0, 48 and 96 hours. As
shown in figure 16, the hMPC population doubled in approximately 35 to 40 hours.
Interestingly, the proliferation of hMPCs in presence of 1.10-6M 1,25-D3 was enhanced at
48 and 96 hours compared to the control (p<0.001). For the physiological dose, 1.10-8M
1,25-D3, the proliferation curve of hMPCs was comparable to the control. The results were
also confirmed at 48 hours by a fluorescence-based proliferation assay (Cyquant, data not
shown).
3.3.3 In vitro Mortality Assay
HMPCs were cultured 48 hours in presence or not of 1,25-D3 (1.10-6M). The
medium was then removed and cells were cultivated 24 hours with staurosporin, TNF-α or
Gox. Apoptosis was detected by flow cytometry using the Hoechst-PI (figure 17). For the
different pro-apoptotic treatments, the mean level of hMPC mortality without 1,25-D3 was
important (82.83 + 0.56% for the staurosporin, 86.29 + 0.86% for the TNF-α and
84.17 + 0.47% for the Gox). These levels of hMPC mortality induced by the pro-apoptotic
108
factors were not significantly decreased in presence of 1,25-D3 (87.03 + 1.71% for the
staurosporin, 91.24 + 1.72% for the TNF-α and 83.73 + 0.56% for the Gox). Thus, hMPCs
pre-treated with 1,25-D3 are not protected from cell death induced by different proapoptotic factors.
3.3.4 Graft Success
SCID mice were transplanted with 1 x 106 hMPCs. Half of these mice received
1,25-D3 orally from day –7 to day 30 relative to the time of hMPC transplantation. In
addition, half of the 1,25-D3 treated or control mice were injected daily with FK506 (as
mentioned in methods) starting the day of hMPC transplantation. TAs of all mice were
harvested one month after the graft. An immunohisto-chemical staining was performed to
observe the presence of human dystrophin positive fibers resulting from the fusion of the
transplanted hMPCs with the host mouse muscle fibers. As shown in figure 18A, the mean
number of muscle fibers expressing human dystrophin was significantly increased
(p<0.001) in the TA sections of 1,25-D3 treated mice (166.75 + 20.64), compared to the
control mice (97.5 + 16.58). Representative pictures of untreated or 1,25-D3 treated TA
sections are shown in the figure 18B.
A sustained FK506 immunosuppressive treatment is currently associated with
hMPC transplantation to Duchenne muscular dystrophy patients to avoid graft rejection
(Camirand et al 2004; Skuk et al 2004). We have assessed whether this immunosuppressive
conditioning has adverse effects on the 1,25-D3 treatment (figure 19). The FK506
administration to the 1,25-D3 treated mice did not alter the graft success improvement
described above. The mean number of human muscle positive fibers in mice that received
both FK506 and 1,25-D3 remained elevated (166.16 + 21.18) compare to mice that
received no drug (103 + 18.32) or only FK506 (92 + 14.03).
3.3.5 In vivo Mortality and Proliferation
Radioactively labeled male hMPCs were transplanted in female SCID mice to
follow their death and proliferation. Half of these SCID mice transplanted with hMPCs
were administered 1,25-D3 orally (5 μg/kg three times per week). TAs were harvested at 0,
48, 72 and 96 hours after hMPC transplantation. Radio-activity and the presence of hMPC
109
Y-specific DNA within each TA were measured in the same DNA extracts and expressed
as percentages of the T0 value (respectively black and white columns in figure 20A). The
percentage of radio-activity post-transplantation initially dropped rapidly to 30% at 48
hours and then decreased more slowly to 7% at 96 hours as shown in figure 6A (black
bars). This lost of radioactivity is due to the death of the transplanted cells as previously
reported by our group (Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003). The percentage of hMPC Yspecific DNA (white bars) also decreased at 48, 72 and 96 hours compared to T0. However,
the percentage of hMPC Y-specific DNA was always higher than the percentage of radioactivity (figure 20A) because the lost of male DNA due to cell death was partially
compensated by cell proliferation. For each time point, there was no significant difference
in the percentage of radio-activity between the control and the 1,25-D3 treated mice.
Interestingly, at 96 hours, the percentage of hMPC Y-specific DNA was significantly
higher (p<0.01) in 1,25-D3 treated mice (33.25 + 1.67) than in control mice (26.36 + 2.26).
To determine the proliferation of viable hMPCs, an index of hMPC proliferation was
calculated by dividing the percentage of hMPC Y-specific DNA by the percentage of radioactivity for the same muscle (figure 20B). Interestingly, we observed that hMPCs
proliferated constantly, in 1,25-D3 treated as well as in control mice, since the proliferation
index increased progressively. Moreover, this proliferation index being around 2, at 48
hours after the transplantation and around 4, at 96 hours after the transplantation, the hMPC
population doubling time in vivo (48 hours) was slightly higher than the doubling time
observed in vitro (36-40 hours in figure 16). Moreover, the proliferation index in mice
treated with 1,25-D3 was significantly increased at T96 hours (5.15 + 0.33, p<0.001)
compared to the control group at the same time (3.84 + 0.26).
110
3.4 Discussion
3.4.1 MPC transplantation success is reduced by cell death
The transplantation of hMPCs is a promising treatment to increase the repair of
damaged muscles and to delay the severe problems of inherited myopathies. The originality
of this approach is that the in vivo proliferation of hMPCs, before their fusion, may
increase the number of cells able to either fuse later with damaged host muscle fibers or
with each others to form neo-fibers resulting exclusively from the fusion of transplanted
cells (Skuk et al 2004). Moreover, recent results obtained by our group indicated that MPCs
participate in the repair of damaged fibers more than two weeks after their transplantation
(Bouchentouf et al 2006). Thus hMPC transplantation could permit to treat severe muscle
injuries. It has been demonstrated in SCID mice that hMPCs participated to the muscle
regeneration with a high degree of efficacy (Huard et al 1994b). Furthermore a recent
clinical trial confirmed that hMPC transplantation could restore dystrophin expression in
DMD patients (Skuk et al 2004; Skuk D 2005). However, one of the main problems facing
this therapy is the high loss of about 60-70% of the grafted cells in the first 48 hours posttransplantation (figure 20A, black and white columns). This observation confirms previous
results obtained in our laboratory or by other teams (Bouchentouf et al 2004; El Fahime et
al 2003; Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003; Suzuki et al 2004).
Nevertheless, this important drop of viable cells was partially balanced by the proliferation
of transplanted cells (Skuk et al 2003). This result was confirmed (figure 20A) with the
partial compensation by cell proliferation of the lost of male DNA due to cell death. In
addition, it has been reported that an enhancement of the MPC fusion could contribute to
the improvement of the graft success (Brimah et al 2004; Lafreniere et al 2006). Therefore
it seems evident, that to promote effectively muscle regeneration, hMPCs must encounter
an environment that improves their proliferation, fusion and survival.
3.4.2 1,25-D3 signalization pathways in skeletal muscle cells
There is evidence that MAPK cascades are involved in the regulation of myogenesis
(Wu et al 2000). 1,25-D3 stimulates the proliferation of myoblasts and their differentiation
into myotubes (Boland et al 2005), and activation of tyrosine phosphorylation pathways
mediates its effects on muscle growth. In proliferating myoblasts, 1,25-D3 rapidly
111
promotes tyrosine phosphorylation of ERK-1/2, PLCγ (Morelli et al 2000). Ras, c-Src, Raf1 and MAPKK (also known as MEK) participate in the activation of ERK-1/2 by 1,25-D3
(Buitrago et al 2003; Morelli et al 2001); moreover, in muscle cells, the ERK cascade is
positively regulated by PKCa through Raf-1 activation (Buitrago et al 2003; Morelli et al
2001), and by Ca2C and calmodulin-dependent protein kinase II at the level of c-Src
(Buitrago et al 2003; Morelli et al 2001). Through these mechanisms, 1,25-D3 causes
translocation of ERK-1/2 from the cytoplasm to the nucleus in an active phosphorylated
form and induces the synthesis of the growth-related protein c-myc and stimulation of
muscle cell proliferation (Buitrago et al 2001). The signaling pathways involved in the
differentiation of skeletal muscle cells remain to be established. Nevertheless, the relative
contribution of ERK-1/2, p38, and JNK-1/2 through reorganization of actin cytoskeleton
could participate in muscle cell differentiation (Buitrago et al 2006).
3.4.3 1,25-D3 enhanced hMPC proliferation and fusion
We thus initially investigated the 1,25-D3 effect on hMPC proliferation and fusion.
Several studies demonstrated that 1,25-D3 enhanced the proliferation and the
differentiation of chicken embryonic myoblasts (Boland 1986; Boland et al 1995; Boland et
al 1985; Capiati et al 1999; Zanello et al 1997). In accordance with these results, we
observed, that a 1.10-6M 1,25-D3 clearly enhanced the in vitro proliferation of hMPCs
(figure 16). Moreover, we demonstrated that 1,25-D3 improved hMPC fusion relative to the
untreated control (figure 15). As expected, the in vivo proliferation of grafted hMPCs was
similarly increased, compared to the control group, at 96 hours post-transplantation (figure
20A, white columns, and 20B). Thus, we conclude that the improvement of hMPC
transplantation observed (figure 18A and 18B), could partially be due to the proliferative
effect of 1,25-D3. The increased hMPC differentiation induced by 1,25-D3 was also
demonstrated in vitro (figure 15). This 1,25-D3 effect could also be responsible in part for
the improved graft success. However, it remains presently difficult to evaluate, whether it is
the 1,25-D3 effect on proliferation or on differentiation, which plays the most important
role in the increased graft success.
112
3.4.4 Possible interaction of 1,25-D3 with the specific and innate
immunities
Several previous studies reported that 1,25-D3 also modulates the immune
peripheral tolerance (Adorini et al 2003; Berer et al 2000; Bhalla et al 1984; Bouillon et al
1995; Gregori et al 2001; Gregori et al 2002; Penna & Adorini 2000; Rigby et al 1987).
SCID mice were thus used in the present study to exclude the possibility that the improved
graft success involved a modulation of the specific immune response.
A significant inflammatory process is associated with hMPC transplantation and
there are some significant evidences concerning the modulation of the innate immunity by
1,25-D3 (Cantorna et al 1998b; Hullett et al 1998). In the early post-transplantation period,
a high hMPC mortality was observed in control mice as well as in 1,25-D3 treated mice
(figure 20A). This result suggests that innate immunity modulation by 1,25-D3 should not
be involved in the enhanced hMPC graft success.
Clinical trials based on allo-transplantation of hMPCs currently used FK506
immunosuppression (Skuk et al 2004; Skuk D 2005). Some studies reported a positive
synergy between FK506 and 1,25-D3 (Mathieu et al 1994; van Etten et al 2000). As
described in figure 19, the number of human dystrophin positive fibers was unchanged in
1,25-D3/FK506 treated mice compared with mice treated with 1,25-D3 alone. This result
suggests that FK506 administration to DMD patients will not reduce the improvement of
hMPC graft success produced by 1,25-D3 treatment. Additionally, 1,25-D3 and its analogs
seems to be potent dose-reducing drugs for immunosuppressors such as FK506 (van Etten
et al 2000), making them potentially interesting for clinical use in hMPC transplantation.
3.4.5 1,25-D3 did not reduce apoptosis
In the present study, we also investigated whether 1,25-D3 protects hMPCs during
the early post-transplantation period. The mechanisms involved in the early death of
transplanted cells remain unclear (Fan et al 1996; Skuk et al 2002a; Skuk et al 2003).
However, some studies demonstrated that the myoblast graft success could be improved by
preserving them from diverse pro-apoptotic factors (Bouchentouf et al 2004; El Fahime et
al 2003). As observed in our in vitro experiments (figure 17), hMPCs pre-treated with 1,25D3 were not protected from cell death induced by different pro-apoptotic factors such as
113
TNF-α, oxidative stress or staurosporin. Each of these factors are involved in diverse
apoptotic signaling pathways, which should be participating in vivo in the early death of
transplanted cells (Bouchentouf et al 2004). Thus, as expected from the in vitro experiment
(figure 17), 1,25-D3 administration did not reduce the death of the cells transplanted in
muscles in vivo (figure 20A, black columns). Indeed a similar drop of the percentage of
hMPC radio-activity was observed in the 1,25-D3 treated and in the control mice.
Nevertheless, hMPC graft success was significantly increased in 1,25-D3 treated mice
relative to control mice (figure 18A and 18B). Thus 1,25-D3 did not improve the success of
hMPC transplantation by a reduction of early hMPC death.
3.5 Conclusion
This study demonstrates for the first time that 1,25-D3 increases hMPC proliferation
and fusion. This property was observed in vitro for the fusion and in vitro/in vivo for the
proliferation. This proliferative and differentiative effect could partially contribute to
hMPC transplantation improvement observed in the 1,25-D3 treated mice. We have also
established that 1,25-D3 treatment does not, however, protect the grafted hMPCs from the
high mortality, which occurs in the early post-transplantation period. Thus 1,25-D3 did not
increase the MPC graft success through a mechanism involving a reduction of early cell
death. Further investigations should be done to understand which other 1,25-D3 properties
and by which signaling pathways this vitamin could be involved in the improvement of
hMPC transplantation. Nevertheless, in regard of the results obtained in this study, we
conclude that 1,25-D3 or its analogs (Amuchastegui et al 2005) could be good candidates to
improve therapies based on hMPC transplantation.
We thank AFM (Association Française contre les Myopathies) for the financial support of
this research project.
114
Figure 17 : 1,25-D3 increases hMPC differentiation
HMPCs were allowed to differentiate for 5 days in modified MCDB120
supplemented with different concentrations of 1,25-D3 (10-6M or 10-8M) or without 1,25D3 (Control). One 6 wells plate was used for each condition. The fusion index is the
percentage of nuclei in myotubes (cells with at least 3 nuclei) relative to the total number of
nuclei. This fusion index was established for each group by counting approximately 800
nuclei per picture (3 pictures per well for each of the 6 wells of each group). The *
represents a p<0.001 and δ a p<0.001, relative respectively to the control and to the 10-8M
group.
115
Figure 18 : 1,25-D3 enhances hMPC proliferation
HMPCs were initially plated during 24 hours in five 6 well plates containing
modified MCDB120 proliferation medium. HMPCs were then harvested separately from
each well of one of the 6 well plates and counted to establish the T0 values. 10-8M and 106M 1,25-D3 were then added to each of the wells of 2 plates for each concentration. Cells
from 6 wells for each 1,25-D3 concentration were harvested and separately counted with a
haematocytometer at 48 and 96 hours. This figure represents the mean number of cells
counted for each group. The * represents a p<0.001 and δ a p<0.001, relative respectively
to the control and to the 10-8M group.
116
Figure 19 : The 1,25-D3 does not reduce the hMPC mortality induced by staurosporin,
TNF-α or glucose oxydase.
HMPCs were placed during 48 hours in culture medium supplemented (white bars)
or not (black bars) with 1,25-D3 (1.10-6M). Following 1,25-D3 pretreatment, cells were
harvested, washed and plated. Finally cells were cultured 24 hours in the absence (Control)
or with 2 µM staurosporin (STAU) or 30 ng/mL tumor necrosis factor (TNF-α) or 0.1
U/mL glucose oxydase (Gox). This figure represents the percentage of hMPC mortality,
determined by Hoechst/PI staining, for each condition.
117
Figure 20 : 1,25-D3 improves the graft success of hMPCs.
Twelve SCID mice received 1,25-D3 orally (1,25-D3), from day –7 to day 30
relative to the time of hMPC transplantation. Twelve control mice received only the vehicle
(Control). All mice were transplanted at day 0 with 1.106 hMPCs in both TAs and
sacrificed on day 30.
(A) The mean number of muscle fibers expressing human dystrophin was
determined for each group (* p<0.001 compared to the control group).
(B) Representative TA sections of control (left panels) or 1,25-D3 treated SCID
mice (right panels).
118
Figure 21 : FK506 does not interfere with the 1,25-D3 treatment.
Twelve SCID mice received 1,25-D3 orally, from day –7 to day 30 relative to the
time of hMPC transplantation (1,25-D3). Twelve control mice received only the vehicle
(Control). To determine whether FK506 immunosuppression interfered with 1,25-D3
improvement of MPC transplantation, half of the 1,25-D3 treated mice were additionally
injected intramuscularly with FK506 (FK506+1,25-D3). As control, half of mice receiving
only the vehicle were additionally injected with FK506 (FK506). FK506 was daily
administrated during a period of 30 days post-transplantation. The mean number of human
dystrophin positive fibers was determined for each group. The * indicates a p<0.001 and δ
a p<0.001 relative respectively to the control and the FK506 group.
119
Figure 22 : In vivo mortality and proliferation index of hMPCs.
HMPCs were radio-labeled with [methyl-14C] thymidine before their transplantation in
both TAs of SCID mice treated or not with 1,25-D3. Control and treated mice were sacrificed at 0,
48, 72 and 96 hours and both grafted TAs where harvested. DNA was extracted from each muscle
(n=6 for each time and condition).
(A) The amount of radio-activity and the presence of Y-specific DNA within each TA were
measured on DNA extracts (respectively black and white columns). The percentages of radioactivity or Y-specific DNA were calculated as a percentage of the T0. (The * indicates a significant
difference with an ANOVA, i.e., p<0.01)
(B) The in vivo proliferation of transplanted hMPCs was evaluated by calculating the
proliferation index i.e., the percentage of Y-specific DNA divided by the percentage of radioactivity measured in the same TA. The mean index represents, at each time point, the mean values
obtained for each group of SCID mice. (The * indicates a significant difference with an ANOVA,
i.e., p<0.01).
120
4
Perte cellulaire à moyen et long terme
4.1 Causes
Le succès de la TM à long terme est directement compromis par les mécanismes de
rejet aigu. En effet, sans immunosuppression adéquate, la quantité de myoblastes du
donneur dans les muscle transplantés est extrêmement faible une semaine après injection, et
nulle un mois post-transplantation (Kinoshita et al 1996). Comme cela a été décrit (cf.
chapitre 1 : 4.3.6.3) le rejet aigu est le mécanisme par lequel les LTs cytotoxiques du
receveur détruisent l’allogreffe. Cette réponse implique tout d’abord l’interaction entre les
TCRs des LTs et les molécules de CMH de classe I des cellules du donneur. Bien que les
molécules du CMH de classe I soient habituellement faiblement exprimées sur les fibres
musculaires matures (Appleyard et al 1985; Karpati et al 1988b; Ponder et al 1983), leur
expression s’observe toutefois lors de la régénération musculaire, et dans les muscles des
patients atteints de DMD (Cifuentes-Diaz et al 1992; Curnow et al 1998; Mantegazza et al
1991; Michaelis et al 1993; Wiendl et al 2005). Par ailleurs, en dehors du fait que des
protéines du donneur soient présentées indirectement aux LTs (cf. chapitre 1 : 4.3.6.2),
certaines études laissent à penser que les myoblastes eux-mêmes pourraient servir de CPAs
(Goebels et al 1992). En effet, les myoblastes ne sont pas capables d’exprimer
ordinairement le CMH de classe II. Néanmoins, son expression ainsi que l’expression de
certaines molécules membranaires propres aux CPAs et participant aux présentations
antigéniques, pourrait être induite en présence de certaines cytokines (Curnow et al 1998;
Hohlfeld & Engel 1990a). Cependant, cette hypothèse est sujette a beaucoup de
controverses (Skuk & Tremblay 2003).
La TM allogénique, effectuée chez des souris immunocompétentes, a révélé la
présence de cellules lymphocytaires infiltrantes au niveau des tissus greffés (Guerette et al
1995a; Irintchev et al 1995; Skuk et al 2002a; Wernig et al 1995). Cette infiltration se
caractérise par la présence de poches de LTs CD8+ et CD4+. Ces LTs présentaient tous des
signes d’activation distincts (présence de récepteurs à L’IL-2, expression de granzyme B…)
(Guerette et al 1996; Guerette et al 1995b). L’invasion et la destruction des myotubes par
les LTs CD8+, considérée comme un signe de lymphotoxicité T dépendante, furent aussi
conjointement observée (Irintchev et al 1995). La destruction des myotubes observée ne
121
semble pas concerner seulement les néo-fibres ou les fibres hybrides mais également les
fibres de l’hôte. Ceci pourrait être du à la sécrétion continue de cytokines par les LTs
présents (Irintchev et al 1995; Wernig et al 1995). En outre, le rejet aigu de la greffe de
myoblastes ne requière pas nécessairement une incompatibilité antigénique majeure. En
effet, une simple différence pour des antigènes mineurs peut à elle seule provoquer un rejet
aigu de la TM. Ceci a été démontré chez la souris par l’injection de myoblastes issus d’un
mâle chez une femelle syngénique (Boulanger et al 1997). Les myoblastes ainsi greffés ont
tous été rejetés. L’ensemble de ces observations de rejet a été confirmé chez le chien (Ito et
al 1998b) et chez le singe (Kinoshita et al 1996; Skuk 2004).
4.2 Solutions précédemment envisagées
4.2.1 Immunosuppression
Le maintien de la survie d’un greffon chez un patient transplanté nécessite une
immunosuppression destinée à contrôler la réaction immunitaire induite par les LTs alloréactifs. Les premiers médicaments immunosuppresseurs étaient des antimitotiques et des
corticostéroïdes. La découverte fortuite des propriétés immunosuppressives de la
cyclosporine (CsA) par J.F. Borel en 1976 (Borel et al 1976), a conduit à rechercher plus
systématiquement l’effet de molécules biologiques sur la réponse immunitaire. C’est ainsi
que le FK506, la rapamycine, l’acide mycophénolique, la déoxyspergualine ont été
sélectionnés, permettant une action plus sélective. Les Acs antilymphocytes, les
immunotoxines, cytokines et molécules de fusion bloquant certaines interactions
cellulaires, sont venus diversifier la panoplie des traitements immunosuppresseurs. D’autres
molécules immunosuppressives sont en cours de développement, mais aucune d’entres
elles, utilisée en administration prolongée, n’a démontré une efficacité certaine pour
endiguer une réaction immunitaire néfaste sans induire un déficit immunitaire iatrogène
plus ou moins profond.
Le déficit immunitaire lié à des conditions immunosuppressives prolongées peut
provoquer l’apparition d’infections opportunistes telles que la pneumocystose, la
toxoplasmose, la listériose, la légionellose, l’aspergillose, la cryptosporidiose. De plus, les
infections virales sont fréquentes. Les plus remarquables sont les infections à
cytomégalovirus (transmises par l’organe ou la moelle greffés), les réactivations d’infection
122
par les virus herpès HSV1 et HSV2, le virus d’Epstein-Barr, les virus de la varicelle-zona,
du papillome et de l’hépatite (Allison AC 1993). Enfin, l’amoindrissement du système
immunitaire par une immunosuppression soutenue favorise l’apparition de pathologies
tumorales. Tous ces effets néfastes associés à l’immunosuppression soutenue nécessitent
des mesures de prophylaxie et de surveillance ainsi qu’un ajustement rigoureux des
traitements immunosuppressifs en fonction des risques et des bénéfices escomptés pour le
malade.
Dans le contexte de la TM, l’immunosuppression a une contrainte supplémentaire.
En effet, les myoblastes greffés ne doivent pas être détruits par les immunosuppresseurs, et
leur capacité myogénique ne doit pas non plus être perturbée. Ainsi, différents
immunosuppresseurs ont été testés pour satisfaire à ces exigences (Tableau 2). De ces
expériences, c’est l’administration de tacrolimus (FK506) qui a donné les meilleurs
résultats en TM chez la souris et chez le singe (Skuk 2004). Basé sur ces observations, le
FK506 fut également utilisé avec succès dans un essai de phase clinique I (Skuk et al
2004). Néanmoins, même si le FK506 s’avère être l’immunosuppresseur qui convient le
mieux à la TM, son administration à long terme est évidemment affligée d’effets
secondaires similaires à ceux liés à l’immunosuppression soutenue. De plus l’utilisation
prolongée de FK506 facilite l’apparition de problèmes de néphrotoxicité, d’hépatotoxicité,
et de neurotoxicité (Bennett 1998; Neu et al 1997; Schreiber & Crabtree 1992; Tanabe et al
1996). Tous ces effets néfastes viennent noircir l’espérance d’utiliser le FK506 pendant une
longue période de traitement.
4.2.2 Tolérance immunologique
4.2.2.1 Description
La tolérance, du latin tolerare (soutenir, supporter), correspond, médicalement
parlant, à l’aptitude d’un organisme à supporter sans symptômes morbides l’action d’un
médicament, d’un agent physique ou chimique déterminé. C’est aussi la capacité d’un
individu à accepter les effets, la présence, d’un facteur extérieur. La tolérance
immunologique reprend ces deux concepts puisqu’elle se définit comme étant un état de
non réponse du système immunitaire d’un individu en présence d’un antigène n’appartenant
pas au « soi ». Néanmoins, la réponse immunitaire de ce même individu demeure
123
fonctionnelle envers tout autre antigène. La tolérance immunologique présente cet
avantage, face à l’immunosuppression soutenue, de ne pas réduire les défenses
immunitaires des patients tolérisés contournant de fait les risques de développement
d’infections opportunistes et de tumeurs. Néanmoins, l’obtention de ce statut de tolérance
en clinique fait figure de « quête du Saint Graal ». En effet, l’induction de tolérance repose
sur les premiers travaux de Brent, Billingham et Medawar (Starzl 2000) effectués au début
des années 1950. Depuis, beaucoup de protocoles ont été développés chez la souris, mais
peu ont abouti chez le singe ou le chien. Quant à l’existence de protocoles au niveau
clinique, très peu de tentatives ont vu le jour et aucune n’a été reconduite (Fehr & Sykes
2004).
124
Immunosuppression
Résultat de
la TM chez
le singe
Résultat de
la TM chez
l’Homme
Problèmes reliés
Cyclophosphamide
Résultat
de la TM
chez la
souris
Négatif
Non décrit
Négatif
Cette drogue détruit les
cellules en prolifération.
Elle détruit les myoblastes
transplantés
Cyclosporine A
Positif
Non décrit
Controversé
En dose thérapeutique,
provoque une inhibition
de la fusion des
myoblastes; bloque la
différenciation et induit
l’apoptose des myoblastes
de souris; inhibition de
l’hypertrophie du muscle
strié squelettique par
inhibition de la
calcineurine.
Mycophenolate
mofétil
Négatif
Non décrit
seul, Positif
en
combinaison
avec le
tacrolimus
Non décrit
Inhibition de la fusion des
myoblastes de souris.
Sirolimus
Positif
Non décrit
Non décrit
Non décrit
Tacrolimus
Positif
Positif
Positif
Inhibition de
l’hypertrophie du muscle
strié squelettique par
inhibition de la
calcineurine.
Tableau 2 : Résumé des immunosuppressions tentées dans le cadre d’une
transplantation de myoblastes.
Skuk 2004.
125
L’établissement d’une tolérance immunologique doit répondre à trois critères
essentiels :
1) l’absence d’une réponse spécifique dirigée contre le donneur,
2) l’absence d’une infiltration lymphocytaire destructrice dans le site de l’allogreffe,
3) la préservation de la réponse immunitaire à un haplotype autre que celui du
donneur, témoignant de la fonctionnalité de l’immunité spécifique du receveur tolérisé.
Les sections qui suivent vont tout d’abord survoler les principaux mécanismes sur
lesquels repose l’induction de tolérance. Puis, la tolérance sera abordée selon deux voies
différentes : la tolérance périphérique et la tolérance centrale. Ces deux types de tolérance
impliquent la combinaison des divers mécanismes immunologiques qui seront évoqués ciaprès. Les principes de la tolérance périphérique et centrale seront tour à tour explicités.
Enfin, un bref survol des différentes études pré-cliniques et cliniques sera effectué pour
chacune de ces voies de tolérisation. Néanmoins, l’accent sera mis sur la tolérance centrale
qui introduira directement le deuxième article de cette thèse.
4.2.2.2 Mécanismes de l’induction de tolérance
L’ensemble des mécanismes immunologiques impliqués dans l’établissement d’un
statut de tolérance ne sera pas abordé en détail dans cette thèse puisqu’il constituerait une
thèse en soi. De plus, le manque d’études mécanistiques effectuées chez le primate et chez
l’homme restreint les notions abordées ci-après à des études plus fondamentales effectuées
chez les rongeurs. Néanmoins, un résumé succinct des divers outils immunitaires impliqués
dans la tolérisation d’un receveur s’impose pour nous guider vers le deuxième article de
cette thèse.
On distingue 4 mécanismes immunologiques qui sont impliqués dans l’acceptation
par l’hôte de la présence cellulaire ou organique du donneur. Ces mécanismes sont
essentiellement les mêmes que ceux qui permettent le maintien de la tolérance envers les
antigènes du soi. Il s’agit de : la délétion, l’anergie, la régulation/suppression et l’ignorance.
Cependant, une des différences importantes entre la tolérance aux antigènes du soi par
rapport aux allo-antigènes, est la très importante proportion, dans le répertoire
126
lymphocytaire général de cellules T précurseurs et allo-réactives vis-à-vis du CMH du
donneur. En effet, les cellules T allo-réactives représentent 5 à 10% du répertoire
lymphocytaire chez la souris (Suchin et al 2001). De ce fait, l’établissement d’un protocole
de tolérance implique nécessairement de bloquer ou de détruire cette importante population
de cellules T précurseurs allo-réactives.
4.2.2.2.1
La délétion clonale
Comme son nom l’indique, la délétion clonale représente un mécanisme de
destruction des clones lymphocytaires réagissant contre les antigènes du donneur. La
délétion clonale peut survenir dans le thymus (organe lymphoïde primaire) ou dans les
organes lymphoïdes secondaires. Les termes de délétion centrale et de délétion périphérique
sont respectivement utilisés en fonction de l’organe lymphocytaire (primaire ou secondaire)
où la délétion s’effectue.
Bien que le thymus subisse une involution pendant la puberté, il continue à être
fonctionnel chez les adultes (Douek & Koup 2000) et joue un rôle important dans le
maintien de la tolérance au soi. Le thymus est impliqué dans la maturation des lymphocytes
T et la délétion centrale repose sur les mêmes principes que l’éducation thymiques des
thymocytes (cf. chapitre 1 : 4.2.2.1.2) (Manilay et al 1998). La délétion centrale implique la
destruction, au sein du thymus du receveur, des clones allo-réactifs néoformés lorsqu’ils
sont mis en présence des antigènes du donneur. Cette mise en présence peut être obtenue de
deux façons différentes qui seront abordées à la section du développement de tolérance
centrale (cf. chapitre relié).
La délétion des lymphocytes allo-réactifs en périphérie est aussi capitale pour le
développement d’une tolérance (Li et al 1999; Wells et al 1999). En effet, la destruction
seule des lymphocytes T allo-réactifs néoformés n’est pas une condition suffisante à
l’établissement d’une tolérance. Il est nécessaire de bloquer les clones matures présent en
périphérie (Fehr & Sykes 2004). La délétion périphérique implique indépendamment deux
types de mort cellulaire : la mort active et la mort passive. Dans ces deux cas les cellules
meurent par apoptose, mais utilisent des voies apoptotiques distinctes. La mort cellulaire
active est provoquée par une activation soutenue et prolongée des lymphocytes T
« activation induced cell death ». Les mécanismes impliqués dans cette apoptose sont fins
127
et complexes. Néanmoins il est communément établi que la principale voie de signalisation
qui soutient ce mécanisme fait intervenir le système « Fas/Fas ligand » ainsi que le
récepteur au TNF-α. La mort passive s’effectue par l’absence de facteurs de croissance.
Elle survient lorsque les lymphocytes allo-réactifs sont activés mais en absence d’IL-2.
Cette apoptose est indépendante de la voie du « Fas/Fas ligand » ainsi que celle du
récepteur au TNF-α (Sayegh & Turka 1998; Van Parijs & Abbas 1998). Ainsi, tous les
immunosuppresseurs bloquant la sécrétion de l’IL-2 provoquent la destruction des clones
allo-réactifs lorsque ceux-ci sont activés. À l’inverse, l’IL-2 est nécessaire à la délétion
clonale reposant sur la mort active (Li et al 1999; Wells et al 1999).
4.2.2.2.2
L’anergie
L’activation des lymphocytes T requièrent au moins deux signaux (Figure 15) (Fehr
& Sykes 2004). Tout d’abord leur activation nécessite un signal dépendant d’une
présentation antigénique conforme ou de toutes autres molécules déclenchant un signal via
le TCR. Puis, conjointement au premier signal, les lymphocytes T doivent recevoir un
signal de costimulation indépendant de la présentation antigénique et médié par les
molécules de costimulation (Figure 15). Ces molécules sont par exemple l’association
récepteur/ligand : CD28/CD80, CD154/CD40. Actuellement les signaux indépendants de la
présentation antigénique sont divisés en deux : d’un côté les signaux se basant sur
l’interaction récepteur/ligand avec un ligand solide, de l’autre, les signaux se basant sur
l’interaction récepteur/ligand avec un ligand sécrété (tels que les cytokines comme l’IL-2)
(Fehr & Sykes 2004). Quoiqu’il en soit, si les signaux médiés par le TCR ne sont pas
supportés par les autres signaux, alors les lymphocytes T entrent dans un statut d’anergie.
128
Figure 23 : Schématisation de l’activation des lymphocytes T. Classiquement, l’activation
des cellules T requière au moins deux signaux : Un signal dépendant de l’interaction du
récepteur des lymphocytes T (TCR) avec le complexe majeur d’histocompatibilité
présentant un antigène (CMH/peptide) (1), puis un deuxième signal indépendant de la
présentation antigénique et mettant en jeu les molécules de costimulation (2 et 3). Plus
récemment, la signalisation indépendante de la présentation antigénique a été scindée en
deux signaux distincts. Le signal (2) correspondant à l’interaction des molécules de
costimulation entre la cellule présentatrice d’antigènes (CPA) et le lymphocyte T, le signal
(3) représentant la voie autocrine de stimulation des lymphocytes par l’interleukine 2 (IL2)
et son récepteur (IL2-R). Autres abréviations : NFAT (facteur nucléaire des cellules T
activées); NF-κB (facteur nucléaire kappa B).
129
L’anergie se définit alors comme un état réfractaire des cellules T qui, après un
premier contact avec l’antigène, deviennent incapables d’être activées. Il est également
important de noter que suite à une anergie, les lymphocytes T ont une durée de vie plus
courte et meurent par apoptose.
4.2.2.2.3
La régulation/suppression
Les cellules T régulatrices, principalement les cellules exprimant les « clusters » de
différenciation CD4/CD25 sont actuellement « sous le feu » de l’actualité immunologique.
Beaucoup de publications sont parues ces dernières années sur les lymphocytes T
régulateurs. L’immunorégulation dépendante de ces lymphocytes T est un des mécanismes
principaux responsables du maintien de l’homéostasie des lymphocytes T et de la tolérance
envers des antigènes spécifiques (Bach et al 1968). La régulation/suppression a été mise en
évidence dans les modèles de tolérance infectieuse où, après induction d’une tolérance chez
un receveur A1 vis-à-vis d’un donneur B, celle-ci peut être transmise à un autre receveur
syngénique A2 par injection de cellules TCD4+CD25+ de A1 (T régulateurs) (Qin et al
1993). La liste des marqueurs candidats permettant l’identification des lymphocytes T
régulateurs s’accroît continuellement et inclut une expression du CD45RB (faible
expression) (Hara et al 2001), du CD152 (Kingsley et al 2002), du CD62L (L-sélectine)
(Herbelin et al 1998), du « glucocorticoïd-induced tumor-necrosis factor » (GITR)
(Zelenika et al 2002), du CD122 (chez les cellules humaines seulement) (Levings et al
2001). Cependant, le facteur de transcription FOXP3 (Hori et al 2003) semble récemment
se démarquer comme étant le facteur exprimé par les lymphocytes T régulateurs.
Un nombre croissant d’évidences expérimentales et cliniques suggèrent que les
cellules T régulatrices jouent un rôle important dans le maintien du statut de tolérance
(Wood & Sakaguchi 2003). Au moins trois mécanismes se démarquent et semblent être
importants dans ce sens. Des études précliniques et cliniques suggèrent que les effets des
lymphocytes T régulateurs requièrent la production d’IL10 et de TGF-β (Hara et al 2001;
Torrealba et al 2004). Les fonctions des lymphocytes T CD4/CD25 semblent être
particulièrement affectées par l’expression des molécules de surface GITR (McHugh et al
2002; Shimizu et al 2002) et CTLA-4 « cytotoxic T lymphocyte antigen 4 » (Kingsley et al
2002). Ces molécules semblent participer à un effet régulateur par contacts cellulaires
130
(Jiang & Lechler 2003; Wood & Sakaguchi 2003). Enfin, les lymphocytes T régulateurs
pourraient également être impliqués dans l’inhibition de la maturation (et ainsi des
fonctions) des cellules dendritiques (Vendetti et al 2000).
La régulation/suppression via les cellules régulatrices a été plus qu’étudiée
expérimentalement ces dernières années. Cependant, la connaissance clinique du rôle de ce
mécanisme de régulation dans la tolérance immunologique reste mince (Newell et al 2006).
Il n’est donc pas encore envisageable de développer un protocole de tolérance basé sur les
lymphocytes T régulateurs dans le cadre de la TM.
4.2.2.2.4
L’ignorance
L’ignorance est le dernier des mécanismes connus permettant le développement
d’une tolérance dans le cadre d’une transplantation allogénique. La situation d’ignorance
correspond, physiologiquement parlant, à la non rencontre entre les cellules lymphocytaires
et les alloantigènes. Ceci peut arriver dans deux situations distinctes : soit aucun allo
antigène ne peut atteindre et être présenté au système lymphoïde de l’hôte, soit les cellules
T ne peuvent atteindre les antigènes exogènes. Dans un contexte de transplantation ces
situations peuvent survenir lors de greffes non vascularisées (greffe allogénique de cornée
par exemple) (Lafferty et al 1983; Starzl & Zinkernagel 2001). Également, la protection de
cellules greffées dans des sites immuno-protégés (encapsulation des îlots de Langerhans)
(Duvivier-Kali et al 2001), peut conduire à un échec de la présentation des alloantigènes du
donneur aux lymphocytes T du receveur. Malheureusement, ce mécanisme d’ignorance
n’est pas applicable à une greffe d’organe qui nécessite une vascularisation. Dans le cadre
de la TM, les cellules injectées ont besoin de fusionner avec les fibres de l’hôte rendant
également impossible toute isolation (avec des biocapsules par exemple) vis-à-vis du
système immunitaire. Pour l’instant, ce mécanisme de tolérance n’est donc pas
envisageable dans le cadre de la TM.
4.2.2.3 Induction de tolérance
Au cours de ces 15 dernières années, la compréhension des mécanismes
immunologiques
impliqués
dans
l’établissement
d’un
statut
de
tolérance
a
considérablement augmenté. Cependant la transposition des protocoles viables chez la
souris aux primates non-humains ainsi qu’à l’homme reste difficile (Fehr & Sykes 2004;
131
Kean et al 2006). C’est pourquoi, les sections suivantes mettront l’accent sur les protocoles
de tolérance qui ont été effectués chez les primates non-humains et chez l’homme.
L’ensemble des protocoles intentés se répartiront selon deux principes de tolérances : la
tolérance périphérique et centrale.
4.2.2.3.1
Induction tolérance périphérique
La tolérance périphérique repose sur les mécanismes d’anergie, de délétion
(périphérique), et de régulation (Dong et al 1999). Cela fait plus de trente ans que fut posé
le concept d’activation des cellules T via des molécules de costimulation (Bretscher &
Cohn 1970) et maintenant dix ans que les principales voies d’activation furent identifiées.
Les voies d’activation qui sont pour l’instant les plus connues et utilisées dépendent
de l’association des molécules CD80 et CD86 avec le CD28 (Figure 15) ainsi que de
l’association du CD40 avec son ligand le CD154. Le blocage de ces deux voies de
costimulation a notamment permi le développement d’une tolérance allogénique chez la
souris (Larsen et al 1996). S’appuyant sur ce résultat, des protocoles reprenant les mêmes
principes ont été effectués chez les primates non-humains. En ce qui concerne le blocage de
la voie dépendante du CD28, deux méthodes ont été tentées. Il s’agissait de bloquer la
liaison du CD28 au CD80 ou au CD86 via l’utilisation d’Acs bloquants (Birsan et al 2003;
Haanstra et al 2003; Hausen et al 2001; Kirk et al 2001; Montgomery et al 2002; Ossevoort
et al 1999) ou d’une protéine de fusion appelée CTLA-4 Ig (Kirk et al 1997; Larsen et al
2005; Levisetti et al 1997). L’utilisation en monothérapie d’Ac bloquant le contact du
CD80 et/ou du CD86 n’a pas fonctionné. L’utilisation de la protéine de fusion n’a pas
donné de meilleurs résultats (quoiqu’une prolongation de la vie des reins greffés). Il faut
noter aussi que le rejet survenait après arrêt de l’administration des ces molécules bloquant
les voies de costimulation. Les résultats décevant résultant de l’administration de CTLA-4
Ig furent attribués à la mauvaise affinité du CTLA-4 Ig pour le CD80 et le CD86 de singe.
Pour remédier à ce problème le CTLA-4 Ig fut remplacé par le LEA29Y (belatacept), une
version mutée du CTLA-4 IG. Les résultats en monothérapie ne furent pas beaucoup
améliorés (L S Kean). Malgré tout, l’administration combinée et prolongée de LEA29Y
avec de la rapamycine et des Ac bloquant les récepteurs de L’IL-2 permis de réduire la
toxicité des protocoles d’allogreffes de rein (Vincenti et al 2005).
132
Le blocage de la liaison du CD154 au CD40 s’est construit sur l’utilisation d’Ac
anti-CD154. La plupart des Ac utilisés permirent un prolongement de la survie des
allogreffes de rein chez le singe (Fehr & Sykes 2004). Néanmoins, tous les animaux traités
en monothérapie développèrent des problèmes de rejet chronique accompagnés
d’infiltration de cellules mononuclées au niveau du greffon. Des résultats similaires ont
également été rapportés pour les greffes de cœur et d’îlots de Langerhans. De ce fait le
statut de tolérance n’a pas été considéré comme atteint avec ces approches (Fehr & Sykes
2004; Kean et al 2006). Il en va de même avec la combinaison d’Ac anti-CD154 avec le
CTLA-4 Ig ou des Ac anti-CD80/CD86 (Montgomery et al 2002; Pearson et al 2002) Pour
couronner le tout, l’utilisation en clinique d’un traitement basé sur l’administration d’antiCD154 a été affligée de l’apparition d’un évènement thromboembolique (Knechtle et al
2001). L’utilisation en clinique d’anti-CD154 fut de fait suspendue.
La stratégie qui consiste en une déplétion drastique et transitoire des cellules T
alloréactives est conceptuellement assez différente du blocage des molécules de
costimulation. Le principe repose sur l’élimination des cellules T du receveur qui survient
lors du pic de l’activation immunitaire reliée à la transplantation. La repopulation retardée
des clones lymphocytaires est supposée favoriser la prise de la greffe ainsi que
l’établissement d’un statut de tolérance. Chez le primate, le résultat le plus encourageant fut
obtenu lors de l’utilisation d’une toxine diphtérique modifiée couplée à un anti-CD3 de
singe Rhésus (IT) (Neville et al 1996). La première administration en monothérapie de cette
molécule provoqua la mort de plusieurs singes et n’empêcha pas le rejet (2/3) des greffes de
rein intentées. (Fehr & Sykes 2004). Néanmoins, combinée à 14 jours d’administration de
déoxyspergualine (DSG), l’IT amena à la survie des allogreffes de rein (au-delà d’un an)
chez 75% des singes Rhésus transplantés. La DSG est une drogue connue pour interférer
avec le facteur nucléaire NFκB, facteur notamment impliqué dans la signalisation
dépendante de nombreuses cytokines. Ce régime fut appelé STEALTH (Thomas et al
2001). Néanmoins, la repopulation des cellules T nécessita 6 mois post-traitement ce qui est
considérable et pourrait fragiliser le système immunitaire des patients traités. De plus, l’IT
n’a pas d’affinité pour le CD3 humain (Fehr & Sykes 2004).
4.2.2.3.2Induction de tolérance centrale
133
La tolérance centrale est dépendante de la délétion thymique des clones alloréactifs.
Cette délétion peut entre autre être obtenue en injectant directement dans le thymus des
antigènes du donneur. Toutefois, cette méthode ne permet pas un apport thymique continu
en allo antigènes et de ce fait conduit au développement d’une tolérance transitoire (Fehr &
Sykes 2004).
Pour stabiliser la délétion thymique, il est important de faire exprimer en
permanence les allo antigènes par les cellules thymiques. Ceci s’avère possible avec le
chimérisme hématopoïétique. A l’origine, le mot chimère (chimaera en grec) désigne un
monstre mythologique dont l’apparence est un mélange de lion (tête et poitrail), de chèvre
(ventre) et de dragon (queue), bref un excellent exemple de tolérance immunologique
poussée à son extrême. Le chimérisme hématopoïétique reprend un peu ce concept
puisqu’il implique l’existence d’un système sanguin mixte où cellules du donneur et du
receveur coexistent. Les fondations du chimérisme hématopoïétique s’appuient sur la greffe
de moelle osseuse. En effet, la moelle osseuse est le berceau des cellules souches
hématopoïétiques. Ces cellules ont la capacité de se différencier en plusieurs cellules de la
lignée hématopoïétique. Les cellules une fois différenciées gagnent le système sanguin
périphérique et pour certaines d’entre elles (cellules dendritiques par exemple) s’installent
dans le thymus. Ainsi des cellules provenant de l’haplotype du donneur peuvent participer à
l’éducation thymique des thymocytes néoformés (qui peuvent entre autre avoir l’haplotype
du receveur comme de l’hôte) (Starzl 2004). Le statut de tolérance ainsi induit, via
l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique, est communément considéré (chez les
rongeurs) comme la plus robuste des approches thérapeutiques (Sykes 2001). Ce concept
fut également épisodiquement vérifié chez l’homme dès 1991 d’abord pour des greffes de
rein (Sayegh et al 1991) puis de poumon (Svendsen et al 1995a; Svendsen et al 1995b;
1999; Svendsen et al 1995c) et de foie (Kadry et al 2003). Malheureusement, l’obtention du
chimérisme hématopoïétique n’est pas une étape facile à atteindre. En effet, deux
importants facteurs sont à prendre en considération pour obtenir du chimérisme :
La suffisance des cellules de moelle du donneur capables de reconstituer à un
niveau acceptable une partie des lignées hématopoïétique du receveur.
134
L’efficacité de la destruction où de l’anergie des clones matures alloréactifs du
receveur afin d’assurer la survie des cellules dérivant de la moelle osseuse du donneur.
Pour répondre au premier problème, il est nécessaire d’aborder la notion de niveau
de chimérisme. Il existe plusieurs échelles de chimérisme qui représentent la proportion de
cellules d’haplotype du donneur que l’on retrouve dans le sang périphérique du receveur.
Le microchimérisme désigne un état où la proportion des cellules du donneur ne dépasse
pas 1% des cellules hématopoïétiques du receveur. Le microchimérisme est détecté par des
techniques ultrasensibles, comme par amplification en chaîne par polymérisation
« polymerase chain reaction » (PCR). L’implication du microchimérisme dans la survie des
greffes n’a pas été démontrée clairement (Elwood et al 1997; Schlitt et al 1994; Wood &
Sachs 1996). Le macrochimérisme correspond à une proportion de cellules du donneur
supérieure à 1%. Le macrochimérisme se subdivise également en chimérisme mixte ou
partiel (>1% et <100% des cellules du donneur) et en chimérisme total (100% des cellules
du donneur). Toutefois, le chimérisme mixte offre certains avantages par rapport au
chimérisme total, incluant une immunocompétence supérieure (Ildstad et al 1986; Singer et
al 1981) et une susceptibilité réduite de GVHD (Ildstad et al 1986). C’est l’efficacité des
méthodes de myéloablation qui détermine le niveau de chimérisme obtenu. En effet, la
myéloablation favorise la nidation des cellules souches hématopoïétiques du donneur et de
ce fait le développement d’un chimérisme (Sykes 2001). Une myéloablation partielle
conduira à un chimérisme partiel et une myéloablation totale à un chimérisme total.
L’obtention d’un chimérisme mixte apparaît comme le choix le plus judicieux, tant par la
diminution des risques encourus par le receveur que par l’efficacité de ce type de
chimérisme pour répondre aux besoins de l’établissement d’une tolérance immunologique.
Les protocoles de myéloablation partielle, développés chez les rongeurs ou chez les
primates et appelés également par extension abusive non-myéloablatifs, s’appuient sur
l’irradiation du corps du receveur ou sur l’administration de drogues myéloablatives (Fehr
& Sykes 2004; Kean et al 2006). Bien que les protocoles qui utilisent l’irradiation du
receveur affichent une certaine efficacité quant à l’établissement d’un chimérisme mixte,
leur utilisation en clinique est peu appréciée, voir proscrite (Fehr & Sykes). L’autre façon
d’effectuer une myéloablation nécessite le recours à l’utilisation d’agents alkylants et de
certains agents anti-néoplasiques. L’utilisation des ces agents est accompagnée d’une
135
certaine toxicité, dépendamment de la dose utilisée. Parmi ces agents, il y a le
cyclophosphamide (Mayumi & Good 1989), le busulfan (Tomita et al 2000), le diméthyl
myleran (de Vries-van der Zwan et al 1998), la fludarabine (Pan et al 2003) et le treosulfan
(van Pel et al 2003; 2004).
La deuxième condition à remplir pour obtenir du chimérisme hématopoïétique
implique que lorsque la place est faite pour accueillir la moelle du donneur, il devient
capital de s’assurer que celle-ci ne soit pas rejetée par les clones alloréactifs du receveur.
Pour répondre à ce problème plusieurs approches ont été envisagées. La déplétion et/ou
l’anergie efficace des clones alloréactifs a été rapportée chez les rongeurs dans des
protocoles ayant recours à l’irradiation (thymique et/ou sur l’ensemble du corps) (Sharabi
& Sachs 1989) ainsi que l’utilisation d’Ac déplétants/bloquants (Nikolic et al 2001; Tomita
et al 1996b; Wekerle et al 1999). Comme cela a été mentionné au début du chapitre sur la
tolérance, beaucoup de protocoles ont été testés chez les rongeurs mais peu d’entre eux ont
vu le jour sur les primates humains ou non humains. Parmi ces protocoles deux ont retenu
l’attention de cette thèse.
La première approche est basée sur l’utilisation de l’Ac anti-CD154. Les premiers
protocoles utilisant cet Ac furent développés chez les rongeurs. Ces protocoles visaient à
bloquer les signaux de co-stimulation entre le CD40 et son ligand (CD154) (Figure 15).
L’anti-CD154 fut utilisé dans des protocoles de développement de tolérance périphérique
mais l’ensemble de ces protocoles ne conduisit qu’à une prolongation de la survie des
greffes intentées (Fehr & Sykes 2004). Les protocoles impliquant une transplantation de
moelle osseuse (BMT : « Bone Marrow Transplantation ») associée à une administration
d’anti-CD154, amenèrent (chez la souris) au développement d’un chimérisme
hématopoïétique mixte. L’obtention du chimérisme permit d’aboutir à un statut de
tolérance à long terme. Deux de ces protocoles requéraient une irradiation corporelle
généralisée (TBI : « Total Body Irradiation) d’une intensité de 3Gy (Wekerle et al 1998).
Pour palier au recours à l’irradiation, des protocoles utilisant des drogues cytoréductrices (à
action plus ciblée que l’irradiation) furent également intentés avec succès chez la souris.
Ces drogues étaient le busulfan (Adams et al 2001) ou la fludarabine associée à du
cyclophosphamide (Pan et al 2003). Enfin, pour augmenter l’effet de l’anti-CD154,
136
l’ensemble des protocoles cités ci-dessus impliqua l’administration conjointe d’autres Ac
bloquants ou déplétants tels que le CTLA-4 Ig (Adams et al 2001; Wekerle et al 1999),
l’anti-CD8 (Ito et al 2001) ou de cyclophosphamide (Guo et al). De part ces résultats, deux
protocoles utilisant l’anti-CD154 furent développés pour effectuer des greffes allogéniques
de myoblastes. L’un de ces protocoles visait à obtenir une tolérance périphérique sans
passer par un chimérisme hématopoïétique. Malheureusement, et en suivant la logique des
tentatives similaires d’établissement de tolérance périphérique, l’anti-CD154 ne conduisit
qu’à une prolongation de la survie des transplantations de myoblastes (Camirand et al
2002). La combinaison d’une BMT accompagnée d’une myéloablation partielle par TBI
(3Gy) joint au protocole utilisant l’anti CD-154 donna des résultats très satisfaisants. En
effet, pour la première fois, une greffe de myoblastes était capable de tenir à long terme
sans immunosuppression soutenue (Camirand et al 2004). De plus, l’utilisation de l’antiCD154 ne se limita pas à une des tentatives restreintes aux rongeurs. En 1995, une équipe
de recherche proposait un protocole chez le primate non-humain basé sur l’établissement
d’un chimérisme hématopoïétique. Le traitement était très lourd puisqu’il impliqué une TBI
par irradiation (3Gy), une irradiation thymique (7Gy), une déplétion des cellules T par
administration d’immunoglobulines anti-thymocytes, une splénectomie et 4 semaines sous
cyclosporine. Ce conditionnement servit néanmoins à permettre la tenue à long terme (>1
an) d’une greffe de moelle osseuse allogénique suivie d’une greffe de rein du même
haplotype que le donneur (Kawai et al 1995; Kawai et al 1999). Il est intéressant de noter
que cette greffe tenue malgré le caractère transitoire du macrochimérisme observé. Pour
« adoucir le traitement » la splénectomie fut remplacée par la suite par l’administration
d’anti-CD154 (Kawai et al 2002; Kawai et al 2004). Les greffes de rein furent supportées
par
tous
les
singes
cynomolgus
(Macaca
fascicularis)
qui
développèrent
du
macrochimérisme transitoire. Ces résultats très encourageants conduirent à la production
d’un anti-CD154 qui reconnaissait le CD154 humain. Le premier patient qui reçu cet Ac
souffrit de complications thromboemboliques (Kawai et al 2000). Ce problème est
néanmoins contournable chez le singe Cynomolgus par l’utilisation de ketorolac (un antiinflammatoire non stéroïdien) (Koyama et al 2004). Ces tentatives fortement intéressantes,
réalisées sur le singe, conduirent à la réalisation d’une expérience sur deux patients
humains. Le protocole incluait une cytoréduction au cyclophosphamide, un traitement avec
137
des immunoglobulines anti-thymocytes, une irradiation thymique et 3 à 9 mois
d’administration de cyclosporine A (Fehr & Sykes 2004). Les deux patients qui reçurent
une greffe de moelle et une transplantation rénale provenant du même donneur,
développèrent du macrochimérisme transitoire et ne rejetèrent pas leur greffe (Buhler et al
2002). Cependant, l’évaluation de la morbidité de ce type de protocole, même partiellement
myéloablatif, fut vue par beaucoup comme excessive vis-à-vis des traitements basés sur une
immunosuppression classique (Guenther & Madsen 2005). Les plus grandes réticences des
cliniciens reposent sur le risque inconnu à long terme que représente une TBI partielle, la
méconnaissance de l’activité clinique détaillée des Ac utilisés, ainsi que la lourdeur
thérapeutique du traitement dans son ensemble (Guenther & Madsen 2005). La lourdeur
thérapeutique d’un traitement est d’autant plus importante lorsque le protocole est appliqué
à un enfant (dystrophique en l’occurrence). Pour accabler le verdict, il faut rappeler que les
Ac utilisés chez les rongeurs, voir même, chez les primates non humains, ne sont pas
toujours disponibles pour une utilisation clinique. Il faut souvent produire ces Acs. De ce
fait, le manque de recul, quant aux effets cliniques de ces nouveaux Acs, combiné au coût
que pourrait entraîner leur production et leur utilisation, freinent considérablement
l’aboutissement des protocoles de tolérance basés sur l’induction de chimérisme
hématopoïétique.
La deuxième approche envisagée pour obtenir un chimérisme hématopoïétique
débouchant sur l’établissement d’un statut de tolérance allogénique, se base sur l’utilisation
de drogues cytoréductrices. C’est cette approche qui est abordée dans le deuxième article de
cette thèse.
138
5 Article II : Induction d’une tolérance pour des
greffes allogéniques par un protocole de myéloablation
partiel ne requérant ni anticorps ni irradiation du
receveur.
Ce deuxième article propose une approche thérapeutique basée sur l’utilisation
exclusive de drogues cytoréductrices afin de permettre un développement de tolérance
immunologique applicable à une greffe allogénique de myoblastes. L’auteur principal est
l’investigateur prépondérant de cette étude, il a contribué à toutes les expériences réalisées
et rédigé l’article. Pichavant Christophe a mis au point la technique d’ELISPOT, Manaf
Bouchentouf et Phillippe Mills ont participé aux greffes de myoblastes et la mise en forme
informatique des photos effectuées. Saloua Tagmouti a participé aux greffes de peaux,
Geoffrey Camirand a contribué à la bonne rédaction de cet article, et David Rothstein a
révisé celui-ci avant publication. Cet article a été accepté dans la revue Cell Transplantation
(Stephan et al 2006).
139
5.1 Résumé de l’article II
Le principal avantage du chimérisme hématopoïétique mixte est de permettre de
contourner les protocoles impliquant une immunosuppression soutenue. Cependant,
l’ensemble des approches permettant d’aboutir à ce statut de chimérisme requière
l’utilisation massive d’anticorps et/ou l’irradiation de l’hote. Une première expérience
visant à obtenir du chimérisme et combinant l’administration de Busulfan et de
Cyclophosphamide donna des résultats prometteurs. Parallèlement, de récentes publications
ont révélé à la différence du Busulfan que l’administration de Treosulfan était nettement
moins toxique. Pour l’instant, la transplantation de myoblastes (TM) nécessite une
immunisation soutenue des patients dystrophiques. Cet article propose une approche
expérimentale moindrement toxique permettant d’obtenir de la tolérance pour la TM. Ainsi,
des souris dystrophiques C57Bl10J mdx/mdx ont reçu une transfusion donneur-spécifique,
une dose de cyclophosphamide combinée à 3 doses de Treosulfan et une transplantation de
moelle provenant de nos souris donneuses BALB/c. Ce traitement (TTCB) fut administré
aux souris mdx, avant une première TM dans le Tibialis anterior (TA) de BALB/c. Une
seconde TM fut réalisée 100 jours après dans les TA opposés. Les résultats ont démontré
que toutes les souris ayant reçu le traitement TTCB ont développé un chimérisme
hématopoïétique mixte. Également, nous avons détecté, dans les deux TAs greffés, la
présence de fibres musculaires du donneur et ce longtemps après la TM. Seule une légère et
basale infiltration lymphocytaire fut décelée dans les muscles greffés. De plus, les souris
traitées demeuraient capables de rejeter une greffe provenant d’un tiers donneur. Ainsi, le
chimérisme hématopoïétique mixte, obtenu via le traitement TTCB, nous a permis de
développer une tolérance immunologique stable conduisant à l’acceptation à long terme
d’une TM allogénique et ce sans avoir recours à une immunosuppression soutenue. Par la
suite, ce protocole pourrait être appliqué à la TM pour les patients dystrophiques ou pour
d’autres types de transplantations.
5.2 Abstract
Mixed-chimerism
approach
is
a
major
goal
to
circumvent
sustained
immunosuppression but most of proposed protocols needed antibodies treatment or host
irradiation. Another promising experience involved a Busulfan combined with
140
Cyclophosphamide treatment. Additionally, recent publications demonstrated that, differing
to Busulfan, treosulfan administration not presented severe organ or hemato toxicities.
Currently, Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients are treated with chronic
immunosuppression for muscle precursor cell transplantation (MT). We have developed a
safely tolerance approach within this cellular allo-transplantation therapy background.
Thus, we have conditioned, prior to a donor BALB/c MT, the dystrophic mouse model
C57Bl10J mdx/mdx, with our treatment based on a donor specific Transfusion, then a
Treosulfan treatment combined with single Cyclophosphamide dose and finally a donor
Bone marrow transplantation (TTCB). A first MT was performed in all mixed-chimeric
mice resulting from the TTCB treatment in the left Tibialis anterior (TA) muscles. A
second MT from the same donor strain was performed 100 days later in the right TA
without any additional therapy. Results show that all treated mice developed permanent
mixed-chimerism. Long-lasting donor positive fibers were present in both TAs of the mice,
which received MT after the TTCB treatment. Only basal level of infiltration was observed
around donor fibers and mixed-chimeric mice rejected third-party haplotype skin grafts.
Thus, mixed-chimerism development with this TTCB conditioning regimen promotes
donor specific stable tolerance avoiding costimulatory blockade antibodies or irradiation
use and side effects of sustained immunosuppressive treatments. This protocol could be
eventually applied for MT to DMD patients or others tissue transplantations.
6 Title : Induction of tolerance across fully
mismatched barriers by a non myeloablative treatment
excluding antibodies or irradiation use.
6.1 Introduction
Rejection of organ or cell allo-transplantation is currently prevented with
immunosuppressive drugs such as cyclosporine, FK506, mycophenolate mofetil, etc.
Although these drugs are very effective for this purpose, their non-specific immunosuppression increases recipient’s risks of developing opportunistic infections and
malignancies. Moreover their use is associated with some toxicities (Bennett 1998;
Falkenhain et al 1996; Glover et al 1997; Neu et al 1997; Penn 1998; Tanabe et al 1996). In
addition, chronic rejection is not well controlled by these immunosuppressive agents. An
141
alternative approach to permit graft acceptance by the host immune system is to induce
immunological tolerance. The establishment of mixed hematopoietic chimerism has several
advantages over other tolerance-inducing methods. In mixed-chimeras, tolerance to both
host and donor is permanently established leading to the absence of both graft-versus-host
and host-versus-graft diseases (Sharabi & Sachs 1989; Wekerle & Sykes 1999). Many
protocols to induce mixed-chimerism have been investigated, but most of them required
antibody treatment or irradiation of the host (Camirand et al 2004; de Vries-van Der Zwan
et al 1994; Kawai et al 2004). An interesting protocol based on stable multi-lineage
chimerism involved a non-myeloablative treatment with Busulfan (BUSILVEX ®) in mice
primed with allogeneic spleen cells followed by a single dose of an immunosuppressive
drug, Cyclophosphamide (PROCYTOX ®) (Tomita et al 2000). However, Busulfan
administration is associated with severe organ and hemato-toxicity, which may not be
avoided, even after reduced-intensity conditioning (Kroger et al 2001; Ringden et al 1999;
Schetelig et al 2002; Slavin et al 1998; Storb et al 1997).
A Busulfan analog already used in clinics is Treosulfan (OVASTAT ®), a prodrug
of a bifunctional alkylating cytotoxic agent. It is indicated for oral or intravenous treatment
of human advanced ovarian cancer (Duncan & Clayton 1985; Gropp et al 1998; Masding et
al 1990; Meden et al 1997). Recently, a successful combination of Treosulfan with
Cyclophosphamide or fludarabine has been tested as a new preparative regimen before
allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in several patients with haematological
malignancies (Beelen et al 2005; Casper et al 2003; 2004). Furthermore, last years, a few
groups have obtained mixed-chimerism and tolerance specific induction, in mouse models,
with non myeloablative conditionings including Treosulfan (Ploemacher et al 2004; van Pel
et al 2003; 2004). However, these protocols still required depleting antibodies, which are
not always available or accepted for clinical use.
In the context of muscle precursor cell allo-transplantation (MT) as clinical
approach for the Duchenne muscular dystrophy (DMD), a sustained FK506
immunosuppression is required to prevent a MT rejection in mice (Camirand et al 2001),
monkeys (Kinoshita et al 1996; Skuk et al 2000) and humans (Skuk et al 2004). DMD is a
fatal neuromuscular genetic recessive disease characterized by widespread muscle
142
degeneration throughout the body. No cure is currently available for this disease, which is
caused by the deficiency of a subsarcolemmal protein called dystrophin. MT consist to
improve the strength of at least some muscles in DMD patients (Skuk et al 2004). Briefly,
normal muscle precursor cells (MPC) harvested from a healthy donor are injected in
skeletal muscles of DMD patients, fuse with host muscle fibers, introduce their nuclei
containing the normal dystrophin gene and thus restore dystrophin expression (Kinoshita et
al 1995a; Skuk et al 1999a; Skuk et al 2000; Skuk et al 2004; Skuk et al 1999b; Skuk &
Tremblay 2000). As in all allo-transplantation conditions, one of problems facing this
therapy is the specific immune reaction directed against transplanted cells and hybrid
muscle fibers that they form (Guerette et al 1994; 1995a; Guerette et al 1996; Guerette et al
1995b; Guerette et al 1997b).
The goal of the present study is thus to test whether an antibody and radiation free
tolerance induction protocol, supported by a mild myeloablative agent regimen
conditioning, permits a stable allo-transplantation such as MT for the DMD.
To avoid the rejection BALB/c myogenic cells without a constant FK506
administration, C57Bl10J mdx/mdx mice were treated with our tolerance inducing protocol
called TTCB:
i.e., a donor specific Transfusion, followed by a Treosulfan treatment
combined with single Cyclophosphamide dose and a donor Bone marrow transplantation.
We have demonstrated that without antibodies or radiation conditioning, all TTCB treated
mice developed stable multi-lineage mixed-chimerism and stable immunological tolerance
towards fully allogeneic myogenic cells and skin.
6.2 Materials and methods
6.2.1 Animals
BALB/c mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; H-2d) were used as
fully allogeneic donors. C57BL/10 J mdx/mdx mice (H-2b), which lack dystrophin
expression, were used as hosts. C3H mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; H2k) were used as third-party haplotype donors. All experiments were conducted in
accordance of the Laboratory Animal Care and Use Ethics Committee of Laval University.
143
Donor specific transfusion (DST) and drug treatments
A DST consisting in a single dose of male and female adult BALB/c splenocytes
(1x108, intravenously) was done in mdx recipients 3 days before the BALB/c BMT.
Briefly, spleen were harvested and crushed in a cell strainer. The cell suspension was
filtered through a 70 µm nylon mesh (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) before
assessing cell viability using trypan blue. Cells were suspended in RPMI medium 1640
(Gibco, Burlington, ON) before intravenous injection. Treosulfan (500 mg/kg or 650
mg/kg) graciously obtained from Medac research (Medac, Wedel, DE) was dissolved in
37°C sterile water and intravenously administered (100 µL/mouse, at days -3, -2, -1 before
BMT). Cyclophosphamide (200 mg/kg) was dissolved in sterile water and administered
intraperitoneally (day –1 before BMT).
6.2.2 BMT
Bone marrow cells (BMC) were obtained by flushing femoral and tibialis bones
from donor BALB/c mice with Hank’s balanced salt solution (HBSS; Sigma, St-Louis,
USA). BMCs were T cells depleted by a treatment with anti-CD90/Thy-1 (RT-550-PABX;
Medicorp, Montreal, QC, Canada) and with complement (low-tox M rabbit complement,
Cedarlane, Hornby, ONT, Canada). BMT (day 0) consisted of a 40×106 freshly harvested
adult BALB/c BMC intravenous injection.
6.2.3 MPC culture
Newborn BALB/c mice (Jackson Laboratory, H-2d) were used for primary MPC
cultures as previously described (Cossu et al 1980). Briefly, arm and leg muscles were
dissociated with collagenase (600 IU/ml; Sigma, St-Louis, MO) and dispase II (2 mg/ml;
Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). The cell suspension was grown in DMEM
(Gibco, Burlington, ON) supplemented with 15% fetal calf serum and a mixture of
penicillin G (10 000 IU/ml) and streptomycin (10 mg/ml). After two days in culture, cells
were harvested and frozen in 40% DMEM, 50% fetal bovine serum (FBS) and 10%
dimethyl sulfoxide, until MT.
144
6.2.4 MPC transplantation (MT)
The hind legs of mdx mice, which received or not the TTCB treatment, were
irradiated (20 Gy) to inhibit host MPC proliferation and thus reduce competition with
grafted MPCs (Wakeford et al 1991). Prior to MT, 1×106 BALB/c MPCs were suspended
in 10 µL of notexin (5 µg/ml) to induce myofiber necrosis without affecting the blood
vessels and peripheral nerves (Harris et al 1974). The Tibialis anterior (TA) of untreated or
treated mdx mice (H-2b) were injected in several sites with these fully MHC allogeneic
BALB/c MPCs (H-2d).
A positive control group for MT received a sustained immunosuppression during 1
month with FK506 (IM, 2.5 mg/kg/day) (Fujisawa Pharmaceutical Co. ltd, Osaka, Japan).
6.2.5 Skin transplantation
Full thickness tail skin ~1 cm2 from BALB/c (H2-b) and third-party (C3H; H2-k)
were grafted on the dorsum of the mixed-chimeric mice 30 days after the BMT. Similar
skin grafts were performed on untreated or FK506-treated mdx/mdx mice and represented
respectively negative and positive control groups. Skin grafts were considered rejected
when less than 10% of the graft remained viable.
Blood and muscle collection
Mouse blood was collected on days 30 and 130 post BMT. TA injected with MPCs
were dissected, placed in a 30% sucrose solution, embedded in OCT (Miles Inc., Elkhart,
IN), frozen in liquid nitrogen and serially sectioned at 12 µm using a Microm cryostat.
6.2.6 Immunohistochemical detection of Dystrophin
Cryostat sections were incubated with a rabbit anti-mouse-dystrophin antibody
(Camirand et al 2004), followed by a goat anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 488, or
Alexa 546 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA).
6.2.7Immunohistochemical detection of CD4 or CD8 T cells
Cryostat sections were incubated with a rat anti-CD4 antibody (clone GK 1.5;
ATCC, Rockville, MD), or a rat anti-CD8 antibody (clone YTS 169; gift from Dr.
Waldmann, Oxford University, Oxford, UK). Sections were then incubated with a biotin-
145
conjugated rabbit anti-rat antibody (clone E0468, Dakocytomation, Mississauga, ONT),
followed by incubation with streptavidin-Cy3 (Sigma).
For all Immunohistochemical detections, non-specific binding sites were blocked
with FBS 10% in PBS and staining was observed with a UV lamp microscope using the
appropriate filter.
6.2.8 Elispot
Spleen cells from untreated or mixed-chimeric mice were harvested and used as
effectors. Spleen cells from BALB/c or C3H mice were harvested and used as stimulators.
Cells were purified by Ficoll (Ficoll-Paque Plus, 17-1440-03, Amersham Bioscience AB,
Uppsala, SWE) in order to isolate peripheral blood mononuclear cells. Stimulator cells
were irradiated (20 Gy) and co-cultured (ratio 1:1) with effector cells for 48 hrs. Roughly
1x104 cells were placed on the coated plates of INFγ ELISPOT kit (Immuno-assay kit,
KME1235, Biosource International, Ca, USA) and incubated for 48 hrs. The spots were
then revealed with the reagent from the ELISPOT kit. Resulting spots were counted in each
well with a microscope. The mean number of spots in wells containing mixed-chimeric
mouse lymphocytes alone was evaluated and corresponded to the basal level of activity.
The mean level of activation was also calculated in the other wells containing both effector
and stimulator cells. The relative activity was the level of activation divided by the basal
activity level.
Flow cytometry
Blood samples of the treated mdx mice were harvested 30 days and 3 months post
BMT to determine the level of micro-chimerism. Blood samples of mdx and BALB/c mice
were also collected as negative and positive controls for H-2d haplotype. Briefly, blood
cells were stained with an anti-MHC class I H-2d haplotype (clone 34-2-12, BD
Biosciences, Mississauga, ONT, CA) specific for the donor BALB/c strain. The chimerism
level in different hematopoietic cell populations was determined with a phycoerythrincoupled anti-CD90 (clone RM5504-3, Cedarlane), and Cy5-coupled anti-CD4 (clone L3T4,
BD bioscience) or a Cy5-coupled anti-CD8 (clone 53-67, BD Biosciences). An anti-
146
FcγIIIR (clone 2.4G2, BD Biosciences) was added to the first incubation to block nonspecific FcγR binding of labelled antibodies.
A three-color FACS analysis was performed to analyze the expression of TCRs on
the host T cells. Blood cells from treated or untreated mdx mice were harvested at 3 months
post BMT. Cells were labelled with phycoerythrin-conjugated anti-Vβ11 or anti-Vβ8.1/8.2
mouse antibody (respectively clone CTVB11 or KJ16, Cedarlane), and Cy5-CD4 mouse
antibody (L3T4, BD Biosciences). The percentage of mdx-derived CD4 cells that were
Vβ11 or Vβ8.1/8.2 represents the number of CD4+ and Vβ+ cells gated on a total event of
1x104 leukocyte cells (discriminated by FACS with size scatter and forward scatter)
divided by the total CD4+ cell population gated with the same method. The labelling was
analyzed with a flow-cytometry (Epics XL, Coulter, Miami, FL).
6.2.9 Statistical analysis.
A Fisher PLSD test was used for statistical analysis using the Stat View software
(SAS Institute inc, Cary, NC) and P <0.05 was considered statistically significant.
6.3 Results
6.3.1 Cyclophosphamide/Treosulfan combination permits bone marrow
engraftment
The conditioning regimen, called TTCB was done to mdx/mdx recipients as shown
in figure 24. Blood samples were collected 30 and 230 days after the BMT, to determine
the peripheral chimerism level using cell-specific markers for CD90, CD4 and CD8 (Figure
25). Thirty days after the BMT all TTCB treated mice had significant levels of mixedchimerism for leukocytes (3-81%), CD4 lymphocytes (1-51%) and CD8 lymphocytes (129%). Significant levels of mixed-chimerism were also observed 230 days after the BMT.
However, leukocyte mean mixed-chimerism decreased from 28% to 13% (p<0.05),
between 30 and 230 days post BMT (Figure 25A). In figure 25D, TTCB mice were
classified in function of their CD90 mixed-chimerism level measured 30 and 230 days post
BMT. Thirty days after the BMT, most of mice (69%) had a leukocyte mixed-chimerism
level between 15% and 35%. This distribution was changed 230 days after the BMT, since
an equal number of mice were distributed between [1.5 %-15%] and [15 %-35%] ranges of
147
leukocyte chimerism level. This observation coincides with the decrease of the mean
mixed-chimerism mentioned above.
Two mice (numbers 5 and 13) died between the 30th and 230th days after the BMT.
We cannot exclude that these mice developed a GVHD since they both presented a
significant level of mixed-chimerism. However, no evident clinical sign of GVHD, such as
a sudden loss of weight, was observed (data not shown).
6.3.2 Clonal deletion of allo-reactive T cells occurred in response to BMT
after the TTCB treatment
Vβ T-cell receptors (TCR) were used to evaluate anti-donor reactivity and verify
whether our protocol resulted in deletion of host cells bearing anti-donor reactivity, an
evaluation of central tolerance (Cossu et al 1980; Harris et al 1974; Hoffman et al 1990;
Tomita et al 1996a; Tomita et al 2000; Wekerle et al 1998). Two hundred days after the
BMT, a deletion of Vβ11 TCR-bearing CD4+ T cells was observed in the peripheral blood
of mice that received the TTCB tolerigenic treatment (Figure 26). Thus, the percentages of
Vβ11 TCR CD4+ T cells were significantly lower in TTCB treated mdx mice than in
untreated mdx mice (p<0.01), and were similar to the levels seen in untreated BALB/c
mice. As a control, the percentage of Vβ8, which should not be deleted in any strain of
mice, was also examined. No significant differences in the percentage of CD4 cells
expressing Vβ8 were detected in mdx mice before and after receiving the TTCB treatment,
demonstrating the specificity for deletion of Vβ11 TCR-bearing CD4+ T cells and
involving a central tolerance establishment.
6.3.3 The TTCB treatment led to long-term survival of fully allogeneic
MPC transplantation (MT).
Mdx mice received the TTCB treatment, followed 30 and 130 days later, by two
MTs respectively in the left TA (MT1 in TA.L), and in the right TA (MT2 in TA.R). To
assess MT survival and fusion with the remaining muscle fibers of mdx mice, both injected
TAs were harvested 100 days after MT2 (Figure 24). Dystrophin expression (Figure 27) in
whole TA section of a grafted muscle was determined by immuno-histochemistry (of note,
MPCs do not express dystrophin before their fusion with muscle fibers). An average of
340.91+ 63.03 fibers (MT1 in TA.L) dystrophin positive fibers were observed in left TA
148
muscles of TTCB treated mice.
Rare dystrophin-positive fibers (~5-10 fibers/muscle
section) were present in muscles of naive mdx mice. Similarly, low frequency (6.6 + 3.7
fibers/muscle section) dystrophin-positive fibers were observed in muscles of mdx control
mice, which did not received the TTCB treatment but received a MT (Figure 27B, 28). A
high number of dystrophin positive fibers (277+ 41 fibers) was observed in mdx mice
immunosuppressed daily with FK506 (Figure 27A, 28). This shows that similar high-level
engraftment of MPCs did occur when immunological rejection was prevented either with
FK506 or with the TTCB treatment. Importantly, mice that received the TTCB treatment
had significant long-term MPC engraftment as evidenced by high-levels of dystrophin
expression 200 days after MT1 (Figure 27C, 28) in MPC-grafted TA.L.
Since several successive MTs will be required to treat several muscles in DMD
patients, the immunological tolerance induced by the TTCB treatment should resist to
several donor stimulations. Therefore, MT2 was done as a challenge to assess the
persistence of the tolerance. Dystrophin expression was examined in both injected TA
muscles 100 days after the MT2. Interestingly (Figure 27D, 28), the mean number of
dystrophin positive fibers was not significantly different in both grafted TA (TA.L:
340.91+ 63.03 fibers; TA.R: 331+ 39.42 fibers), demonstrating that a second allograft did
not affect the survival of the original allograft. Moreover, the number of muscle fibers
expressing dystrophin in TA.L or TA.R was similar to that observed after a sustained
FK506 administration.
6.3.4 No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted
TAs of the TTCB treated mice.
Signs of a cellular immune reaction against the transplanted MPCs and against the
muscle fibers resulting from their fusions were also assessed. This includes assessment of
infiltration by CD4 and CD8 lymphocytes. Therefore, TA sections of mixed-chimeric mice,
which received MT, were evaluated for signs of muscle fibers invasion by cytotoxic cells.
The presence of CD4 and CD8 lymphocytes around the dystrophin-positive fibers was
investigated by immuno-histochemistry. TAs from untreated mdx/mdx mice grafted with
BALB/c MPCs were the positive controls for lymphocyte staining. High numbers of CD4
and CD8 lymphocytes infiltrated these positive control muscles (Figure 29). Non-grafted
149
TAs from untreated mdx/mdx were used as negative controls for lymphocyte staining and
exhibited a low level patchy focal lymphocytic infiltrates containing both CD4 and CD8
cells (Figure 29). Such a lymphocyte infiltration has previously been reported in the mdx
muscles and attributed to the permanent inflammatory reaction present in these muscles
where fibers are frequently in degeneration/regeneration (Spencer et al 2001). Comparable
low levels of CD4 and CD8 infiltrations were observed in the MPC grafted TA muscles of
the mice that previously received the TTCB treatment. Interestingly, the second allograft
(TA.R) had no effect in the stability of this specific immune unresponsiveness against MT
since no increased infiltration was observed.
6.3.5 The TTCB treated mice developed a donor specific tolerance.
The anti-donor immune response was also investigated in the mixed-chimeric mice.
To test this, all the mice that received the TTCB treatment and that had been successfully
grafted with BALB/c donor MPCs were sacrificed 200 days after MT1. Spleen cells were
collected, and the frequency of reactive T cells producing IFNγ, a type 1 cytokine, was
measured by a modified ELISPOT assay. Spleen cells obtained from untreated mdx/mdx
mice were used as positive controls. T cells from chimeric mice did not react in presence of
stimulator cells of a BALB/c donor (Figure 30A). In contrast, T cells of chimeric mice
showed an increased IFNγ production in presence of stimulator spleen cells of a third-party
allogeneic (C3H) mouse. These data indicate that tolerance to the BALB/c MT induced in
TTCB treated mice was strictly associated with the abrogation of anti-BALB/c type 1
immune response. T-cells from TTCB treated mice consistently showed strong stimulation
and secretion of IFNγ in presence of stimulator cells of a third-party haplotype. Finally, the
level of IFNγ production was equivalent when T-cells from TTCB treated mice were in
presence of C3H T-cells and when T-cells from untreated mdx mice were in presence of
either BALB/c T-cells or C3H T-cells. This result indicated that the immune system of the
TTCB mice conserved its capacity to respond to an allogeneic stimulation as well as
immune system of untreated mdx mice. In order to support these in vitro results, an
additional group of 6 mdx/mdx mice received the TTCB treatment. However, considering
the variation and the time dependant decrease of mixed-chimerism level, observed between
the 13 TTCB treated mice of the first experiment, the dose of Treosulfan dose was
increased from 500 mg/kg (1st experiment) to 650mg/kg. Their levels of mixed-chimerism
150
were also quantified as described above 30 and 230 days after the BALB/c donor BMT.
Interestingly, as illustrated in figure 30B, thirty days after the BMT all mice, which
received a TTCB treatment including a higher dose of Treosulfan, developed high and
homogeneous mixed chimerism levels for leukocyte (46.55+3.74%), CD4+ (34.7+6.37%)
and CD8+ (16.92+4.39%) lymphocyte populations. Moreover, in opposite to the first
experiment, 230 days after the BMT mixed-chimerism level remained homogeneous
between the TTCB treated mice and increased for leukocyte (68.64+ 3.74%), CD4+
(68.34+11.43%) and CD8+ (65.91+8.1%) lymphocyte populations (p<0.01). These mixedchimeric mice then received allogeneic skin graft from both BALB/c and C3H donors.
Untreated and FK506 treated mdx/mdx mice were also similarly grafted and respectively
corresponded to our negative and positive control groups. As showed in figure 30C,
untreated mice promptly rejected both skin grafts (1-3 weeks post grafting). FK506-treated
mice preserved skin grafts until the end of FK506 treatment period, and then rejected it (1-4
weeks after the end of the FK506 treatment). TTCB treated mice fast rejected third-party
donor skin graft (1-2 weeks post-grafting). Importantly, however, this rejection of C3H
donor skin did not precipitate rejection of donor-specific BALB/c skin graft, which
survived throughout the follow-up period, i.e., 10 weeks. Thus the development of mixedchimerism by the TTCB treatment allowed to a long-lasting donor-specific tolerance.
6.4 Discussion
Sustained immunosuppression increases infection and cancer risks (Bennett 1998;
Falkenhain et al 1996; Glover et al 1997; Neu et al 1997; Penn 1998; Tanabe et al 1996).
An alternative method to permit graft acceptance by the host is the induction of
immunological tolerance. An established approach depends on central immune system
tutoring through the development of mixed hematopoietic chimerism (Sharabi & Sachs
1989; Wekerle & Sykes 1999). Several strategies for tissue or organ transplantations,
developed in many animal models such as mouse or monkey, already allow permanent or
transient mixed-chimerism development. However, most of them involve irradiation
conditioning associated with depleting or blocking antibodies (Camirand et al 2004; de
Vries-van Der Zwan et al 1994; Kawai et al 2004; Ploemacher et al 2004; van Pel et al
2003; 2004). Moreover, the mAbs used for these treatments are not available or not already
151
approved for clinical use. A promising alternative method proposed the combination of
alkylators, Busulfan and Cyclophosphamide, and a single donor spleen cell transfusion
(Tomita et al 2000). All mice treated with this conditioning regimen developed stable
multilineage chimerism. Furthermore, Tomita et al. demonstrated in that publication that all
components of this regimen were required for the establishment of a firm mixed chimerism
(Tomita et al 2000). However, Busulfan toxicity compromises this therapy finality (Casper
et al 2003; 2004; Kroger et al 2001; Ringden et al 1999; Ritchie et al 2001; Schetelig et al
2002; Slavin et al 1998; Storb et al 1997). This study proposes a conditioning regimen
called TTCB, which is based on Treosulfan administration. The low dose of Treosulfan
(Figure 25 and 30) used in this TTCB treatment should be considered as a non
myeloablative conditioning regimen (Ploemacher et al 2004). This new conditioning
regimen is well tolerated as expected since none of treated mice developed any signs of
GVHD, and only 2 of 19 mice died after the beginning of protocol for unknown causes. As
demonstrated following the TTCB treatment, a stable multi-lineage mixed-chimerism was
obtained for leukocytes and more especially for both CD4 and CD8 T cell populations. In
the first experiment (Figure 25), the mixed-chimerism levels were variable in TTCB treated
mice. However, this variability did not prevent the establishment of central tolerance
(Figure 24). In addition, all treated mice presented comparable stable clonal deletion level,
230 days after the BMT, independently of their mixed-chimerism level indicating that all of
them had acquired central tolerance. In the second experiment, the TTCB treated mice
(Figure 30) showed elevated and uniform mixed-chimerism levels 30 and 230 days post
BMT, probably due to the higher dose of Treosulfan administrated (3 x 650 mg/kg instead
of 3 x 500 mg/kg). In this second experiment, increased mixed-chimerism levels were
observed in the TTCB treated mice between the 30th and the 230th days post BMT
(p<0.01). A previous study in mice, involving T-cell depletion with an anti-CD3 mAb
combined with a Treosulfan treatment, demonstrated that similar uniform levels of mixedchimerism were obtained. However, this protocol required not only the use of a monoclonal
antibody but also higher doses of Treosulfan, i.e., three consecutive administrations of 1500
mg/kg (van Pel et al 2003).
The second aim of this study was to evaluate the application of a protocol of
tolerance induction in the context of an allotransplantation for a cellular therapy. Currently,
152
no effective treatment for DMD exists and MT represents a potential treatment since
normal MPCs, carrying the wild type dystrophin gene, can fuse with and provide the preexisting muscle fibers with a normal dystrophin gene. However, MT faces several technical
problems. Because MPCs have a weak motility in vivo, multiple injections are required to
reach a good incorporation of the donor MPCs throughout a given skeletal muscle (Skuk et
al 2000). Because of this problem, many MTs at different times would be needed to restore
efficiently the dystrophin expression in several muscles of DMD patient. Therefore, strong
and stable tolerance is essential to avoid a repeated tolerigenic treatment before each MT.
Our present results are important in this context because for the first time, a regimen
exclusively based on drugs currently approved for human used, allowed tolerance induction
for allogeneic MT. Indeed, in agreement with the potential clinical application requiring
several consecutive MTs in DMD patients, all mice receiving the TTCB regimen
demonstrated long-term engraftment and donor specific tolerance to a re-challenge with
allogeneic MPCs.
Even without any allogeneic MT, the presence of activated lymphocytes
(CD44high, CD4 or CD8) was increased in mdx mouse muscles compared to those of the
non-dystrophic allelic strain, i.e., C57BL10J mice (Spencer et al 2001). However, the
frequency of activated T cells was not elevated in mdx lymph nodes, suggesting a musclespecific T cell activation. Moreover, it has been demonstrated that T cells promote mdx
pathology and suggested that immune-based therapies may provide benefit to DMD
patients (Spencer et al 2001). A previous tolerigenic protocol, by our group, using costimulatory blockade with anti-CD45Rb and anti-CD154, revealed an increased
lymphocyte infiltration in MPC-grafted muscles of mixed-chimeric mdx/mdx mice even
though dystrophin positive fibers formed by the transplanted MPCs persisted (Camirand et
al 2004). Our present results showed (Figure 29) that in TTCB treated mice, the presence of
CD4 or CD8 T cells was not increased in grafted TA compared with the mdx/mdx standard
TA. Thus our protocol avoided a muscle specific response, which may have been present
with the co-stimulatory blockade protocol.
Finally, the TTCB treated mice significantly maintained reactivity to unrelated
antigenic challenge as demonstrated by third-party skin graft rejection. The tolerance
153
specificity was confirmed by the inactivity of the T cells of the TTCB treated mice towards
BALB/c spleen cells, while in contrast a high reactivity was present against the spleen cells
of a third-party (C3H) (Figure 30A). Additionally, the reactivity level of the C3H activated
T cells was similar for TTCB treated or native mdx mice suggesting that specific immune
system of TTCB treated mice has conserved his original capacity to respond to alloantigens.
The present study demonstrates that Treosulfan, in a protocol requiring no
irradiation and using only drugs already approved for clinical use, permitted to obtain a safe
and sustained donor specific immunological tolerance for MT in mice. Moreover, given
that Treosulfan is already reported to have a low toxicity profile in hematopoietic stem cell
transplantations, the merits of including Treosulfan in non myeloablative regimen in
clinical setting, such as for dystrophic patients, should be seriously evaluated (Beelen et al
2005; Casper et al 2004; Scheulen et al 2000).
This study also shows that multiple MPC injections after a drug-induced tolerance,
leads to stable dystrophin expression in a large number of muscle fibers (Figure 28). The
level of dystrophin expression obtained in the present study has been previously shown to
improve strength and decrease exercise-induced injury (Alameddine et al 1994a;
Alameddine et al 1994b; Alameddine et al 1994c; Brussee et al 1998; Irintchev et al 1997a;
Irintchev et al 1997b; Liu et al 2005). Moreover, some of the transplanted MPCs will not
fuse immediately and will remain as quiescent satellite cells, which will be able to repair
subsequent damage induced by normal muscle activity (Alameddine & Fardeau 1990;
Gussoni et al 1999; LaBarge & Blau 2002; Lee et al 2000). Additionally, we have shown
that excellent distribution of MPCs can be achieved even when transplanted into larger
muscles of non-human primates with up to 70% to of the fibers expressing a donor gene
(Skuk et al 2000). Finally, a recent patient study showed a successful MT, which restored
around 50% of dystrophin expression in the grafted area (Skuk D 2005). Associated with
the monkey and murine studies noted above (Alameddine et al 1994a; Alameddine et al
1994b; Alameddine et al 1994c; Brussee et al 1998; Irintchev et al 1997a; Irintchev et al
1997b; Liu et al 2005; Skuk et al 2000), MT coupled with TTCB treatment could be
expected to improve strength, quality of life and perhaps the life span of DMD patients.
154
Moreover this approach may be useful to improve TTCB as a potential tool for other cell,
organ or tissue transplantations.
This work was supported by:
ROTRF (Roche Organ Transplantation Research Fondation)
AFM (Association Française contre les Myopathies)
Acknowledgement:
This work has been revised by Dr Skuk.D
155
Figure 24 : Tolerance induction protocol and MPC transplantation chronology
Time course of a non-myeloablative conditioning treatment (called TTCB) and of
MPC transplantations (MT1 and MT2, 1x106 BALB/c MPCs) The TTCB treatment
includes: Treosulfan (TREO, 3 doses of 500 mg/kg), BALB/c donor specific Transfusion
(DST, 1x108 spleen cells), Cyclophosphamide (CYP, 1 dose of 200 mg/kg), and BALB/c
donor Bone marrow transplantation (BMT, 40x106 CD90-depleted bone marrow cells). The
level of mixed-chimerism level was analyzed at days 30 and 230. Mice were sacrificed 230
days after the BMT, blood and both grafted Tibialis anterior (TA.L and TA.R) were
collected.
156
Figure 25 : Peripheral mixed-chimerism level evaluation
Levels of peripheral blood mixed-chimerism were evaluated in mice, which
received the TTCB conditioning regimen. The level of mixed chimerism at 30 and 230 days
after the BMT are represented respectively in white and in black columns. This analyze was
performed for the leukocyte cell population and the CD8 or CD4 T-cell population,
respectively, A, B, C. Note that mice 5 and 13 died between days 30 and 230. The
distribution of mixed-chimeric mice at 30 and 230 days after the BMT according to the
percentage of donor haplotype CD90 cells is represented (D).
157
Figure 26 : Clonal deletion of allo-reactive T cells occurs in response to TTCB
conditioning.
Clonal deletion level of donor-reactive CD4+ Vβ11+ cells was assessed in
peripheral blood samples of mixed-chimeric mice (n=11). The mixed-chimeric mouse
group was compared with untreated donor (BALB/c, n=5) and recipient (mdx, n=5) mouse
strains. Peripheral CD4+ cells in mixed-chimeric mice were assessed on day 230 post BMT
for Vβ8 (control) or Vβ11+ (donor reactive) T-cell receptor (TCR) (*p<0.001 compared
with untreated mdx mice).
158
Figure 27 : Stable mixed chimerism led to long-term survival of several fully allogeneic
MPC transplantations.
Dystrophin expression was detected by immuno-histochemistry using an antidystrophin anti-serum in cryostat sections of the TA muscles of mdx mice grafted with
BALB/c MPCs (magnification X100). A: Mdx mice chronically immunosuppressed with
FK506 shown 30 days after MPC injection. B: Untreated mdx mice 40 days after MPC
injection. C: Mixed-chimeric mdx mice showed 200 days after the first MPC injection
(MT1) in left TA (TA.L). D: Mixed-chimeric mdx mice showed 100 days after the second
MPC injection (MT2) in right TA (TA.R).
159
Figure 28 : The success of MPC transplantation in mixed-chimeric mice is similar to that
observed in FK506 chronically immunosuppressed mice.
Mean number of dystrophin positive fibers in TA muscle sections of mice that
received allogeneic BALB/c MPC transplantation. Dystrophin positive fibers were
individually counted in photographs of cryostat section of the muscle of the mixedchimeric mice TA (n=11) 200 days after the first MPC injection in left TA (MT1/TA.L) or
100 days after the second (challenge) MPC transplantation in right TA (MT2/TA.R). A
similar procedure was used for chronically FK506 immunosuppressed mdx mice (n=5;
FK506) and for untreated mdx mice (n=5; control (-)). TAs of FK506 or control (-) group
were harvested 40 days after the MPC injection. (*p<1x10-7 compared with control (-)).
160
Figure 29 : No increase of T-cell mediated activity was observed in the grafted TA of
mixed-chimeric mice.
Signs of a cellular immune reaction against the transplanted MPCs and against the
muscle fibers resulting from their fusion were assessed by immuno-histochemistry. This
included assessment of infiltration by CD4 and CD8 T-cells with a red immunofluorecence
staining (Streptavidine-Cy3) and localization of dystrophin-positive fibers with green
immunofluorecence staining (Alexa 488). Whole TA muscle sections in A and 10X
magnifications of the same sections in B are represented. TA of untreated mdx mice grafted
with donor BALB/c MPCs and collected 7 days after the MPC injection were considered as
positive control (Control(+)).Non-grafted TA muscles of untreated mdx mice were the
negative controls (Control(-)). Mixed-chimeric mice injected with BALB/c donor MPCs for
a second time in the right TA (MT2/TA.R) were sacrificed 100 days after this second MPC
injections and both TAs were collected. Both stainings were performed on TA sections,
combining dystrophin (dys) and CD4 staining or dystrophin and CD8 staining. The merges
represent the respective staining associations, i.e., dys/CD4 or dys/CD8.
161
Figure 30 : Mixed-chimeric mice developed a stable donor specific tolerance.
T-cell activity of mixed-chimeric mice in presence of donor BALB/c or third-party C3H spleen cells
was evaluated by the INFγ-ELISPOT method (A). Spleen cells of diverse mice were mixed in a 1:1 ratio.
Spleen cells of mice, which developed mixed chimerism following the TTCB treatment, were mixed with
BALB/c or C3H spleen cells (respectively BALB/TTCB, n=10 or C3H/TTCB, n=6). Spleen cells of mdx
mice were mixed with BALB/c or C3H spleen cells (respectively BALB/mdx, n=5 or C3H/mdx, n=5). As
reference of basal T-cell activity, the mean number of spots/well was calculated for spleen cells alone of
mixed-chimeric mice (n=6). The ratios of the mean number of spots/well is illustrated for each cell
combination and for basal T-cell activity (*p<0.001 compared with BALB/TTCB combination). Levels of
peripheral blood mixed-chimerism were evaluated in 6 mice, which received the TTCB treatment (B). The
levels of mixed chimerism 30 and 230 days after the BMT are represented for the leukocyte cell population
and for the CD8 and CD4 T-cell populations. Skin graft survival was determined for mice, which received the
TTCB regimen (C). Untreated mdx mice (n=5) or FK506 treated mdx mice (n=5) received simultaneously
BALB/c and C3H skin grafts. Similar skin grafts were performed 30 days after BALB/c BMT on mice, which
received the TTCB regimen (n=6). (*** marked the end of FK506 administration).
162
Discussion générale
L’ensemble des travaux réalisés au cours de cette thèse visait à améliorer le
potentiel clinique de la TM appliquée à la dystrophie musculaire de Duchenne. À cette fin,
deux approches ont été tentées pour contrecarrer la destruction des myoblastes survenant
après leur greffe et réduisant de ce fait le succès clinique de cette transplantation.
Compensation de la perte précoce des myoblastes transplantés
La première vague de mortalité cellulaire qui frappe les myoblastes apparaît dans
les premières heures qui suivent leur injection. Cette observation avait été effectuée par
notre laboratoire ainsi que par d’autres équipes de recherche. Elle a été de nouveau
confirmée au cours de l’étude qui constitue le premier article de cette thèse. Ainsi, près de
60 à 70% des myoblastes humains, greffés dans des souris SCID, sont détruits dans les 48
heures post-transplantation. Néanmoins, cette perte cellulaire ne prévient pas complètement
le succès de la transplantation. En effet, les cellules greffées qui survivent peuvent
proliférer et ultérieurement fusionner entre elles ou avec les fibres de l’hôte. En outre,
plusieurs études ont démontré l’importance, en période post-traumatique, que pouvaient
avoir la prolifération, la fusion et la survie des cellules myogéniques sur la régénération
musculaire (Charge & Rudnicki 2004). De ce fait, la première étude de cette thèse visait à
améliorer le succès d’une transplantation de myoblastes humains, en greffant ces derniers
dans un contexte favorisant leur prolifération, leur différenciation et leur survie.
La forme active de la vitamine D3 (VD3) produit plusieurs effets susceptibles de
répondre à cette attente. Ses effets mitogéniques et morphogéniques ont été préalablement
décrits sur des myoblastes d’embryon de poulet (Boland et al 1995; Boland et al 1985). Les
mécanismes d’action de la VD3 sur ces cellules sont encore sous investigation. Néanmoins,
il semble que les effets mitogéniques et morphogéniques de cette molécule soient
imputables à son récepteur membranaire (Figure 31). Les voies de signalisation cellulaire
passant par la phosphorylation des tyrosines aisni que par les « MAP »kinases et JUNK
kinases sont impliquées dans la prolifération et la différenciation des myoblastes de souris
et d’embryons de poulet (Boland et al 2005; Buitrago et al 2006). Ceci laisse penser que les
effets de la vitamine D3 sur la modulation de la prolifération et myoblastes sont
163
principalement médiés par son récepteur membranaire. Toutefois, une participation du
récepteur nucléaire n’est pas à exclure (Buitrago et al 2006). Ce même récepteur
membranaire est notamment présent à la surface des myoblastes humains (Bischoff et al
2001).
164
différenci
Figure 31 : Signalisation intracellulaire dépendante de la forme active de la vitamine D3.
Le 1α25-dihydroxycholécalciférol agit sur les cellules par des mécanismes génomiques et
non-génomiques. Classiquement, il est établi que la forme active de la vitamine D3
interagit avec l’ADN pour déclencher une synthèse de protéines dont le promoteur
reconnaît le VDR. Des études plus récentes démontrent que la forme active de la vitamine
D3 induit une réponse biologique plus rapide en passant par des voies de signalisation
intracytoplasmiques.
165
Notre première étude révèle effectivement que la VD3 a in vitro des effets bénéfices sur la
prolifération et la différenciation des myoblastes humains. De plus, nous avons démontré
que l’administration de cette molécule augmente in vivo la prolifération des myoblastes
injectés et favorise la réussite de leur transplantation. Cependant, il est difficile de discerner
et de quantifier l’impact de chacun des effets sur la prolifération et sur la différenciation sur
l’amélioration du succès de la TM. Malgré tout, nos expériences sur la mortalité des
myoblastes nous permettent d’écarter la possibilité que la VD3 influence la survie des
myoblastes transplantés. En effet, même si cette molécule réduit l’apoptose induite par des
cytokines pro-inflammatoires (Boland et al 2005; Riachy et al 2002), elle s’avère inefficace
sur les myoblastes humains.
En dehors du fait que la VD3 agit sur ces cellules, cette molécule se distingue par
ses effets sur la réponse immunitaire. Premièrement, la VD3 semble diminuer l’efficacité
de la réponse immunitaire innée qui se déroule dans les premiers instants qui précèdent la
transplantation (Cantorna et al 1998a; Cantorna et al 1998b; Cantorna et al 1998c; Hullett
et al 1998). Deuxièmement, la VD3 agit sur les mécanismes de tolérance immunitaire
périphérique (Adorini et al 2003; Berer et al 2000; Bhalla et al 1984; Gregori et al 2001;
Gregori et al 2002; Penna & Adorini 2000). Les expériences réalisées in vivo avec la VD3
ont été faites chez des souris SCID. L’utilisation de ces souris a permis d’exclure que la
VD3 améliore le succès de greffe de myoblastes humains via une modulation de
mécanismes de tolérance périphériques, les souris SCID n’ayant pas de lymphocytes. De
plus, la VD3 n’augmente pas chez ces souris la survie des myoblastes transplantés. Ce
résultat indique que la mortalité des myoblastes due à l’inflammation ne semble pas
influencée par l’administration de VD3. Toutefois, même la VD3 ne présente pas d’intérêt
d’un point de vue immunitaire à la vue des transplantations de myoblastes humains
effectuées la souris SCID, sa participation à l’augmentation de succès d’une allogreffe n’est
pas à exclure. En effet, l’application en clinique d’une TM allogénique requière
l’immunosuppression au FK506 des patients traités. Or, il est présentement établi que
l’administration de VD3 agit en synergie avec le FK506 et permet ainsi de réduire la dose
de FK506 prescrite pour une efficacité immunosuppressive équivalente (Mathieu et al
1994; van Etten et al 2000). Notre étude (article I), démontre que l’administration conjointe
de VD3 et de FK506 n’interfère pas sur l’augmentation du succès de greffe enregistré avec
166
l’administration de VD3 seule. Néanmoins, il reste à effectuer des tests qui confirmeraient
qu’une administration de VD3 puisse réduire la dose efficace de FK506.
En conclusion de notre première étude, nous pensons qu’un traitement basé sur
l’administration de VD3 pourrait améliorer le succès des transplantations de myoblastes à
des patients Duchenne. À première vue, l’augmentation de la prolifération des cellules
transplantées joue un rôle dans ce résultat. L’augmentation de la fusion des myoblastes
observée in vitro pourrait également participer au renforcement de la capacité myogénique
des cellules transplantées. En outre, il reste à effectuer des études plus fondamentales sur
les myoblastes humains pour comprendre par quels mécanismes cellulaires la VD3 module
les capacités mitogéniques et myogéniques des myoblastes humains. Enfin, il ne faut pas
oublier que la VD3 est déjà utilisée en clinique par exemple pour le traitement de
problèmes osseux. Sa posologie est donc très bien documentée et ceci favorise donc une
application possible en clinique pour la TM. Cependant, les doses efficaces qui ont été
administrées aux souris SCID pourraient très bien chez l’être humain correspondre à des
doses susceptibles de provoquer une hypercalcémie (Hathcock et al 2007). L’utilisation
d’un analogue de la VD3 (Amuchastegui et al 2005) ne causant pas d’hypercalcémie
pourrait palier à ce problème. Il faudrait cependant confirmer l’effet de ces analogues sur la
TM.
Assurer la survie à long terme des myoblastes transplantés sans immunosuppression
soutenue
La réponse immunitaire spécifique suite à une TM allogénique est à l’origine de la
deuxième vague de mortalité cellulaire qui frappe les myoblastes après leur transplantation.
Toutefois, à la différence de la première vague de perte cellulaire, cette dernière annihile
complètement le résultat de la greffe, tous les myoblastes du donneur ainsi que les fibres
musculaires qu’ils ont formées par leur fusion sont detruits. Actuellement, les patients
subissant une allogreffe sont tous sous immunosuppression soutenue. Ce type de traitement
est également nécessaire pour les patients dystrophiques qui reçoivent une TM (Skuk et al
2004; Skuk D 2005). L’administration en continue de FK506, est le traitement qui donne
présentement les meilleurs résultats pour la TM. Malheureusement, ce traitement est un
frein majeur pour la prolongation des essais cliniques puisqu’il est toxique à long terme et
167
pourrait de ce fait réduire l’espérance de vie des patients traités même si la greffe rétablit
l’expression de dystrophine. Une alternative à l’immunosuppression soutenue consiste à
induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique
mixte. Pour que cette approche fonctionne, il faut détruire tous les clones alloréactifs de
l’hôte. Puis il faut réaliser une greffe de moelle osseuse efficace provenant du même
donneur que l’organe (ou les cellules) transplanté. Beaucoup de protocoles ont été
développés chez la souris mais très peu ont été testés et surtout validés chez les primates
non-humains et chez l’homme. Pour l’instant, pour obtenir un chimérisme hématopoïétique
mixte, les conditionnements des receveurs les plus prometteurs requièrent l’utilisation
d’anticorps bloquants ou déplétants ainsi que l’irradiation thymique ou pan corporelle du
receveur. Ces conditionnements sont encore jugés trop invasifs pour être utilisés chez
l’humain. Quant à l’utilisation d’anticorps bloquants ou déplétants, leur disponibilité est
encore faible et le recul thérapeutique les concernant est trop court. Néanmoins il est
important de noter que dans le cadre d’une TM, un protocole nécessitant l’utilisation
d’anticorps déplétants ou bloquants a été réalisé avec succès chez la souris mdx (Camirand
et al 2004). Cependant les anticorps équivalents ne sont pas disponibles pour les antigènes
humains. Ils devraient donc être produits et validés pour utilisation clinique, un processus
très couteux.
Une autre approche pour obtenir du chimérisme hématopoïétique mixte consiste à
utiliser des drogues cytoréductrices pour détruire les clones alloréactifs et détruire
partiellement la moelle du receveur pour permettre un « enracinement » de la moelle du
donneur. Ce concept a été développé avec succès en 2000 et implique l’administration de
busulfan et de cyclophosphamide (Tomita et al 2000). Cette approche a conduit chez la
souris au maintien à long terme de greffes de peaux pleinement allogéniques. Bien que le
résultat obtenu soit très intéressant, l’administration de busulfan est hématotoxique et
organotoxique. Par ailleurs, ces effets délétères persistent même après réduction de la
quantité de busulfan administrée (Ringden et al 1999; Ritchie et al 2001). Le deuxième
article de cette thèse proposait de remplacer le busulfan par un dérivé moins toxique du
busulfan : le tréosulfan. À l’origine le tréosulfan était administré aux patientes souffrant de
cancer ovarien. Puis, bénéficiant d’une toxicité réduite en comparaison avec le busulfan, le
tréosulfan fut inclu, chez l’enfant, dans des protocoles de transplantation de cellules
168
souches hématopoïétiques. Il faut noter que l’un de ces traitements cliniques propose une
administration conjointe de tréosulfan et de cyclophosphamide. Enfin, ces dernières années,
le tréosulfan a été utilisé avec succès, chez la souris, dans des protocoles d’établissement de
chimérisme hématopoïétique. Néanmoins ces protocoles proposent encore une déplétion
des clones lymphocytaires alloréactifs par des anticorps.
L’utilisation en clinique du tréosulfan et du cyclophosphamide offre une avenue
intéressante pour la conception d’un protocole de développement de tolérance,
particulièrement pour le traitement d’un enfant. C’est pourquoi nous avons mis au point un
tel protocole, chez le modèle murin dystrophique, basé sur l’administration conjointe de ces
deux drogues. Nous avons dénommé l’ensemble de ce protocole de conditionnement :
TTCB,
pour
« Transfusion,
Treosulfan,
Cyclophosphamide,
Bone
marrow
transplantation ». Ce protocole a conduit au développement stable d’une tolérance aux
allogreffes de peaux et aux allotransplantations de myoblastes. Notre première tentative
révèle chez les souris traitées l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte.
Nous avons enregistré une certaine variabilité inter-souris n’influençant toutefois
aucunement le résultat positif des TMs. Nous avons répété un protocole identique en
augmentant la dose de tréosulfan, et obtenu un chimérisme mixte constant chez toutes les
souris. Par ailleurs, un chimérisme similaire avait été obtenu chez les souris par une autre
équipe utilisant le tréosulfan. Néanmoins, les doses de tréosulfan administrées étaient
supérieures à celles utilisées dans notre protocole (van Pel et al 2003). En ce qui concerne
le chimérisme mixte, nous avons démontré que ce chimérisme reposait sur des mécanismes
d’induction de tolérance centrale. L’implication d’une tolérance périphérique n’a pas été
démontrée. Cependant, une étude réalisée chez la souris a révélé que les mécanismes de
tolérance périphérique intervenaient dans les premiers jours qui suivaient la transplantation
de moelle osseuse. Ces mécanismes semblent nécessaires à l’établissement du chimérisme
hématopoïétique mais n’influenceraient pas le maintien à long terme de la greffe
(Bigenzahn et al 2005). Pour que le TTCB réponde parfaitement aux critères de la TM, il ne
doit pas interférer avec la capacité myogénique des cellules transplantées. Également, il
faut prendre en considération la répétition des injections de myoblastes dans le temps pour
traiter une grande surface musculaire. La tolérance établie doit donc résister à plusieurs
transplantations successives. Notre étude a démontré que le TTCB permettait au receveur
169
d’être greffé plusieurs fois sans répéter le protocole tolérigénique et sans nuire aux
premières greffes effectuées. Nous avons donc un protocole qui induit une tolérance forte et
stable face aux TMs. Enfin, compte tenu du résultat des greffes, nous pouvons conclure que
le TTCB ne nuit pas à la capacité myogénique des cellules injectées.
Une bonne tolérance se définit également par l’absence de lymphocytes infiltrants
dans la zone de greffe. La première tentative de développement de tolérance pour la TM
s’appuyant sur l’induction d’un chimérisme hématopoïétique mixte nécessitait l’utilisation
d’anticorps anti-CD154 et anti-CD45RB (Camirand et al 2004). Elle donna de bons
résultats et permit l’acceptation à long terme de TMs allogéniques. Curieusement, des
poches éparses d’infiltration lymphocytaire étaient présentes dans les zones de greffe. Les
lymphocytes infiltrés ne présentaient cependant pas de signe d’activation et n’influaient pas
sur l’acceptation des fibres néoformées par le receveur. Bien que l’origine de ces poches
d’infiltrats lymphocytaires ne soit pas encore clairement définie, leur présence pourrait
soulever quelques inquiétudes. Nous avons vérifié si ces infiltrations lymphocytaires se
répétaient dans nos souris traitées avec le TTCB. Nous avons remarqué la présence de
lymphocytes dans les muscles transplantés. Toutefois, nous n’avons observé aucune
différence significative d’infiltration lymphocytaire basale entre un muscle non greffé de
souris dystrophique (Spencer et al 2001; Spencer & Tidball 2001) et un muscle greffé. De
ce fait, nous pouvons donc émettre l’hypothèse que le traitement TTCB permettrait de
contourner une réaction lymphocytaire spécifique contre des antigènes spécifiques au
muscle qui pourrait survenir dans le cas d’un protocole basé sur le bloquage des voies de
costimulation lymphocytaire.
En conclusion de notre deuxième étude nous pensons que le TTCB peut s’avérer un
traitement potentiel pour circonvenir à l’immunossuppression des patients dystrophiques et
ainsi permettre d’assurer la réussite durable d’une TM. La stabilité du statut de tolérance
obtenu avec le traitement TTCB face à la répétition de plusieurs TM, renforce l’idée
prometteuse de son application possible en clinique. Pour parfaire le tout, la combinaison
des deux drogues cytoréductrices incluse dans le protocole du TTCB est déjà utilisée chez
les enfants souffrant d’une leucémie grave. Par ailleurs, le passage du traitement TTCB sur
des grands animaux est présentement sous investigation dans notre laboratoire. Le singe
170
Cynomolgus a été choisi en raison de la forte similarité entre le système immunitaire de
l’homme et celui des primates non-humains. Le chien fait également parti des projets
d’investigation sur le TTCB. Le singe ne développant pas de dystrophie, il est important de
tester le modèle de tolérance du TTCB sur le chien dystrophique. Ce passage est nécessaire
pour appliquer la TM sur un modèle dystrophique qui se rapproche le plus de l’homme.
Néanmoins ces étapes ne sont pas sans difficultés. Pour le singe, la posologie du
cyclophosphamide et du tréosulfan se rapproche de l’enfant en termes de dose. Néanmoins,
les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de tolérance chez les primates
non-humains sont potentiellement différents de ceux de la souris. En effet, il a été rapporté
lors d’un protocole d’induction de tolérance, basé sur le chimérisme, que des
allotransplantations de rein ont été acceptées à long terme par le receveur alors que le
chimérisme observé n’était que transitoire (Kawai et al 2004). Cette donnée stipule que
dans un protocole d’induction de chimérisme hématopoïétique les mécanismes de tolérance
périphérique ont un rôle différent à jouer dans le maintien d’une allogreffe que ceux de la
souris. Pour le chien, outre la particularité de son système immunitaire, sa sensibilité aux
agents alkylants nécessite une étude dose/réponse plus sérée pour le cyclophosphamide et
le tréosulfan que pour le singe. De plus, aucun protocole sur le chien n’a encore requis
l’administration de tréosulfan.
Conclusion générale
Plusieurs thérapies potentielles pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne
sont en développement. La TM est pour l’instant une des rares thérapies qui a déjà produit
des résultats positifs dans un essai clinique. Cette approche offre la possibilité de restaurer
une expression stable de dystrophine et d’augmenter la capacité régénérative des muscles
transplantés (Bouchentouf et al 2006). Cependant, il faut voir en cette thérapie une solution
palliative efficace et non pleinement curative. En effet, la faible distribution des cellules
transplantées et la difficulté à atteindre des organes comme le cœur et le diaphragme
cantonne l’application de la transplantation de cellules myogéniques à une zone curative
limitée. Néanmoins, la TM pourrait contribuer à augmenter l’espérance et la qualité de vie
des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Pour atteindre cet objectif et
compte tenu de la fragilité des patients, il faut que cette méthode soit la plus efficace et la
moins invasive possible. L’objectif de cette thèse était de contribuer à cette perspective. Au
travers des études de ces manuscrits, l’ensemble des méthodes développées avait pour trait
commun l’utilisation de drogues dont la connaissance et le recul clinique étaient éprouvés.
En premier lieu, l’administration de la forme active de la vitamine D3 offre la possibilité
d’aider les cellules myogéniques transplantées à participer à la réparation des muscles
greffés. Enfin, le traitement TTCB permet d’assurer la survie à long terme de la TM, sans
avoir recours à une immunosuppression et en se basant sur une administration de drogues
cytoréductrices déjà utilisées chez l’enfant. Il reste encore beaucoup de travail à réaliser
pour confirmer ces résultats sur des modèles animaux supérieurs et plus proche
physiologiquement de l’homme. Toutefois, ces deux études pourraient conjointement,
s’insérer ultérieurement dans les essais cliniques en cours de TM et ainsi contribuer à la
finalisation de ce grand défit scientifique.
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Liste des abréviations.
AAV: Adeno-associated viral vectors
Ac : Anticorps
ADN : Acide désoxyribo-nucléique
ADNc : Acide désoxyribo-nucléique complémentaire
Ag : Antigène
AONs : « Antisens Oligonucleotides »
ARN : Acide ribo-nucléique
ARNm : Acide ribo-nucléique messager
ATP : Adénosine tri phosphate
BCR : « B cell receptor » récepteur antigénique des cellules lymphocytaires de type B
CAR: Coxsackie-adenovirus receptor
CD: cluster de différenciation
CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité
CMYO : Cellules de la lignée myogénique
CPA : Cellules présentatrices d’antigènes
CsA : cyclosporine A
CTLA-4 : « Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 »
DAP : Dystrophine associated protein
DAP: Dystrophin associated protein
DMD: Dystrophie musculaire de Duchenne
DSG : Déoxyspergulaine
FGF :« Fibroblastic growth factors »
GVHD : Graft versus host disease
hdAd: Helper-dependant adenovirus
HGF : « Hepatocyte growth Factor »
Ig :Immunoglobuline
IL : Interleukine
IL-2 : Interleukine de type 2
INFγ : Interferon gamma
IT : Méthode de déplétion immunitaire basée sur une immunotoxine couplée à un anticorps
anti-CD3.
J.-C. : Jésus Christ
kb : kilo-base
kDa: kilo-Dalton
LB : Lymphocytes à éducation myéloïde
LT : Lymphocytes à éducation thymique
MAST205 : microtubules associated serine/threonine kinase
Mb : Mégabase
Nos : nitric oxyde synthase
PCK: Phosphate créatine kinase
PCR : Polymerase chain reaction
TCR: “T cell receptor” récepteur antigénique des cellules lymphocytaires de type T